BR112020005414B1 - STRUCTURED LIGHTING IMAGE FORMATION SYSTEM AND METHOD FOR STRUCTURED LIGHTING IMAGE FORMATION - Google Patents

Abstract

A descrição provê sistemas de formação de imagem de microscopia de iluminação estruturada (SIM). Em um conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, em que cada braço do sistema inclui um emissor de luz e um divisor de feixe (por exemplo, uma grade de difração transmissiva) tendo uma orientação fixa, específica com relação ao eixo óptico do sistema. Em um segundo conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de múltiplos divisores de feixe, onde um estágio de movimento linear é montado com múltiplos divisores de feixe tendo uma correspondente orientação fixa com relação ao eixo óptico do sistema. Em um terceiro conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, em que uma grade de difração bidimensional fixa é usada em combinação com uma roda de filtro espacial para projetar padrões de margem unidimensionais em uma amostra.The description provides structured illumination microscopy (SIM) imaging systems. In one set of implementations, a SIM imaging system may be implemented as a multi-arm SIM imaging system, wherein each arm of the system includes a light emitter and a beam splitter (e.g., a transmissive diffraction grating) having a fixed, specific orientation with respect to the optical axis of the system. In a second set of implementations, a SIM imaging system may be implemented as a multiple beamsplitter blade SIM imaging system, where a linear motion stage is assembled with multiple beamsplitters having a corresponding fixed orientation with respect to the optical axis of the system. In a third set of implementations, a SIM imaging system may be implemented as a standard angle spatial selection SIM imaging system, in which a fixed two-dimensional diffraction grating is used in combination with a rotation wheel. spatial filter to project one-dimensional margin patterns onto a sample.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOSCROSS REFERENCE WITH RELATED ORDERS

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 62/618.068 depositado em 16 de janeiro de 2018 e intitulado “Multi-Arm Structured Lightining Imaging”. Todo o conteúdo do pedido mencionado anteriormente é incorporado aqui por referência.[0001] The present application claims priority to US Provisional Patent Application No. 62/618,068 filed on January 16, 2018 and entitled “Multi-Arm Structured Lighting Imaging”. The entire contents of the aforementioned order are incorporated herein by reference.

FUNDAMENTOSFUNDAMENTALS

[0002] Microscopia de iluminação estruturada (SIM) descreve uma técnica através da qual luz espacialmente estruturada (isto é, padronizada) pode ser usada para formar imagem de uma amostra para aumentar a resolução lateral do microscópio em um fator de dois ou mais. Em alguns casos, durante a formação de imagem da amostra, três imagens de padrões de franjas da amostra são adquiridas em várias fases de padrão (por exemplo, 0°, 120°, e 240°), de forma que cada localização na amostra é exposta a uma faixa de intensidades de iluminação, com o procedimento repetido através da rotação da orientação de padrão em torno do eixo óptico para 3 ângulos separados (por exemplo 0°, 60° e 120°). As imagens capturadas (por exemplo, nove imagens) podem ser montadas para uma única imagem tendo uma largura de banda de frequência espacial estendida, que pode ser transformada em espaço real para gerar uma imagem tendo uma maior resolução do que uma capturada por um microscópio convencional.[0002] Structured Illumination Microscopy (SIM) describes a technique whereby spatially structured (i.e., patterned) light can be used to image a sample to increase the lateral resolution of the microscope by a factor of two or more. In some cases, during sample imaging, three images of sample fringe patterns are acquired at various pattern phases (e.g., 0°, 120°, and 240°), so that each location on the sample is exposed to a range of illumination intensities, with the procedure repeated by rotating the pattern orientation around the optical axis to 3 separate angles (e.g. 0°, 60° and 120°). The captured images (e.g., nine images) can be assembled into a single image having an extended spatial frequency bandwidth, which can be transformed into real space to generate an image having a higher resolution than that captured by a conventional microscope .

[0003] Em algumas implementações de sistemas de SIM correntes, um feixe de luz linearmente polarizado é direcionado através de um divisor de feixe óptico que divide o feixe em duas ou mais ordens separadas que podem ser combinadas e projetadas na amostra de imagem formada como um padrão de franjas de interferência com uma variação de intensidade senoidal. Grades de difração são exemplos de divisores de feixe que podem gerar feixes com um alto grau de coerência e ângulos de propagação estáveis. Quando dois tais feixes são combinados, a interferência entre eles pode criar um padrão de franjas que se repete regularmente uniforme onde o espaçamento é determinado por fatores incluindo o ângulo entre os feixes de interferência. Se mais do que dois feixes são combinados, o padrão resultante tipicamente contém uma mistura de espaçamentos de franjas, com o resultado de que a diferença entre a intensidade máxima e a intensidade mínima (também conhecida como a “profundidade de modulação”) é reduzida, tornando menos adequado para propósitos de SIM.[0003] In some implementations of current SIM systems, a linearly polarized beam of light is directed through an optical beam splitter that divides the beam into two or more separate orders that can be combined and projected onto the image sample formed as a pattern of interference fringes with a sinusoidal intensity variation. Diffraction gratings are examples of beam splitters that can generate beams with a high degree of coherence and stable propagation angles. When two such beams are combined, interference between them can create a uniform regularly repeating fringe pattern where the spacing is determined by factors including the angle between the interference beams. If more than two beams are combined, the resulting pattern typically contains a mixture of fringe spacings, with the result that the difference between the maximum intensity and minimum intensity (also known as the “modulation depth”) is reduced, making it less suitable for SIM purposes.

[0004] Em algumas implementações de sistemas de SIM correntes, a orientação do padrão projetado é controlada através da rotação do elemento de divisão de feixe em torno do eixo óptico, e a fase do padrão é ajustada através do movimento do elemento lateralmente pelo eixo. Em tais sistemas, uma grade de difração tipicamente é montada em um estágio de translação, que por sua vez é montado em um estágio de rotação. Adicionalmente, tais sistemas geralmente utilizam um polarizador linear para polarizar a luz emitida pela fonte de luz antes de ser recebida na grade.[0004] In some implementations of current SIM systems, the orientation of the projected pattern is controlled by rotating the beam splitting element about the optical axis, and the phase of the pattern is adjusted by moving the element laterally along the axis. In such systems, a diffraction grating typically is mounted on a translation stage, which in turn is mounted on a rotation stage. Additionally, such systems generally utilize a linear polarizer to polarize the light emitted by the light source before it is received at the grid.

SUMÁRIOSUMMARY

[0005] Implementações divulgadas aqui estão direcionadas aos sistemas de iluminação estruturada e métodos.[0005] Implementations disclosed here are directed to structured lighting systems and methods.

[0006] Em um primeiro conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, onde cada braço do sistema inclui um emissor de luz e a divisor de feixe (por exemplo, uma grade de difração transmissiva) tendo uma orientação fixa, específica com relação ao eixo óptico do sistema.[0006] In a first set of implementations, a SIM imaging system can be implemented as a multi-arm SIM imaging system, where each arm of the system includes a light emitter and a beam splitter ( for example, a transmissive diffraction grating) having a fixed, specific orientation with respect to the optical axis of the system.

[0007] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, o sistema inclui: um primeiro braço óptico, incluindo: um primeiro emissor de luz para emitir luz; e um primeiro divisor de feixe para dividir luz emitida pelo primeiro emissor de luz para projetar uma primeira pluralidade de franjas em um plano de uma amostra; e um segundo braço óptico, incluindo: um segundo emissor de luz para emitir luz; e um segundo divisor de feixe para dividir luz emitida pelo segundo emissor de luz para projetar uma segunda pluralidade de franjas do plano da amostra. Nesta implementação, o sistema também pode incluir um elemento óptico para combinar um caminho óptico do primeiro braço e o segundo braço. Adicionalmente, o sistema pode incluir um sensor de imagem para coletar luz emitida pela amostra. Em algumas implementações, a amostra pode incluir uma pluralidade de funcionalidades regularmente padronizadas em um arranjo retangular ou arranjo hexagonal.[0007] In an implementation of a multi-arm SIM imaging system, the system includes: a first optical arm, including: a first light emitter for emitting light; and a first beam splitter for dividing light emitted by the first light emitter to project a first plurality of fringes in a plane of a sample; and a second optical arm, including: a second light emitter for emitting light; and a second beam splitter for dividing light emitted by the second light emitter to project a second plurality of fringes from the sample plane. In this implementation, the system may also include an optical element for combining an optical path of the first arm and the second arm. Additionally, the system may include an image sensor to collect light emitted by the sample. In some implementations, the sample may include a plurality of regularly patterned features in a rectangular arrangement or hexagonal arrangement.

[0008] Em algumas implementações, o primeiro divisor de feixe inclui uma primeira grade de difração transmissiva e o segundo divisor de feixe inclui uma segunda grade de difração transmissiva. Em algumas implementações, o primeiro divisor de feixe inclui uma primeira grade de difração refletiva e o segundo divisor de feixe inclui uma segunda grade de difração refletiva. Em algumas implementações, cada um do primeiro e do segundo divisores de feixe inclui um cubo de divisor de feixe ou placa.[0008] In some implementations, the first beam splitter includes a first transmissive diffraction grating and the second beam splitter includes a second transmissive diffraction grating. In some implementations, the first beam splitter includes a first reflective diffraction grating and the second beam splitter includes a second reflective diffraction grating. In some implementations, the first and second beam splitters each include a beam splitter hub or plate.

[0009] Em algumas implementações, o primeiro e o segundo emissores de luz emitem luz não polarizada, e a primeira e a segunda grades de difração transmissiva são para difratar luz não polarizada emitida por um respectivo do primeiro e do segundo emissores de luz.[0009] In some implementations, the first and second light emitters emit unpolarized light, and the first and second transmissive diffraction gratings are for diffracting unpolarized light emitted by a respective of the first and second light emitters.

[00010] Em algumas implementações, o elemento óptico para combinar um caminho óptico da primeira pluralidade de franjas e da segunda pluralidade de franjas inclui um espelho com orifícios, com o espelho arranjado para refletir luz difratada pela primeira grade de difração e com os orifícios arranjados para passar através de pelo menos primeiras ordens de luz difratada pela segunda grade de difração. Em algumas implementações, o elemento óptico para combinar um caminho óptico do primeiro braço e o segundo braço inclui um divisor de feixe de polarização, onde a primeira grade de difração difrata luz polarizada verticalmente e onde a segunda grade de difração difrata luz polarizada horizontalmente.[00010] In some implementations, the optical element for combining an optical path of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes includes a mirror with holes, with the mirror arranged to reflect light diffracted by the first diffraction grating, and with the holes arranged to pass through at least first orders of light diffracted by the second diffraction grating. In some implementations, the optical element for combining an optical path of the first arm and the second arm includes a polarization beam splitter, where the first diffraction grating diffracts vertically polarized light and where the second diffraction grating diffracts horizontally polarized light.

[00011] Em algumas implementações, o sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços inclui um ou mais elementos ópticos para deslocar a fase da primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas.[00011] In some implementations, the multi-arm SIM imaging system includes one or more optical elements to shift the phase of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes.

[00012] Em algumas implementações, os um ou mais elementos ópticos para deslocar a fase da primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas incluem uma primeira janela óptica rotativa para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e uma segunda janela óptica rotativa para deslocar de fase a segunda pluralidade de franjas ópticas. Em algumas implementações, os um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas incluem um primeiro estágio de movimento linear para fazer a translação da primeira grade de difração e um segundo estágio de movimento linear para fazer a translação a segunda grade de difração. Em algumas implementações, os um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas incluem uma única janela óptica rotativa, onde a única janela óptica rotativa é posicionada após o espelho com orifícios em um caminho óptico para a amostra.[00012] In some implementations, the one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes include a first rotatable optical window for phase shifting the first plurality of fringes and a second rotatable optical window for phase shift the second plurality of optical fringes. In some implementations, the one or more optical elements for phase-shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes include a first linear motion stage for translating the first diffraction grating and a second linear motion stage for translating the first plurality of fringes and the second plurality of fringes. the translation the second diffraction grating. In some implementations, the one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes include a single rotatable optical window, wherein the single rotatable optical window is positioned after the pinhole mirror in an optical path to the sample.

[00013] Em algumas implementações, um eixo de rotação da única janela óptica rotativa é deslocado em cerca de 45 graus a partir de um eixo óptico de cada uma das grades.[00013] In some implementations, an axis of rotation of the single rotating optical window is offset by about 45 degrees from an optical axis of each of the gratings.

[00014] Em algumas implementações, a primeira pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da segunda pluralidade de franjas no plano de amostra em cerca de 90 graus.[00014] In some implementations, the first plurality of fringes is angularly offset from the second plurality of fringes in the sample plane by about 90 degrees.

[00015] Em algumas implementações, o sistema também inclui: uma lente objetiva para projetar cada uma da primeira pluralidade de franjas e da segunda pluralidade de franjas na amostra.[00015] In some implementations, the system also includes: an objective lens for projecting each of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes into the sample.

[00016] Em algumas implementações, o sistema também inclui: um ou mais bloqueadores de feixe óptico para bloquear zero ordens de luz emitida por cada uma da primeira e da segunda grades de difração. Em particular implementações, os um ou mais blocos de feixe óptico incluem uma grade de Bragg.[00016] In some implementations, the system also includes: one or more optical beam blockers to block zero orders of light emitted by each of the first and second diffraction gratings. In particular implementations, the one or more optical beam blocks include a Bragg grating.

[00017] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, um método inclui: ligar um primeiro braço óptico de um sistema de iluminação estruturada, o primeiro braço óptico compreendendo um primeiro emissor de luz para emitir luz e uma primeira grade de difração para difratar luz emitida pelo primeiro emissor de luz para projetar uma primeira pluralidade de franjas orientada em uma direção específica em um plano de uma amostra; capturar uma primeira pluralidade de imagens de fase da amostra, onde durante a captura da primeira pluralidade de imagens, as posições da primeira pluralidade de franjas são deslocadas do plano da amostra; ligar um segundo braço óptico do sistema de iluminação estruturada, o segundo braço óptico compreendendo um segundo emissor de luz para emitir luz e uma segunda grade de difração para difratar luz emitida pelo segundo emissor de luz para projetar uma segunda pluralidade de franjas do plano da amostra, onde a segunda pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da primeira pluralidade de franjas do plano da amostra; e capturar uma segunda pluralidade de imagens de fase da amostra iluminada com a segunda pluralidade de franjas, onde durante a captura da segunda pluralidade de franjas, as posições da segunda pluralidade de franjas são deslocadas do plano da amostra. Nas implementações deste método, a primeira grade de difração e a segunda grade de difração são grades de difração transmissiva, onde o sistema de iluminação estruturada inclui um espelho com orifícios para refletir luz difratada pela primeira grade de difração e para passar através de pelo menos primeiras ordens de luz difratada pela segunda grade de difração.[00017] In an implementation of a multi-arm SIM imaging system, a method includes: connecting a first optical arm of a structured lighting system, the first optical arm comprising a first light emitter for emitting light and a first diffraction grating for diffracting light emitted by the first light emitter to project a first plurality of fringes oriented in a specific direction in a plane of a sample; capturing a first plurality of phase images of the sample, wherein during capturing the first plurality of images, the positions of the first plurality of fringes are displaced from the plane of the sample; connecting a second optical arm of the structured illumination system, the second optical arm comprising a second light emitter for emitting light and a second diffraction grating for diffracting light emitted by the second light emitter to project a second plurality of fringes from the sample plane , wherein the second plurality of fringes is angularly displaced from the first plurality of fringes of the sample plane; and capturing a second plurality of phase images of the sample illuminated with the second plurality of fringes, wherein during capturing the second plurality of fringes, the positions of the second plurality of fringes are displaced from the plane of the sample. In implementations of this method, the first diffraction grating and the second diffraction grating are transmissive diffraction gratings, where the structured lighting system includes a mirror with holes for reflecting light diffracted by the first diffraction grating and for passing through at least first orders of light diffracted by the second diffraction grating.

[00018] Nas implementações, o método inclui adicionalmente: usar pelo menos a primeira pluralidade de imagens de fase capturadas e a segunda pluralidade de imagens em fase capturadas para reconstruir computacionalmente uma ou mais imagens tendo maior resolução do que cada uma da primeira e da segunda pluralidade de imagens em fase capturadas. Nas implementações, a primeira pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da segunda pluralidade de franjas no plano de amostra em cerca de 90 graus.[00018] In implementations, the method further includes: using at least the first plurality of captured phase images and the second plurality of captured phase images to computationally reconstruct one or more images having greater resolution than each of the first and second plurality of captured phase images. In the implementations, the first plurality of fringes is angularly offset from the second plurality of fringes in the sample plane by about 90 degrees.

[00019] Nas implementações, a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas são deslocadas em fase através da rotação de uma única janela óptica posicionada em um caminho óptico entre a amostra e cada uma da primeira e da segunda grades, onde um eixo de rotação da única janela óptica rotativa está deslocado a partir de um eixo óptico de cada uma das grades.[00019] In the implementations, the first plurality of fringes and the second plurality of fringes are phase-shifted through the rotation of a single optical window positioned in an optical path between the sample and each of the first and second gratings, where an axis of rotation of the single rotating optical window is offset from an optical axis of each of the gratings.

[00020] Nas implementações do método, o primeiro braço óptico é desligado e o segundo braço óptico do sistema de iluminação estruturada é ligado após capturar a primeira pluralidade de imagens de fase.[00020] In implementations of the method, the first optical arm is turned off and the second optical arm of the structured lighting system is turned on after capturing the first plurality of phase images.

[00021] Nas implementações do método, a primeira grade de difração e a segunda grade de difração são fixadas mecanicamente durante a captura da imagem.[00021] In implementations of the method, the first diffraction grating and the second diffraction grating are mechanically fixed during image capture.

[00022] Em um segundo conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de múltiplos divisores de feixe, onde um estágio de movimento linear é montado com múltiplos divisores de feixe tendo uma correspondente orientação fixa com relação ao eixo óptico do sistema.[00022] In a second set of implementations, a SIM imaging system can be implemented as a multiple beamsplitter blade SIM imaging system, where a linear motion stage is assembled with multiple beamsplitters. beam having a corresponding fixed orientation with respect to the optical axis of the system.

[00023] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de múltiplos divisores de feixe, o sistema inclui: um emissor de luz para emitir luz; um estágio de movimento linear montado com um primeiro divisor de feixe e um segundo divisor de feixe, onde o primeiro divisor de feixe é para dividir luz emitida pelo emissor de luz para projetar uma primeira pluralidade de franjas em um plano de uma amostra, e onde o segundo divisor de feixe é para dividir luz emitida pelo emissor de luz para projetar uma segunda pluralidade de franjas do plano da amostra; e um sensor de imagem para coletar luz emitida pela amostra. Nas implementações, o estágio de movimento linear é um estágio de movimento linear unidimensional, onde o estágio de movimento linear é para fazer a translação ao longo da uma dimensão para acoplar opticamente cada um do primeiro divisor de feixe e do segundo divisor de feixe com o emissor de luz, onde o primeiro divisor de feixe está adjacente com o segundo divisor de feixe ao longo da uma dimensão. Nas implementações, a primeira pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da segunda pluralidade de franjas no plano de amostra em cerca de 90 graus.[00023] In an implementation of a multiple beam splitter blade SIM imaging system, the system includes: a light emitter for emitting light; a linear motion stage mounted with a first beam splitter and a second beam splitter, wherein the first beam splitter is for splitting light emitted by the light emitter to project a first plurality of fringes onto a plane of a sample, and wherein the second beam splitter is for dividing light emitted by the light emitter to project a second plurality of fringes from the sample plane; and an image sensor to collect light emitted by the sample. In the implementations, the linear motion stage is a one-dimensional linear motion stage, where the linear motion stage is to translate along the one dimension to optically couple each of the first beam splitter and the second beam splitter with the light emitter, where the first beam splitter is adjacent with the second beam splitter along one dimension. In the implementations, the first plurality of fringes is angularly offset from the second plurality of fringes in the sample plane by about 90 degrees.

[00024] Nas implementações, o primeiro divisor de feixe inclui uma primeira grade de difração transmissiva e o segundo divisor de feixe inclui uma segunda grade de difração transmissiva. A primeira grade de difração e a segunda grade de difração podem estar angularmente deslocadas a partir de uma dimensão (isto é, giradas em torno da direção de propagação da luz). Em particular implementações, a primeira grade de difração e a segunda grade de difração são deslocadas angularmente a partir de uma dimensão em cerca de ±45 graus.[00024] In implementations, the first beam splitter includes a first transmissive diffraction grating and the second beam splitter includes a second transmissive diffraction grating. The first diffraction grating and the second diffraction grating may be angularly offset from one dimension (i.e., rotated about the direction of light propagation). In particular implementations, the first diffraction grating and the second diffraction grating are angularly displaced from one dimension by about ±45 degrees.

[00025] Em algumas implementações, a primeira grade de difração e a segunda grade de difração podem ser integradas com um único elemento óptico montado no estágio de movimento linear. Nas implementações onde as grades de difração são integradas com um único elemento óptico, o único elemento óptico pode incluir um primeiro lado padronizado com a primeira grade de difração e um segundo lado, adjacente ao primeiro lado, padronizado com a segunda grade de difração.[00025] In some implementations, the first diffraction grating and the second diffraction grating may be integrated with a single optical element mounted on the linear motion stage. In implementations where the diffraction gratings are integrated with a single optical element, the single optical element may include a first side patterned with the first diffraction grating and a second side, adjacent to the first side, patterned with the second diffraction grating.

[00026] Em algumas implementações, o sistema pode incluir adicionalmente: um ou mais bloqueadores de feixe óptico para bloquear zero ordens de luz emitida por cada uma da primeira e da segunda grades de difração.[00026] In some implementations, the system may additionally include: one or more optical beam blockers to block zero orders of light emitted by each of the first and second diffraction gratings.

[00027] Em algumas implementações, o sistema pode incluir adicionalmente: uma lente de projeção em um caminho óptico entre o estágio de movimento linear e a lente objetiva. A lente de projeção pode ser para projetar uma transformada de Fourier de cada uma da primeira grade de difração e da segunda grade de difração para uma pupila de entrada da objetiva.[00027] In some implementations, the system may additionally include: a projection lens in an optical path between the linear motion stage and the objective lens. The projection lens may be for projecting a Fourier transform from each of the first diffraction grating and the second diffraction grating to an entrance pupil of the objective.

[00028] Em algumas implementações, o sistema pode incluir adicionalmente um padrão de alinhamento formado em um componente montado no estágio de movimento linear, onde o padrão de alinhamento divide luz emitida pelo emissor de luz para projetar um padrão do plano da amostra para formar imagem do alinhamento. O padrão de alinhamento pode ser formado em um substrato incluindo pelo menos um da primeira grade de difração e da segunda grade de difração. O padrão projetado pode incluir linhas tendo uma frequência inferior do que a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas projetadas.[00028] In some implementations, the system may additionally include an alignment pattern formed on a component mounted on the linear motion stage, where the alignment pattern divides light emitted by the light emitter to project a pattern from the plane of the sample to form an image. of the alignment. The alignment pattern may be formed on a substrate including at least one of the first diffraction grating and the second diffraction grating. The projected pattern may include lines having a lower frequency than the first plurality of fringes and the second plurality of projected fringes.

[00029] Em algumas implementações, o sistema pode incluir adicionalmente: um modulador de fase óptica para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e segunda pluralidade de franjas que são projetadas do plano da amostra. Em tais implementações, o modulador de fase óptica pode ser um componente separado do estágio de movimento linear.[00029] In some implementations, the system may additionally include: an optical phase modulator to phase shift the first plurality of fringes and second plurality of fringes that are projected from the sample plane. In such implementations, the optical phase modulator may be a separate component from the linear motion stage.

[00030] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de múltiplos divisores de feixe, um método inclui: ligar um emissor de luz de um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada, o sistema de formação de imagem de iluminação estruturada incluindo um estágio de movimento linear unidimensional montado com uma primeira grade de difração e uma segunda grade de difração, onde o estágio de movimento linear é para fazer a translação ao longo de uma dimensão; fazer a translação do estágio de movimento linear ao longo da uma dimensão para deslocar de fase uma primeira pluralidade de franjas projetada pela primeira grade de difração em uma amostra; fazer a translação do estágio de movimento linear para acoplar opticamente a segunda grade de difração para o emissor de luz; e após acoplar opticamente a segunda grade de difração para o emissor de luz, fazer a translação do estágio de movimento linear ao longo da uma dimensão para deslocar de fase uma segunda pluralidade de franjas projetada pela segunda grade de difração na amostra. A primeira grade de difração e a segunda grade de difração pode ser grades de difração transmissiva e podem estar angularmente deslocadas a partir de a uma dimensão de translação. Por exemplo, a primeira grade de difração e a segunda grade de difração podem estar angularmente deslocadas a partir de a uma dimensão em cerca de ±45 graus.[00030] In an implementation of a multiple beam splitter blade SIM imaging system, a method includes: connecting a light emitter of a structured illumination imaging system, the imaging system of structured lighting including a one-dimensional linear motion stage mounted with a first diffraction grating and a second diffraction grating, wherein the linear motion stage is for translating along one dimension; translating the linear motion stage along the one dimension to phase shift a first plurality of fringes projected by the first diffraction grating onto a sample; translating the linear motion stage to optically couple the second diffraction grating to the light emitter; and after optically coupling the second diffraction grating to the light emitter, translating the linear motion stage along one dimension to phase shift a second plurality of fringes projected by the second diffraction grating onto the sample. The first diffraction grating and the second diffraction grating may be transmissive diffraction gratings and may be angularly offset from a translational dimension. For example, the first diffraction grating and the second diffraction grating may be angularly offset from a dimension by about ±45 degrees.

[00031] Nas implementações, o método pode incluir adicionalmente: fazer a translação do estágio de movimento linear ao longo da uma dimensão uma pluralidade de tempos para deslocamento de fase, uma pluralidade de tempos, a primeira pluralidade de franjas projetada pela primeira grade de difração na amostra; e após acoplar opticamente a segunda grade de difração para o emissor de luz, fazer a translação do estágio de movimento linear ao longo da uma dimensão uma pluralidade de tempos para deslocamento de fase, uma pluralidade de tempos, a segunda pluralidade de franjas projetada pela segunda grade de difração na amostra.[00031] In implementations, the method may additionally include: translating the linear motion stage along the one dimension a plurality of times for phase shift, a plurality of times, the first plurality of fringes projected by the first diffraction grating in the sample; and after optically coupling the second diffraction grating to the light emitter, translating the linear motion stage along the one dimension a plurality of times for phase shift, a plurality of times, the second plurality of fringes projected by the second diffraction grating on the sample.

[00032] Nas implementações, o método pode incluir adicionalmente: capturar uma imagem da amostra após cada tempo em que o estágio de movimento linear sofre translação para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas; e capturar uma imagem da amostra após cada tempo em que o estágio de movimento linear sofre translação para deslocar de fase a segunda pluralidade de franjas. As imagens capturadas podem ser usadas para reconstruir computacionalmente uma imagem tendo a maior resolução do que cada uma das imagens capturadas.[00032] In implementations, the method may additionally include: capturing an image of the sample after each time the linear motion stage is translated to phase shift the first plurality of fringes; and capturing an image of the sample after each time the linear motion stage is translated to phase shift the second plurality of fringes. The captured images can be used to computationally reconstruct an image having higher resolution than each of the captured images.

[00033] Nas implementações do método, o estágio de movimento linear sofre translação em torno da mesma distância ao longo de uma dimensão cada vez que a primeira pluralidade de franjas ou a segunda pluralidade de franjas são deslocadas de fase na amostra.[00033] In implementations of the method, the linear motion stage is translated about the same distance along one dimension each time the first plurality of fringes or the second plurality of fringes are phase shifted in the sample.

[00034] Em particular implementações, o movimento linear é o estágio que sofre translação entre cerca de 10 mm e 15 mm quando a segunda grade de difração é acoplada opticamente com o emissor de luz.[00034] In particular implementations, the linear motion is the stage that undergoes translation between about 10 mm and 15 mm when the second diffraction grating is optically coupled with the light emitter.

[00035] Em um terceiro conjunto de implementações, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, em que uma grade de difração bidimensional fixa é usada em combinação com uma roda de filtro espacial para projetar padrões de franjas unidimensionais em uma amostra.[00035] In a third set of implementations, a SIM imaging system can be implemented as a standard angle spatial selection SIM imaging system, in which a fixed two-dimensional diffraction grating is used in combination with a spatial filter wheel for projecting one-dimensional fringe patterns onto a sample.

[00036] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, o sistema inclui: um emissor de luz para emitir luz; uma grade de difração bidimensional para difratar luz emitida pelo emissor de luz para projetar uma primeira pluralidade de franjas orientada em uma primeira direção em um plano de amostra e para projetar uma segunda pluralidade de franjas orientada em uma segunda direção, perpendicular com a primeira direção, no plano de amostra; e uma roda de filtro espacial para passar através da luz difratada recebida a partir da grade de difração bidimensional em uma respectiva da primeira direção ou da segunda direção e bloquear luz em uma respectiva da primeira direção ou da segunda direção, a roda de filtro espacial compreendendo uma primeira pluralidade de aberturas e uma segunda pluralidade de aberturas ortogonal com a primeira pluralidade de aberturas. A primeira pluralidade de aberturas pode ser para passar através de luz difratada pela difração bidimensional na primeira direção e na segunda pluralidade de aberturas pode ser para passar através de luz difratada pela difração bidimensional na segunda direção.[00036] In an implementation of a standard angle spatial selection SIM imaging system, the system includes: a light emitter for emitting light; a two-dimensional diffraction grating for diffracting light emitted by the light emitter to project a first plurality of fringes oriented in a first direction onto a sample plane and to project a second plurality of fringes oriented in a second direction, perpendicular to the first direction, in the sample plan; and a spatial filter wheel for passing through diffracted light received from the two-dimensional diffraction grating in a respective of the first direction or the second direction and blocking light in a respective of the first direction or the second direction, the spatial filter wheel comprising a first plurality of openings and a second plurality of openings orthogonal to the first plurality of openings. The first plurality of openings may be for passing through light diffracted by two-dimensional diffraction in the first direction and the second plurality of openings may be for passing through light diffracted by two-dimensional diffraction in the second direction.

[00037] Em algumas implementações, o sistema inclui adicionalmente: um elemento de bloqueio de feixe para bloquear luz de ordem 0 transmitida pela grade de difração bidimensional. Em particular implementações, o elemento de bloqueio de feixe inclui um elemento óptico difrativo padronizado para refletir luz normal para o elemento e passar através da luz em outros ângulos.[00037] In some implementations, the system additionally includes: a beam blocking element to block 0th order light transmitted by the two-dimensional diffraction grating. In particular implementations, the beam blocking element includes a diffractive optical element patterned to reflect light normal to the element and pass through light at other angles.

[00038] Em algumas implementações, a roda de filtro espacial é para refletir ordens de difração de luz recebida a partir da grade de difração bidimensional que não são passadas.[00038] In some implementations, the spatial filter wheel is to reflect diffraction orders of light received from the two-dimensional diffraction grating that are not passed.

[00039] Em algumas implementações, a grade de difração bidimensional é uma grade de difração transmissiva. A grade de difração transmissiva pode ser descartada ou formada em uma face de uma óptica sólida que recebe luz do emissor de luz. Ângulos de dispersão da grade de difração transmissiva podem ser arranjados tal que luz de ordem 0 é bloqueada em um lado distante da óptica sólida. Em algumas implementações, a óptica sólida inclui faces anguladas para difratar e emitir primeiras ordens de luz difratada pela grade de difração bidimensional transmissiva. Em particular implementações, as faces anguladas incluem uma lente de focalização. Em algumas implementações, uma lente de projeção recebe luz emitida pela óptica sólida.[00039] In some implementations, the two-dimensional diffraction grating is a transmissive diffraction grating. The transmissive diffraction grating can be discarded or formed on a face of a solid optic that receives light from the light emitter. Scattering angles of the transmissive diffraction grating can be arranged such that light of order 0 is blocked on a far side of the solid optics. In some implementations, the solid optics include angled faces to diffract and emit first orders of light diffracted by the transmissive two-dimensional diffraction grating. In particular implementations, the angled faces include a focusing lens. In some implementations, a projection lens receives light emitted by solid optics.

[00040] Em algumas implementações, a grade de difração bidimensional é uma grade de difração bidimensional refletiva. A grade de difração bidimensional refletiva pode ser descartada ou formada em uma face da óptica sólida oposta a uma abertura da óptica sólida que recebe luz do emissor de luz. A óptica sólida pode incluir faces internas refletivas para refletir e emitir primeiras ordens de luz difratada pela grade de difração bidimensional refletiva através de faces de saída da óptica sólida. Em particular implementações, as faces de saída incluem uma lente de focalização difrativa. Em algumas implementações, uma lente de projeção é para receber luz emitida pela óptica sólida.[00040] In some implementations, the two-dimensional diffraction grating is a reflective two-dimensional diffraction grating. The reflective two-dimensional diffraction grating may be discarded or formed on a face of the solid optic opposite an aperture of the solid optic that receives light from the light emitter. The solid optics may include reflective internal faces to reflect and emit first orders of light diffracted by the reflective two-dimensional diffraction grating through exit faces of the solid optics. In particular implementations, the exit faces include a diffractive focusing lens. In some implementations, a projection lens is to receive light emitted by solid optics.

[00041] Em algumas implementações, o sistema inclui adicionalmente: um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas. Em particular implementações, os um ou mais elementos ópticos para deslocar a fase da primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas compreendem uma óptica de placa paralela inclinada em duas direções perpendiculares.[00041] In some implementations, the system additionally includes: one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes. In particular implementations, the one or more optical elements for shifting the phase of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes comprise parallel plate optics inclined in two perpendicular directions.

[00042] Em uma implementação de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, um método inclui: ligar um emissor de luz de um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada, o sistema de formação de imagem de iluminação estruturada incluindo uma grade de difração bidimensional; receber luz emitida pelo emissor de luz na grade de difração bidimensional para emitir a primeira luz difratada orientada em uma primeira direção e segunda luz difratada orientada em uma segunda direção perpendicular com a primeira direção; passar a primeira luz difratada através de uma primeira pluralidade de aberturas de uma roda de filtro espacial e bloquear a segunda luz difratada na roda de filtro espacial; projetar a primeira luz difratada que passa através da primeira pluralidade de orifícios as uma primeira pluralidade de franjas em um plano de amostra; e capturar uma primeira pluralidade de imagens de fase de luz emitida pela amostra, em que durante a captura da primeira pluralidade de imagens, a primeira pluralidade de franjas são deslocadas em fase no plano de amostra. A primeira pluralidade de franjas pode ser deslocada em fase movendo a amostra (por exemplo, usando um estágio de movimento), movendo as franjas projetadas, ou movendo tanto a amostra e quanto as franjas projetadas.[00042] In an implementation of a standard angle spatial selection SIM imaging system, a method includes: turning on a light emitter of a structured illumination imaging system, the illumination imaging system structured including a two-dimensional diffraction grating; receiving light emitted by the light emitter on the two-dimensional diffraction grating to emit first diffracted light oriented in a first direction and second diffracted light oriented in a second direction perpendicular to the first direction; passing the first diffracted light through a first plurality of apertures of a spatial filter wheel and blocking the second diffracted light in the spatial filter wheel; projecting the first diffracted light passing through the first plurality of holes or a first plurality of fringes onto a sample plane; and capturing a first plurality of phase images of light emitted by the sample, wherein during capturing the first plurality of images, the first plurality of fringes are phase-shifted in the sample plane. The first plurality of fringes can be phase-shifted by moving the sample (e.g., using a moving stage), moving the projected fringes, or moving both the sample and the projected fringes.

[00043] Nas implementações, o método inclui adicionalmente: rotar a roda de filtro espacial tal que a mesma passa a segunda luz difratada através de uma segunda pluralidade de aberturas da roda de filtro espacial e bloqueia a primeira luz difratada na roda de filtro espacial; projetar a segunda luz difratada que passa através da segunda pluralidade de orifícios as uma segunda pluralidade de franjas, ortogonal com a primeira pluralidade de franjas, no plano de amostra; e capturar uma segunda pluralidade de imagens de fase de luz emitida pela amostra, onde durante a captura da segunda pluralidade de imagens, a segunda pluralidade de franjas são deslocadas em fase no plano de amostra.[00043] In implementations, the method further includes: rotating the spatial filter wheel such that it passes the second diffracted light through a second plurality of apertures of the spatial filter wheel and blocks the first diffracted light in the spatial filter wheel; projecting the second diffracted light passing through the second plurality of holes into a second plurality of fringes, orthogonal to the first plurality of fringes, onto the sample plane; and capturing a second plurality of phase images of light emitted by the sample, wherein during capturing the second plurality of images, the second plurality of fringes are phase-shifted in the sample plane.

[00044] Em particular implementações do método, a grade de difração bidimensional é uma grade de difração bidimensional transmissiva formada em ou disposta sobre a face de uma óptica sólida, e o método inclui adicionalmente: bloquear luz de ordem 0 emitida pela grade de difração transmissiva em um lado da óptica sólida oposto à grade de difração transmissiva; e difratar e emitir, a partir de faces anguladas da óptica sólida, primeiras ordens de luz difratada pela grade de difração bidimensional transmissiva.[00044] In particular implementations of the method, the two-dimensional diffraction grating is a transmissive two-dimensional diffraction grating formed in or disposed on the face of a solid optic, and the method further includes: blocking 0th order light emitted by the transmissive diffraction grating on one side of the solid optics opposite the transmissive diffraction grating; and diffracting and emitting, from angled faces of the solid optics, first orders of light diffracted by the transmissive two-dimensional diffraction grating.

[00045] Em particular implementações do método, a grade de difração bidimensional é uma grade de difração bidimensional refletiva formada em ou disposta sobre a face de uma óptica sólida oposta a uma abertura da óptica sólida que recebe luz do emissor de luz, e o método inclui adicionalmente: refletir, nas faces da óptica sólida, primeiras ordens de luz difratada pela grade de difração bidimensional refletiva.[00045] In particular implementations of the method, the two-dimensional diffraction grating is a reflective two-dimensional diffraction grating formed in or disposed on the face of a solid optic opposite an aperture of the solid optic that receives light from the light emitter, and the method additionally includes: reflecting, on the faces of the solid optics, first orders of light diffracted by the reflective two-dimensional diffraction grating.

[00046] Outras funcionalidades e aspectos da tecnologia divulgada serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, por meio de exemplo, as funcionalidades de acordo com algumas implementações descritas aqui da tecnologia divulgada. O sumário não está intencionado a limitar o escopo de qualquer uma das invenções descritas aqui, o qual é definido pelas reivindicações e equivalentes.[00046] Other features and aspects of the disclosed technology will be apparent from the following detailed description, taken in conjunction with the accompanying drawings, which illustrate, by way of example, the features according to some implementations described here of the disclosed technology. The summary is not intended to limit the scope of any of the inventions described herein, which is defined by the claims and equivalents.

[00047] Deve ser percebido que todas as combinações dos conceitos anteriores (provido que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) são contempladas como sendo parte da matéria inventiva divulgada aqui. Em particular, todas as combinações da matéria inventiva reivindicada que aparecem no fim desta descrição são contempladas como sendo parte da matéria inventiva divulgada aqui.[00047] It should be understood that all combinations of the previous concepts (provided that such concepts are not mutually inconsistent) are contemplated as being part of the inventive subject matter disclosed herein. In particular, all combinations of the claimed inventive subject matter appearing at the end of this description are contemplated as being part of the inventive subject matter disclosed herein.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[00048] A presente descrição, de acordo com uma ou mais implementações, é descrita em detalhe com referência às seguintes figuras. As figuras são providas para os propósitos de ilustração apenas e meramente representam implementações de exemplo. Adicionalmente, deve ser notado que para a clareza e facilidade de ilustração, os elementos nas figuras não necessariamente estão desenhados em escala.[00048] The present description, according to one or more implementations, is described in detail with reference to the following figures. The figures are provided for illustration purposes only and merely represent example implementations. Additionally, it should be noted that for clarity and ease of illustration, the elements in the figures are not necessarily drawn to scale.

[00049] Algumas das figuras incluídas aqui ilustram várias implementações da tecnologia divulgada a partir de diferentes ângulos de observação. Apesar do texto descritivo anexo poder se referir a tais vistas como vistas de “topo,” “fundo” ou “lateral”, tais referências são meramente descritivas e não implicam ou necessitam que a tecnologia divulgada possa ser implementada ou usada em uma orientação espacial particular a menos que seja declarado explicitamente de outra forma.[00049] Some of the figures included here illustrate various implementations of the disclosed technology from different observation angles. Although the accompanying descriptive text may refer to such views as “top,” “bottom,” or “side” views, such references are merely descriptive and do not imply or require that the disclosed technology can be implemented or used in a particular spatial orientation. unless explicitly stated otherwise.

[00050] A FIG. 1 ilustra um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada que ilumina uma amostra com luz espacialmente estruturada de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00050] FIG. 1 illustrates a structured illumination imaging system that illuminates a sample with spatially structured light in accordance with some implementations described herein.

[00051] A FIG. 2 é um diagrama óptico ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de microscopia de iluminação estruturada (SIM) de dois braços, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00051] FIG. 2 is an optical diagram illustrating an example optical configuration of a two-arm structured illumination microscopy (SIM) imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00052] A FIG. 3 é um diagrama óptico ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00052] FIG. 3 is an optical diagram illustrating another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00053] A FIG. 4 é um diagrama óptico ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00053] FIG. 4 is an optical diagram illustrating another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00054] A FIG. 5 é um diagrama de fluxo operacional ilustrando um exemplo de método que pode ser realizado por um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços durante um ciclo de formação de imagem para usar luz estruturada para criar uma imagem de alta resolução, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00054] FIG. 5 is an operational flow diagram illustrating an example method that can be performed by a multi-arm SIM imaging system during an imaging cycle to use structured light to create a high-resolution image, in accordance with some implementations described here.

[00055] A FIG. 6 ilustra padrões de franjas de iluminação simplificada que podem ser projetados para o plano de uma amostra por uma grade vertical e grade horizontal de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços durante a captura da imagem, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00055] FIG. 6 illustrates simplified illumination fringe patterns that can be projected onto the plane of a sample by a vertical grid and horizontal grid of a two-arm SIM imaging system during image capture, in accordance with some implementations described herein. .

[00056] A FIG. 7 ilustra um exemplo de projeto experimental de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços que usa um divisor de feixe de polarização para iluminar uma grade vertical com luz polarizada de maneira vertical e a grade horizontal com luz polarizada de maneira horizontal, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00056] FIG. 7 illustrates an example experimental design of a two-arm SIM imaging system that uses a polarization beam splitter to illuminate a vertical grating with vertically polarized light and the horizontal grating with horizontally polarized light, so that according to some implementations described here.

[00057] A FIG. 8A ilustra uma imagem espelhada afocal e lâmina fluorescente capturada usando o exemplo de sistema de formação de imagem de SIM da FIG. 7, usando um microscópio 20x/0,75 NA.[00057] FIG. 8A illustrates an afocal mirror image and fluorescent slide captured using the example SIM imaging system of FIG. 7, using a 20x/0.75 NA microscope.

[00058] A FIG. 8B ilustra medições de modulação de franjas adquiridas usando o sistema da FIG. 7 com uma célula de fluxo frisada. O gráfico ilustra alterações típicas de intensidade de imagem do recurso durante um ciclo de ajuste de fase neste exemplo, quando o ângulo de placa paralela W2 da FIG. 7 é alterado.[00058] FIG. 8B illustrates fringe modulation measurements acquired using the system of FIG. 7 with a crimped flow cell. The graph illustrates typical feature image intensity changes during a phase adjustment cycle in this example, when the parallel plate angle W2 of FIG. 7 is changed.

[00059] A FIG. 9 ilustra outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00059] FIG. 9 illustrates another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system in accordance with some implementations described herein.

[00060] A FIG. 10A é um diagrama esquemático ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla em uma primeira posição de grade de difração, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00060] FIG. 10A is a schematic diagram illustrating an example optical configuration of a dual optical grating blade SIM imaging system in a first diffraction grating position, in accordance with some implementations described herein.

[00061] A FIG. 10B é um diagrama esquemático ilustrando um exemplo de configuração óptica do sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla da FIG. 10A em uma segunda posição de grade de difração, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00061] FIG. 10B is a schematic diagram illustrating an example optical configuration of the dual optical grating blade SIM imaging system of FIG. 10A in a second diffraction grating position, according to some implementations described here.

[00062] A FIG. 11 é um diagrama de fluxo operacional ilustrando um exemplo de método que pode ser realizado por um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica múltipla durante um ciclo de formação de imagem para usar luz estruturada para criar uma imagem de alta resolução, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00062] FIG. 11 is an operational flow diagram illustrating an example method that can be performed by a multiple optical grid blade SIM imaging system during an imaging cycle to use structured light to create a high resolution image, according to some implementations described here.

[00063] A FIG. 12 ilustra padrões de franjas de iluminação simplificada que podem ser projetados para o plano de uma amostra através de uma primeira grade de difração e uma segunda grade de difração de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla durante a captura da imagem, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00063] FIG. 12 illustrates simplified illumination fringe patterns that can be projected onto the plane of a sample through a first diffraction grating and a second diffraction grating of a dual optical grating blade SIM imaging system during image capture. image, according to some implementations described here.

[00064] A FIG. 13 é um diagrama ilustrando um exemplo de configuração de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00064] FIG. 13 is a diagram illustrating an example dual optical grating blade SIM imaging configuration in accordance with some implementations described herein.

[00065] A FIG. 14 é um diagrama esquemático ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00065] FIG. 14 is a schematic diagram illustrating an example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00066] A FIG. 15 é um diagrama esquemático ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00066] FIG. 15 is a schematic diagram illustrating another example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00067] A FIG. 16 é um diagrama esquemático ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00067] FIG. 16 is a schematic diagram illustrating another example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00068] A FIG. 17 mostra um exemplo de um padrão de alinhamento que pode ser usado em algumas implementações de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica múltipla.[00068] FIG. 17 shows an example of an alignment pattern that may be used in some implementations of a multiple optical grating blade SIM imaging system.

[00069] A FIG. 18 ilustra uma amostra que pode ser formada sobre um conjunto de sensor de imagem de um sistema de formação de imagem de SIM, de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00069] FIG. 18 illustrates a sample that can be formed on an image sensor assembly of a SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein.

[00070] A FIG. 19 ilustra alguns componentes de um exemplo de sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla de acordo com algumas implementações descritas aqui.[00070] FIG. 19 illustrates some components of an example dual optical grating blade SIM imaging system in accordance with some implementations described herein.

[00071] As figuras não são exaustivas e não limitam a presente descrição à forma precisa divulgada.[00071] The figures are not exhaustive and do not limit the present description to the precise form disclosed.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[00072] Como usado aqui para se referir à luz difratada por uma grade de difração, o termo “ordem” ou “número de ordem” está intencionado a significar o número de comprimentos de onda inteiros que representa a diferença de comprimento de caminho de luz a partir de adjacentes fendas ou estruturas da grade de difração para interferência construtiva. A interação de um feixe de luz incidente em uma série repetida de estruturas de grade ou outras estruturas de divisão de feixe pode redirecionar ou difratar porções do feixe de luz para direções angulares previsíveis a partir do feixe original. O termo “ordem zero” ou “máximo de ordem zero” está intencionado a se referir à franja de brilho central emitida por uma grade de difração em que não existe difração. O termo “primeira ordem” está intencionado a se referir às duas franjas brilhantes difratadas para ambos os lados da franja de ordem zero, onde a diferença de comprimento de caminho é de ± 1 comprimentos de onda. Maiores ordens são difratadas para maiores ângulos a partir do feixe original. As propriedades da grade podem ser manipuladas para controlar quanto da intensidade do feixe é direcionada para várias ordens. Por exemplo, uma grade de fase pode ser fabricada para maximizar a transmissão das ordens ±1 e minimizar a transmissão do feixe de ordem zero.[00072] As used herein to refer to light diffracted by a diffraction grating, the term “order” or “order number” is intended to mean the number of whole wavelengths that represents the light path length difference. from adjacent slits or diffraction grating structures for constructive interference. The interaction of an incident light beam on a repeating series of grating structures or other beam-splitting structures can redirect or diffract portions of the light beam into angular directions predictable from the original beam. The term “zero order” or “zero order maximum” is intended to refer to the central bright fringe emitted by a diffraction grating in which there is no diffraction. The term “first order” is intended to refer to the two bright fringes diffracted to either side of the zero-order fringe, where the path length difference is ±1 wavelengths. Higher orders are diffracted to greater angles from the original beam. The grating properties can be manipulated to control how much of the beam intensity is directed to various orders. For example, a phase grating can be fabricated to maximize ±1 order transmission and minimize zero order beam transmission.

[00073] Como usado aqui para se referir a uma amostra, o termo "recurso" está intencionado a significar um ponto ou área em um padrão que pode ser distinto a partir de outros pontos ou áreas de acordo com a localização relativa. Um recurso individual pode incluir uma ou mais moléculas de um tipo particular. Por exemplo, um recurso pode incluir uma molécula de ácido nucleico alvo única tendo uma sequência particular ou um recurso pode incluir várias moléculas de ácido nucleico tendo a mesma sequência (e/ou sequência complementar, do mesmo).[00073] As used herein to refer to a sample, the term "feature" is intended to mean a point or area in a pattern that can be distinguished from other points or areas according to relative location. An individual resource may include one or more molecules of a particular type. For example, a resource may include a single target nucleic acid molecule having a particular sequence or a resource may include multiple nucleic acid molecules having the same sequence (and/or complementary sequence thereof).

[00074] Como usado aqui, o termo "plano xy" está intencionado a significar uma área bidimensional definida pelos eixos de linha reta x e y em um sistema de coordenadas Cartesianas. Quando usado em referência a um detector e um objeto observado pelo detector, a área pode ser adicionalmente especificada como sendo ortogonal com o eixo de feixe, ou a direção de observação entre o detector e objeto sendo detectado.[00074] As used herein, the term "xy plane" is intended to mean a two-dimensional area defined by the straight line x and y axes in a Cartesian coordinate system. When used in reference to a detector and an object observed by the detector, the area may be further specified as being orthogonal to the beam axis, or the observation direction between the detector and object being detected.

[00075] Como usado aqui, o termo "coordenada z" está intencionado a significar informação que especifica a localização de um ponto, linha ou área ao longo de um eixo que é ortogonal com um plano xy. Em particular implementações, o eixo z é ortogonal com uma área de um objeto que é observado por um detector. Por exemplo, a direção de foco para um sistema óptico pode ser especificada ao longo do eixo z.[00075] As used herein, the term "z coordinate" is intended to mean information that specifies the location of a point, line or area along an axis that is orthogonal to an xy plane. In particular implementations, the z-axis is orthogonal to an area of an object that is observed by a detector. For example, the focus direction for an optical system can be specified along the z-axis.

[00076] Como usado aqui, o termo “acoplado opticamente” está intencionado a se referir a um elemento sendo adaptado para transmitir luz para outro elemento diretamente ou indiretamente.[00076] As used herein, the term “optically coupled” is intended to refer to an element being adapted to transmit light to another element directly or indirectly.

[00077] Como notado acima, implementações pré- existentes de sistemas de SIM montam uma grade de difração em um estágio de translação, que por sua vez é montado em um estágio de rotação. Adicionalmente, tais sistemas geralmente usam um polarizador linear para polarizar a fonte de luz antes de ser recebido pela grade. Este projeto pré-existente sofre a partir de várias desvantagens para o uso em um sistema de microscópio de alto rendimento. Primeiramente, como um estágio de rotação deve girar a grade várias vezes durante a aquisição de um conjunto de imagem (por exemplo, três times), isto desacelera a velocidade do instrumento e afeta a sua estabilidade. Tipicamente, os estágios de grade mais rápidos podem rotar estão na ordem de dezenas de milissegundos (ms), o que impõe um limite de rendimento mecânico na velocidade de formação de imagem. Por segundo, o projeto pré-existente tem pouca repetibilidade já que tolerâncias mecânicas do estágio de rotação limitam a repetibilidade dos padrões de iluminação estruturados a partir de um conjunto de aquisição de imagem para o próximo. Isto também impõe um maior custo no sistema de SIM já que requer um estágio de rotação muito preciso.[00077] As noted above, pre-existing implementations of SIM systems mount a diffraction grating on a translation stage, which in turn is mounted on a rotation stage. Additionally, such systems generally use a linear polarizer to polarize the light source before it is received by the grating. This pre-existing design suffers from several disadvantages for use in a high-throughput microscope system. Firstly, as a rotation stage must rotate the grid several times during the acquisition of a set of images (e.g., three times), this slows down the speed of the instrument and affects its stability. Typically, the fastest grating stages can rotate are on the order of tens of milliseconds (ms), which imposes a mechanical throughput limit on image formation speed. Second, the pre-existing design has poor repeatability as mechanical tolerances of the rotation stage limit the repeatability of structured illumination patterns from one image acquisition set to the next. This also imposes a higher cost on the SIM system as it requires a very precise rotation stage.

[00078] Por terceiro, o projeto de SIM pré-existente não é o mais confiável para o uso em um sistema de microscópio de alto rendimento por causa do número de atuações que são feitas para rotar a grade. Por exemplo, se um conjunto de imagem de SIM é adquirido a cada segundo, o estágio de rotação pode requisitar de milhões de dezenas de milhões de atuações por ano. Por quarto, o projeto de SIM pré-existente possui baixa eficiência ótica já que o polarizador linear bloqueia pelo menos 50% da luz recebida na grade.[00078] Third, the pre-existing SIM design is not the most reliable for use in a high-throughput microscope system because of the number of actuations that are made to rotate the grid. For example, if a set of SIM images are acquired every second, the spin stage may require millions to tens of millions of actuations per year. Fourth, the pre-existing SIM design has low optical efficiency as the linear polarizer blocks at least 50% of the light received at the grid.

[00079] Para tal fim, implementações da tecnologia divulgada aqui são direcionadas aos sistemas e métodos de SIM aprimorados.[00079] To this end, implementations of the technology disclosed herein are directed toward improved SIM systems and methods.

[00080] De acordo com um primeiro conjunto de implementações da tecnologia divulgada aqui, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, em que cada braço do sistema inclui um emissor de luz e a divisor de feixe (por exemplo, uma grade de difração transmissiva) tendo uma orientação fixa, específica com relação ao eixo óptico do sistema. De acordo com estas implementações, os divisores de feixe no sistema de formação de imagem de SIM são rotativamente fixados (isto é, não necessitam de rotação mecânica), o que pode prover velocidade de sistema aprimorada, confiabilidade e repetibilidade. Para os sistemas onde os objetos tendo a imagem formada são orientados primariamente ao longo de 2 eixos perpendiculares (isto é vertical e horizontal), é possível alcançar resolução espacial aprimorada usando 2 ângulos padrão, em vez de 3 ângulos tipicamente usados para objetos orientados de maneira aleatória. Em particular implementações, o sistema pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços incluindo uma grade vertical fixa e uma grade horizontal fixa para projetar respectivos padrões de franjas em uma amostra de imagem formada. Outros pares de gradeamento ortogonal e ângulos padrão podem ser usados, provido que eles são alinhados com a orientação dos objetos de amostra. Adicionalmente, o sistema pode incluir um espelho com orifícios para combinar os dois braços no caminho óptico de uma maneira sem perdas.[00080] According to a first set of implementations of the technology disclosed herein, a SIM imaging system may be implemented as a multi-arm SIM imaging system, wherein each arm of the system includes an emitter of light and the beam splitter (e.g., a transmissive diffraction grating) having a specific, fixed orientation with respect to the optical axis of the system. According to these implementations, the beam splitters in the SIM imaging system are rotationally fixed (i.e., do not require mechanical rotation), which can provide improved system speed, reliability and repeatability. For systems where imaged objects are oriented primarily along 2 perpendicular axes (i.e. vertical and horizontal), it is possible to achieve improved spatial resolution by using 2 standard angles, rather than the 3 angles typically used for so-oriented objects. Random. In particular implementations, the system may be implemented as a two-arm SIM image formation system including a fixed vertical grid and a fixed horizontal grid for projecting respective fringe patterns onto a formed image sample. Other pairs of orthogonal grids and standard angles can be used, provided they are aligned with the orientation of the sample objects. Additionally, the system may include a mirror with holes to combine the two arms into the optical path in a lossless manner.

[00081] De acordo com um segundo conjunto de implementações da tecnologia divulgada aqui, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de múltiplos divisores de feixe, onde um estágio de movimento linear é montado com uma pluralidade de divisores de feixe (por exemplo, grades de difração) tendo uma correspondente orientação fixa com relação ao eixo óptico do sistema. Em particular implementações, o sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla em que todos os deslocamentos de fase ou rotações do padrão de grade projetado na amostra de imagem formada podem ser feitos através da translação linear de um estágio de movimento ao longo de um único eixo de movimento, para selecionar uma de duas grades ou para efetuar um deslocamento de fase do padrão gerado por uma grade selecionada. Em tais implementações, apenas um único braço óptico tendo um único emissor e único estágio de movimento linear é necessário para iluminar uma amostra, o que pode prover vantagens do sistema tais como reduzir o número de partes móveis do sistema para aprimorar a velocidade, a complexidade e o custo. Adicionalmente, em tais implementações, a ausência de um polarizador pode prover a vantagem de alta eficiência óptica.[00081] According to a second set of implementations of the technology disclosed herein, a SIM imaging system can be implemented as a multiple beam splitter blade SIM imaging system, wherein a linear motion stage is assembled with a plurality of beam splitters (e.g., diffraction gratings) having a corresponding fixed orientation with respect to the optical axis of the system. In particular implementations, the SIM imaging system may be implemented as a dual optical grating sheet SIM imaging system in which any phase shifts or rotations of the projected grating pattern on the formed image sample may be be done by linearly translating a motion stage along a single motion axis, to select one of two grids, or to phase shift the pattern generated by a selected grid. In such implementations, only a single optical arm having a single emitter and single stage of linear motion is required to illuminate a sample, which can provide system advantages such as reducing the number of moving parts of the system to improve speed, complexity and the cost. Additionally, in such implementations, the absence of a polarizer can provide the advantage of high optical efficiency.

[00082] De acordo com um terceiro conjunto de implementações da tecnologia divulgada aqui, um sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, em que uma grade de difração bidimensional fixa é usada em combinação com uma roda de filtro espacial para projetar padrões de difração unidimensionais em uma amostra. Em tais implementações, os componentes ópticos primários do sistema de formação de imagem podem permanecer estacionários, o que pode aprimorar a estabilidade do sistema óptico (e do padrão de iluminação) e minimizar o peso, a saída de vibração e o custo dos elementos móveis do sistema.[00082] According to a third set of implementations of the technology disclosed herein, a SIM imaging system can be implemented as a standard angle spatial selection SIM imaging system, wherein a two-dimensional diffraction grating fixed is used in combination with a spatial filter wheel to project one-dimensional diffraction patterns onto a sample. In such implementations, the primary optical components of the imaging system can remain stationary, which can improve the stability of the optical system (and illumination pattern) and minimize the weight, vibration output, and cost of moving elements of the imaging system. system.

[00083] Antes de descrever várias implementações dos sistemas e métodos divulgados aqui, é útil descrever um exemplo de ambiente com o qual a tecnologia divulgada aqui pode ser implementada. Tal exemplo de ambiente é aquele de um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada 100, ilustrado na FIG. 1, que ilumina uma amostra com luz espacialmente estruturada. Por exemplo, o sistema 100 pode ser um sistema de microscopia de fluorescência de iluminação estruturada que usa luz de excitação espacialmente estruturada para formar imagem de uma amostra biológica.[00083] Before describing various implementations of the systems and methods disclosed herein, it is useful to describe an example environment with which the technology disclosed herein may be implemented. Such an example environment is that of a structured lighting imaging system 100, illustrated in FIG. 1, which illuminates a sample with spatially structured light. For example, system 100 may be a structured illumination fluorescence microscopy system that uses spatially structured excitation light to image a biological sample.

[00084] No exemplo da FIG. 1, um emissor de luz 150 é configurado para emitir um feixe de luz que é colimado pela lente de colimação 151. A luz colimada é estruturada (padronizada) pelo conjunto óptico de estruturação de luz 155 e direcionada pelo espelho dicroico 160 através da lente objetiva 142 para uma amostra de um recipiente de amostra 110, que é posicionado em um estágio de movimento 170. No caso de uma amostra fluorescente, a amostra fica fluorescente em resposta à luz de excitação estruturada, e a luz resultante é coletada pela lente objetiva 142 e direcionada para um sensor de imagem do sistema de câmera 140 para detectar a fluorescência.[00084] In the example of FIG. 1, a light emitter 150 is configured to emit a beam of light that is collimated by the collimating lens 151. The collimated light is structured (patterned) by the light-structuring optical assembly 155 and directed by the dichroic mirror 160 through the objective lens 142 for a sample from a sample container 110, which is positioned on a moving stage 170. In the case of a fluorescent sample, the sample fluoresces in response to structured excitation light, and the resulting light is collected by objective lens 142 and directed to an image sensor of the camera system 140 to detect the fluorescence.

[00085] O conjunto óptico de estruturação de luz 155 em várias implementações, adicionalmente descrito aqui, inclui uma ou mais grades de difração óptica ou outros elementos de divisão de feixe (por exemplo, um cubo de divisor de feixe ou placa) para gerar um padrão de luz (por exemplo, franjas, tipicamente sinusoidal) que é projetado para amostras de um recipiente de amostra 110. As grades de difração podem ser grades refletivas ou transmissivas unidimensionais ou bidimensionais. As grades de difração podem ser grades de amplitude senoidal ou grades de fase senoidal.[00085] The optical light structuring assembly 155 in various implementations, further described herein, includes one or more optical diffraction gratings or other beam splitting elements (e.g., a beam splitter cube or plate) to generate a light pattern (e.g., fringes, typically sinusoidal) that is designed for samples from a sample container 110. Diffraction gratings can be one-dimensional or two-dimensional reflective or transmissive gratings. Diffraction gratings can be sinusoidal amplitude gratings or sinusoidal phase gratings.

[00086] Como descrito adicionalmente abaixo com referência às implementações particulares, no sistema 100 as grades de difração não necessitam um estágio de rotação como o sistema de microscopia de iluminação estruturada típico de sistemas pré-existentes discutidos acima. Em algumas implementações, as grades de difração podem ser fixadas durante a operação do sistema de formação de imagem (isto é, não necessitam de movimento linear ou rotativo). Por exemplo, em uma implementação particular, adicionalmente descrita abaixo, as grades de difração podem incluir duas grades de difração transmissiva unidimensionais fixas orientadas perpendiculares entre si (por exemplo, uma grade de difração horizontal e grade de difração vertical).[00086] As further described below with reference to particular implementations, in system 100 the diffraction gratings do not require a rotation stage like the structured illumination microscopy system typical of pre-existing systems discussed above. In some implementations, the diffraction gratings may be fixed during operation of the imaging system (i.e., do not require linear or rotary motion). For example, in a particular implementation, further described below, the diffraction gratings may include two fixed one-dimensional transmissive diffraction gratings oriented perpendicular to each other (e.g., a horizontal diffraction grating and vertical diffraction grating).

[00087] Como ilustrado no exemplo da FIG. 1, conjunto óptico de estruturação de luz 155 emite as primeiras ordens dos feixes de luz difratados (por exemplo, m = ± 1 ordens) enquanto bloqueia ou minimiza todas as outras ordens, incluindo as ordens zero. No entanto, em implementações alternativas, ordens de luz adicionais podem ser projetadas para a amostra.[00087] As illustrated in the example of FIG. 1, optical light structuring assembly 155 emits the first orders of the diffracted light beams (e.g., m = ± 1 orders) while blocking or minimizing all other orders, including the zero orders. However, in alternative implementations, additional light orders can be projected onto the sample.

[00088] Durante cada ciclo de formação de imagem, sistema de formação de imagem 100 utiliza o conjunto óptico de estruturação de luz 155 para adquirir uma pluralidade de imagens em várias fases, com o padrão de franjas deslocado lateralmente na direção de modulação (por exemplo, no plano x-y e perpendicular com as franjas), com este procedure repetido uma ou mais vezes através da rotação da orientação de padrão em torno do eixo óptico (isto é, com relação ao plano x-y da amostra). As imagens capturadas então podem ser reconstruídas computacionalmente para gerar uma imagem de resolução mais alta (por exemplo, uma imagem tendo cerca de duas vezes a resolução espacial lateral de imagens individuais).[00088] During each image formation cycle, image formation system 100 utilizes light structuring optical assembly 155 to acquire a plurality of images in various phases, with the fringe pattern shifted laterally in the modulation direction (e.g. , in the x-y plane and perpendicular to the fringes), with this procedure repeated one or more times by rotating the pattern orientation around the optical axis (i.e., with respect to the x-y plane of the sample). The captured images can then be computationally reconstructed to generate a higher resolution image (e.g., an image having about twice the lateral spatial resolution of individual images).

[00089] No sistema 100, o emissor de luz 150 pode ser um emissor de luz incoerente (por exemplo, emitir feixes de luz emitidos por um ou mais diodos de excitação) , ou um emissor de luz coerente tal como o emissor de luz emitida por um ou mais lasers ou diodos de laser. Como ilustrado no exemplo do sistema 100, o emissor de luz 150 inclui uma fibra óptica 152 para guiar um feixe óptico a ser emitido. No entanto, outras configurações de um emissor de luz 150 podem ser usadas. Nas implementações que usam iluminação estruturada em um sistema de formação de imagem de múltiplos canais (por exemplo, um microscópio de fluorescência de múltiplos canais usando múltiplos comprimentos de onda da luz), a fibra óptica 152 opticamente pode acoplar com uma pluralidade de diferentes fontes de luz (não mostrado), cada fonte de luz emitindo luz de um diferente comprimento de onda. Apesar de o sistema 100 ser ilustrado como tendo a single emissor de luz 150, em algumas implementações múltiplos emissores de luz 150 podem ser incluídos. Por exemplo, múltiplos emissores de luz podem ser incluídos no caso de um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada que usa múltiplos braços, adicionalmente discutido abaixo.[00089] In system 100, the light emitter 150 may be an incoherent light emitter (e.g., emitting beams of light emitted by one or more excitation diodes), or a coherent light emitter such as the emitted light emitter by one or more lasers or laser diodes. As illustrated in the example system 100, the light emitter 150 includes an optical fiber 152 for guiding an optical beam to be emitted. However, other configurations of a light emitter 150 may be used. In implementations that use structured illumination in a multi-channel imaging system (e.g., a multi-channel fluorescence microscope using multiple wavelengths of light), the optical fiber 152 can optically couple with a plurality of different light sources. light (not shown), each light source emitting light of a different wavelength. Although system 100 is illustrated as having a single light emitter 150, in some implementations multiple light emitters 150 may be included. For example, multiple light emitters may be included in the case of a structured lighting imaging system that uses multiple arms, further discussed below.

[00090] Em algumas implementações, o sistema 100 pode incluir uma lente de projeção 156 que pode incluir um elemento de lente para se articular ao longo do eixo z para ajustar o caminho e a forma do feixe estruturado. Por exemplo, um componente da lente de projeção pode ser articulado para levar em conta uma faixa de espessuras de amostra (por exemplo, diferentes espessuras de vidro de cobertura) da amostra no recipiente 110.[00090] In some implementations, the system 100 may include a projection lens 156 that may include a lens element to pivot along the z axis to adjust the path and shape of the structured beam. For example, a projection lens component may be pivoted to account for a range of sample thicknesses (e.g., different cover glass thicknesses) of the sample in container 110.

[00091] No exemplo do sistema 100, o dispositivo ou módulo de distribuição de fluido 190 pode direcionar o fluxo de reagentes (por exemplo, nucleotídeos marcados de maneira fluorescente, tampões, enzimas, reagentes de clivagem, etc.) para o (e através do) recipiente de amostra 110 e válvula de resíduo 120. O recipiente de amostra 110 pode incluir um ou mais substratos em que as amostras são providas. Por exemplo, no caso de um sistema para analisar um grande número de diferentes sequências de ácido nucleico, recipiente de amostra 110 pode incluir um ou mais substratos em que ácidos nucleicos a ser sequenciados estão ligados, anexados ou associados. O substrato pode incluir qualquer substrato inerte ou matriz em que os ácidos nucleicos podem ser anexados, por exemplo, tal como superfícies de vidro, superfícies de plástico, látex, dextrana, superfícies de poliestireno, superfícies de polipropileno, géis de poliacrilamida, superfícies de ouro, e wafers de silício. Em algumas aplicações, o substrato está dentro de um canal ou outra área em uma pluralidade de localizações formadas em uma matriz ou arranjo através de um recipiente de amostra 110. O sistema 100 também pode incluir um atuador de estação de temperatura 130 e aquecedor/resfriador 135 que pode opcionalmente regular a temperatura de condições dos fluidos dentro de um recipiente de amostra 110.[00091] In the example of system 100, the fluid delivery device or module 190 may direct the flow of reagents (e.g., fluorescently labeled nucleotides, buffers, enzymes, cleavage reagents, etc.) to (and through) the do) sample container 110 and waste valve 120. The sample container 110 may include one or more substrates on which samples are provided. For example, in the case of a system for analyzing a large number of different nucleic acid sequences, sample container 110 may include one or more substrates on which nucleic acids to be sequenced are linked, attached or associated. The substrate may include any inert substrate or matrix to which nucleic acids can be attached, for example, such as glass surfaces, plastic surfaces, latex, dextran, polystyrene surfaces, polypropylene surfaces, polyacrylamide gels, gold surfaces. , and silicon wafers. In some applications, the substrate is within a channel or other area at a plurality of locations formed in an array or array across a sample container 110. The system 100 may also include a temperature station actuator 130 and heater/cooler. 135 which may optionally regulate the temperature of fluid conditions within a sample container 110.

[00092] Em particular implementações, um recipiente de amostra 110 pode ser implementado como uma célula de fluxo padronizada incluindo uma placa de cobertura translúcida, um substrato, e um líquido contido entre eles, e uma amostra biológica pode ser localizada em uma superfície interior da placa de cobertura translúcida ou uma superfície interior do substrato. A célula de fluxo pode incluir um grande número (por exemplo, milhares, milhões, ou bilhões) de poços ou regiões que são padronizados para um arranjo definido (por exemplo, um arranjo hexagonal, arranjo retangular, etc.) para o substrato. Cada região pode formar um agrupamento (por exemplo, um agrupamento monoclonal) de uma amostra biológica tal como DNA, RNA, ou outro material genomico que pode ser sequenciado, por exemplo, usando sequenciamento por síntese. A célula de fluxo pode ser adicionalmente dividida para um número de pistas espaçadas (por exemplo, oito pistas), cada pista incluindo um arranjo hexagonal de agrupamentos. Exemplos de células de fluxo que podem ser usadas nas implementações divulgadas aqui são descritas na Patente dos EUA No. 8.778.848.[00092] In particular implementations, a sample container 110 may be implemented as a patterned flow cell including a translucent cover plate, a substrate, and a liquid contained therebetween, and a biological sample may be located on an interior surface of the translucent cover plate or an interior surface of the substrate. The flow cell may include a large number (e.g., thousands, millions, or billions) of wells or regions that are patterned to a defined arrangement (e.g., a hexagonal arrangement, rectangular arrangement, etc.) for the substrate. Each region can form a cluster (e.g., a monoclonal cluster) of a biological sample such as DNA, RNA, or other genomic material that can be sequenced, for example, using sequencing by synthesis. The flow cell may be further divided into a number of closely spaced lanes (e.g., eight lanes), each lane including a hexagonal array of clusters. Examples of flow cells that can be used in the implementations disclosed herein are described in US Patent No. 8,778,848.

[00093] O recipiente de amostra 110 pode ser montado em um estágio de amostra 170 para prover movimento e alinhamento do recipiente de amostra 110 com relação à lente objetiva 142. O estágio de amostra pode ter um ou mais atuadores para permitir que ele se mova em qualquer uma de três dimensões. Por exemplo, em termos do sistema de coordenadas Cartesianas, os atuadores podem ser providos para permitir que o estágio se mova nas direções X, Y e Z com relação à lente objetiva. Isto pode permitir que uma ou mais localizações de amostra no recipiente de amostra 110 sejam posicionadas em alinhamento óptico com a lente objetiva 142. O movimento do estágio de amostra 170 com relação à lente objetiva 142 pode ser alcançado movendo o estágio de amostra em si, a lente objetiva, algum outro componente do sistema de formação de imagem, ou qualquer combinação dos anteriores. Em algumas implementações, o movimento do estágio de amostra 170 pode ser implementado durante a formação de imagem de iluminação estruturada para mover franjas de iluminação estruturada com relação à amostra para alterar as fases. Implementações adicionais também podem incluir mover todo o sistema de formação de imagem sobre uma amostra estacionária. Alternativamente, o recipiente de amostra 110 pode ser fixado durante a formação de imagem.[00093] The sample container 110 may be mounted on a sample stage 170 to provide movement and alignment of the sample container 110 with respect to the objective lens 142. The sample stage may have one or more actuators to allow it to move in any of three dimensions. For example, in terms of the Cartesian coordinate system, actuators may be provided to allow the stage to move in the X, Y, and Z directions with respect to the objective lens. This may allow one or more sample locations in the sample container 110 to be positioned in optical alignment with the objective lens 142. Movement of the sample stage 170 with respect to the objective lens 142 may be achieved by moving the sample stage itself, the objective lens, some other component of the imaging system, or any combination of the above. In some implementations, movement of sample stage 170 may be implemented during structured lighting imaging to move structured lighting fringes relative to the sample to change phases. Additional implementations may also include moving the entire imaging system over a stationary sample. Alternatively, the sample container 110 may be fixed during imaging.

[00094] Em algumas implementações, um componente de foco (eixo z) 175 pode ser incluído para controlar o posicionamento dos componentes ópticos com relação a um recipiente de amostra 110 na direção do foco (tipicamente referida como o eixo z, ou direção z). O componente de foco 175 pode incluir um ou mais atuadores acoplados fisicamente com o estágio óptico ou o estágio de amostra, ou ambos, para mover o recipiente de amostra 110 no estágio de amostra 170 com relação aos componentes ópticos (por exemplo, a lente objetiva 142) para prover focalização apropriada para a operação de formação de imagem. Por exemplo, o atuador pode ser acoplado fisicamente com o respectivo estágio tal como, por exemplo, através de anexação ou contato mecânico, magnético, fluídico ou outro diretamente ou indiretamente para ou com o estágio. Os um ou mais atuadores podem ser configurados para mover o estágio na direção z enquanto mantém o estágio de amostra no mesmo plano (por exemplo, mantendo um nível ou atitude horizontal, perpendicular com o eixo óptico). Os um ou mais atuadores também podem ser configurados para inclinar o estágio. Isto pode ser feito, por exemplo, de forma que o recipiente de amostra 110 pode ser nivelado dinamicamente para levar em conta qualquer inclinação nas suas superfícies.[00094] In some implementations, a focusing component (z-axis) 175 may be included to control the positioning of optical components relative to a sample container 110 in the focus direction (typically referred to as the z-axis, or z-direction). . The focusing component 175 may include one or more actuators physically coupled with the optical stage or the sample stage, or both, to move the sample container 110 in the sample stage 170 with respect to the optical components (e.g., the objective lens 142) to provide appropriate focusing for the imaging operation. For example, the actuator may be physically coupled with the respective stage such as, for example, through mechanical, magnetic, fluidic or other attachment or contact directly or indirectly to or with the stage. The one or more actuators can be configured to move the stage in the z direction while maintaining the sample stage in the same plane (e.g., maintaining a horizontal level or attitude, perpendicular to the optical axis). The one or more actuators may also be configured to tilt the stage. This can be done, for example, so that the sample container 110 can be dynamically leveled to take into account any inclination on its surfaces.

[00095] Deve ser percebido que apesar de a FIG. 1 ilustrar o uso de uma lente objetiva 142 para combinar e projetar as duas ordens de feixe na amostra de imagem formada como um padrão de franjas de interferência, outros meios adequados podem ser usados para combinar os dois feixes e/ou projetar o padrão de interferência na amostra. Qualquer meio de redirecionamento dos feixes pode ser suficiente (por exemplo, usando espelhos), provido que o comprimento de caminho atravessado pelos feixes esteja dentro de um comprimento de coerência temporal dos feixes. Adicionalmente, em algumas implementações, as duas ordens de feixe podem se sobrepor automaticamente para uma distância além do divisor de feixe (por exemplo, grade de difração). Em tais implementações, um padrão de interferência pode parecer próximo da grade, removendo a necessidade de um sistema de projeção adicional se a grade de difração é colocada suficientemente próxima da amostra. Desta forma, deve ser percebido que implementações para SIM descritas aqui podem se aplicar aos sistemas que não confiam nos sistemas de lente objetiva para projetar padrões de interferência.[00095] It should be noted that although FIG. 1 illustrate the use of an objective lens 142 to combine and project the two beam orders into the image sample formed as an interference fringe pattern, other suitable means may be used to combine the two beams and/or project the interference pattern in the sample. Any means of redirecting the beams may be sufficient (for example, using mirrors), provided that the path length traversed by the beams is within a temporal coherence length of the beams. Additionally, in some implementations, the two beam orders may automatically overlap for a distance beyond the beam splitter (e.g., diffraction grating). In such implementations, an interference pattern can appear close to the grating, removing the need for an additional projection system if the diffraction grating is placed sufficiently close to the sample. Thus, it should be realized that implementations for SIM described here can apply to systems that do not rely on objective lens systems to design interference patterns.

[00096] A luz estruturada que emana a partir de uma amostra de teste em uma localização de amostra que tem a imagem formada pode ser direcionada através do espelho dicroico 160 para um ou mais detectores do sistema de câmera 140. Em algumas implementações, um conjunto de comutação de filtro 165 com um ou mais filtros de emissão pode ser incluído, onde os um ou mais filtros de emissão podem ser usados para passar através de particulares comprimentos de onda de emissão e bloquear (ou refletir) outros comprimentos de onda de emissão. Por exemplo, os um ou mais filtros de emissão podem ser usados para comutar entre diferentes canais do sistema de formação de imagem. Em uma implementação particular, os filtros de emissão podem ser implementados como espelhos dicroicos que direcionam luz de emissão de diferentes comprimentos de onda para diferentes sensores de imagem do sistema de câmera 140.[00096] Structured light emanating from a test sample at an imaged sample location may be directed through the dichroic mirror 160 to one or more detectors of the camera system 140. In some implementations, a set Filter switching 165 with one or more emission filters may be included, where the one or more emission filters may be used to pass through particular emission wavelengths and block (or reflect) other emission wavelengths. For example, the one or more emission filters may be used to switch between different channels of the imaging system. In a particular implementation, the emission filters may be implemented as dichroic mirrors that direct emission light of different wavelengths to different image sensors of the camera system 140.

[00097] O sistema de câmera 140 pode incluir um ou mais sensores de imagem para monitorar e rastrear a formação de imagem (por exemplo, sequenciamento) de recipiente de amostra 110. O sistema de câmera 140 pode ser implementado, por exemplo, como uma câmera de sensor de imagem de dispositivo de carga acoplada (CCD), mas outras tecnologias de sensor de imagem tais como sensores de pixel ativo (por exemplo, sensores de imagem de semicondutor de óxido de metal complementar (CMOS)) podem ser usados. Em algumas implementações, o sistema de formação de imagem de iluminação estruturada 100 pode usar um sensor de imagem (por exemplo, sensor de pixel ativo) em um plano ativo da amostra. Em tais implementações, a amostra de imagem formada pode ser padronizada e/ou alinhada sobre o sensor de imagem.[00097] The camera system 140 may include one or more image sensors for monitoring and tracking the image formation (e.g., sequencing) of sample container 110. The camera system 140 may be implemented, for example, as a charge-coupled device (CCD) image sensor camera, but other image sensor technologies such as active pixel sensors (e.g., complementary metal oxide semiconductor (CMOS) image sensors) can be used. In some implementations, the structured illumination imaging system 100 may use an image sensor (e.g., active pixel sensor) in an active plane of the sample. In such implementations, the formed image sample may be patterned and/or aligned over the image sensor.

[00098] Dados de saída (por exemplo, imagens) a partir do sistema de câmera 140 podem ser comunicados com um módulo de análise em tempo real (não mostrado) que pode ser implementado como um aplicativo de software que, como é adicionalmente descrito abaixo, pode reconstruir as imagens capturadas durante cada ciclo de formação de imagem para criar uma imagem tendo uma maior resolução espacial. Alternativamente, os dados de saída podem ser armazenados para a reconstrução em um momento posterior.[00098] Output data (e.g., images) from the camera system 140 may be communicated with a real-time analysis module (not shown) that may be implemented as a software application that, as is further described below , can reconstruct the images captured during each image formation cycle to create an image having a higher spatial resolution. Alternatively, the output data can be stored for reconstruction at a later time.

[00099] Apesar de não ser ilustrado, um controlador pode ser provido para controlar a operação do sistema de formação de imagem de iluminação estruturada 100, incluindo a sincronização dos vários componentes ópticos do sistema 100. O controlador pode ser implementado para controlar aspectos da operação do sistema tais como, por exemplo, a configuração de conjunto óptico de estruturação de luz 155 (por exemplo, seleção e/ou translação linear de grades de difração), movimento de lente de projeção 156, focalização, movimento de estágio, e operações de formação de imagem. Em várias implementações, o controlador pode ser implementado usando hardware, algoritmos (por exemplo, instruções executáveis de máquina), ou uma combinação dos anteriores. Por exemplo, em algumas implementações o controlador pode incluir um ou mais CPUs ou processadores com memória associada. Como outro exemplo, o controlador pode compreender hardware ou outros circuitos para controlar a operação, tais como um processador de computador e um meio legível por computador não transitório com instruções legíveis por máquina armazenadas no mesmo. Por exemplo, estes circuitos podem incluir um ou mais dos seguintes: arranjo de portal programável de campo (FPGA), circuito integrado específico de aplicativo (ASIC), dispositivo lógico programável (PLD), dispositivo lógico programável complexo (CPLD), um arranjo lógico programável (PLA), lógica de arranjo programável (PAL) ou outros circuitos ou dispositivos de processamento similares. Como mais um exemplo, o controlador pode compreender uma combinação destes circuitos com um ou mais processadores.[00099] Although not illustrated, a controller may be provided to control the operation of the structured lighting imaging system 100, including synchronization of the various optical components of the system 100. The controller may be implemented to control aspects of the operation of the system such as, for example, the configuration of optical light structuring assembly 155 (e.g., selection and/or linear translation of diffraction gratings), movement of projection lens 156, focusing, stage movement, and operations of image formation. In various implementations, the controller may be implemented using hardware, algorithms (e.g., machine executable instructions), or a combination of the foregoing. For example, in some implementations the controller may include one or more CPUs or processors with associated memory. As another example, the controller may comprise hardware or other circuitry for controlling operation, such as a computer processor and a non-transitory computer-readable medium with machine-readable instructions stored therein. For example, these circuits may include one or more of the following: field programmable gate array (FPGA), application specific integrated circuit (ASIC), programmable logic device (PLD), complex programmable logic device (CPLD), a logic array programmable array logic (PLA), programmable array logic (PAL), or other similar processing circuits or devices. As a further example, the controller may comprise a combination of these circuits with one or more processors.

[000100] Sistema de formação de imagem de microscopia de iluminação estruturada de múltiplos braços[000100] Multi-Arm Structured Illumination Microscopy Imaging System

[000101] De acordo com algumas implementações da tecnologia divulgada aqui, o sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços, onde cada braço do sistema inclui um emissor de luz e uma grade tendo uma orientação fixa, específica com relação ao eixo óptico do sistema.[000101] According to some implementations of the technology disclosed herein, the SIM imaging system can be implemented as a multi-arm SIM imaging system, wherein each arm of the system includes a light emitter and a grid. having a fixed, specific orientation with respect to the optical axis of the system.

[000102] A FIG. 2 é um diagrama óptico ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 200 de acordo com algumas implementações descritas aqui. O primeiro braço do sistema 200 inclui um emissor de luz 210A, um colimador óptico 220A para colimar luz emitida pelo emissor de luz 210A, uma grade de difração 230A em uma primeira orientação com relação ao eixo óptico, uma janela rotativa 240A, e uma lente de projeção 250A. O segundo braço do sistema 200 inclui um emissor de luz 210B, um colimador óptico 220B para colimar luz emitida pelo emissor de luz 210B, uma grade de difração 230B em uma segunda orientação com relação ao eixo óptico, uma janela rotativa 240B, e uma lente de projeção 250B. Apesar de as grades de difração serem ilustradas neste exemplo, em outras implementações, outros elementos de divisão de feixe tais como um cubo de divisor de feixe ou placa podem ser usados para dividir luz recebida em cada braço do sistema de formação de imagem de SIM 200.[000102] FIG. 2 is an optical diagram illustrating an example optical configuration of a two-arm SIM imaging system 200 in accordance with some implementations described herein. The first arm of the system 200 includes a light emitter 210A, an optical collimator 220A for collimating light emitted by the light emitter 210A, a diffraction grating 230A in a first orientation with respect to the optical axis, a rotatable window 240A, and a lens 250A projection. The second arm of the system 200 includes a light emitter 210B, an optical collimator 220B for collimating light emitted by the light emitter 210B, a diffraction grating 230B in a second orientation with respect to the optical axis, a rotatable window 240B, and a lens 250B projection. Although diffraction gratings are illustrated in this example, in other implementations, other beam splitting elements such as a beam splitter cube or plate may be used to split light received into each arm of the SIM 200 imaging system. .

[000103] Cada emissor de luz 210A-210B pode ser um emissor de luz incoerente (por exemplo, emite feixes de luz emitidos por um ou mais diodos de emissão de luz (LEDs)), ou um emissor de luz coerente tal como o emissor de luz emitida por um ou mais lasers ou diodos de laser. No exemplo do sistema 200, cada emissor de luz 210A-210B é uma fibra óptica que emite um feixe óptico que é colimado por um respectivo colimador 220A-220B.[000103] Each light emitter 210A-210B may be an incoherent light emitter (e.g., emitting beams of light emitted by one or more light emitting diodes (LEDs)), or a coherent light emitter such as the emitter of light emitted by one or more lasers or laser diodes. In the example system 200, each light emitter 210A-210B is an optical fiber that emits an optical beam that is collimated by a respective collimator 220A-220B.

[000104] Em algumas implementações, cada fibra óptica pode ser acoplada opticamente com uma correspondente fonte de luz (não mostrado) tal como um laser. Durante a formação de imagem, cada fibra óptica pode ser ligada ou desligada usando um obturador de alta velocidade (não mostrado) posicionado no caminho óptico entre a fibra e a fonte de luz, ou pulsando a correspondente fonte de luz das fibras em uma frequência predeterminada durante a formação de imagem. Em algumas implementações, cada fibra óptica pode ser opticamente acoplada com a mesma fonte de luz. Em tais implementações, um divisor de feixe ou outro elemento óptico adequado pode ser usado para guiar luz a partir da fonte de luz para cada uma das fibras ópticas. Em tais exemplos, cada fibra óptica pode ser ligada ou desligada usando um obturador de alta velocidade (não mostrado) posicionado no caminho óptico entre a fibra e divisor de feixe.[000104] In some implementations, each optical fiber may be optically coupled with a corresponding light source (not shown) such as a laser. During imaging, each optical fiber can be turned on or off using a high-speed shutter (not shown) positioned in the optical path between the fiber and the light source, or by pulsing the fibers' corresponding light source at a predetermined frequency. during image formation. In some implementations, each optical fiber can be optically coupled to the same light source. In such implementations, a beam splitter or other suitable optical element may be used to guide light from the light source to each of the optical fibers. In such examples, each optical fiber can be turned on or off using a high-speed shutter (not shown) positioned in the optical path between the fiber and beam splitter.

[000105] No exemplo de sistema de formação de imagem de SIM 200, o primeiro braço inclui uma grade vertical fixa 230A para projetar um padrão de grade em uma primeira orientação (por exemplo, um padrão de franjas vertical) para a amostra, e o segundo braço inclui uma grade horizontal fixa 230B para projetar um padrão de grade em uma segunda orientação (por exemplo, um padrão de franjas horizontal) para a amostra 271. Diferentemente dos sistemas de formação de imagem de SIM pré-existentes, as grades do sistema de formação de imagem de SIM 200 não precisam sofrer rotação ou translação mecânica, o que pode prover velocidade de sistema aprimorada, confiabilidade e repetibilidade.[000105] In the example SIM imaging system 200, the first arm includes a fixed vertical grating 230A for projecting a grating pattern in a first orientation (e.g., a vertical fringe pattern) onto the sample, and the second arm includes a fixed horizontal grating 230B for projecting a grating pattern in a second orientation (e.g., a horizontal fringe pattern) onto sample 271. Unlike pre-existing SIM imaging systems, the system's gratings SIM 200 imaging systems do not need to undergo mechanical rotation or translation, which can provide improved system speed, reliability and repeatability.

[000106] Como ilustrado no exemplo da FIG. 2, as grades 230A-230B podem ser grades de difração transmissiva, incluindo uma pluralidade de elementos de difração (por exemplo, ranhuras ou fendas paralelas) formadas para um substrato de vidro ou outra superfície adequada. As grades podem ser implementadas como grades de fase que proveem uma variação periódica do índice de refração do material da grade. O espaçamento de recurso ou ranhura pode ser escolhido para difratar luz em ângulos adequados e ajustados para o tamanho de recurso resolvível mínimo da amostra de imagem formadas para a operação do sistema de formação de imagem de SIM 200. Em outras implementações, as grades podem ser grades de difração refletivas.[000106] As illustrated in the example of FIG. 2, gratings 230A-230B may be transmissive diffraction gratings, including a plurality of diffraction elements (e.g., parallel grooves or slits) formed to a glass substrate or other suitable surface. The gratings can be implemented as phase gratings that provide a periodic variation of the refractive index of the grating material. The feature or slot spacing may be chosen to diffract light at suitable angles and adjusted to the minimum resolvable feature size of the image sample formed for operation of the SIM 200 imaging system. In other implementations, the gratings may be reflective diffraction gratings.

[000107] No exemplo de sistema de formação de imagem de SIM 200, os padrões vertical e horizontal são deslocados em cerca de 90 graus. Em outras implementações, outras orientações das grades podem ser usadas para criar um deslocamento de cerca de 90 graus. Por exemplo, as grades podem ser orientadas tal que elas projetam imagens que são deslocados ±45 graus a partir do plano x ou y da amostra 271. A configuração do exemplo de sistema de formação de imagem de SIM 200 pode ser particularmente vantajosa no caso de uma amostra regularmente padronizada 271 com funcionalidades em uma rede retangular, já que aprimoramento de resolução estruturada pode ser alcançado usando apenas duas grades perpendiculares (por exemplo, grade vertical e grade horizontal).[000107] In the example SIM 200 imaging system, the vertical and horizontal patterns are shifted by about 90 degrees. In other implementations, other orientations of the grids can be used to create an offset of about 90 degrees. For example, the gratings may be oriented such that they project images that are offset ±45 degrees from the x or y plane of sample 271. The configuration of the example SIM imaging system 200 may be particularly advantageous in the case of a regularly patterned sample 271 with features on a rectangular grid, as structured resolution enhancement can be achieved using only two perpendicular grids (e.g., vertical grid and horizontal grid).

[000108] As grades 230A-230B, no exemplo do sistema 200, são configuradas para difratar os feixes de entrada para um número de ordens (por exemplo, 0 ordem, ± 1 ordens, ± 2 ordens, etc.) em que as ± 1 ordens podem ser projetadas na amostra 271. Como mostrado neste exemplo, a grade vertical 230A difrata um feixe de luz colimada para feixes difratados de primeira ordem (± 1 ordens), espalhando as primeiras ordens do plano da página, e a grade horizontal 230B difrata um feixe de luz colimada para feixes difratados de primeira ordem, espalhando as ordens acima e abaixo do plano da página (isto é, em um plano perpendicular com a página). Para aprimorar a eficiência do sistema, os feixes de ordem zero e todos os outros feixes de maior ordem (isto é, ± 2 ordens ou maior) podem ser bloqueados (isto é, filtrados do padrão de iluminação projetado na amostra 271). Por exemplo, um elemento de bloqueio de feixe (não mostrado) tal como um filtro de ordem pode ser inserido para o caminho óptico após cada grade de difração para bloquear o feixe de ordem 0 e os feixes de maior ordem. Em algumas implementações, as grades de difração 230A-230B podem ser configuradas para difratar os feixes para apenas as primeiras ordens e a ordem 0 (feixe não difratado) podem ser bloqueados por algum elemento de bloqueio de feixe.[000108] Gratings 230A-230B, in the example of system 200, are configured to diffract the input beams to a number of orders (e.g., 0 order, ± 1 orders, ± 2 orders, etc.) in which the ± 1 orders can be projected onto sample 271. As shown in this example, the vertical grating 230A diffracts a beam of collimated light to first-order diffracted beams (±1 orders), scattering the first orders from the page plane, and the horizontal grating 230B diffracts a beam of collimated light into first-order diffracted beams, scattering the orders above and below the plane of the page (i.e., in a plane perpendicular to the page). To improve system efficiency, zero-order beams and all other higher-order beams (i.e., ±2 orders or greater) can be blocked (i.e., filtered from the illumination pattern projected onto sample 271). For example, a beam blocking element (not shown) such as an order filter can be inserted into the optical path after each diffraction grating to block the 0th order beam and higher order beams. In some implementations, the 230A-230B diffraction gratings can be configured to diffract the beams to only the first orders and the 0th order (non-diffracted beam) can be blocked by some beam blocking element.

[000109] Cada braço inclui um modulador de fase óptica ou deslocador de fase 240A-240B para deslocar de fase a luz emitida difratada por cada uma das redes 230. Por exemplo, durante a formação de imagem estruturada, a fase óptica de cada feixe difratado pode ser deslocada por alguma fração (por exemplo, 1/2, 1/3, 1/4, etc.) do passo (À) de cada franja do padrão estruturado. No exemplo da FIG. 2, os moduladores de fase 240A e 240B são implementados como janelas rotativas que podem usar um galvanômetro ou outro atuador rotativo para rotar e modular o comprimento de caminho óptico de cada feixe difratado. Por exemplo, a janela 240A pode rotar em torno do eixo vertical para deslocar a imagem projetada pela grade vertical 230A na amostra 271 para a esquerda ou para a direita, e a janela 240B pode rotar em torno do eixo horizontal para deslocar a imagem projetada pela grade horizontal 230B na amostra 271 para cima ou para baixo.[000109] Each arm includes an optical phase modulator or phase shifter 240A-240B to phase shift the emitted light diffracted by each of the gratings 230. For example, during structured imaging, the optical phase of each diffracted beam may be shifted by some fraction (e.g., 1/2, 1/3, 1/4, etc.) of the pitch (À) of each fringe of the structured pattern. In the example of FIG. 2, phase modulators 240A and 240B are implemented as rotating windows that can use a galvanometer or other rotary actuator to rotate and modulate the optical path length of each diffracted beam. For example, window 240A may rotate about the vertical axis to shift the image projected by the vertical grid 230A on sample 271 to the left or right, and window 240B may rotate about the horizontal axis to shift the image projected by the horizontal grid 230B in sample 271 up or down.

[000110] Em outras implementações, adicionalmente descritas abaixo, outros moduladores de fase que alteram o comprimento de caminho óptico da luz difratada (por exemplo estágios de translação lineares, cunhas, etc.) podem ser usados. Adicionalmente, apesar de os moduladores de fase óptica 240A-240B serem ilustrados como sendo posicionados após as grades 230A-230B, em outras implementações eles podem ser colocados em outras localizações no sistema de iluminação. Em algumas implementações, um modulador de fase única pode ser operado em duas direções diferentes para os diferentes padrões de franjas, ou um modulador de fase única pode usar um movimento único para ajustar ambos os comprimentos de caminho, como descrito abaixo.[000110] In other implementations, further described below, other phase modulators that change the optical path length of the diffracted light (e.g. linear translation stages, wedges, etc.) can be used. Additionally, although the optical phase modulators 240A-240B are illustrated as being positioned after the grids 230A-230B, in other implementations they may be placed in other locations in the lighting system. In some implementations, a single-phase modulator may be operated in two different directions for different fringe patterns, or a single-phase modulator may use a single motion to adjust both path lengths, as described below.

[000111] No sistema de exemplo 200, um espelho 260 com orifícios 261 combina os dois braços para o caminho óptico de uma maneira sem perdas (por exemplo, sem uma perda significativa de potência óptica, diferente do que uma pequena absorção no revestimento refletivo). O espelho 260 pode estar localizado tal que as ordens difratadas a partir de cada uma das grades são espacialmente resolvidas, e as ordens indesejadas podem ser bloqueadas. O espelho 260 passa as primeiras ordens de luz emitidas pelo primeiro braço através de orifícios 261. O espelho 260 reflete as primeiras ordens de luz emitidas pelo segundo braço. Desta forma, o padrão de iluminação estruturada pode ser comutado a partir de uma orientação vertical (por exemplo, grade 230A) para uma orientação horizontal (por exemplo, grade 230B) ligando ou desligando cada emissor ou abrindo e fechando um obturador óptico que direciona a fonte de luz da luz através do cabo de fibra óptica. Em outras implementações, o padrão de iluminação estruturada pode ser comutado usando um comutador óptico para alterar o braço que ilumina a amostra.[000111] In example system 200, a mirror 260 with holes 261 combines the two arms into the optical path in a lossless manner (e.g., without a significant loss of optical power, other than a small absorption in the reflective coating). . The mirror 260 may be located such that orders diffracted from each of the gratings are spatially resolved, and unwanted orders may be blocked. Mirror 260 passes the first orders of light emitted by the first arm through holes 261. Mirror 260 reflects the first orders of light emitted by the second arm. In this way, the structured lighting pattern can be switched from a vertical orientation (e.g., grid 230A) to a horizontal orientation (e.g., grid 230B) by turning each emitter on or off or by opening and closing an optical shutter that directs the light source of light through the fiber optic cable. In other implementations, the structured illumination pattern can be switched using an optical switch to change the arm that illuminates the sample.

[000112] Também ilustrados no exemplo de sistema de formação de imagem 200 estão uma lente de projeção 265, um espelho semirrefletivo 280, a objetiva 270, e a câmera 290. A lente de projeção 265 pode ser usada em conjunto com a lente 250A para projetar a transformada de Fourier da grade 230A para a pupila de entrada da lente objetiva 270. De maneira similar, a lente de projeção 265 pode ser usada em conjunto com a lente 250B para projetar a transformada de Fourier da grade 230B para a pupila de entrada da lente objetiva 270. A lente de projeção 265 também pode ser implementada para se articular ao longo do eixo z para ajustar o foco de grade no plano de amostra. Espelho semirrefletivo 280 pode ser um espelho dicroico para refletir iluminação estruturada luz recebida a partir de cada braço para a objetiva 270 para a projeção na amostra 271, e para passar através da luz emitida pela amostra 271 (por exemplo, luz fluorescente, que é emitida em comprimentos de onda diferentes do que a excitação) para a câmera 290.[000112] Also illustrated in example image formation system 200 are a projection lens 265, a semi-reflective mirror 280, the objective 270, and the camera 290. The projection lens 265 can be used in conjunction with the lens 250A to project the Fourier transform from the grating 230A to the entrance pupil of the objective lens 270. Similarly, the projection lens 265 can be used in conjunction with the lens 250B to project the Fourier transform from the grating 230B to the entrance pupil of the objective lens 270. The projection lens 265 may also be implemented to pivot along the z axis to adjust the grid focus on the sample plane. Semi-reflective mirror 280 may be a dichroic mirror to reflect structured illumination light received from each arm to the objective 270 for projection onto sample 271, and to pass through light emitted by sample 271 (e.g., fluorescent light, which is emitted at different wavelengths than the excitation) for camera 290.

[000113] Vale a pena destacar que o exemplo do sistema 200 pode prover a alta eficiência óptica devido à ausência de um polarizador. Adicionalmente, o uso de luz não polarizada pode não ter um impacto significativo no contraste de padrão dependendo do ajuste de abertura numérica da objetiva 270.[000113] It is worth highlighting that the example of system 200 can provide high optical efficiency due to the absence of a polarizer. Additionally, the use of unpolarized light may not have a significant impact on pattern contrast depending on the numerical aperture setting of the 270 objective.

[000114] Deve ser notado que, para o bem da simplicidade, componentes ópticos do sistema de formação de imagem de SIM 200 podem ter sido omitidos da discussão anterior. Adicionalmente, apesar de o sistema 200 ser ilustrado neste exemplo como um sistema de canal único, em outras implementações, ele pode ser implementado como um sistema de múltiplos canais (por exemplo, usando duas câmeras diferentes e fontes de luz que emitem em dois diferentes comprimentos de onda).[000114] It should be noted that, for the sake of simplicity, optical components of the SIM 200 imaging system may have been omitted from the previous discussion. Additionally, although system 200 is illustrated in this example as a single-channel system, in other implementations, it may be implemented as a multi-channel system (e.g., using two different cameras and light sources that emit at two different lengths). waveform).

[000115] A FIG. 3 é um diagrama óptico ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 300 de acordo com algumas implementações descritas aqui. No sistema 300, uma grande janela óptica rotativa 310 pode ser posicionada após o espelho 260 com os orifícios 261. Neste caso, a janela 310 pode ser usada no lugar das janelas 240A e 240B para modular as fases de ambos os conjuntos de feixe difratados emitidos pelas grades de difração vertical e horizontal. Em vez de ser paralelos com relação ao eixo óptico de uma das grades, o eixo de rotação para a janela rotativa 310 pode ser deslocado 45 graus (ou algum outro deslocamento angular) a partir do eixo óptico de cada das grades vertical e horizontal para permitir o deslocamento de fase ao longo de ambas as direções ao longo de um eixo de rotação comum da janela 310. Em algumas implementações, a janela rotativa 310 pode ser substituída por uma óptica de cunha rotativa em torno do eixo de feixe nominal.[000115] FIG. 3 is an optical diagram illustrating another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system 300 in accordance with some implementations described herein. In system 300, a large rotatable optical window 310 may be positioned after mirror 260 with holes 261. In this case, window 310 may be used in place of windows 240A and 240B to modulate the phases of both sets of emitted diffracted beams. by vertical and horizontal diffraction gratings. Instead of being parallel with respect to the optical axis of one of the grids, the axis of rotation for the rotating window 310 may be offset 45 degrees (or some other angular displacement) from the optical axis of each of the vertical and horizontal grids to allow the phase shift along both directions along a common rotation axis of the window 310. In some implementations, the rotating window 310 may be replaced by a rotating wedge optic around the nominal beam axis.

[000116] A FIG. 4 é um diagrama óptico ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 400 de acordo com algumas implementações descritas aqui. No sistema 400, as grades 230A e 230B são montadas nos respectivos estágios de movimento linear 410A e 410B que podem sofrer translação para alterar o comprimento de caminho óptico (e assim a fase) de luz emitida pelas grades 230A e 230B. o eixo de movimento dos estágios de movimento linear 410A-410B pode ser perpendicular ou de outra forma deslocado a partir da orientação das suas respectivas grades para realizar a translação de um padrão de grade ao longo de uma amostra 271. Nas implementações, cada um dos estágios 410A e 410B pode usar mancais de rolo cruzados, um motor linear, um codificador linear de alta precisão, e/ou outras tecnologias para prover translações lineares precisas das grades para deslocar de fase as imagens projetadas.[000116] FIG. 4 is an optical diagram illustrating another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system 400 in accordance with some implementations described herein. In system 400, gratings 230A and 230B are mounted on respective linear motion stages 410A and 410B that can undergo translation to change the optical path length (and thus phase) of light emitted by gratings 230A and 230B. The axis of motion of the linear motion stages 410A-410B may be perpendicular to or otherwise offset from the orientation of their respective grids to translate a grid pattern along a sample 271. In implementations, each of the Stages 410A and 410B may use crossed roller bearings, a linear motor, a high-precision linear encoder, and/or other technologies to provide accurate linear translations of the gratings to phase shift the projected images.

[000117] A FIG. 5 é um diagrama de fluxo operacional ilustrando um exemplo de método 500 que pode ser realizado por um sistema de formação de imagem de SIM de múltiplos braços durante um ciclo de formação de imagem para usar luz estruturada para criar uma imagem de alta resolução de acordo com algumas implementações descritas aqui. Nas implementações, o método 500 pode ser realizado para formar imagem de toda uma amostra ou uma localização de uma amostra maior. O método 500 será descrito em conjunto com a FIG. 6, que ilustra padrões de franjas de iluminação simplificada que podem ser projetados para o plano de uma amostra 271 por uma grade vertical e grade horizontal de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços durante a captura da imagem. Por exemplo, o sistema de formação de imagem de SIM 200 pode usar a grade vertical 230A e a grade horizontal 230B para gerar os padrões de iluminação horizontal e vertical mostrados na FIG. 6, enquanto os moduladores de fase 230A e 230B podem ser definidos para três posições diferentes para produzir os três deslocamentos de fase mostrados.[000117] FIG. 5 is an operational flow diagram illustrating an example method 500 that may be performed by a multi-arm SIM imaging system during an imaging cycle to use structured light to create a high-resolution image in accordance with some implementations described here. In implementations, method 500 may be performed to image an entire sample or a location of a larger sample. Method 500 will be described in conjunction with FIG. 6, which illustrates simplified illumination fringe patterns that can be projected onto the plane of a sample 271 by a vertical grid and horizontal grid of a two-arm SIM imaging system during image capture. For example, the SIM imaging system 200 may use the vertical grating 230A and the horizontal grating 230B to generate the horizontal and vertical illumination patterns shown in FIG. 6, while phase modulators 230A and 230B can be set to three different positions to produce the three phase shifts shown.

[000118] Na operação 510, um primeiro braço correspondendo com uma primeira orientação de grade é ligado para começar a gerar padrões de iluminação usando o primeiro braço. Por exemplo, na implementação do sistema de formação de imagem 200, um obturador de alta velocidade posicionado no caminho entre fibra óptica 210A e a fonte de luz pode ser aberta ou de outra maneira atuada tal que a fonte de luz não é bloqueada. Alternativamente, uma ou mais fontes de luz podem ser ligadas ou desligadas (por exemplo, pulsadas), ou um comutador óptico pode ser usado para direcionar a fonte de luz através do caminho óptico do primeiro braço (por exemplo, através de um do primeiro ou do segundo emissor). Em alguns casos, a operação 510 também pode incluir ligar a fonte de luz (por exemplo, no caso do primeiro ciclo de formação de imagem).[000118] In operation 510, a first arm corresponding to a first grid orientation is turned on to begin generating lighting patterns using the first arm. For example, in implementing the imaging system 200, a high-speed shutter positioned in the path between optical fiber 210A and the light source may be opened or otherwise actuated such that the light source is not blocked. Alternatively, one or more light sources may be turned on or off (e.g., pulsed), or an optical switch may be used to direct the light source through the optical path of the first arm (e.g., through one of the first or from the second transmitter). In some cases, operation 510 may also include turning on the light source (e.g., in the case of the first image formation cycle).

[000119] Uma vez que o primeiro braço é ligado, na operação 520 um primeiro padrão de grade pode ser projetado na amostra e uma imagem pode ser capturada. Por exemplo, como ilustrado pela FIG. 6, a grade vertical 230A pode projetar franjas de iluminação de primeira ordem na amostra 271. Qualquer luz emitida pela amostra pode ser capturada pela câmera 290 e uma primeira imagem de fase do primeiro padrão (por exemplo, padrão vertical) pode ser capturada. Por exemplo, corantes fluorescentes situados em diferentes funcionalidades da amostra 271 podem fluorescer e a luz resultante pode ser coletada pela lente objetiva 270 e direcionada para um sensor de imagem da câmera 2 90 para detectar a fluorescência.[000119] Once the first arm is turned on, in operation 520 a first grid pattern can be projected onto the sample and an image can be captured. For example, as illustrated by FIG. 6, the vertical grating 230A can project first-order illumination fringes onto the sample 271. Any light emitted by the sample can be captured by the camera 290 and a first phase image of the first pattern (e.g., vertical pattern) can be captured. For example, fluorescent dyes located in different features of the sample 271 may fluoresce and the resulting light may be collected by the objective lens 270 and directed to an image sensor of the camera 2 90 to detect the fluorescence.

[000120] Se adicionais imagens deslocadas em fase precisam ser capturadas (decisão 530), na operação 540 o padrão projetado pela grade pode ser deslocado em fase para capturar a próxima imagem de fase do padrão. Por exemplo, na implementação do sistema 200, a fase do padrão projetada pela grade vertical 230A pode ser deslocada em fase pela janela óptica rotativa 240A. Alternativamente, outros moduladores de fase óptica tais como estágios de translação ou cunhas ópticas rotativas podem ser usadas para deslocar a fase. Por exemplo, como ilustrado no exemplo da FIG. 6, a fase pode ser deslocada por 1/3 do passo (À) do padrão de franjas tal que o padrão projetado na amostra está deslocado por 1/3À a partir da imagem anterior que foi capturada. Em algumas implementações, o padrão projetado pela grade pode ser deslocado em fase movendo a amostra (por exemplo, usando um estágio de movimento) enquanto as franjas projetadas permanecem estacionárias. Em algumas implementações, o padrão projetado pela grade pode ser deslocado em fase movendo tanto a amostra quanto as franjas projetadas. As operações 520-540 podem iterar até todas as imagens de fase de um primeiro padrão são capturadas (por exemplo, três imagens de fase deslocada do padrão vertical no caso da FIG. 6.).[000120] If additional phase-shifted images need to be captured (decision 530), in operation 540 the pattern projected by the grid can be phase-shifted to capture the next phase image of the pattern. For example, in the implementation of system 200, the phase of the pattern projected by the vertical grating 230A may be phase-shifted by the rotating optical window 240A. Alternatively, other optical phase modulators such as translation stages or rotating optical wedges can be used to shift the phase. For example, as illustrated in the example of FIG. 6, the phase can be shifted by 1/3 of the step (À) of the fringe pattern such that the pattern projected onto the sample is offset by 1/3À from the previous image that was captured. In some implementations, the pattern projected by the grating can be phase-shifted by moving the sample (e.g., using a motion stage) while the projected fringes remain stationary. In some implementations, the pattern projected by the grid can be phase-shifted by moving both the sample and the projected fringes. Operations 520-540 may iterate until all phase images of a first pattern are captured (e.g., three phase-shifted images of the vertical pattern in the case of FIG. 6.).

[000121] Uma vez que todas as imagens de fase de um padrão foram capturadas, na operação 560 o segundo braço correspondendo com uma segunda orientação de grade do sistema de formação de imagem de SIM pode ser ligada. Por exemplo, na implementação do sistema de formação de imagem 200, um obturador de alta velocidade posicionado no caminho entre fibra óptica 210B e a fonte de luz pode ser aberta ou de outra maneira atuada tal que a fonte de luz não é bloqueada. Alternativamente, uma ou mais fontes de luz podem ser ligadas ou desligadas (por exemplo, pulsadas), ou um comutador óptico pode ser usado para direcionar a fonte de luz através do caminho óptico do segundo braço. Adicionalmente, o outro braço pode ser desligado. Uma série de imagens de fase então pode ser capturada para o próximo braço através de operações de repetição 520-540. Por exemplo, como ilustrado pela FIG. 6, grade horizontal 230B pode projetar franjas de iluminação de primeira ordem na amostra 271, e as franjas projetadas podem ser deslocadas na posição por 1/3À para capturar três imagens de fase do padrão horizontal. Como outro exemplo, o padrão projetado pela grade pode ser deslocado em fase movendo a amostra (por exemplo, usando um estágio de movimento) enquanto as franjas projetadas permanecem estacionárias, ou movendo tanto a amostra quanto as franjas projetadas.[000121] Once all phase images of a pattern have been captured, at operation 560 the second arm corresponding to a second grating orientation of the SIM imaging system can be turned on. For example, in implementing the imaging system 200, a high-speed shutter positioned in the path between optical fiber 210B and the light source may be opened or otherwise actuated such that the light source is not blocked. Alternatively, one or more light sources may be turned on or off (e.g., pulsed), or an optical switch may be used to direct the light source through the optical path of the second arm. Additionally, the other arm can be turned off. A series of phase images can then be captured for the next arm through repeat operations 520-540. For example, as illustrated by FIG. 6, horizontal grating 230B can project first-order illumination fringes onto sample 271, and the projected fringes can be shifted in position by 1/3À to capture three phase images of the horizontal pattern. As another example, the pattern projected by the grating can be phase-shifted by moving the sample (e.g., using a moving stage) while the projected fringes remain stationary, or by moving both the sample and the projected fringes.

[000122] Uma vez que todas as imagens foram capturadas para o ciclo de formação de imagem, na operação 570, uma imagem de alta resolução pode ser construída a partir das imagens capturadas. Por exemplo, uma imagem de alta resolução pode ser reconstruída a partir das seis imagens mostradas na FIG. 6. Algoritmos adequados podem ser usados para combinar estas várias imagens para sintetizar uma única imagem da amostra com resolução espacial significativamente maior do que qualquer uma das imagens de componente individual.[000122] Once all images have been captured for the image formation cycle, at operation 570, a high resolution image can be constructed from the captured images. For example, a high-resolution image can be reconstructed from the six images shown in FIG. 6. Suitable algorithms can be used to combine these multiple images to synthesize a single image of the sample with significantly greater spatial resolution than any of the individual component images.

[000123] Deve ser notado que apesar de o método 500 ter sido descrito primariamente no contexto de formação de imagem de canal único (por exemplo, formação de imagem de uma amostra usando a fonte de luz tendo um único comprimento de onda), em algumas implementações o método 500 pode ser adaptado para formação de imagem de múltiplos canais (por exemplo, formação de imagem de uma amostra usando fontes de luz tendo diferentes comprimentos de onda). Em tais implementações, o método 500 pode ser repetido para cada canal do sistema de formação de imagem (por exemplo, em sequência, ou em paralelo) para gerar imagens de alta resolução para cada canal.[000123] It should be noted that although method 500 has been described primarily in the context of single-channel imaging (e.g., imaging a sample using a light source having a single wavelength), in some Implementations method 500 can be adapted for multi-channel imaging (e.g., imaging a sample using light sources having different wavelengths). In such implementations, method 500 may be repeated for each channel of the imaging system (e.g., in sequence, or in parallel) to generate high-resolution images for each channel.

[000124] Apesar das implementações do sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 200 descritas aqui até aqui terem sido descritas no contexto do sistema 200 que usa um espelho 260 com orifícios 261 para combinar sem perdas os caminhos ópticos dos dois braços, em uma implementação alternativa, as duas imagens das grades horizontal e vertical 230A-230B podem ser combinadas sem perdas usando um divisor de feixe de polarização no lugar do espelho com orifícios e para iluminar a grade vertical com luz polarizada de maneira vertical e a grade horizontal com luz polarizada de maneira horizontal. Em tais implementações, o padrão de iluminação estruturada pode ser comutado a partir de horizontal para vertical ligando e desligando as correspondentes fontes de iluminação polarizada.[000124] Although the implementations of the two-arm SIM imaging system 200 described heretofore have been described in the context of system 200 that uses a mirror 260 with holes 261 to losslessly combine the optical paths of the two arms, in In an alternative implementation, the two images of the horizontal and vertical gratings 230A-230B can be losslessly combined using a polarization beam splitter in place of the pinhole mirror and to illuminate the vertical grating with vertically polarized light and the horizontal grating with vertically polarized light. horizontally polarized light. In such implementations, the structured lighting pattern can be switched from horizontal to vertical by turning on and off the corresponding polarized lighting sources.

[000125] Por meio de exemplo, FIG. 7 ilustra um exemplo de projeto experimental de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 700 que usa um divisor de feixe de polarização para combinar os caminhos ópticos dos braços, e que ilumina uma grade vertical com luz polarizada de maneira vertical e a grade horizontal com luz polarizada de maneira horizontal. Na implementação da FIG. 7, as grades horizontal e vertical são G1 e G2, as janelas rotativas horizontal e vertical são W1 e W2, e o divisor de feixe de polarização para combinar as imagens de grade horizontal e vertical é PBS2. A saída de um laser de múltiplos modos de modo embaralhado de fibra acoplada é Fiber1.[000125] By way of example, FIG. 7 illustrates an example experimental design of a two-arm SIM imaging system 700 that uses a polarizing beam splitter to combine the optical paths of the arms, and that illuminates a vertical grating with vertically polarized light and the horizontal grid with horizontally polarized light. In implementing FIG. 7, the horizontal and vertical gratings are G1 and G2, the horizontal and vertical rotating windows are W1 and W2, and the polarization beam splitter for combining the horizontal and vertical grating images is PBS2. The output of a fiber-coupled scrambled-mode multi-mode laser is Fiber1.

[000126] A FIG. 8A ilustra uma imagem espelhada afocal e lâmina fluorescente capturada usando exemplo de sistema de formação de imagem de SIM 700, usando um microscópio 20x/0,75 NA. A imagem espelhada afocal possui visibilidade de franja de 84%. A imagem de lâmina fluorescente possui visibilidade de franja de 6,6%.[000126] FIG. 8A illustrates an afocal mirror image and fluorescent slide captured using an example SIM 700 imaging system, using a 20x/0.75 NA microscope. The afocal mirror image has 84% fringe visibility. The fluorescent slide image has fringe visibility of 6.6%.

[000127] A FIG. 8B ilustra medições de modulação de franjas adquiridas usando o sistema 700 com uma célula de fluxo frisada. O gráfico ilustra alterações típicas de intensidade de imagem do recurso durante um ciclo de ajuste de fase, como quando o ângulo de placa paralela W2 da FIG. 7 é alterado.[000127] FIG. 8B illustrates fringe modulation measurements acquired using system 700 with a crimped flow cell. The graph illustrates typical feature image intensity changes during a phase adjustment cycle, as when parallel plate angle W2 of FIG. 7 is changed.

[000128] A FIG. 9 ilustra outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de dois braços 900 de acordo com algumas implementações descritas aqui. O primeiro braço do sistema 900 inclui um emissor de luz 910A (por exemplo, fibra óptica), um colimador óptico 920A para colimar luz emitida pelo emissor de luz 910A, uma grade de difração 930A em uma primeira orientação com relação ao eixo óptico, e uma lente de retransmissão 940A. O segundo braço do sistema 900 inclui um emissor de luz 910B, um colimador óptico 920B para colimar luz emitida pelo emissor de luz 910B, uma grade de difração 930B em uma segunda orientação com relação ao eixo óptico, e uma lente de retransmissão 940B.[000128] FIG. 9 illustrates another example optical configuration of a two-arm SIM imaging system 900 in accordance with some implementations described herein. The first arm of the system 900 includes a light emitter 910A (e.g., fiber optic), an optical collimator 920A for collimating light emitted by the light emitter 910A, a diffraction grating 930A in a first orientation with respect to the optical axis, and a 940A relay lens. The second arm of the system 900 includes a light emitter 910B, an optical collimator 920B for collimating light emitted by the light emitter 910B, a diffraction grating 930B in a second orientation with respect to the optical axis, and a relay lens 940B.

[000129] O sistema 900 também inclui um elemento de combinação de feixe 950 para combinar os dois braços do sistema óptico. Como ilustrado, o elemento de combinação de feixe 950 inclui um prisma de 45° com orifícios para passar através de luz estruturada do segundo braço do sistema e uma superfície espelhada para refletir luz estruturada recebida do primeiro braço. Antes de entrar o elemento de combinação de feixe 950, cada feixe estruturado de luz passa através de um filtro espacial tendo um par de aberturas para passar as ±1 ordens e bloquear outras ordens. Luz estruturada que emana do primeiro braço em um primeiro plano pode ser direcionada por óptica refletiva 945 para o elemento de combinação de feixe 950. No sistema 900, o elemento óptico de placa paralela 960 serve como um ajustador de fase e pode ser rotado para deslocar luz estruturada em qualquer orientação após o elemento de combinação de feixe 950.[000129] The system 900 also includes a beam combining element 950 for combining the two arms of the optical system. As illustrated, the beam combining element 950 includes a 45° prism with holes for passing structured light from the second arm of the system and a mirrored surface for reflecting structured light received from the first arm. Before entering the beam combining element 950, each structured beam of light passes through a spatial filter having a pair of apertures to pass the ±1 orders and block other orders. Structured light emanating from the first arm in a foreground may be directed by reflective optics 945 to the beam combining element 950. In system 900, the parallel plate optical element 960 serves as a phase adjuster and may be rotated to shift structured light in any orientation after the beam combining element 950.

[000130] Apesar de implementações descritas aqui terem sido descritas até agora no contexto de um sistema de formação de imagem de iluminação estruturada de dois braços que inclui duas grades orientadas em dois ângulos diferentes, deve ser notado que em outras implementações, sistemas com mais do que dois braços podem ser implementados. No caso de uma amostra regularmente padronizada com funcionalidades em uma rede retangular, aprimoramento de resolução pode ser alcançado com apenas dois ângulos perpendiculares (por exemplo, grade vertical e grade horizontal) como descrito acima. Por outro lado, para o aprimoramento de resolução de imagem em todas as direções para outras amostras (por exemplo, amostras padronizadas de maneira hexagonal), três ângulos de grade podem ser usados. Por exemplo, um sistema de três braços pode incluir três emissores de luz e três grades de difração fixadas (uma por braço), onde cada grade de difração é orientada em torno do eixo óptico do sistema para projetar uma respectiva orientação de padrão na amostra (por exemplo, um padrão de 0°, um padrão de 120°, ou um padrão de 240°). Em tais sistemas, espelhos adicionais com orifícios podem ser usados para combinar as imagens adicionais de grades adicionais para o sistema de uma maneira sem perdas. Alternativamente, tais sistemas podem usar um ou mais divisores de feixe de polarização para combinar as imagens de cada uma das grades.[000130] Although implementations described here have been described thus far in the context of a two-arm structured lighting imaging system that includes two gratings oriented at two different angles, it should be noted that in other implementations, systems with more than that two arms can be implemented. In the case of a regularly patterned sample with features on a rectangular grid, resolution enhancement can be achieved with just two perpendicular angles (e.g., vertical grid and horizontal grid) as described above. On the other hand, for image resolution enhancement in all directions for other samples (e.g., hexagonal patterned samples), three grating angles can be used. For example, a three-arm system may include three light emitters and three fixed diffraction gratings (one per arm), where each diffraction grating is oriented around the optical axis of the system to project a respective pattern orientation onto the sample ( for example, a 0° pattern, a 120° pattern, or a 240° pattern). In such systems, additional mirrors with holes can be used to combine additional images from additional gratings into the system in a lossless manner. Alternatively, such systems may use one or more polarizing beam splitters to combine the images from each of the gratings.

[000131] Sistema de formação de imagem de microscopia de iluminação estruturada de lâmina de grade óptica múltipla[000131] Multiple Optical Grid Slide Structured Illumination Microscopy Imaging System

[000132] De acordo com some implementações da tecnologia divulgada aqui, o sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica múltipla, onde um estágio de movimento linear é montado com uma pluralidade de grades de difração (ou outros elementos ópticos de divisão de feixe) tendo uma correspondente orientação fixa com relação ao eixo óptico do sistema.[000132] According to some implementations of the technology disclosed herein, the SIM imaging system can be implemented as a multiple optical grid blade SIM imaging system, where a linear motion stage is mounted with a plurality of diffraction gratings (or other optical beam-splitting elements) having a corresponding fixed orientation with respect to the optical axis of the system.

[000133] As FIGs. 10A-10B são diagramas esquemáticos ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla 1000 de acordo com algumas implementações descritas aqui. As adicionalmente descrita abaixo, na configuração do sistema 1000, todas as alterações para o padrão de grade projetado na amostra 1070 (por exemplo, deslocamentos de fase ou rotações de padrão) podem ser feitas através da translação linear de um estágio de movimento 1030 ao longo de um único eixo de movimento, para selecionar uma grade 1031 ou 1032 (isto é, selecionar a orientação de grade) ou para deslocar de fase uma das grades 1031-1032.[000133] FIGS. 10A-10B are schematic diagrams illustrating an example optical configuration of a dual optical grating blade SIM imaging system 1000 in accordance with some implementations described herein. As further described below, in system configuration 1000, any changes to the grating pattern projected on sample 1070 (e.g., phase shifts or pattern rotations) may be made by linearly translating a motion stage 1030 along of a single axis of motion, to select a grid 1031 or 1032 (i.e., select the grid orientation) or to phase shift one of the grids 1031-1032.

[000134] O sistema 1000 inclui um emissor de luz 1010 (por exemplo, a fibra óptica opticamente acoplada com a fonte de luz), um primeiro colimador óptico 1020 (por exemplo, lente de colimação) para colimar luz emitida pelo emissor de luz 1010, um estágio de movimento linear 1030 montado com uma primeira grade de difração 1031 (por exemplo, grade horizontal) e uma segunda grade de difração 1032 (por exemplo grade vertical), uma lente de projeção 1040, um espelho semirrefletivo 1050 (por exemplo, espelho dicroico), uma objetiva 1060, uma amostra 1070, e uma câmera 1080. Para os propósitos de simplicidade, os componentes ópticos do sistema de formação de imagem de SIM 1000 podem ser omitidos a partir da FIG. 10A. Adicionalmente, apesar de o sistema 1000 ser ilustrado neste exemplo como um sistema de canal único, em outras implementações, ele pode ser implementado como um sistema de múltiplos canais (por exemplo, usando duas diferentes câmeras e fontes de luz que emitem em dois diferentes comprimentos de onda).[000134] The system 1000 includes a light emitter 1010 (e.g., the optical fiber optically coupled with the light source), a first optical collimator 1020 (e.g., collimating lens) for collimating light emitted by the light emitter 1010 , a linear motion stage 1030 assembled with a first diffraction grating 1031 (e.g., horizontal grating) and a second diffraction grating 1032 (e.g., vertical grating), a projection lens 1040, a semi-reflective mirror 1050 (e.g., dichroic mirror), an objective 1060, a sample 1070, and a camera 1080. For the purposes of simplicity, the optical components of the SIM imaging system 1000 may be omitted from FIG. 10A. Additionally, although system 1000 is illustrated in this example as a single-channel system, in other implementations, it may be implemented as a multi-channel system (e.g., using two different cameras and light sources that emit at two different lengths). waveform).

[000135] Como ilustrado pela FIG. 10A, uma grade 1031 (por exemplo, uma grade de difração horizontal) pode difratar um feixe de luz colimada para feixes de luz difratada de primeira ordem (do plano da página). Como ilustrado pela FIG. 10B, uma grade de difração 1032 (por exemplo, a grade de difração vertical) pode difratar um feixe em primeiras ordens (acima e abaixo o plano da página). Nesta configuração apenas um único braço óptico tendo um único emissor 1010 (por exemplo, fibra óptica) e único estágio de movimento linear é necessário para formar imagem de uma amostra 1070, o que pode prover vantagens do sistema tal como reduzir o número de partes móveis do sistema para aprimorar a velocidade, a complexidade e o custo. Adicionalmente, no sistema 1000, a ausência de um polarizador pode prover a vantagem mencionada anteriormente de alta eficiência óptica. A configuração do exemplo de sistema de formação de imagem de SIM 200 pode ser particularmente vantajosa no caso de uma amostra regularmente padronizada 1070 com funcionalidades em uma rede retangular, já que o aprimoramento de resolução estruturada pode ser alcançado usando apenas duas grades perpendiculares (por exemplo, grade vertical e grade horizontal).[000135] As illustrated by FIG. 10A, a grating 1031 (e.g., a horizontal diffraction grating) can diffract a beam of collimated light into beams of first-order diffracted light (from the plane of the page). As illustrated by FIG. 10B, a diffraction grating 1032 (e.g., the vertical diffraction grating) can diffract a beam in first orders (above and below the plane of the page). In this configuration only a single optical arm having a single emitter 1010 (e.g., optical fiber) and single linear motion stage is required to image a sample 1070, which can provide system advantages such as reducing the number of moving parts. of the system to improve speed, complexity and cost. Additionally, in system 1000, the absence of a polarizer can provide the previously mentioned advantage of high optical efficiency. The configuration of the example SIM imaging system 200 may be particularly advantageous in the case of a regularly patterned sample 1070 with features on a rectangular grid, as structured resolution enhancement can be achieved using just two perpendicular grids (e.g. , vertical grid and horizontal grid).

[000136] Para aprimorar a eficiência do sistema, os feixes de ordem zero e todos os outros feixes de difração de ordem superior (isto é, ± 2 ordens ou maior) emitem por cada grade podem ser bloqueados (isto é, filtrados do padrão de iluminação projetado na amostra 1070). Por exemplo, um elemento de bloqueio de feixe (não mostrado) tal como um filtro de ordem pode ser inserido para o caminho óptico após o estágio de movimento 1030. Em algumas implementações, as grades de difração 1031-1032 podem ser configuradas para difratar os feixes apenas para as primeiras ordens e a ordem 0 (feixe não difratado) pode ser bloqueada por algum elemento de bloqueio de feixe.[000136] To improve system efficiency, zero-order beams and all other higher-order (i.e., ±2 orders or greater) diffraction beams emitting from each grating can be blocked (i.e., filtered from the lighting designed on sample 1070). For example, a beam blocking element (not shown) such as an order filter may be inserted into the optical path after motion stage 1030. In some implementations, diffraction gratings 1031-1032 may be configured to diffract the beams only for the first orders and the 0th order (non-diffracted beam) can be blocked by some beam blocking element.

[000137] No exemplo do sistema 1000, as duas grades podem ser arranjadas em cerca de ±45° a partir do eixo de movimento (ou algum outro deslocamento angular a partir do eixo de movimento tal como cerca de +40°/-50°, cerca de + 30°/-60°, etc.) tal que um deslocamento de fase pode ser realizado para cada grade 1031-1032 ao longo de um único eixo de movimento linear. Em algumas implementações, as duas grades podem ser combinadas em um elemento óptico físico. Por exemplo, um lado do elemento óptico físico pode ter um padrão de grade em uma primeira orientação, e um lado adjacente do elemento óptico físico pode ter um padrão de grade em uma segunda orientação ortogonal com a primeira orientação.[000137] In the example of system 1000, the two grids may be arranged at about ±45° from the axis of motion (or some other angular offset from the axis of motion such as about +40°/-50° , about +30°/-60°, etc.) such that a phase shift can be performed for each grating 1031-1032 along a single axis of linear motion. In some implementations, the two gratings can be combined into a physical optical element. For example, one side of the physical optical element may have a grid pattern in a first orientation, and an adjacent side of the physical optical element may have a grid pattern in a second orientation orthogonal to the first orientation.

[000138] O estágio de movimento linear de eixo único 1030 pode incluir um ou mais atuadores para permitir que ele se mova ao longo do eixo X com relação ao plano de amostra, ou ao longo do eixo Y com relação ao plano de amostra. Durante a operação, o estágio de movimento linear 1030 pode prover viagem suficiente (por exemplo, cerca de 12 a 15 mm) e precisão suficiente (por exemplo, cerca de menos do que 0,5 micrometro de repetibilidade) para fazer com que os padrões de iluminação precisos sejam projetados para a reconstrução de imagem eficiente. Nas implementações onde o estágio de movimento 1030 é usado em um sistema de formação de imagem automatizado tal como um microscópio de fluorescência, ele pode ser configurado para prover uma alta velocidade de operação, mínima geração de vibração e um longo tempo de vida de trabalho. Nas implementações, o estágio de movimento linear 1030 pode incluir mancais de rolo cruzados, um motor linear, um codificador linear de alta precisão, e/ou outros componentes. Por exemplo, o estágio de movimento 1030 pode ser implementado como um motor de passo de alta precisão ou estágio de movimento piezo que pode sofrer translação usando um controlador.[000138] The single-axis linear motion stage 1030 may include one or more actuators to allow it to move along the X axis with respect to the sample plane, or along the Y axis with respect to the sample plane. During operation, the linear motion stage 1030 may provide sufficient travel (e.g., about 12 to 15 mm) and sufficient accuracy (e.g., about less than 0.5 micrometer repeatability) to make patterns Precise lighting systems are designed for efficient image reconstruction. In implementations where the motion stage 1030 is used in an automated imaging system such as a fluorescence microscope, it can be configured to provide high operating speed, minimal vibration generation, and a long working life. In implementations, the linear motion stage 1030 may include crossed roller bearings, a linear motor, a high-precision linear encoder, and/or other components. For example, motion stage 1030 may be implemented as a high-precision stepper motor or piezo motion stage that can be translated using a controller.

[000139] A FIG. 11 é um diagrama de fluxo operacional ilustrando um exemplo de método 1100 que pode ser realizado por um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica múltipla durante um ciclo de formação de imagem para usar luz estruturada para criar uma imagem de alta resolução de acordo com algumas implementações descritas aqui. Dependendo da implementação, o método 1100 pode ser realizado para formar imagem de toda uma amostra ou uma localização de uma amostra maior. Método 1100 será descrito em conjunto com a FIG. 12, que ilustra padrões de franjas de iluminação simplificada que podem ser projetados para o plano de uma amostra 1070 por uma primeira grade de difração e uma segunda grade de difração de um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla durante a captura da imagem. Por exemplo, um sistema de formação de imagem de SIM 1000 pode usar uma primeira grade de difração 1031 e uma segunda grade de difração 1032 para gerar os padrões de iluminação mostrados na FIG. 12. Como ilustrado no exemplo da FIG. 12, as duas grades projetam padrões de franjas perpendiculares na superfície da amostra 1070 e são arranjados em cerca de ±45° a partir do eixo de movimento do estágio de movimento linear 1030.[000139] FIG. 11 is an operational flow diagram illustrating an example method 1100 that may be performed by a multiple optical grid blade SIM imaging system during an imaging cycle to use structured light to create a high-resolution image. according to some implementations described here. Depending on the implementation, method 1100 may be performed to image an entire sample or a location of a larger sample. Method 1100 will be described in conjunction with FIG. 12, which illustrates simplified illumination fringe patterns that may be projected onto the plane of a sample 1070 by a first diffraction grating and a second diffraction grating of a dual optical grating blade SIM imaging system during image capture. For example, a SIM imaging system 1000 may use a first diffraction grating 1031 and a second diffraction grating 1032 to generate the illumination patterns shown in FIG. 12. As illustrated in the example in FIG. 12, the two grids project perpendicular fringe patterns onto the surface of the sample 1070 and are arranged at about ±45° from the axis of motion of the linear motion stage 1030.

[000140] Na operação 1110, a fonte de luz é ligada. Por exemplo, um obturador óptico pode ser atuado para acoplar opticamente a fibra óptica do emissor de luz 1010 com a fonte de luz. Como outro exemplo, a fonte de luz pode ser pulsada ou um comutador óptico pode ser usado para direcionar a fonte de luz através do caminho óptico do emissor de luz. Na operação 1120, um primeiro padrão de grade pode ser projetado na amostra e uma imagem pode ser capturada. Por exemplo, como ilustrado pela FIG. 12, uma primeira grade (por exemplo, grade 1031), pode projetar franjas de iluminação de primeira ordem na amostra 1070. Qualquer luz emitida pela amostra pode ser capturada pela câmera 1080 e uma primeira imagem de fase do primeiro padrão (por exemplo, padrão de +45°) pode ser capturada. Por exemplo, corantes fluorescentes situados em diferentes funcionalidades da amostra 1070 pode fluorescer e a luz resultante pode ser coletada pela lente objetiva 1060 e direcionada para um sensor de imagem da câmera 1080 para detectar a fluorescência.[000140] In operation 1110, the light source is turned on. For example, an optical shutter may be actuated to optically couple the optical fiber of the light emitter 1010 with the light source. As another example, the light source may be pulsed or an optical switch may be used to direct the light source through the optical path of the light emitter. In operation 1120, a first grid pattern may be projected onto the sample and an image may be captured. For example, as illustrated by FIG. 12, a first grating (e.g., grating 1031), may project first-order illumination fringes onto sample 1070. Any light emitted by the sample may be captured by camera 1080 and a first phase image of the first pattern (e.g., pattern +45°) can be captured. For example, fluorescent dyes located in different features of the sample 1070 may fluoresce and the resulting light may be collected by the objective lens 1060 and directed to an image sensor of the camera 1080 to detect the fluorescence.

[000141] Para capturar adicionais imagens deslocadas em fase, na operação 1140 o padrão projetado pela grade pode ser deslocado em fase fazendo a translação do estágio de movimento linear. No exemplo da FIG. 12, estes movimentos de deslocamento de fase são ilustrados como as etapas 1 e 2. Os movimentos de deslocamento de fase podem prover pequenos movimentos (por exemplo, cerca de 3 a 5 micrometros ou menos) das grades para deslocar levemente o padrão de franjas projetado na grade.[000141] To capture additional phase-shifted images, in operation 1140 the pattern projected by the grid can be phase-shifted by translating the linear motion stage. In the example of FIG. 12, these phase shift movements are illustrated as steps 1 and 2. The phase shift movements can provide small movements (e.g., about 3 to 5 micrometers or less) of the gratings to slightly shift the projected fringe pattern. on the grid.

[000142] Por meio de particular exemplo, considere o caso onde o passo À da franja na amostra da FIG. 11 é de 2100 nm. Neste caso, três imagens deslocadas em fase são capturadas na amostra, necessitando que os deslocamentos de fase das franjas projetadas sejam de À/3, ou 700 nm. Assumindo que uma ampliação de iluminação de objetiva de 10X, as etapas de deslocamento de fase (translações lineares) necessárias do estágio de movimento linear de eixo único podem ser calculadas como 700 nm * 10 * sqrt(2), ou cerca de 9,9 μm. Neste caso, o fator sqrt(2) leva em conta o deslocamento de 45 graus entre a orientação da grade e o eixo de movimento do estágio de movimento. De maneira mais geral, a distância de translação do estágio de movimento linear durante cada etapa de deslocamento de fase nesta configuração de exemplo pode ser descrita por | x MAG X 2ÀX onde MAG é a ampliação de iluminação.[000142] By way of particular example, consider the case where the step À of the fringe in the sample of FIG. 11 is 2100 nm. In this case, three phase-shifted images are captured on the sample, requiring the phase shifts of the projected fringes to be À/3, or 700 nm. Assuming a 10X objective illumination magnification, the required phase shift steps (linear translations) of the single-axis linear motion stage can be calculated as 700 nm * 10 * sqrt(2), or about 9.9 μm. In this case, the factor sqrt(2) takes into account the 45 degree offset between the grid orientation and the movement axis of the movement stage. More generally, the translational distance of the linear motion stage during each phase shift step in this example configuration can be described by | x MAG X 2ÀX where MAG is the illumination magnification.

[000143] Seguindo a captura de todas as imagens deslocadas em fase para uma grade de difração (decisão 1130), na operação 1160 o sistema pode comutar as grades de difração fazendo a translação do estágio de movimento linear para acoplar opticamente outra grade de difração com a fonte de luz do sistema de formação de imagem (por exemplo, transição de FIG. 10A à FIG. 10B). Este movimento é ilustrado como a etapa 3 no exemplo da FIG. 12. No caso de alterações de grade de difração, o estágio de movimento linear pode prover uma translação relativamente grande (por exemplo, na ordem de 12 a 15 mm).[000143] Following the capture of all phase-shifted images to a diffraction grating (decision 1130), in operation 1160 the system can switch the diffraction gratings by translating the linear motion stage to optically couple another diffraction grating with the light source of the imaging system (e.g., transition from FIG. 10A to FIG. 10B). This movement is illustrated as step 3 in the example of FIG. 12. In the case of diffraction grating changes, the linear motion stage can provide a relatively large translation (e.g., on the order of 12 to 15 mm).

[000144] Uma série de imagens de fase, então, podem ser capturadas para a próxima grade através da repetição das operações 1120 a 1140. Por exemplo, como ilustrado pela FIG. 12, uma segunda grade de difração pode projetar franjas de iluminação de primeira ordem na amostra 271, e as franjas projetadas podem ser deslocadas na posição por À/3 fazendo a translação do estágio de movimento linear para capturar três imagens de fase do padrão de grade (por exemplo, etapas 4 e 5 da FIG. 12) .[000144] A series of phase images can then be captured for the next grid by repeating operations 1120 to 1140. For example, as illustrated by FIG. 12, a second diffraction grating may project first-order illumination fringes onto sample 271, and the projected fringes may be shifted in position by À/3 translating the linear motion stage to capture three phase images of the grating pattern. (e.g., steps 4 and 5 of FIG. 12).

[000145] Uma vez que todas as imagens foram capturadas para o ciclo de formação de imagem, na operação 1170, uma imagem de alta resolução pode ser construída a partir das imagens capturadas. Por exemplo, uma imagem de alta resolução pode ser reconstruída a partir de seis imagens mostradas esquematicamente na FIG. 12. Como o exemplo anterior ilustra, um sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica múltipla vantajosamente pode comutar entre ângulos de franja e fases com um único atuador linear, economizando desta forma no custo e na complexidade do sistema de formação de imagem de iluminação estruturada.[000145] Once all images have been captured for the image formation cycle, at operation 1170, a high resolution image can be constructed from the captured images. For example, a high-resolution image can be reconstructed from six images shown schematically in FIG. 12. As the previous example illustrates, a multiple optical grating blade SIM imaging system can advantageously switch between fringe angles and phases with a single linear actuator, thereby saving on the cost and complexity of the imaging system. structured lighting image.

[000146] A FIG. 13 é um diagrama ilustrando um exemplo de configuração de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla 1300. Como ilustrado, a configuração 1300 pode incluir uma fibra óptica 1310 para emitir luz, um colimador 1320, um estágio de movimento linear 1330 montado com a primeira e a segunda grades de difração 1331-1332, uma lente de projeção 1340, e um espelho rotativo 1350. Neste exemplo, as grades 1331-1332 são incorporadas no mesmo objeto, adjacentes entre si ao longo do eixo de movimento do estágio 1330. Outros componentes não mostrados podem ser similares com aqueles na FIG 10A, tais como o espelho dicroico 1050, a objetiva 1060 e a amostra 1070.[000146] FIG. 13 is a diagram illustrating an example dual optical grating blade SIM imaging configuration 1300. As illustrated, the configuration 1300 may include an optical fiber 1310 for emitting light, a collimator 1320, a linear motion stage 1330 mounted with first and second diffraction gratings 1331-1332, a projection lens 1340, and a rotating mirror 1350. In this example, the gratings 1331-1332 are embedded in the same object, adjacent to each other along the axis of motion of the stage. 1330. Other components not shown may be similar to those in FIG. 10A, such as the dichroic mirror 1050, the objective 1060, and the sample 1070.

[000147] Em algumas implementações, o estágio de movimento linear ou lâmina do sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla pode ser montado com um ou mais adicionais padrões de frequência inferior para auxiliar com o alinhamento do padrão de franjas que é projetado na amostra pelas grades de formação de imagem (por exemplo, as duas grades arranjadas em cerca de ±45° a partir do eixo de movimento do estágio de movimento linear). Por exemplo, o estágio de movimento linear 1030 das FIGs. 10A- 10B pode ser montado com o padrão de alinhamento adicional, ou o estágio de movimento linear 1330 da FIG. 13 pode ser montado com o padrão de alinhamento adicional. Nos casos onde as duas grades de formação de imagem são incorporadas no mesmo substrato como representado na FIG. 13, a grade de alinhamento também pode ser incorporada neste substrato, ou pode ser incorporado em um substrato separado. O padrão de alinhamento pode ser posicionado entre as duas grades de formação de imagem ou em alguma outra posição adequada do estágio de movimento.[000147] In some implementations, the linear motion stage or blade of the dual optical grating blade SIM imaging system may be mounted with one or more additional lower frequency patterns to assist with alignment of the fringe pattern that is projected onto the sample by the imaging gratings (e.g., the two gratings arranged at about ±45° from the motion axis of the linear motion stage). For example, the linear motion stage 1030 of FIGS. 10A-10B may be assembled with the additional alignment pattern, or the linear motion stage 1330 of FIG. 13 can be mounted with the additional alignment pattern. In cases where the two image forming gratings are embedded in the same substrate as depicted in FIG. 13, the alignment grid may also be embedded in this substrate, or may be embedded in a separate substrate. The alignment pattern may be positioned between the two imaging grids or at some other suitable position of the motion stage.

[000148] O padrão de alinhamento, quando iluminado, pode ser configurado para projetar um padrão tendo uma frequência inferior e/ou maior passo em uma amostra. Em virtude destas características, alinhamento grosseiro das grades com relação à amostra pode ser facilitado. O padrão de alinhamento pode ser implementado como linhas paralelas, linhas ortogonais, e/ou uma grade tendo uma frequência inferior de fendas do que as outras grades. Em algumas implementações, múltiplos padrões de alinhamento podem ser usados. A FIG. 17 mostra um exemplo de um padrão de alinhamento que pode ser usado nas implementações da descrição. Como ilustrado neste exemplo, uma marca de padrão de alinhamento 1605 é implementada no mesmo substrato como uma grade 1615, fora da abertura liberada 1625. Neste exemplo, o padrão de alinhamento é implementado como dois conjuntos de linhas ortogonais. Em virtude desta implementação, a inclinação de grade pode ser verificada. Em algumas implementações, o padrão de alinhamento ilustrado pode ser implementado em múltiplas áreas (por exemplo, quatro cantos de um substrato).[000148] The alignment pattern, when illuminated, can be configured to project a pattern having a lower frequency and/or higher pitch onto a sample. Due to these characteristics, rough alignment of the grids with respect to the sample can be facilitated. The alignment pattern can be implemented as parallel lines, orthogonal lines, and/or a grid having a lower frequency of slits than the other grids. In some implementations, multiple alignment patterns may be used. FIG. 17 shows an example of an alignment pattern that can be used in implementations of the description. As illustrated in this example, an alignment pattern mark 1605 is implemented on the same substrate as a grid 1615, outside the released opening 1625. In this example, the alignment pattern is implemented as two sets of orthogonal lines. By virtue of this implementation, the grid tilt can be checked. In some implementations, the illustrated alignment pattern may be implemented in multiple areas (e.g., four corners of a substrate).

[000149] Durante o uso, o padrão de alinhamento pode ser iluminado para projetar um padrão. O padrão de alinhamento pode ser usado durante a fabricação do sistema de formação de imagem de SIM, após a instalação de campo, ou durante uma verificação de engenheiro de serviço de campo. Em algumas implementações, o padrão de alinhamento pode ser usado durante a operação do sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla. Por exemplo, o padrão de alinhamento pode ser iluminado para projetar um padrão de alinhamento antes da formação de imagem de uma amostra começar.[000149] During use, the alignment pattern can be illuminated to project a pattern. The alignment pattern can be used during manufacturing of the SIM imaging system, after field installation, or during a field service engineer check. In some implementations, the alignment pattern may be used during operation of the dual optical grating blade SIM imaging system. For example, the alignment pattern may be illuminated to project an alignment pattern before imaging of a sample begins.

[000150] Em algumas implementações do sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla, um modulador de fase óptica (por exemplo, uma janela rotativa) que é um componente separado do que o estágio de movimento linear pode ser usado para o ajuste de fase. Em tais implementações, o modulador de fase óptica pode ser usado para ajuste de fase inserido do estágio de movimento linear (por exemplo, o estágio de movimento linear pode ser usado apenas para comutar entre as duas grades). Em virtude de tais implementações, a velocidade, a precisão, e/ou a confiabilidade do sistema podem ser aprimoradas potencialmente através da diminuição substancial do número de translações necessárias com o tempo pelo estágio de movimento e não necessitando usar um estágio de movimento para fazer translações finas (por exemplo, na ordem de μm) para selecionar uma fase.[000150] In some implementations of the dual optical grating blade SIM imaging system, an optical phase modulator (e.g., a rotating window) that is a separate component than the linear motion stage may be used to phase adjustment. In such implementations, the optical phase modulator may be used for inset phase adjustment of the linear motion stage (e.g., the linear motion stage may be used only to switch between the two grids). By virtue of such implementations, the speed, accuracy, and/or reliability of the system can potentially be improved by substantially decreasing the number of translations required over time by the motion stage and not needing to use a motion stage to make translations. (e.g., on the order of μm) to select a phase.

[000151] O modulador de fase óptica pode ser posicionado no caminho de luz entre a fonte de luz e a amostra, após as grades (por exemplo, diretamente após o estágio de movimento). A FIG. 19 ilustra alguns componentes de um exemplo de sistema de formação de imagem de SIM de lâmina de grade óptica dupla 1900 de acordo com tais implementações. Como mostrado, o sistema 1900 inclui um emissor de luz 1910 (por exemplo, fibra óptica opticamente acoplada com a fonte de luz), um primeiro colimador óptico 1920 (por exemplo, lente de colimação) para colimar luz emitida pelo emissor de luz 1910, um estágio de movimento linear 1930 montado com uma primeira grade de difração 1931 (por exemplo, grade horizontal) e uma segunda grade de difração 1932 (por exemplo grade vertical), e um modulador de fase óptica 1940 para deslocar de fase a luz emitida difratada por cada grade.[000151] The optical phase modulator can be positioned in the light path between the light source and the sample, after the gratings (e.g., directly after the movement stage). FIG. 19 illustrates some components of an exemplary dual optical grating blade SIM imaging system 1900 in accordance with such implementations. As shown, the system 1900 includes a light emitter 1910 (e.g., optical fiber optically coupled to the light source), a first optical collimator 1920 (e.g., collimating lens) for collimating light emitted by the light emitter 1910, a linear motion stage 1930 assembled with a first diffraction grating 1931 (e.g., horizontal grating) and a second diffraction grating 1932 (e.g., vertical grating), and an optical phase modulator 1940 for phase shifting the diffracted emitted light for each grid.

[000152] Sistema de formação de imagem de microscopia de iluminação estruturada Sistema de seleção espacial de ângulo padrão[000152] Structured Illumination Microscopy Imaging System Standard Angle Spatial Selection System

[000153] De acordo com some implementações da tecnologia divulgada aqui, o sistema de formação de imagem de SIM pode ser implementado como um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão, em que uma grade de difração bidimensional fixa é usada em combinação com uma roda de filtro espacial para projetar padrões de difração unidimensionais na amostra.[000153] According to some implementations of the technology disclosed herein, the SIM imaging system can be implemented as a standard angle spatial selection SIM imaging system, in which a fixed two-dimensional diffraction grating is used. in combination with a spatial filter wheel to project one-dimensional diffraction patterns onto the sample.

[000154] A FIG. 14 é um diagrama esquemático ilustrando um exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão 1400 de acordo com algumas implementações descritas aqui. Para a simplicidade, os componentes ópticos do sistema de formação de imagem de SIM 1400 podem ser omitidos a partir da FIG. 14. Adicionalmente, apesar de o sistema 1400 ser ilustrado neste exemplo como um único sistema de canal, em outras implementações, ele pode ser implementado como um sistema de múltiplos canais (por exemplo, usando duas câmeras diferentes e fontes de luz que emitem em dois diferentes comprimentos de onda).[000154] FIG. 14 is a schematic diagram illustrating an example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system 1400 in accordance with some implementations described herein. For simplicity, the optical components of the SIM 1400 imaging system may be omitted from FIG. 14. Additionally, although system 1400 is illustrated in this example as a single channel system, in other implementations, it may be implemented as a multiple channel system (e.g., using two different cameras and light sources that emit in two different wavelengths).

[000155] Como ilustrado, o sistema 1400 inclui um emissor de luz 1410 (por exemplo, fibra óptica), um colimador 1420 para colimar luz emitida pelo emissor 1410, uma grade bidimensional 1430, um bloqueador de feixe de ordem zero 1440, um modulador de fase óptica 1450, uma lente de projeção 1460, uma roda de filtro espacial 1470, um espelho dicroico 1480, uma objetiva 1490, uma amostra 1491, e uma câmera 1495.[000155] As illustrated, the system 1400 includes a light emitter 1410 (e.g., fiber optic), a collimator 1420 for collimating light emitted by the emitter 1410, a two-dimensional grating 1430, a zero-order beam blocker 1440, a modulator phase sensor 1450, a projection lens 1460, a spatial filter wheel 1470, a dichroic mirror 1480, an objective 1490, a sample 1491, and a camera 1495.

[000156] Nesta configuração de exemplo, a grade 1430 é uma grade de difração de transmissão bidimensional configurada para difratar um feixe de entrada para um número de ordens (por exemplo, 0 ordem, ± 1 ordens, ± 2 ordens, etc.) em duas direções perpendiculares. Para aprimorar a eficiência e o desempenho do sistema, os feixes de ordem zero e todos os outros feixes de ordem superior (isto é, ± 2 ordens ou maior) podem ser bloqueados (isto é, filtrados do padrão de iluminação projetado na amostra 1491). Enquanto maiores ordens podem ser difratadas em ângulos maiores onde elas podem ser filtradas usando uma variedade de elementos de filtração, o componente de ordem 0 passa direto através da grade no caminho de feixe para a amostra. Para bloquear o componente de ordem 0, um elemento de bloqueio de feixe 1440 pode ser inserido para o caminho óptico após a grade de difração bidimensional 1430. Por exemplo, o elemento de bloqueio de feixe 1440 pode ser uma Grade de Bragg de Volume (VBG), um elemento óptico difrativo que pode ser padronizado para refletir luz normal para o elemento (por exemplo, 0- order light) e passar através da luz em outros ângulos, tal como as ordens +1 & -1. Com a ordem 0 removida, óptica menos e mais compacta pode ser usada para focalizar as ordens +1 & -1 para a lente objetiva.[000156] In this example configuration, the grating 1430 is a two-dimensional transmission diffraction grating configured to diffract an input beam to a number of orders (e.g., 0 order, ±1 orders, ±2 orders, etc.) in two perpendicular directions. To improve system efficiency and performance, zero-order beams and all other higher-order beams (i.e., ±2 orders or greater) can be blocked (i.e., filtered from the illumination pattern projected onto sample 1491) . While higher orders can be diffracted at larger angles where they can be filtered using a variety of filtration elements, the 0th order component passes straight through the grating on the beam path to the sample. To block the 0th order component, a beam blocking element 1440 may be inserted into the optical path after the two-dimensional diffraction grating 1430. For example, the beam blocking element 1440 may be a Volume Bragg Grating (VBG). ), a diffractive optical element that can be patterned to reflect light normal to the element (e.g., 0-order light) and pass through light at other angles, such as +1 & -1 orders. With the 0 order removed, fewer and more compact optics can be used to focus the +1 & -1 orders for the objective lens.

[000157] O modulador de fase óptica 1450 (por exemplo, uma janela rotativa) pode ser usado para alterar a fase da luz incidente para ajustar a posição de fase padrão na amostra 1491. Por exemplo, o modulador de fase óptica 1450 pode incluir uma variedade de elementos ópticos móveis, incluindo uma óptica de placa paralela inclinada em um ângulo variável para o eixo óptico, uma óptica de cunha rotada em torno do eixo óptico, um espelho inclinado para fazer a translação do feixe, elementos eletro-ópticos, ou elementos acústico-ópticos. Em uma implementação particular, o modulador de fase óptica 1450 pode ser implementado como uma óptica de placa paralela inclinada em duas direções perpendiculares para ajustar a fase de dois padrões de ângulo de grade diferentes. Alternativamente, em algumas implementações, a posição de fase padrão pode ser ajustada movendo a amostra (por exemplo, usando um estágio de movimento) enquanto o padrão projetado permanece estacionário, ou movendo tanto a amostra quanto o padrão projetado.[000157] Optical phase modulator 1450 (e.g., a rotating window) may be used to change the phase of incident light to adjust the standard phase position in sample 1491. For example, optical phase modulator 1450 may include a variety of movable optical elements, including a parallel plate optic tilted at a variable angle to the optical axis, a wedge optic rotated about the optical axis, a mirror tilted to translate the beam, electro-optical elements, or acoustic-optical. In a particular implementation, the optical phase modulator 1450 may be implemented as a parallel plate optic tilted in two perpendicular directions to adjust the phase of two different grating angle patterns. Alternatively, in some implementations, the pattern phase position may be adjusted by moving the sample (e.g., using a motion stage) while the projected pattern remains stationary, or by moving both the sample and the projected pattern.

[000158] No exemplo do sistema 1400, uma roda de filtro espacial rotativa 1470 pode incluir uma pluralidade de orifícios orientados em duas direções perpendiculares (por exemplo, um conjunto vertical de orifícios 1471 e um conjunto horizontal de orifícios 1472) para selecionar uma imagem de grade vertical ou uma imagem de grade horizontal para a projeção na amostra 1491. Por exemplo, através da rotação de a roda de filtro espacial, as +/- 1 ordens de um dos padrões de grade podem passar através de um conjunto de orifícios para gerar um padrão de franjas horizontal ou vertical na amostra 1491. Nas implementações, a roda de filtro espacial 1470 pode ser implementada como uma máscara de peso leve ou filtro espacial (por exemplo, um disco rotativo incluindo uma pluralidade de portas ou aberturas).[000158] In the example system 1400, a rotating spatial filter wheel 1470 may include a plurality of holes oriented in two perpendicular directions (e.g., a vertical set of holes 1471 and a horizontal set of holes 1472) to select an image from vertical grid or a horizontal grid image for projection onto sample 1491. For example, by rotating the spatial filter wheel, the +/- 1 orders of one of the grid patterns can pass through a set of holes to generate a horizontal or vertical fringe pattern on the sample 1491. In implementations, the spatial filter wheel 1470 may be implemented as a lightweight mask or spatial filter (e.g., a rotating disk including a plurality of ports or openings).

[000159] Na configuração do sistema 1400, os componentes ópticos primários do sistema 1400 podem permanecer estacionários, o que pode aprimorar a estabilidade do sistema óptico (e do padrão de iluminação) e minimizar o peso, a saída de vibração e o custo dos elementos móveis. Como parte da intensidade do feixe (por exemplo, até 50%) pode precisar ser filtrada em qualquer orientação da roda de filtro espacial 1470, em algumas implementações o filtro espacial pode ser configurado para refletir os feixes desnecessários (por exemplo, o padrão de ordens de grade de difração que não é passado através) para uma descarga de feixe para o apropriado gerenciamento de calor.[000159] In the system 1400 configuration, the primary optical components of the system 1400 can remain stationary, which can improve the stability of the optical system (and lighting pattern) and minimize the weight, vibration output, and cost of the elements. furniture. Because some of the beam intensity (e.g., up to 50%) may need to be filtered at any orientation of the spatial filter wheel 1470, in some implementations the spatial filter may be configured to reflect unnecessary beams (e.g., the order pattern grating that is not passed through) to a beam discharge for proper heat management.

[000160] A FIG. 15 é um diagrama esquemático ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão 1500 de acordo com algumas implementações descritas aqui. No exemplo de sistema de formação de imagem 1500, as funções da grade de transmissão bidimensional e elemento de bloqueio de feixe podem ser integradas com uma óptica sólida 1510. Adicionalmente, a função de uma lente de projeção pode ser integrada com óptica sólida 1510. Neste exemplo de implementação, uma grade de transmissão bidimensional 1511 é fabricada em ou de outra forma disposta sobre uma face de óptica 1510 que recebe luz colimada a partir do emissor 1410 (a entrada de óptica 1510). Os ângulos de dispersão da grade 1511 podem ser arranjados tal que a ordem 0 luz pode ser bloqueada no lado distante da óptica. As ordens +1 & -1 desejadas, em ambas as direções, podem sair da óptica 1510 através de faces anguladas 1512 (a saída de óptica 1510) que difrata as ordens +1 & -1 em uma direção opticamente desejável. Estas faces de saída podem incluir lentes de focalização difrativas. Alternativamente, uma óptica separada pode ser usada como uma lente de projeção para focalizar os feixes para a objetiva 1490. No sistema 1500, um deslocador de fase 1450 e a máscara de filtro espacial rotativo 1470 podem ser usados como descrito acima.[000160] FIG. 15 is a schematic diagram illustrating another example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system 1500 in accordance with some implementations described herein. In the example imaging system 1500, the functions of the two-dimensional transmission grating and beam blocking element may be integrated with solid optics 1510. Additionally, the function of a projection lens may be integrated with solid optics 1510. In this example implementation, a two-dimensional transmission grating 1511 is fabricated on or otherwise disposed on an optics face 1510 that receives collimated light from the emitter 1410 (the optics input 1510). The scattering angles of the grating 1511 can be arranged such that order 0 light can be blocked on the far side of the optics. The desired +1 & -1 orders, in both directions, can exit the optics 1510 through angled faces 1512 (the optics exit 1510) that diffracts the +1 & -1 orders in an optically desirable direction. These exit faces may include diffractive focusing lenses. Alternatively, a separate optic may be used as a projection lens to focus the beams to the objective 1490. In the system 1500, a phase shifter 1450 and the rotating spatial filter mask 1470 may be used as described above.

[000161] A FIG. 16 é um diagrama esquemático ilustrando outro exemplo de configuração óptica de um sistema de formação de imagem de SIM de seleção espacial de ângulo padrão 1600 de acordo com algumas implementações descritas aqui. No exemplo de sistema de formação de imagem 1600, uma óptica sólida 1610 novamente pode ser usada para integrar as funções de uma grade bidimensional e um elemento de bloqueio de feixe. Adicionalmente pode integrar a função de uma lente de projeção. Em contraste com o exemplo de sistema de formação de imagem 1600, a entrada de óptica sólida 1610 é uma janela de entrada ou abertura 1614 que guia a luz recebida para uma grade refletiva bidimensional 1611. Como a grade 1611 é refletiva neste exemplo, a luz de ordem 0 pode ser refletida de volta através da janela de entrada 1614. As +1 & -1 ordens desejadas da luz difratada, em cada uma das direções perpendiculares, podem refletir de respectivas faces internas revestidas de maneira refletiva 1613 da óptica 1610, e saem através de faces de saída 1612. Nas implementações, estas faces de saída podem incluir as lentes de focalização difrativas. Alternativamente, uma óptica de lente de projeção separada 1615 pode ser usada para focalizar os feixes para a objetiva 1490. No sistema 1600, um deslocador de fase 1450 e máscara de filtro espacial rotativo 1470 podem ser usados como descrito acima.[000161] FIG. 16 is a schematic diagram illustrating another example optical configuration of a standard angle spatial selection SIM imaging system 1600 in accordance with some implementations described herein. In the example imaging system 1600, a solid optic 1610 again may be used to integrate the functions of a two-dimensional grating and a beam blocking element. Additionally, it can integrate the function of a projection lens. In contrast to the example imaging system 1600, the solid optics input 1610 is an input window or aperture 1614 that guides incoming light onto a two-dimensional reflective grating 1611. Because the grating 1611 is reflective in this example, the light of order 0 may be reflected back through the input window 1614. The desired +1 & -1 orders of diffracted light, in each of the perpendicular directions, may reflect from respective reflectively coated inner faces 1613 of the optic 1610, and exit through exit faces 1612. In implementations, these exit faces may include diffractive focusing lenses. Alternatively, a separate projection lens optic 1615 can be used to focus the beams to the objective 1490. In system 1600, a phase shifter 1450 and rotating spatial filter mask 1470 can be used as described above.

[000162] Apesar de algumas implementações da descrição terem sido ilustradas nas figuras no contexto dos sistemas de formação de imagem de SIM que usam uma ou mais óptica para formar novamente a imagem da luz de excitação coletada (por exemplo, luz coletada novamente pela objetiva) para um sensor de imagem (por exemplo, um sensor de câmera de CCD), deve ser percebido que as várias implementações descritas aqui podem se aplicar aos sistemas de formação de imagem de SIM que usam um sensor de imagem (por exemplo, um sensor de CMOS) que é em um plano ativo de uma amostra de imagem formada. Por meio de exemplo ilustrativo, a FIG. 18, ilustra uma amostra 1710 que pode ser formada sobre um conjunto de sensor de imagem 1740 de um sistema de formação de imagem de SIM, de acordo com algumas implementações descritas aqui. Por exemplo, funcionalidades da amostra podem ser alinhadas de maneira fotolitográfica com pixels do sensor de imagem. Qualquer luz emitida pela amostra padronizada 1710 em resposta à iluminação estruturada é coletada pelo conjunto de sensor de imagem 1740, que é posicionado diretamente abaixo sample 1710 neste exemplo. A formação de imagem 1710 sobre o conjunto de sensor de imagem 1740 pode prover a vantagem de garantir que funcionalidades padronizadas 1711 da amostra 1710 permanecem alinhadas com relação aos particulares fotosítios (por exemplo, pixels) de conjunto de sensor de imagem 1740 durante a formação de imagem.[000162] Although some implementations of the description have been illustrated in the figures in the context of SIM imaging systems that use one or more optics to re-image collected excitation light (e.g., light re-collected by the objective) for an image sensor (e.g., a CCD camera sensor), it should be realized that the various implementations described here may apply to SIM imaging systems that use an image sensor (e.g., a CMOS) that is in an active plane of a formed image sample. By way of illustrative example, FIG. 18, illustrates a sample 1710 that can be formed on an image sensor assembly 1740 of a SIM imaging system, in accordance with some implementations described herein. For example, sample features can be photolithographically aligned with image sensor pixels. Any light emitted by the patterned sample 1710 in response to structured lighting is collected by the image sensor assembly 1740, which is positioned directly below sample 1710 in this example. Image formation 1710 on image sensor assembly 1740 may provide the advantage of ensuring that standardized features 1711 of sample 1710 remain aligned with respect to the particular photosites (e.g., pixels) of image sensor assembly 1740 during image formation. image.

[000163] A amostra 1710 pode ser padronizada e alinhada com o conjunto de sensor de imagem 1740 tal que cada sensor de luz (por exemplo, pixel) do sensor de imagem 1740 possui uma ou mais funcionalidades 1711 formadas e/ou montadas acima. Como ilustrado no exemplo da FIG. 18, a amostra 1710 é padronizada sobre o conjunto de sensor de imagem 1740 tal que uma funcionalidade 1711 é formada sobre cada pixel do arranjo de pixel de conjunto de sensor de imagem 1740. Em outras implementações, mais do que uma funcionalidade pode ser formada sobre cada pixel.[000163] The sample 1710 may be patterned and aligned with the image sensor assembly 1740 such that each light sensor (e.g., pixel) of the image sensor 1740 has one or more features 1711 formed and/or mounted above. As illustrated in the example of FIG. 18, sample 1710 is patterned over image sensor assembly 1740 such that a feature 1711 is formed over each pixel of the image sensor assembly 1740 pixel array. In other implementations, more than one feature may be formed over each pixel.

[000164] No caso de uma amostra fluorescente, por exemplo, funcionalidades iluminadas 1711 da amostra pode fluorescer em resposta à luz de excitação ilustrada 1760, e a luz resultante 1761 emitida de funcionalidades 1711 pode ser coletada pelos fotosítios (por exemplo, pixels) do conjunto de sensor de imagem 1740 para detectar a fluorescência. Por exemplo, como ilustrado pela FIG. 18, os pixels (1,1) e (1,3) do conjunto de sensor de imagem 1740 podem coletar luz 1761 que é emitida pelo recurso 1711 da amostra que é posicionada ou padronizada sobre ela. Em algumas implementações, uma camada (não mostrado) pode prover isolamento entre a amostra 1710 e o conjunto de sensor de imagem 1740 (por exemplo, parra blindar o conjunto de sensor de imagem a partir de um ambiente fluídico da amostra). Em outras implementações, a amostra 1710 pode ser montada e alinhada sobre o conjunto de sensor de imagem 1740.[000164] In the case of a fluorescent sample, for example, illuminated features 1711 of the sample may fluoresce in response to illustrated excitation light 1760, and the resulting light 1761 emitted from features 1711 may be collected by the photosites (e.g., pixels) of the 1740 image sensor assembly to detect fluorescence. For example, as illustrated by FIG. 18, pixels (1,1) and (1,3) of image sensor assembly 1740 may collect light 1761 that is emitted by feature 1711 of the sample that is positioned or patterned thereon. In some implementations, a layer (not shown) may provide isolation between the sample 1710 and the image sensor assembly 1740 (e.g., to shield the image sensor assembly from a fluidic environment of the sample). In other implementations, the sample 1710 may be mounted and aligned over the image sensor assembly 1740.

[000165] Deve ser notado que apesar de a FIG. 18 ilustrar um exemplo de representação de um sistema de formação de imagem de SIM onde as imagens de SIM se alinham com as funcionalidades da amostra na orientação correta, na prática isto não necessariamente ou tipicamente é o caso para a formação de imagem de SIM. Por exemplo, com o tempo e/ou o espaço, pode ser derivado no espaçamento entre as adjacentes franjas, a fase ou o ângulo do padrão de iluminação estruturada, e/ou a orientação do padrão de franjas com relação à amostra iluminada. Devido a estas variações nos parâmetros de SIM, em alguns casos algumas funcionalidades iluminadas podem ser 80% “ligadas” enquanto outras funcionalidades podem ser 60% “ligadas” e mais outras funcionalidades podem ser 20% “ligadas.” Desta forma, deve ser percebido que em tais sistemas, algoritmos de formação de imagem de SIM podem ser usados para levar em conta estas variações de processo durante a reconstrução de imagem. Por exemplo, variações em parâmetros de iluminação estruturada podem ser estimadas e/ou previstas com o tempo para levar em conta estas variações.[000165] It should be noted that although FIG. 18 illustrate an example representation of a SIM imaging system where the SIM images align with the sample features in the correct orientation, in practice this is not necessarily or typically the case for SIM imaging. For example, over time and/or space, it may be derived from the spacing between adjacent fringes, the phase or angle of the structured illumination pattern, and/or the orientation of the fringe pattern with respect to the illuminated sample. Due to these variations in SIM parameters, in some cases some illuminated features may be 80% “on” while other features may be 60% “on” and more other features may be 20% “on.” Thus, it should be realized that in such systems, SIM image formation algorithms can be used to take these process variations into account during image reconstruction. For example, variations in structured lighting parameters can be estimated and/or predicted over time to account for these variations.

[000166] Como usado aqui, o termo módulo deve descrever uma dada unidade de funcionalidade que pode ser realizada de acordo com uma ou mais implementações do presente pedido. Como usado aqui, um módulo deve ser implementado usando qualquer forma de hardware, software, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, um ou mais processadores, controladores, ASICs, PLAs, PALs, CPLDs, FPGAs, componentes lógicos, rotinas de software ou outros mecanismos devem ser implementados para compor um módulo. Na implementação, os vários módulos descritos aqui devem ser implementados como módulos discretos ou as funções e funcionalidades descritas podem ser divididas em parte ou no total dentre um ou mais módulos. Em outras palavras, como pode ser aparente para um perito na técnica após a leitura desta descrição, os vários recursos e a funcionalidade descrita aqui podem ser implementadas em qualquer dada aplicação e podem ser implementadas em um ou mais módulos separados ou divididos em várias combinações e permutações. Mesmo que várias funcionalidades ou elementos de funcionalidade possam ser individualmente descritos como módulos separados, um perito na técnica vai entender que estes recursos e a funcionalidade podem ser divididas dentre um ou mais elementos de software e hardware comuns, e tal descrição não deve necessitar ou implicar que componentes de hardware ou software separados são usados para implementar tais recursos ou funcionalidade.[000166] As used herein, the term module should describe a given unit of functionality that can be realized in accordance with one or more implementations of the present application. As used herein, a module must be implemented using any form of hardware, software, or a combination thereof. For example, one or more processors, controllers, ASICs, PLAs, PALs, CPLDs, FPGAs, logic components, software routines, or other mechanisms must be implemented to make up a module. In implementation, the various modules described here must be implemented as discrete modules or the functions and functionalities described may be divided in part or in total among one or more modules. In other words, as may be apparent to one skilled in the art after reading this description, the various features and functionality described herein can be implemented in any given application and can be implemented in one or more separate modules or divided into various combinations and permutations. Even though various features or functionality elements may be individually described as separate modules, one skilled in the art will understand that these features and functionality may be divided among one or more common software and hardware elements, and such description should not require or imply that separate hardware or software components are used to implement such features or functionality.

[000167] Neste documento, os termos "meio legível por computador", "meio útil por computador " e “meio de programa de computador” são usados em geral para se referir aos meios não transitórios, voláteis ou não voláteis, tais como, por exemplo, uma memória, unidade de armazenamento, e mídia. Estas e outras várias formas de meios de programa de computador ou meios úteis por computador podem ser envolvidos na realização de uma ou mais sequências de uma ou mais instruções para um dispositivo de processamento para a execução. Tais instruções incorporadas no meio, em geral são referidas como “código de programa de computador” ou um “produto de programa de computador” (que pode ser agrupado na forma de programas de computador ou outros agrupamentos) .[000167] In this document, the terms "computer readable medium", "computer useful medium" and "computer program medium" are used generally to refer to non-transitory, volatile or non-volatile media, such as, for example, example, a memory, storage unit, and media. These and other various forms of computer program means or computer useful means may be involved in carrying out one or more sequences of one or more instructions to a processing device for execution. Such instructions embedded in the medium are generally referred to as “computer program code” or a “computer program product” (which may be grouped in the form of computer programs or other groupings).

[000168] Apesar de descrito acima nos termos de vários exemplos de implementações e implementações, deve ser entendido que as várias funcionalidades, aspectos e funcionalidade descritos em uma ou mais das implementações individuais não estão limitadas na sua aplicabilidade para a implementação particular com a qual eles são descritos, mas em vez disso podem ser aplicados, sozinhos ou em várias combinações, para uma ou mais das outras implementações da aplicação, se ou não tais implementações são descritas e se ou não tais funcionalidades são apresentadas como sendo uma parte de uma implementação descrita. Assim, a amplitude e o escopo do presente pedido não devem ser limitados por qualquer uma das implementações de exemplo descritas acima.[000168] Although described above in terms of various example implementations and implementations, it should be understood that the various features, aspects and functionality described in one or more of the individual implementations are not limited in their applicability to the particular implementation with which they are described, but may instead be applied, alone or in various combinations, to one or more other implementations of the application, whether or not such implementations are described and whether or not such features are presented as being a part of a described implementation . Accordingly, the breadth and scope of the present application should not be limited by any of the example implementations described above.

[000169] Deve ser percebido que todas as combinações dos conceitos anteriores (provido que tais conceitos não são mutuamente inconsistentes) são contempladas como sendo parte da matéria inventiva divulgada aqui. Em particular, todas as combinações de matéria reivindicada que aparecem no fim desta descrição são contempladas como sendo parte da matéria inventiva divulgada aqui.[000169] It should be understood that all combinations of the previous concepts (provided that such concepts are not mutually inconsistent) are contemplated as being part of the inventive subject matter disclosed herein. In particular, all combinations of claimed subject matter appearing at the end of this description are contemplated as being part of the inventive subject matter disclosed herein.

[000170] Os termos “substancialmente” e “cerca de” usados através desta descrição, incluindo as reivindicações, são usados para descrever e levar em conta pequenas flutuações, tais como devido às variações no processamento. Por exemplo, elas podem se referir a menos do que ou igual a ±5%, tal como menos do que ou igual a ±2%, tal como menos do que ou igual a ±1%, tal como menos do que ou igual a ±0,5%, tal como menos do que ou igual a ±0,2%, tal como menos do que ou igual a ±0,1%, tal como menos do que ou igual a ±0,05%.[000170] The terms “substantially” and “about” used throughout this description, including the claims, are used to describe and take into account minor fluctuations, such as due to variations in processing. For example, they may refer to less than or equal to ±5%, such as less than or equal to ±2%, such as less than or equal to ±1%, such as less than or equal to ±0.5%, such as less than or equal to ±0.2%, such as less than or equal to ±0.1%, such as less than or equal to ±0.05%.

[000171] Para tal extensão aplicável, os termos “primeiro,” “segundo,” “terceiro,” etc. aqui são meramente empregados para mostrar os respectivos objetos descritos por estes termos como entidades separadas e não devem conotar um sentido de ordem cronológica, a menos que seja explicitamente declarado de outra forma aqui.[000171] For such applicable extension, the terms “first,” “second,” “third,” etc. here are merely employed to show the respective objects described by these terms as separate entities and are not intended to connote a sense of chronological order unless explicitly stated otherwise here.

[000172] Termos e frases usados neste documento, e variações dos mesmos, a menos que seja expressamente declarado de outra forma, devem ser interpretados como abertos de maneira oposta a serem limitantes. Como exemplos dos anteriores: o termo “incluindo” devem ser lidos como significando “incluindo, sem limitação” ou semelhantes; o termo “exemplo” é usado para prover alguns casos no item na discussão, não uma lista exaustiva ou limitante dos mesmos; os termos “um” ou “uma” devem ser lidos como significando “pelo menos um,” “um ou mais” ou semelhantes; e adjetivos tais como “convencional,” “tradicional,” “normal,” “padrão,” “conhecido” e termos de significado similar não devem ser interpretados como limitantes do item descrito para um dado período de tempo ou para um item disponível como de um dado tempo, mas em vez disso deve ser lido para englobar tecnologias convencionais, tradicionais, normais, ou padrão que podem estar disponíveis ou conhecidas agora ou em qualquer momento no futuro. Da mesma forma, onde este documento se refere às tecnologias que podem ser aparentes ou conhecidas de um perito na técnica, tais tecnologias englobam aquelas aparentes ou conhecidas de um perito agora ou em qualquer momento no futuro.[000172] Terms and phrases used in this document, and variations thereof, unless expressly stated otherwise, should be construed as open as opposed to being limiting. As examples of the foregoing: the term “including” should be read as meaning “including, without limitation” or similar; the term “example” is used to provide some cases in the item in the discussion, not an exhaustive or limiting list thereof; the terms “one” or “an” should be read as meaning “at least one,” “one or more” or the like; and adjectives such as “conventional,” “traditional,” “normal,” “standard,” “known” and terms of similar meaning should not be construed as limiting the item described for a given period of time or for an item available as of a given time, but should instead be read to encompass conventional, traditional, normal, or standard technologies that may be available or known now or at any time in the future. Likewise, where this document refers to technologies that may be apparent or known to a person skilled in the art, such technologies encompass those apparent or known to a person skilled in the art now or at any time in the future.

[000173] A presença de frases e palavras abrangentes tais como “um ou mais,” “pelo menos,” “mas não limitado a” ou outras frases semelhantes em alguns casos não devem ser lidos para significar que o caso mais estrito está intencionado ou necessário nos casos onde tais frases abrangentes podem estar ausentes. O uso do termo “módulo” não implica que os componentes ou funcionalidade descritos como parte do módulo são todos configurados em um pacote comum. De fato, qualquer um ou todos os vários componentes de um módulo, seja lógica de controle ou outros componentes, podem ser combinados em um único pacote ou mantidos separadamente e podem ser adicionalmente distribuídos em múltiplos agrupamentos ou pacotes ou por múltiplas localizações.[000173] The presence of encompassing phrases and words such as “one or more,” “at least,” “but not limited to” or other similar phrases in some cases should not be read to mean that the stricter case is intended or necessary in cases where such comprehensive phrases may be absent. The use of the term “module” does not imply that the components or functionality described as part of the module are all configured in a common package. In fact, any or all of the various components of a module, whether control logic or other components, can be combined into a single package or maintained separately and can be further distributed in multiple groupings or packages or across multiple locations.

[000174] Adicionalmente, as várias implementações definidas aqui são descritas em termos do exemplo de diagramas de bloco, fluxogramas e outras ilustrações. Como será aparente para um perito na técnica após a leitura deste documento, as implementações ilustradas e as suas várias alternativas podem ser implementadas sem confinamento para os exemplos ilustrados. Por exemplo, diagramas de bloco e a sua descrição anexa não devem ser interpretados como mandatários de uma particular arquitetura ou configuração.[000174] Additionally, the various implementations defined here are described in terms of example block diagrams, flowcharts and other illustrations. As will be apparent to one skilled in the art after reading this document, the illustrated implementations and their various alternatives can be implemented without confinement to the illustrated examples. For example, block diagrams and their accompanying description should not be interpreted as mandating a particular architecture or configuration.

[000175] Enquanto várias implementações da presente descrição foram descritas acima, deve ser entendido que elas foram apresentadas por meio de exemplo apenas, e não de limitação. Da mesma forma, os vários diagramas podem representar um exemplo de arquitetura ou outra configuração para a descrição, que é feita para auxiliar no entendimento dos recursos e da funcionalidade que podem ser incluídas na descrição. A descrição não está restrita ao exemplo ilustrado de arquiteturas ou configurações, mas as funcionalidades desejadas podem ser implementadas usando uma variedade de arquiteturas e configurações alternativas. De fato, será aparente para um perito na técnica como configurações e particionamento físico, lógico ou funcional alternativo podem ser implementados para implementar as funcionalidades desejadas da presente descrição. Ainda, uma multiplicidade de diferentes nomes de módulo constitui nomes diferentes do que aqueles aqui pode ser aplicada às várias partições. Adicionalmente, com relação aos diagramas de fluxo, descrições operacionais e reivindicações do método, a ordem em que as etapas são apresentadas aqui não deve mandar que várias implementações sejam implementadas para realizar a funcionalidade citada na mesma ordem a menos que o contexto dite de outra forma.[000175] While various implementations of the present description have been described above, it should be understood that they have been presented by way of example only, and not by way of limitation. Likewise, the various diagrams may represent an example architecture or other configuration for the description, which is meant to aid in understanding the features and functionality that may be included in the description. The description is not restricted to illustrated example architectures or configurations, but the desired functionality can be implemented using a variety of alternative architectures and configurations. Indeed, it will be apparent to one skilled in the art how alternative physical, logical or functional configurations and partitioning can be implemented to implement the desired functionalities of the present disclosure. Still, a multitude of different module names constitute different names than those here that can be applied to the various partitions. Additionally, with respect to flow diagrams, operational descriptions, and method claims, the order in which the steps are presented here should not dictate that multiple implementations be implemented to perform the cited functionality in the same order unless the context dictates otherwise. .

Claims (20)

1. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro braço óptico, compreendendo: um primeiro emissor de luz (210A) para emitir luz; e um primeiro divisor de feixe para dividir luz emitida pelo primeiro emissor de luz (210A) para projetar uma primeira pluralidade de franjas em um plano de uma amostra; um segundo braço óptico, compreendendo: um segundo emissor de luz (210B) para emitir luz; e um segundo divisor de feixe para dividir luz emitida pelo segundo emissor de luz (210B) para projetar uma segunda pluralidade de franjas do plano da amostra; um elemento óptico para combinar um caminho óptico da primeira pluralidade de franjas do primeiro braço óptico e a segunda pluralidade de franjas do segundo braço óptico; e um ou mais elementos ópticos adicionais (240A, 240B, 310, 410A, 410B) para deslocar a fase da primeira pluralidade de franjas e da segunda pluralidade de franjas; em que o primeiro divisor de feixe compreende uma primeira grade de difração (230A) transmissiva e o segundo divisor de feixe compreende uma segunda grade de difração (230B) transmissiva; em que o elemento óptico, para combinar um caminho óptico da primeira e da segunda pluralidade de franjas, compreende um espelho (260) com furos (261), com o espelho (260) disposto para refletir a luz difratada pela primeira grade de difração (230A) e com os furos (261) dispostos para passar através de pelo menos primeiras ordens de luz difratada pela segunda grade de difração (230B); e em que a primeira pluralidade de franjas é desviada angularmente da segunda pluralidade de franjas no plano de amostra em 90 graus.1. Structured illumination imaging system (100), characterized in that it comprises: a first optical arm, comprising: a first light emitter (210A) for emitting light; and a first beam splitter for dividing light emitted by the first light emitter (210A) to project a first plurality of fringes onto a plane of a sample; a second optical arm, comprising: a second light emitter (210B) for emitting light; and a second beam splitter for dividing light emitted by the second light emitter (210B) to project a second plurality of fringes from the sample plane; an optical element for combining an optical path of the first plurality of fringes of the first optical arm and the second plurality of fringes of the second optical arm; and one or more additional optical elements (240A, 240B, 310, 410A, 410B) for shifting the phase of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes; wherein the first beam splitter comprises a first transmissive diffraction grating (230A) and the second beam splitter comprises a second transmissive diffraction grating (230B); wherein the optical element, for combining an optical path of the first and second plurality of fringes, comprises a mirror (260) with holes (261), with the mirror (260) arranged to reflect light diffracted by the first diffraction grating ( 230A) and with the holes (261) arranged to pass through at least first orders of light diffracted by the second diffraction grating (230B); and wherein the first plurality of fringes is angularly offset from the second plurality of fringes in the sample plane by 90 degrees. 2. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo emissores de luz (210A, 210B) emitem luz não polarizada, e em que a primeira e a segunda grades de difração (230A, 230B) transmissiva são para difratar luz não polarizada emitida por um respectivo do primeiro e do segundo emissores de luz (210A, 210B).2. Structured illumination imaging system (100), according to claim 1, characterized by the fact that the first and second light emitters (210A, 210B) emit unpolarized light, and wherein the first and the second transmissive diffraction gratings (230A, 230B) are for diffracting unpolarized light emitted by a respective of the first and second light emitters (210A, 210B). 3. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas compreendem uma primeira janela óptica rotativa (240A) para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e uma segunda janela óptica rotativa (240B) para deslocar de fase a segunda pluralidade de franjas ópticas.3. Structured illumination imaging system (100) according to claim 1, characterized in that the one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes comprise a first rotatable optical window (240A) for phase shifting the first plurality of fringes and a second rotatable optical window (240B) for phase shifting the second plurality of optical fringes. 4. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas compreendem um primeiro estágio de movimento linear (410A) para fazer a translação da primeira grade de difração (230A) e um segundo estágio de movimento linear (410B) para fazer a translação da segunda grade de difração (230B).4. Structured illumination imaging system (100) according to claim 1, characterized in that the one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes comprise a first linear motion stage (410A) for translating the first diffraction grating (230A) and a second linear motion stage (410B) for translating the second diffraction grating (230B). 5. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os um ou mais elementos ópticos para deslocar de fase a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas compreendem uma única janela óptica rotativa (310), em que a única janela óptica rotativa (310) é posicionada após o espelho (260) com orifícios (261) em um caminho óptico para a amostra.5. Structured illumination imaging system (100) according to claim 1, wherein the one or more optical elements for phase shifting the first plurality of fringes and the second plurality of fringes comprise a single rotating optical window (310), wherein the single rotating optical window (310) is positioned after the mirror (260) with holes (261) in an optical path to the sample. 6. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um eixo de rotação da única janela óptica rotativa (310) é deslocado em 45 graus a partir de um eixo óptico de cada uma das grades.6. Structured illumination imaging system (100) according to claim 5, characterized in that an axis of rotation of the single rotatable optical window (310) is displaced by 45 degrees from an optical axis of each of the grids. 7. Sistema de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma pluralidade de funcionalidades regularmente padronizadas em um arranjo retangular ou arranjo hexagonal.7. Structured lighting system (100), according to claim 1, characterized by the fact that the sample comprises a plurality of features regularly patterned in a rectangular arrangement or hexagonal arrangement. 8. Sistema de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: uma lente objetiva para projetar cada uma da primeira pluralidade de franjas e da segunda pluralidade de franjas na amostra.8. Structured lighting system (100), according to claim 1, characterized by the fact that it further comprises: an objective lens for projecting each of the first plurality of fringes and the second plurality of fringes onto the sample. 9. Sistema de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: um ou mais bloqueadores de feixe óptico para bloquear zero ordens de luz emitida por cada uma da primeira e da segunda grades de difração (230A, 230B).9. Structured lighting system (100), according to claim 1, characterized by the fact that it further comprises: one or more optical beam blockers to block zero orders of light emitted by each of the first and second diffraction gratings (230A, 230B). 10. Sistema de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os um ou mais bloqueadores de feixe óptico compreendem uma grade de Bragg.10. Structured lighting system (100), according to claim 9, characterized by the fact that the one or more optical beam blockers comprise a Bragg grating. 11. Sistema de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento óptico para combinar um caminho óptico do primeiro braço e do segundo braço compreende um divisor de feixe de polarização, em que a primeira grade de difração (230A) difrata luz polarizada verticalmente e em que a segunda grade de difração (230B) difrata luz polarizada horizontalmente.11. Structured lighting system (100) according to claim 1, characterized in that the optical element for combining an optical path of the first arm and the second arm comprises a polarization beam splitter, wherein the first grating diffraction grating (230A) diffracts vertically polarized light and wherein the second diffraction grating (230B) diffracts horizontally polarized light. 12. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada um do primeiro e do segundo divisores de feixe compreende um cubo de divisor de feixe ou placa.12. The structured lighting imaging system (100) of claim 1, wherein each of the first and second beam splitters comprises a beam splitter cube or plate. 13. Sistema de formação de imagem de iluminação estruturada (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro divisor de feixe compreende uma primeira grade de difração (230A) refletiva e o segundo divisor de feixe compreende uma segunda grade de difração (230B) refletiva.13. Structured lighting imaging system (100) according to claim 1, characterized in that the first beam splitter comprises a first reflective diffraction grating (230A) and the second beam splitter comprises a second diffraction grating (230B) reflective. 14. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, caracterizado pelo fato de que compreende: ligar um primeiro braço óptico de um sistema de iluminação estruturada, o primeiro braço óptico compreendendo um primeiro emissor de luz (210A) para emitir luz e uma primeira grade de difração (230A) para difratar luz emitida pelo primeiro emissor de luz (210A) para projetar uma primeira pluralidade de franjas orientada em uma direção específica em um plano de uma amostra; capturar uma primeira pluralidade de imagens de fase da amostra, em que durante a captura da primeira pluralidade de imagens, as posições da primeira pluralidade de franjas são deslocadas do plano da amostra; ligar um segundo braço óptico do sistema de iluminação estruturada, o segundo braço óptico compreendendo um segundo emissor de luz (210B) para emitir luz e uma segunda grade de difração (230B) para difratar luz emitida pelo segundo emissor de luz (210B) para projetar uma segunda pluralidade de franjas do plano da amostra, em que a segunda pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da primeira pluralidade de franjas no plano de amostra em 90 graus; e capturar uma segunda pluralidade de imagens de fase da amostra iluminada com a segunda pluralidade de franjas, em que durante a captura da segunda pluralidade de franjas, as posições da segunda pluralidade de franjas são deslocadas do plano da amostra, em que a primeira grade de difração (230A) e a segunda grade de difração (230B) são grades de difração transmissivas, em que o sistema de iluminação estruturado compreende espelhos (260) com furos (261) para refletir luz difratada pela primeira grade de difração (230A) e para passar através de pelo menos as primeiras ordens de luz difratadas pela segunda grade de difração (230B).14. Method for forming structured lighting images, characterized in that it comprises: connecting a first optical arm of a structured lighting system, the first optical arm comprising a first light emitter (210A) for emitting light and a first grating diffraction method (230A) for diffracting light emitted by the first light emitter (210A) to project a first plurality of fringes oriented in a specific direction in a plane of a sample; capturing a first plurality of phase images of the sample, wherein during capturing the first plurality of images, the positions of the first plurality of fringes are displaced from the plane of the sample; connecting a second optical arm of the structured lighting system, the second optical arm comprising a second light emitter (210B) for emitting light and a second diffraction grating (230B) for diffracting light emitted by the second light emitter (210B) to project a second plurality of sample plane fringes, wherein the second plurality of fringes is angularly offset from the first plurality of sample plane fringes by 90 degrees; and capturing a second plurality of phase images of the sample illuminated with the second plurality of fringes, wherein during capturing the second plurality of fringes, the positions of the second plurality of fringes are displaced from the plane of the sample, wherein the first plurality of fringes diffraction grating (230A) and the second diffraction grating (230B) are transmissive diffraction gratings, wherein the structured lighting system comprises mirrors (260) with holes (261) to reflect light diffracted by the first diffraction grating (230A) and to pass through at least the first orders of light diffracted by the second diffraction grating (230B). 15. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: usar pelo menos a primeira pluralidade de imagens de fase capturadas e a segunda pluralidade de imagens de fase capturadas para reconstruir computacionalmente uma ou mais imagens tendo maior resolução do que cada uma da primeira e da segunda pluralidade de imagens em fase capturadas.15. The method of forming a structured lighting image according to claim 14, further comprising: using at least the first plurality of captured phase images and the second plurality of captured phase images to computationally reconstruct a or more images having greater resolution than each of the first and second plurality of captured phase images. 16. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de franjas está deslocada angularmente a partir da segunda pluralidade de franjas no plano de amostra em 90 graus.16. The method of forming a structured illumination image according to claim 15, wherein the first plurality of fringes is angularly displaced from the second plurality of fringes in the sample plane by 90 degrees. 17. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma pluralidade de funcionalidades regularmente padronizadas em um arranjo retangular ou arranjo hexagonal.17. The method of forming a structured illumination image according to claim 16, wherein the sample comprises a plurality of features regularly patterned in a rectangular arrangement or hexagonal arrangement. 18. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a primeira pluralidade de franjas e a segunda pluralidade de franjas são deslocadas em fase através da rotação de uma única janela óptica posicionada em um caminho óptico entre a amostra e cada uma da primeira e da segunda grades (230A, 230B), em que um eixo de rotação da única janela óptica rotativa está deslocado a partir de um eixo óptico de cada uma das grades.18. The method of forming a structured illumination image according to claim 14, wherein the first plurality of fringes and the second plurality of fringes are phase-shifted through the rotation of a single optical window positioned in a path between the sample and each of the first and second grids (230A, 230B), wherein a rotational axis of the single rotating optical window is offset from an optical axis of each of the grids. 19. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro braço óptico é desligado e o segundo braço óptico do sistema de iluminação estruturada é ligado após capturar a primeira pluralidade de imagens de fase.19. The method of forming a structured lighting image according to claim 14, wherein the first optical arm is turned off and the second optical arm of the structured lighting system is turned on after capturing the first plurality of phase images . 20. Método para formação de imagem de iluminação estruturada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a primeira grade de difração (230A) e a segunda grade de difração (230B) são fixadas mecanicamente durante a captura da imagem.20. Method for forming a structured illumination image according to claim 14, characterized in that the first diffraction grating (230A) and the second diffraction grating (230B) are mechanically fixed during image capture.