BR112020002027A2 - detecção de isótipo de apolipoproteína e por espectrometria de massa - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se aos métodos para a determinação do fenótipo da apolipoproteína E (ApoE) em uma amostra através da espectrometria de massa; em que os alelo(s) de ApoE presen-tes na amostra são determinados a partir da identidade dos íons detectados por espectrometria de massa. Em outro aspecto, são aqui fornecidos métodos para o diagnóstico ou prognóstico da doença de Alzheimer ou demência.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETEC- ÇÃO DE ISÓTIPO DE APOLIPOPROTEÍNA E POR ESPECTROME- TRIA DE MASSA".
[0001] A invenção refere-se à detecção ou quantificação de apoli- poproteína E. Em um aspecto particular, a invenção refere-se a méto- dos para detectar a apolipoproteína E ou seus alelos através da es- pectrometria de massa.
[0002] A doença de Alzheimer é a forma mais comum de demên- cia que afeta a população idosa. A doença de Alzheimer é caracteriza- da por uma deterioração progressiva das habilidades cognitivas, em particular memória e aprendizado. A apolipoproteína E (APOE) está associada com um aumento marcante no desenvolvimento da doença de Alzheimer. O gene de APOE humano possui três alelos polimórfi- cos, ε2, ε3 e ε4, os quais resultam em seis fenótipos diferentes: ε2/ε2, ε2/ε3, ε3/ε3, ε2/ε4, ε3/ε4 e ε4/ε4.
[0003] A precisão e a sensibilidade dos métodos atuais de diag- nóstico clínico para prever ou diagnosticar a doença de Alzheimer são baixas. É necessário um ensaio preciso e sensível para detectar a apolipoproteína E. Em particular, é necessário um ensaio preciso e sensível para detectar várias isoformas.
[0004] São aqui fornecidos métodos para detectar ou determinar a quantidade de apolipoproteína E (APOE) em uma amostra através da espectrometria de massa, incluindo a espectrometria de massa em tandem.
[0005] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos são para detectar ou determinar a quantidade de apolipoproteína E que compreende (a) purificação de apolipoproteína E na amostra; (b) ioni-
zação de apolipoproteína E na amostra; e (c) detecção ou determina- ção da quantidade dos íons de apolipoproteína E através da espec- trometria de massa; em que a quantidade dos íons de apolipoproteína E está relacionada à quantidade de apolipoproteína E na amostra.
[0006] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos são para determinar o fenótipo de apolipoproteína E (ApoE) em uma amos- tra, o dito método compreendendo: (a) purificação de ApoE na amos- tra; (b) ionização de ApoE na amostra para produzir um ou mais íons de ApoE; (c) detecção dos íons da etapa (b) por espectrometria de massa; em que os alelos de ApoE presentes na amostra são determi- nados a partir da identidade dos íons detectados na etapa (c).
[0007] Em algumas modalidades, a purificação aqui fornecida compreende cromatografia em fase líquida. Em algumas modalidades, a cromatografia em fase líquida compreende cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC).
[0008] Em algumas modalidades, a ApoE nas amostras é digerida. Em algumas modalidades, a ApoE é digerida por tripsina. Em algumas modalidades, a ApoE digerida é submetida a micro-ondas. Em algu- mas modalidades, a ApoE é digerida pela tecnologia de micro-ondas de digestão rápida de enzima.
[0009] Em algumas modalidades, a purificação aqui fornecida compreende extração em fase sólida (SPE).
[0010] Em algumas modalidades, a ionização compreende ioniza- ção por eletroaspersão (ESI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionizar no modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionizar no modo negativo.
[0011] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos compreendem ainda adicionar um padrão interno. Em algumas moda- lidades, o padrão interno é marcado isotopicamente.
[0012] Em algumas modalidades, o fenótipo determinado pelo mé-
todo aqui fornecido é ApoE2/ApoE2. Em algumas modalidades, o fe- nótipo é ApoE2/ApoE3. Em algumas modalidades, o fenótipo é ApoE2/ApoE4. Em algumas modalidades, o fenótipo é ApoE3/ApoE3. Em algumas modalidades, o fenótipo é ApoE3/ApoE4. Em algumas modalidades, o fenótipo é ApoE4/ApoE4.
[0013] Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 555,15 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é deter- minado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 612,19 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em algumas modalidades, a ApoE2/ApoE2 é determinada pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga seleciona- da do grupo que consiste em 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determina- do pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de mas- sa/carga selecionada do grupo que consiste em 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
[0014] Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 555,15 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determi-
nado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de mas- sa/carga de 612,19 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 475,05 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em certas mo- dalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de íons frag- mentados tendo relações de massa/carga de 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela pre- sença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é de- terminado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE3 é determinado pela pre- sença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
[0015] Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 555,15 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determi-
nado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de mas- sa/carga de 612,19 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 475,05 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 503,56 ± 0,5. Em algumas modalida- des, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmen- tado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 665,72 ± 0,5 e 835,93 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de mas- sa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5,
665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE2/ApoE4 é determinado pela pre- sença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5, 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5, e 982,08 ± 0,5.
[0016] Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pe- la presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 612,19 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é deter- minado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 475,05 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas configurações, o ApoE3/ApoE3 é determi- nado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE3 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
[0017] Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 612,19 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é deter-
minado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 475,05 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 503,56 ± 0,5. Em algumas modalida- des, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmen- tado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga seleciona- da do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de mas- sa/carga selecionada do grupo que consiste em 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é de- terminado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
[0018] Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 475,05 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é deter-
minado pela presença de um íon precursor tendo uma relação de massa/carga de 503,56 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5 e 502,55 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de massa/carga seleciona- da do grupo que consiste em 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em algumas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determina- do pela presença de um íon fragmentado tendo uma relação de mas- sa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5. Em certas modalidades, o ApoE3/ApoE4 é determinado pela presença de íons fragmentados tendo relações de massa/carga de 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5.
[0019] Em certas modalidades, a presença do alelo de ApoE4 in- dica aumento do risco de desenvolver a doença de Alzheimer. Em cer- tas modalidades, a presença de alelos de ApoE4/ApoE4 indica risco aumentado de desenvolvimento da doença de Alzheimer.
[0020] Em algumas modalidades, a quantificação da ApoE total compreende medir um íon precursor tendo uma relação de mas- sa/carga de 485,06 ± 0,5. Em algumas modalidades, a quantificação da ApoE total compreende medir um íon fragmentado tendo uma rela- ção de massa/carga selecionada entre 489,51 ± 0,5 e 588,64 ± 0,5.
[0021] Em certas modalidades, o limite de quantificação dos méto- dos é menor ou igual a 10 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 5 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 4 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos méto- dos é menor ou igual a 3 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 2 ng/ml. Em certas mo- dalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 1 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 0,5 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 0,2 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 0,1 ng/ml.
[0022] Em algumas modalidades, o limite de detecção dos méto- dos é menor ou igual a 5 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 1 ng/ml. Em algumas moda- lidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,5 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,1 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de detec- ção dos métodos é menor ou igual a 0,05 ng/ml. Em algumas modali- dades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,01 ng/ml.
[0023] Em algumas modalidades, a ApoE não é derivativa antes da espectrometria de massa.
[0024] Em algumas modalidades, a ApoE é derivativa antes da espectrometria de massa.
[0025] Em certas modalidades, a amostra é um fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra é o líquido cérebro-espinhal (CSF). Em algumas modalidades, a amostra é plasma ou soro. Em algumas modalidades, a amostra é o sangue total. Em algumas modalidades, a amostra é saliva ou urina.
[0026] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir a adi-
ção de um agente na amostra em uma quantidade suficiente para desproteinizar a amostra.
[0027] Como utilizado nesta invenção, a menos que mencionado de outra forma, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referência plural. Assim, por exemplo, uma referência a "uma proteína" inclui uma pluralidade de moléculas de proteína.
[0028] Como aqui utilizado, o termo "purificação" ou "purificar" não se refere à remoção de todos os materiais da amostra, a não ser os analitos de interesse. Em vez disso, a purificação se refere a um pro- cedimento que enriquece a quantidade de um ou mais analitos de inte- resse em relação a outros componentes da amostra que podem inter- ferir na detecção do analito de interesse. As amostras são aqui purifi- cadas por vários meios para permitir a remoção de uma ou mais subs- tâncias interferentes, por exemplo, uma ou mais substâncias que iriam interferir com a detecção de íons pai e filha de ApoE selecionados por espectrometria de massa.
[0029] Como utilizado nesta invenção, o termo "amostra de teste" refere-se a qualquer amostra que possa conter ApoE. Conforme aqui utilizado, o termo "fluido corporal" significa qualquer fluido que possa ser isolado do corpo de um indivíduo. Por exemplo, "fluido corporal" pode incluir sangue, plasma, soro, bile, saliva, urina, lágrimas, transpi- ração e similares.
[0030] Como aqui utilizado, o termo "derivativo" significa reagir du- as moléculas para formar uma nova molécula. Os agentes de deriva- ção podem incluir grupos de isotiocianato, grupos de dinitro- fluorofenila, grupos de nitrofenoxicarbonila e/ou grupos de ftalaldeído, e similares.
[0031] Como aqui utilizado, o termo "cromatografia" refere-se a um processo no qual uma mistura química carregada por um líquido ou gás é separada em componentes como um resultado da distribuição diferencial das entidades químicas à medida que fluem ao redor ou sobre uma fase líquida ou sólida estacionária.
[0032] Como aqui utilizado, o termo "cromatografia em fase líqui- da" ou "LC" significa um processo de retardo seletivo de um ou mais componentes de uma solução fluida quando o fluido penetra unifor- memente através de uma coluna de uma substância finamente dividida ou através de passagens capilares. O retardo resulta da distribuição dos componentes da mistura entre uma ou mais fases estacionárias e o fluido volumoso (isto é, fase móvel), à medida que esse fluido se move em relação às fases estacionárias. Exemplos de "cromatografia em fase líquida" incluem cromatografia em fase líquida de fase inversa (RPLC), cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia em fase líquida de alta turbulência (HTLC).
[0033] Como utilizado nesta invenção, o termo "cromatografia em fase líquida de alta eficiência" ou "HPLC" refere-se à cromatografia em fase líquida em que o grau de separação é aumentado forçando a fase móvel sob pressão através de uma fase estacionária, tipicamente uma coluna densamente acondicionada.
[0034] Como aqui utilizado, o termo "cromatografia em fase líquida de alta turbulência" ou "HTLC" refere-se a uma forma de cromatografia que utiliza fluxo turbulento do material que está sendo analisado atra- vés do acondicionamento da coluna como a base para executar a se- paração. A HTLC foi aplicada na preparação de amostras contendo dois fármacos não identificados antes da análise por espectrometria de massa. Ver, por exemplo, Zimmer et al., J. Chromatogr. A 854: 23-35 (1999); ver também, as Patentes U.S. Nos. 5.968.367, 5.919.368,
5.795.469 e 5.772.874, que explicam ainda mais a HTLC. As pessoas de habilidade prática na técnica entendem "fluxo turbulento". Quando o fluido flui lenta e suavemente, o fluxo é chamado de "fluxo laminar". Por exemplo, o fluido que se move através de uma coluna de HPLC em baixas taxas de fluxo é laminar. No fluxo laminar, o movimento das partículas de fluido é ordenado com as partículas que se movem ge- ralmente em linhas retas. Em velocidades mais rápidas, a inércia da água supera as forças de atrito do fluido e os resultados do fluxo turbu- lento. O fluido não em contato com o limite irregular “ultrapassa” o que é retardado por atrito ou desviado por uma superfície irregular. Quan- do um fluido está fluindo de forma turbulenta, ele flui em redemoinhos e turbilhões (ou vórtices), com mais "arrasto" do que quando o fluxo é laminar. Muitas referências estão disponíveis para ajudar a determinar quando o fluxo de fluido é laminar ou turbulento (por exemplo, Turbu- lent Flow Analysis: Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc., (2000); An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)).
[0035] Como aqui utilizado, o termo "cromatografia em fase gaso- sa" ou "GC" refere-se à cromatografia em que a mistura da amostra é vaporizada e injetada em uma corrente de gás de arraste (como nitro- gênio ou hélio) que se move através de uma coluna contendo uma fa- se estacionária composta de um líquido ou de um sólido particulado e é separado em seus compostos componentes de acordo com a afini- dade dos compostos com relação à fase estacionária.
[0036] Como aqui utilizado, o termo "coluna de partículas grandes" ou "coluna de extração" refere-se a uma coluna de cromatografia con- tendo um diâmetro médio de partícula maior do que cerca de 35 μm. Conforme utilizado neste contexto, o termo "cerca de" significa ± 10%. Em uma modalidade preferida, a coluna contém partículas de cerca de 60 μm de diâmetro.
[0037] Como aqui utilizado, o termo "coluna analítica" refere-se a uma coluna de cromatografia tendo placas cromatográficas suficientes para efetuar uma separação de materiais em uma amostra que elui da coluna o suficiente para permitir uma determinação da presença ou quantidade de um analito. Tais colunas geralmente são diferenciadas de "colunas de extração", as quais possuem o propósito geral de sepa- rar ou extrair o material retido de materiais não retidos, a fim de obter uma amostra purificada para análise posterior. Conforme utilizado nes- te contexto, o termo "cerca de" significa ± 10%. Em uma modalidade preferida a coluna analítica contém partículas de cerca de 4 μm de di- âmetro.
[0038] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "on-line" ou "in- line", por exemplo, como utilizado no "modo automatizado on-line" ou "extração on-line" refere-se a um procedimento executado sem a ne- cessidade de intervenção do operador. Ao contrário, o termo "off-line" conforme aqui utilizado, refere-se a um procedimento que requer inter- venção manual de um operador. Assim, se as amostras forem subme- tidas à precipitação e os sobrenadantes forem então carregados ma- nualmente em um amostrador automático, as etapas de precipitação e carregamento serão off-line a partir das etapas subsequentes. Em vá- rias modalidades dos métodos, uma ou mais etapas podem ser execu- tadas de maneira automatizada on-line.
[0039] Como aqui utilizado, o termo "espectrometria de massa" ou "MS" refere-se a uma técnica analítica para identificar compostos por sua massa. MS refere-se a métodos de filtragem, detecção e medição de íons com base em sua relação de massa para carga, ou "m/z". A tecnologia de MS geralmente inclui (1) ionizar os compostos para for- mar compostos carregados; e (2) detectar o peso molecular dos com- postos carregados e calcular uma razão de massa para carga. Os compostos podem ser ionizados e detectados por qualquer meio ade- quado. Um "espectrômetro de massa" geralmente inclui um ionizador e um detector de íons. Em geral, uma ou mais moléculas de interesse são ionizadas e os íons são subsequentemente introduzidos em um instrumento espectrográfico de massa, onde, devido a uma combina- ção de campos magnéticos e elétricos, os íons seguem um caminho no espaço que depende da massa ("m") e carga ("z"). Ver, por exem- plo, as Patentes U.S. Nos. 6.204.500, “Mass Spectrometry From Sur- faces;” 6.107.623, intitulada “Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry;” 6.268.144, intitulada “DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry;” 6.124.137, intitulada “Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes;” Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76 (1999); e Merchant and Weinberger, Electrophoresis 21:1164-67 (2000).
[0040] Como aqui utilizado, o termo "operando no modo de íons negativos" refere-se àqueles métodos de espectrometria de massa em que os íons negativos são gerados e detectados. O termo "operando no modo de íons positivos", conforme utilizado nesta invenção, refere- se àqueles métodos de espectrometria de massa em que os íons posi- tivos são gerados e detectados.
[0041] Como aqui utilizado, o termo "ionização" ou "ionizar" refere- se ao processo de geração de um íon de analito tendo uma carga elé- trica líquida igual a uma ou mais unidades de elétrons. Íons negativos são aqueles que possuem uma carga líquida negativa de uma ou mais unidades de elétrons, enquanto íons positivos são aqueles que possu- em uma carga líquida positiva de uma ou mais unidades de elétrons.
[0042] Como aqui utilizado, o termo "ionização de elétrons" ou "EI" refere-se aos métodos nos quais um analito de interesse em uma fase gasosa ou de vapor interage com um fluxo de elétrons. O impacto dos elétrons com o analito produz íons de analito, os quais podem então ser submetidos a uma técnica de espectrometria de massa.
[0043] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "ionização quí- mica" ou "CI" refere-se aos métodos nos quais um gás reagente (por exemplo, amônia) é submetido ao impacto de elétrons, e os íons de analito são formados pela interação dos íons de gases reagentes e moléculas de analito.
[0044] Como aqui utilizado, o termo "bombardeio rápido de áto- mos" ou "FAB" refere-se a métodos nos quais um feixe de átomos de alta energia (geralmente Xe ou Ar) afeta uma amostra não volátil, mo- léculas de dessorção e ionização contidas na amostra. As amostras de teste são dissolvidas em uma matriz líquida viscosa tal como glicerol, tioglicerol, álcool m-nitrobenzílico, éter 18 coroa-6 coroa, éter 2- nitrofeniloctílico, sulfolano, dietanolamina e trietanolamina. A escolha de uma matriz apropriada para um composto ou amostra é um proces- so empírico.
[0045] Como aqui utilizado, o termo "ionização e dessorção a laser assistida por matriz" ou "MALDI" refere-se a métodos nos quais uma amostra não volátil é exposta à irradiação a laser, que absorve e ioniza analitos na amostra por várias vias de ionização, incluindo fotoioniza- ção, protonação, desprotonação e deterioração de aglomerado de átomos. Para a MALDI, a amostra é misturada com uma matriz de ab- sorção de energia, o que facilita a dessorção das moléculas de analito.
[0046] Como aqui utilizado, o termo "ionização e dessorção a laser intensificada por superfície" ou "SELDI" refere-se a outro método no qual uma amostra não volátil é exposta à irradiação a laser, que des- sorve e ioniza os analitos na amostra por várias vias de ionização, in- cluindo fotoionização, protonação, desprotonação e deterioração de aglomerado de átomos. Para a SELDI, a amostra é tipicamente ligada a uma superfície que preferivelmente retém um ou mais analitos de interesse. Como na MALDI, esse processo também pode empregar um material de absorção de energia para facilitar a ionização.
[0047] Como aqui utilizado, o termo "ionização por eletroaspersão" ou "ESI", refere-se a métodos nos quais uma solução é passada ao longo de um curto comprimento de tubo capilar, no final do qual é apli-
cado um alto potencial elétrico positivo ou negativo. A solução que chega ao final do tubo é vaporizada (nebulizada) em um jato ou pulve- rização de gotículas muito pequenas de solução no vapor de solvente. Essa névoa de gotículas flui através de uma câmara de evaporação, que é aquecida levemente para evitar a condensação e evaporar o solvente. À medida que as gotículas diminuem, a densidade da carga elétrica da superfície aumenta até o momento em que a repulsão natu- ral entre cargas iguais faz com que os íons assim como as moléculas neutras sejam liberados.
[0048] Como aqui utilizado, o termo "ionização química por pres- são atmosférica" ou "APCI", refere-se aos métodos de espectroscopia de massa que são semelhantes à ESI; no entanto, a APCI produz íons através das reações de moléculas iônicas que ocorrem no plasma na pressão atmosférica. O plasma é mantido por uma descarga elétrica entre o capilar de pulverização e um contraeletrodo. Depois os íons são tipicamente extraídos no analisador de massa mediante o uso de um conjunto de estágios de escumadeira diferencialmente bombea- dos. Um contrafluxo de gás N2 seco e preaquecido pode ser utilizado para melhorar a remoção do solvente. A ionização em fase gasosa no APCI pode ser mais eficaz que a ESI com relação à análise de espé- cies menos polares.
[0049] O termo "Fotoionização por Pressão Atmosférica" ou "AP- PI", conforme utilizado nesta invenção, refere-se à forma de espec- troscopia de massa em que o mecanismo para a fotoionização da mo- lécula M é a absorção de fótons e a ejeção de elétrons para formar o íon molecular M+. Visto que a energia do fóton tipicamente está logo acima do potencial de ionização, o íon molecular é menos suscetível à dissociação. Em muitos casos, pode ser possível analisar amostras sem a necessidade de cromatografia, economizando assim tempo e despesas significativos. Na presença de vapor de água ou solventes próticos, o íon molecular pode extrair H para formar MH+. Isso tende a ocorrer se M tiver uma alta afinidade de prótons. Isso não afeta a pre- cisão da quantificação porque a soma de M+ e MH+ é constante. Os compostos de fármaco em solventes próticos são geralmente obser- vados como MH+, enquanto que os compostos não polares tais como naftaleno ou testosterona geralmente formam M+. Robb, D.B., Covey, T.R. and Bruins, A.P. (2000): Ver, por exemplo, Robb et al., Atmos- pheric pressure photoionization: An ionization method for liquid chro- matography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15): 3653-3659.
[0050] Como aqui utilizado, o termo "plasma indutivamente aco- plado " ou "ICP" refere-se a métodos nos quais uma amostra interage com um gás parcialmente ionizado em uma temperatura suficiente- mente alta, de tal modo que a maioria dos elementos seja atomizada e ionizada.
[0051] Como utilizado nesta invenção, o termo "dessorção de campo" refere-se aos métodos nos quais uma amostra de teste não volátil é colocada em uma superfície de ionização e um campo elétrico intenso é utilizado para gerar íons de analito.
[0052] Como aqui utilizado, o termo "dessorção" refere-se à remo- ção de um analito de uma superfície e/ou à entrada de um analito em uma fase gasosa.
[0053] Como aqui utilizado, o termo "limite de quantificação" ou "LOQ" refere-se ao ponto em que as medições se tornam quantitati- vamente significativas. A resposta do analito neste LOQ é identificável, discreta e reproduzível com uma precisão de 20% e uma precisão de 80% a 120%.
[0054] Como aqui utilizado, o termo "limite de detecção" ou "LOD" é o ponto em que o valor medido é maior do que a incerteza associada a ele. O LOD é definido arbitrariamente como 2 desvios-padrão (SD) da concentração zero.
[0055] Como aqui utilizado, uma "quantidade" de ApoE em uma amostra de fluido corporal refere-se de uma forma geral a um valor absoluto que reflete a massa de ApoE detectável no volume de fluido corporal. No entanto, uma quantia também contempla uma quantidade relativa em comparação com outra quantidade de ApoE. Por exemplo, uma quantidade de ApoE em um fluido corporal pode ser uma quanti- dade que seja maior ou menor do que um nível de controle ou normal de ApoE normalmente presente.
[0056] O termo "cerca de" conforme aqui utilizado em referência às medições quantitativas que não incluem a medição da massa de um íon, refere-se ao valor indicado mais ou menos 10%. Os instru- mentos de espectrometria de massa podem variar um pouco na de- terminação da massa de um determinado analito. O termo "cerca de" no contexto da massa de um íon ou da relação de massa/carga de um íon refere-se a +/- 0,5 unidade de massa atômica.
[0057] O sumário da invenção descrito acima não é limitativo e ou- tras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção e das reivindicações.
[0058] A Figura 1 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE2/E2 o qual possui uma frequência de cerca de 0,2%.
[0059] A Figura 2 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE2/E3 o qual possui uma frequência de cerca de 9,4%.
[0060] A Figura 3 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE2/E4 que possui uma frequência de cerca de 2,2%.
[0061] A Figura 4 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE3/E3 que possui uma frequência de cerca de 66%.
[0062] A Figura 5 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE3/E4 que possui uma frequência de cerca de 20%.
[0063] A Figura 6 mostra cromatogramas de exemplo do fenótipo de ApoE4/E4 que possui uma frequência de cerca de 2,5%.
[0064] A Figura 7 mostra a frequência do alelo de ApoE com base em 319 amostras de soro individuais determinadas por LC-MS/MS.
[0065] A Figura 8 mostra a contribuição do biomarcador da doença de Alzheimer para o Modelo de Avaliação de Risco. A Fórmula para calcular o prognosticador linear (pontuação) para MCI ou doença de Alzheimer dada: relação de Aβ42 (pg/ml) / Aβ40 (pg/ml); contagem de alelos de ApoE4; ApoE total (ug/ml). Pontuação = 2,8336 - 9,9026 x Relação + 0,7358 x ApoE4 - 0,2183 x ApoE total. O risco é categoriza- do em três grupos: Baixo risco; Risco médio; Alto risco.
[0066] A Figura 9 mostra os gráficos de probabilidade de doença para o modelo de relação Aβ42/40 vs. número de alelos.
[0067] A Figura 10 mostra os gráficos de risco de doença para a relação Aβ42/40 + modelo de ApoE total vs. número do alelo de ApoE4.
[0068] A Figura 11 mostra a pontuação da avaliação de risco ver- sus número de alelos de ApoE4.
[0069] A Figura 12 mostra o modelo de regressão logística vs. ADMark.
[0070] A Figura 13 mostra uma representação gráfica da fenotipa- gem do isótipo de ApoE através da espectrometria de massa. O fenó- tipo de ApoE2/E2 é determinado pela detecção de um íon associado com E2 e
[0071] A apolipoproteína E (ApoE) é um fator de risco genético bem definido para a doença de Alzheimer de início tardio (DA). O gene APOE humano possui três alelos polimórficos, ε2, ε3 e ε4, que resul- tam em seis fenótipos diferentes: ε2/ε2, ε2/ε3, ε3/ε3, ε2/ ε4, ε3/ε4 e ε4/ε4. Cerca da metade dos pacientes com AD carregam o alelo ε4 (comparado com 14% na população em geral), com a maioria sendo heterozigotos (ε3/ε4). O número de alelos ε4 herdados está associado tanto com o aumento do risco de doença quanto à diminuição da idade média de início em comparação com a herança dos alelos ε2 ou ε3. As diferenças entre as três isoformas de ApoE são baseadas em dois aminoácidos que afetam sua estrutura e, portanto, na interação e liga- ção da proteína com vários lipídios e beta-amilóide (Aβ). ApoE e Aβ podem colocalizar no cérebro e, portanto, seus papéis complementa- res na AD foram estudados extensivamente. Os níveis de ApoE no plasma e CSF em circulação foram recentemente observados de se- rem biomarcadores potenciais para a DA. Além disso, os níveis au- mentados de Apo-E2 ou -E3 no CSF podem representar uma resposta protetora à lesão na AD e podem ter efeitos neuroprotetores mediante a diminuição do dano neuronal independente da deposição de tau e amilóide, além de seus efeitos na depuração de amilóide. Níveis mais baixos de ApoE também podem estar associados com a esclerose múltipla e outras doenças neurodegenerativas que afetam o metabo- lismo lipídico do cérebro.
[0072] Em certas modalidades, os métodos aqui fornecidos são para a determinação do fenótipo de apolipoproteína E (ApoE) em uma amostra, o dito método compreendendo: (a) purificação de ApoE na amostra; (b) ionização de ApoE na amostra para produzir um ou mais íons de ApoE; (c) detecção dos íons da etapa (b) através da espec- trometria de massa; em que os alelos de ApoE presentes na amostra são determinados a partir da identidade dos íons detectados na etapa (c).
[0073] Em algumas modalidades, a purificação aqui fornecida compreende a cromatografia em fase líquida. Em algumas modalida- des, a cromatografia em fase líquida compreende cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC).
[0074] Em algumas modalidades, a purificação aqui fornecida compreende a extração em fase sólida (SPE).
[0075] Em algumas modalidades, a ionização compreende ioniza- ção por eletroaspersão (ESI). Em algumas modalidades, a ionização compreende ionizar no modo positivo. Em algumas modalidades, a ionização compreende ionizar no modo negativo.
[0076] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos ain- da compreendem adicionar um padrão interno. Em algumas modalida- des, o padrão interno é isotopicamente marcado.
[0077] Em algumas modalidades, o fenótipo determinado pelo mé- todo aqui fornecido é ApoE2/ApoE2. Em algumas modalidades, o fe- nótipo é ApoE2/ApoE3. Em algumas modalidades, o fenótipo é ApoE2/ApoE4. Em certas modalidades, o fenótipo é ApoE3/ApoE3. Em certas modalidades, o fenótipo é ApoE3/ApoE4. Em certas moda- lidades, o fenótipo é ApoE4/ApoE4.
[0078] Em algumas modalidades, a presença do alelo de ApoE4 indica aumento do risco de desenvolver a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a presença de alelos de ApoE4/ApoE4 indica risco aumentado de desenvolvimento da doença de Alzheimer.
[0079] Em certas modalidades, o limite de quantificação dos méto- dos é menor ou igual a 10 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 5 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 4 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 3 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de quanti- ficação dos métodos é menor ou igual a 2 ng/ml. Em algumas modali- dades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 1 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos méto- dos é menor ou igual a 0,5 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a 0,2 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de quantificação dos métodos é menor ou igual a
0,1 ng/ml.
[0080] Em algumas modalidades, o limite de detecção dos méto- dos é menor ou igual a 5 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 1 ng/ml. Em certas modali- dades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,5 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,1 ng/ml. Em certas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,05 ng/ml. Em algumas modalidades, o limite de detecção dos métodos é menor ou igual a 0,01 ng/ml.
[0081] Em algumas modalidades, a ApoE não é derivativa antes da espectrometria de massa.
[0082] Em algumas modalidades, a ApoE é derivativa antes da espectrometria de massa.
[0083] Em certas modalidades, a amostra é um fluido corporal. Em algumas modalidades, a amostra é o líquido cérebro-espinhal (CSF). Em algumas modalidades, a amostra é plasma ou soro. Em algumas modalidades, a amostra é sangue total. Em algumas modalidades, a amostra é saliva ou urina.
[0084] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir a adi- ção de um agente à amostra em uma quantidade suficiente para des- proteinizar a amostra.
[0085] As amostras de teste adequadas incluem qualquer amostra de teste que possa conter o analito de interesse. Em algumas modali- dades preferidas, uma amostra é uma amostra biológica; isto é, uma amostra obtida de qualquer fonte biológica, tal como um animal, uma cultura celular, uma cultura de órgãos, etc. Em certas modalidades preferidas, as amostras são obtidas de um animal mamífero, tal como um cachorro, gato, cavalo, etc. Os animais mamíferos particularmente preferidos são primatas, os mais preferíveis seres humanos masculi- nos ou femininos. As amostras particularmente preferidas incluem sangue, plasma, soro, cabelo, músculo, urina, saliva, lágrima, líquido cérebro-espinhal, ou outra amostra de tecido. Tais amostras podem ser obtidas, por exemplo, de um paciente; isto é, uma pessoa viva, homem ou mulher, apresentando-se em um ambiente clínico para di- agnóstico, prognóstico ou tratamento de uma doença ou condição. A amostra de teste é preferivelmente obtida de um paciente, por exem- plo, soro sanguíneo. Preparação de Amostras para Espectrometria de Massa
[0086] Os métodos que podem ser utilizados para enriquecer na ApoE em relação a outros componentes na amostra (por exemplo, pro- teína) incluem, por exemplo, filtração, centrifugação, cromatografia de camada delgada (TLC), eletroforese incluindo eletroforese capilar, se- parações por afinidade incluindo separações por imunoafinidade, mé- todos de extração incluindo extração de acetato de etila e extração de metanol, e o uso de agentes caotrópicos ou qualquer combinação dos acima ou semelhantes.
[0087] A precipitação de proteínas é um método preferido de pre- paração de uma amostra de teste. Tais métodos de purificação de pro- teínas são bem conhecidos na técnica, por exemplo, Polson et al., Journal of Chromatography B 785:263-275 (2003) descrevem técnicas de precipitação de proteínas adequadas para uso nos métodos. A pre- cipitação de proteína pode ser utilizada para remover a maior parte da proteína da amostra que deixa a ApoE no sobrenadante. As amostras podem ser centrifugadas para separar o sobrenadante líquido das pro- teínas precipitadas. O sobrenadante resultante pode então ser aplica- do à cromatografia em fase líquida e subsequente análise por espec- trometria de massa. Em certas modalidades, o uso de precipitação de proteína tal como, por exemplo, precipitação de proteína de acetonitri- la, previne a necessidade de cromatografia em fase líquida de alta tur- bulência (HTLC) ou outra extração on-line antes da HPLC e espectro-
metria de massa. Consequentemente, em tais modalidades, o método envolve (1) executar uma precipitação de proteína da amostra de inte- resse; e (2) carregar o sobrenadante diretamente na HPLC- espectrômetro de massa sem utilizar a extração on-line ou cromato- grafia em fase líquida de alta turbulência (HTLC).
[0088] Em algumas modalidades preferidas, a HPLC, isoladamen- te ou em combinação com um ou mais métodos de purificação, pode ser utilizada para purificar a ApoE antes da espectrometria de massa. Em tais modalidades, as amostras podem ser extraídas utilizando um cartucho de extração por HPLC que captura o analito, depois eluem e cromatografam em uma segunda coluna de HPLC ou em uma coluna de HPLC analítica antes da ionização. Visto que as etapas envolvidas nesses procedimentos de cromatografia podem ser ligadas de uma maneira automatizada, o requisito para o envolvimento do operador durante a purificação do analito pode ser minimizado. Esse aspecto pode resultar em economia de tempo e custos e eliminar a oportunida- de de erro do operador.
[0089] Acredita-se que o fluxo turbulento, tal como aquele forneci- do pelas colunas e métodos de HTLC, pode aumentar a taxa de trans- ferência de massa, o que melhora as características de separação. As colunas de HTLC separam os componentes por meio de altas taxas de fluxo cromatográfico através de uma coluna acondicionada contendo partículas rígidas. Mediante o emprego de altas taxas de fluxo (por exemplo, 3 a 5 ml/min), o fluxo turbulento ocorre na coluna que provo- ca interação quase completa entre a fase estacionária e os analitos de interesse. Uma vantagem do uso de colunas de HTLC é que a forma- ção macromolecular associada com as matrizes de fluidos biológicos é evitada, uma vez que as espécies de alto peso molecular não são reti- das sob condições de fluxo turbulento. Os métodos de HTLC que combinam múltiplas separações em um procedimento diminuem a ne-
cessidade de preparação demorada da amostra e operam em uma ve- locidade significativamente maior. Tais métodos também alcançam um desempenho de separação superior à cromatografia de fluxo laminar (HPLC). A HTLC leva em consideração a injeção direta de amostras biológicas (plasma, urina, etc.). É difícil conseguir a injeção direta nas formas tradicionais de cromatografia, visto que as proteínas desnatu- radas e outros detritos biológicos bloqueiam rapidamente as colunas de separação. A HTLC também leva em conta um volume de amostra muito baixo de menos do que 1 ml, preferivelmente de menos do que 0,5 ml, de preferência de menos do que 0,2 ml, preferivelmente 0,1 ml.
[0090] Exemplos de HTLC aplicados à preparação de amostra an- tes da análise por espectrometria de massa foram descritos em outros lugares. Ver, por exemplo, Zimmer et al., J. Chromatogr. A 854:23-35 (1999); ver também, as Patentes U.S. Nos. 5.968.367; 5.919.368;
5.795.469; e 5.772.874. Em certas modalidades do método, as amos- tras são sujeitas à precipitação de proteínas como descrito acima an- tes do carregamento na coluna de HTLC; nas modalidades preferidas alternativas, as amostras podem ser carregadas diretamente na HTLC sem serem submetidas à precipitação de proteínas. A coluna de extra- ção de HTLC é preferivelmente uma coluna de partículas grandes. Em várias modalidades, uma ou mais etapas dos métodos podem ser exe- cutadas de maneira automatizada on-line. Por exemplo, em uma mo- dalidade, as etapas (i) a (v) são executadas de uma maneira automati- zada on-line. Em outro, as etapas de ionização e detecção são execu- tadas on-line após as etapas (i) a (v).
[0091] A cromatografia em fase líquida (LC) incluindo a cromato- grafia em fase líquida de alta eficiência (HPLC), conta com a tecnolo- gia de fluxo laminar relativamente lenta. A análise tradicional por HPLC baseia-se em acondicionamentos de coluna nas quais o fluxo laminar da amostra através da coluna é a base para a separação do analito de interesse da amostra. O especialista versado entenderá que a separa- ção em tais colunas é um processo de difusão. A HPLC foi aplicada com sucesso à separação de compostos em amostras biológicas, mas uma quantidade significativa de preparação da amostra é requerida antes da separação e subsequente análise com um espectrômetro de massa (MS), tornando esta técnica trabalhosa. Além disso, a maioria dos sistemas de HPLC não utiliza o espectrômetro de massa em todo o seu potencial, permitindo que apenas um sistema de HPLC seja co- nectado a um único instrumento de MS, resultando em longos requisi- tos de tempo para a execução de um grande número de ensaios.
[0092] Vários métodos foram descritos para o uso de HPLC para limpeza de amostras antes da análise por espectrometria de massa. Ver, por exemplo, Taylor et al., Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12 (2000); e Salm et al., Clin. Therapeutics 22 Supl. B:B71-B85 (2000).
[0093] Uma pessoa de habilidade na técnica pode selecionar ins- trumentos e colunas de HPLC adequados para uso com a ApoE. A co- luna cromatográfica inclui tipicamente um meio (isto é, um material de acondicionamento) para facilitar a separação dos componentes quími- cos (isto é, fracionamento). O meio pode incluir pequenas partículas. As partículas incluem uma superfície ligada que interage com os vários componentes químicos para facilitar a separação dos componentes químicos. Uma superfície ligada adequada é uma superfície ligada hi- drofóbica, tal como uma superfície ligada à alquila. As superfícies liga- das à alquila podem incluir grupos de alquila ligados a C-4, C-8, C-12 ou C-18, preferivelmente grupos ligados em C-18. A coluna cromato- gráfica inclui uma porta de entrada para receber uma amostra e uma porta de saída para descarregar um efluente que inclui a amostra fra- cionada. Em uma modalidade, a amostra (ou amostra pré-purificada) é aplicada à coluna na porta de entrada, eluída com um solvente ou mis- tura de solventes e descarregada na porta de saída. Diferentes modos de solvente podem ser selecionados para eluir os analitos de interes- se. Por exemplo, a cromatografia em fase líquida pode ser executada utilizando um modo gradiente, um modo isocrático ou um modo políp- tico (isto é, misturado). Durante a cromatografia, a separação dos ma- teriais é efetuada por variáveis tais como a escolha do eluente (tam- bém conhecida como uma “fase móvel”), modo de eluição, condições de gradiente, temperatura, etc.
[0094] Em certas modalidades, um analito pode ser purificado através da aplicação de uma amostra a uma coluna sob condições em que o analito de interesse é retido reversivelmente pelo material de acondicionamento da coluna, enquanto um ou mais outros materiais não são retidos. Nessas modalidades, uma primeira condição de fase móvel pode ser empregada em que o analito de interesse é retido pela coluna e uma segunda condição de fase móvel pode ser empregada subsequentemente para remover o material retido da coluna, uma vez que os materiais não retidos são lavados completamente. Alternativa- mente, um analito pode ser purificado mediante a aplicação de uma amostra a uma coluna sob condições de fase móvel, onde o analito de interesse elui em uma taxa diferencial em comparação com um ou mais de outros materiais. Tais procedimentos podem enriquecer a quantidade de um ou mais analitos de interesse em relação a um ou mais de outros componentes da amostra.
[0095] Em uma modalidade preferida, a HTLC pode ser seguida por HPLC em um sistema cromatográfico em coluna hidrofóbica. Em certas modalidades preferidas, uma coluna à base de polímero Turbo- Flow Cyclone P® da Cohesive Technologies (tamanho de partícula de 60 μm, dimensões da coluna de 50 x 1,0 mm, tamanho de poro de 100Å) é utilizada. Nas modalidades preferidas relacionadas, uma colu- na analítica de fenila ligada a éter Synergi Polar-RP® da Phenomenex Inc (tamanho de partícula de 4 μm, dimensões da coluna de 150 x 2,0 mm, tamanho de poro 80Å) com capeamento de extremidade hidrófilo. Em certas modalidades preferidas, a HTLC e a HPLC são executadas utilizando HPLC Grade Ultra Pure Water e 100% metanol como as fa- ses móveis.
[0096] Através da seleção cuidadosa das válvulas e do encana- mento do conector, duas ou mais colunas de cromatografia podem ser conectadas conforme necessário, de tal modo que o material seja pas- sado de uma para a outra sem a necessidade de quaisquer etapas manuais. Nas modalidades preferidas, a seleção das válvulas e enca- namento é controlada por um computador pré-programado para exe- cutar as etapas necessárias. Mais preferivelmente, o sistema de cro- matografia também é conectado de maneira on-line ao sistema detec- tor, por exemplo, um sistema MS. Assim, um operador pode colocar uma bandeja de amostras em um amostrador automático e as opera- ções remanescentes são executadas sob controle do computador, re- sultando na purificação e análise de todas as amostras selecionadas.
[0097] Em certas modalidades preferidas, a ApoE ou seus frag- mentos em uma amostra podem ser purificados antes da ionização. Nas modalidades particularmente preferidas, a cromatografia não é cromatografia em fase gasosa. Detecção e Quantificação por Espectrometria de Massa
[0098] Em várias modalidades, a ApoE ou seus fragmentos podem ser ionizados por qualquer método conhecido pelo especialista versa- do. A espectrometria de massa é executada utilizando um espectrôme- tro de massa, que inclui uma fonte iônica para ionizar a amostra fraci- onada e criar moléculas carregadas para análises posteriores. Por exemplo, a ionização da amostra pode ser executada através da ioni- zação eletrônica, ionização química, ionização por eletroaspersão (ESI), ionização por fóton, ionização química por pressão atmosférica (APCI), fotoionização, fotoionização por pressão atmosférica (APPI),
bombardeio rápido de átomo (FAB), ionização secundária em fase lí- quida (LSI), ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MAL- DI), ionização de campo, dessorção de campo, ionização por termo- pulverização/pulverização de plasma, ionização e dessorção a laser intensificada por superfície (SELDI), plasma indutivamente acoplado (ICP) e ionização por feixe de partículas. O especialista versado en- tenderá que a escolha do método de ionização pode ser determinada com base no analito a ser medido, tipo de amostra, tipo de detector, escolha do modo positivo versus negativo, etc.
[0099] Nas modalidades preferidas, a ApoE ou um fragmento des- ta é ionizado por ionização por eletroaspersão aquecida (HESI) no modo positivo ou negativo. Nas modalidades alternativas, a ApoE ou seu fragmento é ionizado através da ionização por eletroaspersão (ESI) ou ionização química por pressão atmosférica (APCI) no modo positivo ou negativo.
[00100] Após a amostra ter sido ionizada, os íons positivamente carregados ou negativamente carregados assim criados podem ser analisados para determinar uma relação de massa para carga. Os analisadores adequados para determinar as relações de massa para carga incluem analisadores quadripolares, analisadores coletores iôni- cos e analisadores de tempo de trajetória. Os íons podem ser detecta- dos utilizando vários modos de detecção. Por exemplo, íons selecio- nados podem ser detectados, isto é, utilizando um modo seletivo de monitoramento de íons (SIM) ou, alternativamente, os íons podem ser detectados utilizando um modo de varredura, por exemplo, monitora- mento de múltiplas reações (MRM) ou monitoramento de reação sele- cionada (SRM). De preferência, a relação massa para carga é deter- minada utilizando um analisador quadripolar. Por exemplo, em um ins- trumento "quadripolar" ou "coletor iônico quadripolar", os íons em um campo de radiofrequência oscilante experimentam uma força proporci-
onal ao potencial CC aplicado entre os eletrodos, a amplitude do sinal de RF e a relação massa/carga. A voltagem e a amplitude podem ser selecionadas de modo que apenas os íons tendo uma relação de massa/carga específica se deslocam pelo comprimento do quadrupolo, enquanto todos os outros íons são desviados. Assim, os instrumentos quadripolares podem atuar tanto como um "filtro de massa" quanto como um "detector de massa" para os íons injetados no instrumento.
[00101] Pode-se melhorar a resolução da técnica MS empregando "espectrometria de massa em tandem" ou "MS/MS". Nesta técnica, um íon precursor (também chamado de íon pai) gerado a partir de uma molécula de interesse pode ser filtrado em um instrumento de MS, e o íon precursor é subsequentemente fragmentado para produzir um ou mais íons fragmentados (também chamados íons filha ou íons produ- to) que são então analisados em um segundo procedimento de MS. Por seleção cuidadosa de íons precursores, apenas os íons produzi- dos por certos analitos são passados para a câmara de fragmentação, onde colisões com átomos de um gás inerte produzem os íons frag- mentados. Visto que os íons tanto precursores quanto fragmentados são produzidos de maneira reproduzível sob um determinado conjunto de condições de ionização/fragmentação, a técnica MS/MS pode for- necer uma ferramenta analítica extremamente poderosa. Por exemplo, a combinação de filtração/fragmentação pode ser utilizada para elimi- nar substâncias interferentes, e pode ser particularmente útil em amos- tras complexas, tais como amostras biológicas.
[00102] O espectrômetro de massa tipicamente fornece ao usuário uma varredura de íons; isto é, a abundância relativa de cada íon com uma massa/carga específica em uma determinada faixa (por exemplo, 100 a 1000 amu). Os resultados de um ensaio de analito, isto é, um espectro de massa, podem estar relacionados à quantidade de analito na amostra original por vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, dado que os parâmetros de amostragem e análise são cui- dadosamente controlados, a abundância relativa de um determinado íon pode ser comparada a uma tabela que converte essa abundância relativa em uma quantidade absoluta da molécula original. Alternati- vamente, os padrões moleculares podem ser conduzidos com as amostras e uma curva-padrão construída com base nos íons gerados a partir desses padrões. Utilizando uma tal curva-padrão, a abundân- cia relativa de um determinado íon pode ser convertida em uma quan- tidade absoluta da molécula original. Em certas modalidades preferi- das, um padrão interno é utilizado para gerar uma curva padrão para o cálculo da quantidade de ApoE. Os métodos de geração e uso de tais curvas-padrão são bem conhecidos na técnica e uma pessoa de habi- lidade prática na técnica é capaz de selecionar um padrão interno apropriado. Por exemplo, um isótopo de ApoE pode ser utilizado como um padrão interno. Numerosos outros métodos para relacionar a quan- tidade de um íon com a quantidade da molécula original serão bem conhecidos daqueles de habilidade prática na técnica.
[00103] Uma ou mais etapas dos métodos podem ser executadas utilizando máquinas automatizadas. Em certas modalidades, uma ou mais etapas de purificação são executadas on-line e, mais preferivel- mente, todas as etapas de purificação e espectrometria de massa po- dem ser executadas on-line.
[00104] Em certas modalidades, tais como MS/MS, onde os íons precursores são isolados para fragmentação adicional, a dissociação de ativação de colisão é frequentemente utilizada para gerar os íons fragmentados para outra detecção. Na CAD, os íons precursores ga- nham energia através de colisões com um gás inerte e, posteriormen- te, fragmentam-se por um processo conhecido como "decomposição unimolecular". Energia suficiente deve ser depositada no íon precursor para que certas ligações dentro do íon possam ser rompidas devido ao aumento da energia vibracional.
[00105] Nas modalidades particularmente preferidas, a ApoE é de- tectada e/ou quantificada utilizando MS/MS como se segue. As amos- tras são submetidas à cromatografia em fase líquida, preferivelmente HPLC, o fluxo de solvente líquido da coluna cromatográfica entra na interface do nebulizador aquecido de um analisador MS/MS e a mistu- ra solvente/analito é convertida em vapor no tubo aquecido da interfa- ce. O analito é ionizado pelo ionizador selecionado. Os íons, por exemplo, íons precursores, passam através do orifício do instrumento e entram no primeiro quadrupolo. Os quadrupolos 1 e 3 (Q1 e Q3) são filtros de massa, que permitem a seleção de íons (isto é, íons "precur- sores" e "fragmentados") com base em sua relação massa para carga (m/z). O quadrupolo 2 (Q2) é a célula de colisão, onde os íons são fra- gmentados. O primeiro quadrupolo do espectrômetro de massa (Q1) seleciona moléculas com a massa para carregar relações de ApoE. Os íons precursores com as relações corretas de massa/carga de ApoE são deixados passar para dentro da câmara de colisão (Q2), enquanto que os íons indesejados com qualquer outra relação de massa/carga colidem com os lados do quadrupolo e são eliminados. Os íons pre- cursores que entram no Q2 colidem com moléculas e fragmentos neu- tros de gás argônio. Esse processo é chamado dissociação ativada por colisão (CAD). Os íons de fragmento gerados são passados para dentro do quadrupolo 3 (Q3), onde os íons fragmentados de ApoE são selecionados enquanto outros íons são eliminados.
[00106] Os métodos podem envolver MS/MS executados no modo de íon positivo ou negativo. Utilizando métodos padrão bem conheci- dos na técnica, uma pessoa de habilidade prática na técnica é capaz de identificar um ou mais íons fragmentados de um íon precursor par- ticular de ApoE que pode ser utilizado para seleção no quadrupolo 3 (Q3).
[00107] Se o íon precursor de ApoE incluir um grupo de álcool ou amina, os íons fragmentados são comumente formados que represen- tam a desidratação ou desaminação do íon precursor, atenciosamente. No caso de íons precursores que incluem um grupo de álcool, esses íons fragmentados formados por desidratação são motivados por uma perda de uma ou mais moléculas de água do íon precursor (isto é, on- de a diferença de massa para carregar a relação entre o íon precursor e o íon fragmentado é ao redor de 18 para a perda de uma molécula de água ou ao redor de 36 para a perda de duas moléculas de água, etc.). No caso de íons precursores que incluem um grupo de amina, esses íons fragmentados formados por desaminação são motivados por uma perda de uma ou mais moléculas de amônia (isto é, onde a diferença na relação de massa/carga entre o íon precursor e o íon fra- gmentado é de aproximadamente 17 para a perda de uma molécula de amônia ou aproximadamente 34 pela a perda de duas moléculas de amônia etc.). Da mesma forma, os íons precursores que incluem um ou mais grupos de álcool e amina geralmente formam íons fragmenta- dos que representam a perda de uma ou mais moléculas de água e/ou uma ou mais moléculas de amônia (isto é, onde a diferença na relação de massa para carga entre o íon precursor e o íon fragmentado é de cerca de 35 para a perda de uma molécula de água e para a perda de uma molécula de amônia). Geralmente, os íons fragmentados que re- presentam desidratações ou desaminações do íon precursor não são íons fragmentados específicos para um analito particular. Consequen- temente, nas modalidades preferidas da invenção, MS/MS é executa- da de tal modo que pelo menos um íon fragmentado de ApoE é detec- tado que não representa apenas uma perda de uma ou mais molécu- las de água e/ou uma perda de uma ou mais moléculas de amônia de o íon precursor.
[00108] Quando os íons colidem com o detector, eles produzem um pulso de elétrons que são convertidos em um sinal digital. Os dados adquiridos são retransmitidos para um computador, que marca em grá- fico a contagem dos íons coletados versus tempo. Os cromatogramas de massa resultantes são semelhantes aos cromatogramas gerados nos métodos tradicionais de HPLC. As áreas sob os picos que corres- pondem aos íons específicos, ou a amplitude de tais picos, são medi- das e a área ou amplitude é correlacionada com a quantidade do anali- to de interesse. Em certas modalidades, a área sob as curvas, ou am- plitude dos picos, com relação aos íons fragmentados e/ou íons pre- cursores, é medida para determinar a quantidade de ApoE. Como descrito acima, a abundância relativa de um determinado íon pode ser convertida em uma quantidade absoluta do analito original, utilizando curvas padrão de calibração com base nos picos de um ou mais íons de um padrão molecular interno.
[00109] Os seguintes exemplos servem para ilustrar a invenção. Esses exemplos não têm a intenção de limitar o escopo dos métodos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Determinação do fenótipo de ApoE por espectrometria de massa
[00110] Sumário do reagente: Tabela 1 Fornecedor & Número Reagentes Quantidade do Catálogo Apolipoproteína E2 Abcam, 30R-AA019 0,5 mg Apolipoproteína E3 Abcam, 30R-2382 0,5 mg Apolipoproteína E4 Abcam, 003002 0,5 mg Ácido Fórmico Millipore, FX0440-S 1L Água Burdick & Jackson, 365-4 4L Acetonitrila Burdick & Jackson, 015-4 4L Deoxicolato de sódio Fisher Scientific, PI89905 25 g Ditiothreitol Sigma, 43819-25G 25 gg Iodoacetamida Sigma, I1149-25G 25 g
Tripsina Sigma, T1426-100MG 0,5 mg New England Peptide, Apolipoproteína E2 IS 2 mg Custom Synthesis New England Peptide, Apolipoproteína E2/3 IS 2 mg Custom Synthesis New England Peptide, Apolipoproteína E3/4 IS 2 mg Custom Synthesis New England Peptide, Apolipoproteína E4 IS 2 mg Custom Synthesis New England Peptide, Apolipoproteína E total IS 2 mg Custom Synthesis Albumina de Soro Bovino Sigma, A2153-500G 500 g Comprimidos de Salina Fisher, 003002 100 comprimidos Tamponada com Fosfato Bicarbonato de Amônio Sigma, A6141-500G 500 g (AmBic) Bioreclaimation IVT, per- Líquido Cérebro-espinhal sonalizado 250 mL Bovino (BCSF) Não extraído, agrupados Metanol Fisher Scientific, A454-4 4L Fisher Scientific, Carvão Vegetal Ativado 2,5 kg AC134370025 Agilent BondElut C18 Agilent, A4960125 1 placa 25mg Agilent Poroshell 120 Bo- Agilent, 695768-901 1 Coluna nus RP 2,1 x 100 2,7um
[00111] A identificação de isoformas de apolipoproteína E do CSF (ApoE) pelo ensaio de LC-MS/MS mede três isoformas distintas para ApoE, que podem então ser utilizadas para inferir um fenótipo. Existem três alelos que codificam a proteína apolipoproteína E, ApoE2, ApoE3 e ApoE4, que são expressos codominantemente produzindo seis fenó-
tipos únicos; ApoE2/E2, ApoE2/E3, ApoE2/E4, ApoE3/E3, ApoE3/E4 e ApoE4/E4.
[00112] A fim de medir cada fenótipo de ApoE, uma digestão de proteína tríptica é executada e um peptídeo único é utilizado como um substituto para identificar cada isoforma de proteína. Existe um peptí- deo único tanto para a isoforma ApoE2 quanto para a isoforma ApoE4. A isoforma ApoE3 é determinada através do uso de um peptídeo com- partilhado entre a isoforma ApoE2 e ApoE3 e um peptídeo comparti- lhado entre a isoforma ApoE3 e ApoE4. Os padrões internos para ca- da isoforma são reforçados em cada amostra para servir como pontos de referência do tempo de retenção.
[00113] As amostras de ApoE do CSF são analisadas utilizando es- pectrometria de massa em tandem com uma LC de alto fluxo Thermo Aria Cohesive TLX-4 acoplada a um espectrômetro de massa Thermo Fisher Quantiva Triple Quadrupole. Os dados são monitorados por monitoramento de múltiplas reações (MRM) e analisados utilizando o software de análise de dados Thermo Fisher LC Quan.
[00114] Todas as relações massa para carga (m/z) que identificam os vários alelos de ApoE são descritas nas figuras e resumidas na Ta- bela 2 abaixo.
[00115] Valores esperados: Apolipoproteína E no CSF: 2,84 a 7,24 ug/ml; Apolipoproteína E no soro: 20,07 a 101,68 ug/ml.
[00116] Cinco réplicas técnicas de cada nível de controle de quali- dade foram executadas em ordem de baixa, média e alta ao longo de cinco dias separados.
[00117] Controle de Baixa Qualidade do CSF: 1,2 ug/ml Apolipoproteína E: MÉDIA: 1,16 a 1,37 SD: 0,03 a 0,12 %CV: 2,27 a 10,35% % de recuperação: 97,00 a 104,00%
[00118] Controle de qualidade média do CSF: 3,0 ug/ml Apolipoproteína E: MÉDIA: 2,68 a 3,37 SD: 0,05 a 0,33 %CV: 1,74 a 10,59% % de recuperação: 89,27 a 112,40%
[00119] Controle de alta qualidade do CSF: 15,0 ug/ml Apolipoproteína E: MÉDIA: 13,38 a 16,54 SD: 0,40 a 1,65 %CV: 4,71 a 11,36% % de recuperação: 89,20 a 110,29%
[00120] Precisão: Vinte amostras de pacientes com genótipos co- nhecidos de APOE (método de análise: polimorfismo de comprimento de restrição (RLPM)) foram analisadas por LC-MS/MS. Os fenótipos de ApoE foram então comparados com os genótipos conhecidos. Hou- ve 100% de concordância entre o genótipo e o fenótipo para cada amostra de paciente conforme mostrado na Tabela 3 abaixo.
[00121] Estabilidade de Congelamento e Descongelamento: A aná- lise de congelamento e descongelamento foi conduzida através da análise de seis fenótipos de reforço que foram divididos em quatro alí- quotas idênticas. Todas as quatro alíquotas para cada fenótipo foram congeladas de -90 a -60 °C. As alíquotas de dois a quatro foram des- congeladas para a temperatura ambiente de 18 a 25 °C e congeladas, durante um ciclo de congelamento-degelo. As alíquotas três e quatro foram descongeladas para a temperatura ambiente de 18 a 25 °C e congeladas, durante dois ciclos de congelamento-degelo. A alíquota quatro foi então descongelada para a temperatura ambiente de 18 a 25 °C e congelada, durante três ciclos congelamento-degelo.
[00122] Todas as alíquotas foram descongeladas pela última vez para a temperatura ambiente de 18 a 25 °C e analisadas em triplicata técnica. A análise de congelamento e descongelamento contém dados sobre três ciclos de congelamento e descongelamento. O fenótipo de ApoE possui estabilidade aceitável até três ciclos de congelamento e descongelamento. Tabela 4:
[00123] Estabilidade da amostra extraída: Dez amostras foram ana- lisadas no mesmo dia da extração da amostra para um valor de linha de base. No dia seguinte, as mesmas amostras foram novamente inje- tadas para análise contra os valores da linha de base. Este ensaio produz amostra suficiente para duas injeções. ApoE mostra a estabili- dade da amostra extraída de pelo menos 1 dia em 2 a 8ºC na pilha C do amostrador automático CTC. Tabela 5:
[00124] Estabilidade na Temperatura Ambiente: As amostras são estáveis até 7 dias em 18 a 25°C. Tabela 6:
[00125] Estabilidade Refrigerada: As amostras são estáveis até 7 dias em 2 a 8oC. Tabela 7:
[00126] Estabilidade Congelada: as amostras são estáveis durante pelo menos 31 dias em -30 a -10 ºC. Tabela 8:
[00127] Estudo de Interferência: Critérios de aceitabilidade: A dife- rença devido a uma substância potencialmente interferente deve ser ≤2SD ou 20%CV para ser considerada aceitável.
[00128] Interferência de Hemólise: Seis grupos de pacientes foram reforçados com hemoglobina (Sigma Cat. #H7379) e analisados em triplicata para uma interferência de hemólise da básica, leve, modera-
da e total. Uma solução de hemoglobina a 10 mg/ml foi utilizada para interferência "total". A solução de 10 mg/ml foi diluída com 10 mM BS 1:10 e 1:20 para interferência moderada e leve, respectivamente.
[00129] Todos os níveis de hemólise são inaceitáveis devido à pos- sível contaminação da Apolipoproteína E derivada do soro. Tabela 9:
[00130] Interferência de lipemia: Seis grupos de pacientes foram reforçados com intralipídeo (Sigma Cat. # I141) e analisados em tripli- cata para uma interferência lipêmica básica, leve, moderada e total. Uma diluição 1:5 (intralipídeo: PBS 10 mM) foi utilizada para interfe- rência "total". A solução 1:5 foi diluída com PBS 10 mM 1:10 e 1:20 para interferência moderada e leve, respectivamente. A ApoE é acei-
tável para todos os graus de amostras de lipemia no CSF. Tabela 10:
[00131] Interferência da Bilirrubina: Seis grupos de pacientes foram reforçados com bilirrubina (Sigma Cat. # B4126) e analisados em tripli- cata para uma interferência ictérica básica, leve, moderada e total. Uma solução de bilirrubina de 1 mg/ml foi utilizada para interferência "total". A solução de 1 mg/ml foi diluída com PBS 10 mM 1:10 e 1:20 para interferência moderada e leve, respectivamente. A ApoE é acei- tável para qualquer grau de amostras de CSF ictéricas. Tabela 11:
[00132] Supressão de Íons: Dez amostras de pacientes foram extra- ídas. As dez amostras foram injetadas através da coluna analítica en- quanto a mistura peptídica digerida de ApoE foi infundida pós-coluna. Se o cromatograma de íons total (TIC) para ApoE mostrasse uma di- minuição de ≥15% da intensidade de sinal quando o padrão interno para ApoE elui, então a supressão de íons será determinada de estar presente no ensaio. O TIC dos peptídeos digeridos ApoE não mostrou nenhuma supressão no gradiente quando o analito está eluindo. A in- tensidade de sinal do TIC é uma linha plana e mostra uma diferença ≤15% na intensidade de sinal que está dentro dos parâmetros aceitá- veis do ensaio.
[00133] Análise quantitativa de ApoE Total: A Apolipoproteína E do
CSF (ApoE) pelo ensaio LC-MS/MS mede os níveis totais de ApoE no CSF. Para medir a ApoE total, uma digestão de proteína tríptica é exe- cutada e um peptídeo único para todas as três isoformas (ApoE2, ApoE3 e ApoE4) é utilizado como substituto para medir a concentra- ção total da proteína ApoE. As amostras de ApoE do CSF são anali- sadas utilizando espectrometria de massa em tandem com uma LC de alto fluxo Thermo Aria Cohesive TLX-4 acoplada a um espectrômetro de massa Thermo Fisher Quantiva Triple Quadrupole. Os dados são monitorados no monitoramento de múltiplas reações (MRM) e analisa- dos utilizando o software de análise de dados Thermo Fisher LC Quant. Os seguintes íons foram medidos:
[00134] Limite de detecção (LOD) para ApoE no CSF: 0,33 μg/ml. O limite de quantificação para ApoE no CSF é determinado como 1,0 µg/ml. LOB para ApoE no CSF: 0,3 ug/ml.
[00135] Os conteúdos dos artigos, patentes e pedidos de patentes, e todos os outros documentos e informações eletronicamente disponí- veis mencionados ou citados nesta invenção, são aqui incorporados por referência na sua totalidade na mesma medida como se cada pu- blicação individual fosse específica e individualmente indicada a ser incorporada por referência. Os Requerentes se reservam o direito de incorporar fisicamente a este pedido todo e qualquer material e infor- mação de tais artigos, patentes, pedidos de patentes ou outros docu- mentos físicos e eletrônicos.
[00136] Os métodos aqui descritos ilustrativamente podem ser ade- quadamente praticados na ausência de qualquer elemento ou elemen- tos, limitação ou limitações, não especificamente divulgadas nesta in- venção. Assim, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo",
"contendo" etc. devem ser lidos de forma expansiva e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões aqui empregados foram utili- zados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões para excluir quaisquer equivalen- tes dos recursos mostrados e descritos ou suas partes. É reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ficar entendido que, embora a presente in- venção tenha sido especificamente divulgada por modalidades preferi- das e características opcionais, a modificação e a variação da inven- ção incorporada nesse particular aqui divulgada podem ser recorridas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas dentro do escopo desta invenção.
[00137] A invenção foi aqui descrita ampla e genericamente. Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos que se enquadram na divulgação genérica também fazem parte dos métodos. Isso inclui a descrição genérica dos métodos com uma condição ou limitação negativa, removendo qualquer assunto do gênero, indepen- dentemente se o material cortado é aqui especificamente recitado ou não.
[00138] Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindica- ções. Além disso, onde características ou aspectos dos métodos são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção também é descrita em termos de qual- quer membro ou subgrupo individual de membros do grupo Markush.
Claims (27)
1. Método para a determinação do fenótipo de apolipoprote- ína E (ApoE) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende: (a) purificar a ApoE na amostra; (b) ionizar a ApoE na amostra para produzir um ou mais íon(s) de ApoE; (c) detectar os íon(s) da etapa (b) através da espectrome- tria de massa; em que os alelos de ApoE presentes na amostra são determinados a partir da identidade dos íons detectados na etapa (c).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita purificação compreende cromatografia em fase líquida.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que dita cromatografia em fase líquida compreende a cromatografia em fase líquida de alta eficiência (HPLC).
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita purificação compreende a extração em fase sóli- da (SPE).
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita ionização compreende a ionização por electros- pray (ESI).
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita ionização compreende ionizar no modo positivo.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a adição de um padrão interno.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito padrão interno é marcado isotopicamente.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é o líquido cerebroespinhal (CSF).
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é soro.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a digestão de ApoE an- tes da purificação.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a digestão compreende digestão com tripsina.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a digestão compreende digestão por micro-ondas.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE2/ApoE2.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo de ApoE2/ApoE2 é determinado pela presença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de mas- sa/carga selecionada do grupo que consiste em 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE2/ApoE3.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo ApoE2/ApoE3 é determinado pela pre- sença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE2/ApoE4.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo ApoE2/ApoE4 é determinado pela pre- sença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5, 665,72 ± 0,5, 835,93 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5 e
982,08 ± 0,5.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE3/ApoE3.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo ApoE3/ApoE3 é determinado pela pre- sença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 866,99 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE3/ApoE4.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo ApoE3/ApoE4 é determinado pela pre- sença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5, 866,99 ± 0,5, 892,96 ± 0,5 e 982,08 ± 0,5.
24. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fenótipo é ApoE4/ApoE4.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que o fenótipo ApoE3/ApoE4 é determinado pela pre- sença de um íon(s) fragmentado tendo uma relação de massa/carga selecionada do grupo que consiste em 374,42 ± 0,5, 502,55 ± 0,5, 649,74 ± 0,5 e 892,96 ± 0,5.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a presença do alelo de ApoE4 indica risco aumentado de desenvolvimento da doença de Alzheimer.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a presença de alelos de ApoE4/ApoE4 indica risco aumentado de desenvolvimento da doença de Alzheimer.
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