BR112020000378A2 - anticorpo de receptor de prolactina para perda capilar padrão masculino e feminino - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a uma formulação do anticorpo de receptor de prolactina mat3 e seu uso no tratamento de perda capilar padrão masculino e feminino.

Description

“ANTICORPO DE RECEPTOR DE PROLACTINA PARA PERDA CAPILAR PADRÃO MASCULINO E FEMININO”

[0001] A presente invenção se refere a uma formulação do anticorpo de receptor de prolactina (PRLR) mat3, assim como seu uso para o tratamento de perda capilar padrão masculino e feminino e formas de perda capilar relacionadas a prolactina, por exemplo, causadas por prolactinoma, fármacos de aumento de prolactina, como neurolépticos ou perda capilar peripartal que é associada a altos níveis de prolactina sistêmica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A perda capilar padrão masculino e feminino (M/FPHL) parcialmente também descrita como “Alopecia Androgênica” é a causa mais importante de perda capilar e se refere a até 70 % dos machos e 40 % das fêmeas (Wolff, H. et al., (2016), Diagnostik und Therapie von Haar und Kopfhauterkrankungen. Deutsches Árzteblatt, 113, 377-386). M/FPHL afeta principalmente o topo e a frente do couro cabeludo em que os machos têm uma entrada no cabelo e as fêmeas mostram afinamento do cabelo. Acredita-se que o hormônio masculino di-hidrotestosterona é uma agente principal na perda capilar padrão masculino. O padrão de perda capilar em mulheres difere da calvície padrão masculino. Em mulheres, a entrada no cabelo não retrocede e não leva à calvície total.

[0003] O crescimento capilar no couro cabeludo em ciclos: a fase anágena é caracterizada pelo crescimento capilar ativo; A fase catágena mostra a involução e é seguida pela fase telógena (repouso). A fase exógena (a liberação do cabelo morto) coincide com o fim da fase telógena. A perda capilar pode ser a consequência de crescimento capilar perturbado em qualquer fase.

[0004] A perda capilar telogênica pode ter muitos gatilhos (estresse psicológico e emocional, condições médicas, deficiência de ferro e zinco). De modo importante, M/FPHL em seus estágios mais precoces mostra a queda capilar telogênica (Cleveland Clinic Journal of Medicine (2009). 76, 361-367). A perda capilar anagênica é frequentemente a consequência de radiação ou quimioterapia.

[0005] Embora alguns medicamentos para tratar M/FPHL estejam disponíveis como, finasterida e minoxidil, o tratamento de perda capilar ainda é uma necessidade médica não atendida. Os qglicocorticoides são usados para o tratamento de alopecia areata, em que o corpo ataca seus próprios folículos capilares anagênicos e suprime ou para o crescimento capilar. Minoxidil e finasterida são usados para o tratamento de perda de M/FPHL em homens enquanto apenas a minoxidil também é usada para essa indicação em mulheres. Em geral, todos esses tratamentos têm efeitos colaterais. Finasterida pode levar a perda de libido e impotência em homens e outros efeitos laterais graves como câncer de mama são discutidos; ela é contraindicada em mulheres. Minoxidil pode levar a reações hipostáticas, anginina de peito e crescimento capilar indesejado. Também, nem todos os pacientes tratados são efetivamente tratados com qualquer um desses fármacos. Portanto, o problema de tratar M/FPHL claramente não foi solucionado e uma necessidade médica não atendida significativa ainda permanece.

[0006] Em roedores, experimentos de raspagem em animais adultos foram usados para analisar os efeitos de compostos na perda capilar analisando-se renascimento capilar na área raspada conforme o paradigma lido (British Journal of dermatology (2008).159, 300-305). A raspagem de animais adultos em um ponto no tempo em que o crescimento capilar está, principalmente, em repouso (fase telógena), induz a fase anágena que é caracterizada pelo crescimento capilar. Deve ser demonstrado que a aplicação de di- hidrotestosterona em camundongos do tipo selvagem atrasa o renascimento capilar após a raspagem enquanto os camundongos deficientes de receptor andrógeno mostram renascimento intensificado após a raspagem (British Journal of dermatology 2008;159:300-305).

[0007] Notavelmente, todos os fármacos que mostram eficácia em perda capilar androgenética humana são eficazes nesses experimentos de raspagem, isto é, finasterida, minoxidil foram mostrados para estimular o renascimento capilar em camundongos do tipo selvagem raspados (Int OI Pharmaceutics (2005). 306, 91-98; Med Chem Lett (2007). 17, 5983-5988) .

[0008] Prolactina (PRL) é um hormônio de polipeptídeo composto de 199 aminoácidos. PRL pertence ao hormônio do crescimento (GH), família de lactogênio placentário (PL) de hormônios de polipeptídeo e é sintetizado em células lactotróficas da pituitária e em diversos tecidos da extrapituitária como linfócitos, células epiteliais mamárias, o miométrio e a próstata. Dois promotores diferentes regulam a síntese de PRL da pituitária e extrapituitária (BioEssays 28:1051-1055, 2006).

[0009] PRL se liga ao receptor de PRL (PRLR), um receptor de transmembrana único que pertence à superfamília de receptor de citocina classe 1 (Endocrine Reviews 19:225- 268, 1998). Mediante o fato de o ligante se ligar a PRLRsS pré-dimerizados, JAKs (predominantemente JAK2, Janus Quinase 2) associados ao receptor, se transfosforilam e se ativam. Além de o PRLR também ser fosforilado e poder se ligar ao domínio de SH2 que contém proteínas como STATs (Transdutores de sinal e ativadores de transcrição). Os STATS ligados por receptor são subsequentemente fosforilados, disassociados do receptor e se translocam para o núcleo em que os mesmos estimulam a transcrição de genes-alvo. Além disso, a ativação da trajetória de Ras- Raf-MAPK e a ativação da src quinase citoplásmica por PRLRS foram descritas (Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998).

[0010] A sinalização mediada por PRLR desempenha um papel em uma variedade de processos como desenvolvimento da glândula mamária, lactação, reprodução, crescimento de tumor mamário e de próstata, doenças autoimunes, crescimento geral e metabolismo e imunomodulação (Endocrine Reviews 19: 225-268, 1998; Annu. Rev. Physiol. 64: 47-67, 2002).

[0011] A secreção de PRL de pituitária pode ser inibida pelo uso de bromocriptina e outros agonistas de receptor 2 de dopamina (Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581, 2006). Esses agentes, no entanto, não suprimem a síntese de PRL extrapituitária que podem compensar com sucesso para a inibição de síntese de PRL de pituitária que leva quase a sinalização mediada por PRLR debilitada (Endocrine Reviews 19:225-268, 1998).

Portanto, não é surpreendente que os agonistas de receptor tipo 2 de dopamina não fossem benéficos em pacientes que sofrem de câncer de mama ou doenças autoimunes como lúpus sistêmico ou artrite reumatoide (Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989; Lupus 7:414-419, 1998) embora a prolactina tenha sido implicada nessas doenças. A síntese de prolactina local em células de câncer de mama ou linfócitos que desempenha um papel central no carcinoma mamário ou doenças autoimunes, respectivamente, não foi bloqueada pelos agonistas de receptor de dopamina.

[0012] Os camundongos deficientes de PRLR semelhantes aos camundongos deficientes de receptor andrógeno mostram crescimento capilar intensificado enquanto a administração de prolactina aos camundongos do tipo selvagem atrasa o crescimento capilar (J Endocrinol (2006).191, 415-425).

[0013] Foitzik relatou (Am J Pathol (2003), 162 (5), 1611-1621) que a prolactina pode ter um efeito no crescimento capilar. Com base na análise in vitro de crescimento capilar após incubação com concentrações não fisiologicamente altas de prolactina Foitzik concluiu que os antagonistas de PRLR poderiam ser úteis para o tratamento de alopecia androgênica. No entanto, PRL humano pode interagir com o receptor de PRL humano assim como o receptor de hormônio do crescimento (GHR). Com o uso de PRL em altas doses não fica claro qual receptor é ativado, isto é, o GHR ou o PRLR. Não é especificado nem revelado quais tipos de antagonistas de PRLR foram empregados no estudo. Variantes de PRL assim como antagonistas de PRLR competitivos não são eficazes na neutralização de sinalização de PRL local no folículo capilar devido a suas características negativas que são 1) uma inibição de PRLR reduzida na presença de concentrações de PRL crescentes devido ao mecanismo de ação competitivo, 2) meia-vida reduzida, e 3) afinidade reduzida para o PRLR se comparado ao PRL.

[0014] Recentemente, diversos anticorpos de PRLR que interferen com a sinalização mediada por PRLR foram descritos (documentos WO2012163932, WO2011069799 WO2011069795). Foi demonstrado que a neutralização de anticorpos de PRLR (documento WO2011069799) estimula o renascimento capilar em camundongos normo- e hiperprolactinêmicos raspados. Também poderia ser demonstrado que o receptor de prolactina (PRLR) é expresso em folículos capilares na pele de macacos e camundongos (vide exemplo 1) e que o PRLR é neutralizado por meio de ligação do anticorpo específico a PRLR 005-CO4. Também poderia ser mostrado que o anticorpo de PRLR 005-CO4 estimula o renascimento capilar em camundongos fêmeas raspadas (Otto, C. et al. (2015) Endocrinology 156 (11), 4365-4373). Os anticorpos de PRLR específicos descritos não interferem com o GHR. O bloqueio do PRLR intensifica o renascimento capilar em camundongos conforme foi demonstrado com antiandrógenos no mesmo modelo animal. No entanto, o pelo das costas dos camundongos não pode ser considerado como um modelo relevante para cabelo de couro cabeludo humano. Portanto, o efeito descrito no cabelo do pelo do camundongo é meramente sugestivo, mas não conclusivo por si em relação aos efeitos de tratamento potenciais em alopecia humana. No entanto, muito embora os dados do camundongo sejam conclusivos e consistentes com os dados do macaco no contexto de receptor andrógeno e PRLR, a tradução dos dados de camundongo para a situação do ser humano pode ser dificultada pelo fato de que o renascimento de cabelo do tronco de camundongo (pelo) pode diferir do renascimento do cabelo do couro cabeludo em macaco e ser humano assim com pelo fato de que o renascimento capilar após perda capilar espontânea em seres humanos e macacos pode diferir do renascimento após a raspagem de troncos de camundongo.

[0015] Ainda há uma necessidade médica não atendida para a provisão de medicamentos para o tratamento de M/FPHL. O problema subjacente da presente invenção está na provisão de um medicamento inovador que pode ser usado no tratamento de M/FPHL.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Esta invenção se refere a uma formulação que contém anticorpo estável de um anticorpo de PRLR que é surpreendentemente eficaz no modelo primata não humano mais aceito para M/FPHL (o modelo de macaco-de-cauda-coto) e é, então, promissor quanto a um tratamento inovador também para M/FPHL humano.

[0017] Estudos recentes que empregam esse modelo de macaco de perda capilar de couro cabeludo pós-puberdade espontânea com alto valor preditivo para perda capilar padrão masculino e feminino humano demonstraram que a eficácia do anticorpo de PRLR mat3 quando animais foram tratados com uma formulação que contém anticorpo estável. O próprio anticorpo é a matéria do pedido PCT WO2012163932 enquanto a formulação é revelada no pedido PCT WO2014036076, cada um dos quais é incorporado a título de referência em sua totalidade no presente documento.

[0018] Empregando-se macacos-de-cauda-coto poderia demonstrar que o tratamento com a formulação que contém anticorpo de PRLR estável seria provavelmente eficaz na perda capilar padrão masculino e feminino humano. Uma proporção muito alta (81 %) de animais (9 de 11) respondeu ao tratamento com composto, embora a população seja heterogênea em relação a idade e ao gênero e a área observada mostrou calvície a longo prazo antes do tratamento. 5 dos 11 macacos tinham >25 anos de idade e foram considerados particularmente difíceis de tratar. No entanto, três deles responderam ao tratamento com composto. De modo notável, as áreas de couro cabeludo completamente carecas responderam melhor. O anticorpo de PRLR mat3 mostrou mais eficácia e foi eficaz seguindo um regime mais conveniente (s.c. duas vezes por mês) do que apenas as duas medicações “aprovadas para M/FPHL (minoxidil (tópica, diariamente), e finasterida (oral, uma vez ao dia, apenas para homens). (Vide exemplo 4 e Figuras 2-3)).

[0019] Portanto, a formulação que contém anticorpo de PRLR mat3 estável pode ser considerada como uma opção de tratamento inovadora para M/FPHL em mulheres e homens. A provisão de uma formulação que contém anticorpo mat3 estável específica soluciona o problema anterior de fornecer um novo medicamento para M/FPHL em mulheres e homens. A formulação também pode ser empregada para o tratamento de formas de perda capilar relacionadas a prolactina, por exemplo, causadas por prolactinoma, fármacos de aumento de prolactina como neurolépticos ou perda capilar peripartal que é associada a altos níveis de prolactina sistêmica.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0020] Figura 1: Imunorreatividade para o PRLR em glândulas mamárias e pele de camundongos fêmeas e macacos cinomolgos

[0021] Figura 1A: pele de macaco cinomolgo fêmea; Figura 1B: glândula mamária de macaco cinomolgo fêmea; Figuras 1C: pele, camundongo fêmea, Figura 1D: glândula mamária de camundongo fêmea.

[0022] A imunorreatividade para o PRLR pode ser encontrada em folículos capilares e células epiteliais epidérmicas na pele de camundongos (Figura 1C) e macacos (Figura 1A) fêmeas. A imunorreatividade forte para o PRLR foi demonstrada em células epiteliais mamárias de ambas as espécies (Figura 1B e 1D). Esses experimentos fornecem evidência para um papel de sinalização mediada por PRLR na biologia do folículo capilar.

[0023] Figura 2: Comparação de crescimento capilar: Dados históricos com Minoxidil e Finasterida em função do Tratamento com anticorpo de PRLR mat 3

[0024] A Figura 2 representa uma análise dos efeitos dos compostos de referência aprovados minoxidil e finasterida no crescimento capilar (Figura 2A) em comparação com o tratamento com o anticorpo de PRLR mat3 inovador (Figura 2B), ambos os estudos empregaram o modelo de macaco-de- cauda-coto.

[0025] Figura 2A: No estudo que emprega minoxidil e finasterida a alteração em peso capilar em mg/pol? foi medido em um período de 20 semanas (quadrados abertos: finasterida em combinação com o veículo, quadrados cheios:

finasterida em combinação com minoxidil; minoxidil em círculo em separado). Durante o tempo de tratamento um patamar foi alcançado após aproximadamente 12 semanas seguido pelo declínio no peso capilar. (de: Hair Growth Effects of Oral Adinistration of Finasteride, a Steroid 5a- Reductase Inhibitor, Alone and in a Combination with Topical Minoxidil in the Balding Stumptail Macaque. Diani, A.R. et al. (1992). Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 74, 345-350).

[0026] Figura 2B: No estudo em que macacos-de-cauda-coto foram tratados com o anticorpo de PRLR mat3 a porcentagem de cabelo grosso foi medida em um período de tratamento de 6 meses. A Figura 2B mostra que nenhum patamar foi alcançado durante esse tempo. Esses dados mostram o efeito superior do anticorpo de PRLR mat3 no renascimento capilar terminal em comparação com os compostos de referência minoxidil e finasterida. Um aumento do atrito de pelos terminais na área careca poderia ser observado em animais fêmeas (quadrados) e em machos (diamantes). A faixa de aumento era de 50-220 cabelos/cm?, os animais mais jovens responderam melhor do que os animais idosos. (quadrados cheios: fêmeas, diamantes cheios: animais machos).

[0027] Figura 3: Contagem de cabelo (“grosso”) terminal

[0028] A Figura 3 representa uma análise de contagens de pelo terminal nas áreas “careca” (A), “transição” (B), “parte de trás da cabeça” (C) e “tronco” (D) no período de tratamento de 24 semanas. Tais áreas foram predefinidas na linha de base e marcadas por 2 tatuagens que ocorreram no canto esquerdo superior e direito inferior da imagem de Trichoscan e permitida a monitorar os mesmos folículos capilares em toda a duração do estudo. Um drástico aumento da contagem de pelo terminal em áreas carecas (109 % de aumento) foi demonstrado assim como um aumento nas áreas de transição (27 %). De modo esperado, alterações menores ocorreram nas áreas da parte de trás da cabeça e tronco em que menos pelos velos, mas muitos pelos terminais já estavam presentes antes do começo do tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] A presente invenção se baseia na conclusão de que a formulação que contém anticorpo de receptor de prolactina estável matô promove o crescimento capilar e pode, portanto, conferir um benefício terapêutico a um indivíduo. Definições

[0030] Conforme descrito acima, a presente revelação fornece uma formulação de anticorpo de PRLR que estabiliza o anticorpo na forma líquida ou na forma liofilizada em condições de armazenamento pretendidas. A formulação descrita no presente documento inclui um ou mais excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, e está contida em meios tamponados em um pH adequado e é substancialmente isosmótico com fluidos fisiológicos. Para a administração sistêmica, a injeção é uma via de administração possível, incluindo intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e subcutânea para injeção. Devido a sua baixa viscosidade, a formulação de anticorpo de PRLR presentemente apresentada pode ser convenientemente processada por meio, por exemplo, de ultrafiltração e filtração estéril e pode ser administrada a um paciente por meio de injeção, incluindo tanto injeção intravenosa quanto subcutânea. Além do mais, devido ao fato de que os mesmos são substancialmente isosmótico, a formulação de anticorpo de PRLR presentemente revelada reduz os danos ao tecido ou outros efeitos fisiológicos adversos e, desse modo, obtendo tolerância ao paciente favorável adesão do paciente aumentada.

[0031] A formulação descrita no presente documento é caracterizada pela ausência substancial de sais adicionados além de um sal orgânico ou um sal inorgânico que é usado para tamponar a formulação, que fornece a flexibilidade para aumentar as concentrações de outros estabilizadores, como sacarose, enquanto mantém a osmolalidade da formulação para tolerabilidade in vivo aprimorada e, consequentemente, adesão do paciente aumentada. Além do mais, a baixa viscosidade da formulação presentemente descrita permite o processamento conveniente, incluindo ultrafiltração e filtração estéril, e injeção da solução de produto de fármaco através da agulha.

[0032] Com a finalidade de interpretar esse relatório descritivo, as definições a seguir se aplicarão. No caso em que qualquer definição estabelecida abaixo entre em conflito com o uso dessa palavra em qualquer outro documento, incluindo qualquer documento incorporado ao presente documento a título de referência, a definição estabelecida deve sempre prevalecer para fins de interpretação deste relatório descritivo e suas reivindicações associadas a menos que um significado contrário seja claramente pretendido (por exemplo, no documento em que o termo é originalmente usado).

[0033] Sempre que adequado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. O uso de "um" no presente documento significa "um ou mais" a menos que seja definido o contrário ou onde o uso de "um ou mais" seja claramente inadequado. O uso de “ou” significa “e/ou” exceto onde especificado o contrário. o uso de "compreendem", "compreende", "que compreende", "incluem", "inclui", e "que inclui" são intercambiáveis e não destinados a serem limitantes. O termo "como" também se destina a ser limitante. Por exemplo, o termo "incluindo" deve significar "incluindo, mas sem limitação". Ademais, quando a descrição de uma ou mais modalidades usar o termo "que compreende", aqueles que são versados na técnica compreenderiam que, em alguns casos específicos, a modalidade ou as modalidades podem ser alternativamente descritas com o uso da linguagem "que consiste essencialmente em" e/ou "que consiste em".

[0034] Conforme usado no presente documento, o termo "viscosidade" se refere à resistência de uma formulação líquida para fluir, como quando injetada através de uma agulha de seringa durante a administração a um paciente. Medições de viscosidade podem ser feitas por uma técnica de cone e placa com um elemento Peltier definido em uma temperatura definida, como 22 ºC-23 ºC conforme descrito no presente documento. Tipicamente, um gradiente de tensão de cisalhamento bem definido é aplicado à formulação líquida e a taxa de cisalhamento resultante é medida. A viscosidade é a razão da tensão de cisalhamento para a taxa de cisalhamento. Conforme usado no presente documento, a viscosidade é expressa em unidades de mPa-S a 22 ºC-23 “*C em que l mPa-S = 1 cP. As formulações substancialmente isosmóticas de alta concentração, baixa viscosidade reveladas no presente documento são tipicamente caracterizadas por ter uma viscosidade na faixa de 1 a 8 mPa-S a 22 ºCc-23 ºC.

[0035] Conforme usado no presente documento, o termo "osmolalidade" se refere a uma medição de concentração de soluto, definida como o número de mmol de soluto por kg de solução. Um nível desejado de osmolalidade pode ser obtido pela adição de um ou mais estabilizador como um açúcar ou um álcool de açúcar que inclui manitol, dextrose, glicose, trealose e/ou sacarose. Estabilizadores adicionais que são adequados para fornecer osmolalidade são descritos em referências como o manual de Pharmaceutical Excipients (Quarta Edição, Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, Science & Practice Publishers) ou Remingtons: The Science and Practice of Pharmacy (Nineteenth Edition, Mack Publishing Company).

[0036] Conforme usado no presente documento, o termo "cerca de" se refere a +/- 10 % do valor unitário fornecido. Conforme usado no presente documento, o termo "substancialmente" se refere à condição qualitativa de exibir um grau total ou aproximado de uma característica ou propriedade de interesse. Um versado na arte nas técnicas biológicas compreenderá que os fenômenos biológicos e químicos raramente alcançam ou evitam, caso o façam, um resultado absoluto devido às muitas variáveis que afetam o teste, a produção e o armazenamento de composições e materiais biológicos e químicos, e devido ao erro inerente nos instrumentos e equipamento usados no teste, na produção e no armazenamento de composições e materiais biológicos e químicos. O termo substancialmente é, portanto, usado no presente documento para capturar a falta de completeza potencial inerente em muitos fenômenos biológicos e químicos.

[0037] Conforme usado no presente documento, os termos "isosmótico" e "isotônico" são usados intercambiavelmente com os termos "substancialmente isosmótico" e "substancialmente isotônico" e se referem a formulações caracterizadas por ter uma pressão osmótica que é a mesma ou pelo menos substancialmente equivalente à pressão osmótica de uma outra solução, que é obtida por meio de formulações em que a concentração total de solutos, incluindo solutos tanto permeáveis quanto impermeáveis, na formulação são é igual ou pelo menos substancialmente equivalente ao número total de solutos em uma outra solução. Então, embora seja observado por aqueles versados na técnica que formulações "isosmóticas" e "isotônicas" que são usadas para administração in vivo geralmente têm uma osmolalidade na faixa de cerca de 270 mmol/kg a cerca de 310 mmol /kg, no contexto das formulações de alta concentração, baixa viscosidade da presente revelação, os termos "isosmótico", "isotônico", "substancialmente isosmótico" e "substancialmente isotônico" são usados intercambiavelmente para se referir a formulações que têm uma osmolalidade na faixa de cerca de 240 mmol/kg a cerca de 380 mmol/kg, ou de cerca de 270 mmol/kg a cerca de 370 mmol/kg, ou de cerca de 300 mmol/kg a cerca de 330 mmol/kg.

[0038] As formulações de anticorpo de PRLR substancialmente isosmóticas de alta concentração, baixa viscosidade presentemente reveladas contêm de cerca de O mM a cerca de 70 mM de histidina; de cerca de 50 ppm a cerca de 300 ppm de um tensoativo não iônico como, por exemplo, polissorbato (TweenO) 80 e/ou polissorbato (TweenG) 20; de cerca de 34 mM a cerca de 292 mM de um açúcar ou álcool de açúcar, como, por exemplo, manitol, dextrose, glicose, trealose e/ou sacarose; de cerca de O mM a cerca de 50 mM de arginina; de cerca de O mM a cerca de 50 mM de lisina; de cerca de 0 mM à cerca de 270 mM de glicina ou alanina; de cerca de O mM a cerca de 10 mM de metionina; e de cerca de 1 mg/ml a cerca de 150 mg/ml do anticorpo de PRLR a um pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5. As formulações reveladas no presente documento exibem uma viscosidade na faixa de cerca de 1 a cerca de 8 mPa-S a 22 ºC-23 ºC e osmolalidade na faixa de cerca de 240 a cerca de 380 mmol/kg.

[0039] Nessas formulações, a histidina é um agente de tampão, que pode ser usado para manter o pH da formulação de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, ou de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0, como cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,5, cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 6,5.

[0040] Os açúcares ou álcool de açúcar, como manitol, dextrose, glicose, trealose, e/ou sacarose, são usados separadamente ou em combinação tanto como crioprotetores quanto como um estabilizador o anticorpo de PRLR em formulações líquidas também durante a liofilização.

[0041] Os tensoativos não iônicos como polissorbatos, incluindo polissorbato 20 e polissorbato 80; polioxâmeros incluindo poloxâmero 184 e 188; polióis pluronicO; e outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno, estabilizam o anticorpo de PRLR durante o processamento e armazenamento reduzindo-se a interação interfacial e impedem o anticorpo da adsorção.

[0042] A arginina é um solubilizador de proteína e também um estabilizador que reduz o anticorpo e outra agregação de proteína, como a agregação de anticorpo de PRLR, e outra possível degradação. A metionina é um antioxidante que impede a oxidação do anticorpo durante o processamento e o armazenamento.

[0043] Os açúcares e sais inorgânicos são comumente usados como estabilizadores de proteína; no entanto, tantos os açúcares quanto os sais inorgânicos também são agentes de tonicidade eficazes. Se uma formulação precisar de uma alta concentração de um ou mais açúcares para estabilizar o anticorpo de PRLR, a concentração de sal inorgânico deve ser zero ou mantida muito baixa a fim de manter a osmolalidade da formulação de modo que a dor da injeção seja reduzida mediante a administração.

[0044] Conforme usado no presente documento, o termo "sal" se refere a sais inorgânicos, que incluem cloreto de sódio (NaCl), sulfato de sódio (NaszS0s:), tiocianato de sódio (NaSCN), cloreto de magnésio (MgCl), sulfato de magnésio (MgS04), tiocinanato de amônio (NH«SCN), sulfato de amônio ((NH4)2S04), cloreto de amônio (NH.Cl), cloreto de cálcio (CaCl;), sulfato de cálcio (CaS0s), cloreto de zinco (ZnCl2) e semelhantes, ou combinações dos mesmos. A formulação de anticorpo de PRLR revelada no presente documento é caracterizada por uma ausência substancial de sal adicionado e é, portanto, referida no presente documento como uma formulação de anticorpo livre de sal. Será compreendido por aqueles versados na técnica que a presença de sais inorgânicos nas formulações presentemente reveladas que são introduzidas por meio de ajuste de pH não é considerada como sais adicionados. Tais sais inorgânicos quando introduzidos por meio de ajustes de pH, se presentes em uma formulação de acordo com a presente revelação, não devem exceder uma concentração de cerca de 2 mM.

[0045] Conforme usado no presente documento, o termo "tensoativo" inclui tensoativos não iônicos que incluem, sem limitação, polissorbatos, como polissorbato 20 ou 80, e os polioxâmeros, como polioxâmero 184 ou 188, polióis pluronico, e outros polímeros em bloco de etileno/polipropileno. Quantidades de tensoativos eficazes para fornecer alta concentração estável da formulação de anticorpo de PRLR estão normalmente na faixa de 50 ppm a 300 ppm. O uso de tensoativos não iônicos permite que a formulação seja exposta as tensões de cisalhamento e superfície sem causar desnaturação do anticorpo de PRLR, e também reduzem a adsorção nas superfícies durante o processamento e o armazenamento. A formulação revelada no presente documento inclui, sem limitação, uma formulação que tem um ou mais tensoativos não iônicos incluído, por exemplo, um ou mais polissorbatos, como polissorbato 20 ou 80; um ou mais polioxâmeros, como poloxâmero 184 ou 188; polióis pluronico; e/ou um ou mais polímeros em bloco de etileno/polipropileno. São exemplificadas no presente documento as formulações que têm um polissorbato, como polissorbato 20 (TweenG 20) ou 10 polissorbato 80 (TweenO 80).

[0046] O termo “pelos velos” se refere a pelos curtos, finos, ligeiramente coloridos e pouco notáveis que se desenvolvem durante a infância. Cada filamento de pelos velos tem normalmente menos que 2 mm de comprimento.

[0047] O termo “pelo terminal” se refere a pelo espesso, longo e pigmentado, normalmente na fase anágena de crescimento capilar. O pelo terminal é definido para ter um diâmetro médio de 31,5 um ou mais.

[0048] O termo “área careca” se refere a uma região predefinida na parte central/frontal do couro cabeludo que era inicialmente cabeludo ainda assim afetado pela perda completa de pelos visíveis, por exemplo, terminais. Os folículos permanecem produzindo pelos finos (geralmente do tipo velos).

[0049] O termo “área de transição” se refere a uma região predefinida do couro cabeludo em que a perda capilar visualmente óbvia, no entanto, incompleta ocorreu, isto é, a densidade de pelo terminal é reduzida em comparação com a área do couro cabeludo traseiro enquanto os pelos terminais caídos são, agora, substituídos por pelos do tipo velos.

[0050] O termo “área de parte de trás da cabeça” se refere à parte do couro cabeludo em que nenhuma perda capilar ocorreu, isto é, a grande maioria dos pelos pertence ao tipo pelo terminal e apenas alguns pelos do tipo velos estão presentes.

[0051] o termo “tronco” se refere a uma área predeterminada no flanco das costas do macaco que é coberta por pelos, isto é, pelos terminais principalmente espessos.

[0052] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são uma mimética química artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. A menos que seja indicado o contrário, uma sequência de polipeptídeos específica também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas da mesma.

[0053] O termo "um anticorpo que se liga a PRLR" se refere a um anticorpo que tem capacidade de ligar PRLR com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil como um diagnóstico e/ou agente terapêutico no alvejamento de PRLR.

[0054] Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo" se refere a uma classe de proteínas que é geralmente conhecida como imunoglobulinas. Os anticorpos incluem anticorpos monoclonais de comprimento total (mAb), como anticorpos monoclonais de IgG2, que incluem regiões de Fc de imunoglobulina. O termo anticorpo também inclui anticorpos biespecíficos, diacorpos, moléculas de cadeia única e fragmentos de anticorpo como Fab, F(ab'): e Fv. O anticorpo compreendido, de preferência, de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) que são tipicamente interconectadas pelas ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada pode compreender, por exemplo, três domínios CHl, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio (CL). As regiões de VH e VL podem ser adicionalmente subdividas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de armação (FR) Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs.

Conforme usado no presente documento, o termo "anticorpo de anti- PRLR" se refere a um anticorpo que tem especificidade de ligação contra a proteína de PRLR humana assim como os fragmentos e variantes da proteína de PRLR humana.

Os anticorpos de anti-PRLR apresentados no presente documento podem ser anticorpos de IgG62 e incluem anticorpos monoclonais de IgG2 anti-PRLR, como anticorpos monoclonais de IgG2 anti-PRLR quiméricos, humanizados e totalmente humanos.

Os anticorpos monoclonais anti-PRLR, que incluem anticorpos com comprimento total e fragmentos de ligação a antígeno e variantes dos mesmos, que são adequados para uso nas formulações reveladas no presente documento são apresentados nos números de Publicação de Patente PCT W0O/20111069799, W0/20111069795, e W0/2012163932, cada um dos quais são incorporados a título de referência no presente documento em sua totalidade.

Isso também inclui o anticorpo de PRLR mat3 que compreende um domínio de ligação a antígeno, em que o dito domínio de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a. as sequências de aminoácidos do HCDRl, HCDR2 e

HCDR3 da dita região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4 e 5,

respectivamente, e b. as sequências de aminoácidos do LCDRlI, LCDR2 e LCDR3 da dita região variável de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 7 e 8.

[0055] As sequências de aminoácidos do LCDR1I também podem ser representadas por SEQ ID NO: 9. O anticorpo de PRLR compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que

[0056] a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia pesada está de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia leve está de acordo com a SEQ ID NO: 2.

[0057] O termo "anticorpo monoclonal" como usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas possíveis, por exemplo, mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Assim, o termo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em oposição às preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas em que são tipicamente descontaminadas — por outras imunoglobulinas. O termo

"monoclonal” não deve ser interpretado para precisar de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados podem ser produzidos a partir do método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature, 256: 495 [1975, ou pode ser por meio de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente nº Us 4.816.567). os anticorpos monoclonais também podem ser isolados das bibliotecas de exibição de fago usando as técnicas como aquelas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Markset al., J Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser recombinantes, quiméricos, humanizados, humanos, Human Engineered" (geneticamente modificados por ser humano), ou fragmentos de anticorpo, por exemplo.

[0058] Os anticorpos monoclonais incluem "anticorpos monoclonais quiméricos" em que uma porção de uma cadeia pesada e/ou leve inclui sequências dos anticorpos derivados de uma espécie, enquanto o restante do anticorpo, incluindo a região de Fc, inclui sequências dos anticorpos derivados de uma segunda espécie, e a segunda espécie pode ser humana. Vide, por exemplo, a Patente nº US 4.816.567 e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984).

[0059] os anticorpos monoclonais também incluem "anticorpos monoclonais humanizados" em que uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDR) de uma sequência de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos derivados de uma espécie substitui uma ou mais CDR de uma sequência de cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos derivados de uma segunda espécie, e a segunda espécie pode ser humana. O processo de "humanização” é normalmente aplicado a anticorpos monoclonais desenvolvidos para administração a seres humanos. Vide, por exemplo, Riechmann et al., Nature 332(6162):323-27 (1988) e Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86(24):10029-33 (1989).

[0060] os anticorpos monoclonais também incluem "anticorpos monoclonais totalmente humanos" em que todas as sequências de cadeia pesada e leve são derivadas de sequências de anticorpo humano. Os anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser gerados pelas tecnologias de exibição de fago e podem ser isolados dos camundongos que foram geneticamente modificados para expressar o repertório de anticorpo humano. Vide, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348(6301):552-554 (1990), Marks et al., J Mol. Biol. 222(3):581-597 (1991), e Carmen e Jermutus, Brief Funct. Genomic Proteomic 1(2): 189-203 (2002).

[0061] Conforme usado no presente documento, um anticorpo “se liga especificamente 2a”, é “específico a/para” ou “reconhece especificamente” um antígeno de interesse, por exemplo, alvo de antígeno de polipeptídeo de PRLR, é um que liga o antígeno com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil como um agente terapêutico no alvejamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não reage por cruzamento significativamente com outras proteínas ou não reage por cruzamento significativamente com proteínas além das ortólogas e variantes (por exemplo, formas mutantes, variantes de splice, ou formas proteoliticamente truncadas) do alvo de antígeno mencionado anteriormente. O termo "reconhece especificamente" ou "se liga especificamente a" ou é "específico a/para" um polipeptídeo em particular ou um epítopo em um alvo de polipeptídeo em particular conforme usado no presente documento pode ser exibido, por exemplo, por um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que tem um Kp monovalente para o antígeno de menos que cerca de 10-* M, alternativamente menos que cerca de 10- Ss M, alternativamente menos que cerca de 10-56 M, alternativamente menos que cerca de 107 M, alternativamente menos que cerca de 1078 M, alternativamente menos que cerca de 10º M, alternativamente menos que cerca de 10-10 M, alternativamente menos que cerca de 10742 M, alternativamente menos que cerca de 10? M, ou menos. Um anticorpo “se liga especificamente 2a”, é “específico a/para” ou “reconhece especificamente” um antígeno se tal anticorpo for capaz de discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígenos de referência. Em sua forma mais geral, “ligação específica”, “se liga especificamente 2a”, é “específico a/para” ou “reconhece especificamente” se refere à habilidade do anticorpo discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não relacionado, conforme descrito, por exemplo, de acordo com um dos seguintes métodos. Tais métodos compreendem, mas sem limitação, Western blots, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídeo. Por exemplo, um ensaio ELISA padrão pode ser realizado.

[0062] “Afinidade de ligação" ou “afinidade” se refere à intensidade da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula e seu parceiro de ligação. A menos que seja indicado de outro modo, como usado no presente documento, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um anticorpo e um antígeno). A constante de dissociação “K”” é comumente usada para descrever a afinidade entre uma molécula (como um anticorpo) e seu parceiro de ligação (como um antígeno) isto é, o quão apertado um ligante se liga a uma proteína específica. Afinidades entre ligante e proteína são influenciadas por interações intermoleculares não covalentes entre as duas moléculas. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Em uma modalidade, o "KW" ou "valor KW" de acordo com esta invenção é medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare Biacore, Inc.). Outros dispositivos adequados são BIACORE T100, BIACORE(R)-2000, BIACORe 4000, um BIACORE (R) -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), ou o instrumento ProteOon XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

[0063] Conforme usado no presente documento a expressão “os anticorpos antagonizam a sinalização mediada por receptor de prolactina” deve se referir a um bloqueio da ativação de PRLR pelos anticorpos da presente invenção, o que leva a uma inibição de sinalização mediada por PRLR.

[0064] Um anticorpo “antagonista” ou um anticorpo “de bloqueio” é um que inibe significativamente (seja particular ou completamente) uma atividade biológica do antígeno que o mesmo liga.

[0065] O termo “anticorpos amadurecidos” ou “fragmentos de ligação a antígeno amadurecidos” como variantes de Fab amadurecidos inclui derivados de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que exibe ligação mais forte - isto é, ligação com afinidade aumentada - a um dado antígeno como o domínio extracelular de uma proteína-alvo. A maturação é o processo de identificação de um pequeno número de mutações nas seis CDRs de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que leva a esse aumento de afinidade. O processo de maturação é a combinação de métodos de biologia molecular para introdução de mutações no anticorpo e triagem para identificar os aglutinantes aprimorados.

[0066] Conforme usado no presente documento, o termo "quantidade farmaceuticamente eficaz" de uma formulação de anticorpo de PRLR se refere a uma quantidade da formulação que fornece efeito terapêutico em um regime de administração, incluindo aliviar alguns ou todos os tais sintomas da doença ou reduzir a predisposição à doença, quando administrado de acordo com o regime de tratamento desejado.

[0067] As formulações de anticorpo de PRLR de alta concentração reveladas no presente documento incluem tipicamente um anticorpo de anti-PRLR em uma concentração na faixa de cerca de 1 mg/ml a cerca de 150 mg/ml, ou de cerca de 2 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, ou de cerca de 5 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, ou de cerca de 7,5 ma/ml a cerca de 60 mg/ml. Dentro de alguns aspectos, a concentração de anticorpo de anti-PRLR dentro dessas formulações é cerca de 2 mg/ml, ou cerca de 7,5 mg/ml, ou cerca de 20 mg/ml, ou cerca de 50 mg/ml, ou cerca de 60 mg/ml. Tais formulações são tipicamente administradas em um volume de menos que cerca de 2 ml, ou cerca de 1,5 ml, ou cerca de 1 ml, ou cerca de 0,5 ml por sítio de injeção para injeção subcutânea. É preferencial uma formulação que contém o anticorpo de PRLR mat 3 que compreende um domínio de ligação a antígeno, em que o dito domínio de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a. as sequências de aminoácidos do HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da dita região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4 e 5, respectivamente, e b. as sequências de aminoácidos do LCDRl, LCDR2 e LCDR3 da dita região variável de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 7 e 8.

[0068] As sequências de aminoácidos do LCDRlI também podem ser representadas por SEQ ID NO: 9. O anticorpo de PRLR compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia pesada está de acordo com SEQ ID NO: 1, e a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia leve está de acordo com a SEQ ID NO: 2

[0069] A formulação pode ser líquida ou liofilizada e pode ser estável a ºC por pelo menos 6 meses.

[0070] Dentro de outros aspectos, a formulação de anticorpo de anti-PRLR contém cerca de 5-30 mM de histidina, cerca de 34-292 mM de sacarose, cerca de 50-150 ppm de tensoativo não iônico, cerca de 10-50 mM de arginina, cerca de 1-10 mM de metionina, cerca de 20-120 mg/ml de anticorpo de anti-PRLR a um pH na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, como pH 5,5.

[0071] Dentro de outros aspectos, a formulação de anticorpo de anti-PRLR contém cerca de 5-30 mM de histidina, cerca de 34-292 mM de sacarose, cerca de 50-150 ppm de polissorbato, cerca de 10-50 mM de arginina, cerca de 1-10 mM de metionina, cerca de 20-120 mg/ml de anticorpo de anti-PRLR a um pH na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, como pH 5,5.

[0072] Dentro de outros aspectos, a formulação de anticorpo de anti-PRLR contém cerca de 10 mM de histidina, cerca de 234 mM de sacarose, cerca de 80 ppm de polissorbato 80, cerca de 30 mM de arginina, cerca de 5 mM de metionina, cerca de 60 (40) mg/ml de anticorpo de anti- PRLR a um pH na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, como pH 5,5.

[0073] Dentro de outros aspectos, a formulação de anticorpo de anti-PRLR contém cerca de 1,8 mM de L- histidina e 8,2 mM de L-histidina HCl, cerca de 234 mM de sacarose, cerca de 80 ppm de polissorbato 80, cerca de 30 mM de L-arginina HCl, cerca de 5 mM de L-metionina, cerca de 60 (40) mg/ml de anticorpo de anti-PRLR a um pH na faixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, como pH 5,5.

[0074] O termo “formulação farmacêutica” /“composição farmacêutica” se refere a uma preparação que está em tal forma com a finalidade de permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido na mesma para ser eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

[0075] Então, a presente revelação fornece formulações mAb anti-PRLR, incluindo formulações mAb de IgG2 anti-PRLR, em que o mAb de anti-PRLR é solúvel em altas concentrações de proteína. O mAb de anti-PRLR na formulação revelada no presente documento permanece solúvel em concentrações entre cerca de 1 mg/ml a cerca de 150 mg/ml e permanece estável sob condições de armazenamento isosmótico e exibe viscosidade reduzida em comparação com formulações de anticorpo atualmente disponíveis.

[0076] O anticorpo de anti-PRLR que tem a sequência conforme revelada nos pedidos PCT WO2012163932 e WO2014036076, cada um dos quais é incorporado a título de referência em sua totalidade) é um anticorpo de IgG2 que bloqueia o receptor de prolactina (PRLR) . Conforme mencionado acima, o anticorpo de PRLR pode induzir o crescimento capilar bloqueando-se PRLR, desse modo, superando as deficiências em M/FPHL. As formulações de anticorpo de anti-PRLR livres de sal em alta concentração apresentadas no presente documento podem ser administradas aos pacientes por meio de injeção intravenosa ou injeção subcutânea ou outras vias de injeção. Geração de Anticorpo

[0077] O anticorpo matô da presente invenção e sua geração é a matéria do pedido WO2012163932. A revelação deste pedido é incorporada ao presente documento em sua totalidade. As sequências do anticorpo mat3 são mostradas na Tabela 1. A formulação de anticorpo de PRLR foi preparada conforme revelada no pedido WO 2014036076. A revelação deste pedido é incorporada ao presente documento em sua totalidade. Tabela 1: Sequências do anticorpo de PRLR mat3: Região da sequência Tipo da SEQ ID atm EL ES Região variável de cadeia proteína 1 E ps Região variável de cadeia proteína 2 Ee E BE es E BE es

EPE FE E

[0078] O uso do anticorpo mat3 em uma dada formulação para impedir M/FPHL é a matéria da presente invenção. Também, o objetivo da presente invenção é o uso da formulação para o tratamento de formas de perda capilar relacionadas a prolactina, por exemplo, causada por prolactinoma, fármacos de aumento de prolactina como neurolépticos ou perda capilar peripartal que é associada a altos níveis de prolactina sistêmica.

EXEMPLOS Exemplo 1: Imunoistoquímica para o PRLR na pele e glândulas mamárias de macacos cinomolgos e camundongos fêmeas

[0079] A imunoistoquímica foi realizada em seções de glândulas mamárias e pele embebidas em parafina de um macaco cinomolgo fêmea e camundongos fêmeas com o uso de um antissoro anti-PRLR policlonal de coelho da Santa Cruz direcionado contra o c-terminal do PRLR humano (aa 323-622) (sc-20992). Esse anticorpo reage por cruzamento com PRLR humano, murino e de rato.

[0080] A imunorreatividade para o PRLR pode ser encontrada em folículos capilares e células epiteliais epidérmicas na pele de camundongos (Figura 1C) e macacos (Figura 1A) fêmeas. A imunorreatividade forte também foi observada conforme esperado em células epiteliais mamárias de ambas as espécies (Figura 1B e 1D). Nenhuma imunorreatividade foi observada, quando o anticorpo primário foi omitido.

[0081] Esses resultados fornecem evidência para um papel de sinalização mediada por PRLR na biologia do folículo capilar. Exemplo 2: A neutralização de anticorpo de PRLR mat3 estimula o renascimento capilar em macacos-de-cauda-coto

[0082] os efeitos do anticorpo de PRL mat3 no renascimento capilar em macacos-de-cauda-coto foram analisados. Esses animais são um modelo-chave aceito para perda capilar humana com um alto valor preditivo. Os estudos foram realizados no laboratório do Institute of Molecular Medicine, Peking University, Yiheyuan Road, nº 5, 100871 Beijing, China. O tamanho do grupo era 11, em que um animal fêmea senil morreu em anestesia na semana 16; o grupo consistiu em 4 animais fêmea e 7 animais machos, idade 12-27 anos. Os animais receberam 40 mg/kg de anticorpo de PRLR mat3 subcutaneamente duas vezes por mês. A solução de anticorpo é representada na Tabela 2:

Tabela 2: Composição de solução s.c. de anticorpo de PRLR mat3 L-Arginina 30 mM Estabilizador em qm ess L-Histidina 8,2 mM Agente tampão e em eme — Polissorbato 80 ppm Estabilizador (tensoativo) e e pese eee |

[0083] O renascimento capilar foi determinado nas seguintes áreas: careca, transição, não afetada, tronco (pelo). As biópsias de 2 áreas de transição adjacentes foram amostradas assim como sangue e soro. A leitura primária foi um fototricograma, por exemplo, um Trichoscan para determinar a densidade do pelo terminal. Os valores de linha de base foram comparados aos valores obtidos após cada quatro semanas. A leitura secundária foi a situação capilar óptica padronizada, histologia e níveis de prolactina reativa. Os parâmetros gerais, por exemplo, peso corporal, contagem de célula sanguínea foram medidos mensalmente. Deve ser demonstrado que havia eficácia robusta e visível em áreas carecas e/ou de transição em comparação com os dados de linha de base (vide Figuras 2). Muito embora o estudo não fosse projetado como estudo de segurança/tolerabilidade/toxicológico, os animais de teste foram observados quanto anomalias comportamentais e fenotípicas. Não havia sinais de segurança ou tolerabilidade evidente durante ou após o período de tratamento relacionado à administração de fármaco.

[0084] Os dados para os Trichoscans foram coletados nos seguintes pontos no tempo: linha de base (dia de início de tratamento), tratamento de 4 semanas (d28), tratamento de 8 semanas (d56), tratamento de 12 semanas (d84), tratamento de 16 semanas (dll2), tratamento de 24 semanas (dl68) e no dia 364, isto é, 24 semanas após a última dosagem. A melhor “foto imagem de Trichoscans (foco, contraste, qualidade de pigmentação, ausência de dobras cutâneas) foi escolhida para cada ponto no tempo em cada área predefinida. Nos pontos no tempo individuais, as espessuras do pelo foram medidas. Com base nos diâmetros do pelo, o número de pelos velos e terminais por cm? foi determinado. Ambas as medições (diâmetros e contagem do pelo) foram realizadas com o uso de Datinf TrichoScan Smart Software de maneira semiautomatizada com cura manual. Por razões de consistência, cada região foi analisada pelo mesmo observador ao longo do tempo. Os dados obtidos mostraram uma contagem de pelo terminal aumentada na região anteriormente careca em 9 de 11 macacos. O aumento na contagem de pelo estava na faixa de 50 - 220 pelos/cm? em macacos respondedores (vide Figura 2B). O efeito foi observado em macacos machos e fêmeas. Os animais mais jovens responderam melhor que aqueles senis. Nenhum patamar de eficácia foi alcançado em 6 meses de tratamento com o anticorpo mat3. Os melhores efeitos em relação ao aumento de números absolutos de pelos terminais assim como em relação ao aumento em porcentagem foram observados em áreas anteriormente carecas, isto é, tais áreas em que os pelos velos eram dominantes antes do tratamento. Tais áreas foram inicialmente consideradas as mais difíceis de tratar uma vez que a calvície dessas áreas era pré-existente por décadas em alguns macacos. Seis meses após cessar o tratamento, nenhum aumento adicional de diâmetros de pelo ou aumento de pelos terminais foi observado. No entanto, havia também apenas uma queda marginal (insignificante) do nível alcançado no fim do estudo. A proporção de pelos terminais foi significativamente maior que antes do início do tratamento 12 meses atrás, isto é, um longo efeito duradouro do tratamento foi observado.

[0085] A Figura 3 representa uma análise de contagens de pelo terminal nas áreas “careca” (A), “transição” (B), “parte de trás da cabeça” (C) e “tronco” (D) no período de tratamento de 24 semanas. Tais áreas foram predefinidas na linha de base e marcadas por 2 tatuagens que ocorreram no canto esquerdo superior e direito inferior da imagem de Trichoscan e permitida a monitorar os mesmos folículos capilares em toda a duração do estudo. Um drástico aumento da contagem de pelo terminal em áreas carecas (109 % de aumento) foi demonstrado assim como um aumento nas áreas de transição (27 %). De modo esperado, alterações menores ocorreram nas áreas da parte de trás da cabeça e tronco em que menos pelos velos, mas muitos pelos terminais já estavam presentes antes do começo do tratamento.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação liofilizada ou líquida que contém anticorpo estável caracterizada por compreender 20-120 mg/ml de anticorpo em que o anticorpo é o anticorpo de PRLR mat3, que compreende a. 10 - 50 mM de arginina HCl b. 5- 30 mM de histidina c. 1-10 mM de metionina d. 50-150 ppm de tensoativo não iônico e. 34-292 mM de açúcar, para o uso no tratamento de perda capilar padrão masculino e feminino.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é polissorbato e o açúcar é sacarose.

3. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por compreender a. 30 mM de L-arginina HCl b. 1,8 mM de L-histidina c. 8,2 mM de L-histidina HCl d. 5 mM de L-metionina e. 80 ppm de polissorbato 80 f. 234 mM de sacarose.

4, Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a concentração de anticorpo é 60 mg/kg.

5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de PRLR mat 3 compreende um domínio de ligação a antígeno, em que o dito domínio de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a. as sequências de aminoácidos do HCDRl, HCDR2 e HCDR3 da dita região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 4 e 5, respectivamente, e b. as sequências de aminoácidos do LCDRlI, LCDR2 e LCDR3 da dita região variável de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 7 e 8.

6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que as sequências de aminoácidos do LCDR1 são de acordo com a SEQ ID NO: 9.

7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de PRLR compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a. a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia pesada está de acordo com a SEQ ID NO: 1, e b. a sequência de aminoácidos da dita região variável de cadeia leve está de acordo com a SEQ ID NO: 2.

8. Formulação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ter um valor de pH na faixa de 5,0 a 6,5.

9. Formulação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser estável a ºC por pelo menos 6 meses.

10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser para uso no tratamento de formas de perda capilar relacionadas a prolactina causadas pela prolactinaoma.

11. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser para uso no tratamento de formas de perda capilar relacionadas a prolactina causadas pelos neurolépticos.

12. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser para uso no tratamento de perda capilar pós-parto.