BR112019027604B1 - SECONDARY AMINE SUBSTITUTED COUMARIN COMPOUNDS AND USES THEREOF AS FLUORESCENT MARKERS - Google Patents

Abstract

A presente divulgação se refere a compostos de cumarina substituídos com amina secundária e usos dos mesmos como marcadores fluorescentes. Os compostos podem ser utilizados como marcadores fluorescentes para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.The present disclosure relates to secondary amine-substituted coumarin compounds and uses thereof as fluorescent markers. The compounds can be used as fluorescent markers for nucleotides in nucleic acid sequencing applications.

Description

[0001] A presente divulgação se refere a compostos de cumarina substituídos com amina secundária e usos dos mesmos como marcadores fluorescentes. Em particular, os compostos podem ser utilizados como marcadores fluorescentes para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento de ácidos nucleicos.[0001] The present disclosure relates to coumarin compounds substituted with secondary amine and their uses as fluorescent markers. In particular, the compounds can be used as fluorescent markers for nucleotides in nucleic acid sequencing applications.

ANTECEDENTESBACKGROUND

[0002] Várias publicações e documentos de patentes são referenciados neste pedido para descrever de forma mais detalhada o estado da técnica a que esta divulgação se refere. A divulgação de cada uma dessas publicações e documentos é incorporada por referência aqui.[0002] Various publications and patent documents are referenced in this application to describe in more detail the prior art to which this disclosure refers. The disclosure of each such publication and document is incorporated by reference herein.

[0003] A detecção não radioativa de ácidos nucleicos com marcadores fluorescentes é uma tecnologia importante na biologia molecular. Muitos procedimentos empregados na tecnologia de DNA recombinante baseavam-se anteriormente na utilização de nucleotídeos ou polinucleotídeos marcados radioativamente com, por exemplo, 32P. Compostos radioativos permitem a detecção sensível de ácidos nucleicos e outras moléculas de interesse. No entanto, existem sérias limitações na utilização de isótopos radioativos, tais como despesas, prazo de validade limitado, sensibilidade insuficiente e, mais importante, considerações de segurança. A eliminação da necessidade de marcadores radioativos reduz tanto os riscos de segurança quanto o impacto e custos ambientais associados, por exemplo, à eliminação de reagentes. Métodos passíveis não radioativos de detecção fluorescente incluem, a título de exemplo não limitativo, sequenciamento automatizado de DNA, métodos de hibridação, detecção em tempo real de produtos de reação em cadeia da polimerase, e imunoensaios.[0003] Non-radioactive detection of nucleic acids with fluorescent markers is an important technology in molecular biology. Many procedures used in recombinant DNA technology were previously based on the use of radioactively labeled nucleotides or polynucleotides with, for example, 32P. Radioactive compounds allow sensitive detection of nucleic acids and other molecules of interest. However, there are serious limitations to the use of radioactive isotopes, such as expense, limited shelf life, insufficient sensitivity and, most importantly, safety considerations. Eliminating the need for radioactive tracers reduces both safety risks and the environmental impact and costs associated with, for example, the disposal of reagents. Non-radioactive methods amenable to fluorescent detection include, by way of non-limiting example, automated DNA sequencing, hybridization methods, real-time detection of polymerase chain reaction products, and immunoassays.

[0004] Para muitas aplicações, é desejável empregar múltiplos marcadores fluorescentes espectralmente distinguíveis para conseguir a detecção independente de uma pluralidade de analitos que se sobrepõem espacialmente. Em tais métodos multiplex, o número de recipientes de reação pode ser reduzido, simplificando os protocolos experimentais e facilitando a produção de kits de reagentes específicos da aplicação. Em sistemas multicoloridos automatizados de sequenciamento de DNA, por exemplo, a detecção fluorescente multiplex permite a análise de múltiplas bases nucleotídicas em uma única pista de eletroforese, aumentando assim a produtividade através de métodos de cor única e reduzindo as incertezas associadas às variações de mobilidade eletroforética entre as pistas.[0004] For many applications, it is desirable to employ multiple spectrally distinguishable fluorescent labels to achieve independent detection of a plurality of spatially overlapping analytes. In such multiplex methods, the number of reaction vessels can be reduced, simplifying experimental protocols and facilitating the production of application-specific reagent kits. In automated multicolor DNA sequencing systems, for example, multiplex fluorescent detection allows analysis of multiple nucleotide bases in a single electrophoresis lane, thereby increasing throughput over single-color methods and reducing uncertainties associated with electrophoretic mobility variations. between the tracks.

[0005] No entanto, a detecção fluorescente multiplex pode ser problemática e existem vários fatores importantes que restringem a seleção de marcadores fluorescentes apropriados. Primeiro, pode ser difícil encontrar compostos corantes com espectros de absorção e emissão adequadamente resolvidos em uma determinada aplicação. Além disso, quando vários corantes fluorescentes são utilizados em conjunto, a geração de sinais de fluorescência em regiões espectrais distinguíveis por excitação simultânea pode ser complicada, uma vez que bandas de absorção dos corantes estão normalmente afastadas entre si, portanto, é difícil obter eficiências de excitação de fluorescência comparáveis, mesmo para dois corantes. Muitos métodos de excitação utilizam fontes de luz de alta potência, tal como lasers e, portanto, o corante deve possuir fotoestabilidade suficiente para suportar essa excitação. Uma consideração final de particular importância para os métodos de biologia molecular está relacionada a extensão em que os corantes fluorescentes devem ser compatíveis com as substâncias químicas reagentes, tais como, por exemplo, solventes e reagentes de síntese de DNA, tampões, enzimas polimerase e enzimas ligase.[0005] However, multiplex fluorescent detection can be problematic and there are several important factors that restrict the selection of appropriate fluorescent markers. First, it can be difficult to find dye compounds with adequately resolved absorption and emission spectra in a given application. Furthermore, when several fluorescent dyes are used together, the generation of fluorescence signals in distinguishable spectral regions by simultaneous excitation can be complicated, since the absorption bands of the dyes are usually far apart, therefore, it is difficult to obtain efficiencies of fluorescence. Comparable fluorescence excitation even for two dyes. Many excitation methods use high-power light sources, such as lasers, and therefore the dye must have sufficient photostability to withstand this excitation. A final consideration of particular importance for molecular biology methods relates to the extent to which fluorescent dyes must be compatible with reagent chemicals, such as, for example, solvents and DNA synthesis reagents, buffers, polymerase enzymes, and bind.

[0006] Com o avanço da tecnologia de sequenciamento, surgiu necessidade para mais compostos fluorescentes, conjugados de ácidos nucleicos dos mesmos, e vários conjuntos de corantes que satisfazem todas as restrições mencionadas acima e que são favoráveis particularmente em métodos moleculares de elevado rendimento, tais como o sequenciamento de fase sólida e semelhantes.[0006] With the advancement of sequencing technology, a need has arisen for more fluorescent compounds, nucleic acid conjugates thereof, and various sets of dyes that satisfy all the restrictions mentioned above and that are particularly favorable in high-throughput molecular methods, such as such as solid phase sequencing and the like.

[0007] Moléculas de corante fluorescente com propriedades de fluorescência aprimoradas, tais como intensidade de fluorescência, forma e comprimento de onda adequados podem melhorar a velocidade e a precisão do sequenciamento de ácidos nucleicos. Fortes sinais de fluorescência são especialmente importantes quando as medições são feitas em tampões biológicos à base de água e com temperatura elevada, uma vez que as intensidades de fluorescência da maior parte dos corantes são significativamente mais baixas sob tais condições. Além disso, a natureza da base à qual um corante está ligado também afeta a fluorescência máxima, a intensidade de fluorescência e outras propriedades espectrais do corante. As interações específicas de sequência entre as nucleobases e os corantes fluorescentes podem ser adaptadas pelo desenho específico dos corantes fluorescentes. A otimização da estrutura dos corantes fluorescentes pode melhorar a eficiência de incorporação de nucleotídeos, reduzir o nível de erros de sequenciamento, e diminuir o uso de reagentes, e, portanto, reduzir os custos de sequenciamento de ácidos nucleicos.[0007] Fluorescent dye molecules with enhanced fluorescence properties such as suitable fluorescence intensity, shape and wavelength can improve the speed and accuracy of nucleic acid sequencing. Strong fluorescence signals are especially important when measurements are made in water-based biological buffers at elevated temperature, since the fluorescence intensities of most dyes are significantly lower under such conditions. Furthermore, the nature of the base to which a dye is attached also affects the maximum fluorescence, fluorescence intensity, and other spectral properties of the dye. Sequence-specific interactions between nucleobases and fluorescent dyes can be tailored by the specific design of fluorescent dyes. Optimizing the structure of fluorescent dyes can improve the efficiency of nucleotide incorporation, reduce the level of sequencing errors, and decrease the use of reagents, and therefore reduce the costs of nucleic acid sequencing.

[0008] Alguns desenvolvimentos ópticos e técnicos já proporcionaram uma qualidade de imagem bastante aprimorada, mas acabaram limitados pela baixa resolução óptica. Geralmente, a resolução óptica da microscopia óptica é limitada a objetos espaçados a aproximadamente metade do comprimento de onda da luz utilizada. Em termos práticos, apenas objetos que estão muito distantes (pelo menos de 200 nm a 350 nm) poderiam ser resolvidos por microscopia luminosa. Uma maneira de melhorar a resolução da imagem e aumentar o número de objetos resolvíveis por unidade de área de superfície é usar luz de excitação com comprimento de onda menor. Por exemplo, se o comprimento de onda da luz é encurtado por AÀ ~ 100 nm com a mesma óptica, a resolução será melhor (cerca de Δ 50 nm / (cerca de 15 %)), imagens menos distorcidas serão gravadas, e a densidade de objetos na área reconhecível aumentará cerca de 35%.[0008] Some optical and technical developments have already provided greatly improved image quality, but ended up being limited by low optical resolution. Generally, the optical resolution of optical microscopy is limited to objects spaced approximately half the wavelength of the light used. In practical terms, only objects that are very distant (at least 200 nm to 350 nm) could be resolved by light microscopy. One way to improve image resolution and increase the number of resolvable objects per unit surface area is to use shorter wavelength excitation light. For example, if the wavelength of light is shortened by AÀ ~ 100 nm with the same optics, the resolution will be better (about Δ 50 nm/(about 15%)), less distorted images will be recorded, and the density of objects in the recognizable area will increase by approximately 35%.

[0009] Certos métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos utilizam luz laser para excitar e detectar nucleotídeos marcados com corante. Esses instrumentos usam luz com comprimento de onda mais longo, tal como lasers vermelhos, juntamente com corantes apropriados que são excitáveis a 660 nm. Para detectar clusters de sequenciamento de ácido nucleico mais densamente compactados enquanto mantém uma resolução útil, uma fonte de luz azul com comprimento de onda menor (450 nm a 460 nm) pode ser usada. Nesse caso, a resolução óptica será limitada, não pelo comprimento de onda da emissão dos corantes fluorescentes vermelhos com comprimento de onda mais longo, mas pela emissão de corantes excitáveis pela próxima fonte de luz com comprimento de onda mais longa, por exemplo, "laser verde" a 532 nm. Assim, são necessários marcadores de corante azul para uso na detecção de fluorescência em aplicações de sequenciamento.[0009] Certain nucleic acid sequencing methods use laser light to excite and detect dye-labeled nucleotides. These instruments use longer wavelength light, such as red lasers, together with appropriate dyes that are excitable at 660 nm. To detect more densely packed nucleic acid sequencing clusters while maintaining useful resolution, a shorter wavelength blue light source (450 nm to 460 nm) can be used. In this case, the optical resolution will be limited, not by the emission wavelength of the longer wavelength red fluorescent dyes, but by the emission of excitable dyes by the next longer wavelength light source, e.g., "laser green" at 532 nm. Thus, blue dye markers are needed for use in fluorescence detection in sequencing applications.

[00010] Embora a química do corante azul e as tecnologias a laser associadas tenham melhorado, por exemplo, para produzir corantes para discos DVD e Blu-ray, esses compostos não são apropriados para a rotulagem biológica e não podem ser usados como biomarcadores.[00010] Although blue dye chemistry and associated laser technologies have improved, for example, to produce dyes for DVD and Blu-ray discs, these compounds are not suitable for biological labeling and cannot be used as biomarkers.

[00011] Infelizmente, ainda são raros os corantes azuis comercialmente disponíveis com forte fluorescência e adequados para a marcação de nucleotídeos. São aqui descritos novos compostos fluorescentes adequados para marcação de nucleotídeos com forte fluorescência sob excitação por luz azul.[00011] Unfortunately, commercially available blue dyes with strong fluorescence and suitable for marking nucleotides are still rare. New fluorescent compounds suitable for labeling nucleotides with strong fluorescence under blue light excitation are described here.

SUMÁRIOSUMMARY

[00012] A presente invenção se refere a derivados de cumarina substituídos com amina secundária. Os compostos podem ser úteis como marcadores fluorescentes, particularmente para marcação de nucleotídeos em aplicações de sequenciamento de ácido nucleico. Em alguns aspectos, os corantes absorvem a luz de maneira ideal a um comprimento de onda de 450 nm a 460 nm e são particularmente vantajosos em situações em que fontes de excitação de comprimento de onda azul com comprimento de onda de 450 nm a 460 nm são usadas. A excitação do comprimento de onda azul permite a detecção e resolução de uma densidade mais alta de características por unidade de área, devido ao menor comprimento de onda da emissão de fluorescência. Quando tais corantes são usados e conjugados com nucleotídeos, melhorias podem ser vistas no comprimento, na intensidade, na precisão, e na qualidade das leituras de sequenciamentos obtidos durante os métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos.[00012] The present invention relates to coumarin derivatives substituted with secondary amine. The compounds may be useful as fluorescent labels, particularly for labeling nucleotides in nucleic acid sequencing applications. In some aspects, the dyes ideally absorb light at a wavelength of 450 nm to 460 nm and are particularly advantageous in situations where blue wavelength excitation sources with a wavelength of 450 nm to 460 nm are used. Blue wavelength excitation allows detection and resolution of a higher density of features per unit area due to the shorter wavelength of fluorescence emission. When such dyes are used and conjugated to nucleotides, improvements can be seen in the length, intensity, precision, and quality of sequencing reads obtained during nucleic acid sequencing methods.

[00013] Em um primeiro aspecto, são fornecidos compostos de fórmula (I) ou sais dos mesmos: em que: - X é O, S, Se, ou NRn, em que Rn é H ou alquil C1-C6; - R e R1 são, cada um, independentemente H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquil opcionalmente substituído, carbociclil opcionalmente substituído, heterociclil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; - R2 e R4 são cada um, independentemente, H, halo, - CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, - SO2NH2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquil opcionalmente substituído, carbociclil opcionalmente substituído, heterociclil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; ou R2 ou R4 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído; - R3 é H, alquil C1-C6, alquil C2-C6 substituído, alquenil C2-C6 opcionalmente substituído, alquinil C2-C6 opcionalmente substituído, ou carbociclil, heterociclil, aril, ou heteroaril opcionalmente substituído, ou R3 está ligado a R2 ou R4 para formar um anel opcionalmente substituído; em que, quando R é -CN, R3 não é alquil C1-C6; - cada R5 é, independentemente, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquil opcionalmente substituído, carbociclil opcionalmente substituído, heterociclil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído; e - m é 0, 1, 2, 3 ou 4.[00013] In a first aspect, compounds of formula (I) or salts thereof are provided: where: - X is O, S, Se, or NRn, where Rn is H or C1-C6 alkyl; - R and R1 are each independently H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, optionally substituted alkoxy, optionally substituted aminoalkyl, optionally substituted carbocyclyl, optionally substituted heterocyclyl, optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl; - R2 and R4 are each, independently, H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, optionally substituted alkoxy, optionally substituted aminoalkyl, optionally substituted carbocyclyl, optionally substituted heterocyclyl, optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl; or R2 or R4 is linked to R3 to form an optionally substituted heterocyclic ring; - R3 is H, C1-C6 alkyl, substituted C2-C6 alkyl, optionally substituted C2-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl, or carbocyclyl, heterocyclyl, aryl, or optionally substituted heteroaryl, or R3 is bonded to R2 or R4 to form an optionally substituted ring; wherein, when R is -CN, R3 is not C1-C6 alkyl; - each R5 is, independently, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, alkoxy optionally substituted, optionally substituted aminoalkyl, optionally substituted carbocyclyl, optionally substituted heterocyclyl, optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl; and - m is 0, 1, 2, 3 or 4.

[00014] Em alguns aspectos, R não é -CN, de modo que R é H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, - SO3H, -SO2NH2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquil opcionalmente substituído, carbociclil opcionalmente substituído, heterociclil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído.[00014] In some aspects, R is not -CN, such that R is H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, optionally substituted alkyl , optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, optionally substituted alkoxy, optionally substituted aminoalkyl, optionally substituted carbocyclyl, optionally substituted heterocyclyl, optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl.

[00015] Em outro aspecto, é fornecido um composto de fórmula (II) ou um sal do mesmo: em que: - X' é selecionado a partir de O, S, e NRp, onde Rp é H ou alquil C1-C6; - R6 é H ou alquil C1-C4; - R7 é H, halo, -CN, -OH, alquil C1-C4 opcionalmente substituído, alquenil C1-C4 opcionalmente substituído, alquinil C2-C4 opcionalmente substituído, -CO2H, -SO3H, - SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, e alcoxi C1-C4 opcionalmente substituído; - R8 e R10 são, cada um, independentemente H, halo, - CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, alquil C1-C6 opcionalmente substituído, alquenil C1-C6 opcionalmente substituído, alquinil C2-C6 opcionalmente substituído ou alcoxi C1-C6 opcionalmente substituído; ou - R8 ou R10 é H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, - SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, alquil C1C6 opcionalmente substituído, alquenil C1-C6 opcionalmente substituído, alquinil C2-C6 opcionalmente substituído ou alcoxi C1-C6 opcionalmente substituído e o outro, R8 ou R10, é tomado com R9 de modo a formar um anel heterocíclico de 4 a 7 membros opcionalmente substituído; - R9 é alquil C2-C6 ou alquil C1-C6 substituído com - CO2H, -CO2-alquil C1-C4, -CONH2, -CONH(alquil C1-C4), - CON(alquil C1-C4)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), ou -SO2N(alquil C1-C4)2; - cada R11 é, independentemente, halo, -CN, carboxi, amino, -OH, C-amido, N-amido, nitro, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, e alcoxi C1-C6 opcionalmente substituído; e - q é 0, 1 ou 2.[00015] In another aspect, a compound of formula (II) or a salt thereof is provided: where: - X' is selected from O, S, and NRp, where Rp is H or C1-C6 alkyl; - R6 is H or C1-C4 alkyl; - R7 is H, halo, -CN, -OH, optionally substituted C1-C4 alkyl, optionally substituted C1-C4 alkenyl, optionally substituted C2-C4 alkynyl, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl ), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, and optionally substituted C1-C4 alkoxy; - R8 and R10 are each independently H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C1-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl or optionally substituted C1-C6 alkoxy; or - R8 or R10 is H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, optionally substituted C1C6 alkyl , optionally substituted C1-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl or optionally substituted C1-C6 alkoxy and the other, R8 or R10, is taken with R9 so as to form an optionally substituted 4- to 7-membered heterocyclic ring; - R9 is C2-C6 alkyl or C1-C6 alkyl substituted with - CO2H, -CO2-C1-C4 alkyl, -CONH2, -CONH(C1-C4 alkyl), - CON(C1-C4 alkyl)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), or -SO2N(C1-C4 alkyl)2; - each R11 is, independently, halo, -CN, carboxy, amino, -OH, C-amido, N-amido, nitro, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (C1-C4 alkyl), -SO2N (C1-alkyl- C4)2, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, and optionally substituted C1-C6 alkoxy; e - q is 0, 1 or 2.

[00016] Em outra modalidade, um composto da presente divulgação é conjugado com uma porção de substrato, tal como, por exemplo, um nucleosídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, polipeptídeo, carboidrato, ligante, partícula, célula, superfície semi-sólida (por exemplo, gel) ou superfície sólida. A conjugação pode ser realizada através de um grupo carboxil -CO2H, que pode ser reagido utilizando métodos conhecidos no estado da técnica com um grupo amino ou hidroxil em uma porção (tal como um nucleotídeo), ou um ligante ligado ao mesmo, para formar uma amida ou éster.[00016] In another embodiment, a compound of the present disclosure is conjugated to a substrate moiety, such as, for example, a nucleoside, nucleotide, polynucleotide, polypeptide, carbohydrate, ligand, particle, cell, semisolid surface (e.g. , gel) or solid surface. Conjugation can be accomplished through a carboxyl -CO2H group, which can be reacted using methods known in the art with an amino or hydroxyl group on a moiety (such as a nucleotide), or a ligand attached thereto, to form a amide or ester.

[00017] De acordo com outro aspecto da presente divulgação, consequentemente, são fornecidos compostos corantes que compreendem grupos de ligação para permitir, por exemplo, ligação covalente a uma porção de substrato. A ligação pode ser realizada em qualquer posição do corante, incluindo qualquer um dos grupos R. A ligação pode ser realizada através de R3 ou através de R5 da Fórmula (I), ou através de R9 ou R11 da Fórmula (II).[00017] According to another aspect of the present disclosure, accordingly, dye compounds are provided that comprise linking groups to allow, for example, covalent attachment to a substrate moiety. The linkage can be carried out at any position of the dye, including any of the R groups. The linkage can be carried out through R3 or through R5 of Formula (I), or through R9 or R11 of Formula (II).

[00018] De acordo com um aspecto adicional, a presente divulgação fornece um nucleosídeo ou composto de nucleotídeo definido pela fórmula: N-L-Corante em que: - N é um nucleotídeo; - L é uma porção de ligação opcional; e - Corante é um composto fluorescente de acordo com a presente divulgação.[00018] According to a further aspect, the present disclosure provides a nucleoside or nucleotide compound defined by the formula: N-L-Dye wherein: - N is a nucleotide; - L is an optional binding moiety; and - Dye is a fluorescent compound according to the present disclosure.

[00019] Assim, algumas concretizações aqui descritas estão relacionadas a uma porção, em particular nucleotídeo ou oligonucleotídeo, marcada com um composto de (a) Fórmula (I) ou (b) Fórmula (II).[00019] Thus, some embodiments described here are related to a portion, in particular nucleotide or oligonucleotide, labeled with a compound of (a) Formula (I) or (b) Formula (II).

[00020] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece métodos de sequenciamento que utilizam os compostos corantes da presente divulgação.[00020] In a further aspect, the present disclosure provides sequencing methods that utilize the dye compounds of the present disclosure.

[00021] De acordo com um aspecto adicional, a invenção também fornece um kit que compreende um composto corante (livre ou em forma de conjugado) que pode ser utilizado em vários ensaios imunológicos, marcação de oligonucleotídeos ou ácido nucleico, ou para sequenciamento de DNA por síntese. Em outro aspecto adicional, a presente divulgação fornece kits que compreende "conjuntos" de corantes particularmente adequados para ciclos de sequenciamento por síntese em uma plataforma de instrumento automatizado. Em alguns aspectos, são fornecidos kits contendo um ou mais nucleotídeos, em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado como aqui descrito.[00021] According to a further aspect, the invention also provides a kit comprising a dye compound (free or in conjugated form) that can be used in various immunological assays, oligonucleotide or nucleic acid labeling, or for DNA sequencing. by synthesis. In another additional aspect, the present disclosure provides kits comprising "sets" of dyes particularly suitable for sequencing-by-synthesis cycles on an automated instrument platform. In some aspects, kits containing one or more nucleotides are provided, wherein at least one nucleotide is a labeled nucleotide as described herein.

[00022] Em outro aspecto da presente divulgação, é fornecida a preparação química de compostos da divulgação, incluindo corantes cumarina substituídos com amina secundária e porções tais como os nucleotídeos marcados com tais corantes.[00022] In another aspect of the present disclosure, there is provided the chemical preparation of compounds of the disclosure, including secondary amine-substituted coumarin dyes and moieties such as nucleotides labeled with such dyes.

[00023] Em aspectos adicionais, estão fornecidos métodos de sequenciamento, incluindo a incorporação de um nucleotídeo marcado como aqui descrito em um polinucleotídeo em um ensaio de sequenciamento, e a detecção do nucleotídeo marcado incorporado.[00023] In additional aspects, sequencing methods are provided, including incorporating a labeled nucleotide as described herein into a polynucleotide in a sequencing assay, and detecting the incorporated labeled nucleotide.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

[00024] As Figuras 1A, 1B e 1C apresentam gráficos de dispersão que demonstram a usabilidade de novos corantes aqui descritos no sequenciamento utilizando a química de sequenciamento por síntese (SBS) da Illumina. Os corantes são detectados como quatro áreas distintas, resolvidas espectralmente, conforme descrito no Exemplo 5.[00024] Figures 1A, 1B and 1C present scatter plots that demonstrate the usability of new dyes described here in sequencing using Illumina's sequencing by synthesis (SBS) chemistry. The dyes are detected as four distinct, spectrally resolved areas as described in Example 5.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[00025] A presente divulgação fornece compostos de cumarina substituídos com amina secundária, particularmente adequados para métodos de detecção de fluorescência e sequenciamento por síntese. As concretizações aqui descritas referem-se a corantes e derivados dos mesmos com estrutura da Fórmula (I).[00025] The present disclosure provides secondary amine-substituted coumarin compounds, particularly suitable for fluorescence detection and synthetic sequencing methods. The embodiments described herein refer to dyes and derivatives thereof with the structure of Formula (I).

[00026] De acordo com um primeiro aspecto, a presente divulgação fornece compostos de Fórmula (I) ou sais dos mesmos.[00026] According to a first aspect, the present disclosure provides compounds of Formula (I) or salts thereof.

[00027] Limitações particulares para os vários substituintes são mostradas abaixo. Cada grupo único pode ser combinado com qualquer outra limitação individual, a menos que seja especificado de outra forma.[00027] Particular limitations for the various substituents are shown below. Each single group may be combined with any other individual limitation unless otherwise specified.

[00028] Para melhorar as propriedades fluorescentes dos biomarcadores e, especialmente, os seus bioconjugados em soluções à base de água, o composto de Fórmula (I) é um composto em que: - R2 é -SO3H; e/ou - R4 é -SO3H; e/ou - R5 é -SO3H ou -SO2NH2.[00028] To improve the fluorescent properties of biomarkers and, especially, their bioconjugates in water-based solutions, the compound of Formula (I) is a compound in which: - R2 is -SO3H; and/or - R4 is -SO3H; and/or - R5 is -SO3H or -SO2NH2.

[00029] Em alguns aspectos, X é O ou S. Em alguns aspectos, X é O. Em alguns aspectos, X é S. Em alguns aspectos, X é NRn, em que Rn é H ou alquil C1-C6, e em alguns aspectos, Rn é H.[00029] In some aspects, X is O or S. In some aspects, X is O. In some aspects, X is S. In some aspects, In some respects, Rn is H.

[00030] Em alguns aspectos, R3 é H. Em alguns aspectos, R3 é metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, sec-butil, terc-butil, pentil, ou hexil. Em outros aspectos, R3 é etil. Em outros aspectos, R3 é alquil C2-C6 substituído. Em outros aspectos, R3 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H. Em outros aspectos, R3 é alquenil C2C6 opcionalmente substituído. Em outros aspectos, R3 é alquinil C2-C6 opcionalmente substituído. Em alguns aspectos, R3 está ligado a R2 ou R4 para formar um anel opcionalmente substituído.[00030] In some aspects, R3 is H. In some aspects, R3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, or hexyl. In other respects, R3 is ethyl. In other aspects, R3 is substituted C2-C6 alkyl. In other aspects, R3 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H. In other aspects, R3 is optionally substituted C2C6 alkenyl. In other aspects, R3 is optionally substituted C2-C6 alkynyl. In some aspects, R3 is linked to R2 or R4 to form an optionally substituted ring.

[00031] Nos sítios onde o acoplamento a um ligante ou nucleotídeos é feito através de R3, R3 deve ser de comprimento suficiente para permitir o acoplamento de um grupo funcional a ele ligado. Em alguns aspectos, R3 não é - CH2COOH, ou -CH2COO-.[00031] In sites where coupling to a ligand or nucleotides is done through R3, R3 must be of sufficient length to allow the coupling of a functional group attached to it. In some aspects, R3 is not -CH2COOH, or -CH2COO-.

[00032] Opcionalmente, R3 é -(CH2)nCOOH onde n é de 2 a 6. Em alguns aspectos, n é 2, 3, 4, 5 ou 6. Em outros aspectos, n é 2 ou 5. Em alguns aspectos, n é 2. Em alguns aspectos, n é 5.[00032] Optionally, R3 is -(CH2)nCOOH where n is 2 to 6. In some aspects, n is 2, 3, 4, 5 or 6. In other aspects, n is 2 or 5. In some aspects, n is 2. In some respects, n is 5.

[00033] Opcionalmente, R3 é -(CH2)nSO3H, em que n é de 2 a 6. Em alguns aspectos, n é 2, 3, 4, 5 ou 6. Em outros aspectos, n é 2 ou 5. Em alguns aspectos, n é 2. Em alguns aspectos, n é 5.[00033] Optionally, R3 is -(CH2)nSO3H, where n is 2 to 6. In some aspects, n is 2, 3, 4, 5 or 6. In other aspects, n is 2 or 5. In some In some respects, n is 2. In some respects, n is 5.

[00034] O anel benzeno da porção indol é opcionalmente substituído em qualquer um, dois, três, ou quatro posições por um substituinte definido como R5. Onde m é zero, o anel benzeno não é substituído. Quando m é maior do que 1, cada R5 pode ser igual ou diferente. Em alguns aspectos, m é 0. Em outros aspectos, m é 1. Em outros aspectos, m é 2. Em alguns aspectos, m é 1, 2, ou 3, e cada R5 é, independentemente, halo, -CN, -CO2H, amino, - OH, -SO3H, ou -SO2NH2. Em alguns aspectos, R5 é -(CH2)xCOOH, onde x é de 2 a 6. Em alguns aspectos, x é 2, 3, 4, 5 ou 6. Em outros aspectos, x é 2 ou 5. Em alguns aspectos, x é 2. Em alguns aspectos, x é 5.[00034] The benzene ring of the indole moiety is optionally substituted at any one, two, three, or four positions by a substituent defined as R5. Where m is zero, the benzene ring is not substituted. When m is greater than 1, each R5 can be the same or different. In some respects, m is 0. In other respects, m is 1. In other respects, m is 2. In some respects, m is 1, 2, or 3, and each R5 is independently halo, -CN, - CO2H, amino, -OH, -SO3H, or -SO2NH2. In some aspects, R5 is -(CH2)xCOOH, where x is 2 to 6. In some aspects, x is 2, 3, 4, 5, or 6. In other aspects, x is 2 or 5. In some aspects, x is 2. In some respects, x is 5.

[00035] Em alguns aspectos, R5 é halo, -CN, -CO2H, - SO3H, -SO2NH2, ou alquil C1-C6 opcionalmente substituído. Em alguns aspectos, R5 é halo, -CO2H, -SO3H, ou -SO2NH2. Em alguns aspectos, R5 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H, - SO3H, ou -SO2NH2. Em alguns aspectos, cada R5 é, independentemente, alquil C1-C6 opcionalmente substituído, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, ou -SO2NH2.[00035] In some aspects, R5 is halo, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, or optionally substituted C1-C6 alkyl. In some aspects, R5 is halo, -CO2H, -SO3H, or -SO2NH2. In some aspects, R5 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H, -SO3H, or -SO2NH2. In some aspects, each R5 is independently optionally substituted C1-C6 alkyl, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, or -SO2NH2.

[00036] Em alguns aspectos, R1 é H. Em alguns aspectos, R1 é halo. Em alguns aspectos, R1 é Cl. Em alguns aspectos, R1 é alquil C1-C6. Em alguns aspectos, R1 é metil.[00036] In some aspects, R1 is H. In some aspects, R1 is halo. In some respects, R1 is Cl. In some aspects, R1 is C1-C6 alkyl. In some aspects, R1 is methyl.

[00037] Em alguns aspectos, R é H. Em alguns aspectos, R é halo. Em alguns aspectos, R é Cl. Em alguns aspectos, R é alquil C1-C6. Em alguns aspectos, R é metil. Em alguns aspectos, R não é -CN. Em alguns aspectos, R é H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, - SO2NH2, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, alcoxi opcionalmente substituído, aminoalquil opcionalmente substituído, carbociclil opcionalmente substituído, heterociclil opcionalmente substituído, aril opcionalmente substituído ou heteroaril opcionalmente substituído.[00037] In some aspects, R is H. In some aspects, R is halo. In some respects, R is Cl. In some aspects, R is C1-C6 alkyl. In some aspects, R is methyl. In some respects, R is not -CN. In some aspects, R is H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, optionally substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, optionally substituted alkoxy , optionally substituted aminoalkyl, optionally substituted carbocyclyl, optionally substituted heterocyclyl, optionally substituted aryl or optionally substituted heteroaryl.

[00038] Em alguns aspectos, R2 é H. Em alguns aspectos, R2 é alquil opcionalmente substituído. Em alguns aspectos, R2 é alquil C1-C4 opcionalmente substituído com - CO2H ou -SO3H. Em alguns aspectos, R2 é -SO3H. Em alguns aspectos, R2 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, tal como uma pirrolidina ou piperidina, opcionalmente substituído com um ou mais grupos alquil. Em alguns aspectos, R2 é H, alquil opcionalmente substituído, alquil C1-C4 opcionalmente substituído com -CO2H ou -SO3H, ou -SO3H. Em alguns aspectos, R2 é H ou -SO3H.[00038] In some aspects, R2 is H. In some aspects, R2 is optionally substituted alkyl. In some aspects, R2 is C1-C4 alkyl optionally substituted with -CO2H or -SO3H. In some aspects, R2 is -SO3H. In some aspects, R2 is linked to R3 to form an optionally substituted heterocyclic ring, such as a pyrrolidine or piperidine, optionally substituted with one or more alkyl groups. In some aspects, R2 is H, optionally substituted alkyl, C1-C4 alkyl optionally substituted with -CO2H or -SO3H, or -SO3H. In some aspects, R2 is H or -SO3H.

[00039] Em alguns aspectos, R4 é H. Em alguns aspectos, R4 é alquil opcionalmente substituído. Em alguns aspectos, R4 é alquil C1-C4 opcionalmente substituído com - CO2H ou -SO3H. Em alguns aspectos, R4 é -SO3H. Em alguns aspectos, R4 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, tal como uma pirrolidina ou piperidina, opcionalmente substituído com um ou mais grupos alquil.[00039] In some aspects, R4 is H. In some aspects, R4 is optionally substituted alkyl. In some aspects, R4 is C1-C4 alkyl optionally substituted with -CO2H or -SO3H. In some aspects, R4 is -SO3H. In some aspects, R4 is linked to R3 to form an optionally substituted heterocyclic ring, such as a pyrrolidine or piperidine, optionally substituted with one or more alkyl groups.

[00040] Exemplos particulares de um composto de Fórmula (I) incluem aqueles em que X é O ou S; R é H; R1 é H; R3 é -(CH2)nCOOH onde n é de 2 a 6; R5 é H, -SO3H, ou - SO2NH2; R2 é H ou -SO3H; e R4 é H ou -SO3H.[00040] Particular examples of a compound of Formula (I) include those in which X is O or S; R is H; R1 is H; R3 is -(CH2)nCOOH where n is 2 to 6; R5 is H, -SO3H, or -SO2NH2; R2 is H or -SO3H; and R4 is H or -SO3H.

[00041] Exemplos particulares de um composto de Fórmula (I) incluem aqueles em que X é O ou S; R é H; R1 é H; R3 é -(CH2)2COOH; R5 é H, -SO3H, ou -SO2NH2; R2 é H ou - SO3H; e R4 é H ou -SO3H.[00041] Particular examples of a compound of Formula (I) include those in which X is O or S; R is H; R1 is H; R3 is -(CH2)2COOH; R5 is H, -SO3H, or -SO2NH2; R2 is H or - SO3H; and R4 is H or -SO3H.

[00042] Exemplos particulares de um composto de Fórmula (I) incluem aqueles em que X é O ou S; R é H; R1 é H; R3 é -(CH2)5-COOH; R5 é H, -SO3H, ou -SO2NH2; R2 é H ou - SO3H; e R4 é H ou -SO3H.[00042] Particular examples of a compound of Formula (I) include those in which X is O or S; R is H; R1 is H; R3 is -(CH2)5-COOH; R5 is H, -SO3H, or -SO2NH2; R2 is H or - SO3H; and R4 is H or -SO3H.

[00043] Em alguns aspectos da Fórmula (II), X’ é O. Em alguns aspectos, X’ é S. Em alguns aspectos, X’ é NRp, onde Rp é H ou alquil C1-C6. Em alguns aspectos, X’ é NRp, onde Rp é H.[00043] In some aspects of Formula (II), X' is O. In some aspects, X' is S. In some aspects, X' is NRp, where Rp is H or C1-C6 alkyl. In some respects, X' is NRp, where Rp is H.

[00044] Em alguns aspectos, R6 é H. Em alguns aspectos, R6 é alquil C1-C4.[00044] In some aspects, R6 is H. In some aspects, R6 is C1-C4 alkyl.

[00045] Em alguns aspectos, R7 é H. Em alguns aspectos, R7 é alquil C1-C4 opcionalmente substituído, - CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1- C4)2. Em alguns aspectos, R7 é alquil C1-C4 opcionalmente substituído com -CO2H.[00045] In some aspects, R7 is H. In some aspects, R7 is optionally substituted C1-C4 alkyl, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl) two. In some aspects, R7 is C1-C4 alkyl optionally substituted with -CO2H.

[00046] Em alguns aspectos, R8 é H. Em alguns aspectos, R8 é -CO2H, SO3H, ou -SO2NH2. Em alguns aspectos, R8 é -SO3H.[00046] In some aspects, R8 is H. In some aspects, R8 is -CO2H, SO3H, or -SO2NH2. In some aspects, R8 is -SO3H.

[00047] Em alguns aspectos, R10 é H. Em alguns aspectos, R10 é -CO2H, SO3H, ou -SO2NH2. Em alguns aspectos, R10 é -SO3H. Em alguns aspectos, R8 é H e R10 é -SO3H. Em alguns aspectos, R8 é -SO3H e R10 é H.[00047] In some aspects, R10 is H. In some aspects, R10 is -CO2H, SO3H, or -SO2NH2. In some aspects, R10 is -SO3H. In some aspects, R8 is H and R10 is -SO3H. In some aspects, R8 is -SO3H and R10 is H.

[00048] Em alguns aspectos, R8 ou R10 é H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), - SO2N(alquil C1-C4)2, alquil C1-C6 opcionalmente substituído, alquenil C1-C6 opcionalmente substituído, alquinil C2-C6 opcionalmente substituído ou alcoxi C1-C6 opcionalmente substituído e o outro, R8 ou R10, é tomado com R9 de modo a formar um anel heterocíclico de 4 a 7 membros opcionalmente substituído.[00048] In some aspects, R8 or R10 is H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2 , optionally substituted C1-C6 alkyl, optionally substituted C1-C6 alkenyl, optionally substituted C2-C6 alkynyl or optionally substituted C1-C6 alkoxy and the other, R8 or R10, is taken with R9 so as to form a heterocyclic ring from 4 to 7 members optionally replaced.

[00049] Em alguns aspectos, R9 é alquil C2-C6. Em alguns aspectos R9 é alquil C1-C6 substituído com -CO2H, - CO2-alquil C1-C4, -CONH2, -CONH(alquil C1-C4), -CON(alquil C1-C4)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), ou - SO2N(alquil C1-C4)2. Em alguns aspectos, R9 é alquil C1-C6 substituído com -CO2H. Em alguns aspectos, R9 é -(CH2)y- CO2H, onde y é 2, 3, 4, ou 5.[00049] In some aspects, R9 is C2-C6 alkyl. In some aspects R9 is C1-C6 alkyl substituted with -CO2H, -CO2-C1-C4 alkyl, -CONH2, -CONH(C1-C4 alkyl), -CON(C1-C4 alkyl)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), or - SO2N(C1-C4 alkyl)2. In some aspects, R9 is C1-C6 alkyl substituted with -CO2H. In some aspects, R9 is -(CH2)y- CO2H, where y is 2, 3, 4, or 5.

[00050] Em alguns aspectos, cada R11 é, independentemente, halo, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, - SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, ou alquil opcionalmente substituído. Em outros aspectos, cada R11 é, independentemente, halo, -CO2H, -SO3H, ou -SO2NH2.[00050] In some aspects, each R11 is independently halo, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, or optionally substituted alkyl. In other aspects, each R11 is independently halo, -CO2H, -SO3H, or -SO2NH2.

[00051] Em alguns aspectos, q é 0. Em outros aspectos, q é 1. Em outros aspectos, q é 2.[00051] In some aspects, q is 0. In other aspects, q is 1. In other aspects, q is 2.

[00052] Exemplos específicos de corantes de cumarina substituídos com amina secundária incluem: e sais dos mesmos.[00052] Specific examples of secondary amine substituted coumarin dyes include: and get out of them.

[00053] Um composto particularmente útil é um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado com um corante tal como aqui descrito. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode possuir o marcador ligado ao átomo de nitrogênio da molécula de cumarina através de um grupo alquil-carboxi para formar uma alquil-amida. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode possuir o marcador ligado à posição C5 de uma base de pirimidina ou à posição C7 de uma base de 7-deazapurina através de uma porção ligante.[00053] A particularly useful compound is a nucleotide or oligonucleotide labeled with a dye as described herein. The labeled nucleotide or oligonucleotide may have the label attached to the nitrogen atom of the coumarin molecule through an alkyl carboxy group to form an alkyl amide. The labeled nucleotide or oligonucleotide may have the label linked to the C5 position of a pyrimidine base or the C7 position of a 7-deazapurine base through a linker moiety.

[00054] O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado também pode possuir um grupo bloqueador covalentemente ligado ao açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo. O grupo bloqueador pode ser ligado em qualquer posição no açúcar ribose ou desoxirribose. Em concretizações particulares, o grupo bloqueador está na posição 3'OH do açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.[00054] The labeled nucleotide or oligonucleotide may also have a blocking group covalently linked to the ribose or deoxyribose sugar of the nucleotide. The blocking group can be attached at any position on the ribose or deoxyribose sugar. In particular embodiments, the blocking group is at the 3'OH position of the ribose or deoxyribose sugar of the nucleotide.

[00055] São aqui fornecidos kits incluindo dois ou mais nucleotídeos em que pelo menos um nucleotídeo é um nucleotídeo marcado com um composto da presente divulgação. O kit pode incluir dois ou mais nucleotídeos marcados. Os nucleotídeos podem ser marcados com dois ou mais marcadores fluorescentes. Dois ou mais marcadores podem ser excitados usando uma única fonte de excitação, que pode ser um laser. Por exemplo, as bandas de excitação para os dois ou mais marcadores podem estar pelo menos parcialmente sobrepostas, de modo que a excitação na região de sobreposição do espectro faça com que ambos os marcadores emitam fluorescência. Em concretizações particulares, a emissão dos dois ou mais marcadores ocorrerá em diferentes regiões de espectro, de modo que a presença de pelo menos um dos marcadores possa ser determinada pela distinção óptica da emissão.[00055] Kits including two or more nucleotides are provided herein in which at least one nucleotide is a nucleotide labeled with a compound of the present disclosure. The kit may include two or more labeled nucleotides. Nucleotides can be labeled with two or more fluorescent labels. Two or more markers can be excited using a single excitation source, which can be a laser. For example, the excitation bands for the two or more labels may be at least partially overlapping, such that excitation in the overlapping region of the spectrum causes both labels to emit fluorescence. In particular embodiments, the emission of the two or more labels will occur in different spectral regions, so that the presence of at least one of the labels can be determined by the optical distinction of the emission.

[00056] O kit pode conter quatro nucleotídeos marcados, em que o primeiro nucleotídeo é marcado com um composto tal como aqui divulgado. Em tal kit, cada um dos quatro nucleotídeos pode ser marcado com um composto que é igual ou diferente em relação aos marcadores dos outros três nucleotídeos. Assim, um ou mais dos compostos podem ter uma emissão máxima e/ou absorbância máxima distinta, de modo que o(s) composto(s) é(são) distinguível(s) em relação a outros compostos. Por exemplo, cada composto pode ter uma emissão máxima e/ou absorbância máxima distinta, de modo que cada um dos compostos seja distinguível em relação aos outros três compostos. Será entendido que partes do espectro de absorbância e/ou espectro de emissão diferentes dos máximos podem diferir e essas diferenças podem ser exploradas para distinguir os compostos. O kit pode ser tal que dois ou mais dos compostos tenham uma absorbância máxima distinta. Os compostos da invenção absorvem luz tipicamente na região abaixo de 500 nm.[00056] The kit may contain four labeled nucleotides, wherein the first nucleotide is labeled with a compound as disclosed herein. In such a kit, each of the four nucleotides can be labeled with a compound that is the same or different from the labels on the other three nucleotides. Thus, one or more of the compounds may have a distinct maximum emission and/or maximum absorbance, so that the compound(s) is/are distinguishable from other compounds. For example, each compound may have a different maximum emission and/or maximum absorbance, so that each of the compounds is distinguishable from the other three compounds. It will be understood that parts of the absorbance spectrum and/or emission spectrum other than the maxima may differ and these differences can be exploited to distinguish compounds. The kit can be such that two or more of the compounds have a different maximum absorbance. The compounds of the invention typically absorb light in the region below 500 nm.

[00057] Os compostos, nucleotídeos, ou kits que são aqui definidos podem ser utilizados para detectar, mensurar, ou identificar um sistema biológico (incluindo, por exemplo, processos ou componentes dos mesmos). Exemplos de técnicas que pode empregar os compostos, nucleotídeos ou kits incluem sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridização, análise genética, análise de RNA, ensaio celular (por exemplo, análise de função celular ou análise de ligação celular), ou ensaio de proteína (por exemplo, ensaio de ligação de proteínas ou ensaio de atividade proteica). O uso pode estar em um instrumento automatizado para executar uma técnica específica, tal como um instrumento de sequenciamento automatizado. O instrumento de sequenciamento pode conter dois lasers operando em diferentes comprimentos de onda.[00057] The compounds, nucleotides, or kits that are defined herein can be used to detect, measure, or identify a biological system (including, for example, processes or components thereof). Examples of techniques that may employ the compounds, nucleotides, or kits include sequencing, expression analysis, hybridization analysis, genetic analysis, RNA analysis, cellular assay (e.g., cellular function analysis or cellular binding analysis), or protein (e.g. protein binding assay or protein activity assay). The use may be in an automated instrument to perform a specific technique, such as an automated sequencing instrument. The sequencing instrument can contain two lasers operating at different wavelengths.

[00058] O presente relatório descritivo divulga métodos de sintetizar compostos. Os corantes de acordo com a presente divulgação podem ser sintetizados a partir de uma variedade de diferentes materiais de partida adequados. Os métodos para preparação de corantes de cumarina são bem conhecidos no estado da técnica.[00058] The present specification discloses methods of synthesizing compounds. Dyes according to the present disclosure can be synthesized from a variety of different suitable starting materials. Methods for preparing coumarin dyes are well known in the art.

DEFINIÇÕESDEFINITIONS

[00059] Os títulos das seções aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando o escopo descrito.[00059] The section titles used here are for organizational purposes only and should not be interpreted as limiting the scope described.

[00060] Deverá ser observado que, conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais, a menos que expressamente e inequivocamente limitado a um referente. Será evidente para os técnicos versados no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas em várias concretizações descritas neste relatório descritivo sem se afastar do espírito ou escopo dos presentes ensinamentos. Assim, pretende-se que as várias concretizações descritas aqui abranjam outras modificações e variações dentro do escopo das reivindicações anexas e suas equivalentes.[00060] It should be noted that, as used in this specification and the appended claims, the singular forms "a", "an", "the" and "a" include plural referents, unless expressly and unambiguously limited to one referent. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in various embodiments described in this specification without departing from the spirit or scope of the present teachings. Thus, the various embodiments described herein are intended to encompass other modifications and variations within the scope of the appended claims and their equivalents.

[00061] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico versado no assunto. O uso do termo "incluindo", bem como de outras formas, tais como "incluir", "inclui" e "incluído", não é limitativo. O uso do termo “ter/possuir”, assim como outras formas, tais como “ter”, “tem” e “teve” não é limitativo. Conforme usado nesta especificação, seja em uma frase de transição ou no corpo da reivindicação, os termos "compreender" e "compreendendo" devem ser interpretados como tendo um significado aberto. Ou seja, os termos acima devem ser interpretados como sinônimos com as frases "tendo pelo menos" ou "incluindo pelo menos". Por exemplo, quando usado no contexto de um processo, o termo "compreendendo" significa que o processo inclui pelo menos as etapas recitadas, mas podem incluir etapas adicionais. Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo "compreendendo" significa que o composto, composição ou dispositivo inclui pelo menos os recursos ou componentes recitados, mas também pode incluir recursos ou componentes adicionais.[00061] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as is commonly understood by a person skilled in the art. The use of the term "including", as well as other forms, such as "include", "includes" and "included", is not limiting. The use of the term “have/possess”, as well as other forms, such as “have”, “has” and “had” is not limiting. As used in this specification, whether in a transitional phrase or in the body of the claim, the terms "comprise" and "comprising" are to be interpreted as having an open meaning. That is, the terms above should be interpreted as synonymous with the phrases "having at least" or "including at least". For example, when used in the context of a process, the term "comprising" means that the process includes at least the steps recited, but may include additional steps. When used in the context of a compound, composition, or device, the term "comprising" means that the compound, composition, or device includes at least the recited features or components, but may also include additional features or components.

[00062] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, o termo "covalentemente ligado" ou "covalentemente unido" refere-se à formação de uma ligação química que é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Por exemplo, um revestimento polimérico covalentemente ligado refere-se a um revestimento polimérico que forma ligações químicas com uma superfície funcionalizada de um substrato, em comparação com a fixação à superfície por outros meios, por exemplo, adesão ou interação eletrostática. Será apreciado que os polímeros que estão covalentemente ligados a uma superfície também podem ser unidos por meios adicionais à ligação covalente.[00062] As used in this specification, the term "covalently bonded" or "covalently joined" refers to the formation of a chemical bond that is characterized by the sharing of electron pairs between atoms. For example, a covalently bonded polymeric coating refers to a polymeric coating that forms chemical bonds with a functionalized surface of a substrate, as compared to attachment to the surface by other means, for example, adhesion or electrostatic interaction. It will be appreciated that polymers that are covalently bonded to a surface may also be joined by means in addition to the covalent bond.

[00063] O termo "halogênio" ou "halo", conforme usado aqui, significa qualquer um dos átomos radioestáveis da coluna 7 da Tabela Periódica, por exemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo, com flúor e cloro sendo preferenciais.[00063] The term "halogen" or "halo", as used herein, means any of the radiostable atoms in column 7 of the Periodic Table, for example, fluorine, chlorine, bromine or iodine, with fluorine and chlorine being preferred.

[00064] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "alquil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que é totalmente saturada (ou seja, não contém ligações duplas ou triplas). O grupo alquil pode ter de 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aparece aqui, um intervalo numérico como "de 1 a 20" refere-se a cada número inteiro no intervalo especificado; por exemplo, "de 1 a 20 átomos de carbono" significa que o grupo alquil pode ser constituído de 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "alquil", onde nenhum intervalo numérico é designado. O grupo alquil também pode ser um alquil de tamanho médio com 1 a 9 átomos de carbono. O grupo alquil também pode ser um alquil inferior com 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquil pode ser designado como "alquil C1-C4" ou designações semelhantes. Apenas a título exemplificativo, “alquil C1-C6” indica que existem de 1 a 6 átomos de carbono na cadeia alquil, ou seja, a cadeia alquil é selecionada a partir do grupo que consiste em metil, etil, propil, isopropil, n-butil, iso-butil, sec- butil e t-butil. Grupos alquil típicos incluem, mas não estão limitados a, metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, butil terciário, pentil, hexil e semelhantes.[00064] As used in this specification, "alkyl" refers to a linear or branched hydrocarbon chain that is fully saturated (that is, does not contain double or triple bonds). The alkyl group may have from 1 to 20 carbon atoms (wherever it appears here, a numerical range such as "from 1 to 20" refers to each whole number in the specified range; for example, "from 1 to 20 carbon atoms " means that the alkyl group may consist of 1 carbon atom, 2 carbon atoms, 3 carbon atoms, etc., up to and including 20 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "alkyl", where no numerical range is designated. The alkyl group can also be a medium-sized alkyl having 1 to 9 carbon atoms. The alkyl group can also be a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. "C1-C4 alkyl" or similar designations. By way of example only, “C1-C6 alkyl” indicates that there are from 1 to 6 carbon atoms in the alkyl chain, that is, the alkyl chain is selected from the group consisting of methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl and t-butyl. Typical alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tertiary butyl, pentyl, hexyl and the like.

[00065] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "alcoxi" refere-se à fórmula -OR, em que R é um alquil como definido acima, tal como "alcoxi C1-C9", incluindo mas não limitado a metoxi, etoxi, n-propoxi, 1- metiletoxi (isopropoxi), n-butoxi, iso-butoxi, sec-butoxi e terc-butoxi, e semelhantes.[00065] As used in the present specification, "alkoxy" refers to the formula -OR, wherein R is an alkyl as defined above, such as "C1-C9 alkoxy", including but not limited to methoxy, ethoxy, n -propoxy, 1-methylethoxy (isopropoxy), n-butoxy, iso-butoxy, sec-butoxy and tert-butoxy, and the like.

[00066] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "alquenil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas. O grupo alquenil pode ter de 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "alquenil", onde nenhum intervalo numérico é designado. O grupo alquenil também pode ser um alquenil de tamanho médio com 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquenil também pode ser um alquenil inferior com 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquenil pode ser designado como "alquenil C2-C6" ou designações semelhantes. Apenas a título exemplificativo, "alquenil C2-C6" indica que existem de dois a seis átomos de carbono na cadeia alquenil, ou seja, a cadeia alquenil é selecionada a partir do grupo que consiste em etenil, propen-1-il, propen-2-il, propen-3-il, buten-1-il, buten-2-il, buten-3-il, buten-4-il, 1-metil- propen-1-il, 2-metil-propen-1-il, 1-etil-eten-1-il, 2- metil-propen-3-il, buta-1,3-dienil, buta-1,2,-dienil e buta-1,2-dien-4-il. Grupos alquenil típicos incluem, mas não estão limitados a, etenil, propenil, butenil, pentenil e hexenil, e semelhantes.[00066] As used in this specification, "alkenyl" refers to a linear or branched hydrocarbon chain containing one or more double bonds. The alkenyl group may have from 2 to 20 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "alkenyl", where no numerical range is designated. The alkenyl group can also be a medium-sized alkenyl with 2 to 9 carbon atoms. The alkenyl group can also be a lower alkenyl having 2 to 6 carbon atoms. The alkenyl group may be designated as "C2-C6 alkenyl" or similar designations. By way of example only, "C2-C6 alkenyl" indicates that there are two to six carbon atoms in the alkenyl chain, that is, the alkenyl chain is selected from the group consisting of ethenyl, propen-1-yl, propen- 2-yl, propen-3-yl, buten-1-yl, buten-2-yl, buten-3-yl, buten-4-yl, 1-methyl-propen-1-yl, 2-methyl-propen- 1-yl, 1-ethyl-ethen-1-yl, 2-methyl-propen-3-yl, buta-1,3-dienyl, buta-1,2,-dienyl and buta-1,2-dien-4 -il. Typical alkenyl groups include, but are not limited to, ethenyl, propenyl, butenyl, pentenyl and hexenyl, and the like.

[00067] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "alquinil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas. O grupo alquinil pode ter de 2 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "alquinil", em que nenhum intervalo numérico é designado. O grupo alquinil também pode ser um alquinil de tamanho médio com 2 a 9 átomos de carbono. O grupo alquinil também pode ser um alquinil inferior com 2 a 6 átomos de carbono. O grupo alquinil pode ser designado como "alquinil C2-C6" ou designações semelhantes. Apenas a título exemplificativo, "alquinil C2-C6" indica que existem de dois a seis átomos de carbono na cadeia alquinil, ou seja, a cadeia alquinil é selecionada do grupo que consiste em etinil, propin-1-il, propin-2-il, butin-1-il, butin-3- il, butin-4-il e 2-butinil. Grupos alquinil típicos incluem, mas não estão limitados a etinil, propinil, butinil, pentinil e hexinil, e similares.[00067] As used in this specification, "alkynyl" refers to a linear or branched hydrocarbon chain containing one or more triple bonds. The alkynyl group may have from 2 to 20 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "alkynyl", in which no numerical range is designated. The alkynyl group can also be a medium-sized alkynyl with 2 to 9 carbon atoms. The alkynyl group can also be a lower alkynyl having 2 to 6 carbon atoms. The alkynyl group may be designated as "C2-C6 alkynyl" or similar designations. By way of example only, "C2-C6 alkynyl" indicates that there are two to six carbon atoms in the alkynyl chain, that is, the alkynyl chain is selected from the group consisting of ethynyl, propyn-1-yl, propyn-2- yl, butyn-1-yl, butyn-3-yl, butyn-4-yl and 2-butynyl. Typical alkynyl groups include, but are not limited to, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl and hexinyl, and the like.

[00068] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "heteroalquil" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada contendo um ou mais heteroátomos, ou seja, um elemento que não seja carbono, incluindo, mas não limitado a nitrogênio, oxigênio e enxofre na cadeia principal. O grupo heteroalquil pode ter de 1 a 20 carbonos átomo, embora a presente definição abranja também a ocorrência do termo “heteroalquil”, onde nenhum intervalo numérico é designado. O grupo heteroalquil também pode ser um heteroalquil de tamanho médio com 1 a 9 átomos de carbono. O grupo heteroalquil também pode ser um heteroalquil inferior com 1 a 6 átomos de carbono. O grupo heteroalquil pode ser designado como "heteroalquil C1-C6" ou designações semelhantes. O grupo heteroalquil pode conter um ou mais heteroátomos. Apenas a título exemplificativo, “heteroalquil C4-C6” indica que existem de quatro a seis átomos de carbono na cadeia heteroalquil e, adicionalmente, um ou mais heteroátomos na cadeia principal.[00068] As used in this specification, "heteroalkyl" refers to a linear or branched hydrocarbon chain containing one or more heteroatoms, that is, an element other than carbon, including, but not limited to nitrogen, oxygen and sulfur in the main chain. The heteroalkyl group may have from 1 to 20 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term “heteroalkyl”, where no numerical range is designated. The heteroalkyl group can also be a medium-sized heteroalkyl having 1 to 9 carbon atoms. The heteroalkyl group may also be a lower heteroalkyl having 1 to 6 carbon atoms. The heteroalkyl group may be designated as "C1-C6 heteroalkyl" or similar designations. The heteroalkyl group may contain one or more heteroatoms. By way of example only, “C4-C6 heteroalkyl” indicates that there are four to six carbon atoms in the heteroalkyl chain and, in addition, one or more heteroatoms in the main chain.

[00069] O termo "aromático" refere-se a um anel ou sistema de anéis que possui um sistema de elétrons pi conjugado e inclui grupos aromáticos carbocíclicos (por exemplo, fenil) e grupos aromáticos heterocíclicos (por exemplo, piridina). O termo inclui grupos monocíclicos ou policíclicos de anel fundido (isto é, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos), desde que todo o sistema de anéis seja aromático.[00069] The term "aromatic" refers to a ring or ring system that has a conjugated pi electron system and includes carbocyclic aromatic groups (e.g., phenyl) and heterocyclic aromatic groups (e.g., pyridine). The term includes monocyclic or polycyclic fused ring groups (i.e., rings that share adjacent pairs of atoms), as long as the entire ring system is aromatic.

[00070] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "aril" refere-se a um anel ou sistema de anéis aromáticos (isto é, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos de carbono adjacentes) contendo apenas carbono na cadeia principal do anel. Quando o aril é um sistema de anéis, todos os anéis no sistema são aromáticos. O grupo aril pode ter de 6 a 18 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "aril", em que nenhum intervalo numérico é designado. Em algumas modalidades, o grupo aril tem de 6 a 10 átomos de carbono. O grupo aril pode ser designado como "aril C1-C6", "aril C6-10" ou designações semelhantes. Exemplos de grupos aril incluem, mas não estão limitados a fenil, naftil, azulenil e antracenil.[00070] As used in the present specification, "aryl" refers to an aromatic ring or ring system (that is, two or more fused rings that share two adjacent carbon atoms) containing only carbon in the main chain of the ring. When the aryl is a ring system, all rings in the system are aromatic. The aryl group may have from 6 to 18 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "aryl", in which no numerical range is designated. In some embodiments, the aryl group has 6 to 10 carbon atoms. The aryl group may be designated as "C1-C6 aryl", "C6-10 aryl" or similar designations. Examples of aryl groups include, but are not limited to, phenyl, naphthyl, azulenyl and anthracenyl.

[00071] Um "aralquil" ou "arilalquil" é um grupo aril conectado, como um substituinte, através de um grupo alquileno, tal como "aralquil C7-C14" e similares, incluindo, mas sem limitação, benzil, 2-feniletil, 3- fenilpropil e naftilalquil. Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (ou seja, um grupo alquileno C1-C6).[00071] An "aralkyl" or "arylalkyl" is an aryl group connected, as a substituent, through an alkylene group, such as "C7-C14 aralkyl" and the like, including, but not limited to, benzyl, 2-phenylethyl, 3- phenylpropyl and naphthylalkyl. In some cases, the alkylene group is a lower alkylene group (i.e., a C1-C6 alkylene group).

[00072] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "heteroaril" refere-se a um anel ou sistema de anéis aromáticos (ou seja, dois ou mais anéis fundidos que compartilham dois átomos adjacentes) que contêm um ou mais heteroátomos, ou seja, um elemento diferente de carbono, incluindo mas não limitado a nitrogênio, oxigênio e enxofre na cadeia principal do anel. Quando o heteroaril é um sistema de anéis, todos os anéis no sistema são aromáticos. O grupo heteroaril pode ter de 5 a 18 membros no anel (ou seja, o número de átomos que compõem a cadeia principal do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "heteroaril", onde nenhum intervalo numérico é designado. Em algumas modalidades, o grupo heteroaril tem de 5 a 10 membros no anel ou de 5 a 7 membros no anel. O grupo heteroaril pode ser designado como "heteroaril de 5 a 7 membros", "heteroaril de 5 a 10 membros" ou designações semelhantes. Exemplos de anéis heteroaril incluem, mas não estão limitados a furil, tienil, ftalazinil, pirrolil, oxazolil, tiazolil, imidazolil, pirazolil, isoxazolil, isotiazolil, triazolil, tiadiazolil, piridinil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, triazinil, quinolinil, isoquinlinil, benzimidazolil, benzoxazolil, benzotiazolil, indolil, isoindolil e benzotienil.[00072] As used in the present specification, "heteroaryl" refers to an aromatic ring or ring system (i.e., two or more fused rings that share two adjacent atoms) that contain one or more heteroatoms, i.e., a element other than carbon, including but not limited to nitrogen, oxygen, and sulfur in the main ring chain. When the heteroaryl is a ring system, all rings in the system are aromatic. The heteroaryl group may have from 5 to 18 ring members (i.e., the number of atoms composing the main chain of the ring, including carbon atoms and heteroatoms), although the present definition also covers the occurrence of the term "heteroaryl", where no numeric range is designated. In some embodiments, the heteroaryl group has 5 to 10 ring members or 5 to 7 ring members. The heteroaryl group may be designated as "5- to 7-membered heteroaryl", "5- to 10-membered heteroaryl" or similar designations. Examples of heteroaryl rings include, but are not limited to, furyl, thienyl, phthalazinyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, triazolyl, thiadiazolyl, pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl, quinolinyl, isoquinlinyl, benzimidazolyl , benzoxazolyl, benzothiazolyl, indolyl, isoindolyl and benzothienyl.

[00073] Um "heteroaralquil" ou "heteroarilalquil" é um grupo heteroaril conectado, como um substituinte, através de um grupo alquileno. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, 2-tienilmetil, 3-tienilmetil, furilmetil, tieniletil, pirrolilalquil, piridilalquil, isoxazolilalquil e imidazolilalquil. Em alguns casos, o grupo alquileno é um grupo alquileno inferior (ou seja, um grupo alquileno C1-C6).[00073] A "heteroaralkyl" or "heteroarylalkyl" is a heteroaryl group connected, as a substituent, through an alkylene group. Examples include, but are not limited to, 2-thienylmethyl, 3-thienylmethyl, furylmethyl, thienylethyl, pyrrolylalkyl, pyridylalkyl, isoxazolylalkyl and imidazolylalkyl. In some cases, the alkylene group is a lower alkylene group (i.e., a C1-C6 alkylene group).

[00074] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "carbociclil" significa um anel ou sistema de anéis cíclicos não aromáticos contendo apenas átomos de carbono na cadeia principal do sistema de anéis. Quando o carbociclil é um sistema de anéis, dois ou mais anéis podem ser unidos de maneira fundida, em ponte ou conectada no modelo espiro. O carbociclil pode ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel em um sistema de anéis não seja aromático. Assim, o carbociclil inclui cicloalquil, cicloalquenil e cicloalquinil. O grupo carbociclil pode ter de 3 a 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "carbociclil", onde nenhuma faixa numérica é designada. O grupo carbociclil também pode ser um carbociclil de tamanho médio com 3 a 10 átomos de carbono. O grupo carbociclil também pode ser um carbociclil com 3 a 6 átomos de carbono. O grupo carbociclil pode ser designado como "carbociclil C3-C6" ou designações semelhantes. Exemplos de anéis de carbociclil incluem, entre outros, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclo-hexil, ciclo-hexenil, 2,3-di-hidro- indeno, diciclo[2.2.2]octanil, adamantil e espiro[4.4]nonanil.[00074] As used in this specification, "carbocyclyl" means a non-aromatic cyclic ring or ring system containing only carbon atoms in the main chain of the ring system. When carbocyclyl is a ring system, two or more rings can be joined in a fused, bridged or spiro-connected manner. Carbocyclyl may have any degree of saturation as long as at least one ring in a ring system is non-aromatic. Thus, carbocyclyl includes cycloalkyl, cycloalkenyl and cycloalkynyl. The carbocyclyl group may have from 3 to 20 carbon atoms, although the present definition also covers the occurrence of the term "carbocyclyl", where no numerical range is designated. The carbocyclyl group can also be a medium-sized carbocyclyl with 3 to 10 carbon atoms. The carbocyclyl group can also be a carbocyclyl having 3 to 6 carbon atoms. The carbocyclyl group may be designated as "C3-C6 carbocyclyl" or similar designations. Examples of carbocyclyl rings include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, 2,3-dihydroindene, dicyclo[2.2.2]octanyl, adamantyl, and spiro[4.4]nonanyl.

[00075] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "cicloalquil" significa um anel ou sistema de anéis de carbociclil totalmente saturado. Exemplos incluem ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil e ciclo-hexil.[00075] As used in the present specification, "cycloalkyl" means a fully saturated carbocyclyl ring or ring system. Examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl.

[00076] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, "heterociclil" significa um anel ou sistema de anéis cíclicos não aromáticos contendo pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel. O heterociclil pode ser unido maneira fundida, em ponte ou conectada no modelo espiro. O heterociclil pode ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel no sistema de anéis não seja aromático. O(s) heteroátomo(s) pode(m) estar presente(s) em um anel não aromático ou aromático no sistema de anéis. O grupo heterociclil pode ter de 3 a 20 membros no anel (ou seja, o número de átomos que compõem a cadeia principal do anel, incluindo átomos de carbono e heteroátomos), embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "heterociclil", onde nenhum intervalo numérico é designado. O grupo heterociclil também pode ser um heterociclil de tamanho médio com 3 a 10 membros no anel. O grupo heterociclil também pode ser um heterociclil com 3 a 6 membros no anel. O grupo heterociclil pode ser designado como "heterociclil de 3-6 membros" ou designações semelhantes. No heterociclil monocíclico preferencial de seis membros, o(s) heteroátomo(s) é(são) selecionado(s) a partir de O, N ou S, e no heterociclil monocíclico preferencial de cinco membros, o(s) heteroátomo(s) é(são) selecionado(s) a partir de um ou dois heteroátomos selecionados de O, N, ou S. Exemplos de anéis de heterociclil incluem, mas não estão limitados a, azepinil, acridinil, carbazolil, cinolinil, dioxolanil, imidazolinil, imidazolidinil, morfolinil, oxiranil, oxepanil, tiepanil, piperidinil, piperazinil, dioxopiperazinil, pirrolidinil, pirrolidonil, pirrolidionil, 4-piperidonil, pirazolinil, pirazolidinil, 1,3-dioxinil, 1,3-dioxanil, 1,4-dioxinil, 1,4-dioxanil, 1,3-oxatianil, 1,4-oxatiinil, 1,4-oxatianil, 2H-1,2-oxazinil, trioxanil, hexa-hidro-1,3,5-triazinil, 1,3-dioxolil, 1,3-dioxolanil, 1,3-ditiolil, 1,3-ditiolanil, isoxazolinil, isoxazolidinil, oxazolinil, oxazolidinil, oxazolidinonil, tiazolinil, tiazolidinil, 1,3-oxatiolanil, indolinil, isoindolinil, tetra-hidrofuranil, tetra- hidropiranil, tetra-hidrotiofenil, tetra-hidrotiopiranil, tetra-hidro-1,4-tiazinil, tiamorfolinil, di- hidrobenzofuranil, benzimidazolidinil, e tetra- hidroquinolina.[00076] As used in the present specification, "heterocyclyl" means a non-aromatic cyclic ring or ring system containing at least one heteroatom in the main chain of the ring. The heterocyclyl can be joined fused, bridged or connected in the spiro model. The heterocyclyl may have any degree of saturation as long as at least one ring in the ring system is non-aromatic. The heteroatom(s) may be present on a non-aromatic or aromatic ring in the ring system. The heterocyclyl group may have from 3 to 20 ring members (i.e., the number of atoms composing the main chain of the ring, including carbon atoms and heteroatoms), although the present definition also covers the occurrence of the term "heterocyclyl", where no numeric range is designated. The heterocyclyl group can also be a medium-sized heterocyclyl with 3 to 10 ring members. The heterocyclyl group can also be a heterocyclyl with 3 to 6 ring members. The heterocyclyl group may be designated as "3-6 membered heterocyclyl" or similar designations. In the preferred six-membered monocyclic heterocyclyl, the heteroatom(s) is selected from O, N, or S, and in the preferred five-membered monocyclic heterocyclyl, the heteroatom(s) is(are) selected from one or two heteroatoms selected from O, N, or S. Examples of heterocyclyl rings include, but are not limited to, azepinyl, acridinyl, carbazolyl, cinolinyl, dioxolanyl, imidazolinyl, imidazolidinyl , morpholinyl, oxiranil, oxepanil, thiepanil, piperidinyl, piperazinyl, dioxopiperazinyl, pyrrolidinyl, pyrrolidonyl, pyrrolidionyl, 4-piperidonyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, 1,3-dioxinyl, 1,3-dioxanyl, 1,4-dioxinyl, 1,4 -dioxanyl, 1,3-oxathianyl, 1,4-oxathiinyl, 1,4-oxathianyl, 2H-1,2-oxazinyl, trioxanyl, hexahydro-1,3,5-triazinyl, 1,3-dioxolyl, 1 ,3-dioxolanyl, 1,3-dithiolyl, 1,3-dithiolanyl, isoxazolinyl, isoxazolidinyl, oxazolinyl, oxazolidinyl, oxazolidinonyl, thiazolinyl, thiazolidinyl, 1,3-oxathiolanyl, indolinyl, isoindolinyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetra -hydrothiophenyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydro-1,4-thiazinyl, thiamorpholinyl, dihydrobenzofuranyl, benzimidazolidinyl, and tetrahydroquinoline.

[00077] Um grupo “O-carboxi” refere-se a um grupo “- OC(=O)R” em que R é selecionado a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00077] An “O-carboxy” group refers to a group “-OC(=O)R” in which R is selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3 to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00078] Um grupo “C-carboxi” refere-se a um grupo “- C(=O)OR” em que R é selecionado a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido. Um exemplo não limitativo inclui carboxil (isto é, -C(=O)OH).[00078] A “C-carboxy” group refers to a “- C(=O)OR” group in which R is selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3 to 10-membered heterocyclyl, as defined herein. A non-limiting example includes carboxyl (i.e. -C(=O)OH).

[00079] Um grupo “sulfonil” refere-se a um grupo “- SO2R” em que R é selecionado a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00079] A “sulfonyl” group refers to a “-SO2R” group in which R is selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6 aryl -C10, 5- to 10-membered heteroaryl and 3 to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00080] Um grupo "sulfino" refere-se a um grupo "- S(=O)OH".[00080] A "sulfino" group refers to a "- S(=O)OH" group.

[00081] Um grupo “S-sulfonamido” refere-se a um grupo “-SO2NRARB” em que RA e RB são, cada um, selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00081] An “S-sulfonamido” group refers to a “-SO2NRARB” group in which RA and RB are each independently selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-alkynyl C6, C3-C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3- to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00082] Um grupo “N- sulfonamido” refere-se a um grupo “-N(RA)SO2RB” em que RA e RB são, cada um, selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6- C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00082] An “N-sulfonamido” group refers to a “-N(RA)SO2RB” group in which RA and RB are each independently selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl , C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3- to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00083] Um grupo “C-amido” refere-se a um grupo “- C(=O)NRARB” em que RA e RB são, cada um, selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00083] A “C-amido” group refers to a “- C(=O)NRARB” group in which RA and RB are each independently selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-alkenyl C6, C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3- to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00084] Um grupo “N-amido” refere-se a um grupo “- N(RA)C(=O)RB” grupo em que RA e RB são, cada um, selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido.[00084] An “N-amido” group refers to a “- N(RA)C(=O)RB” group in which RA and RB are each independently selected from hydrogen, C1-alkyl C6, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3- to 10-membered heterocyclyl, as defined herein.

[00085] Um grupo “amino” refere-se a um grupo “- NRARB” em que RA e RB são, cada um, selecionado independentemente a partir de hidrogênio, alquil C1-C6, alquenil C2-C6, alquinil C2-C6, carbociclil C3-C7, aril C6-C10, heteroaril de 5 a 10 membros e heterociclil de 3 a 10 membros, conforme aqui definido. Um exemplo não limitativo inclui amino livre (isto é, -NH2).[00085] An “amino” group refers to a “-NRARB” group in which RA and RB are each independently selected from hydrogen, C1-C6 alkyl, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, C3-C7 carbocyclyl, C6-C10 aryl, 5- to 10-membered heteroaryl and 3- to 10-membered heterocyclyl, as defined herein. A non-limiting example includes free amino (i.e. -NH2).

[00086] Um grupo "aminoalquil" refere-se a um grupo amino conectado via um grupo alquileno.[00086] An "aminoalkyl" group refers to an amino group connected via an alkylene group.

[00087] Um grupo "alcoxialquil" refere-se a um grupo alcoxi conectado via um grupo alquileno, tal como um "alcoxialquil C2-C8" e semelhantes.[00087] An "alkoxyalkyl" group refers to an alkoxy group connected via an alkylene group, such as a "C2-C8 alkoxyalkyl" and the like.

[00088] Conforme utilizado no presente relatório descritivo, um grupo substituído é derivado do grupo pai não substituído no qual houve uma troca de um ou mais átomos de hidrogênio por outro átomo ou grupo. A menos que indicado de outra forma, quando um grupo é considerado como “substituído”, entende-se que o grupo está substituído com um ou mais substituintes selecionados independentemente a partir de alquil C1-C6, alquenil C1-C6, alquinil C1-C6, heteroalquil C1-C6, carbociclil C3-C7 (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), carbociclil(C3-C7)-alquil)C1-C6) (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), heterociclil de 3 a 10 membros (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), heterociclil de 3 a 10 membros-alquil(C1-C6) (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), aril (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, halogenoalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), aril-alquil(C1-C6) (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), heteroaril de 5 a 10 membros (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), heteroaril de 5-10 membros-alquil(C1-C6) (opcionalmente substituído com halo, alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquil C1-C6, e haloalcoxi C1-C6), halo, -CN, hidroxi, alcoxi C1-C6, alcoxi(C1-C6)-alquil(C1-C6) (isto é, éter), ariloxi, sulfidril (mercapto), halo-alquil(C1-C6) (por exemplo, - CF3), halo-alcoxi(C1-C6) (por exemplo, -OCF3), alquiltio C1C6, ariltio, amino, amino-alquilo(C1-C6), nitro, O- carbamil, N-carbamil, O-tiocarbamil, N-tiocarbamil, C- amido, N-amido, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxi, O- carboxi, acil, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, sulfinil, sulfonil, -SO3H, sulfino, -OSO2- alquil(C1-C4) e oxo (=O). Onde quer que um grupo seja descrito como "opcionalmente substituído", esse grupo poderá ser substituído pelos substituintes acima.[00088] As used in the present specification, a substituted group is derived from the unsubstituted parent group in which there has been an exchange of one or more hydrogen atoms for another atom or group. Unless otherwise indicated, when a group is considered to be “substituted”, it is understood that the group is substituted with one or more substituents independently selected from C1-C6 alkyl, C1-C6 alkenyl, C1-C6 alkynyl , C1-C6 heteroalkyl, C3-C7 carbocyclyl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), carbocyclyl(C3-C7)-C1-C6 alkyl ) (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), 3- to 10-membered heterocyclyl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy , C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), 3- to 10-membered heterocyclyl-(C1-C6)alkyl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1 haloalkoxy -C6), aryl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), aryl(C1-C6)alkyl (optionally substituted with halo, C1-alkyl C6, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), 5- to 10-membered heteroaryl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1- haloalkoxy C6), 5-10 membered heteroaryl-(C1-C6)alkyl (optionally substituted with halo, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkoxy, C1-C6 haloalkyl, and C1-C6 haloalkoxy), halo, -CN, hydroxy , C1-C6 alkoxy, C1-C6 alkoxy-C1-C6 alkyl (i.e. ether), aryloxy, sulfhydryl (mercapto), halo-C1-C6 alkyl (e.g. - CF3), halo -C1-C6 alkoxy (e.g. -OCF3), C1C6 alkylthio, arylthio, amino, amino-C1-C6 alkyl, nitro, O-carbamyl, N-carbamyl, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl, C - starch, N-starch, S-sulfonamido, N-sulfonamido, C-carboxy, O- carboxy, acyl, cyanate, isocyanate, thiocyanate, isothiocyanate, sulfinyl, sulfonyl, -SO3H, sulfin, -OSO2- alkyl (C1-C4 ) and oxo (=O). Wherever a group is described as "optionally substituted", that group may be replaced by the above substituents.

[00089] Em algumas modalidades, grupos alquil, alquenil, ou alquinil substituídos são substituídos com um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que compreende halo, -CN, SO3-, SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH, e COORb, onde Ra, Rb e Rc são cada um deles selecionados independentemente a partir de H, alquil, alquil substituído, alquenil, alquenil substituído, alquinil, alquinil substituído, aril, e aril substituído.[00089] In some embodiments, substituted alkyl, alkenyl, or alkynyl groups are substituted with one or more substituents selected from the group comprising halo, -CN, SO3-, SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH, and COORb, where Ra, Rb, and Rc are each independently selected from H, alkyl, substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, and substituted aryl.

[00090] Os compostos aqui descritos podem ser representados como várias formas mesoméricas. Onde uma única estrutura é desenhada, qualquer uma das formas mesoméricas relevantes é pretendida. Os compostos de cumarina aqui descritos são representados por uma única estrutura, mas podem ser igualmente mostrados como qualquer uma das formas mesoméricas relacionadas. Estruturas mesoméricas exemplares são mostradas abaixo para a Fórmula (I): [00090] The compounds described here can be represented as various mesomeric forms. Where a single structure is drawn, any of the relevant mesomeric forms are intended. The coumarin compounds described herein are represented by a single structure, but can equally be shown as any of the related mesomeric forms. Exemplary mesomeric structures are shown below for Formula (I):

[00091] Em cada caso em que uma única forma mesomérica de um composto aqui descrito é mostrada, as formas mesoméricas alternativas são igualmente contempladas.[00091] In each case in which a single mesomeric form of a compound described herein is shown, alternative mesomeric forms are equally contemplated.

[00092] Tal como entendido por um técnico versado no assunto, um composto aqui descrito pode existir na forma ionizada, por exemplo, -CO2- ou -SO3-. Se um composto contém um grupo substituinte carregado positivamente ou negativamente, por exemplo, SO3-, pode também conter um contra-íon carregado negativamente ou positivamente de modo que o composto, como um todo, é neutro. Em outros aspectos, o composto pode existir na forma de sal, em que o contra- íon é fornecido por um ácido ou base conjugada.[00092] As understood by one skilled in the art, a compound described herein can exist in ionized form, for example, -CO2- or -SO3-. If a compound contains a positively or negatively charged substituent group, for example, SO3-, it may also contain a negatively or positively charged counterion so that the compound, as a whole, is neutral. In other aspects, the compound may exist in salt form, in which the counterion is provided by a conjugate acid or base.

[00093] Deverá ser entendido que certas convenções de nomenclatura para radicais podem incluir um mono-radical ou um di-radical, dependendo do contexto. Por exemplo, onde um substituinte requer dois pontos de ligação ao resto da molécula, entende-se que o substituinte é um di-radical. Por exemplo, um substituinte identificado como alquil que requer dois pontos de fixação inclui di-radicais, tais como -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, e outros semelhantes. Outras convenções de nomenclatura para radicais indicam claramente que o radical é um di-radical, tal como "alquileno" ou "alquenileno".[00093] It should be understood that certain naming conventions for radicals may include a mono-radical or a di-radical, depending on the context. For example, where a substituent requires two points of attachment to the rest of the molecule, the substituent is understood to be a diradical. For example, a substituent identified as alkyl that requires two attachment points includes diradicals such as -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, and the like. Other naming conventions for radicals clearly indicate that the radical is a diradical, such as "alkylene" or "alkenylene".

[00094] Quando se diz que dois grupos R “adjacentes” formam um anel “junto com o átomo ao qual estão ligados”, isto significa que a unidade coletiva dos átomos, as ligações intermediárias e os dois grupos R são o anel recitado. Por exemplo, quando a seguinte subestrutura está presente: [00094] When it is said that two “adjacent” R groups form a ring “together with the atom to which they are attached”, this means that the collective unit of the atoms, the intermediate bonds and the two R groups are the recited ring. For example, when the following substructure is present:

[00095] E R1 e R2 são definidos como sendo selecionados a partir do grupo que compreende hidrogênio e alquil, ou R1 e R2, em conjunto com os átomos aos quais eles estão ligados, formam um aril ou carbociclil, deverá ser entendido que R1 e R2 podem ser selecionados a partir de hidrogênio ou alquil, ou alternativamente, a subestrutura tem estrutura:, em que A é um anel aril ou um carbociclil contendo a ligação dupla representada.[00095] And R1 and R2 are defined as being selected from the group comprising hydrogen and alkyl, or R1 and R2, together with the atoms to which they are bonded, form an aryl or carbocyclyl, it should be understood that R1 and R2 may be selected from hydrogen or alkyl, or alternatively, the substructure has structure: , wherein A is an aryl or carbocyclyl ring containing the depicted double bond.

Nucleotídeos MarcadosLabeled Nucleotides

[00096] De acordo com um aspecto da presente divulgação, são fornecidos compostos corantes adequados para ligação às porções de substrato, particularmente compreendendo grupos ligantes para permitir a ligação às porções de substrato. Porções de substrato podem ser praticamente qualquer molécula ou substância à qual os corantes da presente divulgação possam ser conjugados e, a título de exemplo não limitativo, podem incluir nucleosídeos, nucleotídeos, polinucleotídeos, carboidratos, ligantes, partículas, superfícies sólidas, polímeros orgânicos e inorgânicos, cromossomos, núcleos, células vivas e combinações ou arranjos dos mesmos. Os corantes podem ser conjugados por um ligante opcional através de uma variedade de meios, incluindo atração hidrofóbica, atração iônica e ligação covalente. Em alguns aspectos, os corantes são conjugados ao substrato através de ligação covalente. Mais particularmente, a ligação covalente é realizada por meio de um grupo de ligação. Em alguns casos, esses nucleotídeos marcados também são chamados de "nucleotídeos modificados".[00096] According to one aspect of the present disclosure, dye compounds suitable for binding to substrate moieties are provided, particularly comprising linker groups to enable binding to substrate moieties. Substrate moieties may be virtually any molecule or substance to which the dyes of the present disclosure may be conjugated and, by way of non-limiting example, may include nucleosides, nucleotides, polynucleotides, carbohydrates, ligands, particles, solid surfaces, organic and inorganic polymers. , chromosomes, nuclei, living cells and combinations or arrangements thereof. Dyes can be conjugated by an optional ligand through a variety of means, including hydrophobic attraction, ionic attraction, and covalent bonding. In some aspects, the dyes are conjugated to the substrate through covalent bonding. More particularly, the covalent bond is carried out by means of a linking group. In some cases, these labeled nucleotides are also called "modified nucleotides".

[00097] A presente divulgação adicionalmente fornece conjugados de nucleosídeos e nucleotídeos marcados com um ou mais dos corantes aqui estabelecidos (nucleotídeos modificados). Os nucleosídeos e nucleotídeos marcados são úteis para marcar polinucleotídeos formados por síntese enzimática, tal como exemplo não limitativo, na amplificação por PCR, amplificação isotérmica, amplificação em fase sólida, sequenciamento de polinucleotídeos (por exemplo, sequenciamento em fase sólida), reações de tradução e semelhantes.[00097] The present disclosure additionally provides conjugates of nucleosides and nucleotides labeled with one or more of the dyes set forth herein (modified nucleotides). Labeled nucleosides and nucleotides are useful for labeling polynucleotides formed by enzymatic synthesis, such as by non-limiting example, in PCR amplification, isothermal amplification, solid phase amplification, polynucleotide sequencing (e.g., solid phase sequencing), translation reactions and the like.

[00098] A ligação às biomoléculas pode ser via posição R, R1, R2, R3, R4, R5, ou X do composto de Fórmula (I). Em alguns aspectos, a ligação é através do grupo R3 ou R5 da Fórmula (I). Para a Fórmula (II), a ligação pode estar na posição R6 a R11 ou X'. Em algumas modalidades, o grupo substituinte é um grupo alquil substituído, por exemplo, alquil substituído com -CO2H ou uma forma ativada de um grupo carboxil, por exemplo, uma amida ou éster, o qual pode ser usado para ligação ao grupo amino ou hidroxil das biomoléculas. Em uma modalidade, os grupos R, R1, R2, R3, R4, R5, ou X da Fórmula (I) ou grupos de R6 a R11 ou X' da Fórmula (II) podem conter um éster ativado ou resíduo de amida mais adequado para formação adicional de ligação amida/peptídeo. O termo "éster ativado", conforme usado aqui, refere-se a um derivado do grupo carboxil que é capaz de reagir em condições suaves, por exemplo, com um composto contendo um grupo amino. Exemplos não limitativos de ésteres ativados incluem, mas não se limitam a ésteres p- nitrofenil, pentafluorofenil e succinimido.[00098] Binding to biomolecules can be via the R, R1, R2, R3, R4, R5, or X position of the compound of Formula (I). In some aspects, the connection is through the R3 or R5 group of Formula (I). For Formula (II), the bond can be in position R6 to R11 or X'. In some embodiments, the substituent group is a substituted alkyl group, e.g., alkyl substituted with -CO2H, or an activated form of a carboxyl group, e.g., an amide or ester, which can be used to bond to the amino or hydroxyl group. of biomolecules. In one embodiment, the groups R, R1, R2, R3, R4, R5, or X of Formula (I) or groups from R6 to R11 or X' of Formula (II) may contain a more suitable activated ester or amide residue. for additional amide/peptide bond formation. The term "activated ester", as used herein, refers to a carboxyl group derivative that is capable of reacting under mild conditions, for example, with a compound containing an amino group. Non-limiting examples of activated esters include, but are not limited to, p-nitrophenyl, pentafluorophenyl, and succinimide esters.

[00099] Em algumas modalidades, os compostos corantes podem ser ligados covalentemente a oligonucleotídeos ou nucleotídeos através da base nucleotídica. Por exemplo, o nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado pode ter o marcador anexado à posição C5 de uma base de pirimidina ou à posição C7 de uma base de 7-desazapurina através de uma porção ligante. O nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado também pode ter um grupo bloqueador 3'-OH ligado covalentemente ao açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.[00099] In some embodiments, the dye compounds can be covalently linked to oligonucleotides or nucleotides through the nucleotide base. For example, the labeled nucleotide or oligonucleotide may have the label attached to the C5 position of a pyrimidine base or the C7 position of a 7-deazapurine base via a linker moiety. The labeled nucleotide or oligonucleotide may also have a 3'-OH blocking group covalently attached to the ribose or deoxyribose sugar of the nucleotide.

[000100] Uma aplicação particularmente útil dos novos corantes fluorescentes tal como aqui descrito é para marcar biomoléculas, por exemplo, nucleotídeos ou oligonucleotídeos. Algumas concretizações da presente aplicação são direcionadas a um nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado com os novos compostos fluorescentes, tal como aqui descrito.[000100] A particularly useful application of the new fluorescent dyes as described here is to label biomolecules, for example, nucleotides or oligonucleotides. Some embodiments of the present application are directed to a nucleotide or oligonucleotide labeled with the novel fluorescent compounds, as described herein.

LigantesLigands

[000101] Os compostos corantes conforme aqui divulgados podem incluir um grupo ligante reativo em uma das posições substituintes para ligação covalente do composto a um substrato ou outra molécula. Grupos de ligação reativa são porções capazes de formar uma ligação (por exemplo, uma ligação covalente ou não covalente), em particular uma ligação covalente. Em uma concretização particular, o ligante pode ser um ligante clivável. O uso do termo "ligante clivável" não significa que todo o ligante deve ser removido. O local de clivagem pode estar localizado em uma posição no ligante que garante que parte do ligante permaneça vinculada ao corante e/ou à porção do substrato após a clivagem. Os ligantes cliváveis podem ser, a título de exemplo não limitativo, ligantes eletrofilicamente cliváveis, ligantes nucleofilicamente cliváveis, ligantes fotocliváveis, cliváveis sob condições redutivas (por exemplo, ligantes contendo dissulfeto ou azida), condições oxidantes, cliváveis através do uso de ligantes de trava de segurança e clivável através de mecanismos de eliminação. O uso de um ligante clivável para conectar o composto corante a uma porção de substrato garante que o marcador possa, se necessário, ser removido após a detecção, evitando qualquer sinal de interferência nas etapas posteriores.[000101] The coloring compounds as disclosed herein may include a reactive linking group at one of the substituent positions for covalent attachment of the compound to a substrate or other molecule. Reactive linkage groups are moieties capable of forming a bond (e.g. a covalent or non-covalent bond), in particular a covalent bond. In a particular embodiment, the linker may be a cleavable linker. Use of the term "cleavable linker" does not mean that the entire linker must be removed. The cleavage site may be located in a position on the linker that ensures that part of the linker remains bound to the dye and/or substrate portion after cleavage. Cleavable linkers may be, by way of non-limiting example, electrophilically cleavable linkers, nucleophilically cleavable linkers, photocleavable linkers, cleavable under reductive conditions (e.g. disulfide or azide containing linkers), oxidizing conditions, cleavable through the use of locking linkers. safety and cleavable through elimination mechanisms. The use of a cleavable linker to connect the dye compound to a substrate moiety ensures that the label can, if necessary, be removed after detection, avoiding any sign of interference in later steps.

[000102] Grupos de ligantes úteis podem ser encontrados na Publicação PCT No. WO2004/018493 (aqui incorporada por referência), exemplos dos quais incluem ligantes que podem ser clivados usando fosfinas solúveis em água ou catalisadores de metais de transição solúveis em água formados a partir de um metal de transição e pelo menos ligantes parcialmente solúveis em água. Em solução aquosa, pelo menos parcialmente, este último forma complexos de metais de transição solúveis em água. Tais ligantes cliváveis podem ser usados para conectar bases de nucleotídeos a marcadores, tais como os corantes aqui apresentados.[000102] Useful linker groups can be found in PCT Publication No. WO2004/018493 (incorporated herein by reference), examples of which include linkers that can be cleaved using water-soluble phosphines or water-soluble transition metal catalysts formed by from a transition metal and at least partially water-soluble ligands. In aqueous solution, at least partially, the latter forms water-soluble transition metal complexes. Such cleavable linkers can be used to connect nucleotide bases to tags, such as the dyes presented here.

[000103] Ligantes particulares incluem aqueles divulgados na Publicação PCT No. WO2004/018493 (aqui incorporada por referência), bem como aqueles que incluem porções das fórmulas: - em que X é selecionado a partir do grupo que compreende O, S, NH e NQ em que Q é um grupo alquil C1-C10 substituído ou não substituído, Y é selecionado a partir do grupo que compreende O, S, NH e N(alil), T é hidrogênio ou um grupo alquil C1-C10 substituído ou não substituído, e * indica onde o radical está ligado à parte restante do nucleotídeo ou nucleosídeo. Em alguns aspectos, os ligantes conectam as bases dos nucleotídeos à marcadores como, por exemplo, os compostos corantes aqui descritos.[000103] Particular binders include those disclosed in PCT Publication No. WO2004/018493 (incorporated herein by reference), as well as those that include portions of the formulas: - wherein X is selected from the group comprising O, S, NH and NQ wherein Q is a substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl group, Y is selected from the group comprising O, S, NH and N (allyl), T is hydrogen or a substituted or unsubstituted C1-C10 alkyl group, and * indicates where the radical is attached to the remaining part of the nucleotide or nucleoside. In some aspects, linkers connect nucleotide bases to markers, such as the dye compounds described herein.

[000104] Em concretizações particulares, o comprimento do ligante entre um corante fluorescente (fluoróforo) e uma base de guanina pode ser alterado, por exemplo, através da introdução de um grupo espaçador de polietilenoglicol, aumentando assim a intensidade da fluorescência em comparação com o mesmo fluoróforo conectado à base de guanina através de outras ligações conhecidas no estado da técnica. Ligantes exemplificativos e suas propriedades são apresentadas na publicação PCT No. WO2007020457 (aqui incorporada por referência). A concepção de ligantes, e especialmente o seu comprimento aumentado, pode permitir melhorias no brilho dos fluoróforos ligados às bases de guanina dos nucleotídeos de guanosina quando incorporados em polinucleotídeos, tal como o DNA. Assim, quando o corante é para uso em qualquer método de análise que exija a detecção de um marcador corante fluorescente ligado a um nucleotídeo contendo guanina, é vantajoso que o ligante compreenda um grupo espaçador de fórmula - ((CH2)2O)n-, em que n é um número inteiro entre 2 e 50, conforme descrito no documento WO 2007/020457.[000104] In particular embodiments, the length of the linker between a fluorescent dye (fluorophore) and a guanine base can be altered, for example, by introducing a polyethylene glycol spacer group, thereby increasing the fluorescence intensity compared to the same fluorophore connected to the guanine base through other bonds known in the art. Exemplary ligands and their properties are set forth in PCT publication No. WO2007020457 (incorporated herein by reference). The design of linkers, and especially their increased length, may allow improvements in the brightness of fluorophores attached to the guanine bases of guanosine nucleotides when incorporated into polynucleotides such as DNA. Thus, when the dye is for use in any method of analysis requiring the detection of a fluorescent dye tag linked to a guanine-containing nucleotide, it is advantageous for the linker to comprise a spacer group of formula - ((CH2)2O)n-, where n is an integer between 2 and 50, as described in WO 2007/020457.

[000105] Os nucleosídeos e nucleotídeos podem ser marcados nos locais do açúcar ou da nucleobase. Tal como conhecido na arte, um "nucleotídeo" consiste em uma base nitrogenada, um açúcar e um ou mais grupos fosfato. No RNA, o açúcar é ribose e no DNA é uma desoxirribose, ou seja, um açúcar sem um grupo hidroxila que está presente na ribose. A base nitrogenada é um derivado de purina ou pirimidina. As purinas são adenina (A) e guanina (G), e as pirimidinas são citosina (C) e timina (T) ou, no contexto do RNA, uracila (U). O átomo C-1 da desoxirribose está ligado a N-1 de uma pirimidina ou N-9 de uma purina. Um nucleotídeo também é um éster fosfato de um nucleosídeo, com esterificação ocorrendo no grupo hidroxila ligado ao C-3 ou C-5 do açúcar. Os nucleotídeos são geralmente mono, di ou trifosfatos.[000105] Nucleosides and nucleotides can be labeled at the sugar or nucleobase sites. As known in the art, a "nucleotide" consists of a nitrogenous base, a sugar and one or more phosphate groups. In RNA, the sugar is ribose and in DNA it is deoxyribose, that is, a sugar without a hydroxyl group that is present in ribose. The nitrogenous base is a purine or pyrimidine derivative. The purines are adenine (A) and guanine (G), and the pyrimidines are cytosine (C) and thymine (T) or, in the context of RNA, uracil (U). The C-1 atom of deoxyribose is linked to N-1 of a pyrimidine or N-9 of a purine. A nucleotide is also a phosphate ester of a nucleoside, with esterification occurring at the hydroxyl group attached to C-3 or C-5 of the sugar. Nucleotides are generally mono-, di- or triphosphates.

[000106] Um "nucleosídeo" é estruturalmente semelhante a um nucleotídeo, mas sem a presença de porções fosfato. Um exemplo de um análogo de nucleosídeo seria aquele em que o marcador está ligado à base e não há grupo fosfato ligado à molécula de açúcar.[000106] A "nucleoside" is structurally similar to a nucleotide, but without the presence of phosphate moieties. An example of a nucleoside analog would be one in which the tag is attached to the base and there is no phosphate group attached to the sugar molecule.

[000107] Embora a base seja geralmente referida como purina ou pirimidina, o técnico versado no assunto apreciará que estão disponíveis derivados e análogos que não alteram a capacidade do nucleotídeo ou nucleosídeo de sofrer emparelhamento de bases de Watson-Crick. "Derivado" ou "análogo" significa um composto ou molécula cuja estrutura principal é igual ou semelhante à de um composto original, mas que possui uma modificação química ou física, tal como, por exemplo, um grupo lateral diferente ou adicional, o que permite que o nucleotídeo ou nucleosídeo derivado seja ligado à outra molécula. Por exemplo, a base pode ser uma deazapurina. Em concretizações particulares, os derivados devem ser capazes de sofrer emparelhamento de Watson-Crick. "Derivado" e "análogo" também incluem, por exemplo, um nucleotídeo sintético ou nucleosídeo derivado com porções de base modificadas e/ou porções de açúcar modificadas. Tais derivados e análogos são discutidos em, por exemplo, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) e Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Análogos de nucleotídeos também podem compreender ligações fosfodiéster modificadas, incluindo ligações fosforotioato, fosforoditioato, alquil-fosfonato, fosforanilidato, fosforamidato e semelhantes.[000107] Although the base is generally referred to as a purine or pyrimidine, the skilled artisan will appreciate that derivatives and analogues are available that do not alter the ability of the nucleotide or nucleoside to undergo Watson-Crick base pairing. "Derivative" or "analogue" means a compound or molecule whose main structure is the same or similar to that of an original compound, but which has a chemical or physical modification, such as, for example, a different or additional side group, which allows that the derived nucleotide or nucleoside is linked to the other molecule. For example, the base may be a deazapurine. In particular embodiments, the derivatives must be capable of undergoing Watson-Crick pairing. "Derivative" and "analog" also include, for example, a synthetic nucleotide or nucleoside derivative with modified base moieties and/or modified sugar moieties. Such derivatives and analogs are discussed in, for example, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Nucleotide analogs may also comprise modified phosphodiester linkages, including phosphorothioate, phosphorodithioate, alkyl-phosphonate, phosphoranilidate, phosphoramidate and the like bonds.

[000108] Um corante pode ser ligado a qualquer posição na base nucleotídica, por exemplo, através de um ligante. Em concretizações particulares, o emparelhamento da base de Watson-Crick ainda pode ser realizado para o análogo resultante. Os locais de marcação de nucleobases específicos incluem a posição C5 de uma base de pirimidina ou a posição C7 de uma base de 7-desazapurina. Tal como descrito acima, um grupo ligante pode ser usado para ligar covalentemente um corante ao nucleosídeo ou nucleotídeo.[000108] A dye can be attached to any position in the nucleotide base, for example, through a linker. In particular embodiments, Watson-Crick base pairing can still be performed for the resulting analog. Specific nucleobase labeling sites include the C5 position of a pyrimidine base or the C7 position of a 7-deazapurine base. As described above, a linking group can be used to covalently attach a dye to the nucleoside or nucleotide.

[000109] Em concretizações particulares, o nucleosídeo ou nucleotídeo marcado pode ser enzimaticamente incorporável e enzimaticamente extensível. Consequentemente, uma porção ligante pode ter comprimento suficiente para conectar o nucleotídeo ao composto, de modo que o composto não interfira significativamente com a ligação e com o reconhecimento geral do nucleotídeo por uma enzima de replicação de ácido nucleico. Assim, o ligante também pode compreender uma unidade espaçadora. O espaçador distancia, por exemplo, a base nucleotídica em relação a um local ou marcador de clivagem.[000109] In particular embodiments, the labeled nucleoside or nucleotide can be enzymatically incorporable and enzymatically extensible. Consequently, a linker moiety may be of sufficient length to connect the nucleotide to the compound so that the compound does not significantly interfere with the binding and general recognition of the nucleotide by a nucleic acid replication enzyme. Thus, the linker may also comprise a spacer unit. The spacer distances, for example, the nucleotide base in relation to a cleavage site or marker.

[000110] Os nucleosídeos ou nucleotídeos marcados com os corantes aqui descritos podem ter a fórmula:, em que: - Dye (corante) é um composto corante; - B é uma nucleobase, tal como, por exemplo, uracila, timina, citosina, adenina, guanina e similares; - L é um grupo ligante opcional que pode ou não estar presente; - R' pode ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, um análogo de éster de fosfato, -O- ligado a um grupo reativo de fósforo contendo, ou -O- protegido por um grupo de bloqueio; - R'' pode ser H, OH, um fosforamidita, ou um grupo de bloqueio 3'-OH; e - R''' é H ou OH.[000110] The nucleosides or nucleotides labeled with the dyes described here may have the formula: , where: - Dye is a coloring compound; - B is a nucleobase, such as, for example, uracil, thymine, cytosine, adenine, guanine and the like; - L is an optional linking group that may or may not be present; - R' can be H, monophosphate, diphosphate, triphosphate, thiophosphate, a phosphate ester analogue, -O- linked to a phosphorus containing reactive group, or -O- protected by a blocking group; - R'' can be H, OH, a phosphoramidite, or a 3'-OH blocking group; and - R''' is H or OH.

[000111] Onde R'' é fosforamidita, R' é um grupo protetor de hidroxila clivável por ácido que permite acoplamento de monômero subsequente sob condições de síntese automatizada.[000111] Where R'' is phosphoramidite, R' is an acid-cleavable hydroxyl protecting group that allows subsequent monomer coupling under automated synthesis conditions.

[000112] Em uma concretização particular, o grupo bloqueador é separado e independente do composto corante, isto é, não está ligado a ele. Alternativamente, o corante pode compreender todo ou parte do grupo bloqueador 3'-OH. Assim, R'' pode ser um grupo bloqueador 3'-OH que pode ou não compreender o composto corante.[000112] In a particular embodiment, the blocking group is separate and independent from the coloring compound, that is, it is not linked to it. Alternatively, the dye may comprise all or part of the 3'-OH blocking group. Thus, R'' may be a 3'-OH blocking group which may or may not comprise the coloring compound.

[000113] Em outra concretização alternativa, não há grupo de bloqueio no carbono 3' do açúcar pentose e o corante (ou construção de corante e ligante) anexado à base, por exemplo, pode ser de tamanho ou estrutura suficiente para atuar como um bloqueio a incorporação de outro nucleotídeo. Assim, o bloqueio pode ser causado por impedimento estérico ou por uma combinação de tamanho, carga e estrutura, independentemente de o corante estar ou não ligado à posição 3' do açúcar.[000113] In another alternative embodiment, there is no blocking group on the 3' carbon of the pentose sugar and the dye (or dye and ligand construct) attached to the base, for example, may be of sufficient size or structure to act as a blocker. the incorporation of another nucleotide. Thus, blocking can be caused by steric hindrance or by a combination of size, charge, and structure, regardless of whether or not the dye is bound to the 3' position of the sugar.

[000114] Ainda em outra concretização alternativa, o grupo de bloqueio está presente no carbono 2' ou 4' do açúcar pentose e pode ser de tamanho ou estrutura suficiente para atuar como um bloco para a incorporação de um nucleotídeo adicional.[000114] In yet another alternative embodiment, the blocking group is present on the 2' or 4' carbon of the pentose sugar and may be of sufficient size or structure to act as a block for the incorporation of an additional nucleotide.

[000115] O uso de um grupo de bloqueio permite que a polimerização seja controlada, tal como através de interrupção da extensão quando um nucleotídeo modificado é incorporado. Se o efeito de bloqueio for reversível, por exemplo, a título de exemplo não limitativo, pela alteração das condições químicas ou pela remoção de um bloqueio químico, a extensão poderá ser interrompida em determinados pontos, e então permitida para continuação.[000115] The use of a blocking group allows polymerization to be controlled, such as by stopping extension when a modified nucleotide is incorporated. If the blocking effect is reversible, for example, by way of non-limiting example, by changing chemical conditions or removing a chemical block, the extension may be stopped at certain points, and then allowed to continue.

[000116] Em outra concretização particular, um grupo de bloqueio 3'-OH compreenderá uma fração divulgada nos documentos WO2004/018497 e WO2014/139596, que são aqui incorporados por referências. Por exemplo, o grupo bloqueador pode ser azidometil (-CH2N3) ou azidometil substituído (por exemplo, - CH(CHF2)N3 ou CH(CH2F)N3), ou alil.[000116] In another particular embodiment, a 3'-OH blocking group will comprise a moiety disclosed in documents WO2004/018497 and WO2014/139596, which are incorporated herein by references. For example, the blocking group may be azidomethyl (-CH2N3) or substituted azidomethyl (e.g., -CH(CHF2)N3 or CH(CH2F)N3), or allyl.

[000117] Em uma concretização particular, o ligante (entre o corante e o nucleotídeo) e o grupo de bloqueio estão presentes e são porções separadas. Em concretizações particulares, o ligante e o grupo de bloqueio são cliváveis sob condições substancialmente semelhantes. Assim, os processos de desproteção e desbloqueio podem ser mais eficientes, uma vez que apenas um único tratamento será necessário para remover o composto corante e o grupo bloqueador. No entanto, em algumas modalidades, um ligante e um grupo de bloqueio não precisam ser cliváveis sob condições semelhantes, ao invés disso, podem ser individualmente cliváveis sob condições distintas.[000117] In a particular embodiment, the linker (between the dye and the nucleotide) and the blocking group are present and are separate portions. In particular embodiments, the linker and blocking group are cleavable under substantially similar conditions. Thus, the deprotection and deblocking processes can be more efficient, since only a single treatment will be necessary to remove the coloring compound and the blocking group. However, in some embodiments, a linker and a blocking group need not be cleavable under similar conditions, rather, they may be individually cleavable under different conditions.

[000118] A presente invenção também abrange polinucleotídeos que incorporam compostos corantes. Tais polinucleotídeos podem ser DNA ou RNA compreendidos respectivamente de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos unidos na ligação fosfodiéster. Os polinucleotídeos podem compreender nucleotídeos de ocorrência natural, nucleotídeos de ocorrência não natural (ou modificados) que não sejam os nucleotídeos marcados aqui descritos ou qualquer combinação dos mesmos, em combinação com pelo menos um nucleotídeo modificado (por exemplo, marcado com um composto corante), conforme estabelecido aqui. Os polinucleotídeos de acordo com a presente divulgação também podem incluir ligações não naturais e/ou modificações químicas não nucleotídicas na cadeia principal. Também são contempladas estruturas quiméricas compostas de misturas de ribonucleotídeos e compreendendo pelo menos um nucleotídeo marcado.[000118] The present invention also covers polynucleotides that incorporate dye compounds. Such polynucleotides may be DNA or RNA comprised respectively of deoxyribonucleotides or ribonucleotides joined in the phosphodiester bond. Polynucleotides may comprise naturally occurring nucleotides, non-naturally occurring (or modified) nucleotides other than the labeled nucleotides described herein, or any combination thereof, in combination with at least one modified nucleotide (e.g., labeled with a coloring compound). , as set forth here. Polynucleotides according to the present disclosure may also include unnatural linkages and/or non-nucleotide chemical modifications to the backbone. Chimeric structures composed of mixtures of ribonucleotides and comprising at least one labeled nucleotide are also contemplated.

[000119] Os nucleotídeos marcados de exemplo não limitativos, tais como aqui descritos incluem: em que: - L representa um ligante e R representa um resíduo de açúcar tal como descrito acima.[000119] Non-limiting example labeled nucleotides as described herein include: wherein: - L represents a linker and R represents a sugar residue as described above.

[000120] Em algumas modalidades, conjugados exemplificativos não limitativos de corante fluorescents são mostrados abaixo: [000120] In some embodiments, exemplary non-limiting fluorescent dye conjugates are shown below:

KitsKits

[000121] A presente invenção também fornece kits que incluem nucleosídeos e/ou nucleotídeos modificados marcados com corantes. Tais kits geralmente incluem pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com um corante aqui estabelecido juntamente com pelo menos um componente adicional. O(s) componente(s) adicional(ais) pode(m) ser um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido aqui ou na seção Exemplos abaixo. Alguns exemplos não limitativos de componentes que podem ser combinados em um kit da presente divulgação são apresentados abaixo.[000121] The present invention also provides kits that include nucleosides and/or modified nucleotides labeled with dyes. Such kits generally include at least one modified nucleotide or nucleoside labeled with a dye set forth herein together with at least one additional component. The additional component(s) may be one or more of the components identified in a method set forth herein or in the Examples section below. Some non-limiting examples of components that can be combined in a kit of the present disclosure are presented below.

[000122] Em uma concretização específica, um kit pode incluir pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com um corante aqui apresentado juntamente com nucleotídeos ou nucleosídeos modificados ou não modificados. Por exemplo, nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a presente divulgação podem ser fornecidos em combinação com nucleotídeos nativos ou não marcados e/ou com nucleotídeos marcados com fluorescência ou qualquer combinação dos mesmos. Consequentemente, os kits podem compreender nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a presente divulgação e nucleotídeos modificados marcados com outros, por exemplo, compostos corantes do estado da técnica. As combinações de nucleotídeos podem ser fornecidas como componentes individuais separados (por exemplo, um tipo de nucleotídeo por recipiente ou tubo) ou como misturas de nucleotídeos (por exemplo, dois ou mais nucleotídeos misturados no mesmo recipiente ou tubo).[000122] In a specific embodiment, a kit may include at least one modified nucleotide or nucleoside labeled with a dye presented herein together with modified or unmodified nucleotides or nucleosides. For example, modified nucleotides labeled with dyes in accordance with the present disclosure may be provided in combination with native or unlabeled nucleotides and/or with fluorescently labeled nucleotides or any combination thereof. Accordingly, kits may comprise modified nucleotides labeled with dyes in accordance with the present disclosure and modified nucleotides labeled with other, for example, prior art dye compounds. Nucleotide combinations may be provided as separate individual components (e.g., one type of nucleotide per container or tube) or as nucleotide mixtures (e.g., two or more nucleotides mixed in the same container or tube).

[000123] Onde os kits compreendem uma pluralidade, particularmente dois, ou três, ou mais particularmente quatro, nucleotídeos modificados marcados com um composto corante, os diferentes nucleotídeos podem ser marcados com diferentes compostos corantes, ou um pode ser escuro, sem compostos corantes. Onde os diferentes nucleotídeos são marcados com diferentes compostos corantes, é uma característica dos kits que os compostos corantes sejam corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis. Tal como aqui utilizado, o termo "corantes fluorescentes espectralmente distintos" refere-se a corantes fluorescentes que emitem energia de fluorescência em comprimentos de onda que podem ser distinguidas pelo equipamento de detecção fluorescente (por exemplo, uma plataforma comercial de sequenciamento de DNA baseado em capilaridade) quando dois ou mais desses corantes estão presente em uma amostra. Quando dois nucleotídeos modificados marcados com compostos de corante fluorescente são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas concretizações que os corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ser excitados no mesmo comprimento de onda, tal como, por exemplo, pelo mesmo laser. Quando quatro nucleotídeos modificados marcados com compostos de corantes fluorescentes são fornecidos em forma de kit, é uma característica de algumas concretizações que dois dos corantes fluorescentes espectralmente distinguíveis possam ser excitados em um comprimento de onda e os outros dois corantes espectralmente distinguíveis possam ser excitados em outro comprimento de onda. Os comprimentos de onda de excitação específicos são 488 nm e 532 nm.[000123] Where the kits comprise a plurality, particularly two, or three, or more particularly four, modified nucleotides labeled with a dye compound, the different nucleotides may be labeled with different dye compounds, or one may be dark, without dye compounds. Where different nucleotides are labeled with different dye compounds, it is a feature of the kits that the dye compounds are spectrally distinguishable fluorescent dyes. As used herein, the term "spectrally distinct fluorescent dyes" refers to fluorescent dyes that emit fluorescence energy at wavelengths that can be distinguished by fluorescent detection equipment (e.g., a commercial DNA sequencing platform based on capillarity) when two or more of these dyes are present in a sample. When two modified nucleotides labeled with fluorescent dye compounds are provided in kit form, it is a feature of some embodiments that the spectrally distinguishable fluorescent dyes can be excited at the same wavelength, such as, for example, by the same laser. When four modified nucleotides labeled with fluorescent dye compounds are provided in kit form, it is a feature of some embodiments that two of the spectrally distinguishable fluorescent dyes can be excited at one wavelength and the other two spectrally distinguishable dyes can be excited at another. wave-length. The specific excitation wavelengths are 488 nm and 532 nm.

[000124] Em uma modalidade, um kit inclui um nucleotídeo modificado marcado com um composto da presente divulgação e um segundo nucleotídeo modificado marcado com um segundo corante, em que os corantes têm uma diferença na absorbância máxima de pelo menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos de corante têm desvios de Stokes entre 15 nm e 40 nm, onde "desvio de Stokes" é a distância entre o pico de absorção e o pico de emissão do comprimento de onda.[000124] In one embodiment, a kit includes a modified nucleotide labeled with a compound of the present disclosure and a second modified nucleotide labeled with a second dye, wherein the dyes have a difference in maximum absorbance of at least 10 nm, particularly 20 nm to 50 nm. More particularly, the two dye compounds have Stokes shifts between 15 nm and 40 nm, where "Stokes shift" is the distance between the absorption peak and the emission peak wavelength.

[000125] Em uma concretização adicional, um kit pode incluir ainda dois outros nucleotídeos modificados marcados com corantes fluorescentes, em que os corantes são excitados pelo mesmo laser a 532 nm. Os corantes podem possuir uma diferença na absorbância máxima de pelo menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Mais particularmente, os dois compostos corantes podem possuir desvios de Stokes entre 20 nm a 40 nm. Corantes particulares que são espectralmente distinguíveis dos corantes da presente divulgação e que atendem aos critérios acima são análogos de polimetina, tal como descrito na Patente US 5.268.486 (por exemplo Cy3) ou documento WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) ou polimetinas assimétricas, tal como divulgadas na Patente US 6.924.372, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Corantes alternativos incluem análogos de rodamina, por exemplo, tetrametil rodamina e análogos.[000125] In an additional embodiment, a kit may further include two other modified nucleotides labeled with fluorescent dyes, where the dyes are excited by the same laser at 532 nm. Dyes may have a difference in maximum absorbance of at least 10 nm, particularly 20 nm to 50 nm. More particularly, the two dye compounds may have Stokes shifts between 20 nm to 40 nm. Particular dyes that are spectrally distinguishable from the dyes of the present disclosure and that meet the above criteria are polymethine analogs as described in US Patent 5,268,486 (e.g. Cy3) or WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) or polymethines asymmetrical structures, as disclosed in US Patent 6,924,372, each of which is incorporated herein by reference. Alternative dyes include rhodamine analogues, for example, tetramethyl rhodamine and the like.

[000126] Em uma concretização alternativa, os kits da presente divulgação podem conter nucleotídeos onde a mesma base é marcada com dois compostos diferentes. Um primeiro nucleotídeo pode ser marcado com um composto da presente divulgação. Um segundo nucleotídeo pode ser marcado com um composto espectralmente distinto, por exemplo, um corante 'verde' absorvendo a menos de 600 nm. Um terceiro nucleotídeo pode ser marcado como uma mistura do composto da presente divulgação e do composto espectralmente distinto, e o quarto nucleotídeo pode ser 'escuro' e não conter marcador. Portanto, em termos simples, os nucleotídeos de 1 a 4 podem ser marcados como 'azul', 'verde', 'azul/verde' e escuro. Para simplificar ainda mais a instrumentação, quatro nucleotídeos podem ser marcados com dois corantes excitados com um único laser e, portanto, a marcação dos nucleotídeos de 1 a 4 pode ser 'azul 1', 'azul 2 ', 'azul 1/azul 2' e escuro.[000126] In an alternative embodiment, the kits of the present disclosure may contain nucleotides where the same base is labeled with two different compounds. A first nucleotide may be labeled with a compound of the present disclosure. A second nucleotide can be labeled with a spectrally distinct compound, for example a 'green' dye absorbing at less than 600 nm. A third nucleotide may be labeled as a mixture of the compound of the present disclosure and the spectrally distinct compound, and the fourth nucleotide may be 'dark' and contain no label. So, in simple terms, nucleotides 1 to 4 can be labeled as 'blue', 'green', 'blue/green' and dark. To further simplify the instrumentation, four nucleotides can be labeled with two dyes excited with a single laser, and therefore the labeling of nucleotides 1 to 4 can be 'blue 1', 'blue 2', 'blue 1/blue 2' ' it is dark.

[000127] Os nucleotídeos podem conter dois corantes da presente divulgação. Um kit pode conter dois ou mais nucleotídeos marcados com corantes da presente divulgação. Os kits podem conter um nucleotídeo adicional em que o nucleotídeo é marcado com um corante que absorve na região de 520 nm a 560 nm. Os kits podem adicionalmente conter um nucleotídeo não marcado.[000127] The nucleotides can contain two dyes of the present disclosure. A kit may contain two or more nucleotides labeled with dyes of the present disclosure. Kits may contain an additional nucleotide in which the nucleotide is labeled with a dye that absorbs in the 520 nm to 560 nm region. Kits may additionally contain an unlabeled nucleotide.

[000128] Embora kits sejam exemplificados neste relatório descritivo em relação a configurações com diferentes nucleotídeos marcados com diferentes compostos corantes, deverá ser entendido que os kits podem incluir 2, 3, 4 ou mais nucleotídeos diferentes que possuem o mesmo composto corante.[000128] Although kits are exemplified in this specification in relation to configurations with different nucleotides labeled with different dye compounds, it should be understood that the kits may include 2, 3, 4 or more different nucleotides that have the same dye compound.

[000129] Em concretizações particulares, um kit pode incluir uma enzima polimerase capaz de catalisar a incorporação dos nucleotídeos modificados em um polinucleotídeo. Outros componentes a serem incluídos em tais kits podem incluir tampões e similares. Os nucleotídeos modificados marcados com corantes de acordo com a presente divulgação e outros componentes nucleotídicos, incluindo misturas de diferentes nucleotídeos, podem ser fornecidos no kit em uma forma concentrada a ser diluída antes da utilização. Em tais modalidades, um tampão de diluição adequado também pode ser incluído. Novamente, um ou mais dos componentes identificados em um método estabelecido neste relatório descritivo podem ser incluídos em um kit da presente divulgação.[000129] In particular embodiments, a kit may include a polymerase enzyme capable of catalyzing the incorporation of the modified nucleotides into a polynucleotide. Other components to be included in such kits may include plugs and the like. The dye-labeled modified nucleotides in accordance with the present disclosure and other nucleotide components, including mixtures of different nucleotides, may be provided in the kit in a concentrated form to be diluted before use. In such embodiments, a suitable dilution buffer may also be included. Again, one or more of the components identified in a method set forth in this specification may be included in a kit of the present disclosure.

Métodos de SequenciamentoSequencing Methods

[000130] Os nucleotídeos (ou nucleosídeos) modificados compreendendo um composto corante de acordo com a presente divulgação podem ser usados em qualquer método de análise, tal como um método que inclui a detecção de um marcador fluorescente ligado a um nucleotídeo ou nucleosídeo, por si só, incorporado a, ou associado com uma estrutura molecular maior ou conjugada. Nesse contexto, o termo "incorporado a um polinucleotídeo" pode significar que o fosfato 5' é unido na ligação fosfodiéster ao grupo hidroxila 3' de um segundo nucleotídeo (modificado ou não modificado), que pode ele próprio fazer parte de uma cadeia polinucleotídica mais longa. A extremidade 3' de um nucleotídeo modificado apresentado aqui pode ou não ser unida na ligação fosfodiéster ao fosfato 5' de um outro nucleotídeo (modificado ou não modificado). Assim, em uma concretização não limitativa, a presente invenção fornece um método para detectar um nucleotídeo modificado incorporado em um polinucleotídeo que compreende: (a) incorporar pelo menos um nucleotídeo modificado da presente divulgação em um polinucleotídeo e (b) detectar o(s) nucleotídeo(s) modificado(s) incorporado(s) ao polinucleotídeo através da detecção do sinal fluorescente do composto corante ligado aos referidos nucleotídeos modificados.[000130] The modified nucleotides (or nucleosides) comprising a dye compound according to the present disclosure can be used in any method of analysis, such as a method that includes detecting a fluorescent label linked to a nucleotide or nucleoside, per se. alone, incorporated into, or associated with a larger or conjugated molecular structure. In this context, the term "incorporated into a polynucleotide" may mean that the 5' phosphate is joined in the phosphodiester linkage to the 3' hydroxyl group of a second nucleotide (modified or unmodified), which may itself form part of a longer polynucleotide chain. long. The 3' end of a modified nucleotide presented here may or may not be joined in the phosphodiester bond to the 5' phosphate of another nucleotide (modified or unmodified). Thus, in a non-limiting embodiment, the present invention provides a method for detecting a modified nucleotide incorporated into a polynucleotide comprising: (a) incorporating at least one modified nucleotide of the present disclosure into a polynucleotide and (b) detecting the modified nucleotide(s) incorporated into the polynucleotide by detecting the fluorescent signal of the dye compound linked to said modified nucleotides.

[000131] Este método pode incluir: uma etapa sintética (a), na qual um ou mais nucleotídeos modificados de acordo com a presente divulgação são incorporados em um polinucleotídeo e uma etapa de detecção (b), na qual um ou mais nucleotídeos modificados incorporados no polinucleotídeo são detectados, através de detecção ou medição quantitativamente de suas fluorescências.[000131] This method may include: a synthetic step (a), in which one or more nucleotides modified in accordance with the present disclosure are incorporated into a polynucleotide and a detection step (b), in which one or more modified nucleotides incorporated in the polynucleotide are detected, through detection or quantitative measurement of their fluorescence.

[000132] Algumas concretizações do presente pedido são direcionadas a métodos de sequenciamento, incluindo: (a) incorporar pelo menos um nucleotídeo marcado conforme aqui descrito em um polinucleotídeo; e (b) detectar o(s) nucleotídeo(s) marcado(s) incorporado(s) no polinucleotídeo, através de detecção do sinal fluorescente do novo corante fluorescente ligado ao(s) nucleotídeo(s) modificado(s).[000132] Some embodiments of the present application are directed to sequencing methods, including: (a) incorporating at least one labeled nucleotide as described herein into a polynucleotide; and (b) detecting the labeled nucleotide(s) incorporated into the polynucleotide, by detecting the fluorescent signal of the new fluorescent dye bound to the modified nucleotide(s).

[000133] Em uma modalidade, pelo menos um nucleotídeo modificado é incorporado em um polinucleotídeo na etapa sintética pela ação de uma enzima polimerase. No entanto, podem ser utilizados outros métodos para unir nucleotídeos modificados a polinucleotídeos, tais como, por exemplo, síntese química de oligonucleotídeos ou ligação de oligonucleotídeos marcados à oligonucleotídeos não marcados. Portanto, o termo "incorporando", quando usado em referência a um nucleotídeo e polinucleotídeo, pode abranger a síntese de polinucleotídeos por métodos químicos, bem como métodos enzimáticos.[000133] In one embodiment, at least one modified nucleotide is incorporated into a polynucleotide in the synthetic step by the action of a polymerase enzyme. However, other methods can be used to join modified nucleotides to polynucleotides, such as, for example, chemical synthesis of oligonucleotides or ligation of labeled oligonucleotides to unlabeled oligonucleotides. Therefore, the term "incorporating", when used in reference to a nucleotide and polynucleotide, can encompass the synthesis of polynucleotides by chemical methods as well as enzymatic methods.

[000134] Em uma concretização específica, uma etapa sintética é realizada e pode opcionalmente compreender a incubação de uma fita polinucleotídica modelo com uma mistura reacional compreendendo nucleotídeos modificados marcados com fluorescência da presente divulgação. Uma polimerase também pode ser fornecida sob condições que permitem a formação de uma ligação fosfodiéster entre um grupo hidroxila 3' livre em uma fita polinucleotídica anelada a fita polinucleotídica modelo e um grupo fosfato 5' no nucleotídeo modificado. Assim, uma etapa sintética pode incluir a formação de uma fita polinucleotídica, conforme dirigido pelo emparelhamento de bases complementar de nucleotídeos com uma fita modelo.[000134] In a specific embodiment, a synthetic step is performed and may optionally comprise incubating a model polynucleotide strand with a reaction mixture comprising fluorescently labeled modified nucleotides of the present disclosure. A polymerase can also be provided under conditions that allow the formation of a phosphodiester bond between a free 3' hydroxyl group on a polynucleotide strand annealed to the template polynucleotide strand and a 5' phosphate group on the modified nucleotide. Thus, a synthetic step may include the formation of a polynucleotide strand, as directed by complementary base pairing of nucleotides with a template strand.

[000135] Em todas as concretizações dos métodos, a etapa de detecção pode ser realizada enquanto a fita polinucleotídica na qual os nucleotídeos marcados são incorporados é anelada em uma fita modelo, ou após uma etapa de desnaturação na qual as duas fitas estão separadas. Etapas adicionais, por exemplo, etapas de reação química ou enzimática ou etapas de purificação, podem ser incluídas entre a etapa sintética e a etapa de detecção. Em particular, a fita alvo que incorpora o(s) nucleotídeo(s) marcado(s) pode ser isolada ou purificada e depois adicionalmente processada ou usada em uma análise subsequente. A título de exemplo, os polinucleotídeos alvo marcados com nucleotídeo(s) modificado(s) conforme aqui descrito em uma etapa sintética podem ser subsequentemente usados como sondas ou iniciadores marcados. Em outras modalidades, o produto da etapa sintética aqui apresentada pode estar sujeito a outras etapas da reação e, se desejado, o produto dessas etapas subsequentes é purificado ou isolado.[000135] In all embodiments of the methods, the detection step can be carried out while the polynucleotide strand into which the labeled nucleotides are incorporated is annealed into a template strand, or after a denaturation step in which the two strands are separated. Additional steps, for example, chemical or enzymatic reaction steps or purification steps, may be included between the synthetic step and the detection step. In particular, the target strand incorporating the labeled nucleotide(s) can be isolated or purified and then further processed or used in a subsequent analysis. By way of example, target polynucleotides labeled with modified nucleotide(s) as described herein in a synthetic step can subsequently be used as labeled probes or primers. In other embodiments, the product of the synthetic step presented herein may be subjected to other reaction steps and, if desired, the product of these subsequent steps is purified or isolated.

[000136] As condições adequadas para a etapa sintética serão bem conhecidas dos familiarizados com as técnicas convencionais de biologia molecular. Em uma modalidade, uma etapa sintética pode ser análoga a uma reação de extensão do iniciador padrão usando precursores de nucleotídeos, incluindo nucleotídeos modificados, tal como descrito aqui, para formar uma fita alvo estendida complementar à fita modelo na presença de uma enzima polimerase adequada. Em outras modalidades, a etapa sintética pode ela própria fazer parte de uma reação de amplificação produzindo um produto de amplificação de fita dupla marcada, o qual é composto por fitas complementares emparelhadas derivadas da cópia das fitas de polinucleotídeo alvo e modelo. Outras etapas sintéticas exemplificativas incluem tradução, polimerização por deslocamento de cadeia, marcação aleatória de DNA, etc. Uma enzima polimerase particularmente útil para uma etapa sintética é aquela que é capaz de catalisar a incorporação de nucleotídeos modificados, tal como aqui estabelecido. Pode ser utilizada uma variedade de polimerases de ocorrência natural ou modificadas. A título de exemplo, uma polimerase termoestável pode ser usada para uma reação sintética que é realizada usando condições de termociclagem, enquanto uma polimerase termoestável pode não ser desejada para reações de extensão isotérmica do iniciador. Polimerases termoestáveis adequadas que são capazes de incorporar os nucleotídeos modificados de acordo com a presente divulgação incluem aquelas descritas nos documentos WO 2005/024010 ou WO06120433, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Em reações sintéticas realizadas com temperaturas mais baixas, tal como 37°C, as enzimas polimerase não precisam necessariamente ser polimerases termoestáveis; portanto, a escolha da polimerase dependerá de vários fatores, tais como temperatura da reação, pH, atividade de deslocamento de cadeia e semelhantes.[000136] The appropriate conditions for the synthetic step will be well known to those familiar with conventional molecular biology techniques. In one embodiment, a synthetic step may be analogous to a standard primer extension reaction using nucleotide precursors, including modified nucleotides, as described herein, to form an extended target strand complementary to the template strand in the presence of a suitable polymerase enzyme. In other embodiments, the synthetic step may itself be part of an amplification reaction producing a labeled double-stranded amplification product, which is composed of paired complementary strands derived from copying the target and template polynucleotide strands. Other exemplary synthetic steps include translation, strand displacement polymerization, random DNA labeling, etc. A particularly useful polymerase enzyme for a synthetic step is one that is capable of catalyzing the incorporation of modified nucleotides, as set forth herein. A variety of naturally occurring or modified polymerases can be used. By way of example, a thermostable polymerase may be used for a synthetic reaction that is carried out using thermocycling conditions, while a thermostable polymerase may not be desired for isothermal primer extension reactions. Suitable thermostable polymerases that are capable of incorporating the modified nucleotides in accordance with the present disclosure include those described in WO 2005/024010 or WO06120433, each of which is incorporated herein by reference. In synthetic reactions carried out at lower temperatures, such as 37°C, polymerase enzymes do not necessarily need to be thermostable polymerases; therefore, the choice of polymerase will depend on several factors, such as reaction temperature, pH, strand displacement activity, and the like.

[000137] Em concretizações específicas não limitativas, a presente divulgação abrange métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos, re-sequenciamento, sequenciamento de genoma inteiro, pontuação de polimorfismo de nucleotídeo único, qualquer outra aplicação envolvendo a detecção de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado com corantes aqui estabelecidos quando incorporados em um polinucleotídeo. Qualquer uma de várias outras aplicações que beneficiam o uso de polinucleotídeos marcados com os nucleotídeos modificados compreendendo corantes fluorescentes pode usar nucleotídeos ou nucleosídeos modificados com os corantes aqui apresentados.[000137] In specific non-limiting embodiments, the present disclosure covers methods of nucleic acid sequencing, re-sequencing, whole genome sequencing, single nucleotide polymorphism scoring, any other application involving the detection of dye-labeled modified nucleotide or nucleoside established here when incorporated into a polynucleotide. Any of various other applications that benefit from the use of polynucleotides labeled with the modified nucleotides comprising fluorescent dyes can use nucleotides or nucleosides modified with the dyes disclosed herein.

[000138] Em uma concretização específica, a presente divulgação fornece o uso de nucleotídeos modificados compreendendo compostos corantes de acordo com a presente divulgação em uma reação de sequenciamento por síntese de polinucleotídeo. A sequência por síntese geralmente envolve a adição sequencial de um ou mais nucleotídeos ou oligonucleotídeos a uma cadeia polinucleotídica crescente na direção 5' a 3' usando uma polimerase ou ligase para formar uma cadeia polinucleotídica estendida complementar ao ácido nucleico modelo a ser sequenciado. A identidade da base presente em um ou mais nucleotídeos adicionados pode ser determinada em uma etapa de detecção ou "de imagem". A identidade da base adicionada pode ser determinada após cada etapa de incorporação de nucleotídeos. A sequência do modelo pode então ser inferida usando regras convencionais de emparelhamento de bases de Watson-Crick. O uso dos nucleotídeos modificados marcados com corantes aqui apresentados para determinação da identidade de uma única base pode ser útil, por exemplo, na classificação de polimorfismos de nucleotídeo único, e essas reações de extensão de base única estão dentro do escopo da presente invenção.[000138] In a specific embodiment, the present disclosure provides the use of modified nucleotides comprising dye compounds according to the present disclosure in a sequencing reaction by polynucleotide synthesis. Sequencing by synthesis generally involves the sequential addition of one or more nucleotides or oligonucleotides to a growing polynucleotide chain in the 5' to 3' direction using a polymerase or ligase to form an extended polynucleotide chain complementary to the template nucleic acid to be sequenced. The identity of the base present in one or more added nucleotides can be determined in a detection or "imaging" step. The identity of the added base can be determined after each nucleotide incorporation step. The template sequence can then be inferred using conventional Watson-Crick base pairing rules. The use of the dye-labeled modified nucleotides presented herein for determining the identity of a single base may be useful, for example, in classifying single nucleotide polymorphisms, and such single base extension reactions are within the scope of the present invention.

[000139] Em uma concretização da presente invenção, a sequência de um polinucleotídeo modelo é determinada pela detecção da incorporação de um ou mais nucleotídeos em uma fita nascente complementar ao polinucleotídeo modelo a ser sequenciado através da detecção de marcador(es) fluorescente(s) ligado(s) ao() nucleotídeo(s) incorporado(s). O sequenciamento do polinucleotídeo modelo pode ser iniciado com um iniciador adequado (ou preparado como uma construção harpin que conterá o iniciador como parte do harpin), e a cadeia nascente é estendida de maneira gradual pela adição de nucleotídeos na extremidade 3' do iniciador em uma reação catalisada por polimerase.[000139] In one embodiment of the present invention, the sequence of a template polynucleotide is determined by detecting the incorporation of one or more nucleotides into a nascent strand complementary to the template polynucleotide to be sequenced through the detection of fluorescent marker(s) linked to the incorporated nucleotide(s). Sequencing of the template polynucleotide can be initiated with a suitable primer (or prepared as a harpin construct that will contain the primer as part of the harpin), and the nascent chain is extended in a stepwise manner by adding nucleotides to the 3' end of the primer in a reaction catalyzed by polymerase.

[000140] Em concretizações particulares, cada um dos diferentes trifosfatos de nucleotídeos (A, T, G e C) pode ser marcado com um fluoróforo único e também compreende um grupo bloqueador na posição 3' para evitar uma polimerização descontrolada. Alternativamente, um dos quatro nucleotídeos pode não estar marcado (escuro). A enzima polimerase incorpora um nucleotídeo na cadeia nascente complementar ao polinucleotídeo modelo, e o grupo bloqueador impede a incorporação adicional de nucleotídeos. Quaisquer nucleotídeos não incorporados podem ser lavados e o sinal fluorescente de cada nucleotídeo incorporado pode ser "lido" opticamente por meios adequados, tal como um dispositivo de carga acoplada usando excitação a laser e filtros de emissão adequados. O grupo bloqueador 3' e os compostos corantes fluorescentes podem então ser removidos (desprotegidos) (simultaneamente ou sequencialmente) para expor a cadeia nascente para posterior incorporação de nucleotídeos. Tipicamente, a identidade do nucleotídeo incorporado será determinada após cada etapa de incorporação, mas isso não é estritamente essencial. Da mesma forma, a Patente Norte America No. 5.302.509 (que é aqui incorporada por referência) descreve um método para sequenciar polinucleotídeos imobilizados sobre um suporte sólido.[000140] In particular embodiments, each of the different nucleotide triphosphates (A, T, G and C) can be labeled with a unique fluorophore and also comprises a blocking group in the 3' position to prevent uncontrolled polymerization. Alternatively, one of the four nucleotides may be unlabeled (dark). The polymerase enzyme incorporates a nucleotide into the nascent chain complementary to the template polynucleotide, and the blocking group prevents additional nucleotide incorporation. Any unincorporated nucleotides can be washed away and the fluorescent signal from each incorporated nucleotide can be "read" optically by suitable means, such as a charge-coupled device using laser excitation and suitable emission filters. The 3' blocking group and fluorescent dye compounds can then be removed (deprotected) (simultaneously or sequentially) to expose the nascent chain for subsequent nucleotide incorporation. Typically, the identity of the incorporated nucleotide will be determined after each incorporation step, but this is not strictly essential. Likewise, North American Patent No. 5,302,509 (which is incorporated herein by reference) describes a method for sequencing polynucleotides immobilized on a solid support.

[000141] O método, tal como exemplificado antes, utiliza a incorporação de nucleotídeos A, G, C, e T fluorescentemente marcados e bloqueados em 3’ para uma cadeia em crescimento complementar para polinucleotídeo imobilizado, na presença de DNA polimerase. A polimerase incorpora uma base complementar ao polinucleotídeo alvo, mas é impedida de realizar outra adição pelo grupo bloqueador 3'. O marcador do nucleotídeo incorporado, em seguida, pode ser determinado, e o grupo de bloqueio removido por clivagem química para permitir a ocorrência da polimerização. O ácido nucleico modelo a ser sequenciado em uma reação de sequenciamento por síntese pode ser qualquer polinucleotídeo que se deseja sequenciar. O ácido nucleico modelo para uma reação de sequenciamento compreenderá tipicamente uma região de fita dupla tendo um grupo hidroxila 3' livre que serve como um iniciador ou ponto de iniciação para a adição de outros nucleotídeos na reação de sequenciamento. A região do modelo a ser sequenciado ultrapassará esse grupo hidroxila 3' livre na cadeia complementar. A região pendente do modelo a ser sequenciado pode ser de fita simples, mas pode ser de fita dupla, desde que um "nick esteja presente" na fita complementar à fita modelo a ser sequenciada para fornecer um grupo 3'OH livre para iniciação da reação de sequenciamento. Em tais modalidades, o sequenciamento pode prosseguir pelo deslocamento da fita. Em certas modalidades, um iniciador que possui grupo hidroxila livre 3' pode ser adicionado como um componente separado (por exemplo, um oligonucleotídeo curto) que hibridiza para uma região de cadeia simples do modelo a ser sequenciado. Alternativamente, o iniciador e a fita modelo a ser sequenciada podem cada um formar parte de uma fita de ácido nucleico parcialmente auto-complementar capaz de formar um duplex intra-molecular, tal como, por exemplo, uma estrutura de alça harpin. Polinucleotídeos em harpin e métodos pelos quais eles podem ser ligados a suportes sólidos são divulgados nas Publicações PCT Nos. WO0157248 e WO2005/047301, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Os nucleotídeos podem ser adicionados sucessivamente a um iniciador de crescimento, resultando na síntese de uma cadeia polinucleotídica na direção 5' para 3'. A natureza da base que foi adicionada pode ser particularmente determinada, mas não necessariamente após cada adição de nucleotídeo, fornecendo assim informações de sequência para o ácido nucleico modelo. Assim, um nucleotídeo é incorporado em uma fita de ácido nucleico (ou polinucleotídeo) pela união do nucleotídeo ao grupo hidroxila 3' livre da fita de ácido nucleico através da formação de uma ligação fosfodiéster com o grupo fosfato 5' do nucleotídeo.[000141] The method, as exemplified before, uses the incorporation of fluorescently labeled and 3'-blocked A, G, C, and T nucleotides into a growing chain complementary to the immobilized polynucleotide, in the presence of DNA polymerase. The polymerase incorporates a base complementary to the target polynucleotide, but is prevented from making further addition by the 3' blocking group. The incorporated nucleotide tag can then be determined, and the blocking group removed by chemical cleavage to allow polymerization to occur. The template nucleic acid to be sequenced in a sequencing by synthesis reaction can be any polynucleotide that is desired to be sequenced. The template nucleic acid for a sequencing reaction will typically comprise a double-stranded region having a free 3' hydroxyl group that serves as a primer or initiation point for the addition of other nucleotides in the sequencing reaction. The region of the template to be sequenced will surpass this free 3' hydroxyl group on the complementary chain. The dangling region of the template to be sequenced may be single-stranded, but may be double-stranded, as long as a "nick is present" on the strand complementary to the template strand to be sequenced to provide a free 3'OH group for initiation of the reaction. of sequencing. In such embodiments, sequencing may proceed by strand displacement. In certain embodiments, a primer having a free 3' hydroxyl group can be added as a separate component (e.g., a short oligonucleotide) that hybridizes to a single-stranded region of the template to be sequenced. Alternatively, the primer and template strand to be sequenced may each form part of a partially self-complementary nucleic acid strand capable of forming an intra-molecular duplex, such as, for example, a harpin loop structure. Harpin polynucleotides and methods by which they can be attached to solid supports are disclosed in PCT Publications Nos. WO0157248 and WO2005/047301, each of which is incorporated herein by reference. Nucleotides can be successively added to a growth primer, resulting in the synthesis of a polynucleotide chain in the 5' to 3' direction. The nature of the base that has been added can be determined particularly, but not necessarily after each nucleotide addition, thereby providing sequence information for the template nucleic acid. Thus, a nucleotide is incorporated into a nucleic acid strand (or polynucleotide) by joining the nucleotide to the free 3' hydroxyl group of the nucleic acid strand through the formation of a phosphodiester bond with the 5' phosphate group of the nucleotide.

[000142] O ácido nucleico modelo a ser sequenciado pode ser DNA ou RNA, ou mesmo uma molécula híbrida composta por desoxinucleotídeos e ribonucleotídeos. O ácido nucleico modelo pode compreender nucleotídeos de ocorrência natural e/ou não natural e ligações de cadeias principais naturais ou não naturais, desde que estes não impeçam a cópia do modelo na reação de sequenciamento.[000142] The model nucleic acid to be sequenced can be DNA or RNA, or even a hybrid molecule composed of deoxynucleotides and ribonucleotides. The template nucleic acid may comprise naturally occurring and/or non-naturally occurring nucleotides and natural or non-natural backbone linkages, provided that these do not prevent copying of the template in the sequencing reaction.

[000143] Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo a ser sequenciado pode ser ligado a um suporte sólido através de qualquer método de ligação adequado conhecido na arte, por exemplo, através de ligação covalente. Em certas modalidades, os polinucleotídeos modelo podem ser ligados diretamente a um suporte sólido (por exemplo, um suporte à base de sílica). No entanto, em outras concretizações da presente divulgação, a superfície do suporte sólido pode ser modificada de alguma forma, de modo a permitir que qualquer ligação covalente direta dos polinucleotídeos modelo, ou para imobilizar os polinucleotídeos modelo através de um hidrogel ou polielectrólito de múltiplas camadas, o qual pode ser fixado de forma não covalente ao suporte sólido.[000143] In certain embodiments, the model nucleic acid to be sequenced can be linked to a solid support through any suitable linking method known in the art, for example, through covalent linkage. In certain embodiments, the template polynucleotides can be linked directly to a solid support (e.g., a silica-based support). However, in other embodiments of the present disclosure, the surface of the solid support may be modified in some way so as to permit any direct covalent bonding of the template polynucleotides, or to immobilize the template polynucleotides via a multilayer hydrogel or polyelectrolyte. , which can be fixed non-covalently to the solid support.

[000144] Os arranjos em que os polinucleotídeos foram diretamente ligados a suportes à base de sílica são aqueles, por exemplo, descritos no documento WO00006770 (aqui incorporada por referência), em que os polinucleotídeos são imobilizados sobre um suporte de vidro, por reação entre um grupo pendente epóxido sobre o vidro com um grupo amino interno no polinucleotídeo. Além disso, os polinucleotídeos podem ser ligados a um suporte sólido por uma reação de um nucleófilo à base de enxofre com o suporte sólido, por exemplo, tal como descrito no documento W02005/047301 (aqui incorporado por referência). Outro exemplo adicional de polinucleotídeo modelo com suporte sólido é o local em que os polinucleotídeos modelo estão ligados ao hidrogel suportado em suportes à base de sílica ou outros suportes sólidos, por exemplo, conforme descrito nos documentos W000/31148, W001/01143, W002/12566, W003/014392, Patente Norte Americana No. 6.465.178 e W000/53812, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.[000144] The arrangements in which the polynucleotides were directly linked to silica-based supports are those, for example, described in document WO00006770 (incorporated here by reference), in which the polynucleotides are immobilized on a glass support, by reaction between an epoxide pendant group on the glass with an internal amino group on the polynucleotide. Furthermore, polynucleotides can be attached to a solid support by a reaction of a sulfur-based nucleophile with the solid support, for example, as described in W02005/047301 (incorporated herein by reference). Another additional example of a solid-supported model polynucleotide is where the model polynucleotides are attached to the hydrogel supported on silica-based supports or other solid supports, for example, as described in W000/31148, W001/01143, W002/ 12566, W003/014392, U.S. Patent No. 6,465,178 and W000/53812, each of which is incorporated herein by reference.

[000145] Uma superfície particular na qual os polinucleotídeos modelo podem ser imobilizados é um hidrogel de poliacrilamida. Os hidrogéis de poliacrilamida são descritos nas referências citadas acima e no documento WO2005/065814, que é aqui incorporado por referência. Os hidrogéis específicos que podem ser utilizados incluem os descritos nos documentos WO 2005/065814 e Publicação Norte Americana No. 2014/0079923. Em uma modalidade, o hidrogel é PAZAM (poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co- acrilamida)).[000145] A particular surface on which model polynucleotides can be immobilized is a polyacrylamide hydrogel. Polyacrylamide hydrogels are described in the references cited above and in WO2005/065814, which is incorporated herein by reference. Specific hydrogels that can be used include those described in WO 2005/065814 and North American Publication No. 2014/0079923. In one embodiment, the hydrogel is PAZAM (poly(N-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide)).

[000146] As moléculas modelo de DNA podem ser ligadas a esferas ou micropartículas, por exemplo, tal como descrito na Patente Norte Americana No. 6.172.218 (que é aqui incorporado por referência). A ligação a esferas ou micropartículas pode ser útil para aplicações de sequenciamento. As bibliotecas de esferas podem ser preparadas onde cada esfera contém diferentes sequências de DNA. Bibliotecas e métodos exemplares para sua criação são descritos em Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), cada um dos quais é incorporado aqui por referência. O sequenciamento de arranjos de tais esferas usando nucleotídeos aqui apresentados está dentro do escopo da presente divulgação.[000146] DNA template molecules can be attached to beads or microparticles, for example, as described in U.S. Patent No. 6,172,218 (which is incorporated herein by reference). Binding to beads or microparticles could be useful for sequencing applications. Bead libraries can be prepared where each bead contains different DNA sequences. Exemplary libraries and methods for their creation are described in Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005), each of which is incorporated herein by reference. Sequencing arrays of such beads using nucleotides presented herein is within the scope of the present disclosure.

[000147] Os modelos a serem sequenciados podem fazer parte de um "arranjo" em um suporte sólido; nesse caso, o arranjo pode assumir qualquer forma conveniente. Assim, o método da presente divulgação é aplicável a todos os tipos de arranjos de alta densidade, incluindo arranjos de molécula única, arranjos aglomerados, e arranjos de esferas. Nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação podem ser utilizados para modelos de sequenciamento de essencialmente qualquer tipo de arranjo, incluindo, mas não limitados a aqueles que são formados por imobilização de moléculas de ácidos nucleicos sobre um suporte sólido.[000147] The models to be sequenced can be part of an "array" on a solid support; in which case the arrangement may take any convenient form. Thus, the method of the present disclosure is applicable to all types of high-density arrays, including single-molecule arrays, clustered arrays, and sphere arrays. Modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure can be used for sequencing templates of essentially any type of array, including, but not limited to, those that are formed by immobilizing nucleic acid molecules on a solid support.

[000148] No entanto, os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação são particularmente vantajosos no contexto de sequenciamento de arranjos agrupados. Em arranjos agrupados, regiões distintas no arranjo (muitas vezes referidas como sítios ou características) compreendem várias moléculas polinucleotídicas modelo. Geralmente, as múltiplas moléculas de polinucleotídeo não são individualmente resolvíveis por meios ópticos e, em vez disso, são detectadas como um conjunto. Dependendo de como o arranjo é formado, cada sítio do arranjo pode compreender várias cópias de uma molécula de polinucleotídeo individual (por exemplo, o sítio é homogêneo para uma determinada espécie de ácido nucleico de fita simples ou dupla) ou até várias cópias de um pequeno número de diferentes moléculas polinucleotídicas (por exemplo, cópias múltiplas de duas espécies diferentes de ácidos nucleicos). Arranjos agrupados de moléculas de ácido nucleico podem ser produzidos usando técnicas geralmente conhecidas do estado da técnica. A título de exemplo, os documentos WO 98/44151 e WO00/18957, cada um dos quais é aqui incorporado, descrevem métodos de amplificação de ácidos nucleicos, em que tanto o modelo quanto os produtos de amplificação permanecem imobilizados sobre um suporte sólido, com o intuito de formar arranjos compostos de clusters ou "colônias" de moléculas de ácido nucleico imobilizados. As moléculas de ácido nucleico presentes nos arranjos agrupados preparados de acordo com esses métodos são modelos adequados para sequenciamento usando os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação.[000148] However, modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure are particularly advantageous in the context of clustered array sequencing. In clustered arrays, distinct regions in the array (often referred to as sites or features) comprise several template polynucleotide molecules. Generally, multiple polynucleotide molecules are not individually resolvable by optical means and are instead detected as an assembly. Depending on how the array is formed, each site in the array may comprise multiple copies of an individual polynucleotide molecule (e.g., the site is homogeneous for a particular single- or double-stranded nucleic acid species) or even multiple copies of a small number of different polynucleotide molecules (e.g., multiple copies of two different species of nucleic acids). Clustered arrays of nucleic acid molecules can be produced using techniques generally known in the art. By way of example, WO 98/44151 and WO00/18957, each of which is incorporated herein, describe methods of amplification of nucleic acids, in which both the template and the amplification products remain immobilized on a solid support, with the aim of forming arrangements composed of clusters or "colonies" of immobilized nucleic acid molecules. The nucleic acid molecules present in the pooled arrays prepared in accordance with these methods are suitable templates for sequencing using the modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure.

[000149] Os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação também são úteis no sequenciamento de modelos em arranjos de moléculas únicas. O termo "arranjo de molécula única" ou "SMA", conforme usado aqui, refere-se a uma população de moléculas de polinucleotídeos, distribuídas (ou dispostas) sobre um suporte sólido, em que o espaçamento de qualquer polinucleotídeo individual de todos os outros da população é tal que possível resolver individualmente as moléculas polinucleotídicas individuais. As moléculas de ácidos nucleicos alvo imobilizadas sobre a superfície do suporte sólido podem, assim, ser capazes de ser resolvidas por meios ópticos em algumas modalidades. Isto significa que um ou mais sinais distintos, cada um representando um polinucleotídeo, ocorrerão dentro da área resolvível do dispositivo de imagem usado.[000149] The modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure are also useful in sequencing templates in single-molecule arrays. The term "single molecule array" or "SMA", as used herein, refers to a population of polynucleotide molecules, distributed (or arranged) on a solid support, in which the spacing of any individual polynucleotide from all others of the population is such that it is possible to resolve individual polynucleotide molecules individually. Target nucleic acid molecules immobilized on the surface of the solid support may thus be capable of being resolved by optical means in some embodiments. This means that one or more distinct signals, each representing a polynucleotide, will occur within the resolvable area of the imaging device used.

[000150] A detecção de molécula única pode ser alcançada onde o espaçamento entre moléculas de polinucleotídeo adjacentes em um arranjo é de pelo menos 100 nm, mais particularmente pelo menos 250 nm, ainda mais particularmente pelo menos 300 nm, ainda mais particularmente pelo menos 350 nm. Assim, cada molécula é individualmente resolvível e detectável como um único ponto fluorescente de molécula, e a fluorescência a partir do referido único ponto fluorescente de molécula também exibe fotodegradação em uma única etapa.[000150] Single molecule detection can be achieved where the spacing between adjacent polynucleotide molecules in an array is at least 100 nm, more particularly at least 250 nm, even more particularly at least 300 nm, even more particularly at least 350 nm. Thus, each molecule is individually resolvable and detectable as a single molecule fluorescent spot, and fluorescence from said single molecule fluorescent spot also exhibits single-step photobleaching.

[000151] Os termos "individualmente resolvido" e "resolução individual" são aqui usados para especificar que, quando visualizado, é possível distinguir uma molécula no arranjo a partir de suas moléculas vizinhas. A separação entre moléculas individuais no arranjo será determinada, em parte, pela técnica específica usada para resolver as moléculas individuais. As características gerais dos arranjos de moléculas únicas serão entendidas por referência aos pedidos publicados WO00/06770 e WO 01/57248, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Embora um uso dos nucleotídeos modificados da presente divulgação seja em reações de sequenciamento por síntese, a utilidade dos nucleotídeos modificados não está limitada a esses métodos. De fato, os nucleotídeos podem ser utilizados vantajosamente em qualquer metodologia de sequenciamento que exija a detecção de marcadores fluorescentes ligados a nucleotídeos incorporados em um polinucleotídeo.[000151] The terms "individually resolved" and "individual resolution" are used here to specify that, when viewed, it is possible to distinguish a molecule in the array from its neighboring molecules. The separation between individual molecules in the array will be determined, in part, by the specific technique used to resolve the individual molecules. The general characteristics of single molecule arrays will be understood by reference to published applications WO00/06770 and WO 01/57248, each of which is incorporated herein by reference. Although one use of the modified nucleotides of the present disclosure is in synthetic sequencing reactions, the utility of the modified nucleotides is not limited to these methods. In fact, nucleotides can be used advantageously in any sequencing methodology that requires the detection of fluorescent markers linked to nucleotides incorporated into a polynucleotide.

[000152] Em particular, os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação podem ser utilizados em protocolos de sequenciamento fluorescente automatizados, particularmente sequenciamento de ciclo terminador de corante fluorescente com base no método de sequenciamento de terminação de cadeia de Sanger. Tais métodos geralmente utilizam enzimas e sequenciamento cíclico para incorporar didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência em uma reação de sequenciamento de extensão do iniciador. Os então chamados métodos de sequenciamento de Sanger, e relacionados com os protocolos (tipo Sanger), utilizam a terminação aleatória da cadeia com didesoxinucleotídeos marcados.[000152] In particular, the modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure can be used in automated fluorescent sequencing protocols, particularly fluorescent dye terminator cycle sequencing based on the Sanger chain termination sequencing method. Such methods typically utilize enzymes and cyclic sequencing to incorporate fluorescently labeled dideoxynucleotides into a primer extension sequencing reaction. The so-called Sanger sequencing methods, and related protocols (Sanger type), use random chain termination with labeled dideoxynucleotides.

[000153] Assim, a presente divulgação também abrange nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes que são didesoxinucleotídeos sem grupos hidroxila nas posições 3' e 2', sendo esses didesoxinucleotídeos modificados adequados para uso nos métodos de sequenciamento do tipo Sanger e similares.[000153] Thus, the present disclosure also covers modified nucleotides labeled with dye compounds that are dideoxynucleotides without hydroxyl groups in the 3' and 2' positions, these modified dideoxynucleotides being suitable for use in Sanger-type sequencing methods and the like.

[000154] Os nucleotídeos modificados marcados com compostos corantes da presente divulgação que incorporam grupos bloqueadores 3', conforme será reconhecido, também podem ser úteis nos métodos de Sanger e nos protocolos relacionados, uma vez que o mesmo efeito obtido pelo uso de nucleotídeos didesoxi modificados pode ser alcançado usando nucleotídeos modificados tendo grupos bloqueadores 3'-OH: ambos impedem a incorporação de nucleotídeos subsequentes. Nos casos em que os nucleotídeos de acordo com a presente divulgação e um grupo de bloqueio 3' devem ser utilizados nos métodos de sequenciamento do tipo Sanger, será apreciado que os compostos corantes ou marcadores detectáveis ligados aos nucleotídeos não precisam ser conectados por meio de ligantes cliváveis, uma vez que, em cada caso, um nucleotídeo marcado da divulgação é incorporado; nenhum nucleotídeo precisa ser subsequentemente incorporado e, portanto, o marcador não precisa ser removido a partir do nucleotídeo.[000154] Modified nucleotides labeled with dye compounds of the present disclosure that incorporate 3' blocking groups, as will be recognized, may also be useful in Sanger methods and related protocols, since the same effect obtained by the use of modified dideoxy nucleotides can be achieved using modified nucleotides having 3'-OH blocking groups: both prevent the incorporation of subsequent nucleotides. In cases where nucleotides according to the present disclosure and a 3' blocking group are to be used in Sanger-type sequencing methods, it will be appreciated that dye compounds or detectable markers attached to the nucleotides need not be attached via linkers. cleavable, since in each case a labeled nucleotide of the disclosure is incorporated; no nucleotide needs to be subsequently incorporated and therefore the tag does not need to be removed from the nucleotide.

EXEMPLOSEXAMPLES

[000155] Concretizações adicionais são divulgadas com mais detalhes nos exemplos a seguir, os quais não têm a intenção de limitar o escopo das reivindicações.[000155] Additional embodiments are disclosed in more detail in the following examples, which are not intended to limit the scope of the claims.

[000156] Concretizações adicionais são divulgadas de forma mais detalhada nos exemplos a seguir, os quais não têm a intenção de limitar o escopo das reivindicações. A Tabela 2 resume as propriedades espectrais dos novos corantes fluorescentes de cumarina divulgados nos exemplos. A Tabela 3 resume a estrutura e as propriedades espectrais de vários nucleotídeos marcados com novos corantes aqui divulgados. Exemplo 1-1-1: 7-(5-Carboxipentil)amino-3- (benzotiazol-2-il)cumarina [000156] Additional embodiments are disclosed in more detail in the following examples, which are not intended to limit the scope of the claims. Table 2 summarizes the spectral properties of the new coumarin fluorescent dyes disclosed in the examples. Table 3 summarizes the structure and spectral properties of several nucleotides labeled with new dyes disclosed herein. Example 1-1-1: 7-(5-Carboxypentyl)amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin

[000157] Derivado de 3-(benzotiazol-2-il)-7-fluoro- cumarina (FC-1, 0,4 g, 1.345 mmol, 1 eqv) e ácido 6-amino- hexanóico (AC-C5, 0,25 g, 1,906 mmol, 1,417 eqv) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 3 mL). Após a adição estar completa, a mistura foi agitada por alguns minutos à temperatura ambiente e, em seguida, N,N- diisopropil-N-etilamina (DIPEA, 0,25 g, 2 mmol, 2 eqv) foi adicionada a esta mistura. A mistura reacional foi agitada durante 3 horas a 120°C. Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a mistura reacional semissólida de coloração amarela foi diluída com água (5 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento 0,36 g (65,5%). MS (DUIS): MW calculado 408,47. m/z encontrado: (+) 409 (M+1)+; (-), 407 (M-1)-. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12,03 (m, 2H), 9,00 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,73 (dd, J = 8,8, 2,1 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 3,18 (q, J = 6,5 Hz, 2H), 2,23 (t, J = 7,3 Hz, 2H)), 1,57 (dp, J = 14,7, 7,2 Hz, 4H), 1,39 (dq, J = 9,2, 4,5, 3,5 Hz, 2H). Exemplo 1-1-2: 7-(5-carboxipentil)amino-3- (benzimidazol-2-il)cumarina [000157] Derivative of 3-(benzothiazol-2-yl)-7-fluorocoumarin (FC-1, 0.4 g, 1,345 mmol, 1 eqv) and 6-aminohexanoic acid (AC-C5, 0. 25 g, 1.906 mmol, 1.417 eqv) was added to anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO, 3 mL). After the addition was complete, the mixture was stirred for a few minutes at room temperature and then N,N-diisopropyl-N-ethylamine (DIPEA, 0.25 g, 2 mmol, 2 eqv) was added to this mixture. The reaction mixture was stirred for 3 hours at 120°C. After standing at room temperature for 1 hour, the yellow-colored semisolid reaction mixture was diluted with water (5 mL) and stirred overnight. The resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 0.36 g (65.5%). MS (DUIS): calculated MW 408.47. m/z found: (+) 409 (M+1)+; (-), 407 (M-1)-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.03 (m, 2H), 9.00 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.99 ( d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.73 (dd, J = 8.8, 2.1 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3, 18 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 7.3 Hz, 2H)), 1.57 (dp, J = 14.7, 7.2 Hz, 4H) , 1.39 (dq, J = 9.2, 4.5, 3.5 Hz, 2H). Example 1-1-2: 7-(5-carboxypentyl)amino-3-(benzimidazol-2-yl)coumarin

[000158] 3-(benzimidazol-2-il)-7-fluoro-cumarina (FC- 2, 0,28 g, 1 mmol, 1 eqv) e o ácido 6-amino-hexanóico (AC- C5, 0,13 g, 1 mmol, 1 eqv) foram adicionado a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 2 mL). A mistura resultante foi agitada durante alguns minutos à temperatura ambiente e depois foi adicionado DIPEA (0,25 g, 2 mmol, 2 eqv). A mistura reacional foi agitada durante 4 horas à temperatura de 130°C. Porções adicionais de ácido 6-amino-hexanóico (CA-1, 0,13 g, 1 mmol, 1 equiv) e DIPEA (0,26 g, 2 mmol, 2 eq) foram adicionadas à mistura reacional e o aquecimento foi continuado a 130°C durante 5 horas. Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a mistura reacional amarelo pálido foi diluída com água (5 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento 0,26 g (68,5%). A pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 391,15. m/z encontrado: (+) 392 (M+1)+; (-) 390 (M-1)-, 781 (2M-1)-. Exemplo 1-1-3: 7-(2-carboxietil)amino-3-(benzotiazol- 2-il)cumarina Etapa (A)[000158] 3-(benzimidazol-2-yl)-7-fluoro-coumarin (FC- 2, 0.28 g, 1 mmol, 1 eqv) and 6-aminohexanoic acid (AC- C5, 0.13 g, 1 mmol, 1 eqv) were added to anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO, 2 mL). The resulting mixture was stirred for a few minutes at room temperature and then DIPEA (0.25 g, 2 mmol, 2 eqv) was added. The reaction mixture was stirred for 4 hours at 130°C. Additional portions of 6-aminohexanoic acid (CA-1, 0.13 g, 1 mmol, 1 equiv) and DIPEA (0.26 g, 2 mmol, 2 eq) were added to the reaction mixture and heating was continued at 130°C for 5 hours. After standing at room temperature for 1 hour, the pale yellow reaction mixture was diluted with water (5 mL) and stirred overnight. The resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 0.26 g (68.5%). The purity, structure and composition of the product were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): calculated MW 391.15. m/z found: (+) 392 (M+1)+; (-) 390 (M-1)-, 781 (2M-1)-. Example 1-1-3: 7-(2-carboxyethyl)amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin Step (A)

[000159] 7-[2-(t-butiloxicarbonil)etil]amino-3- (benzotiazol-2-il)cumarina. Fórm. Molecular: C8H19N [000159] 7-[2-(t-butyloxycarbonyl)ethyl]amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin. Form. Molecular: C8H19N

[000160] 3-(benzotiazol-2-il)-7-fluoro-cumarina (FC- 1, 0,3 g, 1,01 mmol, 1 eqv) e cloridrato de 3- aminopropionato-t-butila (AC-C2, 0,2 g, 1,1 mmol, 1,09 eqv) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 2 mL) e a mistura resultante foi agitada durante alguns minutos à temperatura ambiente e depois foi adicionado DIPEA (0,26 g, 2 mmol, 2 eqv). A mistura resultante foi agitada durante 2 horas a 100°C. Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a mistura de reação amarela foi diluída com água (7 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento 0,38 g (69%). MS (DUIS): MW calculado 422,13. m/z encontrado: (+) 423 (M+1)+; (-), 421 (M-1)-. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9,28 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,27-8,16 (m, 1H), 8,10 (tt, J = 8,3, 0,9 Hz, 2H), 8,05 - 7,92 (m, 1H), 7,72 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,66 - 7,55 (m, 1H), 7,51 (dddd, J = 11,4, 8,2, 7,1, 1,3 Hz, 2H), 7,46 - 7,32 (m, 2H), 6,74 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,41 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,55 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). Etapa (B) [000160] 3-(benzothiazol-2-yl)-7-fluoro-coumarin (FC-1, 0.3 g, 1.01 mmol, 1 eqv) and 3-aminopropionate-t-butyl hydrochloride (AC-C2 , 0.2 g, 1.1 mmol, 1.09 eqv) was added to anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO, 2 mL) and the resulting mixture was stirred for a few minutes at room temperature and then DIPEA (0.26 g, 2 mmol, 2 eqv). The resulting mixture was stirred for 2 hours at 100°C. After standing at room temperature for 1 hour, the yellow reaction mixture was diluted with water (7 mL) and stirred overnight. The resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 0.38 g (69%). MS (DUIS): calculated MW 422.13. m/z found: (+) 423 (M+1)+; (-), 421 (M-1)-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.28 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.27-8.16 (m, 1H), 8.10 (tt, J = 8.3, 0.9 Hz, 2H), 8.05 - 7.92 (m, 1H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.66 - 7.55 ( m, 1H), 7.51 (dddd, J = 11.4, 8.2, 7.1, 1.3 Hz, 2H), 7.46 - 7.32 (m, 2H), 6.74 ( dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.41 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 2, 55 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H). Step (B)

[000161] Uma solução de 7-[2-(t- butiloxicarbonil)etil]amino-3-(benzotiazol-2-il)cumarina (I-1-3tBu, 0,2 g, 0,473 mmol) em diclorometano anidro (20 mL) foi tratada com ácido trifluoroacético (0,5 mL) e a mistura resultante foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. Os solventes foram removidos por destilação e o resíduo foi triturado com água (10 mL). O precipitado resultante foi coletado através de filtragem por sucção. Rendimento 0,15 g (86%). Pureza, estrutura e composição foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 366,39. m/z encontrado: (+) 367 (M+1)+; (-), 365 (M-1)-. 7-(3-Carboxipropil)amino-3- (benzotiazol-2-il)cumarina Etapa (A)[000161] A solution of 7-[2-(t-butyloxycarbonyl)ethyl]amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin (I-1-3tBu, 0.2 g, 0.473 mmol) in anhydrous dichloromethane (20 mL) was treated with trifluoroacetic acid (0.5 mL) and the resulting mixture was stirred for 24 hours at room temperature. The solvents were removed by distillation and the residue was triturated with water (10 ml). The resulting precipitate was collected through suction filtration. Yield 0.15 g (86%). Purity, structure and composition were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): Calculated MW 366.39. m/z found: (+) 367 (M+1)+; (-), 365 (M-1)-. 7-(3-Carboxypropyl)amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin Step (A)

[000162] 7-[3-(t-butiloxicarbonil)propil]amino-3- (benzotiazol-2-il)cumarina. [000162] 7-[3-(t-butyloxycarbonyl)propyl]amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin.

[000163] 3-(benzotiazol-2-il)-7-fluoro-cumarina (FC- 1, 0,6 g, 2,02 mmol, 1 eqv) e cloridrato de 4- aminobutanoato-t-butila (AC-C3, 0,5 g, 2,56 mmol, 1,27 eqv) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL). Após a adição estar completa, a mistura foi agitada durante alguns minutos à temperatura ambiente e depois foi adicionado DIPEA (0,65 g, 5 mmol, 4 eqv). A mistura reacional foi agitada durante 3 horas à temperatura de 100°C. Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a mistura reacional semissólida amarela foi diluída com água (10 ml) e foi deixada agitando durante a noite. O precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento 0,7 g (79%). Pureza, estrutura e composição foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 436,53. m/z encontrado: (+) 437 (M+1)+; (-), 435 (M-1)-. Etapa (B) [000163] 3-(benzothiazol-2-yl)-7-fluoro-coumarin (FC-1, 0.6 g, 2.02 mmol, 1 eqv) and 4-aminobutanoate-t-butyl hydrochloride (AC-C3 , 0.5 g, 2.56 mmol, 1.27 eqv) was added to anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO, 5 mL). After the addition was complete, the mixture was stirred for a few minutes at room temperature and then DIPEA (0.65 g, 5 mmol, 4 eqv) was added. The reaction mixture was stirred for 3 hours at 100°C. After standing at room temperature for 1 hour, the yellow semi-solid reaction mixture was diluted with water (10 ml) and left stirring overnight. The resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 0.7 g (79%). Purity, structure and composition were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): calculated MW 436.53. m/z found: (+) 437 (M+1)+; (-), 435 (M-1)-. Step (B)

[000164] Uma solução de 7-[3-(t- butiloxicarbonil)propil]amino-3-(benzotiazol-2-il)cumarina (I-1-4tBu, 0,7 g, 1,604 mmol) em diclorometano anidro (25 mL) foi tratada com ácido trifluoroacético (1 mL) e a mistura reacional foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. Os solventes foram removidos por destilação e o resíduo foi triturado com água (10 mL). O precipitado resultante foi coletado através de filtragem por sucção. Rendimento 0,59 g (97%). Pureza, estrutura e composição foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 366,39. m/z encontrado: (+) 381 (M+1)+; (-), 379 (M-1)-. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12,17 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,12 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,48 - 7,30 (m, 2H), 6,73 (dd, J = 8,8, 2,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,21 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 2,36 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 1,80 (p, J = 7,3 Hz, 2H). Exemplo 1-1-5: 7-(5-carboxipentil)amino-3-(5-cloro- benzoxazol-2-il)cumarina [000164] A solution of 7-[3-(t-butyloxycarbonyl)propyl]amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin (I-1-4tBu, 0.7 g, 1.604 mmol) in anhydrous dichloromethane (25 mL) was treated with trifluoroacetic acid (1 mL) and the reaction mixture was stirred for 24 hours at room temperature. The solvents were removed by distillation and the residue was triturated with water (10 ml). The resulting precipitate was collected through suction filtration. Yield 0.59 g (97%). Purity, structure and composition were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): Calculated MW 366.39. m/z found: (+) 381 (M+1)+; (-), 379 (M-1)-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.17 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.99 ( d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 - 7.30 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 8 .8, 2.1 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.21 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.36 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.80 (p, J = 7.3 Hz, 2H). Example 1-1-5: 7-(5-carboxypentyl)amino-3-(5-chlorobenzoxazol-2-yl)coumarin

[000165] 3-(5-cloro-benzoxazol-2-il)-7-fluoro- cumarina (FC-3, 0,32 g, 1 mmol, 1 eqv) e ácido 6-amino- hexanóico (AC-C5, 0,26 g, 2 mmol, 2 eqv) foram adicionados a dimetilsulfóxido anidro (DMSO, 5 mL) em um fraco de fundo redondo. Após a adição estar completa, a mistura foi agitada durante alguns minutos à temperatura ambiente e depois foi adicionado DIPEA (0,52 g, 4 mmol, 2 eqv). A mistura reacional foi agitada durante 7 horas à temperatura de 135°C. Porções adicionais de ácido 6-amino-hexanóico (CA-1, 0,13 g, 1 mmol, 1 equiv) e DIPEA (0,26 g, 2 mmol, 2 eq) foram adicionados e o aquecimento foi continuado a 135°C durante 5 horas. Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a mistura reacional de coloração amarelo pálido foi diluída com água (15 mL) e agitada durante a noite. O precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento de 0,09 g (21%). A pureza, estrutura e composição do produto foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 426,10. m/z encontrado: (+) 427 (M+1)+; (-) 425 (M-1)-, 851 (2M-1)-. Exemplo 2: Ácido 7-(5-carboxipentil)amino-3- (benzotiazol-2-il)cumarina-6-sulfônico (2A) e ácido 7-(5- carboxipentil)amino-3-(benzotiazol-2-il)cumarina-8- sulfónico (2B) [000165] 3-(5-chloro-benzoxazol-2-yl)-7-fluorocoumarin (FC-3, 0.32 g, 1 mmol, 1 eqv) and 6-aminohexanoic acid (AC-C5, 0.26 g, 2 mmol, 2 eqv) was added to anhydrous dimethylsulfoxide (DMSO, 5 mL) in a round-bottomed flask. After the addition was complete, the mixture was stirred for a few minutes at room temperature and then DIPEA (0.52 g, 4 mmol, 2 eqv) was added. The reaction mixture was stirred for 7 hours at 135°C. Additional portions of 6-aminohexanoic acid (CA-1, 0.13 g, 1 mmol, 1 equiv) and DIPEA (0.26 g, 2 mmol, 2 eq) were added and heating was continued at 135°C. for 5 hours. After standing at room temperature for 1 hour, the pale yellow reaction mixture was diluted with water (15 mL) and stirred overnight. The resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 0.09 g (21%). The purity, structure and composition of the product were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): calculated MW 426.10. m/z found: (+) 427 (M+1)+; (-) 425 (M-1)-, 851 (2M-1)-. Example 2: 7-(5-carboxypentyl)amino-3-(benzothiazol-2-yl)coumarin-6-sulfonic acid (2A) and 7-(5-carboxypentyl)amino-3-(benzothiazol-2-yl) acid coumarin-8- sulfonic acid (2B)

[000166] O composto I-1-1 (0,1 g, 0,245 mmol) foi adicionado em pequenas porções com agitação a ácido sulfúrico fumegante a 20% (1 mL) que foi arrefecida em um banho de seco de gelo/acetona. Após a adição estar completa, a mistura foi agitada durante 1 hora a 0°C, aquecida até à temperatura ambiente, e, em seguida, agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução foi vertida em éter anidro (25 mL). Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, o precipitado resultante foi recolhido através de filtragem por sucção. Rendimento de 78 mg (65%). 1H RMN (DMSO-d6) mostrou composto 2A, mais uma pequena quantidade (~4%) de composto 2B. Exemplo 2A, sal de sódio: O precipitado da parte superior foi novamente suspenso em água (2 mL) e o pH da suspensão foi ajustado para ~5 pela adição de solução de NaOH 5 M. A mistura resultante foi vertida em 10 m L de metanol e a suspensão foi filtrada. O filtrado foi evaporado até à secura para originar o corante como sal de sódio (I-2A-Na). Pureza, estrutura e composição foram confirmadas por HPLC, RMN e LCMS. MS (DUIS): MW calculado 488,07. m/z encontrado: (+) 489 (M+1)+; (-) 243 (M-1)2-, 487 (M-1)-.[000166] Compound I-1-1 (0.1 g, 0.245 mmol) was added in small portions with stirring to 20% fuming sulfuric acid (1 mL) which was cooled in a dry ice/acetone bath. After the addition was complete, the mixture was stirred for 1 hour at 0°C, warmed to room temperature, and then stirred for 2 hours at room temperature. The solution was poured into anhydrous ether (25 mL). After standing at room temperature for 1 hour, the resulting precipitate was collected by suction filtration. Yield 78 mg (65%). 1H NMR (DMSO-d6) showed compound 2A, plus a small amount (~4%) of compound 2B. Example 2A, sodium salt: The upper precipitate was resuspended in water (2 mL) and the pH of the suspension was adjusted to ~5 by the addition of 5 M NaOH solution. The resulting mixture was poured into 10 mL of methanol and the suspension was filtered. The filtrate was evaporated to dryness to give the dye as sodium salt (I-2A-Na). Purity, structure and composition were confirmed by HPLC, NMR and LCMS. MS (DUIS): calculated MW 488.07. m/z found: (+) 489 (M+1)+; (-) 243 (M-1)2-, 487 (M-1)-.

[000167] Preparação de sais de trietilamônio de 2A e 2B: O composto I-1-1 (0,41 g, 1 mmol) foi adicionado em pequenas porções com agitação a ácido sulfúrico fumegante a 20% (5 mL) que foi resfriado em um banho de gelo seco / acetona. Após a adição estar completa, a mistura foi agitada durante 1 hora a 0°C, aquecida até à temperatura ambiente, e, em seguida, agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução foi vertida em éter anidro (50 mL). Depois de repousar à temperatura ambiente durante 1 hora, a camada de solvente orgânico é decantada e a camada inferior semi-sólida foi dissolvida em acetonitrila- água (1:1, 10 mL). O pH da solução foi ajustado para ~ 7,0 pela adição de solução de TEAB 2 M em água. A solução resultante foi filtrada através de um filtro de nylon de 20 μm e os isômeros foram separados por HPLC preparativa. A solução dos isômeros foi concentrada sob vácuo e depois re- dissolvida em água (20 μL) e o solvente foi removido sob vácuo até a secura para originar os corantes como sais de trietilamônio. A pureza e a composição foram confirmadas por HPLC e LCMS. Exemplo 3: Sal de trietilamônio 7-(5- carboxipentil)amino-3-[5-sulfonato(benzotiazol-2-il)- cumarina-6-sulfonato [000167] Preparation of triethylammonium salts of 2A and 2B: Compound I-1-1 (0.41 g, 1 mmol) was added in small portions with stirring to 20% fuming sulfuric acid (5 mL) which was cooled in a dry ice/acetone bath. After the addition was complete, the mixture was stirred for 1 hour at 0°C, warmed to room temperature, and then stirred for 2 hours at room temperature. The solution was poured into anhydrous ether (50 mL). After standing at room temperature for 1 hour, the organic solvent layer is decanted and the lower semi-solid layer was dissolved in acetonitrile-water (1:1, 10 mL). The pH of the solution was adjusted to ~7.0 by adding 2 M TEAB solution in water. The resulting solution was filtered through a 20 μm nylon filter and the isomers were separated by preparative HPLC. The isomer solution was concentrated under vacuum and then re-dissolved in water (20 μL) and the solvent was removed under vacuum until dryness to give the dyes as triethylammonium salts. Purity and composition were confirmed by HPLC and LCMS. Example 3: Triethylammonium salt 7-(5-carboxypentyl)amino-3-[5-sulfonate(benzothiazol-2-yl)-coumarin-6-sulfonate

[000168] O composto I-1-1 (0,08 g, 0,2 mmol) foi adicionado em pequenas porções com agitação a ácido sulfúrico fumegante a 20% (2 mL), foi arrefecido em banho de gelo seco/acetona. Após a adição estar completa, a mistura foi agitada durante 1 hora a 0°C, aquecida até à temperatura ambiente, e, em seguida, agitada durante 2 horas a 70°C. A mistura foi então agitada durante a noite à temperatura ambiente. A solução foi vertida em éter anidro (30 mL). Após agitação à temperatura ambiente por 1 hora, o precipitado resultante foi coletado através de filtração por sucção. Rendimento 43 mg (38%).[000168] Compound I-1-1 (0.08 g, 0.2 mmol) was added in small portions with stirring to 20% fuming sulfuric acid (2 mL), cooled in a dry ice/acetone bath. After the addition was complete, the mixture was stirred for 1 hour at 0°C, warmed to room temperature, and then stirred for 2 hours at 70°C. The mixture was then stirred overnight at room temperature. The solution was poured into anhydrous ether (30 mL). After stirring at room temperature for 1 hour, the resulting precipitate was collected through suction filtration. Yield 43 mg (38%).

[000169] O precipitado foi novamente suspenso em água (2 mL) e o pH da suspensão foi ajustado para ~ 7,5 pela adição de solução de TEAB 2 M em água. A mistura resultante foi filtrada através de um filtro de Nylon de 20 μm e purificada por HPLC preparativa. A fração corante foi concentrada sob vácuo e depois redissolvida em água (20 μL) e o solvente foi removido sob vácuo até a secura para originar o corante como o sal bis-trietilamônio. A pureza e a composição foram confirmadas por HPLC e LCMS. MS (DUIS): MW Calculado 568,03. m/z encontrado: (+) 569 (M+1)+.[000169] The precipitate was resuspended in water (2 mL) and the pH of the suspension was adjusted to ~ 7.5 by adding 2 M TEAB solution in water. The resulting mixture was filtered through a 20 μm Nylon filter and purified by preparative HPLC. The dye fraction was concentrated under vacuum and then redissolved in water (20 μL) and the solvent was removed under vacuum until dryness to give the dye as the bis-triethylammonium salt. Purity and composition were confirmed by HPLC and LCMS. MS (DUIS): Calculated MW 568.03. m/z found: (+) 569 (M+1)+.

[000170] As intensidades de fluorescência de soluções exemplificativas de corante foram comparadas com um corante comercial para a mesma região espectral. Os resultados são mostrados na Tabela 2 e demonstram vantagens significativas dos corantes exemplificativos para aplicações analíticas baseadas em fluorescência. Tabela 2. Propriedades espectrais dos novos corantes fluorescentes revelados nos exemplos. * Excitação de fluorescência a 460 nm[000170] The fluorescence intensities of exemplary dye solutions were compared with a commercial dye for the same spectral region. The results are shown in Table 2 and demonstrate significant advantages of the exemplary dyes for fluorescence-based analytical applications. Table 2. Spectral properties of the new fluorescent dyes disclosed in the examples. * Fluorescence excitation at 460 nm

Exemplo 4: Procedimento geral conjugados de nucleotídeos totalmente corantes fluorescentsExample 4: General procedure for nucleotide conjugates of all-fluorescent dyes

[000171] Corantes fluorescentes de cumarina aqui divulgados foram acoplados com derivados de nucleotídeos citosina (C) (A-LN3-NH2) e adenina (A) (C-LN3-NH2) substituídos com amino apropriados: - após a ativação do grupo carboxílico de um corante com reagentes apropriados, de acordo com o seguinte esquema exemplificativo de adenina: [000171] Coumarin fluorescent dyes disclosed herein were coupled with appropriate amino-substituted cytosine (C) (A-LN3-NH2) and adenine (A) (C-LN3-NH2) nucleotide derivatives: - after activation of the carboxylic group of a dye with appropriate reagents, according to the following exemplary adenine scheme:

[000172] O produto geral para o acoplamento de adenina é como mostrado abaixo: - ffA-LN3-Corante refere-se a um nucleotídeo A totalmente funcionalizado com um ligante LN3 e marcado com um corante de cumarina aqui divulgado. O grupo R em cada uma das estruturas refere-se à porção de corante de cumarina após a conjugação.[000172] The general product for adenine coupling is as shown below: - ffA-LN3-Dye refers to an A nucleotide fully functionalized with an LN3 linker and labeled with a coumarin dye disclosed herein. The R group in each of the structures refers to the coumarin dye moiety after conjugation.

[000173] O corante (10 μmol) é seco colocando-o em um frasco de fundo redondo de 5 mL, e é dissolvido em dimetilformamida anidra (DMF, 1 mL) e o solvente é removido por destilação sob vácuo. Este procedimento é repetido duas vezes. O corante seco é dissolvido em N,N-dimetilacetamida anidra (DMA, 0,2 mL) à temperatura ambiente. É adicionado tetrafluoroborato O-(N-succinimidila)-N,N,N',N'- tetrametiluronio (TSTU, 1,5 eq., 15 μmol, 4,5 mg) à solução de corante, então DIPEA (3 eq. 30 μmol, 3,8 mg, 5,2 μL) é adicionada via micropipeta à esta solução. O frasco reacional é selado sob gás nitrogênio. O progresso da reação é monitorado por TLC (eluente Acetonitrile-Water 1:9) e HPLC. Entretanto, uma solução de derivado de nucleotídeo substituído com amino apropriado (A-NH LN3-NH2, 20 mM, 1,5 eq., 15 μmol, 0,75 ml) é concentrada sob vácuo, em seguida, redissolvida em água (20 mL). Uma solução do corante ativado em DMA é transferida para o frasco contendo a solução de N-LN3-NH2. Mais DIPEA (3 eq., 30 umol, 3.8 mg, 5,2 mL) é adicionada juntamente com trietilamina (1 μL). O progresso de acoplamento é monitorado a cada hora por TLC, HPLC, e LCMS. Quando a reação está completa, tampão de bicarbonato de trietilamina (TEAB, 0,05 M ~ 3 mL) é adicionado para a mistura da reação via pipeta. A purificação inicial do nucleotídeo totalmente funcionalizado é realizada executando a mistura de reação extinta através de uma coluna DEAE-Sephadex® para remover a maior parte do corante não reagido restante. Por exemplo, Sephadex é derramado em um cartucho Biotage vazio de 25 g, sistema solvente TEAB/MeCN. A solução a partir da coluna de Sephadex é concentrada em vácuo. O material restante é redissolvido no volume mínimo de água e acetonitrila antes da filtragem através de um filtro de nylon de 20 μm. A solução filtrada é purificada por HPLC preparativa. A composição dos compostos preparados foi confirmada por LCMS. Tabela 3. Propriedades estruturais e espectrais de vários nucleotídeos marcados com novos corantes à base de cumarina aqui divulgados. [000173] The dye (10 μmol) is dried by placing it in a 5 mL round-bottom flask, and is dissolved in anhydrous dimethylformamide (DMF, 1 mL) and the solvent is removed by vacuum distillation. This procedure is repeated twice. The dried dye is dissolved in anhydrous N,N-dimethylacetamide (DMA, 0.2 mL) at room temperature. O-(N-succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU, 1.5 eq., 15 μmol, 4.5 mg) is added to the dye solution, then DIPEA (3 eq. 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL) is added via micropipette to this solution. The reaction flask is sealed under nitrogen gas. The progress of the reaction is monitored by TLC (acetonitrile-Water eluent 1:9) and HPLC. Meanwhile, a solution of appropriate amino-substituted nucleotide derivative (A-NH LN3-NH2, 20 mM, 1.5 eq., 15 μmol, 0.75 ml) is concentrated under vacuum, then redissolved in water (20 mL). A solution of the activated dye in DMA is transferred to the vial containing the N-LN3-NH2 solution. More DIPEA (3 eq., 30 umol, 3.8 mg, 5.2 mL) is added along with triethylamine (1 μL). Coupling progress is monitored hourly by TLC, HPLC, and LCMS. When the reaction is complete, triethylamine bicarbonate buffer (TEAB, 0.05 M ~ 3 mL) is added to the reaction mixture via pipette. Initial purification of the fully functionalized nucleotide is performed by running the quenched reaction mixture through a DEAE-Sephadex® column to remove most of the remaining unreacted dye. For example, Sephadex is poured into an empty 25 g Biotage cartridge, TEAB/MeCN solvent system. The solution from the Sephadex column is concentrated in vacuum. The remaining material is redissolved in the minimum volume of water and acetonitrile before filtering through a 20 μm nylon filter. The filtered solution is purified by preparative HPLC. The composition of the prepared compounds was confirmed by LCMS. Table 3. Structural and spectral properties of various nucleotides labeled with new coumarin-based dyes disclosed herein.

[000174] Uma comparação de intensidades de fluorescência em solução de nucleotídeos marcados com corantes aqui divulgados com dados apropriados para os nucleotídeos marcados com um corante comercial para a mesma região espectral (Atto465 da AttoTec GmbH) demonstram a vantagem dos corantes aqui descritos para marcação de biomoléculas no que tange seu uso em aplicações analíticas baseadas em fluorescência.[000174] A comparison of fluorescence intensities in solution of nucleotides labeled with dyes disclosed herein with data appropriate for nucleotides labeled with a commercial dye for the same spectral region (Atto465 from AttoTec GmbH) demonstrates the advantage of the dyes described herein for labeling biomolecules regarding their use in fluorescence-based analytical applications.

Exemplo 5: Análise de SequenciamentoExample 5: Sequencing Analysis

[000175] Alguns ffA baseados em corantes aqui divulgados foram testados para sequenciamento (usando química de sequenciamento por síntese) e as imagens nas Figuras 1A, 1B e 1C demonstram sua utilidade. Os nucleotídeos A, C, G e T foram marcados da seguinte forma:[000175] Some dye-based ffA disclosed herein have been tested for sequencing (using sequencing-by-synthesis chemistry) and the images in Figures 1A, 1B and 1C demonstrate their usefulness. Nucleotides A, C, G and T were labeled as follows:

[000176] A: BL-NR550S0; C: NR440; G: Escuro; e T: AF550POPOS0. Instrumento: M615, Temperatura de varredura 22°C, Tempos de exposição: azul 500 ms, verde 500 ms; Célula de fluxo SFA. Os números entre parênteses nos gráficos abaixo indicam a proporção entre o novo ffA azul e o A verde (A-BL-NR550S0).[000176] A: BL-NR550S0; C: NR440; G: Dark; and T: AF550POPOS0. Instrument: M615, Scan temperature 22°C, Exposure times: blue 500 ms, green 500 ms; SFA flow cell. The numbers in parentheses in the graphs below indicate the ratio of the new blue ffA to the green A (A-BL-NR550S0).

Claims (23)

1. Composto caracterizado pelo fato de que é de Fórmula (I) ou um sal do mesmo: em que: - X é O, S, Se, ou NRn, em que Rn é H ou alquil-C1-C6; - R é H, halo, -CN, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril ou heteroaril; - R1 é H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N- amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril ou heteroaril; - R2 e R4 são cada um, independentemente, H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril ou heteroaril; - R3 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H or -SO3H, ou heterociclil, ou R3 está ligado a R2 ou R4 para formar um anel; - cada R5 é, independentemente, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril ou heteroaril; e - m é 0, 1, 2, 3 ou 4.1. Compound characterized by the fact that it is of Formula (I) or a salt thereof: where: - X is O, S, Se, or NRn, where Rn is H or C1-C6 alkyl; - R is H, halo, -CN, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl; - R1 is H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl; - R2 and R4 are each, independently, H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl; - R3 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H or -SO3H, or heterocyclyl, or R3 is linked to R2 or R4 to form a ring; - each R5 is, independently, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl , aryl or heteroaryl; and - m is 0, 1, 2, 3 or 4. 2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R é H, halo, -CO2H, amino, - OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril ou heteroaril.2. Compound according to claim 1, characterized by the fact that R is H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl , alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl or heteroaryl. 3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que R2 e R4 são cada um, independentemente, H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril, ou heteroaril; e nenhum de R2 e R4 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico.3. Compound according to claim 1 or 2, characterized by the fact that R2 and R4 are each, independently, H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl; and neither of R2 and R4 is bonded to R3 to form a heterocyclic ring. 4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que R2 é -SO3H; e/ou R4 é -SO3H.4. Compound according to claim 2, characterized by the fact that R2 is -SO3H; and/or R4 is -SO3H. 5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a) X é O ou S; ou b) X é NRn, em que Rn é H ou alquil C1-C6, em que opcionalmente - (a) R3 é H; ou (b) R3 é metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, sec-butil, terc-butil, pentil ou hexil; ou (c) R3 é etil, ou - em que R3 é alquil C2-C6 substituído, adicionalmente opcionalmente: a) em que R3 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H; ou b) em que R3 é -(CH2)nCOOH, onde n é 2, 3, 4, 5 ou 6; ou c) em que R3 é -(CH2)nSO3H, onde n é 2, 3, 4, 5 ou 6.5. Compound, according to any one of claims 1 to 4, characterized by the fact that a) X is O or S; or b) X is NRn, wherein Rn is H or C1-C6 alkyl, wherein optionally - (a) R3 is H; or (b) R3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl or hexyl; or (c) R3 is ethyl, or - wherein R3 is substituted C2-C6 alkyl, further optionally: a) wherein R3 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H; or b) wherein R3 is -(CH2)nCOOH, where n is 2, 3, 4, 5 or 6; or c) where R3 is -(CH2)nSO3H, where n is 2, 3, 4, 5 or 6. 6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de: - m é 0, 1 ou 2; - cada R5 é, independentemente, alquil C1-C6, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, ou -SO2NH2, opcionalmente em que cada R5 é halo, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2 ou alquil C1-C6, opcionalmente em que R5 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H, -SO3H ou -SO2NH2, opcionalmente em que R5 é -(CH2)xCOOH, onde x é 2, 3, 4, 5 ou 6.6. Compound according to any one of claims 1 to 5, characterized by the fact that at least one of: - m is 0, 1 or 2; - each R5 is independently C1-C6 alkyl, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, or -SO2NH2, optionally wherein each R5 is halo, -CN, -CO2H, -SO3H, - SO2NH2 or C1-C6 alkyl, optionally wherein R5 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H, -SO3H or -SO2NH2, optionally wherein R5 is -(CH2)xCOOH, where x is 2, 3, 4, 5 or 6 . 7. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que R5 é -SO3H ou -SO2NH2.7. Compound according to claim 4, characterized by the fact that R5 is -SO3H or -SO2NH2. 8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R1 é H, Cl, halo, ou alquil C1-C6.8. Compound according to any one of claims 1 to 6, characterized by the fact that R1 is H, Cl, halo, or C1-C6 alkyl. 9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R é H, Cl, halo, ou alquil C1-C6,.9. Compound according to any one of claims 1 to 8, characterized by the fact that R is H, Cl, halo, or C1-C6 alkyl. 10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que R é H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, - SO2NH2, alquil, alquenil, alquinil, alcoxi, aminoalquil, carbociclil, heterociclil, aril, ou heteroaril, opcionalmente em que R é H.10. Compound according to any one of claims 1 to 9, characterized by the fact that R is H, halo, -CO2H, amino, -OH, C-amido, N-amido, -NO2, -SO3H, -SO2NH2 , alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aminoalkyl, carbocyclyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, optionally wherein R is H. 11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que: a) R2 é H, alquil, alquil C1-C4 substituído com -CO2H ou -SO3H, ou -SO3H, opcionalmente em que R2 é H ou -SO3H; ou b) R2 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico, preferivelmente pirrolidina ou piperidina, substituído com um ou mais grupos alquil.11. Compound according to any one of claims 1 to 10, characterized by the fact that: a) R2 is H, alkyl, C1-C4 alkyl substituted with -CO2H or -SO3H, or -SO3H, optionally where R2 is H or -SO3H; or b) R2 is linked to R3 to form a heterocyclic ring, preferably pyrrolidine or piperidine, substituted with one or more alkyl groups. 12. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que R4 é H, alquil, alquil C1-C4 substituído com -CO2H ou -SO3H, ou - SO3H, ou em que R4 está ligado a R3 para formar um anel heterocíclico, preferivelmente pirrolidina ou piperidina, substituído com um ou mais grupos alquil.12. Compound according to any one of claims 1 to 11, characterized by the fact that R4 is H, alkyl, C1-C4 alkyl substituted with -CO2H or -SO3H, or - SO3H, or in which R4 is linked to R3 to form a heterocyclic ring, preferably pyrrolidine or piperidine, substituted with one or more alkyl groups. 13. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que X é O ou S; R é H; R1 é H; R3 é -(CH2)nCOOH onde n é 2, 3, 4, 5, ou 6; R5 é H, SO3H, ou - SO2NH2; R2 é H ou -SO3H; e R4 é H ou -SO3H, em que opcionalmente: a) R3 é -(CH2)2COOH; ou b) R3 é -(CH2)5COOH.13. Compound according to claim 1, characterized by the fact that X is O or S; R is H; R1 is H; R3 is -(CH2)nCOOH where n is 2, 3, 4, 5, or 6; R5 is H, SO3H, or - SO2NH2; R2 is H or -SO3H; and R4 is H or -SO3H, where optionally: a) R3 is -(CH2)2COOH; or b) R3 is -(CH2)5COOH. 14. Composto caracterizado pelo fato de que é de Fórmula (II) ou um sal do mesmo: em que: - X' é selecionado a partir de O, S, e NRp, onde Rp é H ou alquil C1-C6; - R6 é H ou alquil C1-C4; - R7 é H, halo, -CN, -OH, alquil C1-C4, alquenil C1-C4, alquinil C2-C4, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), - SO2N(alquil C1-C4)2, e alcoxi C1-C4; - R8 e R10 são, cada um, independentemente H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), - SO2N(alquil C1-C4)2, alquil C1-C6, alquenil C1-C6, alquinil C2C6 ou alcoxi C1-C6; - R9 é alquil C2-C6 substituído com -CO2H, -CO2-alquil C1-C4, -CONH2, -CONH(alquil C1-C4), -CON(alquil C1-C4)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), ou -SO2N(alquil C1-C4)2; - cada R11 é, independentemente, halo, -CN, carboxi, amino, -OH, C-amido, N-amido, nitro, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2, alquil, alquenil, alquinil, e alcoxi C1-C6; e - q é 0, 1 ou 2.14. Compound characterized by the fact that it is of Formula (II) or a salt thereof: where: - X' is selected from O, S, and NRp, where Rp is H or C1-C6 alkyl; - R6 is H or C1-C4 alkyl; - R7 is H, halo, -CN, -OH, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkenyl, C2-C4 alkynyl, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), - SO2N(alkyl C1-C4)2, and C1-C4 alkoxy; - R8 and R10 are each independently H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkenyl, C2C6 alkynyl or C1-C6 alkoxy; - R9 is C2-C6 alkyl substituted with -CO2H, -CO2-C1-C4 alkyl, -CONH2, -CONH(C1-C4 alkyl), -CON(C1-C4 alkyl)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2 , -SO2NH(C1-C4 alkyl), or -SO2N(C1-C4 alkyl)2; - each R11 is, independently, halo, -CN, carboxy, amino, -OH, C-amido, N-amido, nitro, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (C1-C4 alkyl), -SO2N (C1-alkyl- C4)2, alkyl, alkenyl, alkynyl, and C1-C6 alkoxy; e - q is 0, 1 or 2. 15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos: i) X' é O ou X' é S, ou em que X' é NRp, onde Rp é H ou alquil C1-C6; ii) em que R6 é H ou alquil C1-C4; iii) R7 é H, ou R7 é alquil C1-C4, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (alquil C1-C4), ou -SO2N(alquil C1-C4)2, opcionalmente em que R7 é alquil C1-C4 substituído com -CO2H; iv) em que R8 é H ou R8 é -CO2H, SO3H ou -SO2NH2; v) em que R10 é H ou é -CO2H, SO3H ou -SO2NH2; vi) em que (a) R8 é H e R10 é -SO3H; ou (b) R8 é -SO3H e R10 é H; vii) em que um dos R8 e R10 é H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1- C4)2, alquil C1-C6, alquenil C1-C6, alquinil C2-C6, ou alcoxi C1-C6, e o outro, R8 e R10, é tomado com R9 de modo a formar um anel heterocíclico de 4 a 7 membros, viii) em que R9 é alquil C2-C6 ou alquil C1-C6 substituído com -CO2H, -CO2-alquil C1-C4, -CONH2, -CONH(alquil C1-C4), - CON(alquil C1-C4)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4) ou - SO2N(alquil C1-C4)2, opcionalmente em que R9 é alquil C1C6 substituído com -CO2H, preferivelmente em que R9 é -(CH2)y- CO2H, onde y é 2, 3, 4, ou 5; ix) em que cada R11 é independentemente halo, -CO2H, - SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(alquil C1-C4), -SO2N(alquil C1-C4)2 ou alquil; x) em que q é 0, 1 ou 2.15. Compound according to claim 14, characterized by the fact that at least one of: i) X' is O or X' is S, or where X' is NRp, where Rp is H or C1-C6 alkyl ; ii) where R6 is H or C1-C4 alkyl; iii) R7 is H, or R7 is C1-C4 alkyl, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (C1-C4 alkyl), or -SO2N(C1-C4 alkyl)2, optionally where R7 is C1 alkyl -C4 replaced with -CO2H; iv) wherein R8 is H or R8 is -CO2H, SO3H or -SO2NH2; v) wherein R10 is H or is -CO2H, SO3H or -SO2NH2; vi) wherein (a) R8 is H and R10 is -SO3H; or (b) R8 is -SO3H and R10 is H; vii) wherein one of R8 and R10 is H, halo, -CN, -CO2H, amino, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH (C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2, C1-C6 alkyl, C1-C6 alkenyl, C2-C6 alkynyl, or C1-C6 alkoxy, and the other, R8 and R10, is taken with R9 so as to form a 4 to 7 membered heterocyclic ring, viii) wherein R9 is C2-C6 alkyl or C1-C6 alkyl substituted with -CO2H, -CO2-C1-C4 alkyl, -CONH2, -CONH(C1-C4 alkyl), - CON(C1-C4 alkyl)2, -CN, - SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl) or - SO2N(C1-C4 alkyl)2, optionally wherein R9 is C1C6 alkyl substituted with -CO2H, preferably wherein R9 is -(CH2)y- CO2H, where y is 2, 3, 4, or 5; ix) wherein each R11 is independently halo, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4 alkyl), -SO2N(C1-C4 alkyl)2 or alkyl; x) where q is 0, 1 or 2. 16. Composto, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo que consiste em: - e sais dos mesmos.16. Compound, characterized by the fact that it is selected from the group consisting of: - and you get out of them. 17. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto está ligado a um nucleotídeo ou oligonucleotídeo.17. Compound according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the compound is linked to a nucleotide or oligonucleotide. 18. Nucleotídeo ou oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de ser marcado com um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.18. Nucleotide or oligonucleotide characterized by the fact that it is labeled with a compound as defined in any one of claims 1 to 16. 19. Nucleotídeo ou oligonucleotídeo marcado, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que opcionalmente compreende pelo menos um dos: - em que o composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 está ligado por meio de R3 da Fórmula (I) ou R9 da Fórmula (II) adicionalmente compreende: - em que R3 da Fórmula (I) é - (CH2)nCOOH onde n é 2, 3, 4, 5, ou 6, ou R9 da Fórmula (II) é -(CH2)yCOOH, onde Y é 2, 3, 4, 5, ou 6, e a ligação forma uma amida utilizando o grupo -COOH; - em que o marcador está ligado à posição C5 de uma base de pirimidina ou à posição C7 de uma base de 7- deazapurina através de uma porção ligante; - adicionalmente compreende um grupo bloqueador 3'OH covalentemente ligado ao açúcar ribose ou desoxirribose do nucleotídeo.19. Labeled nucleotide or oligonucleotide according to claim 18, characterized in that it optionally comprises at least one of: - wherein the compound as defined in any one of claims 1 to 5 is linked through R3 of the Formula ( I) or R9 of Formula (II) further comprises: - wherein R3 of Formula (I) is - (CH2)nCOOH where n is 2, 3, 4, 5, or 6, or R9 of Formula (II) is - (CH2)yCOOH, where Y is 2, 3, 4, 5, or 6, and the bond forms an amide using the -COOH group; - wherein the label is linked to the C5 position of a pyrimidine base or the C7 position of a 7-deazapurine base via a linker moiety; - additionally comprises a 3'OH blocking group covalently linked to the ribose or deoxyribose sugar of the nucleotide. 20. Kit caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro nucleotídeo marcado conforme definido na reivindicação 19 e um segundo nucleotídeo marcado, em que opcionalmente: i) o segundo nucleotídeo marcado é marcado com um composto diferente em relação ao primeiro nucleotídeo marcado, ou não é marcado, em que opcionalmente a) o primeiro e o segundo nucleotídeos marcados são excitáveis usando um único comprimento de onda do laser e/ou, b) adicionalmente compreende um terceiro nucleotídeo e um quarto nucleotídeo, em que cada um dos segundo, terceiro, e quarto nucleotídeos é marcado com um composto diferente, ou não é marcado, em que cada marcador possui uma absorbância máxima distinta que é distinguível em relação aos outros marcadores; ii) em que o kit compreende quatro nucleotídeos, em que um primeiro nucleotídeo dos quatro nucleotídeos é um nucleotídeo marcado conforme definido na reivindicação 18 ou 19, um segundo nucleotídeo dos quatro nucleotídeos carrega um segundo marcador, um terceiro nucleotídeo carrega um terceiro marcador, e um quarto nucleotídeo não é marcado (escuro); ou iii) em que o kit compreende quatro nucleotídeos, em que um primeiro nucleotídeo dos quatro nucleotídeos é um nucleotídeo marcado conforme definido na reivindicação 18 ou 19, um segundo nucleotídeo dos quatro nucleotídeos carrega um segundo marcador, um terceiro nucleotídeo carrega uma mistura de dois marcadores, e um quarto nucleotídeo não é marcado (escuro).20. Kit characterized by the fact that it comprises a first labeled nucleotide as defined in claim 19 and a second labeled nucleotide, wherein optionally: i) the second labeled nucleotide is labeled with a different compound in relation to the first labeled nucleotide, or is not labeled, wherein a) the first and second labeled nucleotides are excitable using a single laser wavelength and/or, b) additionally comprises a third nucleotide and a fourth nucleotide, wherein each of the second, third, and fourth nucleotide is labeled with a different compound, or is unlabeled, with each label having a distinct maximum absorbance that is distinguishable from the other labels; ii) wherein the kit comprises four nucleotides, wherein a first nucleotide of the four nucleotides is a labeled nucleotide as defined in claim 18 or 19, a second nucleotide of the four nucleotides carries a second label, a third nucleotide carries a third label, and a fourth nucleotide is unmarked (dark); or iii) wherein the kit comprises four nucleotides, wherein a first nucleotide of the four nucleotides is a labeled nucleotide as defined in claim 18 or 19, a second nucleotide of the four nucleotides carries a second label, a third nucleotide carries a mixture of two markers, and a fourth nucleotide is unlabeled (dark). 21. Uso de um nucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, um oligonucleotídeo conforme definido na reivindicação 18 ou 19, ou um kit conforme definido na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser para sequenciamento, análise de expressão, análise de hibridação, análise genética, análise de RNA, ou ensaio de ligação de proteína.21. Use of a nucleotide as defined in any one of claims 1 to 17, an oligonucleotide as defined in claim 18 or 19, or a kit as defined in claim 20, characterized in that it is for sequencing, expression analysis, analysis of hybridization, genetic analysis, RNA analysis, or protein binding assay. 22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser para um instrumento de sequenciamento automatizado, em que o referido instrumento de sequenciamento automatizado compreende dois lasers que operam em diferentes comprimentos de onda.22. Use according to claim 21, characterized by the fact that it is for an automated sequencing instrument, wherein said automated sequencing instrument comprises two lasers operating at different wavelengths. 23. Método de sequenciamento caracterizado pelo fato de que compreende a incorporação de um nucleotídeo conforme definido na reivindicação 18 ou 19 em um ensaio de sequenciamento, em que opcionalmente adicionalmente compreende a detecção do nucleotídeo, em que opcionalmente o ensaio de sequenciamento é realizado em um instrumento de sequenciamento automatizado e em que o instrumento de sequenciamento automatizado compreende duas fontes de luz que operam em diferentes comprimentos de onda.23. Sequencing method characterized by the fact that it comprises incorporating a nucleotide as defined in claim 18 or 19 into a sequencing assay, wherein optionally further comprising detecting the nucleotide, wherein optionally the sequencing assay is performed in a automated sequencing instrument and wherein the automated sequencing instrument comprises two light sources operating at different wavelengths.