BR112019023210A2 - Método para determinação de membros da família s100 de proteínas de ligação ao cálcio por meio de imunoturbidimetria - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a um método de medição da presença de heterodímero de calprotectina (s100a8/a) em uma amostra biológica utilizando um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partícula (ietip) com base em anticorpos monoclonais. o método pode ser adaptado em analisadores automatizados padrão e proporciona uma medição clínica confiável de calprotectina em amostras e extratos fecais. o método é comparável com elisa tipo sanduíche de dois sítios. o método descrito combate aglutinação espontânea causada por íons de cálcio e proteínas s100 de ligação ao cálcio de baixo peso molecular conforme observado com imunoensaio turbidimétrico intensificado com partícula (ietip). o método pode ser usado para medição da presença de calprotectina humana em fezes, urina, soro, plasma, líquido sinovial e outros líquidos corporais. rastreabilidade metrológica e alta comutabilidade com imunoensaios convencionais (elisa) foram mostradas apesar de diferentes princípios de medição utilizados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE MEMBROS DA FAMÍLIA S100 DE PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO CÁLCIO POR MEIO DE IMUNOTURBIDIMETRIA.

CAMPO DA DESCRIÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um método turbidimétrico e um sistema de teste para determinação quantitativa de membros da família S100 de proteínas de ligação ao cálcio em fluidos corporais e fezes. O kit de teste compreende anticorpos, tampões e um kit de peças para uso no diagnóstico de doenças e condições inflamatórias agudas e crônicas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] O termo calprotectina abrange duas proteínas granulocíticas com pesos moleculares relativos de 36.500 Dáltons e pontos isoelétricos sob pH 6,3 e 6,5 (US 4.833.074; Fagerhol e outros, Scand. J. Haematol. 24, 393-398 (1980). Fagerhol e outros, Bull. Europ. Physiopath. Resp. 16 (supl.), 273-281 (1980). Nomes alternativos incluem proteínas de ligação ao cálcio S100A8 e S100A9 de baixo peso molecular, proteína 8 relacionada com mieloide (MRP8), proteína 14 relacionada com mieloide (MRP14), proteínas 8/14 relacionadas com fator inibitório de migração (MRP8-MRP14), S100a/b, calgranulina A/B, antígeno de fibrose cística (AFC), proteína leucocítica humana, complexo de proteína leucocítica L1, antígeno 60BB e antígeno 27E10. Calprotectina é um marcador comprovado para ativação de neutrófilos quando sua concentração em fluidos e matrizes corpóreas é indicativa para a rotatividade (turnover) de leucócitos e sua infiltração em tecidos. Tornando-se, portanto, um biomarcador amplamente utilizado em química clínica para infecções, distúrbios inflamatórios agudos e crônicos e outras doenças. A medição de calprotectina pode ser usada para distinguir infecções bacterianas a partir de outras causas, bem como,

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2/43 para diagnóstico de inflamação sistêmica não infecciosa (Striz, I & Trebichavsky, Calprotectina - uma molécula pleiotrópica na inflamação aguda e crônica, pesquisa fisiológica/Academ/a Scientiarum Bohemoslovaca (2004) 53(3): 245-53; Nilsen T. e outros, A new turbidimetric immunoassay for serum calprotectin for fully automatized clinical analysers, (Um novo imunoensaio turbidimétrico para calprotectina sérica de analisadores clínicos totalmente automatizados), Journal of Inflammation (2015) 12:45; Johne B. e outros, Functional and clinical aspects of the myelomonocyte protein calprotectin, (Aspectos funcionais e clínicos da calprotectina da Proteína de mielomonócitos), Mol. Pathol. 1997; 50:113-23; Nielsen T. e outros, Serum calprotectin levels in elderly males and females without bacterial or viral infections, (Níveis séricos de calprotectina em homens e mulheres idosos sem infecções bacterianas ou virais), Clin. Biochem. 2014; 47(12):1065-8). Propõe-se ainda calprotectina como um marcador do potencial para uma doença cardiovascular (DCV) antes do início dos sintomas de DCV em indivíduos sem sintomas (cf. EP 1 573 335 B1).

[003] A presença simultânea de diferentes, mono e multímeros de S100 além do heterodímero, entretanto, complica a determinação imunológica de calprotectina em amostras biológicas (sangue, soro, fluidos sinoviais, etc.) e matrizes (fezes). As propriedades de ligação a Ca²⁺ e Zn²⁺. das proteínas S100A8/A9 apresentam adicionalmente uma influência crucial em sua conformação e oligomerização. S100A8 e S100A9 tendem a formar tetrâmeros na presença de íons cálcio ou zinco, visto que o heterodímero parece ser a forma prevalente na ausência de cálcio (cf. Grabarek Z., Structural basis for diversity of the EF-hand calcium-binding proteins, (Base estrutural para diversidade das proteínas de ligação ao cálcio EF-hand), J. Mol. Biol. (2006), 359: 509-25). A mistura de S100A8 e S100A9 purificada não produz automaticamente uma calprotectina com propriedades como o heterodíme

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3/43 ro secretado por granulócitos. Experimentos com S100A8 e S100A9 mutantes sugerem que a homo e hetero-oligomerização de S100A8 e S100A9 também é funcional e diagnosticamente relevante.

[004] Calprotectina é expressa in vivo durante vários estágios de diferenciação de mieloide, em neutrófilos e monócitos circulantes, enquanto ausente em macrófagos e linfócitos normais do tecido e induzida (up-regulated) em muitos tipos de cânceres, incluindo, cânceres gástrico, esofágico, de cólon, pancreático, de bexiga, ovariano, da tireoide, mama e pele, distúrbios neurodegenerativos, bem como, em doenças e patologias inflamatórias e autoimunes. Condições inflamatórias crônicas, tal como psoríase, levam a uma expressão na epiderme. Calprotectina é encontrada em altas concentrações em sítios de inflamação, bem como, no soro (sangue) e nas fezes de pacientes com doenças inflamatórias, artrite reumatoide, fibrose cística, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, arterite de células gigantes, síndrome de Sjõgren, lúpus eritematoso sistêmico e esclerose sistêmica progressiva. A calprotectina também está envolvida na formação e deposição de amiloides no envelhecimento da próstata, conhecido como inclusões de corpos amiláceos (corpora amylacea).

[005] Numerosos papéis foram atribuídos à calprotectina. Esta pode induzir quimiotaxia de neutrófilos e aumentar atividade bactericida promovendo fagocitose e/ou uma desgranulação de neutrófilos por meio de um mecanismo dependente de MAPK (Simard J.C. e outros, Induction of neutrophil degranulation by S100A9 via a MAPKdependent mechanism (Indução de desgranulação de neutrófilos por S100A9 via um mecanismo dependente de MAPK), J. Leukoc Biol. (2010) 87(5):905-14). Atividades antimicrobianas, sequestrantes de oxidantes e indutoras de apoptose, bem como, atividades próinflamatórias (por exemplo, recrutamento de leucócitos) foram ainda atribuídas à calprotectina, a qual parece ser um amplificador de infla

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4/43 mação em autoimunidade, bem como, um estimulante de células imunes inatas através de sua ligação a receptores de reconhecimento padrão tais como receptor 4 semelhante a Toll (TLR4) e o receptor de produtos finais de glicação avançada (AGER). Outras atividades incluem a promoção de produção de citocinas e quimiocinas e regulação de adesão e migração de leucócitos. A ligação a TLR4 e AGER ativa as vias de sinalização quinase MAP e capa-B de NF, o que resulta na amplificação da cascata pró-inflamatória. As atividades antimicrobianas contra bactérias e fungos provavelmente resultam da ligação de íons de Zn²⁺ e Mn²⁺ que são essenciais para crescimento microbiano. Atividade da transnitrosilase também foi encontrada para calprotectina e o complexo da transnitrosilase ÍNOS-S100A8/A9 foi proposto para direcionar nitrosilação S dependente de estímulos inflamatórios seletivos de alvos compreendendo um motivo [IL]-x-C-x-x-[DE], Calprotectina pode adicionalmente agir como uma molécula de padrão molecular associado a alarmina ou de risco (DAMP).

[006] A medição verdadeira e precisa de calprotectina em amostras e matrizes biológicas é essencial para que os resultados sejam interpretados para fins de diagnóstico e assistência ao paciente, notavelmente, para monitorar o tratamento de distúrbios inflamatórios agudos e crônicos com produtos biológicos. Em particular, os resultados devem ser comparáveis se valores comuns de decisão diagnostica e achados de pesquisas clínicas fossem aplicados. O problema metrológico em vista dos estados variáveis de oligomerização de calprotectina pode ser dividido em rastreabilidade de valores medidos, incerteza de medição e comutabilidade. Quando a rastreabilidade não é alcançada, a comparabilidade dos resultados deve ser realizada por outros métodos, uma vez que as medições são a atividade principal de laboratórios clínicos. A meta é que os resultados dos pacientes sejam rastreáveis até a referência mais alta disponível para melhorar a qualidade de

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5/43 resultados diagnósticos.

[007] Métodos convencionais para medição de calprotectina utilizam anticorpos policlonais em forma livre ou ligados a uma fase sólida (cf. WO2012/175616, WO2013/132347, WO2014/037588,

US20170108507). A determinação paralela por meio de um imunoensaio (por exemplo, um ensaio imunoabsorvente enzimático - ELISA) ou de calprotectina purificada em soluções de amostra fortificada (spiked) usando UV/VIS, Biuret, Bradford ou Coomassie Blue, entretanto, não fornece respostas conclusivas para o problema padrão, uma vez que calprotectina pode tomar a forma de dímeros (S100A8/A9), tetrâmeros (S100A8/A9)2 ou mesmo oligômeros (T. Vogl e outros, Poster: Towards a Reference Material for the Standardization of Calprotectin (S100A8/Ag; MRP8/14) Immunoassay, apresentado em FOCUS (Association for Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine) (Associação de Bioquímica Clínica e Medicina Laboratorial), 3 a 5 de maio de 2017, Leeds, Reino Unido). O uso de proteínas S100A8 e S100A9 mutantes apresentando pelo menos uma mutação na região de ligação a cálcio de alta ou baixa afinidade foi sugerido, à medida em que essas proteínas recombinantes não podem mais oligomerizar-se (WO 2016/116881).

[008] Imunoensaios turbidimétricos proporcionam as vantagens de procedimentos fáceis e de um analisador automatizado. No imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas (IETIP), os anticorpos específicos ao alvo são ligados a partículas (partículas sensibilizadas), de tal modo que a reação de anticorpo-antígeno resulta em uma aglutinação de partículas que podem ser medidas por meio de espectrometria (cf. EP 0 061 857; EP1 205 755 B1; e suas referências). Um tipo de reagente particulado é suficiente quando o antígeno alvo é reconhecido por dois ou mais anticorpos, formando ponte entre duas ou mais partículas de látex (Methods in Enzymology (1981) 74,

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106-139, Academic Press, Nova Iorque; EP 1 739 430 B1; EP1 573 335 B1). Reações inespecíficas entre o reagente particulado e a amostra podem também levar a uma aglutinação e turbidez elevada (cf. JP 11 023 573 A, JP 58 144 748 A, EP 1 205 755 B1). Inibição segura e completa de reações inespecíficas representa, em particular, um problema se forem utilizados anticorpos policlonais ligados ao reagente particulado ou se o alvo for extraído de uma matriz complexa ou variegada tal como fezes (cf. EP 0 038 181 B1). Um padrão com calprotectina mutante (mutS100A8/A9) é de pouca utilidade quando se mede a presença de calprotectina endógena em matrizes e amostras humanas, por exemplo, aquela obtida a partir dos respectivos pacientes ou por um método de aglutinação. Atualmente, determina-se calprotectina em amostras biológicas empregando um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas (IETIP), em que os anticorpos policlonais imobilizados se ligam a múltiplos epítopos em calprotectina, de tal modo que qualquer tipo de proteína S100 possa levar à aglutinação, independentemente, de estar no estado de oligomerização secretado por granulócitos ou não. Isso causa valores de corte não diagnósticos, incerteza de medição e prejudica comutabilidade, em particular, quando antissoros policlonais demonstram produzir aglutinação inespecífica.

[009] A propagação observada na comparação do método entre um ELISA baseado em anticorpos monoclonais e um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas (IETIP) baseado em uma aglutinação empregando anticorpos policlonais, bem como, a não comutabilidade de valores de corte do diagnóstico são causas adicionais de preocupações. Embora os anticorpos monoclonais sejam mais fáceis de padronizar e permitir controle de qualidade para um padrão definido durante toda a vida útil do produto, existe o problema combinado de se obter uma reação de aglutinação, sensibilidade e especificidade da

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7/43 medição de calprotectina quando secretada por qranulócitos. O estado da técnica na determinação de calprotectina em amostras e matrizes biológicas representa, portanto, um problema.

[0010] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Uma solução desses problemas é obtida por um método in vitro conforme descrito na reivindicação 1. Modalidades preferidas do método são definidas nas reivindicações dependentes 1 a 14. Outro aspecto da invenção refere-se a um kit, por exemplo, para utilização em um imunoensaio turbidimétrico ou nefelométrico, kit este que compreende dois componentes de reação conforme definido na reivindicação 15.

[0012] Consequentemente, é um objetivo proporcionar um método in vitro de medição da presença de calprotectina em uma amostra biológica de um paciente, método este que compreende as etapas de: a) coletar uma quantidade predeterminada da amostra biológica; b) solubilizar e extrair a amostra biológica em uma quantidade predeterminada de tampão orgânico aquoso apresentando i) um pH entre 5,0 e 6,0, ii) uma osmolaridade de pelo menos 150 mosmol/kg de H2O, iii) 0,01 a 0,1% em peso de tensoativo aniônico, iv) em que as moléculas de tampão orgânico podem coordenar-se com íons de cálcio e zinco, e v) e, opcionalmente, homogeneizar e extrair a matriz da amostra biológica, seguido por uma remoção de qualquer material particulado para se obter uma solução de amostra com uma presença solubilizada definida de calprotectina (S100A8/A9) quando secretada por granulócitos (com compartimentos lisossômicos intactos); c) misturar uma quantidade definida da solução de amostra de etapa (b) com uma quantidade de reagente para se obter uma mistura compreendendo nanopartículas apresentando anticorpos monoclonais imobilizados ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a um de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9) e uma reação de anticorpo-antígeno ligado

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8/43 a partículas com calprotectina (S100A8/A9); d) incubar a mistura de etapa c) durante um intervalo de tempo; e e) adquirir uma propriedade óptica da mistura e determinar um sinal indicativo do teor de calprotectina (S100A8/A9) com base na propriedade óptica da mistura; f) relacionar o teor com um controle calibrado e avaliar a condição clínica do paciente com base na presença medida de calprotectina (S100A8/A9) na amostra biológica. Se a calprotectina for determinada como descrita acima, a quantidade será rastreável metrologicamente até uma medição de um padrão de calprotectina isolada de granulócitos com compartimentos lisossômicos intactos. Os métodos iniciais para determinação de calprotectina utilizaram anticorpos policlonais monoespecíficos, quando a estrutura, número e concentração das proteínas de ligação ao cálcio da família S100 variaram.

[0013] A etapa de adquirir uma propriedade óptica compreende determinar um valor de absorvância, transmitância, reflectância, dispersão de luz, fluorescência ou cintilação. Medições turbidimétricas ou nefelométricas são preferidas, e mais preferido, é um imunoensaio turbidimétrico intensificado por partículas (IETIP), em que as etapas b) e c) compreendem a utilização de dois componentes de reagentes.

[0014] As nanopartículas apresentam preferencialmente diâmetros de 150 a 350 nm para sensibilidade elevada. Mais preferido é um IETIP, em que os anticorpos são ligados a dois tipos de partículas apresentando diâmetros homogêneos na faixa de i) 150 a 200 nm e ii) de 250 a 350 nm de faixa de medição elevada. Tais nanopartículas podem ser produzidas de poliestireno carboxilado ou poliestireno ativado com clorometila.

[0015] A reação de anticorpo-antígeno ligado a partícula é preferencialmente realizada em uma mistura apresentando um pH entre 5,0 e 6,0 e compreendendo um tensoativo aniônico ou dodecilsulfato de sódio e moléculas de tampão coordenado Ca²⁺..

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[0016] A amostra biológica pode ser fezes ou, mais precisamente, um extrato de fezes quando a determinação de calprotectina fecal torna-se um componente integral do processamento laboratorial de doença inflamatória intestinal. O monitoramento de um parâmetro de inflamação nas fezes e de um marcador da atividade de granulócitos neutrofílicos, tal como calprotectina, facilita o reconhecimento precoce de um surto de doença recorrente após remissão estabelecida. Outras amostras biológicas preferidas são sangue, soro ou plasma e urina, por exemplo, para diagnóstico e diferenciação de doença renal pré e intrarrenal ou outras doenças inflamatórias do sistema cardiovascular. [0017] A composição tampão é preferencialmente composta de pelo menos um sal selecionado do grupo que compreende ácidos policarboxílicos, ácidos tricarboxílicos, ácidos aconíticos, ácidos tricarbalílicos, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adipínico, ácido pimelínico, ácidos alfa, beta e gama-hidroxicarboxílicos, ácidos hidroxidicarboxílicos, ácido málico, ácido cítrico, ácidos tartráticos, ácido malônico, ácido glicônico, ácido 5-cetoglicônico, ácido 2-cetoglicônico, ácido di-hidroximaleico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido nitrilotriacético, ácido lático e/ou ácido ascórbico. O tampão sequestrante de cálcio da etapa b) compreende preferencialmente pelo menos um sal de citrato, acetato ou maleato, soroalbumina tratada com protease e 0,01 a 0,1 por cento em peso de tensoativos aniônicos. A adição ou presença de antissoro de IgM inespecífico nos componentes da reação pode ser necessária para iniciação e aceleração da reação de aglutionatina.

[0018] É outro objetivo proporcionar um kit de teste para medição da presença de calprotectina em uma amostra biológica por meio de um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas conforme descrito. O kit de teste pode compreender:

um primeiro componente reagente compreendendo:

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- 20 a 1.000 mmol/L de tampão orgânico com urn pH na faixa de 5,0 a 6,0;

- 50 a 300 mmol/L de sal de sódio, potássio ou litio;

- 0,1 a 1,5% de soroalbumina tratada com protease;

- 0,01 a 0,1% (p/v) de dodecilsulfato de sódio, e opcionalmente, beta-aldoses, triose, tetroses, pentoses, hexoses, glucano, dextrano e/ou açúcar para se obter uma osmolaridade de, pelo menos 200 mmosM/L; e um segundo componente reagente compreendendo:

- 0,01 a 0,5% (p/v) de partículas de látex de 150 a 350 nm de diâmetro transportando anticorpos monoclonais imobilizados que se ligam a um de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9).

[0019] Os reagentes de tampão nesses componentes de reação para sequestrar íons cálcio e zinco podem compreender pelo menos um sal de um ácido orgânico selecionado do grupo que consiste de ácidos policarboxílicos, ácidos tricarboxílicos, ácidos aconíticos, ácidos tricarbalílicos, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adipínico, ácido pimelínico, ácidos alfa, beta e gama-hidroxicarboxílicos, ácidos hidroxidicarboxílicos, ácido málico, ácido cítrico, ácidos tartráticos, ácido malônico, ácido glicônico, ácido 5-cetoglicônico, ácido 2-cetoglicônico, ácido di-hidroximaleico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido nitrilotriacético, ácido lático, ácido ascórbico. Tais ácidos orgânicos podem coordenar-se em água com íons de cálcio e zinco, em particular, quando utilizados em combinação.

[0020] Embora não se deseja estar vinculado por qualquer teoria, o pH ácido de 5,0 e 6,0 e a coordenação do íon cálcio dos reagentes de tampão parecem criar condições específicas para a calprotectina quando presente em granulócitos neutrofílicos, cujas proteínas S100A8 e S100A9 apresentam um pKI de 6,3 e 6,5 e são fortemente

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11/43 ligadas ao cálcio por meio de ligação em ponte bidentada, unidentada e pseudodentada. A presença de uma pequena quantidade de tensoativo aniônico, tal como dodecilsulfato de sódio, pode ser necessária para manter as proteínas em solução, embora não inibindo a reação entre os anticorpos ligados com as partículas e o alvo. A composição tampão como reivindicada é em termos de pH e osmolaridade similar ao ambiente celular em que a calprotectina está presente nos granulócitos. Os granulócitos apresentam um pH interno entre 5,0 e 6,0 e uma concentração de íons cálcio de 100 a 1.000 vezes abaixo a do ambiente.

[0021] Um aspecto preferido da invenção consiste em um kit com dois componentes de reação que suportam uma determinação por meio de turbidimetria. Esse pode ser um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas (IETIP) compreendendo dois componentes reagentes em suporte de etapas b) e c). Uma modalidade mais preferida refere-se a uma determinação de calprotectina fecal juntamente com um dispositivo para transferência de uma quantidade definida de fezes para um tampão de diluição e extração de calprotectina a partir de uma matriz de fezes, por exemplo, conforme descrito em DE10 2012 109 457 B4, DE10 2008 057 866 B4 US 5.246.669 A, JPH10-300 642 A, DE10 2007 07 760 B3.

[0022] Objetivos, características e vantagens adicionais tomarão evidentes a partir de uma consideração das figuras e descrição subsequente de exemplos representativos que são apenas para ilustração e não se limitam, quando aquele versado no estado da técnica também considerará modificações potenciais desta. O escopo da invenção será definido nas reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] Nas figuras:

[0024] Figura 1 é um diagrama com uma curva de calibração de

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12/43 um imunoensaio turbidimétrico empregando um anticorpo monoclonal anticalprotectina de camundongo (S100 A8/A9) ligado covalentemente a partículas de látex apresentando um diâmetro de 180 nm;

[0025] Figura 2 mostra uma curva de calibração de um ensaio turbidimétrico com um anticorpo monoclonal de camundongo contra calprotectina e o limite prozona do imunoensaio;

[0026] Figura 3 é um gráfico que mostra a correlação do imunoensaio turbidimétrico empregando um anticorpo monoclonal e um ELISA convencional usando dois monoclonais como anticorpos de captura e detecção para determinação de calprotectina padrão a partir de granulócitos com compartimentos ácidos intactos;

[0027] Figura 4 é um gráfico que mostra a correlação do ensaio turbidimétrico com dois anticorpos monoclonais e um ensaio ELISA convencional para determinação de calprotectina padrão isolada a partir de granulócitos com membranas lisossômicas intactas.

[0028] Figura 5 é um gráfico que mostra a correlação da medição do ensaio turbidimétrico para determinação de calprotectina de acordo com a invenção com dois anticorpos monoclonais e um anticorpo monoclonal.

[0029] Figura 6 é um gráfico que mostra a correlação da medição do descrito, empregando dois tipos de partículas de tamanhos diferentes e um ensaio ELISA convencional para determinação de calprotectina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0030] No passado, foi difícil estabelecer um limiar de diagnóstico específico de calprotectina em fezes e existem diferenças pronunciadas interensaios entre diferentes ensaios comerciais devido aos diferentes métodos de extração e tampões (Sipponen T., Kolho KL. Faecal calprotectin in children with clinically quiescent inflammatory bowel disease. (Calprotectina fecal em crianças com doença inflamatória intesPetição 870190112988, de 05/11/2019, pág. 31/73

13/43 tinal clinicamente quiescente). Scand J. Gastroenterol. 2010, 45: 872877; Gisbert J.P., Bermejo F., Perez-Calle J.L., e outros Fecal calprotectin and lactoferrin for the prediction of inflammatory bowel disease relapse (Calprotectina fecal e lactoferrina para a predição de recidiva de doença inflamatória intestinal) Inflamm. Bowel Dis. 2009, 15:11901198; Walkiewicz D., Werlin S.L., Fish D., e outros Fecal calprotectin is useful in predicting disease relapse in pediatric inflammatory bowel disease (Calprotectina fecal é útil na predição de recidiva da doença em doença inflamatória intestinal pediátrica). Inflamm Bowel Dis. 2008, 14:669-673; D'Inca R. Dal Pont E, Di Leo V. e outros. Can calprotectin predict relapse risk in inflammatory bowel disease? (Pode calprotectina predizer risco de recidiva em doença inflamatória intestinal?); Am. J. Gastroenterol. 2008 103:2007-2014. Tibble J.A., Sigthorsson G., Bridger S. e outros. Surrogate markers of intestinal inflammation are predictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease (Marcadores substitutos de inflamação intestinal são preditivos de recidiva em pacientes com doença inflamatória intestinal). Gastroenterology. 2000; 119:15-22). O método descrito proporciona a vantagem de que os tampões de extração e medição proporcionam um ambiente similar àquele encontrado quando se destroem granulócitos, mas mantendo membranas lisossômicas intactas e compartimentos ácidos. Em outras palavras, o ambiente é fisiológico semelhante àquele em que os granulócitos liberam sua calprotectina fisiológica.

[0031] O tampão utilizado na etapa b) pode compreender pelo menos um sal de citrato, acetato ou maleato, soroalbumina tratada com protease e 0,01 a 0, 1 por cento em peso de um ou mais tensoativos aniônicos. Para aglutinação melhorada e acelerada, um ou mais dos componentes da reação podem adicionalmente compreender um agente que facilita a aglutinação, por exemplo, IgM inespecífico, fator reumatoide (FR). Embora o RF possa existir como isotipos de IgG,

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IgM, IgA e IgE, o RF da classe IgM é preferido para medição clínica de calprotectina.

[0032] O segundo componente reagente pode compreender um ou mais anticorpos monoclonais anticalprotectina imobilizados em nanopartículas. Pelo menos dois anticorpos monoclonais diferentes são preferidos por razões de segurança gerais. Se for utilizado apenas um anticorpo monoclonal específico, existe sempre o risco de uma reação imune atípica e um resultado falso diagnóstico, cujo risco pode ser melhorado pelo uso de um segundo monoclonal específico contra a calprotectina. Além disso, a reação de aglutinação é mais segura com dois anticorpos específicos, quando esses apresentam epítopos e determinantes de ligação.

[0033] As nanopartículas podem apresentar diâmetros de 150 a 350 nm para aumentar sensibilidade. Nanopartículas com diâmetro homogêneo são preferidas. Para uma faixa de medição elevada, esta pode ser preferível empregando anticorpos monoclonais anticalprotectina imobilizados em dois tipos de partículas apresentando diâmetros nas faixas de i) 150 a 200 nm e ii) de 250 a 350 nm. Essas partículas de tamanho mono ou múltiplo podem ser partículas de poliestireno carboxilado ou poliestireno ativado por clorometila.

[0034] Outro aspecto refere-se ao kit de dois componentes reagentes para medir calprotectina em um fluido corporal ou amostra por meio de um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas. O primeiro componente reagente pode ser um tampão de extração conforme descrito acima e/ou compreendendo de 20 a 1.000 mmol/L de sal de um reagente tampão, como descrito com um pH na faixa de 5,0 a 6,0; 50 a 300 mmol/L de íons sódio, potássio ou lítio; 0,1 a 1,5% de soroalbumina tratada com protease; 0,01 a 0,1% (p/v) de detergente aniônico, preferencialmente, dodecilsulfato de sódio, e opcionalmente, beta-aldoses, triose, tetroses, pentoses, hexoses, glucano, dextrano

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15/43 e/ou açúcar para atingir uma osmolaridade de pelo menos 200 mmos/L. O segundo componente reagente pode compreender partículas de látex de 0,01 a 0,5% (p/v) de 150 a 350 nm de diâmetro, transportando anticorpos monoclonais imobilizados contra calprotectina humana que se ligam a um de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9) sob um pH entre 5,0 e 6,0.

[0035] O método de medição da presença de calprotectina em uma amostra biológica de um paciente compreende as etapas de: (a) coletar uma quantidade predeterminada da amostra biológica, que pode ser fezes, soro ou fluido sinovial; b) solubilizar e extrair a amostra biológica em uma quantidade predeterminada de tampão orgânico apresentando i) um pH entre 5,0 e 6,0; ii) uma osmolaridade de pelo menos 150 mmosM/kg de H2O; iii) 0 qual ácido orgânico pode coordenar ou sequestrar íons de zinco e cálcio, e iv) 0,01 a 0,1% por cento em peso de um tensoativo aniônico e, opcionalmente, homogeneizar e extrair a matriz da amostra biológica seguido por uma remoção de qualquer material particulado para se obter uma solução de amostra contendo calprotectina (S100A8/A9); c) misturar uma quantidade definida da solução de amostra da etapa (b) com uma quantidade de reagente contendo partículas para formar uma mistura apresentando i) um pH entre 5,0 e 6,0; ii) uma osmolaridade de pelo menos 150 mmosM/kg de H2O, iii) sais e ácidos orgânicos que sequestram íons de cálcio e zinco, e iv) compreendendo nanopartículas apresentando diâmetros de pelo menos 150 a 350 nm e anticorpos monoclonais imobilizados nesses ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a qualquer um das proteínas S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9); d) incubar a mistura da etapa c) por um primeiro intervalo de tempo; e e) adquirir uma propriedade óptica dessa mistura e determinar um sinal indicativo do teor de calprotectina (S100A8/A9) com base na propriedade óptica da mistura; f) relacionar

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16/43 o teor com um controle calibrado de calprotectina na mesma solução tampão e avaliar a condição clínica do paciente com base na presença de calprotectina (S100A8/A9) medida nessa amostra biológica.

[0036] Outro aspecto refere-se a um conjunto de reagentes imunológicos de turbidimetria de látex para uma análise automatizada, bem como, o uso desses reagentes. A modalidade pode ser um sistema de dois reagentes composto de um primeiro componente reagente contendo um tampão para estabilizar a forma dímera de calprotectina na solução de amostra da etapa b) e um segundo componente reagente contendo partículas que transportam um ou mais anticorpos monoclonais imobilizados contra S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9). O método descrito pode abranger uma transferência ou diluição de um extrato da amostra biológica no primeiro componente reagente, opcionalmente, após remoção de qualquer material sólido presente. O primeiro componente reagente pode compreender albumina sérica bovina ou humana tratada com protease, preferencialmente, em uma quantidade de 0,1 a 1,5%, em um sistema de tampão orgânico apresentando um pH na faixa de 5,0 a 6,0 e compreendendo reagentes de tampão orgânico que sequestram íons de cálcio e zinco.

[0037] Conforme mencionado, as nanopartículas utilizadas podem ser partículas de poliestireno carboxiladas com diâmetros que variam de 150 a 350 nm, preferencialmente, de 150 a 200 nm. Em uma modalidade mais preferida, as nanopartículas de poliestireno carboxilado apresentam diâmetros que variam de 160 a 180 nm. Em uma modalidade mais preferida, as nanopartículas são substancialmente de mesmo tamanho, preferencialmente, com diâmetros que variam de 160 a 180 nm. Esse tamanho de partícula permite apresentação acentuada de moléculas de anticorpos e minimiza as armadilhas de determinação em condições de excesso de antígeno. Uma vez que tais nanopartículas apresentam uma grande superfície de interação com an

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17/43 tígeno, são necessárias menos partículas revestidas com anticorpos e a reação de anticorpo-antígeno torna-se comparável com uma reação imune mediada por superfície que é tipicamente mais rápida. Tais partículas grandes são também preferidas para melhor rastreabilidade metrológica de valores medidos com medições anteriores de calprotectina utilizando um ensaio imunossorvente (por exemplo, ELISA) e para comutabilidade. A rastreabilidade, certeza e comutabilidade não podem ser alcançadas quando a reação de anticorpo-antígeno é em 3D em líquido e não depende da superfície. Consequentemente, os autores acreditam que o uso de partículas maiores que as usuais, melhora rastreabilidade metrológica dos resultados. A comparabilidade dos resultados deve ser realizada e representa a atividade principal de laboratórios clínicos.

[0038] São preferidas nanopartículas de tamanhos que são adequados para uma reação bidimensional específica entre os anticorpos monoclonais e calprotectina essencialmente heterodimérica e otimizada, pelo fato de que são necessários menos anticorpos. A reação imune intensificada com partículas é promovida enquanto efeitos esféricos parecem reduzir o impacto da estrutura de calprotectina. O aumento no tamanho das partículas não está associado a um maior grau de turbidez espontânea se dentro da faixa determinada de tamanhos de partículas.

[0039] Em uma modalidade preferida, as nanopartículas podem ser de dois diferentes tamanhos apresentando diâmetros de i) 250 a 350 nm e ii) de 160 a 250 nm. A combinação de partículas imunossensibilizadas de diferentes tamanhos deve adicionalmente intensificar precisão, bem como, faixa de medição.

[0040] Calprotectina é expressa por granulócitos, um subgrupo de glóbulos brancos, e antes de sua liberação ou secreção armazenada em grânulos citoplasmáticos, provavelmente, algum tipo de comparti

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18/43 mento do retículo endoplasmático e da rede trans de Golgi, mas isso ainda está sob investigação. Os granulócitos, entretanto, obtiveram seu nome pela presença de grânulos em seu citoplasma. Os granulócitos são também chamados de leucócitos polimorfonucleares, de acordo com suas formas variáveis do núcleo. O termo leucócito polimorfonuclear geralmente se refere a granulócitos neutrófilos, que representam cerca de 95% dos granulócitos. Os outros granulócitos subdividiram-se em granulócitos eosinofílicos e basofílicos e mastócitos, os quais apresentam números mais baixos. Os granulócitos são produzidos via granulopoiese na medula óssea e permanecem em circulação por cerca de 6 horas, onde exercem suas funções biológicas. Níveis de íons cálcio no citosol de células são mantidos relativamente constantes, dentro de uma célula sendo 100.000 vezes menor do que fora da célula. Sabe-se bem que aumento em íons cálcio dentro da célula pode trazer importantes alterações celulares, de modo que os íons cálcio e níveis intracelulares de cálcio sejam considerados um segundo mensageiro. É vital para as funções dos granulócitos e de suas proteínas de ligação ao cálcio, tal como calproteção que os níveis intracelulares de íons cálcio sejam fortemente controlados. Um controle rigoroso do ambiente de cálcio disponível para ligação por calprotectina parece, portanto, crucial para suas funções e estrutura e para determinação reprodutível da calprotectina biologicamente eficaz em fluidos corporais (soro, líquido sinovial etc.), bem como, em matrizes biológicas, tais como tecidos e fezes.

[0041] Por outro lado, o uso de fosfatos, por exemplo, tripolifosfato de sódio (TPS) em formulações detergentes pode levar a precipitados se cálcio estiver presente. Sob pH baixo, S100A8 e S100A9 são fortes ligantes de cálcio e apresentam pontos isoelétricos sob pH 6,3 e pH 6,5. Consequentemente, essas proteínas já ligaram o íon cálcio e qualquer adição de cálcio presente nas amostras biológicas (soro, fe

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19/43 zes, fluidos sinoviais, etc.) podem interferir com sua determinação quantitativa. Embora não deseje estar ligado por teoria, parece benéfico inibir ligação e oligomerização adicionais de cálcio por uma alteração do pH abaixo dos pontos isoelétricos, mais precisamente, abaixo de um pH de 6,0, e esse agente de sequestro moderado é necessário para evitar precipitados de cálcio. Isso pode ser alcançado utilizando tampões de citrato, maleato ou málico. Alternativamente, polímeros e copolímeros de acrilato e maleato podem ser adicionados para inibir precipitados e aglutinação induzida por íons de cálcio. Complexação do cálcio depende do pH da solução. No caso de ácido cítrico, a concentração de cálcio não complexado permanece fraca e constante sob pH superior a 6,5, quando a desprotonação total dos três grupos carboxílicos é efetiva. No caso de ácidos málico e láctico e sob pH superior à última constante de desprotonação, a concentração de cálcio livre é mais importante e flutuante. Vários ácidos policarboxílicos contendo funções acetais foram estudados e seu comportamento de sequestro de cálcio foi comparado. O sequestro de cálcio por carboidratos oxidados é geralmente menor que, por policarboxilatos de éter correspondentes.

[0042] Quando calprotectina é determinada em fezes, a quantidade de cálcio para ligação por calprotectina depende dos níveis de cálcio no trato gastrointestinal (Gl) e varia muito entre os espécimes. A maioria dos sais de cálcio, dizem as fontes naturais de cálcio em suplementos e alimentos, apresentar solubilidade dependente de pH. A solubilidade dos quatro principais sais de cálcio (oxalato de cálcio hidratado, citrato de cálcio tetra-h id ratado, fosfato de cálcio, glicerofosfato de cálcio) aumenta em cada caso com o pH. Consequentemente, um pH baixo é preferido para extração e medição, uma vez que qualquer cálcio livre pode levar à formação de tetrâmeros ou oligômeros atípicos das proteínas de ligação ao cálcio de baixo peso molecular

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S100A8 e S100A9.

[0043] O segundo componente reagente pode ser uma suspensão de partículas de látex transportando anticorpo imobilizado. Uma modalidade do reagente imunológico da turbidimetria de látex pode ser primeiro componente reagente contendo de 0,1 a 1,5% de albumina sérica humana tratada com protease, 20 a 1.000 mmol/L de tampão de citrato, pH 5,0, 50 a 300 mmol/L de cloreto de sódio e 0,1% (p/v) de dodecilsulfato de sódio. O segundo componente reagente pode compreender de 20 a 1.000 mmol/L de tampão citrato, pH 5,0; 50 a 300 mmol/L de cloreto de sódio e 0,01 a 0,5% (p/v) de partículas de látex de 150 a 350 nm de diâmetro transportando anticorpos monoclonais imobilizados que se ligam a um dos heterodímeros de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9).

[0044] Tais componentes reagentes proporcionam alta sensibilidade e especificidade para calprotectina (S100A8/A9) e maior confiabilidade do diagnóstico em um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas que se utiliza antianticorpos monoclonais contra calprotectina (MRP 8/14, S100A8/A9) como, por exemplo, comercialmente disponível de Immundiagnostik AG, Bensheim, DE (Art. K6927, K6936). Mais precisamente, os resultados do diagnóstico com tal imunoensaio homogêneo são comparáveis, ainda mais precisos, com métodos ELISA estabelecidos e testes imunocromatográficos no local de atendimento. Pode ser definido um valor de corte de diagnóstico de 50 microgramas/g de fezes para a presença de uma inflamação. O imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas emprega, comparado com o estado da técnica, monoclonais padronizados contra heterodímero de calprotectina (S100A8/A9) imobilizado em nanopartículas grandes apresentando diâmetros na faixa de 150 a 350 nm.

[0045] Quando calprotectina ocorre preferencialmente em fluidos corporais e fezes como heterodímero, a aglutinação não deve romper

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21/43 os complexos. Parece que grandes nanopartículas na faixa de 150 a 350 nm tomam a aglutinação cineticamente dependente da superfície (bidimensional), de modo que a turbidez se torne homogênea e rastreável metrologicamente à concentração de calprotectina (S100A8/A9), conforme determinado por um padrão ELISA. Desse modo, resultados e avaliações de diagnóstico são comutáveis, o que é essencial para o trabalho clínico em laboratório. Consequentemente, os valores de corte de diagnóstico estabelecidos podem, portanto, ser utilizados.

[0046] Em resumo, os resultados do diagnóstico são comparáveis e comutáveis àqueles de ELISAs estabelecidos usando monoclonais, enquanto o imunoensaio turbidimétrico não é apenas um ensaio homogêneo. A quantidade de calprotectina (S100A8/A9) presente na amostra pode ser determinada por meio de determinação da aglutinação ou opacidade/turbidez da amostra com referência a um padrão. A análise pode, portanto, ser realizada em qualquer analisador comercial automatizado, tal como Hitachi ou Cobas®. A utilização de anticorpos e fragmentos recombinantes é preferida em vista das quantidades de anticorpos necessários.

[0047] Uma calprotectina estabilizada durante extração de fezes e, posteriormente, pode ser obtida por Ca²⁺ nos tampões de extração e reação. Amostras biológicas (soro, sangue, líquido sinovial ou fezes), contudo, compreendem cálcio endógeno. É preferível o uso de um tampão, íons de cálcio suavemente quelante. Calprotectina fecal (S100A8/A9) é protegida apenas contra proteases quando se apresenta íons de cálcio ligados, visto que, excesso de íons cálcio leva à formação de tetrâmeros e oligômeros. Parece que um tampão ácido que sequestra o cálcio pode estabilizar e suportar o heterodímero de calprotectina (S100A/A9). O tampão ácido estabilizante pode apresentar um pH entre 5,0 e 6,0 e até 0,5%, preferencialmente, 0,1% de um tensoativo iônico e aniônico. O tensoativo iônico pode ser SDS e o tenso

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22/43 ativo não iônico Tween®20. Um pH entre 5,0 e 6,0 e uma força iônica acima de 150 mosm/L são também observados nos grânulos de granulócitos, de modo que as condições de solubilização e medição sejam similares ao ambiente nos grânulos secretores.

[0048] No seguinte: alguns termos conforme utilizados na descrição são adicionalmente explicados e definidos:

[0049] O termo amostra corporal ou fluido corporal descreve material humano ou animal, incluindo, sangue, soro, plasma, fezes, urina, saliva, excrementos, fluidos corporais e tecidos. As amostras corporais também são extratos de material e espécime para exame ou avaliação de diagnóstico e identificação de uma condição médica. A amostra pode ser líquida ou sólida. No caso de uma matriz sólida ou semissólida (amostra fecal), a amostra deve ser extraída. Qualquer kit de extração de amostra de fezes comercialmente pode ser utilizado, por exemplo, sistema de preparação de amostras de fezes (SPAF) preenchido com IDK Extract® (Immundiagnostik AG, Bensheim, DE) ou manualmente com um primeiro componente de reação, conforme descrito neste relatório. A quantidade necessária para realizar um teste turbidimétrico varia de 5 a 20 mg de fezes extraídas. A amostra pode ser urina para estudar doenças do trato intestinal, fígado, bílis, pâncreas ou rim. A amostra pode ser de sangue, plasma ou soro para estudar doenças cardio vasculares.

[0050] Calibradores são soluções (em série) com concentrações conhecidas do analito (calprotectina) e igualmente necessários para desempenho preciso no trabalho em laboratório. A fim de interpretar a força do sinal e, desse modo, determinar a presença ou concentração de analito (calprotectina) na amostra, o resultado com um espécime de uma amostra corporal é comparado com aqueles obtidos com uma diluição em série do calibrador.

[0051] Limite de detecção é definido como a menor quantidade de

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23/43 analito que pode ser detectada com segurança no ensaio em que ο erro total está de acordo com os requisitos de precisão. Um limite de detecção de < 10 microgramas de calprotectina/grama de fezes pode ser obtido de acordo com o método descrito, razoavelmente abaixo do ponto de corte (50 microgramas de calprotectina/grama de fezes) para o diagnóstico de uma inflamação em fezes.

[0052] Turbidimetria é a medição da perda de intensidade de luz transmitida devido ao efeito de dispersão das partículas suspensas em uma solução. A luz de comprimento de onda conhecido (nm) é passada através de uma cubeta contendo a solução com partículas e coletada por uma célula fotoelétrica. Um valor de medição (mE) é fornecido para a quantidade de luz absorvida. Atualmente, são utilizados dois tipos de ensaios turbidimétricos, imunoturbidimetria direta e intensificada com partículas (IETIP). Na imunoturbidimetria direta, os anticorpos formam um complexo imune por meio de interação direta com seus antígenos correspondentes. O método imunoturbidimétrico intensificado com partículas baseia-se no revestimento de nanopartículas com anticorpos, no presente pedido com dois anticorpos monoclonais de camundongo contra calprotectina. Os ensaios imunoturbidimétricos intensificados com partículas são realizados quando o analito está presente em baixa concentração, à medida que as partículas amplificam o sinal e produzem uma sensibilidade aumentada.

[0053] Nanopartículas são geralmente utilizadas cujo diâmetro médio é tipicamente medido em nanômetros (nm). O tamanho (diâmetros) de nanopartículas pode ser confiável por meio de dispersão dinâmica de luz (DLS), espectroscopia de correlação de fótons (PCS) ou dispersão de luz quasi-elástico (QELS). Os diâmetros como descritos neste relatório são medidos empregando um Malvern Zetasizer Nano (Malvern Panalaytical Ltd., Malvern, GB) ou Horiba SZ-100, sendo o desvio gaussiano da média fornecida menor que 10 nm. Como a su

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24/43 perfície da nanopartícula é conjugada com biomoléculas (HAS) e, naturalmente, imunoglobulinas (Ig) e monoclonais, os diâmetros devem ser estritamente determinados e controlados. Uma grande razão superficial de área-para-volume de um bioconjugado de nanopartículasIg é vantajosa para interação das imunoglobulinas com as biomoléculas-alvo. A preparação de nanopartículas portadoras de anticorpos é bem conhecida no estado da técnica. Os anticorpos podem ser absorvidos por um revestimento adequado nas partículas, ou podem ser quimicamente acoplados a estas através de um agente de ligação em ponte. Os anticorpos podem também ser acoplados diretamente ao polímero da própria partícula de látex. As nanopartículas podem ser armazenadas antes de uso em um tampão compreendendo citrato de sódio tribásico desidratado, albumina sérica bovina, Tween 20, sacarose, azida de sódio (tampão de armazenamento). Por utilização do tampão de armazenamento da invenção, imunopartículas de látex com anticorpos monoclonais contra calprotectina são altamente estáveis em suspensão, isto é, sem agregação espontânea, por períodos de até 12 meses em 2 a 8°C antes de imunoensaio, enquanto se preserva estabilidade do anticorpo.

[0054] Calprotectina é liberada por granulócitos e liberação prévia armazenada no interior dos grânulos celulares, mais precisamente, compartimentos prováveis do trans de Golgi que não são lisossomos. Níveis de íons de cálcio no citossol e dentro desses compartimentos ácidos (pH 5,0 a 6,0) são mantidos relativamente constantes, com a concentração de íons cálcio 100.000 vezes menor do que fora da célula. É vital para as funções dos granulócitos, bem como, para outras células, que níveis intracelulares de íons cálcio sejam bem controlados. Um controle rígido dos íons de cálcio disponíveis para ligação por calprotectina e do pH é igualmente crucial, não apenas por suas funções, mas também para uma determinação metrologicamente rastreá

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25/43 vel de calprotectina em amostras corporais. Consequentemente, devem ser utilizados anticorpos monoclonais contra calprotectina que se ligam sob pH baixo. Desse modo, é necessário estabilizar a forma solúvel de calprotectina durante extração a partir da matriz da amostra e na solução de ensaio em que ocorre imunorreação e aglutinação subsequente. Isto pode ser obtido adicionando até 0,5%, preferencialmente, 0,1% de tensoativo iônico e não iônico. Um tensoativo aniônico preferido é SDS, enquanto o estado da técnica parece funcionar principalmente com tensoativos não iônicos, tal como Tween®20. Utiliza-se um pH entre 5,0 e 6,0 para extração e esse pH também é observado nos compartimentos ácidos e nos grânulos de granulócitos.

[0055] Para uma redução de imunorreações inespecíficas, a amostra pode ser dissolvida em uma solução tampão compreendendo antissoro anti-IgM. A presença de antissoro anti-lgM pode contribuir para corrigir o efeito de interferências de IgM no imunoensaio, de modo que resultados consistentes podem ser obtidos independentemente de origem da amostra. O antissoro anti-lgM pode conter calprotectina endógena, de modo que cada lote de antissoro anti-lgM exija eventual correção do teor de calprotectina relacionado com soro de IgM.

[0056] A presente invenção contempla adicionalmente um kit de teste para determinação quantitativa de calprotectina. O kit pode compreender nanopartículas homogêneas revestidas com pelo menos um anticorpo monoclonal anticalprotectina, ou fragmentos de anticorpos, ligando-se sob pH entre 5,0 e 6,0, em que as nanopartículas apresentam diâmetros que variam de 160 a 180 nm. Para maior sensibilidade e faixa de medição, o kit pode compreender um segundo tipo de nanopartículas homogêneas apresentando outros diâmetros homogêneos. A invenção também se refere a um método para detecção quantitativa de calprotectina em fezes, método este que compreende as etapas de a) extrair uma quantidade definida de fezes com um primeiro compo

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26/43 nente de reação para solubilizar calprotectina e proporcionar uma amostra líquida, o primeiro componente de reação apresentando um pH de 5,0 a 6,0 e uma osmolaridade de pelo menos 150 mosm/L; b) contatar a amostra líquida com nanopartículas apresentando pelo menos um anticorpo monoclonal imobilizado contra calprotectina (S100A8/A9) que se liga sob pH 5,0 a 6,0; e c) avaliar a quantidade de calprotectina na amostra por meio de turbidimetria, em que os diâmetros das nanopartículas são na faixa de 160 a 350 nm. Em uma modalidade preferida, as nanopartículas podem ser partículas de poliestireno carboxilado e, por uma questão de sensibilidade e fúria de detecção, pode haver dois tipos de nanopartículas de tamanho homogêneo, seus diâmetros homogêneos sendo na faixa de i) 150 nm a 250 nm e ii) de 250 nm a 350 nm. As partículas de látex podem ser partículas de materiais orgânicos de alto peso molecular, tais como partículas de látex de poliestireno, copolímero de ácido estirenometacrílico, copolímero de (met) acrilato de estireno-glicidila ou copolímero de sulfato de estireno-estireno.

[0057] Tal teste e método podem ser adaptados a analisadores automatizados em laboratórios clínicos. O método é caracterizado por aglutinação inespecífica reduzida devido ao uso de monoclonais que não são específicos ao lote e se ligam apenas a um único epítopo. Testes turbidimétricos convencionais empregam anticorpos policlonais aviários (IgY de frango contra o heterodímero de MRP8/MRP14) que sofrem agregação espontânea no ensaio turbidimétrico. Além disso, um tampão de reação sob pH fisiológico (tampão de 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS) com pH 7,2) é utilizado no estado da técnica, o que não interfere com uma agregação das proteínas S100A8 e S100A9 a multi-homo e multi-heterômeros (Nilsen T. e outros, A new turbidimetric immunoassay for serum calprotectin for fully automized clinical analysers, (Um novo imunoensaio turbidimétrico de calprotecti

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27/43 na sérica para analisadores clínicos totalmente automatizados), J. Inflammation, 2015, 12: 45). O mesmo pode ser observado quando calprotectina é diluída em um tampão sob pH fisiológico 8R1: pH 7,2; R2, pH 8,1) como utilizado pelo Bühlmann fCal® turbo, que emprega os mesmos anticorpos policlonais aviários. O método turbidimétrico e reação, contudo, determina o número de moléculas alvo (complexo) em solução e não a quantidade de proteína (aminoácidos) como é determinada para calibração pelo método de Biuret. Consequentemente, os métodos turbidimétricos convencionais para determinação de calprotectina usando um pH alto e anticorpos policlonais não podem fornecer resultados metrologicamente rastreáveis. A comutabilidade de resultados entre métodos convencionais pode apenas ser obtida por fatores de correção (ex pós-fato) que não são disponíveis na rotina de laboratório clínico. Além disso, variação de lotes entre diferentes processos descontínuos de anticorpos criados e purificados com diferentes lotes de antígeno de calprotecina em diferentes processos descontínuos é crítica.

[0058] Em uma modalidade da invenção, as nanopartículas podem ser partículas de látex. Em uma modalidade preferida, as nanopartículas de látex são partículas de poliestireno carboxilado com um tamanho de partículas de 150 a 250 nm (250 a 350 nm), densidade de carga superficial de 40 a 60 pC/cm²; densidade de carga superficial: 150 250 pEq/g, teor de sólidos 10,0 (%); estabilizado com 0,05% de azida de sódio.

[0059] O método turbidimétrico da invenção não requer um analisador dedicado, uma vez que é aplicável de forma flexível a analisadores fotométricos comuns. De acordo com a presente invenção, custos adicionais para adquirir um instrumento dedicado ou consumíveis não são mais necessários. O presente método facilita o processamento totalmente automatizado, sem consumir tempo de separação da amos

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28/43 tra, permitindo maior produtividade da amostra e aumentando a eficiência clínica de laboratório. Com base da presente invenção, é possível quantificação exata, rastreabilidade metrológica, comutabilidade de resultados e diferenciação de diagnóstico com base em um valor de corte (por exemplo, de 50 microgramas de calprotectina/grama de fezes). Tal é a necessidade de monitoramento terapêutico de pacientes. Automação e padronização são modalidades aplicáveis e preferidas, uma vez que teste manual envolve alto risco de contaminação para o usuário e a amostra analisada.

[0060] Um objetivo do presente pedido é a provisão de um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas, o qual é se baseia em anticorpos monoclonais de mamíferos contra calprotectina humana, o que impede a desvantagem de sensibilidade reduzida ao ensaio, como é tipicamente incorrido com anticorpos aviários. Outro objetivo proporcionado é um ensaio para determinação de calprotectina que pode ser aplicado em qualquer analisador químico padrão de uma maneira independente do fabricante. Outro aspecto é um tampão de armazenamento de partículas de látex com anticorpos imobilizados, eliminando a tendência natural de partículas de látex se agregarem e precipitarem espontaneamente após o armazenamento. O tampão de reação descrito pode também ser utilizado como tampão de armazenamento.

[0061] Atualmente, a contagem de leucócitos e/ou medição de proteína C reativa (PCR) é usada para diagnóstico de uma infecção bacteriana que requer tratamento com antibióticos. Estima-se que cerca de 40% desses casos sejam classificados erroneamente como infecções bacterianas e outras causas (XuS e outros, Lipocalins as biochemical markers of disease (Lipocalinas como marcadores bioquímicos de doença), Biochim. Biophys. Acto 2000, 1482:298-307). O marcador de ativação de neutrófilos HNL/NGAL permitiría distinção entre

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29/43 infecções bacterianas e virais agudas, mas não é um marcador viável devido à sua concentração muito baixa em amostras corporais. O presente ensaio de calprotectina reflete ativação de granulócitos e demonstrou estar elevado em condições inflamatórias. A molécula de calprotectina humana, entretanto, foi descrita como um heterodímero de 24 kDa compreendendo subunidades de S100A8 (MRP8) e S100A9 (MRP14), mas não há consenso sobre a estrutura real da calprotectina in vivo, quando a medição por meio de turbidimetria exige um padrão definido e moléculas. De acordo com os autores, calprotectina pode ser encontrada como um heterodímero, um heterotrímero ou mesmo um heterotetrâmero quando o cálcio está presente. A calprotectina é uma proteína de ligação ao cálcio encontrada em granulócitos neutrofílicos que se tornam disponíveis no lúmen intestinal via liberação (shedding) de leucócitos, secreção ativa, distúrbio celular e morte celular. Durante a inflamação intestinal, os granulócitos neutrofílicos migram-se para a mucosa intestinal e elevam os níveis fecais de calprotectina.

[0062] Níveis fecais de calprotectina correlacionam-se com avaliação histológica e endoscópica de atividade da doença em doença de Morbus Crohn e colite ulcerosa. Excreção fecal de granulócitos neutrofílicos marcados com índio-111 tem sido sugerida como o padrão ouro de atividade da doença em doença inflamatória intestinal (Dll). Como os pacientes com doenças inflamatórias intestinais ativas (Dll) podem apresentar um aumento até 10 vezes nos níveis fecais de calprotectina, é necessária uma determinação comutável de concentrações elevadas de calprotectina em fezes. A calprotectina fecal é também utilizada para discriminar entre Dll e síndrome do intestino irritável. Devido à sua resistência à degradação enzimática, mas apenas se cálcio estiver ligado, a calprotectina pode ser extraída e medida em fezes. A calprotectina pode também indicar outras condições gastroin

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30/43 testinais inflamatórias, tais como câncer colorretal, gastroenterite e intolerância alimentar, mas seus níveis variam dependendo da idade e do dia-a-dia dos indivíduos. A calprotectina sérica é um valioso marcador inflamatório para o diagnóstico de sepse e apendicite aguda. Entretanto, não existe um padrão internacional de calprotectina. Portanto, padrões internamente estabelecidos para calibração estão sendo usados para evitar determinações imprecisas devido às variações de processos descontínuos. Isso também leva a diferentes níveis de padrões entre os fabricantes, dependendo de qual método escolhido.

[0063] A determinação da calprotectina conforme descrita, entretanto, proporciona resultados metrologicamente rastreáveis. Um aspecto colateral é, portanto, uma validação do desempenho de ensaio turbidimétrico por calibradores de calprotectina de 0 a 2.000 pg/ml de amostra, a qual é necessária para superar a alta variabilidade do teor de calprotectina entre diferentes amostras biológicas. A ampla faixa evita percursos excessivos ou problemas em excesso de antígeno e pode ser alcançada com o método descrito.

[0064] Figura 1 mostra uma curva de calibração com partículas de látex revestidas com anticorpo monoclonal de camundongo. Os valores de absorvância (eixo Y) correspondem aos valores de calprotectina em microgramas de calprotectina/g de fezes (eixo X). Os resultados suportam um comportamento contínuo na faixa de 0 a 2.000 pg/g. O desempenho do imunoensaio perde linearidade quando as concentrações de calprotectina na amostra estão acima de 2.000 pg/g de fezes, como mostrado na Figura 2.

[0065] As imunopartículas da invenção são revestidas com anticorpos monoclonais de camundongo criados contra calprotectina MRP8/MRP14. Embora os anticorpos aviários sejam menos reativos com fator reumatoide ou anticorpos de IgG humana anticamundongo ou ao sistema de complemento humano (ver, EP 1 573 335 B1) - cau

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31/43 sas bem conhecidas de medição errônea - os anticorpos policlonais aviários são menos específicos que os anticorpos monoclonais de mamíferos. Outro objetivo da presente invenção é, portanto, a provisão de um ensaio turbidimétrico de calprotectina que se baseia em anticorpos altamente específicos sem a desvantagem de reatividade inespecífica. Isto é obtido pelo presente sistema de ensaio.

[0066] Métodos sensíveis de medição da calprotectina são disponíveis. Os ensaios ELISA disponíveis são, entretanto, associados a longos tempos de execução dos testes e mais trabalhosos do que os ensaios turbidimétricos. A presente invenção proporciona um sistema de ensaio em que as amostras podem ser processadas após sua chegada ao laboratório, de modo que qualquer condição médica associada aos níveis elevados de calprotectina possa ser diagnosticada em tempo hábil. A adequabilidade do método turbidimétrico foi testada em 36 amostras de fezes e correlacionada com um ensaio ELISA padrão como referência. A Figura 3 mostra a correlação entre o ensaio turbidimétrico com um tamanho de partícula revestido com anticorpo monoclonal e um ensaio ELISA para determinação de calprotectina. Para o ensaio turbidimétrico, utilizou-se uma Aplicação Hitachi 912, de acordo com o fabricante. Análise estatística revelou resultados comutáveis, confirmando, desse modo, a adequabilidade do método descrito para determinação de calprotectina em fezes (regressão P/B; Y = 0,914* X - 21,403; md (95) = 212,169; n = 36; r = 0,9018, t = 0,7693). De nota, o coeficiente de correlação r varia de -1 (0) a 1. Um valor de 1 indica que a relação entre X e Y é perfeitamente descrita por uma equação linear. Um valor 0 refere-se à correlação não linear entre as variáveis.

[0067] Em um experimento adicional, em que partículas de látex de tamanho único foram revestidas com dois anticorpos monoclonais diferentes contra calprotectina, testou-se o método turbidimétrico com

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32/43 amostras de fezes e os resultados determinados correlacionados com um ensaio ELISA padrão como referência. A Figura 4 mostra a correlação das medições do ensaio turbidimétrico com um e dois anticorpos monoclonais e um ELISA correspondente a calprotectina. Análise estatística dos ensaios não revelou diferença significativa entre o uso de um (Fig. 3) ou dois anticorpos (Fig. 4). O ligeiro aumento na sensibilidade do ensaio com dois anticorpos é provavelmente de uma maior intensidade de sinal devido ao aumento da carga de anticorpos (regressão P/B; Y = 1,063* X - 22,849; md (95) = 258,068; n = 36; r = 0,9023, t = 0,7781).

[0068] Adicionalmente, partículas de látex de tamanho único foram revestidas com a) dois anticorpos monoclonais e b) um único anticorpo monoclonal (mAB Nos. 1062, 1067, 1068, 1089 de Immundiagnostik AG, Bensheim, DE). 39 amostras de fezes foram extraídas e incubadas com partículas de látex de qualquer uma das condições. O ensaio turbidimétrico de acordo com a invenção foi realizado, em ambas as condições, usando a aplicação Hitachi 912. A Figura 5 mostra a análise de correlação do ensaio turbidimétrico (regressão P/B; Y = 1,151* X + 0,0; md (95) = 39,409; n = 39; r = 0,9989; t = 0,9605). Experimentos adicionais resultaram em valores estatísticos similares conforme mostrado na Tabela 1.

TABELA 1

Anticorpo monoclonal Nr.	Y	X	md (95)	n	r	t
1067 Vs. 1062+1089	1,151	0,0	39,409	39	0,9989	0,9605
1067 Vs. 1067+1068	1,014	0,0	14,472	61	0,9997	0,9748
1068 Vs. 1067+1068	1,008	+ 9,051	22,799	61	0,9994	0,9617

[0069] O desempenho do ensaio de turbidimetria com imunopartículas de dois tamanhos diferentes (heterogêneos) revestidas com um único anticorpo monoclonal foi testado em 36 amostras de fezes e correlacionado com um ensaio ELISA padrão como referência. Para o ensaio turbidimétrico, utilizou-se aplicação Hitachi 912 de acordo com o

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33/43 fabricante. A Figura 6 mostra a análise de correlação do ensaio turbidimétrico. Análise estatística do teste revelou resultados comutáveis, confirmando, desse modo, o método para determinação precisa de calprotectina em fezes (regressão P/B; Y = 1,102* X - 24,963; md (95) = 289,067, n = 36; r = 0,9012; t = 0,7847).

[0070] O método turbidimétrico foi adicionalmente testado e medições de calprotectina realizadas com partículas de látex de dois tamanhos diferentes (heterogêneos) e comparadas com uma que emprega um único tamanho de partícula (homogêneo). As partículas de látex de 250 nm e 175 nm foram revestidas com um único anticorpo monoclonal contra calprotectina. Amostras com concentrações de calprotectina que variam de 0 a 2.000 pg/g foram utilizadas como calibradores para o ensaio turbidimétrico usando aplicação Hitachi 912, de acordo com as instruções do fabricante. Conforme mostrado na Tabela 2 (mE (mA): mAbsorvância), o desempenho do ensaio com partículas de látex de dois tamanhos diferentes resulta em maior sensibilidade à determinação em comparação com partículas de tamanho único. Consequentemente, a combinação de pelo menos dois tamanhos de partículas pode resultar em uma faixa de detecção aperfeiçoada de calprotectina em comparação com o uso de partículas de tamanho único.

[0071] As nanopartículas de látex apresentam a tendência de autoagregar. O tampão de armazenamento descrito pode compreender citrato de sódio tribásico desidratado, sob pH 5,0, albumina sérica bovina, SDS a 1%, sacarose, azida de sódio. O tampão de armazenamento da invenção contribui para aumentar a estabilidade de armazenamento das imunopartículas de látex por longos períodos de tempo. A descrição da estabilidade das imunopartículas significa que a agregação espontânea de partículas de látex (turbidez) é reduzida de modo que o segundo componente de reação possa ser armazenado por até 12 meses a 2-8°C antes de uso. O tampão de armazenamento é

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34/43 estável a partículas sob 37°C por vários dias. Não apenas a agregação é reduzida, mas a estabilidade do anticorpo pode ser prolongada, resultando em valores de medição bastante independentes de condições de armazenamento.

TABELA 2

Calprotectina (pg/g)	110 nm + 175 nm (mE)	175 nnm (mE)
0	11,3	9,2
100	52,1	47,5
200	111,4	103,9
400	218,1	212,6
1000	456,1	443,7
2000	681,9	672,2
4000	768,7	757,9
8000	748,2	724,3
12000	715,3	695,1
16000	629,7	689,8

[0072] A Tabela 3 mostra os valores de absorvância (mE) medidos em 1 dia e 30 dias de armazenamento sob 2-8°C usando imunopartículas revestidas com dois anticorpos monoclonais em um ensaio de turbidimetria de acordo com a invenção. As imunopartículas foram preservadas i) a 2-8°C por 30 dias e ii) mantidas a 37°C por 3 dias e, adicionalmente, 30 dias sob 2-8°C. Levando em consideração que os anticorpos monoclonais são sensíveis à temperatura, isso sugere que o tampão de armazenamento da invenção contribui para uma determinação precisa de calprotectina em diferentes níveis, a saber, agregação de imunopartículas e estabilidade de anticorpos ligados a partículas.

TABELA 3

	Tampão de armazenamento a 2-8°C	Tampão de armazenamento a 37°C
Calprotectina (pg/g)	1 dia	30 dias	1 dia	30 dias
0	3,4	2,1	3,4	-1,1
100	58,5	53,6	58,5	59,7
200	108,4	114,3	108,4	119,1
400	220,3	229,8	220,3	240,4
1000	487,7	500	487,7	531,6
2000	707,9	698,2	707,9	732,9
4000	818,4	790,1	818,4	814,7

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[0073] Se o analito excede uma certa concentração na amostra, ocorrerá saturação do anticorpo, seguido por agregação reduzida. Uma agregação reduzida resulta em sinais de menor intensidade. Esse efeito é descrito como excesso de antígeno e pode levar à interpretação incorreta de valores falsamente baixos e a decisões erradas de diagnóstico. Conforme descrito, um excesso de antígeno alvo não interfere necessariamente com a determinação turbidimétrica, uma vez que as nanopartículas sejam otimamente dispersas e separadas umas das outras, também por suas superfícies carregadas, deixando toda a superfície da partícula livre para ligação ao antígeno. Um aumento na capacidade de ligação ao anticorpo é alcançado pelo tampão descrito para armazenamento de partículas e reação de teste.

[0074] Em uma modalidade preferida, o método da invenção é realizado com nanopartículas revestidas com anticorpo de tamanhos que variam de 150 a 350 nm. O estado da técnica ensina que as nanopartículas para imunoensaios turbidimétricos não podem apresentar mais de 140 nm de diâmetro porque um tamanho de partícula elevado se correlacionaria com uma agregação inespecífica, em particular, de partículas de látex. Esse ensinamento, contudo, deve se referir a partículas que transportam anticorpos policlonais menos específicos ou com reação cruzada. A presente invenção, entretanto, suporta nanopartículas apresentando diâmetros de 150 a 350 nm e que partículas grandes contribuem para uma determinação precisa. Também se obtém uma reação acentuada entre o anticorpo monoclonal e o antígeno alvo (calprotectina) devido ao aumento da área de interação e porque a reação é parcialmente dependente da superfície. É importante ressaltar que o aumento de tamanho não se associa a um maior grau de turbidez espontânea.

[0075] Contudo, não existem meios fiáveis no estado da técnica para intensificar a sensibilidade da medição e acelerar a dispersão de

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36/43 partículas de látex suspensas sem perturbar a reação imunológica. O método da invenção resolve esse problema por meio de utilização de uma composição tampão (tampão de teste ou primeiro componente da reação) compreendendo citrato de sódio, pH 5,0 a 6,0, NaCl 150 mM, albumina sérica bovina, SDS/Tween® 20, sacarose, azida de sódio. O presente método pode ser usado em combinação com um tampão de extrato de fezes comercialmente disponível (por exemplo, IDK Extract® Immundiagnostik AG, Bensheim, DE) se misturado com o primeiro componente de reação R1. Para comparação, diferentes concentrações de calibradores de calprotectina de 0 a 2.000 pg/g foram diluídas separadamente em tampão de teste conforme descrito e em tampão IDK Extract®. Ensaios de imunoturbidimetria foram realizados com dois anticorpos monoclonais diferentes ligados a partículas de látex. Como mostrado na Tabela 4, um aumento mensurável na sensibilidade de detecção pode ser alcançado com tampão de teste (mA: valores de mAbsorvância), que aponta para mais moléculas alvo disponíveis e menos formação de multímeros.

[0076] Para comparação adicional, 20 amostras de fezes foram extraídas separadamente com o tampão de teste da invenção e o tampão de extração Bühlmann comercialmente disponível (Bühlmann fCal Turbo®) que apresenta um pH fisiológico medido de 7,2 (Bühlmann Laboratories AG, Basel, Suíça). O ensaio turbidimétrico foi realizado como descrito acima usando Aplicação Hitachi 912 de acordo com as instruções do fabricante. Os valores de absorvância em ambas as condições foram correlacionados entre si. Análise estatística mostrou correlação entre ambas as condições (regressão P/B; Y = 1,004* X - 1,552; md (95) = 30,37; n = 20; r = 0,9932; t = 0,9524). O tampão de teste da invenção, portanto, fornece pelo menos a extração de calprotectina fecal tão boa quanto os tampões comercialmente disponíveis, mas fornece a vantagem de agregação inespecífica reduzida de

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37/43 imunopartículas.

TABELA 4

Calprotectina (pg/g)	Tampão de teste (mE)	Extrato de IDK (mE)
0	11,5	0,4
100	48,1	44,5
200	103,3	93,9
400	206,6	194,6
1000	456,1	435,6
2000	656	630,8
4000	759,4	730,5
8000	751,8	724,8
12000	712,8	675,6
16000	673	638

[0077] As fezes contêm cerca de 75% de água e a fração sólida restante é de 84 a 93% de sólidos orgânicos. Esses sólidos orgânicos consistem de: 25-54% de biomassa bacteriana, 2-25% de proteínas ou matéria nitrogenada, 25% de carboidratos ou matéria vegetal não digerida e 2-15% de lipídios. Essas proporções variam consideravelmente, dependendo da dieta e do peso corporal. Os sólidos restantes são compostos de fosfatos de cálcio e ferro, secreções intestinais, células epiteliais e muco. Os componentes da amostra corporal, em particular, das fezes, podem representar uma fonte de interferência que afeta a sensibilidade dos imunoensaios e de IETIP. Tais interferências podem levar, por exemplo, a valores de absorvância negativos. Pelo presente método, a interferência pelos componentes de amostra de fezes acima descritos é reduzida.

[0078] Imunoglobulina M (IgM) é um anticorpo básico produzido por células B. A IgM é o maior anticorpo no sistema circulatório humano e o primeiro anticorpo a aparecer em resposta à exposição inicial a um antígeno. A presença de antissoro de IgM pode contribuir para combater distúrbios relacionados à matriz da amostra. Entretanto, o antissoro de IgM pode conter calprotectina endógena. Recomenda-se uma análise de cada processo descontínuo de antissoro de IgM. A Tabela 5 mostra os valores de absorvância de mE obtidos por medições

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38/43 turbidimétricas de calibradores de calprotectina e amostras de fezes diluídas no componente de reação, com ou sem adição de antissoro de IgM. Os valores de absorvância negativos são abolidos e um aumento geral na sensibilidade e confiabilidade de detecção é alcançado.

TABELA 5

Calprotectina (pg/g)	p/o IgM (mE)	IgM (mE)
Calibradores	0	4,2	8,5
40	31,7	27,6
100	74,2	61
200	160,5	134,4
400	392	351,3
2000	1094,1	1082,1
4000	1211,1	1183
8000	1140,3	1128,9
Amostras de fezes	14	-10,4	2,3
22	-6,5	11,7
31	5,6	17,5
40	82,6	67,7
57	29,5	43,3

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Produção de imunopartículas contra calprotectina

[0079] Partículas de látex a partir de produtores bem conhecidos, por exemplo, MERCK, Bangs Laboratories foram utilizadas. O látex foi poliestireno carboxilado ou látex de clorometila. As partículas de látex apresentavam os seguintes parâmetros: densidade de carga superficial 62 pC/cm²; densidade de carga superficial 163 pEq/g pol.; teor de sólidos 9,0%, estabilizadas com azida de sódio a 0,05%. Imunopartículas foram preparadas por meio de ligação covalentemente de anticorpos monoclonais purificados de camundongo (mAB 1062, 1067, 1069, 1089 e ligação no primeiro componente da reação) direcionados contra calprotectina humana purificada a partir de granulócitos com membranas lisossômicas intactas. As partículas de poliestireno carboxilado foram preferencialmente de tamanho uniforme (175 nm). Alternativamente, nanopartículas de dois tamanhos diferentes (160 a 175 nm e

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250 - 275 nm) foram revestidas com um único anticorpo monoclonal (ver Figura 6). Também, partículas de látex de tamanho único de 175 nm foram revestidas com dois anticorpos monoclonais diferentes.

[0080] As partículas foram mantidas antes de uso em tampão de armazenamento compreendendo citrato de sódio, pH 5,0 a 6,0, tampão de maleato 50 mM, pH 5,0, NaC 150 mM, albumina sérica bovina, sacarose 150 mM, azida de sódio a 2-8°C.

EXEMPLO 2: Extração da amostra de fezes

[0081] As amostras de fezes foram extraídas como seguem: 15 mg de fezes foram diluídas 1:100 em tampão de 1,5 ml. Os tubos da amostra vazios foram preenchidos com 1,5 ml de tampão de teste, maleato 50 mM pH 5,0, NaCl 150 mM, azida de sódio, dodecilsulfato de sódio a 0,1%, albumina sérica bovina, com ou sem antissoro de IgM. Para comparação, as amostras foram também extraídas usando o tampão de extração IDK Extract® pronto para uso (Cat. N° K 6967) e tampão de extração Bühlmann fCal Turbotm sob temperatura ambiente. As amostras de fezes foram coletadas e armazenadas até 48 horas, sob 2-8°C. Por períodos prolongados (até 12 meses), recomendase o armazenamento a -20°C. Após início do ensaio turbidimétrico, as amostras congeladas foram descongeladas lentamente, de preferência a 2-8°C. Em algumas ocasiões, amostras heterogêneas foram homogeneizadas mecanicamente. Para a coleta de amostras, utilizou-se Sistema de Aplicação de Amostra de Fezes IDK® (IDK® Stool Sample Application System (SAS)) (Cat. N° K 6998SAS). A ponta da vareta do SAS, que possui entalhes que retêm uma quantidade fixa de matériaprima, foi inserida na amostra de fezes. A vareta foi colocada de volta no tubo com tampão de extração. Ao recolocar o bastão de volta para o tubo, excesso de material foi retirado. A amostra de 15 mg de fezes remanescente na vareta foi então diluída em tampão de extração. Os tubos foram bem fechados e bem agitados até que nenhuma amostra

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40/43 de fezes permanecesse nos entalhes. Foram necessários 10 minutos para permitir a sedimentação do sedimento. Certificando-se de que o sedimento não foi disperso novamente, a amostra extraída foi diluída 1:25 em tampão de teste. Por exemplo, 40 μΙ de amostra de fezes extraídas foram adicionadas ao tampão de teste de 960 pl.

EXEMPLO 3: Imunoensaio tu rbidi métrico de calprotectina

[0082] Amostras extraídas com qualquer um dos tampões de extração, conforme descritos acima, foram utilizadas para determinação turbidimétrica usando a aplicação Roche Hitachi 912, de acordo com o fabricante. Amostra extraída de 10 pL foi adicionada a 200 μΙ_ de tampão de teste e 50 μΙ_ de tampão de armazenamento, compreendendo citrato de sódio pH 5,0, albumina sérica bovina, Tween 20, sacarose, azida de sódio. O analisador automatizado misturou imunopartículas suavemente com as amostras extraídas enquanto incubando a 37 graus Celsius por 5 minutos. O segundo componente da reação com partículas portadoras de anticorpos monoclonais imobilizados foi adicionado, enquanto agitando suavemente. O tempo para aglutinação foi de 5 minutos a 37 graus Celsius, durante o qual mediu-se a absorvância. Medições foram realizadas em duplicatas. Os valores de absorvância foram obtidos com leitura no comprimento de ondas de 570 nm. [0083] Calprotectina purificada comercialmente disponível foi diluída em tampão de citrato pH = 5,4 em uma faixa de 0 a 2.000 pg/g. (6 pontos de calibração) para calibração do ensaio turbidimétrico. Foi obtida uma faixa linear de 30 a 2.000 pg/g.

[0084] Amostras de fezes com quantidades conhecidas de calprotectina foram utilizadas como amostras de controle e de teste. As amostras de fezes contendo calprotectina foram diluídas 1:100 em tampão de reação, resultando em faixas de medição de 0,1 a 20 pg de calprotectina em 1 g de fezes. Levando em consideração o fator de diluição, a faixa de medição real foi até 2.000 pg/g.

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[0085] Faixa de referência de 1 g de fezes é equivalente a 1 ml. O valor médio em adultos saudáveis é de cerca de 25 pg de calprotectina/g em fezes. Amostras com concentração de calprotectina abaixo de 50 pg/g foram consideradas como negativas. Amostras com uma concentração de calprotectina entre 50 pg/g em fezes e 100 pg/g em fezes foram consideradas como limítrofes positivas. Amostras com uma concentração de calprotectina acima de 100 pg/g em fezes foram consideradas como positivas.

EXEMPLO 4: Ensaio ELISA de calprotectina

[0086] Escolheu-se calprotectina (MRP8/14) de ELISA IDK® para comparação com o método de determinação turbidimétrica da invenção. O ensaio utiliza a técnica de sanduíche de dois sítios com dois anticorpos monoclonais selecionados que se ligam à calprotectina humana. Calibrador, controles e amostras de pacientes diluídas são adicionados aos poços da microplaca revestidos com um anticorpo monoclonal de calprotectina anti-humano. Durante a primeira etapa de incubação, as moléculas do anticorpo imobilizado se ligam à calprotectina nas amostras. Em seguida, um conjugado marcado com peroxidase é adicionado a cada poço e um complexo é formado. Tetrametilbenzidina (TMB) é usada como um substrato para peroxidase. Finalmente, uma solução de parada ácida é adicionada para finalizar a reação. A cor se altera de azul para amarelo na presença de calprotectina.

[0087] A intensidade da cor foi diretamente proporcional à concentração de calprotectina da amostra. As amostras foram quantificadas em relação à sua densidade óptica. Uma curva de calibração principal usando um calibrador de calprotectina é executada em cada teste. Duplicatas foram realizadas. A absorção foi medida imediatamente com um leitor ELISA a 450 nm contra 620 nm (ou 690 nm) como referência. Alternativamente, a absorção foi medida a 405 nm contra 620

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42/43 nm como referência quando a extinção do padrão mais alto excedeu a faixa do fotômetro. De nota, a intensidade da mudança de cor é sensível à temperatura. Protocolos de acordo com Calprotectina (MRP8/14) ELISA IDK® Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemanha).

[0088] Os resultados comparativos foram avaliados usando o Analyse-it de Excel (Software Analyse-lt, Ltd., Leeds RU). Ajuste de regressão Passing Bablok foi utilizado para análise de comutabilidade dos ensaios tubidimétricos (e ELISA).

[0089] Em sumário, foi proporcionado um ensaio imunoturbidimétrico para calprotectina, em particular, para determinação de calprotectina em uma matriz fecal ou em soro e outros fluidos e amostras corporais, o qual se baseia em anticorpos monoclonais de mamíferos específicos a calprotectina quando presente nos grânulos ácidos de granulócitos neutrofílicos. Tais monoclonais foram criados contra subunidades de calprotectina em pH baixo e também se ligam a essas subunidades no pH fornecido. É necessária uma calibração específica do analito de calprotectina, uma vez que este analito pode (auto) agregar e formar multímeros complexos na presença de cálcio, o que interfere na medição turbidimétrica. A rastreabilidade metrológica e a comutabilidade dos resultados são necessárias no trabalho clínico em laboratório. Os autores verificaram que os monoclonais de camundongo descritos se ligam à calprotectina principalmente como heterodímero (S100A8/A9) e que formação de multímeros pode ser inibida por um tampão orgânico que coordena os íons de cálcio. A presença de um tensoativo é recomendada e mais preferida é a adição de um tensoativo aniônico quando as subunidades de calprotectina apresentam um pl de 6,1 e 6,3 e a reação imunoturbidimétrica é realizada sob um pH abaixo de 6,0, preferencialmente, sob um pH entre 5,0 e 6,0. Os componentes da reação devem apresentar uma osmolalidade acima de 150 mosm/kg para aglutinação adicional. A rastreabilidade metrológica

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43/43 e comutabilidade dos resultados foram comprovadas contra diferentes imunoensaios convencionais, empregando anticorpos monoclonais e policlonais (mas utilizando tampões convencionais sob pH fisiológico).

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método in vitro de medição da presença de calprotectina em uma amostra biológica de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) coletar uma quantidade predeterminada da amostra biológica;

   b) solubilizar e extrair a referida amostra biológica em uma quantidade predeterminada de tampão orgânico aquoso apresentando i) um pH entre 5,0 e 6,0, ii) uma osmolalidade de pelo menos 150 mosmol/kg de H2O, iii) 0,01 a 0,1% em peso de tensoativo aniônico, iv) em que as moléculas de tampão orgânico podem coordenar-se e sequestrar íons de cálcio e zinco, e iv) e, opcionalmente, homogeneizar e extrair a matriz da amostra biológica, seguido por uma remoção de qualquer material particulado para se obter uma solução de amostra com uma presença solubilizada de calprotectina (S100A8/A9) essencialmente heterodimérica;

   c) misturar uma quantidade definida da referida solução de amostra de etapa (b) com uma quantidade de reagente compreendendo nanopartículas apresentando dois ou mais anticorpos monoclonais imobilizados ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a um de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9) para se obter reação de anticorpo-antígeno ligado a partículas com calprotectina (S100A8/A9); estando presente em um estado molecular definido;

   d) incubar a mistura de etapa c) durante um intervalo de tempo; e

   e) adquirir uma propriedade óptica da mistura e determinar um sinal indicativo do teor de calprotectina (S100A8/A9) com base na propriedade óptica da mistura;

   f) relacionar 0 referido teor com um controle calibrado e avaliar a condição clínica do paciente com base na presença medida

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2. 2/4 de calprotectina (S100A8/A9) na amostra biológica.

   2. Método de medição de calprotectina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que quantidade determinada é rastreável metrologicamente com um calprotectina padrão isolada de granulócitos com compartimentos lisossômicos intactos e determinada por anticorpos policlonais monoespecíficos.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa e) de adquirir uma propriedade óptica compreende determinar um valor de absorvância, transmitância, reflectância, dispersão de luz, fluorescência ou cintilação.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é um imunoensaio turbidimétrico ou nefelométrico.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partículas (IETIP) em que as etapas b) e c) compreendem o uso de dois componentes reagentes.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de nanopartículas apresentando diâmetros de 150 a 350 nm de sensibilidade elevada.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são ligados a dois tipos de partículas apresentando diâmetros homogêneos na faixa de i) 150 a 200 nm e ii) de 250 a 350 nm de faixa de medição elevada.
8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as referidas partículas são partículas de poliestireno carboxilado ou poliestireno ativado com clorometila.
9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é fezes ou um extrato de fezes.

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10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a composição tampão é produzida de pelo menos um sal selecionado do grupo que compreende: ácidos policarboxílicos, ácidos tricarboxílicos, ácidos aconíticos, ácidos tricarbalílicos, ácidos dicarboxílicos, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adipínico, ácido pimelínico, ácidos alfa, beta e gama-hidroxicarboxílicos, ácidos hidroxidicarboxílicos, ácido málico, ácido cítrico, ácidos tartráticos, ácido malônico, ácido glicônico, ácido 5-cetoglicônico, ácido 2-cetoglicônico, ácido dihidroximaleico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido nitrilotriacético, ácido lático e/ou ácido ascórbico.
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a reação de anticorpoantígeno ligado com partícula é realizada em uma mistura apresentando um pH entre 5,0 e 6,0 e, compreendendo um tensoativo aniônico ou dodecilsulfato de sódio e moléculas de tampão coordenado com Ca²⁺.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão sequestrante de cálcio da etapa b) compreende pelo menos um sal de citrato, acetato ou maleato, albumina sérica tratada com protease, e 0,01 a 0,1 por cento em peso de tensoativos aniônicos.
13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende a adição ou presença de antissoro de IgM inespecífico.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é sangue, soro ou plasma.
15. 15. Kit de teste para medição da presença de calprotectina em uma amostra biológica por um imunoensaio turbidimétrico intensificado com partícula como definido em qualquer uma das reivindicações

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    1 a 14 posteriores, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro componente reagente aquoso compreendendo:

    - 20 a 1.000 mmol/L de tampão orgânico com um pH na faixa de 5,0 a 6,0;

    - 50 a 300 mmol/L de sal de sódio, potássio ou lítio;

    - 0,1 a 1,5% de albumina sérica tratada com protease;

    - 0,01 a 0,1% (p/v) de dodecilsulfato de sódio, e opcionalmente, beta-aldoses, triose, tetroses, pentoses, hexoses, glucano, dextrano e/ou açúcar para alcançar uma osmolalidade de pelo menos 200 mmosM/L;

    e um segundo componente reagente compreendendo 0,01 a 0,5% (p/v) de partículas de látex de 150 a 350 nm de diâmetro transportando anticorpos monoclonais imobilizados que se ligam a uma de S100A8 e S100A9 ou calprotectina (S100A8/A9).