BR112019015768A2

BR112019015768A2 - Efeitos de uma pluralidade de mutações para melhorar a resistência/tolerância a herbicida em arroz

Info

Publication number: BR112019015768A2
Application number: BR112019015768-9A
Authority: BR
Inventors: Bernacchi Dario; Knepper Caleb
Original assignee: Ricetec, Inc.
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2020-03-17
Also published as: US20180216128A1; US20240074374A1; CO2019006209A2; US20240008436A1; PH12019501515A1; UY37584A; WO2018144180A1; CN110545659A; US11877553B2

Abstract

descreve-se arroz que é tolerante/resistente aos inibidores de ahas/als devido a uma pluralidade de mutações que atuam sinergisticamente para proporcionar resistência/tolerância ao herbicida. a tolerância/resistência deve-se à presença de mutações combinadas no arroz que levam a substituições de aminoácidos (a205v e g654e) na enzima ahas/als. o uso do arroz para o controle de plantas daninhas e métodos de produção de arroz tolerante/resistente também são divulgados.

Description

“EFEITOS DE UMA PLURALIDADE DE MUTAÇÕES PARA MELHORAR A RESISTÊNCIA/TOLERÂNCIA A HERBICIDA EM ARROZ”

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] O pedido reivindica o benefício de prioridade sob o artigo 35 USC § 119(e) para o Pedido Provisório U.S. No. 62/452,800, depositado em 31 de janeiro de 2017, Pedido Provisório U.S. No. 62/453,094, depositado em 1 de fevereiro de 2017, Pedido Provisório U.S. No. 62/508,264, depositado em 18 de maio de 2017, e Pedido Provisório U.S. No. 62/573,451, depositado em 17 de outubro de 2017. As divulgações estabelecidas nos pedidos referidos neste documento são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

FUNDAMENTOS

Listagem de Sequências.

[002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 27 de dezembro de 2017, é denominada 269608_ SEQ_ST25.txt e tem 65.409 bytes de tamanho.

[003] Descreve-se arroz mutante que é (1) resistente/tolerante aos inibidores de AHAS/ALS, especialmente os herbicidas da classe das imidazolinonas (IMI), a uma concentração relativamente alta de inibidores, e (2) em que as mutações efetuam respostas sinérgicas aos herbicidas no arroz. Métodos para o controle de plantas daninhas que utilizam arroz resistente/tolerante a herbicidas com estas mutações como culturas em campos são divulgados. Métodos para a produção de arroz resistente/tolerante a herbicida também são divulgados.

Valorização das Culturas de Arroz.

[004] O arroz é uma antiga cultura agrícola e hoje é uma das principais culturas alimentares do mundo. Existem duas espécies de arroz cultivadas:

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Oryza sativa L, o arroz asiático, e Oryza glaberrima Steud, o arroz africano. A espécie asiática constitui praticamente todo o arroz cultivado no mundo e é a espécie cultivada nos Estados Unidos. Três grandes regiões produtoras de arroz existem nos Estados Unidos: o Delta do Mississippi (Arkansas, Mississippi, nordeste da Louisiana, sudeste do Missouri), a Costa do Golfo (sudoeste de Louisiana, sudeste do Texas) e o Vale Central da Califórnia. Outros países, em especial na América do Sul e no Oriente, são os principais produtores de arroz.

[005] O arroz é uma das poucas culturas que podem ser cultivadas em uma inundação rasa, pois tem uma estrutura única que permite a troca de gases através dos caules entre as raízes e a atmosfera. O crescimento em uma inundação rasa resulta em melhor produtividade e é a razão pela qual o arroz é geralmente cultivado em solos argilosos pesados ou solos com uma camada dura impermeável logo abaixo da superfície do solo. Esses tipos de solo geralmente não são adequados para outras culturas ou, na melhor das hipóteses, a produtividade agrícola é ruim.

[006] O aperfeiçoamento constante do arroz é imperativo para fornecer a nutrição necessária para uma população mundial crescente. Uma grande parte da população mundial consome arroz como sua principal fonte de nutrição, e as culturas devem prosperar em várias condições ambientais, incluindo a competição com plantas daninhas e ataques de agentes desfavoráveis. O aperfeiçoamento do arroz é realizado através de práticas de melhoramento convencionais e também por técnicas de genética recombinante. Embora pareça simples para aqueles que não pertencem a esta área, o aperfeiçoamento das culturas requer uma habilidade científica e artística apurada e os resultados são geralmente imprevisíveis.

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3/35 [007] Embora os objetivos específicos de melhoramento variem um pouco nas diferentes regiões produtoras de arroz do mundo, aumentar a produtividade é um objetivo prioritário em todos os programas.

[008] O melhoramento de plantas começa com a análise e a definição dos pontos fortes e fracos das cultivares existentes, seguido pelo estabelecimento de metas de programa para melhorar as áreas de fragilidade para produzir novas cultivares. Os objetivos específicos de melhoramento incluem combinar, em uma única cultivar, uma combinação melhorada de características desejáveis provenientes das fontes parentais. Características desejáveis podem ser introduzidas devido a mutações espontâneas ou induzidas. Características desejáveis incluem maior produtividade, resistência ao estresse ambiental, doenças, insetos e, caules e raízes melhores, tolerância a temperaturas baixas, características agronômicas, valor nutricional e qualidade de grãos melhores.

[009] Por exemplo, o melhorista (ou criador) seleciona e cruza inicialmente duas ou mais linhagens parentais, seguidas pela seleção das características desejadas entre as diversas combinações genéticas novas. O melhorista pode, teoricamente, gerar bilhões de combinações genéticas novas e diferentes através do cruzamento. O melhoramento pelo uso do cruzamento e autofecundação não implica controle direto no nível celular. No entanto, esse tipo de controle pode ser alcançado, em parte, pelo uso de técnicas de genética recombinante.

[010] O melhoramento genealógico é usado comumente para o aperfeiçoamento de culturas autopolinizantes, como o arroz. Por exemplo, dois genitores que possuem traços complementares favoráveis são cruzados para produzir uma geração Fi. Um ou ambos os genitores podem representar uma Fi de um cruzamento anterior. Subsequentemente, produz-se uma população

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4/35 segregante, pelo cultivo das sementes resultantes da autofecundação de uma ou várias Fis, se os dois genitores forem de linhagens puras, ou pelo cultivo direto da semente resultante do cruzamento inicial, se pelo menos um dos genitores for uma Fi. A seleção dos melhores genomas individuais pode começar na primeira população segregante ou F2; em seguida, começar na F3, os melhores indivíduos nas melhores famílias são selecionados. “Melhor” é definido de acordo com os objetivos de um programa de melhoramento específico, por exemplo, aumentar 0 rendimento, resistir a doenças. Em geral, uma abordagem multifatorial é usada para definir “melhor” por causa das interações genéticas. Um gene desejável em um background genético pode diferir em um background diferente. Além disso, a introdução do gene pode interferir em outras características genéticas favoráveis. Testes de famílias replicados podem começar na geração F4 para melhorar a eficácia da seleção das características com baixa hereditariedade. Em um estágio avançado de endogamia (isto é, Fe e F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente semelhantes são testadas quanto à liberação potencial como novas linhagens parentais.

[011] O melhoramento por retrocruzamento tem sido utilizado para transferir genes para uma característica altamente hereditária em uma cultivar homozigota desejável ou linhagem endogâmica que é 0 genitor recorrente. A fonte da característica a ser transferida é chamada de genitor doador. Esperase que a planta resultante tenha os atributos do genitor recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida do genitor doador. Após 0 cruzamento inicial, os indivíduos que possuem 0 fenótipo desejado do genitor doador são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) com 0 genitor recorrente. O processo é usado para recuperar todas as características

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5/35 benéficas do genitor recorrente com a adição da nova característica fornecida pelo genitor doador.

[012] Linhagens de reprodução avançadas e promissoras são exaustivamente testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) alvo comercial(is) por pelo menos três anos ou mais. As melhores linhagens são candidatas a novas variedades comerciais ou genitores de híbridos; aquelas que ainda são deficientes em algumas características podem ser utilizadas como genitores para produzir novas referências para seleção posterior.

[013] Esses processos, que levam à etapa final de comercialização e distribuição, levam geralmente de 8 a 12 anos a partir do momento em que o primeiro cruzamento é realizado e podem depender do desenvolvimento das linhagens de reprodução melhoradas como precursores. Portanto, o desenvolvimento de novas cultivares não é apenas um processo que consome muito tempo, mas requer planejamento antecipado preciso, uso eficiente de recursos e um mínimo de mudanças de direção. Os resultados incluem novas combinações genéticas não encontradas na natureza.

[014] Qualquer aperfeiçoamento do arroz através da reprodução pode ser restrito à variação genética natural no arroz e espécies híbridas, como o arroz selvagem. A introdução de novas variações em um programa de melhoramento é realizada geralmente por meio do programa de cruzamentos, como descrito, como o melhoramento genealógico ou por retrocruzamento. No entanto, ocasionalmente, são encontradas mutações naturais que resultam na introdução de novas características, como resistência a doenças ou alterações de altura. Os melhoristas também desenvolveram novas características ao induzir mutações (pequenas mudanças na sequência de DNA) em um genoma de arroz. Algumas dessas mutações ou combinações dos genes não são encontradas na

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6/35 natureza. Comumente, EMS (metanossulfonato de etila) ou azida sódica mais MNU (N-metil-N-nitrosourea) são utilizados como agentes mutagênicos. Esses produtos químicos induzem aleatoriamente alterações de base única no DNA, geralmente de G e C alteradas para A e T. Os efeitos gerais são imprevisíveis. A maioria dessas mudanças não tem efeito sobre a cultura, porque ocorrem fora das regiões codificantes do gene ou não alteram a sequência de aminoácidos do produto gênico. No entanto, algumas produzem novas características ou incorporam novas alterações de DNA nas linhagens anteriores.

[015] O melhorista não tem controle direto dos sítios de mutação na sequência do DNA. A identificação de alterações úteis decorre geralmente da possibilidade aleatória que uma mutação efetiva será induzida, e do melhorista reconhecer os efeitos fenotípicos da alteração e ser capaz de selecionar o arroz com essa mutação para a produção. As sementes são tratadas com um produto químico mutagênico e imediatamente plantadas para crescerem. As plantas resultantes são designadas como MO como a população mutada inicial. MO, selecionada ou não, pode ser autofecundada em culturas autógamas, como arroz, para produzir a progênie M1 e, posteriormente, M2, M3, e assim por diante, conforme a população avança. A semente M2 carregará inúmeras variações novas; portanto, dois experimentos não produzirão as mesmas combinações. Entre essas variações, novas características que não existiam anteriormente no arroz e que não estavam disponíveis anteriormente para seleção por um melhorista de plantas ou fitogeneticista, podem ser encontradas e usadas para o aperfeiçoamento do arroz.

[016] Para encontrar novas características, o melhorista deve usar estratégias de seleção eficientes e direcionadas, visto que o processo é completamente aleatório e possui uma frequência extremamente baixa de novas combinações úteis. Entre milhares de novas variantes genéticas induzidas, pode

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7/35 haver apenas uma com uma nova característica desejável. Um sistema de seleção ideal irá filtrar milhares de novas variantes e permitir a detecção de poucas ou até mesmo de uma única planta que possa ter uma nova característica. Depois de identificar ou encontrar uma possível nova característica, o melhorista deve desenvolver uma nova cultivar por melhoramento genealógico ou por retrocruzamento e testes extensivos para verificar se a nova característica e cultivar exibe valor estável e hereditário para os produtores de arroz. Após uma mutação ser identificada por qualquer meio, ela pode ser transferida para o arroz por técnicas recombinantes.

Resistência ao herbicida no arroz.

[017] As plantas daninhas nos campos de cultura competem por recursos e reduzem bastante a produtividade e a qualidade da cultura. As plantas daninhas têm sido controladas nas lavouras através da aplicação de herbicidas seletivos que matam as plantas daninhas, mas não prejudicam a lavoura. Normalmente, a seletividade dos herbicidas é baseada em variações bioquímicas ou diferenças entre a cultura e as plantas daninhas. Alguns herbicidas não são seletivos, o que significa que matam todas ou quase todas as plantas. Herbicidas não seletivos ou de largo espectro podem ser utilizados em culturas apenas se estas possuem um mecanismo genético que confira tolerância aos herbicidas. As culturas podem ser convertidas em “Tolerância a Herbicidas” (HT) se novos genes que expressam proteínas específicas que transmitem tolerância ou resistência ao herbicida são inseridos. A resistência a herbicidas também foi alcançada em culturas por meio de mutações genéticas que alteram proteínas e processos bioquímicos. Essas mutações podem surgir na natureza, mas na maioria das culturas identificadas, elas foram efetuadas pelo melhorista.

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8/35 [018] Em alguns casos, especialmente com o uso repetido de um determinado herbicida, as plantas daninhas desenvolveram resistência pela seleção não intencional de mutações naturais que fornecem resistência. Quando as plantas daninhas se tornam resistentes a um determinado herbicida, esse herbicida não é mais útil para o controle das plantas daninhas. O desenvolvimento da resistência em plantas daninhas pode ser retardado alternando-se o uso dos herbicidas com diferentes modos de ação para controlar as plantas daninhas, o que interrompe o desenvolvimento das plantas daninhas resistentes.

[019] A produção de arroz é assolada por pragas folheares e gramíneas daninhas que são difíceis de controlar, entre as quais há uma planta daninha particularmente difícil de controlar chamada arroz vermelho. Uma dificuldade surge porque o arroz vermelho é tão geneticamente similar ao arroz cultivado (ocasionalmente se polinizam) que não há herbicidas seletivos disponíveis que tenham como alvo o arroz vermelho, sem que prejudiquem o arroz cultivado. Atualmente, o controle é proporcionado na produção comercial de arroz através do desenvolvimento de mutações encontradas no arroz que tornam o arroz resistente a herbicidas de largo espectro, por exemplo, os herbicidas imidazolinona e sulfonilureia. Culturas de arroz resistentes a herbicidas que inibem outras plantas deletérias, como plantas de folhas largas, são necessárias.

[020] Encontrar novas mutações no arroz que melhorem a resistência a herbicidas beneficiaria muito a produção de arroz. A obtenção e incorporação de genes e combinação de genes para o aumento da resistência a herbicidas nos genomas de arroz, ao mesmo tempo que mantém as características favoráveis para sustentar ou melhorar a aptidão, é desafiador, imprevisível, demorado e caro, mas necessário para atender às crescentes necessidades alimentares do mundo.

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SUMÁRIO [021] Linhagens e híbridos de arroz novos e distintos com resistência única a herbicidas, em particular, herbicidas inibidores de AHAS/ALS encontramse descritos e divulgados no presente documento¹. A resistência conferida às plantas de arroz pelas substituições A205V/G6254E na sequência de aminoácidos AHAS/ALS, quando as plantas de arroz são desafiadas por herbicidas IMI, é significativamente maior do que a resistência/tolerância mostrada por uma planta de arroz carregando apenas A205V ou G654E. A uniformidade é devida a uma combinação de mutações genéticas que levam a aumentos sinérgicos na tolerância/resistência a herbicidas no arroz com a combinação de mutações genéticas, em comparação com os níveis de tolerância/resistência causados pelas mutações genéticas individuais.

[022] Várias mutações na sequência codificante de ácidos nucleicos para a enzima AHAS/ALS² provocam substituições de aminoácidos que, quando expressas em arroz, resultam em uma enzima resistente aos herbicidas IMI tolerantes. A FIG. 1 ilustra o alinhamento de sequências de ácidos nucleicos que codificam as sequências de aminoácidos de AHAS/ALS em 2 linhagens de arroz, uma (0001 -2-2) contendo uma mutação que causa a substituição A205V e outra, (80034-5), que causa a substituição G654E. São ilustradas também as sequências em arroz selvagem (P1003) e R0146, uma linhagem parental exclusiva. As substituições designadas de aminoácidos codificadas estão listadas nas caixas abaixo dos códons mutados. A FIG. 2 ilustra as posições de algumas das substituições de aminoácidos de AHAS/ALS conhecidas [205 (179), 653 (627), 654 (628)]³.

¹ Para nomes de alguns herbicidas “IMI” adequados, consulte “DEFINIÇÕES”.

² O gene que codifica a proteína aceto-hidroxiácido sintase (AHAS, EC2.2.1.6), também referida como acetolactato sintase (ALS) no arroz está presente em um único lócus no arroz listado no lócus LOC_Os06g51280 no banco de dados anotado. - http://rice.plantbiology.msu.edu/cgibin/ORF_infopage.cgi?orf=LOC_Os02g30630.1

Usando os números de posição do Blackgrass e do arroz.

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10/35 [023] O empilhamento (ou stacking) de ambas as mutações genéticas (designadas RTC1 e RTC2)⁴ é exemplificado pelos genomas de sementes a partir de três híbridos depositados sob o Tratado de Budapeste e designados na ATCC como PTA-123859, PTA-123860 e PTA-123861, respectivamente (vide Tabela 1).

[024] Inesperadamente, o sinergismo apresentado em termos de tolerância a herbicidas IMI é claramente maior do que a soma da dose/tolerância manifestada pela proteína AHAS que carrega uma única mutação A205V ou uma única mutação G654E. Usando os dados de múltiplos experimentos (identificados como 15SA-T11, 16-T7, 16GH-T7) realizados em 2 anos, em múltiplos sítios, com múltiplos herbicidas imidazolinona diferentes (imazetapir, imazamox e imazetapic) e múltiplas linhagens, estimou-se que a interação específica das duas mutações únicas RTC1 + RTC2, quando agem em conjunto (RTC1-RTC2), e expressa como a prevenção adicional do % lesão relativa às mutações individuais, pode ser estimada como a redução de -25% da taxa de lesão em doses de 1X, redução de -55% da lesão em 2X, -65% em 3X e redução de -67% em 4X (FIG. 10 A).

[025] É um resultado surpreendente e inesperado encontrar resistência/tolerância a herbicidas afetada por uma combinação de mutações que levam a duas substituições diferentes em uma enzima alvo - AHAS/ALS, como aqui divulgado. É particularmente inesperado que a combinação produza uma resposta sinérgica - percentual menor de danos devido a exposição ao herbicida no arroz com a combinação, do que no arroz com uma ou outra mutação. É importante ressaltar que a produtividade não foi afetada de forma deletéria, como relatado em algum arroz resistente/tolerante a herbicida mutante.

⁴ RTC1 causou a substituição de aminoácido A205V na enzima AHAS/ALS, em que a valina substitui a alanina, e o RTC2 causou a substituição G654E, em que o ácido glutâmico substitui a glicina

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11/35 [026] Como essas mutações afetam a mesma enzima e estão no mesmo gene, pode-se esperar, no máximo, um efeito aditivo e, provavelmente, um efeito negativo sobre a enzima. Inesperadamente, o sinergismo no nível de tolerância ao herbicida resultou em outras características sem efeitos deletérios (Tabelas 4, 5).

[027] O mecanismo de tolerância a herbicidas foi classificado grosseiramente em dois grupos: tolerância a herbicida no sítio alvo (target site tolerance) e no sítio não-alvo (non-targetsite tolerance). A tolerância ao herbicida no sítio alvo é causada pelo impedimento da ligação do herbicida à enzima alvo, provocada por mutações pontuais que ocorrem no alvo. Os mecanismos moleculares da tolerância ao herbicida no sítio alvo são regulados principalmente por um único gene que codifica uma enzima alvo portador de uma mutação pontual. Os híbridos divulgados neste documento têm uma combinação de 2 mutações pontuais.

[028] Um método para controlar plantas daninhas em um campo de arroz é descrito neste documento, em que o arroz no campo inclui plantas resistentes aos herbicidas IMI. O método inclui:

a. usar arroz resistente/tolerante a herbicidas no campo; e

b. colocar o campo de arroz em contato com pelo menos um herbicida, ou uma pluralidade de herbicidas, por exemplo, qualquer um que possa pertencer à família de produtos químicos conhecidos como inibidores de AHAS/ALS, ou qualquer um que possa pertencer à classe de herbicidas conhecida como herbicidas inibidores de AHAS/ALS.

[029] Um método para o cultivo de plantas de arroz resistentes/tolerantes a herbicidas inclui (a) plantar sementes de arroz resistentes; (b) permitir que as sementes de arroz germinem; (c) aplicar um ou

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12/35 mais herbicidas aos brotos de arroz em níveis herbicidas que normalmente inibiríam o crescimento de uma planta de arroz.

[030] Os métodos para a produção de plantas de arroz tolerantes a herbicidas podem usar também um transgene ou pluralidade de transgenes. Uma forma de realização de tal método é a transformação de uma célula de uma planta de arroz com transgenes, em que os transgenes codificam 2 mutações diferentes, cada uma resultando na resistência do arroz aos inibidores IMI. Qualquer célula adequada pode ser usada na prática destes métodos, por exemplo, a célula pode estar na forma de um calo. As mutações específicas reveladas aqui incluem aquelas que causam as substituições A205V e G654E na enzima AHAS/ALS. Com esta combinação, o sinergismo na resistência foi efetuado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [031] FIG. 1 ilustra um alinhamento de sequências de ácidos nucleicos entre a linhagem de arroz selvagem P1003 (SEQ ID NO: 1), a linhagem parental específica R0146 (SEQ ID NO: 3), e uma linhagem que apresenta uma mutação que codifica uma substituição A205 (179)V (SEQ ID NO: 2) e outra linhagem com G654 (628)E (SEQ ID NO: 4).

[032] FIG. 2 ilustra o alinhamento da sequência de aminoácidos de AHAS/ALS das substituições nas posições 205 (SEQ ID NO: 5), 653 (SEQ ID NO: 6) e 654 (SEQ ID NO: 7); em que P1003 (SEQ ID NO: 10) e R0146 (SEQ ID NO: 11) são linhagens de arroz não mutadas; Nipponbare (SEQ ID NO: 12) e Arabidopsis (SEQ ID NO: 13) também são ilustrados. FIG. 2 também divulga as SEQ ID NOS: 8-9, respectivamente, por ordem de aparição (Cyp-MT-653, CypWT). Os espaços em branco ilustram o não alinhamento.

[033] FIG. 3A a FIG. 3I ilustram os resultados do Exemplo 1: FIG. 3A Controle; FIG. 3B 0,5X Imazamox; FIG. 3C 1X Imazamox; FIG. 3D 2X Imazamox;

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FIG.3E 4X Imazamox; FIG. 3F 1X Imazetapir + 0,5X Imazamox; FIG. 3G 1X Imazetapir + 1X Imazamox; FIG. 3H 1X Imazetapir + 2X Imazamox; FIG. 3I 1X Imazetapir + 4X Imazamox; Vasos E para D: LF2-RTC2/LM1-RTC1, LF1RTC2/LM1-RTC1, LF3-RTC2/LM4-RTC1, linhagem mutada P1003A205V, linhagem mutada R0146G654E, variedade comercial de controle sensível Cypress, híbrido comercial CLXL745.

[034] FIG. 4 ilustra graficamente os resultados do Exemplo 1.

[035] FIG. 5A a FIG. 5 D ilustram os resultados do Exemplo 2: FIG. 5A; Controle; FIG. 5B 8X; FIG. 5C 1X; FIG. 5D 0,25X; Ordem de plantio da E para D: P1003A205V, R0146G654E, P1003, LF2-RTC2/LM1-RTC1, LF3-RTC2/LM4RTC1.

[036] FIG. 6 ilustra graficamente os resultados do Exemplo 2.

[037] FIG. 7 ilustra graficamente os resultados do Exemplo 3.

[038] FIG. 8 é uma ilustração gráfica do percentual de lesões 4 semanas após a aplicação pré-inundação.

[039] FIG. 9 é uma comparação gráfica da produtividade após várias doses de herbicidas IMI: controle comparada a várias linhagens e híbridos de arroz.

[040] FIG. 10A e FIG. 10B ilustram o percentual médio de lesões 3 semanas após a última aplicação de herbicida nos ensaios [15SA-T11, 16-T7, 16GH-T7], que incluíram experimentos independentes com ingredientes ativos únicos imazetapir, imazamox ou imazetapic e combinações em aplicações sequenciais; realizou-se a média dos dados sobre os efeitos em todos os experimentos para cada linhagem, apenas RTC1, apenas RTC2 ou RTC1-RTC2; Os efeitos sinérgicos das interações RTC1 + RTC2 são expressos como % de lesão observada RTC1 + RTC2 menos % de lesão esperada RTC1 + RTC2, e calculados como [(RTC1+RTC2)-(RTC1XRTC2/100)]; FIG. 10A ilustra o

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14/35 percentual médio de lesão 3 semanas após a aplicação de herbicidas e os efeitos sinérgicos de RTC1-RTC2 calculados como indicado acima; FIG. 10B ilustra graficamente o percentual médio % de lesão em diferentes doses de aplicação para as linhagens de mutação única homozigotas, RTC1 e RTC2 e o duplo hemizigoto RTC1/RTC2.

DESCRIÇÃO DETALHADA [041] Linhagens de arroz com diferentes genes de resistência a herbicidas, piramidados ou empilhados no mesmo background genético ou, como produtos isolados que são usados alternativamente na rotatividade usada pelo agricultor, representam uma ferramenta ou estratégia crítica na extensão da vida útil dos herbicidas, visto que essas práticas retardam o desenvolvimento de variantes resistentes a herbicidas entre as plantas daninhas alvo. Vários métodos são possíveis para implantar essas resistências em híbridos ou variedades para o controle de plantas daninhas, bem como opções para a produção de sementes híbridas. As linhagens de arroz descritas neste documento representam novos métodos para o controle de plantas daninhas em arroz e podem ser implantadas em qualquer uma das muitas estratégias possíveis para controlar plantas daninhas e proporcionar o uso a longo prazo desses e de outros métodos de controle de plantas daninhas.

O novo efeito das duplas mutações na proteína AHAS [042] AHAS é uma enzima importante em plantas e microrganismos que catalisa a formação de acetolactato a partir do piruvato, o primeiro passo na biossíntese dos aminoácidos valina e isoleucina. O complexo proteico funcional pode ter uma estrutura de homodímero ou homotetrâmero e apresenta tanto grandes subunidades catalíticas quanto pequenas subunidades reguladoras.

[043] A subunidade reguladora estimula a atividade da subunidade catalítica e confere sensibilidade à inibição por feedback de aminoácidos de

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15/35 cadeia ramificada. Como a estrutura cristalina de AHAS está bem caracterizada para Arabidopsis thaliana, foi possível (1) identificar os sítios de ligação ao herbicida AHAS (2) estabelecer e compreender a interação molecular entre AHAS, seus cofatores e os herbicidas que a afetam. O sítio catalítico da AHAS é profundo dentro de um canal da proteína, mas vale ressaltar que os herbicidas AHAS não se ligam dentro do sítio catalítico. Em vez disso, eles se ligam através de um domínio de ligação a herbicidas que atravessa a entrada do canal, bloqueando, assim, o acesso do substrato ao sítio catalítico e interrompendo o metabolismo normal da enzima causando a morte da planta. Através deste domínio, muitos resíduos de aminoácidos estão envolvidos na ligação ao herbicida. Os herbicidas AHAS estruturalmente diferentes orientam-se diferentemente no domínio de ligação ao herbicida, causando um nível variável de interação para qualquer determinada substituição. As substituições específicas de aminoácidos dentro do domínio de ligação ao herbicida podem conferir resistência a alguns, mas não a outros, herbicidas AHAS (vide revisão em Powles e Yu, 2010).

[044] Apesar do grande número de mutações únicas espontâneas ou induzidas bem caracterizadas em muitos dos resíduos de aminoácidos, nenhuma delas apresentou substituições simultâneas em 2 ou mais substituições ativas nos resíduos de aminoácidos críticos do gene AHAS. Além disso, dada a proximidade desses diferentes sítios ativos de ligação a herbicidas, é impossível também empilhá-los a partir de doadores de mutação única em um único genoma de base (background genome) por meio da reprodução sexuada. Essa limitação existe simplesmente por causa da extraordinária improbabilidade de tal evento de recombinação específico. Assim, a novidade do produto RTC1RTC2 que suplanta efetivamente a então combinação improvável de mutações múltiplas na proteína AHAS em arroz híbrido é descrita aqui. Os híbridos foram

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16/35 produzidos através da combinação dos dois alelos mutados diferentes no locus da AHAS, os quais, por sua vez, produzem um complexo proteico funcional que contém subcomponentes de ambas as formas. Surpreendentemente, o resultado é o de conferir ao arroz a tolerância sinérgica ao herbicida quando comparado com os efeitos de mutação única da forma pura.

Aplicações de arroz com 2 mutações diferentes [045] As células derivadas de sementes resistentes a herbicidas, plantas desenvolvidas a partir destas sementes e células derivadas de tais plantas, descendentes das plantas que cresceram a partir dessas sementes e células derivadas dessas progênies estão dentro do escopo desta invenção. O crescimento das plantas produzidas a partir das sementes depositadas e a progênie de tais plantas serão tipicamente resistentes/tolerantes a herbicidas, por exemplo, um inibidor IMI em níveis herbicidas que normalmente inibiríam o crescimento de uma planta de tipo selvagem correspondente. Existem alguns níveis naturais (não-induzidos) de tolerância a alguns herbicidas, mas eles não são capazes de proteger as plantas em níveis que seriam comercialmente úteis.

[046] Um método para o controle do crescimento de plantas daninhas no entorno das plantas de arroz resistentes/tolerantes a herbicidas encontra-se também dentro do escopo da invenção. Um exemplo de tais métodos é a aplicação de um ou mais herbicidas aos arrozais em níveis herbicidas que normalmente inibiríam o crescimento de uma planta de arroz. Por exemplo, pelo menos um herbicida inibe a atividade de AHAS/ALS.

[047] Para maximizar o controle das plantas daninhas em um campo de arroz, diferentes herbicidas podem ser necessários para cobrir o espectro de plantas daninhas presentes e, por sua vez, várias aplicações ao longo do ciclo de cultivo podem ser necessárias para qualquer herbicida particular dependendo da sobreposição entre a janela de controle efetivo proporcionada por uma única

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17/35 aplicação e a janela de tempo durante a qual a planta daninha-alvo pode germinar, o que muitas vezes é mais longa do que a proteção proporcionada por uma única aplicação de herbicida. As condições de temperatura e umidade do solo são fatores-chave que afetam tanto a janela de eficácia do herbicida quanto a janela do momento de germinação e crescimento das plantas daninhas. Com base nesses fatores, os modelos de controle por herbicidas geralmente incluem aplicações repetidas e sequenciais durante o ciclo de cultivo.

[048] Em um sistema padrão de tolerância a herbicida para resistência a herbicidas imidazolinona, por exemplo, um utilizado comercialmente em arroz nos dias de hoje, a primeira aplicação do herbicida é aplicada no estágio de 2 folhas, com a segunda aplicação seguindo um mínimo de 10 dias após e imediatamente antes do estabelecimento da inundação permanente quando as plantas estão brotando. O objetivo da segunda aplicação é eliminar as plantas daninhas que possam ter germinado após a primeira aplicação antes de serem efetivamente suprimidas pela inundação. Em algumas características, incluindo herbicidas inibidores ΊΜΓ, o momento das aplicações dos herbicidas pode ser crítico, não apenas para o controle eficaz das plantas daninhas, mas também para o nível de tolerância observado nas próprias plantas. A lesão vegetal observada em resposta à aplicação do herbicida pode alinhar estreitamente com a fase da planta. Em algumas linhagens em crescimento, as aplicações após a emergência inicial provocam lesão muito maior na fase de uma folha, sendo que a lesão observada declina em cada fase de crescimento da planta até o primeiro broto. Algumas características de tolerância a herbicidas não apresentam tolerância em aplicações pré-emergência, embora a tolerância pós-emergência seja excelente. Esta resposta herbicida variável ligada à fase de crescimento da planta requer testes cuidadosos para estabelecer os limites de uso seguro de um novo produto tolerante a herbicida.

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18/35 [049] Uma pluralidade inclui, por exemplo, pelo menos 2 herbicidas ΊΜΓ.

[050] Ao considerar as combinações de diferentes genes de resistência a herbicidas, independentemente de a combinação incluir dois ou mais modos diferentes de ação para o mesmo herbicida, ou dois ou mais genes para herbicidas de diferentes famílias ou funções, pode-se observar interações antagônicas ou sinérgicas resultantes das interações intergênicas, como algumas das formas de realização descritas aqui evidenciaram. A combinação dos novos genes mutantes resistentes aos herbicidas inibidores de AHAS/ALS descritos neste documento resulta na tolerância a herbicidas que é muito superior à resistência aditiva dos dois genes agindo individualmente, o que demonstra um sinergismo. (FIGs. 3-6; Exemplos 1-4).

[051] A produção de arroz com boa produtividade requer práticas específicas de controle de plantas daninhas. Alguns herbicidas são aplicados como pré-emergentes - após o plantio, mas antes da emergência da cultura; e outros, como pós-emergentes. No caso do arroz, a aplicação pós-emergente pode ser antes que as lavouras sejam inundadas, ou depois. Os tempos de aplicação preferenciais se baseiam normalmente na fase de desenvolvimento da cultura, conforme definido pelo número de folhas abertas na planta em crescimento (Tabela 3: Estágios de Desenvolvimento do Arroz). O tempo da aplicação dos herbicidas é um fator importante, não apenas na perspectiva de maximizar a eficiência do controle das plantas daninhas, mas também na perspectiva de minimizar o impacto na cultura tolerante a herbicida. Esta consideração resulta do fato de as resistências aos herbicidas decorrentes de mutação, de ocorrência natural ou transgênicas, não serem, na maioria das vezes, completamente independentes dos efeitos do tempo de aplicação e dose. Diferentes genes de resistência a herbicidas têm respostas a dose diferentes, bem como respostas ao tempo de aplicação, pelo qual, tipicamente, a

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19/35 fitotoxicidade na cultura resistente aumenta à medida que a dose aumenta para além de um determinado nível, ou a fitotoxicidade à cultura resistente varia com diferentes tempos de aplicação para uma determinada dose de herbicida.

[052] A avaliação dos novos genes de resistência a herbicidas, matéria deste pedido, foi conduzida com uma gama de doses de herbicidas adequadas, que cobrem as taxas de aplicação tipicamente utilizadas nas operações de cultivo de arroz, levando em consideração também os desvios possíveis das doses recomendadas pelo fabricante. Considerando 1X, a dose recomendada pelos fabricantes ou a recomendada pela boa prática, as doses adicionais mais frequentemente avaliadas são 2X e 4X, sendo que alguns experimentos incluem outros valores.

[053] A linhagem RTC1 foi derivada da linhagem de arroz P1003. A RTC2 foi derivada de R0146 - uma linhagem privada de origem chinesa. Nenhuma destas duas linhagens tem qualquer tolerância aos herbicidas imidazolinona. Após o retrocruzamento para corrigir as mutações e remover efeitos indesejados, as características foram introgredidas em uma série de linhagens de arroz puras de modo a produzir uma gama de variedades híbridas de arroz adequadas a uma gama de diferentes exigências comerciais quanto à tolerância a herbicidas.

[054] A mutação A179 (205)V foi desenvolvida por mutagênese EMS a partir da linhagem P1003, também chamada Lemont, que é a variedade pública designada como Cypress. A mutação desenvolvida independentemente G628 (654)E foi obtida pelo processo de mutagênese química (Azida Sódica + MNU) a partir da linhagem privada R0146 de origem chinesa. Estas mutações foram independentemente fixadas por endogamia durante o processo de otimização da linhagem após a mutagênese e detecção precoce, e estão, por conseguinte, disponíveis em configuração homozigótica estável nas linhagens endogâmicas

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20/35 derivadas. Estas duas mutações independentes, localizadas no mesmo gene expresso em posições dentro da mesma proteína, não estão empilhadas em um estoque endogâmico. Felizmente, produtos híbridos com uma dose de cada alelo e que expressam ambas as modificações apresentam tolerância herbicida mais elevada do que as linhagens homozigóticas para ambos os genes e são, portanto, o produto alvo.

[055] Todos os materiais genéticos utilizados para o desenvolvimento destes mutantes, ou derivados nos mesmos, são de propriedade da RiceTec. Todos os marcadores utilizados foram desenvolvidos internamente a partir de sequências públicas disponíveis ou de informações de sequência derivadas dos mesmos materiais. Os herbicidas IMI padrão comerciais foram selecionados para o processo de seleção, utilizando-se a orientação do rótulo para determinar os parâmetros de uso do herbicida. A resposta ao herbicida foi determinada utilizando-se as taxas de lesão vegetal (vide Tabela 2).

[056] A Tabela 4 é uma comparação dos atributos morfológicos e fisiológicos/qualidade de grãos das linhagens híbridas de arroz RTC1-RTC2, em comparação com suas contrapartes não mutadas, para evidenciar que essas linhagens mutantes de arroz tolerantes a IMI são de alguma forma agronomicamente idênticas às suas contrapartes não mutadas. No geral, nenhuma diferença comercialmente relevante foi encontrada entre os híbridos de arroz RTC1-RTC2 e os seus controles não mutados (mesma linhagem original sem as mutações). A comparação dos híbridos contendo ambas as mutações com a mutação única e com a linhagem controle também mostrou poucas diferenças estatisticamente significativas, nenhuma das quais sendo biologicamente relevante. Sabe-se que os tratamentos mutagênicos resultam frequentemente em múltiplas alterações nas plantas regeneradas, mas estas

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21/35 linhagens foram retrocruzadas repetidas vezes e convertidas em linhagens endogâmicas, removendo-se, assim, as mutações indesejáveis do germoplasma.

[057] Os exemplos abaixo são ilustrativos da invenção, mas não limitantes.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Ensaio 16GH-T7: Imazamox (vide FIG. 3A a FIG. 3I e FIG. 4) [058] FIG. 3 Configuração do ensaio: O ensaio consistiu de 2 regimes de tratamento com aplicações de Imazamox aproximadamente na fase de préinundação com taxas de 0,5X, 1X, 2X ou 4X, isoladamente ou 2 semanas após a aplicação de imazetapir 1X.

[059] FIG. 4 Vasos representativos 4 semanas após a aplicação do Imazamox.

[060] Resumo: Os resultados deste estudo indicam que os híbridos IMI RiceTec (RT) apresentam um elevado grau de tolerância ao herbicida imazamox. Nenhuma lesão foi observada em qualquer um dos híbridos RT IMI sob qualquer tratamento. No entanto, a lesão foi observada nas linhagens mutantes de característica única. Isso era esperado, pois já é de conhecimento que a mutação G654E confere apenas um nível de tolerância fraco aos herbicidas IMI. Devido ao ensaio ter sido conduzido na estufa durante a difícil estação invernal, a resposta da lesão pode não ter sido exatamente igual à de um ensaio de campo ideal, mas dada a consistência da resposta em todos os tratamentos, os dados indicam que os híbridos RT IMI têm níveis iguais ou superiores de tolerância ao Imazamox do que os híbridos IMI comerciais atuais.

EXEMPLO 2: Ensaio com pulverizador logarítmico: 16-T7; Imazetapir (vide FIG. 5A, 5B, 5C, 5D; e FIG. 6)

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22/35 [061] Ensaio: a aplicação de herbicida único no estágio de 3-4 folhas utilizando o pulverizador logarítmico tipo meio passo (half-step) a taxas de 16X a 1/128X.

[062] Imagens do lote 3 semanas após a aplicação. A FIG. 5A Controle, FIG. 5B 8X, FIG. 5C 1X, FIG. 5D 0,25X. Ordem de plantio E para D: P1003A205V, R0146G654E, P1003, P1003, LF2-RTC2/LM1-RTC1, LF3-RTC2/LM4-RTC1.

[063] Resumo: A FIG. 6 ilustra o % de lesão 3 semanas após a aplicação no estágio de 3-4 folhas. A linhagem mutante homozigótica A205V (RTC1) (P1003A205V) apresentou uma tolerância muito boa até mesmo em altas taxas do herbicida Imazetapir. A lesão observada no P1003A205V foi abaixo de 10% em todas as taxas testadas 8X (48 oz/acre) e inferiores. A lesão registrada na linhagem homozigótica G654E (RTC2) foi menor que a esperada, mas isso pode ser parcialmente devido à aplicação posterior. Os híbridos G654E/A205V mostraram níveis muito fortes de tolerância neste ensaio, sem lesão observada por três semanas após a aplicação em ambos os híbridos.

EXEMPLO 3: Ensaio de eficácia de conversão de IMI: 15SA-T9 de conversões de IMI recentes (vide FIG. 7) [064] Ensaio: aplicação em estágio de 2 folhas e pré-inundação do herbicida IMI em materiais convertidos com características RiceTec IMI e controles. Todos os machos incluíram RTC1 (A205V) no seu genoma. As fêmeas com RTC2 (G654E) não foram incluídas devido ao número limitado de sementes. As fêmeas foram testadas separadamente em 15GH-T8 utilizando-se réplicas de plantas em vaso.

[065] Resumo: Híbridos A205V-G654E apresentaram taxas de lesões muito baixas em resposta a 2 aplicações de Imazetapir. A lesão observada nos híbridos RT IMI A205V-G654E foi comparável aos híbridos de IMI comerciais

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23/35 atuais. Este ensaio suporta a comercialização do híbrido A205V-G654E. Este ensaio foi mantido durante a colheita.

EXEMPLO 4: Ensaio 15SA-T11: KI FIX (vide FIG. 8 e FIG. 9) [066] Ensaio: aplicação em estágio de 2 folhas e pré-inundação do herbicida imazetapir ou Kifix™ (imazapic/imazapir) em materiais convertidos com características RiceTec IMI e controle IMI comercial.

[067] Resumo: As taxas de lesões observadas nos híbridos A205VG654E convertidos são muito semelhantes entre as aplicações de Imazetapir e Kifix (imazapic/imazapir), com lesão ligeiramente reduzida sendo observada nos tratamentos equivalentes com Kifix. Consistente com os dados anteriores, os híbridos heterozigóticos A205V apresentam tolerância reduzida a ambos os herbicidas em comparação com os híbridos A205V-G654E. As produtividades dos híbridos convertidos foi surpreendente na medida em que todos os três híbridos convertidos com duas características (A205V-G654E) tiveram desempenho ainda melhor do que o controle comercial Clearfield® (CLXL745) quando o herbicida foi aplicado, em que os híbridos com duas características desenvolvidos internamente apresentam realmente mais resistência à perda de produtividade nas taxas de aplicação (4x) do que o controle híbrido Clearfield . Isso confirma que as características de IMI se mostram eficazes em conferir tolerância tanto ao Newpath™ para o mercado dos EUA quanto ao Kifix para o Brasil, sem perda de produtividade significativa.

[068] No geral, as FIGs. 10A e 10B ilustram o percentual médio de lesão 3 semanas após a última aplicação do herbicida em todos os ensaios [15SA-T11, 16-T7, 16GH-T7], que incluiu experimentos independentes com apenas ingredientes ativos imazetapir, imazetapic imazamox, em aplicações sequenciais, ou ingredientes ativos únicos ou em combinação. Também foi calculada a média entre o material que transporta apenas RTC1, apenas RTC2 ou RTC1-RTC2. Os

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24/35 efeitos sinérgicos das interações RTC1 + RTC2 são expressos como % de lesão observada RTC1 + RTC2 menos % de lesão esperada RTC1 + RTC2, e calculados como [(RTC1+RTC2)-(RTC1XRTC2/100)]. (Vide a Tabela 2 para a Escala de Avaliação das Lesões).

DEPÓSITOS DE SEMENTES SOB O TRATADO DE BUDAPESTE [069] Depósitos de sementes de híbridos de arroz resistentes/tolerantes foram depositados pela Rice Tec Inc. na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, Estados Unidos em 01 de fevereiro de 2017. Os números de acesso PTA são PTA-123859, PTA123860 e PTA-123861. (Vide também a Tabela 1). Todas as restrições serão removidas mediante a concessão de uma patente, e os depósitos destinam-se a atender a todos os requisitos do 37 CFR §§1.801-1.809 e satisfazem os requisitos do Tratado de Budapeste. O depósito será mantido no depositário por um período de trinta anos, ou cinco anos após o último pedido, ou durante a vida aplicável da patente, o que for mais longo, e será substituído conforme necessário durante esse período.

DEFINIÇÕES [070] Vários termos são utilizados na descrição e nas tabelas abaixo. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo dado por esses termos, as seguintes definições são fornecidas:

[071] Alelo. O alelo é qualquer uma das muitas formas alternativas de um gene, todas elas geralmente relacionadas a uma característica ou traço. Em uma célula diploide ou organismo, os dois alelos de um dado gene ocupam loci correspondentes em um par de cromossomos homólogos.

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25/35 [072] Retrocruzamento. Processo de cruzamento de uma progênie híbrida com um dos genitores, por exemplo, um híbrido F1 de primeira geração com um dos genótipos parentais do híbrido F1.

[073] Mistura. Misturar fisicamente sementes de arroz de um híbrido de arroz com sementes de um, dois, três, quatro ou mais de outro híbrido de arroz, variedade de arroz ou arroz endogâmico para produzir uma cultura contendo as características de todas as sementes de arroz e plantas nesta mistura.

[074] Célula. Célula, tal como aqui utilizada, inclui uma célula vegetal, tanto isolada quanto em cultura de tecidos ou incorporada em uma planta ou parte da planta.

[075] Cultivar. Variedade ou estirpe persistente sob cultivo.

[076] Derivado. Como utilizado neste documento, significa que um gene ou uma pluralidade de genes é tirada, obtida, recebida, rastreada, substituída ou descende de uma fonte de planta ou sementes, e, independentemente do método utilizado, foi transferida para uma planta diferente.

[077] Embrião. O embrião é a pequena planta contida em uma semente madura.

[078] Essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas. Uma planta que possui essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas do híbrido ou cultivar, exceto pelas características derivadas do gene de interesse introduzido.

[079] Produtividade dos grãos. Peso do grão colhido de uma determinada área. A produtividade dos grãos pode ser determinada indiretamente também pela multiplicação do número de panículas por área, pelo número de grãos por panícula e pelo peso do grão.

[080] Imidazolinona. IMI inclui, por exemplo, imazapir, imazapic, imazetapir, imazamox, imazametabenz e imazaquin.

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26/35 [081] Lesão à Planta ou Vegetal. É definida pela comparação de uma planta teste com os controles e observar que a planta teste não tem a mesma altura; tem uma cor anormal, por exemplo, amarelo, e não verde; formato de folha incomum, enrolada, menos brotos; não sobrevive (vide Tabela 2).

[082] Induzida. Como utilizado neste documento, o termo significa resistência genética que surgiu após o tratamento com um agente mutagênico.

[083] Introgressão. Como utilizado neste documento, é o movimento de genes de uma planta para outra, de modo que a planta e sua progênie carregam o gene.

[084] Lócus. Um lócus é uma posição em um cromossomo ocupado por uma sequência de DNA; ele confere uma ou mais características tais como, por exemplo, esterilidade masculina, tolerância a herbicidas, resistência a insetos, resistência a doença, amido ceroso, metabolismo de ácidos graxos modificado, metabolismo do ácido fítico modificado, metabolismo de carboidratos modificado e metabolismo proteico modificado. A característica pode ser, por exemplo, conferida por um gene de ocorrência natural introduzido no genoma da variedade por retrocruzamento, uma mutação natural ou induzida, ou um transgene introduzido através de técnicas de transformação genética. Um lócus pode compreender um ou mais alelos integrados em uma única localização cromossômica.

[085] Não induzida. Como utilizado neste documento, o termo “não induzida” significa resistência genética não conhecida por ser induzida; pode estar em uma localização diferente de uma resistência induzida no genoma.

[086] Planta. Como utilizado neste documento, o termo planta inclui a referência a uma planta completa imatura ou madura, incluindo uma planta a partir da qual as sementes, grãos ou anteras foram removidos. A semente ou o embrião que produzirá a planta também é considerado como planta.

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27/35 [087] Parte da planta. Como utilizado neste documento, o termo parte da planta (ou uma planta de arroz, ou parte dela) inclui protoplastos, folhas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras, sementes, grãos, embriões, pólen, óvulos, cotilédones, hipocótilo, glumas, panículas, flor, broto, tecido, células, células meristemáticas e afins.

[088] Progênie. Descendentes das plantas parentais obtidas por métodos reprodutivos, recombinantes ou outros, em que os genes de interesse são replicados a partir das plantas parentais nos genes descendentes.

[089] Piramidado. Pilhas de vetores: quando diferentes características são empilhadas em um vetor, e em um único ato ou transformação, as características são transmitidas para a planta; a planta transformada exibe múltiplas características. Características de Piramidação: transformação sequencial de características únicas (todos os vetores são carreadores de características individuais), ou, alternativamente, cada característica é transformada em paralelo, na mesma linhagem, e o cruzamento sexual simples é utilizado para “piramidá-los” em uma única linhagem. “São adicionados gradualmente (de diferentes doadores) ou adicionados de uma só vez (de um único doador com múltiplas características).

[090] Quantitative Trait Loci (QTL - Loci de uma característica quantitativa). Loci genéticos que controlam, até certo ponto, características numericamente mensuráveis que são geralmente distribuídas de forma contínua.

[091] Recombinante/Não-Recombinante. Se a combinação não parental ocorrer, uma patente de arroz é recombinante.

[092] Regeneração. Regeneração refere-se ao desenvolvimento de uma planta a partir da cultura de tecidos.

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28/35 [093] Resistência/resistente⁵. A capacidade herdada de uma planta para sobreviver e reproduzir após exposição a uma dose de herbicida normalmente letal ao tipo selvagem; a resistência pode ocorrer naturalmente ou ser induzida por técnicas, tais como engenharia genética ou seleção de variantes produzidas por cultura de tecido ou mutagênese.

[094] Convertido com Único Gene (Conversão). Convertido com único gene (conversão) inclui plantas desenvolvidas por uma técnica de melhoramento de plantas chamada retrocruzamento, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas de uma planta endogâmica são recuperadas, enquanto retém um único gene transferido para a planta endogâmica através do cruzamento e retrocruzamento. O termo também pode se referir à introdução de um único gene através de técnicas de engenharia genética conhecidas no estado da arte.

[095] Planta ou semente de origem. Uma planta ou semente a partir da qual um gene ou pluralidade de genes é transferido para uma planta diferente, semente, calo ou outro recipiente adequado.

[096] Empilhamento. Adição de mais de um item à mesma entidade receptora. Os métodos para atingir o estado “empilhado” incluem: métodos de empilhamento vetorial de dois ou mais genes em um único vetor e fazer uma única transformação para obter a pilha; realizar transformações sequenciais no mesmo receptor adicionando características passo a passo; conseguir o híbrido empilhado simplesmente pelo cruzamento final de genitores carregando características diferentes; desenvolver linhagens com múltiplas características por mutagênese sequencial ou cruzamento, e fixar o estado empilhado em um dos genitores; e suas variantes.

⁵ Weed Science Society of America, Weed Technology, vol. 12, edição 4 (outubro-dezembro de 1998, p. 789)

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29/35 [097] Sinergismo. Conforme descrito no Herbicide Handbook da Weed Science Society of America, Nona Edição, 2007, p. 429, “'sinergismo' [é] uma interação de dois ou mais fatores, de tal forma que o efeito quando combinado é maior que o efeito previsto baseado na resposta a cada fator aplicado separadamente”.

[098] A seguinte equação pode ser usada para calcular a resistência/tolerância esperada no arroz com combinações de mutações a herbicidas, por exemplo, A e B:

Esperado = A + B-(AxB/100)

A = eficácia observada da mutação A na mesma concentração de herbicida;

B = eficácia observada da mutação B na mesma concentração de herbicida.

[099] Sinérgico no contexto herbicida pode significar que a utilização do herbicida resulta em um aumento do efeito de controle de planta daninha em comparação com os efeitos de controle de plantas daninhas de A + B que são possíveis com a utilização de cada herbicida isoladamente. Ou sinérgico pode ser considerado como o nível de resistência/tolerância do arroz, com mutações combinadas (empilhadas) em comparação com os efeitos de um arroz com uma única mutação.

[0100] Em algumas formas de realização, o dano ou lesão à vegetação indesejada causada pelo herbicida é avaliada usando uma escala de 0% a 100%, quando comparada com a vegetação controle não tratada, em que 0% indica nenhum dano à vegetação indesejada e 100% indica destruição completa da vegetação indesejada.

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30/35 [0101] Tolerância/Tolerante. A capacidade inerente de uma espécie de sobreviver e se reproduzir após o tratamento com herbicida implica que não houve seleção ou manipulação genética para tornar a planta tolerante.

[0102] Resistência/Tolerância são usadas de forma intercambiável neste documento; para um específico genótipo de planta de arroz, as informações sobre o herbicida aplicado, a potência do herbicida e a resposta da planta são fornecidas.

Publicações citadas

Powles, Stephen B. e Yu, Qin, Evolution in Action: Plants Resistant to Herbicides, Annu. Rev. Plant Biol. (2010) 61: 317-347.

TABELA 1 Arroz híbrido com ambas RTC1 e RTC2 em seus genomas

Fonte #	Híbrido	Designação	PTA
15USAA04803	S5120G654E/P1062A205V	TH1524551	123860
15USAA04858	S5209G654E/P1308A205V	TH1524568	123859
15USAA04810	S5107G654E/P1062A205V	TH1524558	123861

TABELA 2 Escala de Avaliação das Lesões por Herbicidas em Arroz

Pontuação	Descrição da classificação
0	nenhuma lesão visível
1	lesão observada em pelo menos 1 planta, mas muito mínima
5	lesão mínima observada no lote
10	plantas estão atrofiadas em 10% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 10% da área foliar no lote
15	plantas estão atrofiadas em 15% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 15% da área foliar no lote
20	plantas estão atrofiadas em 20% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 20% da área foliar no lote
25	plantas estão atrofiadas em 25% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 25% da área foliar no lote
30	plantas estão atrofiadas em 30% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 30% da área foliar no lote

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Pontuação	Descrição da classificação
35	plantas estão atrofiadas em 35% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 35% da área foliar no lote
40	plantas estão atrofiadas em 40% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 40% da área foliar no lote
45	plantas estão atrofiadas em 45% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 45% da área foliar no lote
50	plantas estão atrofiadas em 50% quando comparadas com o controle, ou plantas mostram lesão por herbicida em aproximadamente 50% da área foliar no lote
55	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 55% da área foliar no lote
60	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 60% da área foliar no lote
65	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 65% da área foliar no lote
70	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 70% da área foliar no lote
75	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 75% da área foliar no lote
80	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 80% da área foliar no lote
85	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 85% da área foliar no lote
90	plantas apresentam lesão por herbicida em aproximadamente 90% da área foliar no lote
95	todas as plantas estão gravemente danificadas, a maioria está morta. Algum tecido verde se espalhou por todo o lote.
99	quase todas as plantas estão mortas, mas pelo menos 1 planta tem tecido verde.
100	todas as plantas estão mortas e marrons. Nenhum tecido verde no lote.

TABELA 3: Estágios de Desenvolvimento do Arroz

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TABELA 4: Informações sobre a produtividade, qualidade de grãos e

maturidade para híbridos ΑΊ	FCC RTC1-RTC2 depositados e controles
Híbrido/Controles	LF2-RTC2/ LM1-RTC1	LF2/LM1- CL	LF1-RTC2/ LM1-RTC1	LF1/LM1	LF3-RTC2\ LM4-RTC1	LF3\LM4
ATCC#	PTA- 123860		PTA-123861		PTA-123859
Produtividade (lbs/ac)	10128,38	10234,75	9189,8	9930,19	10187,72	9967,7
Acamação %	17,4	20,3	22,8	19,7	13	10,0
Dias até 50% de emergência (da cabeça)	82,75	81,63	81,7	83,6	86,33	80,3
Altura da Planta (polegadas)	114,56	115,44	122,9	114,46	123,7	122,9
Brunimento Total % (total mill)	71,9	72,6	71,3	72	71,3	70,0
Brunimento Completo %	60,5	60,4	62,9	62,7	64,7	60,0

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(whole mill)
Comprimento do Grão (mm)	6,72	6,84	6,88	6,66	5,48	5,6
Espessura do Grão (mm)	2,08	2,1	2,12	2,1	2,6	2,7
Razão Comprimento e Espessura	3,23	3,26	3,24	3,17	2,11	2,1
FIGS %	6,25	3,2	2,9	6,25	2,43	1,9
Barriga Branca %	13,43	13,35	10,35	12,62	5,23	4,5
Amilose	19,8	19,9	20,3	19,8	15,4	15,5
ASV	3,4	3,1	4,7	3,2	5,0	4,3
Umidade %	15,7	16,6	17,8	16,8	17,3	17,9
Tipo de Grão	Longo	Longo	Longo	Longo	Médio	Médio

[0103] 0 material inclui: submissões ATTC PTA-123860 [LF2RTC2/LM1-RTC1], PTA-123861 [LF1-RTC2/LM1-RTC1], PTA-123859 [LF3RTC2/LM4-RTC1] e seus respectivos controles LF2/LM1-CL, LF1/LM1 e LF3/LM4. Os dados referentes ao desempenho da produtividade e à qualidade dos grãos em múltiplos locais são fornecidos para demonstrar a equivalência dos produtos RTC1-RTC2 em relação aos controles que carreiam a mesma base genética. Todos os materiais foram pulverizados no estágio de 2 folhas com aplicação (1X) de imazamox

TABELA 5: Avaliação da produtividade e da qualidade dos grãos em múltiplos locais para o material adicional RTC1-RTC2 comparadas com a versão comercial atual ClearField® dos mesmos híbridos. Todos os materiais foram pulverizados no estágio de 2 folhas com aplicação (1X) de imazamox.

Material	Ano	Locai s	Produtivida de cvWa	Dias até a emergênc ia	Altur a (cm)	Retençã o do Grão	Brunimen to Completo %	Gess 0 (chal k)%	Barrig a Branc a Gess 0 %	Amilos e	Temp . Gel
LF2/LM1-	201	8	10235	83	115	Boa	58	4	15	19	Inter

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Material	Ano	Locai s	Produtivida de cvWa	Dias até a emergênc ia	Altur a (cm)	Retençã o do Grão	Brunimen to Completo %	Gess 0 (chal k)%	Barrig a Branc a Gess 0 %	Amilos e	Temp . Gel
CL	7										m.
LF2- RTC2/LM 1-RTC1	201 7	8	10128	84	115	Boa	59	7	15	19	Inter m.

LF2/LM1- CL	201 6	5	9295	80	121	Boa	59	5	12	19	Inter m.
LF2- RTC2/LM 1-RTC1	201 6	5	8976	81	128	Boa	57	7	15	19	Inter m.

HYB5-CL	201 7	5	9401	83	115	Boa	59	7	17		Inter m.
HYB5MG- FP	201 7	5	9189	81	123	Excelent e	58	5	14		Inter m.

HYB5-CL	201 6	5	8897	85	122	Boa	58	8	13	19	Inter m.
HYB5MG- FP	201 6	5	8726	84	124	Boa	56	8	15	20	Inter m.


HYB5-CL	201 6	7	8897	85	122	Fraca	58	8	13	19	Inter m.
HYB5-FP	201 6	7	8726	84	124	Fraca	56	8	15	20	Inter m.

HYB4-CL	201 7	7	10236	88	119	Boa	60	7	14		Inter m.
HYB4	201 7	7	10666	85	121	Boa	59	8	16		Inter m.
HYB4-FP	201	7	10739	85	119	Excelent	59	8	15		Inter

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Material	Ano	Locai s	Produtivida de cvWa	Dias até a emergênc ia	Altur a (cm)	Retençã o do Grão	Brunimen to Completo %	Gess 0 (chal k)%	Barrig a Branc a Gess 0 %	Amilos e	Temp . Gel
	7					e					m.

[0104] O material inclui: híbridos controle comerciais com tolerância ao herbicida ClearField® (sufixo CL) e híbridos pré-comerciais comparativos com a mesma fonte parental, mas carregando as mutações de tolerância a herbicida RTC1-RTC2 (sufixo FP). Os híbridos Clearfield® carregam a mutação IMI localizada na posição 653.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta de arroz tolerante/resistente aos inibidores de AHAS/ALS em níveis significativamente maiores do que aqueles tolerados por plantas sem mutações na sequência de aminoácidos da enzima AHAS, CARACTERIZADA pelo fato de que a tolerância/resistência está associada a uma pluralidade de mutações na sequência de ácidos nucleicos que resultam nas substituições combinadas de aminoácidos A205V e G654E na enzima AHAS/ALS expressa na planta, em que a planta de arroz está expressando dois alelos, um alelo carreando A205V e o outro alelo carreando G654E e em que existe sinergismo na resistência/tolerância aos inibidores associados às substituições combinadas.
2. Planta de arroz, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é selecionada a partir de plantas produzidas por sementes representativas depositadas com os números de acesso ATCC PTA-123859, PTA-123860 e PTA-123861, seus descendentes e derivados.
3. Planta de arroz tolerante/resistente aos inibidores de AHAS/ALS, CARACTERIZADA pelo fato de que a tolerância/resistência está associada a pelo menos duas sequências de ácido nucleico no genoma da planta que codificam as substituições de aminoácidos na enzima AHAS/ALS, as substituições selecionadas do grupo constituído por A205V, G654E e suas combinações.
4. Sementes da planta de arroz, de acordo com as reivindicações 1 ou 3, CARACTERIZADAS pelo fato de que estão depositadas com os números de acesso ATCC PTA-123859, PTA-123860 e PTA-123861.
5. Método para o controle de plantas daninhas em um campo de arroz, o método CARACTERIZADO por compreender:

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a. ter arroz no campo, sendo que o arroz é resistente a um ou mais inibidores de AHAS/ALS devido a um efeito sinérgico causado pelas substituições de aminoácido A205V e G654E na enzima expressa pelo arroz;

b. colocar o campo de arroz em contato com pelo menos um dos inibidores de AHAS/ALS da classe das imidazolinonas, herbicidas aos quais o arroz é resistente em níveis conhecidos por matar plantas daninhas.
6. Progênie CARACTERIZADA por ser da planta de arroz definida na reivindicação 1 ou reivindicação 3.
7. Método para produzir uma planta de arroz resistente ao tratamento com inibidores de AHAS/ALS em níveis adequados para o controle de plantas daninhas, o método CARACTERIZADO por compreender combinar, na planta de arroz, um primeiro genoma de arroz contendo um ácido nucléico que efetua uma substituição de A205(179)V na sequência de aminoácidos da enzima AHAS/ALS, com um segundo genoma de arroz contendo um ácido nucléico que codifica uma substituição de G654(628)E na sequência de aminoácidos da enzima AHAS/ALS.
8. Planta monocotiledônea, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a tolerância/resistência é determinada pelo percentual de lesão após o tratamento do arroz.
9. Planta de arroz, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a aptidão da planta não é significativamente diferente de uma planta de arroz com um genoma essencialmente similar, mas sem as substituições A205V ou G654E.
10. Planta de arroz, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é sinérgica, conforme determinado pela observação de que o percentual de lesão observado no arroz tratado com herbicidas imidazolinonas é menor quando o genoma de AHAS/ALS do arroz

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3/3 inclui ambas as substituição A205V e G654E, do que o percentual de lesão aditiva esperado no arroz tratado com herbicida imidazolinona com apenas uma das substituições na sequência de aminoácidos de AHAS/ALS.
11. Planta de arroz, de acordo com a reivindicação 1, com níveis de tolerância/resistência aos inibidores de AHAS/ALS, CARACTERIZADA pelo fato de que a interação específica das duas mutações únicas que codificam as substituições de aminoácidos, A205V com G654E, expressa como a prevenção adicional do % de lesão relativa àquela expressa pelas plantas de arroz que possuem apenas uma das mutações individuais, é de -25% a -67% de redução dependendo da dose.
12. Planta de arroz, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a produtividade é comparável ao arroz controle com uma única mutação.