BR112019013459A2 - composição de diácido manurônico - Google Patents
composição de diácido manurônico Download PDFInfo
- Publication number
- BR112019013459A2 BR112019013459A2 BR112019013459A BR112019013459A BR112019013459A2 BR 112019013459 A2 BR112019013459 A2 BR 112019013459A2 BR 112019013459 A BR112019013459 A BR 112019013459A BR 112019013459 A BR112019013459 A BR 112019013459A BR 112019013459 A2 BR112019013459 A2 BR 112019013459A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- manuronic
- total weight
- composition
- diacids
- diacid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7016—Disaccharides, e.g. lactose, lactulose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/734—Alginic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
- C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/04—Disaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
a presente invenção refere-se a uma composição de oligossacarídeo de ácido dicarboxílico manurônico, que compreende ácido dicarboxílico manurônico de fórmula (iii) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, onde n é um número inteiro selecionado de 1 a 9, m é selecionado de 0, 1 ou 2, m? é selecionado de 0 ou 1, o peso total de ácido dicarboxílico manurônico para o qual n = 1-5 responde por 80-95% do peso total da composição, e a relação do peso total do ácido dicarboxílico manurônico para o qual n = 1-3 para o peso total de ácido dicarboxílico manurônico para qual n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE DIÁCIDO MANURÒNICO.
CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se a uma composição ideal dos diácidos manurônicos obtidos por um método de rastreamento da atividade biológica, que utiliza um modelo animal de demência senil para avaliar os efeitos de diferentes graus de polimerização e as proporções de diácidos manurônicos na atividade biológica dos mesmos. A composição com a melhor atividade biológica foi finalmente rastreada e a substância alvo desejado foi preparada por separação de membrana de ultrafiltração.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [002] Os diácidos manurônicos têm recebido atenção extensiva devido aos seus potenciais valores medicinais. Diácidos manurônicos são normalmente preparados por um método de múltiplas etapas usando o ácido algínico como uma matéria-prima.
[003] A molécula de polissacarídeo da matéria-prima, ácido algínico, compreende um segmento M formada de ácidos D-manurônicos ligados por ligações β-1,4-glicosídicas, um segmento G formado de ácidos L-gulurônicos ligados por ligações a-1,4-glicosídicas e um segmento MG híbrido formado dos dois sacarídeos. As fórmulas estruturais de ácido manurônico e ácido gulurônico são mostradas na seguinte Fórmula (I):
M: ácido β-D-manurônico G: ácido a-L-gulurônico [004] Os segmentos M e G podem ser separados da matériaprima, ácido algínico. O método comum pode ser simplesmente descrito abaixo: ácido algínico é preliminarmente degradado para produzir
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 26/69
2/34 uma mistura de polissacarídeo de ácido poligulurônico e ácido poligulurônico; a mistura de polissacarídeo é submetida à precipitação ácida para remover o ácido poligulurônico nesta; e refinamento adicional é conduzido para obter um ácido homopolimanurônico tendo uma pureza de 90% ou mais (em seguida também referido como intermediário de segmento M). Veja, por exemplo, métodos descritos no Pedido de Patente Chinesa No. 98806637,8 e CN02823707,2.
[005] O ácido oligomanurônico pode ser preparado como segue: o intermediário de segmento M obtio acima é submetido a outra acidólise por acidólise por aquecimento sob uma condição ácida para obter um polímero de ácido monurônico de fragmento pequeno tendo uma faixa desejada de peso molecular. Além disso, a eficiência de degradação pode ser melhorada por um método de degradação oxidativa; enquanto isso, a extremidade de redução pode ser oxidada em um ácido sacárico de anel aberto, veja Pedido de Patente Chinesa No. 200580009396,5 (Literatura de patentes 1) depositado por Meiyu Geng, et al. e Patente US No. 8.835.403 B2 (Literatura de patente 2). Por conveniência, as Literaturas de patente 1 e 2 são em seguida coletivamente referidas como patentes anteriores, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
[006] O processo de reação do diácido manurônico descrito nas patentes anteriores pode ser representadp pela seguinte equação de reação (II), isto é, o grupo aldeido na posição C1 do ácido manurônico na extremidade de redução do polissacarídeo de ácido oligomanurônico é oxidado em um grupo carboxila.
(H) [007]
No processo de conversão oxidativa acima, um oxidante
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 27/69
3/34 geralmente usado é uuma solução de sulfato de cobre alcalina, isto é, o reagente de Fehling. Patentes anteriores apenas adotam este método de oxidação. Especificamente, sob uma condição alcalina, o substrato da reação ácido polimanurônico, isto é, o intermediário de segmento M acima, é adicionado a uma solução de sulfato de cobre e reagido em um banho de água em ebulição durante 15 minutos a 2 horas. O método utiliza íons de Cu2+ como um agente de oxidação para oxidar o grupo aldeido, e um precipitado de óxido cuproso vermelhotijolo é gerado na reação. Esta reação é frequentemente usada para identificar um açúcar reduzido.
[008] Patentes anteriores em que os ácidos oligomanáricos têm efeitos contra a doença de Alzheimer (AD) e Diabetes Melito. A patogênese da doença de Alzheimer e diabetes tipo 2 está intimamente relacionado com amiloides (β-amiloides e amilina). Os amiloides podem se agregar para formar oligômeros de proteína, e podem também se agregar para formar as fibras. Estes agregados de proteína são citotóxicos, podem induzir uma reação de oxidação em células para danificar as mitocôndrias, e podem desencadear uma reação em cascata, tal como uma resposta inflamatória, causando dano a um grande número de neurônios e células beta, e finalmente, levando ao início de doença de Alzheimer e diabetes tipo 2. Ácidos oligomanáricos direcionam amiloide e antagonizam as reações em cascata induzidas pelos amiloides e, portanto, têm os efeitos de prevenir e tratar a doença de Alzheimer e o diabetes tipo 2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição de oligossacarídeo de diácido manurônico, compreendendo um diácido manurônico de Fórmula (III) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 28/69
4/34
OM Fórmula (III) [0010] em que n é um número inteiro de 1 a 9, m é 0, 1 ou 2 e m’ é 0 ou 1, [0011] e em que, [0012] o peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-5 é 8095 % do peso total da composição, e [0013] a relação do peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total de diácidos manurônicos em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5.
[0014] Outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica ou um produto para cuidados de saúde compreendendo a composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção e, se necessário, um veículo adequado.
[0015] Um outro aspecto da presente invenção fornece um método para o tratamento de um paciente com demência senil, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção a um paciente em necessidade da mesma.
[0016] A composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção é preparada por um método diferente do da técnica anterior. Este método de preparação tem as vantagens de uma reação simples, um alto teor de ingrediente ativo e nenhum reagente de reação residual. Demonstrou-se experimentalmente que a composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção pode inibir o dano celular, proteger as células nervosas e aumentar a taxa de sobrevivência celular. Em um modelo animal, a composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção pode melhorar significativamente as funções de aprendizagem e cognitivas de ratos
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 29/69
5/34 com demência. A composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção tem efeitos potenciais de prevenção e tratamento da doença de Alzheimer.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0017] Figura 1 mostra o espectro de massa do dissacarídeo, trissacarídeo e tetrassacarídeo no produto A.
[0018] Figura 2 mostra o espectro de massa de pentassacarídeo, hexassacarídeo e heptassacarídeo no produto A.
[0019] Figura 3 mostra os espectros de massa de octassacarídeo, nonassacarídeo e decassacarídeo no produto A.
[0020] Figura 4 mostra o efeito protetor do produto A em diferentes concentrações no dano das células nervosas induzido por Αβ.
[0021] Figura 5 mostra o efeito protetor do ácido oligomanárico com um único grau de polimerização no dano das células nervosas induzido por Αβ.
[0022] Figura 6 mostra a avaliação dos efeitos do dissacarídeo ao decassacarídeo em um modelo animal de AD.
[0023] Figura 7 mostra os efeitos das composições de oligossacarídeo e hexassacarídeo no número de vezes que os animais de AD passam através da plataforma.
[0024] Figura 8 mostra o efeito das composições de oligossacarídeo e hexassacarídeo na distância de natação de animais com AD.
[0025] Figura 9 mostra as atividades do dissacarídeo ao decassacarídeo e composição A em um modelo de cocultura celular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0026] Vários aspectos da presente invenção serão descritos em detalhes abaixo. No entanto, a presente invenção não está limitada a estas formas de realização específicas. Uma pessoa versada na técnica pode fazer algumas modificações e ajustamentos à presente invenção à luz da descrição substancial abaixo, e tais modificações estão
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 30/69
6/34 também abrangidas no escopo da presente invenção.
Composição de oliqossacarídeo de diácido manurônico [0027] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição de oligossacarídeo de diácido manurônico, compreendendo um diácido manurônico de Fórmula (III) ou um sal farmaceuticamente aceitável:
H.
Fórmula (III) [0028] em que n é um número inteiro de 1 a 9, m é 0, 1 ou 2 e rri é 0 ou 1, [0029] e em que, [0030] o peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-5 é 8095% do peso total da composição, e a relação do peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total de diácidos manurônicos em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5.
[0031] A composição de oligossacarídeo de ácido manurônico da presente invenção é uma mistura de diácidos manurônicos com diferentes graus de polimerização, e os seus componentes principais são oligossacarídeos de diácido manurônico com um grau de polimerização de 2 a 10. De acordo com as aplicações anteriores, os sacarídeos mais ativos em diácidos manurônicos são do pentassacarídeo ao octassacarídeo, em particular o hexassacarídeo. No entanto, ao contrário da técnica anterior conhecida, os inventores descobriram que a adição de dissacarídeo menos ativo ao tetrassacarídeo ao pentassacarídeo mais ativo ao octassacarídeo produz uma atividade biológica melhor do que a do pentassacarídeo ao octassacarídeo, sob a condição de diluir as concentrações dos sacarídeos altamente ativos.
[0032] De acordo com uma modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, o peso total de diácidos manurônicos em que m + rri = 1 ou 2 não é inferior
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 31/69
7/34 a 50% ou mais, preferivelmente 60-90%, mais preferivelmente 70 90% do peso total da composição. Em particular, na composição de oligossacarídeo de ácido manurônico da presente invenção, o peso total de diácidos manurônicos em que m + m’ = 1 não é inferior a 10%, preferivelmente 30-40% do peso total da composição. Em outra modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, o peso total de diácidos manurônicos em que m + m’ = 2 não é inferior a 10%, preferivelmente, 30-50% do peso total da composição.
[0033] De acordo com uma modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, o peso total dos oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 1-5 é 80-95% do peso total da composição.
[0034] De acordo com uma modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, o peso total dos oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 1-3 é 20-70% do peso total da composição.
[0035] De acordo com uma modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, a relação do peso total dos diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total dos oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5, preferivelmente entre 1,0 e 3,0.
[0036] De acordo com uma modalidade preferida, na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, as porcentagens em peso de oligossacarídeos de diácido manosônico com diferentes graus de polimerização na composição são: 5-25% de dissacarídeo, 15-30% de trissacarídeo, 15-25% de tetrassacarídeo, 10-25% de pentassacarídeo, 5-15% de hexassacarídeo, 3-10% de heptassacarídeo, 2-5% de octassacarídeo, 1-5% de nonassacarídeo e 1-5% de decassacarídeo. Em particular, as porcentagens em peso dos oligossaca
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 32/69
8/34 rídeos na composição são: 10-20% de dissacarídeo, 18-30% de trissacarídeo, 15-25% de tetrassacarídeo, 15-20% de pentassacarídeo, 510% de hexassacarídeo, 3-5% de heptassacarídeo, 2-3% de octassacarídeo, 1-3% de nonassacarídeo e 1-3% de decassacarídeo.
[0037] Na composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de sódio ou um sal de potássio.
Método para preparar uma composição de oligossacarídeo de diácido manurônico [0038] O processo para preparar o diácido manurônico de acordo com a presente invenção é resumido como segue.
[0039] O intermediário do segmento M como descrito acima é oxidativamente degradado na cadeia de açúcar na presença de um agente de oxidação para produzir os oligossacarídeos oxidados com diferentes graus de polimerização. Os oligossacarídeos oxidados são caracterizados pelo fato dos ácidos manurônicos na extremidade de redução dos oligossacarídeos terem sido oxidados em ácidos sacáricos tendo 3-6 átomos de carbono.
[0040] O agente de oxidação que é particularmente vantajoso para a reação da presente invenção é ozônio. Durante a reação, a reação de degradação oxidativa da cadeia de açúcar ocorre quando o ozônio é introduzido em uma solução contendo o intermediário do segmento Μ. A temperatura na qual a etapa de degradação oxidativa é realizada é preferivelmente 0-70Ό, mais preferivelmente 10-4 5Ό. O pH no qual a etapa de degradação oxidativa, como descrito acima é realizada é 313, preferivelmente 4-10, mais preferivelmente 6-8.
[0041] A reação de degradação oxidativa utilizando ozônio na presente invenção e a degradação oxidativa utilizando sulfato de cobre alcalino (patentes anteriores) ou hidrólise de ácido na presença de peróxido de hidrogênio e hipoclorito de sódio (Pedido de Patente Chinesa
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 33/69
9/34
No. 01107952,5) na técnica anterior causam todos degradação da cadeia de açúcar, porém, as estruturas nas extremidades de redução das cadeias de açúcar dos produtos de degradação são diferentes: o produto de degradação oxidativa obtido na presente invenção, diácido manurônico, tem uma estrutura de diácido tendo 3-6 átomos de carbo no na extremidade de redução. Adicionalmente, o processo utilizado na etapa de degradação oxidativa da presente invenção também oferece outras vantagens: 1) a condição de reação é leve, e nenhuma condição de reação especial é necessária; 2) o ozônio utilizado pode ser preparado in situ, e, assim, a pressão de transporte é reduzida na produção industrial; e 3) após a reação, o ozônio é automaticamente decomposto em oxigênio e, desse modo, não há danos causados por reagentes de reação residuais ou poluição ambiental. O processo de reação é mostrado na seguinte equação (IV):
« s, ». representa a posição da quebra do anel de açúcar ou glicosídico ligado por radical livre
O < reação continua | /íkX Ύ-? § Υτ?8®5
O produto foi submetido à separação de membrana { “; para remover as moléculas pequenas abaixo do * < <
monossacarideo n = 1 - 9; m = 0, 1 ou 2; m1 = 0 ou 1
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 34/69
10/34 [0042] No diagrama esquemático da equação de reação acima (IV) e o composto de Fórmula (III), um oligossacarídeo em que m = 2 e rri = 1 é um ácido sacárico compreendendo 6 átomos de carbono;
um oligossacarídeo em que m = 1 e rri = 1 ou (m = 2 e rri = 0) é um ácido sacárico compreendendo 5 átomos de carbono;
um oligossacarídeo em que m = 1 e rri = 0 ou (m = 0 e rri = 1) é um ácido sacárico compreendendo 4 átomos de carbono; e um oligossacarídeo em que m = 0em’ = 0éum ácido sacárico compreendendo 3 átomos de carbono.
[0043] O produto de reação acima descrito é dessalinizado por separação de membrana para obter o produto A, conforme determinado por verificação da estrutura de LC-MS e medição da proporção de oligossacarídeo. A proporção de oligossacarídeo é determinada por cromatografia de exclusão de peneira molecular em combinação com a dispersão de laser de mútiplos ângulos. Em seguida, o produto A é separado por cromatografia de coluna para preparar os oligossacarídeos com um único grau de polimerização: do dissacarídeo ao decassacarídeo. Estes oligossacarídeos com um único grau de polimerização são comparados quanto à atividade biológica in vitro e in vivo. Verificou-se que o hexassacarídeo tem a melhor atividade entre os 9 oligossacarídeos, o que é semelhante aos resultados das patentes anteriores, por exemplo, os resultados da atividade de oligossacarídeo descritos revelados no documento do pedido de patente anterior 1.
[0044] Os inventores do presente pedido de patente descobriram que quando os 9 oligossacarídeos acima tendo estruturas novas são compostos em uma certa relação, uma composição de oligossacarídeo altamente ativa tendo uma atividade mais elevada do que o hexassacarídeo mais ativo pode ser obtida. As proporções de vários oligossacarídeos na composição de oligossacarídeo altamente ativa precisam
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 35/69
11/34 ser combinadas de acordo com a seguinte relação proporcional:
[0045] O peso total de oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 1-5 na composição é 80-95% do peso total da composição, e o peso total dos oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 1-3 é 20-70% do peso total da composição. A relação entre o peso total de oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 1-3 ao peso total de oligossacarídeos de diácido manurônico em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5, preferivelmente, entre 1,0 e 3,0.
[0046] A presente invenção fornece uma fórmula para a preparação de uma composição de oligossacarídeo de ácido oligomanárico altamente ativa.
[0047] A composição de oligossacarídeo de diácido manurônico da presente invenção pode inibir o dano celular e proteger as células nervosas. Em um modelo animal, a composição de oligossacarídeo de diácido manurônico fornecida pela presente invenção pode melhorar significativamente as funções de aprendizagem e cognitivas de animais modelo de demência. Portanto, a composição de oligossacarídeo de diácido manurônico fornecida pela presente invenção tem efeitos potenciais de prevenção e tratamento da doença de Alzheimer.
[0048] Em uma modalidade exemplar, o método da presente invenção inclui as seguintes etapas:
[0049] (1) Preparação do produto de diácido manurônico:
[0050] Preparação do intermediário do segmento M. Como descrito acima, o intermediário do segmento M do material de partida utilizado na presente invenção pode ser produzido por um método conhecido na técnica anterior, por exemplo, os métodos descritos no Pedido de Patente Chinesa No. 98806637,8 e CN02823707,2. Um método comum pode ser simplesmente descrito abaixo: o ácido algínico é preliminarmente degradado para produzir uma mistura de polissacarídeo de ácido polimanurônico e ácido poligulurônico; a mistura de polissa
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 36/69
12/34 carídeo é submetida à precipitação ácida para remover o ácido poligulurónico nesta; e um outro refinamento é conduzido para obter um ácido homopolimanurônico tendo uma pureza de 90% ou mais, isto é, um intermediário do segmento M.
[0051] Degradação oxidativa de ozônio. O intermediário do segmento M é dissolvido em uma quantidade apropriada de água e agitado à temperatura ambiente ou sob aquecimento. O ozônio é continuamente carregado para iniciar a reação. O pH da reação pode ser ajustado em 3-13, preferivelmente 4-10, mais preferivelmente 6-8, adicionando em gotas o ácido clorídrico diluído ou uma solução de NaOH diluída. A temperatura é preferivelmente 0-70Ό, mais preferivelmente 10-45Ό. Após a conclusão da reação, o carregamento de ozônio é interrompido e o pH é ajustado para neutro.
[0052] Separação e purificação de membrana. O produto de reação obtido acima é formulado em uma solução a uma concentração de cerca de 10% e separado por uma membrana de corte molecular para remover produtos de degradação abaixo do monossacarideo e coletar o retentado. A membrana de corte molecular utilizada tem um MWCO de 1000-3000 Da, preferivelmente 2000 Da. O líquido coletado é concentrado em um evaporador rotativo e seco sob vácuo para obter uma mistura de diácido oligomanurônico. Estes produtos são constatados ser composições compreendendo oligossacarídeos, isto é, de dissacarídeo ao decassacarídeo, com teores estando dentro de determinadas faixas. Três composições, A, B e C, foram preparadas de acordo com o método anterior. As proporções e estruturas dos oligossacarídeos nestas composições foram confirmadas nos Exemplos 1-3.
[0053] (2) Preparação de oligossacarídeos com um único grau de polimerização [0054] A mistura de oligossacarídeo obtido na etapa (1) é dissolvida em uma concentração de cerca de 10%, separada em uma coluna
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 37/69
13/34 cromatográfica em gel P6, e submetida à detecção ultravioleta para coletar cada componente efluente. Os componentes tendo o mesmo grau de polimerização são combinados. Nove componentes do dissacarídeo ao decassacarídeo são coletados, dessalinizados por cromatografia de coluna em gel G10, concentrados em um evaporador rotativo e secados sob vácuo. Os processos específicos de purificação e preparação são mostrados no Exemplo 4. Estas operações de cromatografia de coluna, dessalinização e secagem são conhecidas por aqueles versados na técnica.
[0055] Os 9 oligossacarídeos com único grau de polimerização foram avaliados quanto à atividade farmacológica em um modelo animal de demência senil. Verificou-se que o hexassacarídeo tinha a melhor atividade. Veja o Exemplo 4 para detalhes.
[0056] (3) Comparação das atividades das composições de oligossacarídeos [0057] Os oligossacarídeos com um único grau de polimerização como preparado na etapa acima (2) são compostos nas porcentagens de massa como mostrado na tabela seguinte para obter uma quarta composição, isto é, composição D. As proporções de oligossacarídeos nas três composições de oligossacarídeos A, B e C da etapa acima (1) e composição D são mostradas na seguinte tabela:
dissacarídeo | trissacarídeo | tetrassacarídeo | pentassacarídeo | hexassacarídeo | heptassacarídeo | octassacarídeo | nonassacarídeo | decassacarídeo | |
A | 19% | 25% | 22% | 13% | 9% | 6% | 3% | 2% | 1% |
B | 24% | 25% | 19% | 12% | 9% | 5% | 3% | 2% | 1% |
C | 8% | 20% | 28% | 19% | 13% | 6% | 3% | 2% | 1% |
D | 5% | 30% | 20% | 20% | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
[0058] As quatro composições acima e o hexassacarídeo purificado na etapa (2) são comparados quanto às atividades farmacológicas. Os resultados mostram que as quatro composições de oligossacarídeo
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 38/69
14/34
A, B, C e D são significativamente mais ativas que o hexassacarídeo que tem a melhor atividade nos oligossacarídeos com único grau de polimerização. Pode ser observado que um único oligossacarídeo pode ter um efeito sinérgico após a composição. Após a composição, os oligossacarídeos que são menos ativos, tais como o dissacarídeo e o trissacarídeo, são mais ativos que o hexassacarídeo.
[0059] Em resumo, a presente invenção fornece um método para a preparação de uma composição de oligossacarídeo de diácido manurônico altamente ativo, compreendendo uma reação de degradação oxidativa usando o intermediário do segmento M como matéria-prima na presença de ozônio, e separação e purificação do produto da reação através da membrana de ultrafiltração. O processo de preparação envolve um processo de produção simples e um alto rendimento, e o produto da reação pode ser facilmente purificado para obter um produto tendo uma boa atividade. Os inventores revelam também faixas das porcentagens em massa e proporções de vários oligossacarídeos na composição altamente activa. A significância do processo de preparação fornecido pela presente invenção está no fato de que um diácido manurônico tendo uma nova estrutura, isto é, um resíduo de diácido tendo 6 possíveis estruturas na extremidade de redução da cadeia de açúcar, é obtido, e que a composição de oligossacarídeo preparada compreende proporções moderadas de vários oligossacarídeos e tem uma forte atividade biológica.
[0060] A presente invenção fornece ainda um medicamento ou produto para cuidados de saúde que compreende uma composição de oligossacarídeos de diácido manurônico como descrito acima e, opcionalmente, um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0061] Métodos para a preparação de fármacos de combinação de oligossacarídeo contendo ingredientes ativos em várias proporções são conhecidos, ou evidentes para aqueles versados na técnica da
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 39/69
15/34 descrição da presente invenção, por exemplo, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, Martin, E.W., ed. Mack Publishing Company, 19- ed. (1995). Os métodos para preparar a composição farmacêutica compreendem a incorporação de excipientes, veículos, diluentes farmacêuticos adequados e similares.
[0062] A preparação farmacêutica da presente invenção é preparada por um método conhecido, incluindo mistura convencional, dissolução ou liofilização.
[0063] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada a um paciente através de uma variedade de rotinas adequadas para o modo de administração escolhido, tal como oralmente ou parentericamente (via intravenosa, intramuscular, tópica ou subcutânea).
[0064] Consequentemente, o fármaco de combinação da presente invenção pode ser administrado sistemicamente, por exemplo, oralmente, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um diluente inerte ou um veículo comestível. Pode ser incluído em cápsulas de gelatina de casca dura ou macia, ou pode ser prensado em comprimidos. Para administração terapêutica oral, o composto ativo da presente invenção pode ser incorporado com um ou mais excipientes e utilizado na forma de comprimidos para engolir, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas, e similares. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% do composto ativo. A proporção das composições e preparações pode, evidentemente, ser variado e pode situar-se em uma faixa de cerca de 1% a cerca de 99% em peso de uma determinada forma de dosagem unitária. A quantidade de um composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que um nível de dosagem eficaz pode ser obtido.
[0065] Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e similares po
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 40/69
16/34 dem também conter: um aglutinante tal como goma tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; um excipiente tal como fosfato de dicálcio; um agente de desintegração, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante tal como sacarose, frutose, lactose ou aspartame; ou um agente aromatizante tal como hortelãpimenta, óleo de gualtéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido tal como óleo vegetal ou polietileno glicol. Vários outros materiais podem ser apresentados como revestimentos ou, de outro maneira, modificar a forma física da unidade de dosagem unitária sólida. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com gelatina, cera, goma-laca ou açúcar. Os xaropes ou elixires podem conter o composto ativo, sacarose ou frutose como um agente edulcorante, um metilparabeno ou propilparabeno como um conservante, um corante e um agente aromatizante tal como sabor de cereja ou laranja. Naturalmente, qualquer material utilizado para preparar qualquer forma de dosagem unitária deve ser farmaceuticamente aceitável e não tóxico nas quantidades empregadas. Além disso, o composto ativo pode ser incorporado em formulações de libertação prolongada e dispositivos de liberação prolongada.
[0066] O composto ativo pode também ser administrado intravenosamente ou intraperitonealmente por infusão ou injeção. Soluções do composto ativo ou um sal do mesmo podem ser preparadas em água opcionalmente misturada com um tensoativo não tóxico. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, triacetina e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de micro-organismos.
[0067] As formas de dosagem farmacêutica adequadas para injec
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 41/69
17/34 ção ou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis do ingrediente ativo (opcionalmente encapsulados em lipossomas) incluídos em uma preparação extemporânea de uma solução ou dispersão estéril adequada para injeção ou infusão. Em todos os casos, a forma de dosagem final deve ser estéril, líquida e estável sob as condições de fabricação e armazenamento. O veículo líquido pode ser um solvente ou um meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e similares), óleos vegetais, glicerídeos não tóxicos e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela formação de lipossomas, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão, ou pelo uso de tensioativos. A ação de antimicro-organismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, tampões ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada por uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0068] As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização por filtração. No caso de pós estéreis para a preparação da solução injetável estéril, os métodos preferidos de tratamento são secagem a vácuo e a técnica de liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer outro ingrediente desejado da solução previamente filtrada estéril.
[0069] Veículos sólidos úteis incluem sólidos pulverizados (por exemplo, talco, argila, celulose microcristalina, silica, alumina, etc.).
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 42/69
18/34
Veículos líquidos úteis incluem água, etanol, etileno glicol ou uma mistura água-etanol / etileno glicol. O Fármaco de combinação da presente invenção pode ser dissolvido pó disperso no veículo em uma quantidade eficaz, opcionalmente com o auxílio de um tensoativo não tóxico. Adjuvantes (como fragrâncias) e agentes antimicrobianos adicionais podem ser usados para otimizar as propriedades para um determinado uso.
[0070] Espessantes (como polímeros sintéticos, ácidos graxos, sais de ácidos graxos e ésteres, celuloses modificadas ou materiais inorgânicos modificados) também podem ser usados com veículos líquidos para formar pastas revestidas, géis, unguentos, sabão, etc., que podem ser aplicados diretamente à pele do usuário.
[0071] A quantidade terapeuticamente necessária do composto ou uma mistura do mesmo depende não apenas do composto per se, mas também do modo de administração, da natureza da doença a ser tratada e da idade e condição do paciente, finalmente depende da decisão do médico assistente ou clínico.
[0072] As preparações acima podem estar presentes na forma de dosagem unitária, que é uma unidade fisicamente discreta contendo uma dose unitária, e é adequada para administração a corpos humanos e outros mamíferos. A forma de dosagem unitária pode ser uma cápsula ou comprimido, ou uma pluralidade de cápsulas ou comprimidos. A quantidade de dose unitária do ingrediente activo pode variar ou ser ajustada entre cerca de 0,1 e cerca de 1000 mg ou mais, dependendo do tratamento particular envolvido.
Modelo animal e etapas para avaliar a eficácia e atividade [0073] 1. Modelo animal para avaliação da eficácia contra a AD:
Um modelo de AD induzido por injeção intraventricular unilateral de Αβ, e os comportamentos de aprendizagem e memória dos ratos modelo de AD avaliados pelo teste do labirinto de água de Morris.
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 43/69
19/34 [0074] Utilizam-se ratos machos Wistar, cada um pesando entre 180 e 220 g. Randomização: um grupo controle de operação simulada, um grupo modelo e grupos de dosagem, 14 animais por grupo. Os ratos são anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg / kg) e fixados em um aparelho estereotáxico. A pele é rotineiramente preparada, esterilizada, cortada e a fontanela anterior é exposta. A região do CA1 do hipocampo está localizada na posição 3,0 mm após a fontanela anterior, 2,2 mm ao lado da rafe e 2,8 mm sob a dura-máter como descrito no Mapa Estereotáxico do Cérebro de Rato, Xinming Baao e SiyunShu, Beijing, People's Medical Publishing House, 1991, 28. Para o grupo modelo e os grupos de dosagem, 5 μΙ de Αβ agregado (Αβ1-40 é formulado em uma solução PBS para 1,4 mg / mL, e incubado em uma incubadora a 37 Ό por 5 dias para formar um agregado), injetado lentamente na região CA1 do hipocampo direito, com uma agulha micro-injetora vertical ao crânio, em um fluxo de 1 pL / min. Após a injeção estar completa, a agulha é deixada por 5 min, de modo que Αβ possa ser suficientemente disperso. Então, a agulha é retirada lentamente. A incisão cirúrgica é suturada e mantida quente para recuperação. O grupo controle recebe o mesmo procedimento, exceto que uma quantidade igual de PBS estéril é injetada. O fármaco correspondente é administrado 7 dias antes da operação e a administração é continuada até ao final da experiência.
[0075] O teste do labirinto de água de Morris é realizado no dia 11 após a operação.
[0076] Teste de navegação local: Cada grupo de ratos é treinado uma vez por dia durante 5 dias consecutivos, ou seja, recebe um teste de navegação local. O tempo levado pelos animais para encontrar a plataforma (isto é, latência de escape) é registrado. Os ratos que não conseguem encontrar a plataforma em cerca de 90 s são orientados a nadar até a plataforma em uma direção de linha reta e ficar na plata
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 44/69
20/34 forma por 30 s, para induzir seu aprendizado e memória.
[0077] Teste de sonda espacial: No segundo dia após o final do teste de navegação local, a plataforma é removida e os ratos são colocados na água a partir do local de entrada. O número de vezes que os animais passam pela plataforma e a porcentagem da distância de natação no quadrante onde a plataforma está localizada em relação à distância total é registrada. As funções de aprendizagem e memória dos animais são avaliadas.
[0078] 2. Modelo para avaliar a viabilidade celular: células SHSY5Y (células de neuroblastoma) são semeadas em uma placa de 96 cavidades (3000 células / cavidade). Após 24 h, o meio é removido e é adicionado um fármaco para pré-tratamento durante 0,5 h (formulado em um meio de cultura isento de soro; 3 replicações por dose). Depois, Αβ1-42 agregado (Αβ1-42 formulado em uma solução PBS a 1 mg / mL e incubado em uma incubadora a 4 °C durante 24 horas para formar um estado agregado, a uma concentração final de 2 μΜ) é adicionado e incubado durante 48 horas. A viabilidade celular é detectada pela CCK8.
[0079] Vantagens da presente invenção são ainda ilustradas nos seguintes exemplos não limitantes. Contudo, os materiais específicos e suas quantidades, bem como outras condições experimentais utilizadas nos exemplos, não devem ser interpretados como limitantes da presente invenção. As partes, proporções, percentagens e semelhantes na presente invenção são todas expressas em massa, salvo indicação em contrário.
Exemplos
Exemplo 1:
Etapa 1): Preparação de uma mistura de oliqossacarídeo de diácido manurônico [0080] Um intermediário do segmento M foi preparado pelo méto
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 45/69
21/34 do descrito nas patentes anteriores. As operações específicas são simplesmente descritas abaixo: 5 kg de alginato de sódio foram formulados em uma solução a ~ 10 % e o pH foi ajustado para cerca de 3,0 pela adição de ácido clorídrico diluído. A solução foi aquecida a 80 Ό e agitada. Foi permitida reagir por 10 horas antes do aquecimento ser interrompido. Após resfriamento até a temperatura ambiente, o pH foi ajustado para 9,0 pela adição de NaOH, e posteriormente ajustado para 2,85 por adição de ácido clorídrico diluído. A solução foi centrifugada a 5000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi coletado e ajustado para pH 1,0 pela adição de HCI. Após centrifugação, o precipitado foi coletado, concentrado em um evaporador rotativo e secado em vácuo para produzir 1500 g do intermediário do segmento M. 500 g do intermediário do segmento M foram pesados e dissolvidos em água destilada para preparar uma solução em um volume de 5 L. A solução foi ajustada para pH 6,5 com NaOH, e aquecida em um banho de água para controlar a temperatura de reação a 75 Ό. A t axa de fluxo de gás na saída de um cilindro de oxigênio e a potência de um gerador de ozônio foram ajustadas de tal modo que o ozônio foi alimentado à solução de reação a um taxa de fluxo de concentração em massa de 8 g / h. Após 4 horas de reação, a alimentação de ozônio foi parada e adicionou-se uma quantidade adequada de água para ajustar a concentração da solução para cerca de 10%. A solução foi filtrada através de uma membrana de ultrafiltração com um limite de peso molecular de 2.000 Da para coletar o retentado. O líquido coletado foi concentrado em um evaporador rotativo e secado sob vácuo para se obter 350 g do produto de diácido manurônico A.
Etapa 2): Análise de proporções e estruturas de oliqossacarídeos com vários graus de oolimerizacão no produto de diácido manurônico A [0081] 100 mg do produto de diácido manurônico A secado acima foram pesados, dissolvidos em água até uma concentração de 10 mg /
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 46/69
22/34 mL e passados através de uma membrana de filtro de 0,22 um para obter uma solução de amostra de teste. As proporções de oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização na composição foram determinadas por cromatografia de exclusão molecular de peptídeo Superdex (GE Co.) em combinação com dispersão da luz de laser de múltiplos ângulos (MALS, Wyatt Co.). As condições experimentais foram as seguintes:
Coluna cromatográfica: peptídeo Superdex 10 / 300GI
Fase móvel: 0,1 mol / L NaCI
Volume de injeção: 10 μι
Taxa de fluxo: 0,3 mL / min [0082] Resultados dos testes: do dissacarídeo ao decassacarídeo foram representados por dp2-dp10, respectivamente. dp2 foi 19 %, dp3 foi 25 %, dp4 foi 22 %, dp5 foi 13 %, dp6 foi 9 %, dp7 foi 6 %, dp8 foi 3 %, dp9 foi 2 % e dp 10 foi 1 %.
Etapa 3): Análise de LC-MS de estruturas de oligossacarídeos com vários graus de polimerização no produto de diácido manurônico A [0083] Condições experimentais:
Coluna cromatográfica: peptídeo Superdex 10 / 300GI
Fase móvel: 20 % de metanol + 80 % de 80 mmol / L de NH4Ac
Taxa de fluxo: 0,1 mL / min
Temperatura da coluna: 25 ± 0,8 Ό.
[0084] Condições de espectrometria de massa: Agilent 6540 QTOF; Fonte de íons: tensão de colisão ESI 120 V; modo de íon negativo. A largura do sinal adquirido (m/z) foi de 100-1000.
[0085] Os espectros de massa de oligossacarídeos com vários graus de polimerização são mostrados nas Figuras 1-3. Foram atribuídos vários picos de sinal no espectro de massa, confirmando as estruturas moleculares de todos os oligossacarídeos no produto A, isto é, a
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 47/69
23/34 estrutura como mostrada na Fórmula (III). As designações de sinal e as estruturas correspondentes aos sinais são mostradas na Tabela 1 abaixo.
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 48/69
Tabela 1. 6 Estruturas de diácido de oligossacarídeos com diferentes graus de polimerizacão no produto A e suas relações massa-carqa em massa
No. | Estrutura molecular | Fórmula molecular | Relação massa-carga (m/z) | ||||||||||
n=1 [M-1]- | n=2 [M-1]’ | n=3 [M-1]’ | n=4 [M-1]’ | n=5 [M-1]’ | n=6 [M-1]’ | n=7 [M-2]2- | n=8 [M-2]2’ | n=9 [M-2]2’ | |||||
1 | hJ I ho-7''-~^^--cooh í°ho \ n hooc °H | (CeHsOejnCeHioOs n=1-9 | 385 | 561 | 737 | 913 | 1089 | 1265 | 720 | 808 | 896 | ||
2 | H > | HOOC ni_| 1 ?ÜO ° \^***’^1 \ HO *Λ^-,’-**Ι*****Χ/Ι | o Ho-^^^COOH n hooc OH | (CeHsOejnCõHsO? n=1-9 | 355 | 531 | 707 | 883 | 1059 | 1235 | 705 | 793 | 881 |
3 | (CeHsOejnCõHsO? n=1-9 | 355 | 531 | 707 | 883 | 1059 | 1235 | 705 | 793 | 881 | |||
4 | H > | Γ HOOC ni_| ?ÜO *o \ , HO^X^--i****^z | COOH n hooc OH | (CeHsOejnCdHeOe n=1-9 | 325 | 501 | 677 | 853 | 1029 | 1205 | 690 | 778 | 866 |
5 | H > | HOOC ni_| 1 ?ÜO o \ HO | Ho-y^^COOH °^Z^COOH n | (CeHsOejnCdHeOe n=1-9 | 325 | 501 | 677 | 853 | 1029 | 1205 | 690 | 778 | 866 |
6 | H | Γ HOOC ni_| > T^° ‘o \ , HO^\^-- | COOH .^^Z-COOH s* n | (CeHsOejnCa^Oõ n=1-9 | 295 | 471 | 647 | 823 | 999 | 1175 | 675 | 763 | 851 |
24/34
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 49/69
25/34 [0086] Verificou-se a partir da análise estrutural espectrométrica de massa acima que o ácido manurônico na extremidade redutora da cadeia de açúcar no produto A foi oxidado em uma estrutura de ácido sacárico (ver a Fórmula III), que podería ser uma estrutura de ácido manárico compreendendo 6 átomos de carbono ( m + rri = 3), com um teor de cerca de 10-30 %, ou um produto de descarboxilação do ácido manárico, isto é, um ácido sacárico compreendendo 5 átomos de carbono (m + rri = 2) (30-50 %) e um ácido sacárico compreendendo 4 átomos de carbono (m + rri = 1) (30-40 %).
Etapa 4) Avaliação da atividade farmacolóqica [0087] 1. Efeito protetor do produto A na lesão de células nervosas induzida por Αβ [0088] O teste foi conduzido de acordo com o modelo para avaliar a viabilidade celular e o procedimento experimental foi como se segue: células SH-SY5Y (células de neuroblastoma) foram semeadas em uma placa de 96 cavidades (3000 células / cavidade). Após 24 h, o meio foi removido e, para os grupos de dosagem, 10 μΙ_ por cavidade de um fármaco (10 mg / mL) foi adicionado para pré-tratamento por 0,5 h (formulado em meio de cultura livre de soro; 3 réplicas por dose). Em seguida, Αβ 1-42 agregado (Αβ 1-42 foi formulado em uma solução PBS a 1 mg / mL e incubado em uma incubadora a 4 Ό durante 24 h para formar um estado agregado, a uma concentração final de 2 μΜ) foi adicionado e incubado durante 48 horas. A viabilidade celular foi detectada por CCK8.
[0089] Os resultados mostraram que o tratamento de células SHSY5Y com 2 μΜ de Αβ1-42 podería induzir dano celular significativo e diminuir a viabilidade celular após 48 horas, enquanto 25, 50 e 100 pg / mL de produto A inibiríam significativamente a viabilidade celular induzida por Αβ; ver a Figura 4. Os resultados acima indicam que o produto A pode proteger as células nervosas dos efeitos tóxicos do Αβ em
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 50/69
26/34 baixa concentração (25 pg / mL), uma concentração média (50 pg / mL) e uma alta concentração (100 pg / mL).
Exemplo 2:
[0090] Pesaram-se 100 g do intermediário do segmento M do Exemplo 1 e dissolveu-se em água destilada para preparar uma solução em um volume de 0,8 L. A solução foi ajustada para pH 4,0 com NaOH, e a reação foi realizada em temperatura ambiente (25 Ό). A taxa de fluxo de gás na saída de um cilindro de oxigênio e a potência de um gerador de ozônio foram ajustadas de modo a que o ozônio fosse introduzido na solução de reação a uma taxa de fluxo de concentração em massa de 1 g / h. Após 10 h de reação, a alimentação de ozônio foi parada e foi adicionada uma quantidade adequada de água para ajustar a concentração da solução até cerca de 15 %. A solução foi filtrada através de uma membrana de ultrafiltração com um limite de peso molecular de 1000 Da para coletar um retentado. O líquido coletado foi concentrado em um evaporador rotativo e secado sob vácuo para obter 80 g do produto de diácido manurônico B.
[0091] As proporções de oligossacarídeos com vários graus de polimerização em B foram determinadas por cromatografia de exclusão molecular de peptídeo Superdex (GE Co.) em combinação com dispersão da luz de laser de múltiplos ângulos (MALS, Wyatt Co.). O método de medição foi o mesmo do Exemplo 1. Resultados dos testes: do dissacarídeo ao decassacarídeo foram representados por dp2dp10, respectivamente. dp2 foi de 24 %, dp3 foi de 25 %, dp4 de 19 %, dp5 de 12 %, dp6 de 9 %, dp7 de 5 %, dp8 de 3 %, dp9 de 2 % e dp 10 de 1 %.
Exemplo 3:
[0092] Pesaram-se 100 g do intermediário do segmento M do Exemplo 1 e dissolveu-se em água destilada para preparar uma solução em um volume de 1,5 L. A solução foi ajustada para pH 9,0 com
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 51/69
27/34
NaOH, e a reação foi realizada em um banho de água a 45 Ό. A taxa de fluxo de gás na saída de um cilindro de oxigênio e a potência de um gerador de ozônio foram ajustadas de modo a que o ozônio fosse introduzido na solução de reação a um taxa de fluxo de concentração em massa de 3 g / h. Após 2 h de reação, a alimentação de ozônio foi parada e foi adicionada uma quantidade adequada de água para ajustar a concentração da solução até cerca de 5 %. A solução foi filtrada através de uma membrana de ultrafiltração com um limite de peso molecular de 3.000 Da para coletar um retentado. O líquido coletado foi concentrado em um evaporador rotativo e secado sob vácuo para obter 60 g de produto diurético manurônico C.
[0093] As proporções de oligossacarídeos com vários graus de polimerização em C foram determinadas por cromatografia de exclusão molecular de peptídeo Superdex (GE Co.) em combinação com dispersão da luz de laser de múltiplos ângulos (MALS, Wyatt Co.). O método de medição foi o mesmo do Exemplo 1. Resultados dos testes: do dissacarídeo ao decassacarídeo foram representados por dp2dp10, respectivamente. dp2 foi de 8 %, dp3 foi de 20 %, dp4 de 28 %, dp5 de 19 %, dp6 de 13 %, dp7 de 6 %, dp8 de 3 %, dp9 de 2 % e dp10 de 1 %.
Exemplo 4:
[0094] Etapa 1) Preparação do oligossacarídeo de diácido manurônico com grau único de polimerização, que foi o seguinte:
[0095] 1. Preparação da Amostra: 300 g do produto de diácido manurônico A preparado no Exemplo 1 foram dissolvidos em água para preparar 1000 mL de uma solução concentrada, a qual foi colocada em um refrigerador a 4 °C para utilização. Para cada utilização, 50 mL da solução foram diluídos com água a 1 : 2 e depois filtrados por sucção através de uma membrana de ultrafiltração de 0,22 um.
[0096] 2. Condições de separação cromatográfica: O cromatógrafo
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 52/69
28/34 foi o AKTA pure 150 (adquirido da GE Co.) equipado com um detector de UV e um coletor automático. Coluna cromatográfica de separação: Misturou-se 1,2 kg de BioGel P6 (adquirido a Bio-Rad Co.) com água desionizada, desgaseificou-se a vácuo, encheu-se manualmente em uma coluna de vidro (diâmetro interno: 10 cm), lavou-se com 10 volumes de coluna de água pura. O leito da coluna cromatográfica foi estável e a altura foi de 1,0 m. Em seguida, a fase móvel foi alterada para uma solução de NaCI a 0,02 M e, após o equilíbrio com 10 volumes de coluna, foi iniciada a carga da amostra.
[0097] 3. Carregamento e Separação: A taxa de fluxo da bomba foi ajustada em 1 mL / min. Depois de bombear 100 mL da solução da amostra para o topo da coluna através da própria bomba do cromatógrafo, esta foi comutada para a fase móvel e eluída com uma taxa de fluxo de 5 mL / min. Após a saída do volume de água morta, a coleta automática foi iniciada e 50 mL foram coletados por tubo.
[0098] 4. A carga da amostra foi repetida, e após 20 repetições de preparação, as mesmas frações foram combinadas, concentradas em um evaporador rotativo e liofilizadas para se obter um total de 9 oligossacarídeos com um grau de polimerização simples de dissacarídeo a decassacarídeo.
[0099] Etapa 2) Avaliação da atividade farmacológica [00100] As atividades farmacológicas dos oligossacarídeos de ácido oligomanárico com grau único de polimerização foram avaliadas da seguinte forma:
[00101] 1. Efeitos protetores dos oligossacarídeos na lesão de células nervosas induzida por Αβ [00102] A experiência foi realizada do mesmo modo que o descrito no Exemplo 1 e as soluções de oligossacarídeos foram preparadas a uma concentração de 10 mg / mL.
[00103] Os resultados mostraram que o tratamento de células SH
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 53/69
29/34
SY5Y com 2 μΜ de Αβ1-42 podería induzir dano celular significativo e diminuir a viabilidade celular após 48 horas, enquanto todos os oligossacarídeos de diácido manurônico com grau de polimerização único tinham uma tendência a inibir o dano celular induzido por Αβ. Os oligossacarídeos de diácido manurônico com um grau de polimerização de 4-10 (a concentração final dos fármacos foi de 25 pg / mL) poderíam proteger significativamente as células nervosas dos efeitos tóxicos do Αβ, em que os oligossacarídeos com quatro graus de polimerização de 5-8 tiveram melhores efeitos, e o hexassacarídeo teve a melhor atividade; veja a Figura 5.
[00104] 2. Efeitos de oligossacarídeos no modelo de aprendizagem e prejuízo da memória induzido pela injeção intraventricular direita de Αβ1-40 em ratos [00105] O procedimento experimental foi realizado em 10 g de cada um dos dissacarídeos para decasacarídeo de acordo com o método para modelo animal para avaliar a eficácia contra a AD.
[00106] Devido ao grande número de ácidos oligossacarídicos com um único grau de polimerização, a experiência foi completada em múltiplas bateladas. A comparação e avaliação da eficácia de vários oligossacarídeos foi realizada calculando a percentagem do número de vezes que os animais em cada grupo passaram através da plataforma em relação ao número de vezes que os animais controle de operação simulada passaram através da plataforma. Os resultados mostraram que o número de passagens pela plataforma foi significativamente reduzido no grupo de modelos em comparação com o grupo controle de operação simulada. Cada oligossacarídeo com grau único de polimerização apresentou tendência a aumentar o número de passagens através da plataforma. Os oligossacarídeos de diácido manurônico com grau de polimerização único de 4-10 poderíam aumentar significativamente o número de passagens através da plataforma, na qual os oli
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 54/69
30/34 gossacarídeos com quatro graus de polimerização de 5-8 tiveram melhores efeitos, e o hexassacarídeo teve a melhor atividade; veja a Figura 6.
Exemplo 5 [00107] Efetuou-se uma avaliação da atividade farmacológica entre as composições e o hexassacarídeo para examinar o efeito sinérgico dos oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização nas composições e na faixa de proporções dos oligossacarídeos.
[00108] Preparação da Amostra: Os oligossacarídeos de diácido manurônico com um único grau de polimerização como preparado no Exemplo 4 foram pesados com precisão de dissacarídeo a decassacarídeo pelo grau de polimerização. O peso de cada sacarídeo utilizado foi o seguinte: 0,5 g de dissacarídeo, 3,0 g de trissacarídeo, 2,0 g de tetrassacarídeo, 2,0 g de pentassacarídeo, 0,5 g de hexassacarídeo, 0,5 g de heptassacarídeo, 0,5 g de octasacarídeo, 0,5 g de nonassacarídeo, e 0,5 g de decassacarídeo. Eles foram misturados para obter 10 g de produto de composição D.
[00109] As proporções de oligossacarídeos nos produtos A, BeC preparados nos Exemplos 1, 2 e 3, respectivamente, e produto D preparado no presente Exemplo são mostrados na Tabela 2 abaixo.
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 55/69
Tabela 2. Porcentagens de oligossacarídeos nos produtos de composição de oligossacarídeos de diácido manurônico
proporção z'combinação | dissacarídeo | trissacarídeo | tetrassacarídeo | pentassacarídeo | hexassacarídeo | heptassacarídeo | octassacarídeo | nonassacarídeo | decassacarídeo |
A | 19% | 25% | 22% | 13% | 9% | 6% | 3 % | 2% | 1 % |
B | 24% | 25% | 19% | 12% | 9% | 5% | 3 % | 2% | 1 % |
C | 8% | 20 % | 28% | 19% | 13% | 6% | 3 % | 2% | 1 % |
D | 5% | 30 % | 20 % | 20 % | 5% | 5% | 5% | 5% | 5% |
31/34
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 56/69
32/34 [00110] Utilizaram-se 10 g de cada uma das amostras A, B, CeD acima para comparar as atividades farmacológicas destas composições e hexassacarídeo (6T) de acordo com o método descrito em modelo animal para avaliar a eficácia contra a AD.
[00111] No experimento, em comparação com o grupo controle de operação simulada, os animais do grupo de modelos tiveram uma latência de pesquisa de plataforma significativamente prolongada, indicando que a modelagem de avaliação obteve sucesso. Em comparação com o grupo de modelos, cada grupo de dosagem teve uma latência de pesquisa de plataforma significativamente reduzida.
[00112] Houve um dia de descanso após o término do treinamento de navegação local. Em seguida, a plataforma foi removida e um teste de sonda espacial foi realizado para observar o número de vezes que os animais passaram pela plataforma e a porcentagem da distância de natação no quadrante onde a plataforma estava originalmente localizada em relação à distância total, e avaliar a função de memória dos animais. Os resultados mostraram que o número de passagens através da plataforma foi significativamente reduzido no grupo de modelos e aumentou significativamente nos grupos de dosagem em comparação com o grupo controle de operação simulada, como mostrado na Figura 7. A porcentagem da distância de natação no quadrante onde a plataforma estava originalmente localizada em relação à distância total mostrou uma tendência similar ao número de passagens através da plataforma. Em comparação com o grupo controle de operação simulada, a porcentagem da distância de natação no quadrante onde a plataforma estava originalmente localizada em relação à distância total foi significativamente reduzida no grupo de modelo, e foi significativamente aumentada nos grupos de dosagem, como mostrado Figura 8.
[00113] Os resultados experimentais mostraram que as atividades farmacológicas respectivas das composições de oligossacarídeo A, B,
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 57/69
33/34
C e D eram ainda muito fortes no dia 4, e mais fortes do que a atividade do hexassacarídeo com um único grau de polimerização, sugerindo uma sinergia entre os oligossacarídeos nas composições.
Exemplo 6 [00114] Utilizou-se uma técnica de cocultura celular para avaliar melhor as atividades de vários oligossacarídeos com um único grau de polimerização e as composições.
[00115] Quantidades adequadas dos oligossacarídeos com um único grau de polimerização como preparado no Exemplo 4 e o produto A de composição de oligossacarídeo preparado no Exemplo 1 foram pesados com precisão e dissolvidos em PBS para preparar soluções de fármaco teste a uma concentração de 10 mg / mL.
[00116] A experiência de cocultura celular foi substancialmente a mesma que o método de cultura de células nos Exemplo 1 e Exemplo
4. A principal diferença reside no fato de a técnica de cocultura celular imitar a interação de diferentes células in vivo. Considerando que as células in vivo podem interagir umas com as outras por meio de uma via de sinalização, a fim de estarem mais próximas do ambiente in vivo, e simular a interação entre diferentes células durante o desenvolvimento da AD, as células da microglia foram introduzidas durante a cultura. O procedimento experimental específico foi o seguinte: células SH-SY5Y (células de neuroblastoma) foram semeadas em uma placa de 24 cavidades (12.000 células / cavidade), e células BV-2 (células microgliais) foram semeadas na câmara superior em uma concentração de 15.000 células / cavidade. Após 24 h, o meio foi removido e as soluções do fármaco teste foram adicionadas à câmara inferior para obter uma concentração final do fármaco de 25 pg / mL. Após 0,5 h de tratamento (formulado em um meio de cultura isento de soro; 3 réplicas por solução de fármaco), Αβ1-42 agregado (Αβ1-42 foi formulado em uma solução PBS para 1 mg / mL e incubado em uma incubadora
Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 58/69
34/34 a 4 Ό durante 24 horas para formar um estado agreg ado, a uma concentração final de 2 μΜ) foi adicionado e incubado durante 48 horas. A viabilidade das células SH-SY5Y na câmara inferior foi detectada por CCK8.
[00117] Após 48 horas, o grupo modelo foi comparado com o grupo controle normal. O primeiro exibiu danos significativos e reduziu a taxa de sobrevivência celular. Os grupos de dosagem mostraram o efeito de inibir o dano celular induzido por Αβ. Em particular, a atividade do produto A foi significativamente melhor do que as atividades de outros 9 oligossacarídeos com um único grau de polimerização, como mostrado na Figura 9. O modelo de células cocultivadas pode identificar a diferença de atividade entre a composição e os oligossacarídeos com único grau polimerização, possivelmente porque pode ocorrer um efeito sinérgico entre citocinas liberadas pelas células da microglia e os oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização na composição, aumentando assim a atividade da composição de oligossacarídeos.
Claims (17)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico, caracterizada pelo fato de que compreende um diácido manurônico de Fórmula (III) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo:OHH i ÕHq. I 3fcr···· · \ io / tn l HhCOOH oh Fórmula (III) em que n é um número inteiro de 1 a 9, m é 0, 1 ou 2 e rri é 0 ou 1, e onde o peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-5 é 8095% do peso total da composição; e a relação do peso total de diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total de diácidos manurônicos em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5.
- 2. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peso total de diácidos manurônicos em que m + rri = 1 ou 2 não é inferior a 50% ou mais, preferivelmente 60-90%, mais preferivelmente 70-90% do peso total da composição.
- 3. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o peso total de diácidos manurônicos em que m + rri = 1 não é inferior a 10%, preferivelmente 30-40% do peso total da composição.
- 4. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peso total de diácidos manurônicos em que m + rri = 2 não é inferior a 10%, preferivelmente 30 a 50% do peso total da composição.
- 5. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pePetição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 60/692/4 so total dos diácidos manurônicos em que η = 1-5 é 80-95% do peso total da composição.
- 6. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peso total dos diácidos manurônicos em que n = 1-3 é 20-70% do peso total da composição.
- 7. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a relação do peso total dos diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total dos diácidos manurônicos em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,5.
- 8. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a relação do peso total dos diácidos manurônicos em que n = 1-3 ao peso total dos diácidos manurônicos em que n = 4-7 está entre 1,0 e 3,0.
- 9. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que as porcentagens em peso de diácidos manosônicos com diferentes graus de polimerização na composição são: 5-25% de dissacarídeo, 15-30% de trissacarídeo, 15-25% de tetrassacarídeo, 10 -25% de pentassacarídeo, 5-15% de hexassacarídeo, 3-10% de heptassacarídeo, 2-5% de octassacarídeo, 1-5% de nonassacarídeo e 15% de decassacarídeo.
- 10. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as porcentagens em peso de diácidos manosônicos com diferentes graus de polimerização na composição são: 10-20% de dissacarídeo, 1830% de trissacarídeo, 15-25% de tetrassacarídeo, 15-20% de pentassacarídeo, 5-10% de hexassacarídeo, 3-5% de heptassacarídeo, 2-3% de octassacarídeo, 1-3% de nonassacarídeo e 1-3% de decassacarídeo.Petição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 61/693/4
- 11. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de sódio ou um sal de potássio.
- 12. Composição farmacêutica ou produto de cuidados da saúde, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz da composição de oligossacarídeo de diácido manurônico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e, se necessário, um veículo adequado.
- 13. Uso da composição de oligossacarídeo de diácido manurônico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para demência antissenil ou produto para cuidados de saúde.
- 14. Composição de oligossacarídeo de diácido manurônico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de ser para utilização como medicamento de demência antissenil ou produto para cuidados de saúde.
- 15. Método para tratar um paciente com demência senil, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade eficaz da composição de oligossacarídeo de diácido manurônico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 a um paciente em necessidade a mesma.
- 16. Método para a preparação de um oligossacarídeo de diácido manurônico e uma composição do mesmo por degradação oxidativa do ozônio, caracterizado pelo fato de que os componentes ou composição como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 são preparados.
- 17. Método para preparar um oligossacarídeo e uma composição do mesmo por degradação oxidativa de ozônio de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que: a reação de oxidaPetição 870190060262, de 27/06/2019, pág. 62/694/4 ção é realizada a uma temperatura de preferivelmente 0-700, mais preferivelmente 10-450; a etapa de degradação oxid ativa é realizada em um pH de 3-13, preferivelmente 4-10, mais preferivelmente 6-8.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2016113879 | 2016-12-30 | ||
PCT/CN2017/118843 WO2018121559A1 (zh) | 2016-12-30 | 2017-12-27 | 甘露糖醛二酸的组合物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BR112019013459A2 true BR112019013459A2 (pt) | 2019-12-31 |
Family
ID=62706915
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BR112019013459A BR112019013459A2 (pt) | 2016-12-30 | 2017-12-27 | composição de diácido manurônico |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11384111B2 (pt) |
EP (1) | EP3563853A4 (pt) |
JP (1) | JP6977059B2 (pt) |
KR (1) | KR102539060B1 (pt) |
CN (1) | CN108283647B (pt) |
AU (1) | AU2017385332B2 (pt) |
BR (1) | BR112019013459A2 (pt) |
CA (1) | CA3048554C (pt) |
EA (1) | EA201991615A1 (pt) |
MA (1) | MA47179A (pt) |
MY (1) | MY192462A (pt) |
PH (1) | PH12019550107A1 (pt) |
UA (1) | UA127034C2 (pt) |
WO (1) | WO2018121559A1 (pt) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110652525A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 上海绿谷制药有限公司 | 甘露糖醛二酸的组合物在治疗炎症中的应用 |
CN110652516A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 上海绿谷制药有限公司 | 甘露糖醛二酸的组合物在治疗帕金森氏症中的应用 |
CN110652526A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 上海绿谷制药有限公司 | 甘露糖醛二酸的组合物在治疗糖尿病中的应用 |
CN110652523A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 上海绿谷制药有限公司 | 甘露糖醛二酸的组合物在治疗血管性痴呆症中的应用 |
CN110652517A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 上海绿谷制药有限公司 | 褐藻胶寡糖二酸的组合物 |
CN112336876A (zh) * | 2019-08-06 | 2021-02-09 | 上海绿谷制药有限公司 | 用于识别阿尔茨海默病患者中的糖类药物敏感性患者的方法 |
CN112336742A (zh) * | 2019-08-06 | 2021-02-09 | 上海绿谷制药有限公司 | 甘露糖醛酸寡糖治疗Th1主导相关疾病的用途 |
CN112336860A (zh) * | 2019-08-06 | 2021-02-09 | 上海绿谷制药有限公司 | 通过调节肠道微生物治疗阿尔茨海默病的方法 |
CN112336861A (zh) * | 2019-08-06 | 2021-02-09 | 上海绿谷制药有限公司 | 通过调节氨基酸水平治疗阿尔茨海默病的方法 |
CN112741838A (zh) * | 2019-10-31 | 2021-05-04 | 上海绿谷制药有限公司 | 含有褐藻胶寡糖二酸的药用组合物 |
CN110755440B (zh) * | 2019-11-20 | 2023-02-28 | 中国海洋大学 | 川芎嗪和甘露糖醛酸的组合物在用于制备治疗血栓性疾病和神经***疾病的药物中的应用 |
CN113244445A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-08-13 | 广州市尚信净化工程有限公司 | 一种氧化亚铜-氧化刺槐豆胶抗菌凝胶 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1562050A (zh) | 2004-03-24 | 2005-01-12 | 中国海洋大学 | 褐藻酸寡糖在抗痴呆、抗糖尿病中的应用 |
CN100508985C (zh) * | 2004-03-24 | 2009-07-08 | 中国海洋大学 | 褐藻胶寡糖及其衍生物及其制备方法和用途 |
JP2016108474A (ja) | 2014-12-08 | 2016-06-20 | 栄治 松村 | オリゴ糖の製造方法およびオリゴ糖 |
CN106344595B (zh) * | 2015-07-17 | 2020-06-19 | 上海绿谷制药有限公司 | 褐藻胶寡糖及其衍生物在制备治疗疼痛药物中的应用 |
CN106344594A (zh) | 2015-07-17 | 2017-01-25 | 上海绿谷制药有限公司 | 褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗炎症中的应用 |
CN106349298B (zh) | 2015-07-17 | 2021-02-09 | 上海绿谷制药有限公司 | 褐藻胶寡糖及其衍生物在改善睡眠障碍中的应用 |
CN106344592A (zh) * | 2015-07-17 | 2017-01-25 | 上海绿谷制药有限公司 | 还原端1位为羧基的甘露糖醛酸寡糖及其衍生物在治疗帕金森氏症中的应用 |
CN106344593B (zh) | 2015-07-17 | 2020-01-10 | 上海绿谷制药有限公司 | 褐藻胶寡糖及其衍生物在制备治疗血管性痴呆药物中的应用 |
-
2017
- 2017-12-27 CA CA3048554A patent/CA3048554C/en active Active
- 2017-12-27 WO PCT/CN2017/118843 patent/WO2018121559A1/zh unknown
- 2017-12-27 MA MA047179A patent/MA47179A/fr unknown
- 2017-12-27 JP JP2019556407A patent/JP6977059B2/ja active Active
- 2017-12-27 EA EA201991615A patent/EA201991615A1/ru unknown
- 2017-12-27 EP EP17888733.7A patent/EP3563853A4/en active Pending
- 2017-12-27 UA UAA201908582A patent/UA127034C2/uk unknown
- 2017-12-27 AU AU2017385332A patent/AU2017385332B2/en active Active
- 2017-12-27 KR KR1020197022102A patent/KR102539060B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-27 US US16/474,928 patent/US11384111B2/en active Active
- 2017-12-27 MY MYPI2019003786A patent/MY192462A/en unknown
- 2017-12-27 BR BR112019013459A patent/BR112019013459A2/pt unknown
- 2017-12-28 CN CN201711467596.6A patent/CN108283647B/zh active Active
-
2019
- 2019-06-27 PH PH12019550107A patent/PH12019550107A1/en unknown
-
2022
- 2022-07-08 US US17/860,468 patent/US20220356202A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018121559A1 (zh) | 2018-07-05 |
MA47179A (fr) | 2019-11-06 |
US20200385417A1 (en) | 2020-12-10 |
EP3563853A4 (en) | 2021-01-06 |
PH12019550107A1 (en) | 2020-06-01 |
WO2018121559A8 (zh) | 2023-03-30 |
KR102539060B1 (ko) | 2023-06-02 |
KR20190101420A (ko) | 2019-08-30 |
NZ754947A (en) | 2021-03-26 |
MY192462A (en) | 2022-08-22 |
EA201991615A1 (ru) | 2019-12-30 |
JP2020507619A (ja) | 2020-03-12 |
EP3563853A8 (en) | 2020-06-17 |
EP3563853A1 (en) | 2019-11-06 |
CN108283647A (zh) | 2018-07-17 |
AU2017385332A1 (en) | 2019-07-18 |
CA3048554C (en) | 2022-11-29 |
UA127034C2 (uk) | 2023-03-22 |
US11384111B2 (en) | 2022-07-12 |
US20220356202A1 (en) | 2022-11-10 |
CA3048554A1 (en) | 2018-07-05 |
AU2017385332B2 (en) | 2020-10-29 |
CN108283647B (zh) | 2021-01-15 |
JP6977059B2 (ja) | 2021-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
BR112019013459A2 (pt) | composição de diácido manurônico | |
US10213456B2 (en) | Alginate oligosaccharides and the derivatives thereof as well as the manufacture and the use of the same | |
EP3815692A1 (en) | Composition of alginate oligosaccharide diacid | |
US20180207194A1 (en) | Oxidized b-1,4-oligoglucuronic acid, and preparation method therefor and uses thereof | |
EP3815690A1 (en) | Application of composition of mannuronic diacid in treating diabetes | |
NZ754947B2 (en) | Composition of mannuronic diacid | |
AU2019296419A1 (en) | Use of mannuronic dicarboxylic acid composition in treatment of inflammation | |
CN110652516A (zh) | 甘露糖醛二酸的组合物在治疗帕金森氏症中的应用 | |
US11406653B2 (en) | Use of mannuronic diacid composition in treatment of pain | |
EA041420B1 (ru) | Композиции маннуроновой дикислоты, способы ее получения и использования | |
US11406651B2 (en) | Use of mannuronic diacid composition in treatment of vascular dementia | |
EA045761B1 (ru) | Композиция олигомерных сахарных дикислот, получаемых из альгиновой кислоты |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |