BR112019010792A2

BR112019010792A2 - composição compreendendo uma mistura bacteriana para uso na prevenção e melhoria da condição de ungulados que sofrem de doenças envolvendo uma infecção podal parasitária ou bacteriana.

Info

Publication number: BR112019010792A2
Application number: BR112019010792A
Authority: BR
Inventors: Brame Alexandre; Layus Michel
Original assignee: Nolivade
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2019-10-01
Also published as: BR112019010792A8; US11052121B2; EP3548052B1; MX2019006086A; CA3044013A1; FR3059237B1; WO2018100292A1; FR3059237A1; EP3548052A1; CN110248670A; US20200179465A1; DK3548052T3; CN110248670B; ES2888999T3; PL3548052T3

Abstract

a invenção se refere ao uso de uma mistura bacteriana para a prevenção e melhoria do estado de ungulados que sofrem de patologias que envolvem uma infecção parasítica ou bacteriana das patas, a dita composição compreendendo: pelo menos uma cepa de bactérias do gênero bacillus, e pelo menos uma bactéria do ácido láctico.

Description

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA MISTURA BACTERIANA PARA USO NA PREVENÇÃO E MELHORIA DA CONDIÇÃO DE UNGULADOS QUE SOFREM DE DOENÇAS ENVOLVENDO UMA INFECÇÃO PODAL PARASITÁRIA OU BACTERIANA [001] A invenção se refere ao uso de uma composição para o tratamento de doenças de animais.

[002] Na moderna pecuária bovina, caprina e ovina, a claudicação é comum e constitui um terço de todas as visitas de um profissional veterinário. Os distúrbios podais, sejam ou não a causa da claudicação, são cada vez mais frequentes no contexto da pecuária intensiva atual. Eles têm várias etiologias e a localização dos mesmos no sistema musculoesquelético é variável. O ambiente sujo e abrasivo ao redor das patas é um fator que muitas vezes é dito promover a ocorrência de doenças que fazem o animal ficar manco. De fato, terra úmida e suja e concreto abrasivo promovem e mantêm a inflamação da pele subjacente à claudicação observada e ao alto nível de recorrência desses distúrbios.

[003] A combinação desses estressores que contribuem para causar dor e claudicação nos animais é chamada de “estresse abiótico”. Esse estresse abiótico causa abrasão nos espaços entre os dedos ou nos próprios dedos, o que resulta em reações inflamatórias que promovem o ingresso de bactérias ou outros parasitas, causando pododermatite e claudicação. Isso enfraquece a barreira cutânea em particular e produz condições favoráveis para que doenças podais se estabeleçam e persistam.

[004] Há tanto antibióticos, como a oxitetraciclina, quanto desinfetantes para aplicação em um banho para as patas no mercado, mas a frequência e a duração da administração não são padronizadas. Não é dada qualquer indicação sobre a necessidade de usar os ditos antibióticos e desinfetantes, dependendo do número de casos detectados, e estes banhos para as patas nem sempre são totalmente práticos para colocar em prática. Alguns

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2/32 desses produtos de tratamento têm a reputação de serem eficazes (formol, sulfato de cobre), mas correm o risco de serem proibidos para uso em um futuro próximo, já que são de um risco tóxico para os seres humanos ou o meio ambiente. Além disso, o uso de antibióticos também está sujeito a críticas e é restrito devido ao risco de desenvolver resistência.

[005] Isso representa uma limitação para os meios disponíveis para o controle dessa doença, já que as medidas que foram implementadas são inadequadas para limitar a disseminação de doenças que resultam em animais tomando-se coxos.

[006] Além disso, existe a necessidade de fornecer tratamentos eficazes para tratar animais e proteger sua saúde, respeitando o meio ambiente.

[007] Diversas abordagens foram usadas para tentar reduzir a claudicação nos ungulados. Por exemplo, o pedido de patente francês FR3026643A1 descreve o uso de extratos vegetais aromáticos em combinação com minerais para o tratamento da doença de Mortellaro em bovinos. Os animais são tratados pela ingestão de um suplemento dietético contendo os ditos extratos, o que faz com que as suas defesas imunes sejam estimuladas. Outro exemplo é o pedido de patente internacional WO1998047374, que descreve o uso de probióticos para prevenir infecções bacterianas, fúngicas ou virais, sendo os probióticos cepas de Bacillus selecionadas dentre: Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Bacillus laterosporus e Bacillus laevolacticus. Estes probióticos são usados para tratar a dermatite e dermatite de contato. Os probióticos em questão são aplicados diretamente na pele ou na mucosa a ser tratada. No entanto, a eficácia do mesmo não foi formalmente demonstrada.

[008] Além disso, estes métodos não parecem ser os mais eficazes e não apresentam uma solução mais geral para o problema da claudicação em ungulados.

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3/32 [009] Além disso, a invenção visa superar essas desvantagens.

[0010] Um dos objetivos da invenção é propor um meio para melhorar a qualidade de vida dos animais que sofrem de claudicação.

[0011] Outro objetivo da invenção é fornecer uma composição com estas propriedades.

[0012] A invenção se refere a uma composição compreendendo uma mistura bacteriana para uso na prevenção e melhoria da condição dos ungulados que sofrem de doenças envolvendo uma infecção podai bacteriana ou parasitária, a dita composição compreendendo:

pelo menos uma cepa bacteriana do gênero Bacillus, em especial pelo menos uma Bacillus subtilis, e pelo menos uma cepa bacteriana láctica, em especial pelo menos uma Lactococcus lactis e/ou pelo menos uma Pediococcus pentosaceus.

[0013] A invenção baseia-se na descoberta surpreendente pelos inventores de que a combinação de bactérias do gênero Bacillus e bactérias lácticas melhora significativamente a condição de ungulados que sofrem de claudicação causada por uma infecção parasitária ou bacteriana podai.

[0014] Na invenção, “doenças envolvendo uma infecção podai parasitária ou bacteriana” significa uma doença cujos sintomas estão ligados a uma bactéria, mas também a um vírus ou a um parasita (como um ácaro ou um artrópode).

[0015] Na invenção, como na zootecnia, “pata” significa a porção final dos quatro membros. Cada pata é composta por dois dedos funcionais; o dedo externo ou lateral III e o dedo interno ou medial IV, assim como dois dedos auxiliares não funcionais, estão localizados na superfície palmar da pata, em frente à segunda falange. Eles são chamados de garras de orvalho e são os vestígios dos dedos II intemamente e os dedos V extemamente. Aqui, o diagnóstico diferencial das doenças bovinas podais leva em consideração

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4/32 apenas as estruturas anatômicas entre a articulação mandacarpofalângica e a extremidade dos membros anteriores e posteriores. Ela também pode ser chamada de região do dedo.

[0016] Na invenção, “ungulados” significa animais tendo um ou mais cascos no final de seus membros. O casco é, portanto, uma formação córnea altamente desenvolvida que envolve o(s) dedo(s) em contato com o solo ao caminhar. Os ungulados abrangidos pela presente invenção são, em particular, os ungulados domésticos, especialmente os ungulados criados, tais como os da pecuária suína, bovina, caprina e ovina. Os ungulados preferenciais são porcos, vacas e vitelos, cabras e ovelhas e, em menor grau, cavalos.

[0017] As bactérias do gênero Bacillus usadas na invenção são bactérias gram-positivas da família das Bacillaceae, da ordem Bacillales, da classe Bacillis e do filo Firmicutes.

[0018] As bactérias lácticas da invenção são bactérias gram-positivas.

[0019] Os inventores demonstraram que o uso de uma combinação de pelo menos um bacilo com pelo menos uma bactéria láctica teve o efeito de melhorar a qualidade de vida dos ungulados que sofrem de claudicação devido a uma infecção podai.

[0020] Vantajosamente, a invenção se refere a uma composição para uso como definido acima, em que a composição bacteriana contém:

pelo menos uma das quatro seguintes cepas de Bacillus subtilis: NOL01, NOL02, NOL03 e NOL04, as ditas cepas sendo depositadas no CNCM com os números CNCM I - 4606, CNCM I - 5043, CNCM I - 4607 e CNCM I - 4608, respectivamente, e pelo menos uma bactéria láctica selecionada das seguintes bactérias lácticas: cepa de Lactococcus lactis spp lactis 1 NOL11 e cepa de Pediococcus pentosaceus 2 NOL12, as ditas cepas sendo depositadas no CNCM sob os números CNCM I - 4609 e CNCM 1-4610, respectivamente.

[0021] As diferentes cepas da invenção, referenciadas por seu número

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5/32 de depósito, foram todas depositadas na National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), no Institut Pasteur, em Paris (25,28 rue du Docteur Roux 75724 Paris CEDEX 15) de acordo com o Tratado de Budapeste.

[0022] A cepa NOLOl foi depositada sob o número CNCM 1-4606 em 14 de março de 2012,

A cepa NOL02 foi depositada sob o número CNCM 1-5043, em 21 de janeiro de 2016,

A cepa NOL03 foi depositada sob o número CNCM 1-4607 em 14 de março de 2012,

A cepa NOL04 foi depositada sob o número CNCM 1-4608 em 14 de março de 2012,

A cepa NOL11 foi depositada sob o número CNCM 1-4609 em 14 de março de 2012, e

A cepa NOL12 foi depositada sob o número CNCM 1-4610 em 14 de março de 2012.

[0023] A invenção se refere ao uso de pelo menos uma cepa selecionada das cepas NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL04, e pelo menos uma cepa selecionada das cepas NOLI 1 e NOLI2. Além disso, a invenção abrange as 45 seguintes combinações:

NOLOl e NOLI 1,

NOLOl eNOL 12,

NOLOl, NOLI 1 eNOL 12,

NOL02 eNOLll,

NOL02 e NOL 12,

NOL02, NOLI 1 eNOL 12,

NOL03 eNOLll,

NOL03 eNOL 12,

NOL03, NOLI 1 eNOL 12,

NOL04 eNOLll,

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NOL04 e NOL 12,

NOL04, NOLI 1 e NOL 12,

NOLOl, NOL02 e NOLI 1,

NOLOl, NOL02 e NOLI 2,

NOLOl, NOL02, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL03 e NOLI 1,

NOLOl, NOL03 e NOLI2,

NOLOl, NOL03, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL04 e NOLI 1,

NOLOl, NOL04 e NOLI2,

NOLOl, NOL04, NOL11 e NOL12,

NOL02, NOL03 e NOL11,

NOL02, NOL03 e NOLI 2,

NOL02, NOL03, NOL11 e NOL12,

NOL02, NOL04 e NOLI 1,

NOL02, NOL04 e NOLI 2,

NOL02, NOL04, NOL11 e NOL12,

NOL03, NOL04 e NOLI 1,

NOL03, NOL04 e NOLI2,

NOL03, NOL04, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL11,

NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL12,

NOLOl, NOL02, NOL03, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL02, NOL04 e NOL11,

NOLOl, NOL02, NOL04 e NOL12,

NOLOl, NOL02, NOL04, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL03, NOL04 e NOL11,

NOLOl, NOL03, NOL04 e NOL12,

NOLOl, NOL03, NOL04, NOL11 e NOL12,

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NOL02, NOL03, NOL04 e N0L11,

NOL02, NOL03, NOL04 e NOL12,

NOL02, NOL03, NOL04, NOL11 e NOL12,

NOLOl, NOL02, NOL03, NOL04 e NOL11, NOLOl, NOL02, NOL03, NOL04 e NOL12, e NOLOl, NOL02, NOL03, NOL04, NOL11 e NOL12.

[0024] Vantajosamente, a invenção se refere a uma composição para uso como definido acima, a dita composição contendo de 10⁵ a 10¹¹ colônias bacterianas de Bacillus e de 10⁵ a 10¹¹ colônias bacterianas de bactérias lácteas, as colônias bacterianas em ml ou g de composição.

[0025] Na invenção, a partir de 10⁵ a 10¹¹ colônias bacterianas significa: aproximadamente 10⁵, aproximadamente 5,10⁵, aproximadamente 10⁶, aproximadamente 5,10⁶, aproximadamente 10⁷, aproximadamente 5,ΙΟ⁷, aproximadamente 10⁸, aproximadamente 5.10⁸, aproximadamente ΙΟ⁹, aproximadamente 5,10⁹, aproximadamente 10¹⁰, aproximadamente 5,10¹⁰ ou aproximadamente 10¹¹ colônias bacterianas por ml de cultura bacteriana.

[0026] Uma pessoa versada na técnica sabe prontamente como determinar este número de bactérias, em particular quer por contagem manual (usando uma lâmina de Malassez) ou usando um contador de células automático, ou por diluição e depois semeando em placas de ágar e contando as colônias.

[0027] Mais vantajosamente, a invenção se refere a uma composição para uso como definido acima, em que pelo menos uma cepa de Bacillus está na forma esporulada e/ou na forma vegetativa.

[0028] Em particular, é especialmente vantajoso para as bactérias do gênero Bacillus, e em particular as cepas NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL04 como definido acima, estarem na forma esporulada e as cepas de bactérias lácticas estarem na forma vegetativa.

[0029] Ainda mais vantajosamente, a invenção se refere a uma

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8/32 composição para o uso acima mencionado, em que ditas doenças envolvendo uma infecção parasitária ou bacteriana nas patas de ungulados são selecionadas da doença de Mortellaro, dermatite digital, ou tiloma, paroníquia ou laminite, ou podridão da pata, erosão de bulbo, necrose do dedo e pododermatite.

[0030] A doença de Mortellaro, ou dermatite dos dedos, foi descrita pela primeira vez em 1974 em Milão por Cheli e Mortellaro. Foi evidenciada na França na década de 1980. Esta doença parece ser cada vez mais frequente na pecuária francesa e coloca uma série de questões relacionadas com a sua gestão a longo prazo. E considerada a terceira infecção podai mais frequente após a erosão do calcanhar (dermatite interdigital) e hemorragia única (calos). A doença de Mortellaro é causada por Treponema e potencialmente por Fusobacterium necrophorum. Uma vez introduzida em uma fazenda, é muito raramente erradicada e ocorre em surtos sucessivos. A dermatite digital é uma doença contagiosa caracterizada por uma inflamação superficial circunscrita da pele da coroa, que leva à claudicação. Afeta o gado em particular. A doença de Mortellaro é reconhecível por um pé inchado e necrose interdigital. [0031] A dermatite interdigital (chamada ‘Le Fourchet’ em francês) é uma infecção bacteriana. E causada por uma bactéria (Dichelobacter nodosus e Fusobacterium necrophorum) que gosta particularmente de ambientes quentes e úmidos. A Le Fourchet, ou dermatite interdigital, começa com uma inflamação úmida e fétida da pele interdigital e se estende até o como do calcanhar, onde afeta a bainha córnea. O corno produzido é de baixa qualidade e surgem fissuras no bulbo do calcanhar. Essas fissuras causam irritação à pododerma, que reage produzindo mais como. A partir deste estágio, a situação só piora.

[0032] O Tiloma, ou hiperplasia interdigital, é uma reação inflamatória proliferativa da pele entre as garras, mas é comum ter lesões de Mortellaro acima. A patologia resulta, portanto, de infecções causadas por

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Treponema e Fusobacterium necrophorum.

[0033] A paroníquia ou flegmão interdigital são inflamações agudas dos tecidos moles caracterizadas por um casco vermelho inchado. Estas doenças são causadas por bactérias, em particular Arcanobacterium pyogenes e Fusobacterium necrophorum.

[0034] A laminite, ou pododermatite asséptica difusa, é uma lesão na sola que dá uma cor amarela/vermelha e pode até ficar azul, e pode evoluir para uma úlcera.

[0035] A podridão da pata é uma doença bacteriana transmitida por pastagens, leitos ou caminhos contaminados por animais infectados. Esta doença é caracterizada, em primeiro lugar, por vermelhidão no espaço interdigital e, em seguida, os animais tomam-se coxos e têm lesões com escorrimento com um odor desagradável. O como então começa a apodrecer, algumas partes da garra se necrosam e se desprendem da pata do animal.

[0036] A erosão do bulbo é definida como a perda irregular do como do bulbo na região do calcanhar, muitas vezes na forma de sulcos oblíquos profundos. Esta infecção bacteriana causa podridão nos calcanhares. A necrose do dedo da pata é uma lesão na extremidade distai das patas do gado, o que causa claudicação ocasionalmente severa.

[0037] Pododermatite é uma infecção bacteriana da pele que geralmente se situa em tomo das garras ou cascos das patas. As seguintes doenças foram identificadas em ungulados: pododermatite asséptica (Pododermatite asséptica aguda, Pododermatite asséptica crônica), pododermatite com aspecto pumlento (Pododermatite pumlenta), pododermatite verrucosa cancerosa ou crônica (Pododermatite crônica verrucosa), certas formas de gangrena (Pododermatite gangrenosa), pododermatite necrosante (Pododermatite necrótica), pododermatite com infecção (Pododermatite infecciosa) e pododermatite crônica hiperplásica (Pododermatite crônica hiperplástica).

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10/32 [0038] A composição acima mencionada pode portanto ser usada como descrito acima para melhorar a qualidade de vida de animais que sofrem de claudicação causada pelas doenças mencionadas acima. De fato, a mistura bacteriana da invenção tem um efeito limitante na progressão das bactérias que causam as ditas doenças.

[0039] A mistura bacteriana também tem um efeito preventivo, limitando a proliferação de bactérias patogênicas e, portanto, previne a claudicação resultante das mesmas.

[0040] Vantajosamente, a invenção se refere a uma composição para uso como definido acima, estando a dita composição em uma forma líquida que se destina a ser pulverizada ou usada em uma bacia.

[0041] A composição de acordo com a invenção é, em particular, fornecida sob a forma de pó, mas também pode ser fornecida sob a forma de líquido, a fim de ser aplicada mais facilmente às patas dos ungulados. Esta aplicação na forma líquida pode ser realizada pulverizando-se ou nebulizando-se diretamente nas patas já infeccionados, ou simplesmente em patas sã com a finalidade de profilaxia. E também possível fornecer composições na forma de líquidos que são colocadas em banhos de patas através dos quais os animais andam, o que coloca a composição da invenção em contato com as patas dos ungulados.

[0042] Mais vantajosamente, a invenção também se refere a uma composição para o uso acima mencionado, em que a dita composição é diluída em pelo menos um 1 litro de líquido mas no máximo 5 litros de líquido para 50 a 60 animais.

[0043] No contexto da invenção, é vantajoso que a composição bacteriana acima mencionada seja diluída em um volume líquido de 1 a 5 litros para tratar 50 a 60 animais por pulverização.

[0044] Na invenção, “pelo menos um 1 litro de líquido mas no máximo 5 litros de líquido” especifica que a composição pode ser diluída em

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1:1, 1,5:1, 2:1, 2,5:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 4,5:1, ou 5:1, quando há 50 a 60 animais a serem tratados (ou 100 a 120 patas traseiras, que são os patas mais afetadas).

[0045] Volumes de aproximadamente de 1:1 são particularmente vantajosos para uma aplicação que é em particular realizada por pulverização nas patas. Os maiores volumes, e em particular 5:1, são os mais apropriados para banhos de patas. No entanto, os maiores volumes podem ser usados para pulverização ou nebulização.

[0046] Para 100 animais, também é possível dobrar os volumes mencionados acima de uma forma proporcional, e um versado na técnica saberá converter as conversões apropriadas.

[0047] A composição de acordo com a invenção, quando diluída como mencionado acima, é em particular um líquido que é água, água salgada (0,9% em peso de solução salina de sal com base no volume total), ou qualquer outro líquido que seja fisiologicamente aceitável para aplicação cutânea ou aplicação ao como dos cascos dos animais.

[0048] O líquido usado pode também conter aditivos fisiologicamente aceitáveis e, em particular, tiossulfato quando o líquido é água. O tiossulfato, na verdade, neutraliza o cloro contido na água corrente fornecida por várias companhias de água. O líquido também pode conter sais e/ou corantes. E importante que os aditivos não tenham influência na vitalidade das bactérias contidas na composição da invenção.

[0049] Vantajosamente, a invenção se refere a uma composição para o uso acima mencionado, onde a dita composição é aplicada às patas dos ungulados de uma vez a cada 3 dias a uma vez a cada 15 dias.

[0050] A dose de tratamento apropriada para prevenir a claudicação nos animais ou para melhorar a sua qualidade de vida é um uso uma vez a cada 3 dias até uma vez a cada duas semanas.

[0051] Na invenção, “de uma vez a cada 3 dias a uma vez a cada 15 dias” significa uma vez a cada 3 dias, uma vez a cada 4 dias, uma vez a cada 5

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12/32 dias, uma vez a cada 6 dias, uma vez a cada 7 dias, uma vez a cada 8 dias, uma vez a cada 9 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 11 dias, uma vez a cada 12 dias, uma vez a cada 13 dias, uma vez a cada 14 dias, ou uma vez a cada 15 dias.

[0052] E vantajoso tratar os rebanhos que sofrem das doenças acima mencionadas de uma maneira permanente. O tratamento pode, no entanto, ser modulado para baixo de acordo com as estações do ano e a atividade dos animais (particularmente se o animal pasta).

[0053] A invenção também se refere a uma composição como definida acima, em associação com pelo menos um desinfetante, para uso no contexto do tratamento de doenças envolvendo uma infecção podai parasitária ou bacteriana dos ungulados, o dito pelo menos um desinfetante sendo usado pelo menos 48 horas antes a dita composição ser usada.

[0054] Na invenção, antes do uso das composições acima mencionadas, é possível tratar as patas dos ungulados com desinfetantes. E portanto imperativo que o desinfetante seja interrompido pelo menos 48 horas antes de se usar a composição de acordo com a invenção, de modo a não matar as bactérias que contém.

[0055] Os desinfetantes usados podem ser aqueles que são comumente usados por um versado na técnica, isto é, antibióticos (por exemplo, oxitetraciclina para vacas), formol, sulfato de zinco ou sulfato de cobre ou cal. Podem ser usados outros desinfetantes conhecidos de um versado na técnica.

[0056] A invenção será mais bem compreendida à luz dos quatro exemplos seguintes e 11 figuras:

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0057] A Fig. 1 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas de referência nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

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13/32 [0058] A Fig. 2 é um gráfico de barras que mostra a progressão da classificação média da claudicação das vacas de referência nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0059] As Figuras 3A e 3B são gráficos de pizza mostrando a distribuição das 4 categorias de claudicação para as vacas de referência. As diferentes categorias são as seguintes: a categoria 0 está em preto, a categoria 1 em branco, a categoria 2 em cinza e a categoria 3 é sombreada.

[0060] A Fig. 3A mostra as proporções no início do ensaio.

[0061] A Fig. 3B mostra as proporções no final do ensaio.

[0062] A Fig. 4 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas de referência nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0063] A Fig. 5 é um gráfico de barras que mostra a progressão da classificação média da claudicação das vacas de referência nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0064] As Figuras 6A e 6B são gráficos de pizza mostrando a distribuição das 4 categorias de claudicação para as vacas de referência. As diferentes categorias são as seguintes: a categoria 0 é em branco, a categoria 1 é sombreada, a categoria 2 é em preto e a categoria 3 é em preto.

[0065] A Fig. 6A mostra as proporções no início do ensaio.

[0066] A Fig. 6B mostra as proporções no final do ensaio.

[0067] A Fig. 7 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas de referência nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0068] A Fig. 8 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas no rebanho nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0069] A Fig. 9 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas no rebanho nas diferentes datas de

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14/32 tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0070] A Fig. 10 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas no rebanho nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0071] A Fig. 11 é um gráfico que mostra a progressão da classificação média da condição das patas das vacas de referência (curva com triângulos) e as vacas no rebanho (curva com quadrados) nas diferentes datas de tratamento com a composição de acordo com a invenção.

[0072] As Figuras 12A a 12D mostram gráficos que mostram as proporções de patas saudáveis (cinzento claro) e de patas problemáticas (cinzento escuro) para cada uma das quatro patas das ovelhas, para cada mês após o início do tratamento.

[0073] A Fig. IA mostra os resultados para a pata esquerda dianteira: coluna 1: Janeiro - saudável 80,1%, problema: 19,9%; coluna 2: Fevereiro saudável 81,4%, problema: 18,6%; coluna 3: Março - saudável 93,1%, problema: 6,9%; coluna 1: Abril - saudável 92,9%, problema: 7,1%.

[0074] A Fig. 1B mostra os resultados para a pata direita dianteira: coluna 1: Janeiro - saudável 80,1%, problema: 19,9%; coluna 2: Fevereiro saudável 81,4%, problema: 18,6%; coluna 3: Março - saudável 90,3%, problema: 9,7%; coluna 1: Abril - saudável 91,5%, problema: 8,5%.

[0075] A Fig. 1C mostra os resultados para a pata esquerda traseira: coluna 1: Janeiro - saudável 82,6%, problema: 17,4%; coluna 2: Fevereiro saudável 81,1%, problema: 18,9%; coluna 3: Março - saudável 91%, problema: 9%; coluna 1: Abril - saudável 88,5%, problema: 11,5%.

[0076] A Fig. 1D mostra os resultados para a pata direita traseira: coluna 1: Janeiro - saudável 82,9%, problema: 17,1%; coluna 2: Fevereiro saudável 81,1%, problema: 18,9%; coluna 3: Março - saudável 91,3%, problema: 8,7%; coluna 1: Abril - saudável 87,8%, problema: 12,2%.

EXEMPLOS:

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Exemplo 1: Preparação das misturas bacterianas [0077] No contexto da invenção, os inventores prepararam previamente frascos contendo as seguintes preparações:

Preparação 1 = Frasco de 20 ml [0078] Mistura de 4 Bacillus NOL01, NOL02, NOL03 e NOL04, em forma esporulada, na concentração de 10⁵ a 10¹¹ colônias/ml, para cada cepa bacteriana. As quatro cepas são misturadas em partes iguais, nas respectivas proporções 25:25:25:25.

[0079] A mistura foi mantida a uma temperatura entre -21 °C e -80°C. Preparação 2 = Frasco de 20 ml [0080] Bactérias lácticas de NOE11 em uma concentração de 10⁵ a 10¹¹ colônias/ml.

[0081] As bactérias foram mantidas a uma temperatura entre -21 °C e 80°C.

[0082] Os inventores então prepararam a composição usada para o restante dos experimentos:

Mistura: 1 frasco de preparação 1 + 1 frasco de preparação 2.

Exemplo 2: Estudo do impacto da aplicação da composição de acordo com a invenção em um rebanho de gado leiteiro que sofre de doença de Mortellaro [0083] Este ensaio seguiu o pré-teste que mostrou uma redução nos casos de doença de Mortellaro em um rebanho após a aplicação da composição da invenção às patas traseiras das vacas. O objetivo deste novo ensaio é:

confirmar os resultados em 4 novos rebanhos para determinar o efeito da composição da invenção na doença de Mortellaro, comparar o efeito da composição com os tratamentos preventivos já usados nos rebanhos, medir quantitativamente a eficácia deste tratamento.

[0084] O experimento foi realizado em 5 rebanhos de vacas Holstein,

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16/32 nas quais o produto foi pulverizado nas patas traseiras dos animais. O efeito da composição da invenção foi medido através do monitoramento da saúde do rebanho (contagem e progressão dos casos de doença de Mortellaro, tratamentos veterinários).

Características dos rebanhos

Rebanho 1: Normandia (Calvados; França) de interesse

Número de vacas	160/170
Ordenha	3 robôs Delaval
Número de bateladas	2
Estabulação	Estábulos com leitos de palha
Frequência de mudança do leito de palha	Diariamente
Quantidade de palha	Alto
Headlock	Sim, mas não para todos
Raspagem	Automático 3 a 4 vezes por dia
Fonte de água	Poço
Tratamento de água	n°
Tratamento atual de Mortellaro	Banho de antibiótico nas patas + spray de desinfecção de robô

Rebanho 2: Normandia (Calvados; França)

Número de vacas	190
Ordenha	Rotativo externo
Número de bateladas	2
Estabulação	Barracas com leitos de palha
Frequência de mudança do leito de palha	-
Quantidade de palha	Baixa (silagem de palha)
Headlock	n°
Raspagem	Trator duas vezes por dia
Fonte de água	Rede de distribuição
Tratamento de água	—
Tratamento atual de Mortellaro	Banho da pata com antibiótico depois de lavar as patas durante a ordenha

Rebanho 3: Normandia (Sena Marítimo; França)

Número de vacas	190 + vacas secas
Ordenha	3 robôs Delaval
Número de bateladas	2 (130 vacas por 2 robôs e 60 vacas por 1 robô)
Estabulação	1° batelada em estábulos com leito de palha 2^o batelada em área com leito de palha
Quantidade de palha	Moderadamente baixo
Headlock	Sim
Raspagem	Automático
Fonte de água	—
Tratamento de água	—
Tratamento atual de Mortellaro	Banho de patas formol

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17/32

Rebanho 4: Normandia (Calvados; França) de interesse

Número de vacas	100
Ordenha	2 robôs
Número de bateladas	—
Estabulação	Barracas com leitos de palha
Quantidade de palha	Moderado
Headlock	Sim
Raspagem	Automático
Fonte de água	—
Tratamento de água	Tratamento contra cloro
Tratamento atual de Mortellaro	Banho da pata seca

Rebanho 5: Normandia (Calvados; França)

Número de vacas	47 + 7 vacas secas
Ordenha	1 robô Delaval
Número de bateladas	1
Estabulação	Barracas com leitos de palha
Quantidade de palha	—
Headlock	Sim
Raspagem	—
Fonte de água	Poço
Tratamento de água	Tratamento contra cloro
Tratamento atual de Mortellaro	Antibióticos em uma lata de spray

Produto usado e material [0085] Uma dose de composição de acordo com a invenção foi preparada a partir de dois frascos separados de 20 ml:

• frasco 1 contendo os Bacillus NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL04, • frasco 2 contendo o Lactococcus NOL11, conforme descrito no exemplo 1.

[0086] Os frascos contêm as bactérias vivas em seu meio de cultura. Eles são fornecidos para a fazenda em um estado congelado e devem ser mantidos em um freezer, uma vez recebidos. O produto é descongelado e diluído em água antes da nebulização e depois pulverizado por nebulização. A água usada durante a nebulização não deve conter cloro e, portanto, o tratamento prévio da água com tiossulfato de sódio pode ser necessário.

[0087] O ensaio durou dois meses, com um tratamento sendo realizado uma vez por semana.

[0088] Os tratamentos para as patas que foram realizados pelos

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18/32 fazendeiros com composições antibióticas ou com composições que são incompatíveis com as bactérias na composição de acordo com a invenção foram interrompidos pelo menos 3 dias antes da primeira aplicação da composição de acordo com a invenção (fim da semana 00). A primeira aplicação do produto será realizada na primeira semana (início de fevereiro). [0089] Uma análise situacional do estado de saúde do rebanho foi realizada com o fazendeiro antes do início do ensaio. Essa avaliação constitui o ponto de partida e é a partir dessa referência que a progressão é avaliada. Uma vez que, na maioria dos rebanhos do estudo, o estado de saúde do rebanho estava sendo estabilizado por um tratamento antibiótico ou outro tratamento, este foi interrompido desde o início do estudo.

[0090] O fazendeiro relatou suas observações sobre o estado de saúde do rebanho e os registros qualitativos foram mantidos pelo técnico durante as visitas. O produto termina de ser aplicado na 9^a semana.

Tratamento [0091] Uso: para ser aplicado na forma líquida. Uma dose do produto (constituída pelos frascos B e L) é necessária para cada tratamento semanal.

[0092] O tratamento é baseado em uma dose diluída em 5 litros de água para o tratamento das patas traseiras das vacas. A quantidade de produto pulverizado é de aproximadamente 25 ml (ou aproximadamente 3 segundos de pulverização) por pata ou aproximadamente 5 litros de produto para o tratamento das patas traseiras de 100 vacas leiteiras.

Procedimento para preparar a solução:

• Deixe o produto descongelar à temperatura ambiente, entre 15 e 25°C, até que esteja completamente liquefeito (aprox. 1 hora ±15 minutos) • Prepare 5:1 de água no reservatório do nebulizador e adicione 80 mg de tiossulfato de sódio ou 10 ml se a solução for líquida (se a água for tratada com peróxido de hidrogênio, sempre use água mineral ou água não

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19/32 tratada).

[0093] · Retire a cápsula e remova a tampa dos frascos • Deite os dois frascos de produto na água tratada e adicione aproximadamente 10 ml de corante E 133 (corante azul brilhante de qualidade alimentar).

[0094] · Misture para homogeneizar o produto e deixe descansar por minutos • Pulverize as patas traseiras das vacas com aproximadamente 25 ml por pata • Este tratamento deve ser repetido a cada semana do estudo (9 tratamentos no total)._______________________________________________________

	Rebanho 1	Rebanho 2	Rebanho 3	Rebanho 4	Rebanho 5
Número de doses por aplicação	2	2	2	1	1
Quantidade de água	10:1	10:1	10:1	5:1	5:1 (apenas 2,5:1 são pulverizados)
Quantidade de tiossulfato adicionado	160 mg (2 doses)	160 mg (2 doses)	160 mg (2 doses)	80 mg (1 dose)	80 mg (1 dose)
Quantidade de corante adicionado	8 ml	Sem corante	8 ml	4 ml	4 ml

[0095] Para o rebanho 5, é preparada uma solução de uma dose diluída em 5 litros, que é normalmente fornecida para 100 vacas, mas somente metade é usada para a aplicação, e o restante é descartado.

Descrição das medidas e análises

Medidas comuns para todos os rebanhos [0096] Classificação da condição de cada vaca de referência:

No primeiro dia do teste, cerca de uma dúzia de vacas identificadas pelo fazendeiro como gravemente afetadas ou particularmente vulneráveis à doença de Mortellaro são acompanhadas mais de perto. Uma classificação indicativa da condição de cada vaca é dada pelo fazendeiro em uma escala de 0 a 10, com 0 representando uma vaca saudável e 10 uma vaca seriamente afetada.

[0097] Classificação geral da condição do rebanho:

O fazendeiro também dá uma classificação geral da condição

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20/32 de seu rebanho em uma escala de 0 a 10, com 0 representando um rebanho totalmente saudável e 10 para 100% dos animais afetados.

[0098] Fotos das patas das vacas, aplicação:

Fotos das patas traseiras das vacas são tiradas para dar uma imagem das possíveis observações na fazenda e dos sinais clínicos dos casos de doença de Mortellaro sem levantar as patas. Fotos da preparação e aplicação também são tiradas.

[0099] Classificação de claudicação das vacas de referência:

Uma classificação de claudicação é dada para as vacas de referência de acordo com a seguinte matriz:

0: Boa mobilidade - caminha com uma distribuição uniforme de peso e ritmo nas suas quatro patas, com costas planas. A vaca pode dar passos longos e lisos.

[00100] 1: Mobilidade deficiente - não uniforme (em termos de distribuição de peso ou ritmo) ou reduzida capacidade de locomoção; afeta uma ou mais patas, difícil de identificar.

[00101] 2: Mobilidade reduzida - caminhada não uniforme sobre pata facilmente identificável e/ou passada consideravelmente reduzida (geralmente associada a costas arqueadas).

[00102] 3: Mobilidade severamente reduzida - incapaz de andar tão rápido quanto um humano andando em um ritmo rápido (não consegue acompanhar o rebanho saudável) e tem sinais da pontuação de 2 acima.

Medida específica para o rebanho 2 [00103] Avaliação da reação das vacas durante a lavagem:

Uma classificação da reação das vacas é dada enquanto as patas estão sendo lavadas. As lesões encontradas em um estágio agudo da doença de Mortellaro são muito sensíveis e, portanto, o jato de água usado para lavar as patas doentes provoca frequentemente uma reação nas vacas, que levantam ou movimentam as patas. Esta reação é, portanto, registrada

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21/32 para cada um das patas traseiras usando a seguinte classificação:

Nenhuma reação - reação leve - reação forte

Medida específica para o rebanho 5 [00104] Fotos das patas traseiras de todas as vacas:

Nesta fazenda, todo o rebanho passa para uma gaiola de aparar (contratada ou produzida por um aparador) e uma foto é tirada de cada pata traseira. Usando essas fotos, cada pata é classificada de acordo com a seguinte matriz:

MO: saudável Vaca saudável sem lesões de dermatite digital

Ml: estágio inicial. Lesão bem circunscrita, com aparência de “pele de morango”, rosa ou cinza, menor que 2 cm. Geralmente doloroso

M2: estágio agudo. Lesões que tornam as vacas aleijadas por serem hipersensíveis e dolorosas. Ulceração da pele localizada na borda do como do casco (1) ou ao redor das garras (2). Progressão: inflamação crônica e crescimento da pele em pequenos nódulos levantados (3) ou em filamentos (pêlos grossos) (4). Muitas vezes coberto de pus com um odor fétido

M3: estágio de cura. Aparece após tratamento eficaz; a lesão fica coberta com uma crosta negra e toma-se insensível. A recuperação pode ser completa (retomar ao estágio MO) ou parcial (estágio M4)

M4: reservatório de doença. Lesão crônica, não ativa, seca e insensível. Pele espessa com o crescimento de pêlos grossos

M4-1: Ml forma ativa na lesão M4, muitas vezes sem bordas distintas.

Registros tomados pelo fazendeiro [00105] Se o fazendeiro já fez regularmente registros sobre problemas relacionados com a claudicação, estes são recolhidos e usados para avaliar o efeito do produto (por exemplo, número de vacas aleijadas, tratamento individual, abate de vacas por este motivo, etc.).

[00106] A percepção do fazendeiro sobre o efeito geral do tratamento e

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22/32 quaisquer observações ou comentários também são registrados.

[00107] Da mesma forma, se o fazendeiro tem um registro histórico das frequências da doença/claudicação de Mortellaro ou tratamentos veterinários, esses dados são usados para obter um ponto de comparação com o período do estudo.

Resultados

Rebanho 2

Resultado para o rebanho 2: classificação da condição da pata

	Avaliação da condição da pata em uma escala de 0 a 10 (0 = NTR (nada a relatar), 10 = problemas graves na pata)
n° da Vaca	03/02/16	10/02/16	17/02/16	24/02/16	02/03/16	09/03/16	16/03/16	23/03/16	30/03/16
8480	0	0	0	0	0	0	0	0	0
6264	7	7	6	5	5	5	5	4	2
5959	4	4	3	3	2,5	2	2	1	1
6300	9	9	9	8	7	6	6	5	5
6271	9	9	9	8	8	8	8	8	8
6367	4	4	3	3	3	4	5	5	4,5
6244	7	7	7	6	6	6	5	5	5
6209	4	4	4	3	2	1	1	1	0
6242	9	9	9	8,5	7	7	7	7	7
4834	8	6	5	5	4	5	5	4	2
8535	4	4	4	3	2	2	2	1,5	1
6010	4	5	5	5	4	4	3	2	2
0750	4	4	3	3	2	2	1	1	1
6289	6	5	5	4	4,5	4	4	4,5	4
4837	4	4	4	3	2	2	2	1	1
6232	4	3	3	2	2	2	2	2	0
5993	4	4	3	2	2	1	1	1	0
6416	4	4	6	6	5	4	3	3	2,5

[00108] Um aumento médio de 2,7 pontos é observado para as vacas problemáticas, com a claudicação de 16 vacas de 18 tendo sido reduzida. As outras duas estavam em condição estável.

[00109] A progressão da classificação média ao longo do ensaio é mostrada na Figura 1.

Resultados sobre a claudicação: classificação da claudicação_____________

	Classificação da claudicação entre 0 e 3 (cf. matriz)
n° da Vaca	03/02/16	24/02/16	30/03/16
8480	0	0	0
6264	2	1	1
5959	1	0	0
6300	2,5	3	2,5

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23/32

6271	3	2	2
6367	1	1	1
6244	2	1	2
6209	1	0	0
6242	3	3	2
4834	3	2	0
8535	1	1	1
6010	1	2	1
0750	1	1	0
6289	2	2	2
4837	1	2	0
6232	1	0	0
5993	1	1	0
6416	1	2	1

[00110] No final do estudo, a categoria de claudicação de 11 vacas de 18 tinha reduzido, e nenhum agravamento foi observado nas vacas monitoradas. Os resultados são mostrados nas Figs. 2 e 3A a 3B.

[00111] Os resultados para este rebanho são muito positivos.

[00112] Antes do tratamento com a composição de acordo com a invenção, as vacas receberam o seguinte tratamento uma vez por semana:

Lavagem das patas das vacas na sala de ordenha

Banhos da pata com Formol, sulfato de cobre e sulfato de zinco com o banho da pata sendo alterado entre as 2 bateladas

Durante o ensaio, os animais foram tratados da seguinte maneira uma vez por semana:

Lavagem das patas das vacas na sala de ordenha (apenas a I^ametade do ensaio)

Aplicação da composição de acordo com a invenção na sala de ordenha com o pulverizador.

[00113] O tratamento de acordo com a invenção tornou possível passar de 7 a 8 tratamentos de oxitetraciclina por semana para um tratamento uma ou três vezes durante o mesmo período. Embora o odor da infecção das vacas estivesse muito presente antes do ensaio, esse odor foi amplamente reduzido.

[00114] De acordo com o fazendeiro, sem a lavagem das patas das vacas na sala de ordenha, a aplicação da microflora com o material usado é menos restritiva que o sistema de banho das patas.

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24/32 [00115] Em relação à aparagem, todo o rebanho foi submetido à aparagem duas semanas antes do final do ensaio sem que os aparadores fossem informados do ensaio. Os aparadores concluíram que este foi o primeiro ano em que não mencionaram problemas relacionados à dermatite (contaminação <5% do rebanho).

Rebanho 3

Resultado para o rebanho 3: classificação da condição da pata

	Avaliação da condição da pata em uma escala de 0 a graves com as	0 (0 = NTR (nada a relatar), 10 = problemas patas)
n° da Vaca	03/02/1 6	10/02/16	17/02/16	24/02/16	02/03/16	09/03/16	16/03/16	23/03/16	30/03/16
1758	10	8	5	5	5	5	5	10	10
0751	5	3	2	1	1	0	0	0	0
9086	6	3	2	2	2	0	0	0	0
9152	6	3	3	3	2	0	0	0	0
5376	2	2	2	2	2	3	2	1	0
0227	5	5	5	5	4	3	2	2	0
0226	5	8	8	8	7	7	7	8	8
9144	8	5	8	8	8	7	7	7	8
3589	8	8	8	8	10	10	9	7	2
0216	8	8	8	8	8	8	8	8	8
0366	6	5	5	5	4	4	3	0	0
9460	8	7	7	7	7	6	6	5	6
0294	2	2	2	2	1	1	1	1	0
1787		9	9	9	6	5	5,5	8	8

[00116] Um aumento médio de 2,9 pontos é observado para as vacas problemáticas. 11 vacas de 14 têm uma condição da pata melhorada, exceto nas últimas 2 semanas. Nas últimas duas semanas, os problemas com raspagem levaram à deterioração da limpeza das áreas de vida, o que provavelmente aumentou a contagem bacteriana ambiental e teve impacto na condição de duas vacas de referência.

[00117] A progressão da classificação média ao longo do ensaio é mostrada na Figura 4.

Resultados sobre a claudicação: classificação da claudicação

	Classificaçãc	da claudicação entre 0 e	3 (cf. matriz)
n° da Vaca	03/02/16	24/02/16	30/03/16
1758	3	2	3
0751	3	1	0
9086	1	1	0
9152	2	1	0
5376	2	2	1

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25/32

0227	0	0	0
0226	2	3	3
9144	2	2	3
3589	1	2	0
0216	3	3	3
0366	3	2	0
9460	2,5	2	1
0294	2	2	0
1787		3	3

[00118] No final do ensaio, 9 vacas de 14 tiveram melhor mobilidade, 3 não mudaram e 2 se deterioraram. Deve-se notar, no entanto, que houve uma melhoria em uma categoria para todas as vacas de referência. Os resultados são mostrados nas Figs. 5 e 6A a 6B.

[00119] Os resultados para este rebanho também são muito positivos.

[00120] Antes do tratamento com a composição de acordo com a invenção, as vacas receberam banhos das patas com formol como tratamento.

[00121] Durante o ensaio, os animais foram tratados da maneira seguinte uma vez por semana no headlock, aplicando a composição de acordo com a invenção utilizando o pulverizador.

[00122] Segundo o fazendeiro, antes do tratamento, numerosos casos de claudicação ocorreram regularmente. Após o tratamento, apenas 2 a 3 vacas tiveram problemas, e apenas algumas vacas não responderam bem à composição.

[00123] O fazendeiro está convencido da eficácia da composição, apesar de ser cético antes do ensaio.

Rebanho 5

Resultado para o rebanho 5: classificação da condição da pata

	Avaliação da condição da pata em uma escala de 0 a 10 (0 = NTR (nada a relatar), 10 = problemas graves com as patas)
n° da Vaca	10/02/16	17/02/16	24/02/16	02/03/16	09/03/16	16/03/16	23/03/16
5722	10	9	9	9	9	9	9
2095	8	7	6	5	4	4	3
5377	8	8	7	5	4	3	3
5794	8	8	7	5	5	5	5
2105	7	6	6	4	3	3	2
5795	8	6	6	5	4	3	2
5801	10	7,5	7	6	6	6	5
5728	7	6	6	6	6	5	3

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26/32

5788	7	6	5	4	4	3	3
1937	6,5	6	5	3,5	3	2	1
2082	7	7	6	4,5	3	3	2
1826	8	7	6	6	6	5	5
2077	7	6	6	4,5	3	2,5	2
5581	4	4	3,5	2	1,5	1	1
2029	4	3	2	1,5	1	1	1
2108			10	8	6	4	3

[00124] Um aumento médio de 4,2 pontos é observado para as vacas problemáticas, com 15 vacas de 16 mostrando uma melhora na condição de suas patas. Apenas uma vaca permaneceu em más condições.

[00125] A progressão da classificação média ao longo do ensaio é mostrada na Figura 7.

[00126] Os resultados para este rebanho são novamente muito positivos aqui.

[00127] Antes do tratamento com a composição de acordo com a invenção, as vacas receberam uma aplicação de desinfetante por robô (4Hooves).

[00128] Durante o ensaio, os animais foram tratados da maneira seguinte uma vez por semana no headlock, aplicando a composição de acordo com a invenção utilizando o pulverizador.

[00129] Antes do tratamento, as vacas que foram gravemente afetadas foram tratadas individualmente com oxitetraciclina. Nenhum destes tratamentos foi necessário após a aplicação da composição de acordo com a invenção.

[00130] Segundo o fazendeiro, houve boa melhora no ouvido, e de fato consideravelmente menos vacas precisaram ser acompanhadas até a sala de ordenha.

[00131] Rebanho 1: o fazendeiro queria interromper o ensaio, pois ele tinha que parar suas práticas anteriores (desinfecção diária, alternando todas as semanas entre o peróxido e água sanitária) e ele viu a deterioração na condição de seu rebanho depois de uma única semana.

[00132] Rebanho 3: o ensaio foi interrompido, pois os inventores viram

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27/32 que o fazendeiro havia mudado de absorvente em seus estábulos, mudando de absorvente convencional para cal apagado aplicado de manhã e à noite. Uma vez que a cal apagada tem propriedades desinfetantes, era portanto incompatível com a composição da invenção. O fazendeiro optou por parar o ensaio em vez de parar a cal.

[00133] As Figs. 8 a 10 mostram a progressão geral dos rebanhos nas 3 fazendas.

[00134] Estes resultados, após uma aplicação da composição de acordo com a invenção, são visíveis apenas aproximadamente 3 semanas após a primeira aplicação, que é o tempo necessário para as bactérias contidas na composição de acordo com a invenção se implantarem.

[00135] A interrupção de um antigo tratamento regular que estabilizou a condição do rebanho pode resultar em deterioração nas 2 primeiras semanas de tratamento com a composição de acordo com a invenção. Portanto, pode ser necessário tratar individualmente cada vaca.

Exemplo 3: Teste de redução da frequência de aplicação [00136] Os inventores queriam testar se a redução da frequência de aplicação para uma vez a cada 2 semanas permite que uma situação estabilizada seja mantida após 2 meses de aplicação semanal.

[00137] Para fazer isso, o protocolo descrito no exemplo anterior foi ligeiramente modificado. Para o rebanho 2, a partir de 30/03/2016, o fazendeiro mudou para uma aplicação a cada 2 semanas com uma dose equivalente (2 doses para 100 vacas usadas para as 190 vacas do rebanho).

[00138] Para o rebanho 5, a partir de 15/04/2016, o fazendeiro mudou para uma aplicação a cada 2 semanas com uma dose equivalente (1 dose para 100 vacas para as 55 vacas do rebanho).

Rebanho 3:

[00139] A condição das vacas de referência continuou a melhorar e estabilizou-se com uma boa condição da pata após a redução do tratamento.

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28/32

Além disso, o estado geral do rebanho estabilizou-se com uma boa condição da pata.

[00140] A partir de abril, as vacas foram para fora.

[00141] A mudança de uma aplicação a cada semana para uma aplicação a cada duas semanas estabilizou a situação geral do rebanho com uma boa condição em relação aos problemas nas patas. Nenhuma deterioração foi observada.

[00142] Os resultados são mostrados em Fig. 11.

[00143] A tabela a seguir mostra os valores obtidos:

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n° da Vaca	10/02/16	17/02/16	24/02/16	02/03/16	09/03/16	16/03/16	23/03/16	07/04/16	27/04/16	11/05/16	25/05/16
5722	10	9	9	9	9	9	9	9	7	7	6
2095	8	7	6	5	4	4	3	2	2	2	2
5377	8	8	7	5	4	3	3	3	3	3	2
5794	8	8	7	5	5	5	5	4	2	2	2
2105	7	6	6	4	3	3	2	1	1	2	1
5795	8	6	6	5	4	3	2	1	1	1	1
5801	10	7,5	7	6	6	6	5	4	3	3	2
5728	7	6	6	6	6	5	3	2	2	3	2
5788	7	6	5	4	4	3	3	2	2	2	2
1937	6,5	6	5	3,5	3	2	1	0	0	0	0
2082	7	7	6	4,5	3	3	2	1	1	1	1
1826	8	7	6	6	6	5	5	4	3	3	2
2077	7	6	6	4,5	3	2,5	2	1	1	1	1
5581	4	4	3,5	2	1,5	1	1	0	0	0	0
2029	4	3	2	1,5	1	1	1	0	0	0	0
2108			10	8	6	4	3	3	2	2	2

29/32

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30/32

Para o rebanho 1:

Após uma fase de transição, que requereu tratamentos antibióticos seguidos de um protocolo para aplicação intensificada da composição da invenção (pés + construção), o estado geral do rebanho melhorou consideravelmente.

[00144] Segundo o fazendeiro, ele estava vendo uma situação que não vivenciara há um ano e meio. Ele tentou afastar ligeiramente as aplicações mudando para 10/12 dias, mas observou que não era possível ir além dos 12 dias já que as patas começaram a ficar rosadas, o que é um sinal dos sintomas reaparecendo.

Para o rebanho 5:

[00145] A deterioração severa foi observada no estado de saúde do rebanho devido à falta de manutenção do estábulo, resultante de erro humano. [00146] O controle foi recuperado da fazenda e a aplicação intensificada das aplicações às patas e ao ambiente foi realizado por 1 mês com a composição de acordo com a invenção, a fim de restabelecer o estado de saúde do rebanho.

[00147] A condição atual do rebanho melhorou, e a aparagem do rebanho começou.

[00148] No período em que as vacas tiveram acesso ao pasto, a contagem de patogênicos foi menor (frequentando áreas menos sujas), e a aplicação a cada duas semanas ou mais não causou deterioração na condição da pata do rebanho.

Exemplo 4: Estudo do impacto da aplicação da composição de acordo com a invenção a um rebanho ovino [00149] Neste exemplo, os inventores queriam testar a eficiência da composição de acordo com a invenção para tratar ou melhorar a claudicação em ovelhas, dentro do contexto da podridão da pata.

[00150] O ensaio foi realizado em um rebanho de 300 da raça Lacaune

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31/32 de ovelhas, em uma fazenda no Pyrénées-Atlantiques department.

[00151] As ovelhas foram tratadas com a composição de acordo com a invenção por uma aplicação da microflora uma vez por semana durante 12 semanas por meio de um tapete para banho de patas. Em cada dia de aplicação, as ovelhas passaram sobre o tapete duas vezes (uma vez por ordenha).

[00152] As bactérias que constituem a composição de acordo com a invenção são usadas a uma taxa de uma dose representando 40 ml da composição como descrito no exemplo 1, em 30 1 de água com um corante El33 azul brilhante e tiossulfato, e depois a solução foi vertida para o banho de patas.

Resultados

Os resultados gerais são apresentados na tabela a seguir:

	Janeiro	Fevereiro	Março	Abril
Número de ovelhas	281	291	288	295
Ovelhas com problema	91	106	94	113
Sem problemas	190	185	194	182
1 pata	5	0	89	110
2 patas	69	103	5	3
3 patas	3	0	0	0
4 patas	14	3	0	0

Verificou-se que as proporções são as seguintes:

	Janeiro	Fevereiro	Março	Abril
Sem problemas	68%	64%	67%	62%
1 pata	2%	0%	31%	37%
2 patas	25%	35%	2%	1%
3 patas	1%	1%	0%	0%
4 patas	5%	0%	0%	0%

Teste Qui-quadrado 2x2 entre as datas na distribuição das ovelhas por número de patas problemáticas:______________________________________

valor p	Janeiro	Fevereiro	Março	Abril
Janeiro	/
Fevereiro	2,26E-04	/
Março	2,20E-16	2,20E-16	/
Abril	2,20E-16	2,20E-16	0,2214	/

[00153] As distribuições são significativamente diferentes entre as

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32/32 datas, exceto entre março e abril.

[00154] As ovelhas com problemas no primeiro dia do ensaio quase todas melhoraram em termos do número de patas problemáticas.

[00155] No entanto, a deterioração é possível nas primeiras semanas após o término de um tratamento anterior.

[00156] Entre o início e o final do ensaio, das 82 ovelhas problemáticas presentes durante todo o ensaio, 79 tiveram uma redução na categoria. As ovelhas problemáticas no final do ensaio eram ovelhas diferentes.

[00157] Os resultados, discriminados da pata, são apresentados nas Figs. 12A a 12D.

[00158] Estes resultados mostram que 96% das ovelhas problemáticas no início do ensaio, presentes durante todo o ensaio, tiveram pelo menos um pé problemático após o tratamento.

[00159] Além disso, no final do ensaio, não havia ovelhas com 2 ou mais patas problemáticas.

[00160] Em conjunto, estes resultados mostram a eficácia da composição de acordo com a invenção no problema da claudicação.

[00161] A invenção não está limitada às modalidades apresentadas aqui, e outras modalidades serão claras para uma pessoa versada na técnica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição compreendendo uma mistura bacteriana para uso na prevenção e melhoria da condição de ungulados que sofrem de doenças envolvendo uma infecção podai parasitária ou bacteriana, a dita composição caracterizada pelo fato de que compreende:

pelo menos uma cepa bacteriana do gênero Bacillus, em especial pelo menos uma Bacillus subtilis, e pelo menos uma cepa bacteriana láctica, em especial pelo menos uma Lactococcus lactis ou pelo menos uma Pediococcus pentosaceus.
2. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição bacteriana contém:

pelo menos uma das quatro seguintes cepas de Bacillus subtilis: NOLOl, NOL02, NOL03 e NOL04, as ditas cepas sendo depositadas no CNCM com os números CNCM I - 4606, CNCM I - 5043, CNCM I - 4607 e CNCM I - 4608, respectivamente, e pelo menos uma bactéria láctica selecionada das seguintes bactérias lácticas: cepa de Lactococcus lactis spp lactis 1 NOL11 e cepa de Pediococcus pentosaceus 2 NOL12, as ditas cepas sendo depositadas no CNCM sob os números CNCM I - 4609 e CNCM 1-4610, respectivamente.
3. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, a dita composição caracterizada pelo fato de que contém 10⁵a 10¹¹ colônias bacterianas de Bacillus e de 10⁵ a 10¹¹ colônias bacterianas de bactérias lácteas, as colônias bacterianas em ml ou g de composição.
4. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a dita pelo menos uma cepa de Bacillus está na forma esporulada e/ou na forma vegetativa.
5. Composição para uso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que as ditas doenças envolvendo uma infecção parasitária ou bacteriana nas patas de ungulados são

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2/2 selecionadas da doença de Mortellaro, dermatite interdigital, ou tiloma, paroníquia ou laminite, ou podridão da pata, erosão de bulbo, necrose do dedo e pododermatite.
6. Composição para uso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, a dita composição caracterizada pelo fato de que está em uma forma líquida que se destina a ser pulverizada ou usada em uma bacia.
7. Composição para uso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a dita composição é diluída em pelo menos um 1 litro de líquido para no máximo 5 litros de líquido para 50 a 60 animais.
8. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a dita composição é aplicada às patas de ungulados de uma vez a cada 3 dias a uma vez a cada 15 dias.
9. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em associação com pelo menos um desinfetante, caracterizada pelo fato de que é para uso no contexto do tratamento de doenças envolvendo uma infecção podai parasitária ou bacteriana de ungulados, dito que pelo menos um desinfetante sendo usado pelo menos 48 horas antes da dita composição ser usada.