BR112019006742A2 - composições de aminoácido e usos das mesmas - Google Patents

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Dennison Daniel
Yin Lianjie
Gerson Okunieff Paul
Gupta Reshu
Vidyasagar Sadasivan
Gatto Stephen
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Univ Florida
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Abstract

a invenção refere-se a composições e métodos para promover a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras. as composições fornecidas podem ser úteis no tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), uma condição relacionada com a melhora da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesão à mucosa gi em um indivíduo com sua necessidade. a invenção também refere-se a métodos para promover a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras em um indivíduo com necessidade de tal tratamento mediante a administração de uma composição. a capacidade de estimular a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras in vivo, ex vivo e/ou in vitro fornece um formidável benefício. a invenção pode ser utilizada para aumentar as populações de células-tronco in vivo, ex vivo e/ou in vitro. o transplante de células-tronco fornece tratamentos e/ou curas de muitos estados doentios, degenerações e/ou lesões.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES DE AMINOÁCIDO E USOS DAS MESMAS.
PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica a prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) aos Pedidos Provisórios U.S.S.N. 62/403.965, depositado em 04 de outubro de 2016, e U.S.S.N. 62/421.443, depositado em 14 de novembro de 2016, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] As células epiteliais intestinais humanas são geradas a partir de uma população fixa de células-tronco funcionalmente localizadas na parte inferior das criptas intestinais, incluindo as células colunares de base cripta de ciclagem rápida (CBCs) e células mais quiescentes +4 acima das células de Paneth em camundongos. 14'16 Estas células-tronco dão origem a enterócitos absorventes, células de muco, células de Paneth e células enteroendócrínas.17 A diferenciação de cada tipo de célula ocorre quando as células se movem para cima dentro das vilosidades (células absorvenes, muco e endócrinas) ou concentradas para baixo no fundo da cripta (células de Paneth). Os múltiplos mecanismos responsáveis por estes eventos complexos não são completamente compreendidos.
[0003] Radiação e/ou quimioterapia podem provocar danos graves ao revestimento do trato gastrintestinal (Gl). Doses moderadas a elevadas de radiação e/ou quimioterapia resultam na destruição de células com potencial clonogênico, que são essenciais para a substituição contínua de células que são removidas da parte superior das vilosidades durante o processo normal de proliferação, maturação e diferenciação.
[0004] Os efeitos tóxicos da exposição à radiação e/ou quimioterapia no sistema gastrointestinal provocam sintomas tais como náusea, vômito, diarréia, desequilíbrio de eletrólitos e desidratação, e afe
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2/102 tam adversamente a saúde do paciente no decurso da terapia de câncer. A exposição à radiação afeta as células epiteiiais intestinais que passam por mitose rápida nas criptas submucosas. Na exposição à radiação terapêutica, a toxicidade gastrointestinai muitas vezes tornase um fator de iimitação da dose para o tratamento e pode afetar a qualidade de vida do paciente. Compostos terapêuticos e cuidados de suporte são frequentemente utilizados para minimizar a toxicidade, mas estas abordagens não são totalmente eficazes.
[0005] Houve um interesse crescente no desenvolvimento de agentes de mitigação com relação à toxicidade Gl de curto prazo e longo prazo em pacientes com câncer e vitimas de desastres de radiação. 534’37 Existem apenas dois agentes aprovados pela FDA; Neupogen® e Pegfilgrastim (Fator estimulador de colônias de granulócitos) são os dois contra-recursos médicos aprovados pela FDA que estão atualmente disponíveis para tratar a sindrome de radiação. Ambos trabalham para aumentar a sobrevivência em pacientes expostos a doses mielossupressoras de radiação. No entanto, não existe nenhum agente que trate especificamente a toxicidade gastrointestinal. O tratamento da toxicidade Gl é principalmente sintomático, com antidiarréicos utilizados para prevenir a perda de fluido, esmectita para absorver sais biliares, opióides para aliviar a dor estomacal ou retal, esteróides para aliviar a inflamação, e em casos extremos a alimentação parenteral para corrigir a má absorção de nutrientes e eletrólitos. Outros agentes que poderíam potencialmente ser utilizados para mitigar a toxicidade Gl são; 1) estatina e/ou enzima conversora da angiotensina, estes agentes foram observados de serem eficazes quando utilizados durante os trabalhos de radioterapia pélvica radical por suas ações antiinflamatórias, antifibróticas e antitrombóticas; 2) antioxidantes tais como vitamina E e/ou selênio; 3) teduglutide, um análogo de peptídeo-2 semelhante a glucagon que deve ser dado antes da radiação; 4) sucral·
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3/102 fato, um dissacarídeo polianiônico altamente sulfatado ajuda na cicatrização epitelial, mas não mostrou ser útil na toxicidade GI induzida por radiação; 5) nitróxidos tais como hidroxilaminas (tempol), funciona por suas propriedades antioxidantes; 6) ditioltiona (Oltipraz), funciona pelo aumento da sulfidrila nas células; 7) isoflavona (genisteína). um inibidor da tlroslna cinase e antioxldante; 8) Inibidores de Cox (celecoxib, aspirina), funciona através do aumento da atividade de Cox2 e síntese de prostaglandina; e 8) probióticos, uma preparação contendo mlcrorganismos viáveis e bem definidos em grande número para alterar a microflora de hospedeiros e pode ter algum efeito sobre a toxicidade GI induzida por radiação,5 (Stacey, R. & Green, J. T. Radiationinduced small bowel disease: latest developments and clinical guidance. Ther. Adv. Chronic Disease, 5, 15-29, doi: 10.1177/2040622313510730 (2014)).
[0006] A cripta para a migração de vilosidades leva entre 5 a 7 dias. Portanto, a toxicidade gastrointestinal manifesta-se na primeira semana após a exposição à radiação e/ou quimioterapia e é o fator limitative da dose mais significativo na terapia de câncer. Mesmo em doses baixas, uma perda contínua da vilosidade e borda em escova do intestino delgado é observada dentro de dias após a Irradiação e/ou quimioterapia. Embora as células da cripta possam reocupar rapidamente a região após doses suaves a moderadas de irradiação e/ou quimioterapia, elas se tornam perdidas em uma taxa logaritmica após a irradiação e/ou quimioterapia em altas doses.
[0007] A irradiação e/ou quimioterapia é particularmente destrutiva para o epltélio viloso, onde a absorção de nutrientes e eletrólitos ocorre. O epitélio viloso é submetido a um processo contínuo de perda e regeneração celular, em que um suprimento constante de enterócitos imaturos, que se originam de células progenitoras localizadas dentro dos pólos inferiores das criptas de Lieberkuhn, migra para fora do
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4/102 compartimento proliferative na base da cripta até a parte superior das vilosidades. Durante sua expectativa de vida curta, estes enterócitos amadurecem gradualmente ao longo do eixo de cripta-vilosidade nas células vílíosas. A terapia de radiação e/ou quimioterapia destrói não apenas as células viliosas existentes, mas também as células-tronco e/ou células progenítoras, a partir das quais novas células vilosas se formam, e assim, pode esgotar quase todo o epitélio vliloso mesmo em doses moderadas.
[0008] Células vilosas maduras e diferenciadas estão envolvidas na absorção de fluido secundária para a absorção de sódio, cloreto e nutrientes, enquanto que as células imaturas epiteliais menos diferenciadas imaturas localizadas na cripta estão predominantemente envolvidas na secreção de cloreto (Cl·) e perda de fluido. A falta de células epiteliais vilosas absortivas leva a um estado de absorção deficiente no qual os nutrientes não absorvidos, eletrólitos e água são despejados nos segmentos distais do trato GI, resultando em náusea, vômito e diarréia.
[0009] A repopulação mediada pela célula-tronco das células vilosas através da proliferação de células in situ e/ou migração potencial para dentro dos tecidos através da circulação de células progenitoras de locais distantes é responsável pela recuperação dos efeitos de irradiação aguda e/ou quimioterapia no nível tecidual. 1113 Portanto, a perda de células-tronco da cripta ou células endoteliais vilosas é suposta de ser responsável pelo dano intestinal Induzido por radiação e/ou quimioterapia.
[0010] Dano ao trato GI não apenas resulta na absorção deficiente e perda de nutrientes, minerais e fluidos, mas também rompe a função de barreira intestinal. O intestino com vazamento leva em conta a fácil entrada de patógenos e outras substâncias antigônícas do alimento para dentro do compartimento sistêmico, através da barreira mucosal,
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5/102 provocando inflamação, bacteremia e endotoxemia. Por exemplo, entente de radiação aguda, diarréia e dor abdominal podem desenvolverse dentro de dias pós-irradiação mesmo em doses tão baixas quanto 5 a 12 Gy (um curso fracionado convencional de radiação utiliza 1,8 a 2 Gy por fração), embora a toxicidade Gl normalmente ocorra em doses mais elevadas. A enterite de radiação crônica pode desenvolver entre 18 meses e 6 anos após a radioterapia, embora ela possa desenvolver-se até 15 anos mais tarde.27-29 [0011] As opções de tratamento para a enterite de radiação e/ou quimioterapia são limitadas. Regimes de tratamento convencionais incluem a administração de antidiarréicos para prevenir a perda de fluido, esmectita como um adsorvente de sais biliares, opióides para aliviar a dor estomacal ou retal, e esteróides para aliviar a inflamação.
[0012] Uma abordagem comum na terapia de enterite de radiação e/ou quimioterapia é a utilização de nutrição parenteral total (TPN) para fornecer repouso intestinal; no entanto, se a nutrição parenteral satisfaz as necessidades nutricionais dos pacientes, ou realmente possui efeitos terapêuticos sobre a enterite induzida por radiação e/ou quimioterapia, permanece a ser determinada. Embora a TPN possa corrigir o desequilíbrio nutricional em certos pacientes, a enterite induzida por radiação e/ou quimioterapia grave pode ainda se desenvolver.37 A TPN também provoca atrofia intestinal, geralmente dentro de 48 horas de administração. A TPN também enfraquece as barreiras mecânicas e imunológicas.38 [0013] A formulação utilizada na Patente U.S. No. 8.993.522 funciona através da correção da reidratação através do transporte de sódio acoplado com aminoácido, diminuição da secreção de ânion da cripta pela escolha de um conjunto de aminoácidos com propriedade antisecretória, e através do enrijecimento da mucosa mediante o uso dos aminoácidos que foram mostrados de enrijecer a barreira mucosa.
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6/102 [0014] Existe uma necessidade de composições melhoradas para o tratamento de lesão do GI induzida por irradiação e/ou quimioterapia secundária à perda de células-tronco e/ou progenitoras proliferativas. Existe também uma necessidade de composições para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou o tratamento de danos à mucosa GI em um indivíduo com sua necessidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0015] São aqui descritas composições de aminoácidos para o tratamento de distúrbios GI, pulmonares e da pele. Em um aspecto, a presente invenção fornece composições e métodos para promover a sobrevivência, proliferação, migração, maturação e/ou diferenciação celular. Em certas modalidades, a presente invenção fornece composições e métodos para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. O desenvolvimento celular pode incluir, por exemplo, migração, maturação e/ou diferenciação. A presente invenção também fornece composições e métodos para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada à função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou o tratamento de lesão à mucosa GI em um indivíduo com sua necessidade.
[0016] Esta proliferação e/ou desenvolvimento celular pode ser utilizada para melhorar a proliferação e função das células-tronco e
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7/102 células progenltoras localizadas em vários sistemas de órgãos e lugares no corpo. As células-tronco e/ou progenltoras podem estar, por exemplo, no intestino delgado ou em outros tecidos, incluindo, mas não limitado a pele, medula óssea, pulmões, neurônios, pâncreas, músculo, tecidos esqueléticos, células endoteliais vasculares e células epiteliais comeais. As células-tronco e/ou progenltoras podem ser células-tronco adultas, células-tronco embrionárias ou células-tronco de câncer. Em uma modalidade, a composição útil no tratamento das condições aqui descritas compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina; e, opcionalmente, um veículo aceitável.
[0017] Em certas modalidades, a composição da presente invenção não inclui um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em lisina, glicina, isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina. Em outra modalidade específica, a composição não inclui, ou somente inclui quantidades insignificantes de, serina, lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina. Certas modalidades, a composição não inclui glutamina e/ou metionina; e qualquer dl-, oligo- ou polipeptídeos ou proteínas que podem ser hidrolisadas em glutamina e/ou metionina. Em certas modalidades, a composição não inclui metionina.
[0018] Ou, em certas modalidades, mesmo se estes aminoácidos estiverem presentes na composição, eles não estão presentes em uma quantidade que inibiría a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento da célula-tronco e/ou célula progenitora. Em algumas modalidades, a composição não inclui serina. Em algumas modalidades, a composição não inclui cisterna. Em certas modalidades, mesmo se estes aminoácidos estiverem presentes na composição, eles não estariam presentes em uma quantidade que afetaria o tratamento de uma
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8/102 doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesão à mucosa Gl.
[0019] Estes aminoácidos, se presentes na composição, podem estar presentes, por exemplo, nas seguintes concentrações: treonina em cerca de 0,4 a cerca de 1,5, cerca de 0,7 a cerca de 1,3, ou cerca de 0,9 a cerca de 1,1 grama/litro; valina em cerca de 0,7 a cerca de
1,7, cerca de 0,9 a cerca de 1,5, ou cerca de 1, 1 a cerca de 1,3 grama/litro; serina em cerca de 0,6 a cerca de 1,6, cerca de 0,8 a cerca de 1,4, cerca de 1,0 a cerca de 1,2 grama/litro; tirosina em cerca de 0,05 a cerca de 0,4, ou cerca de 0,1 a cerca de 0,3 gGrama/litro; e triptofano em cerca de 1,1 a cerca de 2,1, cerca de 1,3 a cerca de 1,9 ou cerca de 1,5 a cerca de 1,7 gramas/litro. Em certas modalidades, a concentração é gramas de aminoácido por litro de solução. Em certas modalidades, a solução compreende água. Em uma certa modalidade, a composição terapêutica compreende treonina (aproximadamente 1,0 grama/litro), valina (aproximadamente 1,2 grama/litro), serina (aproximadamente 1,1 grama/litro), tirosina (aproximadamente 0,2 grama/litro) e íriptofano (aproximadamente 1,6 grama/litro). Em uma modalidade, a composição não inclui serina. Em algumas modalidades, a composição não inclui metionina. Em algumas modalidades, a composição não inclui cisteína.
[0020] Em certas modalidades, a osmolaridade total da composição é de cerca de 100 mosm a cerca de 280 mosm, ou cerca de 150 a cerca de 280 mosm.
[0021] A composição pode ter um pH de, por exemplo, cerca de
2,5 a cerca de 8,5. Em certas modalidades, a composição possui um
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9/102 pH de cerca de 2,5 a cerca de 6,5, cerca de 3,0 a cerca de 6,0, cerca de 3,5 a cerca de 5,5, cerca de 3,9 a cerca de 5,0 ou cerca de 4,2 a cerca de 4,6. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0 ou de cerca de 7,2 a cerca de
7,8.
[0022] Em certas modalidades, a composição é administrada como uma solução ou bebida, um pó, uma pílula, um gel, creme, unguento, como parte de uma matriz, ou em uma bandagem. Em certas modalidades, a composição é administrada como parte de um sistema de liberação de matriz.
[0023] A composição pode ser administrada sistêmica ou localmente. Em certas modalidades, a composição é utilizada para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento celular ex vivo ou in vitro. Em certas modalidades, a composição é utilizada para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada à função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras, ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesão à mucosa Gl.
[0024] Em certas modalidades, a composição também compreende aditivos (por exemplo, nutrientes, eletrólitos, vitaminas, minerais, etc.).
[0025] Sem desejar ser limitado por qualquer teoria particular, acredita-se que as composições e métodos impedem o dano ao DNA e são, portanto, úteis na prevenção de dano ao DNA e/ou ao reparo do DNA danificado. Em outra modalidade, as composições e métodos promovem a sobrevivência, proliferação, e desenvolvimento de células-tronco através da prevenção de danos ao DNA e/ou reparo do DNA danificado.
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10/102 [0026] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio pulmonar em um indivíduo com sua necessidade. Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições e métodos para melhorar a cicatrização do pulmão, diminuir a pneumonite, diminuir a resistência das vias aéreas, e/ou melhorar a função pulmonar em um indivíduo com sua necessidade. Em certas modalidades, a condição pulmonar é uma lesão pulmonar, pneumonite ou asma. Em certas modalidades, a condição pulmonar está associada com uma maior resistência das vias aéreas. Em certas modalidades, a condição pulmonar está associada com a função de barreira diminuída. Em certas modalidades, a composição é administrada sistemicamente ou administrada por meio de inalação. Em certas modalidades, as composições e métodos são úteis para melhorar a cicatrização do pulmão, diminuição da pneumonite, diminuição da resistência das vias aéreas e melhora da função pulmonar, por exemplo, após a exposição à radiação e/ou quimioterapia.
[0027] Em outra modalidade, as composições e métodos da presente Invenção para tratar a supressão da medula óssea que é provocada, por exemplo, através de um fármaco, vírus, bactérias, toxinas, produtos químicos ou deficiência de vitamina. Por exemplo, em certas modalidades, as composições e métodos são utilizados para tratar um paciente com uma baixa contagem de plaquetas (trombocitopenia) provocada, por exemplo, através da infecção por vírus da Dengue.
[0028] Em outro aspecto, a presente Invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio Gl ou distúrbio do trato Gl (por exemplo, lesão por radiação, colite isquêmica, infecção, trauma) ou qualquer outra condição relacionada com a função e/ou integridade da barreira da mucosa. Em certas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa. Em certas modalidades, a doença ou condição
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11/102 que está relacionada com a função de barreira da mucosa é a disfunção de uma barreira mucosa. Em certas modalidades, o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada à função de barreira da mucosa é a cicatrização de feridas, que traía a lesão à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade. Em certas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de danos à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade. Em certas modalidades, a mucosa Gl é a mucosa do intestino delgado. Em certas modalidades, a composição é utilizada para o tratamento após a cirurgia (por exemplo, cirurgia intestinal). Em certas modalidades, a composição é utilizada para tratar qualquer doença ou condição que levaria ao intestino isquêmico, incluindo, por exemplo, hipotensão, choque, trombose, obstrução intestinal, etc.
[0029] Uma composição útil para o tratamento de entente de radiação é uma solução de reidratação oral à base de aminoácido (AAORS) descrita na Patente U.S. No. 8.993.522, que é aqui incorporada por referência. A AA-ORS é uma composição para melhorar a saúde do intestino delgado, em que a composição é formulada para administração enteral e compreende treonina, valina, triptofano, serina e tirosina, como aminoácidos livres; e água; em que a composição não inclui o aminoácido livre glutamina ou um dipeptídeo contendo glutamina, ou, se o aminoácido livre glutamina e/ou um dipeptídeo contendo glutamina está presente, a concentração total do aminoácido livre glutamina e o dipeptídeo contendo glutamina é menor do que 50 mg/l; em que a composição não inclui glicose ou, se a glicose estiver presente, a concentração de glicose é menor do que 1 g/l; e em que a composição não inclui aminoácido livre metionina ou um peptídeo contendo metionina, opcionalmente Hsina, glicina, ácido aspártico e/ou isoleucina, e opcionalmente eletrólítos, vitaminas, minerais e/ou agentes aromatizantes.
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12/102 [0030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma condição da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase ou condição relacionada ao envelhecimento da pele) em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a condição da pele é dermatite atópica, psoríase, o envelhecimento da pele ou escaras. Em certas modalidades, a composição e métodos aqui descritos são úteis para aplicações de beleza onde, por exemplo, o rejuvenescimento das várias camadas da pele e/ou dos tecidos subjacentes é desejável.
DEFINIÇÕES [0031] Os termos melhora da condição da pele” ou tratamento de uma condição da pele incluem profilaticamente prevenir ou terapeuticamente tratar uma condição da pele, e podem envolver um ou mais dos seguintes benefícios: espessamento da pele, prevenção da perda de elasticidade da pele, e uma redução das linhas de expressão ou rugas.
[0032] O termo epiderme ou epidérmico como utilizando nesta invenção, refere-se à camada mais externa da pele.
[0033] O termo aplicação tópica” como aqui utilizado, significa aplicar ou espalhar as composições da presente invenção sobre a superfície do tecido da epiderme.
[0034] O termo dermatologicamente aceitável como usado nesta invenção, significa que as composições ou seus componentes assim descritos são adequados para uso em contato com o tecido epidérmico de mamífero sem toxicidade indevida, incompatibilidade, instabilidade, resposta alérgica, e similares.
[0035] O termo quantidade terapeuticamente eficaz como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de composto ou composição suficiente para induzir um benefício positivo, de preferência uma aparên
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13/102 cia e/ou sensação positiva da pele. De acordo com a presente invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de aminoácidos, isoladamente ou em combinação com outros agentes, que regula e/ou melhora a pele.
[0036] O termo melhora ou qualquer variação gramatical deste (por exemplo, melhorar, aperfeiçoar e melhora, etc.), conforme aqui utilizado, inclui, mas não é limitado a retardar o início ou reduzir a gravidade de uma doença ou condição. A melhora, conforme aqui utilizada, não requer a completa ausência de sintomas.
[0037] O termo quantidade eficaz ou quantidade significativa como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade que é capaz de tratar ou melhorar uma doença ou condição ou de outro modo capaz de produzir um efeito terapêutico pretendido.
[0038] O termo alimento funcional de saúde refere-se a um alimento preparado ou processado em comprimido, cápsula, pó, grânulo, líquido, pílula ou qualquer outra forma utilizando matérias-primas ou ingredientes com funções úteis para o corpo humano.
[0039] O termo funcional significa um efeito útil para a saúde humana, tal como regulação estrutural ou funcional de nutrientes, o sistema imune, inflamação, equilíbrio de fluido, ação fisiológica, ou coisa parecida.
[0040] O termo veículo refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou meio com o qual o composto é administrado. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin.
[0041] O termo tratamento ou qualquer variação gramatical deste (por exemplo, tratar, tratando e tratamento, etc.) conforme aqui utilizado, inclui, mas não é limitado ao alívio de um sintoma de uma doença ou condição; e/ou redução, supressão, inibição, redução ou afetação da progressão, gravidade e/ou escopo de uma doença ou condição.
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14/102 [0042] O termo consistindo essencialmente em, como aqui utilizado, limita o escopo dos ingredientes e etapas aos materiais ou etapas especificados e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e inovadoras da presente invenção, isto é, composições e métodos para promover o desenvolvimento de células-tronco. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0043] As Figuras 1A a 1B mostram a contagem de cripta aumentada por AA-ORS e o comprimento das vilosidades após a irradiação. Solução salina normal (salina) foi utilizada como um controle; solução salina e AA-ORS foram fornecidas por gavagem gástrica. 6 Camundongos por grupo de radiação (0, 1, 3, 5, 6, 7, 9, 13 e 15 Gy) com e sem tratamento. A Figura 1A mostra a curva de sobrevivência semi-log que mostra o efeito da AA-ORS na contagem de cripta. A AA-ORS alterou o gráfico para a esquerda. A curva de sobrevivência de cripta foi modelada utilizando um modelo de sobrevivência celular de múltiplos alvos de impacto único para avaliar o efeito biológico. A probabilidade de sobrevivência das células mitóticas na cripta após a radiação foi calculada utilizando a equação [S= 1-( 1-eA-D/D0)n. S representa a fração de células mitóticas nas criptas que sobreviveram em cada uma das doses de radiação, D representa a dose de radiação; Do, uma medida da resistência à radiação intrínseca das unidades reprodutivas da cripta. Valores Dq para camundongos tratados com solução salina e camundongos tratados com AA-ORS são representados pela seta preta e seta cinza, respectivamente. Dq é calculado a partir da fórmula Dq = Do In n. Sem restringir a sensibilidade da célula constante, os valores N foram 10,4 ± 0,2 e 5,3 ± 0,1 (P < 0,001), indicando uma duplicação próxima das unidades progenitoras por circunferência de um controle. Quando uma constante Do (4,8 ± 0,1 Gy) foi restrita, a diferença permaneceu significativa em 8,8 ± 0,4 a 6,1 ± 0,3 (P < 0,001). A Fig. 1B mostra a altura da vilosidade após o tratamento utilizando solução sa
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15/102 iina e AA-ORS em camundongos irradiados. Aumento significativo na altura da viiosidade com camundongos tratados com AA-ORS em comparação com os camundongos que recebem solução salina como tratamento. As criptas por circunferência foram contadas, e o comprimento da viiosidade foi medido a partir de 10 seções obtidas do íleo. Os dados são mostrados como a média ± S.E.M. para 6 camundongos por grupo. * Indica diferença estatisticamente significativa (P < 0,01). A solução salina normal (salina) foi utilizada como controle e tanto a solução salina quanto a AA-ORS foram dadas por gavagem gástrica.
[0044] A Figura 2A mostra a microscopia confocal do corte longitudinal do íleo com células epiteliais coradas de forma proeminente ao longo do comprimento da viiosidade. Os tecidos incorporados com parafina em uma espessura de 5 -pm foram utilizados. Os núcleos das células foram corados com DAPI (cinza escuro), e as células epiteliais Edu-positivas foram coradas com cinza claro. O software Image Pro Plus foi utilizado para as medições da distância migrada pelas células Edu-positivas ao longo da altura da viiosidade. Barra - 50 pm. Um mínimo de cinco vílosidades bem orientadas foi contado por seção de tecido, e os resultados foram medidos. As células Edu-positivas foram observadas todo o caminho até a ponta da viiosidade nos tecidos irradiados com 5 Gy, mas não em camundongos tratados com AA-ORS.
[0045] A Figura 2B mostra a distância de migração de células EdU-positivas medida em 72 horas. Os camundongos tratados com solução salina irradiada com 5 Gy tiveram uma diminuição significativa na distância de migração celular (barra preta) em comparação com 0 Gy; os camundongos tratados com AA-ORS tiveram uma distância de migração aumentada quando se compara com a solução salina tratada não irradiada e irradiada. Os valores são médias ± SEM para 6 camundongos por grupo.
[0046] As Figuras 3A a 3B mostram estudos de fluxo de câmara
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Ussing utilizando 22Na e 36Ci mostrando o efeito de AA-ORS sobre a absorção de sódio e cioreto. A AA-ORS aumentou a absorção líquida de sódio (JnetNa) e cloreto (JnetCI) nos tecidos irradiados de 0 Gy e 5 Gy (n = 8).
[0047] A Figura 3C é uma imunohistoquímica que mostra uma vista ampliada da expressão de NHE3 (cinza claro) ao longo da membrana de borda em escova (BBM) das células epiteliais vilosas (setas brancas). Tecidos incorporados com parafina na espessura de 5 pm foram utilizados. Os núcleos das células foram corados com DAPI (cinza escuro). Um mínimo de cinco vílosídades bem orientadas foram utilizados.
[0048] A Figura 3D mostra uma análise de Western blot para a proteína NHE3.
[0049] A Figura 3E mostra uma representação gráfica da densidade de proteína NHE3 em tecidos intestinais de camundongos tratados com solução salina (barras pretas) ou AA-ORS (barras hachuradas) após uma irradiação de 0 ou 5 Gy. Imunomarcações foram repetidas quatro vezes. Os valores são médias ± SEM de n = 4; * indica diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) de animais tratados com solução salina.
[0050] A Figura 3F mostra níveis de transcrito de NHE3 em tecidos intestinais de camundongos tratados com solução salina (barras pretas) ou AA-ORS (barras hachuradas) após a irradiação de 0 ou 5 Gy. Os valores são médias ± SEM de n = 6; * indica diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) de animais tratados com solução salina. A solução salina ou AA-ORS foi fornecida durante 6 dias.
[0051] As Figuras 4A a 4D mostram uma absorção de sódio estimulada por glicose e níveis de proteína SGLT1: (4A) estudos de fluxo de câmara Ussing utilizando 22Na mostrando o efeito de AA-ORS sobre a absorção de sódio acoplada à glicose. Tratamento de AA-ORS
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17/102 aumentou a absorção de JneíNa em tecidos irradiados com 5 Gy (n = 8). (4B) Análise de Western blot para proteína SGLT1 e betagalactosidase mostrou níveis aumentados de proteína com tratamento de AA-ORS em células vilosas de camundongos 0 Gy e 5 Gy. Imunomarcações foram repetidas quatro vezes. (40) Níveis de proteína SGLT1 normalizados para análise de western blot. Diferença significativa nos níveis de proteína SGLT1 foi observada em camundongos irradiados com 5 Gy tratados com AA-ORS quando comparados com camundongos 5 Gy. Níveis de transcrito de SGLT1 em tecidos intestinais de camundongos tratados com solução salina (barras pretas) ou AA-ORS (barras hachuradas) após a irradiação de 0 ou 5 Gy. Os valores são médias ± SEM de n = 6; * indica uma diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) de animais tratados com solução salina. Solução salina ou AA-ORS foi dada durante 6 dias.
[0052] As Figuras 5A a 5G mostram níveis de proteína e expressão de mRNA de Lgr5. BMI1, p-AKT, AKT, pERK e ERK em células epiteliais vilosas de camundongos tratados com solução salina normal e AA-ORS após a irradiação de 0 e 5 Gy. A Figura 5H mostra a análise de Western blot para Lgr5, BMI1, p-AKT, AKT, p-ERK e ERK. Imunomarcações foram repetidas pelo menos quatro vezes, e q-PCRs foram repetidas pelo menos 6 vezes. (5A) Análise de Western blot para marcadores de célula-tronco e proliferação (Lgr5, BMI1, p-AKT, AKT, pERK, ERK e PCNA). A faixa de proteína de interesse foi normalizada para a quantidade total de proteína em cada pista utilizando coloração com azul de Coomassie. (5B) Análise de Western blot para proteínas apoptóticas (Bcl2, Bax, caspase-3 clivada, caspase-3 e p53). (5C) Níveis de mRNA de Lgr5 em camundongos tratados com solução salina ou AA-ORS e irradiação de 0 Gy ou 5 Gy. (5D) Alterações nos níveis de mRNA de BMI1 em camundongos tratados com solução salina ou AA-ORS e irradiação de 0 Gy ou 5 Gy. (5E) Alterações nos níveis de
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18/102 mRNA de ERK em camundongos tratados com solução salina ou AAORS e irradiação de 0 Gy ou 5 Gy. (5F) Alterações nos níveis de mRNA de AKT em camundongos tratados com solução salina ou AAORS e irradiação de 0 Gy ou 5 Gy. (5G) Expressão de mRNA para caspase-3. Os valores são médias ± SEM de η = 6 camundongos diferentes repetidos em triplicata. # P < 0,05 e * p < 0,001 em comparação com o controle de solução salina. (5H) Análise de Western blot para Lgr5, BMI1, p-AKT, AKT, p-ERK e ERK. A faixa de proteína de interesse foi normalizada com a quantidade total de proteína em cada pista utilizando a mancha de Ponsceau S.
[0053] As Figuras 6A a 6G apresentam microfotografias representativas da distribuição de células Lgr5+, KI-67+ e PCNA+ dentro da mucosa ileal de 0 Gy (esquerda) e 5 Gy (direita) após o tratamento com solução salina (parte superior) ou AA-ORS (parte inferior). (6A) Imunomarcação para Lgr5: as células Lgr5+ foram observadas em 1/3 da cripta inferior. Os camundongos irradiados com 5 Gy resultaram em um declínio significativo de células-tronco Lgr5+ nas criptas do ílio, e a AA-ORS aumentou as células-tronco Lgr5+. As barras em escala representam 25 pm. (6B) Número médio de células Lgr5+ expressas na cripta. Barras de erro Indicam S.E.M. (6C) Immunomarcação para Ki67: O número de células de expressão de Ki-67, um marcador de proliferação, não apresentou nenhuma diferença significativa em camundongos irradiados com 0 Gy tratados com AA-ORS quando comparados com grupos tratados com solução salina. Os camundongos irradiados com 5 Gy mostraram aumento significativo nas células Ki-67+ com tratamento de AA-ORS. Barras em escala representam 100 pm. (6D) Número médio de células de expressão de Ki-67 nas células da cripta e/ou vilosidade. Barras de erro indicam S.E.M. (6E) Imunomarcação para PCNA: O número e a distribuição de células PCNA\ As células PCNA4’ foram reduzidas em camundongos após radiação de 5
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Gy, mas aumentadas com tratamento de AA-ORS. Barras em escala representam 100 pm. (6F) Número médio de células de expressão de PCNA em células da cripta e/ou vilosidade. Barras de erro indicam
S.E.M. (6G) Níveis de proteína e expressão de mRNA de caspase 3 clivada, caspase 3 total e p53 nas células epiteliais vilosas de camundongos tratados com solução salina normal e AA-ORS de camundongos irradiados com 0 e 5 Gy. Imunomarcações foram repetidas pelo menos quatro vezes e q-PCR foi repetida pelo menos 6 vezes. Análise de Western blot para caspase 3 clivada, caspase 3 total e p53. A faixa de proteína de interesse foi normalizada para a quantidade total de proteína em cada pista utilizando a coloração de Ponsceau S e beta actina.
[0054] A Figura 7 mostra uma figura esquemática de vilosidades e enterócitos do intestino delgado: o tratamento com AA-ORS aumenta rapidamente a divisão das células-tronco que são Lgr5 positivas, assim como os marcadores de proliferação P-ERK, p-AKT e PCNA. O tratamento também aumenta a caspase 3, p53 e Bcl-2 clivadas. O tratamento com AA-ORS aumenta as alturas das vilosidades, aumenta a expressão de NHE3, SGLT1 e β-galactosidases, aumentando assim a absorção de eletróiitos, absorção de glicose acoplada com sódio, e decomposição de dissacarídeos na membrana de borda em escova, respectivamente. Um cartum do enterócito na parte superior direita mostra a melhora funcional na absorção de Na+ mediada por NHE3 e no transporte de sódio acoplado à glicose com AA-ORS.
[0055] A Figura 8 mostra a densidade de proteína. A densidade de proteína foi normalizada para b-actina. Os camundongos tratados com solução salina são mostrados como barras pretas e tratados com AAORS são mostrados como barras hachuradas após a irradiação de 0 ou 5 Gy. (Valores são médias ± SEM de n = 4 camundongos diferentes repetidos em triplicata. # P < 0,05 em comparação com o controle de
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20/102 solução salina. (8A) Proteína Lgr5; (8B) Proteína Bmi1; (8C) Proteína p-ERK; (8D) Proteína ρ·ΑΚΤ; (8E) Proteína AKT; (8F) Proteína caspase-3 (normalizada para b-actina).
[0056] A Figura 9A mostra os resultados da análise Western blot que mostram que a gavagem gástrica utilizando a valina aumenta os níveis de proteína Lgr5 em camundongos irradiados com 0 Gy e 5 Gy. A Figura 9B mostra uma representação gráfica dos níveis de proteína da proteína Lgr5 em camundongos tratados com valina durante um período de 6 dias. Para As Figuras 9 a 13, os dados são de camundongos Male NIH Swiss (8 semanas) tratados com aminoácidos individuais (Figura 9 (valina); Figura 10 (triptofano); Figura 11 (serina); Figura 12 (tirosina); Figura 13 (treonina)), como por savage gástrica (300 pl OD) durante um período de 6 dias. Os animais foram sacrificados no dia 6 por eutanásia de CO2 e os tecidos coletados para determinar a proteína por análise de western blot. Lgr5 (100KD) foi utilizada como o marcador para proliferação de células-tronco da cripta. Estas experiências são repetidas pelo menos 4 vezes (dados mostrados) a partir de 4 diferentes camundongos.
[0057] A Figura 10A mostra mudanças nos níveis de proteína Lgr5 com tratamento de triptofano durante um período de 6 dias. A Figura 10B mostra uma representação gráfica dos níveis de proteína Lgr5 em camundongos tratados com triptofano durante um período de 6 dias.
[0058] A Figura 11A mostra as alterações nos níveis de proteína Lgr5 com tratamento de serina durante um período de 6 dias. A Figura 11B mostra uma representação gráfica dos níveis de proteína Lgr5 em camundongos tratados com serina durante um período de 6 dias.
[0059] A Figura 12A mostra alterações nos níveis de proteína Lgr5 com tratamento de tirosina durante um período de 6 dias. A Figura 12B mostra uma representação gráfica dos níveis de proteína Lgr5 em camundongos tratados com tirosina durante um período de 6 dias.
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21/102 [0060] A Figura 13 mostra mudanças nos níveis de proteína Lgr5 com tratamento de treonina durante um período de 6 dias.
[0061] As Figuras 14 a 20 mostram os resultados para uma doença alérgica e função das vias aéreas anti-inflamatórias para o tratamento com uma formulação de aminoácido em um modelo de ovelha. No estudo, os animais demonstraram respostas das vias aéreas tanto precoces quanto atrasadas ao estímulo de inalação com antigeno Ascaris suum. As amostras de sangue venoso (~3 ml) podem ser obtidas da vela jugular externa para dados farmacocinéticos. Medição das Mecânicas das Vias Aéreas: As ovelhas não entorpecidas são restritas em uma carreta na posição propensa com suas cabeças imobilizadas. Após a anestesia tópica das passagens nasais com solução de lidocaina a 2%, um cateter de balão será levada adiante através de uma narina para dentro do esôfago inferior. Os animais serão intubados com um tubo endotraqueal preso através da outra narina. (O manguido do tubo endotraqueal será inflado apenas para a medição das mecânicas das vias aéreas e durante os estímulos com aerossol para impedir desconforto indevido. Este procedimento não possui efeito sobre as mecânicas das vias aéreas). A pressão pleural será estimada com o cateter do balão esofágico (carregado com um ml de ar) que será posicionado 5 a 10 cm da junção gastroesofageal. Nesta posição, a pressão pleural expiratória final varia entre -2 e -5 cm de H2O. Assim que o balão é colocado, será fixada de modo que ela permaneça na posição para a duração do experimento. A pressão lateral na traquéia será medida com um cateter de furo lateral (dimensão interna, 2,5 mm) avançado através e posicionado distai à ponta do tubo endotraqueal. A pressão transpulmonar, a diferença entre a pressão traqueal e pleural, será medida com um sistema de cateter transdutor de pressão diferencial. Para a medição da resistência pulmonar (RL), a extremidade proximal do tubo endotraqueal será conectada a um pneumotacógra
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22/102 fo. Os sinais de pressão de fluxo e transpulmonar serão gravados em um gravador de osciloscópio que é ligado a um computador para cálculo on-line de RL da pressão transpulmonar, volume respiratório (obtido através da integração digital) e fluxo. A análise de 5 a 10 respirações será utilizada para a determinação de RL em L x cm H2O/L/S. [0062] Efeito sobre respostas das vias aéreas induzidas por antigeno: Curvas de resposta de dose no valor de referência para carbacol de aerossol são obtidas 1 a 3 dias antes do estímulo com antigeno. No dia do estimulo os valores de linha de base de resistência pulmonar (RL) são obtidos e então as ovelhas são estimuladas com 0 antigeno Áscar/s suum. As medições de RL são obtidas imediatamente após 0 estimulo, de hora em hora de 1 a 6 horas após 0 estimulo e na meia hora de 6 V2 a 8 h após 0 estímulo. As medições de RL são obtidas 24 horas após 0 estímulo seguido pela curva de resposta de dose pósestimulo de 24 horas. Nas Figuras 14 a 19, para as Figuras que mostram receptividade das vias aéreas (PC400), BSL é a linha de base, e PASC é 0 estímulo pós-antigeno.
[0063] Para os estudos iniciais, as ovelhas recebem um composto nebulizado (de uma formulação de aminoácidos que consiste em tirosina (1.2 mM), treonina (8 mM), valina (10 mM), serina (10 mM) e triptofano (8 mM), em que 4 ml da solução de formulação de aminoácidos são administrados utilizando 0 sistema de nebulização descrito acima) 30 minutos antes, 1 hora antes, 30 minutos após ou 2 horas após 0 estimulo de antigeno. As medições de RL são repetidas após 0 tratamento. Depois disso, os estudos que seguem irão avaliar os efeitos após fornecer 0 composto por via oral. Nos estudos orais, as ovelhas recebem uma formulação de aminoácidos que consiste em tirosina (1,2 mM), ácido aspártico (8 mM), treonina (8 mM), valina (10 mM), serina (10 mM), em que 8 oz da solução de formulação de aminoácidos é administrada por via oral, e as medições do RL e receptividade
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23/102 das vias aéreas (PC 400) são tornadas como descrito acima.
[0064] A Figura 14 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas que receberam o composto nebulizado uma hora antes do estímulo de antigeno, em comparação com o controle.
[0065] A figura 15 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas tratadas com o composto nebulizado duas horas após o estímulo de antígenos, em comparação com o controle.
[0066] A Figura 16 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas tratadas com o composto nebulizado 30 minutos antes do estímulo de antigeno, em comparação com o controle.
[0067] A Figura 17 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas que receberam o composto nebulizado 30 minutos após o estímulo de antígenos, em comparação com o controle.
[0068] A Figura 18 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas abastecidas com a formulação de composto por via oral 30 minutos após o estímulo de antigeno, em comparação com o controle.
[0069] A Figura 19 mostra os resultados com relação à resistência pulmonar (RL) e PC 400 (unidades de respiração) para ovelhas abastecidas com a formulação por via oral duas horas após o estímulo de antigeno, em comparação com o controle.
[0070] A Figura 20 mostra um resumo dos resultados dos estudos de asma em ovelha, incluindo a Resposta das Vias Aéreas Tardia Média (LAR) e hiperreceptividade das vias aéreas (AHR) para o controle e ovelha tratada com o composto nebulizado (5 a 8 horas) ou abastecida com a formulação de aminoácido por via oral, antes e após
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24/102 o estímulo de antigeno aerossol, para a função melhorada antiinflamatória das vias aéreas. Indica a Resposta das Via aéreas Tardia Média (5 a 8 horas). ”+ Indica o Pós-estímulo/Pré-estímulo PC 400. Relação próxima a 1 indica nenhuma hiperreceptlvldade das vias aéreas (AHR).
[0071] A Figura 21 mostra os resultados de estudos de cicatrização de feridas: superfície dorsal dos camundongos que foram selecionados para cirurgia foi raspada para remover o pelo. Todos os procedimentos cirúrgicos estavam sob anestesia utilizando isoflurano a 5% em oxigênio e o plano cirúrgico de anestesia foi mantido utilizando isoflurano 1 a 3%. Biópsias de punção de 3 mm de tamanho foram feitas no dorso de camundongos NIH Swiss de 8 semanas de idade. Modelos de feridas de murino podem ser afetados por contração da ferida por causa da presença de uma camada de músculo subcutâneo, uma camada que está ausente em seres humanos. Para evitar a contratura da ferida, um anel O de silício foi utilizado como uma tala e mantido no lugar por suturas interrompidas. A AA-ORS ou solução salina foi utilizada no curativo oclusivo transparente das fendas. O curativo foi mudado todos os dias após a medição da área de ferida utilizando compassos de calibre. Este procedimento, portanto, mede a reepitelização e imita a cicatrização de feridas em seres humanos. O resultado é mostrado na figura. Os dados são de n = 6 camundongos por grupo.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0072] Aqui descritas são as composições de aminoácidos para o tratamento de distúrbios GI, pulmão e pele. Em um aspecto, são aqui descritas composições e métodos para promover a proliferação e/ou desenvolvimento celular. Em uma certa modalidade, as células são células-tronco e/ou células progenitoras. Como utilizado nesta invenção, referência a desenvolvimento pode incluir, por exemplo, migra
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25/102 cão, maturação e/ou diferenciação das células. A presente invenção também fornece composições e métodos para o tratamento de uma ferida, uma condição da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras, condição relacionada ao envelhecimento da pele, condição cosmética), um distúrbio pulmonar (por exemplo, lesão pulmonar, pneumonite ou asma), um distúrbio GI (por exemplo, dano por radiação, colite isquêmica, infecção, trauma), ou qualquer outra condição relacionada à função e/ou integridade da barreira mucosa.
[0073] As composições e métodos podem ser utilizados para melhorar as populações de células-tronco e/ou células progenitoras in vivo, ex vivo e/ou in vitro. Estas células são úteis para fornecer tratamento para muitos estados doentios, degeneração e lesões.
[0074] Em uma modalidade, são aqui fornecidos métodos para promover a proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras em um indivíduo com necessidade de tal tratamento através da administração de uma composição da presente invenção ao indivíduo.
[0075] O indivíduo pode ser um paciente no qual a promoção da proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras é necessária. O paciente pode ter esta necessidade devido a, por exemplo, toxicidade gastrointestinal induzida por absorção deficiente, radiação ou quimioterapia, ou resultante a uma infecção, câncer ou terapia de câncer. Em uma modalidade, o paciente é assintomático. O indivíduo pode ser qualquer animal, incluindo, por exemplo, um ser humano. Além de seres humanos, o animal pode ser. por exemplo, mamíferos, tais como gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras, cães e gatos. Os animais também podem ser, por exemplo, galinhas, perus ou peixes.
[0076] Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treo
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26/102 nina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico, serina e seus derivados. Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano e ácido aspártico. A composição de preferência compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina e triptofano. Em certas modalidades, a composição compreende dois ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende três ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende quatro ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende treonina, valina, tirosina, triptofano e ácido aspártico. Em certas modalidades, a composição compreende os aminoácidos livres de treonina, valina, tirosina, triptofano e serina.
[0077] Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende, consiste essencialmente de ou consiste em, um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, serina, ácido aspártico e seus derivados; e opcionalmente, por exemplo, veículos, adjuvantes e outros agentes ativos farmaceutícamente aceitáveis. Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, serina e ácido aspártico; e opcionalmente, por exemplo, veículos, adjuvantes, outros agentes ativos e aditivos farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo,
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27/102 açúcares, eletrólitos, vitaminas, minerais, etc).
[0078] Em um aspecto, a composição aqui descrita compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo constituído de treonina, valina, tirosina, tríptofano, ácido aspártico ou serina.
[0079] Em algumas modalidades específicas, a composição não inclui um ou mais aminoácidos selecionados do grupo constituído de lisina, glicina, isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina. Em certas modalidades, a composição não inclui glicina. Em certas modalidades, a composição não inclui isoleucina. Em certas modalidades, a composição não inclui asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina e glicina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina e isoleucina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina, glicina e isoleucina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina, glicina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina, glicina, isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui glicina e isoleucina. Em certas modalidades, a composição não inclui glicina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui glicina, isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina. Em outra modalidade específica, a composição não inclui, ou somente inclui quantidades insignificantes de serina, lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina. Em certas modalidades, a composição não inclui glutamina e/ou metionina; e qualquer di-, oligo-, ou polipeptídeos ou proteínas que possam ser hidrolisadas em glutamina e/ou metionina.
[0080] Ou, em certas modalidades, mesmo se estes aminoácidos estiverem presentes na composição, eles não estão presentes em
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28/102 uma quantidade que inibida a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. Em algumas modalidades, a composição não possui serina, ou quantidades insignificantes de serina. Por insignificante significa que a serina presente não possui efeito sobre a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento da célula-tronco. Por ’’insignificante significa que a serina presente não possui nenhum efeito sobre uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira de mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento das condições de pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), função de barreira da mucosa, e/ou danos à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade.
[0081] Estes aminoácidos, se presentes na composição, podem estar presentes, por exemplo, nas seguintes concentrações: treonina em cerca de 0,4 a cerca de 1,5, cerca de 0,7 a cerca de 1,3, ou cerca de 0,9 a cerca de 1,1 grama/litro; valina em cerca de 0,7 a cerca de
1,7, cerca de 0,9 a cerca de 1,5, ou cerca de 1,1 a cerca de 1,3 grama/litro; serina em cerca de 0,6 a cerca de 1,6, cerca de 0,8 a cerca de 1,4, cerca de 1,0 a cerca de 1,2 grama/litro; tirosína em cerca de 0,05 a cerca de 0,4, ou cerca de 0,1 a cerca de 0,3 grama/litro; e triptofano em cerca de 1,1 a cerca de 2,1, cerca de 1,3 a cerca de 1,9 ou cerca de 1,5 a cerca de 1,7 grama/litro. Em uma determinada modalidade, a composição compreende treonina (ao redor de 1,0 grama/litro), valina (ao redor de 1,2 grama/litro), serina (ao redor de 1,1 grama/litro), tirosína (ao redor de 0,2 grama/litro), triptofano (ao redor de 1,6 grama/litro) e ácido aspártico (ao redor de 0,4 a 3,6 gramas/litro). Em certas modalidades, a composição não possui, ou é insignificante, serina. Em certas modalidades, a concentração é gramas de aminoácido por litro de solução. Em certas modalidades, a solução
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29/102 compreende água.
[0082] Em uma modalidade, a osmolaridade total da composição é de cerca de 100 mosm a cerca de 280 mosm, ou de preferência de cerca de 150 a cerca de 260 mosm.
[0083] A composição pode ter um pH que varia de cerca de 2,5 a cerca de 8,5. Em certas modalidades, o pH da composição varia de cerca de 2,5 a cerca de 6,5, de cerca de 3,0 a cerca de 6,0, de cerca de 3,5 a cerca de 5,5, cerca de 3,9 a cerca de 5,0 ou de cerca de 4,2 a cerca de 4,6. Em outras modalidades, o pH da composição varia de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0 ou de cerca de 7,2 a cerca de 7,8.
[0084] Em certas modalidades, a composição possuí um pH de, por exemplo, cerca de 2,5 a cerca de 8,5. Em certas modalidades, a composição possui um pH de cerca de 2,5 a cerca de 6,5, de cerca de
2,5 a cerca de 6,0, de cerca de 3,0 a cerca de 6,0, de cerca de 3,5 a cerca de 6,0, de cerca de 3,9 a cerca de 6,0, de cerca de 4,2 a cerca de 6,0, de cerca de 3,5 a cerca de 5,5, de cerca de 3,9 a cerca de 5,0, ou de cerca de 4,2 a cerca de 4,6. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0, de cerca de 7,2 a cerca de 8,0 ou de cerca de 7,2 a cerca de 7,8.
[0085] Em algumas modalidades, a composição é administrada sistêmica ou localmente. Em certas modalidades, a composição é utilizada para promover sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento celular ex vivo ou in vitro. Em certas modalidades, a composição é utilizada para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de fendas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atóplca, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma),
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30/102 melhora da função de barreira da mucosa e/ou tratamento da tesão à mucosa Gl. A composição terapêutica pode ser administração por meio de uma via entérica ou parenteral ou topicamente ou através de inalação. Em certas modalidades, a composição é terapêutica, cosmética ou nutricional.
[0086] Em algumas modalidades, a composição (por exemplo, uma solução de reidratação oral à base de aminoácido (AA-ORS)) aqui descrita, funciona através da correção das alterações funcionais que aconteceram na mucosa Gl após a radiação. Em certas modalidades, a composição é uma solução. Em certas modalidades, a solução é uma solução de reidratação oral à base de aminoácido (AA-ORS). Os aminoácidos foram selecionados para agir contra a permeabilidade paracelular aumentada, secreção aumentada de Cl· e absorção diminuída de eletrólitos após a radiação. Visto que a composição aqui descrita (por exemplo, AA-ORS) corrige as alterações funcionais na mucosa Gl, acredita-se que sua ação seja a montante dos agentes atuais no tubo. A composição pode ser administrada com outros agentes terapêuticos. Foi recentemente observado que os eletrólitos, a glicose e alguns aminoácidos são fracamente absorvidos no trato Gl após a irradiação. Além disso, observou-se que a glicose e alguns aminoácidos podem estimular a secreção de Cl· eletrogênica além da absorção de Na+ e pode aumentar a permeabilidade paracelular, que complica ainda mais a diarréia induzida por radiação e aumenta a permeabilidade do intestino.5152 A permeabilidade paracelular aumentada é conhecida de aumentar a transtocação de substâncias antigênicas do lúmen do intestino para dentro do compartimento sistêmico, provocando um aumento nas citocinas pró-inflamatórias.51 [0087] Em uma modalidade, a composição da presente invenção não inclui quantidades significativas de glicose, glutamina, metionina e/ou lactose. Em certas modalidades, a composição não inclui quanti
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31/102 dades significativas de glicose. Em certas modalidades, a composição não inclui quantidades significativas de glutamina. Em certas modalidades, a composição não inclui quantidades significativas de metionina. Em certas modalidades, a composição não inclui metionina. Em certas modalidades, a composição não inclui quantidades significativas de lactose.
[0088] Em uma modalidade, a composição descrita nesta invenção é utilizada como uma composição para o cultivo de células para promover a sobrevivência, desenvolvimento e/ou proliferação de célulastronco e/ou células progenitoras. A composição para o cultivo das células pode ser utilizada para obter células-tronco e/ou células progenitoras em quantidade aumentada para tratar várias doenças. A composição também pode ser aplicada às células-tronco e/ou células progenitoras imediatamente antes e/ou após o transplante. A composição também pode ser utilizada para aumentar a proliferação de célulastronco nativas presentes em várias partes do corpo.
[0089] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar os resultados terapêuticos de células-tronco e/ou células progenitoras implantadas compreendendo a administração de uma composição em conjunto com a implantação de células-tronco e/ou células progenitoras ou como uma terapia de manutenção ou suporte, por exemplo, transplante de medula óssea ou fígado. Em certas modalidades, é aqui concedida uma terapia de manutenção ou suporte após, por exemplo, o transplante de medula óssea ou fígado. A administração da composição pode estar em, ou próxima a, um sítio de implantação de células alvo e/ou células progenitoras em um ser humano ou animal não humano. Em uma modalidade alternativa, o ambiente pode ser ainda modificado pela provisão de fatores influenciadores ou através da limpeza do ambiente de agentes indesejados ou tóxicos que podem afetar as células-tronco e/ou progenitoras administradas
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32/102 de forma indesejada.
[0090] As células administradas podem ser não modificadas ou podem ser planejadas para serem induzidas em direção a um desfecho de diferenciação alvo. As Publicações de Patente U.S. Nos. 2006/0134789 e 2006/0110440 são aqui incorporadas por referência em suas totalldades para fornecer exemplos de células-tronco planejadas para indução de diferenciação negativa e positiva que são contempladas para uso com os métodos aqui ensinados.
[0091] Quando a composição é aplicada às células-tronco e/ou células progenitoras em cultura, ou in situ, mudanças ocorrem nas proteínas secretórias tais como fatores relacionados à sobrevivência e proliferação celular e fatores de transcrição. Como um resultado, a atividade celular é alterada e, em particular, a sobrevivência e/ou o desenvolvimento de proliferação celular são melhorados. Consequentemente, as células-tronco e/ou as células progenitoras produzidas em escala aumentada com o auxílio das composições de acordo com a presente invenção podem ser transplantadas em uma doença ou outro local como um agente de terapia celular para promover a regeneração de células e tratar eficazmente várias condições.
[0092] Em uma modalidade, a composição aqui descrita estimula a sobrevivência, proliferação, e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras como evidenciado por um ou mais de: 1) um aumento nos marcadores de proliferação, tais como p-ERK e p-AKT, em níveis de mRNA e/ou proteína, 2) um aumento nos marcadores de células-tronco, tais como BMI1 e Lgr5, em níveis de mRNA e/ou proteína, 3) uma ativação de uma proteína cinase, tal como MEK e ERK; e 4) uma diminuição nos marcadores de apoptose tais como caspase 3 clivada.
[0093] ERK é uma proteína conhecida de comunicar sinais da superfície celular ao núcleo para a mediação das mudanças transcricio
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33/102 nais e translacionais necessárias para efetuar a proliferação. ERK2 e ERK2 são proteínas de 44 kDa e 42 kDa que são uma subfamília importante de proteínas cinases que controlam uma ampla faixa de atividades celulares e processos fisiológicos, Incluindo a proliferação e diferenciação celular através da infrarregulação de moléculas próapoptóticas e suprarreguiação de moléculas anti-apoptóticas. A ativação de MEK1/2 leva à fosforilação de ERK1 e ERK2. Após a estimulação, ERK1/2 se torna fosforilada em resíduos de treonina e tirosina, e o último resulta na dissociação de ERK1/2 de MEK1/2. ERK1/2 então transloca para o núcleo. Em uma modalidade, as composições aqui descritas ajudam a manter o estímulo mitogênico até o último G1 para a entrada bem sucedida de S-fase.
[0094] AKT é uma proteína cinase específica de serina/treonina que desempenha um papel na proliferação e sobrevivência celular e inibe a apoptose e metabolismo. A fosforilação de AKT ativa a AKT. Como pERK, a AKT também é conhecida de desempenhar um papel no ciclo celular. A AKT também poderia promover a sobrevivência celular mediada pelo fator de crescimento. Uma variedade de estudos documenta a função chave da via de Akt na prevenção da morte da célula apoptótica.9 PCNA, uma proteína distinta ligada à replicação de DNA e, portanto, utilizada como um marcador para a proliferação foi medida com tratamento de AA-ORS ou solução salina. A AA-ORS aumentou a PCNA em camundongos irradiados com 0 Gy e 5 Gy, mas não em camundongos tratados com solução salina. O aumento na PCNA é uma indicação precoce de proliferação epitelial do intestino delgado. Juntos estes estudos sugerem uma proliferação aumentada com o tratamento utilizando AA-ORS.
[0095] Caspase-3 é um executivo, ou efetor de apoptose, quando a divagem de substratos de proteína dentro da célula leva a mudanças morfológicas associadas com a apoptose, incluindo a degradação
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34/102 do DNA e a condensação de cromatina, e a formação de bolhas da membrana para desencadear o processo apoptótico. Esta pró-enzima inativa é ativada pela divagem proteolítica.746 O estudo mostrou que a radiação aumentou a caspase-3 e que o tratamento de AA-ORS diminuiu a caspase-3 divada nas células epiteliais vilosas de camundongos 0 Gy e 5 Gy. Bcl-2, um alvo a jusante para Erk1 /2, é conhecido de inibir Bax na via pró-apoptótica intrínseca. Níveis aumentados de proteína Bcl-2 com AA-ORS sugerem um mecanismo protetor para prevenir apoptose. No entanto, níveis aumentados de proteína de Bcl2 nos tecidos de camundongos irradiados podem sugerir um mecanismo de radioproteção. Aumento semelhante nos níveis de proteína Bcl-2 após a irradiação foi relatado e combina com as descobertas anteriores (Ezekwudo, D. et al. Inhibition of expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and induction of cell death in radioresistant human prostate adenocarcinoma cell line (PC-3) by methyl jasmonate. Cancer Lett 270, 277-285, doi:10.1016/j.canlet.2008.05.022 (2008)). Entretanto, a proteína Bax falhou em mostrar mudanças significativas com radiação ou com tratamento, o que sugere um efeito de AA-ORS sobre a apoptose em uma etapa a montante à Bax26. O aumento de p-Akt em camundongos tratados com AA-ORS sugere que sua ação pode ser pela ativação da proliferação ou inibição da apoptose (Figura 5). Juntamente com os efeitos observados na caspase-3 e Bcl-2, estes resultados podem explicar o efeito de pró-sobrevivência e a proliferação aumentada observada com tratamento de AA-ORS. No entanto, outros estudos serão necessários para caracterizar os mecanismos pelos quais a AA-ORS ativa Erk1 /2 e Akt, PCNA caspase-3, Bcl-2 ou Bax.
p53 [0096] Visto que a Akt também pode desempenhar papéis proeminentes na transformação maligna, 10 o papel de p53, uma proteína supressora de tumor conhecida, foi estudada com AA-ORS. As altera
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35/102 ções na proteína p53 podem sugerir que a AA-ORS possuí efeitos de supressão de tumor. Mutações no gene p53 supressor de tumor53 são as lesões genéticas mais frequentemente observadas em cânceres humanos. Os camundongos homozigotos pelo alelo nulo parecem normais, mas são propensos ao desenvolvimento espontâneo de uma variedade de tumores. 11 p53 também mostrou-se desempenhar um papel importante na resposta à radiação; de fato, o nível de acúmulo de p53 em resposta à irradiação resulta principalmente da intensidade de dano de DNA. 12 Estudos demonstraram que a perda de célulastronco desempenha um papel importante em lesões intestinais agudas induzidas por radiação e letalidade e é regulada pela via p53 e seus alvos transcricionais PUMA e p21.23 34 37 A apoptose dependente de PUMA rapidamente reduz as células-tronco intestinais (ISC) e seus progenitores em horas após a irradiação de alta dose, e deficiência de PUMA leva à sobrevivência animal melhorada e regeneração da cripta através do aumento do reparo de DNA dependente de p21 e é crucial para o dano intestinal induzido por radiação. 2438 Juntamente com Lgr5, p-Erk e p-Akt, as mudanças na caspase-3 clivada sugerem que a AA-ORS aumentou a altura da vilosidade nos tecidos intestinais de camundongos não irradiados e irradiados não apenas através da proliferação, mas também através de apoptose diminuída e sobrevivência celular aumentada. Para avaliar se as células epiteliais vilosas que resultam da proliferação aumentada e apoptose diminuída estão maduras, diferenciadas e funcionalmente ativa, a capacidade de absorção de Na+ e absorção de Na+ estimulada pela glicose foram medidas. Tanto NHE3, o transportador predominante da absorção de Na+ no intestino delgado, quanto SGLT1, o transportador para absorção de glicose acoplada a sódio, foram apenas encontrados em células vilosas maduras e diferenciadas; elas tiveram função aumentada (Figuras 3 & 4) assim como níveis aumentados de mRNA e proteína. Estes es
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36/102 tudos sugerem que o tratamento de AA-ORS após a irradiação aumentou a absorção de eletrólito e glicose (Figuras 3, 4e 7).
[0097] Em uma modalidade, as composições descritas nesta invenção são úteis para a prevenção de danos ao DNA e/ou ao reparo de DNA danificado. Em outra modalidade, a composição promove a proliferação e/ou desenvolvimento das células-tronco e/ou progenitoras através da prevenção ou redução de danos ao DNA e/ou reparo de DNA danificado.
kradiação, Contagem de Cripta, Comprimento das VHosidades e ^munohístoquímíca [0098] Descobriu-se que o ganho de peso aumentado e a sobrevivência podem ser secundários para o número aumentado de criptas e a altura das vilosidades que depois aumentaram a área superficial de absorção. Demonstrou-se que o número de cripta e a altura das vilosidades aumentaram com o tratamento de AA-ORS começando 6 dias após a irradiação. A utilização do modelo de múltiplos alvos de impacto único para a sobrevivência da cripta, descobriu-se que o número de unidades progenitoras de cripta através da circunferência ileal (N) aumentou significativamente (P < 0,001) sem uma alteração em D0 (4,8 ± 0,1 Gy) (Figura 1A). Os valores Dq melhoraram o equivalente a uma tolerância à radiação aumentada de 1,7 Gy com tratamento de AAORS, indicando sobrevivência de cripta melhorada. Os estudos de sobrevivência de cripta sugeriram um aumento nas unidades progenitoras ou células-tronco por cripta. Assim, examinou-se o efeito de irradiação e AA-ORS sobre o número de células-tronco utilizando anticorpos específicos para marcadores de células-tronco intestinal e migração das células filhas nas vilosidades secundárias para a proliferação através da incorporação EdU. 2436 Pelo menos três tipos distintos de células da cripta são postulados para representar células-tronco intestinais (ISC). 2 Cada elemento da população possui cinética de prolifePetição 870190039092, de 25/04/2019, pág. 66/150
37/102 ração distinta e sensibilidades à radiação; portanto, considera-se que cada um sirve a uma única função.31 Acredita-se que elas comutam dinamicamente de um tipo para o outro em resposta aos sinais inibidores e estimulantes provocados por citocinas, hormônios ou fatores de crescimento. 25 Em contraste, células-tronco epiteliais intestinais de ciclagem lenta (IESC) [células de retenção de marcador (LRC)] na posição de cripta +4 contribuem para a capacidade regenerativa homeostática, particularmente durante a recuperação da lesão. 33 Estas LRC expressam vários marcadores, tais como Bmil, HopX, Lrig 1 e/ou Dclkl, e podem mudar para a ciclagem rápida de lESCs em resposta à lesão. 34 Lgr5 pode marcar ambas as células, enquanto que Bmi1 e HopX foram relatadas de preferencialmente marcar as células +4. 15 Lgr5+ ISC são necessárias para a regeneração intestinal após a lesão por radiação.35 Acredita-se que Lgr5- e Bmi1 sejam células de reserva que montam a resposta regenerativa após a lesão ou lesão induzida por radiação. Estudos demonstraram que a perda de células Lgr5+ é tolerada devido à ativação do grupo de células-tronco que expressam Bmi1. 2’30 [0099] A formulação de aminoácidos AA-ORS que aumenta a altura das vilosidades possui implicações importantes para as condições doentias caracterizadas por uma diminuição na altura das vilosidades que estão fora da radiação ou da toxicidade induzida por quimioterapia, tais como doença de Crohn, doença celíaca, má nutrição e enteropatia ambiental. Este estudo significa como uma seleção sistemática de certos nutrientes com base no seu efeito benéfico sobre a função Gl ajudou a melhorar a proliferação, maturação e diferenciação de células-tronco intestinais in situ, levando a células epiteliais vilosas longas funcionalmente ativas cuja função e altura foram inicialmente comprometidas pela irradiação (Figura 7). O estudo também sustenta a observação de Leibowitz et al. de que as células-tronco derivadas da
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38/102 medula óssea não possuem nenhum papel significativo na repopulação da mucosa intestinal após radiação de alta dose (Leibowitz, B. J. et al. Ionizing irradiation induces acute haematopoietic syndrome and gastrointestinal syndrome independently in mice. Nat Commun 5, 3494, doi:10.1038/ncomms4494 (2014)). Estudos futuros devem procurar determinar os mecanismos pelos quais estes aminoácidos aumentam a população de células-tronco, aumentam a sua proliferação, e diminuem a apoptose e também excluem a transformação maligna. O trabalho realça a importância da seleção cuidadosa de diferentes nutrientes ou aminoácidos individuais para afetar várias populações de células-tronco, incluindo as células-tronco hematopoiéticas. Células-Tronco e/ou Células Progemtoras [00100] As composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para aumentar a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. As células podem ser, por exemplo, embriônicas, pluripotentes ou totipotentes, e podem ser in vivo ou in vitro.
[00101] Uma célula-tronco é tipicamente capaz de diferenciação nas células ectodérmicas, mesodérmica e endodérmica. As célulastronco pluripotentes são células não diferenciadas que possuem a capacidade de diferenciar em uma variedade de tipos celulares. As células-tronco totipotentes são células não diferenciadas com a capacidade de diferenciar em todos os tipos celulares e, por definição, implicam na transmissão da linha germinativa.
[00102] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco mesenquimais que possuem um potencial de diferenciar, por exemplo, em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, fibroblastos, células do músculo liso, células estromais, células do tendão, células epiteliais, células nervosas e células endoteliais vasculares.
[00103] Em uma modalidade, as células são células-tronco embrio
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39/102 nárias (ES). que podem proliferar indefinidamente em um estado não diferenciado. Além disso, as células ES são células totipotentes, o que significa que elas podem gerar todas as células presentes no corpo (osso, músculo, células cerebrais, etc.). Células ES foram isoladas da massa celular interna (ICM) do blastocisto de murino em desenvolvimento (Evans et al., Nature 292:154-156, 1981; Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:7634-7636, 1981; Robertson et al., Nature 323:445448, 1986). Adicionalmente, as células humanas com propriedades ES foram isoladas da massa celular de blastocisto interna (Thomson et al., Science 282:1145-1147, 1998) e células germinativas em desenvolvimento (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13726-13731, 1998). Células-tronco embrionárias de primatas humanos e não humanos foram produzidas (ver a Pat. U.S. No. 6.200.806, que é aqui incorporada por referência).
[00104] Em uma modalidade, as células são células-tronco adultas, que se auto-renovam e geram células diferenciadas. As células-tronco adultas, também denominadas células-tronco somáticas, são célulastronco que mantêm e reparam o tecido no qual elas são encontradas. Estas células podem ser, por exemplo, células-tronco de medula óssea.
[00105] Células precursoras somáticas também podem ser utilizadas com os métodos aqui divulgados. As células precursoras somáticas podem ser isoladas a partir de uma variedade de fontes utilizando métodos conhecidos de uma pessoa versada na técnica. As células precursoras somáticas podem ser de origem ectodérmica, mesodérmica ou endodérmica. Quaisquer células precursoras somáticas que podem ser obtidas e mantidas in vitro podem ser utilizadas de acordo com os presentes métodos. Tais células incluem células de tecidos epiteliais tais como a pele e o revestimento do intestino, células do músculo cardíaco embriônico, e células precursoras neurais (Stemple
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40/102 and Anderson, 1992, Cell 71:973-985). Tais células também incluem células-tronco pancreáticas, células-tronco de sangue do cordão umbilical, células-tronco do sangue periférico e células-tronco derivadas de tecidos adiposos.
[00106] Em uma modalidade, as células-tronco incluem ainda células-tronco pluripotentes obtidas através da reprogramação de células somáticas. A reprogramação de células somáticas é o processo de conversão do estado epigenético de uma célula somática diferenciada em um estado plurlpotente capaz de dar origem a qualquer tipo de célula. A reprogramação de células somáticas pode ser obtida, por exemplo, através da transferência de um núcleo somático para um oócito doador, que é denominada transferência nuclear de células somáticas (SCNT). A reprogramação de células somáticas também pode ser obtida através da reprogramação direta, denominada célulastronco pluripotentes induzidas (iPSCs), por exemplo, através da expressão retroviral simultânea dos quatro fatores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4 e C-myc. Estas IPSCs compartilham todas as características essenciais das células ES.
[00107] Em outra modalidade, outras células-tronco pósembriônicas podem ser obtidas começando a partir da semana 12 após gestação de fígado fetal, sangue do cordão umbilical perinatal (UCB), medula óssea humana ou sangue periférico estimulado por GCSF.
[00108] Em certas modalidades, as células-tronco são célulastronco neural (NSCs), células-tronco da pele, células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células-tronco mesenquimais (MSCs), células-tronco do tecido (por exemplo, células-tronco do músculo), células-tronco mesodérmica, células-tronco de órgãos (por exemplo, células-tronco pancreáticas e células-tronco hepáticas), ou células-tronco intestinais. Em certas modalidades, as células-tronco são células-tronco adultas,
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41/102 células-tronco embrionárias, células-tronco de câncer, células-tronco neurais (NSCs) células-tronco da pele, células-tronco hematopoiéticas (HSCs), células-tronco mesenquimais (MSCs) células-tronco do tecido (por exemplo, células-tronco do músculo), células-tronco mesodérmíca, células-tronco de órgãos (por exemplo, células-tronco pancreáticas e células-tronco hepáticas), ou células-tronco intestinais.
[00109] Em uma modalidade, as células são células-tronco neuronals. Em exemplos não limitativos, as células são células precursoras neuronals e/ou células precursoras gliais. As células-tronco neurais não diferenciadas se diferenciam em neuroblastos e glioblastos, que dão origem a neurônios e células gliais.
[00110] Células-tronco e progenitoras neurais podem participar dos aspectos de desenvolvimento normal, incluindo migração ao longo das vias migratórias bem estabelecidos para regiões do CNS disseminadas, diferenciação em múltiplos tipos de células de maneira desenvolvida e regionalmente apropriados em resposta às sugestões microambientals, e intercalação não disruptlva não-tumorlgênlca com progenitores de hospedeiro e sua progênie.
[00111] As NSCs humanas são capazes de expressar transgenes estranhos in vivo nestas localizações disseminadas. Como tais, estas células encontram uso no tratamento de uma variedade de condições, incluindo lesões traumáticas à medula espinhal, cérebro e sistema nervoso periférico; tratamento de distúrbios degenerativos incluindo doença de Alzheimer, doença de Huntington e doença de Parkinson; distúrbios afetivos incluindo depressão principal; acidente vascular cerebral; e similares.
[00112] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco musculares. O tecido muscular em vertebrados adultos regera-se a partir dos míoblastos de reserva denominados células satélites. As células satélites são distribuídas por todo o tecido muscular e são mitoti
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42/102 camente quiescent© na ausência de lesão ou doença. Após a recuperação de danos devido à lesão ou doença ou em resposta a estímulos para crescimento ou hipertrofia, as células satélites reeníram no ciclo celular, proliferam e sofrem diferenciação em miotubos multinucleados, que formam nova fibra muscular. Os mioblastos finalmente produzem fibras musculares de substituição ou se fundem nas fibras musculares existentes, aumentando assim a circunferência da fibra através da síntese de componentes do mecanismo contrátil. Critérios para o estímulo para contração muscular incluem a expressão de proteínas miogênicas, as quais incluem a proteína de filamento intermediário desmina, e fatores de transcrição mlogênicos MyoD, Myf-5 e Pax-7.
[00113] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco de folículo capilar. A área de inchação do folículo capilar é uma fonte abundante facilmente acessível de células-tronco adultas pluripotentes de crescimento ativo. Nestina, um marcador de proteína para célulastronco neurais, também é expressa nas células-tronco de folículo assim como em sua progênie diferenciada imediata. As células-tronco de folículo capilar de expressão de nestina diferenciam-se em, por exemplo, neurônios, células gliais, ceratinócitos e células do músculo liso in vitro.
[00114] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco pancreáticas e células progenitoras multipotentes pancreáticas (PMP). Estas células podem ser isoladas do tecido pancreátíco derivado das ilhotas e dutos e ainda se desenvolvem, por exemplo, em outras células PMP ou células neurais ou pancreáticas. As células pancreáticas opcionalmente incluem células alfa, células delta, células beta, células exócrinas pancreáticas e células estreladas pancreáticas. Células α são células produtoras de glucagon maduras. In vivo, estas células são encontradas nas ilhotas pancreáticas de Langerhans. Células β são células produtoras de insulina maduras. In vivo, estas células tam
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43/102 bém são encontradas nas ilhotas pancreáticas de Langerhans. As células-tronco pancreáticas são importantes no tratamento de diabetes, diabetes tipo I, para fornecer células β.
[00115] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco da medula óssea. As células-tronco da medula óssea são células que são geradas na medula óssea e que podem diferenciar nas células de vários tecidos corporais. As células-tronco da medula óssea também são capazes de recuperar uma função perdida de um tecido através da diferenciação em células do tecido sob a influência de um Indutor de diferenciação. Exemplos de células-tronco da medula óssea incluem células-tronco mesenquimais da medula óssea capazes de diferenciar, por exemplo, em células ósseas, condrócitos, adípócitos, miócitos, tenócitos ou células estromais da medula óssea, e células-tronco hematopoiéticas capazes de diferenciar em células sanguíneas, tais como eritrócitos e leucócitos.
[00116] Em uma modalidade, as células-tronco são do trato gastrintestinal. Linhagens celulares epiteliais dentro do trato gastrintestinal. A rotatividade dessas células é um processo constante sob a homeostasia normal e crescente após o dano. Células-tronco multipotentes regulam este processo gerando todas as linhagens celulares epiteliais gastrointestinais e mesmo criptas intestinais e glândulas gásticas inteiras. Estas células-tronco situadas na parte inferior das criptas intestinais, incluindo células colnares de base da cripta de cíclagem rápida (CBCs) e células mais quiescentes +4 acima das células de Paneth em mamíferos.
[00117] Pelo menos três tipos distintos de células da cripta são postulados para representar as células-tronco intestinais (ISC). Cada elemento da população possui cinética de proliferação distinta e sensibilidades à radiação; portanto, acredita-se que cada um cumpra uma função única. Acredita-se que eles comutam dinamicamente de um tipo
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44/102 para o outro em resposta aos sinais inibidores e estimulantes provocados por citocinas, hormônios, ou fatores de crescimento. Em contraste, células-tronco epiteliais intestinais de ciclagem lenta (IESC) [células de retenção de marcador (LRC)] na posição da cripta +4 contribuem com a capacidade regenerativa homeostática, particularmente durante a recuperação da lesão. Estas LRC expressam vários marcadores, tais como BMI1, HOPX. LRIG1 e/ou DCLK1, e podem mudar para lESCs de ciclagem rápida em resposta à lesão. Lgr5 pode marcar ambas as células, enquanto que Bml1 e HopX foram relatados de marcar preferencíalmente células +4. Lgr5+ ISC são necessárias para a regeneração intestinal após a lesão gastrointestinal induzida por radiação e/ou quimioterapia. LgrS’ e BMI1 são supostas de serem células de reserva que montam a resposta regenerativa após a lesão ou dano Induzido por radiação. Similarmente, a formulação pode ser utilizada em condições doentias subclínicas tais como enteropatia ambiental que estão associadas com maior permeabilidade do intestino, inflamação local e sistêmica aumentada, e menor altura das vilosidades. Os indivíduos com entopatia ambiental experimentam má nutrição crônica secundária à má absorção de nutrientes e minerais.
Composições para promover a proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras, e para cicatrização de feridas, tratamento de condições de pele, distúrbios pulmonares, condições de barreira da mucosa, e uma doença ou condições que estão relacionadas à função de barreira da mucosa, e tratamento de lesões à mucosa GI [00118] Em um aspecto, são aqui fornecidas composições terapêuticas para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. São aqui descritas composições e métodos para o tratamento de uma doença ou condições que estão relacionadas com a função de barreira da mucosa, por
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45/102 exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesões à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade.
[00119] Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de, um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico, serina e seus derivados; e opcionalmente, veículos, adjuvantes e/ou ingredientes ativos adicionais farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, a composição terapêutica compreende, consiste essencialmente de, ou consistir de, um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina; e opcionalmente, veículos, adjuvantes e/ou ingredientes ativos adicionais farmaceuticamente aceitáveis. Em certas modalidades, a composição é estéril.
[00120] Em uma modalidade, a osmolaridade total da composição é de cerca de 100 mosm a cerca de 280 mosm, ou qualquer valor entre estes. De preferência, a osmolaridade total é de cerca de 150 a cerca de 260 mosm. Em outra modalidade, a composição possui uma osmolaridade total que é qualquer valor inferior a cerca de 280 mosm.
[00121] A composição pode ter um pH de, por exemplo, 2,5 a 8,5. Em certas modalidades, a composição possui um pH de cerca de 2,5 a cerca de 6,5, de cerca de 3,0 a cerca de 6,0, de cerca de 3,5 a cerca de 5,5, de cerca de 3,9 a cerca de 5,0 ou de cerca de 4,2 a cerca de 4,6. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, de cerca de 7,0 a cerca de 8,0 ou de cerca de 7,2 a cerca de 7,8.
[00122] Em certas modalidades, a composição compreende um ou
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46/102 mais aminoácidos livres selecionados do grupo constituído de treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico, serina e seus derivados. Em certas modalidades, a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano e ácido aspártico. A composição de preferência compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina e triptofano. Em certas modalidades, a composição compreende dois ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo constituído de treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende três ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende quatro ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina. Em certas modalidades, a composição compreende treonina, valina, tirosina, triptofano e ácido aspártico. Em certas modalidades, a composição compreende os aminoácidos livres de treonina, valina, tirosina, triptofano e serina.
[00123] Estes aminoácidos, se presentes na composição, podem estar presentes, por exemplo, nas seguintes concentrações: treonina em cerca de 0,4 a cerca de 1,5, cerca de 0,7 a cerca de 1,3 ou cerca de 0,9 a cerca de 1,1 grama/litro; valina em cerca de 0,7 a cerca de
1,7, cerca de 0,9 a cerca de 1,5 ou cerca de 1,1 a cerca de 1,3 grama/litro; serina em cerca de 0,6 a cerca de 1,6, cerca de 0,8 a cerca de 1,4, cerca de 1,0 a cerca de 1,2 grama/litro; tirosina em cerca de 0,05 a cerca de 0,4, ou cerca de 0,1 a cerca de 0 3 grama/litro; e triptofano em cerca de 1,1 a cerca de 2,1, cerca de 1,3 a cerca de 1,9 ou
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47/102 cerca de 1,5 a cerca de 1,7 grama/litro. Em uma certa modalidade, a composição terapêutica compreende treonina (ao redor de 1,0 grama/litro), valina (ao redor de 1,2 grama/litro), serina (ao redor de 1,1 grama/litro), tirosina (ao redor de 0,2 grama/litro), e triptofano (ao redor de 1,6 grama/litro). Em uma modalidade a composição não inclui serina.
[00124] Em uma outra modalidade, a composição compreende, ou consiste essencialmente em apenas um aminoácido livre selecionado de treonina, valina, tirosina e triptofano, e/ou seus derivados. Em uma outra modalidade, a composição terapêutica compreende, ou consiste essencialmente em treonina como um aminoácido livre. A composição terapêutica também pode compreender, ou consiste essencialmente de, valina como o aminoácido livre. Além disso, a composição terapêutica compreende, ou consiste essencialmente de, tirosina como um aminoácido livre. A composição terapêutica compreende, ou consiste essencialmente de, triptofano como um aminoácido livre. Além disso, a composição terapêutica compreende, ou consiste essencialmente de, ácido aspártico como um aminoácido livre. Em certas modalidades, a composição compreende serina como um aminoácido livre.
[00125] Em outra modalidade, a composição também pode compreender, ou consistir essencialmente de, dois aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico, incluindo a combinação de treonina e valina, a combinação de treonina e serina, a combinação de treonina e tirosina, a combinação de treonina e triptofano, a combinação de valina e serina, a combinação de valina e tirosina, a combinação de valina e triptofano, a combinação de valina e triptofano, a combinação de serina e tirosina, a combinação de serina e triptofano, a combinação de serina e triptofano, a combinação de tirosina e ácido aspártico, a combinação de serina e ácido aspártico, a combinação de valina e ácido
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48/102 aspártico, a combinação de íreonina e ácido aspártico, a combinação de triptofano e ácido aspártico e a combinação de tirosina e triptofano. [00126] Em outra modalidade, a composição pode compreender, ou consistir essencialmente de, três aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico, incluindo a combinação de treonina, valina e serina; a combinação de íreonina, valina e tirosina; a combinação de treonina, valina e triptofano; a combinação de treonina, serina e tirosina; a combinação de treonina, serina e triptofano; a combinação de treonina, tirosina e triptofano; a combinação de valina, serina e tirosina; a combinação de valina, serina e triptofano; a combinação de valina, tirosina e triptofano; e a combinação de serina, tirosina e triptofano; a combinação de treonina, valina e ácido aspártico, a combinação de treonina, serina e ácido aspártico; a combinação de íreonina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de treonina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de valina, serina e ácido aspártico; a combinação de valina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de valina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de serina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de serina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de tirosina, triptofano e ácido aspártico.
[00127] Em outra modalidade, a composição pode compreender, ou consistir essencialmente de, quatro aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico, incluindo a combinação de treonina, valina, serina e tirosina; a combinação de treonina, valina, serina e triptofano; a combinação de treonina, valina, tirosina e triptofano; a combinação de treonina, serina, tirosina e triptofano; e a combinação de valina, serina, tirosina e triptofano; a combinação de treonina, valina, serina e ácido aspártico; a combinação de treonina, valina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de treonina, valina, triptofano e ácido aspártico; a com
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49/102 binação de treonina, serina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de treonina, serína, triptofano e ácido aspártico; a combinação de treonina, tirosina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de valina, serina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de valina, serína, triptofano e ácido aspártico; a combinação de vaiina, tirosina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de serína, tirosina, triptofano e ácido aspártico.
[00128] Em outra modalidade, a composição pode compreender, ou consistir essencialmente de, cinco aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico, incluindo a combinação de treonina, valina, serina, tirosina e triptofano; a combinação de treonina, valina, serina, tirosina e ácido aspártico; a combinação de treonina, valina, serina, triptofano e ácido aspártico; a combinação de treonina, valina, tirosina , triptofano e ácido aspártico; a combinação de treonina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico.
[00129] Em outra modalidade, a composição pode compreender, ou consistir essencialmente de, treonina, valina, serina, tirosina, triptofano e ácido aspártico como aminoácidos livres.
[00130] Em certas modalidades, as composições podem compreender aminoácidos naturais ou seus derivados que retêm substancialmente a mesma, ou melhor, atividade em termos de aumento da sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. Em certas modalidades, as composições podem compreender aminoácidos naturais ou seus derivados que retêm substancialmente a mesma, ou melhor, atividade em termos de cicathzação de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesão à
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50/102 mucosa GI em um indivíduo com sua necessidade. Os derivados podem ser, por exemplo, enantiômeros, e incluem as formas tanto Dquanto L- dos aminoácidos. Os derivados podem ser, por exemplo, iodotirosina ou norvaiina. Outros derivados de aminoácido incluem, por exemplo, norleucina, ornitina, penicilamina, derivados de plroglutamlna, ou outros derivados de alanina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmlco, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, fenalalanina, serina, treonina, triptofano ou valina. Em certas modalidades, os derivados de aminoácido são derivados de treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico ou serina. Outros derivados de aminoácidos incluem, mas não são limitados a estes, aqueles que são sintetizados, por exemplo, através da acilação, metilação e/ou halogenação do aminoácido. Estes incluem, por exemplo, aminoácidos de βmetil, aminoácidos de C-metila e aminoácidos de N-metila.
[00131] Em algumas modalidades específicas, a composição da presente invenção não compreende um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina. Ou, em certas modalidades, mesmo se estes aminoácidos estiverem presentes na composição, eles não estão presentes em uma quantidade que inibíria a proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras.
[00132] Em certas modalidades específicas, a composição da presente invenção não inclui, ou apenas compreende quantidades insignificantes de, um dos aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina. Em outras modalidades, a composição terapêutica não inclui lisina como um aminoácido livre, ou a composição terapêutica não inclui glicina como um aminoácido livre; ou a composição terapêutica não inclui ácido aspártico como um aminoácido livre; ou a composição terapêutico não inclui isoleucina como um aminoácido livre; ou a composição terapêutica
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51/102 não inclui a asparagina como um aminoácido livre.
[00133] Em algumas modalidades, a composição terapêutica não inclui qualquer um de dois aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em serína, Usina, glicina, isoleucina e asparagina, incluindo a combinação de lisina e glicina, a combinação de lisina e ácido aspártico, a combinação de lisina e Isoleucina, a combinação de lisina e asparagina, a combinação de glicina e ácido aspártico, a combinação de glicina e isoleucina, a combinação de glicina e asparagina, a combinação de ácido aspártico e isoleucina, a combinação de ácido aspártico e asparagina e a combinação de isoleucina e asparagina.
[00134] Em outras modalidades, a composição não inclui qualquer um de três aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina, incluindo a combinação de lisina, glicina e ácido aspártico; a combinação de lisina, glicina e isoleucina; a combinação de lisina, glicina e asparagina; a combinação de lisina, ácido aspártico e isoleucina; a combinação de lisina, ácido aspártico e asparagina; a combinação de lisina, isoleucina e asparagina; a combinação de glicina, ácido aspártico e isoleucina; a combinação de glicina, ácido aspártico e asparagina; a combinação de glicina, isoleucina e asparagina; e a combinação de ácido aspártico, isoleucina e asparagina.
[00135] Em outras modalidades, a composição não inclui qualquer um de quatro aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina, incluindo a combinação de lisina, glicina, ácido aspártico e isoleucina; a combinação de lisina, glicina, ácido aspártico e asparagina; a combinação de lisina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina; a combinação de lisina, glicina, isoleucina e asparagina e a combinação de glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina.
[00136] Em uma modalidade específica, a composição da presente
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52/102 invenção não inclui lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparaglna. Em outra modalidade específica, a composição não inclui, ou somente inclui quantidades insignificantes de, serina, lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina. Em uma modalidade, a composição não inclui glutamina e/ou metionina; e quaisquer di-, oligo- oupolipeptídeos ou proteínas que possam ser hidrolisadas em glutamina e/ou metionina.
[00137] Em certas modalidades específicas, a composição terapêutica pode compreender lisina, em que a concentração total de lisina é menor do que 300 mg/l, 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. A composição terapêutica também pode compreender ácido aspártico, em que a concentração total de ácido aspártico é menor do que 300 mg/l, 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. A composição terapêutica também pode compreender glicina, em que a concentração total de glicina é menor do que 300 mg/l, 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. A composição terapêutica pode ainda compreender isoleucina, em que a concentração total de isoleucina é menor do que 300 mg/l, 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. A composição terapêutica pode ainda compreender asparagina, em que a concentração total de asparagina é menor que 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l.
[00138] Em uma modalidade alternativa, a composição pode compreender aminoácido livre glutamina, e opcionalmente, um ou mais dipeptídeos contendo glutamina, em que a concentração total do aminoácido livre glutamina e do dipeptídeo contendo glutamina é menor do que 300 mg/l, ou qualquer concentração abaixo de 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. Em certas modalidades, a composição pode compreender aminoácido livre glutamina, e opcionalmente, um ou mais peptídeos contendo glu
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53/102 tamina, em que a concentração total do aminoácido livre glutamina e do peptídeo contendo glutamina é menor do que 300 mg/l, ou qualquer concentração abaixo de 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l.
[00139] Em outra modalidade alternativa, a composição terapêutica pode compreender aminoácldo livre metionina, e opcionalmente, um ou mais dipeptídeos contendo metionina, em que a concentração total do aminoácido livre metionina e do dipeptídeo contendo metionina é menor do que 300 mg/l, ou qualquer concentração mais baixa do que 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l. Em certas modalidades, a composição pode compreender aminoácido livre metionina, e opcionalmente, um ou mais dipeptídeos contendo metionina, em que a concentração total do aminoácido livre metionina e do peptídeo contendo metionina é menor do que 300 mg/l, ou qualquer concentração mais baixa do que 300 mg/l, tal como 100 mg/l, 50 mg/l, 10 mg/l, 5 mg/l, 1 mg/l, 0,5 mg/l ou 0,01 mg/l.
[00140] Em certas modalidades, a composição também compreende aditivos (por exemplo, nutrientes, eletrólitos, vitaminas, minerais, etc.). Em certas modalidades, a composição compreende ferro ou zinco. Em certas modalidades, a composição terapêutica compreende um ou mais eletrólitos selecionados de, por exemplo, Na+; K+; HCOs'; CO32·; Ca2+; Mg2+; Fe2; Cl·; íons de fosfato tais como H2PO4·, HPOA e POA; zinco; iodo; cobre; ferro; selênio; cromo; e molibdênio. Em uma modalidade alternativa, a composição não contém HCOs' ou CO32·. Em outra modalidade alternativa, a composição compreende HCOs' e CO32· em uma concentração total menor do que 5 mg/l, ou concentrações mais baixa do que 5 mg/l. Em certas modalidades, a composição não contém eletrólitos. Por exemplo, em certas modalidades, a composição não inclui um ou mais, ou qualquer um de Na+; K+; HCOs'; CO32-; Ca2+; Mg2+; Fe2; Cl·; íons fosfato tais como H2PO4·, HPO42· e
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PO43·; zinco; iodo; cobre; ferro; selênio; cromo; e molibdênio.
[00141] Em certas modalidades, a composição não contém um ou mais dos ingredientes selecionados de oligo-, polissacarídeos, e carboidratos; oligo- ou polipeptídeos, ou proteínas; lipídeos; ácidos graxos de cadeia pequena, média e/ou longa; e/ou alimento contendo um ou mais dos nutrientes mencionados acima. Em certas modalidades, a composição não inclui giicose ou sacarose.
[00142] Em uma modalidade, os ions de fosfato tais como HEPOt, HPO42· e PO43·, são utilizados para tamponar a composição da presente invenção. Em uma modalidade, a composição terapêutica utiliza HCO3· ou CO32· como um tampão. Em outra modalidade, a composição terapêutica não utiliza HCOs' ou CO32· como tampão.
[00143] Em certas modalidades, a composição compreende: valina, treonina, tirosina, eletrólitos, Na+ (ao redor de 10 mmol a 60 mmol), e K+ (ao redor de 1 mmol a 20 mmol). Em certas modalidades, a composição compreende um tampão.
Terapias de Céluias-Tronco e/ou CéUuHas Progenhoras e Terapias para Cicatrização de Feridas, Tratamento de Condições da Pete, Distúrbios Pulmonares, MeUhora da Função de Barreira da Mucosa e/ou Tratamento de Lesões à Mucosa Gi [00144] São aqui descritas composições de aminoácidos como terapias para 0 tratamento de distúrbios GI, pulmão e pele. A presente invenção fornece composições e métodos que intensificam a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. A presente invenção fornece composições e métodos para 0 tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), me
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Ihora da função de barreira da mucosa e/ou tratamento de lesão à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade. O número de célulastronco e/ou células progenitoras pode ser aumentado mediante o aumento da sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento das células. Em uma modalidade, o método compreende a exposição das células-tronco e/ou das células progenitoras à uma composição da presente invenção. As células-tronco e/ou as células progenitoras podem ser expostas à composição em cultura, ex vivo, in situ ou in vivo, incluindo após ser administrado, implantado ou liberado em um indivíduo.
[00145] O indivíduo pode ser, por exemplo, um ser humano no qual a promoção da sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras é necessária. O indivíduo pode ser, por exemplo, um indivíduo humano com uma doença ou condição em necessidade de tratamento. Além dos seres humanos, o animal pode ser de qualquer espécie, incluindo, mas não limitado às espécies de mamífero incluindo, mas não limitadas aos animais domesticados e de laboratório tais como cães, gatos, camundongos, ratos, porquinhos da índia e hamsters; animais de criação tais como cavalos, gado, porcos, ovelha, cabras, patos, gansos e galinhas; outros primatas tais como bugios, chimpanzés, orangotangos e macacos; peixe; anfíbios tais como rãs e salamandras; répteis, tais como cobras e lagartixas; e outros animais, tais como raposa, camelos, ursos, antílopes, lhamas, doninhas, coelhos, marta, castores, arminhos, lontras, zibelinas, focas, coiotes, chinchilas, veados, rato silvestre e gambá.
[00146] Em uma modalidade, os métodos levam a um aumento na sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. Em certas modalidades, os métodos levam a uma melhora na condição de um indivíduo com uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, feridas, condições da pele (por exemplo, dermatite atópica,
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56/102 psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), função de barreira da mucosa e/ou danos à mucosa Gl.
[00147] Em uma modalidade, o método compreende a introdução da composição de acordo com a presente invenção nas células-tronco e/ou células progenitoras em cultura para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento. A composição pode assim ser utilizada para obter as quantidades acentuadas das células para uso no tratamento de várias doenças e condições.
[00148] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar os resultados terapêuticos de células-tronco implantadas compreendendo a administração de uma composição da presente invenção em conjunto com a implantação da célula-tronco. A administração da composição pode estar em um local de implantação de célula-tronco alvo, ou próxima, em um ser humano ou animal não humano. Em certas modalidades, é aqui fornecido um método para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira mucosa, por exemplo, cicathzação de feridas, tratamento de condições de pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira mucosa e/ou tratamento de lesões à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração de uma composição aqui descrita ao indivíduo que dele necessite.
[00149] Em uma modalidade, os receptores das células-tronco e/ou progenitoras administradas podem ser imunosuphmidos, através do uso de fármacos imunossupressores tais como ciclospohna, ou através de estratégias locais de imunossupressão que empregam imunossupressores localmente aplicados, mas tal imunossupressão não pre
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57/102 cisa ser necessariamente um pré-requisito em certos tecidos imunoprivilegiados tais como, por exemplo, tecidos cerebrais e oculares.
[00150] Em certas modalidades, a células-tronco e/ou progenitoras administradas são autólogas por natureza, isto é, preparadas a partir do próprio tecido do receptor. Em tais casos, a progênie de célulastronco pode ser gerada a partir do tecido dissociado ou isolado e proliferada in vitro utilizando a composição da presente invenção. Após a expansão adequada dos números de células, as células podem ser colhidas e preparadas para administração no tecido afetado do receptor.
[00151] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para promover a proliferação e diferenciação de células-tronco em um indivíduo com tal necessidade, em que dito método compreende: identificar um indivíduo com tal necessidade, e administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosína, triptofano, ácido aspártico e serina; e opcionalmente, um ou mais veículos, adjuvantes e/ou outros agentes ativos farmaceuticamente aceitáveis, em que a composição possui uma osmolaridade total de cerca de 100 a cerca de 280 mosm e um pH de cerca de 2,5 a cerca de 6,5. Em certas modalidades, é aqui fornecido um método para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de fendas, tratamento de condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), melhora da função de barreira da mucosa e/ou tratamento de lesão à mucosa Gi, em que dito método compreende: a identificação de um indivíduo com tal necessidade, e a administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz
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58/102 de uma composição que compreende, consiste essencialmente de ou consiste de um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina; e opcionalmente, um ou mais veículos, adjuvantes e/ou outros agentes ativos farmaceuticamente aceitáveis, em que a composição possui uma osmolaridade total de cerca de 100 a cerca de 280 mosm e um pH de cerca de 2,5 a cerca de 6,5.
[00152] Em outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados para superar a supressão da medula óssea resultante de fármacos, produtos químicos e infecções virais ou bacterianas de causa desconhecida.
[00153] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser utilizada para promover a proliferação e desenvolvimento de célulastronco e/ou células progenitoras em doenças e condições que incluem, mas não são limitadas a estas, malignidade; deficiência de células de Paneth; hipopituitarismo; doença de celíaca tal como a doença celíaca não responsiva à dieta livre de glúten; doença tropical; isquemia associada à radiação; atrofia vilosa induzida por fármacos, tal como atrofia vilosa induzida por neomicina e azopina, intolerância alimentar severa; doença de Crohn congênita; enteropatia autoimune; enterocolite; hepatite; câncer intestinal; linfoma intestinal; diabetes tipo 1; alergia; condições oculares, tais como laceração da córnea; gasíroentehte eosinofílica; gastroenterite viral e síndromes de imunodeficiência.
[00154] Em algumas modalidades, a presente invenção pode ser utilizada para promover a proliferação e diferenciação de célulastronco nas condições e doenças induzidas por infecção viral, fúngica ou bacteriana, por exemplo, supressão da medula óssea induzida por infecção viral, fúngica ou bacteriana. Por exemplo, as composições e métodos podem ser utilizados para tratar um paciente com uma baixa contagem de plaqueta provocada, por exemplo, pelo vírus da Dengue.
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59/102 [00155] As composições descritas nesta invenção também podem ser utilizadas para tratar, ou melhorar os sintomas, por exemplo, de déficits provocados por uma doença neurodegenerativa, lesão traumática, lesão neurotóxica, isquemia, distúrbios de desenvolvimento, distúrbios que afetam a visão, lesões ou doenças da medula espinhal, doenças desmielinizantes, doenças autoimunes, infecções, doenças inflamatórias ou doenças corporais.
[00156] Em certas modalidades, as células-tronco implantadas são capazes de proliferar, migrar para uma área de dano do tecido e/ou diferenciar de uma maneira específica do tecido e funcionar de uma maneira que reduz o déficit.
[00157] Em uma modalidade, o método e a composição de acordo com a presente invenção são particularmente úteis para pacientes que são expostos à radiação, ou recebem terapia de radiação, quimio e/ou prótons.
[00158] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de lesões no trato Gl (por exemplo, mucosa do intestino delgado, esôfago, estômago, intestino grosso, etc.), trato genítourínário, ou um órgão com revestimento mucosal em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma condição relacionada à barreira mucosa em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita.
[00159] As composições da presente invenção podem ser utilizadas no tratamento ou melhora de quaisquer doenças ou condições com necessidade de proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras. Em uma modalidade específica, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados no trata
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60/102 mento ou melhora da lesão induzida por radiação no intestino delgado através da promoção da proliferação de células-tronco. Em outra modalidade específica, a presente invenção pode ser utilizada no tratamento ou melhora da lesão no intestino delgado provocadas por terapia de radiação, particularmente terapia de radiação pélvica e abdominal. Em uma modalidade específica, a terapia de radiação é para o tratamento de câncer.
[00160] Adicionalmente, a presente invenção pode ser utilizada para promover a proliferação de células-tronco para o tratamento ou melhora de lesões no intestino delgado provocadas por agentes quimioterapêuticos que incluem, mas não limitados a cisplatina, 5-fluorouracil (5-FU), hidroxiuréia, etoposídeo, arabinosídeo, 6-mercaptopurina, 6tioguanina, fludarabina, metotrexato, esteróides, e/ou uma combinação destes. Agentes quimioterapêuticos exemplares incluem, mas não são limitados a estes, anti-estrógenos (por exemplo, tamoxifeno, raloxifene e megestrol), agonistas de LHRH (por exemplo, goscrclin e leuprolide), anti-andrógenos (por exemplo, flutamida e bicalutamida), terapias fotodinâmicas (por exemplo, vertoporfina (BPD-ΜΑ), ftalocianina, fotossensibiiizador Pc4, e demetóxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA)), mostardas de nitrogênio (por exemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, trofosfamida, clorambucil, estramustina e melfalano), nitrosouréias (por exemplo, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU)), alquilsulfonatos (por exemplo, bussulfano e treossulfano), triazenos (por exemplo, dacarbazina, temozolomida), compostos contendo platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina), alcalóides da pervinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina e vinorrelbina), taxóides (por exemplo, paclitaxel ou um equivalente de paclitaxel tal como o paclitaxel ligado a albumina da nanopartícula (ABRAXANE), paclitaxel ligado a ácido docosaexaenóico (DHA-paciitaxel, Taxoprexin), paclitaxel ligado a poliglutamato (PG-paclitaxel, paclitaxel poliglumex, CT-2103, XYOTAX), o
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61/102 pró-fármaco ativado por tumor (TAP) ANG1005 (Angiopep-2 ligado a três moléculas de paclitaxel), paclitaxel-EC-1 (paclitaxel ligado ao peptídeo de reconhecimento erbB2 EC-1), e paclitaxel conjugado com glicose, por exemplo, succinato de 2'-pacHtaxel metil 2-glícopiranosil; docetaxel, taxol), epipodofilinas (por exemplo, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, teniposídeo, topotecan, 9-aminocampotecina, camptoirinotecan, irinotecan, crisnatol, mytomicina C), antimetabólitos, inibidores de DHFR (por exemplo metotrexato, diclorometoterxato, trimetrexato, edatrexato), inibidores da IMP desidrogenase (por exemplo, ácido micofenólico, tíazofurina, ribavirína e ECAR). inibidores de ribonuclotídeo redutase (por exemplo, hidroxiuréia e deferoxamina), análogos de uracila (por exemplo, 5-fluorouracila (5-FU), floxuridina, doxíflurídina, retitrexed, tegafur-uracila, capecitabina), análogos de citosina (por exemplo, citarabina (araC), citosina arabinosídeo, e fludarabina), análogos de purina (por exemplo, mercaptopurina e Thioguanine), análogos de Vitamina D3 (por exemplo, EB 1089, CB 1093 e KH 1060), inibidores de isoprenilação (por exemplo, lovastatina), neurotoxinas dopaminérgícas (por exemplo. íon de 1 -metil-A-fenilpiridínio), inibidores do ciclo celular (por exemplo, estaurosporina), actinomicina (por exemplo, actinomícina D, dactinomicina), bleomicina (por exemplo, bleomicina A2, bleomicina B2, peplomicina), antraciclina (por exemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, doxorrubicina Hpossômica peguilada, idarrubicina, epirrubicina, pírarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona), inibidores de MDR (por exemplo, verapamil), inibidores de Ca2+ ATRase (por exemplo, thapsigargin), imatinib, talidomida, lenaliomida, inibidores da tirosina cinase (por exemplo, axitinib (AG013736), bosutinib (SKI-606), cediranib (RECENTIN™, AZD2171), dasatinib (SPRYCEL®, BMS354825), erlotinib (TARCEVA®), gefitinib (IRESSAC®), imatinib (Gleevec®, CGP57148B, STI-571), lapatinib (TYKERB®, TYVERB®), lestaurtinib (CEP-701), neratinib (HKI-272), nilotinib (TASIGNA®), semaPetição 870190039092, de 25/04/2019, pág. 91/150
62/102 xanib (semaxinib, SU5416), sunitinib (SUTENT®, SU11248), toceranib (PALLADIA®), vandetanib (ZACTIMA®, ZD6474), vatalanib (PTK787, PTK/ZK), trastuzumab (HERCEPTIN®), bevacizumab (AVASTIN®), rituximab (RITUXAN®), cetuximab (ERBITUX®), panitumumab (VECTIBIX®), ranibizumab (Lucentis®), nilotinib (TASIGNA®), sorafenib (NEXAVARC), everolimus (AFINITOR®), alemtuzumab (CAMPATH®), gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®), temsirolimus (TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, lactato de dovitinib (TKI258, CHIR258), BIBW 2992 (TOVOK™), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120 (VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036,
BMS-690154, CEP-11981, tivozanib (AV-951), OSI-930, MM-121, XL184, XL-647, e/ou XL228), inibidores da proteasomas (por exemplo, bortezomib (VELCADE)), inibidores de mTOR (por exemplo, rapamicina, temsirolimus (CCI-779), everolimus (RAD-001), ridaforolimus, AP23573 (Ariad), AZD8055 (AstraZeneca), BEZ235 (Novartis), BGT226 (Norvartis), XL765 (Sanofi Aventis), PF-4691502 (Pfizer), GDC0980 (Genetech), SF1126 (Semafoe) e OSI-027 (OSI)), oblimersen, gemcitabine, carminomicina, leucovorina, pemetrexed, ciclofosfamida, dacarbazina, procarbizina, prednisolona, dexametasona, campatecina, plicamicina, asparaginase, aminopterina, metopterina, porfiromicina, melfalan, leurosidina, leurosina, clorambucil, trabectedin, procarbazina, discodermolide, carminomicina,, aminopterina e hexametil melamina.
[00161] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser utilizada para promover a sobrevivência e a proliferação de células-tronco para o tratamento ou melhora de doenças envolvendo lesões ao intestino delgado incluindo, mas não limitado a estas, doença inflamatória intestinal (IBD), colite ulceratíva, úlceras duodenais, doença de Crohn, e/ou doença celíaca. A presente invenção pode ser utilizada no trata
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63/102 mento ou melhora da lesão no intestino delgado devido à infecção patogênica, tal como infecção viral, bacteriana, fúngica, ou outras microbianas.
[00162] Em uma modalidade, as células-tronco e/ou as células progenitoras foram submetidas à radiação antes do tratamento com a composição da presente invenção. Em outra modalidade, as célulastronco e/ou células progenitoras serão submetidas à radiação após o tratamento com a composição da presente invenção. A radiação pode ser administrada às células, por exemplo, 1 minuto, 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 1 dia, 5 dias, 7 dias, 14 dias, 30 dias, 60 dias, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos ou 3 anos ou mais, antes ou após o tratamento das células com a composição aqui descrita. A dose de radiação pode ser, por exemplo, de pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 120, or 150 Gy.
[00163] Em uma modalidade, a presente invenção pode ser utilizada no contexto de transplantes da medula óssea. Células-tronco e/ou progenitoras da medula óssea podem ser tratadas in vivo ou ex vivo com uma composição da presente invenção. Tal tratamento aumenta a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento das células.
[00164] Em outra modalidade, a presente invenção pode ser utilizada no contexto de Prochymal, que é utilizado no controle da doença aguda de enxerto-versus-hospedeiro em crianças. Esta é uma terapia de células-tronco alogênica com base em células-tronco mesenquimais (MSCs) derivado da medula óssea de doadores adultos. A sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento das MSCs pode ser intensificada através do seu contato, in vivo ou ex vivo, com a composição da presente descrição.
[00165] Em outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados em tratamentos cardíacos. A te
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64/102 rapia de células-tronco para tratamento de infarto do miocárdio frequentemente faz uso de células-tronco da medula óssea autólogas; entretanto, outros tipos de células-tronco de adulto podem ser utilizados, tais como células-tronco derivadas do tecido adlposo. Em uma modalidade, o uso de terapia de células-tronco resulta na regeneração do tecido cardíaco para reverter a perda de tecido subjacente ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca após danos cardíacos.
[00166] Em outra modalidade, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados na formação e expansão de células sanguíneas. Glóbulos vermelhos humanos totalmente maduros podem ser gerados ex vivo através das células-tronco hematopoiéticas (HSCs), que são precursoras dos glóbulos vermelhos. Neste processo, as HSCs podem ser cultivadas juntamente com as células estromais, criando um ambiente que imita as condições da medula óssea, o local natural de crescimento dos glóbulos vermelhos. Além do uso de composições da presente invenção, a ehtropoietina, um fator de crescimento, pode ser adicionada, que influencia as células-tronco de completar a diferenciação terminal nos glóbulos vermelhos. As composições e métodos também podem ser utilizados para expandir populações de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e/ou plaquetas para melhorar, por exemplo, a capacidade de transporte de oxigênio (tal como para atletas), o sistema imunológico (incluindo para o tratamento de indivíduos imuno-comprometidos), e para melhorar a coagulação.
[00167] Em outra modalidade, o cabelo coclear pode ser redesenvolvido utilizando células-tronco embrionárias tratadas com as composições da presente invenção.
[00168] Em outra modalidade, as células-tronco tratadas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para tratar cegueira e deterioração da visão. Em uma modalidade específica, as composições e métodos são utilizados para tratar a laceração da córnea.
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65/102 [00169] Em outra modalidade, a presente invenção pode ser utilizada no contexto de aumentar o sucesso de transplantes de tecidos, incluindo o transplante de células beta pancreáticas produtoras de insulina. Estas células podem ser preparadas a partir de, por exemplo, células-tronco embrionárias que foram motivadas a diferenciar nas células beta. Estas células podem ser tratadas in vivo ou ex vivo com as composições da presente invenção.
[00170] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma ferida e/ou promoção da cicatrização de feridas em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma ferida em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição descrita nesta invenção. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma ferida ou queimadura em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratamento de uma queimadura em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a ferida é uma ferida de espessura parcial ou de espessura total. Em certas modalidades, a queimadura é uma quemadura de espessura parcial ou de espessura total.
[00171] A presente invenção também pode ser utilizada no contexto de cicatrização de feridas. Em um adulto, o tecido ferido é mais frequentemente substituído por tecido de cicatrização, que é caracterizada por uma estrutura de colágeno desorganizada, perda de folículos capilares e estrutura vascular irregular. Em uma modalidade, as sementes de células-tronco são colocadas dentro de um leito de tecido
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66/102 em um leito de ferida e permite que as células-tronco estimulem a diferenciação nas células do leito de tecido. Este método pode ser grandemente intensificado através do contato da ferida, com ou sem a adição de células-tronco, com a composição da presente invenção. Em certas modalidades, a composição é aplicada na pele. Em certas modalidades, a composição é aplicada nas células-tronco e/ou células progenitoras.
[00172] Em outras modalidades, a composição e métodos aqui descritos são úteis para aplicações cosméticas onde, por exemplo, o rejuvenescimento das várias camadas da pele e/ou dos tecidos subjacentes é desejado. Este rejuvenescimento pode ser auxiliado, por exemplo, pela sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento acentuado das células-tronco e/ou células progenitoras. Este rejuvenescimento pode ser auxiliado, por exemplo, pelo tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, feridas, condições da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), função de barreira da mucosa e/ou danos à mucosa Gl.
[00173] Nesta modalidade, os métodos da presente invenção geralmente incluem a etapa de aplicação tópica das composições à pele (por exemplo, epiderme) do paciente que necessita de tal tratamento, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de tal composição é aplicada. Em uma modalidade, a composição é aplicada na face.
[00174] Vantajosamente, a presente invenção fornece composições e métodos que combatem o envelhecimento da pele, em que o combate ao envelhecimento da pele pode incluir, por exemplo, o tratamento da aparência das rugas, linhas de expressão e outras formas de textura da pele indesejável. Ao apresentar a composição às camadas dérmicas e/ou epidérmicas da pele, a forma, resistência, assim como a
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67/102 função da pele é realçada. Em certas modalidades, a composição e métodos aqui descritos são úteis para aplicações de beleza onde, por exemplo, o rejuvenescimento das várias camadas da pele e/ou dos tecidos subjacentes é desejável.
[00175] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento e/ou prevenção de uma condição da pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase ou condição relacionada ao envelhecimento da pele) em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a condição da pele é dermatite atópica, psoríase, o envelhecimento da pele, uma condição relacionada ao envelhecimento da pele ou escaras. Em algumas modalidades, a condição da pele é prurido (coceira), psoríase, eczema, queimaduras ou dermatite. Em certas modalidades, a condição da pele é psoríase. Em certas modalidades, a condição da pele é prurido.
[00176] Em certas modalidades, as composições da presente invenção compreendem agentes, além dos aminoácidos, que são úteis em retardar, minimizar ou eliminar o envelhecimento, enrugamento e/ou outras alterações histológicas da pele tipicamente associadas com as condições intrínsecas (tais como envelhecimento, menopausa, acne, etc.) e condições extrínsecas (tais como poluição ambiental, vento, calor, luz solar, radiação, baixa umidade, surfactantes ríspidos, etc.).
[00177] A presente invenção é útil para melhora terapêutica e/ou profilática das características visíveis e/ou táteis na pele. Por exemplo, em uma modalidade, a extensão, profundidade e/ou outras dimensões das linhas e/ou rugas são diminuídas.
[00178] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio pulmonar em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de
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68/102 uma composição descrita nesta invenção. Em certas modalidades, a composição é administrada sistemicamente ou administrada por meio de inalação. Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para melhorar a função pulmonar, cicatrização pulmonar, a diminuição da pneumonite, diminuição da resistência das vias aéreas e/ou melhorar a função pulmonar em um indivíduo com sua necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição aqui descrita. Em certas modalidades, a condição pulmonar é uma lesão pulmonar, pneumonite, uma condição associada com a resistência das vias aéreas, asma, ou condições inflamatórias do pulmão. Em certas modalidades, a composição é administrada sistemicamente ou administrada por meio de inalação.
[00179] Em uma modalidade, a composição aplicada à pele ou outro tecido pode ainda compreender colágeno e/ou ácido hialurônico (HA). Em uma modalidade, o HA é HA reticulado. A composição pode ainda compreender componentes tais como, mas não limitados a estes, veículos dermatologicamente aceitáveis, agentes de descamação, agentes anti-acne, agentes antirrugas/agentes anti-atrofia, compostos de vitamina B3, retinóides, ácidos de hidroxila, antioxidantes/depuradores de radicais, quelantes, flavonóides, agentes antiinflamatórios, agentes anticelulite, anestésicos tópicos, agentes de bronzeamento, agentes clareadores da pele, agentes suavizadores da pele e agentes de cicatrização da pele, agentes antimicroblanos e antifúngicos, agentes de filtro solar, agentes condicionadores, agentes estruturantes, agente espessante (incluindo espessantes e agentes de formação de gel), preparação de composição e conservantes. A este respeito, a publicação do pedido PCT internacional, WO 2008/089408, é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00180] A composição da presente invenção também pode ser administrada em um local cirúrgico, incluindo em um local de cirurgia miPetição 870190039092, de 25/04/2019, pág. 98/150
69/102 nimamente invasiva, para melhorar a cicatrização e o resultado cirúrgico.
[00181] As células-tronco também podem ser utilizadas, de acordo com a presente invenção, para tratar infertilidade. Em certas modalidades, uma pessoa é em primeiro lugar diagnosticada com uma condição para a qual a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento celular seria benéfico. Por exemplo, o indivíduo pode ser diagnosticado com a condição e a composição do presente pedido é então administrada através de uma via, e em uma quantidade que resulta na sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento das células-tronco. De preferência, tal administração resulta então no tratamento (por exemplo, uma melhora) da condição.
Uso da Composição para Promover a ProHferação e/ou Desenvolvimento de Células-tronco e/ou Progenitoras, e para Tratar uma Doença ou Condição Relacionada com a Função de Barreira da Mucosa, Condições da Pele, Distúrbios Pulmonares, Melhora da Função de Barreira da Mucosa e Danos à Mucosa GI [00182] São aqui descritas as utilizações de composições de aminoácidos para o tratamento de distúrbios GI, pulmonares e da pele. Nas modalidades específicas, a composição da invenção pode ser utilizada para induzir a proliferação de células epiteliais intestinais resultando no aumento da altura das vilosidades, em que as vilosidades são compreendidas de células epiteliais diferenciadas maduras que levam à absorção aumentada de eletrólitos e nutrientes. Em uma modalidade, a composição de acordo com a presente invenção estimula a proliferação e diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras conforme evidenciado pelo aumento dos níveis de expressão de NHE3 e SGLT1 na membrana de borda em escova. A composição, portanto, aumenta a altura da vilosidade e, além disso, aumenta a expressão de transportadores chaves para a absorção de eletrólitos e
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70/102 nutrientes.
[00183] Assim, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar as lesões gastrointestinais associadas com a perda de células epiteliais do intestino delgado, particularmente na região das vilosidades e na borda em escova, e/ou para tratar ou melhorar as doenças ou condições associadas com a alteração da capacidade de absorção no intestino delgado através da promoção da diferenciação ou proliferação de célulastronco. Estas células-tronco situadas na parte inferior das criptas intestinais, incluindo as células de ciclagem rápida (CBCs) e as células mais quiescentes +4 acima das células de Paneth em mamíferos.
[00184] A presente invenção fornece ainda métodos para o tratamento ou melhora de doenças ou condições associadas com a perda de células epiteliais do intestino delgado, particularmente na região das viílosidades e na borda em escova, e doenças ou condições associadas com a alteração da função da proteína de transporte no epitélio do intestino delgado através da promoção da diferenciação e proliferação de células-tronco. O método compreende administrar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento, uma quantidade eficaz da composição da presente invenção. Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, por exemplo, cicatrização de feridas, tratamento de condições de pele (por exemplo, dermatite atópica, psoríase, escaras ou condição relacionada ao envelhecimento da pele), tratamento de distúrbios pulmonares (por exemplo, asma), uma condição relacionada à melhoria da função de barreira da mucosa, e/ou tratamento de lesões à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade.
Formuhções e Kits [00185] A presente invenção fornece composições terapêuticas ou
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71/102 farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição em questão e, opcionalmente, um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção fornece composições terapêuticas, farmacêuticas, cosméticas ou nutricionais que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição em questão e, opcionalmente, um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos, tais como água. A composição terapêutica também pode compreender excipientes, adjuvantes, agentes aromatizantes, etc., que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações que podem ser farmaceuticamente utilizadas. A formulação apropriada depende da via de administração escolhida. Em uma modalidade, a composição terapêutica e todos os ingredientes ali contidos são estéreis. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição terapêutica, juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer a forma para a administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar à modalidade entérica de administração.
[00186] Em uma modalidade, a administração da composição pode ser sistêmica. Os modos de administração oral, intravenosa, intraarterial, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intraventricular, intranasal, transmucosal, subcutânea, tópica, retal, e outros são todos contemplados.
[00187] Em uma modalidade, para a injeção, o ingrediente ativo pode ser formulado em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis. Para administração transmucosal, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica. Para administração oral, o ingrediente ativo pode ser combinado com
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72/102 veículos adequados para inclusão em comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares. As formulações também podem ser preparadas para uso em terapia de inalação. Para administração por inalação, a composição pode ser liberada na forma de uma apresentação de pulverização aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado. A composição também pode ser administrada por meio de inalação ou outra via como um pó.
[00188] Doses terapeuticamente efetivas da composição presentemente descrita podem ser determinadas por uma pessoa de habilidade na técnica, com um objetivo de alcançar um número desejado de células-tronco e/ou células precursoras. Um aumento no número de células-tronco e células precursoras pode ser avaliado utilizando marcadores dessas células, ou pela determinação de um aumento no número de progênies diferenciadas destas células. Métodos para medir os números aumentados de células diferenciadas são conhecidos na técnica. Por exemplo, imunohistoquímica, avaliações comportamentais ou técnicas eletrofisiológicas também podem ser utilizadas. Uma pessoa de habilidade na técnica pode facilmente detectar um aumento no número de células de um fenótipo específico.
[00189] Nas modalidades particulares, os métodos de acordo com a presente invenção incluem a administração da composição terapêutica por sistemas de libertação prolongada. Exemplos adequados de sistemas de liberação prolongada incluem materiais poliméricos adequados (tais como, matrizes polimérlcas semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas, ou microcápsulas), materiais hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, e derivados moderadamente solúveis (tais como, por exemplo, um sal moderadamente solúvel). As composições de libertação prolongada podem ser administradas por
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73/102 via oral, por via parenteral, por via intracisternal, por via intraperitoneal, por via tópica (como através de pós, unguentos, géis, gotas ou emplastro transdérmico), ou como uma pulverização oral ou nasal. As matrizes de liberação prolongada incluem polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etilL-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983, poly(2hydroxyethyl methacrylate)); (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982, ethylene vinyl acetate (Langer et al., Id.) or poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 133,988).
[00190] Em uma modalidade, os dispositivos de infusão de fármacos implantáveis podem ser utilizados para abastecer pacientes com uma dosagem ou infusão constante e de longo prazo de uma composição terapêutica. Tal dispositivo pode ser categorizado como ativo ou passivo.
[00191] Em uma modalidade, os polímeros podem ser utilizados para liberação controlada por íons. Várias matrizes pollméricas degradáveis e não degradáveis para uso na distribuição controlada de fármaco são conhecidas na técnica (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537, 1993). Por exemplo, o copolímero em bloco, polaxâmero 407, hidroxiapatita e lipossomas.
[00192] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada isoladamente ou em combinação com um ou mais fármacos conhecidos de serem eficazes para o tratamento de doenças. As composições também podem ser formuladas em combinação com pelo menos um outro agente, tal como compostos estabilizantes ou tampão, que pode ser administrado em qualquer veículo farmacêutico estéril biocompatível, incluindo, mas não limitado a solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. Além dos componentes críticos das composições aqui debatidas, as células ou fatores influencia
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74/102 dores, as composições podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A composição pode ser preparada como uma forma de dosagem única utilizando um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável ou pode estar contida em um recipiente de múltiplas dosagens.
[00193] Em uma modalidade, a composição pode ainda conter outros agentes de indução da proliferação e/ou diferenciação. O agente de indução da proliferação ou diferenciação pode ser qualquer um conhecido como um agente de indução da proliferação ou diferenciação. Exemplos incluem fator de crescimento de flbroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e ácido retinóico.
[00194] A composição pode conter ainda outros aditivos comumente utilizados tais como um antioxidante, um tampão, um bacteriostato, etc., e pode ser formulada em uma formulação injetável tal como uma solução aquosa, suspensão, emulsão, etc., uma pílula, uma cápsula, um grânulo, um tablete, etc., através de outra adição de um diluente, um dispersante, um surfactante, um aglutinante, um lubrificante, etc.
[00195] Uma composição alimentícia da presente invenção pode estar contida em um alimento funcional de saúde.
[00196] O alimento funcional de saúde da presente invenção pode ser preparado de acordo com um método comumente empregado na técnica, e as matérias-primas e ingredientes comumente utilizados podem ser adicionados quando se prepara o alimento funcional de saúde.
[00197] Quando a composição da presente invenção é incluída em um alimento funcional de saúde, a composição pode ser adicionada isoladamente ou conjuntamente com outro alimento funcional de saúde ou outro ingrediente alimentício, conforme os métodos comumente
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75/102 empregados. A quantidade do ingrediente ativo pode ser determinada apropriadamente dependendo do propósito de uso (por exemplo, prevenção, melhora da saúde ou intervenção terapêutica). A composição alimentícia pode ainda compreender, por exemplo, uma substância pré-biótica ou pró-biótica.
[00198] O tipo de alimento não é limitado. Exemplos do alimento ao qual a composição pode ser adicionada incluem carne, salsicha, pão, chocolate, doce, petiscos, confeitos, pizza, lámen, outros macarrões, goma, produtos lácteos incluindo sorvete, sopa, bebida, chá, drinque, bebida alcoólica, complexo de vitaminas, etc.
[00199] Também incluídos pela presente invenção são os kits (por exemplo, embalagens farmacêuticas, terapêuticas, cosméticas ou nutricionais). Os kits fornecidos podem compreender uma composição ou composto farmacêutico aqui descrito e um recipiente (por exemplo, um frasco, ampola, garrafa, seringa e/ou embalagem distribuidora, ou outro recipiente adequado). Em algumas modalidades, os kits fornecidos podem incluir ainda opcionalmente um segundo recipiente compreendendo um excipiente farmacêutico para diluição ou suspensão de uma composição ou composto farmacêutico descrito nesta invenção. Em algumas modalidades, a composição ou composto farmacêutico aqui descrito fornecido no primeiro recipiente e no segundo recipiente é combinado para formar uma forma de dosagem unitária.
[00200] Assim, em um aspecto, são fornecidos kits incluindo um primeiro recipiente que compreende uma composição descrita nesta invenção. Em certas modalidades, os kits são úteis para o tratamento de um distúrbio (por exemplo, distúrbios GI, pulmonares e da pele) em um indivíduo com sua necessidade. Em certas modalidades, os kits são úteis para a prevenção de um distúrbio (por exemplo, distúrbios GI, pulmonares e da pele) em um indivíduo com sua necessidade.
[00201] Em certas modalidades, um kit descrito nesta invenção in
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76/102 cIuí ainda instruções para o uso da composição incluída no kit. Um kit aqui descrito também pode incluir informação como requerida por uma agência reguladora tal como a U.S. Food and Drug Administration (FDA). Em certas modalidades, a informação incluída nos kits é a informação de prescrição. Em certas modalidades, os kits e instruções fornecem o tratamento e/ou a prevenção de um distúrbio (por exemplo, distúrbios Gl, pulmonares e da pele) em um indivíduo com sua necessidade. Um kit aqui descrito pode incluir um ou mais agentes farmacêuticos adicionais ou outros aqui descritos como uma composição separada.
Métodos de Administração [00202] Em uma modalidade, a presente invenção envolve a administração da composição de acordo com a presente invenção a um indivíduo e administração adicional de células-tronco e/ou progenltoras ao indivíduo. A composição é administrada em um local no referido Indivíduo de modo a permitir o contato com as células. Este pode estar no mesmo local, próximo ao local ou distante do local de onde as células-tronco são administradas.
[00203] As células-tronco e/ou progenltoras podem ser administradas, por exemplo, através de injeção de uma ou uma pluralidade de células com uma seringa, inserção das células-tronco com um cateter ou implantação cirúrgica das células-tronco. Em certas modalidades, as células-tronco são administradas em uma cavidade corporal conectada de modo fluido a um tecido alvo. Em certas modalidades preferidas, a cavidade corporal é um ventrículo cerebral. Em outras modalidades, as células são inseridas utilizando uma seringa ou cateter, ou implantadas de modo cirúrgico diretamente no sítio do tecido alvo. Em outras modalidades, as células-tronco e/ou progenltoras são administradas por via parenteral. A administração parenteral é definida como administração através de uma via que se desvia do trato gastrintesti
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77/102 nal. A administração parenteral incluí administração intraventricular. [00204] Geralmente, as composições podem ser administradas por qualquer um de um número de vias incluindo, mas não limitadas a estas, vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual ou retal. Os fatores podem ser administrados no mesmo local que as células-tronco administradas. A administração de fatores influenciadores e células-tronco pode ser conduzida simultaneamente, ou uma antes da outra, e em localizações iguais ou diferentes, contanto que as localizações relativas e a escolha do momento levem em conta os fatores que influenciam as célulastronco e/ou progenitoras.
[00205] Por exemplo, através do uso de consistindo essencialmente de”, a composição terapêutica não contém quaisquer ingredientes não especificados incluindo, mas não limitado a aminoácidos livres, di, oligo-, ou polipeptídeos ou proteínas; e mono-, dl-, oligo-, polissacarídeos, e carboidratos que possuem um efeito terapêutico direto benéfico ou adverso sobre a promoção do desenvolvimento de célulastronco. Da mesma forma, através do uso do termo consistindo essencialmente de, a composição pode compreender substâncias que não possuem efeitos terapêuticos sobre a promoção do desenvolvimento de células-tronco; tais ingredientes incluem veículos, excipientes, adjuvantes, aromatizantes, etc. que não afetam a promoção e/ou desenvolvimento de células-tronco.
[00206] Deve ficar entendido que os exemplos e as modalidades aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz disso serão sugeridas para as pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido.
EXEMPLOS
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Materiais e Métodos [00207] Modelo Animal· Camundongos NIH Swiss de oito semanas de idade machos foram alimentados com uma dieta normal e alojados em 4 camundongos por gaiola. Os camundongos foram irradiados usando um Gammacell 40 Exactor LowDose Research Irradiator (Best Theratronics, Ottawa, Ontario) que aloja duas fontes de césio137 em uma geometria paralela e oposta para liberar irradiação isotrópica com uma uniformidade de dose dentro de ± 3%. Os camundongos receberam uma única fração de TBI em uma taxa de dose de 0,9 Gy/minuto. Os camundongos foram presos no meio da câmara de irradiação com uma guia de plástico que permitiu 5 camundongos serem irradiados simultaneamente. Os camundongos tratados com a formulação receberam AA-ORS através da gavagem gástrica uma vez por dia (0,3 ml/camundongo). Os grupos de controle receberam solução salina normal. A formulação de aminoácidos foi dada como uma terapia de suporte e não era parte da terapia de substituição. Os camundongos jejuaram durante 8 horas antes da gavagem. Os animais foram submetidos à eutanásia humanamente através de inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical (pelas AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals) 6 dias após a irradiação quando a secreção de ânion máxima ocorre. A toxicidade foi predominantemente devido à sindrome Gl aguda e apenas minimamente perturbada pela sindrome da medula óssea. 18 Após a retirada de sangue, a mucosa ileal foi obtida conforme descrito anteriormente. 1820 Todos os experimentos foram aprovados pela University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e realizados de acordo com 0 protocolo IACUC #3875.
[00208] Medições de contagem de cripta e comprimento da vilosidade: Cortes de parafina (5 μΙ) foram obtidos de segmentos intestinais orientados de modo que as seções fossem cortadas perpendicu
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79/102 lares ao longo eixo do intestino. As criptas por circunferência foram contadas, e o comprimento da viiosidade foi medido de 10 seções obtidas a partir do íleo. Para a determinação dos parâmetros da curva de sobrevivência celular, as contagens de cripta foram normalizadas e analisadas utilizando o método clássico.21 O tratamento com AA-ORS foi dado durante um período de 6 dias. Solução salina normal foi utilizada como um controle.
[00209] Ensaio de proliferação celular e migração de cripta para viiosidade: A incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU, um análogo de timidina) em DNA celular e a reação subsequente da EdU com uma azida fluorescente em uma reação catalisada por cobre foi utilizada para estudar a proliferação celular na região de células da cripta. Camundongos foram injetados com 0,5 mg de EdU em 150 ml de PBS (16. 7 mg/kg) para avaliar a atividade mitótica nas células da cripta (estes estudos revelam a fase S nas criptas) e submetidos a eutanásia em 24, 48 e 72 horas após a injeção. As seções de parafina do íleo do camundongo foram preparadas, e a Edu incorporada (Thermo Fisher Scientific catalog #A1 0044) foi visualizada seguindo as instruções do fabricante (kit de formação de imagem Alexa 647, catálogo #C 10340). As seções foram então montadas em meio de montagem fluorescente com DAPI (VectaShield, Cat#H- 1200). As células foram classificadas por toda a unidade de cripta e viiosidade. Pelo menos 60 criptas e vilosidades correspondentes foram analisadas por camundongo. As células marcadas com EdU foram normalizadas para o número total de células por cripta ou viiosidade. Os enterócitos positivamente corados são mostrados migrando da base da cripta para a ponta da viiosidade.
[00210] Estudos d@ fluxo para absorção d@ sódio e cloreto: Lâminas de íleo descascadas foram montadas entre duas metades de uma câmara Ussing com 0,3 cm2 de área de superfície exposta (P2304, Physiologic Instruments, San Diego, CA, USA). A solução de
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Ringer continha (mmol.-1) Na+140, Cl’ 119,8, K+ 5,2, HPO4· 2,4, H2PO4· 0,4, Mg2+ 1,2, Ca2+1,2 e HCOs'25, foi borbulhada com 95% 0 2 e 5% de CO2 bilateralmente, e foi mantida a 37°C. Depois que os tecidos foram deixados estabilizar durante 45 minutos, a corrente de curto circuito basal (lsc), expressa como peqh’1-cm’2, e a condutância (G), expressa como mS.cnr2, foram registradas utilizando um dispositivo de fixação de tensão/corrente controlado por computador (VCC MC-8, Physiologic Instruments), como anteriormente descrito.18,20 Para estudos de fluxo, radioisótopos de sódio (22Na) e cloreto (3SCI) foram utilizados para estudar os fluxos de sódio e cloreto através da mucosa ileal, como anteriormente descrito. 182022 A atividade de Na foi medida utilizando um contador gama (Wizard 2, 2480 Automatic Gamma Counter, Perkin Elmer, USA), enquanto que 36CI foi medido utilizando um citilômetro líquido (LS 6500 Multipurpose Scintillation Counter, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA).
[00211] Reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa em tempo real: 0 RNA das amostras de tecido intestinal de camundongos não Irradiados e irradiados (0 Gy, 5 Gy e 7 Gy) foi extraído utilizando ο método TRIZOL. O c-DNA foi preparado com kit de c-DNA (iScript™ Select cDNA Synthesis Kit, Bio-Rad, Hercules, CA); a PCR semiquantitativa e em tempo real foi executada utilizando inlciadores de oligonucleotídeo específicos para caspase3, Lgr5, sgltl e BMI1.0 c-DNA (2 pm) foi adicionado a 25 μΙ de mistura de PCR para a PCR semiquantitativa, e 20 pi de mistura verde SyBr foram adicionados para a PCR quantitativa; 30 ciclos de PCR (ou mais conforme indicado em Resultados) foram realizados utilizando um Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para a PCR semiquantitativa e um CFX Connect Real-time System Cycler (Bio-Rad) para a PCR em tempo real. Um ciclo consistia de 30 seg a 94 °C para desnaturação, 60 seg para recozimento e 90 seg a 72 °C para extensão. Amplicons fo
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81/102 ram separados por eletroforese em gel de agarose e detectados pela coloração com brometo de etídio. CFX Manager™ Software (Bio-Rad) fol utilizado para análise em tempo real. A padronização utilizaou o método delta-delta Ct (DDCt). Resumidamente, DCt = Ct (gene alvo tratado) - Ct (gene ref tratado) e DCt = Ct (gene alvo controle) - Ct (gene ref controle). Portanto, DDCt = DCt (tratado)-Ct (controle). A alteração dobrada foi calculada a partir da fórmula 2(_DDQ).
[00212] Western Blot: Usado celular total de camundongos não irradiados e irradiados tratados com AA-ORS ou tratados com solução salina foi preparado em tampão RIPA gelado [50 mmol/L Tris-HCI (pH 7,4), 150 mmol/L Nad, 1% IGEP AL, 1 mmol/L EDTA, 0,25% desoxicolato de sódio, 1 mmol/L fluoreto de sódio, 1 mmol/L ortovanadato de sódio, 0,5 mmol/L PMSF, 10 pg/ml aprotinina, 10 pg/ml leupeptina]. A concentração de proteína em cada extrato foi determinada por ensaio de BCA (Sigma, St Louis, MO). Os extratos celulares foram submetidos à eletroforese de gel poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE); as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e experimentadas com anticorpos primários que detectam Lgr5, SGL TI, Bmi 1, caspase 3, p-ERK e ERK total. Os sinais foram detectados com Odissey CLX de U-COR. Coloração de Ponesau S reversível (Cat # 786-575, G Biosciences) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante, para verificar a carga igual de géis. A abundância da proteína de interesse foi normalizada com a quantidade total de proteína em cada pista. Esta técnica minimiza as variações associadas com a comparação da densidade de proteína em uma única proteína.
[00213] Identificação imunohistoquímica das proteínas nucleares PCNA e Ki-67 e da proteína de membrana específica da célula-tronco Lgr5 foi executada utilizando anticorpos anti-camundongo de coelho policlonal GAPCR (Lgr5) (Abeam Cat# ab75732), Ki-67 (Abeam Cat#
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82/102 ab!5580) e PCNA (Abeam Cat# ab18197). Um kit de detecção ABC específico de coeiho (Abeam Cat# ab64261) foi utilizado para visualizar a expressão da proteína de acordo com a instrução do fabricante. Resumidamente, amostras de íleo de espessura total fixadas com formalina incorpodadas com parafina foram cortadas em cortes transversais de espessura 4 pm, montadas em lâminas de vidro Superfrost PLus desparafinizadas e reidratadas. Para a recuperação de antígenos, pré-tratamento térmico foi aplicado utilizando um fogão de pressão (125°C durante 30 segundos, e 90°C durante 10 segundos) e tampão de recuperação; Deloaker RTU Buffer (Biocare Medical Cat #RV1000MMRTU) em pH 6,0. Após a supressão de peroxidase endógena e bloqueio de ligações não específicas, as seções foram Incubadas com anticorpo primário diluído em PBS (Lgr5 - 1: 100, Ki-67 - 1: 1000, PCNA-1: 4000, durante 2 horas; 15 min; e 2 horas respectivamente na temperatura ambiente). PBS foi utilizado como um controle negativo. Os tecidos foram então incubados com anticorpo secundário anti-coelho de cabra biotinilado durante 10 minutos. Após a incubação com peroxidase de estreptavidlna, a intensidade de coloração desejada foi obtida com Di-amino-benzidina mediante a visualização sob o microscópio. As seções foram contracoradas com hematoxilina de Mayer (Electron Microscopic Sciences (EMS) Cat #26043-05), desidratadas e montadas em meio de montagem Permount (Fisher Scientific Cat #SP15-100). As lâminas foram avaliadas por microscopia de luz utilizando uma objetiva de 20x para PCNA e Ki-67, e uma objetiva de 40x com imersão em óleo para Lgr5. O número de células marrons positivas foi contado a partir de 50 criptas por grupo e analisado.
[00214] Estatísticas: Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média (S.E.M.). A análise estatística foi executada em 2 etapas: 1) a diferença total foi testada utilizando análise de vahância (ANOVA) (ou seu equivalente não paramétrico Kruskal-Wallis); e
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2) os valores P ajustados por Bonferroni foram computados para todas as comparações em pares.
EXEMPLO 1 ~ AA-ORS aumentou a contagem de cripta e o comprimento das vHosidades em tecidos intestinais de camundongos irradiados [00215] Os tecidos intestinais de camundongos irradiados (5 a 15 Gy) tratados com AA-ORS apresentaram um aumento significativo na contagem de criptas por circunferência (N). Visto que as criptas são formadas por unidades regenerativas, estes resultados indicam um número aumentado de células epiteliais progenitoras. Similarmente, o comprimento da vilosidade aumentou significativamente através de todas as doses de radiação com tratamento de AA-ORS quando comparado com o tratamento de solução salina (Fig. 1B). Isto é consistente com proliferação progenltora aumentada e/ou sobrevivência mais longa das células epiteliais antes do descarte natural.
[00216] A curva de sobrevivência da cripta foi modelada utilizando um modelo de sobrevivência celular de múltiplos alvos de impacto único para avaliar o efeito biológico. Sem restringir a sensibilidade da célula constante, os valores N foram 10,4 ± 0,2 e 5,3 ± 0,1 (P < 0,001), o que indica uma duplicação próxima de unidades progenitoras por circunferência a partir de um controle. Quando uma constante Do (4,8 ± 0,1 Gy) foi restrita, a diferença permaneceu significativa em 8,8 ± 0,4 a
6,1 ± 0,3 (P < 0,001). Os valores de dose próximos do limite (Dq), uma medida compósita da tolerância de radiação da cripta, foram de 10,5 ± 0,5 Gy para camundongos tratados com AA-ORS e 8,8 ± 0,4 Gy para camundongos tratados com solução salina (P < 0,01).
[00217] O grupo de AA-ORS, em comparação com o grupo de solução salina, teve um rebaixo amplo na região de baixa dose de radiação, sugerindo um número aumentado de progenitores por circunferência do intestino (menos senescência) (Fig. 1 A).
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84/102 [00218] Como esperado, a parte terminal seguiu uma conexão exponencial. Uma vez que 5 Gy foi a dose de radiação mais baixa na qual um aumento significativo ocorreu tanto na contagem de cripta quanto na altura da vilosidade, todos os estudos subsequentes foram empreendidos em camundongos irradiados 0 e 5 Gy.
[00219] Observou-se que o ganho de peso aumentado e a sobrevivência podem ser secundários para o número de cripta e a altura da vilosidade aumentados que depois aumentou a área superficial de absorção. Foi demonstrado que o número de cripta e a altura da vilosidade aumentaram com o tratamento de AA-ORS começando 6 dias após a irradiação. Utilizando o modelo de impacto único e múltiplos alvos para a sobrevivência da cripta, observou-se que o número de unidades progenitoras de cripta por circunferência ileal (N) aumentou significativamente (P < 0 001) sem uma alteração em Do (4,8 ± 0,1 Gy) (Fig. 1A). Os valores Dq aperfeiçoaram o equivalente a uma tolerância à radiação aumentada de 1,7 Gy com tratamento de AA-ORS, indicando sobrevivência melhorada da de cripta. Os estudos de sobrevivência da cripta sugeriram um aumento nas unidades progenitoras ou céluiastronco por cripta. Assim, o efeito de irradiação e AA-ORS no número de céiulas-tronco foi examinado utilizando anticorpos específicos para marcadores de céiulas-tronco intestinais e migração das células filhas para dentro das vilosidades sem importância para a proliferação através da incorporação de EdU.14’16
EXEMPLO 2 - AA-ORS promove a migração da céltda epheHal intestinal [00220] Cortes do íleo de camundongos irradiados tratados com AA-ORS mostraram uma contagem de cripta aumentada. Com a renovação contínua das células epiteliais da vilosidade, existe também uma migração contínua de células ao longo do eixo da criptavilosidade.23 À Medida que as células se movem ao longo das vilosi
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85/102 dades, as células epiteliais passam por maturação e diferenciação adicionais e depois migram para dentro da ponta das vilosidades onde elas são espalhadas por anoikis (morte celular programada).24 A proliferação celular foi estudada utilizando a incorporação de Edu.
[00221] As células foram observadas de migrar da base da cripta para a ponta da vilosidade em ~72 horas. Os cortes do íleo de camundongos não irradiados mostraram que as células (EdU-incorporadas) alcançaram a ponta da vilosidade em momentos diferentes (75 ± 0,9 horas; n = 10 camundongos) com uma média de 76,5 horas. O tratamento com AA-ORS durante 6 dias não levou a uma diferença significativa no comprimento coberto pelas células migradas entre camundongos irradiados 0 e 5 Gy (153,5 ± 6 mm vs 158,1 ± 7 mm; n = 10 camundongos). No entanto, o tratamento com durante 6 dias levou a uma diferença significativa em camundongos irradiados 5 Gy (158,1 ± 7 mm vs 183,1 ± 4 mm; p < 0,01, n _ 10 camundongos) (Fig. 2A e B). Estes estudos mostram que a AA-ORS aumenta a proliferação e é responsável pelo comprimento coberto.
EXEMPLO 3 - AA-ORS aumentou a absorção de sódio e cloreto [00222] A AA-ORS aumentou a altura da vilosidade e a proliferação na célula da cripta region. Para determinar se a altura da vilosidade aumentada resultou em células epiteliais da vilosidade funcionalmente maduras e diferenciadas, estudos de fluxo de isótopo foram empreendidos para determinar a absorção de sódio e cloreto.
[00223] Camundongos não irradiados tinham uma absorção líquida de sódio (JNetNa) de 1,9 ± 0,6 ueq.cm2.h-1 e uma absorção líquida de cloreto (ÚNetCI) of 1,9 ± 0,4 ueq.cm2.h-1 (Figs. 3A-3B). O íleo de camundongos irradiados 5 Gy tinha uma diminuição em ÚNetNa (1,9 ± 0,6 peq.cm2.h-1 vs 0,1 ± 0,0 peq.cm2.h-1; P< 0,001, n = 8) e ÚNetCI (1,9 + 0,4 peq.cm2.h-1 vs -0,9 ± 0,4 peq.cm2.h-1). O tratamento com AA-ORS levou a um aumento significativo na absorção líquida de sódio no íleo
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86/102 de camundongos 0 Gy (3,9 ± 0,7 ueq.cm2.h-1; p < 0,05, n = 8) e 5 Gy (3,4 ± 0,7 ueq.cm2.h-1; p <0,001, n = 8) (Fig. 3A). Similarmente, o tratamento com AA-ORS levou à absorção aumentada de cloreto no íleo de camundongos 0 Gy (4,1 ± 0,6 ueq.cm2.h-1; p < 0,05, n = 8) e 5 Gy (3,6 ±0,6 ueq.cm2.h-1; p < 0,001, n = 8) (Fig. 3B).
[00224] Estes estudos sugerem que o aumento induzido por AAORS nas alturas das vilosidades é funcional, ao se mostrar que a capacidade de absorção de eletrólito e a absorção de glicose acoplada ao sódio são aumentadas, que é uma função das células epiteliais da viiosidade maduras e diferenciadas.
[00225] Imunohistoquímica para a proteína NHE3 mostrou o reconhecimento de anticorpos NHE3 ao longo da região de borda em escova de células epiteliais da viiosidade (Fig. 3C). As células da viiosidade de animais irradiados com 5 Gy mostraram pouca ou nenhuma expressão ao longo da membrana de borda em escova. Tratamento com AA-ORS aumentou a expressão de proteína NHE ao longo da região de borda nas células epiteliais de camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy (Fig. 3C). A análise de Western blot mostrou expressão aumentada de proteína NHE3 nos tecidos intestinais de camundongos tratados com AA-ORS irradiados em 0 Gy (3,5 vezes) e 5 Gy (15,5 vezes) em comparação com camundongos irradiados tratados com solução salina (Fig. 3D-3E). Estes estudos sugerem um aumento na proteína NHE3 na membrana de borda em escova das células epiteliais da viiosidade. Para determinar se o aumento na proteína NHE3 resultou de um aumento no mRNA de NHE3, seus níveis nos tecidos intestinais foram determinados utilizando a qPCR (Flg.133F). Ao contrário dos níveis de proteína NHE3, os níveis de mRNA de NHE3 foram apenas significativamente diferentes em 5 Gy quando comparado com camundongos irradiados 5 Gy tratados com solução salina. Os níveis de proteína não se correlacionam bem com as mudanças nos níveis de
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87/102 mRNA de NHE3 e observação semelhante foi relatada anteriormente. EXEMPLO 4 - AA-ORS aumentou a absorção de sódio estimulada por glicose [00226] A glicose estimula a absorção de sódio através de um transportador específico localizado na membrana apical de células epiteliais maduras e diferenciadas localizada na vllosidade. Para determinar se o aumento induzido por AA-ORS na altura da vllosidade resultou em absorção melhorada da glicose, a absorção de sódio estimulada por glicose utilizando estudos de fluxo de 22Na foi avaliada.
[00227] Tecidos ileais de camundongos Irradiados 5 Gy apresentaram uma redução significativa na absorção de sódio estimulada por glicose (4,8 ± 0,5 ueq.cm2.h-1 vs 0,3 ± 0,1 ueq.cm2.h-1; p < 0,001, n = 6). Tecidos ileais de camundongos irradiados 5Gy tratados com AAORS apresentaram um aumento significativo na absorção de sódio estimulada por glicose (0,3 ± 0,1 ueq.cm2.h-1 vs 3,1 ± 0,3 ueq.cm2.h-1; p < 0,001, n = 6), enquanto que os camundongos irradiados 0 Gy não apresentaram este aumento (4,8 ± 0,5 ueq.cm2.h-1 vs 5,9 ± 0,7 ueq.cm2.h-1; p = ns, n = 6) (Fig. 4A). Tratamento com AA-ORS aumentou a expressão de SGLT1 nos níveis de transcrição e translação em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy em comparação com camundongos tratados com solução salina (Figs. 4B a 4D). Estes estudos sugerem que o aumento induzido por AA-ORS nas alturas das vllosidades é funcional, mostrando que a capacidade de absorção do eletrólito durante a fase inter-digestiva (absorção de Na+ mediada por NHE3) e a fase digestiva (absorção de Na+ estimulada por glicose) é aumentada, ambas as quais são uma função das células epiteliais vil· losas maduras e diferenciadas.
[00228] Níveis de beta-galactosidase (proteína da lactose) foram medidos nas células vilosas isoladas utilizando a análise de Western blot. Principalmente, a expressão de beta-galactosidase ocorre nas
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88/102 células epiteliaís vilosas maduras e diferenciadas. O tratamento com AA-ORS aumentou os níveis de proteína beta-galactosidase nas células vilosas em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy (Fig. 4B).
EXEMPLO 5 - Efeito da AA-ORS nas células-tronco intestinal e marcadores de proliferação [00229] Pelo menos três tipos distintos de células da cripta são postulados para representar as células-tronco intestinais (ISC). 14 Cada elemento da população possui cinética de proliferação distinta e sensibilidades à radiação; portanto, considera-se que cada um sirva a uma função única. Eles são supostos de comutar dinamicamente de um tipo para o outro em resposta aos sinais inibidores e estimuladores provocados por cltocinas, hormônios ou fatores de crescimento.29 Em contraste, as células-tronco epiteliaís intestinais de ciclagem lenta (IESC) [células retentoras de marcação (LRC)] na posição da cripta +4 contribuem com a capacidade regenerativa homeostática, particularmente durante a recuperação da lesão. Estas LRC expressam vários marcadores, tais como BMI1, HOPX, LRIG1 e/ou DCLK1, e podem mudar para lESCs de ciclagem rápida em resposta à lesão. 31 Lgr5 pode marcar ambas as células, enquanto que Bmi1 e HopX foram relatados de preferencialmente marcar células +4.14 ISC Lgr5+ são necessárias para a regeneração intestinal após a lesão por radiação. 32 Acredita-se que Lgr5' e BMI1 sejam células de reserva que montam a resposta regenerativa após lesão ou dano induzido por radiação. Estudos demonstraram que a perda de células Lgr5+ é tolerada devido à ativação do pool de células-tronco de expressão de BMI1.14 32 [00230] Para determinar se um aumento no número de célulastronco e proliferação foi responsável pela maior altura das vilosidades observada com AA-ORS, o efeito da AA-ORS nos marcadores para células-tronco e proliferação foi estudado.
[00231] A irradiação resultou em uma diminuição significativa nos
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89/102 níveis de proteína Lgr5 (Fig. 5A). A AA-ORS aumentou os níveis de proteína de Lgr5 de em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy quando comparados com grupos de controle tratados com solução salina. No entanto, tecidos intestinais de camundongos irradiados 5 Gy não mostraram nenhuma alteração significativa nos níveis de proteína BMI1 quando comparados com 0 Gy. Similarmente, A AA-ORS não efetuou uma alteração nos níveis de proteína BMI1 em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy (Fig. 5A). Níveis de transcrito de Lgr5, mas não níveis de BMI1. significativamente aumentaram em camundongos 0 Gy e 5 Gy tratados com AA-ORS (Figs. 5C a 5D).
[00232] Observou-se que 5 Gy resultou em uma diminuição significativa na transcrição de Lgr5 e nos níveis de proteína sem muita alteração nos níveis de Bmi1 quando comparado com 0 Gy. Um aumento significativo nos níveis de mRNA de Lgr5 e proteína sem muita alteração em Bmi1 com tratamento de AA-ORS foi observado, sugerindo um aumento nas células-tronco de Lgr5-positivas. Estes resultados também mostraram que o comprimento coberto pelas células de migração foi significativamente maior nos cortes intestinais de camundongos irradiados tratados com AA-ORS quando comparados com camundongos tratados com solução salina. Visto que a transcrição é interrompida nas células que passam por apoptose, é plausível que a sobrevivência celular aumentada preferencialmente eleva os transcritos de vida curta, tais como Lgr5, sobre os transcritos de vida longa. Os níveis de proteína BMI1 em tecidos intestinais não mudaram em resposta à radiação ou AA-ORS, sugerindo assim que as populações de reserva de ISC não são afetadas na dose de radiação estudada. Também, o aumento nos níveis de proteína Lgr5 com AA-ORS sustenta estas observações no estudo de contagem de cripta em que o tratamento com AA-ORS após doses crescentes de radiação, quando ajustadas em um modelo de múltiplos alvos de impacto único, leva a um
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90/102 aumento no número de ISC.
[00233] A análise de Western blot de ERK1/2 e pERK1/2 foi estudada utilizando a fração de células inteiras para avaliar o efeito de radiação e AA-ORS sobre a proliferação. Para determinar os níveis de transcrito de ERK e AKT, os estudos de qPCR foram empreendidos em células epiteliais isoladas de tecidos irradiados 0 Gy e 5 Gy, ambos na ausência e na presença de tratamento. ERK1/2 e AKT são fosforilados quando ativados. A análise de Western blot mostrou uma diferença significativa nos níveis de proteína p-ERK em 0 Gy e 5 Gy (Fíg. 5A). Os níveis totais de proteína ERK não foram significativamente diferentes nos camundongos tratados com AA-ORS e tratados com solução salina em 0 Gy ou 5 Gy. Similarmente, com ERK, camundongos 0 e 5 Gy tratados com AA-ORS não apresentaram diferenças significativas nos níveis de AKT, enquanto que eles apresentaram um aumento nos níveis de proteína p-AKT quando comparados com os grupos irradiados tratados com solução salina correspondentes. Tecidos intestinais de camundongos 5 Gy mostraram uma diminuição significativa em p-AKT quando comparados com camundongos 0 Gy.
[00234] Estes estudos sugerem um maior nível de fosforilação da proteína com tratamento de AA-ORS sem uma alteração na expressão total da proteína. Visto que o efeito de MARK é dependente do seu efetor a jusante, o fator de transcrição de ativação 4 (Atf4), os níveis de proteína de Atf4 foram medidos utilizando a análise de western blot. A irradiação 5 Gy reduziu os níveis de proteína de Atf4, mas o tratamento com AA-ORS aumentou os níveis de proteína do Atf4 em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy. O estudo dos níveis de transcrito ERK e AKT utilizando qPCR indicou que a irradiação 5 Gy resultou em uma diminuição significativa nos níveis de mRNA quando comparado com 0 Gy. O tratamento com AA-ORS resultou em um aumento significativo quando comparado com camundongos tratados com solução
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91/102 salina em 0 Gy e 5 Gy (Figs. 5E a 5F). Mudanças precoces na proliferação celular normal dentro do trato intestinal servem como uma indicação do desvio da função gastrointestinal normal. Mudanças na expressão do antigeno nuclear da célula proliferante (PCNA), uma proteína 36 kD é reconhecida como um tal marcador para alterações no intestino. A AA-ORS aumentou os níveis de proteína PCNA em camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy (Fig. 5A).
[00235] O efeito da AA-ORS sobre a proteína do linfoma-2 de célula B (Bcl-2), um alvo a jusante para Erk/2, também foi estudado. O Bcl-2 impede a morte celular em vez de promover a proliferação celular pela regulação dos níveis de expressão da proteína X associada com Bcl-2 pró-apoptótica (Bax) na cascata de caspase intrínseca. Os níveis de Bcl-2 aumentaram com o tratamento de AA-ORS em camundongos 0 gy. A irradiação resultou em aumento significativo nos níveis de proteína de Bcl-2. Tratamento utilizando AA-ORS não mostrou aumento adicional nos níveis de proteína de Bc!2 em camundongos irradiados com 5 Gy (Fig. 5B). Níveis aumentados de proteína de Bcl-2 com irradiação podem sugerir um mecanismo protetor para prevenir apoptose. No entanto, a análise de western blot utilizando anticorpos específicos de Bax não mostrou uma diferença significativa nos níveis de proteína (Fig. 5B). Os estudos concordam com as observações anteriores que as intervenções que direcionam Bcl-2 não necessariamente alteram os níveis de proteína Bax4.
[00236] Visto que a AA-ORS aumentou p-ERK, este estudo sugere que os aminoácidos ajudam a manter o estímulo mitogenico até o final G 1 para a entrada bem sucedida de S-fase.38 [00237] Este estudo mostrou que a radiação aumentou a caspase-3 e que o tratamento com AA-ORS diminuiu a caspase-3 clivada nas células epiteliais vilosas de camundongos 0 Gy e 5 Gy. A pAKT aumentada em camundongos tratados com AA-ORS sugere que sua ação
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92/102 pode ser pela ativação da proliferação ou inibição da apoptose (Fig. 5). Juntamente com os efeitos observados na caspase-3, estes resultados podem explicar o efeito de pró-sobrevivência e a proliferação aumentada observada com o tratamento de AA-ORS. Entretanto, outros estudos serão essenciais para caracterizar os mecanismos pelos quais a AA-ORS ativa ERK1/2 e AKT ou caspase-3.
EXEMPLO 6 - AA-ORS dímmuíu os níveis de transcrito da caspase-3 e caspase-3 clivada [00238] A ativação de caspase-3 resulta na formação de uma caspase-3 clivada 19 kD com. A caspase-3 clivada aumenta com a apoptose. A análise de Western blot não mostrou nenhuma diferença significativa no total de caspase-3 após a irradiação e com tratamento quando comparado com o controle. Tecidos intestinais de camundongos 5 Gy mostraram um aumento significativo na caspase-3 clivada quando comparado com os tecidos dos camundongos 0 Gy. No entanto, a capase-3 clivada diminuiu com AA-ORS quando comparada com os controles de irradiação correspondentes (Fig. 5B). Níveis de mRNA de caspase 3 medidos utilizando qPCR apresentaram um aumento significativo nos níveis de transcrito de caspase-3 após a irradiação de 5 Gy quando comparado com 0 Gy. O tratamento utilizando AA-ORS resultou em uma diminuição significativa nos níveis de transcrito de caspase-3 nos tecidos intestinais de camundongos irradiados 0 Gy e 5 Gy (Fig. 5G).
[00239] Juntamente com Lgr5, p-ERK e p-AKT, as mudanças na caspase-3 clivada sugerem que a AA-ORS aumentou a altura da vilosidade nos tecidos intestinais de camundongos não irradiados e irradiados não apenas através da proliferação, mas também através de apoptose diminuída e sobrevivência celular aumentada.
[00240] Para avaliar se as células epiteliais viliosas resultantes da proliferação aumentada e/ou apoptose diminuída estão maduras, dife
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93/102 rendados e são funcionalmente ativas, a capacidade de absorção de sódio e a absorção de sódio estimulada por glicose foram medidas. Tanto NHE3, o transportador predominante de absorção de sódio no intestino delgado, quanto SGLT1, o transportador para absorção de sódio acoplada a sódio, ocorre apenas em células vilosas maduras e diferenciadas e mostrou ter níveis aumentados de função (Figs. 3A a 3F e 4A a 4D), mRNA e proteína. Estes estudos sugeriram, portanto, que o tratamento com AA-ORS após a radiação aumentou a absorção de eletrólito e glicose (Fig. 5A a 5G).
EXEMPLO 7 - AnáHse de Western bllot de p53 tota^ [00241] A p53 é uma proteína supressora de tumor e sua atividade interrompe a formação de tumores. Mutações no gene supressor de tumor de p53 são as lesões genéticas mais frequentemente observadas em cânceres humanos. Os camundongos homozigotos para o aleIo nulo parecem normais, mas são propensos ao desenvolvimento espontâneo de uma variedade de tumores. A p53 mostrou-se desempenhar um papel importante na resposta da irradiação. O nível de acúmulo de p53 em resposta à irradiação é principalmente resultante da intensidade de dano ao DNA. Foi demonstrado que a perda de célulastronco desempenha um papel importante na lesão intestinal aguda induzida por radiação e letalidade, e é regulada pela via p53 e seus alvos transcricionais PUMA e p21. Apoptose dependente de PUMA rapidamente reduz as ISCs e seus progenitores em horas após a radiação de alta dose, e a deficiência de PUMA leva à sobrevivência animal melhorada e regeneração da cripta através do aumento do reparo de DNA dependente de p21 e é crucial para danos intestinais induzidos por radiação.
[00242] A análise de Western blot não mostrou nenhuma diferença significativa no nível de p53 (uma proteína supressor de tumor) nos tecidos intestinais de camundongos 0 Gy e 5 Gy. A AA-ORS mostrou
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94/102 um aumento pequeno, mas consistente, nos níveis de proteína p53 (Fig. 5B).
[00243] Estes estudos sugerem que o efeito proiiferativo associado com AA-ORS pode não estar associado com a tu morigênese.
EXEMPLO 8. Imunchistoquímica [00244] O método de detecção de avidina-bíotina que utiiiza um anticorpo policlonal contra Lgr5+, as células-tronco intestinais apresentaram uma diminuição nas céiuias Lgr5+ com radiação (3,0 ± 0,2 vs 1,6 ± 0,2; P < 0,001, n = 50 criptas). O tratamento utilizando AA-ORS não mostrou uma diferença significativa na Lgr5+ em camundongos irradiados com 0 Gy. No entanto, em camundongos irradiados com 5 Gy a AA-ORS aumentou as céiuias Lgr5+ (1,6 ± 0,2 vs 3,4 ± 0,3; P < 0,001, n = 50 criptas) (Figs. 6A-6B).
[00245] A Ki-67 é uma proteína nuciear, marcador ceiuiar para proliferação e está associada com a transcrição de RNA ribossômico. A Ki67 também está presente na céluia durante todas as fases ativas do cicio ceiuiar (Gi, S, G2 e mitose), mas ausente de céiuias iatentes (Go). As seções ileais apresentaram expressão de Ki-67 ao longo da cripta exceto seu pólo inferior e a expressão prolongada na terça parte inferior das vilosidades. Não houve nenhuma diferença significativa na expressão de Ki-67 com radiação, no entanto, 0 tratamento com 0 uso de AA-ORS resultou em aumento significativo nas células expressas com Ki-67 (50,7 ± 1,3 vs 54,6 ± 1,4; P < 0,05, n = 50 criptas) (Figs. 6C-6D).
[00246] A imunomarcação para PCNA nas seções ileais mostrou a sua expressão ao longo da cripta exceto 0 seu pólo inferior. A irradiação resultou em uma diminuição significativa na expressão de PCNA tanto na cripta quanto nas regiões inferiores das vilosidades (31,1 ± 0,8 vs 26,6 ± 0,6; P < 0,001, n = 50 criptas). O tratamento utilizando AA-ORS mostrou aumento significativo em camundongos 5 Gy (26,6 ± 0,6 vs 34,2 ± 0,5; P < 0,001, n = 50 criptas) e não em camundongos
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95/102 irradiados com 0 Gy (Figs. 6E-6F).
[00247] A análise de Western blot mostrou que os homogeneizados de células do intestino delgado de camundongos irradiados 5 Gy apresentaram aumento significativo quando comparados com 0 Gy. Camundongos tratados com AA-ORS aumentaram os níveis de proteína ki-67 em 0 Gy, mas não aumentaram ainda em 5 Gy. Estes estudos sugerem que a proliferação epitelial induzida por AA-ORS é mediada por meio de KI67 em 0 Gy e não em 5 Gy.
[00248] Este estudo significa como uma seleção sistemática de certos nutrientes com base no seu efeito benéfico sobre a função Gl ajudou a melhorar a proliferação, maturação e diferenciação de célulastronco intestinais, levando a células epiteliais vílosas longas funcionalmente ativas cuja função e altura foram inicialmente comprometidas por irradiação (Fig. 7).
EXEMPLO 9 - Função gastrointestinal melhorada com AA-ORS em camundongos [00249] Utilizando técnicas eletrofisiológicas, foi mostrado que a secreção de Cl Induzida por radiação pode ocorrer em doses de radiação que são muito baixas para provocar alterações histopatológicas óbvias.55 A disfunção entérica induzida por radiação foi caracterizada por: (1) secreção aumentada de Ci que foi responsável pela secreção aumentada de fluido; (2) absorção diminuída de Na+, que levou à absorção diminuída de fluido; e (3) permeabilidade paracelular aumentada que resultou em translocação aumentada de substâncias antigênicas luminals no compartimento sistêmico, que gera uma resposta imune local e sistêmica. A permeação aumentada do conteúdo luminal no compartimento sistêmico aumentou a endotoxina plasmática e citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL1 β).51 [00250] Como delineado em um estudo anterior, uma solução de reidratação oral à base de aminoácido (AA-ORS) foi previamente de
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96/102 senvolvida.51 Aminoácidos particulares foram selecionados com base nas descobertas em tecidos intestinais de camundongos irradiados em que os aminoácidos selecionados: (1) aumentaram a absorção de Na+ por meio da absorção de Na+ acoplada a aminoácidos; (2) não estimularam a secreção de Cl e, portanto, a secreção de fluido; e (3) diminuíram a permeabilidade paraceiular ou enrijecimento da barreira mucosa. Tratamento com AA-ORS durante um período de 14 dias melhorou a absorção de eletrólitos, diminuiu a permeabilidade paraceiular assim como os níveis de endotoxina plasmática e citocina pró-infiamatória, peso corporal melhor conservado, e melhorou a sobrevivência em camundongos expostos a uma dose normalmente letal de irradiação de corpo total (8,5 Gy TBI)51. Os estudos subsequentes mostraram que estas melhoras ocorreram tão cedo quanto 7 dias após o tratamento de AA-ORS; no entanto, os mecanismos exatos para estes efeitos eram desconhecidos.
[00251] Em resumo, a AA-ORS compreendendo um conjunto selectivo de aminoácidos foi identificada como um rádio-mitigador intestinal em camundongos através da intensificação seletiva de marcadores de células-tronco tais como Lgr5 & BMH e através do bloqueio da apoptose mediada por caspase-3 em células-tronco e progenitoras intestinais.
[00252] Este estudo, portanto, significa o efeito de aminoácidos simples na proliferação, maturação e diferenciação de células-tronco intestinais levando a células epiteliais vilosas longas funcionalmente ativas cuja função e altura foram comprometidas pela irradiação. [00253] Os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos e várias modificações ou alterações na sua compreensão serão sugeridas para as pessoas versadas na técnica e estão incluídas dentro do espírito e escopo deste pedido. Além disso, quaisquer elementos ou limitações de qualquer Invenção ou suas mo
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97/102 dalidades aqui divulgadas podem ser combinados com qualquer um e/ou todos os outros elementos ou limitações (individualmente ou em qualquer combinação) ou qualquer outra invenção ou suas modalidades divulgadas nesta invenção, e todas essas combinações são contempladas com o escopo da invenção sem limitação.
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Claims (90)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para o tratamento de um ferimento ou queimadura em um indivíduo com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condição da pele é dermatite atópica, dermatite, psoríase, o envelhecimento da pele, uma condição relacionada com o envelhecimento da pele, escaras, prurido ou eczema.
  3. 3. Método para o tratamento e/ou prevenção de uma condição de pele em um indivíduo com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste no grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  4. 4. Método para o tratamento e/ou a prevenção de uma condição cosmética da pele em um indivíduo com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste do grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  5. 5. Método para o tratamento de um distúrbio pulmonar em um indivíduo com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste no grupo consistindo em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado
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    2/13 pelo fato de que o distúrbio pulmonar é lesão pulmonar, pneumonite, uma condição associada com a resistência das vias aéreas, asma, ou as condições inflamatórias do pulmão.
  7. 7. Método para o tratamento de lesões à mucosa Gl em um indivíduo com sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a lesão à mucosa Gl é a lesão na mucosa do intestino delgado.
  9. 9. Método para o tratamento de uma doença ou condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma composição compreendendo um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença ou a condição que está relacionada com a função de barreira da mucosa é a disfunção de uma barreira mucosa.
  11. 11. Método para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de uma célula-tronco ou célula progenitora, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende o contato da célula com uma quantidade de uma composição que compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina, em que a dita quantidade é suficiente para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de dita célula-tronco ou célula progenitora.
  12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 5, 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que a composição
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    3/13 compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico, serina e seus derivados.
  13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 5, 9 ou 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano e ácido aspártico.
  14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende três ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende quatro ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina.
  18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição não inclui serina.
  19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina e triptofano.
  20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica
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    4/13 ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina.
  21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende valina.
  22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende tirosina.
  23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende triptofano.
  24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ácido aspártico.
  25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição compreende serina.
  26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina e valina; treonina e tirosina; treonina e triptofano; treonina e ácido aspártico; treonina e serina; valina e tirosina; valina e triptofano; valina e ácido aspártico; valina e serina; tirosina e triptofano; tirosina e ácido aspártico; tirosina e serina; triptofano e ácido aspártico; triptofano e serina; ou ácido aspártico e serina.
  27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina, valina e tirosina; treonina, valina, e triptofano; treonina, valina e ácido aspártico; treonina, valina e serina; treonina, tirosina e ácido aspártico; treonina, tirosina e serina; treonina, triptofano e ácido aspártico; treonina, triptofano e serina; treonina, ácido aspártico e serina;
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    5/13 valina, tirosina e triptofano; valina, tirosina e ácido aspártico; valina, tirosina e serina; valina, triptofano e ácido aspártico; valina, triptofano, e serina; valina, ácido aspártico e serina; tirosina, triptofano e ácido aspártico; tirosina, triptofano e serina; tirosina, ácido aspártico e serina; ou triptofano, ácido aspártico, e serina.
  28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina, valina, tirosina e triptofano; treonina, valina, tirosina e ácido aspártico; treonina, valina, tirosina e serina; treonina, valina, triptofano e ácido aspártico; treonina, valina, triptofano e serina; treonina, valina, ácido aspártico e serina; treonina, tirosina, triptofano e ácido aspártico; treonina, tirosina, triptofano e serina; treonina, tirosina, ácido aspártico e serina; treonina, triptofano, ácido aspártico e serina; valina, tirosina, triptofano, e ácido aspártico; valina, tirosina, triptofano e serina; valina, tirosina, ácido aspártico e serina; valina, triptofano, ácido aspártico e serina; ou tirosina, triptofano, ácido aspártico, e serina.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição compreende dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina e triptofano.
  30. 30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição não inclui um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a composição não inclui lisina, glicina, ácido aspártico, isoleucina e asparagina.
  32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a composição não inclui serina.
  33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindica
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    6/13 ções 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração de cerca de 0,7 a cerca de 1,3 g/l, valina em uma concentração de 0,9 a 1,5 g/l, tirosina em uma concentração de 0,1 a 0,3 g/l e triptofano em uma concentração de 1,3 a 1,9 g/l.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração ao redor de 1,0 g/l, valina em uma concentração ao redor de
    1,2 g/l, tirosina em uma concentração ao redor de 0,2 g/l, e triptofano em uma concentração de 1,6 g/l.
  35. 35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a composição não inclui ou compreende apenas quantidades insignificantes de eletrólitos.
  36. 36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a composição promove a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou progenitoras através da prevenção de danos ao DNA e/ou reparo do DNA danificado.
  37. 37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a composição estimula a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras conforme evidenciado por um ou mais de 1) um aumento nos marcadores de proliferação p-ERK e/ou p-AKT, em níveis de mRNA e/ou proteína, 2) um aumento nos marcadores de células-tronco BMil e/ou Lgr5, em níveis de mRNA e/ou proteína, 3) uma ativação de MEK e/ou ERK e 4) uma diminuição no marcador de apoptose como caspase 3 clivada.
  38. 38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco é de um mamífero.
  39. 39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracteriza
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    7/13 do pelo fato de que a célula-tronco é de um ser humano.
  40. 40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que as células são colocadas em contato com a composição in vivo em um indivíduo.
  41. 41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao indivíduo através da administração oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, pulmonar, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual ou retal.
  43. 43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a composição é estéril.
  44. 44. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende a administração de células-tronco e/ou progenitoras ao indivíduo.
  45. 45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é utilizado para tratar um distúrbio ocular, um distúrbio do sistema nervoso, doença de enxerto vs doença hospedeira, perda de cabelo coclear, um distúrbio do sangue, um distúrbio cardíaco, um ferimento ou um distúrbio pancreático.
  46. 46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31 ou 44, caracterizado pelo fato de que é utilizado para tratar uma condição selecionada de malignidade; deficiência de células de Paneth; hipopituitarismo; doença celíaca; doença tropical; isquemia associada à radiação; atrofia vilosa induzida por fármaco; doença de Crohn congênita; enteropatia autoimune; enterocolite; hepatite; câncer intestinal; linfoma intestinal; diabetes tipo 1; alergia; gastroenterite eosinófíla; infecção viral, fúngica ou bacteriana; e síndromes de imunodeficiência.
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    8/13
  47. 47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é utilizado para tratar um distúrbio intestinal.
  48. 48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco é selecionada a partir de células-tronco neurais, células-tronco da pele, célulastronco de medula óssea, células-tronco hematopoiéticas, célulastronco mesenquimais, células-tronco do tecido, células-tronco mesodérmicas, células-tronco de órgãos e células-tronco intestinais.
  49. 49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula-tronco intestinal.
  50. 50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula derivada da medula óssea.
  51. 51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célulatronco pluripotente ou totipotente.
  52. 52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco é uma célula-tronco hematopoiética.
  53. 53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula é exposta a pelo menos 1 Gy de radiação antes ou após ser colocada em contato com a composição.
  54. 54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a célula é exposta à dita radiação antes de ser colocada em contato com a composição.
  55. 55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a célula é colocada em contato com a composição in vitro.
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    9/13
  56. 56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que a célula é colocada em contato com a composição ex vivo e a célula é depois administrada a um indivíduo.
  57. 57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é utilizado para tratar uma ferida.
  58. 58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é utilizado para tratar a supressão da medula óssea.
  59. 59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a supressão da medula óssea é provocada por um vírus.
  60. 60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o vírus é vírus da Dengue.
  61. 61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é utilizado para aumentar o número de glóbulos brancos, glóbulos vermelhos ou plaquetas.
  62. 62. Composição para promover a sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento da célula-tronco e/ou célula progenitora, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina; em que a composição possui uma osmolaridade total de 100 a 280 mosm; e em que a composição possui um pH de 2,5 a 6,5.
  63. 63. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que não inclui serina.
  64. 64. Composição de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que possui um pH de 4,2 a 4,6.
  65. 65. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracte
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    10/13 rizada pelo fato de que compreende um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, ácido aspártico e triptofano.
  66. 66. Composição de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, ácido aspártico e triptofano.
  67. 67. Composição de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato de que compreende treonina, valina, tirosina e triptofano.
  68. 68. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a dita composição não inclui um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina.
  69. 69. Composição de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a dita composição não inclui lisina, glicina, isoleucina e asparagina.
  70. 70. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que é estéril.
  71. 71. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração de 0,7 a 1,3 g/l, valina em uma concentração de 0,9 a
    1,5 g/l, tirosina em uma concentração de 0,1 a 0,3 g/l e triptofano em uma concentração de 1,3 a 1,9 g/l.
  72. 72. Composição de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração ao redor de 1,0 g/l, valina em uma concentração ao redor de 1,2 g/l, tirosina em uma concentração ao redor de 0,2 g/l e triptofano em uma concentração de 1,6 g/l.
  73. 73. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracte
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    11/13 rizada pelo fato de que é formulada para administração oral.
  74. 74. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a composição promove a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou progenitoras através da prevenção de danos ao DNA e/ou reparo do DNA danificado.
  75. 75. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a composição estimula a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras conforme evidenciado por um ou mais de 1) um aumento nos marcadores de proliferação p-ERK e/ou p-AKT, em níveis de mRNA e/ou proteína, 2) um aumento nos marcadores de células-tronco BMil e/ou Lgr5, em níveis de mRNA e/ou proteína, 3) uma ativação de MEK e/ou ERK e 4) uma diminuição no marcador de apoptose como caspase 3 clivada.
  76. 76. Composição para promover sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento de células-tronco e/ou células progenitoras, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende um ou mais aminoácidos livres selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, triptofano, ácido aspártico e serina; e em que a composição não inclui um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em serina, lisina, glicina, isoleucina e asparagina.
  77. 77. Composição de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que não inclui serina.
  78. 78. Composição de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, ácido aspártico, tirosina e triptofano.
  79. 79. Composição de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em treonina, valina, tirosina, ácido aspártico e triptofano.
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    12/13
  80. 80. Composição de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que compreende treonina, valina, tirosina e triptofano.
  81. 81. Composição de acordo com a reivindicação 80, caracterizada pelo fato de que a dita composição não inclui lisina, glicina, isoleucina e asparagina.
  82. 82. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que é estéril.
  83. 83. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração de 0,7 a 1,3 g/l, valina em uma concentração de 0,9 a
    1,5 g/l, tirosina em uma concentração de 0,1 a 0,3 g/l e triptofano em uma concentração de 1,3 a 1,9 g/l.
  84. 84. Composição de acordo com a reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que a composição compreende treonina em uma concentração ao redor de 1,0 g/l, valina em uma concentração ao redor de 1,2 g/l, tirosina em uma concentração ao redor de 0,2 g/l e triptofano em uma concentração de 1,6 g/l.
  85. 85. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração através da via intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, pulmonar, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual, inalação ou retal.
  86. 86. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a composição promove a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou progenitoras através da prevenção de danos ao DNA e/ou reparo do DNA danificado.
  87. 87. Composição de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pelo fato de que a composição estimula a proliferação e/ou diferenciação de células-tronco e/ou células progenitoras conforme evi
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    13/13 denciado por um ou mais de 1) um aumento nos marcadores de proliferação p-ERK e/ou p-AKT, em níveis de mRNA e/ou proteína, 2) um aumento nos marcadores de células-tronco BMil e/ou Lgr5, em níveis de mRNA e/ou proteína, 3) uma ativação de MEK e/ou ERK e 4) uma diminuição no marcador de apoptose como caspase 3 clivada.
  88. 88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é utilizado para melhorar uma aparência e/ou função cosmética.
  89. 89. Método de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que uma camada de pele e/ou tecido subjacente é rejuvenescido através da sobrevivência, proliferação e/ou desenvolvimento intensificado das células-tronco e/ou células progenitoras.
  90. 90. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
    uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 87; e instruções para administrar a um indivíduo ou colocar em contato uma amostra biológica com a composição.
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B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

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