BR112017024087B1 - Método de identificação do evento de milho referência cruzada com pedidos relacionados - Google Patents

Abstract

PRODUÇÃO DE GLUCANASE E MÉTODOS DE SUA UTILIZAÇÃO. São descritos métodos e composições para a produção de uma glucanase em plantas transgênicas, e depois a incorporação de partes das plantas transgênicas em ração animal. A enzima glucanase de ração exibe atividade através de uma ampla faixa de pHs e tolerância a temperaturas que são frequentemente encontradas durante o processo de preparação de ração animal. A produção da enzima na planta transgênica aumenta a estabilidade térmica da enzima.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S. Provisório N° 62/161.482, que foi depositado em 14 de maio de 2015, e é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito.

[002] A listagem de sequências depositada eletronicamente com esse pedido intitulada “Listagem de sequências”, que foi criada em 14 de maio de 2016 e possui um tamanho de 145.921 bytes, é incorporada por referência nesse relatório descritivo como se totalmente descrita.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Essa revelação está relacionada às plantas transgênicas que expressam glucanases com estabilidade térmica aumentada, aos ácidos nucléicos que as codificam, bem como aos métodos de processamento de plantas e tecidos transgênicos, e de produção e utilização de alimentação animal. Essa revelação também está relacionada aos aditivos de ração e aditivos de processamento de grãos e fibras que incluem glucanases.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] A abundância de polissacarídeos não-amido (NSPs) nas dietas de animais monogástricos e ruminantes pode afetar de forma adversa o valor nutricional de rações, e também apresenta uma oportunidade para aumentar o teor nutricional caso possam ser degradados na dieta ou convertidos em componentes nutricionais benéficos. NSPs estão entre os componentes estruturais primários da parede celular de plantas (celulose, hemicelulose, xiloglucanos,arabinoxilanos, galactanas, arabinogalactanas etc.) e também podem servir como reservas de armazenamento de carboidratos em algumas plantas. Adicionalmente, pectinas e gomas são consideradas NSP que não são da parede celular. Por causa de seus vários papéis estruturais e biológicos, NSPs frequentemente se ligam ou envolvem o amido, proteínas, gorduras e outros nutrientes que estão presentes em ingredientes de ração à base de plantas (por exemplo, cereais, legumes, silagem etc.) e outros ingredientes, inibindo a habilidade do animal para digerir nutrientes eficientemente. Níveis aumentados de NSPs na dieta podem aumentar a viscosidade do conteúdo intestinal, o que pode interferir com enzimas digestivas e reduzir a digestibilidade de nutrientes aumentando, dessa forma, a conversão alimentar (massa de ração dividida pela massa de carne produzida) e redução do ganho de peso corporal (Iji, P.A. 1999. “The Impacts of Cereal Non-Starch Polysaccharides on Intestinal Development and Function in the Broiler Chickens”. Worlds Poult. Sci. J.55: 375-387, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito). Por exemplo, a alimentação com níveis crescentes de germe de farelo de guar (0, 5 ou 7,5%) ou cascas de farelo de guar (0, 2,5 ou 5%) a frangos resultou em aumento da viscosidade da digesta (Lee, J.T., C.A. Bailey, e A.L. Cartwright. 2003. “β-Mannanase Ameliorates Viscosity- Associated Depression of Growth in Broiler Chickens Fed Guar Germ and Hull Fractions”. Poult. Sci. 82: 1.925-1.931, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito). Além do aumento da viscosidade, o ganho de peso corporal e a conversão alimentar também pioravam com aumento de casca de farelo de guar, demonstrando os efeitos negativos da viscosidade elevada sobre o desempenho do animal.

[005] NSPs também são conhecidos por desencadear inadvertidamente respostas imunes no intestino, o que pode ainda enfraquecer a eficiência da utilização da ração e possui implicações para a saúde animal.

[006] Além dos componentes de cereal, as dietas agora também contêm rotineiramente DDGS (grãos secos de destilaria e solúveis), que também não é facilmente digerido. Vários estudos demonstraram que a suplementação de enzima pode aumentar a energia metabolizável da dieta (ME), e/ou diminuir a viscosidade de dietas que contêm níveis elevados de trigo, cevada, DDGSs, ou outros componentes fibrosos. A adição de carboidrases às dietas de frangos à base de farelo de milho- soja, quando formuladas para terem uma redução de 3% na ME dietética, foi obtida sem comprometer as conversões de ração de frangos criados sob estações quentes ou frescas. Foi determinado que o β-d-glucano hidrolisado é responsável por crescimento aumentado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em um aspecto, a invenção está relacionada a um método de identificação do evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 em uma amostra. O método compreende o contato de uma amostra com um primeiro iniciador e um segundo iniciador. O método compreende a amplificação de um ácido nucléico na amostra para obter um produto amplificado. O método também compreende a detecção do produto amplificado específico para uma sequência-alvo no evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652.

[008] Em um aspecto, a invenção está relacionada a uma ração animal que compreende uma planta transgênica ou parte desta. A planta transgênica ou parte desta compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. A glucanase inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[009] Em um aspecto, a invenção está relacionada a um método de produção de uma ração animal. O método inclui a misturação de uma planta transgênica ou parte desta com material de planta para formar uma mistura. A planta transgênica ou parte desta compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. A glucanase inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[0010] Em um aspecto, a invenção está relacionada a um método de aumento da energia metabolizável de uma dieta. O método inclui a misturação de uma planta transgênica ou parte desta com um ingrediente de ração. A planta transgênica ou parte desta compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[0011] Em um aspecto, a invenção está relacionada a um método de aumento da produção de açúcares fermentáveis de grãos. O método inclui a misturação de grãos derivados de qualquer uma das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo com grãos derivados de uma planta diferente para formar grãos misturados. O método também inclui o processamento de grãos misturados em açúcares fermentáveis. Os açúcares fermentáveis são subsequentemente convertidos em etanol ou em um produto de fermentação similar, que pode incluir butanol, ácido lático, ácido cítrico, ácido acético, ou outros combustíveis ou substâncias químicas.

[0012] Em um aspecto, a invenção está relacionada a uma planta transgênica, grão transgênico ou biomassa transgênica que compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. A glucanase inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6. A glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[0013] Em um aspecto a invenção está relacionada a um polipeptídeo sintético ou a um fragmento deste. O polipeptídeo sintético ou um fragmento deste compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6. A glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] A descrição detalhada seguinte de modalidades preferidas da presente invenção será mais bem compreendida quando lida em conjunto com os desenhos em anexo. Com o objetivo de ilustrar a invenção, são mostradas nos desenhos modalidades particulares. Subentende-se, no entanto, que a invenção não está limitada aos arranjos e instrumentalidades precisos mostrados. Nos desenhos:

[0015] A Figura 1 ilustra o vetor de expressão pAG4258 que carrega uma única unidade de expressão de glucanase de ração.

[0016] A Figura 2 ilustra o vetor de expressão pAG4588 que carrega uma única unidade de expressão de glucanase de ração.

[0017] A Figura 3 ilustra o vetor de expressão pAG4597 que carrega uma única unidade de expressão de glucanase de ração.

[0018] A Figura 4 ilustra o vetor de expressão pAG4708 que carrega uma única unidade de expressão de glucanase de ração.

[0019] A Figura 5 ilustra o vetor de expressão pAG4766 que carrega duas unidades de expressão de glucanase de ração.

[0020] A Figura 6 ilustra o vetor de expressão pAG4767 que carrega duas unidades de expressão de glucanase de ração.

[0021] A Figura 7 ilustra o vetor de expressão pAG4770 que carrega três unidades de expressão de glucanase de ração.

[0022] A Figura 8 ilustra o vetor de expressão pAG4771 que carrega três unidades de expressão de glucanase de ração.

[0023] A Figura 9 é um gráfico que ilustra a amplitude de atividade de glucanase recuperada de espigas das plantas de milho que carregavam a construção de pAG4588.

[0024] A Figura 10 é um gráfico que ilustra a amplitude de atividade de glucanase recuperada de espigas das plantas de milho que carregavam a construção de pAG4597.

[0025] A Figura 11 é um diagrama que mostra o sítio de integração de T-DNA no cromossomo 7 do evento de milho 4588.652.

[0026] A Figura 12 é um gráfico que ilustra atividade de glucanase observada em plantas T1.

[0027] A Figura 13 é um gráfico que ilustra a atividade de glucanase nas sementes de plantas hemizigotas, homozigotas e híbridas.

[0028] A Figura 14 ilustra o design geral do ensaio de PCR em tempo real usado para determinar a presença do lócus de T-DNA (PCR-padrão e em tempo real) e zigosidade (somente PCR em tempo real) em eventos transgênicos. As letras A, B, X e Y com setas indicam sítios de ligação ao iniciador. As caixas retangulares A + B e X + Y representam produtos de PCR amplificados de respectivos pares de iniciadores.

[0029] A Figura 15 ilustra o design geral do ensaio de PCR-padrão usado para determinar a presença do lócus de T- DNA e zigosidade em eventos transgênicos. As letras A, B e C com setas indicam sítios de ligação ao iniciador. As caixas retangulares A + B e A + C representam produtos de PCR amplificados de respectivos pares de iniciadores.

[0030] A Figura 16 ilustra a análise por PCR multiplex padronizada das plantas segregantes autofecundadas de 4588.652.

[0031] A Figura 17 é um gráfico que ilustra dados de PCR em tempo real para determinar a presença do lócus de T-DNA e zigosidade no evento 4588.259 (FG259).

[0032] As Figuras 18A e 18B são gráficos que ilustram a atividade de glucanase na Dieta de crescimento (Figura 18A) e na Dieta inicial (Figura 18B) antes e depois da peletização.

[0033] As Figuras 19A e 19B são gráficos que ilustram a atividade de glucanase em farinha do tipo selvagem (WT) misturada com glucanase microbiana e farinha transgênica que produz glucanase após tratamento térmico em temperaturas de 130°C (Figura 19A) e 94°C (Figura 19B).

[0034] As Figuras 20 e 21 são gráficos que ilustram o pH ótimo para medição da atividade de AGR2314 em um ensaio a 37°C (Figura 20) e 80°C (Figura 21).

[0035] A Figura 22 é um gráfico que ilustra um exemplo do pH ótimo da glucanase de ração que é produzida em farinha transgênica.

[0036] As Figuras 23A e 23B são gráficos que ilustram a atividade de glucanase em vários substratos a 37°C (Figura 23A) e 80°C (Figura 23B).

[0037] As Figuras 24A e 24B são gráficos que ilustram a hidrólise enzimática de fibra de sementes não tratada de plantas de milho transgênicas que expressam AGR2314. A Figura 24A mostra o rendimento de glicose e a Figura 24B mostra o rendimento de xilose.

[0038] As Figuras 25A e 25B são gráficos que ilustram a hidrólise enzimática de fibra de semente de plantas de milho transgênicas que expressam AGR2314 pré-tratada com o ácido diluído. A Figura 25A mostra o rendimento de glicose e a Figura 25B mostra o rendimento de xilose.

[0039] A Figura 26 é um gráfico que ilustra o ganho de peso corporal (BWG) durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias.

[0040] A Figura 27 é um gráfico que ilustra as alterações no BWG de aves domésticas por intervalo de tempo durante o experimento de alimentação de 28 dias.

[0041] A Figura 28 é um gráfico que ilustra o consumo de ração durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias usando duas dietas diferentes (à base de milho/cevada e à base de milho/LF-DDGS) com (+) ou sem (-) uma glucanase.

[0042] A Figura 29 é um gráfico que ilustra a taxa de conversão alimentar (FCR) durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias com duas dietas diferentes (à base de milho/cevada e à base de milho/LF-DDGS dietas) com (+) ou sem (-) uma glucanase.

[0043] A Figura 30 é um gráfico que ilustra o efeito da glucanase sobre o BWF de aves domésticas em tratamento experimental.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES

[0044] Uma certa terminologia é usada na descrição seguinte apenas por conveniência, e não é limitante.

[0045] Os termos “sequência de ácidos nucléicos sintética”, “polinucleotídeo sintético”, “oligonucleotídeo sintético”, “DNA sintético” ou “RNA sintético”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma sequência de ácidos nucléicos, um polinucleotídeo, um oligonucleotídeo, DNA ou RNA que difere de um encontrado na natureza por ter uma sequência diferente de uma encontrada na natureza ou uma modificação química não encontrada na natureza. Isso pode incluir, sem limitação, uma sequência de DNA criada com o uso de ferramentas de biotecnologia. Essas ferramentas incluem, sem limitação, tecnologia de DNA recombinante, reação em cadeia de polimerase (PCR), técnicas de biotecnologia de mutagênese com o uso de PCR ou técnicas de recombinação que incluem digestão e ligação de DNA, técnicas de mutagênese química, síntese química ou uso dirigido de nucleases (as denominadas tecnologias de “edição do genoma” ou “otimização de genes”).

[0046] Os termos “proteína sintética”, “polipeptídeo sintético”, “oligopeptídeo sintético” ou “peptídeo sintético”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma proteína, polipeptídeo, oligopeptídeo ou peptídeo que foi feito por meio de um processo sintético. O processo sintético pode incluir, sem limitação, a síntese química ou tecnologia recombinante. O processo sintético pode incluir a produção de uma proteína, polipeptídeo, oligopeptídeo ou peptídeo por expressão de uma sequência de ácidos nucléicos sintética em uma célula viva ou por expressão in vitro com o uso de um extrato livre de células.

[0047] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “variante” se refere a uma molécula que retém uma atividade biológica que é a mesma ou substancialmente similar àquela da sequência original. A variante pode ser da mesma espécie ou de espécies diferentes ou sem uma sequência sintética com base em uma molécula natural ou prévia.

[0048] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “alinhamento” se refere às diversas sequências de ácidos nucléicos ou de aminoácidos alinhadas longitudinalmente para identificação visual de nucleotídeos ou aminoácidos comumente compartilhados. A percentagem de nucleotídeos ou aminoácido comumente compartilhados está relacionada com a homologia ou identidade entre domínios e parentesco entre as sequências. Um alinhamento pode ser determinado por programas de computador como, por exemplo, CLUSTAL O (1.2.1) (Sievers e cols. (2011) Molecular Systems Biology 7: 539, identificador de objeto digital: 10.1038/msb.2011.75).

[0049] As palavras “um” e “uma”, como usadas nas reivindicações e nas porções correspondentes do pedido, são definidas como incluindo um ou mais dos itens citados, a menos que especificamente estabelecido de forma diferente.

[0050] Em uma modalidade, é fornecido um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. O ácido nucléico sintético pode incluir uma sequência com pelo menos 70, 72,75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 1 [AGR2314], ID. DE SEQ. N°: 2 [AGR2414] e ID. DE SEQ. N°: 3 [AGR2514]. A glucanase codificada pode ser capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[0051] Uma modalidade inclui uma glucanase que inclui um polipeptídeo sintético que possui uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 4 [AGR2314], ID. DE SEQ. N°: 5 [AGR2414] e ID. DE SEQ. N°: 6 [AGR2514]. A glucanase pode ser capaz de degradar um ou mais polissacarídeos. A glucanase pode ser modificada para estabilidade térmica aumentada.

[0052] Uma glucanase modificada para estabilidade térmica pode ser produzida por técnicas de biologia molecular padronizadas, e depois avaliada. A glucanase pode ser submetida à mutação e depois avaliada quanto à estabilidade térmica. Sistemas de avaliação que podem ser utilizados incluem fago lambda, levedura, ou outros sistemas de expressão que permitam a produção da proteína e/ou a testagem de suas características físicas e/ou funcionais. De uma população de proteínas modificadas, as candidatas podem ser isoladas e analisadas posteriormente. A análise adicional pode incluir sequenciamento de DNA, ensaios funcionais, ensaios estruturais, ensaios de atividade enzimática e alterações no monitoramento na estabilidade térmica, ou estrutura em resposta às condições temperatura elevada.

[0053] Em uma modalidade, uma glucanase pode ser produzida em uma planta ou tecido de planta. A glucanase pode ser isolada da planta ou tecido de planta.

[0054] Uma modalidade inclui uma composição que compreende, que consiste basicamente ou que consiste em uma ou mais glucanases. A composição pode ser, sem limitação, uma planta transgênica que inclui as (uma ou mais) glucanases, uma ração animal ou aditivo de alimentação animal que inclui as (uma ou mais) glucanases ou uma mistura de enzimas que inclui as (uma ou mais) glucanases. Uma glucanase na composição pode ser codificada por qualquer um dos ácidos nucléicos sintéticos descritos nesse relatório descritivo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “glucanase” se refere a uma enzima capaz de catalisar a degradação ou despolimerização de carboidratos complexos.

[0055] Uma glucanase na composição pode ser capaz de degradar um ou mais de dissacarídeos, trissacarídeos e oligossacarídeos em sacarídeos de peso molecular menor. Uma glucanase na composição pode ser capaz de degradar um ou mais de celooligossacarídeo, lignocelulose, celulose, hemicelulose e pectina. Uma glucanase da composição pode atuar mediante celulose ou beta-glucanos de ligação mista. Algumas glucanases podem ter especificidades de substrato mais amplas e podem atuar sobre uma ampla gama de polímeros de carboidratos. Uma glucanase da composição pode ter atividade enzimática sobre uma gama de polímeros de carboidratos. Essa atividade enzimática pode ser, sem limitação, atividades de endoglucanase, exoglucanase, β- glucosidase, celobiohidrolase, endo-1,4-β-xilanase, β- xilosidase, α-glicuronidase, α-L-arabinofuranosidase, acetilesterase, acetilxilanoesterase, α-amilase, β-amilase, glicoamilase, pululanase, β-glucanase, hemicelulase, arabinosidase, mananase, pectina hidrolase ou pectato liase. A glucanase da composição pode ser capaz de degradar um ou mais de beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D- glicopiranosídeo e xilano. Ensaios para determinação da atividade de uma glucanase para a degradação de vários substratos são conhecidos na técnica. O ensaio de beta-glucosidase, ensaio de endocelulase, ensaio de exocelulase (celobiohidrolase), ensaio de amilase, ensaio de endoxilanase, ensaio de pectinase, ensaio de 1,3-beta- glucosidase, ensaio de 1,4-beta-glucosidase são descritos nesse relatório descritivo no Exemplo 13.

[0056] Uma glucanase da composição pode compreender, consistir basicamente ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 4 [AGR2314], ID. DE SEQ. N°: 5 [AGR2414] e ID. DE SEQ. N°: 6 [AGR2514].

[0057] Uma modalidade inclui uma composição que compreende, que consiste basicamente ou que consiste em uma glucanase individual ou uma combinação de duas ou mais glucanases descritas nesse relatório descritivo.

[0058] Em uma modalidade, uma glucanase da composição pode ser uma variante. Variantes podem incluir substituições de aminoácidos conservativas; ou seja, substituições com aminoácidos que possuem propriedades similares.Substituições conservativas podem ser um aminoácido polar para polar (Glicina (G, Gly), Serina (S, Ser), Treonina (T, Thr), Tirosina (Y, Tyr), Cisteína (C, Cys), Asparagina (N, Asn) e Glutamina (Q, Gln)); um aminoácido não polar para não polar (Alanina (A, Ala), Valina (V, Val), Triptofano (W, Trp), Leucina (L, Leu), Prolina (P, Pro), Metionina (M, Met), Fenilalanina (F, Phe)); aminoácido ácido para ácido (Ácido aspártico (D, Asp), Ácido glutâmico (E, Glu)); aminoácido básico para básico (Arginina (R, Arg), Histidina (H, His), Lisina (K, Lys)); aminoácidos carregados para carregados (Ácido aspártico (D, Asp), Ácido glutâmico (E, Glu), Histidina (H, His), Lisina (K, Lys) e Arginina (R, Arg)); e um aminoácido hidrofóbico para hidrofóbico (Alanina (A, Ala), Leucina (L, Leu), Isoleucina (I, Ile), Valina (V, Val), Prolina (P, Pro), Fenilalanina (F, Phe), Triptofano (W, Trp) e Metionina (M, Met)). Substituições de nucleotídeos conservativas podem ser feitas em uma sequência de ácidos nucléicos por substituição de um códon para um aminoácido com um códon diferente para o mesmo aminoácido. Variantes podem incluir substituições não conservativas. Uma variante pode ter 40% de atividade de glucanase em comparação com a glucanase inalterada. Uma variante pode ter pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de atividade, ou um número inteiro entre quaisquer dos dois valores descritos nesse relatório descritivo, em comparação com a glucanase inalterada.

[0059] Em uma modalidade, as (uma ou mais) proteínas que possuem menos do que 100% de identidade para sua sequência de aminoácidos correspondente dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 são uma variante da proteína ou aminoácido citado. Em uma modalidade, uma proteína, polipeptídeo, oligopeptídeo ou peptídeo isolado que possui uma sequência com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma proteína que possui a sequência de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 pode ser uma proteína com um comprimento menor do que o total que possui a sequência com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, juntamente com 6, 10 a 50, 10 a 100, 10 a 150, 10 a 300, 10 a 400, 10 a 500, 10 a 600, 10 a 700, 10 a 800, 10 a 900 ou 10 a todos os aminoácidos de uma proteína. Essa lista de comprimentos de sequências engloba cada proteína de comprimento total nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 e cada comprimento menor dentro da lista, até mesmo para proteínas que não incluem mais de 400 aminoácidos. Por exemplo, os comprimentos de 6, 10 a 50, 10 a 100, 10 a 150, 10 a 300, 10 a 400, e 10 a todos os aminoácidos se aplicariam a uma sequência com 322 aminoácidos. Uma faixa de comprimentos de sequência de aminoácidos citada nesse relatório descritivo inclui cada comprimento de sequência de aminoácidos dentro da faixa, inclusive pontos finais. O comprimento de aminoácidos citado pode começar em qualquer posição única dentro de uma sequência de referência, em que aminoácidos suficientes se seguem à posição única para acomodar o comprimento citado. A faixa de comprimentos de sequências pode ser estendida por incrementos de 10 a 100 N aminoácidos, em que N = um número inteiro de dez ou maior, para sequências de 1.000 aminoácidos ou maiores. O fragmento da glucanase pode ser uma subsequência dos polipeptídeos descritos nesse relatório descritivo que retêm pelo menos 40% de atividade da glucanase. O fragmento pode ter 316, 317 ou 322 aminoácidos. Os fragmentos podem incluir 20, 30, 40,50, 100, 150, 200 ou 300 aminoácidos contíguos. Modalidades também incluem ácidos nucléicos que codificam as referidas sequências de aminoácidos, e anticorpos que reconhecem epitopos nas referidas sequências de aminoácidos.

[0060] Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode ser selecionada de qualquer porção de uma das sequências dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 que correspondem ao comprimento de aminoácidos citado. Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode ser selecionada de uma porção de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 que possuem um domínio catalítico. O fragmento pode incluir um domínio catalítico de uma glucanase. Por exemplo, o domínio catalítico da glucanase do ID. DE SEQ. N°: 4 [AGR2314] inclui a seguinte sequência:

[0061] Na sequência do ID. DE SEQ. N°: 21, resíduos catalíticos no sítio ativo são mostrados por caracteres aumentados em negrito. Outros resíduos do sítio ativo que interagem com o substrato estão em itálico, em negrito e sublinhados.

[0062] Por exemplo, as posições 136 e 253 no ID. DE SEQ. N°: 21 são resíduos catalíticos no sítio ativo, e uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total selecionada do ID. DE SEQ. N°: 21 pode incluir os resíduos 134 e 135 em quaisquer duas posições consecutivas respectivas dentro do comprimento citado. Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode ser selecionada de uma porção de qualquer uma do ID. DE SEQ. N°: 21 pode ter outros resíduos do sítio ativo que interagem com o substrato. Por exemplo, as posições 20, 35, 36, 135, 198, 205, 210 e 286 do ID. DE SEQ. N°: 21 são os resíduos do sítio ativo que interagem com o substrato, e uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total selecionada do ID. DE SEQ. N°: 21 pode incluir os resíduos 20, 35, 36, 135, 198, 205, 210 e 286 em quaisquer posições consecutivas respectivas dentro do comprimento citado.

[0063] Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode ser selecionada de uma porção de qualquer uma do ID. DE SEQ. N°: 21 pode incluir os aminoácidos 136253. Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode possuir a atividade de glucanase. Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode ser capaz de degradar polissacarídeos. Uma sequência de aminoácidos de comprimento menor do que o total pode conter aqueles aminoácidos que conteriam os resíduos do sítio ativo.

[0064] Um domínio catalítico pode ser um domínio conservado. Um “domínio conservado”, nesse relatório descritivo, se refere a uma região em um polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeos heterólogas em que há um grau relativamente elevado de identidade entre as sequências distintas. Com relação aos polipeptídeos que codificam um domínio conservado, eles possuem preferivelmente pelo menos 10 pares de bases (bp) de comprimento.

[0065] Um domínio conservado de qualquer um dos polipeptídeos descritos nesse relatório descritivo se refere a um domínio dentro de uma glucanase que exibe um grau maior de identidade de sequência. Um grau elevado de identidade de sequência pode ser pelo menos 50% de identidade, pelo menos 55% de identidade, pelo menos 60% de identidade, pelo menos 65%, pelo menos 70% de identidade, pelo menos 80% de identidade, pelo menos 85% de identidade, pelo menos 90% de identidade, pelo menos 91% de identidade, pelo menos 92% de identidade, pelo menos 93% de identidade, pelo menos 94% de identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 96% de identidade, pelo menos 97% de identidade, pelo menos 98% de identidade, pelo menos 99% de identidade ou pelo menos 100% de identidade para resíduos de aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo descrito nesse relatório descritivo. Domínios conservados podem ser identificados como domínios de identidade para uma sequência de consenso específica. Domínios conservados podem ser identificados por utilização de alinhamento métodos. O domínio conservado pode ser identificado com múltiplos alinhamentos de sequências de proteínas relacionadas. Esses alinhamentos revelam regiões da sequência que contêm os mesmos padrões de aminoácidos, ou padrões similares. Múltiplos alinhamentos de sequências, a estrutura tridimensional e a superposição da estrutura tridimensional de domínios conservados podem ser usados para inferir a sequência, estrutura e relacionamentos funcionais. Na medida em que a presença de um domínio conservado particular dentro de um polipeptídeo está altamente correlacionado com uma função evolutivamente conservada, um banco de dados de domínios conservados pode ser usado para identificar os aminoácidos em uma sequência de proteína que estão supostamente envolvidos em funções como, por exemplo, degradação de polissacarídeos, como mapeado por anotações do domínio conservado para a sequência pesquisada. Por exemplo, a presença em uma proteína de uma sequência do ID. DE SEQ. N°: 21, que é estruturalmente e filogeneticamente similar a um ou mais domínios nos polipeptídeos da Listagem de sequências em anexo, é um forte indicador de uma função relacionada em plantas. As sequências nesse relatório descritivo citadas como funcionalmente relacionadas e/ou intimamente relacionadas com as sequências ou domínios de polipeptídeos que possuem sequências dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6 podem ter domínios conservados que compartilham pelo menos pelo menos dez aminoácidos de comprimento e pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99%, ou cerca de 100% de identidade de aminoácidos para as sequências de AGR2314, AGR2414 e AGR2514, e possuem funções similares às dos polipeptídeos da presente descrição.

[0066] Em um exemplo, as sequências de AGR2314, AGR2414 e AGR2514 podem ser alinhadas como mostrado abaixo.

[0067] A sequência de AGR2414 é uma sequência de Cel5A de Thermotoga maritima (3AMC em “Protein Data Bank” e no banco de dados de sequências de proteínas PubMed). Resíduos que interagem com o substrato estão sublinhados e são mostrados em caracteres aumentados em negrito: N20, H95, H96, N135, E136 (resíduo catalítico), Y198, H205, W210, E253 (resíduo catalítico), W286 (T. Wu e cols. (2011), Biochim. Biophys. Acta 1814, 1.832-1.840, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito). A numeração desses resíduos em AGR2514 é aquela maior por causa da presença de um resíduo adicional no terminal N nessa sequência.

[0068] Em um exemplo, as sequências de AGR2314 e AGR2414 possuem 305 resíduos conservados dentre 317 resíduos e possuem 96% de identidade.

[0069] Em um exemplo, as sequências de AGR2414 e AGR2514 abaixo possuem 310 resíduos conservados dentre 318 resíduos e possuem 97% de identidade.

[0070] Em um exemplo, as sequências de AGR2314 e AGR2514 possuem 308 resíduos conservados dentre 318 resíduos e possuem 97% de identidade.

[0071] Sequências que possuem ou codificam domínios conservados que atendem a esses critérios de percentagem de identidade e que possuem atividade biológica e regulatória comparáveis com as sequências de polipeptídeos da presente invenção são consideradas, portanto, glucanases descritas nesse relatório descritivo. Sequências que possuem graus menores de identidade, mas atividade biológica comparável, são consideradas como sendo equivalentes.

[0072] A funcionalidade de uma glucanase, variantes, ou fragmentos desta, pode ser determinada com o uso de quaisquer métodos. A funcionalidade de uma glucanase pode ser medida por qualquer um dos ensaios descritos no Exemplo 3.

[0073] Qualquer uma ou mais glucanases nesse relatório descritivo pode ser expressa em uma planta mediante introdução no genoma da planta de qualquer um ou mais dos ácidos nucléicos sintéticos descritos nesse relatório descritivo. Os métodos de introdução de ácidos nucléicos sintéticos nas plantas são conhecidos na técnica. O método pode ser a transformação da planta com um vetor que inclui ácidos nucléicos sintéticos.

[0074] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo sintético que possui uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 7 [pAG4258], ID. DE SEQ. N°: 8 [pAG4588], ID. DE SEQ. N°: 9 [pAG4597], ID. DE SEQ. N°: 10 [pAG4708], ID. DE SEQ. N°: 11 [pAG4766], ID. DE SEQ. N°: 12 [pAG4767], ID. DE SEQ. N°: 13 [pAG4770], ID. DE SEQ. N°: 14 [pAG4771], ID. DE SEQ. N°: 15 [pAG4257], ID. DE SEQ. N°: 16 [pAG4692], ID. DE SEQ. N°: 17 [pAG4693], ID. DE SEQ. N°: 18 [pAG4705] e ID. DE SEQ. N°: 19 [pAG4706]. O polinucleotídeo sintético pode incluir qualquer um dos ácidos nucléicos sintéticos descritos nesse relatório descritivo que codificam glucanase e que são capazes de degradar um polissacarídeo.

[0075] Em uma modalidade, é fornecido um vetor. O vetor pode incluir qualquer um dos polinucleotídeos ou ácidos nucléicos sintéticos descritos nesse relatório descritivo.

[0076] Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos sintéticos que possuem uma sequência como apresentada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados nesse relatório descritivo ou o complemento destes. Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos isolados que possuem uma sequência que hibridiza para um ácido nucléico que possui a sequência de qualquer ácido nucléico listado nesse relatório descritivo, ou o complemento deste. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de rigor baixo. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de rigor moderado. Em uma modalidade, as condições de hibridização são condições de rigor elevado. A hibridização pode ser ao longo do comprimento do ácido nucléico sintético. Exemplos de protocolos de hibridização e métodos para a otimização de protocolos de hibridização são descritos nas seguintes publicações: “Molecular Cloning”, T. Maniatis,E.F. Fritsch e J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; e “Current Protocols in Molecular Biology”, F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl, Volume 1, John Wiley & Sons, 2000 (protocolo-padrão) e “Amersham Gene Images AlkPhos Direct Labeling and Detection System” (GE Healthcare UK, Ltd), que são incorporadas por referência em sua totalidade como se totalmente descritas.

[0077] Em um “AlkPhos Direct Labeling and Detection System”, condições moderadas podem ser as seguintes: membranas carregadas com amostras de DNA são pré- hibridizadas por pelo menos 15 minutos a 55°C no tampão hibridização (12%(p/v) de uréia, 0,5 M de NaCl, 4% (p/v) de reagente de bloqueio). A sonda marcada é adicionada à mesma solução e a hibridização é realizada de um dia para o outro a 55°C. As membranas são lavadas por 10 minutos a 55°C na solução de lavagem primária (2 M de uréia, 0,1% (p/v) de SDS, 50 mM de 0,5 M de fosfato de Na, pH 7,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de 1,0 M de MgCl2 e 0,2% (p/v) de reagente de bloqueio). O procedimento de lavagem é repetido. As membranas são colocadas em um recipiente limpo e lavadas por 5 minutos em um tampão secundário (1 M de base Tris e 2 M de NaCl). A lavagem na solução secundária é realizada mais duas vezes. A quimioluminescência foi detectada usando substrato CDP- STAR® para fosfatase alcalina. Rigor baixo se refere às condições de hibridização em temperaturas baixas, por exemplo, entre 37°C e 60°C. Rigor elevado se refere às condições de hibridização em temperaturas elevadas, por exemplo, acima de 68°C.

[0078] No protocolo-padrão, condições moderadas podem ser as seguintes: filtros carregados com amostras de DNA são pré-tratados por 2-4 horas a 68°C em uma solução contendo 6x solução salina tamponada com citrato (SSC; Amresco, Inc., Solon, OH), dodecil sulfato de sódio 0,5% (SDS; Amresco, Inc., Solon, OH), 5x solução de Denhardt (Amresco, Inc., Solon, OH) e esperma de salmão desnaturado (Invitrogen Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA). A hibridização é realizada na mesma solução com as seguintes modificações: 0,01 M de EDTA (Amresco, Inc., Solon, OH) 100 g/ml de DNA de esperma de salmão e 5-20 x 106 cpm de sondas marcadas com 32P ou de forma fluorescente. Os filtros são incubados na mistura de hibridização por 16-20 horas e depois lavados por 15 minutos em uma solução contendo 2 x SSC e SDS 0,1%. A solução de lavagem é substituída por uma segunda lavagem com uma solução contendo 0,01 x SSC e SDS 0,5% e incubada por mais 2 horas a 20°C a 29°C abaixo da Tm (temperatura de fusão em °C). Tm = 81,5 + 16,61 Log10([Na+]/(1,0 + 0,7 [Na+])) + 0,41 (%[G+C])- (500/n)-P-F. [Na+] = Concentração molar de íons sódio. %[G+C] = percentual de bases G+C na sequência de DNA. N = comprimento de sequência de DNA em bases. P = uma correção de temperatura para % de pares de bases com erro de pareamento (aproximadamente 1°C por 1% de erro de pareamento). F = correção para concentração de formamida (= 0,63°C por 1% de formamida). Os filtros são expostos para o desenvolvimento em um aparelho de imageamento ou por autorradiografia. Condições de rigor baixo se referem às condições de hibridização em temperaturas baixas, por exemplo, entre 37°C e 60°C, e a segunda lavagem com [Na+] mais alto (até 0,825 M) e em uma temperatura 40°C a 48°C abaixo da Tm. Rigor elevado se refere às condições de hibridização em temperaturas altas, por exemplo, acima de 68°C, e a segunda lavagem com [Na+] = 0,0165 a 0,0330 M em uma temperatura 5°C a 10°C abaixo da Tm. Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos sintéticos que possuem uma sequência que possui pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade ao longo de seu comprimento para uma porção contígua de um ácido nucléico que possui qualquer uma das sequências apresentadas nesse relatório descritivo ou os complementos destas. A porção contígua pode ser todo o comprimento de uma sequência apresentada nesse relatório descritivo ou o complemento desta.

[0079] Em uma modalidade, um ácido nucléico sintético pode codificar o fragmento de uma glucanase que possui 316, 317 ou 322 aminoácidos. Os ácidos nucléicos sintéticos podem codificar os fragmentos que incluem 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 ou 300 aminoácidos contíguos e retêm pelo menos 40% da atividade da glucanase. A funcionalidade de uma glucanase, variantes, ou fragmentos desta, pode ser determinada com o uso de quaisquer métodos. A funcionalidade de uma glucanase pode ser medida por qualquer um dos ensaios descritos no Exemplo 3.

[0080] A determinação do percentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucléicos pode incluir o alinhamento e comparação dos resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições correspondentes nas duas sequências. Se todas as posições em duas sequências são ocupadas por resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos, então as sequências são consideradas 100% idênticas. O percentual de identidade pode ser medido pelo algoritmo de Smith Waterman (Smith T.F., Waterman M.S., 1981, “Identification of Common Molecular Subsequences”, Journal of Molecular Biology 147: 195-197, que é incorporado por referência em sua totalidade como se totalmente descrito).

[0081] Em uma modalidade, são fornecidos ácidos nucléicos, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos sintéticos que possuem uma porção da sequência como apresentada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados nesse relatório descritivo ou o complemento destes. Esses ácidos nucléicos, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos isolados não são limitados a esses, mas podem ter um comprimento na faixa de 10 até o comprimento total, 10 a 800, 10 a 10 a 600, 10 a 500, 10 a 400, 10 a 300, 10 a 200, 10 a 100, 10 a 90, 10 a 80, 10 a 70, 10 a 60, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20, 10 a 15, ou 20 a 30 nucleotídeos ou 10, 15, 20 ou 25 nucleotídeos. Um ácido nucléico, polinucleotídeo ou oligonucleotídeo sintético que possui um comprimento dentro de uma das faixas acima pode ter qualquer comprimento específico dentro da faixa citada, inclusive pontos finais. Em uma modalidade, uma sonda ou iniciador de hibridização é 85 a 100%, 90 a 100%, 91 a 100%, 92 a 100%, 93 a 100%, 94 a 100%, 95 a 100%, 96 a 100%, 97 a 100%, 98 a 100%, 99 a 100%, ou 100% complementar a um ácido nucléico com o mesmo comprimento que a sonda ou iniciador e que possui uma sequência escolhida de um comprimento de nucleotídeos que corresponde ao comprimento da sonda ou iniciador dentro de uma porção de uma sequência como apresentada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, uma sonda ou iniciador de hibridização hibridiza ao longo de seu comprimento para um comprimento correspondente de um ácido nucléico que possui a sequência como apresentada em qualquer um dos ácidos nucléicos listados nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de rigor baixo. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de rigor moderado. Em uma modalidade, as condições de hibridização são de rigor elevado.

[0082] Em uma modalidade, é fornecida uma planta transgênica que compreende um ácido nucléico sintético que codifica qualquer uma ou mais das glucanases descritas nesse relatório descritivo. As (uma ou mais) glucanases expressas na planta transgênica descritas nesse relatório descritivo podem ter atividade em um pH que varia de 2,0 a 10,00. O pH pode ser 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 9,0, 9,5 ou 10 ou um pH dentro de uma faixa entre quaisquer dois dos valores de pH citados anteriormente (inclusive pontos finais). As (uma ou mais) glucanases expressas em uma planta transgênica descritas nesse relatório descritivo podem ter atividade quando expostas a uma temperatura em uma faixa de 25°C a 130°C, inclusive pontos finais. A temperatura pode ser de 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C, 120°C, 125°C, 130°C, 25°C a 30°C, 25°C a 35°C, 25°C a 40°C, 25°C a 45°C, 25°C a 50°C, 25°C a 55°C, 25°C a 60°C, 25°C a 65°C, 25°C a 70°C, 25°C a 75°C, 25°C a 80°C, 25°C a 85°C, 25°C a 90°C, 25°C a 95°C, 25°C a 100°C, 25°C a 105°C, 25°C a 110°C, 25°C a 115°C, 25°C a 120°C, 25°C a 125°C, ou menor do que 130°C. A glucanase expressa na planta transgênica pode ter a atividade aumentada comparada com a glucanase que possui uma sequência de aminoácidos idêntica, mas expressa em uma célula bacteriana. A glucanase pode ter estabilidade térmica aumentada, comparada com a atividade da glucanase expressa na célula bacteriana.

[0083] As (uma ou mais) glucanases podem ser produzidas em qualquer planta transgênica. A planta transgênica pode ser, sem limitação, trigo, milho, soja, cevada e sorgo.

[0084] Em uma modalidade, é fornecido um método de produção de uma planta transgênica que inclui uma glucanase. O método pode incluir o contato de uma célula de planta com qualquer um dos ácidos nucléicos sintéticos descritos nesse relatório descritivo. Os ácidos nucléicos sintéticos podem ser parte de qualquer um dos vetores descritos nesse relatório descritivo. O vetor pode incluir um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. A glucanase pode compreender, consistir basicamente ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 4 [AGR2314], ID. DE SEQ. N°: 5 [AGR2414] e ID. DE SEQ. N°: 6 [AGR2514]. O método também pode incluir a regeneração de uma planta transgênica a partir da célula da planta transgênica. O método pode incluir a seleção da planta transgênica que expressa uma glucanase.

[0085] A planta transgênica descrita nesse relatório descritivo também é denominada um “evento”. Um evento é caracterizado pela presença do transgene que compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. O termo “evento” também se refere à região genômica do progenitor transformado que compreende a sequência de ácido nucléico sintética inserida e as sequências genômicas parentais que flanqueiam a inserção. O termo “evento” também se refere à prole produzida por cruzamento da planta transgênica e uma planta não transgênica com os mesmos antecedentes genéticos. O termo “linhagem” também se refere à prole produzida por cruzamento da planta transgênica e uma planta não transgênica com quaisquer antecedentes genéticos. Após cruzamentos repetidos, o transgene e as sequências flanqueadoras do progenitor originalmente transformado podem estar presentes em uma planta da prole na mesma localização no genoma ou no mesmo cromossomo que no progenitor transformado.

[0086] A planta transgênica pode ser homozigota para o transgene que compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase.

[0087] A planta transgênica pode ser hemizigota para o transgene que compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase. Para a produção de plantas homozigotas que expressam uma glucanase, uma planta transgênica hemizigota pode ser autofecundada. A prole pode ser obtida a partir desses cruzamentos. A prole pode incluir plantas homozigotas, hemizigotas e do tipo selvagem. Uma planta hemizigota pode ser fenotipicamente indistinguível das plantas do tipo selvagem. O método pode incluir a análise da prole quanto à presença do transgene e a seleção de uma planta da prole que inclua o transgene. Um método de identificação do evento homozigoto por PCR é descrito nesse relatório descritivo no Exemplo 8.

[0088] Em uma modalidade, o método pode ainda incluir o cruzamento de uma planta transgênica hemizigota com outra planta transgênica hemizigota para o mesmo transgene. O método pode incluir a seleção de uma primeira planta da prole que é homozigota para o transgene. O método pode ainda incluir o cruzamento da planta transgênica com uma planta do tipo selvagem com os mesmos antecedentes genéticos, ou com antecedentes genéticos diferentes. A prole pode ser obtida a partir desses cruzamentos. A prole pode incluir plantas hemizigotas e do tipo selvagem. O método pode incluir a seleção de uma primeira planta da prole que é hemizigota para o transgene. O método pode ainda incluir a autofecundação da primeira planta hemizigota da prole e a seleção de uma segunda planta da prole que é homozigota para o transgene que compreende uma sequência de ácidos nucléicos sintética que codifica uma glucanase.

[0089] A glucanase pode ter atividade e estabilidade térmica aumentadas quando exposta a altas temperaturas, como descrito nesse relatório descritivo.

[0090] Foi descoberto inesperadamente que a expressão e acúmulo de uma enzima em uma planta dá a enzima estabilidade térmica adicional em relação à mesma enzima que é produzida de forma microbiana.

[0091] Em uma modalidade, o método de produção de uma planta transgênica inclui transformação. Para transformação, o ácido nucléico pode ser introduzido em um vetor. Vetores adequados podem ser vetores de clonagem, vetores de transformação, vetores de expressão ou vetores baseados em vírus. A porção do cassete de expressão de um vetor pode ainda incluir um elemento regulador ligado operacionalmente a um ácido nucléico que codifica uma glucanase. Nesse contexto, ligado operacionalmente significa que o elemento regulador transmite sua função no ácido nucléico. Por exemplo, um elemento regulador pode ser um promotor, e o promotor ligado operacionalmente controlaria a expressão do ácido nucléico.

[0092] A expressão de um ácido nucléico que codifica uma glucanase pelo cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor que permite a transcrição do ácido nucléico em uma planta. O promotor pode ser um promotor constitutivo, ou tecido-específico, ou um promotor indutível. Um promotor constitutivo pode permitir a transcrição do ácido nucléico pela maioria das células e tecidos da planta e durante muitos estágios de desenvolvimento, mas não necessariamente em todos os estágios. Um promotor indutível pode iniciar a transcrição da sequência de ácidos nucléicos apenas quando exposto a um estímulo químico ou ambiental particular. Um promotor tecido-específico pode ser capaz de iniciar a transcrição em um tecido de planta particular. O tecido de planta pode ser, sem limitação, um caule, folhas, tricomas, anteras, espiga, semente, endosperma ou embrião. O promotor constitutivo pode ser, sem limitação, o promotor de ubiquitina de milho (ZmUbi1), promotor de vírus do mosaico da couve-flor (CAMV) 35S, o promotor de “Cestrum Yellow Leaf Curling Virus” (CMP), o promotor de actina ou o promotor de subunidade pequena de Rubisco. O promotor tecido-específico pode ser o promotor de globulina de milho (ZmGlb1), o promotor de glutelina de arroz (prGTL), o promotor de zeína do milho (ZmZ27) ou o promotor de oleosina do milho (ZmOle). O promotor pode promover a transcrição de um polinucleotídeo sintético que possui uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 7 [pAG4258], ID. DE SEQ. N°: 8 [pAG4588], ID. DE SEQ. N°: 9 [pAG4597], ID. DE SEQ. N°: 10 [pAG4708], ID. DE SEQ. N°: 11 [pAG4766], ID. DE SEQ. N°: 12 [pAG4767], ID. DE SEQ. N°: 13 [pAG4770], ID. DE SEQ. N°: 14 [pAG4771], ID. DE SEQ. N°: 15 [pAG4257], ID. DE SEQ. N°: 16 [pAG4692], ID. DE SEQ. N°: 17 [pAG4693], ID. DE SEQ. N°: 18 [pAG4705] e ID. DE SEQ. N°: 19 [pAG4706] e expressão de glucanase que é capaz de degradar um polissacarídeo.

[0093] Em uma modalidade, a transformação no método de produção de uma planta transgênica pode ser transformação estável, em que o ácido nucléico que codifica a glucanase se integra no genoma da planta transformada. A transformação pode ser transformação mediada por Agrobacterium usando um vetor adequado à transformação estável descrita nesse relatório descritivo. O método de produção de uma planta transgênica pode incluir quaisquer outros métodos para a transformação de plantas, por exemplo, bombardeamento de partículas, ou transformação de protoplasto por meio de captação direta de DNA. A planta transgênica pode incluir qualquer ácido nucléico sintético, sequência de aminoácidos ou vetor descritos nesse relatório descritivo.

[0094] Em uma modalidade, o método de produção de uma planta transgênica pode incluir a transformação transitória para expressar transitoriamente a proteína recombinante. O termo “expressão transitória” se refere à expressão de uma molécula de ácido nucléico exógena liberada em uma célula, por exemplo, uma célula de planta, e não integrada no cromossomo da célula de planta. A expressão de moléculas de ácido nucléico exógenas extracromossômicas pode ser detectada após um período de tempo após a liberação de um DNA. Vetores baseados em vírus podem ser usados para carregar e expressar moléculas de ácido nucléico exógenas. Vetores baseados em vírus podem replicar e se espalhar sistemicamente dentro da planta. O uso de vetores baseados em vírus pode levar a níveis muito elevados de acúmulo de glucanase em plantas transgênicas.

[0095] Métodos de produção de uma planta transgênica, métodos de aumento da utilização de polissacarídeos não- amido em um animal, métodos para o aumento da produção de açúcares fermentáveis de grãos, métodos para o aumento da energia metabolizável de uma dieta, métodos de preparação de uma ração animal e métodos para a produção de plantas homozigotas modificadas geneticamente para um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase podem compreender um método de detecção descrito nesse relatório descritivo como parte da produção de plantas transgênicas e/ou de identificação de plantas, biomassa de planta ou ração animal que compreendem um ácido nucléico sintético descrito nesse relatório descritivo.

[0096] Uma modalidade compreende um kit para identificação do evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 em uma amostra. O kit pode compreender um primeiro iniciador e um segundo iniciador.

[0097] O primeiro iniciador e o segundo iniciador podem ser capazes de amplificação de uma sequência-alvo específica para um evento. A sequência-alvo pode incluir um ácido nucléico com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 51 55. A sequência-alvo pode ser uma sequência incluída em uma junção entre uma sequência genômica de uma planta transformada e uma sequência da inserção de T-DNA. A sequência-alvo pode estar incluída em uma sequência com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 22-31.

[0098] O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 38, 41 e 47. O kit pode compreender o segundo iniciador que compreende uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 39, 42, 43, 45 e 46. O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 38 e o segundo iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 39. O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 41 e o segundo iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 42. O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 41 e o segundo iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 43. O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 47 e o segundo iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 45. O kit pode compreender o primeiro iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 47 e o segundo iniciador que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 46. O primeiro iniciador e o segundo iniciador podem ser capazes de amplificar a sequência-alvo para produzir um produto amplificado. O produto amplificado ou a sequência- alvo pode ser capaz de hibridizar para a sequência do ácido nucléico que compreende uma sequência do ID. DE SEQ. N°: 40, ou ID. DE SEQ. N°: 44 sob condições de rigor elevado. A sequência-alvo pode ser usada como uma sonda para o diagnóstico de qualquer um dos eventos descritos nesse relatório descritivo.

[0099] Uma amostra pode incluir qualquer amostra na qual ácidos nucléicos de matéria de planta estão presentes. Uma amostra pode ser uma amostra de proteína. Uma amostra de proteína pode incluir qualquer amostra na qual proteínas de matéria de planta estão presentes. A amostra ou amostra de proteína pode incluir qualquer matéria de planta. A matéria de planta pode derivar de uma planta ou parte desta. O material de planta pode derivar de uma ração ou alimento animal.

[00100] Em uma modalidade, é fornecido um método de identificação do evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 em uma amostra. O método pode incluir o contato de uma amostra com um primeiro iniciador e um segundo iniciador. O método pode incluir a amplificação de um polinucleotídeo sintético que compreende uma sequência-alvo específica para o evento de milho. A sequência-alvo pode ser qualquer sequência-alvo descrita nesse relatório descritivo. O primeiro iniciador e o segundo iniciador podem ser capazes de amplificação da sequência-alvo para produzir um produto amplificado. O produto amplificado pode ser usado para determinar se uma planta que resultou de um cruzamento sexual ou autofecundação contém um ou mais dos eventos sequências- alvo- e diagnóstico-específicos. O comprimento do produto amplificado da amostra do evento de milho pode diferir do comprimento do produto amplificado da amostra de planta do tipo selvagem com os mesmos antecedentes genéticos. O produto amplificado da amostra do evento pode ainda ser usado como uma sonda que hibridiza para um polinucleotídeo sintético que compreende uma região específica que codifica uma glucanase sob condições de rigor elevado. O método pode ainda incluir a detecção de hibridização da (pelo menos uma) sonda para a região específica da sequência-alvo.

[00101] Em uma modalidade, é fornecida uma ração animal que compreende qualquer uma ou mais das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo ou partes das plantas transgênicas. O termo “ração animal” se refere a qualquer alimento, ração, composição de ração, dieta, preparação, aditivo, suplemento ou mistura adequada e destinada à ingestão por animais para sua nutrição, manutenção ou crescimento. As glucanases incluídas nas plantas transgênicas e na ração animal podem ser ativas no ambiente gastrintestinal ou do rúmen de animais. O animal pode ser um animal monogástrico. O animal pode ser um animal ruminante. O animal monogástrico pode ser, sem limitação, uma galinha, um peru, um pato, um suíno, um peixe, um gato ou um cão. O animal ruminante pode ser, sem limitação, gado, uma vaca um touro, um carneiro ou uma cabra. As glucanases podem ser ativas após preparação da alimentação animal. As temperaturas às quais as rações são expostas durante ensilamento podem estar dentro da faixa de 20°C a 70°C. A temperaturas às quais as rações são expostas durante peletização podem estar dentro da faixa de 70°C a 130°C. As glucanases podem ter estabilidade térmica aumentada e podem reter a atividade após serem expostas a temperaturas elevadas durante a peletização da ração. A glucanase com estabilidade térmica aumentada pode compreender, consistir basicamente ou consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70, 72, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 4 [AGR2314], ID. DE SEQ. N°: 5 [AGR2414] e ID. DE SEQ. N°: 6 [AGR2514].

[00102] Em uma modalidade, uma glucanase pode ser isolada da planta transgênica antes de ser incluída na ração animal. A glucanase pode ser qualquer uma das glucanases descritas nesse relatório descritivo.

[00103] Em uma modalidade, a ração animal pode ainda incluir um suplemento de ração. O suplemento de ração pode ser qualquer material de planta. O material de planta pode ser uma planta não transgênica ou uma parte desta. O material de planta pode incluir uma planta modificada geneticamente ou uma planta mutante. O suplemento de ração pode ser um mineral. O mineral pode ser um micromineral. O mineral pode ser um macromineral. O suplemento de ração pode ser pelo menos uma vitamina. A (pelo menos uma) vitamina pode ser uma vitamina lipossolúvel. O suplemento de ração pode incluir uma ou mais enzimas exógenas. As (uma ou mais) enzimas exógenas podem incluir uma enzima hidrolítica. A enzima hidrolítica pode ser uma enzima classificada sob EC3.4 como hidrolase. As enzimas hidrolíticas podem ser, sem limitação, xilanases, mananases, carboidrases, proteases peptidases, fitases, celulases, lipases, fosfolipases, pectinases, galactosidases, lacases, amilases, hemicelulases ou celobiohidrolases. As enzimas hidrolíticas podem ser expressas nas plantas modificadas geneticamente ou partes destas incluídas no suplemento de ração. O suplemento de ração pode incluir enzimas hidrolíticas purificadas. Os suplementos de ração podem ser, sem limitação, aditivos que aumentam o crescimento, agentes corantes, flavorizantes, estabilizantes, calcário, estearina, amido, sacarídeos, ácidos graxos ou uma goma. Os agentes corantes podem ser carotenóides. Os carotenóides podem ser, sem limitação, cantaxantina, betacaroteno, astaxantina ou luteína. Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos poliinsaturados. Os ácidos graxos poliinsaturados podem incluir, sem limitação, ácido araquidônico, ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA) ou ácido gama-linoléico. O suplemento de ração pode ser uma planta não transgênica ou uma parte desta. A planta não transgênica ou parte desta pode incluir pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em: cevada, trigo, centeio, aveia, milho, arroz, beterraba triticale, beterraba açucareira, espinafre, repolho, quinoa, farelo de milho, péletes de milho, óleo de milho, grãos de destilaria, forragem, farelo de trigo, péletes de trigo, grão de trigo, grão de cevada, péletes de cevada, farelo de soja, bagaço oleaginoso de soja, farelo de tremoço, farelo de canola, grão de sorgo, péletes de sorgo, canola, semente de girassol e semente de algodão.

[00104] O suplemento de ração pode incluir pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em: sólidos solúveis, gordura, vermiculita, calcário, sal comum, DL- metionina, L-lisina, L-treonina, monensina sódica COBAN® PREMIX, pré-mistura de vitamina, fosfatos inorgânicos de ração, fosfato monocálcico, fosfato dicálcico, fosfato tricálcico, fosfato monodicálcico, fosfato natural, pré- mistura de selênio, cloreto de colina, cloreto de sódio e pré-mistura mineral.

[00105] O suplemento de ração pode incluir farelo de peixe, óleo de peixe, farelo de osso, farelo de penas e gordura animal. O suplemento de ração pode incluir levedura ou extrato de levedura.

[00106] Em uma modalidade, é fornecido um método de produção de uma ração animal. O método pode compreender a inclusão de uma planta transgênica que inclui qualquer uma ou mais glucanases descritas nesse relatório descritivo na ração animal. A ração animal pode compreender, consistir basicamente ou consistir na planta transgênica. O método pode ainda incluir a combinação da planta transgênica com um suplemento de ração. O suplemento de ração pode ser uma planta não transgênica ou uma parte desta. A planta transgênica pode ser produzida por qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo. O suplemento de ração pode ser um mineral. O suplemento pode incluir uma ou mais enzimas exógenas. As enzimas exógenas podem ser, sem limitação, xilanases, mananases, carboidrases, proteases, peptidases, fitases, celulases, lipases, fosfolipases, pectinases, galactosidases, lacases, amilases, hemicelulases ou celobiohidrolases.

[00107] Em uma modalidade, é fornecido um método de produção de carne. O método pode incluir a alimentação de uma ração animal ou uma produzida por qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo ao animal. O método pode incluir a preparação de uma ração animal que inclui uma planta transgênica que expressa uma glucanase.

[00108] Em uma modalidade, é fornecido um método de alimentação de um animal. O método pode incluir a alimentação de uma ração animal ou uma produzida por qualquer um dos métodos descritos nesse relatório descritivo ao animal. O método pode incluir a preparação de uma ração animal que inclui uma planta transgênica que expressa uma glucanase.

[00109] Em uma modalidade, é fornecido um método de aumento de utilização de polissacarídeos não-amido em um animal. O método pode incluir a alimentação de um animal com uma ração animal que inclui qualquer uma ou mais das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo. O método pode incluir a preparação da ração animal.

[00110] Em uma modalidade, é fornecido um método de diminuição da viscosidade gastrintestinal em um animal. O método pode incluir a alimentação de um animal com uma ração animal que inclui qualquer uma ou mais das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo. O método pode incluir a preparação da ração animal.

[00111] A adição de enzimas exógenas coletivamente conhecidas como carboidrases pode melhorar os efeitos de polissacarídeos não-amido (NSPs) na dieta de um animal. Uma ração animal que inclui qualquer uma ou mais das glucanases descritas nesse relatório descritivo pode aumentar a utilização de NSPs pelo animal que ingeriu a ração, ou pode diminuir os efeitos antinutricionais do NSP sobre o animal que ingeriu a ração, e aumentar o crescimento do animal. A preparação da ração animal pode incluir a combinação de uma ou mais plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo com qualquer outro suplemento de ração. A glucanase pode ser isolada, purificada e adicionada à ração animal como uma glucanase pura. A glucanase pode ser adicionada à ração animal misturada com outros suplementos de ração. A planta transgênica que inclui a glucanase ou a glucanase purificada pode ser combinada com outros suplementos de ração para formar pré-misturas.

[00112] Uma ração animal pode ser produzida como ração farelada. A ração animal pode ser produzida como péletes. Os materiais triturados da ração podem ser misturados com a pré-mistura que inclui qualquer uma das plantas transgênicas que incluem uma glucanase. Os materiais triturados da ração podem incluir o material de planta e os suplementos de ração descritos nesse relatório descritivo. Os suplementos de ração podem incluir uma ou mais enzimas exógenas descritas nesse relatório descritivo. Enzimas podem ser adicionadas como formulações líquidas ou sólidas. Para ração farelada, uma formulação de enzima sólida ou líquida pode ser adicionada antes ou durante a etapa de misturação. Para ração peletizada, a preparação de enzima pode ser adicionada antes ou depois da etapa de peletização. A glucanase pode ser incluída em uma pré-mistura. A pré-mistura também pode incluir vitaminas e microminerais. Macrominerais podem ser adicionados separadamente à ração animal.

[00113] Em uma modalidade, é fornecido um método de aumento da energia metabolizável de uma dieta. Energia metabolizável (ME) se refere à energia líquida de uma dieta ou ração que está disponível a um animal após a utilização de alguma energia nos processos de digestão e absorção e a perda de uma parte do material como sendo não digeridos ou indigeríveis. A energia metabolizável pode ser energia metabolizável aparente (AME) medida como a diferença entre as calorias da ração consumida por um animal e excrementos coletados após consumo de ração. A energia metabolizável pode ser energia metabolizável verdadeira (TME), que é similar à AME, exceto que ela também leva em conta energia endógena. O conteúdo de energia em uma dieta ou ingredients de ração pode ser determinado com o uso de uma entre várias metodologias (NRC. 1994. “Nutrient Requirements of Poultry”. 9a Edição Revisada, Natl. Acad. Press Washington DC, que é incorporado nesse relatório descritivo como se totalmente descrito). A energia bruta (GE) é a medida direta com o uso de um calorímetro de bomba adiabática, que mede o calor de combustão de uma amostra dentro de uma atmosfera rica em oxigênio. A energia digerível aparente (DE) é a GE de uma ração ou comida para animais menos a GE somente das fezes. A energia metabolizável aparente (AME) é a GE de uma ração ou comida para animais menos a GE das fezes, urina e produtos gasosos da digestão. Para aves domésticas, a liberação gasosa é muito baixa, e tipicamente desprezada em função de seu valor muito pequeno, e a urina e fezes são excretadas juntas e não são coletadas separadamente na maioria dos casos. A energia metabolizável verdadeira (TME) considera somente a GE do material excretado que se origina da ração ou da comida para animais, por subtração da perda de energia endógena não originada da ração (ou seja, descarte de células do trato intestinal). Outra medição de energia usada para comidas para animais em animais é a energia líquida (NE), que se ajusta ao incremento calórico. Na medida em que o incremento calórico é dependente do nível de produtividade, que flutua em aves domésticas por causa da expectativa de vida curta, essa variável não é frequentemente usada em aves domésticas.

[00114] O ensaio da TME de galos pode ser usado para levar em conta perdas endógenas (não alimentares) de GE por inclusão de um galo em jejum e coleta de excrementos para corrigir a GE do galo alimentado (ração/comida para animais). Veja Sibbald, 1976, Poultry Science 55: 303-308, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito. Esse ensaio tem sido comumente usado para determinação da TME de comidas para animais individuais, ao invés alimentação completa, e exige que galos cecotomizados (cecos removidos cirurgicamente) estejam sempre disponíveis. O ensaio envolve alimentação forçada (no papo) de uma quantidade conhecida de um ingrediente (em pássaros que ficaram previamente em jejum por 24-48 horas) e depois a coleta de fezes por um período de 24-48 horas. A equação usada para calcular a TME é dada como TME = {(GEf x FI)- [(GEe x EO)+ - (GEe x EO)-]} / FI, em que a energia bruta (GE) é determinada por calorimetria por bomba em kcal/kg; FI é ingesta de ração (kg); EO é a saída de excrementos de pássaros alimentados (kg); GEe é a energia bruta do conteúdo de excrementos; GEf é a energia bruta da ração; “+” significa a quantidade da saída de energia de pássaros alimentados; e “-” significa que a quantidade é a saída de energia de pássaros em jejum. Os galos (ou perus) usados nos ensaios de TME são pássaros adultos com um trato digestivo totalmente desenvolvido. Pesquisas demonstraram que há diferenças nas determinações da ME usando galos (raças poedeiras), perus e frangos quando são analisados os mesmos ingredientes de ração (Cozannet e cols., 2010 J. Anim. Sci., 88 (7): 2.382-2.392, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito). Portanto, a determinação da TME ou da AME usando o modelo em galos pode não ser equivalente ao que é observado em um frango jovem, mas é um substituto comumente usando em pesquisas e indústria.

[00115] Para frangos, o ensaio da AME pode ser usado para determinação da ração completa e algumas comidas para animais que fornecem energia, bem como o efeito da adição de ingredientes de ração que auxiliam na digestão. Há dois métodos comuns para determinação da ME: 1) a realização de uma coleta de excremento total e pesagem e registro do consumo de ração durante o período de tempo (Equação 1 abaixo) ou 2) utilização de um marcador indigerível na ração (óxido crômico, óxido de titânio ou cinza insolúvel em ácido) e coleta de uma subamostra de fezes sem necessidade de pesar (Equação 2 abaixo). Pode ser usado o método de determinação da AME com marcador, no qual não é necessário pesar o consumo de ração ou coleta fecal total e não há necessidade de separar ração presente nos coletores de fezes. Com o método do marcador, os pássaros são alimentados com o marcador por pelo menos dois dias (mas, preferivelmente, cinco ou mais dias). As fezes são coletadas ao longo de vários dias (por exemplo, três dias) com a coleta diária reunida em uma amostra.

[00116] A AME usando o método coleta total (Equação 1) é calculada da seguinte forma: AME = [(GEf x FI)- (GEe x EO)] / FI, em que a energia bruta (GE) é medida por calorimetria por bomba (kcal/kg); FI é a ingesta de ração (kg); EO é a saída de excrementos (kg); e se refere ao conteúdo de excremento; e f se refere ao conteúdo de ração. A AME com o uso do método do marcador é calculada como AME = [(GEe / Me)- (GEf / Mf)] / (GEe / Me), em que a energia bruta é GE (kcal/kg); M é o marcador (ppm ou %); “e” = conteúdo de excremento; “f” = conteúdo de ração.

[00117] Outro método que pode ser usado para determinar a AME de ração quando são investigados aditivos de ração que auxiliam na digestão é a energia digerível Ileal (IDE). Esse método usa o método da AME com marcador (descrito acima), mas os pássaros são sacrificados e um corte do íleo é retirado e o conteúdo removido, seco e analisado para GE e para o marcador. O método de IDE pode ser usado eficazmente para a testagem e comparação de aditivos de ração usados para melhorar a digestão/absorção de energia da ração. O benefício da IDE é que não há necessidade de gaiolas com recipientes de coleta durante um estudo de floor-pen. Com o método do marcador, os pássaros são alimentados com o marcador por pelo menos dois dias (e, preferivelmente, cinco ou mais dias).

[00118] A AME usando o método de IDE com marcador (Equação 2) é calculada da seguinte forma: AME = GEf - (GEd x Mf / Md), em que GE (kcal/kg); M representa o marcador; “d” representa o conteúdo de digesta; e “f” significa o conteúdo de ração.

[00119] AME e TME podem ser corrigidas para retenção de nitrogênio (AMEn e TMEn). Para ajustar, os gramas de N são multiplicados por 8,22 kcal/g (GE de ácido úrico; produto excretório primário de tecido de proteína oxidado para energia), que também é subtraído da GE consumida. Veja Hill, F.W. e D.L. Anderson, 1958, “Comparison of Metabolizable Energy and Productive Energy Determinations with Growing Chicks”, J. Nutr. 64: 587-603, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito. Os cálculos para a coleta total do método do marcador para AMEn são mostrados na Equação 3 e Equação 4 abaixo, respectivamente.

[00120] Equação 3: AMEn, coleta total: AMEn = {(GEf x FI) - (GEe x EO) - [8,22 x (Nf - Ne)]} / FI em que GE = kcal/kg; FI = ingesta de ração (kg); EO = saída de excrementos (kg); N = nitrogênio (g); e = conteúdo de excremento; f = conteúdo de ração.

[00121] Equação 4: IDEn, método do marcador: AMEn = GEf - (GEd x Mf / Md) - {8,22 x [Nf - (Nd x Mf / Md)]} em que GE = kcal/kg; M = marcador; N = nitrogênio (g/kg)”d”= conteúdo de digesta; “f”= conteúdo de ração.

[00122] Embora o método de TME possa ser usado para determinação de ME de ingredientes individuais, o método de AME (IDE) pode ser usado com frangos para medir a ME em ingredientes individuais ou dieta total e testagem dos efeitos que aumentam a ME por uso de enzimas ou outros aditivos de ração.

[00123] Uma dieta ou ração pode incluir qualquer ingrediente de ração ou mistura de ingredientes, incluindo água. A dieta pode ser qualquer alimento, ração, composição de ração, dieta, preparação, aditivo, suplemento ou mistura incluída em uma ração animal descrita nesse relatório descritivo. As dietas são conhecidas na técnica e descritas pelo menos nas seguintes publicações: “Nutrient Requirements of Poultry”, 1994, National Research Council, National Academy Press, Washington, D.C.; “Broiler Performance and Nutrition Supplement, Cobb-500™”, L-2114-07EN, Julho de 2015; “Broiler Performance and Nutrition Supplement, Cobb- 700™”, L- 21124-13EN, 21 de dezembro de 2012; “Broiler Performance and Nutrition Supplement, CobbAvian™”, L-2144- 04EN, Abril de 2012; “Broiler Performance and Nutrition Supplement, CobbSasso™”, L-2154-01, 7 de maio de 2008; “Ross 308 Broiler: Nutrition Specifications”, 2014 Aviagen, 0814- AVNR-035; “Ross Nutrition Supplement”, 2009, Aviagen; “Ross 708 Broiler: Nutrition Specification”, 2014 Aviagen, 0814- AVNR-036; “Ross PM3 Brioler Nutrition Specification”, 2014 Aviagen, 0814-AVNR-037; “Arbor Acres Plus Broiler Nutrition Specifications”, 2014 Aviagen, 1014-AVNAA-043; “Arbor Acres Broiler Nutrition Supplement”, 2009 Aviagen; e “Association of American Feed Control Officials” (AAFCO) 2015 “Official Publication, Nutrient Requirements for Poultry”, todos incorporados nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descritos.

[00124] Em uma modalidade, a dieta pode ser uma dieta para frangos. A dieta para frangos pode ser composta por um ou mais dos seguintes ingredientes: 51,49% (p/p)-61,86% (p/p) de milho, 25,45% (p/p)-35,03% (p/p) de farelo de soja, 5,00% (p/p) de grãos secos de destilaria de milho mais sólidos solúveis, 2,00% (p/p) de vermiculita, 0,30% (p/p)- 1,99% (p/p) de fosfato dicálcico, 1,00% (p/p) de gordura de aves domésticas, 0,81% (p/p)-4,01% (p/p) de calcário, 0,24% (p/p)-0,50% (p/p) de sal (NaCl), 0,13% (p/p)-0,45% (p/p) de DL-metionina, 0,20% (p/p) de cloreto de colina 60, 0,20% (p/p) de pré-mistura mineral, 0,05% (p/p) de pré-mistura de vitamina, 0,13% (p/p)-0,23% (p/p) de L-lisina, 0,08% (p/p)- 0,14% (p/p) de L-treonina, 0,05% (p/p) de COBAN®, 0,05% (p/p) de pré-mistura de selênio, 0,15% (p/p) de bicarbonato de sódio e 0,10% (p/p) de areia. A lisina digerível na dieta pode ser 1,00% (p/p) até 1,20% (p/p). Metionina digerível na dieta pode ser 0,47% (p/p) até 0,54% (p/p). Metionina e cisteína digeríveis na dieta podem ser 0,98% (p/p) até 1,10% (p/p). Treonina digerível na dieta pode ser 068% (p/p) até 084% (p/p). Triptofano digerível na dieta pode ser 0,17% (p/p) até 0,22% (p/p). O cálcio na dieta pode ser 0,71% (p/p) até 0,96% (p/p). Fósforo disponível na dieta pode ser 0,17% (p/p) até 0,46% (p/p). Sódio na dieta pode ser 0,17% (p/p) até 0,19% (p/p). A concentração de cada ingrediente dentro de qualquer uma das faixas citadas nesse relatório descritivo pode ser qualquer valor entre quaisquer dois dos pontos de concentração incluídos na faixa. Em uma modalidade, a dieta pode ser a dieta para frangos composta por um ou mais dos seguintes ingredientes: 30,00% (p/p)-75,00% (p/p) de milho, 5,00% (p/p)-75,00% (p/p) de trigo; 5,00% (p/p)-65,00% (p/p) de cevada; 5,00% (p/p)-30,00% (p/p) de sorgo, 5,00% (p/p)- 50,00% (p/p) de painço, 10,00% (p/p)-45,00% (p/p) de farelo de soja, 5,00% (p/p) - 20,00% (p/p) de farelo de Canola, 2,00% (p/p) - 15,00% (p/p) de farelo de glúten de milho, 5,00% (p/p)-15,00% (p/p) de farelo de girassol, 5,00% (p/p)- 30,00% (p/p) de grãos secos de destilaria de milho mais sólidos solúveis, 1,00% (p/p)-8,00% (p/p) de farelo de carne e osso de aves domésticas/suínos/bovinos, 1,00% (p/p)-8,00% (p/p) de farelo de peixe, 0,10% (p/p)-2,1% (p/p) de fosfato dicálcico ou monocálcico ou desfluorizado, 0,50% (p/p)-6,00% (p/p) de óleo de soja ou óleo vegetal ou gordura ou banha animal ou combinação, 0,81% (p/p)-2,00% (p/p) de calcário, 0,50% (p/p)-7,00% de cascas de soja, 0,24%(p/p)-0,50% (p/p) de sal (NaCl), 0,13% (p/p)-0,50% (p/p) de DL-metionina, 0,01% (p/p)-0,20% (p/p) de cloreto de colina 60, 0,10% (p/p)-0,20% (p/p) de pré-mistura mineral, 0,05% (p/p)-0,25% (p/p) de pré-mistura de vitamina, 0,05% (p/p)-0,30% (p/p) de L- lisina, 0,10% (p/p)-0,30% (p/p) de DL-Metionina ou análogo de metionina (MHA), 0,05% (p/p)-0,20% (p/p) de L-treonina, 0,05% (p/p) de COBAN®, 0,05% (p/p) de pré-mistura de selênio, 0,05% (p/p)-0,15% (p/p) de bicarbonato de sódio e 250 FTU/kg - 2.000 FTU/kg de fitase. A energia metabolizável da dieta pode ser 2.700 (kcal/kg)- 3.287 (kcal/kg). A proteína bruta (CP) na dieta pode ser 15% (p/p) até 25% (p/p). Lisina digerível na dieta pode ser 0,85% (p/p) até 1,30% (p/p). Metionina digerível na dieta pode ser 0,45% (p/p) até 0,70% (p/p). Metionina e cisteína digeríveis na dieta podem ser 0,65% (p/p) até 1,10% (p/p). Treonina digerível na dieta pode ser 0,60% (p/p) até 0,84% (p/p). Triptofano digerível na dieta pode ser 0,10% (p/p) até 0,25% (p/p). Cálcio na dieta pode ser 0,68% (p/p) até 1,10% (p/p). Fósforo disponível na dieta pode ser 0,17% (p/p) até 0,50% (p/p). Sódio na dieta pode ser 0,17% (p/p) até 0,19% (p/p). Fitase na dieta pode ser 500 FTU/kg (p/p) até 8.000 FTU/kg (p/p). A concentração de cada ingrediente dentro de qualquer uma das faixas citadas nesse relatório descritivo pode ser qualquer valor entre quaisquer dois dos pontos de concentração incluídos na faixa. Variações nas concentrações desses ingredientes também podem ser usadas em uma dieta.

[00125] O método pode incluir uma misturação de uma planta transgênica ou parte desta com um ingrediente de ração para obter uma mistura. O ingrediente de ração pode ser um ou mais ingredientes incluídos na dieta descrita nesse relatório descritivo. A planta transgênica ou parte desta pode ser qualquer planta transgênica ou parte desta descrita nesse relatório descritivo. O método pode incluir a alimentação de um animal com a mistura. O ganho de peso corporal (BWG) em um animal alimentado com a mistura que compreende uma glucanase pode ser maior do que o BWG em um animal de controle alimentado com ingredientes de ração idênticos não misturados com uma planta transgênica que inclui uma glucanase. Em uma modalidade, o BWG em um animal alimentado com a mistura que compreende uma glucanase pode ser similar ao BWG em um animal de controle alimentado com uma dieta rica em energia ou uma dieta que inclui mais ou concentrações maiores dos ingredientes, comparada com a mistura que inclui uma glucanase. Em uma modalidade, a proporção de conversão alimentar (FCR) em um animal alimentado com a mistura que compreende uma glucanase pode ser menor do que a FCR em um animal de controle alimentado com ingredientes de ração idênticos não misturados com uma planta transgênica que inclui uma glucanase. A FCR é definida como a massa da ração comida pelo animal dividida pela massa do animal. Em uma modalidade, a FCR em um animal alimentado com a mistura que compreende uma glucanase pode ser similar à FCR em um animal de controle alimentado com uma dieta rica em energia ou uma dieta que inclui mais ou concentrações maiores dos ingredientes, comparada com a mistura que inclui uma glucanase.

[00126] Em uma modalidade, é fornecido um método de aumento da estabilidade térmica de uma glucanase. O método pode incluir a produção de uma planta transgênica que inclui um ácido nucléico sintético que codifica a glucanase. O ácido nucléico sintético pode incluir qualquer uma das sequências descritas nesse relatório descritivo. A glucanase pode ser termicamente estável mediante exposição a temperaturas na faixa de 70°C a 130°C, inclusive pontos finais.

[00127] A glucanase pode ser termicamente estável mediante exposição a temperaturas em uma faixa de 25°C a 130°C, inclusive pontos finais. A glucanase pode ser termicamente estável mediante exposição a temperaturas na faixa de 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C, 120°C, 125°C, 130°C, 25°C a 30°C, 25°C a 35°C, 25°C a 40°C, 25°C a 45°C, 25°C a 50°C, 25°C a 55°C, 25°C a 60°C, 25°C a 65°C, 25°C a 70°C, 25°C a 75°C, 25°C a 80°C, 25°C a 85°C, 25°C a 90°C, 25°C a 95°C, 25°C a 100°C, 25°C a 105°C, 25°C a 110°C, 25°C a 115°C, 25°C a 120°C, 25°C a 125°C, ou menos do que 130°C. A glucanase pode ser termicamente estável mediante exposição a temperaturas em uma faixa de 70°C a 130°C, inclusive pontos finais. A glucanase pode ser termicamente estável mediante exposição a temperaturas na faixa de 70°C a 75°C, 70°C a 80°C, 70°C a 85°C, 70°C a 90°C, 70°C a 95°C, 70°C a 100°C, 70°C a 105°C, 70°C a 110°C, 70°C a 115°C, 70°C a 120°C, ou 70°C a 130°C, inclusive pontos finais.

[00128] Os ácidos nucléicos sintéticos mencionados acima podem ser fornecidos em modalidades descritas nesse relatório descritivo isoladamente, como parte de outro ácido nucléico, como parte de um vetor ou como definido acima como parte de uma planta transgênica.

[00129] Em uma modalidade, a planta transgênica pode ser derivada de uma de milho, centeio, capim-elefante, miscanto, cana de açúcar ou sorgo. A planta transgênica pode ser feita por transformação mediada por Agrobacterium com o uso de um vetor que possui uma sequência de ácidos nucléicos como apresentada acima.

[00130] Em uma modalidade, é fornecido um método para o aumento da produção de açúcares fermentáveis de grãos. O método pode incluir uma misturação de grãos derivados de qualquer uma das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo com grãos de uma planta diferente para formar grãos misturados. A planta diferente pode ser uma planta não transgênica. A planta diferente pode ser uma planta modificada geneticamente que inclui um ácido nucléico sintético que codifica pelo menos uma enzima hidrolítica. A enzima hidrolítica pode ser, sem limitação, xilanase, uma amilase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma feruloil esterase, uma glicoamilase, uma amilase inteína-modificada, uma xilanase inteína-modificada, uma endoglucanase inteína- modificada, uma exoglucanase inteína-modificada, uma feruloil inteína-modificada, uma esterase inteína- modificada, uma protease, uma protease inteína-modificada, uma fitase ou uma fitase inteína-modificada. O método pode incluir o processamento dos grãos misturados. O processamento pode incluir uma ou mais operações selecionadas do grupo que consiste em colheita, empacotamento, trituração, moagem, picotagem, redução de tamanho, esmagamento, peletização, extração de um componente dos grãos misturados, purificação de um componente ou porção dos grãos misturados, extração ou purificação de amido, hidrólise de polissacarídeos em oligossacarídeos ou monossacarídeos, ensilamento, uma misturação com silagem ou outra biomassa e ensilamento, fermentação, conversão química e catálise química. A biomassa pode ser, sem limitação, feno, palha, palhada, silagem, rações comprimidas e peletizadas, sojas, grãos brotados, legumes, grãos de ração, grãos de milho, arroz, cevada ou trigo. A biomassa pode ser qualquer biomassa derivada de resíduos agrícolas. O método pode incluir a conversão de açúcares fermentáveis em um produto bioquímico. O produto bioquímico pode ser, sem limitação, etanol, butanol, ácido lático, ácido cítrico e ácido acético.

[00131] Em uma modalidade, é fornecido um método para redução da viscosidade de uma mistura de grãos. O método pode incluir uma misturação de grãos derivados de qualquer uma das plantas transgênicas descritas nesse relatório descritivo com grãos de uma planta diferente para formar grãos misturados. Água pode ser adicionada aos grãos misturados para formar a mistura de grãos. A viscosidade da mistura de grãos pode ser menor quando ela inclui qualquer uma das glucanases descritas nesse relatório descritivo. A viscosidade pode ser viscosidade intestinal, que é tipicamente medida de uma amostra intestinal removida de um pássaro ou porco após eutanásia. Nesse método, a amostra da digesta é centrifugada e a viscosidade do sobrenadante é analisada usando um viscosímetro. Por exemplo, como descrito por Lee e cols., a digesta ileal foi centrifugada por 10 min a 3.500 x a gravidade e 0,5 ml de sobrenadante foi colocado em um Viscosímetro “Cone and Plate” de Brookfield 1 com um eixo CPE-40. Veja Lee, J.T., C.A. Bailey e A.L. Cartwright. 2003. “β-Mannanase Ameliorates Viscosity-Associated Depression of Growth in Broiler Chickens Fed Guar Germ and Hull Fractions”, Poult. Sci. 82: 1.925-1.931, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descrito. As amostras são analisadas por 30 segundos a 40°C e 5 rpm, para determinar as leituras em centipoise (unidades de cP). Quanto maior a cP, maior a viscosidade da amostra.

[00132] A planta diferente pode ser uma planta não transgênica. A planta diferente pode ser uma planta modificada geneticamente que inclui um ácido nucléico sintético que codifica pelo menos uma enzima hidrolítica. A enzima hidrolítica pode ser, sem limitação, xilanase, uma amilase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma feruloil esterase, uma glicoamilase, uma amilase inteína-modificada, uma xilanase inteína-modificada, uma endoglucanase inteína- modificada, uma exoglucanase inteína-modificada, uma feruloil esterase inteína-modificada, uma protease, uma protease inteína-modificada, uma fitase ou uma fitase inteína-modificada. O método pode incluir o processamento da mistura de grãos. O processamento pode incluir uma ou mais operações selecionadas do grupo que consiste em colheita, trituração, moagem, redução de tamanho, esmagamento, aquecimento, gelatinização, liquefação, extração de um componente dos grãos misturados, purificação de um componente ou porção dos grãos misturados, extração ou purificação de amido, hidrólise de polissacarídeos em oligossacarídeos ou monossacarídeos, sacarificação, fermentação, conversão química e catálise química.

[00133] Em uma modalidade, é fornecido um método para o aumento da produção de etanol a partir de grãos. O método inclui a realização de qualquer um dos métodos para o aumento da produção de açúcares fermentáveis descritos nesse relatório descritivo.

[00134] A lista seguinte inclui modalidades particulares da presente invenção; mas a lista não é limitante e não exclui modalidades alternativas, como seria observado por aqueles habilitados na técnica.

MODALIDADES

[00135] 1. Uma planta transgênica que compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase, em que a glucanase inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00136] 2. A planta transgênica da modalidade 1, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D- glicopiranosídeo e xilano.

[00137] 3. A planta transgênica de qualquer uma ou ambas as modalidades precedentes, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a um pH na faixa de 4,0 a 10,0.

[00138] 4. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades precedentes, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a uma temperatura na faixa de 25°C a 130°C.

[00139] 5. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades precedentes, em que a atividade de glucanase aumentou a estabilidade mediante expressão na planta, comparada com a atividade de uma glucanase que possui uma sequência de aminoácidos idêntica e expressa em uma célula bacteriana.

[00140] 6. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades precedentes, em que uma planta é selecionada do grupo que consiste em: trigo, milho, cevada, arroz e sorgo.

[00141] 7. Uma planta transgênica que compreende um ácido nucléico sintético que inclui uma sequência com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-3, em que a glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00142] 8. A planta transgênica da modalidade 7, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D- glicopiranosídeo e xilano.

[00143] 9. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 7-8, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a um pH na faixa de 4,0 a 10,0.

[00144] 10. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 7-9, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a uma temperatura na faixa de 25°C a 130°C.

[00145] 11. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 7-10, em que a atividade de glucanase aumentou a estabilidade mediante expressão na planta, comparada com a atividade de uma glucanase que possui uma sequência de aminoácidos idêntica e expressa em uma célula bacteriana.

[00146] 12. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 7-11, em que a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo que consiste em: trigo, milho, cevada, arroz e sorgo.

[00147] 13. A planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 7-12, que compreende a sequência de ácidos nucléicos do ID. DE SEQ. N°: 1 e produz um amplicon para o diagnóstico do evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652.

[00148] 14. Um ácido nucléico sintético que compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-3, em que a glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00149] 15. O ácido nucléico sintético da modalidade 14, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00150] 16. Um polinucleotídeo sintético que compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 7- 19, em que o polinucleotídeo sintético compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase que é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00151] 17. O polinucleotídeo sintético da modalidade 16, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00152] 18. Um vetor que compreende um polinucleotídeo sintético, ou um fragmento de um polinucleotídeo sintético, da modalidade 17.

[00153] 19. Um método de produção de uma planta transgênica que inclui uma glucanase que compreende:o contato de uma célula de planta com um ácido nucléico sintético que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-3, em que a glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos;regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica; e seleção da planta transgênica que expressa uma glucanase, em que a glucanase é ativa e termicamente estável mediante exposição a uma temperatura na faixa de 25°C a 130°C.

[00154] 20. O método da modalidade 19, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00155] 21. O método de qualquer uma ou ambas as modalidades 19-20, em que o ácido nucléico sintético é parte de um vetor da modalidade 13.

[00156] 22. Uma ração animal que compreende uma planta transgênica ou parte desta de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13, o produto de qualquer uma ou mais das modalidades 19-21, ou um polipeptídeo sintético de qualquer uma ou mais das modalidades 51-54.

[00157] 23. A ração animal da modalidade 22 que compreende ainda um suplemento de ração ou aditivo de ração.

[00158] 24. A ração animal de qualquer uma ou ambas as modalidades 22-23, em que o suplemento de ração é material de planta.

[00159] 25. A ração animal de qualquer uma ou mais das modalidades 22-24, em que o material de planta é uma planta não transgênica.

[00160] 26. A ração animal de qualquer uma ou mais das modalidades 22-24, em que o material de planta é uma planta modificada geneticamente.

[00161] 27. A ração animal de qualquer uma ou mais das modalidades 22-26, em que o suplemento de ração inclui uma ou mais enzimas exógenas.

[00162] 28. A ração animal da modalidade 27, em que as (uma ou mais) enzimas exógenas incluem uma enzima hidrolítica selecionada do grupo que consiste em: xilanase, endoglucanase, celulase, exoglucanase, feruloil esterase, uma xilanase inteína-modificada, uma endoglucanase inteína- modificada, uma celulase inteína-modificada, uma exoglucanase inteína-modificada, uma feruloil esterase inteína-modificada, mananase, amilase, uma amilase inteína- modificada, fitase, uma fitase inteína-modificada, protease, e uma protease inteína-modificada.

[00163] 29. A ração animal de qualquer uma ou mais das modalidades 22-28, em que o material de planta inclui pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em forragem, biomassa, farelo de milho, péletes de milho, farelo de trigo, péletes de trigo, grão de trigo, grão de cevada, péletes de cevada, farelo de soja, bagaço oleaginoso de soja, silagem, grão de sorgo e péletes de sorgo.

[00164] 30. A ração animal de qualquer uma ou mais das modalidades 23- 29, em que o suplemento de ração inclui pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em: sólidos solúveis, gordura e vermiculita, calcário, sal comum, DL-metionina, L-lisina, L-treonina, COBAN®, pré- mistura de vitamina, fosfato dicálcico, pré-mistura de selênio, cloreto de colina, cloreto de sódio e pré-mistura mineral.

[00165] 31. Um método de produção de uma ração animal que compreende uma misturação de 1) uma planta transgênica ou parte desta de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13, 2) o produto de qualquer uma ou mais das modalidades 19-41, ou 3) um polipeptídeo sintético de qualquer uma ou mais das modalidades 51-54 com material de planta.

[00166] 32. O método da modalidade 31 que compreende ainda a peletização da mistura.

[00167] 33. O método da modalidade 32, que compreende ainda a adição de um suplemento de ração à mistura.

[00168] 34. O método da modalidade 33, em que o suplemento de ração inclui pelo menos uma enzima exógena.

[00169] 35. O método da modalidade 34, em que as (pelo menos uma) enzimas exógenas incluem uma enzima hidrolítica selecionada do grupo que consiste em: xilanase,endoglucanase, celulase, exoglucanase, feruloil esterase, uma xilanase inteína-modificada, uma endoglucanase inteína- modificada, uma exoglucanase inteína-modificada, uma celulase inteína-modificada, uma feruloil esterase inteína- modificada, amilase, uma amilase inteína-modificada, mananase, fitase e protease.

[00170] 36. Um método de aumento de utilização de polissacarídeos não-amido em um animal que compreende a alimentação de um animal com uma ração animal 1) que inclui uma planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13, 2) de qualquer ou uma mais das modalidades 22-30, 3) produzida pelo método de qualquer uma ou mais das modalidades 31-35, ou 4) que inclui um polipeptídeo sintético de qualquer uma ou mais das modalidades 51-54.

[00171] 37. O método da modalidade 36 que compreende ainda a preparação da ração animal.

[00172] 38. O método de qualquer uma ou ambas as modalidades 36-37, em que o animal é um animal monogástrico ou um animal ruminante.

[00173] 39. Um método de aumento da estabilidade térmica de uma glucanase que compreende a produção de uma planta transgênica que inclui um ácido nucléico sintético que compreende, que consiste basicamente ou que consiste em uma sequência de aminoácidos que possui 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, em que a sequência codifica uma glucanase capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00174] 40. O método da modalidade 39, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00175] 41. O método de qualquer uma ou ambas as modalidades 39-40, em que a expressão do ácido nucléico produz a glucanase e a glucanase é termicamente estável mediante exposição a uma temperatura em uma faixa de 25°C a 130°C.

[00176] 42. Um método para o aumento da produção de açúcares fermentáveis de grãos que compreende:a misturação de grãos derivados de uma planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13 com grãos derivados de uma planta diferente para formar grãos misturados; e o processamento dos grãos misturados.

[00177] 43. O método da modalidade 42, em que a planta diferente é uma planta modificada geneticamente que inclui um ácido nucléico sintético que codifica pelo menos uma enzima hidrolítica.

[00178] 44. O método de qualquer uma ou ambas as modalidades 42-43, em que as (pelo menos uma) enzimas hidrolíticas são selecionadas do grupo que consiste em: xilanase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, celulase, uma feruloil esterase, uma xilanase inteína-modificada, uma endoglucanase inteína-modificada, uma exoglucanase inteína- modificada, uma celulase inteína-modificada, uma feruloil esterase inteína-modificada amilase fitase e protease.

[00179] 45. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 42-43, em que o processamento inclui pelo menos uma operação selecionada do grupo que consiste em colheita, empacotamento, trituração, moagem, picotagem, redução de tamanho, esmagamento, peletização, extração de um componente dos grãos misturados, purificação de um componente ou porção dos grãos misturados, extração ou purificação de amido, hidrólise de polissacarídeos em oligossacarídeos ou monossacarídeos, ensilamento, fermentação, conversão química e catálise química.

[00180] 46. O método da modalidade 45 que compreende ainda a produção de um produto bioquímico.

[00181] 47. O método da modalidade 46, em que o produto bioquímico é selecionado do grupo que consiste em etanol, butanol, ácido lático, ácido cítrico e ácido acético.

[00182] 48. Um método para o aumento da produção de etanol a partir de grãos que compreende a realização de um método de qualquer uma ou mais das modalidades 42-47.

[00183] 49. Um método para o aumento da produção de etanol a partir de uma planta transgênica que compreende: a misturação de uma planta transgênica ou parte desta de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13 com uma planta diferente ou parte desta para formar material de planta misturado; a conversão do material de planta misturado em açúcares fermentáveis; e o processamento dos açúcares fermentáveis em etanol.

[00184] 50. O método da modalidade 49, em que o material de planta inclui fibra, grão, ou uma combinação destes.

[00185] 51. Um polipeptídeo sintético que inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00186] 52. O polipeptídeo sintético da modalidade 51, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00187] 53. Um polipeptídeo sintético que inclui uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos que possui pelo menos 90% de identidade para 50 a 100, 50 a 150, 50 a 200, 50 a 250, 50 a 300, 50 a 322 ou 50 a todos os resíduos de aminoácidos contíguos de uma glucanase que possui a sequência de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, em que a glucanase é capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00188] 54. O polipeptídeo sintético da modalidade 51, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00189] 55. Um método de aumento da energia metabolizável de uma dieta que compreende uma misturação de uma planta transgênica ou parte desta com um ingrediente de ração, em que A planta transgênica ou parte desta compreende um ácido nucléico sintético que codifica uma glucanase que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 4-6, e capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00190] 56. O polipeptídeo sintético da modalidade 55, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00191] 57. O método de qualquer uma ou ambas as modalidades 55- 56, em que o ácido nucléico sintético compreende uma sequência com pelo menos 70% de identidade para uma sequência de referência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 1-3.

[00192] 58. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 55- 57, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a um pH na faixa de 5,0 a 10,0.

[00193] 59. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 55- 58, em que a glucanase é ativa mediante expressão na planta e exposição a uma temperatura na faixa de 25°C a 130°C.

[00194] 60. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 55- 59, em que o ingrediente de ração inclui pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em: farelo de milho, péletes de milho, farelo de trigo, péletes de trigo, grão de trigo, farelo de trigo, grão de cevada, péletes de cevada, farelo de soja, cascas de soja, grão de destilaria seco, bagaço oleaginoso de soja, grão de sorgo e péletes de sorgo.

[00195] 61. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 55- 60, em que o ingrediente de ração inclui pelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em sólidos solúveis, gordura e vermiculita, calcário, sal comum, DL-metionina, L-lisina, L-treonina, COBAN®, pré- mistura de vitamina, fosfato dicálcico, pré-mistura de selênio, cloreto de colina, cloreto de sódio, pré-mistura mineral, e uma ou mais enzimas exógenas.

[00196] 62. Um método para a produção de uma ração animal que compreende uma misturação de uma planta transgênica ou parte desta de qualquer uma ou mais das modalidades 1-13 com material de planta. O método também pode compreender o método para a produção de uma planta que inclui uma glucanase de qualquer uma ou mais das modalidades 63-68.

[00197] 63. Um método para a produção de uma planta que inclui uma glucanase que compreende o cruzamento de uma planta com uma planta transgênica que compreende o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652, e a seleção de uma primeira planta da prole que compreende o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 e capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00198] 64. O método da modalidade 63, em que os (um ou mais) polissacarídeos são selecionados do grupo que consiste em beta-glucano, celulose, celobiose, pNP-D-glicopiranosídeo e xilano.

[00199] 65. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 63-64 que compreende ainda autofecundação da primeira planta da prole e seleção de uma segunda planta da prole que compreende o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 e capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00200] 66. O método da modalidade 65, em que a segunda planta da prole é homozigota para o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652.

[00201] 67. O método da modalidade 65, em que a segunda planta da prole é heterozigota para o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652.

[00202] 68. O método da modalidade 67 que compreende ainda autofecundação da segunda planta da prole e seleção de uma terceira planta da prole homozigoto para o evento 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 e capaz de degradar um ou mais polissacarídeos.

[00203] 69. Um kit para identificação do evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 em uma amostra, que compreende um primeiro iniciador e um segundo iniciador, em que o primeiro iniciador e o segundo iniciador são capazes de amplificação de uma sequência-alvo específica para o evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652.

[00204] 70. O kit da modalidade 69, em que o primeiro iniciador compreende uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 38 41 e 47.

[00205] 71. O kit de qualquer uma ou mais das modalidades 69-70, em que o segundo iniciador compreende uma sequência de ácidos nucléicos selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 39, 42, 43, 45 e 46.

[00206] 72. O kit de qualquer uma ou mais das modalidades 69-71, em que a sequência-alvo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 51 - 55.

[00207] 73. O kit de qualquer uma ou mais das modalidades 69-72, em que a sequência-alvo é capaz de hibridizar para a sequência do ácido nucléico que compreende uma sequência dos IDS. DE SEQ. Nos: 40 ou 44 sob condições de rigor elevado.

[00208] 74. O kit de qualquer uma ou mais das modalidades 69-73, em que a amostra compreende matéria de planta derivada de uma planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 1 - 13.

[00209] 75. Um método de identificação do evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.652 em uma amostra, que compreende: o contato de uma amostra com um primeiro iniciador e um segundo iniciador do kit de qualquer uma ou mais das modalidades 69-74;a amplificação de um ácido nucléico na amostra para obter um produto amplificado; e a detecção de um produto amplificado específico para uma sequência-alvo no evento de milho 4588.259, 4588.757 ou 4588.65.

[00210] 76. O método da modalidade 75, em que a sequência-alvo compreende uma sequência selecionada dos IDS. DE SEQ. Nos: 51-55. O método de identificação pode ser adicionado a qualquer uma ou mais das modalidades 63-68.

[00211] 77. O método da modalidade 75, em que a sequência-alvo é pelo menos uma sequência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 22-31.

[00212] 78. O método da modalidade 75, em que a etapa de detecção compreende a hibridização do produto amplificado para o ácido nucléico que compreende uma sequência dos IDS. DE SEQ. Nos: 40 sob condições de rigor elevado, e a seleção do produto amplificado específico para o evento de milho 4588.259.

[00213] 79. O método da modalidade 75, em que a etapa de detecção compreende a hibridização do produto amplificado para o ácido nucléico que compreende uma sequência do ID. DE SEQ. N°: 44 sob condições de rigor elevado, e a seleção do produto amplificado específico para o evento de milho 4588.652.

[00214] 80. Um método para redução da viscosidade de uma mistura de grãos, que compreende a combinação de grãos de uma planta transgênica de qualquer uma ou mais das modalidades 1 - 13, uma planta diferente e líquido para formar uma mistura de grãos.

[00215] 81. O método da modalidade 80, em que a planta diferente é uma planta não transgênica.

[00216] 82. O método da modalidade 80, em que a planta diferente é uma planta modificada geneticamente.

[00217] 83. O método das modalidades 80 e 82, em que a planta modificada geneticamente compreende um ácido nucléico sintético que codifica pelo menos uma enzima hidrolítica.

[00218] 84. O método da modalidade 83, em que as (pelo menos uma) enzimas hidrolíticas são selecionadas do grupo que consiste em: xilanase, uma amilase, uma endoglucanase, uma exoglucanase, uma feruloil esterase, uma glicoamilase, uma amilase inteína-modificada, uma xilanase inteína- modificada, uma endoglucanase inteína-modificada, uma exoglucanase inteína-modificada, uma feruloil esterase inteína-modificada, uma protease, uma protease inteína- modificada, uma fitase ou uma fitase inteína-modificada.

[00219] 85. O método de qualquer uma ou mais das modalidades 80-84, que compreende ainda o processamento da mistura de grãos.

[00220] 86. O método da modalidade 85, em que a etapa de processamento inclui uma ou mais operações selecionadas do grupo que consiste em colheita, trituração, moagem, redução de tamanho, esmagamento, aquecimento, gelatinização, liquefação, extração de um componente dos grãos misturados, purificação de um componente ou porção dos grãos misturados, extração ou purificação de amido, hidrólise de polissacarídeos em oligossacarídeos ou monossacarídeos, sacarificação, fermentação, conversão química, e catálise química.

[00221] Modalidades adicionais descritas nesse relatório descritivo podem ser formadas por suplementação de uma modalidade com um ou mais elementos de qualquer uma ou mais outras modalidades descritas nesse relatório descritivo e/ou por substituição de um ou mais elementos de uma modalidade com um ou mais elementos de uma ou mais outras modalidades descritas nesse relatório descritivo.

EXEMPLOS

[00222] Os exemplos não limitantes seguintes são fornecidos para ilustrar modalidades particulares. As modalidades podem ser suplementadas com um ou mais detalhes de um ou mais exemplo abaixo, e/ou um ou mais elementos de uma modalidade podem ser substituídos com um ou mais detalhes de um ou mais exemplos abaixo.

Exemplo 1. Vetores de expressão de glucanase de ração

[00223] Uma sequência de nucleotídeos códon-otimizada para expressão da glucanase de ração AGR2314 em milho foi sintetizada. Para a geração de construções de transformação de planta iniciais, cassetes de expressão de AGR2314 únicos foram montados em vetores pAG4000 (pAG4258) ou pAG4500 (pAG4588, pAG4597 e pAG4708). O vetor pAG4000 foi criado por substituição do promotor de ubiquitina de arroz 3 com o primeiro íntron pelo promotor de ubiquitina de milho 1 contendo seu próprio primeiro íntron para direção da expressão do gene de marcador selecionável que codifica fosfomanose isomerase de E. coli (PMI). O vetor pAG4500 representa aprimoramento adicional de pAG4000 e contém três modificações, ou seja: 1) inserção após o primeiro íntron de ubiquitina de milho de uma sequência de 9 bp (ATCCAGATC) que representa os primeiros três códons do monômero de ubiquitina com ATG convertido em ATC; 2) inserção do elemento de Kozak de milho (TAAACC) após o monômero de ubiquitina da sequência de 9 bp; 3) substituição do sítio de clonagem múltipla (MCS) antigo por um novo MCS que foi sintetizado por PCR e que foi projetado para conter múltiplos sítios pára várias enzimas de corte raras (NotI, PacI, FseI, SwaI, AscI, AsiSI) para facilitar a clonagem de até 4-5 cassetes de expressão em um T-DNA.

[00224] Sequência do novo MCS em pAG4500 (fragmento PmeI-KpnI):GTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAACCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAG TCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAG AACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCTAAGCGGCCGCATTGGACTTAATTAAGTGA GGCCGGCCAAGCGTCGATTTAAATGTACCACATGGCGCGCCAACTATCATGCGATCGCT TCATGTCTAACTCGAGTTACTGGTACGTACCAAATCCATGGAATCAAGGTACC (ID. DE SEQ. N°: 20).

[00225] As Figuras 1-4 ilustram os vetores de expressão pAG4258, pAG4588, pAG4597 e pAG4708, respectivamente, que carregam uma única unidade de expressão de glucanase de ração. O vetor pAG4258 (Figura 1; ID. DE SEQ. N°: 7) foi clonado por montagem de um cassete de expressão que era composto pelo promotor de Glb1 de milho fundido à sequência códon-otimizada de AGR2314 de milho em sítios KpnI-AvrII de pAG4000. Os vetores pAG4588 (Figura 2; ID. DE SEQ. N°: 8) e pAG4597 (Figura 3; ID. DE SEQ. N°: 9) foram desenvolvidos por montagem de seus cassetes de expressão de AGR2314 correspondentes em sítios KpnI-EcoRI de pAG4500, enquanto o vetor pAG4708 (Figura 4; ID. DE SEQ. N°: 10) foi produzido por clonagem do cassete de expressão de AGR2314 em sítios XmaI-AvrII de pAG4500. As Figuras 5-6 ilustram os vetores de expressão pAG4766 e pAG4767, respectivamente, que carregam duas unidades de expressão de glucanase de ração. As Figuras 7-8 ilustram os vetores de expressão pAG4770 e pAG4771, respectivamente, que carregam três unidades de expressão de glucanase de ração. Os sítios de restrição de corte únicos raros que estão disponíveis dentro do MCS do pAG4500 foram subsequentemente usados a fim de desenvolver construções de expressão adicionais contendo unidades de expressão dupla de AGR2314, por exemplo, pAG4766 (Figura 5; ID. DE SEQ. N°: 11) e pAG4767 (Figura 6; ID. DE SEQ. N°: 12), ou unidades de expressão tripla de AGR2314, por exemplo, pAG4770 (Figura 7; ID. DE SEQ. N°: 13) e pAG4771 (Figura 8; ID. DE SEQ. N°: 14), no mesmo T-DNA. Os vetores construídos para expressão de glucanase de AGR2314 em plantas estão listados na Tabela 1. Cepas de E. coli que carregam os vetores de expressão foram usadas para conjugação com Agrobacterium e subsequente transformação de milho. Tabela 1. Descrição de sequências

[00226] Cassetes de expressão para beta-glucanases relacionadas, AGR2414 e AGR2514, foram preparados usando estratégias similares, e são fornecidas sequências para esses cassetes de expressão como elas são encontradas nos vetores de expressão pAG4257 pAG4692, pAG4693, pAG4705, pAG4706, pAG4766, pAG4257, pAG4692, pAG4693, pAG4705 e pAG4706.

Exemplo 2. Procedimento de extração de proteína de glucanase de ração

[00227] Farinha foi preparada a partir de cerca de 20 sementes transgênicas por moagem em um moinho ciclone Udy ou um moinho de lâminas com tela de 0,5 mm ou 1 mm. Cerca de 0,5 ml de tampão de extração de proteína (100 mM de fosfato de sódio, pH 6,5, Tween-20 0,01%) foi adicionado a 20 mg de farinha em um tubo de 2 ml. Em alguns casos, 2 g, 10 g ou 20 g de amostras trituradas foram misturados com 10 ml, 50 ml ou 100 ml do tampão de extração em tubos de 15 ml ou garrafas de 250 ml. Massas e volumes maiores podem ser usados por escalonamento dessas quantidades adequadamente. Após agitação em vórtex, os tubos foram colocados em uma plataforma giratória em uma incubadora a 60°C e girados por 1 hora para extração de proteína. Após centrifugação a 16.000 x g por 10 min em uma centrífuga de bancada, o sobrenadante foi diluído 20 vezes para o ensaio de enzima por adição de 20 μl de sobrenadante a 380 μl de tampão de extração de proteína. Em alguns casos, outros fatores de diluição foram usados, como necessário.

Exemplo 3. Medição da atividade de glucanase de ração

[00228] Ensaio colorimétrico. Cinquenta microlitros do extrato de proteína diluído (20 vezes a 360 vezes) foram misturados com 450 μl de 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,5, Tween-20 0,01% e 1 comprimido de β-glucazima de Megazyme (Wicklow, Irlanda), e depois incubados a 80°C por 1 hora antes da adição de 1 ml de base Tris 2%. Após centrifugação a 3.000 x g por 10 min, 100 μl de sobrenadante foram transferidos para uma microplaca para medição da absorbância a 590 nm (A590). A atividade foi registrada como A590/mg de farinha após multiplicação dos fatores de diluição: A590xAx(500/50)/20 mg, em que A é o fator de diluição da extração de proteína; 500 é o volume (ml) de tampão usado para extração de proteína; 50 é o volume de extração de proteína (ml) usado no teste de atividade.

[00229] Medição da unidade de atividade. O ensaio envolve a quantificação de açúcares redutores que são liberados durante a evolução temporal da digestão de um substrato- modelo (β-glucano de cevada) obtido de Megazyme (Wicklow, Irlanda).

[00230] Hidrólise de substrato-modelo. Tubos de ensaio de 2 ml foram rotulados com o sinal “+”, e 5 mg de substrato de β-glucano de cevada (reação) foram adicionados a cada tubo de ensaio; nenhum substrato foi adicionado aos tubos de controle (controle). Quatrocentos e cinquenta microlitros de 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6,5, foram adicionados a cada tubo (reações e controles), e os tubos foram colocados em um Thermo-Shaker com temperatura ajustada em 80°C e velocidade de agitação ajustada em 1.000 rpm. Os tubos foram agitados a 1.000 rpm a 80°C por 20 min até que o substrato estivesse completamente dissolvido. Um tubo com 2 ml de extrato de proteína de grão diluído, extraído como descrito acima, foi colocado no Thermo-Shaker para ser pré- aquecido.

[00231] Cinquenta microlitros da amostra pré-aquecida foram adicionados aos tubos de controle e de reação. A agitação foi reiniciada e um cronômetro foi disparado. Após 15 minutos de agitação a 80°C, 50 μl de cada uma das amostras de reação e de controle foram removidos e misturados com 10 μl de HCl 0,5 N em microplacas separadas. A agitação das amostras foi reiniciada até que todas as amostras fossem removidas e misturadas com ácido.

[00232] Quantificação com BCA de equivalentes redutores de glicose. Padrões de glicose foram preparados em tampão de extração de proteína nas seguintes concentrações: 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM e 0,8 mM. Reagente de BCA (de Thermo Scientific) foi preparado por misturação de reagente A com reagente B em uma proporção de 50:1. Para fazer uma curva-padrão de glicose, 75 μl de tampão foram dispensados no primeiro poço da fileira A (A1) em uma microplaca e 75 μl de cada padrão de glicose foram dispensados nos poços A2 até A7. Para detectar os açúcares redutores das amostras de reação e de controle de glucanase de ração, 25 μl de cada reação foram dispensados em fileiras da microplaca na ordem de seu tempo de incubação com β-glucano de cevada (por exemplo, fileira B1-B2: 15 min-30 min), e depois adicionados 25 μl de controle correspondente a outra fileira da microplaca (por exemplo, fileira C1-C2: 15 min-30 min). Subsequentemente, 50 μl de tampão de fosfato de sódio foram dispensados em cada poço nessas duas fileiras (reação e controle), e 175 μl de reagente de BCA foram adicionados a cada poço usando uma pipeta multicanais. A misturação foi obtida por pipetagem para cima e para baixo. A microplaca foi lacrada e incubada a 80°C em um bloco de aquecimento. Após incubação por 10 min, a microplaca foi resfriada no gelo por 10 minutos e centrifugada para precipitar um condensado. Subsequentemente, a absorbância a 560 nm de cada poço foi medida em uma leitora de microplacas.

[00233] Cálculo de unidades de atividade de glucanase de ração por A560. A absorbância do branco de reagente foi subtraída dos valores de absorbância para cada um dos padrões de glicose, e os valores resultantes foram tabulados de acordo com suas concentrações de glicose. Regressão linear foi então usada para calcular a linha de “melhor ajuste” através do conjunto de dados. Para determinar os equivalentes redutores de glicose em reações de glucanase/β-glucano de cevada, para cada ponto do tempo, o valor de absorbância da amostra de controle foi subtraído da amostra de reação, e o valor resultante foi usado para calcular a concentração de açúcares redutores por comparação com a curva-padrão de glicose. Uma unidade (U) de atividade de glucanase é a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de equivalentes redutores de glicose de β-glucano de cevada 1% por minuto a 80°C, pH 5,3, usando o método de quantificação com BCA.

[00234] Medição da unidade de atividade (método de rendimento semi-elevado). Como descrito nesse relatório descritivo, o método detecta os açúcares redutores como, por exemplo, glicose, liberados pelo substrato-modelo (β-glucano de cevada) por tratamento com glucanase a 80°C por 40 minutos ou 90 minutos. Quando extrato de proteína de grão ou ração é adequadamente diluído, a velocidade inicial é detectada dentro de 40 minutos (produto de grão) ou 90 minutos (amostra de ração) da reação. As reações foram realizadas em um bloco de 96 poços (Costar, N° de Catálogo 3960) ou tubos strip (VWR, N° de Catálogo 29442-610).

[00235] Preparação de substrato: β-Glucano de cevada (baixa viscosidade) foi pesado com base em diversas reações, por exemplo, 10 amostras, 4 diluições para cada amostra precisaram de um total de 40 reações. Cada reação precisava de 5 mg de substrato e, portanto, pelo menos 40 x 5 = 200 mg de β-glucano de cevada foram necessários. O substrato foi completamente dissolvido com o tampão de extração em um banho-maria a 80°C por 20 minutos, e agitado por vórtex a cada 5 a 10 minutos.

[00236] Os tubos agrupados foram usados para ensaio de unidade de atividade no ponto final de 90 minutos de amostras de ração. O extrato de proteína foi diluído até diluições de 2, 6, 10 e 20 vezes.

[00237] Proteína purificada diluída 100 vezes foi usada como um controle positivo para validação do ensaio. Proteína de glucanase purificada (200.000 ppb) foi armazenada em 50 mM de MES, 150 mM de cloreto de sódio, tampão com pH 6,3, mais glicerol 40% a -20°C. Dez microlitros de proteína foram misturados com 990 μl do tampão de extração, e 50 μl foram usados para ensaio de atividade.

[00238] A digestão de β-glucano de cevada por glucanase de ração foi realizada em um banho-maria ajustado a 80°C. No bloco de tubos agrupados, 450 μl do substrato foram dispensados em tubos de A2 a D12 em referência à Tabela 2. Essas fileiras serviram como a reação.

[00239] Quatrocentos e cinquenta microlitros do tampão de extração (sem substrato) foram adicionados a cada um dos tubos de controle das fileiras E2 a H12, que serviram como um branco para corrigir o teor de proteína detectado pelo método de BCA para cada reação, como descrito na Tabela 2 (A2 a D12).

[00240] Cinquenta microlitros do extrato de amostra diluídos, incluindo o controle negativo e controle positivo, foram adicionados primeiro a cada tubo de branco, E2 a H12, e depois a cada tubo de reação, A2 a D12, como descrito na Tabela 2.Tabela 2. Exemplo de hidrólise enzimática de amostras de ração em tubos agrupados.

[00241] Os tubos foram cobertos com “Storage Mat III” de Corning™, e o “Storage Mat Applicator” de Corning foi usado para lacrar os tubos. A placa foi agitada em uma velocidade baixa. O bloco foi colocado no banho-maria a 80°C pelo período de incubação de 90 minutos. A reação foi terminada por adição de 100 μl de 0,5 N HCl a cada poço e resfriamento do no gelo.

[00242] Quantificação com BCA de equivalentes redutores de glicose. Padrões de glicose foram preparados em 100 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 6, nas seguintes concentrações: 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,4 nM, 0,6 nM e 0,8 nM. Reagente de BCA (de Thermo Scientific) foi preparado por misturação de Reagente A com reagente B em uma proporção de 50:1. Para fazer uma curva-padrão de glicose na coluna 1 em uma microplaca, 75 μl de tampão foram dispensados no primeiro poço da fileira A (A1) e 75 μl de cada padrão de glicose foram dispensados nos poços A2 até A7. Para detectar os açúcares redutores das amostras de reação e de controle de glucanase de ração, 25 μl de cada reação foram dispensados nas fileiras da microplaca de acordo com a ordem exibida na Tabela 2. Subsequentemente, 50 μl do tampão de extração foram dispensados em cada poço de amostra (reação e branco) em referência à Tabela 2 de A2 a H12 para fazer um volume total de 75 μl. Cento e setenta e cinco microlitros do reagente de BCA foram adicionados a cada poço e misturados. A microplaca foi lacrada e incubada a 80°C em um bloco de aquecimento. Após incubação por 10 min, a microplaca foi resfriada no gelo por 10 min e centrifugada para precipitar um condensado. Subsequentemente, a absorbância a 560 nm de cada poço foi medida em uma leitora de microplacas.

[00243] Cálculo de unidades de atividade de glucanase de ração por A560. O valor de absorbância para o branco de reagente foi subtraído dos valores de absorbância para cada um dos padrões de glicose, e os valores resultantes foram tabulados de acordo com suas concentrações de glicose. Regressão linear foi então usada para calcular a linha de “melhor ajuste” para o conjunto de dados. Para determinar equivalentes redutores de glicose nas reações de glucanase/β-glucano de cevada, o valor de absorbância da amostra de controle foi subtraído do valor de absorbância da amostra de reação correspondente, e o valor resultante foi usado para calcular a concentração de açúcares redutores por comparação com a curva-padrão de glicose. Uma unidade (U) de atividade de glucanase é igual a 1 μmol de equivalentes redutores de glicose liberados por β-glucano de cevada 1% por minuto a 80°C, usando o método de quantificação com BCA.

[00244] Cálculo de unidades de controles positivos por A560 para validar o ensaio. O valor de absorbância para amostras de branco (E12, F12, G12, H12) foi subtraído do valor de absorbância para cada amostra de reação (A12, B12, C12, D12). A equação de regressão para o padrão de glicose foi usada para calcular o teor de glicose (μmol). Para determinar a quantidade de unidades redutoras produzidas por minuto (A), o valor para a quantidade de glicose (μmol) liberada por β-glucano de cevada na reação foi dividido pelo tempo de reação, por exemplo 90, se o tempo de reação foi de 90 minutos. O valor de unidade de controles positivos é igual à diluição x (A)/mg de proteína no ensaio. O fator de diluição no ensaio descrito nesse relatório descritivo é igual a 24. O fator de diluição de 24 foi determinado por comparação da proporção do volume de reação total para a porção da reação que foi usada no ensaio de BCA. No ensaio, o volume de reação total foi de 600 μl, incluindo 500 μl de reação e 100 μl de HCl usados para interromper a reação. A porção da reação que foi usada no ensaio de BCA foi de 25 μl. Portanto, o fator de diluição de 24 foi calculado por divisão de 600 μl por 25 μl.

[00245] A quantidade de proteína no ensaio foi calculada da seguinte forma. A concentração do controle positivo foi de 2.000 ng/ml, 50 μl eram a alíquota do controle positivo usada no teste (ou 50/1.000, se calculada em ml). A quantidade de proteína calculada em nanogramas foi de 2.000 x (50/1000), ou 2.000 x (50/1000)/1.000.000, se calculada em miligramas.

Exemplo 4. Atividade de glucanase em semente de milho transgênico

[00246] Sedas em plantas de milho não transformadas (do tipo selvagem) foram polinizadas com pólen de plantas de milho transgênicas individuais que carregavam a construção de pAG4588. Sementes maduras secas foram colhidas das espigas resultantes e testadas quanto à atividade por meio do ensaio colorimétrico. A Figura 9 ilustra a amplitude de atividades recuperadas de 42 espigas independentes. Nessa figura, os números ao longo da abscissa correspondem aos identificadores de eventos individuais. A maior atividade foi observada no evento 259. Nas plantas de milho transgênicas T0, 757 que também carregavam a construção de pAG4588, a atividade foi cerca de 25 A590/mg. A atividade média das sementes homozigotas derivadas da primeira geração das plantas autofecundadas foi de aproximadamente 116 ± 15 A590/mg. A atividade de sementes heterozigotas dessa população foi cerca de 59 ± 18 A590/mg.

[00247] Sedas em plantas de milho não transformadas (do tipo selvagem) foram polinizadas com pólen de plantas de milho transgênicas individuais que carregavam a construção de pAG4597. Sementes maduras secas foram colhidas das espigas resultantes e foram testadas quanto à atividade por meio do ensaio colorimétrico. A Figura 10 ilustra a amplitude de atividades recuperadas de 15 espigas independentes. Nessa figura, os números ao longo da abscissa correspondem aos identificadores de eventos individuais. A maior atividade foi observada no evento 460.

Exemplo 5. Sequências genômicas de milho que flanqueiam sítios de integração de T-DNA em eventos transgênicos 4588.259, 4588.757 e 4588.652

[00248] Evento 4588.259: O evento 4588.259 carrega dois sítios de integração de T-DNA independentes que estão localizados nos cromossomos de milho 4 e 8. As localizações cromossômicas dos sítios de integração de T-DNA foram determinadas por meio de pesquisas com BLASTN, nas quais as sequências de DNA genômico de milho que estão contidas em sequências OB-2880, OB-2832 e OB-3252 isoladas de sítios de inserção de T-DNA nas bordas direita e esquerda do T-DNA, foram usadas com as indagações para a pesquisa de bancos de dados de sequências do genoma de milho B73 disponíveis publicamente, por exemplo, o “Maize Genetics and Genome Database”, http://www.milhogdb.org/ (acessado em 8 de maio de 2016). Veja também Andorf, C.M., Cannon, E.K., Portwood, J.L., Gardiner, J.M., Harper, L.C., Schaeffer, M.L., Braun, B.L., Campbell, D.A., Vinnakota, A.G., Sribalusu, V.V., Huerta, M., Cho, K.T., Wimalanathan, K., Richter, J.D., Mauch, E.D., Rao, B.S., Birkett, S.M., Richter, J.D., Sen, T.Z., Lawrence, C.J. (2015) “MaizeGDB 2015: New tools, Data, and Interface for the Maize Model Organism Database”. Nucleic Acids Research, identificador de objeto digital: 10.1093/nar/gkv1007; Lawrence, C.J., Seigfried, T.E. e Brendel, V. (2005) “The Maize Genetics and Genomics Database. The Community Resource for Access to Diverse Maize Data”. Plant Physiology 138: 55-58; Lawrence, C.J., Dong, Q., Polacco, M.L., Seigfried, T.E. e Brendel, V. (2004) “MaizeGDB, the Community Database for Maize Genetics and Genomics”. Nucleic Acids Research 32: D393- D397, todos incorporados nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descritos. Como ambos os loci segregam independentemente, foram avaliadas plantas que carregam ambos os loci e cada lócus individual.

[00249] Nos flancos OB-2880, OB-2832 e OB-3252, que são fornecidos abaixo, o DNA genômico de milho é mostrado em letras maiúsculas, enquanto as sequências do vetor pAG4588 são indicadas em letras minúsculas e estão sublinhadas.

Sítio de integração no cromossomo de milho 4:

[00250] O sítio de integração de T-DNA no cromossomo de milho 4 é caracterizado pela sequência flanqueadora de 795 bp da borda direita do T-DNA OB-2880, que contém 677 bp do DNA genômico de milho. O flanco de 677 bp isolado do DNA genômico de milho possui 99,3% de identidade de sequência para a sequência derivada da fita de DNA anti-senso do cromossomo de milho 4 (coordenadas de nucleotídeos 5661259356612026).>OB-2880

[00251] CTTAGATTAGAGAATGAAAATTTGATTGCTAAGGCCCAAGATTTTGA TGTTTGCAAAGATACAATTACCGATCTTAGAGATAAGAATGATATACTTCGTGCTAAGA TTGTTGAACTTACACCACAACCTTCTATGCCTTCTGTGACATTAACATTACGTCACAAA CAATAGTATTTTTGTCATACCTTACATGTTGGTGACGTGATTGTGACGAAAATCACATC GTCACAGAAGGTGCGTGTTAAATGGTGTACTATGACGAATAACAAAAAAACGTCATAAT AGTTTATGACGCAAACTACAAACGTCACTAATCTATGACACTCGAATTCGTCACTAATT ATGTCTAAATACGTCACAATTCATGTAGTCGTGCCTTGCCACGTGGCTGATTACGTGGC GAGATGACATGGCAGTTGACGTGGCAGGTGATGTGGCGAAAATGTTGTGACGAGTTCAT TCGTCACAGATGTTATGACGTGGCATGCCACATGGCAGATGATGTGGCAAAATTATGTG ACAAAAATATTTGTCATAAATATCAATGAGGTGGCAATATATGTGTGACGAAATTTTTC ATCACAAAGTACGATGACGTTGCAATATATTTATGACGAATTGTTCATCATAAGGCGTG ATGAATTCATAGCGTCATGGAATATTATGAAATCACATGCtcaaacactgatagtttaa actgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatg acccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttgg (ID. DE SEQ. N°: 22)

[00252] Sítio de integração no cromossomo de milho 8: O sítio de inserção de T-DNA no cromossomo 8 é caracterizado pelas sequências OB-2832 e OB-3252 que representam, consequentemente, flancos esquerdo e direito para o T-DNA integrado nesse lócus.

[00253] A sequência de 1.211 bp OB-2832 contém 864 bp de DNA genômico de milho. O flanco de 864 bp isolado do DNA genômico de milho possui 99,65% de identidade de sequência para a sequência derivada do cromossomo de milho 8 com coordenadas de nucleotídeos 100613054-100613915. >OB-2832

[00254] tcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttg ccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataatt aacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaatt atacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgc gcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattggcgagctcgaattaattcagtaca ttaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaa tatatACTAAAAAAACTCAAGGATCTGTCTCCAGAAAGGCCTTGCAGGGTTTGGCCACG CCCACGGACATTCCATCTCAGAGCCATGATTAGAACGAAAAACACATGAGAGCCGTCGT TGCTAGGAGTCGGTTTCATATGTTCGCTAAAACAAGAGATTTGTTTTTTTTCTCTCTCG TACATACACGAGTCAGCCCTTTTAATCTCAGGTTGACGTGCAATGTCGCTCGTCTAAGC AGAACATTTTGAGAACAAATGTGTTGTACATGAGAGTTTTGTGTACATGGTACGTACAT TAAAACATCATCATTTATCTTAGATCTAACATCTCTACTTGCTTGTTATATATTTTTTT TGTAAAATAACATCTTTCACCACTTTATATGGTGTTGTTTGCAAAATATACAGAGCAAT TAGAGACGTTAGATTTGAGATGGACGGTGATAATTTAATACATGCATAATGTACAAGAA AATCCTAACTGCACTAGATATGTTGTCAAACATTTTACCTTTGTTACAAAAAGAAATGA ATAGATGTTGAACGGTTGTCTTTCAAGCCTGTTCGCTGCGGCTTTAATTCACCAACTGC AATGAACAACCTGAAAGGTGATCGTTGCCGAACACATGCTGTTTGGCAAAGCTAGTAGT ACCTTTTTTGTCTGTCACCTGGAATGATGAGAAAGGAGACAAGAGGAGAGGGCTGGCCA TTGTTTATATATATACGTATTTCCATTGCTTTGTGGCATGCAACAGTTCAAGGGTCCAA ACTGGCAGGTTTTCAGCCCCGACAAATATAATAAAAAAACTACAAAAAAAAAAGGTCCG TTTACATTCCTTTTTTGACAACGCTAGTCCGTGCGGAGCGAGC (ID. DE SEQ. N°: 23)

[00255] A sequência de 696 bp OB-3252 contém 95 bp de DNA genômico de milho. A OB-3252 não contém a sequência da borda esquerda do T-DNA. O flanco de 95 bp isolado possui 100% de identidade de sequência para a sequência derivada da fita de DNA anti-senso do cromossomo de milho 8 com coordenadas de nucleotídeos 100613034-100612940.>OB-3252

[00256] Ggtgaaacaaggtgcagaactggacttcccgattccagtggatgatt ttgccttctcgctgcatgaccttagtgataaagaaaccaccattagccagcagagtgcc gccattttgttctgcgtcgaaggcgatgcaacgttgtggaaaggttctcagcagttaca gcttaaaccgggtgaatcagcgtttattgccgccaacgaatcaccggtgactgtcaaag gccacggccgtttagcgcgtgtttacaacaagctgtaagagcttactgaaaaaattaac atctcttgctaagctgggagctctagatccccgaatttccccgatcgttcaaacatttg gcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataat ttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatg agatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaa aatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc gggaattggcgagctcgaattaaTTCAAGTGTCTTCGTACAAACTGGGGGATGGGGCAG ACCGCCAGGTTCAAACCGTTTGACTAGATGCGGCTGGCAGGCTACTTTGCAGTGCATGC (ID. DE SEQ. N° 24)

[00257] Os flancos do DNA genômico de milho nas sequências OB-2832 e OB-3252 são separadas por 20 nucleotídeos no cromossomo de milho 8, o que indica que durante a integração de T-DNA, 20 bp da sequência genômica de DNA de milho original foram substituídos pelas sequências de T-DNA inseridas.

[00258] Também há uma sequência OB-2861 e uma sequência OB-2868 dentro do evento 259. A sequência de 970 bp OB-2861 consiste nas sequências de pAG4588 rearranjadas, incluindo uma sequência terminadora Nos parcial de 223 bp (letras maiúsculas, nucleotídeos 3290-3512 em pAG4588); a sequência de 73 bp perto da borda esquerda do T-DNA com os primeiros 3 bp da sequência da borda esquerda do T-DNA processada (letras minúsculas em itálico, nucleotídeos 3513-3585); a sequência de 299 bp perto da borda direita do T-DNA com 5 bp da sequência da borda direita do T-DNA processada e sequência polivinculadora com múltiplos sítios de clonagem (letras minúsculas, nucleotídeos 9647-9945); a sequência 5’ de 359 bp do promotor de glutelina de arroz prGTL-03 (letras maiúsculas, nucleotídeos 9946-10304). Estão sublinhados os 18 bp de uma sequência duplicada que foi criada durante o processo de integração de T-DNA. A sequência OB-2861 é a seguinte: GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGT TAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA TTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAAC TAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGgcgagctc gaattaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaa tttgttatcaagttgtctaagcgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacg acaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgc gggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcag cctaagcggccgcattggacttaattaagtgaggccggccaagcgtcgatttaaatgta ccacatggcgcgccaactatcatgcgatcgcttcatgtctaactcgagttactggtacg taccaaatccatggaatcaaggtaccTCCATGCTGTCCTACTACTTGCTTCATCCCCTT CTACATTTTGTTCTGGTTTTTGGCCTGCATTTCGGATCATGATGTATGTGATTTCCAAT CTGCTGCAATATaAATGGAGACTCTGTGCTAACCATCAACAACATGAAATGCTTATGAG GCCTTTGCTGAGCAGCCAATCTTGCCTGTGTTTATGTCTTCACAGGCCGAATTCCTCTG TTTTGTTTTTCACCCTCAATATTTGGAAACATTTATCTAGGTTGTTTGTGTCCAGGCCT ATAAATCATACATGATGTTGTCGTATTGGATGTGAATGTGGTGGCGTGTTCAGTGCCTT GGaTTTGAGTTTGATGAGAGTTGCTTCTGGG (ID. DE SEQ. N°: 25).

[00259] A sequência de 1.127 bp OB-2868 consiste nas sequências de pAG4588 rearranjadas, incluindo a sequência 3’ de 595 bp do gene de marcador de PMI (letras maiúsculas, nucleotídeos 2594-3188 em pAG4588); a sequência de 48 bp entre PMI e terminador Nos (letras minúsculas, nucleotídeos 3189-3236); a sequência terminadora Nos de 276 bp (letras maiúsculas, nucleotídeos 3237-3512); a sequência de 73 bp perto da borda esquerda do T-DNA com os primeiros 3 bp da sequência da borda esquerda do T-DNA processada (letras minúsculas em itálico, nucleotídeos 3513-3585); a sequência de 119 bp perto da borda direita do T-DNA com 5 bp da borda direita do T-DNA processada e uma sequência polivinculadora parcial (sequência em letras minúsculas, nucleotídeos 9647- 9765). Estão sublinhados 18 bp de uma sequência duplicada que foi criada durante o processo de integração de T-DNA. A sequência OB-2868 é a seguinte:AAAATCCCGCGCGCTGGCGATTTTAAAATCGGCCCTCGATAGCCAGCAGGGTGA ACCGTGGCAAACGATTCGTTTAATTTCTGAATTTTACCCGGAAGACAGCGGTCTGTTCT CCCCGCTATTGCTGAATGTGGTGAAATTGAACCCTGGCGAAGCGATGTTCCTGTTCGCT GAAACACCGCACGCTTACCTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCAAACTCCGATAA CGTGCTGCGTGCGGGTCTGACGCCTAAATACATTGATATTCCGGAACTGGTTGCCAATG TGAAATTCGAAGCCAAACCGGCTAACCAGTTGTTGACCCAGCCGGTGAAACAAGGTGCA GAACTGGACTTCCCGATTCCAGTGGATGATTTTGCCTTCTCGCTGCATGACCTTAGTGA TAAAGAAACCACCATTAGCCAGCAGAGTGCCGCCATTTTGTTCTGCGTCGAAGGCGATG CAACGTTGTGGAAAGGTTCTCAGCAGTTACAGCTCAAACCGGGTGAATCAGCGTTTATT GCCGCCAACGAATCACCGGTGACTGTCAAAGGCCACGGCCGTTTAGCGCGTGTTTACAA CAAGCTGTAAgagcttactgaaaaaattaacatctcttgctaagctgggagctctagaT CCCCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCT GTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAAT AATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGC AATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTA TCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGgcgagctcgaattaattcag tacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgttatcaag ttgtctaagcgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatca tgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgt tttacgtttgg (ID. DE SEQ. N°: 26).

[00260] Evento 4588.757: O evento 4588.757 carrega um sítio de integração de T-DNA que está localizado no cromossomo de milho 8.

[00261] A localização cromossômica do sítio de integração de T-DNA foi determinada por meio de pesquisas com BLASTN, nas quais as sequências de DNA genômico de milho que estão contidas em sequências OB-3170 e OB-3237 isoladas consequentemente de sítios de inserção de T-DNA nas bordas direita ou esquerda do T-DNA, foram usadas com as indagações para a pesquisa de bancos de dados de sequências do genoma de milho B73 disponíveis publicamente, por exemplo, http://www.milhogdb.org/. Veja também Andorf, C.M. e cols. (2015) Nucleic Acids Research; identificador de objeto digital: 10.1093/nar/gkv1007; Lawrence, C.J. e cols. (2005) Plant Physiology 138: 55-58; Lawrence, C.J. e cols., (2004) Nucleic Acids Research 32: D393-D397, todos incorporados nesse relatório descritivo por referência como se totalmente descritos.

[00262] Nos flancos OB-3170 e OB-3237, que são fornecidos abaixo, o DNA genômico de milho é mostrado em letras maiúsculas, enquanto o vetor pAG4588 está indicado nas letras minúsculas sublinhadas.

[00263] A sequência flanqueadora da borda direita do T- DNA de 1.303 bp OB-3170 consiste no DNA genômico de 975 bp de milho anexado aos 328 bp da sequência sem borda do vetor pAG4588 proximal à borda direita do sítio de T-DNA. O flanco isolado do DNA genômico de milho de 975 bp possui 99,38% de identidade de sequência para a sequência derivada do cromossomo de milho 8 com coordenadas de nucleotídeos 62661042-62662016.

[00264] A sequência OB-3170 é a seguinte: TTGGGGTTCCTTATCCTGTTGTCGGAGTTGTGCCATTATCCTTTCCATGGTTGA CCTGAGCTTTAGCCTGTACACTGTAGACTCTACTAGAGGTTTACCTGAGGCTGAATTCC CGCTGCTAAGATGTGATGTTCCCGGCCATAAGCAAAGATGCAGGTTGTCTTTGCTTTGT AAAGATGAAGGTTGTCTTTGTTTTGTAATCGAAAAAAAAACCCTCCGACTTCGATAGCA ATCCATTTCTTGAAACGATATAGCTATAAGCTGCAGCCACACCTTGCGTTGATGATGCC AAAGCTTTCTTTCGAGTGCGATGCATGCACTGGCCTGTTGAGATCTTATCAATATGGCA AACAGTAACCTAACGTATATGACTACATGGTCTTCATGCTTTTGAGAGGTGCCTCATAG GAAACAGTCAGGCCAATGATTTTAGGGAATACAATATATTTTTGCTGTTTTTTTTTTGC AAATTGTCCATATTATTACAAAAAAAACTAAACATGCCCAAAGGCAATAGCTTTCTAAA TAAAAATGAATAACGGTCCACTTATATATGTTGGCCAGTAATCAATTCTGAGGCCTGAC AAACCATGCATATATTAACAGTAGGTTAATGGCCGTGCGTGAAAAAATTTCAATACAAC AAGAGATTGAAAAAAAAGAGTGTCTTACCAATATGTTATTTTATAAGTACCAAATGTGT AGGAAACTTGCATTCATTTTTTCCCTGAGAATGGAAAAAAACAAGACATACTCATTTTC AAGTTGAATTGTCATAGCAACACACATGTTGTATCTGCCGGTTCATGCAATTGTGCCAA CCAAAATATCTAAATGAGATATTCAAGACTCAACAGAATTAAAGTATGGAATAGGGTGT ATATACACTCAACCATTATTAAATGGTATAATCATCTATCTATATCACTATAAAATCTA CCAGTTTAAACTTCACAAAACTCATCTAGCTAATGGaggcgggaaacgacaacctgatc atgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccg ttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagcctaagcggcc gcattggacttaattaagtgaggccggccaagcgtcgatttaaatgtaccacatggcgc gccaactatcatgcgatcgcttcatgtctaactcgagttactggtacgtaccaaatcca tggaatcaaggtacctccatgctgtcctactacttgcttcatccccttctacattttgt tctggttttg (ID. DE SEQ. N°: 27).

[00265] A sequência flanqueadora da borda esquerda do T- DNA de 960 bp OB-3237 consiste nos 620 bp do DNA genômico de milho anexados à sequência do vetor pAG4588 de 340 bp (nucleotídeos 3260-3599 em pAG4588), que inclui a sequência terminadora Nos de 253 bp e a sequência de 70 bp upstream da sequência da borda esquerda do T-DNA processada de 17 bp. O flanco isolado de 620 bp do DNA genômico de milho possui 100% de identidade de sequência para a sequência derivada do cromossomo de milho 8 com coordenadas de nucleotídeos 62662037-62662642.

[00266] A sequência OB-3237 é a seguinte: Aaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgat gattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgca tgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatac gcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatc tatgttactagatcgggaattggcgagctcgaattaattcagtacattaaaaacgtccg caatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatataAAATCTACC TGTTCGCTGATAAGCCGTTAGGTTGACTATGTGACTGTTGGGCGGCAAAATGACCACGC GGACGGTCTAGCCCCAAAGCCGGACGGTCCGCGGTCCAGACAGTCTGCACTGGTGGTGT CGGCGTTTCGACCCCGGGGGGTCCCTGGACCGACGAGTAAATTGTCGCTGCGTGTCCCA GCCCAGATGGGTCCGCGCGAGACGGAACGCGAAGATGGGAAAACAGCAAAGGGGAACCC GCGGCCTTCGTGTTGTCCTGCGCCCAGGTCGGGTGCGCTTGCAGTAGGGGGTTACAACC GTTCGCGTGGGAGAGACAGAGAGAGAGCGAGAGCCTTATGCGTCGGCCCGTTCTCCCGC GCGGCCAACCCTCTCGTACGAGAGCCCTGGACCTTCCTTTTATAGACGTAAGGAGAGGG CCCAGGTGTACAATGGGGGGTGTAGCAGAGTGCTAACGTGTCTAGCAGAGAGGAGCCGG AGCCCTAAGTACATGTCGTCGTGGCTGTCGGAGAGGTTTTGGCGCCCTGTTCATGTGAT GTCGTGGCCGTCGGAGGAGCGCTTGAGCCCCGTGGAAGTACAGCTGTCGGGGCTGTCGG ATCCTTGCTGACGTCTCCTTG (ID. DE SEQ. N°: 28).

[00267] Os flancos do DNA genômico de milho nas sequências OB-3170 e OB-3237 são separadas por 21 nucleotídeos no cromossomo de milho 8, o que indica que durante a integração de T-DNA, 21 bp da sequência genômica de DNA de milho original foram substituídos pelas sequências de T-DNA inseridas.

[00268] Evento 4588.652: A Figura 11 ilustra um diagrama que mostra posições das sequências flanqueadoras caracterizadas em 4588.652.

[00269] Sequências isoladas no sítio de inserção de T- DNA em 4588.652. T-DNA no evento 4588.652 se integrou no cromossomo 7 do genoma do milho no genótipo BxA, que foi usado para transformação de milho com a construção de pAG4588. A inserção de T-DNA ocorreu entre os nucleotídeos 141683320-141683357 do genoma do milho B73 de referência publicamente disponível. A integração de T-DNA deslocou 38 bp da sequência genômica de milho nativa nesse sítio. Esse DNA de 38 bp está sublinhado e as sequências de pAG4588 estão sublinhadas e mostradas em caracteres em negrito nas sequências das inserções de T-DNA mostradas abaixo. O diagrama ilustrado na Figura 11 retrata localizações das sequências no lócus em 4588.652. As sequências flanqueadoras da borda direita e da borda esquerda de T-DNA, OB-4448 e OB- 4451, respectivamente, foram isoladas de múltiplas proles de 4588.652 usando uma abordagem de genoma “walking” à base de PCR. Todas as regiões genômicas entre os flancos da borda direita e da borda esquerda foram isoladas e as sequências caracterizadas de genótipos BxA WT, I9545 (E), I5009 (G), bem como os nulos BC2ES2_512x e BC1GS2_518x. As seguintes sequências do DNA genômico de trigo do tipo selvagem foram usadas para referência: a sequência WT_BxA (OB-4541; ID. DE SEQ. N°: 32), a sequência WT_E (OB-4545; ID. DE SEQ. N°: 33), a sequência WT_G (OB-4547, OB-4548; ID. DE SEQ. N°: 34), a sequência Null_ BC2ES2_512x (OB-4578 até OB-4580; ID. DE SEQ. N°: 35), a sequência Null_BC1GS2_518x (OB-4582 até OB-4584; ID. DE SEQ. N°: 36) e a sequência de referência WT_B73Chr7_141681606-141685147 (ID. DE SEQ. N°: 37). Além disso, flancos da borda direita e da borda esquerda foram adicionalmente isolados e inteiramente sequenciados da prole transgênica de 4588_652 mais avançada BC2ES2_472x. Toda a sequência genômica BxA de 4.044 bp contendo as sequências flanqueadoras da borda direita e da borda esquerda possuem altos hits de identidade por BLASTN para duas posições de nucleotídeos 141681606-141682538 e 141682550-141685147 no cromossomo 7 no genoma de milho B73.

Análise das sequências de nucleotídeos no flanco da borda esquerda do T-DNA

[00270] O flanco da borda esquerda do T-DNA OB-4451 possui 98,66% de identidade de sequência por BLASTN para nucleotídeos 141683358-141685147 no cromossomo de milho 7 no genoma B73. O alinhamento de sequências múltiplas das sequências específicas da borda esquerda dos genótipos B73 do tipo selvagem, BxA, I9545 (E), I5009 (G), nulos BC2ES2_512x e BC1GS2_518x, bem como proles transgênicas de 4588_652 116_F1G e BC2ES2_472x e a sequência pública de referência do genoma B73 revelou que essas sequências de 1,8 kb são quase 100% idênticas entre todos os genótipos.

Análise de sequências de nucleotídeos no flanco da borda direita do T-DNA

[00271] O flanco da borda direita de 2.218 bp OB-4448 possui alta identidade de sequência por BLASTN para duas posições de nucleotídeos, 141681606-141682538 e 141682550141683319, no cromossomo de milho 7 no genoma B73. O alinhamento de sequências múltiplas das sequências específicas da borda direita de proles transgênicas de 4588_652 116_F1G e BC2ES2_472x com a sequência WT de BxA revelou que essas três sequências de 2,2 kb são quase 100% idênticas.

[00272] Uma sequência “única” de 521 bp que é específica para o flanco da borda direita do T-DNA foi originada do genótipo BxA, que foi usado para transformação com a construção de pAG4588. Nenhum hit de identidade de sequência por BLASTN para essa sequência foi identificado no sítio de integração de T-DNA dentro do genoma B73 de referência. Por outro lado, a sequência de 521 bp possui vários hits de identidade por BLASTN em múltiplos cromossomos, indicando que essa sequência é altamente repetitiva. A sequência de 521 bp é mostrada em letras minúsculas em itálico.

[00273] Sequências caracterizadas no sítio de integração de T-DNA de 4588_652. A sequência OB-4448 (flanco da borda direita estendido em 4588_652 isolada de F1G de 4588_652) é a seguinte:

[00274] A sequência RB_BC2ES2_472x (flanco da RB estendido isolada da prole avançada de 4588_652) é a seguinte:

[00275] A sequência OB-4451 (flanco da borda esquerda estendido em 4588_652) é a seguinte:

Exemplo 6. Expressão de glucanase de ração em gerações subsequentes

[00276] Várias proles “T1” de plantas de milho transgênicas “T0” originais foram desenvolvidas, e espigas individuais foram autopolinizadas ou polinizadas com pólen de plantas de milho do tipo selvagem. A semente madura das espigas resultantes foi então avaliada quanto à atividade de glucanase de ração por meio do ensaio colorimétrico. A Figura 12 ilustra que a atividade de glucanase foi observada em eventos T1. Nessa figura, os números ao longo da abscissa correspondem aos identificadores de eventos das plantas T0 originais das quais as proles foram derivadas. A maior atividade foi observada para sementes de plantas T1 derivadas do evento 4597_69.

Exemplo 7. Expressão de glucanase de ração em várias gerações de sementes hemizigotas, homozigotas e híbridas

[00277] As proles de plantas de milho transgênicas “T0” originais foram desenvolvidas e retrocruzadas (polinizadas com pólen dos progenitores de milho do tipo selvagem ou polinizadas nos progenitores do tipo selvagem) por 4 gerações (na linhagem de milho endogâmica E (BC4E), ou na linhagem de milho endogâmica G (BC4G)). Em cada geração, algumas espigas individuais foram autopolinizadas. O método de PCR foi aplicado para a seleção de plantas homozigotas, como descrito no Exemplo 8. Espigas hibridas foram feitas por polinização cruzada de plantas da linhagem transgênica G com plantas da linhagem transgênica E, ou vice-versa.

[00278] A Figura 13 ilustra que a atividade de glucanase nas espigas hemizigotas, homozigotas e híbridas do evento 4588.259. As espigas homozigotas e híbridas continham atividade média de 190 unidades/g, o que era aproximadamente o dobro das espigas de plantas hemizigotas.

Exemplo 8. Ensaios de PCR para identificação e determinação de zigosidade dos eventos de glucanase 4588.259, 4588.652 e 4588.757

[00279] Os eventos de glucanase de milho 4588.259, 4588.652 e 4588.757 carregam transgenes que resultam na expressão semente-específica da enzima glucanase. O evento 4588.259 originalmente carregava duas inserções de T-DNA em loci que segregam independentemente, mas subsequentemente um único lócus genético foi selecionado para propagação e desenvolvimento. Os eventos 4588.652 e 4588.757 carregam dois ou mais T-DNAs em um único lócus genético. A identificação molecular e o rastreamento desses transgenes podem ser feitos com o uso de análise por PCR-padrão (pontuação visual de um ponto final em uma eletroforese à base de gel e coloração dos produtos de PCR) ou PCR em tempo real. Além de determinar se uma planta está que carregando um transgene, alguns desses ensaios de PCR também podem determinar se uma planta é hemizigota (que carrega uma cópia da inserção) ou homozigota (que carrega duas cópias da inserção).

[00280] A Figura 24 ilustra o design geral do ensaio de PCR em tempo real usado para determinar a presença do lócus de T-DNA (PCR-padrão e em tempo real) e zigosidade (somente PCR em tempo real).

[00281] Na Figura 14, os ensaios de PCR padrão e em tempo real incluem, para cada lócus de T-DNA, um iniciador (Iniciador A) que se liga a uma região genômica de milho que é adjacente ao local onde o inserto de T-DNA está localizado, e um iniciador (Iniciador B) que se liga a uma região no T- DNA que está perto do Iniciador A. Para determinar zigosidade no ensaio de PCR em tempo real, um segundo gene de referência (GWD, glucano-água-diquinase) é amplificado (iniciadores X e Y), juntamente com os iniciadores do lócus. A amplificação por PCR em tempo real do produto dos Iniciadores A + B indicaria que o lócus de T-DNA está presente e sua fluorescência em relação à fluorescência da referência de GWD (ref) da amplificação do produto dos Iniciadores X + Y determinaria se ela é hemizigota (uma cópia) ou homozigota (duas cópias).

[00282] O ensaio de PCR multiplex padronizado inclui os Iniciadores A e B, como descrito acima, mas também outro iniciador (Iniciador C) que se liga a uma região genômica de milho no outro lado do T-DNA, oposto ao Iniciador A, e estaria perto do Iniciador A se a inserção de T-DNA não estivesse presente, como em um lócus do tipo selvagem (WT). A Figura 15 ilustra o design geral do ensaio de PCR-padrão uado para determinar a presença do lócus de T-DNA e zigosidade. Quando a inserção de T-DNA está presente, a distância entre o Iniciador A e o Iniciador C seria muito grande para amplificar um produto sob nossas condições de amplificação por PCR e, portanto, a ausência desse produto de amplificação é usada para determinar a zigosidade. A amplificação por PCR de produtos pelos Iniciadores A + B e Iniciadores A + C indica que o lócus de T-DNA está presente e é hemizigoto (uma cópia). A amplificação por PCR do produto dos Iniciadores A + B, mas não dos Iniciadores A + C, indica que o lócus de T-DNA está presente e é homozigoto (duas cópias). A amplificação por PCR do produto somente dos Iniciadores A + C indica que nenhum T-DNA está presente e que a planta é WT nesse lócus. Os iniciadores e sondas para todos esses ensaios estão listados nas Tabelas 3 e 4. Tabela 3. Iniciadores e sondas de PCR-padrão e em tempo real (RT) usados para determinar a presença do lócus de T-DNA e a zigosidade dos eventos 4588.259, 4588.652 e 4588.757. Tabela 4. Combinações de iniciadores de PCR específicos para os eventos 4588.259, 4588.652 e 4588.757 e tamanhos do produto de PCR.

Ensaio de PCR com o uso dos iniciadores X (371) e Y (525) identifica o lócus ZmGWDref (ID. DE SEQ. N°: 56). Extração de DNA

[00283] Esses ensaios de PCR funcionarão com qualquer método de extração de DNA que gere DNA que possa ser amplificado com PCR. Um método de extração de DNA padronizado (10X TE + Sarcosil) que foi usado nesse exemplo é o seguinte: é retirada uma amostra de tecido de folha (perfurador padrão de 1 cm) e ela é colocada em um bloco de 96 poços profundos,microesferas de metal são adicionadas , e o bloco é congelado a -80°C por pelo menos 30 min. O bloco é então triturado por 45 segundos em um pulverizador Kleco, centrifugado a 4.000 RPM por 3 min, a tampa é removida, 300 μl de 10X TE + Sarcosil são adicionados, o bloco é lacrado novamente, e o bloco é misturado em temperatura ambiente por 10-20 min. Após incubação, o bloco é centrifugado a 4.000 RPM por 5 min, 165 μl da fase aquosa superior são removidos e adicionados a um bloco de PCR de 96 poços, o bloco de PCR é lacrado, e depois incubado a 90°C por 30 min. Após incubação, 20 μl de extrato são adicionados a 180 μl de água estéril em uma placa de 96 poços (diluição de 1:10) para criar a amostra de DNA final para PCR.

PCR

[00284] Os iniciadores de PCR-padrão e em tempo real para os eventos 4588.259, 4588.652 e 4588.757 estão listados na Tabela 3 e combinações de iniciadores de PCR-padrão com tamanhos esperados do produto de PCR estão listados na Tabela 4.

[00285] PCR-padrão é realizada com 2 μl de extrato de DNA e Mistura de PCR GoTaq (Promega) ou Kapa 3G (Kapa Biosystems) em volumes de reação de 30 μl com os seguintes componentes e condições para cada evento:

PCR-padrão do Evento 4588.259:

[00286] Os componentes (concentração final) foram os seguintes: Mistura de PCR com tampão, MgCl2, nucleotídeos e enzima (1X); iniciador 509 (400 nM) e iniciador 516 (400 nM). As condições foram as seguintes: 95°C, 3 min; 33 ciclos (95°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos); 72°C, 8 min.

PCR-padrão do Evento 4588.652:

[00287] Os componentes (concentração final) foram os seguintes: Mistura de PCR com tampão, MgCl2, nucleotídeos e enzima (1X), iniciador 749 (400 nM), iniciador 750 (400 nM) e iniciador 751 (400 nM). As condições foram as seguintes: 95°C, 3 min; 33 ciclos (95°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos); 72°C, 8 min.

PCR-padrão do Evento 4588757:

[00288] Os componentes (concentração final) foram os seguintes: Mistura de PCR com tampão, MgCl2, nucleotídeos e enzima (1X), iniciador 513 (400 nM), iniciador 608 (400 nM) e iniciador 609 (400 nM). As condições foram as seguintes: 95°C, 3 min; 33 ciclos (95°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos); 72°C, 8 min.

[00289] PCR-padrão foi analisada por execução de aproximadamente 15 μl de produto de PCR em um gel de agarose 3% a 95 V por 30 min. Um exemplo de resultados de uma análise por PCR-padrão das plantas segregantes autofecundadas 4588.652 é mostrado na Figura 16. Em referência a essa figura, dez reações de PCR de 10 plantas independentes foram separadas em um gel de agarose 3% corado com brometo de etídio. Os tamanhos de banda esperados para o lócus e zigosidade estão indicados no lado direito da imagem.

[00290] A presença do lócus e a zigosidade são pontuados por visualização de bandas específicas em cada raia.

[00291] PCR em tempo real foi realizada com 2 μl de extrato de DNA em volumes de reação de 20 μl com os seguintes componentes e condições para cada evento:

PCR em tempo real do Evento 4588.259:

[00292] Os componentes (concentração final) foram os seguintes: Mistura de PCR com tampão, MgCl2, nucleotídeos e enzima (1X), iniciador 509 (400 nM, iniciador 516 (400 nM), iniciador 371 (400 nM), iniciador 525 (400 nM), sonda PB5 (200 nM) e sonda PB2 (200 nM). As condições foram as seguintes: 95°C, 4 min; 40 ciclos (95°C, 5 segundos; 60°C, 45 segundos).

PCR em tempo real do Evento 4588.652:

[00293] Os componentes (concentração final) foram os seguintes: Mistura de PCR com tampão, MgCl2, nucleotídeos e enzima (1X), iniciador 750 (400 nM), iniciador 751 (400 nM), iniciador 371 (400 nM), iniciador 525 (400 nM), sonda PB17 (200 nM) e sonda PB2 (200 nM). As condições foram as seguintes: 95°C, 4 min; 40 ciclos (95°C, 5 segundos; 60°C, 45 segundos)

PCR em tempo real do Evento 4588.259:

[00294] PCR em tempo real pode ser analisada por qualquer máquina de PCR em tempo real e softwares capazes de detecção de fluorescência de quatro canais. Uma máquina de PCR em tempo real Bio Rad CFX96 e o Software de Gerenciamento CFX foram usados para executar um exemplo do ensaio de PCR de 4588.259 em uma população segregante autofecundada de plantas 4588.259. A Figura 17 ilustra um exemplo de dados de PCR em tempo real para 4588.259 para determinar presença do lócus e zigosidade. Nessa figura, “RFU” se refere às unidades de fluorescência relativa; “ntc” se refere a sem controle- alvo. A presença do lócus de 4588.259 e zigosidade foi pontuada por agrupamento de pontos de dados no gráfico.

Exemplo 9. Taxas de germinação entre sementes de plantas transgênicas independentes que expressam glucanase de ração

[00295] Sedas de plantas do tipo selvagem foram polinizadas com pólen de plantas transgênicas individuais (WT x Transgênicas), ou sedas em plantas transgênicas foram polinizadas com pólen de plantas do tipo selvagem (Transgênicas x WT). Sementes secas maduras foram coletadas das espigas resultantes e plantadas no solo. Após 1-2 semanas de incubação, as taxas de germinação foram calculadas. Em alguns casos, esse teste foi repetido após uma segunda geração de crescimento e polinização (T2). Exemplos de resultados desses testes de germinação são mostrados na Tabela 5. Tabela 5. Taxas de germinação entre sementes que expressam beta-glucanase.

[00296] A taxa de germinação em T1 e/ou T2 para os eventos 4597_54, 4597_56, 4588_161, 4588_252, 4588_259, 4597_101 e/ou 4597104 foi observada como sendo de 100%.

Exemplo 10. Sobrevida da atividade de glucanase de ração durante a preparação de peletização de ração de aves domésticas

[00297] Grão moído de plantas transgênicas que expressam a glucanase de ração foi misturado com dietas de milho-soja iniciais e de crescimento que foram formuladas para frangos de corte. A dieta de milho-soja basal para frangos iniciais era composta da seguinte forma: 54,89% de milho 08-2012, 32,81% de bagaço oleaginoso de soja, 5,00% de grãos secos de destilaria mais sólidos solúveis, 2,00% de vermiculita, 1,99% de fosfato dicálcico, 1,00% de gordura de aves domésticas, 0,81% de calcário fino, 0,50% de sal comum (NaCl), 0,20% de DL-metionina, 0,20% de cloreto de colina 60, 0,20% de pré-mistura mineral, 0,13% de L-lisina, 0,12% de L-treonina, 0,05% de pré-mistura de vitamina, 0,05% de COBAN® e 0,05% de pré-mistura de selênio. A dieta de milho- soja basal para o crescimento frangos era composta da seguinte forma: 58,53% de milho, 26,63% de bagaço oleaginoso de soja, 8,00% de grãos secos de destilaria mais sólidos solúveis, 2,00% de vermiculita, 1,69% de fosfato dicálcico, 1,00% aves domésticas gordura, 0,76% de calcário fino, 0,50% de sal comum (NaCl), 0,20% de pré-mistura mineral, 0,20% de cloreto de colina 60, 0,13% de DL-metionina, 0,13% de L- lisina, 0,08% de L-treonina, 0,05% de pré-mistura de vitamina, 0,05% de COBAN® e 0,05% de pré-mistura de selênio.

[00298] Milho fino foi triturado usando as telas de moinho de martelo: N° 4/4 para a dieta inicial e N° 6/6 para as dietas de crescimento e finalizadoras. Milho não refinado (5% do milho total) foi triturado com o moinho de cilindro com aberturas com lacuna 0/100.

[00299] Quatro dietas foram formuladas para o experimento de peletização da seguinte forma: a Dieta A era uma dieta basal, a Dieta D era a dieta basal misturada com uma enzima de controle, a Dieta E era a dieta basal misturada com o grão de milho transgênico triturado contendo um nível elevado de glucanase, e a Dieta F era a dieta basal misturada com o grão de milho transgênico triturado contendo um nível baixo de glucanase.

[00300] Grão moído de plantas transgênicas que expressam a glucanase de ração foi misturado com as dietas basais em uma proporção de aproximadamente 0,454 quilograma por 907,185 quilogramas de mistura da dieta basal. Para a dieta de dose baixa, grão transgênico primeiro foi misturado com grão não transgênico em uma proporção de peso de 1:4 (1 grama de grão transgênico por 4 gramas de grão não transgênico) para diluir a concentração de enzima antes da adição desse ingrediente às dietas basais.

[00301] Todas as dietas de ração foram peletizadas a 79,44-82,22°C em péletes de 4,4 mm, e as dietas iniciais foram esfareladas.

[00302] As Figuras 18A e 18B ilustram a atividade de glucanase antes e depois da peletização na Dieta de crescimento (Figura 18A) e na Dieta inicial (Figura 18B). Em relação a essas figuras, amostras da mistura resultante foram então removidas antes e depois da peletização da ração. Essas amostras foram então testadas por meio do ensaio colorimétrico de glucanase para determinar se a enzima sobreviveu ao processo de peletização. As identidades das várias dietas mostradas nas Figuras 18A e 18B foram as seguintes: A, dieta basal de controle (sem enzima externa); D, dieta de controle positivo (enzima disponível comercialmente adicionada); F, dieta de baixa dose (incluindo grão triturado de plantas que expressam a glucanase de ração); E, dieta de dose alta (incluindo grão triturado de plantas que expressam a glucanase de ração). Foi observado que a atividade de glucanase era elevada na dieta de dose alta tanto para a Dieta inicial quanto para a Dieta de crescimento e sobreviveu à peletização.

Exemplo 11. Estabilidade térmica de glucanase de ração expressa por grãos

[00303] Glucanase de ração foi preparada por meio de expressão microbiana e purificação, e suspensa em tampão SEC (100 mM de MES, 300 mM de NaCl, pH 6,3). Cinco microlitros dessa preparação foram misturados com 20 mg de grão triturado de milho do tipo selvagem. Em paralelo, 5 μl de tampão SEC foram misturados com 20 mg de grão triturado de plantas transgênicas que expressam glucanase de ração. Réplicas de cada um desses dois conjuntos de amostras foram incubadas a 94°C ou aproximadamente 130°C por vários períodos de tempo, e depois foi permitido que resfriassem até a temperatura ambiente. Subsequentemente, a atividade residual de glucanase foi medida por meio do ensaio colorimétrico. As Figuras 19 A e 19B ilustram a atividade de glucanase após tratamento térmico. A Figura 19A ilustra a atividade de glucanase após tratamento a 130°C. A Figura 19B ilustra a atividade de glucanase após tratamento a 94°C. Nesses experimentos, mais atividade sobrevivia quando a glucanase de ração era produzida no próprio grão do que quando ela era adicionada ao grão exogenamente. Esse achado demonstra que a expressão e o acúmulo da enzima no grão fornece eficazmente à enzima estabilidade térmica adicional em relação à mesma enzima que é produzida de forma microbiana. Nesse caso particular, tanto as enzimas expressas pelo grão quanto as enzimas expressas de forma microbiana possuem a mesma sequência de aminoácidos primária. Portanto, a estabilidade térmica aumentada que foi observada na farinha do grão transgênico está relacionada ao hospedeiro de expressão.

Exemplo 12. Atividade de AGR2314 produzida de forma microbiana em vários valores de pH

[00304] A atividade de AGR2314 foi medida em vários valores de pH entre 3 e 8,5. Cada ensaio (500 μl) continha politampão de Britton-Robinson (40 mM de fosfato de sódio, 40 mM de borato de sódio e 40 mM de acetato de sódio), Tween- 20 0,01% (v/v), um comprimido de substrato de Beta-glucazima (Megazyme, Wicklow, Irlanda) e 20 nM de AGR2314 em um tubo de Eppendorf de 2 ml. As amostras foram incubadas por 1 hora a 37°C ou 80°C. As reações foram terminadas pela adição de 1 ml de base Tris 2% (p/v). As amostras foram centrifugadas a 15.000 X g por 10 minutos, e 100 μl de cada sobrenadante (ensaios a 37°C) ou 5 μl de sobrenadante mais 100 μl de água (ensaios a 80°C) foram transferidos para uma microplaca de 96 poços de fundo plano. As absorbâncias foram lidas a 590 nm. Os ensaios em cada valor de pH foram realizados em triplicata. Ensaios de branco únicos (que não contêm enzima) foram realizados em cada pH, e esses valores de absorbância foram subtraídos dos ensaios que contêm enzima.

[00305] As Figuras 20 e 21 ilustram o pH ótimo para medição da atividade de AGR2314 a 37°C (Figura 20) e 80°C (Figura 21). Em relação à Figura 20, o pH ótimo foi determinado como sendo de 7-7,5 a 37°C. A Figura 21 ilustra que o pH ótimo foi determinado como sendo de 6 a 80°C.

[00306] A Figura 22 mostra um exemplo de pH ótimo da glucanase de ração que é produzida in farinha transgênica.

[00307] Para determinar o relacionamento entre o pH do grão do ensaio, 5 ml de água contendo Tween-20 0,2% foram misturados com 200 mg de farinha da semente transgênica em uma plataforma giratória por 1 hora a 60°C. Após centrifugação a 1.500 x g por 20 minutos em uma centrífuga clínica, o sobrenadante foi transferido para um tubo de Eppendorf de 15 ml. Essa amostra foi centrifugada a 1.500 x g por 10 minutos em uma centrífuga de bancada. Alíquotas desse extrato de proteína foram diluídas 20 vezes em ensaios para testar cada condição de pH por misturação de 50 μl de extrato com 950 μl de politampão de Britton-Robinson (40 mM de fosfato de sódio, 40 mM de borato de sódio e 40 mM de acetato de sódio) que foi preparado em pH 2-10. O pH de cada mistura de reação foi verificado usando uma fita de pH. Quinhentos microlitros de cada mistura foram transferidos para uma placa de 96 poços profundos para o ensaio. Um comprimido de beta-glucazima foi adicionado a cada poço e misturado por agitação em vórtex suave, e a placa foi lacrada e incubada a 80°C por 1 hora. As reações foram interrompidas por adição de 1 ml de base Tris 2% (p/v) a cada poço. A placa de 96 poços foi centrifugada a 3.000 x g por 10 minutos em uma centrífuga clínica, e depois 100 μl do sobrenadante de cada uma das amostras foram transferidos para os poços em uma microplaca de fundo plano, e a absorbância a 590 nm foi determinada em um espectrofotômetro de microplacas. Como mostrado na Figura 22, a enzima produzida por semente possui um pH ótimo entre pH 6 e pH 7, mas ainda retém uma grande fração de sua atividade em um pH tão elevado quando 10.

Exemplo 13. Atividade de AGR2314 e AGR2414 produzidas de forma microbiana em vários substratos

[00308] Todas as reações usaram 5 nM de AGR2314, AGR2414, ou 5 μl de enzima de controle nas concentrações indicadas, em 200 mM de fosfato de sódio, Tween-20 0,01% (v/v), pH 6,5. As reações foram realizadas por uma hora a 37°C ou 80°C e terminadas como descrito.

[00309] Ensaios de beta-glucosidase: o substrato foi 1 mM de pNP-D-glicopiranosídeo (Sigma Chemical Co., N° de Catálogo N7006) e a enzima de controle positivo foi betaglucosidase de Rhizobium etli (Prozomix, N° de Catálogo PRO- E0110; 315,9 Unidades/ml). Os volumes de reação foram 500 μl; as reações foram terminadas pela adição de 500 μl de base Tris 2% (p/v). Após centrifugação a 3.000 x g por 10 minutos, 100 μl de sobrenadante foram transferidos para uma microplaca e a absorbância a 405 nm foi registrada.

[00310] Ensaios de endocelulase: cada ensaio continha um comprimido de substrato de Cellazyme C (Megazyme, N° de Catálogo T-CCZ) em 500 μl de tampão. As reações foram terminadas pela adição de 1 ml de base Tris 2%. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 15.000 X g, 100 μl de sobrenadante foram transferidos para uma microplaca, e a absorbância a 590 nm foi registrada.

[00311] Ensaios de exocelulase (celobiohidrolase): o substrato foi 1 mM de pNP-D-celobiosídeo (Sigma, N° de Catálogo N5759) e a enzima de controle positivo foi CBHI de Trichoderma longibrachiatum (Megazyme, N° de Catálogo E- CBHI; 0,5 Unidade/μl). As condições de reação foram como descritas acima para os ensaios de beta-glucosidase.

[00312] Ensaios de amilase: o substrato foi Red Starch (Megazyme, N° de Catálogo S-RTAR; preparada como instruído pelo fabricante) e a enzima de controle positivo foi α- amilase de Bacillus licheniformis (Megazyme, N° de Catálogo E-BLAAM; 3000 Unidades/ml). Duzentos e quarenta e cinco μl tampão, 5 μl de enzima e 125 μl de reagente Red Starch foram misturados e incubados como descrito acima. As reações foram terminadas pela adição de 625 μl de etanol. Após incubação em temperatura ambiente por 10 minutos, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 3.000 x g, e 100 μl de sobrenadante foram transferidos para uma microplaca; a absorbância a 510 nm foi registrada.

[00313] Ensaios de endoxilanase: cada ensaio continha um comprimido de substrato de Xilazima AX (Megazyme, N° de N° de Catálogo XAX-1000) e a enzima de controle positivo foi 100 mg/ml de xilanase de Thermomyces lanuginosis (Sigma, N° de Catálogo X2753) em tampão de ensaio. As reações foram realizadas como descrito acima para os ensaios de endocelulase.

[00314] Ensaios de pectinase: o substrato foi 25 mg/ml de pectina (Sigma, N° de Catálogo P7536) em tampão de ensaio e a enzima de controle positivo foi pectinase de Aspergillus niger (Sigma, N° de Catálogo 17389) a 100 mg/ml em tampão de ensaio. Cinco μl de enzima foram adicionados a 35 μl de solução de pectina e incubados como descrito acima. As reações foram terminadas pela adição de 60 μl de solução de interrupção/reagente DNS (Wicher e cols., [2001], Appl. Biotechnol. 55, página 578), seguida por aquecimento a 95°C por 15 minutos. As amostras foram centrifugadas a 3.000 x g por 10 minutos, 20 μl de sobrenadante foram misturados com 100 μl de água em uma microplaca, e a absorbância a 550 nm foi registrada.

[00315] Ensaios de 1,3-beta-glucosidase: cada ensaio continha um comprimido de substrato de 1,3-beta-glucazima HS (Megazyme, N° de Catálogo ET-CUR200) e a enzima de controle positivo foi 1,3-β-D-glucanase de Trichoderma sp. (Megazyme, N° de Catálogo E-LAMSE; 50 Unidades/ml). As reações foram realizadas como descrito acima para os ensaios de endocelulase.

[00316] Ensaios de 1,4-beta-glucosidase: cada ensaio continha um comprimido de substrato de Beta-glucazima (Megazyme, N° de Catálogo TBGZ-1000T). As reações foram realizadas como descrito acima para os ensaios de endocelulase, exceto que 5 μl de sobrenadante foram misturados com 100 μl de água em uma microplaca para o registro da absorbância.

[00317] As Figuras 23A e 23B ilustram a atividade de glucanase para hidrólise de amido, celobiose (pNP-D- celobiosídeo), xilano (Xilazima AX), HE-celulose (Cellazyme C), cevada-B-glucano (Beta-glucazima), pectina e PNP-D- glicopiranosídeo a 37°C (Figura 23A) e 80°C (Figura 23B). Em relação a essas figuras, foi observado que ambas as enzimas, AGR2314 e AGR2414, eram altamente ativas na hidrólise de celobiose e HE-celulose a 37°C e 80°C.

Exemplo 14. Atividade de glucanase em fibra de semente

[00318] Glicose liberada pela fibra de semente não tratada - Vinte mg de fibra de semente foram digeridos em pH 5,0 com 5 μM de proteína de AGR2314 por 72 horas a 55°C. Um coquetel de enzima comercial foi usado em carregamento completo (FCT) como um controle positivo. Após hidrólise enzimática, os açúcares solúveis no sobrenadante da reação foram hidrolisados em monômeros por meio de hidrólise ácida a 121°C. as Figuras 24A e 24B ilustram a liberação de açúcares monoméricos após hidrólise enzimática da fibra de semente. A Figura 24A mostra o rendimento de glicose e a Figura 24B mostra o rendimento de xilose. Açúcares pré- hidrólise ácida (barras cinza-claro) e totais (barras cinza- escuro) foram separados e quantificados por meio de HPLC usando uma coluna de exclusão de íons Bio Rad Aminex HPX-87- P. AGR2314 não libera glicose monomérica ou xilose a partir de fibra de semente não tratada. No entanto, essa enzima foi capaz de solubilizar fibra de semente não tratada em oligossacarídeos que são responsáveis por aproximadamente 80% dos açúcares totais liberados por um coquetel de enzima- celulase disponível comercialmente.

[00319] Glicose liberada por fibra de semente pré-tratada com ácido diluído - Vinte mg de fibra de semente foram pré- tratados a 80°C em H2SO4 0,5% por 16 horas, e depois neutralizados até pH 5,0. A fibra de semente pré-tratada foi digerida em pH 5,0 com 2 μM de AGR2314 e um conjunto de glucanase, celobiohidrolase, endoglucanase e beta glucosidase (todas em 2 μM de carregamento) por 72 horas a 55°C. Um coquetel de enzima comercial (Accellerase XY, Genencor) foi usado no carregamento completo (FCT) como um controle positivo. Após hidrólise enzimática, os açúcares solúveis no sobrenadante da reação foram hidrolisados em monômeros por meio de hidrólise ácida a 121°C. As Figuras 25A e 25B ilustram a liberação de açúcares monoméricos após hidrólise enzimática da fibra de semente. A Figura 25A mostra o rendimento de glicose e a Figura 25B mostra o rendimento de xilose. Açúcares pré-hidrólise ácida (barras cinza-claro) e totais (barras cinza-escuro) foram separados e quantificados por meio de HPLC usando uma coluna de exclusão de íons Bio-Rad Aminex HPX-87-P.

[00320] AGR2314 não liberou açúcares da fibra de semente pré-tratada em níveis maiores do que o próprio pré- tratamento. Quando combinada com outras enzimas de degradação da parede celular, aproximadamente 90% dos açúcares totais foram liberados, quando comparada com um coquetel de enzima-celulase disponível comercialmente.

Exemplo 15. O uso de enzimas glucanase no desempenho vivo de frangos

[00321] A energia química contida dentro da dieta de um animal, e sua disponibilidade para que o animal que consome a dieta, são características cruciais que influenciam o valor nutricional de qualquer dieta. Dietas ricas em energia fornecem nutrição adequada e promovem crescimento rápido até níveis maiores do que dietas que são deficientes em energia. Portanto, a determinação da energia dentro de uma dieta, e a alteração da disponibilidade de energia por utilização de enzimas glucanase, fornecem um conjunto importante de ferramentas para melhorar a nutrição animal e, portanto, o desempenho do animal.

[00322] Para demonstrar o uso de enzimas glucanase na produção de frangos, a energia metabolizável e a digestibilidade de nutrientes, frangos-machos foram alimentados com ingredientes de ração alternativos (trigo, cevada e DDGS com baixo teor de gordura) com ou sem glucanase suplementar. O ganho de peso corporal, consumo de ração e taxa de conversão alimentar dos frangos foram determinados e a enzima glucanase de ração foi avaliada.

Tratamentos dietéticos e procedimentos

[00323] Frangos-machos com um dia de idade foram obtidos de uma chocadeira comercial e alocados aleatoriamente em 64 gaiolas em bateria em grupos de 10. Dietas experimentais foram fornecidas de 0 a 28 dias de idade. Os pesos do grupo inicial foram obtidos e equalizados entre os tratamentos. O desaparecimento da ração e o peso corporal foram medidos semanalmente (7, 14, 21 e 28 dias de idade) para calcular parâmetros de desempenho vivo (consumo de reação, ganho de peso corporal e proporção de conversão alimentar). Além disso, excrementos foram coletados duas vezes para determinar a energia metabolizável aparente (AME) das dietas em 14 e 29 dias de idade.

[00324] Os tratamentos dietéticos foram alimentados em um design fatorial de 4 x 2 e adicionalmente delineados abaixo. Quatro dietas diferentes (dietas à base de milho/farelo de soja, à base de milho/trigo, à base de milho/cevada e à base de milho/LF-DDGS) e dois níveis de glucanase (com ou sem) foram fornecidos. As dietas foram formuladas para serem isocalóricas e todos os nutrientes, com a exceção de energia, foram formulados para obedecerem ou excederem as necessidades de nutrientes. Os tratamentos com enzima tiveram a enzima adicionada no topo da dieta. Além disso, dióxido de titânio foi adicionado às dietas como um marcador indigerível para determinar AME e a digestibilidade de nutrientes. A Tabela 6 descreve os tratamentos dietéticos. Tabela 6. Delineamento dos tratamentos. Total de machos necessários: 8 tratamentos x 8 reps x 10 pássaros/gaiola = 640 frangos-machos + 60 para equacionamento = 700 frangos-machos

Temperatura

[00325] Gaiolas em bateria: 33,33°C da colocação até 4 d, 32,22°C de 5 a 9 d, 28,88°C de 10 a 15 d, 26,66°C de 16 a 24 d, 25,55°C de 25 a 29 d.

Configuração da sala

[00326] Antes da colocação do pássaro, a iluminação e a temperatura nas salas das gaiolas em bateria eram ajustadas 48 horas antes. Pisos de arame foram adicionados às gaiolas em bateria até o dia 0 a 4. A menos que observado na programação, para períodos de coleta, os recipientes para excrementos eram descartados regularmente para evitar quaisquer problemas relacionados a pragas e odores.

Programa de iluminação

[00327] Um ciclo de 23 horas de luz/1 hora de escuro, com uma intensidade de iluminação de 0,27 m2 foi implementado desde a colocação até 7 dias de idade. Uma programação de iluminação de 23 horas de luz/1 hora de escuro foi implementada de 8-21 dias, com uma intensidade de iluminação de 10,7639 Lux. Uma programação de iluminação de 23 horas de luz/1 hora de escuro foi implementada de 22-28 dias de idade, com uma intensidade de iluminação de 3,229 Lux.

Instruções especiais

[00328] Pisos de arame foram colocados em todas as gaiolas em bateria antes do início do experimento ou pintos com um dia de idade cairiam através da base das gaiolas. Os pisos de arame foram removidos no dia 7. Além disso, as portas das gaiolas foram modificadas para acomodar pássaros menores de 0 a 7 dias de idade.

[00329] Qualquer mortalidade não foi reposta.

[00330] Todas as dietas foram fornecidas em forma esfarelada. Folhetos da mistura eram disponíveis.

[00331] Para evitar contaminação cruzada da enzima, foram necessárias colheres de ração separadas. A Tabela 7 descreve a cronologia experimental.Tabela 7. Cronologia dos tratamentos dietéticos.

[00332] A Figura 26 ilustra o ganho de peso corporal (BWG) durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias. Em relação à Figura 26, quatro dietas diferentes, à base de milho/farelo de soja, à base de milho/cevada, à base de milho/trigo e à base de milho/LF-DDGS, com (+) ou sem (-) uma glucanase, foram testadas. Ainda em relação à Figura 26, é mostrada a média de BWG com ou sem glucanase através das quatro dietas. Foi observado que o ganho de peso corporal foi, na média, maior em galinhas alimentadas com as dietas que incluíam uma glucanase.

[00333] A Figura 27 ilustra as alterações no BWG de aves domésticas por intervalo de tempo durante o experimento de alimentação de 28 dias. Em relação à Figura 27, os pesos do grupo inicial foram obtidos e equalizados entre os tratamentos. O BWG foi medido semanalmente (7, 14, 21 e 28 dias de idade) para a ração de frangos usando a dieta de milho/LF-DDGS com (+) ou sem (-) uma glucanase. Ainda em relação à Figura 27, foi observado através de todos os tratamentos que o ganho de peso corporal em galinhas alimentadas com as dietas que incluem glucanase foi maior do que em galinhas alimentadas com dietas sem glucanase.

[00334] A Figura 28 ilustra o consumo de ração durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias usando duas dietas diferentes (à base de milho/cevada e à base de milho/LF-DDGS) com (+) ou sem (-) uma glucanase. Em relação à Figura 28, foi constatado que o consumo de ração foi maior para as dietas que incluíam uma glucanase.

[00335] A Figura 29 ilustra a taxa de conversão alimentar (FCR) durante o experimento de alimentação de aves domésticas de 28 dias com duas dietas diferentes (dietas à base de milho/cevada e à base de milho/LF-DDGS) com (+) ou sem (-) uma glucanase. A taxa de conversão alimentar se refere ao consumo de ração necessário para adquirir o peso corporal para um animal testado. A FCR é calculada por divisão do valor de consumo de ração pelo valor de ganho de peso corporal. Em relação à Figura 29, foi observado que a FCR foi menor para as dietas que incluíam uma glucanase. Esses dados indicam que as dietas que incluíam uma glucanase facilitavam a digestão e o consumo de ração nos animais testados.

Exemplo 16. O uso de enzimas glucanase para o desempenho vivo de frangos

[00336] Para demonstrar o efeito de enzimas glucanase na produção de frangos, 936 frangos-machos foram alimentados com ração com concentrações variadas de glucanase no experimento em baterias de 17 dias. Os pássaros foram pesados no dia 17. A composição da ração inclui milho, farelo de soja e gordura (óleo de soja). A Tabela 8 descreve detalhes experimentais do experimento em baterias de 17 dias.Tabela 8. Tratamentos experimentais: (as dietas foram fornecidas até o dia 17)- total de 9 TRTs. * Enzima-padrão da indústria_1 se refere a ENSPIRA™ (JBS United) **Enzima-padrão da indústria_2 se refere a HOSTAZYM X® (Huvepharma)

[00337] Em relação à Figura 30, a inclusão de beta- glucanase nos tratamentos 7 (Tratamento 7) e 8 (Tratamento 8) aumentou significativamente (valor-p <0,05) o ganho de peso corporal, comparado com o controle positivo (PC), controle negativo (NC) e com os tratamentos 3 (Tratamento 3) e 4 (Tratamento 4), que continham a inclusão de uma NSPase comercial. A inclusão de glucanase nos tratamentos 5 (Tratamento 5), 6 (Tratamento 6) e 9 (Tratamento 9) produziu resultados intermediários.

REFERÊNCIAS

[00338] Leeson, S. e L. Caston.2000. “Commercial Enzyme and Their Influence on Broilers Fed Wheat or Barley”. J. Appl. Poult. Res., 9: 242-251.

[00339] Yu, B. e T.K. Chung. 2004. “Effects of MultipleEnzyme Mixtures on Growth Performance of Broilers Fed Corn-Soybean Meal Diets”. J. Appl. Poult. Res., 13: 178-182.

[00340] As referências citadas ao longo desse pedido são incorporadas para todas as finalidades evidentes nesse relatório descritivo, e nas próprias referências, como se cada referência fosse totalmente descrita. Para fins de apresentação, aquelas específicas dessas referências são citadas em localizações particulares nesse relatório descritivo. Uma citação de uma referência em uma localização particular indica uma forma (ou formas) na qual os ensinamentos da referência são incorporados. No entanto, uma citação de uma referência em uma localização particular não limita a forma na qual todos os ensinamentos da referência citadas são incorporados para todas as finalidades.

[00341] Subentende-se, portanto, que essa invenção não se limita às modalidades particulares reveladas, mas visa englobar todas as modificações que estejam dentro do espírito e escopo da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo; pela descrição acima; e/ou mostrada nos desenhos anexados.

Claims (1)

1. Método de identificação do evento de milho 4588.259 em uma amostra, caracterizado por compreender: colocar em contato uma amostra com um primeiro iniciador e um segundo iniciador, em que o primeiro iniciador compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 38, o segundo iniciador compreende um ácido nucleico da SEQ ID NO: 39; amplificar um ácido nucléico na amostra para obter um produto amplificado compreendendo um ácido nucleico da SEQ ID NO: 51 específico para a sequência alvo do evento 4588.259 (FG259); e detectar o produto amplificado específico para uma sequência-alvo no evento de milho 4588.259 (FG259), em que o evento de milho 4588.259 (FG259) é uma planta de milho transgênica ou parte dela compreendendo mais ácidos nucleicos sintéticos que codificam uma glucanase capaz de degradar um ou mais polissacarídeos, e em que o evento de milho 4588.259 (FG259) inclui uma sequência alvo compreendendo pelo menos um polinucleotídeo da SEQ ID NOS: 22 - 26; e a amostra compreende planta matéria derivada da planta de milho transgênica ou parte dela.