BR112017016880B1 - Métodos para determinar um valor genético genômico estimado (gebv) ou uma capacidade transmissora genômica predita (gpta) de um feto de mamífero não humano, para aumentar o progresso genético em uma população de mamíferos não humanos, e para disseminação genética - Google Patents
Métodos para determinar um valor genético genômico estimado (gebv) ou uma capacidade transmissora genômica predita (gpta) de um feto de mamífero não humano, para aumentar o progresso genético em uma população de mamíferos não humanos, e para disseminação genética Download PDFInfo
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Abstract
métodos de avaliação genômica em gado. a presente invenção refere-se a métodos para aumentar o progresso genético no gado, e para a disseminação genética, incluindo o uso de amniocentese para obter amniócitos fetais para utilização na avaliação genômica e clonagem.
Description
[001] Este pedido reivindica a prioridade a partir do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 62/242.828 depositado em 16 de Outubro de 2015 e do Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 62/249.018 depositado em 30 de Outubro de 2015.
[002] Quando se produzem futuras gerações de animais de maior mérito genético ou valor genético de elite, uma seleção crítica de potenciais animais reprodutores deve ser feita. Somente o germoplasma dos animais mais elite pode ser colhido e usado no nível do núcleo genético. O germoplasma pode incluir, mas não é exclusivo, gametas tais como esperma e oócitos, mas também embriões, fetos, recém- nascidos e células ou tecidos somáticos de animais vivos.
[003] Para este fim, os testes genômicos na indústria de pecuária tornaram-se uma ferramenta valiosa na avaliação de animais jovens e no aumento do progresso genético aumentando a precisão da seleção e diminuindo o intervalo de geração. Tipicamente, os animais jovens são testados genomicamente logo após o nascimento ou como adultos jovens, portanto, exigindo que recursos significativos sejam dedicados a apoiar a mãe durante a gestação fetal, mesmo que o mérito genético da prole seja desconhecido.
[004] A transferência de embriões é um procedimento que segue a fertilização (in vitro ou in vivo) e envolve a transferência de um ou mais embriões, de um tubo de ensaio ou da mãe biológica, para um animal receptor para gestação e nascimento. A transferência de embriões é outra ferramenta para aumentar o progresso genético, uma vez que aumenta a intensidade de seleção, permitindo o uso de um número menor de fêmeas de elite como mães de muitos descendentes e também pode diminuir o intervalo de geração no caso em que os do-adores de ovos femininos são feitos para ovularem mais cedo do que normalmente seriam capazes de dar à luz. Na indústria pecuária, a parte de maior despesa de qualquer programa de transferência de embriões é o custo e a manutenção dos animais receptores nos quais os embriões são colocados para a gestação, o que pode limitar a sua aplicação.
[005] A clonagem é mais uma ferramenta que pode ser usada para aumentar o progresso genético aumentando a precisão da seleção. Ver Bousquet e Blondin, "Potenciais Usos de Clonagem em Esquemas de Reprodução: Gado de Laticínios", Cloning and Stem Cells, vol. 6, no. 2, resumo (2004). A clonagem também pode ser usada para acelerar a disseminação genética de genes de animais de mérito genético excepcionalmente alto para a população comercial. Id. A aplicabilidade da clonagem até agora tem sido limitada, no entanto, devido ao tempo de atraso antes de um animal clonado poder participar em um programa de reprodução. Id. em 193.
[006] Consequentemente, é necessário aumentar o progresso genético e/ou a disseminação genética aumentando e melhorando a utilização de testes genômicos, transferência de embriões e clonagem na indústria pecuária, bem como para reduzir os custos e a manutenção associados à manutenção de animais receptores usados na transferência de embriões.
[007] Certas modalidades da invenção abrangem um método de determinar um valor genético genômico estimado (GEBV) de um feto de mamífero não humano compreendendo remover líquido amniótico de um saco amniótico contendo um feto de mamífero viável e não humano; isolar um ou mais amniócitos do líquido amniótico; extrair o DNA de um ou mais amniócitos; genotipar o DNA para obter um genó- tipo para o feto; e determinar um GEBV do feto com base no genótipo. Em certas modalidades, a invenção compreende ainda uma ou mais das seguintes etapas: dar à luz o feto de mamífero viável não humano; amplificar o DNA; cultivar um ou mais amniócitos; e criar um clone a partir de um ou mais amniócitos utilizando transferência nuclear. Em algumas modalidades da invenção, o líquido amniótico é removido ou extraído entre o dia 30 e o dia 90 da gestação do feto.
[008] Em certas modalidades, os amniócitos para utilização na invenção são células-tronco mesenquimais derivadas de líquido am- niótico. Em uma modalidade específica, o DNA é extraído de dez ou menos dessas células. Um certo aspecto da invenção considera que o DNA é genotipado utilizando um SNP50 v1 BeadChip de Bovino, SNP v2 BeadChip de Bovino, 3K BeadChip de Bovino, LD BeadChip de Bo- vídeo, HD BeadChip de Bovino, Geneseek® Genomic Profiler™ LD BeadChip ou Geneseek® Genomic Profiler™ HD BeadChip. Uma modalidade adicional da invenção compreende ainda verificar a progenitura do feto com base no genótipo.
[009] Em outras modalidades da invenção, o GEBV é utilizado para determinar a Capacidade de Transmissão Predita Genômica (GPTA). Em uma outra modalidade, os GEBVs são utilizados no cálculo do Índice de Desempenho Total Genômico (GTPI®), que é um índice de seleção genômica utilizado em animais leiteiros. Ainda em uma outra modalidade da invenção, é considerado que os GEBVs e/ou as GPTAs são estimadas ou determinadas para uma ou mais características, incluindo mas não limitadas às seguintes: proteína; eficiência alimentar; forma láctea; composto de pés e pernas; escore de células somáticas; facilidade de parto de filha; gordura; composto de úbere; vida produtiva; índice de fertilidade; e filha natimorta. Em certas modalidades da invenção, a eficiência da alimentação é igual ao valor em dólar do leite produzido menos custos de alimentação para leite extra e menos custos de manutenção extra. Em outras modalidades, o índice de fertilidade é uma função da taxa de concepção de novilhas, taxa de concepção de vaca e taxa de gravidez de filha.
[0010] Outras modalidades da invenção abrangem um método pa ra determinar um GEBV ou uma GPTA de um feto de mamífero não humano compreendendo extrair o DNA de um primeiro amniócito fetal; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; e determinar um GEBV do feto com base no genótipo. Em outra modalidade, o método compreende ainda a etapa de isolar o primeiro amniócito fetal a partir de líquido amniótico, ou a etapa de clonar o feto utilizando um segundo amniócito fetal. Em algumas modalidades da invenção, o primeiro amniócito ou o segundo amniócito compreende uma célula-tronco me- senquimal derivada de líquido amniótico.
[0011] Em certas modalidades, a invenção também engloba um método para aumentar o progresso genético em uma linhagem, rebanho ou núcleo genético de mamífero não humano, compreendendo extrair o DNA de um primeiro amniócito derivado de um feto da linhagem, rebanho ou núcleo genético; genotipar o DNA para obter um ge- nótipo para o feto; determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no genótipo; selecionar o feto como um progenitor para a linhagem ou rebanho com base no GEBV ou na GPTA; e clonar o feto para produzir um clone. Em uma outra modalidade, a etapa de clonagem do feto compreende a utilização de um segundo amniócito derivado do feto. Ainda em outra modalidade, o primeiro amniócito ou o segundo amniócito compreende uma célula-tronco mesenquimal derivada de líquido amniótico. Ainda em outra modalidade, o método compreende ainda as etapas de fertilizar um ovo do clone com esperma de um macho na linhagem ou rebanho para produzir um embrião; e transferir o embrião para um receptor fêmea para a gestação. Em certas modalidades, o esperma é esperma classificado por sexo do qual ao menos 60% têm um cromossomo X.
[0012] Outra modalidade da invenção abrange um método para aumentar o progresso genético em uma população de mamíferos não humanos compreendendo extrair o DNA de um ou mais amniócitos derivados de um feto da população; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; selecionar o feto como um progenitor para a população com base no genótipo; e clonar o feto para produzir um clone. Em uma outra modalidade, a etapa de clonagem do feto compreende a utilização de um amniócito derivado do feto. Em outra modalidade, os um ou mais amniócitos compreendem células-tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico. Ainda em outra modalidade, o método mencionado acima compreende ainda a etapa de determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no genótipo. Em uma modalidade específica deste método, o genótipo é um genótipo de SNP. O método mencionado acima também pode compreender as etapas adicionais de fertilizar um oócito do clone com esperma de um macho na população para produzir um embrião; e transferir o embrião para um receptor fêmea para a gestação. Finalmente, em uma modalidade adicional, o esperma é esperma classificado por sexo do qual ao menos 60% têm um cromossomo X.
[0013] A invenção também abrange um método de disseminação genética compreendendo extrair o DNA de um ou mais amniócitos derivados de um feto; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; e selecionar o feto como doador de oócitos para utilização em FIV com base no genótipo. Este método pode ainda compreender as eta pas de coletar um ou mais oócitos a partir do doador; e fertilizar um ou mais oócitos com esperma classificado por sexo para produzir um ou mais embriões fêmeas. Ainda em outra modalidade, o método também pode compreender a etapa de transferir um ou mais embriões femininos para uma ou mais fêmeas receptoras. Em certas modalidades, as uma ou mais fêmeas receptoras compreendem animais de produção. Este método também pode compreender as etapas de produzir uma ou mais novilhas ou vacas a partir de um ou mais embriões femininos; e produzindo leite a partir de uma ou mais novilhas ou vacas. Finalmente, em outra modalidade, este método pode compreender ainda a etapa de determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no ge- nótipo, e em uma modalidade ainda mais específica, o genótipo é um genótipo de SNP.
[0014] As modalidades da invenção abrangem numerosas espé cies de mamíferos não humanos, e a invenção deveria ser entendida, mas não ser limitada às espécies de mamíferos não humanos descritas pelos exemplos específicos dentro deste pedido. De preferência, os exemplos específicos neste pedido destinam-se a ser ilustrativos das variadas e numerosas espécies de mamíferos não humanos aos quais os métodos da invenção podem ser aplicados. As modalidades da invenção, por exemplo, englobam animais com valor comercial para a produção de carne ou leite, tais como suínos, ovinos, bovinos, equinos, cervídeos, alces, búfalos ou similares (naturalmente os mamíferos utilizados para a produção de carne ou leite podem variar de cultura para cultura). Eles também abrangem várias espécies de mamíferos não humanos domesticados tais como caninos e felinos, bem como primatas, incluindo, mas não limitados a chimpanzés e gorilas, bem como baleias, golfinhos e outros mamíferos marinhos.
[0015] A Figura 1 mostra uma distribuição de EBVs para uma po- pulação de candidatos à seleção, incluindo EBVs para animais selecionados para um programa de criação para produzir touros e EBVs para animais selecionados para um programa de produção de embriões.
[0016] A presente invenção é um novo método que inclui a transfe rência de embriões, a obtenção de uma amostra de células embrionárias e/ou fetais a partir de líquido amniótico durante a gestação, a extração de DNA da amostra de células, a execução de uma análise ge- nômica do DNA extraído e a clonagem do embrião/feto. Em certas modalidades da invenção, a decisão de clonar um embrião ou feto baseia-se na sua análise genômica, incluindo, mas não limitado a, o seu valor genético genômico estimado em relação a uma ou mais características.
[0017] Certas modalidades da invenção podem ser utilizadas para selecionar contra a produção de animais de valor genético e/ou genô- mico inferior ou prejudicial, enquanto selecionando para a produção dos genótipos de elite mais produtivos, com as taxas de chamada mais altas, disponíveis em um sistema de núcleo genético. Consequentemente, certas modalidades da invenção utilizam ferramentas genômicas, avaliação genética e genômica extensiva para produção, saúde, fertilidade e outros traços fisiológicos com base na análise de dados de dados de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) a partir de informação de referência de histórico, então combinação de genóti- pos de reprodução em um programa de reprodução baseado em bio-tecnologia e molecular para maximizar o progresso genético em uma linhagem, rebanho ou núcleo genético. Os embriões são criados in vivo e in vitro a partir de fêmeas e touros de elite para produzir descendentes com o potencial para o maior mérito genético. Estes embriões são transferidos para um grupo altamente classificado e selecionado de receptores mantidos em fazendas de receptores. As fêmeas substi- tutas com gravidez de alto valor genético e/ou genômico são monitoradas durante a gravidez, verificadas quanto ao sexo fetal e depois colocadas em rotação para o diagnóstico genético baseado em amnio- centese. Depois que a organogênese está completa e o crescimento fetal está em andamento, a aspiração de fluido e células do âmnio fetal é realizada. Estes fluidos são coletados em um novo sistema de coleta de aspirado e introduzidos no laboratório para serem colocados em cultura celular. Os aspirados e as células são analisados por ensaios celulares e/ou por abordagens genômicas, as células são continuadas em cultura até a confluência, passagem, criopreservação ou uso produtivo. Após avaliações genéticas e genômicas, a informação genética pode ser usada para determinar o destino do desenvolvimento e a direção de produção de qualquer gravidez de desenvolvimento competente. Em certas modalidades, genótipos genéticos e genômicos selecionados são colocados em um sistema de clonagem somática de componente para propagar as linhagens mais elitistas de genótipos. Os criadores de espécies de mamíferos não humanos estão focados em aumentar a taxa de progresso genético em uma linhagem, rebanho ou núcleo genético, bem como em aumentar a taxa de disseminação genética de genótipos superiores. Para promover esses objetivos, ferramentas como testes genômicos, transferência de embriões e clonagem estão sendo desenvolvidas e utilizadas por criadores em vários estágios da produção animal.
[0018] A transferência de embriões é amplamente utilizada na mo derna indústria pecuária. Como notado acima, a maior parte de despesa de qualquer programa de transferência de embriões é o custo e a manutenção dos animais receptores. Tipicamente, no entanto, estes custos são compensados pelo valor do animal resultante e, geralmente, quanto maior o mérito genético do animal resultante, maior o seu valor comercial. Consequentemente, os programas de transferência de embriões colocam ênfase na produção de animais de alto mérito genético.
[0019] Um aspecto da presente invenção permite a um criador avaliar o mérito genético de um feto no início da gestação. Terminar as gestações de fetos de baixo mérito genético permite então que um reprodutor reduza o número de animais receptores necessários no seu programa de transferência de embriões ou, alternativamente, aumentar o número de fetos de alto mérito genético que podem ser produzidos usando um dado número de receptores ao longo de um determinado período de tempo. Em outra modalidade, depois de se determinar o mérito genético de um feto, um criador pode decidir manter a gravidez, mas substituir o receptor que transporta o feto por um novo receptor; e ainda em uma outra modalidade, o novo receptor está carregando um feto.
[0020] Outro aspecto da presente invenção permite a um criador clonar fetos com alto mérito genético no início da gestação e sem prejudicar o feto. Especificamente, as células ou tecidos fetais obtidos para determinar o mérito genético (via amniocentese, por exemplo) são utilizados para produzir clones através da transferência nuclear de células somáticas. Em contraste com a invenção, os clones na indústria pecuária são tipicamente criados a partir de células somáticas obtidas a partir de animais adultos jovens e, se derivado de um embrião ou feto in vitro, o embrião ou feto é geralmente descartado ou seriamente comprometido após tal procedimento. Além disso, mesmo sem serem submetidos a procedimentos de biópsia, os embriões criados por fertilização in vitro (FIV) têm uma taxa de sobrevivência significativamente inferior à dos seus congêneres in vivo convencionais. Consequentemente, a utilização da presente invenção aumenta a probabilidade de que os custos associados ao teste genômico sejam recuperados uma vez que o teste genômico é realizado após o embrião ter estabelecido uma gestação bem-sucedida no receptor.
[0021] Em certas modalidades da invenção, os embriões podem ser produzidos in vivo por métodos tradicionais para a produção sincronizada de folículos supernumerários, inseminação artificial (IA) e recuperação de embriões intrauterinos cateterizados transvaginal não cirúrgica programada. Em outros aspectos da invenção, os embriões produzidos in vitro podem ser produzidos no laboratório por colheita não típica de oócitos, FIV e metodologias de cultura de embriões. Em novilhas peripubertais, os complexos cumulus-oócitos imaturos da pró- fase I (COCs) são recuperados a partir de fêmeas em pé vivas usando o sistema de recuperação de oócito transvaginal guiado por ultrassom (TVOR), também conhecido como captação de óvulos (OPU). Em novilhas pré-púberes, OPU laparoscópica guiada por ultrassom é empregada para a recuperação do COC. Quando os COCs imaturos são trazidos para o laboratório, são colocados em um sistema de cultura de maturação in vitro típica (IVM) onde os oócitos mais capazes de desenvolvimento sofrem meiose espontânea e programada. Após um período de cultura durante a noite, esses oócitos que progridem através da meiose I (e, consequentemente, derramam seu segundo corpo polar progredindo para metáfase da segunda divisão meiótica) e são morfologicamente normais (incluindo uma membrana plasmática intacta) são usados na FIV. Os oócitos maduros de fêmeas individuais são colocados em gotas tradicionais de FIV e acoplados a touros específicos, usando tratamentos de capacitação de esperma altamente capacitados e precisos e concentração de esperma por oócito fertilizado. Os zigotos (dia 1) são colocados no sistema de cocultura tradicional e cultivados para os estágios uterinos de desenvolvimento, durante o dia 7-8 da cultura. Os embriões são tipicamente transportados para uma fazenda de novilhas receptoras onde são transferidos não cirurgica- mente. Antes da transferência, os embriões podem ser biopsiados ou amostrados para triagem genética e/ou avaliação genômica. Em certos estágios específicos de desenvolvimento embrionário, os embriões podem ser desmantelados e utilizados em procedimentos de multiplicação de embriões e/ou criopreservados para uso posterior. Os embriões destinados a serem transferidos para fêmeas substitutas sincronizadas são transportados para a fazenda em cultura e não cirurgicamente transferidos por métodos tradicionais. Em certas modalidades, a invenção considera que as fêmeas receptoras são regularmente verificadas por veterinários e as gravidezes em andamento são monitoradas em uma base regular e programada através de ultrassonografia transretal em tempo real.
[0022] Embora não necessariamente exigidas, certas modalidades da invenção abrangem a transferência de embriões. Especificamente, em algumas modalidades, as amostras de células fetais são obtidas a partir de líquido amniótico de um animal receptor no qual um embrião foi colocado através de transferência de embriões. Em outras modalidades da invenção, a transferência de embriões é utilizada para transferir um embrião clonado para um receptor. Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para transferir um embrião para um receptor, incluindo qualquer método cirúrgico ou não cirúrgico conhecido. Em modalidades alternativas, as amostras de células fetais são obtidas a partir de fetos que são concebidos e que gestacionam totalmente in vivo.
[0023] Os seguintes métodos cirúrgicos e não cirúrgicos de trans ferência de embriões são fornecidos apenas a título de exemplo não limitante.
[0024] No gado, um embrião pode ser transferido através de uma incisão abdominal em linha média, ou uma incisão no flanco, para um receptor sob anestesia geral. Os receptores são colocados em calhas de aperto que dão acesso a qualquer flanco. O corpo lúteo é localizado por palpação retal e o flanco ipsilateral ao corpo lúteo é cortado, lavado com água e sabão e esterilizado com iodo e álcool. Aproximadamente 60 ml de 2% de procaína são administrados ao longo da linha da incisão planejada. A incisão da pele é feita aproximadamente 15 cm de comprimento, alta no flanco, logo antes do quadril. As camadas musculares são separadas e o peritônio é cortado. O cirurgião introduz uma mão e um antebraço na incisão, localiza o ovário, geralmente aproximadamente 25 cm posterior à incisão, e visualiza ou palpa o corpo lúteo. O corno uterino é exteriorizado agarrando e esticando com o polegar e o indicador o ligamento largo do útero, que está localizado mediano ao corno uterino. Uma ferida de punção é feita com uma agulha rompida através da parede cranial um terço do corno uterino exposto. Utilizando aproximadamente 0,1 ml de meio em uma pequena pipeta de vidro (< 1,5 mm de diâmetro externo), o embrião é retirado do receptor em armazenamento. A pipeta é então inserida no lúmen do útero, e o embrião é expelido. A incisão é então fechada, usando duas camadas de suturas.
[0025] Alternativamente, um método não cirúrgico pode ser utiliza do para transferir um embrião em gado. Em primeiro lugar, é necessário palpar os ovários para selecionar o lado da ovulação, uma vez que as taxas de gravidez são reduzidas se os embriões são transferidos para o corno uterino contralateral ao corpo lúteo. Os receptores deveriam ser rejeitados se nenhum corpo lúteo está presente ou patologia do trato reprodutivo é notado. A etapa seguinte é passar o dispositivo de transferência de embriões, por exemplo, uma pistola inseminadora de Cassou padrão, através do colo do útero. A terceira etapa de transferência não cirúrgica é inserir a ponta do instrumento no corno uterino desejado ipsilateral ao corpo lúteo. A etapa final do procedimento é transferir o embrião de um receptor, tal como uma palheta, para o corno uterino desejado utilizando o dispositivo de transferência.
[0026] Certas modalidades da invenção abrangem métodos de coletar líquido amniótico. Uma vez que o líquido amniótico é coletado, um outro aspecto inclui isolar células fetais a partir do líquido amniótico e executar a análise genômica em DNA extraído de células fetais. Qualquer método conhecido na técnica para a coleta de líquido amnió- tico pode ser utilizado na invenção, incluindo mas não limitado à coleta transvaginal/transuterina usando técnicas de punção guiadas por ultrassom ou manuais. Além disso, o líquido amniótico pode ser coletado a qualquer momento durante a gestação em uma mãe ou receptor de transferência de embrião, incluindo do dia 45 até o parto, ou do dia 1 ao dia 10, do dia 20 ao dia 30, do dia 30 ao dia 280, do dia 40 ao dia 100, do dia 50 ao dia 80, do dia 60 ao dia 70, do dia 70 ao dia 80, do dia 80 ao dia 90, do dia 90 ao dia 100, do dia 100 ao dia 120, do dia 70 ao dia 90, do dia 75 ao dia 80, do dia 75 ao dia 90, do dia 70 ao dia 85, ou do dia 120 ao dia 280, de gestação.
[0027] A título de exemplo, o seguinte processo de coleta pode ser utilizado na invenção. Um versado na técnica saberá que existem variações neste método e que este método não deveria ser interpretado para limitar a funcionalidade ou o escopo da presente invenção. Este método é apenas ilustrativo.
[0028] Obter uma mãe bovina, ou receptor, com um feto no dia 65 ao dia 250 da gestação. Administrar anestesia epidural caudal padrão com lidocaína a 2%. Levantar os animais aproximadamente 40 cm na frente usando uma plataforma, a fim de colocar o trato reprodutor de volta para a pelve. Limpar e desinfetar a região da vulva e dentro das abóbadas vaginais várias vezes com iodo. Retrair transretal o útero com a mão oposta e justapor o corno grávido contra a parede vaginal. Inserir um transdutor de ultrassom coberto com uma manga estéril na abóbada vaginal com o auxílio de lubrificação leve aproximadamente ao nível do colo do útero. Aspirar o líquido fetal por colocação intrava- ginal de uma agulha (0 = 1,3 mm, 68 cm de comprimento) instalada dentro do corpo do transdutor de ultrassom e conectada a um conjunto de coleta de sangue do tubo a vácuo. O digitalizador de ultrassom pode ser equipado com um transdutor do tipo convexo de 5,0 MHz de aproximadamente 1,6 cm de largura e 58 cm de comprimento. Avançar a agulha através das paredes vaginal e uterina, movendo bruscamente o tubo a vácuo ao longo de uma distância de aproximadamente 3 a 4 cm. Se o êmbolo da seringa encontra resistência, reposicionar a agulha e obter outro aspirado. Transferir o aspirado para um tubo de teste estéril de 10 ml, colocar em gelo e enviar para análise de DNA. Confirmar a colocação bem-sucedida da agulha por observação direta de ultrassonografia e fluido fetal rodando dentro do tubo a vácuo. A viabilidade fetal pode ser avaliada entre 7 a 10 dias após o procedimento de aspiração. A imagiologia de qualquer movimento fetal independente ou batimento cardíaco pode ser tomada como prova de viabilidade.
[0029] Outro método de coleta em gado grávido engloba o uso de equipamento de recuperação de ovócitos transvaginal guiada por ultrassom (TVOR), tubulação de recuperação de fluido especializada, e sistema de coleta de filtro adaptado. Neste exemplo, em todo o gado destinado à amniocentese, a gestação é confirmada e o sexo fetal determinado por ultrassonografia transretal em períodos específicos após a transferência do embrião, a implantação e a conclusão da organogê- nese. Nos dias 45-100, ou mais especificamente nos dias 75-80, do primeiro trimestre de gestação, o equipamento de recuperação de ovócitos transvaginal guiado por ultrassom é adaptado e utilizado para visualizar todo o feto e vesícula amniótica em um corno uterino durante a aspiração. Antes da coleta, as novilhas são retidas em estoques e sedadas antes de realizar a amniocentese. A equipe de veterinários que executa a amniocentese utiliza procedimentos estéreis completos, incluindo mãos em luvas de nitrilo sem pó e esterilização em etanol do equipamento. Para assegurar que a área está livre de contaminação antes da inserção do transdutor, o reto é esvaziado de fezes e, sob anestesia epidural, a vulva e a área retal da vaca são cuidadosamente limpas e esfregadas. A etapa de desinfecção é completada por enxágue da vulva e da área retal com solução de Betadina e o enxágue e a pulverização da área limpa com etanol a 70%. O equipamento TVOR é limpo e esterilizado com etanol imediatamente antes da sua introdução na vagina e está equipado com um guia de uma agulha de aço inoxidável estéril. O equipamento TVOR é avançado para a vagina, posicionado à esquerda ou à direita do osso cervical e por meio de manipulação por reto, o corno uterino grávido é posicionado contra a sonda, evitando a interposição de outro tecido no trajeto de agulha proposto. A localização exata do saco amniótico é determinada pelo reconhecimento de partes do corpo fetal, das membranas alantoam- nióticas e alantocoriônicas e da parede uterina. Quando uma área não ecogênica que representa o líquido amniótico é vista na tela do monitor, uma agulha estéril com um cateter é inserida dentro do guia da agulha e avançado penetrando através da parede vaginal, útero e membranas fetais subsequentes. Assim que a ponta da agulha é vista como tendo entrado no compartimento de fluido fetal, o cateter é reti-rado da agulha e a agulha é colocada dentro do âmnio do feto. Um volume inicial de 5 a 10 ml de fluido fetal é aspirado para dentro da tubulação e esvaziado para fora do sistema de tubagem para reduzir ou eliminar a contaminação materna. Um filtro de amniocentese é ligado à tubulação e um adicional de 30-40 ml de líquido amniótico é aspirado. Durante a coleta do líquido, o corno uterino grávido é mantido na mesma posição, e a localização exata da ponta da agulha é garantida por sua visualização na tela de ultrassom. Quando as amostras de mais de 1 novilha são coletadas no mesmo dia, o guia de agulha é substituído por um esterilizado e o transdutor é completamente limpo e desinfetado antes de ser usado no próximo animal. Após a coleta do líquido amniótico ser completada em um animal, o fluido coletado no sistema de filtragem é colocado sobre gelo e transportado de volta para o laboratório de cultura celular.
[0030] O termo "amniócitos", tal como aqui utilizado, refere-se a células obtidas a partir de líquido amniótico, bem como a células cultivadas a partir de células obtidas a partir de líquido amniótico. Os am- niócitos, incluindo os fibroblastos fetais e as células-tronco mesenqui- mais derivadas de líquido amniótico (AFMSCs), utilizados na presente invenção podem ser obtidos a partir, por exemplo, de líquido amniótico de amniocentese realizada para cariótipo fetal ou líquido amniótico obtido a termo. Para fins da invenção, os amniócitos podem ser isolados a partir do líquido amniótico por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por centrifugação seguida por remoção do sobrena- dante.
[0031] Um aspecto da invenção abrange a cultura de amniócitos isolados. Os amniócitos cultivados podem, por sua vez, ser utilizados em várias aplicações, incluindo a genotipagem e para a produção de clones. A título de exemplo, o seguinte procedimento de cultura pode ser utilizado em certas modalidades da invenção. Um versado na técnica saberá que existem variações neste método e que este método não deveria ser interpretado para limitar a funcionalidade ou o escopo da presente invenção. Este método é apenas ilustrativo.
[0032] Os amniócitos são centrifugados (200 g, 10 min) em tempe ratura ambiente e o pélete é suavemente ressuspenso em meio de Chang. As células são colocadas em placas de Petri gelatinizadas de 100 mm e deixadas sem perturbações. O meio é alterado a cada 3-4 dias. Após 2 semanas em cultura, elas são tripsinizadas para dispersar células e permitir o seu crescimento em uma monocamada. Os amnió- citos são cultivados a 37° C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2. As células são passadas em uma razão de 1: 4 a cada 5 dias até atingirem 80% de confluência. Para passagens subsequentes, o meio é aspirado, lavado com PBS, separado com tripsina a 0,05% durante 5 min a 37° C.
[0033] Em certas modalidades da invenção, um método de cultura em dois estágios pode ser usado para isolar, cultivar e enriquecer células-tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico (AFMSCs) a partir de líquido amniótico obtido por amniocentese. As células-tronco mesenquimais de mamíferos são células presumivelmente multipoten- tes que têm o potencial de se diferenciar em múltiplas linhagens incluindo osso, cartilagem, músculo, tendão, gordura de ligamento e uma variedade de outros tecidos conjuntivos. Morfologicamente, as células- tronco mesenquimais no seu estado indiferenciado são em forma de fuso e assemelham-se a fibroblastos. As células-tronco mesenquimais foram identificadas principalmente na medula óssea, mas também foram encontradas no sangue periférico adulto e fetal, no fígado fetal, no baço fetal, na placenta e no sangue do cordão umbilical a termo. Significativamente, as células-tronco mesenquimais podem ser encontradas no líquido amniótico de mamíferos. Sob condições de cultura específicas, as AFMSC de mamífero foram induzidas a diferenciarem-se em adipócitos, osteócitos e células neuronais.
[0034] O protocolo de cultura em dois estágios compreende um primeiro estágio de cultura de amniócitos e um segundo estágio de cultura de células-tronco mesenquimais. O método começa por estabelecer culturas primárias utilizando o protocolo de cultura de amnióci- tos em laboratório citogenético. Células de líquido amniótico não aderentes no meio sobrenadante são coletadas. Para a cultura de células- tronco mesenquimais, as células não aderentes são centrifugadas e depois colocadas em um frasco de cultura com um meio essencial mínimo alfa-modificado suplementado com soro bovino fetal. Para o crescimento de células-tronco mesenquimais, a cultura é incubada com CO2 umidificado.
[0035] A título de exemplo, o seguinte procedimento de cultura es pecífico pode ser utilizado em certas modalidades da invenção. Um versado na técnica saberá que existem variações neste método e que este método não deveria ser interpretado para limitar a funcionalidade ou o escopo da presente invenção. Este método é apenas ilustrativo.
[0036] Para cultivar amniócitos, estabelecer quatro culturas primá rias in situ em pratos de grau de cultura de tecido de 35 mm utilizando meio de Chang (Irvine Scientific, Santa Ana, Califórnia). Coletar as células de líquido amniótico não aderentes no meio sobrenadante no 5° dia após a cultura dos amniócitos primários e mantê-los até a conclusão da análise de cromossomo fetal.
[0037] Para a cultura de células-tronco mesenquimais, centrifugar o tubo contendo as células não aderentes, em seguida, colocá-las em placas em 5-15 ml de meio essencial mínimo alfa-modificado (α-MEM) suplementado com 10-20% de soro bovino fetal (FBS) e 1-20 ng/mL de b-FGF em um frasco de cultura de 25 cm2 e incubar a 37° C com 5% de CO2 umidificado para crescimento de células-tronco mesenqui- mais.
[0038] Citometria de fluxo, RT-PCR e imunocitoquímica podem ser utilizadas para analisar as características fenotípicas das células- tronco mesenquimais cultivadas. Colorações de Von Kossa, Oil Red O e TuJ-1 podem ser utilizadas para avaliar os potenciais de diferenciação das células-tronco mesenquimais.
[0039] O seguinte método de cultura adicional é apresentado ape nas a título de exemplo. A invenção considera a técnica estéril, incluindo colocar luva com luvas de nitrilo não em pó para processar o líquido amniótico. Em certas modalidades da invenção, todo o processo é realizado em um gabinete de biossegurança de fluxo laminar de cultura de células e apenas o etanol de grau alimentar é utilizado na lavagem de mãos enluvadas sempre que necessário ou possível.
[0040] Fluidos e amniócitos são aspirados por pipeta em tubos cô nicos de 15 ml. O filtro de coleta é enxaguado com meio de cultura para remover quaisquer células aderidas e repetido como necessário para remover uma quantidade máxima de amniócitos do filtro. Os tubos cônicos são centrifugados até se formar um pélete celular, o sobrena- dante é aspirado e as células são ressuspensas em meio de cultura celular. A suspensão de células é cuidadosamente misturada e pipeta- da para dentro de poços e/ou pratos de cultura. As culturas de células são colocadas em um incubador de cultura de células e cultivadas a 38,7° C em 5% de CO2/ar durante 5 dias sem serem perturbadas. No dia 5 da cultura, os pratos de cultura de células são removidos da cultura e do meio de cultura celular e quaisquer células flutuantes são aspiradas e colocadas em tubo de centrifugação de 15 ml. As células restantes colocadas nas placas de cultura de células originais, princi-palmente fibroblastos fetais e AFMSCs são alimentadas com meio de cultura fresco e colocadas de volta em incubadoras de cultura de células e cultivadas até que sejam 80-90% confluentes. Após atingir a confluência, as células são levantadas para passagem e/ou criopreserva- ção. Os amniócitos flutuantes aspirados podem ser iniciados em cultura de células específicas de amniócitos ou utilizados em testes de diagnóstico fetal e/ou testes genômicos e perfis. Tanto as culturas de fibroblastos fetais originalmente plaqueadas quanto as culturas de células de amniócitos flutuantes originais podem ser cultivadas para passagem indefinida e criopreservação. Os fibroblastos e/ou amniócitos fetais criopreservados podem ser aquecidos e passados ou utilizados em procedimentos de clonagem.
[0041] Outro aspecto da invenção engloba genotipagem de amniócitos. Especificamente, uma vez que os fibroblastos fetais ou células-tronco mesenquimais foram isolados do líquido amniótico, seu DNA pode ser extraído e usado para genotipagem. Em uma concretização específica, o DNA de fibroblastos fetais cultivados ou células-tronco mesenquimais pode ser usado para genotipagem. Fibroblasto fetal, ou células-tronco mesenquimais, o DNA pode primeiro ser extraído e, em seguida, amplificado (via PCR), de modo que haja uma quantidade suficiente de DNA para genotipagem. Alternativamente, em algumas formas de realização da invenção, o DNA pode ser extraído diretamente de amniócitos, incluindo fibroblastos e células-tronco mesenquimais, encontrados no líquido amniótico. A invenção abrange formas de realização em que a quantidade de DNA extraído é muito baixa, variando de 1ng / μl a 10 ng / μl (com base em ensaios de DNA de cadeia dupla). A visualização usando géis de agarose a 1% mostrou que o DNA extraído em alguns exemplos era grande, > 23000 MW com pouco DNA fragmentado.
[0042] Para a análise genómica, cerca de 1-200 ng de ADN de cadeia dupla devem ser extraídos por amostra de DNA a uma concentração por amostra de 1-50 ng / ul. Em certas formas de realização da invenção, apenas 1 ng / μl a 10 ng / μl de DNA são necessários para análise genômica. Em uma realização particular, é necessário menos de 15 ng de DNA total para a análise genômica. Em algumas formas de realização da invenção, o DNA é utilizado na genotipagem para verificação parental e avaliação genômica. A avaliação genômica para produção, saúde, fertilidade e outros traços fisiológicos utilizados em certas formas de realização da invenção baseia-se na análise de dados de SNP a partir de dados históricos de população de referência determinados por estudos de associação de genoma (GWAS). Esta avaliação das células do feto também permite modelagem de geração rápida, permitindo a pré-seleção do feto como progenitor para a próxima geração de acasalamentos. As células remanescentes em cultura permanecem na cultura celular para passagem e eventual colheita e criopreservação para posterior uso diagnóstico, citogenético e biológico, como a clonagem
[0043] A título de exemplo, o seguinte procedimento de extracção e amplificação de DNA pode ser utilizado em certas formas de realização da invenção. Um técnico no assunto saberá que há variações neste método e que este método não deve ser interpretado para limitar a funcionalidade ou o escopo da presente invenção. Este método é apenas ilustrativo.
[0044] O DNA de fibroblasto é extraído dos conteúdos de um frasco de cultura de 25-cm2 pelo procedimento de relargagem, com pequenas modificações (Miller et al., 1988; Biase et al., 2002). Cinquenta nanogramas de DNA genômico são utilizados em 25 μl, de mistura de PCR (1 U Taq polimerase, 100 μM de dNTP, 1 mM de MgCh, 5 pmol de cada iniciador) e amplificados 36 vezes usando as seguintes condições: 93° C durante 3 min, 93° C durante 40 s, 58° C durante 40 segundos, 72° C durante 40 segundos e 72° C durante 5 min. Os iniciadores são projetados para amplificar um fragmento de 410-pb do gene NeoR (sentido: 5'-GAG-GCT-ATT-CGG-CTA-TGA- CTG-3 'e anti-sentido: 5' -TCG-ACA-AGA -CCG-GCT-TCC-ATC-3 ') e um fragmento de 262-pb do I DNA de um satélite bovino (Gaillard et al., 1981) (sentido: 5'-AGG-TCG-CGA-GAT-TGG-TCG-CTA -GGT- CAT-GCA-3 'e anti-sentido: 5' -AAG-ACC-TCG-AGA-GAC-CCT-CTT- CAA-CAC-GT-3 ').
[0045] Em certas formas de realização da invenção, o DNA de amniócitos e células-tronco mesenquimais pode ser extraído utilizando o kit genômico Purelink Cat # Kl 820-00 (Invitrogen). Em outras formas de realização, uma vez que o DNA é extraído, ele pode ser colocado através de um protocolo completo de amplificação do genoma utilizando o kit de amplificação de DNA Illustra Genomiphi V2 (GE Lifesciences), que usa a DNA polimerase phi29 para amplificar o genoma.
[0046] Em outras formas de realização da invenção é empregado o seguinte procedimento de extração de DNA.
[0047] As células expostas ao meio de cultura geralmente contêm soro fetal de vitelo. Devido a níveis elevados de DNase comumente encontrados no soro fetal de vitela e à presença de cátions que poderiam catalisar a clivagem hidrolítica da ligação fosfodiéster no DNA, um volume igual de uma solução contendo Tris-EDTA é adicionado às células colhidas para cátions quelatos essenciais para Atividade DNase. Após a adição do Tris-EDTA, a suspensão celular é então armazenada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 4°C até ser necessário para extração de DNA.
[0048] Os tubos de 1,5 ml contendo a suspensão celular foram centrifugados a 10000 x g em uma microcentrífuga durante 45 segundos para sedimentar as células. A solução em suspensão foi pipetada cuidadosamente para não remover as células peletizadas. Aproximadamente 50 μl de solução em suspensão foram deixados em cada tubo. Os tubos foram então agitados em vórtex durante 10 segundos para ressuspender os péletes de células. 300 μl de Solução de Lise de Tecidos e Células (Epicenter, Madison Wisconsin, Catálogo # MTC096H) contendo 1 μl de Proteinase K (Epicenter, Madison Wis consin, a 50 μg/μl, Catálogo # MPRK092) foram então adicionados a cada tubo e misturados. Os tubos foram incubados a 65° C durante 30 minutos e agitados em vórtex a 15 minutos. As amostras foram resfriadas a 37° C. Em seguida, 1 μl de RNase a 5 mg/μl (Epicentre, Madison Wisconsin, a 5 mg/ml, número de catálogo MPRK092) foi adicionado a cada amostra e então misturado. As amostras foram então incubadas a 37° C durante 30 minutos. As amostras foram então colocadas em um resfriador a 4° C durante 5 minutos. Foram adicionados 175 μl de Reagente de Precipitação de Proteínas MPC (Epicentre, Madison Wisconsin, Catálogo # MMP095H) a cada amostra, e as amostras foram submetidas a agitação vigorosa durante 10-15 segundos. As amostras foram centrifugadas de modo a peletizar detritos durante 8 minutos a > 10000 x g. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga limpo. 600 μl de isopropanol frio (-20° C) fo ram adicionados ao sobrenadante. Cada tubo foi então invertido 30-40 vezes. O DNA foi peletizado por centrifugação durante 8 minutos em uma microcentrífuga a 10000 x g. O isopropanol foi vertido sem desalojar o pélete de DNA. O pélete foi enxaguado uma vez com etanol a 70% e depois o etanol foi cuidadosamente despejado de modo a não perturbar o pélete de DNA. O etanol residual foi removido com uma pipeta, e o pélete de DNA foi deixado secar ao ar no tubo de microcen- trífuga. Uma vez seco, o pélete de DNA foi ressuspenso em 20 μl de Tris-EDTA.
[0049] Em um aspecto da invenção, o DNA extraído e/ou amplifi cado de amniócitos e células-tronco mesenquimais pode ser genotipa- do utilizando matrizes ou chips de SNP, que estão prontamente disponíveis para várias espécies de animais a partir de empresas como Illumina e Affymetrix. Para os fins da invenção, o termo "genotipagem" inclui, mas não está limitado à obtenção de dados de SNP e/ou de variação de número de cópias (CNV) a partir de DNA. Para os fins da invenção, o termo "genótipo" inclui, mas não está limitado a SNP e/ou dados de variação de número de cópias (CNV) obtidos a partir de DNA. Os chips de baixa densidade e alta densidade são considerados para utilização com a invenção, incluindo conjuntos de SNP compreendendo entre 3.000 e 800.000 SNPs. A título de exemplo, um chip SNP "50K" mede aproximadamente 50.000 SNPs e é comumente utilizado na indústria pecuária para estabelecer o mérito genético ou valores genéticos genômicos estimados (GEBVs). Em certas modalidades da invenção, qualquer um dos seguintes chips de SNP pode ser utilizado: SNP50 v1 BeadChip de bovino (Illumina), SNP v2 BeadChip de bovino (Illumina), 3K BeadChip de bovino (Illumina), Bovide LD BeadChip (Illumina), HD BeadChip de bovino (Illumina), Geneseek® Genomic Profiler ™ LD BeadChip ou Geneseek® Genomic Profiler ™ HD BeadChip.
[0050] A base e o algoritmo para o uso de SNPs na determinação de GEBVs encontram-se em Meuwissen e outros, "Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps", Genetics 157, 1819 - 1829 (2001), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A implementação de dados genômicos em predições para traços desejáveis é encontrada em Van Raden, "Efficient Methods to Compute Genomic Predictions", Dairy Science 91, 4414 - 4423 (2008), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0051] O gado nos Estados Unidos é frequentemente classificado usando índices de seleção que incorporam dados relacionados a vários traços comercialmente importantes. Com o advento do teste ge- nômico, os dados genômicos são agora comumente usados para predizer esses traços. Para calcular um escore de um animal para um ín- dice de seleção genômica, primeiro é necessário calcular os GEBVs do animal para cada traço no índice, o que pode ser realizado utilizando os ensinamentos de Meuwissen e outros e VanRaden, acima. Em seguida, determina-se o peso econômico de cada traço no índice. Finalmente, para determinar o escore do animal para o índice de seleção, multiplicar o GEBV de cada traço por seu peso econômico e, em seguida, somar todos esses valores juntos.
[0052] Um índice genômico comumente usado nos Estados Uni dos para gado leiteiro é o Índice de Desempenho Total Genômico (GTPI®), que é composto pelos seguintes traços: proteína; eficiência alimentar; forma láctea; composto de pés e pernas; escore de células somáticas; facilidade de parto de filha; gordura; composto de úbere; vida produtiva; índice de fertilidade; e filha natimorta. Em certas modalidades, a eficiência da alimentação é igual ao valor em dólar do leite produzido menos os custos de alimentação para o leite extra e menos custos de manutenção extra, e o índice de fertilidade é uma função da taxa de concepção da novilha, taxa de concepção da vaca, e da taxa de gravidez da filha. Em outras modalidades da invenção, o GEBV é utilizado para determinar a Capacidade de Transmissão Genômica Predita (GPTA).
[0053] A título de exemplo, além de determinar um GEBV para um traço, a presença ou ausência de qualquer das seguintes doenças e/ou traços pode ser detectada utilizando dados de SNP ou dados ge- nômicos: síndrome de Demetz; doença de novilha branca; Síndrome de Weaver (haplótipo BHW); haplótipo HHD; haplótipo HH1; Síndrome de trissomia letal de braquignatia; haplótipo HH0; cardiomiopatia hereditária bovina; cardiomiopatia dilatada bovina; lipofuscinose neuronal ceroide; e nanismo condrodisplásico bovino; orelhas entalha- das/orelhas cortadas; epilepsia idiopática; estrabismo bilateral convergente com exoftalmos; haplótipo BHP; haplótipo HHP; haplótipo JHP; hidrocefalia neuropática/cabeça de água; hipotricose congênita e defeito de anodontia/displasia ectodérmica; ictiose fetal; traço letal A46/deficiência hereditária de zinco bovina; Síndrome de Marfan; musculação dupla; defeitos oculares múltiplos; carcinoma de células escamosas oculares bovinas; dente rosa; paralisia posterior/paralisia de membros posteriores; haplótipo BHM; encefalopatia espongiforme bovina/doença da vaca louca; doença do pé de mula (haplótipo HHM); deficiência de miofosforilase; hidropisia; cor de pelagem pre- ta/vermelha (haplótipo HBR, haplótipo HHR); deficiência de BAND3; ataxia de Charolês; dismielinização espinhal bovina (haplótipo BHD); cor da pelagem em gado Dexter; convulsões familiares bovinas e ataxia; bezerro buldogue; trombopatia hereditária simental; GHRD; displasia tubular renal (RTD)/nefrite intersticial crônica; rosto branco de Hereford; haplótipo HHC; duplicações de desenvolvimento; rim preto; cardiomiopatia/gado preto japonês; síndrome da cauda torta; pseudo- motonia congênita; artrogipose múltipla congênita hereditária bovina; Síndrome de Síndrome de hipoplasia capreoliforme generalizada (“d'Hypoplasie Généralisée Capréoliforme”); Síndrome do bezerro da jovem corça; pancitopenia bovina neonatal; síndrome da cauda de rato; cheilognatosquise; síndrome de Fleckvieh branca alemã; Haplótipo JH1; Síndrome da panturrilha; doença da bezerra de bolota/laxidade e nanismo congênitos da articulação; haplótipo HH2; haplótipo HH3; ha- plótipo HH4; nanismo de bulldog em Holstein; haplótipo AH1; haplótipo HH5; haplótipo JH2; e síndrome de artrogipose letal.
[0054] Um aspecto adicional da invenção abrange a clonagem de embriões e/ou fetos que foram avaliados genomicamente utilizando as técnicas aqui descritas. A clonagem é geralmente entendida como a criação de um animal/organismo vivo que é essencialmente geneticamente idêntico à unidade ou indivíduo a partir do qual foi produzido. Nas modalidades da invenção que englobam embriões e/ou fetos clo- nados, pode ser utilizado qualquer método pelo qual um animal possa ser clonado que seja conhecido na técnica. Assim, é considerado que embriões clonados e fetos clonados são produzidos por qualquer método convencional, incluindo, por exemplo, as técnicas de clonagem aqui descritas, bem como as descritas no pedido de patente internacional PCT/US01/41561. Em um aspecto da invenção, uma base para a clonagem de um embrião ou de um feto é o seu mérito genômico. Em um aspecto adicional, o mérito genético do feto ou do embrião é determinado por análise genômica como aqui descrito.
[0055] A clonagem de embriões por transferência nuclear foi de senvolvida em várias espécies. Esta técnica envolve geralmente a transferência de um núcleo de célula (obtido a partir de uma célula doadora) para uma célula enucleada, por exemplo, um oócito de metáfa- se II. Este oócito tem a capacidade de incorporar o núcleo transferido e suportar o desenvolvimento de um novo embrião (Prather e outros, Biol. Reprod 41: 414 a 418, 1989, Campbell e outros, Nature 380: 64 a 66, 1996, Wilmut e outros, Nature 385: 810 a 813, 1997). As indicações morfológicas desta reprogramação são a dispersão de nucléolos (Szollosi e outros, J. Cell Sci. 91: 603 a 613, 1988) e o inchaço do núcleo transferido (Czolowska e outros, 1984; Stice e Robl, Biol, Repro. 39: 657 a 664, 1988, Prather e outros, J. Exp. Zool. 225: 355 a 358, 1990. Collas e Robl. Biol. Reprod 45: 455 a 465, 1991). A evidência mais conclusiva de que o citoplasma do oócito tem a capacidade de reprogramar é o nascimento de descendentes de embriões de transplante nuclear em várias espécies, incluindo ovelhas (Smith e Wilmut, Biol. Reprod. 40: 1027 1035, 1989; Campbell e outros, Nature 380: 64 a 66, 1996, Wells e outros, Biol. Repro. 57: 385 a 393, 1997), bovinos (Wells e outros, Biol. Repro. 60: 996 a 1005, 1999; Kato e outros, Science 282: 2095 a 2098, 1998, Prather e outros, Biol. Reprod. 37: 859 a 866, 1987, Bondioli e outros, Theriogenology 33: 165 a 174, 1990), porcos (Prather e outros, Biol. Reprod. 41: 414 a 418, 1989) e coelhos (Stice e Robl, Biol. Repro. 39: 657 a 664, 1988).
[0056] A clonagem por transferência nuclear implica na remoção do núcleo do oócito do receptor e no isolamento de um núcleo de uma célula doadora. O núcleo do doador é então ligado ao oócito do receptor e a fusão celular induzida eletricamente é utilizada para introduzir os núcleos da célula embrionária do doador em uma célula receptora. Em certas modalidades, o processo de clonagem de embriões segue um procedimento básico de cinco etapas como se segue: (1) selecionar um embrião ou oócito de receptor apropriado para a transferência nuclear; (2) enuclear, isto é, remover o material nuclear do oócito de receptor; (3) introduzir o núcleo ligado à membrana da célula doadora no oócito de receptor enucleado; (4) orientar o núcleo doador ligado à membrana e o oócito receptor para a fusão celular; e (5) fusionar a membrana que envolve o núcleo do doador com a membrana do oóci- to de receptor e ativar o oócito de receptor por dieletroforese.
[0057] Em certas modalidades da invenção, o oócito utilizado co mo célula receptora é uma célula que se desenvolve a partir de um oogônio e, depois da meiose, torna-se um óvulo maduro. Em certas modalidades relacionadas com bovinos, os oócitos em estágio metáfa- se II, podem ser amadurecidos in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, os oócitos de metáfase II maduros podem ser coletados cirurgicamente a partir de vacas ou novilhas não superovuladas ou supero- vuladas 35 a 48 horas após o início do estro ou após uma injeção de gonadotropina coriônica humana (hCG) ou hormônio similar. Alternativamente, em outras modalidades, os oócitos não maduros podem ser recuperados por aspiração a partir de folículos ovarianos obtidos a partir de vacas ou novilhas abatidas e depois podem ser amadurecidos in vitro por tratamento hormonal e cultura apropriados.
[0058] Em certas modalidades da invenção, a micromanipulação de células pode ser realizada utilizando uma pipeta de retenção de células, tendo um diâmetro externo de aproximadamente 120 micrometros e um diâmetro interno de aproximadamente 25 a 35 micrometros e uma pipeta de enucleação e transferência chanfrada afiada com um diâmetro externo de aproximadamente 25 a 35 micrometros. Os oóci- tos maduros podem ser primeiro tratados com citocalasina B a aproximadamente 7,5 microgramas por mililitro, ou um inibidor de microtubo eficazmente similar a uma concentração suficiente para permitir que a pipeta de enucleação e transferência seja inserida através da zona pe- lúcida para permitir a remoção de uma porção do citoplasma sem, em qualquer momento, realmente romper a membrana plasmática. O oóci- to maduro pode ser mantido no lugar por sucção suave pela pipeta de retenção de células. A pipeta de enucleação e transferência pode então ser inserida através da zona pelúcida do oócito no ponto da protu-berância da metáfase II ou adjacente ao primeiro corpo polar, isto é, em uma localização destinada a ser adjacente aos cromossomos da metáfase. A pipeta não penetra na membrana plasmática. A aspiração aplicada através da pipeta extrai uma protuberância celular na pipeta que inclui, no caso da protuberância da metáfase II, toda a protuberância e o citoplasma circundante ou, no caso do primeiro corpo polar, o corpo polar mais o citoplasma circundante. Este processo destina-se a extrair todos os cromossomos da metáfase para a pipeta. À medida que a pipeta é retirada, com a sucção mantida, a membrana plasmáti- ca é esticada e, em seguida, selada deixando uma membrana plasmá- tica competente no oócito enucleado.
[0059] Em algumas modalidades da invenção, as células doadoras podem ser tratadas com citocalasina B, ou podem não ser, dependendo do tamanho da pipeta de transferência. A pipeta de transferência que transporta o núcleo ligado à membrana aspirado pode ser inserida através da zona pelúcida do oócito enucleado receptor, e o núcleo ligado à membrana pode então ser depositado sob a zona pelúcida com a sua membrana adjacente à membrana plasmática do oócito receptor.
[0060] Em algumas modalidades da invenção, a fusão do núcleo ligado à membrana com o oócito receptor enucleado e a ativação simultânea do oócito de receptor podem ser realizadas por um única etapa de dieletroforese utilizando equipamento de eletrofusão disponível comercialmente. Antes da eletrofusão do núcleo do embrião do doador e do oócito do receptor enucleado em conjunto, é necessário orientar as membranas celulares no campo elétrico. O termo "orientação", tal como aqui utilizado, é definido como a colocação das duas células de tal modo que o plano de contato das duas membranas, isto é, a membrana plasmática do corpo que transporta o núcleo doador e a membrana plasmática do oócito de receptor, será fusionado em conjunto, é perpendicular ao campo elétrico. Verificou-se que a orientação aleatória resulta em uma redução acentuada na taxa de fusão bem- sucedida. Se as células forem orientadas de tal modo que as membranas de fusão sejam paralelas, ou aproximadamente a um ângulo de 45°, para o campo elétrico, a taxa de fusão bem-sucedida diminuirá. O alinhamento pode ser feito elétrica ou mecanicamente. Se o tamanho das duas células não for muito desproporcionado, uma tensão de corrente alternada de alinhamento pequeno (~5 volts por milímetro a 1000 KHz) por um curto período de tempo (10 segundos) fará com que as células reorientem com suas membranas conectadas. Pulsos repetidos podem ser necessários. Se as células variam muito em tamanho, pode ser necessária manipulação mecânica para orientar adequadamente as membranas.
[0061] Em algumas modalidades da invenção, a inserção de um núcleo ligado à membrana em um oócito enucleado bovino pode ser conduzida por um método dieletroforético de fusão celular, utilizando uma corrente DC e utilizando um meio de fusão celular não condutor, isto é, não iônica tal como uma solução de manitol ou meio de fusão de células Zimmerman. O fenômeno de fusão é o resultado da degradação da membrana celular e formação de poros entre células opostas devidamente orientadas. Os poros, ou pequenos canais, criados entre as duas células são termodinamicamente instáveis devido à alta curvatura de superfície dos canais e à alta tensão associada na membrana. Esta instabilidade faz com que os canais se fundam e ampliem até que as membranas formem uma única célula.
[0062] Os clones unicelulares embrionários produzidos como aqui descrito preferencialmente são cultivados in vivo ou in vitro, no estágio mórula ou blástula. Por exemplo, os clones podem ser cultivados em ovidutos de ovelhas ou em um meio de cultura adequado. Os embriões podem então ser transferidos para o útero do gado, ou outros animais adequados, em um estágio adequado de estro. Os procedimentos para transferência de embriões são comumente conhecidos e praticados no campo de transferência de embriões. Uma percentagem destas transferências de embriões iniciará gravidezes nos substitutos maternos. Os bezerros vivos nascidos destas gestações serão geneticamente idênticos onde as células doadoras foram de um único embrião ou um clone do mesmo.
[0063] Em uma modalidade da invenção, a clonagem pode ser realizada em um etapa utilizando o núcleo de uma célula somática, tal como um fibroblasto fetal, ou uma célula-tronco, tal como uma célula- tronco mesenquimal. A célula somática ou célula-tronco é fusionada com um oócito enucleado. Após a cultura, muitos dos cites fusionados (ou cíbridos) se desenvolvem em mórulas que podem ser implantadas em receptores para a gestação.
[0064] Em uma outra modalidade, dois ou mais ciclos de clonagem podem ser realizados para aumentar a eficiência de produção de animais clonados. A clonagem em duas etapas, por exemplo, envolve um primeiro ciclo de clonagem (por exemplo, por transferência nuclear) utilizando uma célula doadora, crescendo o cíbrido resultante in vitro e/ou in vivo para produzir um feto clonal, utilizando então uma célula fetal a partir do feto clonal para uma segunda rodada de clonagem (por exemplo, também por transferência nuclear). Em um exemplo, um fi- broblasto é fusionado com um oócito enucleado e cultivado até aproximadamente o estágio de mórula. As mórulas viáveis resultantes deste procedimento são transferidas para os receptores. A maioria destas gravidezes do primeiro ciclo pode ser autorizada a tentar alcançar o termo, por exemplo, para utilização como um controlo experimental interno. Depois que o embrião se desenvolveu em um feto (geralmente por um período de tempo suficiente para exibir diferenciação em tecidos e órgãos), ao menos um e até vários destes fetos de primeiro ciclo são removidos cirurgicamente para fornecer tecido para a produção de culturas de tecidos. A título de exemplo, os fetos de gado podem geralmente ser utilizados depois de atingirem uma idade gestacional de ao menos 30 dias; em modalidades específicas, os fetos de gado podem ser sacrificados a aproximadamente 45 dias de idade gestacional. Alternativamente, em vez de sacrificar o feto, os amniócitos podem ser removidos do receptor por amniocentese como aqui descrito. Qualquer tecido fetal ou células podem servir para produzir culturas de células. Em modalidades representativas, as culturas de células fetais são produzidas a partir de fibroblastos fetais, células gonadais, células-tronco mesenquimais ou células da crista genital. As culturas de células fetais são propagadas e as amostras são preservadas (por exemplo, congeladas) para utilização futura. Em certas modalidades, o tecido fetal é utilizado diretamente para a segunda rodada de clonagem (sem um estágio de armazenamento interveniente e, em alguns casos, sem de- senvolvimento de uma cultura celular in vitro).
[0065] As culturas de células fetais (por exemplo, culturas de fi- broblastos) podem ser utilizadas como doadores nucleares para o segundo ciclo de clonagem. Neste segundo ciclo (a segunda "etapa" de clonagem em duas etapas), as células de cultura fetal são fundidas com oócitos enucleados para produzir mórulas de segunda geração. Estas mórulas são transferidas para os receptores e as gravidezes resultantes permitem ir para termo para produzir progênie viva. As gestações resultantes da transferência de embriões clonados de segunda geração de origem fetal são deixadas amadurecer durante todo o período de gestação completo e resultar no parto de bezerros vivos.
[0066] Em certas modalidades, tanto a célula doadora quanto o oócito devem ser ativados. Uma célula doadora ativada (por exemplo, não quiescente) é uma célula que está em divisão ativa (por exemplo, não em um estágio de repouso da mitose). Em particular, uma célula doadora ativada é uma célula que está envolvida no ciclo celular mitó- tico, tal como fase G1, fase S ou fase G2/M. O ciclo celular mitótico tem as seguintes fases, G1, S, G2 e M. A fase G2/M refere-se à fase de transição entre a fase G2 e a fase M. O evento de comprometimento no ciclo celular, chamado START (ou ponto de restrição), ocorre durante a fase G1. "START", tal como aqui utilizado, refere-se ao estágio G1 tardio do ciclo celular antes do compromisso de uma célula que prossegue através do ciclo celular. A decisão sobre se a célula será submetida a outro ciclo celular é feita em START. Uma vez que a célula passou através de START, ela passa através do restante da fase G1 (isto é, o estágio de síntese pré-DNA). A fase S é o estágio de síntese de DNA, que é seguido pela fase G2, o estágio entre a síntese e a mitose. A mitose ocorre durante a fase M. Se antes do START, a célula não passa por outro ciclo celular, a célula fica presa. Além disso, uma célula pode ser induzida a sair do ciclo celular e tornar-se quies- cente ou inativa. Uma célula "quiescente" ou "inativa", é referida como uma célula na fase G0. Uma célula quiescente é aquela que não está em nenhuma das fases mencionadas acima do ciclo celular. De preferência, a invenção utiliza uma célula doadora que é uma célula na fase G1 do ciclo celular mitótico.
[0067] Em certas modalidades da invenção, as células doadoras são sincronizadas. A utilização de células doadoras em determinadas fases do ciclo celular, por exemplo, fase G1, permite a sincronização das células doadoras. Pode-se sincronizar as células doadoras privando (por exemplo, reduzindo) as células doadoras de uma quantidade suficiente de nutrientes no meio que lhes permite dividir. Uma vez que as células doadoras pararam de se dividir, então as células doadoras são expostas a meios (soro) contendo uma quantidade suficiente de nutrientes para permitir a sua divisão (por exemplo, mitose). As células doadoras iniciam a mitose substancialmente ao mesmo tempo e, portanto, são síncronas. Por exemplo, as células doadoras são privadas de uma concentração suficiente de soro colocando as células em soro bovino fetal a 0,5% (FBS) durante aproximadamente uma semana. Em seguida, as células são colocadas em FBS a aproximadamente 10% e começarão a dividir-se aproximadamente ao mesmo tempo. Eles entrarão na fase G1 quase ao mesmo tempo e, portanto, estarão prontos para o processo de clonagem.
[0068] Os métodos para determinar em que fase do ciclo celular se encontra uma célula são conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, a Patente US. 5.843.705 de DiTullio e outros, Campbell, K.H. S., e outros, Embryo Transfer Newsletter, vol. 14 (1): 12 a 16 (1996), Campbell, KHS e outros, Nature, 380: 64 a 66 (1996), Cibelli, JB e outros, Science 280: 1256 a 1258 (1998) Yong, Z. e L. Yuqiang, Biol, of Reprod., 58: 266 a 269 (1998) e Wilmut, I., e outros, Nature, 385: 810 a 813 (1997). Por exemplo, como descrito abaixo, vários marcadores estão presentes em diferentes estágios do ciclo celular. Tais marcadores podem incluir ciclinas D1, 2, 3 e antígeno nuclear de células proli- ferativas (PCNA) para G1, e BrDu para detectar a atividade sintética de DNA. Além disso, as células podem ser induzidas a entrar no estágio G0 cultivando as células em um meio privado de soro. Alternativamente, as células no estágio G0 podem ser induzidas a entrar no ciclo celular, isto é, no estágio G1 por ativação do soro (por exemplo, expondo as células ao soro depois de as células terem sido privadas de uma certa quantidade de soro).
[0069] Em certas modalidades, o genoma da célula doadora pode ser o genoma que ocorre naturalmente, por exemplo, para a produção de animais clonados, ou o genoma pode ser geneticamente alterado para compreender uma sequência transgênica, por exemplo, para a produção de animais clonados transgênicos.
[0070] Em algumas modalidades da invenção, os oócitos utilizados na presente invenção são oócitos ativados. Os oócitos ativados são aqueles que estão em um estágio de divisão celular meiótica, e incluem a metáfase I, a anáfase I, a anáfase II e, preferencialmente, a teló- fase II. Os oócitos na metáfase II são considerados em estado de repouso. Os oócitos podem estar no estágio de repouso da metáfase II, e depois ativados, utilizando os métodos aqui descritos. O estágio em que o oócito está pode ser identificado por inspeção visual do oócito sob uma ampliação suficiente. Os oócitos que estão na telófase II são identificados, por exemplo, pela presença de uma protrusão da membrana plasmática de um segundo corpo polar. Os métodos para identi-ficar o estágio de divisão celular meiótica são conhecidos na técnica.
[0071] Os oócitos são geralmente ativados aumentando a sua ex posição aos níveis de cálcio, em certas modalidades. Níveis crescentes de cálcio, por exemplo, entre aproximadamente 10% e aproximadamente 60% acima dos níveis basais, induzem a ativação ou divisão celular meiótica do oócito. Os níveis basais são os níveis de cálcio en-contrados em um oócito inativo. O aumento dos níveis de cálcio, juntamente com a diminuição dos níveis de fosforilação, facilita ainda mais a ativação do oócito. Existem vários métodos que permitem a ativação do oócito. Em particular, um ionóforo de cálcio (por exemplo, ionomicina) é um agente que aumenta a permeabilidade da membrana do oócito e permite que o cálcio entre no oócito. À medida que a concentração de cálcio livre na célula aumenta durante a exposição ao ionóforo, o oócito é ativado após a redução da atividade de MPF (fator de promoção de maturação). Tais métodos de ativação estão descritos na Patente U.S. 5.496.720. O etanol tem um efeito similar. Antes ou após a enucleação, um oócito na metáfase II pode ser ativado com etanol de acordo com o tratamento de ativação com etanol tal como descrito em Presicce e Yang, Mol. Reprod. Dev., 37,61 a 68 (1994); e Bordignon & Smith, Mol. Reprod. Dev., 49: 29 a 36 (1998). A exposição do cálcio ao oócito também ocorre através de estimulação elétrica. A estimulação elétrica permite que os níveis crescentes de cálcio entrem no oócito.
[0072] Conforme aqui considerado, os oócitos podem ser obtidos a partir de um animal doador durante o ciclo reprodutivo desse animal. Por exemplo, os oócitos podem ser aspirados a partir de folículos de ovários em determinados momentos durante o ciclo reprodutivo (hormônio exógeno estimulado ou não estimulado). Também em determinados momentos após a ovulação, uma porcentagem significativa dos oócitos, por exemplo, está na telófase. Adicionalmente, os oócitos podem ser obtidos e depois induzidos a maturarem in vitro até a fase de metáfase II parada. Os oócitos da metáfase II parada, produzidos in vivo ou in vitro, podem então ser induzidos in vitro a entrar na telófase. Deste modo, os oócitos em telófase podem ser facilmente obtidos para utilização em certas modalidades da presente invenção. Em particular, os oócitos podem ser coletados a partir de um animal fêmea após super ovulações. Os oócitos podem ser recuperados cirurgicamente lavando os oócitos do oviduto de uma fêmea doadora. Métodos para induzir super ovulações, por exemplo, em cabras e a coleta dos oócitos são descritos aqui.
[0073] Em certas modalidades da invenção, o estágio celular dos oócitos ativados está correlacionado com o estágio do ciclo celular da célula doadora ativada. Esta correlação entre o estágio meiótico do oócito e o estágio mitótico da célula doadora é também aqui chamada de "sincronização". Por exemplo, um oócito em telófase fusionado com o genoma de uma célula doadora em G1 antes de START fornece uma sincronização entre o oócito e os núcleos doadores na ausência de condensação prematura da cromatina (PCC) e de desintegração do envelope nuclear (NEBD).
[0074] Em algumas modalidades, a invenção utiliza um oócito que é enucleado. Como aqui considerado, um oócito enucleado é aquele que é desprovido do genoma, ou um que é "funcionalmente enuclea- do". Um oócito funcionalmente enucleado contém um genoma que não é funcional, por exemplo, não pode replicar ou sintetizar DNA. Ver, por exemplo, Bordignon, V. e L. C. Smith, Molec. Reprod. Dev., 49: 29 a 36 (1998). De preferência, o genoma do oócito é removido do oócito. Um genoma pode ser funcionalmente enucleado a partir do oócito por irradiação, por irradiação de raios-X, por irradiação com laser, remoção física do genoma ou por meios químicos. Outros métodos conhecidos de enucleação podem ser utilizados com a presente invenção para enuclear o oócito.
[0075] O oócito pode também ser tornado funcionalmente inativo, por exemplo, irradiando o material nuclear endógeno no oócito. Os métodos de utilização de irradiação são conhecidos pelos versados na técnica e são descritos, por exemplo, por Bradshaw e outros, Molecul. Reprod. Dev., 41: 503 a 512 (1995).
[0076] Para remover fisicamente o genoma de um oócito, pode-se inserir uma micropipeta ou agulha na zona pelúcida do oócito para remover o material nuclear do oócito. Em um exemplo, os oócitos de te- lófase que têm dois corpos polares podem ser enucleados com uma micropipeta ou agulha removendo o segundo corpo polar no citoplasma circundante. Especificamente, os oócitos no estágio de telófase da meiose podem ser enucleados em qualquer ponto a partir da presença de uma protrusão na membrana plasmática do segundo corpo polar até a formação do próprio segundo corpo polar. Assim, tal como aqui utilizado, os oócitos que demonstram uma protrusão na membrana plasmática, usualmente com um fuso encostado a ela, até a extrusão de um segundo corpo polar são considerados como oócitos na telófa- se.
[0077] O oócito pode ser tornado funcionalmente inativo também por métodos químicos. Os métodos de inativação química do DNA são conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, a inativação química pode ser realizada utilizando o método de citopsoide-ciclo- heximida como descrito por Fulka e Moore, Molecul. Reprod. Dev., 34: 427 a 430 (1993). Certas modalidades da presente invenção consideram a enucleação do genoma de um oócito por tratamento do oócito com um composto que induzirá o genoma do oócito (por exemplo, cromatina nuclear) para segregar nos corpos polares durante a maturação meiótica deixando assim o oócito desprovido de um genoma funcional, e resultando na formação de um citoplasto receptor para utilização em procedimentos de transferência nuclear. Exemplos de agentes que afetarão tal segregação diferencial incluem agentes que perturbarão 1) estruturas citoesqueléticas incluindo, mas não limitadas a, Taxol® (por exemplo, paclitaxel), demecolcina, faloidina, colchicina, nocodozol e 2) metabolismo incluindo, mas não limitado a cicloheximi- da e tunicamicina. Além disso, a exposição dos oócitos a outros agentes ou condições (por exemplo, aumento ou diminuição da temperatura, pH, osmolalidade) que preferencialmente induzem a segregação distorcida do genoma do oócito de modo a serem extrudados a partir dos confins do oócito (por exemplo, nos corpos polares) também estão incluídos no método preferencial. Ver, por exemplo, métodos para incluir mudanças no citoesqueleto e metabolismo de células, métodos que são conhecidos pelos versados na técnica Andreau, J. M. e Ti- masheff, S. N., Proc. Nat. Acad. Sei. 79: 6753 (1982), Obrig, T. G., e outros, J. Biol. Chem. 246: 174 (1971), Duskin, D. e Mahoney, W.C., J. Biol. Chem. 257: 3105 (1982), Scialli, A. R. e outros, Teratogen, Carcinogen, Mutagen 14:23 (1994), Nishiyarna, I e Fujii, T., Exp. Cell Res. 198: 214 (1992), Small, J. V., e outros, J. Cell Sci. 89:21 (1988), Lee, J. C., e outros, Biochem. 19: 6209 (1980).
[0078] A combinação do oócilo enucleado ativado e do genoma da célula doadora ativada pode ocorrer de várias formas para formar o embrião de transferência nuclear. Um genoma de uma célula doadora ativada pode ser injetado no oócito ativado utilizando um microinjetor (isto é, micropipeta ou agulha). O genoma nuclear da célula doadora ativada, por exemplo, uma célula somática, é extraído utilizando uma micropipeta ou agulha. Uma vez extraído, o genoma nuclear do doador pode então ser colocado no oócito ativado, inserindo a micropipeta ou agulha no oócito e liberando o genoma nuclear da célula do doador. McGrath, J. e D. Solter, Science, 226: 1317 a 1319 (1984).
[0079] Em certas modalidades, a presente invenção inclui a com binação do genoma de uma célula doadora ativada com um oócito ativado por fusão, por exemplo, eletrofusão, fusão viral, fusão lipossômi- ca, fusão bioquímica de reagente (por exemplo, proteína fitoeniagluti- nina (PHA)) ou fusão química, polietileno glicol (PEG) ou etanol). O núcleo da célula doadora pode ser depositado dentro da zona pelúcida que contém o oócito. As etapas de fusão do núcleo com o oócito podem então ser realizadas aplicando um campo elétrico que também resultará em uma segunda ativação do oócito. Os oócitos de telófase utilizados já estão ativados, portanto, qualquer ativação subsequente ou simultânea à introdução do genoma a partir de uma célula somática seria considerada um segundo evento de ativação. Com relação à ele- trofusão, câmaras, tais como o sistema de embriomanipulação BTX® 200 para realizar a eletrofusão estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, de BTX®, San Diego. A combinação do genoma da célula doadora ativada com o oócito ativado resulta em um embrião de transferência nuclear.
[0080] Um embrião de transferência nuclear da presente invenção é então transferido para um animal receptor fêmea e deixado desenvolver ou gestacionar em um animal clonado. As condições adequadas para a gestação são aquelas condições que permitem que o embrião se desenvolva e amadureça em um feto e, eventualmente, em um animal vivo. Por exemplo, o embrião de transferência nuclear pode ser transferido através da fimbria para o lúmen ovidutal de cada animal fêmea receptor. Além disso, os métodos de transferência de um embrião para um receptor conhecido dos versados na técnica são descritos por Ebert e outros, Bio/Technology, 12: 699 (1994). O embrião de transferência nuclear pode ser mantido em um sistema de cultura até ao menos a primeira clivagem (estágio de 2 células) até o estágio de blastocisto, de preferência os embriões são transferidos para o estágio de 2 células ou 4 células. Vários meios de cultura para o desenvolvimento de embriões são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, o embrião de transferência nuclear pode ser co-cultivado com uma monocamada de células epiteliais ovidutal derivada do tipo de animal a ser fornecido pelo médico.
[0081] Outro aspecto da presente invenção inclui métodos para enuclear um oócito ativado compreendendo colocar em contato o oóci- to com um composto que desestabiliza (por exemplo, rompe ou de- sassocia) o aparelho de fuso meiótico. O rompimento do aparelho de fuso meiótico resulta na ruptura de microtúbulos, cromossomos e cen- tríolos. Tal composto torna o núcleo não friccional. Exemplos de tais compostos são cochicina, pactiltaxel, nocodazol e preferencialmente, demecolcina.
[0082] Este aspecto da invenção pode ser utilizado para enuclea- ção em combinação com os métodos aqui descritos. Por exemplo, um oócito ativado pode ser preparado para transferência nuclear ativando o oócito (por exemplo, expondo o oócito a etanol ou um ionóforo), e depois sujeitando o oócito ativado a um composto que desestabiliza os fusos meióticos (por exemplo, demecolcina). Uma vez que o oócito ativado é preparado, então ele pode ser combinado com o genoma de uma célula doadora ativada para resultar em um embrião de transferência nuclear.
[0083] O seguinte procedimento de clonagem é fornecido apenas a título de exemplo.
[0084] Complexos Cúmulos-Oócitos (COCs). Os COCs contêm oócitos imaturos que estão na prófase da primeira divisão meiótica. Eles podem ser obtidos a partir de ovários coletados a partir de animais mortos em um matadouro, ou podem ser obtidos in vivo por recuperação de ovócitos transvaginais guiados por ecografia em tempo real (TVOR), também conhecido como captação de óvulos (OPU). Os COCs derivados de OPU podem ser produzidos a partir de OPUs regulares aleatórias ou programadas em conjunto com o desenvolvimento de ondas foliculares nos ovários. Alternativamente, as OPUs programadas podem ser realizadas em fêmeas doadoras estimuladas com hormônios com um horário regular. Todos os COCs independentemente da sua fonte são colocados em maturação in vitro (IVM).
[0085] Formação de citoplastos. Após a conclusão da maturação in vitro (IVM) dos COCs, os COCs são processados para enucleação, o que implica na remoção de cromatina (placa metafásica) de oócitos maduros. Ao menos 20 h após a IVM, os COCs são colocados em TL- Hepes de pH estável com 1mg/ml de hialuronidase onde eles são misturados e pipetados suavemente para remover os seus investimentos de cumulus. Após os ovócitos estarem livres de células cumulus, eles são avaliados sob estereomicroscopia para sua morfologia, a presença de um espaço perivitelino com um primeiro corpo polar extrudado, e a integridade do citoplasma é determinada. Os oócitos com uma zona pelúcida normal, um espaço perivitelino distinto com formação normal do corpo polar, e um citoplasma homogêneo são subjetivamente considerados ovócitos maduros (MOs). Todos os MOs são incubados em um inibidor de microfilamentos tal como citocalasina-b para despolime- rizar eficazmente a actina filamentosa e relaxar a membrana plasmáti- ca do MO. Os MOs são incubados com um fluorocromo específico de DNA ativado por luz ultravioleta (UV) Hoechst 33342 para iluminar os cromossomos de metáfase sob microscopia de fluorescência e permitir a sua remoção por micromanipulação. Sob baixa iluminação incandes-cente e luz UV controlada quando necessário em um microscópio composto invertido, agulhas chanfradas especiais são usadas para perfurar através da zona pelúcida, mas não perfurar a membrana plasmática do MO, logo abaixo da área dos cromossomos fluorescentes de metáfase. A cromatina é aspirada suavemente para fora do MO com o menor citoplasma possível, como um carioplasto encerrado na membrana plasmática, deixando efetivamente o antigo oócito maduro como um citoplasto renderizado e enucleado desprovido de toda a cromatina. Essas enucleações continuam até que todos os MOs te-nham sido manipulados em citoplastos intactos da membrana plasmá- tica.
[0086] Preparação de células somáticas congeladas. Utilizando a técnica de cultura de células assépticas, descongelar um criofrasco de células somáticas genotípicas específicas em um banho de água a 37° C durante 1 minuto, 1-2 dias antes da clonagem, dependendo de como a linhagem celular cresce in vitro. Usando a técnica de recuperação de células assépticas em uma capa de cultura de células de fluxo laminar, transferir o conteúdo aquecido do criofrasco para um tubo de centrifugação de 15 ml. Adicionar 10 ml de meio de cultura celular (DMEM, meio de cultura celular DMEM contendo Glutamina, Penicilina- Estreptomicina e Soro Bovino Fetal a 20%) ao tubo de centrífuga, misturando suavemente por agitação à medida que gotas de meio são adicionadas. Centrifugar o tubo de células a 200 x rpm durante 5-10 minutos. As células são cultivadas em uma placa de cultura de tecido Nunc de 4 poços e em uma placa de cultura celular de 100 mm. Na placa Nunc de 4 poços, adicionar 0,5 ml de DMEM a cada poço e 2 ml de DMEM ao poço central. No prato de cultura celular de 100 mm, adicionar 12 ml de DMEM ao prato. Após a conclusão da centrifugação, remover o sobrenadante sem perturbar o pélete. O pélete é suavemente ressuspenso em 0,5 ml de meio de cultura. Após a mistura, 50 μl de suspensão celular são adicionados a cada um dos primeiros dois poços Nunc, 25 μl ao terceiro poço e 15 μl ao quarto poço. O restante das células em suspensão é colocado no prato de 100 mm. Todas as culturas de células são colocadas na incubadora e cultivadas a 38,7° C em 5% de CO2 e ar. No dia da utilização na clonagem, estas células são retiradas da cultura celular por tratamento com protease e as células livres e dissociadas são colocadas em um prato de cultura organizado para utilização na clonagem de transferência nuclear de células somáticas.
[0087] Reconstrução de clones. Depois de todos os MOs serem enucleados, os citoplastos são preparados para a reconstrução do clone. A reconstrução de clones é o processo pelo qual uma célula somática é colocada dentro da zona pelúcida de um citoplasto, posteriormente fusionada a um citoplasto por fusão de pulso elétrico, após o que os clones reconstruídos são processados para a ativação da reprogramação da célula somática e a ativação de um desenvolvimento maternalmente acionado e eventual ativação de um genoma embrionário figurativo. Especificamente, ao manter um citoplasto em um plano onde a incisão da agulha para enucleação está em um bom plano focal, a ponta de enucleação captura uma célula somática e passa através da incisão real a partir da enucleação na zona pelúcida. A célula somática é então colocada próxima da membrana plasmática. Todas as reconstruções são completadas em série.
[0088] Ativação de Oócitos. Após a reconstrução do clone estar completa, todos os citoplastos reconstruídos são colocados em uma câmara de eletrofusão contendo um meio de fusão baseado em álcool de açúcar condutor. Quando os citoplastos reconstruídos são alinhados uniformemente dentro da câmara, os citoplastos são tratados com um pulso de corrente contínua de 100 volts durante 40 μsec. Após a eletrofusão, os citoplastos são lavados e cultivados permitindo que os cíbridos completem o processo de fusão. Geralmente leva de 15 a 30 minutos para as células somáticas se fusionarem aos citoplastos e a cromatina seja incorporada no citoplasma. Após o processo de fusão estar completo, os cíbridos são colocados em meio de cultura contendo ionomicina, uma molécula de ionóforo de cálcio usada para induzir a ativação partenogênica de um oócito maduro e causar um aumento similar ao da fertilização no cálcio intracelular. A ionomicina induz sistemas de segundo mensageiro de oócitos que ativam o genoma materno e induzem a liberação de grânulos corticais para fora da membrana plasmática. Este processo não é diferente do que acontece com o oócito mediante a fusão de esperma e a ativação do genoma mater- no no início da fertilização do oócito maduro. Para aumentar a eficiência e completar a ativação partenogênica após tratamento com iono- micina, os embriões clonados são incubados durante aproximadamente 5 horas em um inibidor de síntese de proteína cicloheximida (CHX) que induz a retomada dos processos de meiose por inativação do fator promotor de maturação (MPF) e atividade de proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) (Tian e outros, 2002). Os oócitos bovinos geralmente exigem várias horas de tratamento com CHX após ativação induzida por ionomicina para a liberação apropriada da detenção da metáfase meiótica e a ativação completa. É também durante este tempo que a cromatina somática é reorganizada e reprogramada para o desenvolvimento embrionário.
[0089] Cultura de embriões clonados. Todos os embriões clonados reconstruídos intactos são colocados em cultura a longo prazo em meio de cultura de embriões específico bovino suplementado com albumina de soro bovino. No dia 5, os embriões com mais de 8 células e mostrando sinais de compactação precoce são suplementados com FBS a 10%. Nos dias 6-8, os embriões clonados em estágio de blasto- cisto avançado são embalados em meio de transporte e conduzidos para uma instalação de fazenda de receptores onde eles são transferidos não cirurgicamente para novilhas receptoras substitutas.
[0090] Gerenciamento de novilhas receptoras. Os embriões clona- dos destinados à transferência para fêmeas substitutas sincronizadas são transportados para a fazenda em tubos de cultura e não cirurgicamente transferidos por métodos tradicionais para receptores específicos. As fêmeas receptoras são regularmente verificadas por veterinários e as gravidezes em andamento são monitoradas em uma base regular e programada através de ultrassonografia transretal em tempo real em uma base mensal durante o período de gravidez. Todas as fêmeas carregando bezerros clonados são colocadas em um protocolo de manutenção da gestação e gravidez que conclui na cesárea programada e cuidados intensivos para a prole viva.
[0091] O seguinte exemplo adicional de clonagem é fornecido apenas a título de exemplo.
[0092] Enucleação de oócitos. Os oócitos maduros in vivo são co letados a partir de fêmeas doadoras. Os oócitos com células cumulos anexas ou desprovidos de corpos polares são descartados. Os oócitos sem cúmulos são divididos em dois grupos: oócitos com apenas um corpo polar evidente (estágio de metáfase II) e o protocolo de telófase II ativado (oócitos com um corpo polar e evidência de um segundo corpo polar extrudado). Os oócitos na telófase II são cultivados em M199 + FBS a 10% durante 3 a 4 horas. Os oócitos que são ativados durante este período, como evidenciado por um primeiro corpo polar e um segundo corpo polar parcialmente extrudado, são agrupados como oócitos de telófase II ativados por cálcio (Telófase II-Ca + 2) induzidos em cultura e enucleados. Os oócitos que não se ativaram são incubados durante 5 minutos em PBS contendo etanol a 7% antes da enu- cleação. Os oócitos do estágio de metáfase II (um corpo polar) são enucleados com uma pipeta de vidro de 25-30 mícrons por aspiração do primeiro corpo polar e do citoplasma adjacente que circunda o corpo polar (aproximadamente 30% do citoplasma) presumidamente contendo placa metafásica.
[0093] Os oócitos em estágio de telófase são preparados por dois procedimentos. Os oócitos são inicialmente incubados em solução salina tamponada com fosfato (PBS, livre de Ca+2/Mg+2) suplementada com FBS a 5% durante 15 minutos e cultivada em M 199 + FBS a 10% a 38° C durante aproximadamente três horas até a configuração de fuso de telófase ou a extrusão do segundo corpo polar ser alcançada. Todos os oócitos que respondem à cultura sequencial sob tratamento diferencial de concentração de cálcio extracelular são separados e agrupados como Telofase II-Ca2+. Os outros oócitos que não respondem são ainda incubados em etanol a 7% em M199 + FBS a 10% durante 5 a 7 minutos (Telófase II-ETOH) e cultivados em M199 + FBS a 10% durante 2 a 4 horas. Os oócitos são então cultivados em M199 + FBS a 10% contendo 5 μg/ml de citocalasina-B durante 10-15 minutos a 38° C. Os oócitos são enucleados com uma pipeta de vidro de 30 mícrons (OD) aspirando o primeiro corpo polar e aproximadamente 30% do citoplasma adjacente contendo a metáfase II ou aproximadamente 10% do citoplasma contendo o fuso de telófase II. Após a enu- cleação, os oócitos são imediatamente reconstruídos.
[0094] Reconstrução de embriões. As células somáticas são colhi das no dia 7 por tripsinização (tripsina a 0,025% / EDTA a 0,5 mM) (Sigma) durante 7 minutos. As células individuais são ressuspensas em M199 + FBS a 10% equilibrado suplementado com L-glutamina a 2 mM, penicilina/estreptomicina. A injeção de células doadoras é realizada no mesmo meio que para a enucleação. As células doadoras são classificadas em pequenas, médias e grandes antes da seleção para a injeção em citoplastos enucleados. Pequenas células individuais (1015 mícrons) são selecionadas com uma pipeta de vidro de 20-30 mí- crons de diâmetro. A pipeta é introduzida através da mesma fenda da zona feita durante a enucleação e as células doadoras são injetadas entre a zona pelúcida e a membrana ooplasmática. Os embriões reconstruídos são incubados em M199 30-60 minutos antes da fusão e ativação.
[0095] Fusão e Ativação. Todos os embriões reconstruídos (pré- tratamento com etanol ou não) são lavados em tampão de fusão (ma- nitol a 0,3 M, CaCl2 a 0,05 mM, MgSO4- a 1 mM, K2HPO4 a 9 mM, glu- tationa a 0,1 mM, BSA a 0,1 mg/ml em água destilada) durante 3 minutos antes da eletrofusão. A fusão e a ativação são executadas em temperatura ambiente, em uma câmara com dois eletrodos de aço inoxidável separados por 200 mícrons (Sistema de Embriomanipula- ção BTX® 200, BTX®-Genetronics, San Diego, Califórnia) preenchido com tampão de fusão. Os embriões reconstruídos são colocados com uma pipeta em grupos de 3-4 e manualmente alinhados de modo que a membrana citoplasmática dos oócitos receptores e das células doadoras CFF155-92-6 sejam paralelas aos eletrodos. A fusão celular e a ativação são induzidas simultaneamente 32-42 horas após a injeção de GnRH com um pulso de retenção/alinhamento inicial de 5-10 V AC durante 7 segundos, seguido de um pulso de fusão de 1,4 a 1,8 KV/cm DC durante 70 microssegundos utilizando um Electrocell Manipulator e Enhancer 400 (BTX®-Genetronics). Os embriões são lavados em meio de fusão durante 3 minutos, depois são transferidos para M199 contendo 5 μg/ml de citocalasina-B (Sigma) e FBS a 10% e incubados durante 1 hora. Os embriões são removidos do meio M199/citocalasina-B e co-cultivados em gotas de 50 microlitros de M199 mais FBS a 10% com células epiteliais ovidutais de cabra sobrepostas com óleo de parafina. As culturas de embriões são mantidas em uma incubadora umi- dificada a 39° C com CO2 a 5% durante 48 horas antes da transferência dos embriões para fêmeas receptoras.
[0096] Certos aspectos da invenção abrangem um método para aumentar o progresso genético em um núcleo, linhagem ou rebanho genético utilizando clones gerados a partir de amniócitos. Dentro de um núcleo genético (ou linhagem ou rebanho), uma vez selecionado, os progenitores que produzem a próxima geração são acasalados uns com os outros, evitando acasalamentos entre indivíduos intimamente relacionados, com o objetivo de aumentar o mérito genético da próxima geração. Um aumento no mérito genético da próxima geração constitui um progresso genético. Um aumento no mérito genético, nes- se contexto, significa que para um dado traço ou conjunto de traços, os indivíduos na sucessiva geração expressarão o traço desejado ou conjunto de traços mais fortemente do que seus progenitores. Com respeito a traços indesejáveis, um aumento no mérito genético significa que os indivíduos na sucessiva geração expressarão o traço ou o conjunto de traços menos fortemente do que seus progenitores.
[0097] A mudança genética, incluindo a mudança genética desejá vel (isto é, o progresso genético por ano) ("dG") pode ser medida como a diferença entre o nível genético médio de toda a progênie nascida em um ano e toda a progênie nascida no ano seguinte. A diferença é o resultado de progenitores selecionados com maior mérito genético do que o mérito genético médio de todos os candidatos à seleção (os animais disponíveis para seleção como progenitores da próxima geração). Em condições ideais, isso depende da herdabilidade (h2) do traço e da diferença entre o desempenho médio de progenitores selecionados e o de candidatos à seleção. A herdabilidade de um traço (h2) é a proporção de diferenças observáveis (variância fenotípica, G2P) em um traço entre indivíduos dentro de uma população que é devido a dife-renças genéticas aditivas (A), em oposição a ambientais (E) (h2 = σ2A/σ2P = σ2A/(σ2A + σ2E)). A diferença entre o desempenho médio dos progenitores selecionados e o de todos os candidatos selecionados (dos quais os progenitores selecionados são um subconjunto) também é conhecida como o diferencial de seleção.
[0098] O progresso genético por ano é o resultado da superiorida de genética de machos selecionados e de fêmeas selecionadas. Isto é expresso na seguinte equação: dG = {(RIH i)machos + (RIH i)fêmeas} OH/(Lmachos + Lfêmeas),
[0099] Onde, R = a precisão da seleção, i = a intensidade da sele ção, GH = variação genética e L = intervalo de geração, para progenitores machos e fêmeas.
[00100] H = objetivo de reprodução que combina o mérito genético (g) dos traços (1 a m) que precisam ser produzidos ponderado pelos valores econômicos (v) dos traços (H = v1g1 + v2g2 + + vmgm). O valor econômico é positivo se a seleção for para valores fenotípicos maiores e negativo se a seleção for para valores fenotípicos menores I = um índice que combina todas as informações de traços no indivíduo e seus familiares e é a melhor estimativa do valor de H para o indivíduo.
[00101] Em uma população grande, a intensidade de seleção depende de quantos animais são testados e quantos são selecionados - quanto menor a proporção selecionada, maior a intensidade de seleção e maior o progresso genético, sendo todos iguais. Assim, para maximizar o progresso genético, dever-se-ia classificar todos os animais testados com base no GEBV, por exemplo, e então selecionar o número mínimo de machos e fêmeas superiores necessários para manter a linhagem, raça e/ou tamanho do rebanho e para evitar problemas de endogamia. Isto assegura que o GEBV médio de animais selecionados seja substancialmente mais alto do que o GEBV médio de todos os animais testados. Em particular, através do uso de inseminação artificial (IA), é preciso selecionar menos machos do que fêmeas e a intensidade de seleção para os machos é maior do que para as fêmeas.
[00102] O intervalo de geração para machos (ou fêmeas) é a idade média dos progenitores machos (ou progenitores fêmeas) quando a progênie nasce. A taxa anual de progresso genético depende do intervalo de geração e da superioridade dos GEBVs dos progenitores em comparação com os candidatos à seleção. Em geral, os machos contribuem mais para o progresso genético por ano do que as fêmeas.
[00103] "Linhagem", tal como aqui utilizado, refere-se a animais com uma origem comum e características de identificação similares. "Núcleo genético", tal como aqui utilizado, refere-se a uma ou mais populações de animais machos e fêmeas utilizados para gerar candidatos à seleção em um programa de reprodução. "Programa de reprodução", tal como aqui utilizado, refere-se a um sistema para fazer progressos genéticos em uma população de animais.
[00104] A invenção engloba um método no qual GEBVs para um núcleo, linhagem ou rebanho genético são obtidos a partir de DNA extraído de amniócitos em vez de amostras de tecido obtidas de adultos. O método engloba geralmente as etapas de extrair DNA de um primeiro amniócito derivado de um feto a partir do núcleo, linhagem ou rebanho genético; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; determinar um GEBV do feto com base no genótipo; selecionar o feto como um progenitor para o núcleo genético, linhagem ou rebanho baseado no GEBV; e clonar o feto para produzir um clone. Como demonstrado no Exemplo 3 abaixo, o uso de amniocentese para obter amniócitos para avaliação genômica independentemente resulta em um aumento nos candidatos à seleção no núcleo, linhagem ou rebanho genético e assim aumenta a intensidade de seleção e o progresso genético. Isso ocorre porque os fetos com escores genômicos baixos podem ser abortados antes do nascimento, permitindo que as fêmeas receptoras sejam recicladas mais cedo, produzindo assim candidatos adicionais. Além disso, o uso de clonagem independentemente resulta em uma diminuição no número de animais selecionados e aumenta assim a intensidade de seleção e o progresso genético. Isto ocorre porque várias cópias de um único progenitor fêmea com um escore genômico superior podem ser utilizadas para produzir todas, ou uma parte maior, do número necessário de novilhas de substituição para a próxima geração (em oposição a ter de selecionar várias fêmeas diferentes de modo a produzir um número suficiente de substituições).
[00105] Uma vez produzidas, as fêmeas clonadas podem ser usa- das como progenitores para a próxima geração usando OPU e FIV, incluindo a superovulação. Depois disso, as etapas acima podem ser repetidas, isto é, os embriões resultantes da FIV, uma vez transferidos para os receptores, podem ser avaliados genomicamente utilizando os seus amniócitos e uma determinação pode ser feita se eles serão os progenitores e, assim, clonados ou alternativamente abortados.
[00106] Em certos aspectos desta modalidade, é considerado que a FIV é realizada utilizando esperma classificado por sexo. O termo "esperma classificado por sexo" inclui uma amostra de esperma que foi processada para desviar a razão de esperma portadores de cromossomos X para espermas portadores de cromossomos Y. Tal como aqui considerado, o "esperma classificado por sexo" pode ser criado separando os espermas dotados de X e Y um do outro através, por exemplo, de técnicas bem conhecidas utilizando citometria de fluxo, ou alternativamente, matando ou, de outra forma, incapacitando o esperma dotado de cromossomo de sexo indesejado, por exemplo, via ablação a laser. Em certas modalidades, ao menos 60%, 70%, 80%, 90%, 98% ou 99% dos espermas em uma amostra de esperma classificada por sexo apresentam um cromossomo X. Em outras modalidades, ao menos 60%, 70%, 80%, 90%, 98% ou 99% dos espermas em uma amostra de esperma classificada por sexo apresentam um cromossomo Y.
[00107] Outra modalidade da invenção que faz uso da alta capacidade de teste conseguida utilizando a amniocentese abrange o aumento do número de animais selecionados e depois o agrupamento dos animais selecionados em duas categorias diferentes: um grupo de animais é utilizado em um programa de reprodução para gerar touros AI e o outro grupo de animais torna-se doador de oócitos para a produção in vitro de embriões comerciais de leite que se destinam a ser transferidos para fêmeas em fazendas de produção. Em uma modalidade específica, o programa de reprodução gera candidatos à seleção tanto para o programa de reprodução quanto para o programa de embriões. Em uma outra modalidade da invenção, os animais selecionados para o programa de reprodução incluem animais com GEBVs ou GPTAs superiores aos animais selecionados para o programa de embriões. Em uma modalidade mais específica, os animais selecionados para o programa de reprodução compreendem o 1% superior de candidatos à seleção em termos de GEBVs ou GPTAs. Em uma outra modalidade, os animais selecionados para o programa de embriões compreendem os próximos 29% de candidatos à seleção em termos de GEBVs ou GPTAs. Estas porcentagens relativas podem ser ajusta-das para cima ou para baixo dependendo das necessidades de cada programa. Em uma modalidade específica, os animais selecionados para o programa de reprodução compreendem os 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% dos candidatos à seleção em termos de GEBVs ou GPTAs. As fêmeas selecionadas para o programa de embriões são superovuladas e os seus oócitos coletados utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Estes oócitos são então utilizados para produzir embriões fêmeas através de FIV usando esperma classificado por sexo e, em seguida, os embriões são transferidos para animais fêmeas no nível de fazenda de laticínios comerciais para se tornarem subsequentemente animais de produção. Conforme ilustrado no Exemplo 4, abaixo, esta modalidade da invenção é capaz de produzir vacas/animais de produção comerciais que excedem o EBV médio (ou GEBV ou GPTA) dos candidatos à seleção. Em uma modalidade específica da invenção, os candidatos à seleção compreendem prole de progenitores em um núcleo, linhagem ou rebanho genético. Para os fins da invenção, o termo "animal de produção" compreende um animal que produz ou produziu leite para venda comercial.
[00108] Etapa 1. Produção de embrião do doador via FIV. Os COCs imaturos de prófase I foram recuperados a partir de uma novilha Holstein peripubertal utilizando um sistema TVOR. Os COCs imaturos foram trazidos para o laboratório e colocados em um sistema de cultura IVM. Após um período de cultura durante a noite, os oócitos que progrediram através da meiose I e foram morfologicamente normais, foram utilizados na FIV. Os oócitos maduros foram colocados em gotas de FIV e fertilizados com uma concentração específica de esperma capacitado de um touro Holstein. Os zigotos (dia 1) foram colocados no sistema de co-cultura tradicional e cultivados até os estágios uterinos de desenvolvimento no dia 7-8 da cultura. Um embrião foi transportado para uma fazenda de novilhas receptoras onde foi transferido não cirurgicamente para uma fêmea receptora sincronizada. A gravidez foi monitorada de forma regular e programada através de ultras- sonografia transretal em tempo real.
[00109] Etapa 2. Amniocentese para obter amniócitos. No dia 76 da gravidez, a amniocentese foi realizada na fêmea receptora. A fêmea foi retida em estoques e sedada antes de realizar a amniocentese. O reto do receptor foi esvaziado de fezes, e sob anestesia peridural, a vulva e a área retal do receptor foi limpa e esfregada. A etapa de desinfecção foi concluída enxaguando a vulva e a área retal com solução de Betadina e depois enxaguando e pulverizando a área limpa com etanol a 70%. O equipamento TVOR foi limpo e esterilizado com eta- nol imediatamente antes da sua introdução na vagina e foi equipado com um guia de agulha única de aço inoxidável estéril. O equipamento TVOR foi avançado para a vagina, posicionado à esquerda ou à direita do osso cervical e por meio de manipulação por reto, o corno uterino grávido foi posicionado contra a sonda, evitando a interposição de outro tecido no trajeto de agulha proposto. A localização exata do saco amniótico foi determinada pelo reconhecimento de partes do corpo fe tal, as membranas alantoamnióticas e alantocoriônicas e a parede uterina. Quando uma área não ecogênica representando o líquido amnió- tico foi observada na tela do monitor, uma agulha estéril com um cate- ter foi inserida dentro da guia de agulha e avançada penetrando através da parede vaginal, útero e subsequentes membranas fetais. Assim que a ponta da agulha foi vista entrando no compartimento de fluido fetal, um cateter foi retirado da agulha e a agulha foi colocada dentro do âmnio fetal. Um volume inicial de 5-10 ml de fluido fetal foi aspirado para dentro da tubagem e lavado para fora do sistema de tubagem para reduzir ou eliminar a contaminação materna. Um filtro de amniocen- tese foi anexado ao tubo e mais 30-40 ml de líquido amniótico foram aspirados. Durante a coleta do líquido, o corno uterino grávido foi man-tido na mesma posição, e a localização exata da ponta da agulha foi garantida por sua visualização na tela de ultrassom. O líquido coletado no sistema de filtração foi colocado em gelo e transportado de volta para o laboratório de cultura celular.
[00110] Etapa 3. Processamento de líquido de amniocentese. Sob condições estéreis, o líquido e os amniócitos coletados foram aspirados por meio de uma pipeta em tubos cônicos de 15 ml. O filtro de coleta foi enxaguado com meio de cultura para remover quaisquer células aderidas e repetido como necessário para remover uma quantidade máxima de amniócitos do filtro. Os tubos cônicos foram então centrifugados até um pélete de células ser formado. O sobrenadante foi aspirado, e as células foram ressuspensas em meio de cultura celular. A suspensão de células foi cuidadosamente misturada e pipetada para dentro de placas de cultura. As culturas de células foram colocadas em uma incubadora de cultura de células e cultivadas a 38,7° C em CO2 a 5%/ar durante 5 dias sem serem perturbadas. No dia 5 da cultura, as placas de cultura de células foram removidas da cultura e do meio de cultura de células e quaisquer células flutuantes (células- tronco mesenquimais) foram aspiradas e colocadas em tubos de centrifugação de 15 ml. As células-tronco mesenquimais flutuantes aspiradas foram iniciadas em uma cultura celular separada. As células restantes (fibroblastos) foram alimentadas com meio de cultura fresco e colocadas de novo em incubadoras de cultura de células e cultivadas até 80-90% de confluência. Após atingir a confluência (dia 20), os fi- broblastos foram levantados para criopreservação.
[00111] Etapa 4. Extração de DNA a partir de fibroblastos cultivados e análise genômica. Os fibroblastos congelados foram transportados para a instalação para extração de DNA e análise genômica. Após descongelamento, um volume igual de uma solução contendo Tris- EDTA foi adicionado. A suspensão celular foi então armazenada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 4° C até ser necessário para a extração de DNA.
[00112] Os tubos de 1,5 ml contendo a suspensão celular foram centrifugados a >10000 x g em uma microcentrífuga durante 45 segundos para sedimentar as células. A solução em suspensão foi pipe- tada cuidadosamente para não remover as células peletizadas. Aproximadamente 50 μl de solução em suspensão foram deixados em cada tubo. Os tubos foram então agitados em vórtex durante 10 segundos para ressuspender os péletes de células. 300 μl de Solução de Lise de Tecidos e Células (Epicenter, Madison Wisconsin, Catálogo # MTC096H) contendo 1 μl de Proteinase K (Epicenter, Madison Wis-consin, a 50 μg/μl, Catálogo # MPRK092) foram então adicionados a cada tubo e misturados. Os tubos foram incubados a 65° C durante 30 minutos e agitados em vórtex a 15 minutos. As amostras foram resfriadas a 37° C. Em seguida, 1 μl de RNase a 5 mg/μl (Epicentre, Madison Wisconsin, a 5 mg/ml, número de catálogo MPRK092) foi adicionado a cada amostra e então misturado. As amostras foram então incubadas a 37° C durante 30 minutos. As amostras foram então colo- cadas em um resfriador a 4° C durante 5 minutos. Foram adicionados 175 μl de Reagente de Precipitação de Proteínas MPC (Epicentre, Madison Wisconsin, Catálogo # MMP095H) a cada amostra, e as amostras foram submetidas a agitação vigorosa durante 10-15 segundos. As amostras foram centrifugadas de modo a peletizar detritos durante 8 minutos a > 10000 x g. O sobrenadante foi transferido para um tubo de microcentrífuga limpo. 600 μl de isopropanol frio (-20° C) foram adicionados ao sobrenadante. Cada tubo foi então invertido 30-40 vezes. O DNA foi peletizado por centrifugação durante 8 minutos em uma microcentrífuga a >10000 x g. O isopropanol foi vertido sem desalojar o pélete de DNA. O pélete foi enxaguado uma vez com etanol a 70% e depois o etanol foi cuidadosamente despejado de modo a não perturbar o pélete de DNA. O etanol residual foi removido com uma pipeta, e o pélete de DNA foi deixado secar ao ar no tubo de microcen- trífuga. Uma vez seco, o pélete de DNA foi ressuspenso em 20 μl de Tris-EDTA. A extração produziu menos de 10 ng/μl de DNA de cadeia dupla.
[00113] O DNA extraído foi então analisado utilizando um Illumina SNP BeadChip de bovino. Os dados gerados pelo SNP BeadChip foram utilizados para confirmar o parentesco do embrião do doador e produziram um escore GTPI de 2451.
[00114] Etapa 5. IVM de COCs utilizados na clonagem. Os COCs foram obtidos de doadores de matadouro e colocados em um sistema de cultura IVM. Após a conclusão de IVM, os COCs foram processados para enucleação. 20 h após IVM, os COCs foram colocados em TL-Hepes de pH estável com 1mg/ml de Hialuronidase, onde foram misturados e pipetados suavemente para remover os seus investimentos de cumulus. Após os oócitos estarem livres de células cumulus, eles foram avaliados sob estereomicroscopia quanto à sua morfologia, à presença de um espaço perivitelino com um primeiro corpo polar ex- trudado, e à integridade do citoplasma. Oócitos com uma zona pelúci- da normal, um espaço perivitelino distinto com formação normal do corpo polar e um citoplasma homogêneo foram considerados MOs. Os MOs foram incubados em um inibidor de microfilamentos e Hoechst 33342. Sob baixa iluminação incandescente e luz UV controlada em um microscópio composto invertido, uma agulha chanfrada foi usada para perfurar através da zona pelúcida e para dentro da membrana plasmática de cada MO apenas sob a área de cromossomos metafási- cos de fluorescência. A cromatina foi aspirada com sucesso de MOs para tornar os citoplastos enucleados.
[00115] Etapa 6. Preparação de células-tronco mesenquimais para clonagem. As células-tronco mesenquimais cultivadas a partir do embrião do doador foram levantadas da cultura e colocadas em tubos de centrifugação de 15 ml. 10 ml de meio de cultura celular DMEM foram adicionados por gotejamento a cada tubo enquanto sob agitação. Os tubos foram centrifugados a 200 x rpm durante 5 a 10 minutos. As células foram cultivadas em uma placa de cultura de tecido Nunc de 4 poços e em uma placa de cultura celular de 100 mm. Na placa Nunc de 4 poços, 0,5 mL de DMEM foram adicionados a cada poço e 2 mL de DMEM foram adicionados ao poço central. No prato de cultura celular de 100 mm, 12 ml de DMEM foram adicionados à placa. Após a conclusão da centrifugação, o sobrenadante foi removido sem perturbar o pélete. O pélete foi suavemente ressuspenso em 0,5 ml de meio de cultura. Após a misturação, 50 μl de suspensão celular foram adicionados a cada um dos primeiros dois poços Nunc, 25 μl ao terceiro poço e 15 μl ao quarto poço. O restante das células em suspensão foi colocado no prato de 100 mm. Todas as culturas de células foram colocadas na incubadora e cultivadas a 38,7° C em CO2 a 5% e ar. No dia da utilização na clonagem, estas células foram retiradas da cultura celular por tratamento com protease e as células livres e dissociadas foram colocadas em um prato de cultura organizado para utilização na transferência nuclear de células somáticas.
[00116] Etapa 7. Reconstrução de clones. Citoplastos foram preparados para reconstrução de clones. Enquanto mantendo cada citoplas- to em um plano onde a incisão da agulha para enucleação se encontrava em um bom plano focal, uma ponta de enucleação foi usada para coletar uma célula-tronco mesenquimal e depois passar pela incisão real a partir da enucleação na zona pelúcida. A célula-tronco mesen- quimal foi então colocada próxima à membrana plasmática em cada citoplasto. As reconstruções foram completadas em série.
[00117] Etapa 8. Ativação de oócitos. Após a reconstrução do clone ter sido completada, os citoplastos reconstruídos foram colocados em uma câmara de eletrofusão contendo um meio de fusão à base de álcool de açúcar condutor. Quando os citoplastos reconstruídos foram alinhados uniformemente dentro da câmara, os citoplastos foram tratados com um pulso de corrente contínua de 100 volts durante 40 μsec. Após a eletrofusão, os citoplastos foram lavados e cultivados permitindo que os cíbridos completassem o processo de fusão. Depois de completado o processo de fusão, os cíbridos foram colocados em meio de cultura contendo ionomicina. Em seguida, os embriões clona- dos foram incubados durante aproximadamente 5 horas em CHX.
[00118] Etapa 9. Cultura de embriões clonados. Todos os embriões clonados reconstruídos intactos foram colocados em cultura a longo prazo em meio de cultura de embrião específico de bovino suplementado com albumina de soro bovino. No dia 5, os embriões com mais de 8 células e apresentando sinais de compactação precoce foram suplementados com FBS a 10%. Nos dias 6 a 8, os embriões clonados em estágio de blastocisto avançado foram empacotados em meio de transporte e conduzidos para uma instalação de fazenda de receptores onde foram transferidos não cirurgicamente para novilhas receptoras de substituição.
[00119] Etapa 10. Gerenciamento e Nascimento da Novilha Receptora. Os embriões clonados foram transportados para a fazenda em tubos de cultura e transferidos não cirurgicamente por métodos tradicionais para fêmeas receptoras sincronizadas específicas. As fêmeas receptoras foram regularmente verificadas por veterinários e as gravidezes em curso foram monitoradas em uma base regular e programada através de ultrassonografia transretal em tempo real em uma base mensal durante o período de gravidez. Uma gravidez bem-sucedida resultou no nascimento de um bezerro clonado. Uma análise genômica a partir de uma amostra de tecido obtida a partir do bezerro confirmou que o vitelo era um clone do embrião do doador.
[00120] Os materiais e métodos utilizados no Exemplo 1 foram utilizados para obter embriões clonados a partir de um segundo doador de embriões, com as seguintes exceções: 1) Extração de DNA e análise genômica (como descrito na etapa 4, acima) foram realizadas utilizando células-tronco mesenquimais obtidas no dia 5 da cultura (tal como obtido na etapa 3, acima); e 2) os embriões clonados foram criados usando fibroblastos criopreservados (como obtido na etapa 3, acima) em vez de células-tronco mesenquimais. Adicionalmente, cada crio- frasco de fibroblastos foi descongelado em um banho de água a 37° C durante 1 minuto, 1 a 2 dias antes da clonagem, transferido para um tubo de centrífuga de 15 ml e depois processado de acordo com a etapa 5 acima.
[00121] No exemplo a seguir, os efeitos da amniocentese e clonagem sobre o progresso genético em um rebanho, linhagem ou núcleo genético foram avaliados utilizando os seguintes parâmetros e suposições. Parâmetros # ap = Desvio padrão fenotípico # h2 = Herdabilidade # a A = Vh2 * ap (desvio padrão genômico/genético aditivo) # p = Proporção de animais selecionados # r = Precisão da seleção # z = Quantil # I = z/p (Intensidade de seleção) # ΔG = i * Vh2 * ap * r Suposições # Desvio padrão genômico aditivo SA = 76 # Capacidade para receptores N = 6000 # Número de indivíduos selecionados Nsel = 150 # Clonagem - isto fornece o número de clones por fêmea Nclones = 10 # Duração da gestação em dias GL = 285 # Dia de gestação na amniocentese AD = 74 # por ponto no celeiro: quantos dias do ano um animal não está grávido? # Dias de gravidez para o receptor Dp = 32 # Dias a partir da coleta de amostras para os resultados dos testes genômicos (GTPI) gsO = 21 # Precisão dos resultados dos testes genômicos r = 0,8
[00122] O progresso genético do rebanho, linhagem ou núcleo genético sob quatro cenários foi determinado. A avaliação genômica (GTPI) (que resulta em um aumento na precisão da seleção) é realizada em todos os quatro cenários. No entanto, nos cenários 1 e 3, a avaliação genômica é realizada utilizando amostras de tecido pós-parto, enquanto nos cenários 2 e 4, a avaliação genômica é realizada utilizando amniócitos obtidos da amniocentese. Adicionalmente, nos cenários 1 e 2, não foi realizada clonagem, enquanto nos cenários 3 e 4 a clonagem foi realizada. Um resumo dos quatro cenários é o seguinte. 1. Nenhuma amniocentese; sem clonagem. 2. Amniocentese; sem clonagem 3. Nenhuma amniocentese; clonagem utilizando amostras de tecido pós-parto. 4. Amniocentese; clonagem utilizando amniócitos obtidos da amniocentese. Cálculo do progresso genético por geração para os cenários # Função que computa deltaG dados os parâmetros acima deltaG = function(N, Nsel, r, sA) { p = Nsel / N i = dnorm(qnorm(I-p)) / p G = i * sA *r return(list(G = G, N = N)) } Glist <- list() GClist <- list() Glist[[1]] = deltaG(N = N * (365 / (GL + DP + gsO)), Nsel = Nsel, r = r, sA = sA) Glist[[2]] = deltaG(N = N * (365 / (AD + DP + gsO)), Nsel = Nsel, r = r, sA = sA) # e com clones GClist[[I]] = deltaG(N = N * (365 / (GL + DP + gsO)), Nsel = Nsel / Nclones, r = r, sA = sA) GClist[[2]] = deltaG(N = N * (365 / (AD + DP + gsO)), Nsel = Nsel / Nclones, r = r, sA = sA) TABELA 1: RESULTADOS
[00123] O uso de amniocentese para obter amniócitos para avaliação genômica independentemente resulta em um aumento nos candidatos à seleção e assim aumenta a intensidade de seleção. Isso ocorre porque os fetos com escores genômicos baixos podem ser abortados antes do nascimento, permitindo que as fêmeas receptoras sejam recicladas mais cedo, produzindo assim candidatos adicionais. Além disso, a utilização de clonagem independentemente resulta em uma diminuição no número de animais selecionados e, deste modo, aumenta a intensidade de seleção. Isso ocorre porque várias cópias de uma única fêmea com um escore genômico superior podem ser usadas para produzir todas, ou uma parte maior, do número necessário de novilhas de substituição para a próxima geração (ao contrário de ter que selecionar várias fêmeas diferentes para produzir um número suficiente de substituições). Um aumento na intensidade de seleção resulta em um aumento do progresso genético, todo o resto sendo igual.
[00124] O uso de amniocentese e clonagem em conjunto (cenário 4) resultou no maior aumento no progresso genético. Ver Tabela 1. O uso da clonagem isoladamente (cenário 3) foi superior ao uso da amniocen- tese isoladamente (cenário 2). O menor progresso genético foi obtido quando não usando nem amniocentese nem clonagem (cenário 1).
[00125] O alto número de indivíduos que podem ser testados através dos métodos descritos no Exemplo 3, acima, aumenta a intensidade de seleção quando assumindo que o número de animais selecionados por geração é constante. Outra abordagem para fazer uso dessa alta capacidade de teste é aumentar o número de animais selecionados, mas agrupá-los em duas categorias diferentes: um grupo é usado em um programa de reprodução para gerar touros AI (programa de reprodução = BP). O outro grupo de animais torna-se doador de oóci- tos para a produção in vitro de embriões comerciais de leite que se destinam à transferência para fêmeas em fazendas de produ- ção/comerciais (programa de embriões = EP).
[00126] Número de animais testados através o uso de amniocente- se: 17.244
[00127] EBV médio dos candidatos à seleção: 2.600
[00128] Desvio padrão genético aditivo (CTA): 76
[00129] Número de animais selecionados para o programa de reprodução: 150
[00130] Número de animais selecionados para o programa de embriões: 5.000
[00131] A Figura 1 mostra o intervalo sobre a distribuição dos valores de reprodução em todos os candidatos à seleção. Os animais para o programa de reprodução constituem o 1% superior dos candidatos à seleção termos de EBV, enquanto os do programa embrião constituem os próximos 29% dos candidatos à seleção em termos de EBV. Isto leva a dois pontos de truncagem da distribuição. O primeiro define o limite inferior para os animais EP (2.640,15) e o segundo, o EP superior e o limite inferior de BP (2.780,74). Os EBVs médios resultantes nos dois grupos de seleção são 2.684,76 e 2.806,12 para o grupo EP e BP, respectivamente. O uso da amniocentese em conjunto com um programa de produção de embriões para fazendas leiteiras comerciais é, portanto, capaz de fornecer vacas comerciais que excedem o EBV médio dos candidatos à seleção (dados os parâmetros assumidos e o conceito geral do programa). Assume-se que qualquer doador EP selecionado para entregar 200 descendentes através de um programa intensivo de FIV. Os 5.000 animais EP neste exemplo serão, portanto, capazes de gerar 1.000.000 de vacas leiteiras comerciais.
[00132] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe, um versado na técnica compreenderá que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações.
Claims (23)
1. Método para determinar um valor genético genômico estimado (GEB V) ou uma capacidade transmissora genômica predita (GPTA) de um feto de mamífero não humano, caracterizado pelo fato de que compreende: extrair o DNA de uma ou mais amniócitos fetais; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; e determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no genótipo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de isolar uma ou mais amniócitos fetais a partir do líquido amniótico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de clonar o feto utilizando um amniócito fetal.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais amniócitos fetais compreendem células- tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o genótipo é um genótipo de SNP.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o DNA é genotipado utilizando um chip ou matriz de SNP.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de calcular um índice de seleção utilizando o GEBV ou a GPTA.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de verificar a progenitura do feto utilizando o genótipo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o feto de mamífero não humano é um bovídeo.
10. Método para aumentar o progresso genético em uma população de mamíferos não humanos, caracterizado pelo fato de que compreende: extrair o DNA de um ou mais amniócitos derivados de um feto da população; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; selecionar o feto como um progenitor para a população com base no genótipo; e clonar o feto para produzir um clone.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de clonar o feto compreende utilizar um amniócito derivado do feto.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais amniócitos compreendem células- tronco mesenquimais derivadas de líquido amniótico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no genótipo.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o genótipo é um genótipo de SNP.
15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de: fertilizar um oócito a partir do clone com esperma de um macho na população para produzir um embrião; e transferir o embrião para um receptor fêmea para a gestação.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o esperma é esperma classificado por sexo, do qual ao menos 60% é dotado de um cromossomo X.
17. Método para disseminação genética, caracterizado pelo fato de que compreende: extrair o DNA de um ou mais amniócitos derivados de um feto; genotipar o DNA para obter um genótipo para o feto; e selecionar o feto como doador de oócitos para utilização em IVF com base no genótipo.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de: coletar um ou mais oócitos do doador; e fertilizar um ou mais oócitos com esperma classificado por sexo para produzir um ou mais embriões fêmeas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de: transferir um ou mais embriões fêmeas para uma ou mais fêmeas receptoras.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que uma ou mais fêmeas receptoras compreendem animais de produção.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de: produzir uma ou mais novilhas ou vacas a partir de um ou mais embriões fêmeas; e produzir leite a partir de uma ou mais novilhas ou vacas.
22. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de determinar um GEBV ou uma GPTA do feto com base no genótipo.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o genótipo é um genótipo de SNP.
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