BR112017011854B1 - Variante de subtilase, composição detergente a mesma, uso da composição e método para produção de uma variante de subtilase - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE SUBTILASE E POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO AS MESMAS. A presente invenção se relaciona com variantes de subtilase adequadas para uso em, p.ex., composições de limpeza ou detergentes, tais como composições detergentes de lavagem de roupa e composições de lavagem de louça, incluindo composições de lavagem de louça automática. A presente invenção se relaciona também com sequências de DNA isoladas codificando as variantes, vetores de expressão, células hospedeiras, e métodos para produção e uso das variantes da invenção.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[002] A presente invenção se relaciona com variantes de subtilase adequadas para uso em, p.ex., composições de limpeza ou detergentes, tais como composições detergentes de lavagem de roupa e composições de lavagem de louça, incluindo composições de lavagem de louça automática. A presente invenção se relaciona também com sequências de DNA isoladas codificando as variantes, vetores de expressão, células hospedeiras, e métodos para produção e uso das variantes da invenção.

Descrição da Técnica Relacionada

[003] Na indústria dos detergentes, as enzimas têm sido implementadas há muitas décadas em formulações de lavagem. As enzimas usadas em tais formulações compreendem amilases, celulases, lipases, manosidases, e proteases, bem como outras enzimas ou suas misturas. Comercialmente, as enzimas mais importantes são as proteases.

[004] Um número crescente de proteases comercialmente usadas são variantes manipuladas de proteína de proteases de tipo selvagem ocorrendo naturalmente Everlase®, Relase®, Ovozyme®, Polarzyme®, Liquanase®, Liquanase Ultra® e Kannase® (Novozymes A/S), Purafast®, Purafect OXP®, FN3® e FN4® (Genencor International, Inc.). Adicionalmente, um número de variantes de protease é descrito na técnica, tal como WO 91/00345 (Novozymes A/S), e WO 94/23053 (Novozymes A/S) descreve, p.ex., mutações na posição 262. As variantes são adequadas para uso em, p.ex., composições de limpeza ou detergentes.

[005] Um número de variantes de subtilase úteis foi descrito, muitas das quais proporcionaram atividade, estabilidade, e solubilidade melhoradas em diferentes detergentes.

[006] No entanto, vários fatores tornam vantajosa melhoria adicional das proteases. As condições de lavagem tais como temperatura e pH mudam ao longo do tempo e muitas manchas são ainda difíceis de remover completamente sob condições convencionais de lavagem. Adicionalmente, em condições de lavagem podem resultar em inativação das enzimas (devido a, p.ex., pH, temperatura ou instabilidade por quelação) resultando em perda de desempenho de lavagem durante o ciclo de lavagem. Assim, apesar da investigação intensiva no desenvolvimento de proteases, permanece uma necessidade de proteases novas e melhoradas que tenham estabilidade melhorada, em particular em estabilidade na lavagem e/ou estabilidade no armazenamento melhorada, e preferencialmente desempenho de lavagem similar ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora.

Sumário da Invenção

[007] A presente invenção se relaciona com variantes de subtilase tendo atividade de protease e compreendendo as substituições X9E+X206L+X262E, p.ex., S9E+Q206L+L262E, em que as posições correspondem às posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[008] A presente invenção se relaciona com adicionalmente com polinucleotídeos codificando as variantes de subtilase; 3/152 composições, preferencialmente composições detergentes, compreendendo uma variante de subtilase; uso das composições em um processo de limpeza e métodos para obtenção de uma variante de subtilase e para remoção de uma mancha de uma superfície.

Breve Descrição das Figuras

[009] A Figura 1 é um alinhamento das sequências de aminoácidos da subtilisina 309 (SEQ ID NO: 1) e subtilisina BPN' (SEQ ID NO: 2), usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453).

Definições

[0010] O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0011] O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, spliced, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que podem estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo splicing, antes de aparecer como mRNA maduro spliced.

[0012] O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinados por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0013] O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0014] O termo "componente detergente" é definido aqui para significar os tipos de químicos que podem ser usados em composições detergentes. Exemplos de componentes detergentes são tensioativos, hidrótropos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes de branqueamento fluorescentes, perfume, branqueadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, polímeros de libertação da sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, antioxidantes, e solubilizantes. A composição detergente pode compreender um ou mais de qualquer tipo de componente detergente.

[0015] O termo "composição detergente" inclui, a não ser que de outro modo indicado, todas as formas de composições detergentes tais como composições em gel, granuladas, líquidas, em pasta, em pó, pulverização ou comprimidos incluindo líquidos para trabalhos pesados (HDL), detergentes líquidos para tecidos sensíveis, detergentes líquidos e/ou sólidos para lavagem de roupa e detergentes para tecidos sensíveis; formulações para limpeza de superfícies duras para, p.ex., balcões e janelas de vidro, madeira, cerâmica e metal; produtos de limpeza para carpetes; produtos de limpeza para fornos; perfumadores de tecidos; amaciadores de tecidos; produtos de pré-tratamento de têxteis e lavagem de roupa, bem como detergentes para lavagem de louça tais como agentes para lavagem manual de louça, agentes de lavagem de louça para trabalhos leves, agentes para lavagem de louça à máquina; agentes de lavagem polivalentes ou para trabalhos pesados, agentes de lavagem polivalentes líquidos, em forma de gel ou pasta, agentes líquidos de limpeza e desinfetantes, incluindo tipos antibacterianos de lavagem manual, barras de limpeza, elixires bucais, produtos de limpeza de dentaduras, xampus para carros ou carpetes, produtos de limpeza sanitária; xampus para o cabelo e para lavagem dos cabelos; géis de banho, espumas para banho; produtos de limpeza de metais; bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de lixiviação e os tipos "tira-manchas" ou pré-tratamento.

[0016] Adicionalmente a conter uma variante de subtilase da invenção, a formulação detergente pode conter uma ou mais enzimas adicionais (tais como amilases, catalases, celulase (p.ex., endoglucanases), cutinases, haloperoxigenases, lipases, mananases, pectinases, pectina liases, peroxidases, proteases, xantanases, e xiloglucanases, ou qualquer sua mistura), e/ou componentes tais como tensioativos, adjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, corantes, perfume, inibidores do acastanhamento, branqueadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, agentes anticorrosão, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, transferase(s), enzimas hidrolíticas, oxidorreductases, agentes de azulamento e corantes fluorescentes, antioxidantes, e solubilizantes.

[0017] O termo "lavagem de louça" se refere a todas as formas de lavagem de louça, p.ex., lavagem de louça à mão ou automática. Lavagem de louça inclui a, mas não está limitada à, limpeza de todas as faianças de barro tais como pratos, taças, copos, tigelas, todas as formas de talheres tais como colheres, facas, garfos e utensílios de cozinha bem como cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos.

[0018] O termo "composição de lavagem de louça" se refere a todas as formas de composições para limpeza de superfícies duras. A presente invenção não está restrita a qualquer tipo particular de composição de lavagem de louça ou qualquer detergente particular.

[0019] O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-translacional, e secreção.

[0020] O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0021] O termo "limpeza de superfícies duras" é definido aqui como limpeza de superfícies duras em que as superfícies duras podem incluir pisos, mesas, paredes, tetos, etc., bem como superfícies de objetos duros tais como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça). Lavagem de louça inclui mas não está limitada a limpeza de pratos, taças, copos, tigelas, e talheres tais como colheres, facas, garfos, utensílios de cozinha, cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos.

[0022] O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0023] O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada a uma variante de subtilase que é melhorada em comparação com a subtilase progenitora. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitadas a, desempenho de lavagem, atividade de protease, perfil de atividade térmica, termoestabilidade, perfil de atividade por pH, estabilidade a pH, especificidade substrato/cofator, propriedades de superfície melhoradas, especificidade quanto 8/152 ao substrato, especificidade quanto ao produto, estabilidade aumentada, estabilidade melhorada sob condições de armazenamento, e estabilidade química.

[0024] O termo "estabilidade" inclui estabilidade no armazenamento e estabilidade durante o uso, p.ex., durante um processo de lavagem e reflete a estabilidade da variante de subtilase de acordo com a invenção como uma função do tempo, p.ex., quanta atividade é retida quando a variante de subtilase é mantida em solução em particular em uma solução detergente. A estabilidade é influenciada por muitos fatores, p.ex., pH, temperatura, composição detergente, p.ex., quantidade de adjuvante, tensioativos, etc. O termo "estabilidade melhorada" ou "estabilidade aumentada” é definido aqui como uma subtilase variante exibindo uma estabilidade aumentada em solução, em relação à estabilidade da subtilase progenitora. Os termos "estabilidade melhorada" e "estabilidade aumentada" incluem "estabilidade química melhorada", "estabilidade em detergente" ou "estabilidade em detergente melhorada".

[0025] O termo "estabilidade química melhorada" é definido aqui como uma subtilase variante exibindo retenção de atividade enzimática após um período de incubação na presença de um químico ou químicos, ocorrendo naturalmente ou sintéticos, que reduz a atividade enzimática da enzima progenitora. A estabilidade química melhorada pode também resultar em que as variantes sejam mais capazes de catalisar uma reação na presença de tais químicos. Em um aspecto particular da invenção, a estabilidade química melhorada é uma estabilidade melhorada em um detergente, em particular em um detergente líquido. O termo "estabilidade em detergente" ou "estabilidade em detergente melhorada" é em particular uma estabilidade melhorada da atividade de protease quando uma variante de 9/152 subtilase da presente invenção é misturada em uma formulação detergente líquida, e depois armazenada a temperatura entre 15 e 50 °C, p.ex., 20 °C, 30 °C ou 40 °C.

[0026] O termo "atividade térmica melhorada" significa uma variante exibindo um perfil de atividade dependente da temperatura alterado a uma temperatura específica em relação ao perfil de atividade dependente da temperatura do progenitor. O valor da atividade térmica proporciona uma medida da eficácia da variante na intensificação da catálise de uma reação de hidrólise ao longo de uma gama de temperaturas. Uma variante mais termoativa levará a um aumento na intensificação da taxa de hidrólise de um substrato por uma composição de enzimas diminuindo deste modo o tempo requerido e/ou diminuindo a concentração de enzima requerida para a atividade. Alternativamente, uma variante com uma atividade térmica reduzida intensificará uma reação enzimática a uma temperatura menor do que a temperatura ótima do progenitor definida pelo perfil de atividade dependente da temperatura do progenitor.

[0027] O termo "desempenho de lavagem melhorado" é definido aqui como uma variante de subtilase de acordo com a invenção exibindo um desempenho de lavagem melhorado em relação ao desempenho de lavagem da protease progenitora, p.ex., por remoção de manchas aumentada. O termo "desempenho de lavagem" inclui desempenho de lavagem na lavagem de roupa mas também, p.ex., na lavagem de louça. O desempenho de lavagem pode ser quantificado como descrito sob a definição de "desempenho de lavagem" aqui.

[0028] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0029] O termo "lavagem de roupa" se relaciona tanto com a lavagem de roupa doméstica como com a lavagem de roupa industrial e significa um processo de tratamento de têxteis e/ou tecidos com uma solução contendo uma composição detergente da presente invenção. O processo de lavagem de roupa pode por exemplo ser levado a cabo usando, p.ex., uma máquina de lavar doméstica ou industrial ou pode ser levado a cabo manualmente.

[0030] O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N- terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, ativação autocatalítica, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID NO: 1 e 1 a 275 de SEQ ID NO: 2. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[0031] O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de protease.

[0032] O termo "mutante" significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0033] O termo "constructo de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0034] O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0035] O termo "progenitor" significa uma protease à qual é efetuada uma alteração para produzir as variantes de enzimas da presente invenção. Será entendido que no presente contexto a expressão "tendo sequência de aminoácidos idêntica" se relaciona com 100% de identidade de sequências. Em uma modalidade particular, a progenitora é uma protease com pelo menos 60% de identidade, tal como pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade com um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

[0036] O termo "protease" é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo. O termo inclui qualquer enzima pertencente ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das suas treze subclasses). O número EC se refere à Enzyme Nomenclature 1992 deNC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem. 1223: 1-5 (1994); Eur. J. Biochem. 232: 1-6 (1995); Eur. J. Biochem. 237: 1-5 (1996); Eur. J. Biochem. 250: 1-6 (1997); e Eur. J. Biochem. 264: 610-650 (1999); respectivamente. As proteases mais amplamente usadas na indústria dos detergentes tal como lavagem de roupa e louça são as serina proteases ou serina peptidases que são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no local ativo, que forma um aducto covalente com o substrato. Adicionalmente, as subtilases (e as serina proteases) são caracterizadas por terem dois resíduos de aminoácidos de local ativo separados da serina, nomeadamente um resíduo de histidina e um resíduo de ácido aspártico. Subtilase se refere a um subgrupo de serina proteases de acordo com Siezen et al., 1991, Protein Engng. 4: 719-737 e Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, i.e., a família das Subtilisinas, a família das Termitases, a família das Proteinases K, a família das Peptidases lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas. O termo "atividade de protease" significa uma atividade proteolítica (EC 3.4). As proteases usáveis em detergentes são principalmente endopeptidases (EC 3.4.21). Existem vários tipos de atividade de protease: Os três principais tipos de atividade são: tipo tripsina onde existe clivagem de substratos de amida após Arg ou Lys em P1, tipo quimotripsina onde ocorre clivagem após um dos aminoácidos hidrofóbicos em P1, e tipo elastase com clivagem após uma Ala em P1. Para propósitos da presente invenção, a atividade de protease é determinada de acordo com o ensaio de atividade de Suc-AAPF-pNA, como descrito na seção de Materiais e Métodos em baixo. Em um aspecto, as variantes de subtilase da presente invenção têm pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de enzima do polipeptídeo maduro da enzima progenitora. Em um aspecto particular, as variantes de subtilase da presente invenção têm pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 100% da atividade de enzima de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

[0037] O termo "atividade de protease" significa uma atividade proteolítica (EC 3.4). As proteases da invenção são endopeptidases (EC 3.4.21). Existem vários tipos de atividade de protease: Os três principais tipos de atividade são: tipo tripsina onde existe clivagem de substratos de amida após Arg ou Lys em P1, tipo quimotripsina onde ocorre clivagem após um dos aminoácidos hidrofóbicos em P1, e tipo elastase com clivagem após uma Ala em P1. Para propósitos da presente invenção, a atividade de protease é determinada de acordo com o procedimento descrito em "Materiais e Métodos" em baixo. As variantes de subtilase da presente invenção têm preferencialmente pelo menos 20%, p.ex., pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, e pelo menos 100% da atividade de protease de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11.

[0038] A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequências". Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0039] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento).

[0040] As diferentes condições de estringência são definidas como se segue.

[0041] O termo "condições de muito baixa estringência" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0042] O termo "condições de baixa estringência" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência de Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 1X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0043] O termo "condições de média estringência" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 1x SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0044] O termo "condições de estringência média-elevada" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 0,5X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0045] O termo "condições de elevada estringência" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 0,3X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0046] O termo "condições de muito elevada estringência" significa para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos padrão de transferência Southern durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 0,15X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0047] O termo "variante substancialmente pura" significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Preferencialmente, a variante é pelo menos 92% pura, p.ex., pelo menos 94% pura, pelo menos 95% pura, pelo menos 96% pura, pelo menos 97% pura, pelo menos 98% pura, pelo menos 99% pura, pelo menos 99,5% pura, e 100% pura em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. As variantes da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por preparação da variante por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.

[0048] O termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeos isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptídeos geneticamente manipulados. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1%, e no máximo 0,5% em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não traduzidas ocorrendo naturalmente, tais como promotores e terminadores. É preferencial que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, p.ex., pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, e pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura.

[0049] O termo "têxtil" significa qualquer material têxtil incluindo fios, intermediários de fios, fibras, materiais não urdidos, materiais naturais, materiais sintéticos, bem como tecidos feitos destes materiais tais como peças de vestuário, roupas e outros artigos. Quando o termo tecido ou peças de 18/152 vestuário é usado se destina a incluir também o termo mais amplo têxteis.

[0050] O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de protease compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em três ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos adjacentes e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição. O termo variante de subtilase significa uma variante de um progenitor de subtilase, i.e., uma variante de subtilase e é uma subtilase que compreende alterações i.e., uma substituição, inserção e/ou deleção, em três ou mais (p.ex., várias) posições em comparação com a subtilase progenitora.

[0051] O termo "desempenho de lavagem" é usado como a capacidade de uma enzima de remover manchas presentes no objeto a ser limpo durante, p.ex., lavagem, tal como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras. A melhoria no desempenho de lavagem pode ser quantificada calculando o assim chamado valor de intensidade (Int) definido no ensaio AMSA, como descrito no Exemplo 3.

[0052] O termo "subtilase de tipo selvagem" significa uma protease expressa por um organismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, arqueobactéria, levedura, fungo, planta ou animal encontrado na natureza. Um exemplo de uma subtilase de tipo selvagem é subtilisina BPN’, i.e., aminoácidos 1 a 275 de SEQ ID NO: 2.

Convenções para Designação de Variantes

[0053] Para propósitos da presente invenção, a subtilisina BPN’ (a sequência de aminoácidos 1-275 de SEQ ID NO: 2 (Siezen et al., 1991, Protein Eng. 4: 719-737)) é usada para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra protease. A sequência de aminoácidos de outra protease é alinhada com o polipeptídeo maduro divulgado em SEQ ID NO: 2, e, com base no alinhamento, o número de posição de aminoácidos correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo divulgado em SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[0054] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra protease pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expetativa log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26:1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando os seus respectivos parâmetros padrão.

[0055] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613 a 615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequências par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 33893402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[0056] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e são descarregáveis. Duas ou mais estruturas de proteínas podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tal como a matriz de alinhamento por distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e a implementação destes algoritmos pode ser adicionalmente utilizada para questionar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0057] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[0058] Substituições: Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como "Thr226Ala" ou "T226A". Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Gly205Arg + Ser411Phe" ou "G205R + S411F", representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente. Um "X" precedendo uma posição significa que qualquer aminoácido original na posição pode estar substituído. Por exemplo, X9E significa que qualquer resíduo de aminoácido na posição 9 sem ser E está substituído por E; X206L significa que qualquer resíduo de aminoácido na posição 206 sem ser L está substituído por L; e X262E significa que qualquer resíduo de aminoácido na posição 262 sem ser E está substituído por E.

[0059] Deleções: Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Gly195* + Ser411*" ou "G195* + S411*".

[0060] Inserções: A inserção de um resíduo de aminoácido adicional tal como, p.ex., uma lisina após G195, pode ser indicada por: Gly195GlyLys ou G195GK. Alternativamente, a inserção de um resíduo de aminoácido adicional como lisina após G195 pode ser indicada por: *195aK. Quando é inserido mais do que um resíduo de aminoácido, tal como, p.ex., um Lys, e Ala após G195, isto pode ser indicado como: Gly195GlyLysAla ou G195GKA. Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s) pode(m) ser também numerado(s) pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s), em este exemplo: *195aK *195bA. No exemplo acima, as sequências 194 a 196 seriam então: 194 195 196 Subtilisina 309 A - G - L 194 195 195a 195b 196 Variante A - G - K - A - L

[0061] Em casos onde uma substituição e uma inserção ocorrem na mesma posição, isto pode ser indicado como S99SD+S99A ou em abreviatura S99AD. A mesma modificação pode ser também indicada como S99A + *99aD.

[0062] Em casos onde um resíduo de aminoácido idêntico ao resíduo de aminoácido existente é inserido é óbvio que surge degenerescência na nomenclatura. Se por exemplo uma glicina for inserida após a glicina no exemplo acima, isto seria indicado por G195GG ou *195GaG. A mesma alteração real poderia do mesmo modo ser indicada como A194AG ou *194aG para a alteração de: 194 195 196 Subtilisina 309 A - G - L para: 194 195 195a 196 Variante A - G - G - L 194 194a 195 196

[0063] Tais casos serão aparentes para a pessoa perita na técnica e a indicação G195GG e indicações correspondentes para este tipo de inserções se destinam assim a compreender tais indicações degeneradas equivalentes.

[0064] Alterações múltiplas: Variantes compreendendo múltiplas alterações são separadas por sinais de adição ("+"), p.ex., "Arg170Tyr+Gly195Glu" ou "R170Y+G195E" representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente. Alternativamente, múltiplas alterações podem ser separadas por um espaço ou uma vírgula, por exemplo, A170Y G195E ou A170Y, G195E respectivamente.

[0065] Alterações diferentes: Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, p.ex., "Arg170Tyr,Glu" representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

[0066] Alternativamente, diferentes alterações ou substituições opcionais podem ser indicadas entre parênteses, p.ex., Arg170[Tyr, Glu] ou Arg170{Tyr, Glu} ou abreviado R170 [Y,G] ou R170 {Y,G}.

Descrição Detalhada da Invenção

[0067] A presente invenção se relaciona com variantes de subtilase tendo atividade de protease e compreendendo as substituições X9E+X206L+X262E, p.ex., S9E+Q206L+L262E, em que as posições correspondem às posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[0068] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade no armazenamento melhorada, em comparação com a subtilase progenitora. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade no armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora.

[0069] Em outra modalidade, a variante de subtilase é a) um polipeptídeo que tem pelo menos 60% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da subtilase progenitora; b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com: (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora ou (ii) o complemento de comprimento total de (i); ou c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro da subtilase progenitora.

[0070] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 65% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 70% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 75% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 80% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 85% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 90% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 93% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 95% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 96% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 97% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora. Em uma modalidade, a variante de subtilase tem pelo menos 98% mas menos do que 100% de identidade de sequências com a subtilase progenitora.

[0071] Em uma modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 1, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0072] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 2, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0073] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 3, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0074] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 4, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[0075] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 5, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0076] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 6, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[0077] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 7, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[0078] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 8, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0079] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 9, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[0080] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 10, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0081] Em outra modalidade, a variante tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica com SEQ ID NO: 11, p.ex., pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0082] Em um aspecto, o número total de alterações na subtilase progenitora é entre 3 e 30, preferencialmente entre 3 e 20, mais preferencialmente entre 3 e 15, ainda mais preferencialmente entre 3 e 10, o mais preferencialmente entre 3 e 8 alterações. Em outro aspecto, o número total de alterações na subtilase progenitora é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 alterações.

[0083] As variantes de subtilase da presente invenção podem adicionalmente compreender uma ou mais alterações adicionais. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0084] Exemplos de substituições conservativas são dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0085] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0086] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. Para BPN' (SEQ ID NO: 2), a tríade catalítica compreendendo os aminoácidos S221, H64 e D32 é essencial para a atividade de protease da enzima.

[0087] Em uma modalidade, a variante de subtilase compreende X9E+X206L+X262E e compreende adicionalmente X76D (p.ex., N76D).

[0088] Em uma modalidade de qualquer uma das modalidades acima, a variante de subtilase compreende adicionalmente X9E+X206L+X262E e uma ou mais alterações selecionadas do grupo consistindo em X3T (p.ex. S3T), X4I (p.ex. V4I), X15T (p.ex. A15T), X24G (p.ex. S24G), X24R (p.ex. S24R), X27R (p.ex. K27R), *36D, X43A (p.ex. N43A), X43C (p.ex. N43C), X43L (p.ex. N43L), X43R (p.ex. N43R), X43W (p.ex. N43W), X68A (p.ex. V68A), X72A (p.ex. I72A), X72V (p.ex. I72V), X78D (p.ex. S78D), X87R (p.ex. N87R), X87S (p.ex. N87S), *97E, X98S (p.ex. A98S), X99A (p.ex. S99A), X99D (p.ex. S9 X99E (p.ex. S99E), S101D), X101E (p.ex. S101I), X101K (p.ex. S101M), X101N (p.ex. S103A), X104F (p.ex. V104N), X104Y (p.ex. A114V), X115T (p.ex. G118R), X118V (p.ex. H120I), X120N (p.ex. H120V), X123S (p.ex. S128L), X128S (p.ex. P129N), X129Q (p.ex. V147W), X149C (p.ex. , X99D (p.ex. S99D), *99D, X101D (p.ex. S101G), X101I (p.ex. S101L), X101M (p.ex. S101R), X103A (p.ex. V104I), X104N (p.ex. S106A), X114V (p.ex. G115W), X118R (p.ex. H120D), X120I (p.ex. H120T), X120V (p.ex. S128A), X128L (p.ex. P129D), X129N (p.ex. S130A), X147W (p.ex. V149N), X158E (p.ex. A158E), X160D (p.ex. S161C), X161E (p.ex. S163A), X163D (p.ex. R170S), X182C (p.ex. N185C), X185E (p.ex. S188D), X188E (p.ex. A194P), X195E (p.ex. N204D), X204V (p.ex. Y209W), X212A (p.ex. S212G), X212N (p.ex. S216T), X216V (p.ex. L217D), X217E (p.ex. L217Q), X217Y (p.ex. N218E), X218T (p.ex. M222R), X222S (p.ex. A232V), X235L (p.ex. Q245K), X245R (p.ex. T255C), X255E (p.ex. S256C), X256D (p.ex. S256Y), X259D (p.ex. T260P), X261C (p.ex. N261F), X261L (p.ex. G160D, X160P (p.ex. S161E), X162L (p.ex. S163D), X167A (p.ex. Q182C), X182E (p.ex. N185E), X188C (p.ex. S188E), X191N (p.ex. G195E), X199M (p.ex. N204V), X205I (p.ex. S212A), X212D (p.ex. S212N), X216I (p.ex. S216V), X217C (p.ex. L217E), X217M (p.ex. L217Y), X218D (p.ex. N218T), X222C (p.ex. M222S), X225A (p.ex. K235L), X236H (p.ex. Q245R), X252K (p.ex. T255E), X256A (p.ex. S256D), X256V (p.ex. S259D), X260E (p.ex. N261C), X261E (p.ex. N261L), X261M (p.ex. G160P), X161C (p.ex I162L), X163A (p.ex Y167A), X170S (p.ex Q182E), X185C (p.ex S188C), X188D (p.ex Q191N), X194P (p.ex V199M), X204D (p.ex V205I), X209W (p.ex S212D), X212G (p.ex S216I), X216T (p.ex L217C), X217D (p.ex L217M), X217Q (p.ex N218D), X218E (p.ex M222C), X222R (p.ex P225A), X232V (p.ex Q236H), X245K (p.ex N252K), X255C (p.ex S256A), X256C (p.ex S256V), X256Y (p.ex T260E), X260P (p.ex N261E), X261F (p.ex N261M), X261V (p.ex N261V), X261W (p.ex. N261W), X261Y (p.ex. N261Y), e X274A (p.ex. T274A), em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[0089] A invenção se relaciona com variantes de subtilase, preferencialmente variantes de subtilase de um progenitor de protease tendo pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, em que as variantes de subtilase em comparação com SEQ ID NO: 1 compreendem as substituições X9E+X206L+X262E, p.ex., S9E+Q206L+L262E, em que as posições correspondem às posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Como mencionado, SEQ ID NO: 2 é usado para numeração de um alinhamento poderia ser encontrado na Fig. 1 e a pessoa perita pode facilmente alinhar outro progenitor de subtilase sem ser SEQ ID NO: 1 e encontrar os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NO: 2.

[0090] Os inventores descobriram que a substituição de três vezes X9E+X206L+X262E proporciona estabilidade aumentada a uma subtilase. Assim, uma modalidade da invenção se relaciona com variantes de subtilase que em comparação com a subtilase progenitora e/ou em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1 compreendem as três mutações X9E+X206L+X262E (numeradas de acordo com SEQ ID NO: 2) e que têm estabilidade aumentada em um detergente em comparação com a subtilase progenitora, p.ex., em comparação com SEQ ID NO: 1. Uma modalidade preferencial particular se relaciona com variantes de subtilase compreendendo, em comparação com SEQ ID NO: 1, as substituições X9E+X206L+X262E (numeradas de acordo com SEQ ID NO 2) e tendo pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160%, pelo menos 170% de atividade residual mais elevada do que a subtilase progenitora e/ou uma subtilase com SEQ ID NO: 1 quando medida após 47 horas a 60 °C em detergente líquido com pH 8, como descrito no Exemplo 4 e 5 do pedido. Outra modalidade preferencial se relaciona com variantes de subtilase compreendendo, em comparação com SEQ ID NO: 1, as substituições X9E+X206L+X262E (numeradas de acordo com SEQ ID NO: 2) que têm fatores de melhoria de meia-vida t^ em relação ao progenitor ou em relação com SEQ ID NO: 1 (subtilisina 309) que são maiores do que 1 e preferencialmente pelo menos 2, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 600, pelo menos 800, pelo menos 1000, pelo menos 1500, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 3500, pelo menos 4000, pelo menos 4500, pelo menos 5000, pelo menos 5500, pelo menos 6000, pelo menos 6500, pelo menos 7000, pelo menos 7500, pelo menos 8000, pelo menos 8500, pelo menos 9000, pelo menos 9500 ou pelo menos 10000 ou mais. O cálculo de fatores de melhoria de meia-vida t^ é descrito no Exemplo 4 do pedido.

[0091] Outra modalidade preferencial se relaciona com variantes de subtilase compreendendo, em comparação com SEQ ID NO: 1, as substituições X9E+X206L+X262E (numeradas de acordo com SEQ ID NO: 2), em que as variantes de subtilase têm pelo menos 10% mais, tal como pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de atividade residual em comparação com o progenitor ou em comparação com SEQ ID NO 1. O cálculo da atividade residual ou t^ é descrito no exemplo 4 aqui.

[0092] Em outra modalidade da invenção preferencial, a invenção se relaciona com variantes de subtilase que em comparação com a subtilase progenitora e/ou em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1 compreendem as três mutações X9E+X206L+X262E (numeradas de acordo com SEQ ID NO: 2) e que têm estabilidade aumentada em um detergente em comparação com a subtilase progenitora, p.ex., em comparação com SEQ ID NO: 1 e que têm desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora, p.ex., em comparação com SEQ ID NO: 1. As variantes da invenção podem compreender mutações intensificadoras da estabilização e/ou desempenho adicionais tais como N43R, G61E, N76D, S161E, G160D, G160P, S161E, N182E, N185E, S188E, A194P, N204D, V205I, Y209W, ou S212G. Em uma modalidade e de acordo com qualquer uma das modalidades acima, uma variante da invenção compreende as seguintes substituições em comparação com SEQ ID NO 1; S9E+Q206L+L262E, S9E+N76D+Q206L+L262E, S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E, S9E+N43R+N76D+Q206L+L262E, S9E+N43R+N76D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+Q206L+Y209W+S212G+L262E, S9E+N76D+Q206L+V205I+Y209W+L262E, S9E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+S188E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+N185E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+N182E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+S161E+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+G160P+Q206L+Y209W+L262E, S9E+N76D+G160D+Q206L+Y209W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E ou S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+L262E, em que as variantes têm estabilidade melhorada em comparação com a protease com SEQ ID NO 1.

[0093] De acordo com uma modalidade e/ou qualquer uma das modalidades acima, a variante de subtilase da invenção é selecionada do grupo consistindo em: S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+ *275aH+ *275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+ L262E; S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+ N261W+ L262E; S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E +*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E+ *275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S259D+ N261W+L262E; 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S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ T255E+ S256D+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ S259D+T260E+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ T260A+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ T260A+L262E+*275aR; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S259D+ N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ T260A+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+ S259D+ N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+ N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+ N261W+ L262E+*275aH+*275bH; S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V +S256D+ N261W+L262E; S9E+N43R+G61E+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+M222S+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E; S9E+N18S+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L 262E; S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+ N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N76D+G115W+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+T260E +N261W+ L262E S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+Q206L+S256D+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+H120T+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N76D+G160P+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E ; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E; S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+S259D+N261W+L262E+ *275aH; S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E; S9E+N43R+N76D+N185E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+N261M+L262E; S9E+N43R+I72A+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+ S259D+ N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+ N261W+ L262E+*275aH+*275bH; S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V + S256D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+ Y209W+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+ N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E ; S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D +L262E S9E N43R N76D N185E S188E Q191N A194P Q206L Y209W S259D L262E S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E+*275bH+*275 aH; S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+ Y209W+S212G+S216V; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275b H; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E; S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+ *275aH+ *275bH; S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275b H; S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E; S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH; S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+ L262E; S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+ *275aR; S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E; S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E; S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275b H; S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E; S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH; S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E; S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E; S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E; S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH; S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E; S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E; and S9E+N76D+Q206L+L262E.

[0094] Variantes preferenciais incluem as variantes compreendendo as seguintes mutações em comparação com SEQ ID NO 1 (numeradas de acordo com SEQ ID NO 2): S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E; S9E+N43R+ N76D+V205I+ Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E ;S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+N261 W+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D +L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E ; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E +*275bH+*275aH; S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W +S259D+ L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W +S212G+ S216V+L262E; S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W +S212G+ S216V+L262E+*275bH+*275aH; S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L +Y209W+ S212G+S216V+L262E+*275bH *275aH; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D +N261W+ L262E; S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W +L262E; S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W +L262E+ *275aH+*275bH ou S3V+N76D+H120V+Q182E+N185E+S188E+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S256 D+N261W+ L262E.

[0095] As variantes de subtilase podem consistir em 150 a 350, p.ex., 175 a 330, 200 a 310, 220 a 300, 240 a 290, 260 a 280 ou 269, 270, 271, 272, 273, 274 ou 275 aminoácidos.

[0096] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade no armazenamento melhorada, em comparação com a subtilase progenitora. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade no armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora.

[0097] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade na lavagem melhorada, em comparação com a subtilase progenitora. Em uma modalidade preferencial, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade no armazenamento melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora.

[0098] Em uma modalidade, a variante de subtilase tem estabilidade melhorada, em particular estabilidade na lavagem melhorada, e desempenho de lavagem equivalente ou melhorado em comparação com a subtilase progenitora em que a estabilidade na lavagem é medida usando o "ensaio de estabilidade na lavagem" e o desempenho de lavagem é medido usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA) como descrito no Exemplo 3.

Protease progenitora

[0099] O progenitor ou a protease precursora pode ser qualquer subtilase ou ainda mais preferencial qualquer subtilisina como definida em baixo.

[00100] As enzimas clivando as ligações de amida em substratos de proteínas são classificadas como proteases, ou (indistintamente) peptidases (ver Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3).

Serina proteases

[00101] Uma serina protease é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações de peptídeo, e na qual existe um resíduo de resina essencial no local ativo (White, Handler e Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Quinta Edição, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272).

[00102] As serina proteases bacterianas têm pesos moleculares na gama de 20.000 a 45.000 Dalton. São inibidas por fluorofosfato de di-isopropila. Hidrolisam ésteres terminais simples e têm atividade similar à quimotripsina eucariótica, também uma serina protease. Um termo mais limitado, protease alcalina, abrangendo um subgrupo, reflete o elevado pH ótimo de algumas das serina proteases, de pH 9,0 52/152 a 11,0 (para revisão ver Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711-753).

Subtilases

[00103] Um subgrupo das serinas proteases provisoriamente designado subtilases foi proposto por Siezen et al., 1991, Protein Eng. 4:719-737 e Siezen et al., 1997, Protein Science 6:501-523. São definidas por análise de homologia de mais do que 170 sequências de aminoácidos de serina proteases previamente referidas como proteases do tipo subtilisina. Uma subtilisina foi previamente frequentemente definida como uma serina protease produzida por bactérias Gram-positivas ou fungos, e de acordo com Siezen et al. é agora um subgrupo de subtilases. Foi identificada uma ampla variedade de subtilases, e foi determinada a sequência de aminoácidos de um número de subtilases. Para uma descrição mais detalhada de tais subtilases e suas sequências de aminoácidos é feita referência a Siezen et al. (1997).

Subtilisinas

[00104] Um subgrupo de subtilases é subtilisinas que são serina proteases da família S8, em particular da subfamília S8A, como definido pela base de dados MEROPS (merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=S8).

[00105] Subtilisina BPN' e subtilisina 309 têm os números MEROPS S08.034 e S08.003, respectivamente.

Subtilase progenitora

[00106] O termo “subtilase progenitora” descreve uma subtilase definida de acordo com Siezen et al., 1997, Protein Science 6: 501-523. Para detalhes adicionais ver descrição de "Subtilases" acima. Uma subtilase progenitora pode ser também uma subtilase isolada de uma fonte natural, em que foram efetuadas modificações subsequentes (tais como troca(s) da(s) cadeia(s) lateral(ais) de aminoácidos, substituição(ões), deleção(ões) e/ou inserção(ões)) enquanto retém a característica de uma subtilase. Além do mais, uma subtilase progenitora pode ser uma subtilase que foi preparada pela técnica de embaralhamento de DNA, tal como descrito por Ness et al., 1999, Nature Biotechnology, 17: 893-896.

[00107] Alternativamente, o termo "subtilase progenitora" pode ser denominado "subtilase precursora" e é usado para descrever a protease inicial na qual são efetuadas mutações para se obter a variante da invenção. A subtilase progenitora é preferencialmente dos subgrupos subtilisina.

[00108] Um subgrupo das subtilases, I-S1 ou subtilisinas "verdadeiras", inclui as subtilisinas "clássicas", tais como subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, Novozymes A/S) e subtilisina DY (BSSDY). BPN’ é a subtilisina BPN’ de B. amyloliquefaciens, a Subtilisina BPN’ tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Um subgrupo adicional das subtilases, I-S2 ou subtilisinas altamente alcalinas, é reconhecido por Siezen et al. (supra). As proteases de subgrupo I-S2 são descritas como subtilisinas altamente alcalinas e incluem enzimas tais como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, Novozymes A/S), elastase alcalina YaB (BSEYAB) e subtilisina 309 (SAVINASE®, Novozymes A/S) tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

[00109] Para referência, a Tabela 1 em baixo dá uma lista de alguns acrônimos para várias subtilases mencionadas aqui. Para acrônimos adicionais ver Siezen et al. (1991 e 1997). Tabela 1: Acrônimos de várias subtilases

Sequências de subtilases homólogas

[00110] A homologia entre duas sequências de aminoácidos é neste contexto descrita pelo parâmetro "identidade" para propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch como descrito acima. O resultado da rotina é para além do alinhamento de aminoácidos o cálculo da "Percentagem de Identidade" entre as duas sequências.

[00111] Com base nesta descrição é rotineiro para a pessoa perita na técnica identificar subtilases homólogas adequadas, que podem ser modificadas de acordo com a invenção.

[00112] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00113] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[00114] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 3, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[00115] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 4, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 4. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[00116] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[00117] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 6, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 6. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[00118] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 7, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 7. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

[00119] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 8. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[00120] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 9, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 9. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

[00121] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 10, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 10. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[00122] A protease progenitora pode ser um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequências com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 11, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de protease. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do progenitor difere em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo de SEQ ID NO: 11. Em outro aspecto, o progenitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[00123] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00124] A subtilase progenitora pode ser obtida de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de” como usado aqui em conexão com uma dada fonte deverá significar que o progenitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o progenitor é secretado extracelularmente.

[00125] O progenitor pode ser uma protease bacteriana. Por exemplo, o progenitor pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram- positivo tal como uma protease de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo tal como uma protease de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[00126] Em um aspecto, o progenitor é uma protease de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[00127] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00128] O progenitor pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um progenitor pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um progenitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Preparação de Variantes

[00129] A presente invenção se relaciona também com métodos para obtenção de uma variante de subtilase tendo atividade de protease, compreendendo: a) ) introdução em uma subtilase progenitora das substituições X9E+X206L+X262E, em que a posição corresponde à posição de SEQ ID NO: 2, e b) recuperação da variante.

[00130] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de genes sintética, construção de genes semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[00131] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (p.ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando o progenitor.

[00132] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando o progenitor e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades coesivas do plasmídeo e da inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex., Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[00133] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., US 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[00134] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio-dirigida na presente invenção. Existem muitos estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[00135] A construção de genes sintética implica a síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo designada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de genes pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tais como a tecnologia à base de microchip em multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[00136] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese dirigida por região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00137] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com elevado rendimento, métodos de rastreio automatizados para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[00138] A construção de genes semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de genes sintética e/ou mutagênese sítio-dirigida e/ou mutagênese aleatória e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto ainda outras regiões podem estar sujeitas à amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. As subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas.

Polinucleotídeos

[00139] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando uma variante da presente invenção.

Constructos de Ácido Nucleico

[00140] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00141] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade para proporcionar a expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[00142] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle da transcrição que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade de transcrição na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[00143] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, operon trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[00144] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[00145] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[00146] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00147] Exemplos de regiões estabilizantes de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[00148] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura da tradução com o segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de peptídeo sinal que é estranha para a sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida quando a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[00149] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa- amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109137.

[00150] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró- peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00151] Onde estiverem presentes ambas as sequências de peptídeo sinal e pró-peptídeo, a sequência do pró-peptídeo é posicionada próxima do terminal N da variante e a sequência do peptídeo sinal é posicionada próxima do terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[00152] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp.

Vetores de Expressão

[00153] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[00154] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa resultar em expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00155] O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que quando introduzido na célula hospedeira seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(ais) o mesmo foi integrado. Adicionalmente pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.

[00156] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene o produto do qual proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[00157] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou de Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tais como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina.

[00158] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

[00159] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização específica, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequências com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem consistir em qualquer sequência que seja homóloga à sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode 70/152 ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00160] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo que medeie a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00161] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 que permitem replicação em E. coli e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl que permitem replicação em Bacillus.

[00162] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00163] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[00164] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um constructo ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o constructo ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene codificando a variante e sua fonte.

[00165] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00166] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram- positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00167] A célula bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis.

[00168] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00169] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitando a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00170] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação de protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 35833585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

Métodos de Produção

[00171] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivo de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

[00172] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais 74/152 ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisados celulares.

[00173] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes com atividade de protease. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzimas para se determinar a atividade da variante.

[00174] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

[00175] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para se obterem variantes substancialmente puras.

[00176] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante.

Composições

[00177] A presente invenção se relaciona também com uma composição compreendendo uma variante de subtilase da presente invenção. Em uma modalidade, a composição é uma composição detergente.

[00178] A escolha de componentes adicionais está dentro da perícia do especialista e inclui ingredientes convencionais, incluindo os componentes não limitantes exemplificativos apresentados em baixo. A escolha de componentes pode incluir, para cuidado dos tecidos, a consideração do tipo de tecido a ser limpo, o tipo e/ou grau de sujidade, a temperatura à qual a limpeza é para ter lugar, e a formulação do produto detergente.

[00179] Em uma modalidade particular, uma composição detergente compreende uma variante de subtilase da invenção e um ou mais componentes detergentes, tais como tensioativos, hidrótropos, adjuvantes, coadjuvantes, quelantes ou agentes de quelação, sistema de lixiviação ou componentes de lixiviação, polímeros, agentes de matização de tecidos, condicionadores de tecidos, impulsionadores de espuma, supressores de espuma, dispersantes, inibidores de transferência de corantes, agentes de branqueamento fluorescentes, perfume, branqueadores óticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensão da sujidade, polímeros de libertação da sujidade, agentes antirredeposição, inibidores ou estabilizantes de enzimas, ativadores de enzimas, antioxidantes, e solubilizantes.

[00180] Em uma modalidade da presente invenção, a variante de subtilase da presente invenção pode ser adicionada a uma composição detergente em uma quantidade correspondendo a 0,01 a 200 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavagem, preferencialmente 0,05 a 50 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavagem, em particular 0,1 a 10 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavagem.

[00181] Uma composição para uso em lavagem de louça automática (ADW), por exemplo, pode incluir 0,0001%-50%, tal como 0,001%-30%, tal como 0,01%-20%, tal como 0,5-15% de proteína de enzima em peso da composição.

[00182] Uma composição para uso em granulação de lavagem de roupa, por exemplo, pode incluir 0,0001%-50%, tal como 0,001%- 20%, tal como 0,01%-10%, tal como 0,05%-5% de proteína de enzima em peso da composição.

[00183] Uma composição para uso em líquido de lavagem de roupa, por exemplo, pode incluir 0,0001%-10%, tal como 0,001-7%, tal como 0,1%-5% de proteína de enzima em peso da composição.

[00184] As enzimas tais como a variante de subtilase da invenção podem ser estabilizadas usando agentes estabilizantes convencionais, p.ex., um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, p.ex., um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborônico tal como ácido 4-formilfenilborônico, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708 ou as variantes de acordo com a invenção podem ser estabilizadas usando cetonas ou aldeídos de peptídeo tal como descrito em WO 2005/105826 e WO 2009/118375.

[00185] Uma variante da presente invenção pode ser também incorporada nas formulações detergentes divulgadas em WO 97/07202, que é deste modo incorporada aqui por referência.

[00186] As variantes de subtilase da invenção podem ser formuladas em composições líquidas para lavagem de roupa tais como uma composição líquida para lavagem de roupa compreendendo: a) pelo menos 0,01 mg de variante de subtilase ativa por litro de detergente, b) 2% em peso a 60% em peso de pelo menos um tensioativo c) 5% em peso a 50% em peso de pelo menos um adjuvante A composição detergente pode ser formulada em um detergente granular para lavagem de roupa. Tal detergente pode compreender; a) pelo menos 0,01 mg de variante de protease ativa por grama de composição b) tensioativo aniônico, preferencialmente 5% em peso a 50% em peso c) tensioativo não iônico, preferencialmente 1% em peso a 8% em peso d) conjugante preferencialmente 5% em peso a 40% em peso e preferencialmente tal como carbonatos, zeólitos, adjuvante de fosfato, adjuvantes sequestradores de cálcio ou agentes complexantes.

[00187] Embora os componentes mencionados em baixo estejam categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, isto não é para ser interpretado como uma limitação, pois um componente pode compreender funcionalidades adicionais como será apreciado pela pessoa perita na técnica.

Tensioativos

[00188] A composição detergente pode compreender um ou mais tensioativos, que podem ser aniônicos e/ou catiônicos e/ou não iônicos e/ou semipolares e/ou zwitteriônicos, ou uma sua mistura. Em uma modalidade particular, a composição detergente inclui uma mistura de um ou mais tensioativos não iônicos e um ou mais tensioativos aniônicos. O(s) tensioativo(s) está(ão) tipicamente presente(s) a um nível de cerca de 0,1% a 60% em peso, tal como cerca de 1% a cerca de 40%, ou cerca de 3% a cerca de 20%, ou cerca de 3% a cerca de 10%. O(s) tensioativo(s) é(são) escolhido(s) com base na aplicação de limpeza desejada, e inclui(em) qualquer(quaisquer) tensioativo(s) convencional(ais) conhecido(s) na técnica. Pode ser utilizado qualquer tensioativo conhecido na técnica para uso em detergentes. Os tensioativos diminuem a tensão superficial no detergente, o que permite que a mancha sendo limpa seja levantada e dispersada e depois separada por lavagem.

[00189] Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 1% a cerca de 40% em peso, tal como de cerca de 5% a cerca de 30%, incluindo de cerca de 5% a cerca de 15%, ou de cerca de 20% a cerca de 25% de um tensioativo aniônico. Exemplos não limitantes de tensioativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa-olefinassulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-di- ilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), etersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, ésteres de metila de ácido graxo alfa-sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico de dodecenila/tetradecenila (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão, e suas combinações.

[00190] Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensioativo catiônico. Exemplos não limitantes de tensioativos catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de amônio quaternário alcoxilado (AQA), e suas combinações.

[00191] Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0,2% a cerca de 40% em peso de um tensioativo não iônico, por exemplo de cerca de 0,5% a cerca de 30%, em particular de cerca de 1% a cerca de 20%, de cerca de 3% a cerca de 10%, tal como de cerca de 3% a cerca de 5% ou de cerca de 8% a cerca de 12%. Exemplos não limitantes de tensioativos não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, álcoois graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilado, como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamida de ácido graxo propoxilada (PFAM), amidas poli-idróxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina de N-acila e N-alquila (glucamidas, GA, ou glucamida de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob os nomes comerciais SPAN e TWEEN, e suas combinações.

[00192] Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensioativo semipolar. Exemplos não limitantes de tensioativos semipolares incluem óxidos de amina (AO) tais como óxido de alquildimetilamina, óxido de N-(coco alquila)-N,N-dimetilamina e óxido de amina N-(sebo-alquila)-N,N-bis(2-hidroxietila), alcanolamidas de ácido graxo e alcanolamidas de ácido graxo etoxiladas, e suas combinações.

[00193] Quando incluído no mesmo, o detergente irá usualmente conter de cerca de 0% a cerca de 10% em peso de um tensioativo zwitteriônico. Exemplos não limitantes de tensioativos zwitteriônicos incluem betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína, e suas combinações.

Adjuvantes e Coadjuvantes

[00194] A composição detergente pode conter cerca de 0-65% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 45% de um adjuvante ou coadjuvante de detergente, ou uma sua mistura. Em um detergente de lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40-65%, particularmente 50-65%. Os adjuvantes e quelantes amolecem, p.ex., a água de lavagem por remoção dos íons de metal do líquido. O adjuvante e/ou coadjuvante pode ser particularmente um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser utilizado qualquer adjuvante e/ou coadjuvante conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Exemplos não limitantes de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tais como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos taos como carbonato de sódio, silicatos solúveis tais como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (p.ex., SKS-6 da Hoechst), etanolaminas tais como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, também conhecido como iminodietanol), trietanolamina (TEA, também conhecida como 2,2’,2”-nitrilotrietanol) e inulina de carboximetila (CMI), e suas combinações.

[00195] A composição detergente pode conter também 0-20% em peso, tal como cerca de 5% a cerca de 10%, de um coadjuvante de detergente, ou uma sua mistura. A composição detergente pode incluir um coadjuvante sozinho, ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante de zeólito. Exemplos não limitantes de coadjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, tais como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Outros exemplos não limitantes incluem citrato, quelantes tais como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos, e ácido alquil- ou alquenilsuccínico. Exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), ácido iminodissuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’- dissuccínico (EDDS), ácido metilglicinadiacético (MGDA), ácido glutâmico-ácido N,N-diacético (GLDA), ácido 1-hidroxietano- 1,1-difosfônico (HEDP), etilenodiaminetetra-(ácido metilenofosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminapentaquis(ácido metilenofosfônico) (DTPMPA ou DTMPA), ácido N-(2- hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico- ácido N- monoacético (ASMA), ácido aspártico-ácido N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico-ácido N-monopropiônico (ASMP), ácido iminodissuccínico (IDA), ácido N-(2-sulfometil)-aspártico (SMAS), ácido N-(2-sulfoetil)-aspártico (SEAS), ácido N-(2- sulfometil)-glutâmico (SMGL), ácido N-(2-sulfoetil)-glutâmico (SEGL), ácido N-metiliminodiacético (MIDA), ácido α-alanina- N, N-diacético (α-ALDA), ácido serina-N, N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N- diacético (PHDA), ácido antranílico-ácido N,N-diacético (ANDA), ácido sulfanílico-ácido N,N-diacético (SLDA), ácido taurina-N,N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil-N,N-diacético (SMDA), N-(2-hidroxietil)-etilidenodiamina-N,N’,N’-triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), dietilenotriamina penta(ácido metilenofosfônico) (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP), e suas combinações e sais. Adjuvantes e/ou coadjuvantes exemplificativos adicionais são descritos em, p.ex., WO 2009/102854 e US 5,977,053.

[00196] As variantes de subtilase da invenção podem também ser formuladas em uma composição de lavagem de louça, preferencialmente uma composição de lavagem de louça automática (ADW), compreendendo: a) pelo menos 0,01 mg de variante de protease ativa de acordo com a invenção, e b) 10-50% em peso de adjuvante preferencialmente selecionado de ácido cítrico, ácido metilglicina-N,N-diacético (MGDA) e/ou ácido glutâmico-ácido N,N-diacético (GLDA) e suas misturas, e c) pelo menos um componente de lixiviação.

Sistemas de lixiviação

[00197] O detergente pode conter 0-50% em peso, tal como cerca de 0,1% a cerca de 25%, de um sistema de lixiviação. Os sistemas de lixiviação remover a descoloração frequentemente por oxidação, e muitas lixívias têm também fortes propriedades bactericidas, e são usadas para desinfeção e esterilização. Pode ser utilizado qualquer sistema de lixiviação conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Componentes de sistema de lixiviação adequados incluem catalisadores de lixiviação, fotolixiviadores, ativadores de lixiviação, fontes de peróxido de hidrogênio tais como percarbonato de sódio e perboratos de sódio, perácidos pré- formados e suas misturas. Perácidos pré-formados adequados incluem, mas não estão limitados a, ácidos e sais peroxicarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonossulfúricos, por exemplo, Oxone®, e suas misturas. Exemplos não limitantes de sistemas de lixiviação incluem sistemas de lixiviação à base de peróxido, que podem compreender, por exemplo, um sal inorgânico, incluindo sais de metal alcalino tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetraidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sais de persilicato, em combinação com um ativador de lixiviação formando perácido. O termo ativador de lixiviação se entende aqui como um composto que reage com lixívia de peroxigênio como peróxido de hidrogênio para formar um perácido. O perácido assim formado constitui a lixívia ativada. Ativadores de lixiviação adequados a serem usados aqui incluem aqueles pertencendo à classe de amidas, imidas ou anidridos de éster. Exemplos adequados são diamina de tetracetiletileno (TAED), 4-[(3,5,5- trimetilhexanoíl)óxi]benzenossulfonato de sódio (ISONOBS), ácido diperoxidodecanoico, 4-(dodecanoílóxi)benzenossulfonato (LOBS), 4-(decanoílóxi)benzenossulfonato, 4- (decanoílóxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoílóxi)- benzenossulfonato (NOBS), e/ou aqueles divulgados em WO 98/17767. Uma família particular de ativadores de lixiviação de interesse foi divulgada em EP 624154 e particularmente preferencial em essa família é citrato de acetila e trietila (ATC). ATC ou um triglicerídeo de cadeia curta como triacetina tem a vantagem de ser amigo do ambiente pois acaba por se degradar em ácido cítrico e álcool. Além do mais, o citrato de acetila e trietila e a triacetina têm uma boa estabilidade hidrolítica no produto após armazenamento e são um ativador de lixiviação eficaz. Finalmente, o ATC proporciona uma boa capacidade adjuvante ao aditivo de lavagem de roupa. Alternativamente, o sistema de lixiviação pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona. O sistema de lixiviação pode compreender também perácidos tais como ácido 6-(ftalimido)peroxihexanoico (PAP). O sistema de lixiviação pode incluir também um catalisador de lixiviação ou um impulsionador.

[00198] Alguns exemplos não limitantes de catalisadores de lixiviação que podem ser usados nas composições da presente invenção incluem oxalato de manganês, acetato de manganês, manganês-colagênio, catalisadores de cobalto-amina e catalisadores de triazaciclononano de manganês (MnTACN); são particularmente preferenciais complexos de manganês com 1,4,7- trimetil-1,4,7-triazaciclononano (Me3-TACN) ou 1,2,4,7- tetrametil-1,4,7-triazaciclononano (Me4-TACN), em particular Me3-TACN, tal como o complexo de manganês dinuclear [(Me3- TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2, e [2,2',2''-nitrilotris(etano- 1,2-di-ilazanillideno-KN-metanililideno)trifenolato- K3O]manganês (III). Os catalisadores de lixiviação podem ser também outros compostos de metal, tais como complexos de ferro ou cobalto.

[00199] Em algumas modalidades, o componente de lixiviação pode ser um catalisador orgânico selecionado do grupo consistindo em catalisadores orgânicos tendo as seguintes fórmulas:

(iii) e suas misturas; em que cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 24 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 24 carbonos, preferencialmente cada R1 é independentemente um grupo alquila ramificado contendo de 9 a 18 carbonos ou um grupo alquila linear contendo de 11 a 18 carbonos, mais preferencialmente cada R1 é independentemente selecionado do grupo consistindo em 2-propilheptila, 2-butiloctila, 2-pentilnonila, 2- hexildecila, n-dodecila, n-tetradecila, n-hexadecila, n- octadecila, iso-nonila, iso-decila, iso-tridecila e iso-pentadecila. Outros sistemas de lixiviação exemplificativos são descritos, p.ex., em WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 e WO 2007/087242. Fotolixiviadores adequados podem por exemplo ser ftalocianina de zinco sulfonatada. Hidrótopos

[00200] Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou, de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter tanto hidrofílico como hidrofóbico (assim chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensioativos); no entanto, a estrutura molecular dos hidrótopos não favorece geralmente a autoagregação espontânea, ver, p.ex., revisão por Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótopos não exibem uma concentração crítica acima da qual a autoagregação ocorre como encontrado em tensioativos e lipídeos formando mesofases micelares, lamelares e outras bem definidas. Ao invés, muitos hidrótopos mostram um processo de agregação do tipo contínuo onde os tamanhos dos agregados crescem à medida que a concentração aumenta. No entanto, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, estabilidade, e propriedades coloidais de sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensioativos, e polímeros. Os hidrótopos são classicamente usados em várias indústrias desde indústrias farmacêutica, de higiene pessoal, alimentar, a aplicações técnicas. O uso de hidrótopos em composições detergentes permite por exemplo formulações de tensioativos mais concentradas (como no processo de compactação de detergentes líquidos por remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fases ou elevada viscosidade.

[00201] O detergente pode conter 0-5% em peso, tal como cerca de 0,5 a cerca de 5%, ou cerca de 3% a cerca de 5%, de um hidrótopo. Pode ser utilizado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitantes de hidrótopos incluem benzenossulfonato de sódio, p- toluenossulfonatos de sódio (STS), xilenossulfonatos de sódio (SXS), cumenossulfonatos de sódio (SCS), cimenossulfonato de sódio, óxidos de amina, álcoois e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftalenossulfonato de sódio, etilhexilsulfato de sódio, e suas combinações.

Polímeros

[00202] O detergente pode conter 0-10% em peso, tal como 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% ou 0,2-1% de um polímero. Pode ser utilizado qualquer polímero conhecido na técnica para uso em detergentes. O polímero pode funcionar como um coadjuvante como mencionado acima, ou pode proporcionar propriedades antirredeposição, proteção das fibras, liberação de sujidade, inibição de transferência de corantes, limpeza de gorduras e/ou propriedades antiespumantes. Alguns polímeros podem ter mais do que uma das propriedades acima mencionadas e/ou mais do que um dos motivos mencionados em baixo. Polímeros exemplificativos incluem (carboximetil)celulose (CMC), poli(álcool de vinila) (PVA), poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenoglicol) ou poli(óxido de etileno) (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada, inulina de carboximetila (CMI), e policarboxilatos tais como PAA, PAA/PMA, ácido poli- aspártico, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico, CMC hidrofobicamente modificada (HM-CMC) e silicones, copolímeros de ácido tereftálico e glicóis oligoméricos, copolímeros de poli(tereftalato de etileno) e poli(tereftalato de oxieteno) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI), poli(vinilpiridina-N-óxido) (PVPO ou PVPNO) e polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Polímeros exemplificativos adicionais incluem policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno e óxido de polipropileno (PEO- PPO) e sulfato de etóxi diquaternário. Outros polímeros exemplificativos são divulgados em, p.ex., WO 2006/130575. Sais dos polímeros acima mencionados estão também contemplados.

Agentes de matização de tecidos

[00203] As composições detergentes da presente invenção podem incluir também agentes de matização de tecidos tais como corantes ou pigmentos, que quando formulados em composições detergentes podem se depositar em um tecido quando o tecido é contatado com um licor de lavagem compreendendo as composições detergentes e alterando assim a tonalidade do tecido através de absorção/reflexão da luz visível. Os agentes de branqueamento fluorescentes emitem pelo menos alguma luz visível. Em contraste, os agentes de matização de tecidos alteram a tonalidade de uma superfície pois absorvem pelo menos uma porção do espectro de luz visível. Agentes de matização de tecidos adequados incluem corantes e conjugados de corante- argila, e podem incluir também pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo em corantes se enquadrando nas classificações do Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas, por exemplo como descrito em WO 2005/003274, WO 2005/003275, WO 2005/003276 e EP 1876226 (deste modo incorporados por referência). A composição detergente compreende preferencialmente de cerca de 0,00003% por peso a cerca de 0,2% por peso, de cerca de 0,00008% por peso a cerca de 0,05% por peso, ou mesmo de cerca de 0,0001% por peso a cerca de 0,04% por peso de agente de matização de tecidos. A composição pode compreender de 0,0001% em peso a 0,2% em peso de agente de matização de tecidos, isto pode ser especialmente preferencial quando a composição estiver na forma de uma bolsa de dose unitária. Agentes de matização adequados são também divulgados em, p.ex., WO 2007/087257 e WO 2007/087243.

Enzimas Adicionais

[00204] O aditivo detergente bem como a composição detergente podem compreender uma ou mais enzimas (adicionais) tais como uma amilase, arabinase, carboidrase, celulase (p.ex., endoglucanase), cutinase, galactanase, haloperoxigenase, lipase, mananase, oxidase, p.ex., lacase e/ou peroxidase, pectinase, pectina liases, protease, xilanase, xantanase, e xiloglucanase.

[00205] Em geral, as propriedades da enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (i.e., pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades eficazes. Celulases

[00206] As celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p.ex., as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas em US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259.

[00207] Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas em EP 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase tais como aquelas descritas em WO 94/07998, EP 531315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

[00208] Exemplos de celulases exibindo atividade de endo- beta-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) são descritas em WO 02/99091.

[00209] Outros exemplos de celulases incluem as celulases da família 45 descritas em WO 96/29397, e especialmente suas variantes tendo substituição, inserção e/ou deleção em uma ou mais das posições correspondendo às seguintes posições em SEQ ID NO: 8 de WO 02/99091: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200 e/ou 20, preferencialmente selecionadas entre P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H ou Q146 R.

[00210] Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Proteases

[00211] A composição pode compreender uma ou mais proteases adicionais incluindo aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, p.ex., origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode ser por exemplo da família S1, tal como tripsina, ou da família S8 tal como subtilisina. Uma protease das metaloproteases pode ser por exemplo uma termolisina p.ex., da família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8.

[00212] Exemplos de metaloproteases são a metaloprotease neutra como descrita em WO 2007/044993 (Genencor Int.) tal como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

[00213] Enzimas protease comercialmente disponíveis adequadas incluem aquelas vendidas sob os nomes comerciais Alcalase®, DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® (Novozymes A/S), aquelas vendidas sob o nome comercial Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Eraser®, Opticlean® e Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocades N.V.), BLAP (sequência mostrada na Figura 29 de US5352604) e suas variantes (Henkel AG) e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) da Kao.

Lipases e Cutinases

[00214] As lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, p.ex., de T. lanuginosus (previamente nomeada Humicola lanuginosa) como descrito em EP 258068 e EP 305216, cutinase de Humicola, p.ex., H. insolens (WO 96/13580), lipase de estirpes de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas Burkholderia), p.ex., P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), estirpe de P. sp. SD705 (WO 95/06720 & WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), lipases do tipo GDSL de Streptomyces (WO 2010/065455), cutinase de Magnaporthe grisea (WO 2010/107560), cutinase de Pseudomonas mendocina (US 5,389,536), lipase de Thermobifida fusca (WO 2011/084412), lipase de Geobacillus stearothermophilus (WO 2011/084417), lipase de Bacillus subtilis (WO 2011/084599) e lipase de Streptomyces griseus (WO 2011/150157) e S. pristinaespiralis (WO 2012/137147).

[00215] Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas em EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 2007/87508 e WO 2009/109500.

[00216] Produtos de lipase comerciais preferenciais incluem LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (originalmente da Gist-Brocades).

[00217] Ainda outros exemplos são lipases por vezes referidas como aciltransferases ou perhidrolases, p.ex., aciltransferases com homologia com lipase A de Candida antarctica (WO 2010/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO 2005/056782), perhidrolases da família CE 7 (WO 2009/067279), e variantes da perhidrolase de M. smegmatis, em particular a variante S54V usada no produto comercial Gentle Power Bleach da Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 2010/100028).

Amilases

[00218] As amilases adequadas que podem ser usadas em conjunto com as variantes de subtilase da invenção podem ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e podem ser de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, p.ex., uma estirpe especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB 1,296,839.

[00219] As amilases adequadas incluem amilases tendo SEQ ID NO: 2 em WO 95/10603 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3. Variantes preferenciais são descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 e SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, e 444.

[00220] Diferentes amilases adicionais incluem amilases tendo SEQ ID NO: 6 em WO 02/10355 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193.

[00221] Outras amilases que são adequadas são alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 2006/066594 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com a mesma. Variantes preferenciais desta alfa-amilase híbrida são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa- amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada em SEQ ID NO: 6 de WO 2006/066594 e os resíduos 36-483 de SEQ ID NO: 4 são aquelas tendo as substituições: M197T; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

[00222] Outras amilases adequadas são amilases tendo a sequência de SEQ ID NO: 6 em WO 99/19467 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 6 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas tendo deleção nas posições R181 e G182, ou posições H183 e G184.

[00223] Amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas tendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 de WO 96/23873 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476, usando SEQ ID 2 de WO 96/23873 para numeração. Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção em duas posições selecionadas de 181, 182, 183 e 184, tal como 181 e 182, 182 e 183, ou posições 183 e 184. Variantes de amilase o mais preferenciais de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 7 são aquelas tendo uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476.

[00224] Outras amilases que podem ser usadas são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO 2008/153815, SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 ou suas variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2 de WO 2008/153815 ou 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 10 em WO 01/66712 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 e 264.

[00225] Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 2 de WO 2009/061380 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma truncação do terminal C e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. Variantes de amilase mais preferenciais de SEQ ID NO: 2 são aquelas tendo as substituições: N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K; S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; or S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, em que as variantes são C-terminalmente truncadas e opcionalmente compreendem adicionalmente uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[00226] Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 de WO 2013/184577 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: K176, R178, G179, T180, G181, E187, N192, M199, I203, S241, R458, T459, D460, G476 e G477. Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: K176L, E187P, N192FYH, M199L, I203YF, S241QADN, R458N, T459S, D460T, G476K e G477K e/ou uma deleção na posição R178 e/ou S179 ou de T180 e/ou G181. Variantes de amilase o mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 compreendem as substituições: E187P+I203Y+G476K E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K e opcionalmente compreendem adicionalmente uma substituição na posição 241 e/ou uma deleção na posição 178 e/ou posição 179.

[00227] Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID NO: 1 de WO 2010/104675 ou variantes tendo 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1. Variantes preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: N21, D97, V128 K177, R179, S180, I181, G182, M200, L204, E242, G477 e G478.

[00228] Variantes mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: N21D, D97N, V128I K177L, M200L, L204YF, E242QA, G477K e G478K e/ou uma deleção na posição R179 e/ou S180 ou de I181 e/ou G182. Variantes de amilase o mais preferenciais de SEQ ID NO: 1 E compreendem as substituições N21D+D97N+V128I, e opcionalmente compreendem adicionalmente uma substituição na posição 200 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[00229] Outras amilases adequadas são a alfa-amilase tendo SEQ ID NO: 12 em WO 01/66712 ou uma variante tendo pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 12. Variantes de amilases preferenciais são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID NO: 12 em WO 01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Amilases preferenciais particulares incluem variantes tendo uma deleção de D183 e G184 e tendo as substituições R118K, N195F, R320K e R458K, e uma variante tendo adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, o mais preferencial uma variante que tem adicionalmente substituições em todas estas posições.

[00230] Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas em WO 2011/098531, WO 2013/001078 e WO 2013/001087. Amilases comercialmente disponíveis são DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM, Stainzyme TM, Stainzyme PlusTM, NatalaseTM, Liquozyme X e BANTM (da Novozymes A/S), e RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase, Preferenz S1000, Preferenz S100 e Preferenz S110 (da Genencor International Inc./DuPont).

Peroxidases/Oxidases

[00231] As peroxidases/oxidases adequadas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, p.ex., de C. cinereus, e suas variantes como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.

[00232] Peroxidases comercialmente disponíveis incluem Guardzyme™ (Novozymes A/S).

[00233] A(s) enzima(s) de detergente pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas essas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, i.e., um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta, etc. Formulações de aditivo detergente preferenciais são granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas.

[00234] Podem ser produzidos granulados sem formação de poeiras, p.ex., como divulgado em US 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB 1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Podem ser preparadas enzimas protegidas de acordo com o método divulgado em EP 238216.

Materiais adjuntos

[00235] Podem ser utilizados quaisquer componentes de detergentes conhecidos na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Outros componentes de detergente opcionais incluem agentes anticorrosão, agentes antiencolhimento, agentes antirredeposição de sujidades, agentes antipregueamento, bactericidas, ligantes, inibidores de corrosão, agentes desintegrantes/de desintegração, corantes, estabilizantes de enzimas (incluindo ácido bórico, boratos, CMC, e/ou polióis tais como propileno glicol), condicionadores de tecido incluindo argilas, enchimento/auxiliares de processamento, agentes de branqueamento fluorescentes/branqueadores óticos, impulsionadores de espuma, reguladores de espuma (solução saponífera), perfumes, agentes de suspensão da sujidade, amaciadores, supressores de solução saponífera, inibidores de embaciamento, e agentes de migração, ou sozinhos ou em combinação. Pode ser utilizado qualquer ingrediente conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. A escolha de tais ingredientes está bem dentro da perícia do especialista.

[00236] Dispersantes : As composições detergentes da presente invenção podem também conter dispersantes. Em particular, os detergentes em pó podem compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homoou copoliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono. Dispersantes adequados são por exemplo descritos em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.

[00237] Agentes de Inibição de Transferência de Corantes: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes poliméricos adequados incluem, mas não estão limitados a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N- vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma composição em questão, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes a níveis de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5% ou mesmo de cerca de 0,1% a cerca de 3% em peso da composição.

[00238] Agente de branqueamento fluorescente: As composições detergentes da presente invenção irão preferencialmente conter também componentes adicionais que podem tingir os artigos sendo limpos, tais como agente de branqueamento fluorescente ou branqueadores óticos. Onde presente, o branqueador está preferencialmente a um nível de cerca de 0,01% a cerca de 05%. Pode ser usado qualquer agente de branqueamento fluorescente adequado para uso em uma composição detergente de lavagem de roupa na composição da presente invenção. Os agentes de branqueamento fluorescente o mais comummente usados são aqueles pertencendo às classes de derivados de ácido diaminoestilbenossulfônico, derivados de diarilpirazolina e derivados de bisfenil-diestirila. Exemplos do tipo derivado de ácido diaminoestilbenossulfônico de agentes de branqueamento fluorescente incluem os sais de sódio de: 4,4'-bis-(2- dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'- dissulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6- ilamino)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N- metil-N-2-hidróxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno- 2,2'-dissulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2- il)estilbeno-2,2'-dissulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1- metil-2-hidróxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno- 2,2'-dissulfonato e 2-(estilbil-4"-nafto-1,2':4,5)-1,2,3- trizol-2"-sulfonato. Agentes de branqueamento fluorescentes preferenciais são Tinopal DMS e Tinopal CBS disponíveis da Ciba-Geigy AG, Basileia, Suíça. Tinopal DMS é o sal dissódico de dissulfonato de 4,4'-bis-(2-morfolino-4-anilino-s-triazin- 6-ilamino)estilbeno. Tinopal CBS é o sal dissódico de dissulfonato de 2,2'-bis-(fenil-estiril). Agentes de branqueamento fluorescentes são também preferencias é os Parawhite KX comercialmente disponíveis, fornecidos pela Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, Índia. Outros produtos fluorescentes adequados para uso na invenção incluem as 1-3-diarilpirazolinas e as 7-alquilaminocoumarinas. Níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de cerca de 0,01, de 0,05, de cerca de 0,1 ou mesmo de cerca de 0,2% em peso a níveis superiores de 0,5 ou mesmo 0,75% em peso.

[00239] Polímeros de liberação de sujidade: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais polímeros de liberação de sujidade que auxiliam na remoção de sujidades de tecidos tais como tecidos à base de algodão e poliéster, em particular na remoção de sujidades hidrofóbicas de tecidos à base de poliéster. Os polímeros de liberação de sujidade podem por exemplo ser polímeros à base de tereftalato não iônicos ou aniônicos, caprolactama de polivinila e copolímeros relacionados, copolímeros de enxerto de vinila, poliamidas de poliéster, ver por exemplo Capítulo 7 em Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc. Outro tipo de polímeros de liberação de sujidade é polímeros de limpeza de gordura alcoxilados anfifílicos compreendendo uma estrutura nuclear e uma pluralidade de grupos alcoxilato anexados a essa estrutura nuclear. A estrutura nuclear pode compreender uma estrutura de polialquilenimina ou uma estrutura de polialcanolamina como descrita em detalhe em WO 2009/087523 (deste modo incorporada por referência). Além do mais, copolímeros de enxerto aleatórios são polímeros de liberação de sujidade adequados. Copolímeros de enxerto adequados são descritos em mais detalhe em WO 2007/138054, WO 2006/108856 e WO 2006/113314 (deste modo incorporadas por referência). Outros polímeros de liberação de sujidade são estruturas de polissacarídeos substituídos, especialmente estruturas celulósicas substituídas tais como derivados celulósicos tais como aqueles descritos em EP 1867808 ou WO 03/040279 (ambas são deste modo incorporadas por referência). Polímeros celulósicos adequados incluem celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem celulose anionicamente modificada, celulose não ionicamente modificada, celulose cationicamente modificada, celulose zwitterionicamente modificada, e suas misturas. Polímeros celulósicos adequados incluem metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, éster de carboximetilcelulose e suas misturas.

[00240] Agentes antirredeposição: As composições detergentes da presente invenção podem incluir também um ou mais agentes antirredeposição tais como carboximetilcelulose (CMC), álcool de polivinila (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno e/ou polietilenoglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico e ácido maleico, e polietilenoiminas etoxiladas. Os polímeros à base de celulose descritos sob polímeros de liberação de sujidade acima podem também funcionar como agentes antirredeposição.

[00241] Outros materiais adjuntos adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes antiencolhimento, agentes antipregueamento, bactericidas, ligantes, transportadores, corantes, estabilizantes de enzimas, amaciadores de tecido, enchimentos, reguladores de espuma, hidrótopos, perfumes, pigmentos, supressores de solução saponífera, solventes, e estruturantes para detergentes líquidos e/ou agentes de elastização da estrutura.

Formulação de Produtos Detergentes

[00242] A composição detergente da invenção pode estar em qualquer forma conveniente, p.ex., uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado. Existe um número de formas de formulação detergente tais como camadas (mesmas ou diferentes fases), bolsas, bem como formas para unidade de dosagem da máquina.

[00243] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos únicos ou múltiplos. Podem estar em qualquer forma, formato e material que sejam adequados para conter a composição, p.ex., sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contato com a água. A bolsa é feita de filme solúvel em água que encerra um volume interno. O volume interno pode ser dividido em compartimentos da bolsa. Filmes preferenciais são materiais poliméricos, preferencialmente polímeros que são formados em um filme ou folha. Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferenciais são poliacrilatos selecionados, e copolímeros de acrilato solúveis em água, celulose de metila, celulose de carboximetila, dextrina de sódio, celulose de etila, celulose de hidroxietila, celulose de hidroxipropilmetila, maltodextrina, polimetacrilatos, o mais preferencialmente copolímeros de álcool de polivinila e celulose de hidroxipropilmetila (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímeros no filme, por exemplo, PVA, é pelo menos cerca de 60%. O peso molecular médio preferencial será tipicamente cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes podem ser também de composições de combinação compreendendo combinações de polímeros hidroliticamente degradáveis e solúveis em água tais como poliactida e álcool de polivinila (conhecido sob a Referência comercial M8630 como vendido pela Chris Craft In. Prod. de Gary, Indiana, EUA) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, Propileno glicol, sorbitol e suas misturas. As bolsas podem compreender uma composição detergente sólida de lavagem de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida de limpeza ou componentes parciais separados pelo filme solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que os compartimentos contendo sólidos. Ver, p.ex., US 2009/0011970.

[00244] Os ingredientes de detergentes podem estar separados fisicamente uns dos outros por compartimentos em bolsas dissolvíveis em água ou em diferentes camadas de comprimidos. Deste modo pode ser evitada interação de armazenamento negativa entre componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem dar origem a dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem.

[00245] Um detergente líquido ou em gel, que não seja doseado à unidade, pode ser aquoso, contendo tipicamente pelo menos 20% em peso e até 95% de água, tal como até cerca de 70% de água, até cerca de 65% de água, até cerca de 55% de água, até cerca de 45% de água, até cerca de 35% de água. Outros tipos de líquidos, incluindo, sem limitação, alcanóis, aminas, dióis, éteres e polióis podem ser incluídos em um líquido ou gel aquoso. Um detergente líquido ou em gel aquoso pode conter de 0-30% de solvente orgânico. Um detergente líquido ou em gel pode ser não aquoso.

Barras de Sabão para Lavagem de Roupa

[00246] As enzimas da invenção podem ser adicionadas a barras de sabão para lavagem da roupa e usadas para lavagem à mão de roupa, tecidos e/ou têxteis. O termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui barras para lavagem de roupa, barras de sabão, barras combinadas, barras syndet e barras de detergente. Os tipos de barra diferem usualmente no tipo de tensioativo que contêm, e o termo barra de sabão para lavagem de roupa inclui aquelas contendo sabões de ácidos graxos e/ou sabões sintéticos. A barra de sabão para lavagem de roupa tem uma forma física que é sólida e não um líquido, gel ou um pó à temperatura ambiente. O termo sólido é definido como uma forma física que não muda significativamente ao longo do tempo, i.e., se um objeto sólido (p.ex., barra de sabão para lavagem de roupa) for colocado dentro de um recipiente, o objeto sólido não muda para encher o recipiente em que está colocado. A barra é um sólido tipicamente na forma de barra mas pode estar em outras formas sólidas tais como redonda ou oval.

[00247] A barra de sabão para lavagem de roupa pode conter uma ou mais enzimas adicionais, inibidores de protease tais como aldeídos de peptídeo (ou aducto de hidrossulfito ou aducto de hemiacetal), ácido bórico, borato, bórax e/ou derivados do ácido fenilborônico tais como ácido 4-formilfenilborônico, um ou mais sabões ou tensioativos sintéticos, polióis tais como glicerina, compostos de controle do pH tais como ácidos graxos, ácido cítrico, ácido acético e/ou ácido fórmico, e/ou um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico em que o cátion monovalente pode ser por exemplo Na+, K+ ou NH4+ e o ânion orgânico pode ser por exemplo formato, acetato, citrato ou lactato tal que o sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico possam ser, por exemplo, formato de sódio.

[00248] A barra de sabão para lavagem de roupa contém agentes complexantes como EDTA e HEDP, perfumes e/ou diferentes tipos de enchimentos, tensioativos, p.ex., tensioativos sintéticos aniônicos, adjuvantes, agentes de liberação de sujidade poliméricos, quelantes de detergente, agentes estabilizantes, enchimentos, tintas, corantes, inibidores da transferência de corantes, policarbonatos alcoxilados, supressores de solução saponífera, estruturantes, ligantes, agentes lixiviantes, ativadores de lixiviação, agentes de remoção de solo argiloso, agentes antirredeposição, agentes dispersantes poliméricos, branqueadores, amaciadores de tecido, perfumes e/ou outros compostos conhecidos na técnica.

[00249] A barra de sabão para lavagem de roupa pode ser processada em equipamento convencional de fabricação de barras de sabão para lavagem de roupa, tal como mas não se limitando a: misturadores, plodders, p.ex., um plodder a vácuo de duas etapas, extrusoras, cortadores, estampagem de logo, túneis de resfriamento e empacotadores. A invenção não está limitada à preparação das barras de sabão para lavagem de roupa por qualquer método único. A pré-mistura da invenção pode ser adicionada ao sabão em diferentes etapas do processo. Por exemplo, a pré-mistura contendo um sabão, uma enzima, opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais, um inibidor de protease, e um sal de um cátion monovalente e um ânion orgânico pode ser preparada e a mistura é depois extrudada. A enzima e as enzimas adicionais opcionais podem ser adicionadas ao mesmo tempo que o inibidor de protease, por exemplo na forma líquida. Para além do passo de mistura e do passo de extrusão, o processo pode compreender adicionalmente os passos de moagem, extrusão, corte, estampagem, resfriamento e/ou empacotamento.

Formulações detergentes granulares

[00250] Um detergente granular pode ser formulado como descrito em WO 2009/092699, EP 1705241, EP 1382668, WO 2007/001262, US 6,472,364, WO 2004/074419 ou WO 2009/102854. Outras formulações detergentes são descritas em WO 2009/124162, WO 2009/124163, WO 2009/117340, WO 2009/117341, WO 2009/117342, WO 2009/072069, WO 2009/063355, WO 2009/132870, WO 2009/121757, WO 2009/112296, WO 2009/112298, WO 2009/103822, WO 2009/087033, WO 2009/050026, WO 2009/047125, WO 2009/047126, WO 2009/047127, WO 2009/047128, WO 2009/021784, WO 2009/010375, WO 2009/000605, WO 2009/122125, WO 2009/095645, WO 2009/040544, WO 2009/040545, WO 2009/024780, WO 2009/004295, WO 2009/004294, WO 2009/121725, WO 2009/115391, WO 2009/115392, WO 2009/074398, WO 2009/074403, WO 2009/068501, WO 2009/065770, WO 2009/021813, WO 2009/030632, WO 2009/015951, WO 2011/025615, WO 2011/016958, WO 2011/005803, WO 2011/005623, WO 2011/005730, WO 2011/005844, WO 2011/005904, WO 2011/005630, WO 2011/005830, WO 2011/005912, WO 2011/005905, WO 2011/005910, WO 2011/005813, WO 2010/135238, WO 2010/120863, WO 2010/108002, WO 2010/111365, WO 2010/108000, WO 2010/107635, WO 2010/090915, WO 2010/033976, WO 2010/033746, WO 2010/033747, WO 2010/033897, WO 2010/033979, WO 2010/030540, WO 2010/030541, WO 2010/030539, WO 2010/024467, WO 2010/024469, WO 2010/024470, WO 2010/025161, WO 2010/014395, WO 2010/044905, WO 2010/145887, WO 2010/142503, WO 2010/122051, WO 2010/102861, WO 2010/099997, WO 2010/084039, WO 2010/076292, WO 2010/069742, WO 2010/069718, WO 2010/069957, WO 2010/057784, WO 2010/054986, WO 2010/018043, WO 2010/003783, WO 2010/003792, WO 2011/023716, WO 2010/142539, WO 2010/118959, WO 2010/115813, WO 2010/105942, WO 2010/105961, WO 2010/105962, WO 2010/094356, WO 2010/084203, WO 2010/078979, WO 2010/072456, WO 2010/069905, WO 2010/076165, WO 2010/072603, WO 2010/066486, WO 2010/066631, WO 2010/066632, WO 2010/063689, WO 2010/060821, WO 2010/049187, WO 2010/031607, e WO 2010/000636. Usos

[00251] A presente invenção é também dirigida a métodos para uso das variantes de subtilase de acordo com a invenção ou suas composições em lavagem de têxteis e tecidos, tal como lavagem de roupa doméstica e lavagem de roupa industrial.

[00252] A invenção é também dirigida a métodos para uso das variantes de acordo com a invenção ou suas composições em limpeza de superfícies duras tais como pisos, mesas, paredes, telhados, etc., bem como superfícies de objetos duros tais como carros (lavagem de carros) e louça (lavagem de louça).

[00253] As variantes de subtilase da presente invenção podem ser adicionadas a e assim se tornarem um componente de uma composição detergente. Assim, um aspecto da invenção se relaciona com o uso de uma variante de subtilase em um processo de limpeza tal como lavagem de roupa e/ou limpeza de superfícies duras.

[00254] Uma composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré- tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciadora de tecidos adicionada para enxaguamento, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina.

[00255] Em um aspecto específico, a presente invenção proporciona um aditivo detergente compreendendo um polipeptídeo da presente invenção como descrito aqui.

[00256] O processo de limpeza ou o processo de cuidado de têxteis pode por exemplo ser um processo de lavagem de roupa, um processo de lavagem de louça ou limpeza de superfícies duras tais como azulejos de banheiro, pisos, tampos de mesas, ralos, pias e lavatórios. Os processos de lavagem de roupa podem ser por exemplo lavagem de roupa doméstica, mas podem também ser lavagem de roupa industrial. Além do mais, a invenção se relaciona com um processo para lavagem de tecidos e/ou peças de vestuário onde o processo compreende tratamento de tecidos com uma solução de lavagem contendo uma composição detergente, e pelo menos uma variante de protease da invenção. O processo de limpeza ou um processo de cuidado de têxteis pode ser por exemplo levado a cabo em um processo de lavagem à máquina ou em um processo de lavagem manual. A solução de lavagem pode ser por exemplo uma solução de lavagem aquosa contendo uma composição detergente.

[00257] Os últimos anos tem existido um interesse crescente na substituição de componentes em detergentes, que sejam derivados de petroquímicos, por componentes biológicos renováveis tais como enzimas e polipeptídeos sem comprometer o desempenho de lavagem. Quando os componentes de composições detergentes mudam são necessárias novas atividades de enzimas ou novas enzimas tendo propriedades alternativas e/ou melhoradas em comparação com as enzimas de detergentes comummente usadas tais como proteases, lipases e amilases para se alcançar um desempenho de lavagem similar ou melhorado em comparação com as composições detergentes tradicionais.

[00258] A invenção diz adicionalmente respeito ao uso de variantes de subtilase da invenção em um processo de remoção de manchas proteináceas. As manchas proteináceas podem ser manchas tais como manchas de alimentos, p.ex., alimentos para bebês, sebo, cacau, ovo, sangue, leite, tinta, grama, ou uma sua combinação.

Método de Lavagem

[00259] A presente invenção se relaciona com um método de limpeza de um tecido, uma louça ou superfície dura com uma composição detergente compreendendo uma variante de protease da invenção.

[00260] Uma modalidade preferencial diz respeito a um método de limpeza, compreendendo o método os passos de: contato de um objeto com uma composição detergente compreendendo uma variante de protease da invenção sob condições adequadas para a limpeza do objeto. Em uma modalidade preferencial, a composição detergente é usada em uma lavagem de roupa ou lavagem de louça.

[00261] Ainda outra modalidade se relaciona com um método para remoção de manchas de tecido ou louça que compreende contato do tecido ou louça com uma composição compreendendo uma protease da invenção sob condições adequadas para a limpeza do objeto.

[00262] São também contempladas composições e métodos de tratamento de tecidos (p.ex., para desengomar um têxtil) usando uma ou mais das proteases da invenção. A protease pode ser usada em qualquer método de tratamento de tecidos que seja bem conhecido na técnica (ver, p.ex., US 6,077,316). Por exemplo, em um aspecto, a sensação e aparência de um tecido são melhoradas por um método compreendendo contato do tecido com uma protease em uma solução. Em um aspecto, o tecido é tratado com a solução sob pressão.

[00263] As composições detergentes da presente invenção são adequadas para uso em lavagem de roupa e aplicações de superfícies duras, incluindo lavagem de louça. Conformemente, a presente invenção inclui um método para lavagem de um tecido ou lavagem de louça. O método compreende os passos de contato do tecido/louça a ser limpo com uma solução compreendendo a composição detergente de acordo com a invenção. O tecido pode compreender qualquer tecido capaz de ser lavado em condições normais de uso do consumidor. A louça pode compreender qualquer louça tal como faianças, talheres, cerâmicas, plásticos tais como melamina, metais, porcelana, vidro e acrílicos. A solução tem preferencialmente um pH de cerca de 5,5 a cerca de 11,5. As composições podem ser empregues a concentrações de cerca de 100 ppm, preferencialmente 500 ppm a cerca de 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água variam tipicamente de cerca de 5 °C a cerca de 95 °C, incluindo cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C, cerca de 40 °C, cerca de 45 °C, cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, cerca de 80 °C, cerca de 85 °C e cerca de 90 °C. A razão de água em relação a tecido é tipicamente de cerca de 1:1 a cerca de 30:1.

[00264] A(s) enzima(s) da composição detergente da invenção pode(m) ser estabilizada(s) usando agentes estabilizantes e inibidores de proteases convencionais, p.ex., um poliol tal como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, diferentes sais tais como NaCl; KCl; ácido lático, ácido fórmico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, p.ex., um éster borato aromático, ou um derivado de ácido fenilborônico tal como ácido 4-formilfenilborônico, ou um aldeído de peptídeo tal como aldeídos de di-, tri- ou tetrapeptídeo ou análogos de aldeídos (da forma B1-B0-R em que, R é H, CH3, CX3, CHX2, ou CH2X (X = halogênio), B0 é um resíduo de aminoácido único (preferencialmente com uma cadeia lateral alifática ou aromática opcionalmente substituída); e B1 consiste em um ou mais resíduos de aminoácidos (preferencialmente um, dois ou três), compreendendo opcionalmente um grupo de proteção N-terminal, ou como descrito em WO 2009/118375, WO 98/13459) ou um inibidor de protease do tipo de proteína tal como RASI, BASI, WASI (inibidores bifuncionais de alfa-amilase/subtilisina de arroz, cevada e trigo) ou CI2 ou SSI. A composição pode ser formulada como descrito em, p.ex., WO 92/19709, WO 92/19708 e US 6,472,364. Em algumas modalidades, as enzimas empregues aqui são estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de íons de zinco (II), cálcio (II) e/ou magnésio (II) nas composições acabadas que proporcionam tais íons às enzimas, bem como outros íons de metal (p.ex., bário (II), escândio (II), ferro (II), manganês (II), alumínio (III), Estanho (II), cobalto (II), cobre (II), Níquel (II), e oxovanádio (IV)).

[00265] Em algumas modalidades preferenciais, as composições detergentes proporcionadas aqui são tipicamente formuladas tal que, durante o uso em operações de limpeza aquosas, a água de lavagem tenha um pH de cerca de 5,0 a cerca de 11,5 ou, em modalidades alternativas, mesmo de cerca de 6,0 a cerca de 10,5. Em algumas modalidades preferenciais, os produtos de lavagem de roupa granulares ou líquidos são formulados para terem um pH de cerca de 6 a cerca de 8. Técnicas para controle de pH a níveis de uso recomendados incluem o uso de tampões, alcalinos, ácidos, etc., e são bem conhecidas daqueles peritos na técnica.

[00266] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS Ensaio de atividade de Suc-AAPF-pNA

[00267] A atividade proteolítica pode ser determinada por um método empregando Suc-AAPF-PNA como o substrato. Suc-AAPF-PNA é uma abreviatura de N-Succinil-Alanina-Alanina-Prolina- Fenilalanina-p-Nitroanilida, e é um peptídeo bloqueado que pode ser clivado por endo-proteases.

[00268] Após clivagem é liberada uma molécula de PNA livre que tem uma cor amarela e assim pode ser medida por espectrofotometria visível ao comprimento de onda de 405 nm. O substrato Suc-AAPF-PNA é fabricado pela Bachem (no. de cat. L1400, dissolvido em DMSO).

[00269] A amostra de protease a ser analisada é diluída em tampão de atividade residual (Tris a 100 mM pH 8,6). O ensaio é realizado por transferência de 30 μL de amostras de enzimas diluídas para placa de microtitulação de 96 poços e adição de 70 μL de solução de trabalho de substrato (0,72 mg/mL em Tris a 100 mM pH 8,6). A solução foi misturada à temperatura ambiente e a absorção é medida a cada 20 segundos ao longo de 5 minutos a OD 405 nm.

[00270] O declive (absorvância por minuto) da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade da protease em questão sob o dado conjunto de condições. A amostra de protease é diluída até um nível onde o declive era linear. Exemplo 1: Preparação e expressão de variantes de subtilisina 309

[00271] O seguinte resume a mutação e introdução de um cassete de expressão em Bacillus subtilis. Todas as manipulações de DNA foram feitas por PCR (p.ex., Sambrook et al.; Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[00272] Os constructos de B. subtilis recombinantes codificando variantes de subtilase 309 foram usados para inocular frascos agitados contendo um meio rico (p.ex., sacarose a 100 g/L (no. de cat. da Danisco 109-0429), soja de massa (farinha de soja) a 40 g/L, Na2HPO4.12H2O a 10 g/L (no. de cat da Merck 6579), replace-Dowfax63N10 a 0,1 mL/L (Dow). O cultivo leva tipicamente 4 dias a 30 °C agitando com 220 rpm. Exemplo 2: Purificação de variantes de subtilisina 309

[00273] O caldo de cultura foi centrifugado a 26000 x g durante 20 minutos e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado do precipitado. O sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm da Nalgene de modo a se remover o resto das células hospedeiras de Bacillus. O pH no filtrado de 0,2 μm foi ajustado até pH 8 com base Tris a 3 M e o filtrado com ajuste do pH foi aplicado a uma coluna MEP Hypercel (Pall Corporation) equilibrada em Tris/HCl a 20 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 8,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilibração, a coluna foi eluída passo a passo com CH3COOH/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 1 mM, pH 4,5. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9 e as frações do pico foram reunidas. O pH da reunião da coluna MEP Hypercel foi ajustado até pH 6 com CH3COOH a 20% (v/v) ou base Tris a 3 M e a reunião com ajuste do pH foi diluída com água desionizada até à mesma condutividade que MES/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. A reunião diluída foi aplicada a uma coluna SP-Sepharose® Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada em MES/NaOH a 20 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,0. Após lavagem da coluna com o tampão de equilíbrio, a variante de protease foi eluída com um gradiente linear de NaCl (0 --> 0,5 M) no mesmo tampão ao longo de cinco volumes da coluna. As frações da coluna foram analisadas quanto à atividade de protease usando o ensaio de Suc-AAPF-pNA a pH 9 e as frações ativas foram analisadas por SDS-PAGE. As frações onde somente uma banda foi observada no gel de SDS-PAGE colorido com Coomassie foram reunidas como a preparação purificada e foi usada para experiências adicionais. Exemplo 3: Desempenho de lavagem de variantes de subtilisina 309

[00274] O desempenho de lavagem de variantes de subtilisina 309 na lavagem de roupa foi avaliado usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA), onde o desempenho de lavagem de muitas soluções de enzima-detergente de pequeno volume pode ser examinado. A placa AMSA tem um número de ranhuras para as soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente o têxtil a ser lavado contra as aberturas da ranhura. Durante a lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa foram vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar estresse mecânico de uma maneira regular, periódica, oscilante. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments" nas páginas 23-24.

[00275] As experiências de lavagem de roupa foram conduzidas sob as condições experimentais especificadas na Tabela 2.

[00276] O detergente modelo e os materiais de teste foram como descrito na Tabela 3: Tabela 3: Composição de detergentes modelo e materiais de teste

[00277] Os materiais de teste foram obtidos do Center For Testmaterials BV, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos.

[00278] A dureza da água foi ajustada ate 12 °dH por adição de CaCl2, MgCl2, e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+ = 2:1:4,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram passados por água da torneira e secos.

[00279] O desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho pode ser também expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[00280] As medições de cor foram feitas com um digitalizador de massa Kodak iQsmart (Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que é usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[00281] Para extrair um valor para a intensidade da luz das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem foram convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) foi calculado por adição dos valores RGB em conjunto como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

[00282] Os resultados são mostrados na Tabela 4. Os resultados são dados como desempenho relativo em comparação com subtilisina 309 (SEQ ID NO: 1) e uma média de duas concentrações de enzima 30 e 60 nM de duas amostras diferentes. O valor de RP de abaixo de 0,8 é considerado pior, 0,8-1,2 é considerado equivalente, 1,2 ou acima é considerado melhor do que subtilisina 309 (SEQ ID NO: 1). Tabela 4: Desempenho relativo de AMSA de variantes em comparação com a subtilisina 309. Mutações RP em comparação com a subtilisina 309.

Exemplo 4: Ensaio acelerado de estabilidade no armazenamento

[00283] A estabilidade no armazenamento de variantes de protease em detergente líquido foi avaliada usando um ensaio acelerado com incubação a 60 °C durante até 48 horas.

[00284] Os sobrenadantes de cultura contendo protease ativa a 25-75 μg/mL foram diluídos 1, 2, 4 e 8 vezes usando Triton X-100 a 0,01%. Para cada variante foram incluídos 2 poços com cada diluição. 30 μL de amostra de protease diluída foram misturados com 270 μL de detergente Model O no poço de uma placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 mL) usando uma barra magnética (em estação de pipetagem Zephyr (Caliper LifeSciences) durante 30 min). 20 μL desta mistura foram depois transferidos para outra placa de microtitulação (Nunc U96 PP 0,5 mL com barras magnéticas adicionadas) e misturados com 80 μL de Tris a 100 mM pH 8,6 (pelo menos 5 min em Zephyr). 30 μL desta diluição foram transferidos para uma Nunc F 96-MTP, e após a adição de 70 μL de solução de substrato a atividade 121/152 inicial da amostra não estressada foi determinada por medição da absorvância a 405 nm a cada 20 seg durante 5 min (em um SpectraMax Plus). Após selagem, a placa de detergente foi incubada a 60 °C em um Eppendorf Thermomixer (sem agitação). Após 1, 4, 23 e 47 horas de incubação, 20 μL de amostras foram retirados e a atividade residual da amostra estressada foi medida como com a atividade inicial, não estressada.

[00285] Se assume que a diminuição na atividade durante a incubação com detergente é exponencial. As meias-vidas (T^) foram encontradas a partir da regressão linear de Log(Atividade) versus tempo de incubação (0, 1, 4, 23 e 47 horas), e os fatores de melhoria de meia-vida (T^ IF) foram calculados como meia-vida de variante de protease em relação à meia-vida de SEQ ID NO: 1. Isto significa que a T^ para a Savinase (Subtilisina 309) é 1. Tabela 5. Composição de Detergente

Tabela 6 Resultados da estabilidade no armazenamento acelerada em model O. T^ IF: Fatores de melhoria de meia-vida em relação à Subtilisina 309 ou Subtilisina 309 + referência N76D

Exemplo 5: Ensaio acelerado de estabilidade no armazenamento

[00286] A estabilidade no armazenamento de variantes de protease em detergente líquido foi avaliada usando um ensaio acelerado com incubação a 60 °C durante até 48 horas no detergente CNS (padrão nacional chinês). De outro modo, a experiência foi levada a cabo sob as mesmas condições como no Exemplo 4. Tabela 7 Composição de Detergente

[00287] Em esta experiência, a estabilidade é testada em CNS (Padrão Nacional Chinês) e os resultados na Tabela 8 são expressos como T^ IF: Fatores de melhoria de meia-vida em relação à Subtilisina 309 ou Subtilisina 309 + referência N76D como descrito no Exemplo 4. 1: T'- IF > 100 0; 2: 500 < T^ IF < 1000; 3: 50 < T^ IF < 500. Tabela 8: Resultados da estabilidade no armazenamento acelerada em CNS Coluna A = T^ IF em relação à Subtilisina 309 + N76D, Coluna B = T^ IF em relação à Subtilisina 309.

Exemplo 6: Desempenho de lavagem AMSA de variantes de subtilisina 309 sp.

[00288] O desempenho de lavagem de variantes de subtilisina 309 foi testado usando detergente líquido de lavagem de roupa em três manchas técnicas diferentes usando o Ensaio de Estresse Mecânico Automático (AMSA).

[00289] Por AMSA, o desempenho de lavagem de muitas soluções de enzima-detergente de pequeno volume pode ser examinado. A placa AMSA tem um número de ranhuras para as soluções de teste e uma tampa que aperta firmemente o têxtil a ser lavado contra as aberturas da ranhura. Durante a lavagem, a placa, soluções de teste, têxtil e tampa são vigorosamente agitados para colocar a solução de teste em contato com o têxtil e aplicar estresse mecânico de uma maneira regular, periódica, oscilante. Para descrição adicional ver WO 02/42740, especialmente o parágrafo "Special method embodiments" nas páginas 23 a 24. Tabela 9: Os detergente modelo e os materiais de teste foram os seguintes:

[00290] Os materiais de teste foram obtidos da EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Suíça e do Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, Países Baixos

[00291] O desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor do têxtil lavado. O brilho pode ser também expresso como a intensidade da luz refletida da amostra quando iluminada com luz branca. Quando a amostra está manchada, a intensidade da luz refletida é mais baixa do que aquela de uma amostra limpa. Portanto, a intensidade da luz refletida pode ser usada para medir o desempenho de lavagem.

[00292] As medições de cor foram feitas com um digitalizador de massa profissional (Kodak, Midtager 29, DK-2605 Br0ndby, Dinamarca), que foi usado para capturar uma imagem do têxtil lavado.

[00293] Para extrair um valor para a intensidade da luz das imagens digitalizadas, os valores de pixel de 24 bits da imagem foram convertidos em valores para vermelho, verde e azul (RGB). O valor de intensidade (Int) foi calculado por adição dos valores RGB em conjunto como vetores e depois consideração do comprimento do vetor resultante:

[00294] As experiências foram conduzidas usando um procedimento de lavagem de ciclo único, com a composição detergente e amostras descritas na tabela 10 e as condições experimentais como especificado na Tabela 10 em baixo. Tabela 10: Condições experimentais para experiências de lavagem de roupa

[00295] A dureza da água foi ajustada até 12 °dH por adição de CaCl2, MgCl2, e NaHCO3 (Ca2+:Mg2+:CO3- = 2:1:4,5) ao sistema de teste. Após lavagem, os têxteis foram enxaguados em água da torneira e secos. Tabela 11: Desempenho relativo de variantes de subtilisina 309 em comparação com detergente com Subtilisina 309 (SEQ ID NO 1) a 20 °C

[00296] Os resultados da Tabela 11 mostram que as variantes de Subtilisina 309 têm desempenho de lavagem melhorado ou equivalente em comparação com a Subtilisina 309 em chocolate/leite (PC-03, C-03) a 20 °C. Tabela 12: Desempenho relativo de proteases de variantes de subtilisina 309 de Bacillus sp. em comparação com detergente com Subtilisina 309 (SEQ ID NO 1) a 20 °C em manchas EMPA117 EH Sangue/leite/tinta em algodão/poliéster.

[00297] Os resultados da Tabela 12 mostram que as variantes de Subtilisina 309 têm desempenho de lavagem melhorado ou equivalente em comparação com a Subtilisina 309 em EMPA117 EH Sangue/leite/tinta em algodão/poliéster extra-aquecido a 20 Exemplo 7: Teste de variantes de subtilisina 309 em Minilavagem

[00298] O desempenho de lavagem das proteases de Bacillus sp. foi testado usando detergente líquido de lavagem de roupa em uma mancha técnica usando o sistema de minilavagem.

[00299] O ensaio de Minilavagem é um método de teste onde o têxtil sujo é continuamente movimentado para cima e para baixo na solução de teste e subsequentemente enxaguado. Tabela 13: A experiência de lavagem é conduzida sob as condições experimentais especificadas em baixo:

[00300] Os materiais de teste foram obtidos da EMPA Testmaterials AG Movenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, Suíça.

[00301] Os têxteis foram subsequentemente secos ao ar e o desempenho de lavagem foi medido como o brilho da cor destes têxteis. O brilho pode ser também expresso como a Remissão (R), que é uma medida da luz refletida ou emitida do material de teste quando iluminado com luz branca. A Remissão (R) dos têxteis foi medida a 460 nm usando um espectrofotômetro Zeiss MCS 521 VIS. As medições foram feitas de acordo com o protocolo do fabricante.

[00302] O cálculo do efeito da enzima foi feito por consideração das medições de amostras lavadas com enzimas e subtração com as medições de lavadas sem enzima para cada mancha, ΔRemen zima.

[00303] As experiências foram conduzidas como descrito no ensaio de minilavagem para método de lavagem de roupa com a composição detergente e amostras descritas na tabela 13 e as condições experimentais como especificado na Tabela 14 em baixo. Tabela 14: Condições experimentais para experiências de lavagem de roupa de minilavagem

Tabela 15: Desempenho relativo de proteases de variantes de subtilisina 309 de Bacillus sp. em comparação com detergente com Subtilisina 309 (SEQ ID NO 1) a 25 °C

[00304] Os resultados Tabela 15 mostram que as variantes de Subtilisina 309 mostraram desempenho de lavagem melhorado ou equivalente em comparação com a Subtilisina 309 (SEQ ID NO 1) em Sangue/leite/tinta 25 °C. Exemplo 8: Ensaio acelerado de estabilidade no armazenamento

[00305] A estabilidade no armazenamento de variantes de protease em detergente líquido foi avaliada usando um ensaio acelerado com incubação a 58 °C, pH 9 durante até 48 horas no detergente CNS (padrão nacional chinês).

[00306] De outro modo, a experiência foi levada a cabo sob as mesmas condições como nos Exemplos 4 e 5. Os resultados na Tabela 16 são expressos como T½ IF: Fatores de melhoria de meia-vida em relação à Subtilisina 309 (SEQ ID NO 1) como descrito no Exemplo 4. 1: T½ IF > 1000; 2: 500 ≤ T½ IF ≤ 1000; 3: 50 ≤ T½ IF < 500. Tabela 16: Resultados da estabilidade no armazenamento acelerada em CNS em relação à Subtilisina 309.

Claims (13)

1. Variante de subtilase de SEQ ID NO: 1 caracterizada pelo fato de que compreende as substituições S9E+Q206L+L262E, em que (a) as posições correspondem às posições do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; (b) a variante tem atividade de protease; e (c) a variante tem uma atividade residual pelo menos 5% mais elevada do que uma subtilase com SEQ ID NO: 1 quando medida após 47 horas a 60°C em detergente líquido com pH 8.

2. Variante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente a substituição N76D.

3. Variante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais alterações selecionadas do grupo consistindo em S3T, V4I, A15T, S24G, S24R, K27R, *36D, N43A, N43C, N43L, N43R, N43W, V68A, I72A, I72V, S78D, N87R, N87S, *97E, A98S, S99A, S99D, S99A, S99D, S99E, S99G, *99D, S101D, S101E, S101G, S101I, S101K, S101L, S101M, S101N, S101R, S103A, V104F, V104I, V104N, V104Y, S106A, A114V, G115T, G115W, G118R, G118V, H120D, H120I, H120N, H120T, H120V, N123S, S128A, S128L, S128S, P129D, P129N, P129Q, S130A, V147W, V149C, V149N, A158E, G160D, G160P, S161C, S161E, I162L, S163A, S163D, Y167A, R170S, Q182C, Q182E, N185C, N185E, S188C, S188D, S188E, Q191N, A194P, G195E, V199M, N204D, N204V, V205I, Y209W, S212A, S212D, S212G, S212N, S216I, S216T, S216V, L217C, L217D, L217E, L217M, L217Q, L217Y, N218D, N218E, N218T, M222C, M222R, M222S, P225A, A232V, K235L, Q236H, Q245K, Q245R, N252K, T255C, T255E, S256A, S256C, S256D, S256V, S256Y, S259D, T260E, T260P, N261C, N261E, N261F, N261L, N261M, N261V, N261W, N261Y, e T274A, em que "*" antes de uma posição de aminoácido indica uma inserção e em que cada posição corresponde à posição do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

4. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada pelo fato de que compreende ou consisti de um conjunto de alterações selecionadas do grupo que consiste em: • S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E+ *275aH+ *275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+G160P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; • S9E+N43R+N76D+G160P+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T260A+ L262E; • S9E+N43R+N76D+N185E+S188E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S216V+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E; • S9E+N43R+N76D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+ S216V+ L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+S78H+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+S259D+ N261W+ L262E; • S9E+N76D+V205I+Q206L+Y209W+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+ N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+ S212G+ S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+L217M+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S216T+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E+ *275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A158E+S161E+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S259D+ N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+ N261W+ L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V 205I + Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q 206L+ Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E; • S9E+G20H+T22H+S24H+N43R+N76D+G160D+S161E+A194P+N204D+V20 5I + Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N 204D+ V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q 206L+ Y209W+N238H+S259D+L262E+*275aR; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+P129D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y 2 0 9W+ S212G+S216V+N238H+S256D+T260A+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+Y 2 0 9W+ N238H+S259D+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+Q 206L+ Y209W+S212G+S216V+N238H+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+G160D+S161E+A194P+Q206L+Y209W+N 238H+ S259D+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y 2 0 9W+ S212G+S216V+N238H+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y 2 0 9W+ S212G+S216V+N238H+L262E+*275aR; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S 212G+ S216V+N238H+S256D+T260A+L262E; • S9E+N43R+A48H+N76D+N117H+A194P+Q206L+Y209W+N238H+S259D+T 2 60A+ L262E; • S9E+N43R+G61E+N76D+Q206L+L262E; • S9E+N43R+I72A+N76D+G115W+H120V+P129D+A158E+G160P+Q182E+N 185E+ S188E+Q191N+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+T2 55E+ S256D+S259D+T260E+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+Y91H+N117H+A194P+G195E+N204D+V205I+Q206L+Y 2 0 9W+ S212G+S216V+N238H+L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+ Y209W+ S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S256D+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+ S259D+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+V205I+Q206L+ Y209W+ S212G+S216V+L262E+*275bH+*275aH; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+A194P+N204D+V205I+ Q206L+ Y209W+S212G+S216V+L262E+*275bH *275aH; • S9E+N43R+N76D+*99aE+P131*+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+P129D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+ L262E; • S9E+N43R+N76D+G115W+H120V+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+G115W+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+ V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+ V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+N204D+ V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E+*275aR; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+ Y209W+ N238H+S259D+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+ Y209W+ S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+A194P+N204D+ V205I+ Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; 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• S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ T260A+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ T260A+L262E+*275aR; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S256D+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ S259D+ N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ T260A+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+H120V+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S256D+ N261W+ L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N43R+N76D+Q182E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S259D+N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+S188E+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S216V+L262E; • S9E+N76D+Q182E+V205I+Q206L+Y209W+S256D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+N117H+H120D+A158E+G160P+S161E+A194P+Q206L+ Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+N204D+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+V205I+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S212G+S216V+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+T255E+S256D+S259D+T260E+ N261W+ L262E; • S9E+N43R+N76D+Q182E+N185E+S188E+Q191N+A194P+Q206L+Y209W+ S259D+ L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+T260A+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+N261W+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+Y209W+S259D+L262E+*275aH+*275b H; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+S259D+L262E; • S9E+N43R+N76D+A194P+Q206L+L262E; • S9E+G61E+N76D+N117H+H120D+G160D+S161E+S163G+Q206L+L262E+ *275aH+ *275bH; • S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+S256D+T260A+L262E+*275aH+*275b H; • S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+T260A+L262E; • S9E+G61E+N76D+P129D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+A158E+G160P+S161E+Q206L+ L262E; • S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+N204D+Q206L+Y209W+L262E+ *275aR; • S9E+G61E+N76D+Q137H+S141H+R145H+Q206L+L262E; • S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E; • S9E+G61E+N76D+A158E+G160P+S161E+Q206L+L262E+*275aH+*275b H; • S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E; • S9E+G61E+N76D+N204D+Q206L+Y209W+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+G61E+N76D+Q206L+Y209W+S256D+L262E; • S9E+G61E+N76D+Q206L+S256D+L262E; • S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E; • S9E+G61E+N76D+Q206L+L262E+*275aH+*275bH; • S9E+N76D+Q206L+Y209W+N261W+L262E; • S9E+N76D+Q206L+Y209W+L262E; e • S9E+N76D+Q206L+L262E; em que "*" antes de uma posição de aminoácido indica uma inserção e "*" após uma posição de aminoácido indica uma exclusão.

5. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 25% de estabilidade melhorada em comparação com uma subtilase com SEQ ID NO: 1.

6. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada pelo fato de que tem um desempenho de lavagem melhorado em comparação com SEQ ID NO: 1.

7. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 10%, como pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, em pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 160% ou pelo menos 170% atividade residual mais elevada do que uma subtilase com a SEQ ID NO: 1 quando medida após 47 horas a 60°C em detergente líquido com pH 8.

8. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato de que o número total de alterações em comparação com a SEQ ID NO: 1 é entre 3 e 30, preferencialmente entre 3 e 20, mais preferencialmente entre 3 e 15, ainda mais preferencialmente entre 3 e 10, mais preferencialmente entre 3 e 8 alterações.

9. Variante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de que a variante consiste em 260 a 280 ou 269 a 275 aminoácidos.

10. Composição detergente caracterizada pelo fato de que compreende uma variante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-9 e um ou mais componentes detergentes.

11. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que os componentes detergentes compreendem uma ou mais enzimas adicionais selecionadas do grupo consistindo de amilases, catalases, celulases, cutinases, haloperoxigenases, lipases, mananases, pectinases, pectina liases, peroxidases, proteases, xantanases, e xiloglucanases, ou qualquer sua mistura.

12. Composição detergente, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que é na forma de uma barra, um comprimido homogêneo, um comprimido tendo duas ou mais camadas, uma bolsa tendo um ou mais compartimentos, um pó regular ou compacto, um grânulo, uma pasta, um gel, ou um líquido regular, compacto ou concentrado.

13. Uso da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 10-12 caracterizado pelo fato de que é em um processo de limpeza, tal como lavagem de roupa ou limpeza de superfícies duras tal como lavagem de louça.

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