BR112017005104B1 - Derivados de 5,6-di-hidro-4h-benzotieno-[2,3-d]azepina, seus usos, composição farmacêutica e processo para a preparação dos mesmos - Google Patents

Abstract

DERIVADO DE 5,6-DI-HIDRO-4H-BENZOTIENO-[2,3-D]AZEPINA. A presente invenção refere-se a um derivado de 5,6-di-hidro-4H-benzotieno-[2,3-d]azepina que é útil no tratamento de infecção por vírus sincicial respiratório humano (RSV) e para a prevenção de doença associada com infecção por RSV.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um composto, composições contendo o mesmo, processo para fabricação do dito composto e seu uso na terapia. O composto da invenção é destinado a tratar ou prevenir infecções por vírus sincicial respiratório e doença associada particularmente às infecções causadas pelas respectivas cepas A e B. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[002] O vírus sincicial respiratório humano (RSV) é um pneumoví- rus da família do paramixovírus e a causa mais comum de bronquiolite e pneumonia em bebês abaixo de um ano de idade. A maioria das crianças é infectada com RSV antes de seu Segundo aniversário resultando de 75 a 125.000 hospitalizações. Acredita-se que os custos médicos associados excedem $650 milhões de dólares anualmente somente nos Estados Unidades. Além disso, infecções virais respiratórias na infância, notavelmente com RSV, aumentam o risco do desenvolvimento subsequente de asma infantil (Holt and Sly, 2002.). A infecção por RSV pode produzir doença do trato respiratório inferior grave em paciente de qualquer idade. Os idosos, bem como aqueles que têm os sistemas cardíaco, pulmonar e imunológico comprometidos são particularmente vulneráveis e estima-se que cerca de 14.000 mortes ocorrem anualmente nos Estados Unidades em indivíduos acima de 65 anos de idade. Além disso, a infecção por RSV está cada vez mais considerada como um importante precipitador de exacerbações em pacientes que sofrem de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) (Mohan et al., 2010) bem como asma (Newcomb and Peebles, 2009) e fibrose cística (Abman et al., 1988). Em adultos imunocom- Segue-se folha 1a/58 prometidos, aproximadamente 50% das infecções do trato respiratório

[003] A porta inicial de entrada do RSV é através do nariz ou olhos em vez da boca (Hall et al., 1981). Uma vez estabelecido no trato respiratório superior, o vírus é capaz de migrar rapidamente para dentro dos pulmões. A patofisiologia da infecção por RSV foi investigada em um estudo de tecidos do pulmão obtidos de crianças falecidas (Johnson et al., 2007). O exame de quatro indivíduos revelou imunocoloração de células epiteliais indicando a presença de RSV, sem células basais sendo afetadas. A localização epitelial do organismo patogênico fornece um desafio para o tratamento, visto que uma concentração supraeficaz do princípio ativo precisa ser mantida no local celular discreto para possibilitar que a infecção seja tratada e subsequentemente removida.

[004] O vírus RSV existe como dois subgrupos antigênicos: A e B. Os vírus da cepa A de RSV foram considerados anteriormente como os patógenos do subgrupo responsável pela maioria das doenças clínicas e foram relatados para produzir uma patologia mais sintomática (Walsh et al., 1997; Panayiotou et al., 2014). Uma cepa A de RSV comum é RSV A2 (Olivier et al., 2009). Entretanto, durante um recente surto na China, foi descoberto que as cepas do vírus RSV subgrupo B predominam na população afetada (Zhang et al., 2010).

[005] Ao longo das duas últimas décadas, foi feito progresso considerável no tratamento de várias doenças virais incluindo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e ambas hepatite B e hepatite C. Em todos esse casos, as terapias padrão ouro evoluíram, o que consiste em tratamentos de combinação que foram trazidos, pelo menos até certo ponto, em resposta ao surgimento da doença resistente ao fár- maco.

[006] Os fármacos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de infecções agudas por RSV consistem em ribavirina (aerossol) e o anticorpo monoclonal humanizado, palivizu- mab (Synagis). O último agente visa à proteína de fusão (F) de RSV e é limitado ao uso profilático em pacientes pediátricos de alto risco. Além disso, variantes clínicos resistentes à neutralização por palivizu- mab foram recentemente identificados (Zhu et al., 2011) e, portanto, nenhuma vacina verdadeiramente eficaz está atualmente disponível. O uso de ribavirina é limitado por sua baixa potência contra o vírus e por preocupações sobre seu perfil de efeito colateral. Consequentemente, há uma necessidade urgente, não atendida para a descoberta de terapias novas, seguras e eficazes contra infecção por RSV tendo um perfil clínico melhorado. Além disso, em vista da proeminência emergente das cepas B de RSV em doença clínica é altamente desejável que esses tratamentos sejam eficazes contra infecções que surgem de ambas as cepas A de RSV e B de RSV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula (I),

que é: N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azas- piro[3.5]nonan-2-il)nicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno [2,3- d] azepina-2-carboxamida. ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ("o com-posto da invenção").

[008] Os dados biológicos divulgados aqui revelam que o com- posto da invenção inibe o efeito citopático associado com a infecção por cepas A de RSV, e também inibe o efeito citopático associado com infecção por cepas B de RSV.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[009] A Figura 1 mostra o efeito do Composto (I) no título do vírus em células epiteliais cultivadas por interface ar-líquido (ALI) infectadas por RSV A2 após intervenção precoce com composto de teste.

[0010] A Figura 2 mostra o efeito do Composto (I) no título do vírus em células epiteliais cultivadas por interface ar-líquido (ALI) infectadas por RSV A2 após intervenção tardia com composto de teste.

[0011] A Figura 3 mostra o efeito do Composto (I) no título do vírus nos pulmões de camundongos infectados por RSV A2.

[0012] A Figura 4 mostra o efeito do Composto (I) no título do vírus nos pulmões de ratos de algodão infectados por RSV A2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] Os sais farmaceuticamente aceitáveis do composto da fórmula (I) incluem, em particular, sais de adição de ácido farmaceutica- mente aceitáveis do dito composto. Os sais de adição de ácido farma- ceuticamente aceitáveis do composto da fórmula (I) pretendem com-preender os sais de adição de ácido não tóxicos terapeuticamente ativos que o composto da fórmula (I) é capaz de formar. Esses sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem convenientemente ser obtidos pelo tratamento de forma de base livre com tais ácidos apropriados em um solvente adequado ou mistura de solventes. Os ácidos apropriados compreendem, por exemplo, ácidos inorgânicos tais como ácidos hidro-hálicos, por exemplo, ácido clorídrico ou bromí- drico, ácidos sulfúrico, nítrico, fosfórico e similar; ou ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético, propanoico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, malônico, succínico, maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, p-tolue- nossulfônico, ciclâmico, salicílico, p-aminossalicílico, pamoico e similar.

[0014] Inversamente, as ditas formas de sal podem ser convertidas pelo tratamento com uma base apropriada na forma de base livre.

[0015] Os sais, como referidos aqui, por exemplo, em relação aos compostos intermediários, incluem sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles mencionados acima, bem como outros sais que podem ser desfavorecidos para uso farmacêutico. Os sais de compostos ácidos incluem sais formados com íons positivos dos metais do Grupo 1 e Grupo 2 incluindo íons de sódio, cálcio e magnésio, bem como com cátions inorgânicos tais como íon de amônio.

[0016] A definição do composto da fórmula (I) é destinada a incluir todos os estereoisômeros do dito composto. Os estereoiômeros, conforme empregados aqui, referem-se a moléculas isoméricas que têm a mesma fórmula molecular e sequência de átomos ligados (constituição), mas que diferem apenas nas orientações tridimensionais de seus átomos no espaço. Esse contraste com isômeros estruturais, que compartilham a mesma fórmula molecular, mas ligam as conexões e/ou sua ordem difere entre diferentes átomos/grupos. Nos estereoi- sômeros, as conexões de ordem e ligação dos átomos constituintes permanecem as mesmas, mas sua orientação no espaço difere.

[0017] A definição do composto da fórmula (I) é destinada a incluir todos os tautômeros do dito composto.

[0018] A definição do composto da fórmula (I) é destinada a incluir todos os solvatos do dito composto (incluindo solvatos de sais do dito composto) a menos que o contexto indique especificamente de outra maneira. Exemplos de solvatos incluem hidratos.

[0019] O composto da descrição inclui variantes isotópicas em que um ou mais átomos especificados são isótopos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em uma modalidade, o isótopo é um isó- topo solúvel. Assim, o composto da descrição inclui, por exemplo, ver-sões rotuladas de deutério e similares.

[0020] A descrição também se estende para todas as formas poli- mórficas do composto aqui definido.

[0021] Os novos intermediários, conforme descrito aqui [tal como, por exemplo, compostos da fórmula (II), (III), (IV), (VI) e (X)] formam um aspecto adicional da invenção, como os sais respectivos (tais como sais farmaceuticamente aceitáveis).

[0022] O composto da invenção é útil como um produto farmacêutico.

[0023] Em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o composto da invenção opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou portadores farmaceutica- mente aceitáveis.

[0024] Adequadamente, o composto da invenção é administrado topicamente ao pulmão ou nariz, particularmente, topicamente ao pulmão. Assim, em uma modalidade, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o composto da invenção opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou portadores topicamente aceitáveis.

[0025] Adequadamente, as composições para administração pulmonar ou intranasal incluem pós, soluções líquidas, suspensões líquidas, gotas nasais compreendendo soluções ou suspensões ou aerossóis pressurizados ou não pressurizados.

[0026] As composições podem ser convenientemente administradas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bem-conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). As composições também podem ser convenientemente administradas em forma de dosagem unitária múltipla.

[0027] A administração tópica para o nariz ou pulmão pode ser alcançada pelo uso de uma formulação não pressurizada tal como uma solução ou suspensão aquosa. Tais formulações podem ser administradas por meio de um nebulizador, por exemplo, um que pode ser portátil e transportável ou para uso doméstico ou hospitalar (isto é, não transportável). Um dispositivo exemplar é um inalador RESPIMAT. A formulação pode compreender excipientes tais como água, tampões, agentes de ajuste de tonicidade, agentes de ajuste de pH, modificadores de viscosidade, tensoativos e cossolvente (tais como etanol). A suspensão líquida e as formulações em aerossol (se pressurizado ou não pressurizado) tipicamente conterão o composto da invenção na forma finamente dividida, por exemplo, com um D50 de 0,5 a 10 μm, por exemplo, em torno de 1 a 5 μm. As distribuições do tamanho de partícula podem ser representadas usando os valores de D10, D50 e D90. O valor mediano de D50 das distribuições de tamanho de partícula é definido como o tamanho da partícula em mícrons que divide a distribuição na metade. A medição derivada da difração a laser é mais precisamente descrita como uma distribuição de volume, e consequentemente, o valor de D50 obtido usando esse procedimento é mais significativamente referido como um valor de Dv50 (mediano para uma distribuição de volume). Conforme usado aqui, os valores de Dv referem- se às distribuições de tamanho de partícula medidas usando difração a laser. Similarmente, os valores de D10 e D90, usados no contexto da difração a laser, são considerados para significar os valores de Dv10 e Dv90 e referem-se ao tamanho de partícula, pelo que 10% da distribuição estão abaixo do valor de D10, e 90% da distribuição estão abaixo do valor de D90, respectivamente.

[0028] De acordo com um aspecto específico da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o composto da invenção na forma particulada suspensa em um meio aquoso. O meio aquoso tipicamente compreende água e um ou mais excipientes sele-cionados de tampões, agentes de ajuste de tonicidade, agentes de ajuste de pH, modificadores de viscosidade e tensoativos.

[0029] A administração tópica para o nariz ou pulmão também pode ser alcançada pelo uso de uma formulação em aerossol. As formulações em aerossol tipicamente compreendem o princípio ativo suspenso ou dissolvido em um propulsor aerossol adequado, tal como clo- rofluorocarbono (CFC) ou um hidrofluorocarbono (HFC). Os propulsores CFC adequados incluem tricloromonofluorometano (propulsor 11), diclorotetrafluorometano (propulsor 114), e diclorodifluorometano (pro-pulsor 12). Os propulsores HFC adequados incluem tetrafluoroetano (HFC-134a) e heptafluoropropano (HFC-227). O propulsor tipicamente compreende de 40% a 99,5%, por exemplo, de 40% a 90% do peso da composição de inalação total. A formulação pode compreender excipi- entes incluindo cossolventes (por exemplo, etanol) e tensoativos (por exemplo, lecitina, sorbitano trioleato e similar). Outros excipientes pos-síveis incluem polietileno glicol, polivinilpirrolidona, glicerina e similar. As formulações em aerossol são embaladas em latas e uma dose adequada é liberada por meio de uma válvula de medição (por exemplo, como fornecido por Bespak, Valois ou 3M ou alternativamente por Aptar, Coster ou Vari).

[0030] A administração tópica para o pulmão também pode ser alcançada pelo uso de uma formulação de pó seco. Uma formulação de pó seco conterá o composto da descrição na forma finamente dividida, tipicamente com um MMD de 1 a 10 μm ou um D50 de 0,5 a 10 μm, por exemplo, em torno de 1 a 5 μm. Os pós do composto da invenção, na forma finamente dividida, podem ser preparados por um processo de micronização ou processo de redução de tamanho similar. A micronização pode ser realizada usando um moinho de jato tal como aqueles fabricados por Hosokawa Alpine. A distribuição de tamanho de partícula resultante pode ser medida usando difração a laser (por exemplo, com um instrumento Malvern Mastersizer 2000S). A formulação conterá tipicamente um diluente topicamente aceitável tal como lactose, glicose ou manitol (preferencialmente, lactose), usualmente de tamanho comparativamente grande, por exemplo, um MMD de 50 μm ou mais, por exemplo, 100 μm ou mais ou um D50 de 40 a - 150 μm. Conforme usado aqui, o termo "lactose" refere-se a um componente contendo lactose, incluindo monoidrato de α-lactose, monoi- drato de β-lactose, α-lactose anidra, β-lactose anidra e lactose amorfa. Os componentes de lactose podem ser processados por micronização, peneiramento, compressão, aglomeração ou secagem por pulverização. As formas comercialmente disponíveis de lactose em várias formas também estão englobadas, por exemplo, produtos de Lactohale® (lactose de grau inalatório; DFE Pharma), InhaLac®70 (lactose peneirada para inalador de pó seco; Meggle), Pharmatose® (DFE Pharma) e Respitose® (lactose peneirada de grau inalatório; DFE Pharma). Em uma modalidade, o componente de lactose é selecionado do grupo consistindo em monoidrato de α-lactose, α-lactose anidra e lactose amorfa. Preferencialmente, a lactose é monoidrato de α-lactose.

[0031] As formulações de pó seco também podem conter outros excipientes tais como estearato de sódio, estearato de cálcio ou estea- rato de magnésio.

[0032] Uma formulação de pó seco é tipicamente liberada usando um dispositivo inalador de pó seco (DPI). Sistemas exemplares de liberação de pó seco incluem SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS, SKYEHALER, ACCUHALER e CLICKHALER. Outros exemplos de sistemas de liberação de pós secos incluem ECLIPSE, NEXT, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, MONODOSE, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIPTA, inalador de pó seco ORIEL, MI-CRODOSE, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELO- VAIR e PROHALER.

[0033] O composto da invenção é útil no tratamento de infecção por RSV e para a prevenção ou tratamento de doença associada com infecção por RSV.

[0034] Em um aspecto da invenção, é fornecido o uso do composto da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de infecção por RSV e para a prevenção ou tratamento de doença associada com infecção por RSV.

[0035] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo infectado com RSV que compreende ad-ministrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz do composto da in-venção.

[0036] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção ou tratamento de doença associado com infecção por RSV em um indivíduo que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz do composto da invenção.

[0037] O composto da invenção pode ser usado em uma configuração profilática por sua administração antes da infecção.

[0038] Em uma modalidade, a infecção por RSV é a infecção pela cepa A de RSV (por exemplo, com uma cepa A2 de RSV A2). Em ou- tramodalidade, a infecção por RSV é a infecção pela cepa B de RSV (por exemplo, com cepa B Washington de RSV).

[0039] Indivíduos incluem indivíduos seres humanos e animais, especialmente indivíduos humanos.

[0040] O composto da invenção é especialmente útil para o tratamento de infecção por RSV e para a prevenção ou tratamento de do- ença associada com infecção por RSV em indivíduos em risco. Indiví-duos em risco incluem bebês prematuros, crianças com defeitos con-gênitos do pulmão ou coração, indivíduos imunocomprometidos (por exemplo, aqueles de sofrem de infecção por HIV), indivíduos idosos e indivíduos que sofrem de uma condição de saúde crônica que afeta o coração ou pulmão (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva ou doença pulmonar obstrutiva crônica).

[0041] O composto da invenção pode ser administrado em combinação com um segundo princípio ativo ou adicional. O composto da invenção pode ser coformulado com um segundo princípio ativo ou adicional ou o segundo princípio ativo ou adicional pode ser formulado para ser administrado separadamente pela mesma via ou diferente. De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um kit de partes compreendendo (a) uma composição farmacêutica compreendendo o composto da invenção opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou portadores; (b) uma composição farmacêutica com-preendendo um segundo princípio ativo opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou portadores; (c) opcionalmente uma ou mais composições farmacêuticas adicionais, cada compreendendo um terceiro princípio ativo ou adicional opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou portadores; e (d) instruções para a administração das composições farmacêuticas a um indivíduo com essa necessidade. O indivíduo com essa necessidade por sofrer ou ser suscetível à infecção por RSV.

[0042] Os segundos princípios ativos ou adicionais incluem princípios ativos adequados para o tratamento ou prevenção de infecção por RSV ou doença associada com infecção por RSV ou condições co- mórbidas com infecção por RSV.

[0043] Os segundos princípios ativos ou adicionais podem, por exemplo, ser selecionados de agentes antivirais (tais como outros agentes anti-RSV) inibidores de proteína F (incluindo anticorpos anti- proteína F, tais como palivizumab), inibidores de RNA polimerase e ribavirina e agentes anti-inflamatórios.

[0044] O composto da invenção pode ser administrado em um intervalo adequado, por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou quatro vezes ao dia.

[0045] Espera-se que uma quantidade de dose adequada para um humano de peso médio (50 a 70 kg) seja em torno de 50 μg a 10 mg/dia, por exemplo, de 500 μg a 5 mg/dia, embora a dose precisa a ser administrada possa ser determinada por um versado na técnica.

[0046] Espera-se que o composto da invenção tenha um ou mais dos seguintes atributos favoráveis:

[0047] inibição potente de efeito citopático e/ou replicação de vírus e/ou expressão de proteína F em humanos (ou um modelo animal, ou um sistema in vitro) causadas pelas cepas A de RSV, tal como a cepa A2;

[0048] inibição potente de efeito citopático e/ou replicação de vírus e/ou expressão de proteína F em humanos (ou um modelo animal, ou um sistema in vitro) causadas pelas cepas B de RSV;

[0049] longa duração de ação nos pulmões, preferencialmente consistente com dosagem uma vez ao dia; e

[0050] perfil de segurança aceitável, especialmente seguindo ad-ministração tópica ao pulmão ou nariz.

SEÇÃO EXPERIMENTAL

[0051] As abreviações usadas aqui são definidas abaixo (Tabela 1). Quaisquer abreviações não definidas são destinadas a transmitir seu significado geralmente aceito.

PROCEDIMENTOS GERAIS

[0052] Todos os materiais de partida e solventes foram obtidos de fontes comerciais ou preparados de acordo com a citação da literatura. Salvo indicação em contrário, todas as reações foram agitadas. As so-luções orgânicas foram rotineiramente secadas em sulfato de magnésio anidro. As hidrogenações foram realizadas em um reator de fluxo em cubo Thales H sob as condições estabelecidas.

[0053] A cromatografia de coluna foi realizada em cartuchos de sílica pré-embalados (230 a 400 mesh, 40 a 63 μm) usando a quantidade indicada. SCX foi comprador de Supelco e tratado com ácido clorídrico a 1M antes do uso. Salvo indicação ao contrário, a mistura de reação a ser purificada foi primeiro diluída com MeOH e acidificada com algumas gotas de AcOH. Essa solução foi carregada diretamente no SCX e lavada com MeOH. O material desejado foi então diluído por lavagem com NH3 a 0,7 M em MeOH.

[0054] Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Fase Reversa Preparativa: coluna Waters X-Select CSH C18, 5 μm (19 x 50 mm), vazão de 28 mL min-1 eluindo com um gradiente H2O-MeCN contendo 0,1% em v/v de ácido fórmico durante 6,5 min usando detecção UV a 254 nm. Informação do gradiente: 0,0 a 0,2 min, 35% de MeCN; 0,2 a 5,5 min, aumentado de 35% de MeCN para 65% de MeCN; 5,5 a 5,6 min, aumentado de 65% de MeCN para 95% de MeCN; 5,6 a 6,5 min, mantido em 95% de MeCN.

MÉTODOS ANALÍTICOS E ESPECTROSCÓPICOS

[0055] Condições de HPLC de Fase Reversa para Análise de LCMS: coluna Waters X-select CSH C18 XP, 2,5 μm (4,6 x 30 mm) a 40°C; vazão 2,5 a 4,5 mL min -1 eluída com um gradiente H2O e MeCN contendo 0,1% em v/v de ácido fórmico durante 4 min empregando detecção UV a 254 nm. Informação do gradiente: 0 a 3,00 min, aumentado de 95% de H2O e 5% de MeCN para 5% de H2O e 95% de MeCN; 3,00 a 3,01 min, mantido em 5% de H2O e 95% de MeCN, vazão aumentada para 4,5 mL min-1; 3,01 a 3,50 min, mantido em 5% de H2O e 95% de MeCN; 3,50 a 3,60 min, retornado para 95% de H2O e 5% de MeCN, vazão reduzida para 3,50 mL min-1; 3,60 a 3,90 min, mantido a 95% de H2O e 5% de MeCN; 3,90 a 4,00 min, mantido em 95% de H2O e 5% de MeCN, vazão reduzida para 2,5 mL min-1.

[0056] Espectroscopia de 1H RMN: Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro Bruker Avance III a 400 MHz usando solvente não deuterado residual como referência e, salvo indicação em contrário, foram executados em DMSO-d6.

MÉTODOS PARA A SÍNTESE DO COMPOSTO (I)

[0057] Estratégias sintéticas não limitantes que foram usadas para preparar o composto da presente invenção são resumidas abaixo (Es-quema 1). Todas as vias divulgadas para o Composto (I) se originam do derivado de azepina, intermediário (VIIIa), que é prontamente acessível, em três etapas, de materiais de partida comercialmente disponíveis. As principais variações surgem da ordem em que as transformações sintéticas são aplicadas ao dito intermediário chave (VIIIa), gerando, assim, três precursores diferentes para composto (I): a saber, Intermediários (II), (III) e (IV). Via 1, compreende o acoplamento de amida do ácido tiofeno carboxílico (II) com 2-flúor-6-metilanilina. Um método preparativo alternativo, Via 2, explora a formação do composto (I) do intermediário 2-cloronicotinamida (III) por uma reação de deslocamento SNAr como a amina espirocíclica: 7-oxa-2-azaspiro[3.5] nonano. Esse procedimento foi ampliado para fornecer o composto (I) em um único lote de mais de 0,5 kg e essa campanha sintética também é descrita aqui abaixo. Uma terceira abordagem para o composto (I) é Via 3, que consiste em uma reação de acoplamento de amida entre a anilina (IV) e o ácido 2-aminonicotínico pré-formado (VI). Esquema 1: Vias sintéticas usadas para a preparação do Composto (I).

[0058] Os grupos genéricos LG e LG1 no Esquema 1 representam grupos de saída, de modo que os compostos resultantes sejam convertidos em eletrófilos reativos. Exemplos de grupos de saída adequados incluem átomos de halogênio, tais como Cl e Br, em que Cl é tipicamente preferido devido à pronta disponibilidade e uso de reagentes para sua formação. Aqueles especialistas na técnica apreciarão que exemplos adicionais de grupos de saída comuns, usados nesse contexto, incluem mesilato, tosilato ou triflato [p-trifluometilsulfonato]. Uma revisão das metodologias para a preparação de amidas é coberta em: ’Amide bond formation and peptide coupling’ Montalbetti, C.A.G.N. e Falque, V. Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852. No presente caso, o grupo alquila Ra é etila e, mais geralmente, é alquila inferior tal como C1-6aquila ou C1-4alquila. 2-cloro-5-metilnicotinato de etila.

[0059] Em uma solução de ácido 2-cloro-5-metilnicotínico (3,90 g, 22,7 mmols) em DCM (100 mL) foi adicionado cloreto de oxalila (9,95 mL, 114 mmols) seguido por 1 gota de DMF. A mistura resultante foi agitada à TA por 30 min e evaporada in vacuo. O resíduo assim obtido foi retomado em EtOH (66 mL), agitado por mais 2 h e então evaporado in vacuo. O produto bruto obtido foi purificado por cromatografia de coluna flash (SiO2, 120 g, 0 a 50% de DCM em iso-hexano, eluição de gradiente) para se obter o composto do título como um óleo incolor (3,71 g, 82% de rendimento); 1H RMN δ: 1,32 (3H, t), 2,34 (3H, s), 4,34 (2H, q), 8,06-8,07 (1H, m), 8,41-8,43 (1H, m). [Ver também: Yamamoto S. et al., Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 422-434.] 5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan-2-il)nicotinato de etila.

[0060] Uma mistura de 2-cloro-5-metilnicotinato de etila (3,70 g, 18,5 mmols), 7-oxa-2-azaspiro[3.5] nonano hemi oxalato (9,57 g, 55,6 mmols) e DIPEA (19,4 mL, 111 mmols) em NMP (50 mL) foi aquecida a 150°C por 2 h. Após resfriar à TA, a mistura bruta foi derramada em água (200 mL) e extraída com EtOAc (3 x 200 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (2 x 100 mL), e então secados e evaporados in vacuo para se obter o composto do título (4,81 g, g, 88% de rendimento); Tr 1,32 min; m/z 291 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,29 (3H, t), 1,67 (4H, br t), 2,18 (3H, s), 3,52 (4H, br t), 3,67 (4H, s), 4,25 (2H, q), 7,74 (1H, dd aparente), 8,12 (1H, dd aparente). Ácido 5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan-2-il)nicotínico: Inter-mediário (VI).

[0061] Uma mistura de 5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan-2-il) nicotinato de etila (4,1 g, 14 mmols) e hidróxido de lítio (0,50 g, 21 mmols) em THF:água (4:1, 50 mL) foi aquecida a 50°C por 18 h e então evaporada in vacuo. O resíduo assim obtido foi acidificado para pH 4 pela adição de ácido clorídrico a 1 M e a mistura resultante extraída com EtOAc (10 x 250 mL). Os extratos orgânicos combinados foram evaporados in vacuo para se obter o composto do título como um sólido cristalino (3,4 g, 92% de rendimento); Tr 0,42 min; m/z 263 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,67 (4H, br t), 2,17 (3H, s), 3,52 (4H, br t), 3,69 (4H, s), 7,74 (1H, dd aparente), 8,09 (1H, dd aparente), 12,69 (1H, br). 1-(4-Nitrobenzoil)-1,2,3,4-tetra-hidro-5H-benzoazepin-5-ona.

[0062] Em uma solução de 1,2,3,4-tetra-hidro-benzoazepin-5-ona (25,0 g, 155 mmols) em piridina (124 mL) à TA foi adicionada em gotas uma solução de cloreto de 4-nitrobenzoíla (57,6 g, 310 mmols) em MeCN (124 mL). A mistura resultante foi agitada à TA por 16 h e foi então extinta cuidadosamente com água (50 mL) e extraída com EtO- Ac (100 mL). Os extratos orgânicos foram lavados sequencialmente com NaHCO3 aq sat (100 mL), NH4Cl aq sat (2 x 100 mL), água (100 mL), salmoura (100 mL), e finalmente com 1 M ácido clorídrico (2 x 100 mL), secado e os voláteis evaporados in vacuo. O sólido bruto assim obtido foi misturado com MeOH (300 mL) e foi coletado por filtração e secado para se obter o composto do título como um sólido amarelo claro (44,8 g, 93% puro por HPLC, 93% de rendimento); Tr 1,92 min; m/z 311 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado na etapa subsequente sem purificação adicional. 5-Cloro-1-(4-nitrobenzoil)-2,3-di-hidro-1H-benzoazepina-4-carbal- deído.

[0063] Em DMF pura (236 mL) a 0°C foi adicionado, e m gotas, tri- cloreto de fosforila (15,8 mL,170 mmols) e a mistura resultante tratada com uma solução de 1-(4-nitrobenzoil)-1,2,3,4-tetra-hidro-5H-benzo azepin-5-ona (44,8 g, 141 mmols) em DMF (141 mL) (a última obtida pelo aquecimento de uma suspensão a 90°C até total dissolução do sólido ter ocorrido e a solução adicionada enquanto ainda quente) enquanto mantém a temperatura interna entre 0 e 5°C. A mistura de reação foi agitada a 0°C por 15 min, então deixada ati ngir a TA por 30 min e depois disso, ela foi aquecida a 80°C por 72 h. A mistura resultante foi resfriada à TA e foi particionada entre EtOAc (500 mL) e sat aq NaOAc (500 mL). A camada aq foi separada e foi lavada com EtOAc (2 x 500 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (8 x 300 mL), e então secados e evaporados in vacuo para dar um sólido marrom. O produto bruto assim obtido foi misturado com MeOH (300 mL) e foi coletado por filtração e secado para se obter o composto do título como um sólido amarelo (25,8 g, 88% puro por HPLC, 51% de rendimento); Tr 2,28 min; m/z 357 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado na etapa subsequente sem purificação adicional. 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-car- boxilato de etila: Intermediário (VIIIa)

[0064] Em uma solução de 5-cloro-1-(4-nitrobenzoil)-2,3-di-hidro- 1H-benzoazepina-4-carbaldeído (36,6 g, 89,0 mmols) em piridina (260 mL) à TA foi adicionado 2-mercaptoacetato de etila (18,6 mL, 170 mmols) seguido por trietilamina (81,0 mL). A mistura de reação foi aquecida a 70°C por 1 h, e a 118°C por 2 h e foi en tão resfriada à TA. O precipitado branco que se formou foi removido por filtração e o filtrado concentrado in vacuo. O resíduo resultante foi tomado em DCM (100 mL) e foi lavado com água (100 mL) e então com ácido clorídrico a 1 M (70 mL). Os extratos orgânicos foram secados e evaporados in vacuo. O sólido bruto assim obtido foi misturado com MeOH (150 mL), coletado por filtração e secado para se obter o composto do título como um sólido amarelo (34,2 g, 84% de rendimento); Tr 2,65 min; m/z 423 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,32 (3H, t), 3,09-3,17 (1H, m), 3,28-3,41 (assume 2H, obscurecido pelo solvente), 4,33 (2H, q), 4,83-4,92 (1H, m), 6,96 (1H, br d), 7,10 (1H, td), 7,24 (2H, br d), 7,28 (1H, td), 7,787,81 (2H, s e dd sobrepostos), 8,06 (2H, br d). Ácido 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] azepina- 2-carboxílico: Intermediário (VII).

[0065] Em uma solução de 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-ben- zo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (1,50 g, 3,55 mmols) em uma mistura de THF:MeOH (1:1, 36 mL) foi adicionado NaOH aq a 2 M (9,0 mL) e a mistura aquecida a 50°C por 2 h. Apó s resfriar à TA, a mistura foi particionada entre EtOAc (200 mL) e água (200 mL). A camada aq foi separada e foi acidificada em pH 3 pela adição de ácido clorídrico a 1 M e então extraída com EtOAc (2 x 150 mL). A remoção dos voláteis in vacuo proporcionou o composto do título, como um sólido amarelo (1,44 g, 99% de rendimento); Tr 2,24 min; m/z 395 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 3,06-3,17 (1H, m), 3,27-3,40 (assume 2H, obscurecido pelo solvente), 4,83-4,92 (1H, m), 6,95 (1H, br d), 7,08 (1H, br t), 7,23-7,30 (3H, br d e br t sobrepostos), 7,69 (1H, s), 7,78 (1H, dd), 8,06 (2H, br d), 13,33 (1H, br s). 6-(4-aminobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-car- boxilato de etila: Intermediário (IXa). Método de redução catalítica

[0066] Uma solução de 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (1,00 g, 2,37 mmols) em uma mistura de THF:EtOH (1:1, 100 mL) e ácido clorídrico a 1 M (2,00 mL) foi passada através de um cubo Thales H (1,0 mL.min-1, 25°C, 55 mm 10% de Pd/C Cat-Cart, modo hidrogênio completo). Os voláteis foram removidos in vacuo para se obter o composto do título (0.98 g, ~100% de rendimento); Tr 2,28 min; m/z 393 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado na etapa subsequente sem purificação adicional.

Método de Dissolução de Redução de Metal

[0067] Em uma suspensão de pó de ferro (5,29 g, 94,7 mmols) e 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxila- to de etila (8,00 g, 18,9 mmols) em IPA (80 mL) foi adicionado cloreto de amônio aq sat (8.0 mL). Uma mistura resultante foi agitada a 80°C por 1 h e foi então filtrada através de celite. A almofada de celite foi lavada com MeOH (1.5 L) e os filtrados combinados foram evaporados in vacuo. O resíduo resultante foi triturado com água (400 mL) e com éter de dietila (400 mL) e foi lavado in vacuo para se obter o composto do título como um sólido amarelo (5,89 g, 88% puro por HPLC, 70% de rendimento); Tr 2,21 min; m/z 393 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado em etapas subsequentes sem purificação adicional. 6-(4-(2-cloro-5-metilnicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzo- tieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila: Intermediário (Xa).

[0068] Em uma suspensão de ácido 2-cloro-5-metilnicotínico (2,49 g, 14,5 mmols) em DCM (50 mL) foram adicionados cloreto de oxalila (4,24 mL, 48,4 mmols) e uma gota de DMF. A mistura resultante foi agitada à TA por 1 h e foi então evaporada in vacuo. O resíduo foi retomado em DCM (25 mL) e adicionado em uma solução de 6-(4- aminobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (3,80 g, 9,68 mmols) em piridina (20 mL) à TA. A mistura de reação foi mantida à TA por 1 h e então extinta pela adição de água (100 mL) e extraída com EtOAc (100 mL). A camada aq foi separada e foi lavada com EtOAc (2 x 100 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (100 mL), evaporados in vacuo e o sólido resultante triturado com água (200 mL). Essa sequência foi repetida na mesma escala para se obter o composto do título como um sólido amarelo pálido (10,0 g, 89% puro por HPLC, 95% de rendimento); Tr 2,51 min; m/z 545/547 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado em etapas subsequentes sem purificação adicional. N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotie- no [2,3-d] azepina-2-carboxamida.

[0069] Em uma suspensão de ácido 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro- 4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxílico (10,0 g, 25,4 mmols) em DCM (250 mL) foi adicionado cloreto de oxalila (11,1 mL, 127 mmols) seguido por 1 gota de DMF. A mistura resultante foi agitada à TA por 1 h e foi então evaporada in vacuo. O resíduo assim obtido foi retomado em DCM (100 mL) e, para essa solução, foi adicionada uma solução de 2-flúor-6-metilanilina (6,35 g, 50,7 mmols) em piridina (100 mL). A mistura foi agitada à TA por 1 h e foi então evaporada in vacuo. O resíduo foi retomado em EtOAc (500 mL) e a solução foi lavada com ácido clorídrico a 1 M (2 x 100 mL), seguido por NaHCO3 aq sat (100 mL) e então secada e evaporada in vacuo. Esse mesmo procedimento foi repetido três vezes com ácido 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H- benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxílico adicional (12,0 g, 30,4 mmols) para se obter o composto do título como um sólido amarelo pálido (51,1 g, 93% puro por HPLC, 87% de rendimento); Tr 2,46 min; m/z 502 (M+H)+ (ES+). Esse material foi usado na etapa subsequente sem purificação adicional. 6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan-2-il)nicotinamido) ben- zoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de eti- la: Método 1: Acilação de anilina (IXa) com ácido 2-aminonicotínico (VI).

[0070] Em uma suspensão de ácido 5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro [3.5] nonan-2-il)nicotínico (2,21 g, 8,41 mmols) em DCM (50 mL) foi adicionado cloreto de oxalila (0,80 mL, 9,17 mmols) seguido por 1 gota de DMF. A mistura resultante foi agitada à TA por 1 h e então uma se-gunda porção de cloreto de oxalila (0,80 mL, 9,17 mmols) e de DMF (1 gota) foi adicionada. Após mais 30 min, a mistura foi evaporada in vacuo e o resíduo assim obtido foi retomado em DCM (50 mL) e adicionado em uma solução de 6-(4-aminobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (3,00 g, 7,64 mmols) em piri- dina (20 mL). A mistura resultante foi agitada à TA por 1 h, então diluída com água (100 mL) e passada através de um separador de fase. A fase orgânica foi evaporada in vacuo e o resíduo obtido purificado por cromatografia de coluna flash (SiO2, 80 g, 0 a 100% de EtOAc em is- so-hexano, eluição de gradiente). O resíduo laranja pálido, que foi isolado, foi triturado com acetonitrila (2 x 20 mL) e o sólido que se formou foi coletado por filtração e secado para se obter o composto do título como um sólido branco (2,78g, 94% puro por HPLC, 57% de rendimento); Tr 1,95 min; m/z 637 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,32 (3H, t), 1,62 (4H, br t), 2,16 (3H, s), 3,06-3,38 (assume 3H, obscurecido pelo solvente), 3,45 (4H, br t), 3,60 (4H, s), 4,32 (2H, q), 4,85-4,95 (1H, br), 6,88 (1H, br d), 6,99 (2H, br d), 7,14 (1H, br t), 7,29 (1H, td), 7,45-7,53 (3H, m sobreposto), 7,79 (1H, s), 7,82 (1H, dd), 8,04 (1H, dd aparente), 10,37 (1H, s). Método 2: Deslocamento de 2-halonicotinamida (Xa) com um 7-oxa-2- azaspiro[3.5]nonano.

[0071] Uma suspensão de 6-(4-(2-cloro-5-metilnicotinamido) ben- zoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (4,97 g, 9,10 mmols) e 7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonano hemi oxalato (5,93 g, 27,3 mmols) em NMP (23 mL) e Et3N (7,61 mL, 54,6 mmols) foi aquecida a 150°C por 7,5 h e então resfriada à TA e dei xada em espera por 60 h. Água (400 mL) foi adicionada e o precipitado resultante foi coletado por filtração. O sólido assim obtido foi purificado por cromatogra- fia de coluna flash (SiO2, 120 g, 0 a 30% de THF em DCM, eluição de gradiente) para se obter o composto do título como um sólido amarelo pálido (3,72 g, 64% de rendimento); Tr 1,94 min; m/z 637 (M+H)+ (ES+). Ácido 6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan-2-il)nicotinami- do) benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxí- lico: Intermediário (II).

[0072] Em uma solução de 6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5] nonan-2-il)nicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] aze- pina-2-carboxilato de etila (3,72 g, 5,84 mmols) em uma mistura de THF:MeOH (1:1, 40 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de lítio (700 mg, 29,2 mmols) em água (40 mL). A mistura de reação foi aquecida a 50°C por 1 h e foi então resfriada à TA. Os voláteis foram removidos in vacuo e o restante da solução aq foi diluída com água e sonicada até dissolver o precipitado resultante. A mistura foi neutralizada pela adição de ácido clorídrico a 1 M e o sólido resultante coletado por filtração e secado in vacuo para proporcionar o composto do título como um sólido esbranquiçado (3,27 g, 92 % de rendimento); Tr 1,64 min; m/z 609 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,62 (4H, br t), 2,16 (3H, s), 3,00-3,51 (assume 8H, obscurecido pelo solvente), 3,60 (4H, s), 4,82-4,96 (1H, br), 6,86 (1H, br d), 6,99 (2H, br d), 7,11 (1H, br t), 7,28 (1H, td), 7,46-7,54 (3H, m sobreposto), 7,62 (1H, s), 7,78 (1H, dd), 8,03 (1H, dd), 10,38 (1H, s). 6-(4-(2-Cloro-5-metilnicotinamido)benzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)- 5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida: Interme- diário (IIIa)

[0073] Uma solução de cloreto de 2-cloronicotinoíla (1,21 g, 3,36 mmols) em DCM (10 mL) foi adicionada em uma solução agitada de 6- (4-aminobenzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno [2,3-d] azepina-2-carboxamida (2,00 g, 4,24 mmols) em piridina (10 mL). A mistura de reação foi agitada à TA por 1 h e foi então derramada em água (100 mL) e extraída em EtOAc (2 x 50 mL). Os orgânicos combinados foram evaporados in vacuo e o sólido resultante foi mistu-rado em EtOAc (50 mL) e coletado por filtração. O procedimento acima foi repetido três vezes, em uma escala cada vez maior, usando 5,0, 15,0 e finalmente 18,0 g do material de partida de anilina. Todos os quatro lotes foram combinados ao dissolvê-los em DCM (300 mL). O solvente foi evaporado in vacuo para dar o composto do título como um sólido branco (40,3 g, 75% de rendimento); Tr 2,39 min; m/z 625 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 2,26 (3H, s), 2,32 (3H, s), 3,09-3,33 (assume 3H, obscurecido pelo solvente), 4,83-5,03 (1H, m), 6,86 (1H, d), 7,04 (2H, d), 7,09-7,19 (3H, m), 7,22-7,34 (2H, m), 7,51 (2H, d), 7,83 (1H, dd), 7,91 (1H, d), 7,96 (1H, s), 8,36 (1H, dd), 10,04 (1H, s), 10,71 (1H, s). 6-(4-aminobenzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida: Intermediário (IV).

Método 1: Redução de Dissolução de Metal

[0074] Em uma solução de N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitroben- zoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida (5,00 g, 9,97 mmols) em EtOH (100 mL) foram adicionados cloreto de amônio (5,33 g, 100 mmols), água (20 mL) e então pó de ferro (2,78 g, 49,8 mmols). A mistura resultante foi agitada sob refluxo por 1 h e foi então filtrada através de celite. A almofada de celite foi lavada com EtOH (50 mL) e os filtrados combinados foram evaporados in vacuo. O resíduo resultante foi retomado em EtOAc (200 mL), lavado com água (2 x 100 mL) e foi então secado e evaporado in vacuo. Esse procedimento foi repetido três vezes com N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitrobenzoil)-5,6- di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida adicional (15,0 g, 29,9 mmols) e os sólidos foram obtidos e triturados com Et2O (200 mL) para se obter o composto do título como um sólido amarelo pálido (41,1 g, 87% de rendimento); Tr 2,12 min; m/z 472 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 2,25 (3H, s), 3,02-3,30 (3H, br), 4,85-5,05 (1H, br), 5,51 (2H, s), 6,27 (2H, d), 6,75 (2H, d), 6,80 (1H, d), 7,10-7,15 (3H, m sobrepos- to), 7,24-7,30 (2H, m sobreposto), 7,81 (1H, dd), 7,93 (1H, s), 10,02 (1H, s).

Método 2: Hidrogenação Catalítica

[0075] Em uma solução de N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitroben- zoil)-5,6-di-hidro-4Hbenzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida (100 mg, 0,199 mmol) in THF (4.0 mL) foram adicionados 5% de pasta de Pd/C (58% em peso de água, 21,0 mg, 0,100 mmol) e a mistura agitada em 500 kPa (5 bar) de hidrogênio por 18 h. mediante competição da reação, a mistura foi passada através de um filtro de seringa Agilent de 0,45 μm e o filtrado evaporado in vacuo para se obter o composto do título (91,0 mg, 97% de rendimento); Tr 2,13 min; m/z 472 (M+H)+ (ES+). Preparação de N-(2-Flúor-6-metilfenil)-6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2- azaspiro[3.5]nonan-2-il)nicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-ben- zo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida: Composto (I). Via 1: Acoplamento de amida do ácido tiofeno carboxílico (II) com 2- flúor-6-metilanilina.

[0076] Em uma solução de ácido 6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro [3.5]nonan-2-il)nicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] azepina-2-carboxílico (400 mg, 0,657 mmol) em DCM (40 mL) foi adi-cionada 1-cloro-N,N ,2-trimetilprop-1-en-1-amina (174 μL, 1,31 mmol). A reação foi agitada à TA por 1,5 h e foi então concentrada in vacuo. O resíduo foi retomado em DCM (40 mL) e uma alíquota dessa solução (5,0 mL, 0,080 mmol) foi adicionada em 2-flúor-6-metilanilina (100 mg, 0,797 mmol) e a mistura de reação agitada à TA por 3 dias. Os voláteis foram evaporados in vacuo e o resíduo resultante foi purificado por HPLC preparativa para proporcionar o Composto (I), como um sólido esbranquiçado (14 mg, 23% de rendimento); Tr 1,85 min; m/z 716 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,62 (4H, br t), 2,17 (3H, s), 2,26 (3H, s), 3,14-3,37 (assume 3H, obscurecido pelo solvente), 3,46 (4H, br t), 3,60 (4H, s), 4,90-4,98 (1H, br), 6,88 (1H, br d), 7,02 (2H, br d), 7,10-7,16 (3H, m sobreposto), 7,25-7,31 (2H, m sobreposto), 7,48 (1H, d), 7,52 (2H, br d), 7,82 (1H, dd), 7,95 (1H, s), 8,04 (1H, dd), 10,03 (1H, s), 10,37 (1H, s). Via 2: Deslocamento de SNAr da cloronicotinamida (III) com 7-oxa-2- azaspiro[3.5]nonano.

[0077] Em uma solução de 6-(4-(2-cloro-5-metilnicotinamido) ben- zoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] azepina- 2-carboxamida (10,0 g, 16,0 mmols) e 7-oxa-2-azaspiro [3.5] nonano hemi-oxalato (10,4 g, 48,0 mmols) em NMP (125 mL) foi adicionada trietilamina (13 mL, 96 mmols) e a mistura de reação aquecida a 145°C por 7 h. Após resfriar à TA, a mistura foi derramada em água (800 mL) e os sólidos resultantes foram coletados por filtração, lavados com água (2 x 100 mL) e então retomados em DCM (400 mL). A solução foi lavada com água (100 mL), secada sobre sulfato de sódio e evaporada in vacuo. O resíduo sólido foi purificado por cromatografia de coluna flash (SiO2, 220 g, 20 a 100% de EtOAc em éter de dietila, eluição de gradiente) para se obter o composto do título como um sólido branco. Esse procedimento foi repetido em 5 e 10 g de lotes adicionais do ma-terial de partida de cloronicotinamida. Os três lotes do produto foram combinados pela dissolução em EtOAc (500 mL) e a evaporação do solvente in vacuo. O sólido resultante foi triturado com éter de dietila (200 mL) e o sólido coletado por filtração e secado para se obter o composto do título, Composto (I) como um sólido branco (24 g, 82% de rendimento); Tr 1,88 min; m/z 716 (M+H)+ (ES+). Via 3: Acoplamento de amida da anilina (IV) com o ácido 2-ami- nonicotínico (VI).

[0078] Em uma solução de ácido 5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro [3.5] nonan-2-il)nicotínico (83 mg, 0,32 mmol) em DCM (5,0 mL) foi adicionada 1-cloro-N,N,2-trimetilprop-1-en-1-amina (37 μL, 0,28 mmol). A mistura foi agitada à TA por 15 min e foi então adicionada. Em uma solução de 6-(4-aminobenzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H- benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida (100 mg, 0,21 mmol) em piri- dina (5,0 mL). A mistura de reação foi agitada por mais 1 h e concentrada in vacuo. O resíduo foi triturado com água (20 mL) e o sólido castanho amarelado resultante foi coletado por filtração e foi purificado por cromatografia de coluna flash (SiO2, 12 g, 0 a 10% de MeOH em DCM, eluição de gradiente) para proporcionar o Composto (I), como um sólido branco (55 mg, 36% de rendimento); Tr 1,88 min; m/z 716 (M+H)+ (ES+).

Aumento de Escala da Preparação de Composto (I) pela Via 2

[0079] A metodologia sintética descrita acima para Via 2 foi explo-rada com sucesso para preparar o composto da presente invenção em uma escala de >0,5 kg. Os métodos analíticos e espectroscópicos que pertencem a essa campanha são descritos abaixo.

Métodos Analítico e Espectroscópico

[0080] Condições de HPLC de Fase Reversa para Análise de LCMS: coluna CORTECS C18+ 4,6 x 150 mm; 2,7 μm (Ex. Waters n° 186007408) a 40°C; vazão 1,0 mL.min -1 eluída com um gradiente H2O- MeCN purificado contendo 0,1% de ácido fórmico durante 25 min empregando a detecção de UV a 310 nm. Volume de injeção de 5 μL. Informação de gradiente: 0 a 15 min, aumentado de 95% de H2O e 5% de MeCN para 5% de H2O e 95% de MeCN; 15 a 25 min, mantido em 5% de H2O e 95% de MeCN.

[0081] Espectroscopia 1H RMN: Os espectros foram adquiridos usando um espectrômetro JOEL ECX 400 MHz. Solvente não deutera- do residual foi usado como referência e amostras foram executadas em DMSO-d6. 1-(4-Nitrobenzoil)-1,2,3,4-tetra-hidro-5H-benzoazepin-5-ona.

[0082] Em uma solução de 1,2,3,4-tetra-hidrobenzazepin-5-ona (2670 g, 16,6 mols) em DCM (23.2 L) foi adicionada uma solução aquosa de 30% em p/v de K2CO3 (15,2 L). Cloreto de 4-nitrobenzoíla (3105 g, 16,7 mols) foi adicionado em porções durante 15 min man- tendo uma temperatura interna de <25°C. A reação fo i agitada de 18 a 25°C por 18 h em cujo ponto TLC (50% em v/v de acetato de etila em heptano) indicou que a reação estava incompleta. Cloreto de 4- nitrobenzoíla adicional (167 g, 0,9 mol) foi adicionado e a reação agitada por mais 1,5 h após o que TLC indicou que a reação estava completa. As fases foram separadas e os orgânicos foram adicionados em uma solução de NaOH a 2M (10 L) e agitados por 2 h. As fases foram separadas e os orgânicos foram lavados com água (2 x 5 L), secados sobre MgSO4 e filtrados. A almofada foi lavada com DCM (4 L) e os orgânicos combinados foram evaporados in vacuo. O sólido resultante foi secado in vacuo a 45°C por 24 h para se obter o composto do título como um sólido bege claro (4998 g, 97% de rendimento ativo; Pureza de HPLC 96,2%, RMN pureza >95%); Tr 10,09 min; m/z 311,1 (M+H)+ (ES+). 5-Cloro-1-(4-nitrobenzoil)-2,3-di-hidro-1H-benzoazepina-4-carbal- deído.

[0083] Um vaso de 50 L carregado com DMF (10,0 L) foi resfriado a 0°C e foi tratado em gotas durante 1 h com cloreto de fosforila (1802 mL, 19,33 mols), enquanto mantendo a temperatura interna abaixo de 5°C (uma exotermia de 0 a 5°C foi observada) e foi então agitado por 30 min de 0 a 5°C. Uma solução de 1-(4-nitrobenzoil )-1,2,3,4-tetra- hidro-5H-benzoazepin-5-ona (5000 g, 16,11 mols) em DMF (10,0 L), preparada pela dissolução a 70°C, foi então adicion ada enquanto quente (para evitar a precipitação) para a solução de cloreto de fosfori- la/DMF via transferência a vácuo durante 30 min, mantendo a temperatura do lote entre 0 e 10°C. Após a conclusão da adição, a reação foi agitada sob nitrogênio por 30 min de 0 a 5°C e entã o a 80°C por 18 h, momento que a análise de HPLC mostrou que o consumo do material de partida estava completo. A mistura de reação foi resfriada a 40°C e foi dividida em duas porções iguais, ambas as quais foram trabalhadas da mesma maneia, como segue. A primeira porção foi concentrada in vacuo para aproximadamente a metade de seu volume original (~7 L) e foi então adicionada ao NaOAc aq sat (34.0 L), pré-resfriada a 10°C, durante 2 h (uma exotermia de 20 a 30°C foi observa da). Após agitação por 15 min a 20°C, a mistura foi extraída com D CM (27,2 L) e as fases foram separadas. A camada aq foi extraída de volta com DCM (27,2 L), e as fases foram separadas. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água (2 x 40 L) então secados sobre MgSO4 (4,0 kg), filtrados, e o filtrado concentrado. O mesmo procedimento de trabalho foi repetido na segunda porção da mistura de reação bruta e combinado com o primeiro, para dar o composto do título como um óleo (5119 g, 89% de rendimento ativo, Pureza de HPLC de 87,6%, 1H RMN pureza de 95%); Tr 11,74 min; m/z 357,2 (M+H)+ (ES+). 6-(4-Nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-car- boxilato de etila.

[0084] Em uma solução de 5-cloro-1-(4-nitrobenzoil)-2,3-di-hidro- 1H-benzoazepina-4-carbaldeído (3418 g, 9,580 mols) em piridina (15,83 L, 195,4 mols) a 10°C sob nitrogênio foi adi cionado etil-2-mer- captoacetato (1118 mL, 10,24 mols) em gotas durante 30 min, enquanto mantém a temperatura interna abaixo de 20°C (uma exotermia de 10 a 15°C foi observada). A solução resultante foi então tratada em gotas com trietilamina (7531,51 mL, 54,03 mols) durante 30 min, man-tendo a temperatura interna abaixo de 20°C (sem exotermia observada). A mistura de reação foi agitada a 20°C por 1 h e então a 70°C por 18 h. Após esse momento, a análise de HPLC revelou que o consumo do cloro enal de partida estava completo e a reação foi deixada resfriar de 18 a 25°C.

[0085] A mistura foi filtrada (para remover os sais insolúveis), e a almofada foi lavada com acetona (1,0 L). Os filtrados combinados foram concentrados in vacuo para remover voláteis, e o resíduo retomado de DCM (11964 mL) e lavado com água (7623 mL). A fase orgânica foi separada e foi lavada com ácido clorídrico a 1M (7623 mL) e então secada sobre MgSO4. Os inorgânicos foram removidos por filtração, lavados com DCM (4.0 L) e os filtrados combinados foram evaporados in vacuo para um resíduo oleoso.

[0086] O resíduo foi retomado em etanol (20500 mL) e a solução foi agitada a 60°C por 1 h e foi então resfriada de 18 a 25°C e agitada a essa temperatura por 1 h. O sólido resultante foi coletado por filtração, lavado com etanol (13,8 L) e secado a 50°C sob vácuo, para se obter o composto do título (2939 g, 73% de rendimento ativo, pureza de HPLC de 96,9%, 1H RMN pureza >97%); Tr 13,85 min; m/z 423,2 (M+H)+ (ES+). Ácido 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] azepina- 2-carboxílico.

[0087] Um vaso de 50 L foi carregado de 18 a 25°C com uma mistura de 1:1 de THF e água (37,63L) e 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro- 4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxilato de etila (3763,7 g, 8,90 mols). Para a solução resultante foi adicionado KOH sólido (749,1 g, 13,35 mols) em porções, enquanto mantém a temperatura interna abaixo de 25°C (uma exotermia de 20 a 22°C foi observada). A reação foi aquecida a 50°C por 18 h, momento em que a análise de H PLC revelou que o consumo do material de partida estava completo. A reação foi deixada resfriar de 18 a 25°C e o solvente orgânico foi removido in vacuo. A solução aq restante foi diluída com água (28,27 L) e então ácido clorí-drico conc (1,25 L) foi adicionado lentamente à solução até que o pH 1 foi alcançado (uma exotermia de 5°C foi observada, com desgaseifica- ção moderada). A suspensão castanha clara resultante foi filtrada e a almofada foi lavada com água (2 x 9,5 L). O sólido foi secado em um forno sob vácuo a 50°C para se obter o composto do título (3185,5 g, 91% de rendimento ativo, pureza de HPLC de 98,0%, 1H RMN ensaio de 91,0%); Tr 11,11 min; m/z 395,2 (M+H)+ (ES+). N-(2-Flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida.

[0088] Uma suspensão em DCM (15,6 L), de ácido 6-(4-nitroben- zoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxílico (1714 g, 1560 g de material ativo, 3,955 mols) foi colocado em uma atmosfera de nitrogênio e DMF (6,2 mL, 79,1 mmols) foi adicionado à mistura. Cloreto de oxalila (690 mL, 7,91 mols) foi então adicionado lentamente durante 40 min a fim de controlar a evolução do gás (uma exotermia de 16,9 a 18,3°C foi observada) e uma mistura de reação foi agitada de 18 a 25°C durante a noite. A análise de TLC (8% de metanol em DCM) indicou que um pouco do material de partida de ácido tiofeno carboxílico permaneceu e cloreto de oxalila adicional (300 mL, 3,44 mols) foi adicionado à mistura. Após agitação de 18 a 25°C por 3 h, a reação estava completa e a mistura resultante foi concentrada in vacuo para fornecer cloreto de 6-(4-nitrobenzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carbonila como um sólido amarelo escuro (1H RMN indicou a presença de 15,4% de DCM e 0,5% de DMF).

[0089] O cloreto ácido bruto assim obtido foi suspenso em DCM (7,8 L) sob uma atmosfera de nitrogênio e foi tratado com piridina (480 mL, 5,93 mol). 2-Flúor-6-metilanilina (475 mL, 4,11 mol) foi então adicionada lentamente durante 15 min, com resfriamento de um banho de gelo/água, (resultando em uma exotermia de 20,9 a 35,2°C). A mistura formou uma solução e foi agitada de 18 a 25°C duran te a noite ponto em que a reação foi determinada para ser concluída (HPLC 250 nm).

[0090] A suspensão resultante foi dividida em duas porções iguais, cada qual foi diluída com água (7,8 L), agitada por 1 h de 18 a 25°C e então os sólidos coletados por filtração. As duas tortas de filtro foram, cada uma, lavadas com água (1,8 L) e com DCM (2 x 1,6 L) e combinadas. O sólido foi secado em um forno a 50°C para fornecer o composto do título como um sólido esbranquiçado, (1573 g, 79% de rendimento ativo, 1H RMN pureza >95%, contendo 1,98% de DCM e 0,56% de piridina.HCl); Tr 12,76 min; m/z 502,4 (M+H)+ (ES+). 6-(4-Aminobenzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida; Intermediário (IV).

[0091] Em uma solução de N-(2-flúor-6-metilfenil)-6-(4-nitroben- zoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida (80 g, 0,160 mol) em uma mistura de DMF (240 mL) e 2-MeTHF (640 mL), sob uma atmosfera de nitrogênio, foram adicionados 20% de catalisador Pd(OH)2/C (8,0 g) e a mistura aspergida com hidrogênio e aquecida a 55°C. Após aspergir com hidrogênio por 3 h, a reação foi colocada sob uma atmosfera de hidrogênio durante a noite e foi então aspergida com hidrogênio por mais 4h. A análise de HPLC indicou a presença de 98,5% de produto e 0,55% de um intermediário de reação (identidade não confirmada, assumido como intermediário nitroso ou hidroxilamina).

[0092] A mistura de reação foi resfriada a 48°C e foi passada através de uma almofada de Celite (24 g). A almofada de Celite foi lavada com DMF (2 x 160 mL) e como essas lavagens continham catalisador, elas foram passadas através de um filtro embutido. Os filtrados combinados foram concentrados in vacuo para remover a maioria do 2- MeTHF fornecendo uma solução de DMF/produto. Essa mistura foi adicionada durante 5 min em água (1,6 L) que foi resfriada com um banho de gelo/água (uma exotermia foi observada de 9,9 a 17,6°C), fornecendo uma suspensão branca que foi agitada de 18 a 25°C por 1 h. Os sólidos foram coletados por filtração e a torta de filtro foi lavada com água (3 x 160 mL) e então secada em um forno a 50°C para dar o produto como um sólido branco (75,5 g, pureza de HPLC de 98,2%, 0,34% de H2O por KF, 6,56% de DMF por 1H RMN).

[0093] O sólido assim obtido foi misturado em DCM (400 mL) de 18 a 25°C por 65 min, coletado por filtração e a to rta de filtro lavada com DCM (2 x 160 mL). Esse material foi então secado no forno a 50°C para dar o composto do título como um sólido b ranco (72,0 g, 65,9 g do produto ativo, 88% de rendimento, pureza de HPLC de 98,75%; contendo 8,25%, DCM e 0,19% de DMF por RMN); Tr 11,01 min; m/z 472,4 (M+H)+ (ES+). 6-(4-(2-Cloro-5-metilnicotinamido)benzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)- 5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina-2-carboxamida; Interme-diário (IIIa).

[0094] Cloreto de oxalila (133 mL, 1,58 mol) foi adicionado em uma suspensão de ácido 2-cloro-5-metil nicotínico (225,4 g, 1,313 mol) em DCM (2254 mL) de 18 a 25°C seguido por DMF (0,8 mL, 0,010 mol) (resultados em exotermia suave e evolução de gás) e a reação agitada de 20 a 25°C por 1 h. A análise de HPLC de uma alíquota (extinta em metanol) indicou que <1% de ácido 2-cloro-5-metilnicotínico estava restando. O solvente foi removido in vacuo e o resíduo oleoso foi azeotropado com DCM (500 mL) para remover cloreto de oxalila residual.

[0095] O óleo resultante foi retomado em DCM (413 mL) e foi adicionado em gotas durante 10 min em uma suspensão de 6-(4-ami- nobenzoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzo tieno[2,3-d] aze- pina-2-carboxamida (412,9 g, 0,876 mol) em uma mistura de piridina (283 mL, 3,502 mols) e DCM (28920 mL) enquanto mantém a temperatura interna <40°C (temperatura máxima alcançou 3 8°C). A reação foi agitada de 18 a 25°C por 1 h após esse cujo, HP LC (amostra extinta em metanol) indicou que a reação estava completa (<1% de anilina s/m restante).

[0096] Heptano (3300 mL) foi adicionado à mistura de 18 a 25°C e a suspensão resultante foi agitada por 15 min e os sólidos então cole- tados por filtração. A torta de filtro foi lavada com heptano (2 x 1650 mL) e o sólido bruto assim obtido foi misturado em água (4130 mL) de 90 a 95°C por 30 min e então resfriado de 18 a 25°C . Os sólidos foram coletados por filtração, lavados com água (2 x 826 mL) e secados em um forno a vácuo a 50°C para dar o composto do títu lo como um sólido branco (504.2 g, 92% de rendimento ativo, pureza de HPLC [230 nm] de 98,24%; contendo 0,3% de piridina HCl por 1H RMN e 0,4%. H2O por KF); Tr 12,19 min; m/z 625,6 (M+H)+ (ES+). N-(2-Flúor-6-metilfenil)-6-(4-(5-metil-2-(7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonan- 2-il)nicotinamido)benzoil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d] aze- pina-2-carboxamida: Composto (I)

[0097] Uma suspensão de 6-(4-(2-cloro-5-metilnicotinamido) ben- zoil)-N-(2-flúor-6-metilfenil)-5,6-di-hidro-4H-benzotieno[2,3-d]azepina- 2-carboxamida (563,9 g, 0,902 mol), 7-oxa-2-azaspiro[3.5]nonana he- mi oxalato (233,0 g, 1,353 mol) e carbonato de potássio (374,0 g, 2,706 mols) em NMP (2820 mL) foi agitada de 105 a 115°C por 18 h (análise de HPLC indicou a formação de 97,7% do produto desejado e 0,02% de cloro-nicotinamida restante).

[0098] A reação foi resfriada de 18 a 25°C e foi ad icionada à água (8459 mL) com agitação a <45°C (moderadamente exoté rmica). Após agitação de 18 a 25°C por 30 min, o sólido resultan te foi coletado por filtração, lavado com água (2 x 1128 mL) e puxado seco. O produto bruto assim obtido foi remisturado em água (5640 mL) de 90 a 95°C por 30 min, então resfriado de 18 a 25°C, coletado por filtração, lavado com água (2 x 1260 mL) e secado em um forno a vácuo a 50°C para dar um sólido branco (632,0 g).

[0099] O espectro de 1H RMN indicou 1,7% de NMP para estar presente e o sólido foi remisturado em água (5640 mL) de 90 a 95°C por 30 min, resfriado de 18 a 25°C, filtrado, lavad o com água (2 x 1260mL) e puxado seco. Secagem adicional em um forno a vácuo a 50°C forneceu o composto do título, como um sólido branco (614,0 g, 95%, contendo 0,75% de NMP por 1H RMN e 1,7% de H2O por KF.) Tr 9,48 min; m/z 716,8 (M+H)+ (ES+); 1H RMN δ: 1,60 (4H, br t), 2,16 (3H, s), 2,25 (3H, s), 3,14-3,30 (assume 3H, m amplo, parcialmente obscurecido pelo solvente), 3,44 (4H, br t), 3,59 (4H, s), 4,93 (1H, br d), 6,86 (1H, br d), 7,01 (2H, br d), 7,09-7,15 (3H, m sobreposto), 7,24-7,30 (2H, m sobreposto), 7,48 (1H, d), 7,51 (2H, br d), 7,82 (1H, d), 7,95 (1H, s), 8,02 (1H, d), 10,04 (1H, s), 10,39 (1H, s).

Teste Biológico: Métodos Experimentais Avaliação de CPE induzido por RSV em células HEp2

[00100] As células HEp2 foram semeadas (103 / poço / 50μL) em placas de 384 poços (catálogo número 353962, BD Falcon, Oxford, RU) em 5% de DMEM livre de soro contendo L-glutamina a 2 mM e piruvato de sódio a 1 mM um dia antes da infecção. As soluções do vírus cepa A2 de RSV (n° 0709161v, NCPV, Public Health England, Wiltshire) ou cepa B Washington de RSV (VR-1580, ATCC, Manassas, VA 20108) foram preparadas em DMEM livre de soro com L- glutaminae a 2 mM e piruvato de sódio a 1 mM, e então adicionadas (50 μL/poço) para alcançar uma concentração de vírus final de 1 MOI. Simultaneamente, o Composto (I) (0,5 μL de solução de DMSO) foi adicionado em 100 μL de cultura de célula HEp2 com solução de vírus para fornecer uma solução de DMSO final de 0,5%. As placas foram incubadas (37°C/5% de CO 2) por 5 dias para estudos usando a cepa A2 de RSV ou 6 dias para aquelas usando a cepa B de RSV, e então sal de sódio resazurina (5 μL de 0,03% de solução; Sigma-Aldrich, Dorset, UK) foi adicionado em cada poço e a placa incubada por mais 6 h (37°C/5% de CO 2). A fluorescência de cada poço [545 nm (excitação) / 590 nm (emissão)] foi determinada usando um multidigitalizador (Clariostar: BMG, Buckinghamshire, RU). A porcentagem de inibição para cada poço foi calculada e os valores de IC50, IC75 e IC90 foram cal-culados a partir da curva de resposta de concentração gerada para o Composto (I).

Avaliação da expressão de proteína F de RSV em células epiteliais brônquicas BEAS2B

[00101] Um evento recente que acompanha a infecção de células epiteliais por RSV é a expressão da proteína F de RSV na superfície das células. As células BEAS2B (linhagem de célula epitelial brônquica humana imortalizada SV40) foram cultivadas em placas de 96 poços. Uma vez mais de 70% de confluência, as células foram infectadas com A2 de RSV (n° 0709161v, NCPV, Public Health England, Wiltshire) em um MOI de 0,01 em meio claro de RPMI-1640 (Life technologies, Paisley, RU) com 2% de FBS (Life technologies, Paisley, RU), e incubadas por 3 dias (37°C/5% de CO2).

[00102] O sobrenadante foi aspirado e as células foram fixadas com 4% de formaldeído (100 μL em solução de PBS) por 20 min, lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (200 μL; PBS contendo 0,05% de Tween-20) e incubadas com solução de bloqueio (100 μL; 5% de leite Marvel em PBS) por 1 h. As células foram então lavadas com tampão de lavagem (200 μL) e incubadas por 1 h a 37°C com anti- RSV (2F7; camundongo monoclonal, lote 160290, Cat. No. ab43812, Abcam plc, Cambridge, RU) anticorpo de proteína de fusão F (50 μL; preparado em uma diluição de 1:1000 em 5% de leite / PBS-tween). Após a lavagem, as células foram incubadas com um anticorpo IgG anti-ca- mundongo conjugado com HRP (50 μL preparados em uma diluição de 1:2000 em 5% de leite em PBS; lote 00095437, Cat.No. P0447, Dako UK Ltd, Cambridgeshire, RU) por 1 h. As células foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem e uma vez com PBS. Substrato de TMB (100 μL; pacote de reagente de substrato lote 320436, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc. Abingdon, RU) foi então adicionado e a reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico aq (50 μL; 2N). O sinal resultante foi determinado colorimetricamente (OD: 450 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm) em um leitor de microplaca (Multiskan FC®, ThermoFisher Scientific). As células foram então lavadas e 1% de solução cristal violeta (50 μL; lote SLB4576, Cat. No. HT90132-1L, Sigma-Aldrich) foi aplicado por 30 min. Após lavagem com PBS (200 μL) três vezes, 1% de SDS (100 μL) foi adicionado em cada poço, e as placas foram agitadas levemente por 1 h antes de ler a absorvência a 595 nm. As leituras OD450-655 medidas foram corrigidas para o número de célula pela divisão de OD450- 655 pelas leituras OD595. A porcentagem de inibição para cada poço foi calculada e o valor de IC50 derivado da curva de resposta de concentração gerado para o Composto (I).

Viabilidade da Célula: Ensaio de Resazurina

[00103] As células HEp2 foram semeadas em placas de 384 poços (103 / poço / 50 μL; BD Falcon Ref 353962) em FBS DMEM (5%, contendo L-glutamina a 2 mM e piruvato de sódio a 1 mM) um dia antes da experimentação. DMEM livre de soro (50 μL) foi adicionado aos poços de teste enquanto para poços de controle, os meios foram removidos e a água estéril (100 μL) foi adicionada. Composto (I) (0,5 μL de solução de DMSO) foi adicionado para dar uma concentração de DMSO final de 0,5%. As células Hep2 foram incubadas com cada composto de teste por 5 dias (37°C/5% de CO 2 em 5% de FBS) e então solução estoque de resazurina (5 μL; 0,03%) foi adicionada em cada poço e a placa incubada por mais 6 h (37°C/5% de CO2). A fluores- cência de cada poço a 545 nm (excitação) e 590 nm (emissão) foi de-terminada usando um multidigitalizador (Clariostar: BMG Labtech). A perda percentual de viabilidade da célula foi calculada para cada poço em reação ao tratamento veículo (0,5% de DMSO).

[00104] Qualquer aumento aparente na viabilidade da célula associada com tratamento do composto de teste em relação ao veículo é consequentemente tabulado como uma porcentagem negativa. Onde apropriado, uma valor de CC50 foi calculado a partir da curva de resposta de concentração gerada para Composto (I).

Avaliação do título do vírus em células epiteliais brônquicas de cultivadas em interface ar-líquido (ALI)

[00105] As células epiteliais brônquicas humanas cultivadas em ALI foram adquiridas de Epithelix Sàrl (Geneva, Switzerland) e mantidas pela mudança dos meios basais a cada 3 a 4 dias, enquanto a superfície apical foi lavada uma vez por semana com PBS. No dia 0, a superfície apical de cada poço foi lavada uma vez com PBS estéril (300 μL) e as inserções foram transferidas para novas placas de 24 poços contendo meio de cultura fresco MucilAir (780 μL; EP04MM). A2 de RSV (50 μL; diluída em meio de cultura MucilAir para dar um MOI final de 0,01) foi adicionada às células por 1 h (37°C/5% de CO2). Para os fins de padronização dos cálculos de MOI, cada inserção de MucilAir foi estimada para conter 2 x 105 células de revestimento apical por poço. O inóculo do vírus foi removido com um conta-gotas e as inserções foram lavadas duas vezes com PBS estéril (300 μL).

[00106] A amostragem foi conduzida pela adição de PBS estéril (300 μL) à superfície apical de cada poço por 5 min. A amostra apical foi então removida e transferida para tubos contendo 50% de sacarose dissolvidos em PBS (100 μL) antes de ser armazenada a -80°C. Esse procedimento de colheita foi repetido diariamente começando no dia 0 e concluindo no dia 7.

[00107] As culturas em ALI foram dosada apicalmente com Composto (I) nos dias 0 a 7 para protocolos de "intervenção precoce", ou dias 3 a 7 para protocolos de "intervenção tardia". Composto (I) (50 μL em 0,5% de DMSO/PBS) foi adicionado à superfície apical e incubado (37°C/5% de CO 2) por 1 h antes de ser removido. Os tratamentos de veículo (0,5% de DMSO/PBS) foram realizados nas superfícies apicais correspondentes para garantir que cada poço recebeu o mesmo número de manipulações. No dia 5, os meios basais foram removidos de cada poço e reabastecidos com meios de cultura frescos MucilAir como uma etapa de manutenção necessária para as células de cultura em ALI.

[00108] O título do vírus foi quantificado pelo ensaio de placa. As células de HEp2 foram cultivadas em placas de 24 poços (Corning) para 48 h antes da infecção em DMEM contendo 10% de FBS até atingirem 100% de confluência. As amostras coletadas foram descongeladas à TA e diluições em série de dez vezes foram preparadas em DMEM livre de soro. O meio de crescimento das células HEp2 foi aspirado e substituído com 300 μL de coleções de vírus diluídas em série e deixado infectar a 37°C/5% de CO 2 por 4 h. Os meios infecciosos foram aspirados e substituídos com Sobreposição de Ensaio de Placa (500 μL; 1% de metilcelulose em MEM, 2% de FBS, 1% de Pen Strep, 0,5 μg/mL de anfotericina B), e deixados por 7 dias a 37°C/5% de CO2. As células foram fixadas com metanol gelado por 10 min e bloqueadas com 5% de leite em pó (Marvel) em 0,05% de PBS-tween (‘tampão de bloqueio’) por 1 h à TA. O anticorpo de proteína F Anti-RSV (2F7; Ab- cam: ab43812) foi diluído a uma concentração de 1:100 no tampão de bloqueio e adicionada às células por 1 h à TA com agitação. As células foram lavadas usando PBS e incubadas com o anticorpo secundário (anticorpo secundário anticamundongo de cabra conjugado com HRP (Dako P044701-2) diluído em 1:400 com tampão de bloqueio) por 1 h à TA com agitação. A solução de anticorpo secundário foi removida e as células foram lavadas com PBS antes do DAB de substrato de de-senvolvimento melhorado de metal ter sido preparado em água ultra- pura (de acordo com as instruções do fabricante). Cada poço recebeu 300 μL de substrato de desenvolvimento (sigmaFAST D0426) até as placas estarem visíveis. As placas foram contadas por olho e confirmadas usando microscopia de luz, permitindo o cálculo das unidades de formação de placa por mL.

Infecção por RSV em camundongos

[00109] Os camundongos sem jejum (BALB/C machos, 20 a 30g) foram infectados intranasalmente com A2 de RSV ou diluente de vírus (DMEM, 2% de FBS, 12,5% de sacarose) sob anestesia de isoflurano (5% em O2). A cepa A2 de RSV (50 uL de 1,3 x 106 PFU/mL: final 0.65 x 105 PFU/camundongo) foi instilada em cada narina em uma forma de gota a gota alternando entre as duas até um volume de 50 μL ser liberado. Após infecção, cada animal foi pesado em uma base diária para monitorar as mudanças. Composto (I) foi dissolvido em 100% de DMSO (a 20 mg/mL e/ou 2 mg/mL), então diluído em 1:10 em solução salina isotônica para alcançar 10% de DMSO em todos os tratamentos. As formulações foram então sonicadas para produzir uma suspensão. A suspensão foi administrada intratraquealmente (20 μL) com um dispositivo FMJ-250 PennCentury ou intranasalmente (40 μL) com um conta-gotas em 1 dia e 1 h antes da infecção (dia 0) e então nos dias 1, 2 e 3 após infecção. Quatro dias após o desafio de RSV, os animais sofreram eutanásia (por injeção intraperitoneal de uma overdose de pentobarbitona), a traqueia canulada e BALF extraído para contagem de célula total e diferencial. Após coleta de BALF, o pulmão direito foi removido de cada animal e homogeneizado em meio de Eagles modificado por Dulbecco gelado (usando 10 vezes o peso do pulmão de DMEM contendo 1% de BSA e 25% de sacarose) por erupções 2 x 20 segundos. O homogeneizado foi então transferido em um tubo estéril e girou a 4oC (2000 rpm; por 5 min). O homogeneizado clarificado foi transferido para um criovial refrigerado, congelado rapidamente a ar-mazenado a -80°C. Os sobrenadantes dos homogeneizad os do pulmão foram usados para o ensaio de placa.

[00110] As células HEp2 foram cultivas em placas de 24 poços (Corning) por 48 h antes da infecção em DMEM contendo 10% de FBS até alcançarem 100% de confluência. Homogeneizado de pulmão foi descongelado à TA e diluições em série de dez vezes foram preparadas em DMEM livre de soro. O meio de crescimento das células HEp2 foi aspirado e substituído com 300 μL de homogeneizado de pulmão diluído em série e deixado infectar (4 h; 37°C/5% d e CO2). Os meios infecciosos foram aspirados e substituídos com Sobreposição de Ensaio de Placa (500 μL; 1% de metilcelulose em MEM, 2% de FBS, 1% de Pen Strep, 0,5 μg/mL de anfotericina B), e deixados por 7 dias (37°C/5% de CO 2). As células foram fixadas com metanol gelado por 10 min e bloqueadas com 5% de leite em pó (Marvel) em 0,05% de PBS-tween (tampão de bloqueio) por uma h à TA.

[00111] O anticorpo de proteína F Anti-RSV [2F7] (Abcam: ab43812) foi diluído em uma concentração de 1:100 no tampão de bloqueio e adicionado às células por 1 h à TA com agitação. As células foram la-vadas usando PBS e então incubadas com o anticorpo secundário (an-ticorpo secundário anticamundongo de cabra conjugado com HRP (Dako P044701-2) diluído em 1:400 com tampão de bloqueio) por 1 h à TA com agitação. A solução de anticorpo secundário foi removida e as células foram lavadas com PBS antes do DAB de substrato de desenvolvimento aumentado de metal ter sido preparado em água ultra- pura (de acordo com as instruções do fabricante). Cada poço recebeu 300 μL de substrato de desenvolvimento (sigmaFAST D0426) até as placas serem visíveis. As placas foram contadas por olho e confirma- das usando microscopia de luz, permitindo o cálculo de unidades de formação de placa por mL de sobrenadante de homogeneizado de pulmão.

Infecção por RSV em ratos de algodão

[00112] Os ratos de algodão machos Sigmodon hispidus entre 6 e 8 semanas de idade foram infectados com hRSV/A/Long (ATCC, Ma-nassas, VA; 105 pfu) em um volume de 0,1 mL de meios de estabilização de sacarose. Composto (I) foi dissolvido em 100% de DMSO (a 3,3, 10, 33 e 100 mg/mL), então diluído a 1:10 em solução salina iso- tônica para alcançar 10% de DMSO em todos os tratamentos. As formulações foram então sonicadas para produzir suspensões. As suspensões resultantes foram então administradas intranasalmente (50 μL) por conta-gotas 4 h antes da infecção (no dia 0), e então nos dias 1, 2 e 3 após infecção. Quatro dias após o desafio de RSV, os animais sofreram eutanásia e os pulmões foram removidos. O lobo esquerdo foi usado para titulação viral através de ensaio de placa e o lobo lingular para RSV/A/Long NS-1 qRT-PCR e citocina qRT-PCR.

[00113] O sobrenadante dos homogeneizados do pulmão foi diluído 1:10 e 1:100 em Eagle (E)-MEM. As monocamadas de HEp-2 confluentes em placas de 24 cavidades foram infectadas em duplicado (50 μL de amostra por cavidade) começando com amostras não diluídas (puras) seguido pelos homogeneizados diluídos. Após incubação por 1 h (37°C/ 5% de CO 2), os poços foram sobrepostos com 0,75% de meio de metilcelulose e placas substituídas na incubadora a 37°C. Após incubação (por 4 dias), a sobreposição foi removida, as células fixadas com 0,1% de mancha cristal violeta (por 1 h) e então enxaguadas e secadas no ar. As placas foram contadas e títulos virais foram expressos como unidades de formação de placa por grama (pfu.g-1) de tecido.

[00114] O RNA total também foi extraído de tecido de pulmão ho- mogeneizado (kit de purificação de RNeasy; Qiagen) e uma amostra (1 μg) foi usada para preparar cDNA usando Kit de Trascrição Reversa QuantiTect (Qiagen). Para reações de PCR em tempo real (RSV NS-1 e genes RANTES) o Kit PCR QuantiFast SYBR® Green (Qiagen) foi usado em um volume final de 25 μL, com concentrações de iniciador final de 0,5 μM. As amplificações foram realizadas em um Bio-Rad iCycler para 1 ciclo de 95°C por 3 min, seguido por 40 ciclos de 95°C por 10 seg, 60°C por 10 seg, e 72°C por 15 seg. Os ciclos de linha de base e limiar de ciclo (Ct) foram calculados pelo software iQ5 no modo de Ajuste de Curva Subtraída de Linha de Base de PCR. As curvas padrão foram desenvolvidas usando amostra de cDNA diluída em série mais enriquecida no transcrito de interesse (por exemplo, pulmões do dia 4 após infecção primária por RSV). Os valores de Ct foram plo- tados contra fator de diluição de cDNA log10. Essas curvas foram usadas para converter os valores de Ct obtidos para diferentes amostras para unidades de expressão relativa que foram então normalizadas ao nível de mRNA de β-actina ("gene de manutenção") expresso na amostra correspondente. Os níveis de mRNA foram expressos como a média geométrica ± SEM para todos os animais em um grupo.

Resultados de Rastreio in vitro

[00115] O perfil do Composto (I), conforme revelado aqui, é resumido abaixo (Tabela A) e demonstra atividades inibitórias potentes contra ambos CPE induzido por A2 de RSV A2 e CPE induzido por B de RSV nas células HEp2. Além disso, o composto da invenção exibe inibição potente de expressão de proteína F de A2 de RSV em células epiteliais brônquicas BEAS2B. Nenhum efeito na viabilidade da célula, resultante da incubação com Composto (I), foi detectado. Tabela A Os efeitos do tratamento com Composto (I) em CPE induzido por A2 de RSV e B de RSV em células HEp2, na expressão de proteína F de A2 de RSV em células epiteliais brônquicas BEAS2B e na viabilidade da célula.

Notas de roda pé da tabela: 1. Inibição (%) a 0,1 μg/mL; 2. Inibição (%) a 1 μg/mL;

[00116] Os efeitos antivirais também foram avaliados usando células epiteliais brônquicas primárias humanas cultivadas com ar-líquido. As células passam por diferenciação mucociliar extensa, resultando nas culturas com características morfológicas similares àquelas observadas no epitélio respiratório humano normal. Como um resultado, esse modelo de célula imita de perto as infecções por RSV nas vias aéreas humanas.

[00117] O título de RSV aumentou do dia 1, atingiu o pico no dia 3 e então gradual e moderadamente reduziu até o dia 7. O tratamento com o Composto (I) para um poço apical diariamente do dia 0 ao dia 7 (in-tervenção precoce, veja Tabela B, Figura 1) induziu a inibição depen-dente da concentração, e mostrou inibição completa a 0,1 μg/mL durante 7 dias. O tratamento com Composto (I) também produziu uma redução dramática de título de vírus nos dias 6 e 7 após infecção quando foi administrada do dia 3 após o pico do vírus (intervenção tardia, veja Tabela C, Figura 2). Tabela B: Os efeitos de intervenção precoce (dias 0 a 7) com Composto (I) no título viral de A2 de RSV em lavagem apical de células epiteliais brônquicas, cultivadas com interface ar-líquido infectadas com A2 de RSV.

1. 1PFU/mL alocado se qualquer placa for detectada no ensaio com x10 lavagem apical diluída; 2. Os valores de n foram 3 para todos os experimentos. Petição 870170016772, de 14/03/2017, pág. 71/90 Tabela C: Os efeitos de intervenção tardia (dias 3 a 7) com o Composto (I) no título viral de A2 de RSV em lavagem apical de células epiteliais brônquicas cultivadas com interface ar-líquido infectadas com A2 de RSV.

1. 1PFU/mL alocado se nenhuma placa for detectada no ensaio com lavagem apical diluída x10; 2. Os valores de n foram 3 para todos os experimentos. Petição 870170016772, de 14/03/2017, pág. 72/90

Teste In Vivo

[00118] O RSV humano é capaz de infectar e replicar em várias espécies de animal usadas para rastreio pré-clínico, permitindo assim o desempenho e perfis de novos agentes anti-infecciosos para serem avaliados e comparados in vivo (Bem, et al., 2011). Embora espécies de primata também possam ser infectadas e estudadas, a maioria do trabalho dessa natureza é conduzida em camundongos e ratos de al-godão. Ambas as cepas puras de camundongos e ratos de algodão, padrão, são caracterizadas como "semipermissivas" para a replicação de RSV humano, embora replicação viral significativamente maior seja vista nos ratos de algodão comparado às cepas puras de camundongos. O Composto (I) foi, portanto, testado nos sistemas in vivo mencionados acima.

[00119] Nos camundongos infectados com A2 de RSV, o título do vírus atingiu o pico no dia 4 após inoculação. O Composto (I) foi administrado 1 dia e 1 h antes da inoculação (dia 0) e então 2 e 3 dias depois da infecção por vírus seja intranasal (Tabela D, Figura 3) ou in- tratraquealmente (Tabela E) e em ambos os casos demonstrou inibição potente dependente de dose do título viral nos homogeneizados do pulmão. Tabela D: Os efeitos de tratamento intranasal com Composto (I) no título viral de A2 de RSV no pulmão de camundongos infectados com A2 de RSV.

1. valores de n foram 8 para todos os experimentos; 2.: limite inferior de quatificação (LOQ). Tabela E: Os efeitos de tratamento intratraqueal com Composto (I) no título viral de A2 de RSV no pulmão do camundongo infectado com A2 de RSV.

1. valores de n foram 8 para todos os experimentos; 2.: Limite inferior de quantificação (LOQ).

[00120] A inibição potente dependente de dose do título do vírus pelo Composto (I) também foi vista em homogeneizados de pulmão de ratos de algodão infectados com RSV/S/Long no dia 4 (Tabela F, Figura 4). Além disso, a substância medicamentosa exibiu uma inibição dependente de dose de transcritos de gene de RSV NS-1 (Tabela G) e de transcritos de RANTES no pulmão (Tabela H). Tabela F: Os efeitos de tratamento intranasal com Composto (I) no título viral de A2 de RSV no pulmão de ratos de algodão infectados com A2 de RSV.

1. valores de n foram 6 para todos os experimentos; 2.: Limite inferior de quantificação (LOQ). Tabela G: Os efeitos de tratamento intranasal com Composto (I) na expressão de gene NS-1 de A2 de RSV no pulmão de ratos de algodão infectados com A2 de RSV.

1. valores de n foram 6 para todos os experimentos. Tabela H: Os efeitos de tratamento intranasal com Composto (I) na expressão de gene RANTES no pulmão de ratos de algodão infectados com A2 de RSV.

1. valores de n foram 6 para todos os experimentos.

SUMÁRIO

[00121] A atividade antiviral in vitro do composto da invenção foi demonstrada por seu efeito citoprotetor nas células HEp2, infectadas com RSV. Nesse sistema de ensaio, a inibição de replicação de vírus foi detectada e quantificada a partir da inibição resultante do CPE mediado por vírus. É particularmente notável que o Composto (I) é um inibidor potente do CPE induzido por ambas a cepa A de RSV e a cepa B de RSV estudadas. A atividade antiviral potente do Composto (I) foi ainda evidenciada por sua inibição de expressão de proteína F de A2 de RSV nas células BEAS2B.

[00122] O composto da invenção demonstra baixa toxicidade de célula de mamífero conforme medido por sua falta de qualquer efeito significativo no ensaio de viabilidade de célula. Além disso, em um modelo in vitro de epitélio pulmonar humano, compreendendo cultura de interface ar-líquido de células epiteliais brônquicas, o composto da invenção inibiu completamente o título do vírus quando administrado por intervenção de estágio precoce ou tardio. A última observação é particularmente significativa para o tratamento de doença estabelecida.

[00123] A atividade antiviral in vivo do composto da invenção foi demonstrada em camundongos e ratos de algodão infectados com RSV. Nos sistemas de ensaio, a inibição de replicação de vírus foi detectada e quantificada a partir do título de RSV nos homogeneizados de pulmão, conforme medido em um ensaio de placa. Em conformidade com os dados obtidos dos estudos conduzidos em células brônqui- cas humanas cultivadas por ALI, o Composto (I) inibiu completamente o título do vírus nos pulmões de camundongos e ratos de algodão infectados com A2 de RSV. O composto da invenção tem assim os atributos necessários para ser um medicamento eficaz para o tratamento e/ou prevenção de infecção por RSV e doença associada. REFERÊNCIAS Abman S.H., Ogle J.W., Butler-Simon N., Rumack C.M., and Accurso F.J. Role of respiratory syncytial virus in early hospitalizations for respiratory distress of young infants with cystic fibrosis. J. Pe- diatr., 1988, 113, 826-30. Bem R.A., Domachowske J.B. and Rosenberg, H.F. Animal models of human respiratory syncytial disease. Am. J. Physiol., 2011. 301, L148-L156. Hall C.B., Douglas R.G. Jr., Schnabel K.C. and Geiman J.M. Infectivity of respiratory syncytial virus by various routes of inoculation. Infect. Immun., 1981, 33, 779-83. Holt P.G. and Sly P.D. Interactions between RSV infection, asthma, and atopy: unravelling the complexities. J. Exp. Med., 2002, 196, 1271-1275. Johnson J.E., Gonzales R.A., Olson S.J., Wright P.F. and Graham, B.S. The histopathology of fatal untreated human respiratory syncytial virus infection. Modern Pathology, 2007, 20, 108-119. Lee N., Lui G.C., Wong K.T., Li T.C., Tse E.C., Chan J.Y., Yu J., Wong S.S., Choi K.W., Wong R.Y., Ngai K.L., Hui D.S. and Chan P.K. High morbidity and mortality in adults hospitalized for Respiratory syncytial virus infections. Clin. Infect. Dis., 2013, 57, 1069-77. Mohan A., Chandra S., Agarwal D., Guleria R., Broor S., Gaur B. and Pandey R.M. Prevalence of viral infection detected by PCR and TA-PCR in patients with acute exacerbation of COPD: A sys-tematic review. Respirology, 2010, 15, 536-542. Newcomb D.C. and Peebles R.S. Jr. Bugs and asthma: a different disease? Proc. Am. Thorac. Soc., 2009, 1;6, 266-71. Olivier A., Gallup J., de Macedo M.M.M.A., Varga S.M. and Ackermann M. Human respiratory syncytial virus A2 strain replicates and induces innate immune responses by respiratory epithelia of neonatal lambs. Int. J. Exp. Pathol,. 2009, 90, 431-438. Panayiotou C., Richter J., Koliou M., Kalogirou N., Georgiou E. and Christodoulou C. Epidemiology of respiratory syncytial virus in children in Cyprus during three consecutive winter seasons (20102013): age distribution, seasonality and association between prevalent genotypes and disease severity. Epidemiol. Infect., 2014, Jan 24, 1-6. Walsh E.E., McConnochie K.M., Long C.E. and Hall C.B. Severity of respiratory syncytial virus infection is related to virus strain. J. Infect. Dis., 1997, 175, 814-20. Zhang Z-Y., Du L-N., Chen X., Zhao Y., Liu, E-M., Yang X- Q. and Zhao X-D Genetic variability of respiratory syncytial viruses (RSV) prevalent in Southwestern China from 2006 to 2009: emergence of subgroup B and A RSV as dominant strains. J. Clin. Microbiol., 2010, 48, 1201-7. Zhu Q., McAuliffe J.M., Patel N.K., Palmer-Hill F.J., Yang C.F., Liang B., Su L., Zhu W., Wachter L., Wilson S., MacGill R.S., Krishnan S., McCarthy M.P., Losonsky G.A. and Suzich J.A. Analysis of respiratory syncytial virus preclinical and clinical variants resistant to neutralization by monoclonal antibodies palivizumab e/ou motavi- zumab. J Infect. Dis., 2011, 203, 674-82. Em todo o relatório descritivo e reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra ‘compreender’, e variações tais como ‘compreende’ e ‘compreendendo’, será entendida para implicar a inclusão de um número inteiro declarado, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas, mas não para a exclusão de nenhum outro número inteiro, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas.

[00124] Todas as patentes e pedidos de patente referidos aqui são incorporados por referência em sua totalidade.

Claims (16)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (I),

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para uso como um agente farmacêutico.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de infecção por RSV e para a prevenção de doença associada com infecção por RSV.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a infecção por RSV é infecção por vírus da cepa A de RSV e/ou vírus da cepa B de RSV.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é para uso como um agente farmacêutico em combinação com um segundo princípio ativo ou adicional.

6. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (II)

ou um sal do mesmo.

7. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: um composto de fórmula (III)

em que LG é um átomo de halogênio, ou um sal do mesmo; um composto de fórmula (IV)

ou um sal do mesmo.

8. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (VI)

ou um sal do mesmo.

9. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula (X)

em que LG é um átomo de halogênio e Ra é C1-6 alquila; ou um sal do mesmo.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido na reivindicação 1, opcio-nalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos far- maceuticamente aceitáveis.

11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica-ção 10, caracterizada pelo fato de que compreende o composto da fórmula (I) na forma particulada suspensa em um meio aquoso.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica-ção 10, caracterizada pelo fato de que compreende um segundo princípio ativo ou adicional.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 5, ou compo-sição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo princípio ativo ou adicional é selecionado de agentes antivirais, inibidores de proteína F, inibidores de RNA poli- merase, ribavirina e agentes anti-inflamatórios.

14. Processo para a preparação de um composto da fórmula (I), como definido na reivindicação 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: reagir um composto de fórmula (II)

ou um sal do mesmo, com 2-flúor-6-metilanilina; ou reagir um composto de fórmula (III)

em que LG é um átomo de halogênio; ou um sal do mesmo; com 7-oxa-2-azaspiro[3,5]nonano ou um sal do mesmo; ou reagir um composto de fórmula (IV)

ou um sal do mesmo, com um composto de fórmula (VI)

ou um sal do mesmo.

15. Processo para a preparação de um composto da fórmula (II)

ou um sal do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: reagir um composto de fórmula (X)

em que LG é um átomo de halogênio e Ra é C1-6 alquila, ou um sal do mesmo, com 7-oxa-2-azaspiro[3,5]nonano ou um sal do mesmo, se-guido por hidrólise do éster carboxilato para o ácido livre.

16. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a fabri- cação de um medicamento para o tratamento de infecção por RSV e para a prevenção ou tratamento de doença associada com infecção por RSV.

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