BR112017002603B1 - ANALYTE DETECTION DEVICE AND METHOD OF DETECTING A TARGET ANALYTE IN A SAMPLE - Google Patents

Abstract

AMPLIFICAÇÃO DE SINAL EM TESTES DE PARCEIRO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO PLASMÔNICO. A presente invenção refere-se a dispositivos de detecção de analito e métodos de utilizar tais dispositivos para detectar quantidades minuto de um analito alvo em uma amostra. Em particular, a invenção fornece um dispositivo de detecção de analito compreendendo uma pluralidade de nanoestruturas de compósito metálico conjugadas a parceiros de ligação ao analito e uma superfície contendo uma nanocamada metálica na qual uma pluralidade de moléculas de captura está imobilizada. Métodos de preparar nanoestruturas de compósitos são também descritos.SIGNAL AMPLIFICATION IN PLASMANIC SPECIFIC BINDING PARTNER TESTS. The present invention relates to analyte detection devices and methods of using such devices to detect minute amounts of a target analyte in a sample. In particular, the invention provides an analyte detection device comprising a plurality of metallic composite nanostructures conjugated to analyte binding partners and a surface containing a metallic nanolayer on which a plurality of capture molecules are immobilized. Methods of preparing composite nanostructures are also described.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOSCROSS-REFERENCE TO RELATED ORDERS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório US 62/037.071, depositado em 13 de agosto de 2014 e o Pedido Provisório US 62/082.468, depositado em 20 de novembro de 2014, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.[001] This order claims priority over Interim Order US 62/037071, filed on August 13, 2014 and Interim Order US 62/082,468, filed on November 20, 2014, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

[002] A presente invenção refere-se a sistemas e métodos para detectar analitos alvos em uma amostra. Em particular, a presente invenção fornece um sistema de detecção de analito baseado em ressonância de plasmon local capaz de detectar uma quantidade mínima de um analito alvo em uma amostra.[002] The present invention relates to systems and methods for detecting target analytes in a sample. In particular, the present invention provides a local plasmon resonance based analyte detection system capable of detecting a minimal amount of a target analyte in a sample.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOFUNDAMENTALS OF THE INVENTION

[003] Imunoensaios e ensaios de ligação de biomolécula atuais tipicamente necessitam de etapas múltiplas e equipamento sofisticado para realizar os ensaios. A falta de sensibilidade e a complexidade envolvidas na realização de tais ensaios heterogêneos surgem de uma necessidade específica de separar parceiros de ligação específicos marcados dos não marcados.[003] Current immunoassays and biomolecule binding assays typically require multiple steps and sophisticated equipment to perform the assays. The lack of sensitivity and complexity involved in performing such heterogeneous assays arise from a specific need to separate labeled from unlabeled specific binding partners.

[004] Tentativas de desenvolver ensaios baseados nas propriedades de ressonância de plasmon de superfície local (LSPR) de nanopartículas de metal nobre foram realizadas (Tokel et al., Chem Rev., Vol. 114: 5728-5752, 2014). LSPR é a oscilação coletiva de elétrons em estruturas de tamanho em nanômetros induzida por luz incidente. Nanopartículas metálicas têm uma resposta eletromagnética forte para mudanças de índice de refração em suas vizinhanças imediatas e, portanto, deslocamentos na frequência de ressonância das nanopartículas podem ser medidos como um indicador de moléculas de ligação à superfície da nanopartícula. Apesar de nanopartículas metálicas, particularmente nanopartículas de ouro, terem sido empregadas em ensaios diagnósticos para detectar eventos de ligação, tais ensaios geralmente sofrem de baixa sensibilidade e não podem ser utilizados para monitorar quantitativamente as cinéticas dos eventos de ligação sequenciais.[004] Attempts to develop assays based on the local surface plasmon resonance (LSPR) properties of noble metal nanoparticles have been carried out (Tokel et al., Chem Rev., Vol. 114: 5728-5752, 2014). LSPR is the collective oscillation of electrons in nanometer-sized structures induced by incident light. Metallic nanoparticles have a strong electromagnetic response to refractive index changes in their immediate surroundings and therefore shifts in the nanoparticle resonant frequency can be measured as an indicator of molecules binding to the nanoparticle surface. Although metallic nanoparticles, particularly gold nanoparticles, have been employed in diagnostic assays to detect binding events, such assays generally suffer from low sensitivity and cannot be used to quantitatively monitor the kinetics of sequential binding events.

[005] Portanto, métodos de teste melhorados empregando um formato homogêneo enquanto fornecendo sensibilidade aumentada são necessários. Testes utilizando técnicas de laboratório padrão, tais como espectroscopia, também seriam desejáveis.[005] Therefore, improved test methods employing a homogeneous format while providing increased sensitivity are needed. Tests using standard laboratory techniques, such as spectroscopy, would also be desirable.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[006] A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta que nanoestruturas de compósito metálico podem melhorar os sinais ópticos induzidos pela ligação de uma molécula à uma superfície de nanocamada metálica. A amplificação observada aumenta muito a sensibilidade da detecção de eventos de ligação biomolecular específicos, de modo que quantidades abaixo de picograma da biomolécula podem ser detectadas. Por conseguinte, a presente invenção fornece dispositivos de detecção de analito e métodos de utilização de tais dispositivos para detectar quantidades mínimas de um analito alvo em uma amostra.[006] The present invention is based, in part, on the discovery that metallic composite nanostructures can enhance the optical signals induced by binding a molecule to a metallic nanolayer surface. The observed amplification greatly increases the sensitivity of detection of specific biomolecular binding events, so that sub-picogram amounts of the biomolecule can be detected. Accordingly, the present invention provides analyte detection devices and methods of using such devices to detect minute amounts of a target analyte in a sample.

[007] Em uma modalidade, o dispositivo de detecção de analito compreende uma pluralidade de conjugados de detecção, uma superfície contendo uma nanocamada metálica e uma pluralidade de moléculas de captura, em que as moléculas de captura são imobilizadas na nanocamada metálica e são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo. Em modalidades em que os dispositivos de detecção de analito são configurados em um formato de ensaio de sanduíche, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas aos parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo. Em modalidades em que os dispositivos de detecção de analito são configurados em um formato de ensaio competitivo direto, a detecção conjuga nanoestruturas de compósito metálico acopladas aos analitos alvo.[007] In one embodiment, the analyte detection device comprises a plurality of detection conjugates, a surface containing a metal nanolayer and a plurality of capture molecules, wherein the capture molecules are immobilized on the metal nanolayer and are capable of binding specifically to the target analyte. In embodiments where the analyte detection devices are configured in a sandwich assay format, the detection conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to binding partners that are capable of specifically binding the target analyte. In embodiments where the analyte detection devices are configured in a direct competitive assay format, the detection conjugates metallic composite nanostructures coupled to the target analytes.

[008] As nanoestruturas de compósito metálico nos conjugados de detecção geralmente compreendem pelo menos dois metais nobres, metais de transição, metais alcalinos, lantanídeos ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais selecionados de ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, ferro, níquel e zinco. Em certas modalidades, cada uma das nanoestruturas de compósito metálico compreende um núcleo de um primeiro metal e um revestimento de um segundo metal. Em algumas modalidades, o núcleo pode ser prata ou cobre com um revestimento de ouro. Em outras modalidades, o núcleo de um primeiro metal pode ser dissolvido após o revestimento, de modo que a estrutura oca composta do segundo metal de revestimento resulte.[008] The metallic composite nanostructures in the detection conjugates usually comprise at least two noble metals, transition metals, alkali metals, lanthanides or combinations thereof. In some embodiments, the metallic composite nanostructures comprise at least two metals selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, iron, nickel and zinc. In certain embodiments, each of the metallic composite nanostructures comprises a core of a first metal and a cladding of a second metal. In some embodiments, the core can be silver or copper with a gold plating. In other embodiments, the core of a first metal can be dissolved after cladding, so that the composite hollow structure of the second cladding metal results.

[009] A nanocamada metálica depositada na superfície pode ser um filme metálico ou composta de uma pluralidade de nanoestruturas metálicas imobilizadas na superfície. A nanocamada metálica pode também ser composta de um metal nobre ou de transição. Em algumas modalidades, a nanocamada metálica compreende ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, zinco ou um compósito dos mesmos. Em outra modalidade, a nanocamada metálica compreende ouro. Em outra modalidade, a nanocamada metálica compreende prata. Em ainda outra modalidade, a nanocamada metálica compreende uma nanocamada de prata sobreposta com uma nanocamada de ouro.[009] The metallic nanolayer deposited on the surface can be a metallic film or composed of a plurality of metallic nanostructures immobilized on the surface. The metallic nanolayer can also be composed of a noble or transition metal. In some embodiments, the metallic nanolayer comprises gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, zinc or a composite thereof. In another embodiment, the metallic nanolayer comprises gold. In another embodiment, the metallic nanolayer comprises silver. In yet another embodiment, the metallic nanolayer comprises a silver nanolayer superimposed with a gold nanolayer.

[010] A presente invenção também fornece métodos de detectar um analito alvo em uma amostra utilizando os dispositivos de detecção de analito descritos aqui. Em uma modalidade, os métodos compreendem misturar a amostra com uma pluralidade de conjugados de detecção, colocando em contato a mistura com uma superfície contendo uma nanocamada metálica em que uma pluralidade de moléculas de captura é imobilizada, expondo a superfície a uma fonte de luz em uma faixa de comprimento de onda dentro do espectro de ultravioletra-visível-infravermelho; e medir um sinal óptico a partir da superfície, em que uma mudança no sinal óptico indica a presença do analito alvo na amostra. Em certas modalidades, os métodos da presente invenção são capazes de detectar quantidades de femtograma a nanograma de um analito alvo na amostra.[010] The present invention also provides methods of detecting a target analyte in a sample using the analyte detection devices described herein. In one embodiment, the methods comprise mixing the sample with a plurality of detection conjugates, contacting the mixture with a surface containing a metallic nanolayer on which a plurality of capture molecules are immobilized, exposing the surface to a light source in a wavelength range within the ultraviolet-visible-infrared spectrum; and measuring an optical signal from the surface, wherein a change in the optical signal indicates the presence of the target analyte in the sample. In certain embodiments, the methods of the present invention are capable of detecting femtogram to nanogram amounts of a target analyte in the sample.

[011] A presente invenção inclui um ensaio complexo compreendendo um conjugado de detecção compreendendo uma nanoestrutura de compósito metálico acoplada a um parceiro de ligação; um analito alto; e um grânulo revestido de nanocamada metálica em que uma molécula de captura é imobilizada, em que o parceiro de ligação no conjugado de detecção está ligado a um primeiro epítopo no analito alvo e a molécula de captura está ligada a um segundo epítopo no analito alvo, formando, assim, um complexo compreendendo o conjugado de detecção, analito alvo e a molécula de captura. Em algumas modalidades, a nanoestrutura de compósito metálico é uma nanoestrutura de prata revestida de outro ou uma nanoestrutura de cobre revestida de ouro e o revestimento de nanocamada metálica no grânulo compreende ouro.[011] The present invention includes a complex assay comprising a detection conjugate comprising a metallic composite nanostructure coupled to a binding partner; a high analyte; and a metal nanolayer coated bead on which a capture molecule is immobilized, wherein the binding partner in the detection conjugate is linked to a first epitope on the target analyte and the capture molecule is linked to a second epitope on the target analyte, thereby forming a complex comprising the detection conjugate, target analyte and capture molecule. In some embodiments, the metallic composite nanostructure is an gold-coated silver nanostructure or a gold-coated copper nanostructure and the metallic nanolayer coating on the bead comprises gold.

[012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar nanoestruturas de compósito metálico para uso em dispositivos de detecção e métodos descritos aqui. Em uma modalidade, os métodos compreendem preparar uma primeira solução compreendendo uma mistura de um polímero e ácido cloroáurico, preparando uma segunda solução compreendendo nanoestruturas de prata ou cobre, e incubando a primeira solução com a segunda solução por um período de tempo, em que a mistura resultante compreende nanoestruturas de prata revestidas com outro ou nanoestruturas de cobre revestidas com ouro. Em certas modalidades, um agente de redução, tal como ácido ascórbico, é adicionado na mistura de reação para aumentar a quantidade de nanoestruturas produzidas. Em uma modalidade, o polímero na primeira solução é polivinilpirrolidona. Em outra modalidade, o polímero na primeira solução é polivinil álcool.[012] In another aspect, the present invention provides a method for preparing metallic composite nanostructures for use in detection devices and methods described herein. In one embodiment, the methods comprise preparing a first solution comprising a mixture of a polymer and chloroauric acid, preparing a second solution comprising silver or copper nanostructures, and incubating the first solution with the second solution for a period of time, wherein the resulting mixture comprises gold-coated silver nanostructures or gold-coated copper nanostructures. In certain embodiments, a reducing agent, such as ascorbic acid, is added to the reaction mixture to increase the amount of nanostructures produced. In one embodiment, the polymer in the first solution is polyvinylpyrrolidone. In another embodiment, the polymer in the first solution is polyvinyl alcohol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[013] Figura 1. Gráfico de um deslocamento no comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para um sensor de monocamada de ouro (canal 1) acoplado a albumina de soro bovino (BSA) e sensores de monocamada de ouro acoplados a IgG humano (canais 2-4). As setas indicam a sequência de injeção e concentração da proteína A não marcada, 1 mM HCl ou proteína A marcada com ouro coloidal (CGC).[013] Figure 1. Graph of a shift in peak wavelength versus acquisition time for a gold monolayer sensor (channel 1) coupled to bovine serum albumin (BSA) and gold monolayer sensors coupled to human IgG (channels 2-4). Arrows indicate injection sequence and concentration of unlabeled protein A, 1 mM HCl, or colloidal gold-labeled protein A (CGC).

[014] Figura 2. Gráfico de deslocamento no comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para um sensor de nanocamada de ouro acoplado a anticorpo anti- CRP C7. As setas indicam uma sequência de injeção de concentrações de 0 a 100 ng/ml de CRP em canais diferentes (carregando CRP), 1 μg/ml de anticorpo anti-CRP C6 não marcado ou 3 μg/ml de anticorpo anti-CRP C6 marcado com ouro coloidal (C6-CGC). Nenhuma outra ligação C6-CGC foi observada quando a superfície do sensor foi ocupada com anticorpo anti-CRP C6 não marcado.[014] Figure 2. Plot of shift in peak wavelength versus acquisition time for a gold nanolayer sensor coupled to anti-CRP C7 antibody. The arrows indicate a sequence of injection of concentrations of 0 to 100 ng/ml of CRP in different channels (carrying CRP), 1 μg/ml of unlabelled anti-CRP C6 antibody or 3 μg/ml of colloidal gold-labeled anti-CRP C6 antibody (C6-CGC). No further C6-CGC binding was observed when the sensor surface was coated with unlabelled anti-C6 CRP antibody.

[015] Figura 3. Gráfico do deslocamento no comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para um sensor de nanocamada de ouro acoplada a anticorpo anti- CRP C7. As setas indicam a sequência de injeção de concentrações de 0 a 100 ng/ml concentrações de CRP em canais diferentes (carregando CRP), 1 μg/ml de anticorpo anti—CRP C6 marcado com ouro coloidal (C6-CGC), 3 μg/ml de C6-CGC ou HCl 1 mM (Ácido).[015] Figure 3. Graph of peak wavelength shift versus acquisition time for a gold nanolayer sensor coupled to C7 anti-CRP antibody. The arrows indicate the injection sequence of 0 to 100 ng/ml CRP concentrations in different channels (carrying CRP), 1 μg/ml colloidal gold-labeled C6 anti-CRP antibody (C6-CGC), 3 μg/ml C6-CGC or 1 mM HCl (Acid).

[016] Figura 4A. Espectro de refletância de sensores de nanocamada de ouro acoplada a anticorpo anti-CRP C7 carregados com 10 ng/ml de CRP nas várias concentrações de C6-CGC na Figura 3.[016] Figure 4A. Reflectance spectrum of gold nanolayer sensors coupled to anti-CRP C7 antibody loaded with 10 ng/ml of CRP at various concentrations of C6-CGC in Figure 3.

[017] Figura 4B. Gráfico de deslocamento no comprimento de onda de pico versus o tempo de aquisição para um sensor de nanocamada de ouro acoplada com anticorpo anti- CRP C7 incubado com uma de três concentrações de CRP seguindo a introdução de 3 μg/ml de anticorpo anti-CRP C6 marcado com ouro coloidal (C6-CGC). A tabela na direita retrata análises de pico 700 segundos após a introdução do C6-CGC.[017] Figure 4B. Plot of shift in peak wavelength versus acquisition time for a gold nanolayer sensor coupled with anti-CRP C7 antibody incubated with one of three concentrations of CRP following the introduction of 3 μg/ml colloidal gold-labelled anti-CRP C6 antibody (C6-CGC). The table on the right depicts peak analyzes 700 seconds after the introduction of C6-CGC.

[018] Figura 5. Gráfico de deslocamento do comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para um sensor de nanocamada de ouro acoplada com anticorpo anti- CRP C7. As setas indicam a sequência de injeção de concentrações de 0 a 100 ng/ml de CRP em canais diferentes (carregando CRP com tempo de incubação minimizado), 3 μg/ml de anticorpo anti-CRP C6 marcado com ouro coloidal (C6-CGC) ou HCl 1 mM (Ácido).[018] Figure 5. Peak wavelength shift graph versus acquisition time for a gold nanolayer sensor coupled with anti-CRP C7 antibody. The arrows indicate the injection sequence of concentrations from 0 to 100 ng/ml of CRP in different channels (loading CRP with minimized incubation time), 3 μg/ml of anti-CRP C6 antibody labeled with colloidal gold (C6-CGC) or 1 mM HCl (Acid).

[019] Figura 6. Gráfico de deslocamento do comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para traços na Figura 5 seguindo a introdução imediata de 3 μg/ml de anticorpo anti-CRP C6 marcado com ouro coloidal (C6-CGC). A tabela na direita retrata análises de pico 700 segundos após a introdução de C6-CGC como comparado aos deslocamentos de pico obtidos com a incubação de CRP (valores mostrados na Figura 4B).[019] Figure 6. Plot of peak wavelength shift versus acquisition time for traces in Figure 5 following the immediate introduction of 3 μg/ml colloidal gold-labeled C6 anti-CRP antibody (C6-CGC). The table on the right depicts peak analyzes 700 seconds after the introduction of C6-CGC as compared to the peak shifts obtained with the CRP incubation (values shown in Figure 4B).

[020] Figura 7. Gráfico de deslocamento no comprimento de onda de pico versus tempo de aquisição para um sensor de nanocamada acoplado a anticorpo anti-CRP C7 incubado com uma de três concentrações de CRP e anticorpo anti-CRP C6 conjugado a nanoestruturas de prata revestidas com ouro. O controle foi um sensor de nanocamada de ouro com albumina de soro bovino imobilizada (BSA) no lugar do anticorpo C7.[020] Figure 7. Plot of peak wavelength shift versus acquisition time for a nanolayer sensor coupled to anti-CRP C7 antibody incubated with one of three concentrations of CRP and anti-CRP C6 antibody conjugated to gold-coated silver nanostructures. The control was a gold nanolayer sensor with immobilized bovine serum albumin (BSA) in place of the C7 antibody.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[021] A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta de que a amplificação significativa nos ensaios baseados em LSPR pode ser alcançada com parceiros de ligação marcados com nanoestrutura de compósito metálico. Portanto, a presente invenção fornece dispositivos de detecção de analito compreendendo uma superfície LSPR, por exemplo, uma superfície contendo uma nanocamada metálica, uma pluralidade de moléculas de captura imobilizadas na nanocamada metálica e uma pluralidade de conjugados de detecção compreendendo nanoestruturas de compósito metálico acopladas às biomoléculas.[021] The present invention is based, in part, on the discovery that significant amplification in LSPR-based assays can be achieved with metallic composite nanostructure labeled binding partners. Therefore, the present invention provides analyte detection devices comprising an LSPR surface, for example, a surface containing a metallic nanolayer, a plurality of capture molecules immobilized on the metallic nanolayer, and a plurality of detection conjugates comprising metallic composite nanostructures coupled to the biomolecules.

[022] Os dispositivos de detecção de analito podem ser configurados em um formato de ensaios de sanduíche ou um formato de teste competitivo direto. Por exemplo, em uma modalidade, um dispositivo de detecção de analito em um formato de teste de sanduíche compreende (i) uma pluralidade de conjugados de detecção, em que os conjugados compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas a parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente a um analito alvo, (ii) uma superfície contendo uma nanocamada metálica e (iii) uma pluralidade de moléculas de captura, em que as moléculas de captura são imobilizadas na nanocamada metálica e são capazes de ligar especificamente ao analito alvo. Em outra modalidade, um dispositivo de detecção de analito em um formato de ensaio competitivo direto compreende (i) uma pluralidade de conjugados de detecção, em que os conjugados compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas aos analitos alvo, (ii) uma superfície contendo uma nanocamada metálica e (iii) uma pluralidade de moléculas de captura, em que as moléculas de captura são imobilizadas na nanocamada metálica e são capazes de se ligar especificamente aos analitos alvo.[022] Analyte detection devices can be configured in a sandwich assay format or a direct competitive assay format. For example, in one embodiment, an analyte detection device in a sandwich test format comprises (i) a plurality of detection conjugates, wherein the conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to binding partners that are capable of specifically binding to a target analyte, (ii) a surface containing a metallic nanolayer, and (iii) a plurality of capture molecules, wherein the capture molecules are immobilized on the metallic nanolayer and are capable of specifically binding to the target analyte. In another embodiment, an analyte detection device in a direct competitive assay format comprises (i) a plurality of detection conjugates, wherein the conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to the target analytes, (ii) a surface containing a metallic nanolayer, and (iii) a plurality of capture molecules, wherein the capture molecules are immobilized on the metallic nanolayer and are capable of binding specifically to the target analytes.

[023] Os dispositivos de detecção de analito da invenção compreendem uma superfície contendo uma nanocamada metálica. A superfície pode ser de qualquer tamanho e forma adequados, tais como um chip, um poço, uma cubeta ou um grânulo. Em algumas modalidades, a superfície é um chip retangular. Em outras modalidades, a superfície é um disco. Em certas modalidades, a superfície é o fundo, a cobertura e/ou paredes interiores de uma cubeta (por exemplo, cubeta cilíndrica ou retangular). Em ainda outras modalidades, a superfície é um arranjo de partículas não metálicas. A superfície pode ser fabricada a partir de vários materiais, incluindo, mas não limitado a estes, vidro, quartzo, silício, sílica, poliestireno, grafite, tecido (por exemplo, tecidos de polietileno), malha ou uma membrana (por exemplo, membranas de látex, polivinil, náilon ou poliéster).[023] The analyte detection devices of the invention comprise a surface containing a metallic nanolayer. The surface can be any suitable size and shape, such as a chip, well, cuvette or bead. In some embodiments, the surface is a rectangular chip. In other embodiments, the surface is a disc. In certain embodiments, the surface is the bottom, cover and/or interior walls of a cuvette (e.g., cylindrical or rectangular cuvette). In still other embodiments, the surface is an array of non-metallic particles. The surface can be fabricated from a variety of materials including, but not limited to, glass, quartz, silicon, silica, polystyrene, graphite, fabric (e.g., polyethylene fabrics), mesh, or a membrane (e.g., latex, polyvinyl, nylon, or polyester membranes).

[024] Uma nanocamada metálica é preferencialmente depositada na superfície. A nanocamada metálica pode, em algumas modalidades, cobrir toda a área da superfície da superfície particular. Em outras modalidades, a nanocamada metálica pode ser depositada apenas em uma porção da superfície. Por exemplo, a superfície pode conter uma pluralidade de depressões ou poços e a nanocamada metálica é depositada dentro das depressões ou poços. Em outras modalidades, a nanocamada metálica pode ser aplicada na superfície como uma pluralidade de depósitos espaçados ao longo da superfície. As propriedades ópticas da nanocamada metálica podem ser ajustadas variando a espessura da nanocamada e/ou a natureza das nanoestruturas. Em uma modalidade, a nanocamada é composta de nanoilhas metálicas. Em outra modalidade, a nanocamada é composta de nanohastes. Espessuras adequadas da nanocamada metálica para uso nos dispositivos e métodos da invenção incluem de cerca de 0,5 nm a cerca de 100 nm, cerca de 5 nm a cerca de 30 nm, ou cerca de 3 nm a cerca de 10 nm. Superfícies exemplares com um revestimento de nanocamada metálica que podem ser utilizadas nos dispositivos e métodos da invenção incluem as superfícies descritas na Publicação de Patente US 2006/0240573, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.[024] A metallic nanolayer is preferably deposited on the surface. The metallic nanolayer can, in some embodiments, cover the entire surface area of the particular surface. In other embodiments, the metallic nanolayer can be deposited only on a portion of the surface. For example, the surface may contain a plurality of depressions or pits and the metallic nanolayer is deposited within the depressions or pits. In other embodiments, the metallic nanolayer can be applied to the surface as a plurality of deposits spaced along the surface. The optical properties of the metallic nanolayer can be adjusted by varying the thickness of the nanolayer and/or the nature of the nanostructures. In one embodiment, the nanolayer is composed of metallic nanoislands. In another embodiment, the nanolayer is composed of nanorods. Suitable metal nanolayer thicknesses for use in the devices and methods of the invention include from about 0.5 nm to about 100 nm, about 5 nm to about 30 nm, or about 3 nm to about 10 nm. Exemplary surfaces with a metallic nanolayer coating that can be used in the devices and methods of the invention include the surfaces described in US Patent Publication 2006/0240573, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[025] Em certas modalidades, a nanocamada metálica é um filme metálico. Métodos de depositar filmes metálicos em uma superfície de substrato são conhecidos pelos especialistas na técnica e incluem, mas não estão limitados a deposição por camada atômica, deposição por laser pulsado, fundição, deposição por vapor e adsorção. Veja, por exemplo, Atanasov et al., Journal of Physics: Conference Series 514 (2014); Walters and Parkin, Journal of Materials Chemistry, 19: 574-590, 2009; e Gupta et al., J. Appl. Phys. 92, 52645271, 2002, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. O filme metálico pode compreender outros componentes, por exemplo, o filme metálico pode ser um filme de polímero, um filme Langmuir- Blodgett ou um filme de óxido. Em algumas modalidades, o filme metálico compreende duas camadas, em que cada camada compreende um metal diferente. Por modo de exemplo, o filme metálico pode compreender uma camada de prata sobreposta com uma camada de ouro.[025] In certain embodiments, the metallic nanolayer is a metallic film. Methods of depositing metallic films onto a substrate surface are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, atomic layer deposition, pulsed laser deposition, smelting, vapor deposition, and adsorption. See, for example, Atanasov et al., Journal of Physics: Conference Series 514 (2014); Walters and Parkin, Journal of Materials Chemistry, 19: 574-590, 2009; and Gupta et al., J. Appl. Phys. 92, 52645271, 2002, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. The metallic film may comprise other components, for example the metallic film may be a polymer film, a Langmuir-Blodgett film or an oxide film. In some embodiments, the metallic film comprises two layers, each layer comprising a different metal. By way of example, the metallic film may comprise a layer of silver superimposed with a layer of gold.

[026] Em outras modalidades, a nanocamada metálica compreende uma pluralidade de nanoestruturas metálicas imobilizadas na superfície. Nanoestruturas metálicas podem ser imobilizadas na superfície tratando o material de superfície com um reagente para adicionar grupos químicos funcionais, tais como cianeto, amina, tiol, carboxil, aldeído ou maleimida, e reagindo as nanoestruturas metálicas com a superfície tratada. Nanoestruturas metálicas são conhecidas por se ligarem a tais grupos químicos funcionais com alta afinidade. Em algumas modalidades, as nanoestruturas metálicas compreendendo a nanocamada metálica são nanopartículas esféricas. Tais nanopartículas têm diâmetros que são menores do que cerca de 300 nm, menores do que cerca de 200 nm ou menores do que cerca de 150 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas esféricas têm um diâmetro de cerca de 5 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 10 nm a cerca de 100 nm ou de cerca de 20 nm a cerca de 60 nm. Em certas modalidades, os tamanhos das nanoestruturas metálicas utilizadas para criar a nanocamada metálica são similares ao tamanho das nanoestruturas compostas utilizadas nos conjugados de detecção. Em tais modalidades, igualar o tamanho dos dois conjuntos de nanoestruturas pode fornecer um deslocamento de comprimento de onda ótimo em um espectro de refletância, emissão ou dispersão.[026] In other embodiments, the metallic nanolayer comprises a plurality of metallic nanostructures immobilized on the surface. Metallic nanostructures can be immobilized on the surface by treating the surface material with a reagent to add functional chemical groups, such as cyanide, amine, thiol, carboxyl, aldehyde or maleimide, and reacting the metallic nanostructures with the treated surface. Metallic nanostructures are known to bind to such functional chemical groups with high affinity. In some embodiments, the metallic nanostructures comprising the metallic nanolayer are spherical nanoparticles. Such nanoparticles have diameters that are less than about 300 nm, less than about 200 nm, or less than about 150 nm. In some embodiments, the spherical nanoparticles have a diameter of from about 5 nm to about 200 nm, from about 10 nm to about 100 nm, or from about 20 nm to about 60 nm. In certain embodiments, the sizes of the metallic nanostructures used to create the metallic nanolayer are similar to the size of the composite nanostructures used in the detection conjugates. In such embodiments, matching the size of the two sets of nanostructures can provide an optimal wavelength shift in a reflectance, emission or scattering spectrum.

[027] A nanocamada metálica (filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) pode ser composta de um metal nobre ou compósito do mesmo. Em outras modalidades, a nanocamada metálica (filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) pode ser composta de um metal de transição ou compósito do mesmo. Em certas modalidades, a nanocamada metálica compreende um metal selecionado de ouro, prata, cobre, platina, paládio, rutênio, ródio, ósmio, irídio, titânio, cromo, zinco, ferro, cobalto, níquel e compósitos dos mesmos. Em uma modalidade particular, a nanocamada metálica (por exemplo, filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) compreende ouro. Em outra modalidade particular, a nanocamada metálica (por exemplo, filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) compreende prata. Em certas modalidades, a nanocamada metálica (por exemplo, filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) compreende um compósito de outro e prata ou ouro e cobre. O uso de metais alcalinos (por exemplo, lítio, sódio, potássio, rubídio, césio e frâncio) ou lantanídeos (por exemplo, lantânio, cério, praseodímio, neodímio, promécio, samário, európio, gadolínio, térbio, disprósio, hólmio, érbio, túlio, itérbio e lutétio) pode melhorar a intensidade dos picos LSPR. Por conseguinte, em algumas modalidades, a nanocamada metálica (filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) pode ser composta de um ou mais metais alcalinos ou lantanídeos. Em outras modalidades, a nanocamada metálica (filme metálico ou pluralidade de nanoestruturas metálicas) pode ser composta de uma combinação de um metal nobre e um metal alcalino ou lantanídeo.[027] The metallic nanolayer (metallic film or plurality of metallic nanostructures) can be composed of a noble metal or composite thereof. In other embodiments, the metallic nanolayer (metallic film or plurality of metallic nanostructures) can be composed of a transition metal or composite thereof. In certain embodiments, the metallic nanolayer comprises a metal selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, ruthenium, rhodium, osmium, iridium, titanium, chromium, zinc, iron, cobalt, nickel, and composites thereof. In a particular embodiment, the metallic nanolayer (e.g. metallic film or plurality of metallic nanostructures) comprises gold. In another particular embodiment, the metallic nanolayer (e.g. metallic film or plurality of metallic nanostructures) comprises silver. In certain embodiments, the metallic nanolayer (e.g., metallic film or plurality of metallic nanostructures) comprises a composite of gold and silver or gold and copper. The use of alkali metals (eg, lithium, sodium, potassium, rubidium, cesium, and francium) or lanthanides (eg, lanthanum, cerium, praseodymium, neodymium, promethium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium, and lutetium) may improve the intensity of LSPR peaks. Therefore, in some embodiments, the metallic nanolayer (metallic film or plurality of metallic nanostructures) can be composed of one or more alkali metals or lanthanides. In other embodiments, the metallic nanolayer (metallic film or plurality of metallic nanostructures) can be composed of a combination of a noble metal and an alkali metal or lanthanide.

[028] Os dispositivos de detecção de analitos da invenção ainda compreendem uma pluralidade de moléculas de captura imobilizadas na nanocamada metálica depositada em uma superfície. As moléculas de captura são capazes de se ligar especificamente a um analito alvo. Como utilizado aqui, “ligação específica” refere-se a se ligar a uma molécula alvo com alta afinidade, por exemplo, uma afinidade de pelo menos 10-6M. Em algumas modalidades, as moléculas de captura são haptenos e outras moléculas menores, drogas, hormônios, macromoléculas biológicas incluindo, mas não limitadas a, anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, Fv, Fab, (Fab)2, cadeia simples, CDR etc.), antígenos, receptores, ligantes, polinucleotídeos, aptâmeros, polipeptídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, glicopeptídeos, lipoproteínas ou nucleoproteínas. Em certas modalidades, a pluralidade de moléculas de captura são anticorpos. Em outras modalidades, a pluralidade de moléculas de captura são antígenos.[028] The analyte detection devices of the invention further comprise a plurality of capture molecules immobilized on the metallic nanolayer deposited on a surface. Capture molecules are capable of specifically binding to a target analyte. As used herein, "specific binding" refers to binding to a target molecule with high affinity, for example an affinity of at least 10-6M. In some modalities, capture molecules are Hapten and other smaller molecules, drugs, hormones, biological macromolecules including, but not limited to, antibodies or fragments of them (eg FV, FAB, (FAB) 2, simple chain, CDR etc.), antigens, receptors, binders, polysaccharides, polypeptides, polysaccharides , lipopolysaccharides, glycopeptides, lipoproteins or nucleoproteins. In certain embodiments, the plurality of capture molecules are antibodies. In other embodiments, the plurality of capture molecules are antigens.

[029] Métodos de imobilizar moléculas nas nanocamadas metálicas ou nanoestruturas são conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais métodos incluem conjugações químicas, tais como aquelas envolvendo química de cloridrato de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodi-imida (EDC), acoplamento de sulfo-NHS, ligação hidrofóbica ou tioéter. Em algumas modalidades, a molécula pode ser acoplada na nanocamada metálica ou nanoestrutura indiretamente através de uma molécula carreadora maior ou proteína. Tal acoplamento indireto é particularmente útil quando a molécula é pequena, tal como um hormônio, uma droga e outras moléculas pequenas menores do que 10 kD. Preferencialmente, a proteína carreadora não é capaz de interação específica com o analito alvo.[029] Methods of immobilizing molecules on metallic nanolayers or nanostructures are known to those skilled in the art. Such methods include chemical conjugations, such as those involving 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) chemistry, sulfo-NHS coupling, hydrophobic or thioether coupling. In some embodiments, the molecule can be coupled to the metallic nanolayer or nanostructure indirectly through a larger carrier molecule or protein. Such indirect coupling is particularly useful when the molecule is small, such as a hormone, a drug, and other small molecules smaller than 10 kD. Preferably, the carrier protein is not capable of specific interaction with the target analyte.

[030] Os dispositivos de detecção de analito da invenção podem também compreender uma pluralidade de conjugados de detecção. Os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas metálicas acopladas a parceiros de ligação capazes de se ligar especificamente ao analito alvo ou a captura de moléculas dependendo da configuração do ensaio. Por exemplo, em modalidades em que o dispositivo é configurado em um formato de teste de sanduíche, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas metálicas acopladas ou conjugadas a parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo. Em outras modalidades em que o dispositivo é configurado em um formato de teste competitivo direto, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas metálicas acopladas ou conjugadas aos analitos alvo.[030] The analyte detection devices of the invention may also comprise a plurality of detection conjugates. Detection conjugates comprise metallic nanostructures coupled with binding partners capable of specifically binding to target analyte or capture molecules depending on the assay setup. For example, in embodiments where the device is configured in a test sandwich format, the detection conjugates comprise metallic nanostructures coupled or conjugated to binding partners that are capable of binding specifically to the target analyte. In other embodiments where the device is configured in a direct competitive test format, the detection conjugates comprise metallic nanostructures coupled or conjugated to the target analytes.

[031] Os parceiros de ligação podem ser do mesmo tipo de moléculas como as moléculas de captura, incluindo, mas não limitadas a haptenos e outras moléculas pequenas, drogas, hormônios, macromoléculas biológicas tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, Fv, Fab, (Fab)2, cadeia simples, CDR etc.), antígenos, receptores, ligantes, polinucleotídeos, aptâmeros, polipeptídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, glicopeptídeos, lipoproteínas ou nucleoproteínas. Em algumas modalidades, os parceiros de ligação são do mesmo tipo de molécula como as moléculas de captura, mas preferencialmente se ligam ao analito alvo em uma localização distinta do sítio de ligação das moléculas de captura. Por modo de exemplo, os parceiros de ligação e as moléculas de captura podem ser ambos anticorpos que reconhecem um analito alvo, mas o epítopo ao qual os parceiros de ligação ligam o analito alvo é separado de e idealmente não sobrepondo o epítopo ao qual as moléculas de captura se ligam ao analito alvo. Portanto, em certas modalidades, os parceiros de ligação são anticorpos que reconhecem um primeiro epítopo de um analito alvo e as moléculas de captura são anticorpos diferentes que reconhecem um segundo epítopo de um analito alvo.[031] The binding partners can be of the same type of molecules as the capture molecules, including, but not limited to, haptens and other small molecules, drugs, hormones, biological macromolecules such as antibodies or fragments thereof (e.g., Fv, Fab, (Fab)2, single chain, CDR, etc.), antigens, receptors, ligands, polynucleotides, aptamers, polypeptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, glycop peptides, lipoproteins or nucleoproteins. In some embodiments, the binding partners are the same type of molecule as the capture molecules, but preferentially bind the target analyte at a location distinct from the binding site of the capture molecules. By way of example, the binding partners and the capture molecules can both be antibodies that recognize a target analyte, but the epitope to which the binding partners bind the target analyte is separate from and ideally not overlapping the epitope to which the capture molecules bind to the target analyte. Therefore, in certain embodiments, the binding partners are antibodies that recognize a first epitope of a target analyte and the capture molecules are different antibodies that recognize a second epitope of a target analyte.

[032] As nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção podem ser compostas de um metal nobre ou um composto do mesmo. Em algumas modalidades, as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção podem ser compostas de um metal de transição ou compósito do mesmo. Em algumas modalidades, as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção podem compreender um metal alcalino ou lantanídeo em combinação com um metal nobre ou de transição. Em certas modalidades, as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção compreendem um metal selecionado de ouro, prata, cobre, platina, paládio, rutênio, ródio, ósmio, irídio, titânio, cromo, cádmio, zinco, ferro, cobalto, níquel e compostos dos mesmos. Em uma modalidade, as nanoestruturas metálicas são nanoestruturas de ouro. Em outra modalidade, as nanoestruturas metálicas são nanoestruturas de prata.[032] The metallic nanostructures in the detection conjugates can be composed of a noble metal or a composite thereof. In some embodiments, the metallic nanostructures in the detection conjugates can be composed of a transition metal or composite thereof. In some embodiments, the metallic nanostructures in the detection conjugates can comprise an alkali or lanthanide metal in combination with a noble or transition metal. In certain embodiments, the metallic nanostructures in the detection conjugates comprise a metal selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, ruthenium, rhodium, osmium, iridium, titanium, chromium, cadmium, zinc, iron, cobalt, nickel and compounds thereof. In one embodiment, the metallic nanostructures are gold nanostructures. In another embodiment, the metallic nanostructures are silver nanostructures.

[033] Em modalidades preferidas, as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas metálicas compostas. “Nanoestruturas de compósito metálico” refere-se a nanoestruturas que compreendem pelo menos dois metais nobres, metais de transição, metais alcalinos ou lantanídeos. Os dois ou mais metais podem ser misturados juntos, como em uma liga, ou os dois ou mais metais podem estar presentes em porções separadas da nanoestrutura. Por exemplo, um metal pode formar o núcleo da nanoestrutura, enquanto o segundo metal forma uma casca externa ou revestimento da nanoestrutura. Em algumas modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais selecionados de ouro, prata, cobre, platina, paládio, rutênio, ródio, ósmio, irídio, titânio, cromo, cádmio, zinco, ferro, cobalto e níquel. Em outras modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais selecionados de ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, ferro, níquel e zinco. Em uma modalidade partículas, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem ouro e prata. Em outra modalidade, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem ouro e cobre. Em ainda outra modalidade, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem prata e cobre.[033] In preferred embodiments, the metallic nanostructures in the detection conjugates are composite metallic nanostructures. "Metallic composite nanostructures" refers to nanostructures comprising at least two noble metals, transition metals, alkali metals or lanthanides. The two or more metals can be mixed together, as in an alloy, or the two or more metals can be present in separate portions of the nanostructure. For example, one metal can form the core of the nanostructure, while the second metal forms an outer shell or coating of the nanostructure. In some embodiments, the metallic composite nanostructures comprise at least two metals selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, ruthenium, rhodium, osmium, iridium, titanium, chromium, cadmium, zinc, iron, cobalt, and nickel. In other embodiments, the metallic composite nanostructures comprise at least two metals selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, iron, nickel and zinc. In a particle embodiment, metallic composite nanostructures comprise gold and silver. In another embodiment, the metallic composite nanostructures comprise gold and copper. In yet another embodiment, the metallic composite nanostructures comprise silver and copper.

[034] Em algumas modalidades, cada uma das nanoestruturas de compósito metálico é uma liga de um primeiro metal e um segundo metal. Em certas modalidades, cada uma das nanoestruturas de compósito metálico compreende um núcleo de um primeiro metal e um revestimento de um segundo metal. Em uma modalidade, o núcleo é prata e o revestimento é ouro. Em outras modalidades, o núcleo é cobre e o revestimento é ouro. Em outras modalidades, o núcleo é prata e o revestimento é cobre. Em algumas modalidades, cada uma das nanoestruturas de compósito metálico compreende um núcleo dielétrico (por exemplo, dióxido de silício, sulfeto de ouro, dióxido de titânio, sílica e poliestireno), um primeiro revestimento de um primeiro metal, e um segundo revestimento de um segundo metal. Em uma modalidade particular, o núcleo é sílica, o primeiro revestimento (isto é, revestimento interno) é um revestimento de prata, e o segundo revestimento é um revestimento de ouro (isto é, revestimento externo). Em outra modalidade, o núcleo é sílica, o primeiro revestimento (isto é, revestimento interno) é um revestimento de cobre, e o segundo revestimento é um revestimento de ouro (isto é, revestimento externo).[034] In some embodiments, each of the metallic composite nanostructures is an alloy of a first metal and a second metal. In certain embodiments, each of the metallic composite nanostructures comprises a core of a first metal and a cladding of a second metal. In one embodiment, the core is silver and the cladding is gold. In other embodiments, the core is copper and the cladding is gold. In other embodiments, the core is silver and the cladding is copper. In some embodiments, each of the metallic composite nanostructures comprises a dielectric core (e.g., silicon dioxide, gold sulfide, titanium dioxide, silica, and polystyrene), a first coating of a first metal, and a second coating of a second metal. In a particular embodiment, the core is silica, the first coating (i.e., inner coating) is a silver coating, and the second coating is a gold coating (i.e., outer coating). In another embodiment, the core is silica, the first coating (i.e., inner coating) is a copper coating, and the second coating is a gold coating (i.e., outer coating).

[035] Em algumas modalidades, o núcleo compreendendo um primeiro metal é dissolvido seguindo o processo de revestimento com um segundo metal para criar uma estrutura oca composta do segundo metal. Por exemplo, o revestimento de um núcleo de prata com nanopartículas de ouro gera uma casca de ouro em torno do núcleo de prata e o núcleo de prata é subsequentemente dissolvido ou degradado, resultando na formação de uma estrutura de casca de nano- ouro oca.[035] In some embodiments, the core comprising a first metal is dissolved following the coating process with a second metal to create a hollow structure composed of the second metal. For example, coating a silver core with gold nanoparticles generates a gold shell around the silver core and the silver core is subsequently dissolved or degraded, resulting in the formation of a hollow nano-gold shell structure.

[036] As nanoestruturas metálicas incluem nanopartículas esféricas assim como nanoplacas e nanocascas. Nanoplacas têm dimensões laterais (por exemplo, comprimentos de borda) que são maiores do que sua espessura. Nanoplacas incluem nanodiscos, nanopolígonos, nanohexágonos, nanocubos, nanoanéis, nanoestrelas e nanoprismas. Em algumas modalidades, as nanoestruturas metálicas, incluindo as nanoestruturas compostas, têm uma geometria selecionada de nanopartículas esféricas, nanopartículas piramidais, nanopartículas hexagonais, nanotubos, nanocascas, nanohastes, nanopontos, nanoilhas, nanofios, nanodiscos, nanocubos ou combinações das mesmas. Outras formas são também possíveis, incluindo formas irregulares. Em certas modalidades, o tamanho e forma das nanoestruturas metálicas não são uniformes - isto é, as nanoestruturas metálicas são uma mistura heterogênea de formas e tamanhos diferentes das nanoestruturas.[036] Metallic nanostructures include spherical nanoparticles as well as nanoplates and nanoshells. Nanoplates have lateral dimensions (eg edge lengths) that are greater than their thickness. Nanoplates include nanodisks, nanopolygons, nanohexagons, nanocubes, nanorings, nanostars and nanoprisms. In some embodiments, metallic nanostructures, including composite nanostructures, have a selected geometry of spherical nanoparticles, pyramidal nanoparticles, hexagonal nanoparticles, nanotubes, nanoshells, nanorods, nanodots, nanoislands, nanowires, nanodisks, nanocubes, or combinations thereof. Other shapes are also possible, including irregular shapes. In certain embodiments, the size and shape of the metallic nanostructures are not uniform - that is, the metallic nanostructures are a heterogeneous mixture of different shapes and sizes of the nanostructures.

[037] Para nanopartículas esféricas, faixas de diâmetro adequados incluem de cerca de 5 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 10 nm a cerca de 100 nm, e de cerca de 20 nm a cerca de 60 nm. Para nanoplacas, os comprimentos de borda podem ser de cerca de 10 nm a cerca de 800 nm, de cerca de 20 nm a cerca de 500 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 200 nm, de cerca de 30 nm a cerca de 100 nm, ou de cerca de 10 nm a cerca de 300 nm. A espessura das nanoplacas pode variar de cerca de 1 a cerca de 100 nm, de cerca de 5 nm a cerca de 80 nm, de cerca de 10 nm a cerca de 50 nm, ou de cerca de 5 nm a cerca de 20 nm.[037] For spherical nanoparticles, suitable diameter ranges include from about 5 nm to about 200 nm, from about 10 nm to about 100 nm, and from about 20 nm to about 60 nm. For nanoplates, edge lengths can be from about 10 nm to about 800 nm, from about 20 nm to about 500 nm, from about 50 nm to about 200 nm, from about 30 nm to about 100 nm, or from about 10 nm to about 300 nm. The thickness of the nanoplates can range from about 1 nm to about 100 nm, from about 5 nm to about 80 nm, from about 10 nm to about 50 nm, or from about 5 nm to about 20 nm.

[038] Em algumas modalidades, as nanoplacas têm uma proporção de aspecto maior do que 2. A proporção de aspecto é a proporção do comprimento de borda para a espessura. Preferencialmente, as nanoplacas têm uma proporção de aspecto de cerca de 2 a cerca de 25, de cerca de 3 a cerca de 20, de cerca de 5 a cerca de 10, de cerca de 2 a cerca de 15, ou de cerca de 10 a cerca de 30.[038] In some embodiments, nanoplates have an aspect ratio greater than 2. The aspect ratio is the ratio of edge length to thickness. Preferably, the nanoplates have an aspect ratio of from about 2 to about 25, from about 3 to about 20, from about 5 to about 10, from about 2 to about 15, or from about 10 to about 30.

[039] Os parceiros de ligação ou analitos alvo podem ser acoplados ou conjugados nas nanoestruturas metálicas (por exemplo, nanoestruturas compostas) utilizando métodos similares como descritos acima para a imobilização das moléculas de captura na nanocamada metálica. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, química de conjugação EDC, acoplamento sulfo-NHS, ligação hidrofóbica ou química de tioéter. Os parceiros de ligação ou analitos alvo podem ser acoplados às nanoestruturas metálicas através de várias funcionalidades químicas incluindo tiol, amina, ditiol, fosforamidita acrílica, azida ou alquinos.[039] Binding partners or target analytes can be coupled or conjugated to metallic nanostructures (eg, composite nanostructures) using similar methods as described above for the immobilization of capture molecules in the metallic nanolayer. Such methods include, but are not limited to, EDC conjugation chemistry, sulfo-NHS coupling, hydrophobic coupling, or thioether chemistry. Binding partners or target analytes can be coupled to metallic nanostructures through various chemical functionalities including thiol, amine, dithiol, acrylic phosphoramidite, azide or alkynes.

[040] Em algumas modalidades, o metal ou metais empregados na nanocamada metálica depositados na superfície podem ser o mesmo metal ou metais dos quais as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são fabricadas. Por exemplo, em uma modalidade, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de ouro. Em outras modalidades, o metal empregado na nanocamada metálica depositado na superfície é diferente do metal ou metais utilizados para criar as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção. Por exemplo, em algumas modalidades, a nanocamada metálica na superfície compreende um filme de prata ou uma pluralidade de nanoestruturas de prata e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de ouro. Em outras modalidades, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de prata. Em certas modalidades, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósitos. Nas modalidades relacionadas, as nanoestruturas de compósitos compreendem nanoestruturas de prata revestidas de ouro. Em outras modalidades particulares, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósitos compreendendo nanoestruturas de cobre revestidas de ouro. Em ainda outras modalidades, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósitos compreendendo nanoestruturas de magnetita revestidas de ouro. Em ainda outras modalidades, a nanocamada metálica depositada na superfície compreende um filme de ouro ou uma pluralidade de nanoestruturas de ouro e os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósitos compreendendo ouro e um metal alcalino ou lantanídeo.[040] In some embodiments, the metal or metals employed in the metallic nanolayer deposited on the surface may be the same metal or metals from which the metallic nanostructures in the detection conjugates are manufactured. For example, in one embodiment, the metal nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures and the detection conjugates comprise gold nanostructures. In other embodiments, the metal employed in the metallic nanolayer deposited on the surface is different from the metal or metals used to create the metallic nanostructures in the detection conjugates. For example, in some embodiments, the metallic nanolayer on the surface comprises a silver film or a plurality of silver nanostructures and the detection conjugates comprise gold nanostructures. In other embodiments, the metal nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures and the detection conjugates comprise silver nanostructures. In certain embodiments, the metallic nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures and the detection conjugates comprise composite nanostructures. In related embodiments, the composite nanostructures comprise gold-coated silver nanostructures. In other particular embodiments, the metal nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures and the detection conjugates comprise composite nanostructures comprising gold-coated copper nanostructures. In yet other embodiments, the metallic nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures, and the detection conjugates comprise composite nanostructures comprising gold-coated magnetite nanostructures. In yet other embodiments, the metallic nanolayer deposited on the surface comprises a gold film or a plurality of gold nanostructures and the detection conjugates comprise composite nanostructures comprising gold and an alkali metal or lanthanide.

[041] A presente invenção também inclui kits compreendendo os dispositivos de detecção de analito da invenção como divulgados aqui. Em uma modalidade, o kit compreende (i) uma superfície contendo a nanocamada metálica na qual uma pluralidade de moléculas de captura é imobilizada e (ii) uma composição compreendendo uma pluralidade de conjugados de detecção como descritos aqui. Em certas modalidades, a composição é embalada separadamente da superfície de modo que esta pode ser colocada em contato subsequentemente com a superfície durante a performance dos métodos de detecção. Em algumas modalidades, a composição compreendendo a pluralidade dos conjugados de detecção é liofilizada, por exemplo, na forma de um pellet ou grânulo. Em modalidades relacionadas, a superfície contendo a nanocamada metálica pode ser um chip, disco ou uma cubeta. Em uma modalidade particular, a superfície contendo a nanocamada metálica é uma cubeta adaptada para uso com um rotor de centrifugação. Em tais modalidades, a nanocamada metálica pode ser depositada na tampa, fundo e/ou paredes da cubeta.[041] The present invention also includes kits comprising the analyte detection devices of the invention as disclosed herein. In one embodiment, the kit comprises (i) a surface containing the metallic nanolayer on which a plurality of capture molecules are immobilized and (ii) a composition comprising a plurality of detection conjugates as described herein. In certain embodiments, the composition is packaged separately from the surface so that it can subsequently be brought into contact with the surface during the performance of the detection methods. In some embodiments, the composition comprising the plurality of detection conjugates is lyophilized, for example, in the form of a pellet or granule. In related embodiments, the surface containing the metallic nanolayer can be a chip, disk or cuvette. In a particular embodiment, the surface containing the metallic nanolayer is a cuvette adapted for use with a centrifuge rotor. In such embodiments, the metallic nanolayer can be deposited on the lid, bottom and/or walls of the cuvette.

[042] Em certas modalidades, todos os componentes dos sistemas de detecção de analito descritos aqui estão contidos dentro de um rotor de centrifugação ou disco. Por exemplo, um rotor ou disco pode conter uma ou mais câmaras de reação em que a superfície de nanocamada metálica contendo moléculas de captura imobilizadas e a pluralidade de conjugados de detecção estão posicionados. Em uma modalidade, a superfície de nanocamada metálica é um chip localizado no fundo da câmara de reação. Em outra modalidade, a nanocamada metálica é depositada diretamente no piso da câmara de reação. Em ainda outra modalidade, a superfície de nanocamada metálica é um grânulo (por exemplo, grânulo plástico) revestido com a nanocamada metálica. Em todas tais modalidades, as moléculas de captura são imobilizadas nas superfícies de nanocamada metálica. Nas modalidades relacionadas, a pluralidade de conjugados de detecção está presente na forma de uma composição liofilizada, tal como um grânulo ou pellet liofilizado.[042] In certain embodiments, all components of the analyte detection systems described herein are contained within a centrifuge rotor or disk. For example, a rotor or disk may contain one or more reaction chambers in which the metallic nanolayer surface containing immobilized capture molecules and the plurality of detection conjugates are positioned. In one embodiment, the metallic nanolayer surface is a chip located at the bottom of the reaction chamber. In another modality, the metallic nanolayer is deposited directly on the floor of the reaction chamber. In yet another embodiment, the metallic nanolayer surface is a bead (e.g., plastic bead) coated with the metallic nanolayer. In all such embodiments, the capture molecules are immobilized on metal nanolayer surfaces. In related embodiments, the plurality of detection conjugates are present in the form of a lyophilized composition, such as a lyophilized granule or pellet.

[043] Em modalidades alternativas, as moléculas de captura são conjugadas em nanoestruturas metálicas, que estão em suspensão coloidal. A pluralidade de conjugados de detecção é adicionada na suspensão na presença de uma amostra de teste. Se o analito alvo está presente na amostra, a formação de complexo irá ocorrer entre os conjugados de detecção e as nanoestruturas suspensas contendo as moléculas de captura, resultando em uma mudança no sinal óptico (por exemplo, um deslocamento no comprimento de onda da absorbância de pico das nanoestruturas suspensas).[043] In alternative embodiments, the capture molecules are conjugated to metallic nanostructures, which are in colloidal suspension. The plurality of detection conjugates are added to the suspension in the presence of a test sample. If the target analyte is present in the sample, complex formation will occur between the detection conjugates and the suspended nanostructures containing the capture molecules, resulting in a change in the optical signal (e.g., a shift in the wavelength of the peak absorbance of the suspended nanostructures).

[044] Por conseguinte, em algumas modalidades, os kits compreendem um rotor ou disco tendo uma ou mais câmaras de reação, em que cada câmara de reação compreende (i) uma composição liofilizada compreendendo uma pluralidade de conjugados de detecção, como descrito aqui e (ii) um grânulo revestido com uma nanocamada metálica, em que uma pluralidade de moléculas de captura é imobilizada na nanocamada metálica. Tais kits fornecem um ensaio de detecção de analito de uma etapa pelo qual uma amostra teste é colocada em contato com o rotor ou disco, e a aplicação de uma força de centrifugação para o rotor ou disco libera a amostra de teste nas câmaras de reação em que a amostra se mistura com a pluralidade de conjugados de detecção e o grânulo revestido com a nanocamada metálica contendo as moléculas de captura imobilizadas. Em modalidades em que o rotor ou disco contém mais do que uma câmara de reação, os conjugados de detecção e moléculas de captura podem ser selecionados de modo que um analito diferente pode ser detectado em cada câmara de reação. Estes dispositivos de detecção de formato rotor podem ser configurados no formato de ensaio sanduíche, o formato competitivo direto ou ambos se os rotores compreendem câmaras de reação múltiplas.[044] Therefore, in some embodiments, kits comprise a rotor or disk having one or more reaction chambers, each reaction chamber comprising (i) a lyophilized composition comprising a plurality of detection conjugates, as described herein, and (ii) a bead coated with a metallic nanolayer, wherein a plurality of capture molecules are immobilized on the metallic nanolayer. Such kits provide a one-step analyte detection assay whereby a test sample is brought into contact with the rotor or disk, and the application of a centrifugal force to the rotor or disk releases the test sample into the reaction chambers where the sample mixes with the plurality of detection conjugates and the bead is coated with the metal nanolayer containing the immobilized capture molecules. In embodiments where the rotor or disk contains more than one reaction chamber, the detection conjugates and capture molecules can be selected so that a different analyte can be detected in each reaction chamber. These rotor shape detection devices can be configured in the sandwich assay format, the direct competitive format or both if the rotors comprise multiple reaction chambers.

[045] Qualquer um dos tipos de nanocamadas metálicas ou nanoestruturas metálicas discutidas aqui pode ser utilizado com estes dispositivos de detecção de formato rotor. Em algumas modalidades, o revestimento de nanocamada metálica no grânulo é uma nanocamada de ouro e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas de ouro. Em outras modalidades, o revestimento de nanocamada metálica no grânulo é uma nanocamada de prata e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas de ouro. Em ainda outras modalidades, o revestimento de nanocamada metálica no grânulo é uma nanocamada de ouro e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas de prata. Em uma modalidade, o revestimento de nanocamada metálica no grânulo é uma nanocamada de prata sobreposta com uma nanocamada de ouro e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas de ouro. Em certas modalidades, o revestimento de nanocamada metálica no grânulo é uma nanocamada de ouro e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção são nanoestruturas de compósitos. Por exemplo, em uma modalidade, as nanoestruturas de compósitos são nanoestruturas de prata revestidas com ouro. Em outras modalidades, as nanoestruturas de compósitos são nanoestruturas de cobre revestidas com ouro.[045] Any of the types of metallic nanolayers or metallic nanostructures discussed here can be used with these rotor shape detection devices. In some embodiments, the metallic nanolayer coating on the bead is a gold nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates are gold nanostructures. In other embodiments, the metallic nanolayer coating on the bead is a silver nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates are gold nanostructures. In still other embodiments, the metallic nanolayer coating on the bead is a gold nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates are silver nanostructures. In one embodiment, the metallic nanolayer coating on the bead is a silver nanolayer overlaid with a gold nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates are gold nanostructures. In certain embodiments, the metallic nanolayer coating on the bead is a gold nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates are composite nanostructures. For example, in one embodiment, the composite nanostructures are gold-coated silver nanostructures. In other embodiments, the composite nanostructures are gold-coated copper nanostructures.

[046] Os kits da invenção podem também incluir instruções para utilizar o dispositivo para detectar um analito em uma amostra de teste, dispositivos ou ferramentas para coletar amostras biológicas, e/ou tampões de extração para obter amostras de materiais sólidos, tais como solo, alimento e tecidos biológicos.[046] The kits of the invention may also include instructions for using the device to detect an analyte in a test sample, devices or tools for collecting biological samples, and/or extraction buffers for obtaining samples of solid materials, such as soil, food and biological tissues.

[047] A presente invenção também fornece métodos de detectar um analito alvo em uma amostra. Em uma modalidade, os métodos compreendem (i) misturar uma amostra de teste com uma pluralidade de conjugados de detecção como descrito aqui; (ii) colocar em contato a mistura com uma superfície contendo uma nanocamada metálica, em que uma pluralidade de moléculas de captura como descritas aqui são imobilizadas na nanocamada metálica; (iii) expor a superfície a uma fonte de luz em uma faixa de comprimento de onda dentro do espectro ultravioleta- visível-infravermelho; e (iv) medir um sinal óptico da superfície, em que uma mudança no sinal óptico indica a presença do analito alvo na amostra.[047] The present invention also provides methods of detecting a target analyte in a sample. In one embodiment, the methods comprise (i) mixing a test sample with a plurality of detection conjugates as described herein; (ii) contacting the mixture with a surface containing a metallic nanolayer, wherein a plurality of capture molecules as described herein are immobilized on the metallic nanolayer; (iii) exposing the surface to a light source in a wavelength range within the ultraviolet-visible-infrared spectrum; and (iv) measuring an optical signal from the surface, wherein a change in the optical signal indicates the presence of the target analyte in the sample.

[048] Em algumas amostras, os métodos de detecção são testes de sanduíche. Em tais modalidades, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas metálicas acopladas a parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo, se presente na amostra, para formar complexos analito-conjugado de detecção. A pluralidade de moléculas de captura, que são imobilizadas na superfície de nanocamada metálica, também são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo, se presente na amostra. A nanocamada metálica é exposta a uma fonte de luz e um sinal óptico é medido, em que uma mudança no sinal óptico indica a presença do analito na amostra. Por modo de ilustração, quando uma amostra contendo o analito alvo é misturada com a pluralidade de conjugados de detecção, o analito alvo se liga aos parceiros de ligação nos conjugados de detecção para formar complexos analito-conjugado de detecção. Estes complexos, por sua vez, se ligam à pluralidade de moléculas de captura imobilizadas na superfície de nanocamada metálica através do analito, assim trazendo as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção em proximidade à superfície de nanocamada metálica. A quantidade de luz que é absorvida ou dispersada pela superfície de nanocamada metálica é afetada pela proximidade das nanoestruturas metálicas no complexo e, portanto, produz um deslocamento aumentado no comprimento de onda de absorção de pico, o que indica a presença do analito alvo na amostra.[048] In some samples, the detection methods are sandwich tests. In such embodiments, the detection conjugates comprise metallic nanostructures coupled to binding partners that are capable of specifically binding the target analyte, if present in the sample, to form analyte-detection conjugate complexes. The plurality of capture molecules, which are immobilized on the metal nanolayer surface, are also able to specifically bind to the target analyte, if present in the sample. The metallic nanolayer is exposed to a light source and an optical signal is measured, where a change in the optical signal indicates the presence of the analyte in the sample. By way of illustration, when a sample containing the target analyte is mixed with the plurality of detection conjugates, the target analyte binds to the binding partners in the detection conjugates to form analyte-detection conjugate complexes. These complexes, in turn, bind to the plurality of capture molecules immobilized on the metallic nanolayer surface through the analyte, thus bringing the metallic nanostructures in the detection conjugates in close proximity to the metallic nanolayer surface. The amount of light that is absorbed or scattered by the metallic nanolayer surface is affected by the proximity of the metallic nanostructures in the complex and therefore produces an increased shift in the peak absorption wavelength, which indicates the presence of the target analyte in the sample.

[049] Em outras modalidades, os métodos de detecção são testes competitivos. Em tais modalidades, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas metálicas acopladas ao analito alvo de interesse. Como no método de teste sanduíche, a pluralidade das moléculas de captura, que estão imobilizadas na superfície de nanocamada metálica, são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo. Neste tipo de ensaio, os conjugados de detecção se ligarão às moléculas de captura inicialmente. Se uma amostra contendo o analito alvo é misturada com estes complexos iniciais, o analito alvo livre ou não marcado na amostra irá competir com os conjugados de detecção para se ligar às moléculas de captura. A mudança no sinal óptico neste tipo de teste será resultante do deslocamento das nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção da superfície de nanocamada metálica, que irá reduzir proporcionalmente o deslocamento do comprimento de onda no comprimento de onda de absorção de pico.[049] In other embodiments, the detection methods are competitive tests. In such embodiments, the detection conjugates comprise metallic nanostructures coupled to the target analyte of interest. As in the sandwich testing method, the plurality of capture molecules, which are immobilized on the metal nanolayer surface, are capable of binding specifically to the target analyte. In this type of assay, the detection conjugates will bind to the capture molecules initially. If a sample containing the target analyte is mixed with these starting complexes, free or unlabeled target analyte in the sample will compete with the detection conjugates to bind to the capture molecules. The change in the optical signal in this type of test will result from the displacement of the metallic nanostructures in the detection conjugates of the metallic nanolayer surface, which will proportionally reduce the wavelength displacement at the peak absorption wavelength.

[050] Uma amostra de teste pode ser qualquer tipo de amostra líquida, incluindo amostras biológicas ou extratos preparados de amostras ambientes e alimentícias. Em uma modalidade particular, a amostra de teste é uma amostra biológica. Amostras biológicas incluem, mas não estão limitadas a, sangue total, plasma, soro, saliva, urina, efusão pleural, suor, bile, fluido cerebroespinal, material fecal, fluidos vaginais, esperma, fluido de lentes oculares, mucosa, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, tecidos de biópsia, saliva e lisados celulares. A amostra biológica pode ser obtida de um sujeito humano ou sujeito animal suspeito de ter uma condição de doença, tal como câncer, doenças infecciosas (por exemplo, infecções virais, bacterianas, parasíticas ou fúngicas), doença cardiovascular, doença metabólica, doença autoimune, etc. A amostra biológica pode também ser obtida de um sujeito saudável (por exemplo, humano ou animal) passando por um check-up médico de rotina.[050] A test sample can be any type of liquid sample, including biological samples or extracts prepared from ambient and food samples. In a particular embodiment, the test sample is a biological sample. Biological samples include, but are not limited to, whole blood, plasma, serum, saliva, urine, pleural effusion, sweat, bile, cerebrospinal fluid, fecal material, vaginal fluids, sperm, ocular lens fluid, mucosa, synovial fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid, biopsy tissues, saliva, and cell lysates. The biological sample may be obtained from a human subject or animal subject suspected of having a disease condition, such as cancer, infectious diseases (e.g., viral, bacterial, parasitic or fungal infections), cardiovascular disease, metabolic disease, autoimmune disease, etc. The biological sample can also be obtained from a healthy subject (eg, human or animal) undergoing a routine medical checkup.

[051] Em algumas modalidades dos métodos, a amostra de teste é misturada com a pluralidade de conjugados de detecção e a mistura é subsequentemente colocada em contato com a superfície de nanocamada metálica contendo as moléculas de captura imobilizadas. Em outras modalidades, a amostra de teste é colocada em contato com a superfície de nanocamada metálica contendo as moléculas de captura imobilizadas e a pluralidade de conjugados de detecção é adicionada subsequentemente. Em certas modalidades, a amostra, a pluralidade de conjugados de detecção e a superfície de nanocamada metálica contendo as moléculas de captura imobilizadas são colocadas em contato ao mesmo tempo. Por exemplo, o contato da amostra com ambos reagentes simultaneamente pode ocorrer nos dispositivos de detecção em formato de rotor descritos acima.[051] In some embodiments of the methods, the test sample is mixed with the plurality of detection conjugates and the mixture is subsequently brought into contact with the metal nanolayer surface containing the immobilized capture molecules. In other embodiments, the test sample is brought into contact with the metal nanolayer surface containing the immobilized capture molecules and the plurality of detection conjugates are subsequently added. In certain embodiments, the sample, the plurality of detection conjugates, and the metal nanolayer surface containing the immobilized capture molecules are contacted at the same time. For example, sample contact with both reagents simultaneously can occur in the rotor-shaped detection devices described above.

[052] Qualquer um dos dispositivos de detecção de analito descrito acima pode ser utilizado nos métodos de detecção da presente invenção. Por conseguinte, as várias superfícies da nanocamada metálica, moléculas de captura e conjugados de detecção descritos aqui são adequados para uso nos métodos de detecção. Por exemplo, em algumas modalidades dos métodos, a superfície contendo uma nanocamada metálica é um chip, um poço, uma cubeta ou um grânulo. Em certas modalidades dos métodos, a superfície contendo uma nanocamada metálica está nas paredes e fundo de uma cubeta incorporada em ou adaptada para uso com um rotor de centrifugação. Nestas e em outras modalidades, a nanocamada metálica na superfície é um filme metálico, tal como um filme de ouro. Em outras modalidades dos métodos, a nanocamada metálica na superfície compreende uma pluralidade de nanoestruturas metálicas imobilizadas na superfície, tal como nanoestruturas de ouro.[052] Any of the analyte detection devices described above can be used in the detection methods of the present invention. Therefore, the various metallic nanolayer surfaces, capture molecules, and detection conjugates described here are suitable for use in detection methods. For example, in some embodiments of the methods, the surface containing a metallic nanolayer is a chip, well, cuvette, or bead. In certain embodiments of the methods, the surface containing a metallic nanolayer is on the walls and bottom of a cuvette incorporated in or adapted for use with a centrifuge rotor. In these and other embodiments, the metallic nanolayer on the surface is a metallic film, such as a gold film. In other embodiments of the methods, the metallic nanolayer on the surface comprises a plurality of metallic nanostructures immobilized on the surface, such as gold nanostructures.

[053] Em certas modalidades dos métodos de detecção, os conjugados de detecção compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas a parceiros de ligação ou analitos alvo. Como descritas aqui, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais nobres ou metais de transição. Em algumas modalidades dos métodos, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais selecionados de ouro, prata, cobre, platina, paládio, rutênio, ródio, ósmio, irídio, titânio, cromo, cádmio, zinco, ferro, cobalto e níquel. Em outras modalidades dos métodos, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem pelo menos dois metais selecionados de ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, ferro, níquel e zinco. Em uma modalidade particular, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem ouro e prata. Em outra modalidade, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem ouro e cobre. Em ainda outra modalidade, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem prata e cobre. As nanoestruturas de compósito metálico utilizadas nos métodos da invenção podem incluir um número de geometrias diferentes, tais como nanopartículas esféricas, nanopartículas piramidais, nanopartículas hexagonais, nanotubos, nano cascas, nanohastes, nanopontos, nanoilhas, nanofios, nanodiscos, nanocubos ou combinações dos mesmos.[053] In certain embodiments of the detection methods, the detection conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to binding partners or target analytes. As described herein, metallic composite nanostructures comprise at least two noble metals or transition metals. In some embodiments of the methods, the metallic composite nanostructures comprise at least two metals selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, ruthenium, rhodium, osmium, iridium, titanium, chromium, cadmium, zinc, iron, cobalt and nickel. In other embodiments of the methods, the metallic composite nanostructures comprise at least two metals selected from gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, iron, nickel and zinc. In a particular embodiment, the metallic composite nanostructures comprise gold and silver. In another embodiment, the metallic composite nanostructures comprise gold and copper. In yet another embodiment, the metallic composite nanostructures comprise silver and copper. The metallic composite nanostructures used in the methods of the invention can include a number of different geometries, such as spherical nanoparticles, pyramidal nanoparticles, hexagonal nanoparticles, nanotubes, nanoshells, nanorods, nanodots, nanoislands, nanowires, nanodisks, nanocubes or combinations thereof.

[054] Em certas modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico utilizadas nos métodos da invenção são ligas de um primeiro metal e um segundo metal. Em algumas modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico utilizadas nos métodos da invenção compreendem um núcleo de um primeiro metal e um revestimento de um segundo metal. Em modalidades particulares, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem um núcleo de prata e um revestimento de ouro. Em outras modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico compreendem um núcleo de cobre e um revestimento de ouro. Em outra modalidade, o núcleo é prata e o revestimento é cobre. Em algumas modalidades, cada uma das nanoestruturas de compósito metálico compreende um núcleo dielétrico (por exemplo, dióxido de silício, sulfeto de ouro, dióxido de titânio, sílica e poliestireno), um primeiro revestimento de um primeiro metal e um segundo revestimento de um segundo metal. Em uma modalidade particular dos métodos de detecção, o núcleo é sílica, o primeiro revestimento (isto, revestimento interno) é um revestimento de prata e o segundo revestimento é um revestimento de ouro (isto é, revestimento externo). Em outra modalidade, o núcleo é sílica, o primeiro revestimento (isto é, revestimento interno) é um revestimento de cobre e o segundo revestimento é um revestimento de ouro (isto é, revestimento externo).[054] In certain embodiments, the metal composite nanostructures used in the methods of the invention are alloys of a first metal and a second metal. In some embodiments, the metallic composite nanostructures used in the methods of the invention comprise a core of a first metal and a cladding of a second metal. In particular embodiments, the metallic composite nanostructures comprise a silver core and a gold coating. In other embodiments, the metallic composite nanostructures comprise a copper core and a gold coating. In another embodiment, the core is silver and the cladding is copper. In some embodiments, each of the metallic composite nanostructures comprises a dielectric core (e.g., silicon dioxide, gold sulfide, titanium dioxide, silica, and polystyrene), a first coating of a first metal, and a second coating of a second metal. In a particular embodiment of the detection methods, the core is silica, the first coating (ie, inner coating) is a silver coating, and the second coating is a gold coating (ie, outer coating). In another embodiment, the core is silica, the first coating (i.e., inner coating) is a copper coating, and the second coating is a gold coating (i.e., outer coating).

[055] Os métodos de detecção da invenção podem ser utilizados para determinar quantidades qualitativas ou quantitativas de um analito alvo. Tais métodos são particularmente úteis para determinar a quantidade aproximada de um analito alvo em uma amostra, que podem ser utilizados inter alia para diagnosticar certas condições médicas ou avaliar a eficácia de uma terapia de droga. Em uma modalidade, a quantidade de um analito alvo pode ser determinada estabelecendo uma curva padrão para o analito particular medindo mudanças nos sinais ópticos de uma superfície de nanocamada metálica como descrito aqui para amostras com uma quantidade conhecida do analito alvo; determinando a mudança de sinal óptico para uma amostra de teste; e comparando a mudança de sinal óptico da amostra de teste com os valores obtidos para a curva padrão. Em algumas modalidades, determinar a quantidade de um complexo entre um primeiro reagente e um segundo reagente compreende comparar a proporção de absorbância e/ou taxa de reação de uma amostra de teste com a proporção de absorbância e/ou taxa de reação de uma amostra com uma quantidade conhecida do complexo, assim determinando a quantidade do complexo na amostra de teste. Os valores quantitativos obtidos das amostras de teste podem ser comparados a valores limite predeterminados, em que os referidos valores limites predeterminados são indicativos de um nível anormal ou normal do analito alvo.[055] The detection methods of the invention can be used to determine qualitative or quantitative amounts of a target analyte. Such methods are particularly useful for determining the approximate amount of a target analyte in a sample, which can be used inter alia to diagnose certain medical conditions or evaluate the effectiveness of a drug therapy. In one embodiment, the amount of a target analyte can be determined by establishing a standard curve for the particular analyte by measuring changes in optical signals from a metallic nanolayer surface as described herein for samples with a known amount of the target analyte; determining the optical signal shift for a test sample; and comparing the optical signal change of the test sample with the values obtained for the standard curve. In some embodiments, determining the amount of a complex between a first reagent and a second reagent comprises comparing the absorbance ratio and/or reaction rate of a test sample to the absorbance ratio and/or reaction rate of a sample with a known amount of the complex, thereby determining the amount of complex in the test sample. Quantitative values obtained from test samples can be compared to predetermined threshold values, said predetermined threshold values being indicative of an abnormal or normal level of the target analyte.

[056] Os métodos de detecção da presente invenção fornecem uma técnica altamente sensível para detectar quantidades mínimas de um analito alvo em uma amostra. Como demonstrado pelos exemplos de trabalho, a amplificação de sinais baseados em ressonância de plasmon das superfícies de nanocamada de ouro pode ser alcançada com conjugados de nanoestrutura de ouro de modo que quantidades em nanograma de um analito alvo podem ser detectadas em uma amostra. Portanto, em uma modalidade dos métodos, a presença de quantidades em nanograma de um analito alvo é detectada. Os inventores descobriram surpreendentemente que a amplificação significativamente maior de sinais baseados em ressonância de plasmon de superfícies de nanocamada de ouro pode ser alcançada com conjugados de nanoestrutura metálica composta. O uso de nanoestruturas de prata revestidas de ouro conjugadas a um anticorpo específico do analito permite a detecção de quantidades em picograma do analito alvo, que é um aumento de 1000 vezes na sensibilidade como comparada àquela obtida com conjugados de nanoestrutura de ouro. Veja o Exemplo 3. Por conseguinte, em algumas modalidades dos métodos, a presença de quantidades de picograma do analito alvo é detectada. Em outras modalidades dos métodos, a presença de quantidades em femtograma do analito alvo é detectada. Sensibilidades maiores podem ser obtidas alterando a composição e/ou forma das nanoestruturas de compósito metálico e/ou superfície de nanocamada metálica.[056] The detection methods of the present invention provide a highly sensitive technique for detecting minute amounts of a target analyte in a sample. As demonstrated by the working examples, amplification of signals based on plasmon resonance from gold nanolayer surfaces can be achieved with gold nanostructure conjugates so that nanogram amounts of a target analyte can be detected in a sample. Therefore, in one embodiment of the methods, the presence of nanogram amounts of a target analyte is detected. The inventors have surprisingly discovered that significantly greater amplification of signals based on plasmon resonance from gold nanolayer surfaces can be achieved with composite metallic nanostructure conjugates. The use of gold-coated silver nanostructures conjugated to an analyte-specific antibody allows the detection of picogram quantities of the target analyte, which is a 1000-fold increase in sensitivity as compared to that obtained with gold nanostructure conjugates. See Example 3. Therefore, in some embodiments of the methods, the presence of picogram amounts of the target analyte is detected. In other embodiments of the methods, the presence of femtogram amounts of the target analyte is detected. Greater sensitivities can be obtained by changing the composition and/or shape of the metallic composite nanostructures and/or metallic nanolayer surface.

[057] Quando luz incidente é aplicada nas nanoestruturas metálicas, elétrons de banda de condução no metal oscilam coletivamente na mesma frequência da onda eletromagnética incidente. Como resultado destas oscilações de ressonância, as nanoestruturas absorvem e dispersam fortemente luz em uma faixa de comprimento de onda específica. Para nanoestruturas metálicas compreendendo metais nobres ou de transição, esta faixa de comprimento de onda está no espectro ultravioleta-visível-infravermelho dependendo da composição particular das nanoestruturas. Portanto, fontes de luz para aplicar energia eletromagnética adequada para uso nos métodos da invenção podem incluir qualquer fonte que pode aplicar uma faixa de comprimento de onda dentro do espectro ultravioleta-visível ou espectro ultravioleta-visível-infravermelho, incluindo lâmpadas de arco e lâseres. Em algumas modalidades, a fonte de luz pode ser equipada com um monocromador de modo que comprimentos de onda específicos de luz podem ser aplicados na superfície de nanocamada metálica.[057] When incident light is applied to metallic nanostructures, conduction band electrons in the metal collectively oscillate at the same frequency as the incident electromagnetic wave. As a result of these resonance oscillations, the nanostructures strongly absorb and scatter light in a specific wavelength range. For metallic nanostructures comprising noble or transition metals, this wavelength range is in the ultraviolet-visible-infrared spectrum depending on the particular composition of the nanostructures. Therefore, light sources for delivering electromagnetic energy suitable for use in the methods of the invention can include any source that can deliver a wavelength range within the ultraviolet-visible spectrum or ultraviolet-visible-infrared spectrum, including arc lamps and lasers. In some embodiments, the light source can be equipped with a monochromator so that specific wavelengths of light can be applied to the metallic nanolayer surface.

[058] As propriedades ópticas das nanocamadas metálicas e nanoestruturas dependem de seu tamanho, forma e composição. Por exemplo, nanopartículas de ouro sólidas têm uma absorção de comprimento de onda de pico (Àmax) de cerca de 515 nm a cerca de 560 nm dependendo do tamanho de partícula. Nanopartículas esféricas de ouro tendo um diâmetro máximo de 30 nm absorvem em cerca de 52 0 nm com Àmax mudando para comprimentos de onda mais longos conforme o diâmetro de partícula aumenta. Partículas de prata e cobre têm um Àmax na região ultravioleta/azul ou vermelha (por exemplo, de cerca de 350 nm a cerca de 500 nm) com o aumento do diâmetro de partícula causando um deslocamento no Àmax para comprimentos de onda mais longos. Nanohastes metálicas têm um Àmax1 transverso e um Àmax2 longitudinal. Ligas de metais diferentes tipicamente exibem picos de absorção em uma faixa intermediária entre os picos de absorção dos metais compreendendo. Por exemplo, nanoestruturas compreendendo uma liga de 50/50 de ouro e prata exibem um Àmax de cerca de 470 nm com quantidades aumentadas de ouro causando uma mudança no pico de absorção nos comprimentos de onda mais longos. A sensibilidade dos sinais LSPR para mudanças no índice de refração de meio local pode ser modificada mudando a forma ou geometria das nanoestruturas. Por exemplo, as partículas não esféricas (por exemplo, nanoprismas, nano-hastes, nanocascas, etc.) têm sensibilidades LSPR aumentadas como comparado a esferas. Em algumas modalidades, as propriedades ópticas (por exemplo, absorção/dispersão em comprimentos de onda particulares) são adaptadas para uma aplicação particular variando o tamanho, forma ou composição da nanocamada metálica depositada na superfície ou nas nanoestruturas metálicas empregadas nos conjugados de detecção.[058] The optical properties of metallic nanolayers and nanostructures depend on their size, shape and composition. For example, solid gold nanoparticles have a peak wavelength absorption (Àmax) of about 515 nm to about 560 nm depending on the particle size. Spherical gold nanoparticles having a maximum diameter of 30 nm absorb at about 520 nm with λ max shifting to longer wavelengths as the particle diameter increases. Silver and copper particles have an Àmax in the ultraviolet/blue or red region (eg, from about 350 nm to about 500 nm) with increasing particle diameter causing a shift in the Àmax to longer wavelengths. Metallic nanorods have a transverse Àmax1 and a longitudinal Àmax2. Dissimilar metal alloys typically exhibit absorption peaks in a range intermediate between the absorption peaks of the comprising metals. For example, nanostructures comprising a 50/50 alloy of gold and silver exhibit an Àmax of around 470 nm with increasing amounts of gold causing a shift in the absorption peak at longer wavelengths. The sensitivity of LSPR signals to changes in the local media refractive index can be modified by changing the shape or geometry of the nanostructures. For example, non-spherical particles (eg nanoprisms, nanorods, nanoshells, etc.) have increased LSPR sensitivities as compared to spheres. In some embodiments, optical properties (eg, absorption/scattering at particular wavelengths) are tailored to a particular application by varying the size, shape, or composition of the metallic nanolayer deposited on the surface or the metallic nanostructures employed in the detection conjugates.

[059] A interação entre a luz incidente e a superfície de nanocamada metálica pode ser monitorada como luz refletida ou luz transmitida. A quantidade de luz incidente que é absorvida ou dispersada pode ser medida como um espectro de absorção em um modo de reflexão ou o espectro de absorção em um modo de transmissão. Em algumas modalidades, o sinal óptico medido a partir da nanocamada metálica pode ser uma reflexão óptica, um espectro de absorbância, um espectro de dispersão e/ou um espectro de emissão.[059] The interaction between the incident light and the metallic nanolayer surface can be monitored as reflected light or transmitted light. The amount of incident light that is absorbed or scattered can be measured as the absorption spectrum in a reflection mode or the absorption spectrum in a transmission mode. In some embodiments, the optical signal measured from the metallic nanolayer can be an optical reflection, an absorbance spectrum, a scattering spectrum, and/or an emission spectrum.

[060] O plasmon acoplado entre a nanocamada metálica e as nanoestruturas metálicas nos conjugados de detecção resultante da formação do complexo entre os parceiros de ligação, analito alvo e moléculas de captura, produz uma mudança do espectro de ressonância do plasmon de superfície localizado da nanocamada metálica. Por exemplo, tais mudanças podem incluir uma extinção óptica aumentada, uma reflexão óptica aumentada e/ou dispersão e/ou sinal aumentado. Em algumas modalidades, a mudança no sinal óptico indicativa da presença do analito alvo na amostra inclui um deslocamento, aumento ou diminuição na dispersão óptica ou uma combinação destas características. Em certas modalidades, a mudança no sinal óptico indicativa da presença do analito alvo na amostra é um deslocamento no comprimento de onda de pico espectral. Em uma modalidade, o deslocamento no comprimento de onda no pico espectral óptico pode ser um deslocamento no vermelho (por exemplo, um deslocamento para um comprimento de onda mais longo) dentro de uma janela espectral de 200 nm a 1200 nm. Em outra modalidade, o deslocamento no comprimento de onda no pico espectral óptico pode ser um deslocamento no azul (por exemplo, um deslocamento para um comprimento de onda mais curto) dentro de uma janela espectral de 200 nm a 1200 nm. As mudanças nos sinais ópticos podem ser medidas em um ponto de tempo particular seguindo um período de reação estabelecido. Adicionalmente ou alternativamente, mudanças no sinal óptico sobre o período de reação (por exemplo, determinações de taxa) podem ser medidas. Ambos tipos de medições podem ser utilizados para análises qualitativas ou quantitativas de um analito alvo.[060] The plasmon coupled between the metallic nanolayer and the metallic nanostructures in the detection conjugates resulting from the formation of the complex between the binding partners, target analyte and capture molecules, produces a change in the resonance spectrum of the localized surface plasmon of the metallic nanolayer. For example, such changes may include increased optical extinction, increased optical reflection and/or increased scattering and/or signal. In some embodiments, the change in optical signal indicative of the presence of the target analyte in the sample includes a shift, increase or decrease in optical dispersion, or a combination of these characteristics. In certain embodiments, the change in optical signal indicative of the presence of the target analyte in the sample is a shift in spectral peak wavelength. In one embodiment, the wavelength shift in the optical spectral peak may be a redshift (e.g., a longer wavelength shift) within a spectral window of 200 nm to 1200 nm. In another embodiment, the wavelength shift in the optical spectral peak may be a blue shift (e.g., a shift to a shorter wavelength) within a spectral window of 200 nm to 1200 nm. Changes in optical signals can be measured at a particular time point following an established reaction period. Additionally or alternatively, changes in the optical signal over the reaction period (eg rate determinations) can be measured. Both types of measurements can be used for qualitative or quantitative analysis of a target analyte.

[061] Vários meios para medir sinais ópticos em comprimentos de onda diferentes e espectro de extinção de aquisição, dispersão ou emissão são conhecidos na técnica. Quaisquer instrumentos espectrofotométricos ou fotométricos são adequados para uso nos métodos divulgados. Alguns exemplos não limitantes incluem leitores de placa, analisadores Cobas Fara e analisadores Piccolo xpress® e Vetscan (Abaxis, Inc., Union City, CA), leitores de fibra óptica (por exemplo, LightPathTM S4 (LamdaGen, Menlo Park, CA)), instrumentos SPR (por exemplo, Biacore instruments disponível pela GE Healthcare), analisadores de centrifugação da Olympus, Hitachi etc.[061] Various means for measuring optical signals at different wavelengths and acquisition, scattering or emission extinction spectrum are known in the art. Any spectrophotometric or photometric instruments are suitable for use in the disclosed methods. Some non-limiting examples include plate readers, Cobas Fara analyzers and Piccolo xpress® and Vetscan analyzers (Abaxis, Inc., Union City, CA), fiber optic readers (e.g., LightPathTM S4 (LamdaGen, Menlo Park, CA)), SPR instruments (e.g., Biacore instruments available from GE Healthcare), centrifugal analyzers from Olympus, Hitachi, etc.

[062] A presente invenção também inclui um complexo de ensaio compreendendo (i) um conjugado de detecção que compreende uma nanoestrutura de compósito metálico acoplada a um parceiro de ligação, (ii) um analito alvo, e (iii) um grânulo revestido com nanocamada metálica na qual uma molécula de captura está imobilizada, em que o parceiro de ligação no conjugado de detecção está ligado a um primeiro epítopo no analito alvo e a molécula de captura está ligada a um segundo epítopo no analito alvo, assim formando um complexo compreendendo o conjugado de detecção, o complexo de teste está contido dentro de uma cubeta adaptada para uso com um rotor de centrifugação. Em outra modalidade, o complexo de ensaio está contido dentro de uma câmara de reação em um rotor de centrifugação ou disco.[062] The present invention also includes an assay complex comprising (i) a detection conjugate comprising a metallic composite nanostructure coupled to a binding partner, (ii) a target analyte, and (iii) a bead coated with a metallic nanolayer on which a capture molecule is immobilized, wherein the binding partner in the detection conjugate is bound to a first epitope on the target analyte and the capture molecule is bound to a second epitope on the target analyte, thereby forming a complex comprising the detection conjugate, the test complex is contained within a cuvette adapted for use with a centrifuge rotor. In another embodiment, the assay complex is contained within a reaction chamber in a centrifuge rotor or disk.

[063] O parceiro de ligação e a molécula de captura no complexo de teste podem ser qualquer tipo de molécula descrita acima, incluindo haptenos e outras moléculas menores, drogas, hormônios, macromoléculas biológicas, tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, Fv, Fab, (Fab)2, cadeia simples, CDR etc.), antígenos, receptores, ligantes, polinucleotídeos, aptâmeros, polipeptídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, glicopeptídeos, lipoproteínas ou nucleoproteínas. Em uma modalidade, o parceiro de ligação é um anticorpo e a molécula de captura é um anticorpo diferente.[063] The binding partner and capture molecule in the test complex can be any type of molecule described above, including haptens and other smaller molecules, drugs, hormones, biological macromolecules such as antibodies or fragments thereof (for example, Fv, Fab, (Fab)2, single chain, CDR, etc.), antigens, receptors, ligands, polynucleotides, aptamers, polypeptides, polysaccharides, lipopolysaccharides, glycop peptides, lipoproteins or nucleoproteins. In one embodiment, the binding partner is an antibody and the capture molecule is a different antibody.

[064] A nanocamada metálica e nanoestruturas de compósito metálico são descritas em detalhes acima. Em uma modalidade, a nanocamada metálica revestindo o grânulo (por exemplo, grânulo de plástico ou vidro) é uma nanocamada de ouro. Em outra modalidade, a nanocamada metálica revestindo o grânulo é uma nanocamada de prata. O grânulo é preferencialmente menor do que 0,5 cm, mas maior do que 0,1 mm. Em certas modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico são nanoestruturas de prata revestidas de ouro. Em outras modalidades, as nanoestruturas de compósito metálico são nanoestruturas de cobre revestidas de ouro. Em ainda outras modalidades, as nanoestruturas metálicas compreendem ouro envernizado com prata, íons de cobre ou ambos destes íons.[064] The metallic nanolayer and metallic composite nanostructures are described in detail above. In one embodiment, the metallic nanolayer coating the bead (e.g., plastic or glass bead) is a gold nanolayer. In another embodiment, the metallic nanolayer coating the bead is a silver nanolayer. The granule is preferably smaller than 0.5 cm but larger than 0.1 mm. In certain embodiments, the metallic composite nanostructures are gold-coated silver nanostructures. In other embodiments, the metallic composite nanostructures are gold-coated copper nanostructures. In still other embodiments, the metallic nanostructures comprise gold lacquered with silver, copper ions, or both of these ions.

[065] Qualquer tipo de analito alvo pode ser detectado utilizando os métodos, dispositivos e complexos de teste da presente invenção, particularmente aqueles que são significativos para diagnósticos em doenças. Um analito alvo pode incluir, mas não está limitado a, uma proteína, uma enzima, um antígeno, um anticorpo, um peptídeo, um ácido nucleico (RNA, DNA, mRNA, miRNA), hormônio, glicoproteína, polissacarídeo, toxina, vírus, partícula de vírus, molécula de droga, hapteno ou químico. Em algumas modalidades, o analito alvo é um marcador ou antígeno associado com uma doença infecciosa em humanos e/ou animais. Em outras modalidades, o analito alvo é um marcador ou antígeno associado com um estado fisiológico particular ou condição patológica.[065] Any type of target analyte can be detected using the methods, devices and test complexes of the present invention, particularly those that are significant for diagnoses in diseases. A target analyte can include, but is not limited to, a protein, enzyme, antigen, antibody, peptide, nucleic acid (RNA, DNA, mRNA, miRNA), hormone, glycoprotein, polysaccharide, toxin, virus, virus particle, drug molecule, hapten, or chemical. In some embodiments, the target analyte is a marker or antigen associated with an infectious disease in humans and/or animals. In other embodiments, the target analyte is a marker or antigen associated with a particular physiological state or pathological condition.

[066] Em certas modalidades, o analito alvo é um antígeno patogênico ou anticorpo de um antígeno patogênico. Por exemplo, o antígeno patogênico pode ser um antígeno viral (por exemplo, vírus de leucemia felina, parvovírus canino, vírus de pé e boca, vírus influenza, vírus de hepatite a, b, c, vírus HIV, vírus do papiloma humano, vírus Epstein Barr, vírus da raiva, etc.), um antígeno bacteriano (por exemplo, Ehrlichia, Borrelia, Anaplasma, Anthrax, Salmonella, Bacillus, etc.), um antígeno de fungo ou antígeno parasítico (por exemplo, verme do coração canino, Giardia lamblia, Plasmodium falciparum, tripanossomíase africana, Trypanosoma brucei, etc.). Em outras modalidades, o analito alvo é um antígeno ou anticorpo relacionado a doença de um antígeno relacionado a doença. Antígenos relacionados a doença incluem, mas não estão limitados a, antígenos relacionados a câncer ou marcadores (por exemplo, PSA, AFP, CA125, CA15- 3, CA19-9, CEA, NY-ESO-1, MUC1, GM3, GD2, ERBB2, etc.), antígenos ou marcadores relacionados a doença cardiovascular (por exemplo, troponina, proteína C-reativa, peptídeo natriurético do cérebro, CKMB, proteína ligada a ácido graxo, etc.), antígenos ou marcadores relacionados a metabólicos (por exemplo, hormônio estimulante de tireoide, tiroxina, leptina, insulina), ou antígenos ou marcadores relacionados a doença autoimune (por exemplo, auto-anticorpos). Em certas modalidades, o analito alvo é um antígeno inflamatório ou marcador (por exemplo, proteína C-reativa, MRP14, MRP8, 25F9, etc.). Em outras modalidades, o analito alvo é um antígeno ou marcador relacionado a gravidez (por exemplo, um antígeno fetal, gonadotropina coriônica humana).[066] In certain embodiments, the target analyte is a pathogenic antigen or antibody to a pathogenic antigen. For example, the pathogenic antigen may be a viral antigen (e.g. feline leukemia virus, canine parvovirus, foot and mouth virus, influenza virus, hepatitis a, b, c virus, HIV virus, human papilloma virus, Epstein Barr virus, rabies virus, etc.), a bacterial antigen (e.g., Ehrlichia, Borrelia, Anaplasma, Anthrax, Salmonella, Bacillus, etc.), a fungal antigen, or parasitic genotype (eg, canine heartworm, Giardia lamblia, Plasmodium falciparum, African trypanosomiasis, Trypanosoma brucei, etc.). In other embodiments, the target analyte is a disease-related antigen or antibody to a disease-related antigen. Disease-related antigens include, but are not limited to, cancer-related antigens or markers (e.g., PSA, AFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CEA, NY-ESO-1, MUC1, GM3, GD2, ERBB2, etc.), cardiovascular disease-related antigens or markers (e.g., troponin, C-reactive protein, brain natriuretic peptide, CKMB, linked protein to fatty acid, etc.), metabolic-related antigens or markers (eg, thyroid-stimulating hormone, thyroxine, leptin, insulin), or autoimmune disease-related antigens or markers (eg, autoantibodies). In certain embodiments, the target analyte is an inflammatory antigen or marker (e.g., C-reactive protein, MRP14, MRP8, 25F9, etc.). In other embodiments, the target analyte is a pregnancy-related antigen or marker (eg, a fetal antigen, human chorionic gonadotropin).

[067] A presente invenção também fornece um método para preparar nanoestruturas metálicas compostas. Em uma modalidade, o método compreende preparar uma primeira solução compreendendo a mistura de um polímero de ácido cloroáurico, preparar uma segunda solução compreendendo nanoestruturas de prata ou cobre e incubar a primeira solução com a segunda solução por um período de tempo, em que a mistura resultante compreende nanoestruturas de prata revestidas de ouro ou nanoestruturas de cobre revestidas de ouro. A mistura resultante preferencialmente tem uma absorbância de pico de cerca de 515 nm a cerca de 670 nm, ou cerca de 520 nm a cerca de 560 nm. Em uma modalidade, a mistura resultante tem uma absorbância de pico de cerca de 530 nm.[067] The present invention also provides a method for preparing composite metal nanostructures. In one embodiment, the method comprises preparing a first solution comprising mixing a polymer of chloroauric acid, preparing a second solution comprising silver or copper nanostructures, and incubating the first solution with the second solution for a period of time, wherein the resulting mixture comprises gold-coated silver nanostructures or gold-coated copper nanostructures. The resulting mixture preferably has a peak absorbance of about 515 nm to about 670 nm, or about 520 nm to about 560 nm. In one embodiment, the resulting mixture has a peak absorbance of about 530 nm.

[068] O polímero utilizado no preparo da primeira solução pode ser qualquer um de polivinilpirrolidona, polivinil álcool, poliacrilato, polietileno glicol, polietilenoimina, ácido poliaspártico, ácido poliglutâmico, várias gomas, gelatina ou polímeros misturados compreendendo qualquer um dos expostos acima. Em uma modalidade particular, o polímero é polivinilpirrolidona. Tipos diferentes de nanoestruturas revestidas podem ser obtidos variando o peso molecular do polímero. Faixas de peso molecular adequadas do polímero incluem de cerca de 5.000 Daltons a cerca de 150.000 Daltons, cerca de 10.000 Daltons a cerca de 100.000 Daltons, de cerca de 20.000 Daltons a cerca de 80.000 Daltons. Em algumas modalidades, o polímero tem um peso molecular menor que do que 50.000 Daltons. Em outras modalidades, o polímero tem um peso molecular menor do que 20.000 Daltons. Em certas modalidades, o polímero tem um peso molecular de cerca de 10.000 Daltons.[068] The polymer used in preparing the first solution can be any of polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylate, polyethylene glycol, polyethyleneimine, polyaspartic acid, polyglutamic acid, various gums, gelatin or mixed polymers comprising any of the above. In a particular embodiment, the polymer is polyvinylpyrrolidone. Different types of coated nanostructures can be obtained by varying the molecular weight of the polymer. Suitable polymer molecular weight ranges include from about 5,000 Daltons to about 150,000 Daltons, from about 10,000 Daltons to about 100,000 Daltons, from about 20,000 Daltons to about 80,000 Daltons. In some embodiments, the polymer has a molecular weight of less than 50,000 Daltons. In other embodiments, the polymer has a molecular weight of less than 20,000 Daltons. In certain embodiments, the polymer has a molecular weight of about 10,000 Daltons.

[069] As características do revestimento de ouro podem ser controladas ajustando a proporção de concentração do polímero para ácido cloroáurico. Por exemplo, a proporção de concentração do polímero para ácido cloroáurico é de cerca de 100:1 a cerca de 1:100, de cerca de 2:1 a cerca de 5:1, ou de cerca de 1,5:1 a cerca de 8:1. Em algumas modalidades, a proporção de concentração do polímero para ácido cloroáurico é 1:1. Concentrações adequadas do polímero incluem, mas não estão limitadas a, cerca de 0,1 % a cerca de 20% em peso/úmido em água ou etanol. Concentrações adequadas de ácido cloroáurico incluem, mas não estão limitadas a, cerca de 0,001 M a cerca de 1,0 M, cerca de 0,010 M a cerca de 0,500 M e cerca de 0,050 M a cerca de 0,100 M.[069] The characteristics of the gold coating can be controlled by adjusting the concentration ratio of the polymer to chloroauric acid. For example, the concentration ratio of polymer to chloroauric acid is from about 100:1 to about 1:100, from about 2:1 to about 5:1, or from about 1.5:1 to about 8:1. In some embodiments, the concentration ratio of polymer to chloroauric acid is 1:1. Suitable polymer concentrations include, but are not limited to, about 0.1% to about 20% wt/wet in water or ethanol. Suitable concentrations of chloroauric acid include, but are not limited to, about 0.001M to about 1.0M, about 0.010M to about 0.500M, and about 0.050M to about 0.100M.

[070] A eficiência do revestimento e espessura podem também ser afetadas pelo pH e conteúdo de haleto da solução de revestimento (isto é, primeira solução). Em certas modalidades, o pH da solução é mantido em uma faixa de cerca de 3 a cerca de 14. O conteúdo de haleto da solução é, em algumas modalidades, menor do que 150 mM. Em outras modalidades, o conteúdo de haleto da solução está na faixa de cerca de 0 a cerca de 50 mM.[070] Coating efficiency and thickness can also be affected by the pH and halide content of the coating solution (ie, first solution). In certain embodiments, the pH of the solution is maintained in a range of about 3 to about 14. The halide content of the solution is, in some embodiments, less than 150 mM. In other embodiments, the halide content of the solution is in the range of about 0 to about 50 mM.

[071] Métodos de preparar soluções de nanoestruturas de prata e cobre são conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, a segunda solução compreendendo as nanoestruturas de prata ou cobre pode ser preparada por qualquer um dos métodos descritos na Publicação de Patente US 2012/0101007, Publicação de Patente US 2014/0105982 ou Publicação de Patente US 2013/0230717, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a segunda solução compreendendo nanoestruturas de prata ou cobre é preparada misturando uma fonte de prata ou cobre com um agente redutor. Uma fonte de prata adequada inclui um sal de prata, tal como nitrato de prata. Fontes de cobre adequadas incluem sulfato de cobre (II), cloreto de cobre (II), hidróxido de cobre (II) e nitrato de cobre (II), acetato de cobre (II) e trifluoracetato de cobre (II). Agentes redutores que podem ser reagidos com fontes de prata ou cobre para formar as nanoestruturas podem incluir glicose, ácido ascórbico, borohidreto de sódio e soluções alcalinas (por exemplo, pH maior do que 7,5) de polímeros tais como PVP. Em certas modalidades, o agente redutor é ácido ascórbico. A forma desejada e pico espectral óptico das nanoestruturas de prata ou nanoestruturas de cobre podem ser atingidos ajustando as proporções ou concentrações dos reagentes como conhecido por um especialista na técnica. Por modo de exemplo apenas, altas concentrações do agente redutor podem resultar em nanoestruturas de forma pentagonal ou bipiramidal, enquanto baixas concentrações do agente redutor podem resultar em nanofios ou tubos alongados. Dependendo das formas particulares das nanoestruturas, a segunda solução compreendendo as nanoestruturas de prata ou cobre pode ter um pico de absorbância de cerca de 550 nm a cerca de 1000 nm, de cerca de 600 nm a cerca de 700 nm, de cerca de 630 nm a cerca de 680 nm, de cerca de 750 nm a cerca de 850 nm, de cerca de 900 nm a cerca de 940 nm, de cerca de 580 nm a cerca de 620 nm, ou de cerca de 550 nm a cerca de 750 nm. Em certas modalidades, a segunda solução compreendendo nanoestruturas de prata tem um pico de absorbância de cerca de 600 nm (isto é, 595 nm a 605 nm, inclusivo). Em algumas modalidades, a segunda solução compreendendo nanoestruturas de cobre tem um pico de absorbância de cerca de 585 nm (isto é, 580 nm a 590 nm, inclusivo). Em algumas modalidades, o pico de absorbância de uma solução compreendendo nanoestruturas de cobre é maior (isto é, deslocado para vermelho) do que o pico de absorbância de uma solução compreendendo nanoestruturas de prata de um tamanho e forma similares.[071] Methods of preparing solutions of silver and copper nanostructures are known to those skilled in the art. For example, the second solution comprising the silver or copper nanostructures can be prepared by any of the methods described in US Patent Publication 2012/0101007, US Patent Publication 2014/0105982 or US Patent Publication 2013/0230717, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. In one embodiment, the second solution comprising silver or copper nanostructures is prepared by mixing a silver or copper source with a reducing agent. A suitable silver source includes a silver salt such as silver nitrate. Suitable copper sources include copper(II) sulfate, copper(II) chloride, copper(II) hydroxide and copper(II) nitrate, copper(II) acetate and copper(II) trifluoroacetate. Reducing agents that can be reacted with silver or copper sources to form the nanostructures can include glucose, ascorbic acid, sodium borohydride and alkaline solutions (eg, pH greater than 7.5) of polymers such as PVP. In certain embodiments, the reducing agent is ascorbic acid. The desired shape and optical spectral peak of the silver nanostructures or copper nanostructures can be achieved by adjusting the proportions or concentrations of the reagents as known to one skilled in the art. By way of example only, high concentrations of the reducing agent can result in pentagonal or bipyramidal shaped nanostructures, while low concentrations of the reducing agent can result in nanowires or elongated tubes. Depending on the particular shapes of the nanostructures, the second solution comprising the silver or copper nanostructures can have a peak absorbance from about 550 nm to about 1000 nm, from about 600 nm to about 700 nm, from about 630 nm to about 680 nm, from about 750 nm to about 850 nm, from about 900 nm to about 940 nm nm, from about 580 nm to about 620 nm, or from about 550 nm to about 750 nm. In certain embodiments, the second solution comprising silver nanostructures has an absorbance peak of about 600 nm (ie, 595 nm to 605 nm, inclusive). In some embodiments, the second solution comprising copper nanostructures has an absorbance peak of about 585 nm (ie, 580 nm to 590 nm, inclusive). In some embodiments, the absorbance peak of a solution comprising copper nanostructures is greater (ie, red-shifted) than the absorbance peak of a solution comprising silver nanostructures of a similar size and shape.

[072] Em algumas modalidades, o período de incubação da primeira solução com a segunda solução é pelo menos 12 horas. Em outras modalidades, o período de incubação da primeira solução com a segunda solução é maior do que 24 horas, preferencialmente maior do que 48 horas, mais preferencialmente pelo menos 72 horas. Mudanças no pico de absorbância da mistura de reação podem ser monitoradas durante o período de incubação para ajustar o tempo de incubação, por conseguinte. Por exemplo, deslocamentos do pico de absorbância para comprimentos de onda menores, por exemplo, na região de 520 nm a 550 nm, podem indicar que as nanoestruturas revestidas de ouro foram estabilizadas. Em certas modalidades, a estabilidade das nanoestruturas resultantes de cloreto de sódio (por exemplo, 0,25-1M) é utilizada para indicar um revestimento adequado das nanoestruturas.[072] In some embodiments, the incubation period of the first solution with the second solution is at least 12 hours. In other embodiments, the period of incubation of the first solution with the second solution is greater than 24 hours, preferably greater than 48 hours, more preferably at least 72 hours. Changes in peak absorbance of the reaction mixture can be monitored during the incubation period to adjust the incubation time accordingly. For example, shifts of the absorbance peak to shorter wavelengths, for example, in the region from 520 nm to 550 nm, may indicate that the gold-coated nanostructures have stabilized. In certain embodiments, the stability of the nanostructures resulting from sodium chloride (eg, 0.25-1M) is used to indicate adequate coating of the nanostructures.

[073] Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de sintetizar nanoestruturas tendo densidades ópticas maiores do que cerca de 50/mL. Em uma modalidade, os métodos compreendem misturar um polímero como descrito aqui com ácido cloroáurico, agitar a mistura em uma temperatura estabelecida por um primeiro período de tempo, adicionar ácido ascórbico na mistura e incubar a mistura por um segundo período de tempo. O tamanho e a forma das nanoestruturas são ditados pela proporção de concentração do polímero para ácido cloroáurico e a temperatura e o tempo de incubação. As concentrações do polímero e ácido cloroáurico podem ser nas faixas descritas acima. A temperatura pode ser ajustada baseada no tamanho e forma das nanoestruturas desejadas, mas pode ser na faixa de cerca de 4°C a cerca de 100°C. Similarmente, o período de incubação (isto é, primeiro período de tempo) pode ser ajustado baseado nas propriedades desejadas das nanoestruturas, mas pode variar de cerca de 15 minutos a um dia.[073] In certain embodiments, the present invention provides methods of synthesizing nanostructures having optical densities greater than about 50/mL. In one embodiment, the methods comprise mixing a polymer as described herein with chloroauric acid, stirring the mixture at a set temperature for a first period of time, adding ascorbic acid to the mixture, and incubating the mixture for a second period of time. The size and shape of the nanostructures are dictated by the concentration ratio of the polymer to chloroauric acid and the temperature and time of incubation. The polymer and chloroauric acid concentrations can be in the ranges described above. The temperature can be adjusted based on the size and shape of the desired nanostructures, but can be in the range of about 4°C to about 100°C. Similarly, the incubation period (i.e., first time period) can be adjusted based on the desired properties of the nanostructures, but can range from about 15 minutes to a day.

[074] Em algumas modalidades, cerca de 0,1 a 1 parte de ácido ascórbico (por exemplo, cerca de 1 a 5 M) é adicionado na mistura após o primeiro período de incubação. O segundo período de incubação após a adição do ácido ascórbico pode ser de cerca de 1 a cerca de 24 horas. Sem estar ligado por teoria, a adição de ácido ascórbico fornece um aumento substancial na quantidade de nanoestruturas produzidas.[074] In some embodiments, about 0.1 to 1 part of ascorbic acid (for example, about 1 to 5 M) is added to the mixture after the first incubation period. The second incubation period after adding the ascorbic acid can be from about 1 to about 24 hours. Without being bound by theory, the addition of ascorbic acid provides a substantial increase in the amount of nanostructures produced.

[075] Em certas modalidades, os métodos ainda compreendem adicionar ou dopar a mistura com cerca de 1 a cerca de 100 partes de cloreto de ouro (por exemplo, cerca de 0,001 M a 1M) ou nitrato de prata (por exemplo, cerca de 0,001 M a 1M) ou outro metal (por exemplo, metal nobre, metal de transição, metal alcalino ou lantanídeo). Esta etapa de dopagem pode ainda aumentar a intensidade da ressonância das nanoestruturas resultantes. Em algumas modalidades, o cloreto de ouro, nitrato de prata ou outro metal é adicionado na mistura antes do ácido ascórbico ser adicionado na reação. Em outras modalidades, o cloreto de ouro, nitrato de prata ou outro metal é adicionado na mistura após a adição do ácido ascórbico. A ordem de adição do metal e ácido ascórbico pode ser ajustada para adaptar as nanoestruturas resultantes para uma forma e tamanho desejados.[075] In certain embodiments, the methods further comprise adding or doping the mixture with about 1 to about 100 parts of gold chloride (for example, about 0.001 M to 1M) or silver nitrate (for example, about 0.001 M to 1M) or another metal (for example, noble metal, transition metal, alkali metal or lanthanide). This doping step can even increase the resonance intensity of the resulting nanostructures. In some embodiments, the gold chloride, silver nitrate or other metal is added to the mixture before the ascorbic acid is added in the reaction. In other embodiments, the gold chloride, silver nitrate or other metal is added to the mixture after the addition of the ascorbic acid. The order of addition of the metal and ascorbic acid can be adjusted to adapt the resulting nanostructures to a desired shape and size.

[076] Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos adicionais que não devem ser interpretados como limitantes. Os especialistas na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.[076] This invention is further illustrated by the following additional examples which should not be construed as limiting. Those skilled in the art should, in light of the present disclosure, appreciate that many changes can be made in the specific embodiments that are disclosed and still obtain the same or similar result without departing from the spirit and scope of the invention.

[077] Todos os documentos de patente e não patente referenciados ao longo desta divulgação estão incorporados por referência aqui em suas totalidades para todos os propósitos.[077] All patent and non-patent documents referenced throughout this disclosure are incorporated by reference herein in their entirety for all purposes.

EXEMPLOSEXAMPLES Exemplo 1. Amplificação dos sinais LSPR com Analito Conjugado a Nanopartícula de OuroExample 1. Amplification of LSPR signals with Analyte Conjugated to Gold Nanoparticle

[078] Um sistema de detecção de analito foi preparado fornecendo um chip plástico no qual foi depositado um filme de nanocamada de ouro. Proteínas IgG humanas (100 μg/ml) foram imobilizadas no filme de nanocamada de ouro para criar a superfície do sensor. Um sensor controle foi construído imobilizando albumina de soro bovino no filme de nanocamada de ouro. Os dois tipos de superfícies de sensor foram posicionados dentro de um instrumento equipado com fibras emitindo luz e coletando luz que reflete luz na superfície de nanocamada de ouro e coleta a luz refletida de volta da superfície.[078] An analyte detection system was prepared providing a plastic chip on which a gold nanolayer film was deposited. Human IgG proteins (100 μg/ml) were immobilized on the gold nanolayer film to create the sensor surface. A control sensor was constructed by immobilizing bovine serum albumin on a gold nanolayer film. The two types of sensor surfaces were positioned inside an instrument equipped with light-emitting and light-collecting fibers that reflect light off the gold nanolayer surface and collect light reflected back from the surface.

[079] Uma amostra contendo proteína A livre (10 μg/ml) foi colocada em contato com os dois tipos de sensores de superfície e as mudanças no espectro de refletância foram medidas. Como mostrado na Figura 1, a introdução da proteína A livre no sensor contendo IgG humano imobilizado não produziu uma mudança visível significativa no espectro de refletância do filme de nanocamada de ouro como medido por um deslocamento no comprimento de onda de pico.[079] A sample containing free protein A (10 μg/ml) was placed in contact with both types of surface sensors and changes in the reflectance spectrum were measured. As shown in Figure 1, introduction of free protein A into the sensor containing immobilized human IgG did not produce a significant visible change in the reflectance spectrum of the gold nanolayer film as measured by a peak wavelength shift.

[080] As superfícies do sensor foram regeneradas pelo tratamento com ácido clorídrico 1 mM e amostra contendo a proteína A conjugada a nanopartículas de ouro coloidal (CGC) em duas concentrações diferentes (3,5 μg/ml e 0,175 μg/ml) foram colocadas em contato com as superfícies do sensor. A mudança no espectro de refletância da superfície de nanocamada de ouro foi acentuada quando a proteína A (isto é, analito alvo) foi conjugada a nanopartículas de ouro coloidal. Especificamente, 3,5 μg/ml de proteína A-CGC produziu um deslocamento maior no comprimento de onda de pico do que 10 μg/ml de proteína A não marcada. Veja Figura 1, sensor 2. A amplificação do sinal de ressonância de plasmon foi suficientemente grande para permitir a detecção de concentrações em nanograma da proteína A-CGC. Veja Figura 1, sensor 3. As mudanças no espectro de refletância do sensor BSA representam ligação não específica das moléculas de proteína A à superfície do sensor e são significativamente menores do que as mudanças induzidas por ligação específica das moléculas de proteína A nas moléculas de IgG imobilizadas.[080] The sensor surfaces were regenerated by treatment with 1 mM hydrochloric acid and a sample containing protein A conjugated to colloidal gold nanoparticles (CGC) at two different concentrations (3.5 μg/ml and 0.175 μg/ml) were placed in contact with the sensor surfaces. The change in reflectance spectrum of the gold nanolayer surface was accentuated when protein A (ie target analyte) was conjugated to colloidal gold nanoparticles. Specifically, 3.5 µg/ml protein A-CGC produced a greater peak wavelength shift than 10 µg/ml unlabeled protein A. See Figure 1, sensor 2. The amplification of the plasmon resonance signal was large enough to allow detection of nanogram concentrations of the A-CGC protein. See Figure 1, sensor 3. Changes in the reflectance spectrum of the BSA sensor represent non-specific binding of protein A molecules to the sensor surface and are significantly smaller than changes induced by specific binding of protein A molecules to immobilized IgG molecules.

[081] Os resultados deste experimento inicial mostram que amplificação considerável das mudanças nos sinais de ressonância de plasmon de superfície localizados induzidos por eventos de ligação em uma superfície de nanocamada metálica podem ser alcançadas acoplando o analito alvo em nanopartículas de ouro coloidal. Aproximadamente uma melhora de 60 vezes na sensibilidade é observada com quantidades em nanograma do analito sendo detectadas.[081] The results of this initial experiment show that considerable amplification of changes in localized surface plasmon resonance signals induced by binding events on a metallic nanolayer surface can be achieved by coupling the target analyte to colloidal gold nanoparticles. Approximately a 60-fold improvement in sensitivity is seen with nanogram amounts of the analyte being detected.

Exemplo 2. Amplificação dos sinais LSPR em um Ensaio de SanduícheExample 2. Amplification of LSPR Signals in a Sandwich Test

[082] Este exemplo descreve uma série de experimentos desenvolvidos para avaliar se a amplificação dos sinais de ressonância de plasmon localizado na superfície com conjugados de nanopartícula de ouro poderia ser alcançada em um formato de ensaio de sanduíche em que o analito alvo não é diretamente conjugado às nanopartículas de ouro. Uma superfície de chip de nanocamada de ouro foi preparada como descrito no Exemplo 1. O anticorpo C7 contra a proteína reativa C (CRP) (100 μg/ml) foi imobilizado no filme de nanocamada de ouro depositado na superfície da fatia para criar o sensor anti-CRP. O anticorpo C6, que reconhece um epítopo distinto não sobreposto de CRP do que o anticorpo C7, foi conjugado em nanopartículas de ouro coloidal (C6- CGC) para alguns experimentos ou utilizado em uma forma não marcada para outros experimentos.[082] This example describes a series of experiments designed to assess whether amplification of surface-located plasmon resonance signals with gold nanoparticle conjugates could be achieved in a sandwich assay format where the target analyte is not directly conjugated to gold nanoparticles. A gold nanolayer chip surface was prepared as described in Example 1. C7 antibody against C-reactive protein (CRP) (100 µg/ml) was immobilized on the gold nanolayer film deposited on the surface of the slice to create the anti-CRP sensor. The C6 antibody, which recognizes a distinct non-overlapping epitope of CRP than the C7 antibody, was conjugated to colloidal gold nanoparticles (C6-CGC) for some experiments or used in an unlabelled form for other experiments.

[083] Em uma primeira série de experimentos, uma amostra contendo uma de três concentrações diferentes de CRP (1 ng/ml, 10 ng/ml ou 100 ng/ml) foi incubada com o sensor anti-CRP por 15 a 20 minutos e mudanças no espectro de refletância da nanocamada de ouro foram monitoradas. Como mostrado na Figura 2, um deslocamento de pico mínimo foi observado com a ligação do CRP ao anticorpo C7 anti-CRP na superfície do sensor. A exposição subsequente da superfície do sensor ao anticorpo C6 anti-CRP não marcado (1 μg/ml) não resultou em outros deslocamentos de pico. Veja Figura 2. Similarmente, a exposição subsequente da superfície do sensor em 3 μg/ml de C6-CGC não produziu quaisquer outras mudanças no espectro de refletância, indicando que as moléculas CRP ligadas foram similarmente saturadas com anticorpo C6 não marcado. Veja Figura 2.[083] In a first series of experiments, a sample containing one of three different concentrations of CRP (1 ng/ml, 10 ng/ml or 100 ng/ml) was incubated with the anti-CRP sensor for 15 to 20 minutes and changes in the reflectance spectrum of the gold nanolayer were monitored. As shown in Figure 2, a minimal peak shift was observed with CRP binding to C7 anti-CRP antibody on the sensor surface. Subsequent exposure of the sensor surface to unlabeled C6 anti-CRP antibody (1 µg/ml) did not result in further peak shifts. See Figure 2. Similarly, subsequent exposure of the sensor surface to 3 µg/ml of C6-CGC did not produce any further changes in the reflectance spectrum, indicating that bound CRP molecules were similarly saturated with unlabeled C6 antibody. See Figure 2.

[084] Em uma segunda série de experimentos, uma amostra contendo uma de três concentrações diferentes de CRP (1 ng/ml, 10 ng/ml ou 100 ng/ml) foi incubada com o sensor anti-CRP por 15 a 20 minutos. Duas concentrações diferentes de C6-CGC (1 μg/ml e 3 μg/ml) foram subsequentemente introduzidas e mudanças no espectro de refletância foram medidas (Figuras 3 e 4A). Os resultados mostram que a conjugação do anticorpo C6 anti-CRP a nanopartículas de ouro amplifica o deslocamento no comprimento de onda de pico como comparado ao anticorpo C6 não marcado. Concentrações aumentadas de C6-CGC produzem um deslocamento dependente de dose no comprimento de onda de pico. Entretanto, a diferença de sinal entre 1 ng/ml e 10 ng/ml foi pequena (Figura 4B).[084] In a second series of experiments, a sample containing one of three different concentrations of CRP (1 ng/ml, 10 ng/ml or 100 ng/ml) was incubated with the anti-CRP sensor for 15 to 20 minutes. Two different concentrations of C6-CGC (1 μg/ml and 3 μg/ml) were subsequently introduced and changes in the reflectance spectrum were measured (Figures 3 and 4A). The results show that conjugation of C6 anti-CRP antibody to gold nanoparticles amplifies the peak wavelength shift as compared to unlabeled C6 antibody. Increased concentrations of C6-CGC produce a dose-dependent shift in peak wavelength. However, the signal difference between 1 ng/ml and 10 ng/ml was small (Figure 4B).

[085] Em uma terceira série de experimentos, o efeito do tempo de incubação do analito no desenvolvimento de sinal foi avaliado. O sensor anti-CRP foi colocado em contato com uma amostra contendo 0 ng/ml, 10 ng/ml ou 100 ng/ml CRP e 3 μg/ml de C6-CGC foi imediatamente introduzido sem qualquer tempo de incubação do analito ou uma lavagem. Como mostrado nas Figuras 5 e 6, tempo de incubação de analito mais curto resulta em deslocamentos de comprimento de onda de pico menores.[085] In a third series of experiments, the effect of analyte incubation time on signal development was evaluated. The anti-CRP sensor was contacted with a sample containing 0 ng/ml, 10 ng/ml or 100 ng/ml CRP and 3 μg/ml of C6-CGC was immediately introduced without any analyte incubation time or a wash. As shown in Figures 5 and 6, shorter analyte incubation time results in smaller peak wavelength shifts.

[086] Os resultados destas três configurações dos experimentos mostram que a amplificação de sinais LSPR pode ser alcançada com conjugados de nanopartículas de ouro em um formato de ensaio de sanduíche. Um deslocamento de sinal melhorado é observado quando o anticorpo detector é marcado com partículas de ouro coloidal como comparado ao anticorpo não marcado, assim permitindo a detecção de concentrações em nanograma do analito.[086] The results of these three experiment setups show that amplification of LSPR signals can be achieved with gold nanoparticle conjugates in a sandwich assay format. Improved signal displacement is observed when the detector antibody is labeled with colloidal gold particles as compared to unlabeled antibody, thus allowing detection of nanogram concentrations of the analyte.

Exemplo 3. Amplificação de Sinal Melhorada com Nanoestruturas de Prata Revestidas com OuroExample 3. Improved Signal Amplification with Gold Coated Silver Nanostructures

[087] Para avaliar se a variação do tipo de metal utilizado para classificar os parceiros de ligação afetou a amplificação dos sinais LSPR, nanoestruturas de metal compostas foram preparadas. Especificamente, nanoestruturas de prata revestidas de ouro foram preparadas como segue. Nanoestruturas de prata foram preparadas adicionado 50,0 mL de H2O deionizada, 500,0 μL de Citrato Trisódico (75mM), 200 μL de AgNO3 (200mM) e 500,0 μL de H2O2 (27%) enquanto agitando vigorosamente em temperatura ambiente. Uma alíquota de 500μL de NaBH4 (200mM) foi então injetada rapidamente na solução aquosa causando uma mudança de cor para amarelo claro. Por um período de vários minutos a cor continuou a mudar de amarelo escuro para vermelho para roxo e finalmente estabilizando em azul. O espectro UV/Vis determinou o pico de absorbância da solução estando em 604,5 nm.[087] To assess whether varying the type of metal used to classify binding partners affected the amplification of LSPR signals, composite metal nanostructures were prepared. Specifically, gold-coated silver nanostructures were prepared as follows. Silver nanostructures were prepared by adding 50.0 mL of deionized H2O, 500.0 μL of Trisodium Citrate (75mM), 200 μL of AgNO3 (200mM) and 500.0 μL of H2O2 (27%) while stirring vigorously at room temperature. A 500μL aliquot of NaBH4 (200mM) was then rapidly injected into the aqueous solution causing a color change to light yellow. Over a period of several minutes the color continued to change from dark yellow to red to purple and finally stabilizing to blue. The UV/Vis spectrum determined the peak absorbance of the solution to be at 604.5 nm.

[088] Um revestimento de ouro foi adicionado nas nanoestruturas de prata adicionado 5,0 mL de solução azul na mistura de 50 μL de Polivinilpirrolidona (PVP MW « 10.000 20% em etanol) e 50 μL de HAuCl4 (20mM). Após 72 horas de tempo de incubação, a amostra se tornou uma cor vermelho escuro e tinha um pico de absorbância em 534,5 nm. As nanopartículas foram lavadas duas vezes por centrifugação a 20.000 rpm por 20 minutos e ressuspensas em 2,0 mL de H2O deionizada. A solução tinha uma cor vermelho escuro, pico de absorção em 530,3 nm e uma absorbância total de 15,0 unidades OD.[088] A gold coating was added to the silver nanostructures by adding 5.0 mL of blue solution to the mixture of 50 μL of Polyvinylpyrrolidone (PVP MW « 10,000 20% in ethanol) and 50 μL of HAuCl4 (20mM). After 72 hours of incubation time, the sample turned a dark red color and had an absorbance peak at 534.5 nm. The nanoparticles were washed twice by centrifugation at 20,000 rpm for 20 minutes and resuspended in 2.0 mL of deionized H2O. The solution had a deep red color, peak absorption at 530.3 nm, and a total absorbance of 15.0 OD units.

[089] A conjugação de nanoestruturas de prata revestidas de ouro (Au@AgNPs) ao anticorpo C6 anti-CRP foi realizada adicionando 600,0 μL de Au@AgNPs e 20,0 μL de anticorpo C6 anti-CRP (8,0 mg/mL) em 880,0 μL de H2O deionizada gerando a concentração de anticorpo final de 17,8 μg/mL/OD. Após um período de incubação de 2 horas a 4°C, a amostra foi centrifugada em 30.000g por 20 minutos e ressuspensa em 1,5 mL de uma solução de bloqueio contendo BSA (10 mg/mL) em PBS. Os Au@AgNPs conjugados ao anticorpo anti-CRP C6 foram armazenados a 4°C até o uso.[089] The conjugation of gold-coated silver nanostructures (Au@AgNPs) to the C6 anti-CRP antibody was performed by adding 600.0 μL of Au@AgNPs and 20.0 μL of C6 anti-CRP antibody (8.0 mg/mL) in 880.0 μL of deionized H2O generating the final antibody concentration of 17.8 μg/mL/OD. After an incubation period of 2 hours at 4°C, the sample was centrifuged at 30,000g for 20 minutes and resuspended in 1.5 ml of a blocking solution containing BSA (10 mg/ml) in PBS. Au@AgNPs conjugated to anti-CRP C6 antibody were stored at 4°C until use.

[090] O sensor de nanocamada de ouro anti-CRP foi preparado como descrito no Exemplo 2 e teve um pico de absorção em 530nm. Um sensor controle contendo a nanocamada de ouro sem qualquer anticorpo imobilizado também foi preparado. Os sensores foram equilibrados com 100 μL de PBS.[090] The anti-CRP gold nanolayer sensor was prepared as described in Example 2 and had an absorption peak at 530nm. A control sensor containing the gold nanolayer without any immobilized antibody was also prepared. Sensors were equilibrated with 100 µL of PBS.

[091] 100 μL de anticorpos C6 anti-CRP conjugados a Au@AgNPs diluído para 1,5 OD em PBS foram pré-misturados por 1 minuto com 1, 10 ou 500 pg/mL de antígeno CRP. A mistura foi então colocada em contato com o anti-CRP ou superfície de sensor controle e mudanças no espectro de refletância da superfície de nanocamada de ouro foram medidas. Os resultados mostram que as nanoestruturas de prata revestidas de ouro melhoraram o deslocamento no comprimento de onda de pico induzido pela ligação do complexo CRP-anticorpo à superfície do sensor (Figura 7). A detecção de 1 pg/mL do antígeno CRP foi possível com as nanoestruturas de prata revestidas de ouro, que é uma melhora de 1000 vezes na sensibilidade como comparado àquela obtida com nanopartículas de ouro. Em concentrações maiores de antígeno, os sítios de ligação são saturados e nenhum outro deslocamento ocorre.[091] 100 μL of C6 anti-CRP antibodies conjugated to Au@AgNPs diluted to 1.5 OD in PBS were premixed for 1 minute with 1, 10 or 500 pg/mL of CRP antigen. The mixture was then placed in contact with the anti-CRP or control sensor surface and changes in the reflectance spectrum of the gold nanolayer surface were measured. The results show that the gold-coated silver nanostructures improved the peak wavelength shift induced by the binding of the CRP-antibody complex to the sensor surface (Figure 7). Detection of 1 pg/ml of CRP antigen was possible with the gold-coated silver nanostructures, which is a 1000-fold improvement in sensitivity as compared to that obtained with gold nanoparticles. At higher concentrations of antigen, the binding sites are saturated and no further displacement occurs.

[092] Os resultados deste experimento demonstram a amplificação significativamente melhorada dos sinais LSPR de uma superfície de nanocamada metálica alcançada quando nanoestruturas de compósitos, tais como nanoestruturas de prata revestidas de ouro, são utilizadas para marcar parceiros de ligação ao analito.[092] The results of this experiment demonstrate the significantly improved amplification of LSPR signals from a metallic nanolayer surface achieved when composite nanostructures, such as gold-coated silver nanostructures, are used to tag analyte binding partners.

Exemplo 4. Síntese de Nanoestruturas de Densidade Óptica AltaExample 4. Synthesis of High Optical Density Nanostructures

[093] Nanopartículas de ouro foram preparadas misturando os seguintes reagentes em um volume final de 1 ml na ordem indicada: 0,1 ml de PVP-10 1% (1% p/p), 0,2 ml de cloreto de ouro 0,1M, 0,1 ml de NaOH 5N, 0,4 ml de água e 0,2 ml de ácido ascórbico 1M. A mistura de reação foi misturada após cada adição. As medições de espectroscopia indicam que a reação foi principalmente concluída após 24 horas em temperatura ambiente. Este protocolo gerou nanopartículas de ouro esféricas exibindo pico LSPR em torno de 535 nm e a densidade óptica correspondente a cerca de 80 por ml. A disposição de camadas com ouro ou prata adicional foi feita adicionando nitrato de prata ou cloreto de ouro nas nanopartículas de ouro pré-formadas. Excessos de reagentes foram removidos por centrifugação em 30.000 g por 1-2 horas.[093] Gold nanoparticles were prepared by mixing the following reagents in a final volume of 1 ml in the order indicated: 0.1 ml of 1% PVP-10 (1% w/w), 0.2 ml of 0.1M gold chloride, 0.1 ml of 5N NaOH, 0.4 ml of water and 0.2 ml of 1M ascorbic acid. The reaction mixture was mixed after each addition. Spectroscopy measurements indicate that the reaction was mostly complete after 24 hours at room temperature. This protocol generated spherical gold nanoparticles exhibiting LSPR peak around 535 nm and the corresponding optical density around 80 per ml. Layering with additional gold or silver was done by adding silver nitrate or gold chloride onto preformed gold nanoparticles. Excess reagents were removed by centrifugation at 30,000g for 1-2 hours.

[094] Em uma reação separada, 0,05 ml de PVP 20% (p/p) foi misturado com 0,25 ml de água, 0,1 ml de NaOH 5N, 0,1 ml de citrato de sódio 1 M, 0,5 ml de cloreto de ouro 0,1M e 1 ml de ácido ascórbico 1M. Este protocolo resultou em uma formação imediata de partículas de ouro coloidal em uma OD de cerca de 90/ml com pico LSPR em ~525 nm. Uma correspondência linear foi observada quando a OD final e a concentração do ouro entre 2,5 mM e 25 mM na mistura de reação final.[094] In a separate reaction, 0.05 ml of PVP 20% (w/w) was mixed with 0.25 ml of water, 0.1 ml of 5N NaOH, 0.1 ml of 1M sodium citrate, 0.5 ml of 0.1M gold chloride and 1 ml of 1M ascorbic acid. This protocol resulted in immediate formation of colloidal gold particles at an OD of about 90/ml with LSPR peak at ~525 nm. A linear correspondence was observed when the final OD and gold concentration between 2.5 mM and 25 mM in the final reaction mixture.

[095] É entendido que a invenção divulgada não é limitada à metodologia particular, protocolos e materiais descritos, uma vea que estes podem variar. É também entendido que a terminologia utilizada aqui é para os propósitos de descrever modalidades particulares apenas e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção, que será limitada apenas pelas reivindicações em anexo.[095] It is understood that the disclosed invention is not limited to the particular methodology, protocols and materials described, as these may vary. It is also understood that the terminology used herein is for the purposes of describing particular embodiments only and is not intended to limit the scope of the present invention, which will be limited only by the appended claims.

[096] Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção descrita aqui. Tais equivalente são destinados a serem englobados pelas seguintes reivindicações.[096] Those skilled in the art will recognize, or will be able to verify, using no more than routine experimentation, many equivalents of the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims.

Claims (31)

1. Dispositivo de detecção de analito, caracterizado pelo fato de que compreende: uma pluralidade de conjugados de detecção, em que os conjugados compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas a parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente a um analito alvo; em que as nanoestruturas de compósito metálico compreendem um núcleo de prata e um revestimento de ouro; uma superfície contendo uma nanocamada metálica; e uma pluralidade de moléculas de captura, em que as moléculas de captura são imobilizadas na nanocamada metálica e são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo.1. Analyte detection device, characterized in that it comprises: a plurality of detection conjugates, wherein the conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to binding partners that are capable of specifically binding to a target analyte; wherein the metallic composite nanostructures comprise a silver core and a gold coating; a surface containing a metallic nanolayer; and a plurality of capture molecules, wherein the capture molecules are immobilized on the metallic nanolayer and are capable of specifically binding to the target analyte. 2. Dispositivo de detecção de analito, caracterizado pelo fato de que compreende: uma pluralidade de conjugados de detecção, em que os conjugados compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas aos analitos alvo; em que as nanoestruturas de compósito metálico compreendem um núcleo de prata e um revestimento de ouro; uma superfície contendo uma nanocamada metálica; e uma pluralidade de moléculas de captura, em que as moléculas de captura são imobilizadas na nanocamada metálica e são capazes de se ligar especificamente aos analitos alvo.2. Analyte detection device, characterized in that it comprises: a plurality of detection conjugates, wherein the conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to the target analytes; wherein the metallic composite nanostructures comprise a silver core and a gold coating; a surface containing a metallic nanolayer; and a plurality of capture molecules, wherein the capture molecules are immobilized on the metal nanolayer and are capable of specifically binding to target analytes. 3. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas de compósito metálico são nanopartículas esféricas e têm um diâmetro de cerca de 5 nm a cerca de 200 nm.3. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the metallic composite nanostructures are spherical nanoparticles and have a diameter of about 5 nm to about 200 nm. 4. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas de compósito metálico são nanopartículas esféricas e têm um diâmetro de cerca de 10 nm a cerca de 100 nm.4. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the metallic composite nanostructures are spherical nanoparticles and have a diameter of about 10 nm to about 100 nm. 5. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas de compósito metálico são nanoplacas com um comprimento de margem de cerca de 10 nm a cerca de 800 nm e uma espessura de cerca de 1 nm a cerca de 100 nm.5. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the metallic composite nanostructures are nanoplates with a margin length of about 10 nm to about 800 nm and a thickness of about 1 nm to about 100 nm. 6. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de conjugados de detecção está na forma de um pellet ou grânulo liofilizado.6. Analyte detection device, according to claim 1, characterized in that the plurality of detection conjugates is in the form of a freeze-dried pellet or granule. 7. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície é um chip, um poço, um grânulo ou uma parede, tampa e/ou fundo de uma cubeta.7. Analyte detection device, according to claim 1, characterized in that the surface is a chip, a well, a granule or a wall, lid and/or bottom of a cuvette. 8. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanocamada metálica é um filme metálico.8. Analyte detection device, according to claim 1, characterized by the fact that the metallic nanolayer is a metallic film. 9. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o filme metálico compreende ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, zinco ou um compósito dos mesmos.9. Analyte detection device according to claim 8, characterized in that the metallic film comprises gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, zinc or a composite thereof. 10. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o filme metálico compreende ouro.10. Analyte detection device according to claim 8, characterized in that the metallic film comprises gold. 11. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanocamada metálica compreende uma pluralidade de nanoestruturas metálicas imobilizadas na superfície.11. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the metallic nanolayer comprises a plurality of metallic nanostructures immobilized on the surface. 12. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de nanoestruturas metálicas compreende ouro, prata, cobre, platina, paládio, cádmio, zinco ou um compósito dos mesmos.12. Analyte detection device, according to claim 11, characterized in that the plurality of metallic nanostructures comprises gold, silver, copper, platinum, palladium, cadmium, zinc or a composite thereof. 13. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de nanoestruturas metálicas são nanoestruturas de ouro.13. Analyte detection device, according to claim 11, characterized by the fact that the plurality of metallic nanostructures are gold nanostructures. 14. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas de compósitos têm uma geometria selecionada de nanopartículas esféricas, nanopartículas piramidais, nanopartículas hexagonais, nanocascas, nanotubos, nanohastes, nanopontos, nanoilhas, nanofios ou combinações dos mesmos.14. Analyte detection device, according to claim 1, characterized in that the composite nanostructures have a selected geometry of spherical nanoparticles, pyramidal nanoparticles, hexagonal nanoparticles, nanoshells, nanotubes, nanorods, nanodots, nanoislands, nanowires or combinations thereof. 15. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os parceiros de ligação e/ou moléculas de captura são anticorpos, antígenos, polipeptídeos, polinucleotídeos, nucleoproteínas, aptâmeros, ligantes, receptores ou haptenos.15. Analyte detection device, according to claim 1, characterized in that the binding partners and/or capture molecules are antibodies, antigens, polypeptides, polynucleotides, nucleoproteins, aptamers, ligands, receptors or haptens. 16. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os parceiros de ligação são anticorpos que reconhecem um primeiro epítopo de um analito alvo e as moléculas de captura são anticorpos diferentes que reconhecem um segundo epítopo de um analito alvo.16. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the binding partners are antibodies that recognize a first epitope of a target analyte and the capture molecules are different antibodies that recognize a second epitope of a target analyte. 17. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as moléculas de captura são anticorpos, antígenos, polipeptídeos, polinucleotídeos, nucleoproteínas, aptâmeros, ligantes, receptores ou haptenos.17. Analyte detection device, according to claim 2, characterized in that the capture molecules are antibodies, antigens, polypeptides, polynucleotides, nucleoproteins, aptamers, ligands, receptors or haptens. 18. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é um marcador ou antígeno associado com uma doença infecciosa, estado fisiológico ou condição patológica.18. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the target analyte is a marker or antigen associated with an infectious disease, physiological state or pathological condition. 19. Dispositivo de detecção de analito, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o analito alvo é verme de coração canino, vírus de leucemia felina, parvovírus canino, proteína C-reativa, Giardia lamblia, antígeno ou anticorpo de Ehrlichia, antígeno ou anticorpo de Borrelia, antígeno ou anticorpo de Anaplasma, um antígeno de câncer, um antígeno de marcador cardíaco, hormônio estimulante de tireoide, tiroxina, troponina ou peptídeo natriurético do cérebro.19. Analyte detection device according to claim 1, characterized in that the target analyte is canine heartworm, feline leukemia virus, canine parvovirus, C-reactive protein, Giardia lamblia, Ehrlichia antigen or antibody, Borrelia antigen or antibody, Anaplasma antigen or antibody, a cancer antigen, a cardiac marker antigen, thyroid-stimulating hormone, thyroxine, tropon inin or brain natriuretic peptide. 20. Método de detectar um analito alvo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: misturar a amostra com uma pluralidade de conjugados de detecção, em que os conjugados compreendem nanoestruturas de compósito metálico acopladas a parceiros de ligação que são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo, se presente, na amostra para formar complexos analito-conjugado de detecção, em que as nanoestruturas de compósito metálico compreendem um núcleo de prata e um revestimento de ouro; colocar em contato a mistura com uma superfície contendo uma nanocamada metálica, em que uma pluralidade de moléculas de captura está imobilizada na nanocamada metálica e são capazes de se ligar especificamente ao analito alvo, se presente, na amostra; expor a superfície a uma fonte de luz em uma faixa de comprimento de onda dentro do espectro ultravioleta-visível- infravermelho; e medir um sinal óptico da superfície, em que uma mudança no sinal óptico indica a presença do analito alvo na amostra.20. Method of detecting a target analyte in a sample, characterized in that it comprises: mixing the sample with a plurality of detection conjugates, wherein the conjugates comprise metallic composite nanostructures coupled to binding partners that are capable of binding specifically to the target analyte, if present, in the sample to form analyte-detection conjugate complexes, wherein the metallic composite nanostructures comprise a silver core and a gold coating; contacting the mixture with a surface containing a metallic nanolayer, wherein a plurality of capture molecules are immobilized on the metallic nanolayer and are capable of binding specifically to the target analyte, if present, in the sample; exposing the surface to a light source in a wavelength range within the ultraviolet-visible-infrared spectrum; and measuring an optical signal from the surface, wherein a change in the optical signal indicates the presence of the target analyte in the sample. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o sinal óptico é refletância, um espectro de absorbância, espectro de dispersão ou um espectro de emissão.21. Method according to claim 20, characterized in that the optical signal is reflectance, an absorbance spectrum, dispersion spectrum or an emission spectrum. 22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a mudança no sinal óptico compreende um deslocamento do comprimento de onda de pico espectral.22. Method according to claim 20, characterized in that the change in the optical signal comprises a shift of the spectral peak wavelength. 23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a presença de quantidades em nanograma do analito alvo é detectada.23. Method, according to claim 20, characterized by the fact that the presence of nanogram quantities of the target analyte is detected. 24. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a presença de quantidades em picograma do analito alvo é detectada.24. Method according to claim 20, characterized in that the presence of picogram quantities of the target analyte is detected. 25. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a presença de quantidades em femtograma do analito alvo é detectada.25. Method according to claim 20, characterized in that the presence of femtogram quantities of the target analyte is detected. 26. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a superfície é paredes e fundo de uma cubeta incorporada em um rotor de centrifugação.26. Method, according to claim 20, characterized in that the surface is the walls and bottom of a cuvette incorporated in a centrifuge rotor. 27. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a nanocamada metálica é um filme metálico.27. Method, according to claim 20, characterized by the fact that the metallic nanolayer is a metallic film. 28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o filme metálico compreende ouro.28. Method according to claim 27, characterized in that the metallic film comprises gold. 29. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a nanocamada metálica compreende uma pluralidade de nanoestruturas metálicas imobilizadas na superfície.29. Method according to claim 20, characterized in that the metallic nanolayer comprises a plurality of metallic nanostructures immobilized on the surface. 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de nanoestruturas metálicas são nanoestruturas de ouro.30. Method, according to claim 29, characterized by the fact that the plurality of metallic nanostructures are gold nanostructures. 31. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas de compósitos têm uma geometria selecionada de nanopartículas esféricas, nanopartículas piramidais, nanopartículas hexagonais, nanotubos, nanocascas, nanohastes, nanoilhas, nanopontos, nanofios ou combinações dos mesmos.31. Method, according to claim 20, characterized in that the composite nanostructures have a selected geometry of spherical nanoparticles, pyramidal nanoparticles, hexagonal nanoparticles, nanotubes, nanoshells, nanorods, nanoislands, nanopoints, nanowires or combinations thereof.