BR112016030313B1 - Método de identificação de um paciente com aloenxerto renal e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, TRATAMENTO E SELEÇÃO DE PACIENTES COM ALOENXERTO RENAL E KIT. São descritos no presente métodos de diagnóstico de rejeição celular aguda (ACR) de um aloenxerto por meio da análise de conjuntos genéticos previsores e kits de prática desses métodos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Norte- Americano n° 62/017.784, depositado em 26 de junho de 2014, que é integralmente incorporado ao presente como referência.

CLÁUSULA DE SUBSÍDIO GOVERNAMENTAL

[002] A presente invenção foi realizada com apoio governamental com base no subsídio n° 1U01AI070107-01 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo detém alguns direitos sobre a presente invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico de rejeição celular aguda (ACR) de um aloenxerto por meio da análise de conjuntos genéticos previsores e kits de prática desses métodos. Os métodos compreendem a análise do sangue de pacientes com aloenxertos renais por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética que contém pelo menos sete genes previamente selecionados, a fim de identificar e tratar esses pacientes. Nível de expressão alterado de um ou mais genes no sangue do paciente de aloenxertos em comparação com os mesmos genes em um controle indica que o paciente encontra-se em risco de rejeição de aloenxertos. Quanto maior o nível de alteração, maior o risco de rejeição. Pode- se aplicar um modelo de enquadramento de regressão logística a valores de expressão normalizados (tais como contagens de leitura de genes por meio de tecnologia de sequenciamento de gerações seguintes) para gerar um modelo estatístico do qual pode ser calculada avaliação de probabilidades de risco de rejeição celular aguda para cada paciente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Os testes existentes de rejeição de aloenxertos renais são caros e complicados. Esses testes normalmente exigem a obtenção de amostras de biópsia do paciente. Frequentemente, no momento em que a rejeição é reconhecida, é tarde demais para fazer qualquer coisa. Aumento da creatinina no soro ou aumento da proteína na urina podem ser avisos de rejeição, mas não a preveem completamente. Existe a necessidade no campo de testes aprimorados que sejam de fácil condução, eliminem a necessidade de biópsia e prevejam melhor o risco de rejeição de aloenxerto renal ou fibrose.

[005] O teste de perfil de expressão do presente aborda essa necessidade e fornece um exame de sangue que é facilmente administrado repetidamente a pacientes com transplante. Pacientes com transplante renal são examinados pelo seu médico com muita frequência após o transplante - na maior parte dos casos, duas vezes por semana para o primeiro mês, alterando- se para semanalmente e a cada duas semanas, chegando a mensalmente após quatro a cinco meses, com os intervalos de tempo entre as visitas aumentando gradualmente em seguida. Durante esse período, a função renal dos pacientes e os níveis de imunossupressão são monitorados. Os esteroides são afilados até 5 mg por meio de pós-cirurgia por três meses e os níveis de tacrolimus (fármaco que suprime o sistema imunológico e é utilizada para evitar a rejeição de órgãos transplantados) são gradualmente reduzidos para um nível estável em até seis a doze meses caso o transcurso pós-transplante não apresente complicações e o paciente não possua alto risco imunológico. Os perfis de expressão genética descritos abaixo podem ser empregados como teste padrão a ser realizado no momento de uma visita clínica. Resultado de teste positivo (ou seja, o paciente expressa esses genes em nível alterado em comparação com controle) indica que o paciente encontra-se em risco de rejeição do órgão transplantado e seria tratado por meio de aumento da dose de fármacos imunossupressores e suspensão do conjunto costumeiro de fármacos imunossupressores. Teste de repetição (que pode ser realizado economicamente, pois o teste é preferencialmente um exame de sangue) orientará o reinício do afunilamento imunossupressor. Se dois testes subsequentes forem negativos, por exemplo, a dose de prednisona pode, por exemplo, cair em 2,5 ou 5 mg ou o nível alvo de tacrolimus seria reduzido em 0,5 mg/dl. Caso o teste de perfil seja positivo na presença de aumento da creatinina, isso indicaria rejeição aguda clínica, conforme evidenciado por lesões renais. Neste caso, o paciente seria tratado com alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos, dependendo do risco imunológico geral do indivíduo.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[006] Em um aspecto, é fornecido um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão no controle.

[007] Em outro aspecto, é fornecido um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética no controle.

[008] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em amostra de controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado do controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.

[009] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão de amostra controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.

[0010] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de um paciente controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.

[0011] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto de assinatura genética no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.

[0012] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.

[0013] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um conjunto genético selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão do conjunto genético de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.

[0014] Em outro aspecto, é fornecido um kit para uso na determinação de se um paciente com aloenxerto encontra-se em risco de ACR. O kit compreende um teste de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado, primers para um conjunto de assinatura genética previamente selecionado, tampões e controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0015] Em um aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende pelo menos sete genes dentre os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.

[0016] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.

[0017] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7.

[0018] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1.

[0019] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.

[0020] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0021] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0022] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0023] Outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0024] Outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0025] Um aspecto adicional fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra de sangue de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra sanguínea, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura genética previamente selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparadas com um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao nível de expressão no controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto mais alterado for o nível de expressão em pacientes do conjunto genético de assinatura em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.

[0026] Em outro aspecto, os resultados do teste são aplicados a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1- p(x)) = β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente.

[0027] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em um controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0028] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em um controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0031] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto e avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético da amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético em controle para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0033] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.

[0035] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.

[0036] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com onze membros que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.

[0037] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com 17 membros que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.

[0038] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para o conjunto genético previamente selecionado, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0039] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com dezessete membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0040] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com onze membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0041] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com nove membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0042] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com sete membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0043] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de seleção de pacientes com aloenxerto renal para tratamento, a fim de reduzir o risco de rejeição de aloenxerto renal, que compreende: a. fornecimento de amostras de sangue do paciente com aloenxerto renal; b. determinação dos níveis de expressão de um conjunto genético previamente selecionado na amostra; c. comparação dos níveis de expressão dos genes previamente selecionados na amostra com os níveis de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle; e d. seleção do paciente para tratamento de rejeição de aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto genético da amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais dos conjuntos genéticos no controle.

[0044] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de seleção de pacientes com aloenxerto renal para tratamento, a fim de reduzir o risco de rejeição de aloenxerto renal ou perda de aloenxerto, que compreende a comparação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado obtido do paciente com o nível de expressão do conjunto genético previamente selecionado em uma amostra de controle obtida de um paciente de aloenxerto que não sofreu rejeição de aloenxerto e seleção do paciente para tratamento de perda ou rejeição de aloenxerto, caso o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto genético previamente selecionado do paciente seja alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais dos genes do conjunto genético previamente selecionado no controle.

[0045] Os detalhes de uma ou mais realizações da presente invenção são apresentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo, das figuras e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0046] Da forma utilizada no presente, a expressão “cerca de” ou “aproximadamente” normalmente indica em faixa de erro aceitável para o tipo de valor e método de medição. Ela pode indicar, por exemplo, dentro de até 20%, de maior preferência até 10% e, de preferência superior, ainda dentro de 5% de um dado valor ou faixa. Alternativamente, especialmente em sistemas biológicos, a expressão “cerca de” indica dentro de cerca de um logaritmo (ou seja, ordem de magnitude), preferencialmente dentro de um fator de dois de um dado valor.

[0047] Da forma utilizada no presente, “ACR” indica rejeição celular aguda.

[0048] Segundo a presente invenção, pode-se empregar biologia molecular convencional, microbiologia, DNA recombinante, imunologia, biologia celular e outros métodos relacionados dentro do estado da técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al, eds. (2005), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken N. J.; Bonifacino et al, eds. (2005), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coico et al, eds. (2005), Current Protocols in Microbiology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Enna et al, eds. (2005), Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Hames et al, eds. (1999), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, quarta edição, Wiley-Liss; entre outros. Current Protocols, mencionado acima, é atualizado várias vezes por ano.

[0049] Os termos “diminuir”, “diminuído”, “reduzido”, “redução” ou “regulado para baixo” são todos utilizados no presente de forma geral para indicar redução em quantidade estatisticamente significativa. Para evitar dúvida, entretanto, “reduzido”, “redução”, “regulado para baixo”, “diminuído” ou “diminuir” indica redução de pelo menos 10% em comparação com nível de referência, tal como redução de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% e até redução de 100%, inclusive (ou seja, nível ausente em comparação com amostra de referência) ou qualquer redução de 10 a 100% em comparação com nível de referência, ou redução de pelo menos cerca de 0,5 vezes, pelo menos cerca de 1,0 vezes, pelo menos cerca de 1,2 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de quatro vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes, ou qualquer redução de 1,0 vez e 10 vezes ou mais em comparação com nível de referência.

[0050] Os termos “aumentado”, “aumento” ou “regulado para cima” são todos utilizados no presente para indicar, de forma geral, aumento em quantidade estatisticamente significativa; para evitar qualquer dúvida, os termos “aumentado” ou “aumento” indicam aumento de pelo menos 10% em comparação com nível de referência, tal como aumento de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou até aumento de 100%, inclusive, ou qualquer aumento de 10 a 100% em comparação com nível de referência, ou aumento de pelo menos cerca de 0,5 vezes, pelo menos cerca de 1,0 vezes, pelo menos cerca de 1,2 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de quatro vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes, ou qualquer aumento de 1,0 vez a 10 vezes ou mais em comparação com nível de referência.

[0051] Da forma utilizada no presente, “determinação do nível de expressão” ou ”detecção do nível de expressão”, tal como, por exemplo, em “determinação do nível de expressão de um gene”, designa a quantificação da quantidade de mRNA presente em uma amostra. A detecção da expressão dos mRNAs específicos pode ser atingida utilizando qualquer método conhecido na técnica ou descrito no presente. Tipicamente, métodos de detecção de mRNA envolvem a detecção específica de sequências, tal como por meio de PCR RT. Sondas e primers específicos de mRNA podem ser projetados utilizando sequências de ácidos nucleicos que são conhecidas na técnica.

[0052] Ao longo de todo o pedido e nas reivindicações anexas, dever-se-á compreender e pretende-se compreender que o uso das expressões “fármaco”, “medicação”, “agente” e “agente terapêutico” são expressões intercambiáveis que definem entidades idênticas ou similares. “Fármaco” designa geralmente um composto químico, molécula pequena ou outra composição biológica, tal como um composto sem sentido, anticorpo, inibidor da protease, hormônio, quemoquina ou citoquina, capaz de induzir efeito terapêutico ou profilático quando administrado adequadamente ao paciente.

[0053] Da forma utilizada no presente, "tratar" ou "tratamento" de estado, distúrbio ou condição inclui: (1) evitar ou retardar o surgimento de sintomas clínicos ou subclínicos do estado, distúrbio ou condição em desenvolvimento em um mamífero que pode sofrer ou apresentar pré-disposição para o estado, distúrbio ou condição, mas ainda não experimenta nem exibe sintomas clínicos ou subclínicos do estado, distúrbio ou condição (por exemplo, fibrose de aloenxerto renal e/ou perda de aloenxerto); e/ou (2) inibição do estado, distúrbio ou condição, ou seja, suspensão, redução ou retardamento do desenvolvimento da doença ou sua reincidência (no caso de tratamento de manutenção) ou pelo menos um de seus sintomas clínicos ou subclínicos; e/ou (3) alívio da doença, ou seja, causando regressão do estado, distúrbio ou condição ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos ou subclínicos; e/ou (4) promoção de redução da severidade de um ou mais sintomas da doença. O benefício a um paciente a ser tratado é estatisticamente significativo ou ao menos perceptível para o paciente ou para o médico.

[0054] Da forma utilizada no presente, o termo “inibição” de doença ou condição (por exemplo, ACR e/ou perda de aloenxerto) indica, por exemplo, suspensão do desenvolvimento de um ou mais sintomas de doenças em pacientes antes que eles ocorram ou sejam detectáveis, por exemplo, pelo paciente ou pelo médico do paciente. Preferencialmente, a doença ou condição não se desenvolve, ou seja, nenhum sintoma da doença é detectável. Ele pode também resultar, entretanto, em retardamento ou redução da velocidade do desenvolvimento de um ou mais sintomas da doença.

[0055] Da forma utilizada no presente, nível “alterado” de expressão de mRNA em comparação com o nível de referência ou nível de controle é nível alterado em pelo menos 0,5 vezes (por exemplo, pelo menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10.000 vezes) da expressão do mRNA. Compreende-se que a alteração possa ser aumento ou redução. Alternativamente, nível de expressão alterado é definido como aumento da avaliação das probabilidades de rejeição aguda utilizando parâmetros no modelo de regressão logística estabelecido de um grupo de pacientes em treinamento, comparando-se a avaliação de probabilidade com o corte derivado do conjunto de treinamento.

[0056] “Controle” é definido como amostra obtida de paciente que recebeu um transplante de aloenxerto que não sofre de rejeição celular aguda.

[0057] Determinou-se agora que o aumento da transcrição de um conjunto previamente selecionado de genes pode ser utilizado para prever a probabilidade de que um paciente de aloenxerto renal rejeitará rim transplantado antes que o paciente manifeste qualquer sintoma claro. O teste pode também ser empregado para diagnosticar se um paciente com transplante de rim experimenta rejeição aguda. A sobre-expressão dos conjuntos genéticos pode ser utilizada para identificar pacientes em risco de rejeição aguda.

[0058] Caso o paciente expresse os genes previamente selecionados em nível alterado com relação ao controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto maior a alteração do nível de expressão dos genes previamente selecionados em comparação com o controle, maior o risco de rejeição. A informação obtida com o teste pode também ser aplicada a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente. Em uma realização, avaliação mais alta acima indica que o paciente encontra-se em alto risco de rejeição do órgão transplantado.

[0059] Atualmente, o diagnóstico de rejeição aguda exige biópsia de aloenxerto renal acionada por elevação da creatinina na presença de lesão renal. A coleta e o teste de amostras de biópsias de pacientes são caros e demorados. O método de teste do presente é um teste de tecido biológico, preferencialmente um teste com base em sangue que elimina a necessidade de amostras de biópsia. O teste pode ser utilizado para prever a probabilidade de que um paciente com aloenxerto renal rejeitará rim transplantado antes que o paciente manifeste qualquer sintoma claro. O teste pode também ser empregado para diagnosticar se um paciente com transplante de rim está sofrendo rejeição aguda. O teste é barato, altamente preciso, reproduzível e não invasivo.

[0060] Foram identificadas assinaturas do sangue periférico utilizando conjuntos de assinaturas genéticas que compreendem pelo menos sete e até 17 genes previamente selecionados. Esses conjuntos genéticos previamente selecionados podem ser utilizados para diagnosticar com precisão a rejeição subclínica de aloenxertos renais e identificar aloenxertos renais em risco de declínio funcional e histológico subsequente, bem como o risco de rejeição de aloenxerto.

[0061] Os conjuntos de assinatura genética úteis na prática dos métodos descritos no presente são selecionados a partir dos genes a seguir: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.

[0062] O conjunto de assinatura periférica de sete genes de acordo com a presente invenção é: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.

[0063] A assinatura do sangue periférico com nove genes de acordo com a presente invenção é: TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7.

[0064] A assinatura do sangue periférico com onze genes de acordo com a presente invenção é: CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1.

[0065] A assinatura do sangue periférico com 17 genes de acordo com a presente invenção é: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.

[0066] Cada um desses conjuntos de assinatura genética pode ser utilizado na prática da presente invenção. O conjunto de assinatura do sangue com onze genes é, entretanto, uma realização preferida.

[0067] A presente invenção fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra sanguínea de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra sanguínea, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura genética selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparados com um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao nível de expressão dos genes do conjunto de assinatura genética, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto mais alterado for o nível de expressão do paciente em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.

[0068] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes da assinatura genética em uma amostra de controle e determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição mediada por células T do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto de assinatura genética do controle.

[0069] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de um paciente controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição para evitar a rejeição.

[0070] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene previamente selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.

[0071] Em ainda outra realização, é fornecido um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0072] Em ainda outra realização, é fornecido um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0073] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0074] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.

[0075] Em uma realização adicional, a presente invenção fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra sanguínea de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra de sangue, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura com nove genes selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparados com o nível de expressão dos genes do conjunto de assinatura em um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição do íon dos genes do conjunto de assinatura. Quanto maior a alteração (aumento e/ou redução) do nível de expressão dos genes da assinatura genética do paciente em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.

[0076] Em outra realização, os resultados do teste são aplicados a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1- p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente. Caso a avaliação de probabilidade do paciente seja mais alta que a avaliação de probabilidade do controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição celular aguda.

[0077] Em outra realização, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com 17 membros que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.

[0078] Em alguns métodos do presente, é desejável detectar e quantificar mRNAs presentes em amostras. A detecção e a quantificação da expressão de RNA podem ser atingidas por qualquer um dentre uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Utilizando as sequências conhecidas para membros da família de RNA, primers e sondas específicas podem ser projetados para uso nos métodos de detecção descritos abaixo como apropriados.

[0079] Em alguns casos, a detecção e a quantificação da expressão de RNA exigem o isolamento de ácido nucleico de amostras, tais como amostras de células ou tecidos. Ácidos nucleicos, incluindo RNA e, especificamente, mRNA podem ser isolados utilizando qualquer método apropriado conhecido na técnica. A extração com base em fenol, por exemplo, é um método comum de isolamento de RNA. Reagentes com base em fenol contêm uma combinação de desnaturantes e inibidores de RNase para rompimento de células e tecidos e subsequente separação de RNA de contaminantes. Procedimentos de isolamento com base em fenol podem recuperar espécies de RNA na faixa de 10 a 200 nucleotídeos (por exemplo, miRNAs maduros e precursores, RNA ribossômico (rRNA) 5S e 5.8S e RNA nuclear pequeno (snRNA) U1). Além disso, procedimentos de extração tais como os que utilizam TRIZOL® ou TRI REAGENT® purificarão todos os RNAs, grandes e pequenos, e são métodos eficientes de isolamento de RNA total de amostras biológicas que contêm miRNAs e RNAs interferentes pequenos (siRNAs). Procedimentos de extração como os que utilizam kit QIAGEN-ALLprep também são contemplados.

[0080] Em algumas realizações, é desejável o uso de PCR RT quantitativa. PCR RT quantitativa (PCR qRT) é uma modificação de reação em cadeia de polimerase utilizada para medir rapidamente a quantidade de produtos de reação em cadeia de polimerase. PCR qRT é comumente utilizada para o propósito de determinar se uma sequência genética está presente em uma amostra e, se estiver presente, o número de cópias na amostra. Qualquer método de PCR que possa determinar a expressão de moléculas de ácido nucleico, incluindo mRNA, encontra-se dentro do escopo da presente invenção. Existem diversas variações do método de PCR qRT conhecido na técnica, três das quais são descritas abaixo.

[0081] Em outra realização, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para o conjunto genético com 17 membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.

[0082] Em uma realização típica, laboratórios clínicos obterão o valor de expressão utilizando a amostra do paciente e o enviarão para o médico do paciente. O médico comunicará em seguida esse valor para o seu provedor de serviços com base na Web. O provedor de serviços introduzirá aquele valor no sistema de bioinformática que já possui o coeficiente penalizado de cada gene do conjunto genético previamente selecionado e o corte do modelo de regressão logística do conjunto de treinamento. O sistema de bioinformática utilizará essa informação para calcular a avaliação de probabilidade para o paciente. A avaliação calculada refletirá a situação de ACR do paciente.

[0083] O procedimento geral de aplicação da assinatura genética em diagnóstico de ACR é descrito abaixo utilizando a assinatura com nove genes como exemplo não limitador.

[0084] 1. Seleção do grupo de treinamento: será cuidadosamente selecionado um grupo de pacientes com transplante renal com casos de ACR equilibrado e sem ACR (controle) (número total N~100). O grupo de treinamento terá demografia e indicações clínicas bem caracterizadas que tenham sido analisadas por pelo menos dois patologistas.

[0085] 2. Expressão da medição de nove genes: os níveis de expressão de nove genes da amostra de sangue após o transplante de cada paciente do grupo de treinamento podem ser medidos utilizando qualquer método, preferencialmente por meio de tecnologia MiSEQ, PCR RT ou Nanostring. O uso desses métodos é descrito nos Exemplos 1 a 3 abaixo.

[0086] 3. Estabelecimento de modelo de regressão e corte: Um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado utilizando o pacote logistf R (pacote estatístico disponível por meio da r-project.org) será aplicado em seguida sobre valores de expressão dos nove genes para derivar o modelo estatístico do qual será derivado o valor β* para cada gene e a avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente será calculada a partir da equação a seguir: (log (p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (em que (p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é o coeficiente penalizado e gi é a contagem de leitura do gene i).

[0087] Com base na avaliação de probabilidade, a estatística de previsão tal como AUC de previsão (área sob a curva) da curva ROC (característica de operação de recebimento) da velocidade positiva verdadeira em comparação com o falso positivo, sensibilidade/especificidade, serão determinados os valores positivos (PPV) e os valores de previsão negativos (NPV). Em dada especificidade (90%), será estabelecido o corte da avaliação de probabilidade que melhor detecta a presença de rejeição aguda. Espera-se que haja divisão clara em dois grupos, em que, se um paciente estiver no grupo superior, eles possuem alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como positivo, mas, se estiverem no fundo, eles possuem muito pouca probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo negativo.

[0088] A alternativa é que os pacientes serão divididos em terços com base na sua avaliação de probabilidades determinada conforme acima. Neste caso, se o paciente estiver (1) no terço superior, eles possuem alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo positivo; (2) no segundo terço ou grupo intermediário, o seu risco não pode ser determinado com precisão; e (3) no terço inferior, eles possuem probabilidade muito baixa de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo negativo.

[0089] O coeficiente (valor β*) e o corte derivado do grupo de treinamento serão introduzidos e armazenados em um sistema de computador de bioinformática com base na Web que pode ser consultado por consultórios médicos/laboratórios clínicos via Internet.

[0090] 4. Diagnóstico de casos novos: para novos pacientes, os níveis de expressão do conjunto de nove genes serão medidos por meio da mesma tecnologia utilizada para o conjunto de treinamento no laboratório clínico. Utilizando um sistema de bioinformática com base na Web, a avaliação de probabilidades será calculada resumindo-se o valor de expressão (gi) dos nove genes multiplicado pelos seus valores β* que são derivados do conjunto de treinamento. A avaliação de probabilidades será comparada com o corte para determinar a situação de ACR. Aumento da avaliação de probabilidades do paciente com relação à avaliação de probabilidades em controle indica que o paciente encontra-se em risco mais alto de rejeição de aloenxertos. Um laboratório clínico enviará os resultados do teste para o médico.

[0091] Os métodos descritos no presente diagnosticam com precisão a rejeição clínica e subclínica e identificam com precisão aloenxertos com risco de declínio funcional e histológico subsequente e pacientes com aloenxerto em risco de perda de enxerto.

[0092] Quando esses pacientes com aloenxertos são identificados, a presente invenção inclui métodos de tratamento desses pacientes. Os métodos incluem, sem limitações, aumento da administração de fármacos imunossupressores, ou seja, inibidor da calcineurina (CNI), tal como ciclosporina ou tacrolimus, ou fármaco imunossupressor menos fibrogênica, tal como micofenolato mofetil (MMF) ou sirolimus. A classe principal de imunossupressores são os inibidores de calcineurina (CNIs), que inclui tacrolimus (Prograf® e Advagraf®/Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) e genéricos de Prograf®) e ciclosporina (Neoral® e Sandimmune® (Novartis AG) e genéricos). Esteroides como prednisona podem também ser administrados para tratar pacientes em risco de perda de enxerto ou declínio funcional. Agentes antiproliferativos tais como micofenolato mofetil, micofenolato sódio e azatioprina também são úteis nesses tratamentos. A imunossupressão pode ser atingida com muitos fármacos imunossupressores, que incluem esteroides, anticorpos dirigidos e CNIs como tacrolimus. Destes, tacrolimus é um dos mais potentes em termos de supressão do sistema imunológico ou administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfocíticos, dependendo da presença ou ausência de creatinina elevada. O regime de tratamento atualmente preferido para rejeição clínica é alta dose de esteroides ou agentes antilinfocíticos. Outro agente preferido é Nulojix® (belatacept, Bristol-Myers Squibb), agente biológico de infusão.

KITS

[0093] Em certas realizações, são fornecidos kits de determinação de risco de pacientes com aloenxerto renal para perda de aloenxerto.

[0094] Os kits conterão primers para o conjunto de assinatura genética com 17 membros conforme descrito no Exemplo 5 abaixo (para testes Nanostring), primers para dois genes domésticos, beta-actina (ACTB) desidrogenase 3-fosfato de gliceraldeído (GAPDH) e uma sonda controle, RNA ribossomal 18S (para testes de qPCR).

[0095] Um kit pode conter adicionalmente um ou mais reagentes de extração de mRNA e/ou reagentes de síntese de cDNA. Em outras realizações, o kit pode compreender um ou mais recipientes nos quais os agentes biológicos são colocados e, de preferência, adequadamente divididos. Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou em forma liofilizada. Os kits podem também compreender um ou mais excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitadores de excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água livre de RNAse, água destilada, água tamponada, solução salina fisiológica, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose, tampões de reação, tampões de marcação, tampões de lavagem e tampões de hibridização.

[0096] Os kits de acordo com a presente invenção podem assumir uma série de formas. Tipicamente, o kit incluirá reagentes apropriados para a determinação dos níveis de expressão de conjuntos genéticos (tais como os descritos no presente) em amostras. Opcionalmente, os kits podem conter uma ou mais amostras de controle. Além disso, os kits, em alguns casos, incluirão informações escritas (indícios) que fornecem referência (tais como valores previamente determinados), em que a comparação entre os níveis de expressão genética no paciente e na referência (valores previamente determinados) indica situação clínica.

[0097] Em alguns casos, os kits compreendem software útil para comparação dos níveis de expressão de conjuntos genéticos ou ocorrências com uma referência (tal como um modelo de previsão). Normalmente, o software será fornecido em formato legível por computador, tal como disco compacto, mas pode também ser disponível para download via Internet. Os kits não são limitados desta forma, entretanto, e outras variações serão evidentes para os técnicos comuns no assunto.

[0098] Os métodos do presente podem também ser utilizados para seleção de tratamento e/ou determinação de plano de tratamento para pacientes, com base nos níveis de expressão de um conjunto genético (tais como os descritos no presente).

[0099] Os níveis de expressão e/ou níveis de expressão de referência podem ser armazenados em meio de armazenagem de dados apropriado (tal como um banco de dados) e, portanto, também são disponíveis para diagnósticos futuros. Isso também permite o diagnóstico eficiente de prevalência para doença, pois resultados de referência apropriados podem ser identificados no banco de dados após a confirmação (no futuro) de que o paciente do qual foi obtida a amostra de referência correspondente de fato desenvolveu fibrose do aloenxerto e/ou experimentou rejeição do aloenxerto.

[00100] Da forma utilizada no presente, “banco de dados” compreende dados coletados (por exemplo, informações de nível de referência e/ou analisado e/ou informações do paciente) em um meio de armazenagem apropriado. Além disso, o banco de dados pode compreender adicionalmente um sistema de administração de banco de dados. O sistema de administração de banco de dados é preferencialmente um sistema de administração de banco de dados com base em rede, hierárquico ou orientado a objetos. De maior preferência, o banco de dados será implementado na forma de sistema distribuído (federal), tal como sistema de cliente-servidor. De maior preferência, o banco de dados é estruturado de forma a permitir um algoritmo de busca para comparar um conjunto de dados de teste com os conjuntos de dados compreendidos pela coleção de dados. Especificamente, utilizando esse algoritmo, o banco de dados pode ser pesquisado em busca de conjuntos de dados idênticos ou similares que indiquem risco de rejeição de aloenxerto renal. Desta forma, caso possa ser identificado um conjunto de dados idêntico ou similar na coleção de dados, o conjunto de dados de teste será associado a risco de rejeição de aloenxerto renal. Consequentemente, as informações obtidas da coleção de dados podem ser utilizadas para diagnosticar risco de perda de alenxerto do paciente de aloenxerto com base em um conjunto de dados de teste obtido de um paciente. De maior preferência, a coleta de dados compreende valores característicos de todos os analisados compreendidos por qualquer um dos grupos indicados acima.

[00101] A presente invenção fornece adicionalmente, por exemplo, a comunicação de resultados de teste, diagnósticos ou ambos para técnicos, médicos ou pacientes. Em certas realizações, serão utilizados computadores para comunicar resultados de teste, diagnósticos ou ambos a partes interessadas, tais como médicos e seus pacientes.

[00102] Em algumas realizações, o método descrito no presente compreende adicionalmente a modificação do registro clínico do paciente para identificar o paciente como estando em risco de desenvolvimento de ACR e/ou perda de aloenxerto. O registro clínico pode ser armazenado em qualquer meio de armazenagem de dados apropriado (por exemplo, meio legível por computador).

[00103] Em algumas realizações da presente invenção, diagnóstico com base nos métodos fornecidos no presente é comunicado ao paciente com aloenxerto assim que possível após a obtenção do diagnóstico. O diagnóstico pode ser comunicado para o paciente pelo médico responsável. Alternativamente, o diagnóstico pode ser enviado para o paciente por email ou comunicado para o paciente por telefone. O diagnóstico pode ser enviado para o paciente na forma de relatório. Pode-se utilizar um computador para comunicar o diagnóstico por email ou telefone. Em certas realizações, a mensagem que contém resultados de um teste de diagnóstico pode ser gerada e fornecida automaticamente para o paciente utilizando uma combinação de hardware e software de computador que será familiar para os técnicos em telecomunicações.

[00104] Aspectos da presente invenção incluem produtos de programa de computador para identificar pacientes que sofreram aloenxerto renal e encontram-se em risco de rejeição aguda, em que o produto de programa de computador, quando carregado a um computador, é configurado para empregar um resultado de expressão genética de uma amostra derivada do paciente para determinar se o paciente que sofreu aloenxerto renal encontra-se em risco de rejeição de aloenxerto e o resultado da expressão genética compreende dados de expressão para pelo menos um conjunto de assinatura genética.

[00105] Também são fornecidos perfis de expressão de referência para um fenótipo que é um dentre: (a) baixo risco de rejeição aguda; ou (b) alto risco; em que o perfil de expressão é registrado em meio legível por computador que é acessível pelo usuário, por exemplo, em formato legível pelo usuário. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil de fenótipo que apresenta baixo risco. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil de fenótipo que apresenta alto risco.

[00106] Os perfis de expressão e seus bancos de dados podem ser fornecidos em uma série de meios para facilitar o seu uso. “Mídia” indica um produto industrializado que contém as informações do perfil de expressão de acordo com a presente invenção. Os bancos de dados de acordo com a presente invenção podem ser registrados em meios legíveis por computador, tais como qualquer meio que possa ser lido e acessado diretamente por usuários, usando um computador. Esses meios incluem, mas sem limitações: meios de armazenagem magnética, como disquetes, meios de armazenagem em disco rígido e fita magnética; meios de armazenagem óptica como CD-ROMs; meios de armazenagem elétrica como RAM e ROM; e híbridos dessas categorias, como meios de armazenagem magnética/óptica. Os técnicos no assunto podem apreciar facilmente como qualquer um dos meios legíveis por computador conhecidos atualmente pode ser utilizado para criar um produto industrializado que compreende gravações das informações de banco de dados do presente.

[00107] “Gravado” indica processo de armazenagem de informações em meio legível por computador utilizando qualquer um desses métodos conhecidos na técnica. Qualquer estrutura de armazenagem de dados conveniente pode ser selecionada, com base nos meios utilizados para acesso às informações armazenadas. Diversos formatos e programas processadores de dados podem ser utilizados para armazenagem, tais como arquivos de processamento de texto, formatos de bancos de dados etc. Os bancos de dados de perfis de expressão de pacientes podem, portanto, ser acessados por usuários, ou seja, os arquivos de bancos de dados são gravados em formato legível para o usuário (por exemplo, formato legível por computador, em que o usuário controla o computador).

[00108] Da forma utilizada no presente, “sistema com base em computador” designa o meio de hardware, meio de software e meio de armazenagem de dados utilizados para analisar as informações de acordo com a presente invenção. O hardware mínimo dos sistemas computadorizados de acordo com a presente invenção compreende uma unidade central de processamento (CPU), meio de entrada, meio de saída e meio de armazenagem de dados. Os técnicos no assunto podem apreciar facilmente que qualquer um dos sistemas computadorizados disponíveis atualmente é apropriado para uso na presente invenção. Os meios de armazenagem de dados podem compreender qualquer artigo industrializado que compreende uma gravação das informações do presente conforme descrito acima ou um meio de acesso a memória que pode ter acesso a esse artigo industrializado.

[00109] Diversos formatos estruturais para os meios de entrada e de saída podem ser utilizados para receber e emitir as informações nos sistemas computadorizados de acordo com a presente invenção, por exemplo, de e para o usuário. Um formato de meio de saída avalia perfis de expressão que possuem graus variados de similaridade com um perfil de expressão de referência. Essa apresentação fornece aos técnicos no assunto avaliação de similaridades e identifica o grau de similaridade contido no perfil de expressão de teste.

[00110] A presente invenção é descrita abaixo em exemplos que se destinam a descrever a presente invenção sem limitar o seu escopo.

[00111] Conforme descrito nos Exemplos abaixo, descobriu-se uma assinatura molecular para prever o desenvolvimento/progressão de rejeição celular aguda de aloenxerto renal. Os dados demonstraram o uso de formação de perfis de mRNA periférico para supervisão e para estratificar os pacientes em risco de fibrose e perda de enxerto, eliminando a necessidade de biópsia de aloenxertos e identificando aqueles que podem beneficiar-se de intervenções iniciais para evitar perda de aloenxerto crônico.

[00112] Nos exemplos abaixo, foram utilizados os materiais e métodos a seguir: EXEMPLO 1:TESTE DE MISEQ 1. Teste específico (conjuntos de sondas com código de barras para painel de nove genes, incluindo um quadro de genes domésticos). 2. Kit de preparação de amostra de RNA Illumina® TruSeq® v2. 3. Kit QIAGEN RNeasy® de extração de RNA total com alta qualidade.

EXPERIMENTOS DE MISEQ

[00113] O RNA total será extraído utilizando o Kit QIAGEN RNeasy®. A biblioteca de sequenciamento será gerada utilizando o Kit de Preparação de Amostras de RNA Illumina® TruSeq® v2, seguindo o protocolo do fabricante: resumidamente, mRNA que contém poliA será purificado e fragmentado em primeiro lugar a partir do RNA total. A síntese de cDNA de primeira fita será realizada utilizando primers de hexâmetros aleatórios e transcriptase reversa, seguida pela síntese de cDNA de segunda fita. Após o processo de reparo das extremidades que converte as sobreposições em extremidades obtusas de cDNAs, diversos adaptadores de indexação serão adicionados ao final do cDNA de fita dupla e realizar-se- á PCR para enriquecer os alvos utilizando os pares de primers específicos para o painel genético e genes domésticos. Por fim, as bibliotecas indexadas serão validadas, normalizadas e reunidas para sequenciamento sobre o sequenciador MiSEQ.

PROCESSAMENTO DE DADOS MISEQ

[00114] Os dados de RNAseq brutos gerados pelo sequenciador MiSEQ serão processados por meio do procedimento a seguir. As leituras com boa qualidade serão alinhadas em primeiro lugar em diversos bancos de dados de referência humanos, incluindo genoma humano hg19, exon, junção de divisão e bancos de dados de contaminação, incluindo sequências de RNA de ribossomos e mitocôndrias utilizando o algoritmo de alinhamento BWA1. Após leituras de filtragem que mapearam o banco de dados de contaminação, as leituras que são alinhadas exclusivamente a, no máximo, duas faltas de coincidência com as regiões de amplicon desejadas (ou seja, produto de PCR dos primers emparelhados) serão contadas como nível de expressão do gene correspondente e adicionalmente submetidas à normalização de quantis ao longo das amostras após transformação log2 utilizando programas estatísticos R.

EXEMPLO 2: TESTE DE NANOCONJUNTOS

[00115] 1. Conjunto de códigos específicos (conjuntos de sondas com código de barras para o quadro com nove genes, incluindo três genes domésticos e controles negativos fornecidos pela Nanostring).

[00116] 2. Kit Master nCounter® que inclui o Cartucho nCounter, Conjunto de Placas nCounter e Conjunto Preparado nCounter.

[00117] 3. Kit QIAGEN RNeasy® de extração de RNA total com alta qualidade.

EXPERIMENTOS NANOSTRING

[00118] RNA total será extraído utilizando o Kit QIAGEN RNeasy® seguindo o protocolo do fabricante. Sondas de códigos de barras serão combinadas com o RNA total em solução a 65 °C com o kit master. A sonda de captura capturará o alvo para ser imobilizado para dados. Após a hibridização, a amostra será transferida para a Estação nCounter Pre, a sonda/alvo será imobilizada no Cartucho nCounter e as sondas são contadas em seguida pelo Analisador Digital nCounter.

ANÁLISE DE ADOS DE TRANSCRIÇÃO DE MRNA

[00119] Os dados de contagem brutos do analisador Nanostring serão processados utilizando o procedimento a seguir: os dados de contagem brutos serão normalizados em primeiro lugar na contagem dos genes domésticos e os mRNAs com contagens abaixo da média mais três desvios padrão das contagens de controles negativos serão retirados por meio de filtragem. Devido à variação de dados decorrente do lote de reagente, a contagem para cada mRNA de diferentes lotes de reagentes será calibrada multiplicando-se um fator da razão da média das contagens das amostras sobre diferentes lotes de reagentes. As contagens calibradas de diferentes bateladas experimentais serão adicionalmente ajustadas no pacote ComBat.

EXEMPLO 3:TESTE DE QPCR

[00120] 1. Recipiente de primer (16 tubos com um teste qPCR por tubo para 12 genes, incluindo o quadro com nove genes e dois genes domésticos (ACTB e GAPDH) e a sonda controle RNA ribossomal 18S). Os testes serão encomendados à LifeTech.

[00121] 2. Mistura Master Universal TaqMan® II: reagentes para reações de qPCR.

[00122] 3. Placa com 96 cavidades conjunto TaqMan® 6x16.

[00123] 4. Kit de síntese de cDNA QPCR Agilent AffinityScript: para conversão com eficiência superior de RNA em cDNA e totalmente otimizada para aplicações de PCR quantitativa (QPCR) em tempo real.

[00124] RNA total será extraído das amostras de biópsia de aloenxerto utilizando o kit Allprep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia CA, Estados Unidos). cDNA será sintetizado utilizando o kit AffinityScript RT com primers oligo dt (Agilent Inc., Santa Clara CA). Testes de qPCR TaqMan para o conjunto com nove genes, dois genes domésticos (ACTB, GAPDH) e 18S serão adquiridos da ABI Life Technology (Grand Island NY). Experimentos com qPCR serão realizados sobre cDNAs utilizando a mistura universal TAQMAN e reações de PCR serão monitoradas e obtidas utilizando um sistema ABI7900HT. As amostras serão medidas em três cópias. Serão gerados valores de tempos de ciclo (CT) para o conjunto genético de previsão, bem como os dois gentes de abrigo. O valor ΔCt de cada gene será computado subtraindo-se o valor CT médio para os genes domésticos do valor CT de cada gene.

EXEMPLO 4: REALIZAÇÃO DO TESTE EM PACIENTES COM TRANSPLANTE POPULAÇÃO DE ESTUDO

[00125] Oitenta pacientes adultos com transplante renal foram estudados utilizando a formação de perfis de expressão genética para determinar a presença de rejeição aguda subclínica na sua biópsia. Os pacientes foram predominantemente homens (80%) com idade média de 49,7, variando de 19 a 75. As raças dos pacientes foram 55% brancos, 22,5% afro-americanos, 11,25% asiáticos e 11,25% hispânicos. Os doadores foram 40% doadores vivos e 60% doadores mortos. A idade média dos doadores foi de 41,5 anos, em faixa de 3 a 75 anos. Trinta por cento dos pacientes receberam bloqueador de receptor anti-IL-2 para indução, 27,5% receberam timoglobulina, 27,5% não receberam indução e 0,5% receberam Campath-1H. Todos os pacientes receberam prednisona, prograf e micofenolato mofetil.

MÉTODOS

[00126] 10 cc de sangue periférico foram retirados de oitenta pacientes com transplante renal pós-transplante e armazenados em um tubo Paxgene. O sangue é armazenado em um refrigerador a 4 °C; se o teste não puder ser realizado imediatamente, o teste pode ser realizado no dia seguinte. Caso o sangue deva ser armazenado por mais tempo, ele deverá ser armazenado a -80 °C.

[00127] O teste MiSEQ foi realizado conforme descrito no Exemplo 1 acima.

ANÁLISE DE PREVISÃO

[00128] Os dados de expressão obtidos por meio do teste MiSEQ são introduzidos no produto de programa de computador para monitorar pacientes que tenham recebido aloenxerto para reação de rejeição aguda (AC) que acompanha o kit. Este produto de programa de computador, quando carregado em um computador, é configurado para empregar um resultado de expressão genética da amostra derivada de cada um dos pacientes para determinar avaliação e fornecer essa avaliação de ACR para os usuários em formato legível por usuário. A avaliação de ACR é baseada em avaliações de probabilidade derivadas de experimentos de referência a partir dos quais foram validadas as faixas de referência de diagnóstico.

[00129] Negativo para ACR: avaliação de probabilidade de ACR abaixo de 0,16.

[00130] Positivo para ACR: avaliação de probabilidade de ACR acima de 0,5.

[00131] Os resultados são exibidos nas Tabelas 1 e 2 anexas ao presente.

[00132] Os resultados a seguir são baseados em quantificação de sete dentre nove genes por meio de teste MiSEQ. Os sete genes são: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.

[00133] Conforme exibido na Tabela 1, dos oitenta pacientes, 28 possuem avaliação de 0,16 ou menos e 18 possuem avaliação de 0,5 ou mais. Trinta e dois pacientes encontram-se na faixa intermediária e, portanto, são considerados indeterminados.

[00134] Comparação com métodos de diagnóstico convencionais, especificamente patologia, demonstra que, na biópsia, apenas um dos 28 pacientes diagnosticados como sem ACR (Grupo 1) por meio de análise de sangue periférico possui alguma evidência de rejeição aguda na biópsia (Tabela). Este paciente possui nefropatia de BK, que causa inflamação na biópsia de outras causas. Pacientes com esse diagnóstico são excessivamente imunossuprimidos e possuem perfil de sangue periférico diferente de ACR. Estes dados demonstram que inflamações de BK podem ser diferenciadas de inflamações de ACR em sangue periférico utilizando o teste do presente. Concluiu-se que quatro dos 18 pacientes com ACR não possuem ACR na biópsia; dois desses pacientes, entretanto, seguiram para ter ACR, de forma que o teste os identificou corretamente como alto risco.

[00135] Dos 32 pacientes que são intermediários (Grupo 2), concluiu-se que onze pacientes possuem biópsias que são suspeitas (n = 7) ou ACR (n = 4).

[00136] Dos 18 pacientes diagnosticados com ACR (Grupo 3), quatro foram diagnosticados como não possuindo ACR, mas dois desses pacientes prosseguiram para ter ACR posteriormente.

[00137] Utilizando uma faixa de referência com base nesses resultados, o teste possui sensibilidade e especificidade de 1 e 0,875, respectivamente, com NPV e PPV de 1 e 0,78, respectivamente.

ADMINISTRAÇÃO DE PACIENTES

[00138] 1. Os pacientes do grupo 1 (avaliação de ACR negativa) continuam com o protocolo padrão de redução da imunossupressão, em que os pacientes são reduzidos para prednisona 5 mg se os pacientes ainda estiverem tomando e o nível alvo de prograf é reduzido para 5-7 mg/dl e micofenolato mofetil.

[00139] 2. Grupo de pacientes 2 (ACR indeterminado): a abordagem será determinada pelo médico responsável. Potenciais abordagens incluem: a. A imunossupressão não será adicionalmente reduzida, os pacientes sofrerão monitoramento contínuo e, se o teste for positivo, eles serão tratados; b. Será realizada biópsia para confirmar ou eliminar a presença de ACR.

[00140] 3. Grupo de pacientes 3 (avaliação de ACR positiva), os pacientes receberão curta administração de alta dose de esteroides, tal como 500 mg de prednisona por três dias. O teste será repetido uma semana após o término dos esteroides para determinar se o perfil de ACR então estará normal. Caso não esteja, pode ser realizada biópsia.

EXEMPLO 5: PRIMERS

[00141] Os pares de primers para os 17 genes são os seguintes:

[00142] A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas realizações específicas descritas no presente. Na verdade, diversas modificações da presente invenção, além das descritas no presente, tornar-se- ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e das figuras anexas. Essas modificações destinam-se a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

[00143] Deve-se compreender ainda que todos os valores são aproximados e fornecidos para descrição. Patentes, pedidos de patente, publicações, descrições de produtos e protocolos são mencionados ao longo de todo o presente pedido, cujas descrições são integralmente incorporadas ao presente como referência para todos os propósitos. TABELA 1 TABELA 2

Claims (3)

1. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM PACIENTE COM ALOENXERTO RENAL em risco de rejeição de aloenxertos, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecimento de uma amostra de sangue do paciente com aloenxerto renal; (b) determinação dos níveis de expressão de um conjunto de assinatura genético previamente selecionado compreendendo os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 em uma amostra de sangue obtida do paciente com aloenxerto renal; (c) comparação dos níveis de expressão dos genes previamente selecionados com os níveis de expressão dos genes previamente selecionados em um controle; e (d) determinação se o paciente encontra-se em risco de rejeição de aloenxerto se o nível de expressão dos genes previamente selecionados no conjunto de assinatura genético da amostra for alterado com relação ao nível de expressão dos mesmos genes previamente selecionados do controle.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela alteração compreender aumento e/ou redução do nível de expressão dos genes do conjunto genético da amostra em comparação com os mesmos um ou mais genes previamente selecionados do conjunto genético do controle.

3. KIT de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, caracterizado por compreender, em um ou mais recipientes separados, pares de primers mostrados nas SEQ IDs N° 1-34 para o conjunto de assinatura previamente selecionado compreendendo pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.