BR112016014953B1 - METHODS FOR RELEASING GROWTH FACTORS - Google Patents

Abstract

MÉTODO S PARA LIBERAR FATORES DE CRESCIMENTO São revelados métodos e sistemas para liberar fatores de crescimento. Em certas realizações, uma amostra de sangue é exposta a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar a liberação de um fator de crescimento na amostra. Em certas realizações, a liberação de fator de crescimento não é seguida de coagulação dentro da amostra de sangue.METHODS FOR RELEASING GROWTH FACTORS Methods and systems for releasing growth factors are disclosed. In certain embodiments, a blood sample is exposed to a sequence of one or more electrical pulses to trigger the release of a growth factor in the sample. In certain embodiments, growth factor release is not followed by clotting within the blood sample.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[001] A matéria revelada no presente documento refere-se, de modo geral à terapia de plaquetas usada em diversas aplicações médicas, como tratamentos para cirurgia ou trauma. Especificamente, as realizações descritas se referem à ativação de plaquetas e à liberação de fator de crescimento em plasma rico em plaquetas.[001] The matter disclosed in this document generally refers to platelet therapy used in various medical applications, such as treatments for surgery or trauma. Specifically, the described embodiments relate to the activation of platelets and the release of growth factor in platelet-rich plasma.

[002] A terapia de plaquetas é um tratamento de cura de feridas usado para muitos tipos de machucados e afecções, como lesões nos nervos, tendinite, osteoartrite, lesão muscular cardíaca e reparo e regeneração óssea. Uma terapia de plaquetas também pode ser usada para acelerar a cura de ferida após cirurgia.[002] Platelet therapy is a wound healing treatment used for many types of injuries and conditions, such as nerve damage, tendonitis, osteoarthritis, cardiac muscle damage, and bone repair and regeneration. Platelet therapy can also be used to speed wound healing after surgery.

[003] Geralmente, um médico pode tirar sangue de um paciente; o sangue é, então, centrifugado para gerar plasma rico em plaquetas (PRP). Para ativação de plaquetas in vivo, o médico pode aplicar o PRP ao local sem adicionar um ativador de plaquetas. A ativação de plaquetas, que inclui a liberação de fator de crescimento e de coagulação, é normalmente induzida pelo colágeno dentro de tecido conectivo. Para a ativação de plaquetas ex vivo, o médico pode disparar a ativação de plaquetas dentro do PRP adicionando um ativador típico, como trombina, e, então, aplicar o PRP ativado ao local.[003] Generally, a doctor can take blood from a patient; the blood is then centrifuged to generate platelet-rich plasma (PRP). For in vivo platelet activation, the doctor can apply PRP to the site without adding a platelet activator. Platelet activation, which includes the release of growth and clotting factors, is normally induced by collagen within connective tissue. For ex vivo platelet activation, the doctor can trigger platelet activation within the PRP by adding a typical activator, such as thrombin, and then apply the activated PRP to the site.

[004] Para tais aplicações ex vivo, a trombina bovina pode ser usada para induzir a ativação de plaquetas. Entretanto, o uso de trombina de base animal pode causar reações alérgicas ou a possível contaminação do PRP com agentes infecciosos. As alternativas à trombina de base animal tendem a ser custosas e ainda podem continuar a causar reações alérgicas.[004] For such ex vivo applications, bovine thrombin can be used to induce platelet activation. However, the use of animal-based thrombin may cause allergic reactions or possible contamination of PRP with infectious agents. Animal-based alternatives to thrombin tend to be expensive and may still cause allergic reactions.

[005] Adicionalmente, existem algumas aplicações de cura de ferida nas quais a liberação de fator de crescimento é desejada, mas a coagulação subsequente não é. Por exemplo, um médico pode desejar injetar uma amostra de PRP com fatores de crescimento liberados no local, que é um tratamento comum para machucados nas juntas. A exposição de uma amostra de PRP a diversos tipos de luz (por exemplo, infravermelho) pode disparar a liberação de fator de crescimento sem a coagulação subsequente. Entretanto, a configuração experimental é complexa, o que pode ser custoso e demorado para instalar em um laboratório. Adicionalmente, o tempo de exposição à luz para uma amostra pode ser longo, o que aumentaria subsequentemente o tempo total do tratamento.[005] Additionally, there are some wound healing applications in which growth factor release is desired, but subsequent coagulation is not. For example, a doctor may want to inject a sample of PRP with released growth factors into the site, which is a common treatment for joint injuries. Exposure of a PRP sample to various types of light (e.g., infrared) can trigger the release of growth factor without subsequent clotting. However, the experimental setup is complex, which can be costly and time-consuming to set up in a laboratory. Additionally, the light exposure time for a sample may be long, which would subsequently increase the total treatment time.

BREVE DESCRIÇÃOBRIEF DESCRIPTION

[006] Certas realizações condizentes com o escopo da invenção originalmente reivindicada são resumidas abaixo. Essas realizações não são destinadas a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas, de preferência, essas realizações são destinadas apenas a fornecer um breve resumo das possíveis formas da invenção. De fato, a invenção pode abranger uma variedade de formas que podem ser similares ou diferentes das realizações estabelecidas abaixo.[006] Certain embodiments consistent with the scope of the originally claimed invention are summarized below. These embodiments are not intended to limit the scope of the claimed invention, but preferably these embodiments are intended only to provide a brief summary of the possible forms of the invention. In fact, the invention may encompass a variety of forms that may be similar to or different from the embodiments set forth below.

[007] Em uma primeira realização, um método para induzir a liberação de difosfato de adenosina (ADP) em uma amostra de sangue inclui expor uma amostra de sangue a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar uma liberação de ADP na amostra de sangue. A liberação de ADP dispara a ativação de plaquetas e a coagulação dentro da amostra de sangue.[007] In a first embodiment, a method for inducing the release of adenosine diphosphate (ADP) in a blood sample includes exposing a blood sample to a sequence of one or more electrical pulses to trigger a release of ADP in the blood sample. blood. The release of ADP triggers platelet activation and clotting within the blood sample.

[008] Em uma segunda realização, um método para liberar fatores de crescimento inclui expor uma amostra de sangue a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar a liberação de um fator de crescimento na amostra de sangue. A liberação de fator de crescimento não é seguida de coagulação dentro da amostra de sangue.[008] In a second embodiment, a method for releasing growth factors includes exposing a blood sample to a sequence of one or more electrical pulses to trigger the release of a growth factor in the blood sample. The release of growth factor is not followed by clotting within the blood sample.

[009] Em uma terceira realização, um método para tratar uma ferida inclui coletar uma amostra de sangue de um paciente. A amostra de sangue é, então, exposta a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar uma liberação de um fator de crescimento na amostra de sangue sem o acompanhamento de coagulação. O fator de crescimento é, então, coletado e usado pra tratar o paciente.[009] In a third embodiment, a method for treating a wound includes collecting a blood sample from a patient. The blood sample is then exposed to a sequence of one or more electrical pulses to trigger a release of a growth factor into the blood sample without accompanying clotting. The growth factor is then collected and used to treat the patient.

[010] Em uma quarta realização, um sistema inclui uma memória legível por computador não transitória que armazena uma ou mais rotinas executáveis pelo processador. As rotinas executáveis pelo processador, quando executadas, podem fazer com que uma sequência de um ou mais pulsos elétricos seja aplicada a uma amostra de sangue. Isso pode fazer disparar uma liberação de difosfato de adenosina (ADP) na amostra de sangue, que, por sua vez, dispara a ativação de plaquetas e a coagulação dentro da amostra de sangue. O sistema também inclui um processador configurado para acessar e executar as um ou mais rotinas executáveis pelo processador armazenadas na memória legível por computador.[010] In a fourth embodiment, a system includes a non-transitory computer-readable memory that stores one or more routines executable by the processor. Processor-executable routines, when executed, may cause a sequence of one or more electrical pulses to be applied to a blood sample. This can trigger a release of adenosine diphosphate (ADP) into the blood sample, which in turn triggers platelet activation and clotting within the blood sample. The system also includes a processor configured to access and execute the one or more processor-executable routines stored in computer-readable memory.

[011] Em uma quinta realização, um sistema inclui uma memória legível por computador não transitória que armazena uma ou mais rotinas executáveis pelo processador. As rotinas executáveis pelo processador, quando executadas, fazem com que uma sequência de um ou mais pulsos elétricos seja aplicada uma amostra de sangue para disparar a liberação de um fator de crescimento na amostra de sangue. A sequência de um ou mais pulsos elétricos não causa coagulação dentro da amostra de sangue coincidente com a liberação do fator de crescimento. O sistema também inclui um processador configurado para acessar e executar as um ou mais rotinas executáveis pelo processador armazenadas na memória legível por computador.[011] In a fifth embodiment, a system includes a non-transitory computer-readable memory that stores one or more routines executable by the processor. The routines executable by the processor, when executed, cause a sequence of one or more electrical pulses to be applied to a blood sample to trigger the release of a growth factor in the blood sample. The sequence of one or more electrical pulses does not cause clotting within the blood sample coincident with the release of the growth factor. The system also includes a processor configured to access and execute the one or more processor-executable routines stored in computer-readable memory.

FIGURASFIGURES

[012] Essas e outras funções, aspectos e vantagens da presente invenção serão mais bem entendidos quando a descrição detalhada a seguir for lida com referência aos desenhos anexos, nos quais caracteres semelhantes representam partes semelhantes ao longo dos desenhos, em que: a Figura 1 é um esquema de um sistema de geração de pulsos, de acordo com uma realização da presente abordagem; a Figura 2 é um fluxograma que ilustra um método para ativação de plaquetas ex vivo, de acordo com uma realização da presente abordagem; a Figura 3 é um fluxograma que ilustra um método para liberação de fator de crescimento ex vivo, de acordo com uma realização da presente abordagem; a Figura 4 é um fluxograma que ilustra um método de liberação de fator de crescimento ex vivo, de acordo com outra realização da presente abordagem; a Figura 5 ilustra uma amostra de plasma rico em plaquetas ativado com o uso de trombina bovina (lado esquerdo) e uma amostra de plasma rico em plaquetas após exposição a pulsos elétricos (lado direito) em que a liberação de fator de crescimento ocorre sem coagulação; a Figura 6 é um gráfico que mostra a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado nas amostras de plasma rico em plaquetas ilustradas na Figura 5 com o uso de diversas abordagens, incluindo abordagens discutidas no presente documento; a Figura 7 retrata duas amostras de plasma rico em plaquetas expostas a campos elétricos pulsados, conforme discutido em relação a certas realizações; e a Figura 8 é um gráfico que mostra a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado nas amostras de plasma rico em plaquetas ilustradas na Figura 7 com o uso de diversas abordagens, incluindo abordagens discutidas no presente documento.[012] These and other functions, aspects and advantages of the present invention will be better understood when the following detailed description is read with reference to the accompanying drawings, in which similar characters represent similar parts throughout the drawings, in which: Figure 1 is a schematic of a pulse generation system, in accordance with an embodiment of the present approach; Figure 2 is a flowchart illustrating a method for activating platelets ex vivo, in accordance with one embodiment of the present approach; Figure 3 is a flowchart illustrating a method for releasing growth factor ex vivo, in accordance with one embodiment of the present approach; Figure 4 is a flow chart illustrating a method of ex vivo growth factor release in accordance with another embodiment of the present approach; Figure 5 illustrates a sample of platelet-rich plasma activated with the use of bovine thrombin (left side) and a sample of platelet-rich plasma after exposure to electrical pulses (right side) in which the release of growth factor occurs without clotting ; Figure 6 is a graph showing the amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released in the platelet-rich plasma samples illustrated in Figure 5 using various approaches, including approaches discussed herein; Figure 7 depicts two samples of platelet-rich plasma exposed to pulsed electric fields, as discussed in connection with certain embodiments; and Figure 8 is a graph showing the amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released in the platelet-rich plasma samples illustrated in Figure 7 using various approaches, including approaches discussed herein.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[013] Uma ou mais realizações específicas da presente matéria serão descritas abaixo. Em uma tentativa de fornecer uma descrição concisa dessas realizações, todos os recursos de uma implantação real podem não ser descritos no relatório descritivo. Deve-se observar que no desenvolvimento de qualquer tal implantação real, como em qualquer projeto de engenharia ou desenho, inúmeras decisões específicas de implantação devem ser realizadas para alcançar os objetivos específicos dos desenvolvedores, tais como, conformidade com as restrições relacionadas ao sistema e relacionadas a negócios, que podem variar de uma implantação para outra. Além disso, deve- se observar que tal esforço de desenvolvimento pode ser complexo e demorado, contudo, é uma tarefa rotineira de projeto, fabricação e produção para as pessoas de habilidade comum que têm o benefício desta revelação.[013] One or more specific realizations of this matter will be described below. In an attempt to provide a concise description of these accomplishments, all features of an actual implementation may not be described in the specification. It should be noted that in the development of any such actual deployment, as in any engineering or design project, numerous deployment-specific decisions must be made to achieve the specific objectives of the developers, such as compliance with system-related and related constraints. to business, which may vary from one deployment to another. Furthermore, it should be noted that such a development effort may be complex and time-consuming, however, it is a routine design, manufacturing and production task for people of ordinary ability who have the benefit of this disclosure.

[014] Ao introduzir os elementos de várias realizações da presente invenção, os artigos “um”, “uma”, “o”, "a", “dito” e "dita" são destinados a significar que existem um ou mais dos elementos. Os termos “que compreende”, “que inclui” e “que tem” são destinados a serem inclusivos e significam que podem existir elementos adicionais, além dos elementos listados.[014] When introducing the elements of various embodiments of the present invention, the articles “a”, “an”, “the”, “a”, “said” and “said” are intended to mean that there are one or more of the elements . The terms “comprising”, “including” and “having” are intended to be inclusive and mean that there may be additional elements in addition to the elements listed.

[015] A ativação e/ou agregação de plaquetas pode ser usada para tratar feridas in vivo e/ou ex vivo. Durante processos convencionais, as plaquetas no sangue são expostas a um composto de ativação de plaquetas, como trombina, que induz tanto a liberação de fatores de crescimento (por exemplo, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)) e coagulação. Para a ativação de plaquetas in vivo, o PRP inativado é aplicado ou injetado ao local do machucado. Tipicamente, o colágeno dentro do tecido conectivo dispara a ativação de plaquetas, a liberação de fator de crescimento e a coagulação. Para a ativação de plaquetas ex vivo, um médico pode tirar sangue de um paciente, e centrifugar a amostra de sangue para produzir uma amostra de plasma rico em plaquetas (PRP). O cloreto de cálcio (CaCl2) e um composto de ativação de plaquetas, como trombina, podem ser adicionados à amostra de PRP para disparar a ativação de plaquetas e formar um gel que é, então, aplicado à ferida. Entretanto, o uso de trombina de base animal na ativação de plaquetas pode causar reações alérgicas ou a possível contaminação da amostra de PRP. Adicionalmente, as alternativas à trombina de base animal tendem a ser custosas e podem continuar a causar reações alérgicas.[015] Platelet activation and/or aggregation can be used to treat wounds in vivo and/or ex vivo. During conventional processes, platelets in the blood are exposed to a platelet-activating compound, such as thrombin, which induces both the release of growth factors (e.g., platelet-derived growth factor (PDGF)) and clotting. To activate platelets in vivo, inactivated PRP is applied or injected to the injury site. Typically, collagen within connective tissue triggers platelet activation, growth factor release, and clotting. For ex vivo platelet activation, a doctor can draw blood from a patient, and centrifuge the blood sample to produce a platelet-rich plasma (PRP) sample. Calcium chloride (CaCl2) and a platelet-activating compound such as thrombin can be added to the PRP sample to trigger platelet activation and form a gel that is then applied to the wound. However, the use of animal-based thrombin to activate platelets may cause allergic reactions or possible contamination of the PRP sample. Additionally, animal-based alternatives to thrombin tend to be costly and may continue to cause allergic reactions.

[016] As presentes realizações se referem à ativação de plaquetas ex vivo e à liberação de fator de crescimento, incluindo abordagens para liberar o fator de crescimento sem causar eventos de coagulação tipicamente associados à ativação de plaquetas. As aplicações específicas de cura de ferida podem envolver tratar amostras de sangue, incluindo amostras de PRP, para liberar os fatores de crescimento sem coagulação. Os métodos para a ativação de plaquetas ex vivo discutidos no presente documento podem incluir expor uma amostra de sangue, como uma amostra de PRP, a pulsos elétricos para disparar a ativação de plaquetas. A liberação de difosfato de adenosina (ADP) pode ser observada como parte da liberação de ativação de plaquetas em resposta a campos elétricos pulsados em certas implantações. Os métodos para liberação de fator de crescimento ex vivo podem, ou não, envolver elementos químicos que são adicionados à amostra de sangue antes do estímulo elétrico, conforme discutido no presente documento.[016] The present embodiments relate to ex vivo platelet activation and growth factor release, including approaches to release growth factor without causing clotting events typically associated with platelet activation. Specific wound healing applications may involve treating blood samples, including PRP samples, to release growth factors without clotting. Methods for ex vivo platelet activation discussed herein may include exposing a blood sample, such as a PRP sample, to electrical pulses to trigger platelet activation. Release of adenosine diphosphate (ADP) can be observed as part of platelet activation release in response to pulsed electrical fields in certain implantations. Methods for ex vivo growth factor release may or may not involve chemical elements that are added to the blood sample prior to electrical stimulation, as discussed in this document.

[017] Com o supracitado em mente, a Figura 1 mostra esquematicamente um sistema de geração de pulsos 10 para a ativação de plaquetas ex vivo e a liberação de fator de crescimento. O sistema 10 pode incluir o conjunto de circuitos de geração de pulso 12 e os conjuntos de eletrodos (ou matrizes de eletrodos) 14 e 16. Na realização retratada, os eletrodos 14 e 16 estão separados em lados opostos de uma cubeta 18. Ou seja, a cubeta 18 está disposta entre os eletrodos e os eletrodos 14 e 16 estão acoplados ao conjunto de circuitos de geração de pulso por meio dos contatos 20. A cubeta 18 é configurada para manter uma amostra 22 que contém as plaquetas. Em certas realizações, a cubeta 18 pode ser deslocável e removível de um retentor de amostra 24 que inclui os eletrodos 14 e 16. Consequentemente, a inserção da cubeta 18 e o contato dos eletrodos 14 e 16 com os contatos 20 permite que o conjunto de circuitos de geração de pulso produza um pulso elétrico, e que a amostra 22 dentro da cubeta 18 seja exposta aos pulsos. Conforme será observado, a cubeta 18 é meramente um exemplo de um recipiente de amostras, e qualquer recipiente adequado configurado para manter a amostra 22, fazer contato com os eletrodos 14 e 16 e conduzir os pulsos elétricos pode ser usado em conjunto com o sistema 10. O espaçamento entre os eletrodos 14 e 16 pode influenciar a resistência do campo elétrico de pulso, que é definido como a razão entre a voltagem aplicada e a distância de lacuna da cubeta. Por exemplo, expor uma cubeta de 1 cm de largura a um pulso de 1 kV produz uma força de campo de 1 kV/cm.[017] With the above in mind, Figure 1 schematically shows a pulse generation system 10 for ex vivo platelet activation and growth factor release. System 10 may include pulse generating circuitry 12 and electrode arrays (or electrode arrays) 14 and 16. In the depicted embodiment, electrodes 14 and 16 are separated on opposite sides of a cuvette 18. That is, , the cuvette 18 is disposed between the electrodes and the electrodes 14 and 16 are coupled to the pulse generation circuitry via contacts 20. The cuvette 18 is configured to hold a sample 22 that contains the platelets. In certain embodiments, cuvette 18 may be displaceable and removable from a sample holder 24 that includes electrodes 14 and 16. Consequently, insertion of cuvette 18 and contact of electrodes 14 and 16 with contacts 20 allows the assembly of pulse generation circuits produce an electrical pulse, and that the sample 22 within the cuvette 18 is exposed to the pulses. As will be noted, cuvette 18 is merely an example of a sample container, and any suitable container configured to hold sample 22, contact electrodes 14 and 16, and conduct electrical pulses can be used in conjunction with system 10. The spacing between electrodes 14 and 16 can influence the resistance of the pulse electric field, which is defined as the ratio between the applied voltage and the cuvette gap distance. For example, exposing a 1 cm wide cuvette to a 1 kV pulse produces a field strength of 1 kV/cm.

[018] Em certas realizações, o sistema pode incluir o controle adequado e o conjunto de circuitos de entrada e pode ser implantado em um alojamento dedicado ou pode ser acoplado a um computador ou outro sistema de controle com base em processador. O sistema 10 pode incluir ou se comunicar com um processador 26 que controla o conjunto de circuitos de geração de pulso 12. Os componentes adicionais do sistema 10 podem incluir uma memória 28 que armazena instruções que são executadas pelo processador 26. Tais instruções podem incluir protocolos e/ou parâmetros para os pulsos elétricos gerados pelo conjunto de circuitos de geração de pulso 12. O processador 26 pode incluir, por exemplo, microprocessadores de único chip ou múltiplos chips para uso geral. Além disso, o processador 26 pode ser qualquer processador convencional para propósitos especiais, tal como um processador ou circuitos de aplicação específica. A memória 28 pode ser qualquer meio legível por computador não transitório adequado como uma memória de acesso aleatório, um dispositivo de armazenamento em massa, um dispositivo de memória FLASH ou uma memória removível. Em adição, um visor 30 pode fornecer indicações a um operador relacionadas à operação do sistema 10. O sistema 10 pode incluir um dispositivo de entrada do usuário 32 (por exemplo, um teclado, um mouse, uma tela sensível ao toque, bola de rastreamento, dispositivo portátil como PDA ou smartphone ou qualquer combinação dos mesmos) para a ativação do conjunto de circuitos de geração de pulso 12 e/ou seleção dos parâmetros apropriados.[018] In certain embodiments, the system may include suitable control and input circuitry and may be deployed in a dedicated housing or may be coupled to a computer or other processor-based control system. The system 10 may include or communicate with a processor 26 that controls the pulse generating circuitry 12. Additional components of the system 10 may include a memory 28 that stores instructions that are executed by the processor 26. Such instructions may include protocols and/or parameters for the electrical pulses generated by the pulse generating circuitry 12. The processor 26 may include, for example, single-chip or multi-chip general purpose microprocessors. Furthermore, the processor 26 may be any conventional special-purpose processor, such as an application-specific processor or circuitry. Memory 28 may be any suitable non-transitory computer-readable medium such as a random access memory, a mass storage device, a FLASH memory device, or a removable memory. In addition, a display 30 may provide indications to an operator relating to the operation of the system 10. The system 10 may include a user input device 32 (e.g., a keyboard, a mouse, a touch screen, tracking ball , portable device such as PDA or smartphone or any combination thereof) for activating the pulse generation circuitry 12 and/or selecting appropriate parameters.

[019] O sistema de geração de pulsos 10 conforme fornecido no presente documento pode ser implantado como um dispositivo para propósito único para a ativação de plaquetas ou como um dispositivo para múltiplos propósitos que pode ser usado para outras aplicações de exposição de campo elétrico, como eletroporação, além da ativação de plaquetas, conforme discutido no presente documento. Adicionalmente, o sistema 10 pode ser configurado para gerar um pulso elétrico de acordo com um ou mais protocolos. Os protocolos podem ser gerados por entrada de usuário e/ou podem ser armazenados na memória 28 para serem selecionados pelo usuário. Em uma realização, o conjunto de circuitos de geração de pulso 12 pode operar sob o controle do processador 26 para implantar o protocolo que especifica a força de campo elétrico predeterminada, o comprimento de pulso e/ou o tempo de exposição total. Tal protocolo pode ser determinado por estudos empíricos ou teóricos. Em outras realizações, o sistema 10 pode ser configurado para receber uma entrada de usuário relacionada à força de campo elétrico, ao comprimento de pulso e/ou ao tempo de exposição total, isto é, o usuário pode especificar um ou mais desses parâmetros operacionais. Adicionalmente, o sistema 10 pode ser configurado para gerar um formato de pulso particular ou para gerar uma série de pulsos que podem diferir um do outro de acordo com uma entrada de usuário e/ou uma definição de protocolo armazenada.[019] The pulse generation system 10 as provided herein can be deployed as a single-purpose device for activating platelets or as a multi-purpose device that can be used for other electric field exposure applications, such as electroporation, in addition to platelet activation, as discussed in this document. Additionally, system 10 can be configured to generate an electrical pulse according to one or more protocols. Protocols may be generated by user input and/or may be stored in memory 28 for selection by the user. In one embodiment, the pulse generation circuitry 12 may operate under the control of the processor 26 to implement the protocol that specifies the predetermined electric field strength, pulse length, and/or total exposure time. Such a protocol can be determined by empirical or theoretical studies. In other embodiments, system 10 may be configured to receive user input relating to electric field strength, pulse length, and/or total exposure time, i.e., the user may specify one or more of these operating parameters. Additionally, system 10 may be configured to generate a particular pulse shape or to generate a series of pulses that may differ from one another according to a user input and/or a stored protocol definition.

[020] Em certas realizações, um pulso gerado pelo sistema 10 pode ter uma duração de cerca de 1 nanossegundo a cerca de 100 microssegundos, e uma força de campo elétrico de cerca de 0,1 kV/cm a cerca de 350 kV/cm, dependendo da aplicação. Conforme mencionado acima, a força de campo elétrico do pulso é a voltagem aplicada dividida pela distância entre os eletrodos 14 e 16. Embora os pulsos gerados pelo sistema 10 tenham uma força de campo elétrico de pelo menos 0,1 kV/cm, os mesmos não podem exceder o campo de interrupção da suspensão que inclui as células.[020] In certain embodiments, a pulse generated by system 10 may have a duration of about 1 nanosecond to about 100 microseconds, and an electric field strength of about 0.1 kV/cm to about 350 kV/cm , depending on the application. As mentioned above, the electric field strength of the pulse is the applied voltage divided by the distance between electrodes 14 and 16. Although the pulses generated by system 10 have an electric field strength of at least 0.1 kV/cm, the same cannot exceed the suspend break field that includes the cells.

[021] Em algumas realizações, o sistema de geração de pulsos 10 pode incluir funcionalidade de detecção. Ou seja, o sistema de geração de pulsos 10 pode ser configurado para expor a amostra 22 a um sinal de detecção, que pode ser um pulso elétrico com uma força de campo elétrico abaixo daquela dos pulsos elétricos usados para a ativação de plaquetas. O sistema de geração de pulsos 10 pode, conforme retratado na Figura 1, incluir o conjunto de circuitos de detecção de corrente 34, que pode adquirir e/ou processar o sinal de detecção para estimar algumas das propriedades elétricas da amostra 22, que incluem, mas não se limitam à condutividade e permissividade. O conjunto de circuitos de detecção de corrente 34 pode estar acoplado ao processador 26, que pode controlar a geração e o processamento do sinal de detecção e, em algumas realizações, pode realizar uma porção do processamento. Em outras realizações, o conjunto de circuitos de detecção de corrente 34 pode incluir um processador dedicado para controlar o processamento do sinal de detecção e pode se comunicar com o processador 26 para relatar os resultados. Alternativamente, o conjunto de circuitos de detecção de corrente 34 pode ser integral com o conjunto de circuitos de geração de pulso 12. Ainda em outras realizações, o processamento do sinal de detecção pode ser realizado por um processador dedicado, conforme descrito acima, ou pelo processador 26.[021] In some embodiments, the pulse generation system 10 may include detection functionality. That is, the pulse generation system 10 may be configured to expose the sample 22 to a detection signal, which may be an electrical pulse with an electric field strength below that of the electrical pulses used for platelet activation. The pulse generating system 10 may, as depicted in Figure 1, include the current sensing circuitry 34, which may acquire and/or process the sensing signal to estimate some of the electrical properties of the sample 22, which include, but they are not limited to conductivity and permittivity. The current detection circuitry 34 may be coupled to the processor 26, which may control the generation and processing of the detection signal and, in some embodiments, may perform a portion of the processing. In other embodiments, the current detection circuitry 34 may include a dedicated processor for controlling the processing of the detection signal and may communicate with the processor 26 to report the results. Alternatively, the current sensing circuitry 34 may be integral with the pulse generating circuitry 12. In still other embodiments, processing of the sensing signal may be performed by a dedicated processor, as described above, or by the processor 26.

[022] Um método 40 para tratar um machucado com o uso da ativação de plaquetas ex vivo, conforme ilustrado na Figura 2, pode ser usado em conjunto com o sistema 10. Deve ser entendido que certas etapas do método 40 podem ser realizadas por um operador enquanto outras etapas do método podem ser realizadas pelo sistema 10. Na etapa 42, um funcionário (por exemplo, um médico ou enfermeiro) tira sangue de um paciente. Em certas realizações, o sangue tirado pode ser processado para gerar uma amostra de PRP na etapa 44. Várias técnicas adequadas para separação de plaquetas, como centrifugação ou filtragem, podem ser usadas para gerar a amostra de PRP. Em tais realizações, as etapas 46 a 54 podem ser realizadas com o uso da amostra de PRP. Alternativamente, a etapa 44 pode ser omitida, e o restante das etapas no método 40 pode ser realizado com o uso de uma amostra de sangue total. Na implantação retratada, é adicionado CaCl2 à amostra na etapa 46, antes da exposição a um ou mais pulsos por meio do sistema 10 durante a etapa 48. Adicionar CaCl2 à amostra aumenta a probabilidade e a quantidade de mobilização de cálcio entre as plaquetas, que facilita a ativação de plaquetas. O estímulo elétrico da etapa 48 dispara a liberação de ADP dentro da amostra na etapa 50 que, então, em conjunto com o CaCl2, dispara a ativação de plaquetas na etapa 52. Na etapa 54, a amostra com plaquetas ativadas pode, então, ser aplicada ao local do machucado no paciente.[022] A method 40 for treating a wound using ex vivo platelet activation, as illustrated in Figure 2, can be used in conjunction with system 10. It should be understood that certain steps of method 40 can be performed by a operator while other steps of the method may be performed by system 10. In step 42, an employee (e.g., a doctor or nurse) draws blood from a patient. In certain embodiments, the drawn blood may be processed to generate a PRP sample in step 44. Various techniques suitable for platelet separation, such as centrifugation or filtration, may be used to generate the PRP sample. In such embodiments, steps 46 to 54 can be performed using the PRP sample. Alternatively, step 44 can be omitted, and the remainder of the steps in method 40 can be performed using a whole blood sample. In the implantation pictured, CaCl2 is added to the sample in step 46, prior to exposure to one or more pulses through system 10 during step 48. Adding CaCl2 to the sample increases the likelihood and amount of calcium mobilization between platelets, which facilitates platelet activation. The electrical stimulus from step 48 triggers the release of ADP into the sample at step 50 which then, in conjunction with CaCl2, triggers platelet activation at step 52. At step 54, the sample with activated platelets can then be applied to the site of the patient's injury.

[023] Conforme mencionado acima, a ativação de plaquetas é um processo que, em certas abordagens de ativação, envolve tanto a liberação de fator de crescimento quanto a coagulação. Entretanto, em certas situações, pode ser desejável evitar a atividade de coagulação, caso possível. Conforme discutido acima, isso pode ser conseguido com o uso dos campos elétricos pulsados conforme discutido no presente documento.[023] As mentioned above, platelet activation is a process that, in certain activation approaches, involves both the release of growth factor and coagulation. However, in certain situations, it may be desirable to avoid clotting activity if possible. As discussed above, this can be achieved using pulsed electric fields as discussed in this document.

[024] Por exemplo, voltando-se para a Figura 3, um método 60 é descrito para disparar a liberação de fator de crescimento sem coagulação. O método 60 usa pulsos elétricos, similares ao método de ativação de plaquetas 40, e como tal, pode ser realizado em parte pelo sistema 10. Na etapa 62, o funcionário tira sangue de um paciente. Em certas realizações, a amostra de sangue da etapa 62 pode ser processada para gerar uma amostra de PRP na etapa 64, conforme observado acima. Em outras realizações, conforme mencionado acima, as etapas 66 a 70 do método 60 podem ser realizadas com o uso de uma amostra de sangue total. Na etapa 66, a amostra é exposta a um ou mais pulsos por meio do sistema 10, que dispara a liberação de fatores de crescimento na etapa 68. Nesse exemplo, não é adicionado CaCl2 antes ou durante a exposição aos campos elétricos pulsados. Os fatores de crescimento liberados podem ser, então, coletados e armazenados na etapa 70.[024] For example, turning to Figure 3, a method 60 is described for triggering the release of growth factor without clotting. Method 60 uses electrical pulses, similar to platelet activation method 40, and as such, may be performed in part by system 10. In step 62, the employee draws blood from a patient. In certain embodiments, the blood sample from step 62 may be processed to generate a PRP sample in step 64, as noted above. In other embodiments, as mentioned above, steps 66 to 70 of method 60 can be performed using a whole blood sample. In step 66, the sample is exposed to one or more pulses through system 10, which triggers the release of growth factors in step 68. In this example, CaCl2 is not added before or during exposure to the pulsed electric fields. The released growth factors can then be collected and stored in step 70.

[025] Conforme descrito, o método 60 é similar ao método 40, com exceção da adição de CaCl2 à amostra antes do estímulo elétrico. Entretanto, essa distinção produz um resultado diferente em que, embora fatores de crescimento continuem a ser liberados, nenhuma coagulação ocorre na amostra. Como resultado, a cubeta 18 contém apenas e poucos fatores de crescimento liberados após a execução do protocolo.[025] As described, method 60 is similar to method 40, with the exception of the addition of CaCl2 to the sample before the electrical stimulus. However, this distinction produces a different result in that although growth factors continue to be released, no clotting occurs in the sample. As a result, cuvette 18 contains only a few growth factors released after running the protocol.

[026] A Figura 4 ilustra um método alternativo 80 para disparar a liberação de fator de crescimento sem coagulação. O funcionário tira sangue de um paciente na etapa 82, que pode, então, ser processado para gerar uma amostra de PRP na etapa 84. Alternativamente, as etapas 86 a 92 do método 80 podem ser realizadas com o uso de uma amostra de sangue total. O CaCl2 e um elemento químico de bloqueio de ADP (por exemplo, apirase) são, então, adicionados à amostra na etapa 86. Na etapa 88, a amostra é exposta a um ou mais pulsos elétricos por meio do sistema 10, que dispara a liberação de fatores de crescimento na etapa 90. Os fatores de crescimento liberados são, então, coletados e armazenados na etapa 92. Nesse exemplo, o elemento químico de bloqueio de ADP atua para ligar qualquer ADP liberado devido à presença do CaCl2 na amostra, e nenhuma coagulação é observada.[026] Figure 4 illustrates an alternative method 80 to trigger the release of growth factor without clotting. The employee draws blood from a patient in step 82, which can then be processed to generate a PRP sample in step 84. Alternatively, steps 86 to 92 of method 80 can be performed using a whole blood sample. . CaCl2 and an ADP-blocking chemical (e.g., apyrase) are then added to the sample in step 86. In step 88, the sample is exposed to one or more electrical pulses via system 10, which triggers the release of growth factors in step 90. The released growth factors are then collected and stored in step 92. In this example, the ADP blocking chemical acts to bind any ADP released due to the presence of CaCl2 in the sample, and no clotting is observed.

EXEMPLOSEXAMPLES AMOSTRAS DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS COM E SEM CLORETO DE CÁLCIO E ADIÇÃO DE BLOQUEADOR DE ADP ANTES DO ESTÍMULO ELÉTRICOPLATELET-RICH PLASMA SAMPLES WITH AND WITHOUT CALCIUM CHLORIDE AND ADDITION OF ADP BLOCKER BEFORE ELECTRICAL STIMULUS

[027] Com a discussão supracitada em mente, a Figura 5 ilustra duas amostras de 3,7x de concentração de plasma rico em plaquetas (PRP). A Figura 5 ilustra uma amostra de plasma rico em plaquetas ativado com o uso de trombina bovina (lado esquerdo), em que a ativação de plaquetas é acompanhada pela liberação de fator de crescimento com coagulação, conforme indicado pelo PRP que não flui para o fundo do tubo. Por outro lado, mostrado à direita, uma amostra de plasma rico em plaquetas após a exposição a pulsos elétricos (conforme discutido no presente documento) é retratada, em que a liberação de fator de crescimento ocorre sem coagulação, conforme mostrado pelo PRP que flui para o fundo do tubo. O cloreto de cálcio e a apirase, um elemento químico de bloqueio de difosfato de adenosina (ADP), foram adicionados à amostra de PRP no tubo na direita antes do estímulo de pulso elétrico. O cloreto de cálcio e a apirase foram adicionados antes da ativação de plaquetas com o uso de trombina bovina na amostra à esquerda.[027] With the aforementioned discussion in mind, Figure 5 illustrates two samples of 3.7x concentration of platelet-rich plasma (PRP). Figure 5 illustrates a sample of platelet-rich plasma activated using bovine thrombin (left side), in which platelet activation is accompanied by the release of clotting growth factor, as indicated by PRP that does not flow to the bottom. of the tube. Conversely, shown on the right, a platelet-rich plasma sample following exposure to electrical pulses (as discussed herein) is depicted, in which growth factor release occurs without clotting, as shown by PRP flowing into the bottom of the tube. Calcium chloride and apyrase, an adenosine diphosphate (ADP) blocking chemical, were added to the PRP sample in the tube on the right before electrical pulse stimulation. Calcium chloride and apyrase were added prior to platelet activation using bovine thrombin in the sample on the left.

[028] Conforme ilustrado, e conforme observado acima, a amostra ativada com o uso de trombina bovina permanece, de modo geral, na ponta do tubo, o que indica que a mesma coagulou. Dessa forma, conforme pode ser entendido a partir desse estudo, o bloqueio de ADP não afeta a cascata de coagulação quando a trombina for usada para ativação, o que, dessa forma, resulta na coagulação. Por outro lado, a amostra à direita não demonstra a coagulação observada na outra amostra, e, assim, flui mais livremente em direção ao fundo do tubo. Em vista desses resultados, acredita- se que o elemento químico de bloqueio de ADP atue para bloquear o ADP liberado da amostra quando exposto tanto ao cloreto de cálcio quanto a pulsos elétricos. Com o ADP bloqueado, nenhuma coagulação é observada mesmo na presença de CaCl2. Conforme retratado, essa é uma diferença impactante em relação ao caso no qual a trombina bovina é usada, o que leva à conclusão de que o bloqueio de ADP afeta, de fato, a cascata de coagulação quando o estímulo elétrico for utilizado. Dessa forma, a amostra na direita corresponde a uma amostra preparada de acordo com o método 80 da Figura 4.[028] As illustrated, and as noted above, the sample activated with the use of bovine thrombin generally remains at the tip of the tube, which indicates that it has clotted. Therefore, as can be understood from this study, ADP blockade does not affect the coagulation cascade when thrombin is used for activation, which thus results in clotting. On the other hand, the sample on the right does not demonstrate the coagulation observed in the other sample, and thus flows more freely toward the bottom of the tube. In view of these results, it is believed that the ADP-blocking chemical acts to block ADP released from the sample when exposed to both calcium chloride and electrical pulses. With ADP blocked, no clotting is observed even in the presence of CaCl2. As depicted, this is a striking difference in relation to the case in which bovine thrombin is used, which leads to the conclusion that ADP blockade does, in fact, affect the coagulation cascade when electrical stimulation is used. Therefore, the sample on the right corresponds to a sample prepared according to method 80 in Figure 4.

[029] A Figura 6 compara a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberada pra amostras de PRP que não estão ativadas, amostras de PRP com cloreto de cálcio e apirase adicionada e que são ativadas com trombina bovina, e amostras de PRP com cloreto de cálcio e apirase adicionada e que são expostas a pulsos elétricos. A coagulação ocorre na amostra de PRP ativada com trombina bovina, mas não ocorre na amostra de PRP exposta a pulsos elétricos. Em particular, a Figura 6 é um gráfico que mostra a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado nas amostras de plasma rico em plaquetas ilustradas na Figura 5 com o uso de diversas abordagens, incluindo abordagens discutidas no presente documento. Conforme mostrado, campos elétricos pulsados podem liberar fatores de crescimento provenientes de plaquetas sem coagulação. Adicionalmente, uma quantidade de PDGF liberada na amostra de PRP exposta a pulsos elétricos é comparável a uma quantidade de PDGF liberada na amostra de PRP ativada com trombina bovina. Conforme observado acima, nenhuma coagulação ocorre na amostra de PRP exposta a pulsos elétricos.[029] Figure 6 compares the amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released for PRP samples that are not activated, PRP samples with calcium chloride and apyrase added and that are activated with bovine thrombin, and samples of PRP with calcium chloride and apyrase added and exposed to electrical pulses. Coagulation occurs in the PRP sample activated with bovine thrombin, but does not occur in the PRP sample exposed to electrical pulses. In particular, Figure 6 is a graph showing the amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released in the platelet-rich plasma samples illustrated in Figure 5 using various approaches, including approaches discussed herein. As shown, pulsed electric fields can release growth factors from nonclotting platelets. Additionally, the amount of PDGF released in the PRP sample exposed to electrical pulses is comparable to the amount of PDGF released in the PRP sample activated with bovine thrombin. As noted above, no coagulation occurs in the PRP sample exposed to electrical pulses.

AMOSTRAS DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS COM E SEM ADIÇÃO DE CLORETO DE CÁLCIO ANTES DO ESTÍMULO ELÉTRICOPLATELET-RICH PLASMA SAMPLES WITH AND WITHOUT ADDITION OF CALCIUM CHLORIDE BEFORE ELECTRICAL STIMULUS

[030] Duas amostras de 3,7x de concentração de PRP foram expostas a pulsos elétricos. Os tubos de amostra resultantes são mostrados na Figura 7 Em particular, a Figura 7 retrata duas amostras de plasma rico em plaquetas exposto a campos elétricos pulsados (sob as mesmas condições elétricas). A amostra à direita foi totalmente ativada com a coagulação, conforme demonstrado pela PRP que não flui para o fundo do tubo, e pela liberação de fator de crescimento. A amostra à esquerda não coagula, conforme mostrado pelo PRP que flui para o fundo do tubo; entretanto, a liberação de fator de crescimento continua a ocorrer, conforme exemplificado pelos dados na Figura 8 (discutido abaixo).[030] Two samples of 3.7x PRP concentration were exposed to electrical pulses. The resulting sample tubes are shown in Figure 7. In particular, Figure 7 depicts two samples of platelet-rich plasma exposed to pulsed electric fields (under the same electrical conditions). The sample on the right was fully activated with clotting, as demonstrated by PRP not flowing to the bottom of the tube, and the release of growth factor. The sample on the left does not clot, as shown by the PRP flowing to the bottom of the tube; however, growth factor release continues to occur, as exemplified by the data in Figure 8 (discussed below).

[031] O cloreto de cálcio foi adicionado à amostra de PRP no tubo à direita antes do estímulo elétrico, mas não à amostra à esquerda. Ou seja, a amostra à direita foi tratada de acordo com o método 40 da Figura 2, enquanto a amostra à esquerda foi tratada de acordo com o método 60 da Figura 3. Conforme ilustrado, a amostra no tubo no lado direito esta coagulada e permanece na ponta do tubo, mesmo quando invertido. Por outro lado, a amostra à esquerda não coagulou e flui para baixo em relação à ponta do tubo quando invertido.[031] Calcium chloride was added to the PRP sample in the tube on the right before electrical stimulation, but not to the sample on the left. That is, the sample on the right was treated according to method 40 of Figure 2, while the sample on the left was treated according to method 60 of Figure 3. As illustrated, the sample in the tube on the right side is clotted and remains at the end of the tube, even when inverted. On the other hand, the sample on the left did not clot and flowed downward relative to the tip of the tube when inverted.

[032] A Figura 8 retrata um gráfico que compara uma quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado para amostras de PRP não exposta a pulsos elétricos, amostras de PRP expostas a campos elétricos pulsados sem cloreto de cálcio, e amostras de PRP expostas a campos elétricos pulsados na presença de cloreto de cálcio. A coagulação ocorre na amostra de PRP que contém cloreto de cálcio, mas não ocorre na amostra de PRP sem cloreto de cálcio e exposta a pulsos elétricos. Em particular, a Figura 8 é um gráfico que mostra a quantidade de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) liberado nas amostras de plasma rico em plaquetas ilustradas na Figura 7 com o uso de diversas abordagens, incluindo abordagens discutidas no presente documento. Esse gráfico mostra que o fator de crescimento pode ser liberado com ou sem coagulação. A quantidade de PDGF liberado na amostra de PRP sem cloreto de cálcio é comparável a uma quantidade de PDGF liberada na amostra de PRP com cloreto de cálcio. Adicionalmente, nenhuma coagulação ocorre na amostra de PRP sem cloreto de cálcio.[032] Figure 8 depicts a graph that compares an amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released for PRP samples not exposed to electrical pulses, PRP samples exposed to pulsed electrical fields without calcium chloride, and samples of PRP exposed to pulsed electric fields in the presence of calcium chloride. Coagulation occurs in the PRP sample containing calcium chloride, but does not occur in the PRP sample without calcium chloride and exposed to electrical pulses. In particular, Figure 8 is a graph showing the amount of platelet-derived growth factor (PDGF) released in the platelet-rich plasma samples illustrated in Figure 7 using various approaches, including approaches discussed herein. This graph shows that the growth factor can be released with or without clotting. The amount of PDGF released in the PRP sample without calcium chloride is comparable to the amount of PDGF released in the PRP sample with calcium chloride. Additionally, no clotting occurs in the PRP sample without calcium chloride.

[033] Uma ou mais realizações reveladas, sozinha ou em combinação, pode fornecer um ou mais efeitos técnicos úteis para técnicas médicas para a ativação de plaquetas ex vivo e a liberação de fator de crescimento. A presente técnica para a ativação de plaquetas ex vivo usa estímulo elétrico para liberar fatores de crescimento, como fatores de crescimento derivados de plaquetas. Certas realizações podem permitir que operadores extraiam fatores de crescimento de plaquetas sem induzir coagulação. Adicionalmente, as presentes técnicas para liberação de fator de crescimento ex vivo podem ser realizadas em parte com o uso de equipamento médico já presentes em muitos laboratórios médicos. Os efeitos técnicos e problemas técnicos descritos no relatório descritivo são fornecidos apenas como exemplos e não estão destinados a serem limitantes. Deve-se observar que as realizações descritas no relatório descritivo podem ter outros efeitos técnicos e que podem solucionar outros problemas técnicos.[033] One or more disclosed embodiments, alone or in combination, may provide one or more technical effects useful for medical techniques for ex vivo platelet activation and growth factor release. The present technique for ex vivo platelet activation uses electrical stimulation to release growth factors, such as platelet-derived growth factors. Certain embodiments may allow operators to extract growth factors from platelets without inducing clotting. Additionally, the present techniques for ex vivo growth factor release can be carried out in part with the use of medical equipment already present in many medical laboratories. The technical effects and technical problems described in the specification are provided as examples only and are not intended to be limiting. It should be noted that the achievements described in the specification may have other technical effects and may solve other technical problems.

[034] Embora apenas certos recursos da invenção tenham sido ilustrados e descritos no presente documento, muitas modificações e mudanças ocorrerão àqueles versados na técnica. Por esse motivo, deve ser entendido que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e mudanças que estiverem dentro do espírito verdadeiro da invenção. Algumas das realizações podem ser usadas para a ativação fluxos de trabalho de plaquetas in vivo. Pode ser disparada a liberação de fator de crescimento em PRP por estímulo elétrico, sem coagulação, e injetado esse PRP no local do machucado. Os fatores de crescimento liberados dessa forma podem ser usados para a cura de ferida no local do machucado. Adicionalmente, em certas realizações, as plaquetas também podem ser completamente ativadas pelo colágeno dentro do tecido conectivo.[034] Although only certain features of the invention have been illustrated and described herein, many modifications and changes will occur to those skilled in the art. For this reason, it is to be understood that the appended claims are intended to cover all such modifications and changes which are within the true spirit of the invention. Some of the realizations can be used for platelet activation workflows in vivo. The release of growth factor in PRP can be triggered by electrical stimulation, without coagulation, and this PRP can be injected at the site of the injury. The growth factors released in this way can be used to heal wounds at the site of the injury. Additionally, in certain embodiments, platelets can also be fully activated by collagen within the connective tissue.

Claims (6)

1. MÉTODO (60) PARA LIBERAR FATORES DE CRESCIMENTO, caracterizado por compreender: expor (66) uma amostra de sangue (22) a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar (68) a liberação dos fatores de crescimento na amostra de sangue, em que o um ou mais pulsos elétricos têm uma força de campo elétrico entre 0,1 kV/cm e 350 kV/cm e durações de pulso entre 1 nanossegundo e 100 microssegundos; em que cloreto de cálcio (CaCl2) não é adicionado à amostra de sangue (22) antes de expor (66) a amostra de sangue (22) à sequência de um ou mais pulsos elétricos, em que a liberação de fatores de crescimento não é acompanhada de coagulação dentro da amostra de sangue (22); o método compreendendo ainda coletar (70) os fatores de crescimento liberados.1. METHOD (60) FOR RELEASING GROWTH FACTORS, characterized by comprising: exposing (66) a blood sample (22) to a sequence of one or more electrical pulses to trigger (68) the release of growth factors in the blood sample blood, wherein the one or more electrical pulses have an electric field strength between 0.1 kV/cm and 350 kV/cm and pulse durations between 1 nanosecond and 100 microseconds; wherein calcium chloride (CaCl2) is not added to the blood sample (22) before exposing (66) the blood sample (22) to the sequence of one or more electrical pulses, wherein the release of growth factors is not accompanied by clotting within the blood sample (22); the method further comprising collecting (70) the released growth factors. 2. MÉTODO (80) PARA LIBERAR FATORES DE CRESCIMENTO, caracterizado por compreender: adicionar (86) cloreto de cálcio (CaCl2) e um agente de bloqueio de ADP a uma amostra de sangue (22), e posteriormente expor (88) a amostra de sangue (22) a uma sequência de um ou mais pulsos elétricos para disparar (90) a liberação dos fatores de crescimento na amostra de sangue (22), em que o um ou mais pulsos elétricos têm uma força de campo elétrico entre 0,1 kV/cm e 350 kV/cm e durações de pulso entre 1 nanossegundo e 100 microssegundos; e em que a liberação de fatores de crescimento não é acompanhada de coagulação dentro da amostra de sangue (22); o método compreendendo ainda coletar (92) os fatores de crescimento liberados.2. METHOD (80) FOR RELEASING GROWTH FACTORS, characterized by comprising: adding (86) calcium chloride (CaCl2) and an ADP blocking agent to a blood sample (22), and subsequently exposing (88) the sample of blood (22) to a sequence of one or more electrical pulses to trigger (90) the release of growth factors in the blood sample (22), wherein the one or more electrical pulses have an electric field strength between 0, 1 kV/cm and 350 kV/cm and pulse durations between 1 nanosecond and 100 microseconds; and in which the release of growth factors is not accompanied by clotting within the blood sample (22); the method further comprising collecting (92) the released growth factors. 3. MÉTODO (80), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo elemento de bloqueio de ADP compreender apirase.3. METHOD (80), according to claim 2, characterized in that the ADP blocking element comprises apyrase. 4. MÉTODO (60, 80), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ainda compreender coletar (70, 92) os fatores de crescimento.4. METHOD (60, 80), according to any one of claims 1 to 3, characterized by further comprising collecting (70, 92) the growth factors. 5. MÉTODO (60, 80), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos fatores de crescimento compreenderem fatores de crescimento derivados de plaquetas.5. METHOD (60, 80), according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the growth factors comprise growth factors derived from platelets. 6. MÉTODO (60, 80), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela amostra de sangue (22) ser uma amostra de sangue total ou um plasma rico em plaquetas.6. METHOD (60, 80), according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the blood sample (22) is a sample of whole blood or platelet-rich plasma.