BR112016008901B1 - COMPOUNDS FOR USE IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES AND PAIN - Google Patents

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Lin Chun-Jung
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Wang Hung-Li
Tu Benjamin Pang-Hsien
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Abstract

COMPOSTOS PARA USO NA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS E DA DOR Descrevem-se compostos para uso na prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas e dor. Em uma forma de realização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em N6-[(3-halotien-2-il)metila]adenosina, N6-[(4- halotien-2-il)metila]adenosina e N6-[(5-halotien-2-il)metila]adenosina. Em outra concretização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em N6-[(2-bromotien-3- il)metila]adenosina, N6-[(4-bromotien-3-il)metila]adenosina, N6- [(5-bromotien-3-il)metila[adenosina, N6-[(2-clorotien-3-il)metilaladenosina, N6-[(4-clorotien-3-il)metila]adenosina e N6-[( 5t-- clorotien-3-il) meti la ] adenosina . T'e elm-se também métodos para sua produção e utilização.COMPOUNDS FOR USE IN THE PREVENTION AND TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES AND PAIN Compounds for use in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases and pain are described. In one embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(3-halothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-halothien-2-yl)methyl]adenosine and N6-[(5-halothien-2-yl)methyl]adenosine. In another embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(2-bromothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-bromothien-3-yl)methyl]adenosine, N6- [(5-bromothien-3-yl)methyla[adenosine, N6-[(2-chlorothien-3-yl)methylaladenosine, N6-[(4-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine and N6-[(5t- -chlorothien-3-yl)methyl]adenosine. T'e elm are also methods for their production and use.

Description

DOMINIO DA INVENCAOFIELD OF THE INVENTION

[0001] A presente invenção refere-se a compostos para utilização na prevenção e/ou tratamento de doenças neurodegenerativas ou dor, ou ambos.[0001] The present invention relates to compounds for use in the prevention and/or treatment of neurodegenerative diseases or pain, or both.

ANTECEDENTES DA INVENCAOBACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] A publicação de patente norte-americana No. US20120295863 revela compostos de dupla ação que visam ao receptor de adenosina A2A e transportador de adenosina para a prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas. Um receptor agonista seletivo de adenosina A2A (A2AR) chamado CGS21680 (em resumo, CGS) tem-se mostrado capaz de atenuar sintomas da doença de Huntington (HD, na sigla em inglês) num modelo de camundongo transgénico, e resgatar a deficiência do ciclo da ureia de doença HD ao aumentar a atividade do sistema ubiquitina-proteassoma (Chiang et al, 2009 Hum Mol Genet 18:2929-2942; Chou et al, 2005 J Neurochem 93:310-320.). No entanto, o CGS é conhecido por exercer efeito imunossupressor forte e outros efeitos secundários, e, portanto, não é adequado para uso clínico.[0002] US Patent Publication No. US20120295863 discloses dual action compounds that target the adenosine A2A receptor and adenosine transporter for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases. A selective adenosine A2A receptor (A2AR) agonist called CGS21680 (in short, CGS) has been shown to attenuate symptoms of Huntington's disease (HD) in a transgenic mouse model, and rescue cycle deficiency of HD disease urea by increasing the activity of the ubiquitin-proteasome system (Chiang et al, 2009 Hum Mol Genet 18:2929-2942; Chou et al, 2005 J Neurochem 93:310-320.). However, CGS is known to exert strong immunosuppressive effects and other side effects, and therefore is not suitable for clinical use.

[0003] Sugeriu-se que N6-(4-hidroxibenzil)adenosina, designado como T1-11 em US20120295863 e também um agonista A2AR, teria potencial terapêutico no tratamento de doenças degenerativas neurais. No entanto, ainda é difícil desenvolver T1-11 como um fármaco disponível por via oral, devido à sua fraca biodisponibilidade (F < 5%). A biodisponibilidade oral é uma propriedade importante no desenvolvimento de medicamentos uma vez que representa a percentagem da substância que atinge a circulação sistêmica depois da absorção e metabolismo.[0003] It has been suggested that N6-(4-hydroxybenzyl)adenosine, designated as T1-11 in US20120295863 and also an A2AR agonist, has therapeutic potential in the treatment of neural degenerative diseases. However, it is still difficult to develop T1-11 as an orally available drug, due to its poor bioavailability (F < 5%). Oral bioavailability is an important property in drug development as it represents the percentage of the substance that reaches the systemic circulation after absorption and metabolism.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[0004] Num aspecto, o invento refere-se a um composto da fórmula (I) ou (IA):

Figure img0001
ou um sal seu farmaceuticamente aceitável, caracterizado por: X ser halogênio.[0004] In one aspect, the invention relates to a compound of formula (I) or (IA):
Figure img0001
or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that: X is halogen.

[0005] O halogênio (F, Cl, Br ou I) pode estar localizado na posição 3-, 4- ou 5- da fórmula (I), ou na posição 2-, 4- ou 5- da fórmula (IA).[0005] The halogen (F, Cl, Br or I) can be located in the 3-, 4- or 5-position of the formula (I), or in the 2-, 4- or 5- position of the formula (IA).

[0006] Em uma concretização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em N6-[(3-halotien- 2-il)metila]adenosina, N6-[(4-halotien-2- il)metila]adenosina, e N6-[(5-halotien-2- il)metila]adenosina.[0006] In one embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(3-halothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-halothien-2-yl)methyl]adenosine , and N6-[(5-halothien-2-yl)methyl]adenosine.

[0007] Em outra concretização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste de N6-[(2-halotien- 3-il)metila]adenosina, N6-[(4-halotien-3- il)metila]adenosina, e N6-[(5-halotien-3- il)metila]adenosina.[0007] In another embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(2-halothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-halothien-3-yl)methyl]adenosine , and N6-[(5-halothien-3-yl)methyl]adenosine.

[0008] Além disso, em outra concretização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em N6- [(5-bromotien-2-il)metila]adenosina, N6-[(4-bromotien-2- il)metila]adenosina, N6-[(3-bromotien-2-il)metila]adenosina, N6-[(5-clorotien-2-il)metila]adenosina, N6-[(4-clorotien-2- il)metila]adenosina, e N6-[(3-clorotien-2- il)metila]adenosina.[0008] Furthermore, in another embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(5-bromothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-bromothien-2-yl) methyl]adenosine, N6-[(3-bromothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(5-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-chlorothien-2-yl)methyl] adenosine, and N6-[(3-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine.

[0009] Em outra concretização da invenção, o composto é selecionado dentre o grupo que consiste em N6-[(2- bromotien-3-il)metila]adenosina, N6-[(4-bromotien-3- il)metila]adenosina, N6-[(5-bromotien-3-il)metila]adenosina, N6-[(2-clorotien-3-il)metila]adenosina, N6-[(4-clorotien-3- il)metila]adenosina, e N6-[(5-clorotien-3- il)metila]adenosina.[0009] In another embodiment of the invention, the compound is selected from the group consisting of N6-[(2-bromothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-bromothien-3-yl)methyl]adenosine , N6-[(5-bromothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(2-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine, and N6-[(5-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine.

[0010] Em outro aspecto, a invenção refere-se a método para a preparação do composto de fórmula (I) ou fórmula (IA), como acima mencionado, que compreende o passo de (I) reagir 6-cloropurina ribofuranosídeo na presença de uma base com (tienila)metanamina que é substituída com flúor, cloro, bromo ou iodo e tem a fórmula 3 ou 3A:

Figure img0002
para obter o composto de fórmula (I) ou (IA); ou (II): (a1) reagir (2',3'-O-isopropilideno)adenosina na presença de uma base com um agente protetor de grupo hidroxila para obter derivado de (2',3'-O- isopropilideno)adenosina com grupo protetor hidroxila; reagir o derivado de (2',3'-O- hidroxila e um grupo protetor amina; realização de reação de acoplamento por reação do derivado de (2',3'-O-isopropilideno)adenosina que tem os grupos protetores hidroxila e amina com um (tienila)metila composto substituído de fórmula 7 ou 7A que contém o grupo:
Figure img0003
caracterizado por X ser F, Cl, Br, ou I, e Y ser X, OH, metanossulfonato (OSO2CH3, OMs), p- toluenossulfonato (p-OSO2C6H4-CH3, OTs), ou trifluorometanossulfonato (OSO2CF3, OTf), para obter produto que contenha os grupos protetores e o grupo (tienila)metila substituído; e remoção dos grupos protetores do produto da etapa c) em condições ácidas para obter o composto da fórmula (I) ou (IA).[0010] In another aspect, the invention relates to a method for preparing the compound of formula (I) or formula (IA), as mentioned above, which comprises the step of (I) reacting 6-chloropurine ribofuranoside in the presence of a base with (thienyl)methanamine that is substituted with fluorine, chlorine, bromine or iodine and has the formula 3 or 3A:
Figure img0002
to obtain the compound of formula (I) or (IA); or (II): (a1) reacting (2',3'-O-isopropylidene)adenosine in the presence of a base with a hydroxyl group protecting agent to obtain (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative with hydroxyl protecting group; reacting the (2',3'-O-hydroxyl derivative and an amine protecting group; carrying out coupling reaction by reacting the (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative that has the hydroxyl and amine protecting groups with a (thienyl)methyl substituted compound of formula 7 or 7A containing the group:
Figure img0003
characterized in that X is F, Cl, Br, or I, and Y is X, OH, methanesulfonate (OSO2CH3, OMs), p-toluenesulfonate (p-OSO2C6H4-CH3, OTs), or trifluoromethanesulfonate (OSO2CF3, OTf), to obtain product containing the protecting groups and the substituted (thienyl)methyl group; and removing protecting groups from the product of step c) under acidic conditions to obtain the compound of formula (I) or (IA).

[0011] Em uma concretização da invenção, a base na etapa (a) pode ser di-isopropiletilamina. O agente protetor de grupo hidroxila pode ser cloreto de terc-butildimetilsilila. O agente de grupo protetor amina pode ser Di-terc-butila dicarbonato. A base na etapa (a1) pode ser imidazola.[0011] In one embodiment of the invention, the base in step (a) may be diisopropylethylamine. The hydroxyl group protecting agent may be tert-butyldimethylsilyl chloride. The amine protecting group agent may be Di-tert-butyl dicarbonate. The base in step (a1) may be imidazole.

[0012] Em outra concretização da invenção, na etapa (i)(a), a base é a di-isopropiletilamina e a (tienila)metanamina substituída é: (i) (5-bromotien-2- il)metanamina, para obter N6-[(5-bromotien-2- il)metila]adenosina; ou (ii) (5-clorotien-2-il)metanamina, para obter N6-[(5-clorotien-2-il)metila]adenosina.[0012] In another embodiment of the invention, in step (i)(a), the base is diisopropylethylamine and the substituted (thienyl)methanamine is: (i) (5-bromothien-2-yl)methanamine, to obtain N6-[(5-bromothien-2-yl)methyl]adenosine; or (ii) (5-chlorothien-2-yl)methanamine, to obtain N6-[(5-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine.

[0013] Além disso noutra concretização da invenção, a reação de acoplamento é realizada na presença de trifenilfosfina e azodicarboxilato de di-isopropila. O composto que contém o grupo (tienila)metila pode ser substituído (5-bromotien-2-il)metanol.[0013] Furthermore in another embodiment of the invention, the coupling reaction is carried out in the presence of triphenylphosphine and diisopropyl azodicarboxylate. The compound containing the (thienyl)methyl group may be substituted (5-bromothien-2-yl)methanol.

[0014] Além disso, em outro aspecto, a invenção refere- se a uma composição que compreende: (a) quantidade terapeuticamente eficaz do composto como acima mencionado ou um sal seu farmaceuticamente aceitável; e (b) transportador, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.[0014] Furthermore, in another aspect, the invention relates to a composition comprising: (a) a therapeutically effective amount of the compound as mentioned above or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and (b) a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or vehicle.

[0015] Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se à utilização do composto como acima mencionado na fabricação de medicamento para o tratamento de doença neurodegenerativa e/ou dor num indivíduo dele necessitado. Em alternativa, a invenção relaciona-se ao composto acima referido, para utilização no tratamento de doença neurodegenerativa e/ou dor num indivíduo dele necessitado. A doença neurodegenerativa pode ser uma doença de proteína dobrada erroneamente.[0015] In yet another aspect, the invention relates to the use of the compound as mentioned above in the manufacture of a medicament for the treatment of neurodegenerative disease and/or pain in a subject in need thereof. Alternatively, the invention relates to the aforementioned compound, for use in treating neurodegenerative disease and/or pain in a subject in need thereof. Neurodegenerative disease can be a misfolded protein disease.

[0016] Em uma concretização da invenção, a doença neurodegenerativa é selecionada dentre o grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença do príon, doença de Huntington, ataxias cerebelares da coluna vertebral. As ataxias cerebelares espinhais podem ser selecionadas dentre o grupo que consiste em ataxias cerebelares espinhais 2, ataxias cerebelares espinhais 3 e ataxias cerebelares espinhais 7. A dor pode ser dor induzida por ácido. A dor induzida por ácido pode ser dor muscular induzida por ácido. A dor muscular induzida por ácido pode ser dor muscular crônica induzida por ácido.[0016] In one embodiment of the invention, the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Huntington's disease, cerebellar spinal ataxias. Spinal cerebellar ataxias can be selected from the group consisting of spinal cerebellar ataxias 2, cerebellar spinal ataxias 3 and cerebellar spinal ataxias 7. The pain may be acid-induced pain. Acid-induced pain can be acid-induced muscle pain. Acid-induced muscle soreness can be chronic acid-induced muscle soreness.

[0017] Em uma concretização da invenção, a dor é selecionada dentre o grupo que consiste em dor inflamatória, dor de câncer, dor no peito, dor nas costas, dor no pescoço, dor no ombro, enxaqueca, dor de cabeça, dor miofascial, dor nas juntas, síndromes de dores musculares, dor neuropática, dor periférica, dor simpática, dor pós-operatória, dor pós- traumática e dor da esclerose múltipla.[0017] In one embodiment of the invention, the pain is selected from the group consisting of inflammatory pain, cancer pain, chest pain, back pain, neck pain, shoulder pain, migraine, headache, myofascial pain , joint pain, muscle pain syndromes, neuropathic pain, peripheral pain, sympathetic pain, postoperative pain, post-traumatic pain and multiple sclerosis pain.

[0018] Em outra concretização da invenção, a dor pode ser uma dor disfuncional. A dor disfuncional pode ser selecionada dentre o grupo que consiste em fibromialgia, dor miofascial, síndrome da dor da bexiga e dor causada pela síndrome do intestino irritável.[0018] In another embodiment of the invention, the pain may be dysfunctional pain. Dysfunctional pain can be selected from the group consisting of fibromyalgia, myofascial pain, bladder pain syndrome, and pain caused by irritable bowel syndrome.

[0019] Estes e outros aspectos serão aparentes a partir da descrição a seguir da concretização preferencial, tomada em conjunto com os desenhos que se seguem, embora as variações e modificações nelas possam ser afetadas sem se afastar do espírito e âmbito dos novos conceitos da presente revelação.[0019] These and other aspects will be apparent from the following description of the preferred embodiment, taken in conjunction with the drawings that follow, although variations and modifications therein may be affected without departing from the spirit and scope of the new concepts of the present revelation.

[0020] Os desenhos anexos ilustram uma ou mais concretizações da invenção e, juntamente com a descrição escrita, servem para explicar os princípios da invenção. Sempre que possível, os mesmos números de referência são utilizados em todos os desenhos para se referir a elementos iguais ou semelhantes de uma concretização.[0020] The accompanying drawings illustrate one or more embodiments of the invention and, together with the written description, serve to explain the principles of the invention. Whenever possible, the same reference numerals are used throughout the drawings to refer to the same or similar elements of an embodiment.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0021] A FIG. 1 mostra as concentrações sanguíneas de T1-11 (A) e JMF3464 (B) em camundongos ICR que receberam por via intravenosa (1 mg/kg) ou oral (10 mg/kg) de T1-11 ou JMF3464. A biodisponibilidade oral de T1-11 e JMF3464 foram estimadas como sendo de 2,8% e 17,4%, respectivamente.[0021] FIG. 1 shows blood concentrations of T1-11 (A) and JMF3464 (B) in ICR mice that received intravenous (1 mg/kg) or oral (10 mg/kg) T1-11 or JMF3464. The oral bioavailability of T1-11 and JMF3464 were estimated to be 2.8% and 17.4%, respectively.

[0022] A FIG. 2 mostra os efeitos dos agonistas A2AR (CGS21680, T1-11, JMF3464 e JMF3818) sobre a morte celular induzida por privação de soro. Células PC12 privadas de soro foram tratadas com ou sem o(s) reagente(s) indicado(s) durante 24 h. A viabilidade celular foi expressa como percentagem dos resultados de ensaios MTT, em comparação com a média de um grupo de controle com soro. Os pontos de dados representam a média ± SEM (n = 3~6).[0022] FIG. 2 shows the effects of A2AR agonists (CGS21680, T1-11, JMF3464 and JMF3818) on serum deprivation-induced cell death. Serum starved PC12 cells were treated with or without the indicated reagent(s) for 24 h. Cell viability was expressed as a percentage of MTT assay results compared to the mean of a serum control group. Data points represent the mean ± SEM (n = 3~6).

[0023] As FIGs. 3A-B mostram o efeito da JMF3464 em tempo de vida e défices motores. JMF3464 (0,11 g/camundongo/dia), JMF1907 (0,11 g/camundongo/dia) ou veículo (CON) foi administrado subcutaneamente aos camundongos indicados de 7 semanas de idade usando minibombas osmóticas ALZET durante 6 semanas. O desempenho Rotarod (A) e tempo de vida (B) destes camundongos foram avaliados. * p < 0,05. *** p < 0,005.[0023] FIGs. 3A-B show the effect of JMF3464 on lifespan and motor deficits. JMF3464 (0.11 g/mouse/day), JMF1907 (0.11 g/mouse/day) or vehicle (CON) was administered subcutaneously to 7-week-old indicated mice using ALZET osmotic minipumps for 6 weeks. Rotarod performance (A) and lifespan (B) of these mice were evaluated. * p < 0.05. *** p < 0.005.

[0024] As FIGs. 4A-B mostram os efeitos da T1-11 na prevenção de agregações de proteína induzida por superexpressão genes mutantes SCA2 e desempenho comportamental em camundongos transgênicos SCA2. (A) Células pSCA2-22Q-EGFP ou pSCA2-104Q-EGFP-transfectadas foram tratadas com 10 μM ou 10 μM T1-11 JMF1907 (um agonista A2A-R-derivado de T1-11) durante 24 h. As células foram colhidas e submetidas a ensaio de retardo em filtro ou aquisição de imagem. (B) Camundongos de ocorrência natural (WT, na sigla em inglês) ou transgênicos (SCA2) beberam água com ou sem T1-11. O desempenho Rotarod foi utilizado para medir a função comportamental dos camundongos.[0024] FIGs. 4A-B show the effects of T1-11 in preventing protein aggregations induced by overexpression of mutant SCA2 genes and behavioral performance in SCA2 transgenic mice. (A) pSCA2-22Q-EGFP or pSCA2-104Q-EGFP-transfected cells were treated with 10 µM or 10 µM T1-11 JMF1907 (an A2A-R-agonist derived from T1-11) for 24 h. Cells were harvested and subjected to filter delay assay or image acquisition. (B) Naturally occurring (WT) or transgenic (SCA2) mice drank water with or without T1-11. Rotarod performance was used to measure the behavioral function of mice.

[0025] As FIGs. 5A-C mostram que o T1-11 melhora a disfunção motora e a morte neuronal do pontino em camundongos transgênicos com SCA3. (A) Camundongos transgênicos com SCA3 receberam água de beber contendo veículo (0,2% DMSO) ou T1-11 (0,1 mg/ml) com início às 4 semanas de idade. Teste rotarod mostraram que, em comparação com camundongos de ocorrência natural (WT), camundongos transgênicos ataxina-3-Q79 de 4 meses de idade, tratados com veículo exibiram uma latência significativamente mais curta para queda e incoordenação motora. O desempenho Rotarod de camundongos transgênicos de 4 meses de idade SCA3 tratados com T1-11(1 mg por dia) foi significativamente melhor do que a de camundongos ataxina- 3-Q79 de mesma idade tratados com veículo. Cada ponto mostra a média + SE de 7-8 camundongos. (B-C) A coloração imuno-histoquímica de marcador neuronal NeuN indicou que a administração oral diária de T1-11 (1 mg por dia) melhorou significativamente a morte neuronal nos núcleos pontinos de um camundongo transgénico SCA3 com a idade de 4 meses (SCA3 + T1-11). A barra de escala é de 50 mm. Cada barra mostra a média + SE de 7-8 ratos. * P < 0,01 em comparação com camundongos transgênicos SAC3.[0025] FIGs. 5A-C show that T1-11 improves pontine motor dysfunction and neuronal death in SCA3 transgenic mice. (A) Transgenic mice with SCA3 were given drinking water containing either vehicle (0.2% DMSO) or T1-11 (0.1 mg/ml) starting at 4 weeks of age. Rotarod testing showed that, compared to naturally occurring (WT) mice, vehicle-treated, 4-month-old ataxin-3-Q79 transgenic mice exhibited a significantly shorter latency to fall and motor incoordination. Rotarod performance of 4-month-old SCA3 transgenic mice treated with T1-11 (1 mg daily) was significantly better than that of age-matched ataxin-3-Q79 mice treated with vehicle. Each point shows the mean + SE of 7-8 mice. (B-C) NeuN neuronal marker immunohistochemical staining indicated that daily oral administration of T1-11 (1 mg per day) significantly improved neuronal death in the pontine nuclei of a 4-month-old SCA3 transgenic mouse (SCA3+ T1-11). The scale bar is 50 mm. Each bar shows the mean + SE of 7-8 mice. * P < 0.01 compared to SAC3 transgenic mice.

[0026] As FIGs. 6A-C mostram que o JMF1907 alivia o sintoma atáxico e a morte neuronal pontina de camundongos transgênicos com SCA3. (A) O teste Rotarod indicou que, em comparação com camundongos transgênicos SCA3 de 4 meses de idade, tratados com veículo, o desempenho Rotarod de camundongos de 4 meses de idade com SCA3 tratados com JMF1907 (1 mg por dia) foi significativamente melhorado. Cada ponto mostra a média + SE de 6 camundongos. (B-C) coloração imunocitoquímica de NeuN mostrou que a administração oral de JMF1907 (1 mg por dia) preveniu significativamente a morte neuronal nos núcleos pontinos de um camundongo SCA3 com a idade de 4 meses (SCA3 + JMF1907). A barra de escala é de 50 μm. Cada barra representa a média + SE de 6 camundongos. * P < 0,01 em comparação com camundongos SCA3.[0026] FIGs. 6A-C show that JMF1907 alleviates ataxic symptom and pontine neuronal death of SCA3 transgenic mice. (A) Rotarod testing indicated that, compared to vehicle-treated 4-month-old SCA3 transgenic mice, the Rotarod performance of 4-month-old SCA3 mice treated with JMF1907 (1 mg per day) was significantly improved. Each point shows the mean + SE of 6 mice. (B-C) immunocytochemical staining of NeuN showed that oral administration of JMF1907 (1 mg daily) significantly prevented neuronal death in the pontine nuclei of a 4-month-old SCA3 mouse (SCA3 + JMF1907). The scale bar is 50 μm. Each bar represents the mean + SE of 6 mice. * P < 0.01 compared to SCA3 mice.

[0027] As FIGs. 7A-C mostram que JMF3464 melhora a ataxia e morte neuronal pontina de camundongos transgênicos SCA3. (A) Camundongos transgênicos SCA3 exibiram desempenho de rotarod prejudicado. A administração diária de JMF3464 (0,3 mg por dia) melhorou significativamente o desempenho rotarod de camundongos de 4 meses de idade SCA3. (B-C) Coloração imunocitoquímica de marcador neuronal NeuN demonstrou que o tratamento oral diário de JMF3464 (0,3 mg por dia) melhorou significativamente a morte neuronal nos núcleos pontinos de camundongo transgênico SCA3 com idade de 4 meses. Cada barra indica a média + SE de 6 camundongos. # P < 0,01 em comparação com camundongos transgênicos SCA3.[0027] FIGs. 7A-C show that JMF3464 improves ataxia and pontine neuronal death of SCA3 transgenic mice. (A) SCA3 transgenic mice exhibited impaired rotarod performance. Daily administration of JMF3464 (0.3 mg per day) significantly improved rotarod performance of 4-month-old SCA3 mice. (B-C) NeuN neuronal marker immunocytochemical staining demonstrated that daily oral treatment of JMF3464 (0.3 mg daily) significantly improved neuronal death in the pontine nuclei of 4-month-old SCA3 transgenic mice. Each bar indicates the mean + SE of 6 mice. # P < 0.01 compared to SCA3 transgenic mice.

[0028] As FIGs. 8A-B mostram que o tratamento com JMF1907 melhorou as funções motoras dos ratinhos transgênicos TDP-43. 4 doses diferentes de JMF1907 (3,7, 1,25, 0,5, 0,1 mg/kg) foram testadas. CTL: camundongos transgênicos tratados com DMSO. WT: camundongos de ocorrência natural tratados com DMSO. Estatísticas realizadas com ANOVA de duas vias. Para o Rotarod, a significância estatística foi alcançada em todos os pontos para 1,25 e 0,5 mg/kg, a partir de 12-21 semanas para 0,1 mg/kg e 10-12 semanas para 3,7 mg/kg. Para a força de preensão, a significância estatística foi alcançada em todos os pontos para todas as doses testadas. N = 18 (CTL), 15 (WT), 15 (0,1), 15 (0,5), 15 (1,25), 5 (3,7).[0028] FIGs. 8A-B show that JMF1907 treatment improved the motor functions of TDP-43 transgenic mice. 4 different doses of JMF1907 (3.7, 1.25, 0.5, 0.1 mg/kg) were tested. CTL: DMSO-treated transgenic mice. WT: naturally occurring mice treated with DMSO. Statistics performed with two-way ANOVA. For Rotarod, statistical significance was reached at all points for 1.25 and 0.5 mg/kg, from 12-21 weeks for 0.1 mg/kg and 10-12 weeks for 3.7 mg/kg. kg. For grip strength, statistical significance was reached at all points for all doses tested. N = 18 (CTL), 15 (WT), 15 (0.1), 15 (0.5), 15 (1.25), 5 (3.7).

[0029] A FIG. 9 mostra que o tratamento com JMF3464 reduziu a localização errônea de TDP-43 em células NSC34. As células foram pré-tratadas com JMF3464 (30 M) durante uma hora, e, em seguida, tratadas com AICAR (1 mM, Al), na presença de JMF3464 durante mais 24 horas. A localização do TDP-43 (vermelho) foi analisada por imunocoloração. Os locais dos núcleos foram marcados por Hochest (azul).[0029] FIG. 9 shows that JMF3464 treatment reduced TDP-43 mislocalization in NSC34 cells. Cells were pretreated with JMF3464 (30 M) for one hour, and then treated with AICAR (1 mM, Al) in the presence of JMF3464 for a further 24 hours. The location of TDP-43 (red) was analyzed by immunostaining. The locations of the cores were marked by Hochest (blue).

[0030] As FIGs. 10A-C mostram o efeito analgésico de JMF3464 em um modelo de camundongo com fibromialgia. (A-1 e A-2) A administração oral de T1-11 mostrou nenhum efeito analgésico num modelo de camundongo com fibromialgia, em que camundongos desenvolveram dor muscular crônica após a injeção intramuscular de ácido e tratamento com genisteína. As setas vazadas indicam o momento em que os camundongos receberam a injeção de ácido. As setas pretas indicam o momento em que os camundongos receberam T1-11 (p.o.). (B) O JMF3464 mostra efeito analgésico em um modelo de camundongo com fibromialgia, em que camundongos desenvolveram dor crônica generalizada depois de tratados com o estresse frio intermitente durante 2 dias. O efeito analgésico da JMF3464 é dependente da dose. A dose eficaz iniciou a partir de 100 μg/kg (i.p.). (C) A administração oral de JMF3464 (1 mg/kg) mostrou efeito analgésico no modelo de stress frio intermitente.[0030] FIGs. 10A-C show the analgesic effect of JMF3464 in a mouse model of fibromyalgia. (A-1 and A-2) Oral administration of T1-11 showed no analgesic effect in a mouse model of fibromyalgia, in which mice developed chronic muscle pain after intramuscular acid injection and genistein treatment. The hollow arrows indicate when the mice received the acid injection. Black arrows indicate the time when mice received T1-11 (p.o.). (B) JMF3464 shows analgesic effect in a mouse model of fibromyalgia, in which mice developed chronic generalized pain after being treated with intermittent cold stress for 2 days. The analgesic effect of JMF3464 is dose dependent. The effective dose started from 100 μg/kg (i.p.). (C) Oral administration of JMF3464 (1 mg/kg) showed analgesic effect in intermittent cold stress model.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕESDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION DEFINITIONS

[0031] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste pedido de patente têm o mesmo significado que o normalmente entendido por pessoa com habilidade normal na técnica à qual este invento pertence. Em caso de conflito, o presente documento, e as definições nele incluídas terá precedência.[0031] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this patent application have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, this document, and the definitions included therein, will take precedence.

[0032] O termo "tratar" ou "tratamento" refere-se à administração de quantidade eficaz de agente terapêutico a indivíduo dele necessitado, que tenha doença neurodegenerativa e/ou dor, ou sintoma ou predisposição para essa doença e/ou dor, com a finalidade de curar, aliviar, atenuar, remediar, melhorar ou prevenir a doença e/ou dor, seus sintomas, ou a predisposição para ela. Tal indivíduo pode ser identificado por um profissional de saúde com base em resultados de qualquer método de diagnóstico adequado.[0032] The term "treat" or "treatment" refers to the administration of an effective amount of therapeutic agent to a subject in need thereof, who has neurodegenerative disease and/or pain, or symptom or predisposition to such disease and/or pain, with the purpose of curing, alleviating, alleviating, remedying, ameliorating or preventing disease and/or pain, its symptoms, or a predisposition to it. Such an individual can be identified by a healthcare professional based on the results of any suitable diagnostic method.

[0033] "Quantidade eficaz" refere-se à quantidade do composto ativo que é necessária para conferir efeito terapêutico no indivíduo tratado. As doses eficazes variarão, como reconhecido pelos peritos na técnica, dependendo da rota de administração, utilização de excipiente e possibilidade de coutilização com outros tratamentos terapêuticos.[0033] "Effective amount" refers to the amount of the active compound that is required to confer therapeutic effect on the subject treated. Effective doses will vary, as recognized by those skilled in the art, depending on the route of administration, use of excipient and possibility of co-use with other therapeutic treatments.

[0034] O "Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers", publicado pelo U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration divulga que "quantidade terapeuticamente eficaz" pode ser obtida pelo cálculo da seguinte fórmula:[0034] The "Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers", published by the U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration discloses that "therapeutically effective amount" can be obtained by calculating the following formula:

[0035] HED = dose para animais em mg/kg x (peso do animal em kg/peso em kg humano)0,33.[0035] HED = dose for animals in mg/kg x (weight of animal in kg/weight in kg human)0.33.

[0036] JMF 1907 indica o composto N6-[2-(indol-3- il)etila]adenosina e foi revelado na publicação da patente norte-americana No. 20120295863 A1 como composto 6.[0036] JMF 1907 indicates the compound N6-[2-(indol-3-yl)ethyl]adenosine and was disclosed in U.S. Patent Publication No. 20120295863 A1 as compound 6.

Síntese químicachemical synthesis

[0037] Em uma abordagem, a 6-cloropurina ribofuranosídeo (2) foi tratada com (tienila)metanamina opcionalmente substituída (3) na presença de uma base para dar o composto desejado da fórmula (I).[0037] In one approach, the 6-chloropurine ribofuranoside (2) was treated with optionally substituted (thienyl)methanamine (3) in the presence of a base to give the desired compound of formula (I).

[0038] Por exemplo, a di-isopropiletilamina foi utilizada como base, e a reação de substituição de 6- cloropurina ribofuranosídeo com (5-bromotien-2- il)metanamina foi realizada por aquecimento num solvente de 1-propanol para obter N6-[(5-bromo-tien-2- il)metila]adenosina (JMF3464, estrutura 1).

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[0038] For example, diisopropylethylamine was used as a base, and the substitution reaction of 6-chloropurine ribofuranoside with (5-bromothien-2-yl)methanamine was carried out by heating in a 1-propanol solvent to obtain N6- [(5-bromo-thien-2-yl)methyl]adenosine (JMF3464, structure 1).
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[0039] Noutra abordagem, (2',3'-O-isopropilideno)adenina (4) foi tratado com cloreto de terc-butildimetilsilila (TBDMSCI) na presença de uma base imidazola para dar um derivado de éter de silila (5). O grupo 6-amino foi protegido como um carbamato 6 que tem o substituinte terc- butoxicarbonil (Boc). Um grupo opcionalmente substituído (tienila)metila foi introduzido, e o composto desejado da fórmula (I) foi obtido após a remoção de todos os grupos protetores em condições ácidas.[0039] In another approach, (2',3'-O-isopropylidene)adenine (4) was treated with tert-butyldimethylsilyl chloride (TBDMSCI) in the presence of an imidazole base to give a silyl ether derivative (5). The 6-amino group was protected as a carbamate 6 which has the tert-butoxycarbonyl (Boc) substituent. An optionally substituted (thienyl)methyl group was introduced, and the desired compound of formula (I) was obtained after removing all protecting groups under acidic conditions.

[0040] Por exemplo, a reação de acoplamento do composto 6 com (5-bromotien-2-il)metanol (composto 7, em que X = 5- Br, Y = OH) foi promovido usando trifenilfosfina e azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD) para dar o composto 8. A desproteção global da silila, acetonida e grupos Boc no composto 8 foi alcançada em condições acídicas para dar o composto 1.[0040] For example, the coupling reaction of compound 6 with (5-bromothien-2-yl)methanol (compound 7, where X = 5- Br, Y = OH) was promoted using triphenylphosphine and diisopropyl azodicarboxylate (DIAD) to give compound 8. Overall deprotection of the silyl, acetonide and Boc groups in compound 8 was achieved under acidic conditions to give compound 1.

[0041] Usando a mesma abordagem química, o composto (IA), foi obtido.

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[0041] Using the same chemical approach, compound (IA) was obtained.
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Biodisponibilidade oraloral bioavailability

[0042] Para medir a biodisponibilidade oral de um composto de teste, as amostras de sangue foram colhidas a partir de camundongos ICR do sexo masculino (6 semanas de idade; 20-25 g), após as administrações do composto de teste por via oral (10 mg/kg) ou intravenosa (1 mg/kg). As amostras de sangue recolhidas nos períodos indicados foram extraídas com metanol contendo 0,1% de ácido fórmico, e, em seguida, 10 μL de cada amostra extraída foram injetados para UPLC-MSMS para quantificação. Os resultados (FIG. 1A-B) mostraram que a biodisponibilidade oral de T1-11 e JMF3464 em camundongos ICR foram de 2,8% e 17,4%, respectivamente, indicando que a absorção oral de JMF3464 foi mais do que 6 vezes maior do que a de T1-11. Ligação de JMF3464 ao A2AR e ENT1 e proteção da apoptose de células neuronais[0042] To measure the oral bioavailability of a test compound, blood samples were collected from male ICR mice (6 weeks old; 20-25 g) following oral administrations of the test compound. (10 mg/kg) or intravenous (1 mg/kg). Blood samples collected at the indicated times were extracted with methanol containing 0.1% formic acid, and then 10 μL of each extracted sample was injected into UPLC-MSMS for quantification. The results (FIG. 1A-B) showed that the oral bioavailability of T1-11 and JMF3464 in ICR mice were 2.8% and 17.4%, respectively, indicating that the oral absorption of JMF3464 was more than 6-fold higher than that of T1-11. Binding of JMF3464 to A2AR and ENT1 and protection of neuronal cell apoptosis

[0043] Primeiramente caracterizou-se as propriedades farmacológicas do JMF3464 usando ensaios de ligação de radioligandos. A Tabela 1 mostra as propriedades farmacológicas de T1-11, JMF1907 e JMF3464. A ligação dos compostos indicados ao receptor de adenosina A2A (A2AR) e um transportador de adenosina (ENT1) foi caracterizado utilizando protocolos de ligação padrão. Como mostrado na Tabela 1, JMF3464 ligado ao A2AR e um transportador de adenosina - transportador nucleósideo de equilíbrio. A afinidade de JMF3464 ao A2AR foi semelhante à de T1-11 e JMF1907 (um análogo de T1-11), enquanto que a sua afinidade ao ENT1 foi muito melhor do que a dos T1-11 e JMF1907. O estudo indicou também que N6-[(5-clorotien-2-il) metila]adenosina (JMF3818) também inibiram a apoptose de células PC12 causados por retirada de soro. JMF3818 em 10 μM inibiu o receptor A2A de adenosina e o transportador (ENT1) em 54% e 96%, respectivamente (Fig. 2). Tabela 1

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JMF3464 exercendo efeitos benéficos sobre sintomas principais da doença de Huntington (HD) em um modelo HD de camundongo transgênico[0043] We first characterized the pharmacological properties of JMF3464 using radioligand binding assays. Table 1 shows the pharmacological properties of T1-11, JMF1907 and JMF3464. Binding of the indicated compounds to the A2A adenosine receptor (A2AR) and an adenosine transporter (ENT1) was characterized using standard binding protocols. As shown in Table 1, JMF3464 bound to A2AR and an adenosine transporter - equilibrium nucleoside transporter. The affinity of JMF3464 for A2AR was similar to that of T1-11 and JMF1907 (an analog of T1-11), while its affinity for ENT1 was much better than that of T1-11 and JMF1907. The study also indicated that N6-[(5-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine (JMF3818) also inhibited apoptosis of PC12 cells caused by serum withdrawal. JMF3818 at 10 μM inhibited adenosine A2A receptor and transporter (ENT1) by 54% and 96%, respectively (Fig. 2). Table 1
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JMF3464 exerting beneficial effects on key symptoms of Huntington's disease (HD) in a transgenic mouse HD model

[0044] À medida que o A2AR e ENT1 estão localizados no corpo estriado e foram implicados na função estriatal, foi feita a hipótese de que o tratamento crônico com JMF3464 modularia a progressão da HD. Testou-se o efeito de JMF3464 em um modelo de camundongo transgênico (R6/2) de HD em que agonistas A2AR têm efeitos benéficos. A adição de JMF3464 (0,11 mg/kg/dia) aos camundongos desde a idade de 7 semanas contrabalançou a deterioração progressiva na coordenação motora como avaliado pelo desempenho em rotarod (Fig. 3A). A vida útil encurtada de camundongos R6/2 também foi melhorada por um tratamento sustentado (de longo prazo) com JMF3464. Efeitos benéficos da JMF3464 sobre ataxias cerebelares espinhais 2 (SCA2, na sigla em inglês)[0044] As A2AR and ENT1 are located in the striatum and have been implicated in striatal function, it was hypothesized that chronic treatment with JMF3464 would modulate the progression of HD. The effect of JMF3464 was tested in a transgenic mouse model (R6/2) of HD in which A2AR agonists have beneficial effects. Addition of JMF3464 (0.11 mg/kg/day) to mice from the age of 7 weeks counterbalanced the progressive deterioration in motor coordination as assessed by rotarod performance (Fig. 3A). The shortened lifespan of R6/2 mice was also improved by sustained (long-term) treatment with JMF3464. Beneficial effects of JMF3464 on spinal cerebellar ataxia 2 (SCA2)

[0045] Dado que ativação da atividade do proteassoma pode ser o mecanismo da via de sinalização do receptor A2AR na prevenção de agregações Htt mutantes ou de desempenho comportamental em R6/2 do camundongo transgênico (Huang et al, 2011 PLoS One 6:e20934; Lee et al, 2012 PLoS ONE. 7:e38865), é possível que o agonista A2AR possa também ter benefícios no alívio de outras doenças poliQ, tais como SCA2. Com efeito, os dados mostraram que T1-11 é eficaz em impedir agregações ATXN2 mutantes (Fig. 4A) e desempenho comportamental em camundongos SCA2 transgênicos (ATAXN2Q127) (Fig. 4B), o que suporta a hipótese acima. Dado que a biodisponibilidade da JMF3464 é significativamente melhor do que T1-11, concluiu-se que JMF3464 também produziria efeito benéfico sobre SCA2. Efeitos benéficos da T1-11 e seus análogos nas ataxias espinocerebelares 3 (SCA3)[0045] Given that activation of proteasome activity may be the mechanism of the A2AR receptor signaling pathway in preventing mutant Htt aggregations or behavioral performance in R6/2 of the transgenic mouse (Huang et al, 2011 PLoS One 6:e20934; Lee et al, 2012 PLoS ONE. 7:e38865), it is possible that the A2AR agonist may also have benefits in alleviating other polyQ diseases, such as SCA2. Indeed, the data showed that T1-11 is effective in preventing mutant ATXN2 aggregations (Fig. 4A) and behavioral performance in SCA2 transgenic mice (ATAXN2Q127) (Fig. 4B), which supports the above hypothesis. Since the bioavailability of JMF3464 is significantly better than T1-11, it was concluded that JMF3464 would also have a beneficial effect on SCA2. Beneficial effects of T1-11 and its analogues on spinocerebellar ataxia 3 (SCA3)

[0046] Em comparação com camundongos de ocorrência natural, camundongos SCA3 transgênicos tratados com veículo que expressa ataxina-3-Q79 poliglutamina-expandida exibiram vários sintomas atáxicos, inclusive desempenho rotarod prejudicado (FIGs. 5A e 6A) com uma idade de início de cerca de 3-4 meses. Como mostrado nas FIGs. 5A e 6A, camundongos SCA3 transgénicos de quatro meses de idade tratados com administração oral diária de T1-11 (1 mg por dia) ou JMF1907 (1 mg por dia) exibiram desempenho rotarod significativamente melhorado. Semelhante a pacientes SCA3, morte neuronal proeminente foi encontrada nos núcleos pontinos de camundongos SCA3 transgênicos (FIG 5B e 6B). De acordo com os resultados de ensaios rotarod, o tratamento oral diário de T1-11 (FIGs. 5B e 5C) ou JMF1907 (FIGs. 6B e Fig. 6C) atenuou significativamente a morte neuronal pontina em camundongos SCA3 transgênicos (FIGs. 5B, 5C, 6B e Fig. 6C). Os resultados fornecem evidência de que tratamento oral sustentado de T1-11 ou JMF1907 melhora fenótipos neurológicos e neuropatológicos de camundongos SCA3 transgênicos.[0046] Compared to naturally occurring mice, transgenic SCA3 mice treated with vehicle expressing polyglutamine-expanded ataxin-3-Q79 exhibited several ataxic symptoms, including impaired rotarod performance (FIGs. 5A and 6A) with an age of onset of about of 3-4 months. As shown in FIGs. 5A and 6A, four-month-old SCA3 transgenic mice treated with daily oral administration of T1-11 (1 mg daily) or JMF1907 (1 mg daily) exhibited significantly improved rotarod performance. Similar to SCA3 patients, prominent neuronal death was found in the pontine nuclei of SCA3 transgenic mice (FIG 5B and 6B). According to the results of rotarod assays, daily oral treatment of T1-11 (FIGs. 5B and 5C) or JMF1907 (FIGs. 6B and Fig. 6C) significantly attenuated pontine neuronal death in SCA3 transgenic mice (FIGs. 5B, 5C, 6B and Fig. 6C). The results provide evidence that sustained oral treatment of T1-11 or JMF1907 improves neurological and neuropathological phenotypes of SCA3 transgenic mice.

[0047] JMF3464 tem biodisponibilidade muito superior. Portanto, esperava-se também que JMF3464 exercesse efeito benéfico sobre a ataxia induzida por ataxin-3-Q79 mutante e neurodegeneração em camundongos SCA3 transgênicos. Como esperado, a aplicação diária de JMF3464 (0,3 mg por dia) atenuou a ataxia (FIG. 7A) e a morte neuronal pontina (FIGs. 7B e 7C) dos camundongos SCA3 transgênicos. Efeitos benéficos da JMF1907 e JMF3464 sobre a esclerose lateral amiotrófica (ELA)[0047] JMF3464 has far superior bioavailability. Therefore, JMF3464 was also expected to exert a beneficial effect on mutant ataxin-3-Q79-induced ataxia and neurodegeneration in SCA3 transgenic mice. As expected, daily application of JMF3464 (0.3 mg per day) attenuated ataxia (FIG. 7A) and pontine neuronal death (FIGs. 7B and 7C) of SCA3 transgenic mice. Beneficial effects of JMF1907 and JMF3464 on amyotrophic lateral sclerosis (ALS)

[0048] Como mostrado na FIG. 8A-B, os camundongos transgênicos que receberam JMF1907 em 4 doses diferentes (3,7, 1,25, 0,5 e 0,1 mg/kg/dia) tiveram desempenho significativamente melhor em testes rotarod e de força de preensão do que os camundongos de controle. A dose de 1,25 mg/kg mostrou o maior benefício. Estes dados indicam uma clara melhoria na função motora. JMF3464, um análogo de T1-11 e JMF1907, têm biodisponibilidade muito superior. Por conseguinte, é esperado JMF3464 exerça efeito benéfico em camundongos ELA. O tratamento de células NSC34 com JMF3464 normalizou a localização errônea TDP-43 causada pela ativação da AMPK (FIG. 9) o que apoia a noção de que JMF3464 é capaz de prevenir a etapa inicial da patogênese da ELA. Estes resultados suportam que JMF3464 apresenta efeitos benéficos sobre ELA.[0048] As shown in FIG. 8A-B, transgenic mice that received JMF1907 at 4 different doses (3.7, 1.25, 0.5, and 0.1 mg/kg/day) performed significantly better in rotarod and grip strength tests than control mice. The 1.25 mg/kg dose showed the greatest benefit. These data indicate a clear improvement in motor function. JMF3464, an analog of T1-11 and JMF1907, have much superior bioavailability. Therefore, JMF3464 is expected to exert a beneficial effect in ALS mice. Treatment of NSC34 cells with JMF3464 normalized TDP-43 mislocalization caused by AMPK activation (FIG. 9) which supports the notion that JMF3464 is able to prevent the early stage of ALS pathogenesis. These results support that JMF3464 has beneficial effects on ALS.

Efeitos benéficos da JMF3464 sobre a dorBeneficial effects of JMF3464 on pain

[0049] Embora T1-11 (i.p.) apresentou excelentes efeitos analgésicos em 2 camundongos modelos de fibromialgia (dor generalizada crônica induzida por ácido e modelos de stress frio intermitente), a sua biodisponibilidade é muito baixa. A administração oral de T1-11 (até 2 mg/kg) não mostrou efeito analgésico em modelo de dor crônica generalizada induzida por ácido, em que camundongos desenvolveram dor similar à fibromialgia após a injeção intramuscular de ácido e tratamento de genisteína (Fig. 10A). JMF3464, um análogo da T1-11, mostrou efeito analgésico em camundongo modelo da fibromialgia, em que camundongos desenvolveram dor crônica generalizada depois de serem tratados com estresse causado por frio intermitente durante 2 dias (FIG. 10B). Consistente com a sua boa biodisponibilidade, a administração oral de JMF3464 (1 mg/kg) mostrou efeito analgésico no modelo de stress frio intermitente (FIG. 10C).[0049] Although T1-11 (i.p.) showed excellent analgesic effects in 2 mouse fibromyalgia models (acid-induced chronic generalized pain and intermittent cold stress models), its bioavailability is very low. Oral administration of T1-11 (up to 2 mg/kg) showed no analgesic effect in a model of acid-induced chronic generalized pain, in which mice developed fibromyalgia-like pain after intramuscular acid injection and genistein treatment (Fig. 10A). ). JMF3464, a T1-11 analogue, showed analgesic effect in a mouse model of fibromyalgia, in which mice developed chronic generalized pain after being treated with intermittent cold stress for 2 days (FIG. 10B). Consistent with its good bioavailability, oral administration of JMF3464 (1 mg/kg) showed analgesic effect in the intermittent cold stress model (FIG. 10C).

EXEMPLO 1EXAMPLE 1

[0050] Todos os reagentes e solventes eram de grau reagente e foram usados sem purificação adicional a menos que especificado de outra forma. Tetrahidrofurano e éter dietílico foram destilados a partir de Na/benzofenona e CH2Cl2 foi destilado a partir de CaH2. Todas experiências sensíveis a ar ou umidade foram realizadas sob argônio. Todos os copos foram secos numa estufa durante mais de 2 horas e usados após arrefecimento até à temperatura ambiente em dessecadores. Reações em micro-ondas foram realizadas usando aparelho de micro-ondas de modo único focalizado (CEM Discover). A máquina consiste em um sistema de fornecimento de energia de micro-ondas focalizada continuamente com potência selecionável pelo operador.[0050] All reagents and solvents were reagent grade and were used without further purification unless otherwise specified. Tetrahydrofuran and diethyl ether were distilled from Na/benzophenone and CH2Cl2 was distilled from CaH2. All air or moisture sensitive experiments were performed under argon. All cups were dried in an oven for more than 2 hours and used after cooling to room temperature in desiccators. Microwave reactions were performed using a focused single-mode microwave apparatus (CEM Discover). The machine consists of a continuously focused microwave power supply system with operator selectable power.

[0051] Os pontos de fusão foram registados num aparelho micro Yanaco. As rotações ópticas foram medidas em polarímetro digital da JASCO Co. DIP-1000 do Japão. Valores [α]D são dados em unidades de 10-1deg.cm2.g-1. Espectros infravermelho (IR, na sigla em inglês) foram registados num Nicolet Magna 550-II. Os espectros de RMN foram obtidos num Varian Unity-Plus 400 (400 MHz) e os deslocamentos químicos (δ) foram registrados em partes por milhão (ppm) relativamente ao δH 7,24/δC 77,0 (linha central de t) para CHCl3/CDCl3, δH 2.05/δC 29,92 para (CH3)2CO/(CD3)2CO, δH 3,31/49,0 δC para CH3OH/CD3OD e δH 2,49 (m)/δC 39,5 (m) para (CH3)2SO/(CD3)2SO. Os padrões de divisão são relatados como s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto) e br (amplo). As constantes de acoplamento (J) são dadas em Hz. As experiências ESI-MS foram realizadas num espectrômetro de massa de alta resolução Bruker Daltonics BioTOF III. A cromatografia em camada fina (TLC, na sigla em inglês) analítica foi realizada sobre placas (0,25 mm) de gel de sílica 60 F254 da E. Merck. Os compostos foram visualizados por UV, anisaldeído ou pulverização de ninidrina. A cromatografia em coluna foi realizada em colunas cheias com gel de sílica de malha 70-230.[0051] Melting points were recorded on a Yanaco micro apparatus. Optical rotations were measured using a digital polarimeter from JASCO Co. DIP-1000 from Japan. [α]D values are given in units of 10-1deg.cm2.g-1. Infrared (IR) spectra were recorded on a Nicolet Magna 550-II. NMR spectra were obtained on a Varian Unity-Plus 400 (400 MHz) and chemical shifts (δ) were recorded in parts per million (ppm) relative to δH 7.24/δC 77.0 (t axis) for CHCl3/CDCl3, δH 2.05/δC 29.92 for (CH3)2CO/(CD3)2CO, δH 3.31/49.0 δC for CH3OH/CD3OD and δH 2.49 (m)/δC 39.5 (m ) to (CH3)2SO/(CD3)2SO. Splitting patterns are reported as s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), m (multiplet), and br (broad). Coupling constants (J) are given in Hz. ESI-MS experiments were performed on a Bruker Daltonics BioTOF III high resolution mass spectrometer. Analytical thin layer chromatography (TLC) was performed on E. Merck silica gel 60 F254 plates (0.25 mm). Compounds were visualized by UV, anisaldehyde or ninhydrin spray. Column chromatography was performed on columns packed with 70-230 mesh silica gel.

[0052] A pureza dos compostos foi avaliada como >95% por HPLC (Agilent HP-1100), com detecção a 280 nm de comprimento de onda. 2',3'-O-isopropilideno-5'-O-(terc- butildimetilsilila)adenosina (5)[0052] The purity of the compounds was evaluated as >95% by HPLC (Agilent HP-1100), with detection at 280 nm wavelength. 2',3'-O-isopropylidene-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)adenosine (5)

[0053] A uma solução de 2',3'-(O- isopropilideno)adenosina (4, 614 mg, 2,00 mmol) e imidazola (408 mg, 6 mmol) em CH2Cl2 anidro (12 mL), arrefecido num banho de gelo, foi adicionado cloreto de terc- butildimetilsilila (TBDMSCI, 452 mg, 3 mmol) a 0 °C sob atmosfera de N2. O banho de gelo foi removido, e a mistura foi agitada durante 12 h à temperatura ambiente. Adicionou- se metanol (4 mL), e a mistura foi agitada durante mais 15 min, e em seguida concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O resíduo sólido foi dissolvido em CH2Cl2 e lavado sucessivamente com HCl 1 M, água deionizada e solução salina. A camada orgânica foi recolhida, secada sobre MgSO4, e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar o composto 5 (819 mg, 1,57 mmol, 78% de rendimento) na forma de sólidos brancos. 6-N-terc-Butoxicarbonil-2',3' -O-isopropilideno-5' -O-( terc-butil dimetilsilila)adenosina (6)[0053] To a solution of 2',3'-(O-isopropylidene)adenosine (4.614 mg, 2.00 mmol) and imidazole (408 mg, 6 mmol) in anhydrous CH 2 Cl 2 (12 mL), cooled in a bath of ice, tert-butyldimethylsilyl chloride (TBDMSCI, 452 mg, 3 mmol) was added at 0 °C under N 2 atmosphere. The ice bath was removed, and the mixture was stirred for 12 h at room temperature. Methanol (4 mL) was added, and the mixture was stirred for a further 15 min, and then concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The solid residue was dissolved in CH2Cl2 and washed successively with 1M HCl, deionized water and saline. The organic layer was collected, dried over MgSO4 , and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give compound 5 (819 mg, 1.57 mmol, 78% yield) as white solids. 6-N-tert-Butoxycarbonyl-2',3'-O-isopropylidene-5'-O-(tert-butyl dimethylsilyl)adenosine (6)

[0054] Solução de composto 5 (819 mg, 1,57 mmol) e 4- (dimetilamino)piridina (DMAP, quantidade catalítica) em THF anidro (10 mL) foi agitada durante 2 minutos, sob N2. A solução foi arrefecida num banho de gelo, e dicarbonato de di-terc-butila ((Boc)2O, 1,08 ml, 4,71 mmol) foi adicionado gota a gota. O banho de gelo foi removido, e a mistura foi agitada durante 12 h à temperatura ambiente. Depois de completada a reação, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi dissolvido em CH2Cl2, e lavado com sucesso com HCl 1 M, água deionizada e solução salina. A camada orgânica foi recolhida, secada sobre MgSO4, e filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter um composto bis-Boc (859 mg, 1,38 mmol, 87% de rendimento) como uma espuma amarelo-pálido.[0054] Solution of compound 5 (819 mg, 1.57 mmol) and 4-(dimethylamino)pyridine (DMAP, catalytic amount) in anhydrous THF (10 mL) was stirred for 2 minutes under N 2 . The solution was cooled in an ice bath, and di-tert-butyl dicarbonate ((Boc) 2 O, 1.08 ml, 4.71 mmol) was added dropwise. The ice bath was removed, and the mixture was stirred for 12 h at room temperature. After the reaction was complete, the mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was dissolved in CH2Cl2, and successfully washed with 1M HCl, deionized water and saline. The organic layer was collected, dried over MgSO4 , and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a bis-Boc compound (859 mg, 1.38 mmol, 87% yield) as a pale yellow foam.

[0055] À solução do composto bis-Boc (400 mg, 0,64 mmol) em metanol (8 mL) foi adicionada metilamina (0,25 mL de solução a 40% em metanol, 2,54 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 20 h, até que a análise por TLC mostrou o consumo completo da matéria-prima. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica com eluição de EtOAc/hexano (gradientes de 0:1 a 2:1) para dar o composto 6 (300 mg, 0,57 mmol, 88% de rendimento) como um óleo amarelo-pálido. 6-N- (5-Bromotien-2-il)metila-6-N-terc-butoxicarbonila-2',3' -O- isopropilideno-5'-O-(terc-butildimetilsilila) adenosina (8, X = 5-Br)[0055] To the solution of the bis-Boc compound (400 mg, 0.64 mmol) in methanol (8 mL) was added methylamine (0.25 mL of 40% solution in methanol, 2.54 mmol). The mixture was stirred at room temperature for 20 h, until TLC analysis showed complete consumption of the raw material. The mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was purified by silica gel column chromatography eluting with EtOAc/hexane (0:1 to 2:1 gradients) to give compound 6 (300 mg, 0.57 mmol, 88% yield) like a pale yellow oil. 6-N-(5-Bromothien-2-yl)methyl-6-N-tert-butoxycarbonyl-2',3'-O-isopropylidene-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl) adenosine (8, X = 5 -Br)

[0056] Solução do composto 6 (300 mg, 0,57 mmol), (5 bromo-tien-2-il)metanol (164 mg, 0,85 mmol) e trifenilfosfina (226 mg, 0,85 mmol) em THF anidro (9 mL) foi agitada a 45 °C durante 2 min sob atmosfera de N2. Azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD, 0,168 mL, 0,85 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada durante mais 45 minutos até que a análise por TLC mostrou o desaparecimento do composto 6. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (EtOAc/hexano = 1:9) para dar o composto 8 (X = 5-Br) como um óleo amarelo-pálido. N6-[(5-Bromotien-2-il)metila]adenosina (JMF3464)[0056] Solution of compound 6 (300 mg, 0.57 mmol), (5-bromo-thien-2-yl)methanol (164 mg, 0.85 mmol) and triphenylphosphine (226 mg, 0.85 mmol) in THF anhydrous solution (9 mL) was stirred at 45 °C for 2 min under N 2 atmosphere. Diisopropyl azodicarboxylate (DIAD, 0.168 mL, 0.85 mmol) was added dropwise. The mixture was stirred for a further 45 minutes until TLC analysis showed the disappearance of compound 6. The mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was purified by flash chromatography (EtOAc/hexane = 1:9) to give compound 8 (X = 5-Br) as a pale yellow oil. N6-[(5-Bromothien-2-yl)methyl]adenosine (JMF3464)

[0057] Método A: Suspensão do composto 8 (X = 5-Br, 138 mg, 0,19 mmol) em água deionizada (5 mL) e THF (1 mL) foi agitada e arrefecida num banho de gelo. Ácido trifluoroacético (5 mL) foi adicionado gota a gota a 0 °C. A mistura foi agitada durante 10 min, o banho de gelo foi removido, e a mistura foi agitada durante mais 30 min. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (MeOH/EtOAc = 1:49) para dar JMF3464 (composto 1) como um pó branco.[0057] Method A: Suspension of compound 8 (X = 5-Br, 138 mg, 0.19 mmol) in deionized water (5 mL) and THF (1 mL) was stirred and cooled in an ice bath. Trifluoroacetic acid (5 ml) was added dropwise at 0°C. The mixture was stirred for 10 min, the ice bath was removed, and the mixture was stirred for a further 30 min. The mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was purified by flash chromatography (MeOH/EtOAc = 1:49) to give JMF3464 (compound 1) as a white powder.

[0058] Método B: Mistura de (5-bromotien-2-il)metanamina (768 mg, 4 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (143 mg, 0,5 mmol), e di-isopropiletilamina (2 mL, 12 mmol) em 1-propanol (20 mL) foi aquecida a 70 °C durante 7 h. A mistura contendo o produto desejado e que não reagiu (5- bromo-tien-2-il)metanamina foi tratada com dicarbonato de di-terc-butila (0,92 mL, 4 mmol) em THF (6 mL) e NaHCO3 (672 mg, 8 mmol) à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura foi concentrada por evaporação rotativa e purificada por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9). O produto desejado JMF3464 (59 mg, 27% de rendimento) foi obtido por recristalização a partir de MeOH. A pureza do produto foi de 96% como mostrado por HPLC numa coluna HC-C18 (Agilent, 4, 6 x 250 mm, 5 um) com eluição de gradientes de 50% de MeOH aquoso.[0058] Method B: Mixture of (5-bromothien-2-yl)methanamine (768 mg, 4 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (143 mg, 0.5 mmol), and diisopropylethylamine (2 mL, 12 mmol ) in 1-propanol (20 mL) was heated at 70 °C for 7 h. The unreacted mixture containing the desired product (5-bromo-thien-2-yl)methanamine was treated with di-tert-butyl dicarbonate (0.92 mL, 4 mmol) in THF (6 mL) and NaHCO 3 ( 672 mg, 8 mmol) at room temperature for 2 h. The mixture was concentrated by rotary evaporation and purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9). The desired product JMF3464 (59 mg, 27% yield) was obtained by recrystallization from MeOH. Product purity was 96% as shown by HPLC on an HC-C18 column (Agilent, 4.6 x 250 mm, 5 µm) with gradient elution of 50% aqueous MeOH.

[0059] Método C: Num tubo selado (15 mL) adicionou-se (5-bromotien-2-il)metanamina (384 mg, 2 mmol), 6- cloropurina ribofuranosídeo (287 mg, 1 mmol), e di- isopropiletilamina (3 mL, 17 mmol) em EtOH (8 mL). O tubo selado foi colocado na cavidade de um reator de micro-ondas monomodo focalizado (CEM Discover) e irradiado em 100 W durante 20 min a 80 °C. O solvente foi removido por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9), e recristalizado a partir de MeOH para obter o produto desejado JMF3464 (159 mg, 36% de rendimento).[0059] Method C: To a sealed tube (15 mL) was added (5-bromothien-2-yl)methanamine (384 mg, 2 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (287 mg, 1 mmol), and diisopropylethylamine. (3 mL, 17 mmol) in EtOH (8 mL). The sealed tube was placed in the cavity of a focused single-mode microwave reactor (CEM Discover) and irradiated at 100 W for 20 min at 80 °C. The solvent was removed by rotary evaporation. The residue was purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9), and recrystallized from MeOH to obtain the desired product JMF3464 (159 mg, 36% yield).

[0060] C15H16BrN5O4S; pó amarelo; pf 141,4-141,7 °C; [α]25D = -43,0 (DMSO, c = 1,0); TLC (2-propanol/hexano (2:3)) Rf = 0,38; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,55 (1 H, br s), 8,40 (1 H, s), 8,29 (1 H, br s), 7,03 (1 H, d, J = 3,6 Hz), 6,78 (1 H, d, J = 4,0 Hz), 5,90 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 5,45 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 5,34-5,32 (1 H, m), 5,19 (1 H, d, J = 4,4 Hz), 4,76 (2 H, s), 4,63-4,59 (1 H, m), 4,15-4,14 (1 H, m), 3,96-3,95 (1 H, m), 3,69-3,65 (1 H, m), 3,57-3,52 (1 H, m), 13C RMN (DMSO-d6, 100 MHz) δ 153,9, 152,2, 148,5, 145,0, 140,2, 129,6, 126,3, 120,0, 109,7, 87,9 , 85,8, 73,5, 70,6, 61,6, 42,9, ESI-MS calculado para C15H17BrN5O4S: 442,0185, encontrado: m/z 442,0189 [m + H]+. N6-(tien-3-il-metila)adenosina (JMF3461)[0060] C15H16BrN5O4S; yellow powder; mp 141.4-141.7°C; [α]25D = -43.0 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-propanol/hexane (2:3)) Rf = 0.38; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.55 (1H, brs), 8.40 (1H, s), 8.29 (1H, brs), 7.03 (1H, s. d, J = 3.6 Hz), 6.78 (1 H, d, J = 4.0 Hz), 5.90 (1 H, d, J = 6.0 Hz), 5.45 (1 H , d, J = 6.0 Hz), 5.34-5.32 (1 H, m), 5.19 (1 H, d, J = 4.4 Hz), 4.76 (2 H, s ), 4.63-4.59 (1H, m), 4.15-4.14 (1H, m), 3.96-3.95 (1H, m), 3.69-3, 65 (1H, m), 3.57-3.52 (1H, m), 13 C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 153.9, 152.2, 148.5, 145.0, 140 .2, 129.6, 126.3, 120.0, 109.7, 87.9, 85.8, 73.5, 70.6, 61.6, 42.9, ESI-MS calculated for C15H17BrN5O4S: 442.0185, found: m/z 442.0189 [m + H] + . N6-(thien-3-yl-methyl)adenosine (JMF3461)

[0061] Mistura de 3-(aminometila)tiofeno (0,25 mL, 2,5 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (143 mg, 0,5 mmol), e di-isopropiletilamina (2 mL, 12 mmol) em 1-propanol (25 mL) foi aquecida a 80 °C durante 6 h. A mistura foi concentrada por evaporação rotativa, e recristalizada a partir de MeOH para se obter o produto desejado JMF3461 (136 mg, 75% de rendimento). A pureza do produto foi de 99% como mostrado por HPLC numa coluna HC-C18 (Agilent, 4, 6 x 250 mm, 5 um) com eluição de gradientes de 50% de MeOH aquoso. C15H17N5O4S; pó amarelo; pf 134,3-135,1 °C; [α]24D = -58,6 (DMSO, c = 1,0); TLC (2-propanol/hexano, (2:3)) Rf = 0,33; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,36 (2 H, br s), 8,22 (1 H, s), 7,43 (1 H, dd, J = 3,5 Hz), 7,28 (1 H, d, J = 1,6 Hz), 7,09 (1 H, d, J = 4,8 Hz), 5,88 (1 H, d, J = 6,4 Hz), 5,43 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 5,38 (1 H, q, J = 4,6 Hz), 5,17 (1 H, d, J = 4,4 Hz), 4,69 (2 H, s), 4,63-4,16 (1 H, m), 4,14-4,13 (1 H, m), 3,97 -3,95 (1 H, m), 3,69-3,64 (1 H, m), 3,57-3,52 (1 H, m), 13C RMN (DMSO-d6, 100 MHz) δ 154,4, 152,3, 148,5, 140,8, 139,9, 127,9, 125,1, 120,0, 119,8, 87,9, 85,9, 73,5, 70,7, 61,7, 42,9; ESI-MS Calculado para C15H18N5O4S: 364,1080, encontrado: m/z 364,1079 [M + H]+. N6-(Tien-2-il-metila)adenosina (JMF3462)[0061] Mixture of 3-(aminomethyl)thiophene (0.25 mL, 2.5 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (143 mg, 0.5 mmol), and diisopropylethylamine (2 mL, 12 mmol) in 1 -propanol (25 mL) was heated at 80 °C for 6 h. The mixture was concentrated by rotary evaporation, and recrystallized from MeOH to obtain the desired product JMF3461 (136 mg, 75% yield). Product purity was 99% as shown by HPLC on an HC-C18 column (Agilent, 4.6 x 250 mm, 5 µm) with gradient elution of 50% aqueous MeOH. C15H17N5O4S; yellow powder; mp 134.3-135.1°C; [α]24D = -58.6 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-propanol/hexane, (2:3)) Rf = 0.33; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.36 (2 H, br s), 8.22 (1 H, s), 7.43 (1 H, dd, J = 3.5 Hz), 7 .28 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.09 (1 H, d, J = 4.8 Hz), 5.88 (1 H, d, J = 6.4 Hz), 5.43 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.38 (1H, q, J = 4.6 Hz), 5.17 (1H, d, J = 4.4 Hz) , 4.69 (2H, s), 4.63-4.16 (1H, m), 4.14-4.13 (1H, m), 3.97-3.95 (1H, m) m), 3.69-3.64 (1H, m), 3.57-3.52 (1H, m), 13 C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 154.4, 152.3, 148.5, 140.8, 139.9, 127.9, 125.1, 120.0, 119.8, 87.9, 85.9, 73.5, 70.7, 61.7, 42, 9; ESI-MS Calculated for C15H18N5O4S: 364.1080, found: m/z 364.1079 [M+H]+. N6-(Tien-2-yl-methyl)adenosine (JMF3462)

[0062] Mistura de 2-(aminometila)tiofeno (0,25 mL, 2,5 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (143 mg, 0,5 mmol), e di-isopropiletilamina (2 mL, 12 mmol) em 1-propanol (25 mL) foi aquecida a 80 °C durante 7 h. A mistura foi concentrada por evaporação rotativa, e recristalizada a partir de MeOH para obter o produto desejado JMF3462 (154 mg, 85% de rendimento). A pureza do produto foi de 99% como mostrado por HPLC numa coluna HC-C18 (Agilent, 4, 6 x 250 mm, 5 um) com eluição de gradientes de 50% de MeOH aquoso. C15H17N5O4S; pó branco; pf 149,2-149,7 °C; [α]25D = -68,2 (DMSO, c = 1,0); TLC (2-propanol/hexano, (2:3)) Rf = 0,35; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,51 (1 H, br s), 8,39 (1 H, s), 8,27 (1 H, br s), 7,32 (1 H, d, J = 5,2 Hz), 7,28 (1 H, d, J = 3,2 Hz), 6,93 (1 H, dd, J = 1,8, 2,6 Hz), 5,89 (1 H, d, J = 6,0 Hz), 5,46-5,45 (1 H, m) , 5,36 (1 H, q, J = 4,6 Hz), 5,20-5,18 (1 H, m), 4,64 (2 H, s), 4,16-4,13 (1 H, m), 3,97-3,95 (1 H, m ), 3,70-3,65 (1 H, m), 3,58-3,52 (1 H, m), 3,57-3,52 (1 H, m), 13C RMN (DMSO-d6, 100 MHz) δ 154,1, 152,2, 148,5, 142,9, 140,0, 126,5, 125,3, 124,7, 120,0, 87,9, 85,9, 73,5, 70,6, 61,6, 42,9; ESI-MS Calculado para C15H18N5O4S: 364,1080, encontrado: m/z 364,1081 [M + H]+. N6-[(4-Bromotien-2-il)metila]adenosina[0062] Mixture of 2-(aminomethyl)thiophene (0.25 mL, 2.5 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (143 mg, 0.5 mmol), and diisopropylethylamine (2 mL, 12 mmol) in 1 -propanol (25 mL) was heated at 80 °C for 7 h. The mixture was concentrated by rotary evaporation, and recrystallized from MeOH to obtain the desired product JMF3462 (154 mg, 85% yield). Product purity was 99% as shown by HPLC on an HC-C18 column (Agilent, 4.6 x 250 mm, 5 µm) with gradient elution of 50% aqueous MeOH. C15H17N5O4S; White powder; mp 149.2-149.7°C; [α]25D = -68.2 (DMSO, c = 1.0); TLC (2-propanol/hexane, (2:3)) Rf = 0.35; 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.51 (1H, brs), 8.39 (1H, s), 8.27 (1H, brs), 7.32 (1H, s. d, J = 5.2 Hz), 7.28 (1 H, d, J = 3.2 Hz), 6.93 (1 H, dd, J = 1.8, 2.6 Hz), 5, 89 (1H, d, J = 6.0 Hz), 5.46-5.45 (1H, m), 5.36 (1H, q, J = 4.6 Hz), 5.20- 5.18 (1H, m), 4.64 (2H, s), 4.16-4.13 (1H, m), 3.97-3.95 (1H, m), 3. 70-3.65 (1H, m), 3.58-3.52 (1H, m), 3.57-3.52 (1H, m), 13 C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 154.1, 152.2, 148.5, 142.9, 140.0, 126.5, 125.3, 124.7, 120.0, 87.9, 85.9, 73.5, 70 .6, 61.6, 42.9; ESI-MS Calculated for C15H18N5O4S: 364.1080, found: m/z 364.1081 [M+H]+. N6-[(4-Bromothien-2-yl)methyl]adenosine

[0063] Mistura de (4-bromotien-2-il)metanamina (1,152 mg, 6 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (214 mg, 0,75 mmol), e di-isopropiletilamina (3 mL, 18 mmol) em 1-propanol (30 mL) foi aquecida a 70 °C durante 7 h. A mistura contendo o produto desejado e que não reagiu (3-bromotien-2- il)metanamina foi tratada com dicarbonato de di-terc-butila (1,4 mL, 6 mmol) em THF (8 mL) e NaHCO3 (1 g, 1,2 mmol) à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura foi concentrada por evaporação rotativa e purificada por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9) para obter N6-[(4- bromotien-2-il)metila]adenosina. N6-[(3-Bromotien-2-il)metila]adenosina[0063] Mixture of (4-bromothien-2-yl)methanamine (1.152 mg, 6 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (214 mg, 0.75 mmol), and diisopropylethylamine (3 mL, 18 mmol) in 1 -propanol (30 mL) was heated at 70 °C for 7 h. The unreacted mixture containing the desired product (3-bromothien-2-yl)methanamine was treated with di-tert-butyl dicarbonate (1.4 mL, 6 mmol) in THF (8 mL) and NaHCO 3 (1 g , 1.2 mmol) at room temperature for 2 h. The mixture was concentrated by rotary evaporation and purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9) to obtain N6-[(4-bromothien-2-yl)methyl]adenosine. N6-[(3-Bromothien-2-yl)methyl]adenosine

[0064] A um tubo selado (15 mL) foram adicionados (3- bromotien-2-il)metanamina (576 mg, 3 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (430 mg, 1,5 mmol), e di-isopropiletilamina (4,5 mL, 15,5 mmol) em EtOH (10 mL). O tubo selado foi colocado na cavidade de um reator de micro-ondas monomodo focalizado (CEM Discover) e irradiado em 100 W durante 20 min a 80 °C. O solvente foi removido por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9) para obter N6-[(3- bromotien-2-il)metila]adenosina. N6-[(2-Bromotien-3-il)metila]adenosina[0064] To a sealed tube (15 mL) were added (3-bromothien-2-yl)methanamine (576 mg, 3 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (430 mg, 1.5 mmol), and diisopropylethylamine ( 4.5 mL, 15.5 mmol) in EtOH (10 mL). The sealed tube was placed in the cavity of a focused single-mode microwave reactor (CEM Discover) and irradiated at 100 W for 20 min at 80 °C. The solvent was removed by rotary evaporation. The residue was purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9) to obtain N6-[(3-bromothien-2-yl)methyl]adenosine. N6-[(2-Bromothien-3-yl)methyl]adenosine

[0065] A um tubo selado (15 mL) foram adicionados (2- bromotien-3-il)metanamina (384 mg, 2 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (287 mg, 1 mmol), e di-isopropiletilamina (3 mL, 17 mmol) em EtOH (8 mL). O tubo selado foi colocado na cavidade de um reator de micro-ondas monomodo focalizado (CEM Discover) e irradiado em 100 W durante 20 min a 80 °C. O solvente foi removido por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9) para obter N6-[(2-bromotien- 3-il)metila]adenosina. N6-[(4-bromotien-3-il)metila]adenosina[0065] To a sealed tube (15 mL) were added (2-bromothien-3-yl)methanamine (384 mg, 2 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (287 mg, 1 mmol), and diisopropylethylamine (3 mL). , 17 mmol) in EtOH (8 mL). The sealed tube was placed in the cavity of a focused single-mode microwave reactor (CEM Discover) and irradiated at 100 W for 20 min at 80 °C. The solvent was removed by rotary evaporation. The residue was purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9) to obtain N6-[(2-bromothien-3-yl)methyl]adenosine. N6-[(4-bromothien-3-yl)methyl]adenosine

[0066] Uma mistura de (4-bromotien-3-il)metanamina (768 mg, 4 mmol), 6-cloropurina ribofuranosídeo (143 mg, 0,5 mmol), e di-isopropiletilamina (2 mL, 12 mmol) em 1- propanol (20 mL) foi aquecida a 70 °C durante 7 h. A mistura contendo o produto desejado e não reagido (4- bromotien-3-il)metanamina foi tratada com dicarbonato de di-terc-butila (0,92 mL, 4 mmol) em THF (6 mL) e NaHCO3 (672 mg, 8 mmol) à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura foi concentrada por evaporação rotativa e purificada por cromatografia flash (gel de sílica, MeOH/EtOAc = 1:9) para obter N6-[(4-bromotien-3- il)metila]adenosina. 6-N-(5-Bromotien-3-il)metila-6-N-terc-butoxicarbonil-2 ',3'-O- isopropilideno-5'-O- (terc-butildimetilsilil)adenosina[0066] A mixture of (4-bromothien-3-yl)methanamine (768 mg, 4 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (143 mg, 0.5 mmol), and diisopropylethylamine (2 mL, 12 mmol) in 1-propanol (20 mL) was heated at 70 °C for 7 h. The mixture containing the desired, unreacted product (4-bromothien-3-yl)methanamine was treated with di-tert-butyl dicarbonate (0.92 mL, 4 mmol) in THF (6 mL) and NaHCO 3 (672 mg, 8 mmol) at room temperature for 2 h. The mixture was concentrated by rotary evaporation and purified by flash chromatography (silica gel, MeOH/EtOAc = 1:9) to obtain N6-[(4-bromothien-3-yl)methyl]adenosine. 6-N-(5-Bromothien-3-yl)methyl-6-N-tert-butoxycarbonyl-2',3'-O-isopropylidene-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)adenosine

[0067] Solução do composto 6 (360 mg, 0,68 mmol), (5 bromotien-3-il)metanol (197 mg, 1,02 mmol) e trifenilfosfina (271 mg, 1,02 mmol) em THF anidro (10 mL) foi agitada a 45 °C durante 2 min sob atmosfera de N2. Azodicarboxilato de di-isopropila (DIAD, 0,20 mL, 1,02 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada até que a análise TLC mostrou o desaparecimento do composto 6. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (EtOAc/hexano = 1:9) para obter 6-N- (5-bromothien-3-yl)metila-6-N-tert-butoxicarbonil-2',3' -O- isopropilideno-5' -O- (terc-butildimetilsilila)adenosina. N6-[(5-Bromotien-3-il)metila]adenosina[0067] Solution of compound 6 (360 mg, 0.68 mmol), (5-bromothien-3-yl)methanol (197 mg, 1.02 mmol) and triphenylphosphine (271 mg, 1.02 mmol) in anhydrous THF ( 10 ml) was stirred at 45 °C for 2 min under N2 atmosphere. Diisopropyl azodicarboxylate (DIAD, 0.20 mL, 1.02 mmol) was added dropwise. The mixture was stirred until TLC analysis showed the disappearance of compound 6. The mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was purified by flash chromatography (EtOAc/hexane = 1:9) to obtain 6-N-(5-bromothien-3-yl)methyl-6-N-tert-butoxycarbonyl-2',3'-O - isopropylidene-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)adenosine. N6-[(5-Bromothien-3-yl)methyl]adenosine

[0068] Suspensão de 6-N-(5-bromotien-3-il)metila-6-N-terc-butoxicarbonil-2',3'-O-iso propilideno-5'-O-(terc-butildimetilsilila)adenosina (138 mg, 0,19 mmol) em água deionizada (5 mL) e THF (1 mL) foi agitada e arrefecida num banho de gelo. Ácido trifluoroacético (5 mL) foi adicionado gota a gota a 0 °C. A mistura foi agitada durante 10 min, o banho de gelo foi removido, e a mistura foi agitada durante mais 30 min. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida por evaporação rotativa. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (MeOH/EtOAc = 1:49) para obter N6-[(5- bromotien-3-il)metila]adenosina. (5-Clorotien-2-il)metanamina[0068] 6-N-(5-bromothien-3-yl)methyl-6-N-tert-butoxycarbonyl-2',3'-O-isopropylidene-5'-O-(tert-butyldimethylsilyl)adenosine suspension (138 mg, 0.19 mmol) in deionized water (5 mL) and THF (1 mL) was stirred and cooled in an ice bath. Trifluoroacetic acid (5 ml) was added dropwise at 0°C. The mixture was stirred for 10 min, the ice bath was removed, and the mixture was stirred for a further 30 min. The mixture was concentrated under reduced pressure by rotary evaporation. The crude product was purified by flash chromatography (MeOH/EtOAc = 1:49) to obtain N6-[(5-bromothien-3-yl)methyl]adenosine. (5-Chlorothien-2-yl)methanamine

[0069] Mistura de 2-(aminometila)tiofeno (1 mL, 10 mmol), dicarbonato de di-terc-butila (2,5 mL, 11 mmol), e NaHCO3 (840 mg, 10 mmol) em THF (13 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas para dar uma suspensão contendo sólidos amarelo-pálido. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, e o resíduo extraído com CH2Cl2 e H2O. A fase orgânica foi secada sobre MgSO4, filtrada, e purificada por cromatografia flash sobre uma coluna de gel de sílica com eluição de EtOAc/hexano (1:20) para dar terc- butila(tien-2-il)carbamato de metila (C10H15NO2S, 1,62 g, 76% de rendimento).[0069] Mixture of 2-(aminomethyl)thiophene (1 mL, 10 mmol), di-tert-butyl dicarbonate (2.5 mL, 11 mmol), and NaHCO 3 (840 mg, 10 mmol) in THF (13 mL ) was stirred at room temperature for 3 hours to give a suspension containing pale yellow solids. The mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue extracted with CH2Cl2 and H2O. The organic phase was dried over MgSO4, filtered, and purified by flash chromatography over a silica gel column eluting with EtOAc/hexane (1:20) to give methyl tert-butyl(thien-2-yl)carbamate (C10H15NO2S , 1.62 g, 76% yield).

[0070] Mistura de carbamato de terc-butila(tien-2- il)metila (106 mg, 0,5 mmol), N-clorossuccinimida (73 mg, 0,55 mmol) em benzeno (0,3 mL) foi agitada a 80 °C. Após 2 h, foi adicionado ácido acético (0,3 mL, 5 mmol) e deixado a reagir durante mais 21 h. A mistura foi extraída com CH2Cl2 e H2O. A fase orgânica foi secada sobre MgSO4, filtrada, e purificada por cromatografia flash em uma coluna de gel de sílica com eluição de EtOAc/hexano (1:20) para dar terc-butila(5-clorotien-2-il)carbamato de metila (C10H14ClNO2S, 82,6 mg, 67% de rendimento).[0070] Mixture of tert-butyl(thien-2-yl)methyl carbamate (106 mg, 0.5 mmol), N-chlorosuccinimide (73 mg, 0.55 mmol) in benzene (0.3 mL) was stirred at 80°C. After 2 h, acetic acid (0.3 mL, 5 mmol) was added and allowed to react for a further 21 h. The mixture was extracted with CH2Cl2 and H2O. The organic phase was dried over MgSO4 , filtered, and purified by flash chromatography on a silica gel column eluting with EtOAc/hexane (1:20) to give methyl tert-butyl(5-chlorothien-2-yl)carbamate (C10H14ClNO2S, 82.6 mg, 67% yield).

[0071] Mistura do composto acima preparado (65 mg, 0,26 mmol) e TFA (1 mL, 13 mmol) em CH2Cl2 (1 mL) foi agitada durante 3 h à temperatura ambiente. A solução foi concentrada sob pressão reduzida para dar (5-clorotien-2- il)metanamina (~100% de rendimento). C5H6NSCl; sólido amarelo claro; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,07 (1 H, d, J = 4,0 Hz), 6,95 (1 H, d, J = 3,6 Hz), 4,26 (2H, s); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) δ 134,9, 132,8, 130,7, 128,0, 38,8; ESI- HRMS calculado para C5H7ClNS: 147,9988, encontrado: m/z 147,9995 [M + H]+. N6-[(5-Clorotien-2-il)metila]adenosina (JMF3818)[0071] Mixture of the above-prepared compound (65 mg, 0.26 mmol) and TFA (1 mL, 13 mmol) in CH2Cl2 (1 mL) was stirred for 3 h at room temperature. The solution was concentrated under reduced pressure to give (5-chlorothien-2-yl)methanamine (~100% yield). C5H6NSCl; light yellow solid; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.07 (1H, d, J = 4.0 Hz), 6.95 (1H, d, J = 3.6 Hz), 4.26 (2H, s ); 13 C NMR (100 MHz, CD3 OD) δ 134.9, 132.8, 130.7, 128.0, 38.8; ESI-HRMS calculated for C5H7ClNS: 147.9988, found: m/z 147.9995 [M+H]+. N6-[(5-Chlorothien-2-yl)methyl]adenosine (JMF3818)

[0072] Mistura de (5-clorotien-2-il)metanamina (35,4 mg, 0,24 mmol), ribofuranosídeo 6-cloropurina (0,12 mmol) e di- isopropiletilamina (0,36 mL, 2 mmol) em EtOH (1 mL) foi agitada num tubo selado a 80 °C por irradiação de microondas durante 30 min. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente, e concentrada sob pressão reduzida para dar um óleo amarelo pálido, o qual foi lavado sucessivamente com H2O e MeOH para dar o composto do título JMF3818. C15H16ClN5O4S; sólido branco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 8,29 (1 H, s), 8,27 (1 H, s), 6,88 (1 H, d, J = 3,6 Hz), 6,79 (1 H, d, J = 3,6 Hz) , 5,96 (1 H, d, J = 6,8 Hz), 4,74-4,77 (1 H, m), 4,32-4,34 (1 H, m), 4,17 (1 H, d, J = 2,8 Hz), 3,89 (1 H, dd, J = 12,4, 2,0 Hz), 3,75 (1 H, dd, J = 12,4, 2,8 Hz); 13C RMN (100 MHz, CD3OD) δ 156,0, 153,6, 142,8, 142,0, 129,9, 127,0, 126,6, 121,7, 91,5, 88,4, 75,6, 72,9, 63,7, 40,4; ESI-HRMS calculado para C15H17ClN5O4S: 398,0690, encontrado: m/z 398,0692 [M + H]+.[0072] Mixture of (5-chlorothien-2-yl)methanamine (35.4 mg, 0.24 mmol), 6-chloropurine ribofuranoside (0.12 mmol) and diisopropylethylamine (0.36 mL, 2 mmol) in EtOH (1 mL) was stirred in a sealed tube at 80°C by microwave irradiation for 30 min. The mixture was cooled to room temperature, and concentrated under reduced pressure to give a pale yellow oil, which was washed successively with H 2 O and MeOH to give the title compound JMF3818. C15H16ClN5O4S; white solid; 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.29 (1 H, s), 8.27 (1 H, s), 6.88 (1 H, d, J = 3.6 Hz), 6.79 ( 1 H, d, J = 3.6 Hz), 5.96 (1 H, d, J = 6.8 Hz), 4.74-4.77 (1 H, m), 4.32-4, 34 (1 H, m), 4.17 (1 H, d, J = 2.8 Hz), 3.89 (1 H, dd, J = 12.4, 2.0 Hz), 3.75 ( 1H, dd, J = 12.4, 2.8 Hz); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 156.0, 153.6, 142.8, 142.0, 129.9, 127.0, 126.6, 121.7, 91.5, 88.4, 75 .6, 72.9, 63.7, 40.4; ESI-HRMS calculated for C15H17ClN5O4S: 398.0690, found: m/z 398.0692 [M + H] + .

[0073] Estudo farmacocinético. O composto foi administrado na forma de soluções aquosas em solução salina normal. Camundongos ICR machos foram adquiridos de BioLASCO Taiwan Co., Ltd. Para medir a biodisponibilidade oral dos compostos de teste (T1-11 e JMF3464), amostras de sangue foram colhidas a partir de camundongos ICR machos (6 semanas de idade; 20-25 g) depois de administrações por via oral (10 mg/kg) ou intravenosa (1 mg/kg) dos compostos de teste. Para T1-11, amostras de sangue foram recolhidas aos 2, 10, 30, 60, 120, 360 minutos após a administração intravenosa e aos 15, 30, 45, 60, 120, 360 minutos após a administração oral. Para JMF3464, as amostras de sangue foram recolhidas aos 2, 10, 30, 60, 120, 240, 360, 480 minutos após a administração intravenosa e aos 15, 30, 60, 90, 120, 240, 360, 480 minutos após a administração oral. As amostras de sangue foram extraídas por metanol com ácido fórmico a 0,1%, e, em seguida, 10 μl dos extratos das amostras foram injetados para UPLC-MSMS para a quantificação.[0073] Pharmacokinetic study. The compound was administered as aqueous solutions in normal saline. Male ICR mice were purchased from BioLASCO Taiwan Co., Ltd. To measure the oral bioavailability of the test compounds (T1-11 and JMF3464), blood samples were collected from male ICR mice (6 weeks old; 20-25 g) after oral administrations (10 mg/kg ) or intravenous (1 mg/kg) of the test compounds. For T1-11, blood samples were collected at 2, 10, 30, 60, 120, 360 minutes after intravenous administration and at 15, 30, 45, 60, 120, 360 minutes after oral administration. For JMF3464, blood samples were collected at 2, 10, 30, 60, 120, 240, 360, 480 minutes after intravenous administration and at 15, 30, 60, 90, 120, 240, 360, 480 minutes after intravenous administration. oral administration. Blood samples were extracted by methanol with 0.1% formic acid, and then 10 μl of sample extracts were injected into UPLC-MSMS for quantification.

[0074] Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos usando um programa farmacocinético WinNonlin, ajuste dos dados a um modelo não compartimentado. Os parâmetros farmacocinéticos, que incluem a área sob a curva de concentração versus tempo no plasma (AUC) para o último momento de amostragem, (AUC0-120), para o tempo infinito (AUC0-~), a fase de meia-vida terminal (T1/2), a concentração máxima de composto no plasma (Cmax), o tempo de Cmax(Tmax) e a constante de velocidade de primeira ordem associada com a parte terminal da curva (k) foram estimadas por meio de regressão linear do tempo vs o log da concentração. A depuração plasmática total (CL) foi calculada como dose/AUCi.v. A biodisponibilidade oral (F) do composto de teste por administração oral foi calculada a partir da AUC - da dose oral dividida pela AUC - da dose i.v.[0074] Pharmacokinetic parameters were obtained using a WinNonlin pharmacokinetic program, fitting the data to a non-compartmentalized model. Pharmacokinetic parameters, which include area under the plasma concentration versus time curve (AUC) for the last sampling time point, (AUC0-120), for infinite time (AUC0-~), the terminal half-life phase (T1/2), the maximum concentration of compound in the plasma (Cmax), the time of Cmax(Tmax) and the first-order rate constant associated with the terminal part of the curve (k) were estimated by means of linear regression of the time vs log concentration. Total plasma clearance (CL) was calculated as dose/AUCi.v. The oral bioavailability (F) of the test compound by oral administration was calculated from the AUC - of the oral dose divided by the AUC - of the i.v.

EXEMPLO 2EXAMPLE 2

[0075] Ensaios de ligação radioligandos. Ensaios de ligação de radioligandos foram realizados por MDS Pharma Serviços Taiwan (Taipei, Taiwan) utilizando protocolos de ligação padrão. Para os ensaios de ligação A2AR, proteínas de membrana recolhidas a partir de células HEK293 que sobre-expressam A2AR humana foram incubadas no tampão de reação [Tris-HCl (pH 7,4) 5o mM, MgCl2 1o mM, EDTA 1 mM e 2 U/mL de adenosina desaminase] contendo 3H-CGS2168o (5o nM) durante 90 min a 25 °C. A ligação não específica foi avaliada na presença de 5o μM de adenosina-5'-N- etilcarboxamida. Para medir a afinidade de ligação do T1-11 ao A3R, proteínas recolhidas da membrana a partir de células do ovário de hamster chinês (CHO)-K1 que sobre- expressam a A3R humana foram incubadas com 3H-AB-MECA (0,5 nM) durante 60 min a 25 °C na reação que continha 25 mM de tampão HEPES (pH 7,4), 5 mM de MgC2, 1 mM de CaCl., e 0,1% de albumina de soro bovino. A ligação não especifica foi avaliada na presença de 1 μM IB-MECA (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, EUA). Os ensaios de ligação para transportadores de adenosina foram realizados conforme descrito anteriormente. Frações de membrana recolhidas a partir do córtex cerebral de cobaias Duncan Hartley- derivadas foram incubadas com 6-[(4-nitrobenzil)tio]-9-β-D- ribofuranosilpurina (NBTI, 0,5 nM) 3H-rotulados durante 30 min a 25 °C no tampão de incubação que continha Tris-HCl 50 (pH 7,4). A ligação não especifica foi avaliada na presença de 5 μM NBTI, um inibidor eficaz de transportadores de nucleosídeos equilibrativos. Note-se que o NBTI é um inibidor de alta afinidade ao ENT1 e inibe apenas a (h)ENT1 humana a 0,5 nM. As reações foram terminadas por filtração através de fibras de vidro GF/B e lavagem com o tampão de reação.[0075] Radioligand binding assays. Radioligand binding assays were performed by MDS Pharma Services Taiwan (Taipei, Taiwan) using standard binding protocols. For A2AR binding assays, membrane proteins collected from HEK293 cells overexpressing human A2AR were incubated in reaction buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl2 , 1 mM EDTA and 2 U/ml adenosine deaminase] containing 3H-CGS2168o (50 nM) for 90 min at 25°C. Non-specific binding was assessed in the presence of 50 μM adenosine-5'-N-ethylcarboxamide. To measure the binding affinity of T1-11 to A3R, membrane proteins harvested from Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cells that overexpress human A3R were incubated with 3H-AB-MECA (0.5 nM) for 60 min at 25°C in the reaction containing 25 mM HEPES buffer (pH 7.4), 5 mM MgC2 , 1 mM CaCl., and 0.1% bovine serum albumin. Non-specific binding was evaluated in the presence of 1 µM IB-MECA (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA). Binding assays for adenosine transporters were performed as described above. Membrane fractions collected from the cerebral cortex of Duncan Hartley-derived guinea pigs were incubated with 3H-labeled 6-[(4-nitrobenzyl)thio]-9-β-D-ribofuranosylpurine (NBTI, 0.5 nM) for 30 min. at 25°C in the incubation buffer containing Tris-HCl 50 (pH 7.4). Non-specific binding was evaluated in the presence of 5 μM NBTI, an effective inhibitor of equilibrating nucleoside transporters. Note that NBTI is a high affinity inhibitor of ENT1 and only inhibits human (h)ENT1 at 0.5 nM. Reactions were terminated by filtration through GF/B glass fibers and washing with reaction buffer.

Cultura de células e transfecção transienteCell culture and transient transfection

[0076] Células de rato PC12 adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA) foram mantidas em DMEM suplementado com soro de cavalo a 10% e de FBS a 5% e incubadas numa incubadora de CO2 (5%) a 37 °C. LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen) foi utilizado como veículo para transferir os plasmídeos para dentro de células de acordo com o protocolo do fabricante. Os plasmídeos foram gentilmente cedidos pelo Dr. Pulst (Departamento de Neurologia da Universidade de Utah, EUA). Normalmente, 5 μg de ADN combinada com 5 μl de LIPOFECTAMINE™ 2000 foram aplicados a cada poço de placas de 6 poços. O número de plaqueamento foi de (1~1,5) x 106 células/poço. Após as transfecções durante 6 horas, as células foram tratadas com os reagentes durante mais 24 h. As imagens foram obtidas com um microscópio de fluorescência invertida Zeiss Axiovert 200M (Gottingen, Alemanha).[0076] Mouse PC12 cells purchased from the American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) were maintained in DMEM supplemented with 10% horse serum and 5% FBS and incubated in a CO2 incubator (5%) at 37°C. LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen) was used as a vehicle to transfer the plasmids into cells according to the manufacturer's protocol. Plasmids were kindly provided by Dr. Pulst (Department of Neurology, University of Utah, USA). Typically, 5 µg of DNA combined with 5 µl of LIPOFECTAMINE™ 2000 was applied to each well of 6-well plates. The plating number was (1~1.5) x 10 6 cells/well. After transfections for 6 hours, the cells were treated with the reagents for a further 24 h. Images were obtained with a Zeiss Axiovert 200M inverted fluorescence microscope (Gottingen, Germany).

[0077] Ensaio MTT. A sobrevivência foi avaliada por ensaio de metabolismo com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,5-difenila tetrazólio (MTT). Em resumo, depois do tratamento, adicionou-se MTT ao meio (0,5 mg/ml) e incubou- se a 37 °C durante 2 a 3 h. O número de plaqueamento foi de 1x104 células/poço numa placa de 96 poços. Depois de deitar fora o meio, DMSO foi aplicada ao poço para dissolver cristais de formazano, e as absorvâncias a 570 e 630 nm em cada poço foram medidas em um leitor (ELISA) para ensaio de imunoabsorção de micro-conexão-enzimática.[0077] MTT Assay. Survival was assessed by metabolism assay with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Briefly, after treatment, MTT was added to the medium (0.5 mg/ml) and incubated at 37°C for 2 to 3 h. The plating number was 1x10 4 cells/well in a 96-well plate. After discarding the medium, DMSO was applied to the well to dissolve formazan crystals, and the absorbances at 570 and 630 nm in each well were measured in a reader (ELISA) for enzyme-linked microlink immunosorbent assay.

EXEMPLO 3EXAMPLE 3

[0078] Animais e administração de medicamentos. Camundongos R6/2 machos (Mangiarini et al, 1996 Cell 87:493-506) e controles da mesma ninhada foram originalmente obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA), e unidos a camundongos fêmea de controle (B6CBAFI/J). Os filhos foram identificados mediante reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica de genotipagem de ADN genômico extraído a partir de tecidos da cauda, utilizando os iniciadores localizados no transgene (5'- CCGCTCAGGTTCTGCTTTTA-3'; SEQ ID NO: 1, e 5'- GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3'; SEQ ID NO: 2) para assegurar que o número de repetições CAG se mantivesse em cerca de 150. Os animais foram alojados no Institute of Biomedical Sciences Animal Care Facility sob ciclo de luz/escuridão de 12/12-h. Os pesos corporais dos camundongos foram registrados uma vez por dia. Experimentos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pela Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Committee, Taipei, Taiwan.[0078] Animals and drug administration. Male R6/2 mice (Mangiarini et al, 1996 Cell 87:493-506) and littermate controls were originally obtained from Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA), and mated to female control mice (B6CBAFI/J) . The offspring were identified by polymerase chain reaction (PCR), genotyping technique of genomic DNA extracted from tail tissues, using the primers located in the transgene (5'-CCGCTCAGGTTCTGCTTTTA-3'; SEQ ID NO: 1, and 5'- GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3'; SEQ ID NO: 2) to ensure that the number of CAG repeats remained at about 150. Animals were housed at the Institute of Biomedical Sciences Animal Care Facility under a 12/2 light/dark cycle. 12 pm The body weights of the mice were recorded once a day. Animal experiments were performed according to protocols approved by Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Committee, Taipei, Taiwan.

[0079] Desempenho rotarod. A coordenação motora foi avaliada usando um aparelho rotarod (UGO Basile, Comerio, Itália), em velocidade constante (12 rpm) durante um período de 2 min (Carter et al, 1999 J Neurosci 19:3248-3257). Todos os camundongos foram treinados durante 2 dias na idade de 4 semanas para permitir que se familiarizassem com o aparelho rotarod. Os animais foram então testados três vezes por semana nas idades de 4~12 semanas. Para cada teste, os animais foram colocados no aparelho antes do início da rotação. A latência de queda foi gravada automaticamente. Cada camundongo submetido a três ensaios por um máximo de 2 min para cada ensaio.[0079] Rotarod performance. Motor coordination was assessed using a rotarod device (UGO Basile, Comerio, Italy) at constant speed (12 rpm) for a period of 2 min (Carter et al, 1999 J Neurosci 19:3248-3257). All mice were trained for 2 days at the age of 4 weeks to allow them to become familiar with the rotarod device. Animals were then tested three times a week at ages 4~12 weeks. For each test, the animals were placed in the apparatus before the start of rotation. Fall latency was recorded automatically. Each mouse undergoes three trials for a maximum of 2 min for each trial.

EXEMPLO 4EXAMPLE 4

[0080] Animais. Os camundongos C57BL/6 foram adquiridos do National Laboratory Animal Center (Taiwan). Os camundongos transgênicos (ATAXN2Q127) foram fornecidos pelo Dr. Pulst. Os camundongos foram mantidos em uma sala à prova de som sob um ciclo de luz/escuridão de 12/12 h e temperatura controlada (22±2 °C). Alimento e água estavam disponíveis ad libitum. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e sua dor e desconforto, de acordo com os princípios e diretrizes do “NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”. Estas experiências também foram revistas e aprovadas pelo Institutional Animal Care and Use Committee at the National Research Institute of Chinese Medicine (Aprovação No: 10015).[0080] Animals. C57BL/6 mice were purchased from the National Laboratory Animal Center (Taiwan). The transgenic mice (ATAXN2Q127) were provided by Dr. Pulse Mice were kept in a soundproof room under a 12/12 h light/dark cycle and controlled temperature (22±2 °C). Food and water were available ad libitum. Every effort has been made to minimize the number of animals used and their pain and discomfort, in accordance with the principles and guidelines of the NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. These experiments were also reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the National Research Institute of Chinese Medicine (Approval No: 10015).

[0081] Ensaio de retardo de filtro. Este método seguido descrito por Wanker et al. (1999, Methods Enzymol. 309:. 375-386) com algumas modificações. Em resumo, as células colhidas foram ressuspensas no tampão de lise (Tris-HCl (pH 8,8) 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 5,0 mM, EDTA 1 mM e 0,5% (p/v) IPGEAL que continha 1x coquetel inibidor de protease (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA)) e submetida a ultrassons durante 10 s (1 pulso/s). As concentrações de proteína igual (15~20 μg/poço) em cada grupo foram filtradas através de membrana de acetato de celulose (SDS)- pré-equilibrada com dodecilsulfato de sódio a 2% (0,2 μM; Whatman, Maidstone, Kent, Reino Unido), utilizando o Aparelho Bio-Dot SF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Durante a sucção, cada poço foi lavado duas vezes com 200 μl de SDS a 0,1%. A membrana foi bloqueada em TBS (Tris-HCl 100 mM e NaCl 150 mM; pH 7,4) que continha 3% de leite magro seco por 1 h à temperatura ambiente e depois incubada com antipoliglutamina (1:5000; MAB1574) anticorpo em albumina de soro bovino (BSA) a 3% com NaN3 a 0,02% (4 °C durante a noite) para investigar ATAXN2 normal e mutante. Os métodos subsequentes foram as mesmos que os descritos acima.[0081] Filter delay test. This method followed described by Wanker et al. (1999, Methods Enzymol. 309: 375-386) with some modifications. Briefly, the harvested cells were resuspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 100 mM NaCl, 5.0 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA and 0.5% (w/v) IPGEAL which contained 1x protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)) and sonicated for 10 s (1 pulse/s). Equal protein concentrations (15~20 μg/well) in each group were filtered through cellulose acetate membrane (SDS)- pre-equilibrated with 2% sodium dodecyl sulfate (0.2 μM; Whatman, Maidstone, Kent , UK) using the Bio-Dot SF Apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). During suction, each well was washed twice with 200 μl of 0.1% SDS. The membrane was blocked in TBS (100 mM Tris-HCl and 150 mM NaCl; pH 7.4) containing 3% dry skimmed milk for 1 h at room temperature and then incubated with antipolyglutamine (1:5000; MAB1574) antibody in 3% bovine serum albumin (BSA) with 0.02% NaN3 (4°C overnight) to investigate normal and mutant ATAXN2. Subsequent methods were the same as described above.

[0082] Desempenho rotarod. Camundongos de ocorrência natural e transgênicos com a idade de 5 semanas foram utilizados neste estudo. A coordenação motora foi avaliada usando um aparelho rotarod (UGO Basile, Comerio, Itália), em velocidade acelerada (10 a 28 rpm) durante um período de 5 min. Todos os ratos foram treinados por 2 dias dentro do período da idade de 5 semanas para permitir que se familiarizassem com o aparelho rotarod. Além disso, nessa semana parte dos camundongos transgênicos começaram a tomar T1-11 dissolvidos na água de beber diária. Os animais foram então testados formalmente 2 vezes por semana a partir da idade de 6 semanas. Para cada teste, os animais foram colocados no aparelho antes do início da rotação. Latência de queda foi gravada automaticamente. Cada camundongo foi submetido a 2 ensaios de cada vez. Os camundongos foram deixados em repouso por 20~30 min entre os ensaios.[0082] Rotarod performance. Naturally occurring and transgenic mice at the age of 5 weeks were used in this study. Motor coordination was assessed using a rotarod device (UGO Basile, Comerio, Italy) at accelerated speed (10 to 28 rpm) for a period of 5 min. All rats were trained for 2 days within the 5 week age period to allow them to become familiar with the rotarod apparatus. In addition, this week, part of the transgenic mice began taking T1-11 dissolved in their daily drinking water. Animals were then formally tested 2 times a week from the age of 6 weeks. For each test, the animals were placed in the apparatus before the start of rotation. Drop latency was recorded automatically. Each mouse was subjected to 2 trials at a time. Mice were allowed to rest for 20~30 min between trials.

EXEMPLO 5EXAMPLE 5

[0083] Teste comportamental. Funções de equilíbrio e coordenação dos camundongos foram determinadas pela realização do teste de rotarod. Os camundongos foram colocados no tambor movimentado de um aparelho rotarod (Accelerating Model, Ugo Basile Biological Research Apparatus), o qual foi então acelerado até o camundongo cair do tambor para a placa e parar o temporizador. A latência de queda foi medida em quatro ensaios por dia ao longo de 4 dias.[0083] Behavioral test. The mice's balance and coordination functions were determined by performing the rotarod test. The mice were placed in the moving drum of a rotarod apparatus (Accelerating Model, Ugo Basile Biological Research Apparatus), which was then accelerated until the mouse dropped from the drum onto the plate and stopped the timer. Fall latency was measured in four trials per day over 4 days.

[0084] Coloração imuno-histoquímica. Camundongos de ocorrência natural ou transgênicos SCA3 foram anestesiados e perfundidos transcardialmente com 4% de paraformaldeído em PBS. O cérebro foi equilibrado em meio Tissue-Tek de embutir e congelado em nitrogênio líquido. Secções coronais (20 μm) preparadas por seccionamento criostático foram permeabilizadas em 0,1% de Triton X-100, e incubadas a 4 °C durante 48 horas com antissoro monoclonal anti-NeuN diluído (Chemicon). Subsequentemente, as secções foram lavadas e incubadas com IgG de cavalo anticamundongo biotinilado seguido por incubação com o complexo de peroxidase de avidina-biotina de raiz-forte. As secções foram então lavadas e reveladas numa solução de diaminobenzidina. Neurônios NeuN-positivos foram visualizados e contados por um microscópio Leica DM2500 equipado com uma câmara CCD Retiga-2000R (QImaging) e um MAC 600 de 3-eixos de etapa motorizada controlado por computador (Ludl Electronics) com o auxílio do software StereoInvestigator (MBF Bioscience). Cada análise incluiu o processamento de 15 seções de cérebro por camundongo.[0084] Immunohistochemical staining. Naturally occurring or transgenic SCA3 mice were anesthetized and perfused transcardially with 4% paraformaldehyde in PBS. The brain was equilibrated in Tissue-Tek embedding medium and frozen in liquid nitrogen. Coronal sections (20 µm) prepared by cryosectioning were permeabilized in 0.1% Triton X-100, and incubated at 4°C for 48 hours with diluted anti-NeuN monoclonal antiserum (Chemicon). Subsequently, the sections were washed and incubated with biotinylated horse anti-mouse IgG followed by incubation with the avidin peroxidase-horseradish-biotin complex. Sections were then washed and developed in diaminobenzidine solution. NeuN-positive neurons were visualized and counted by a Leica DM2500 microscope equipped with a Retiga-2000R CCD camera (QImaging) and a computer-controlled 3-axis motorized step-step MAC 600 (Ludl Electronics) with the aid of StereoInvestigator (MBF) software. Bioscience). Each analysis included processing 15 brain sections per mouse.

EXEMPLO 6EXAMPLE 6

[0085] Animais e entrega do medicamento. Camundongos transgênicos B6SJL-Tg(Prnp-TARDBP)4Jlel/J foram comprados de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine EUA), e procriados pelo National Laboratory Animal Center em Tainan. Os camundongos transgênicos foram triados por PCR com um iniciador direto 5'-GGT GGT GGG ATG AAC TTT GG-3' (SEQ ID NO: 3) e um iniciador inverso 5'-GAT GTG AAC CCC CCC TCC AGC CTA GAC-3' (SEQ ID NO: 4). Os camundongos de ocorrência natural eram não transgênicos da mesma ninhada. Os camundongos de 6 semanas de idade receberam, por cirurgia, uma microbomba osmótica ALZET Modelo 1004 (DURECT Corporation, Cupertino, CA, EUA) que continha DMSO ou JMF1907 como indicado, incorporado por via subcutânea no lado ventral lateral do abdômen. A bomba foi substituída a cada 28 dias.[0085] Animals and drug delivery. B6SJL-Tg(Prnp-TARDBP)4Jlel/J transgenic mice were purchased from Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine USA), and bred by the National Laboratory Animal Center in Tainan. Transgenic mice were screened by PCR with a forward primer 5'-GGT GGT GGG ATG AAC TTT GG-3' (SEQ ID NO: 3) and a reverse primer 5'-GAT GTG AAC CCC CCC TCC AGC CTA GAC-3' (SEQ ID NO: 4). Naturally occurring mice were non-transgenic littermates. The 6-week-old mice were surgically given an ALZET Model 1004 osmotic micropump (DURECT Corporation, Cupertino, CA, USA) containing DMSO or JMF1907 as indicated, incorporated subcutaneously into the ventral lateral side of the abdomen. The pump was replaced every 28 days.

[0086] Força de preensão. A força de preensão foi medida com Grip Strength-Meter (TSE Systems, Inc., MO, EUA). Resumidamente, um camundongo foi escolhido a dedo por sua cauda e permitido agarrar um aparelho de aperto de altura ajustável montado sobre um sensor de força. Uma força de tração foi aplicada ao camundongo pela cauda. A força máxima foi mostrada em um visor de painel digital de uma unidade de controle ligada quando o camundongo liberava seu aperto. Cada camundongo foi repetidamente testado por 3 vezes.[0086] Grip strength. Grip strength was measured with a Grip Strength-Meter (TSE Systems, Inc., MO, USA). Briefly, a mouse was handpicked for its tail and allowed to grasp a height-adjustable grip device mounted on a force sensor. A pulling force was applied to the mouse by the tail. Maximum force was shown on a digital panel display of a control unit turned on when the mouse released its grip. Each mouse was repeatedly tested 3 times.

[0087] Desempenho rotarod. A coordenação motora dos camundongos de ocorrência natural e transgênicos foi avaliada usando um aparelho (Ugo Basile, Comerio, Itália) a uma velocidade constante (40 rpm) durante 120 segundos. Todos os camundongos foram treinados por 2 dias por semana, durante 2 semanas. Os camundongos foram então testados formalmente 2 vezes por semana desde a idade de 9 semanas. Para cada teste, os animais foram colocados no aparelho antes do início da rotação. Latência de queda foi gravada automaticamente. Cada camundongo foi submetido a 3 ensaios por vez. Os camundongos foram deixados em repouso por 20 min entre os testes.[0087] Rotarod performance. Motor coordination of naturally occurring and transgenic mice was assessed using a device (Ugo Basile, Comerio, Italy) at a constant speed (40 rpm) for 120 seconds. All mice were trained 2 days a week for 2 weeks. Mice were then formally tested 2 times a week from the age of 9 weeks. For each test, the animals were placed in the apparatus before the start of rotation. Drop latency was recorded automatically. Each mouse was subjected to 3 trials at a time. Mice were allowed to rest for 20 min between tests.

[0088] Cultura de células e transfecção. A linha celular do neurônio motor (NSC34) foi uma oferta generosa do Dr. Neil Cashman (Brain Research Centre, The University of British Columbia, Canadá), e cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco da alto-glucose (DMEM, na sigla em inglês) que continha 10% de soro fetal de vitelo (FCS, na sigla em inglês), 2 mM de L-glutamina, e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, EUA) a 37 °C sob 5% de CO2.[0088] Cell culture and transfection. The motor neuron cell line (NSC34) was a generous gift from Dr. Neil Cashman (Brain Research Centre, The University of British Columbia, Canada), and cultured in high-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum (FCS, in acronym), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA) at 37°C under 5% CO2.

EXEMPLO 7EXAMPLE 7

[0089] Camundongos. Camundongos C57BL6N do sexo feminino com idades entre 8-12 semanas foram adquiridos de BioLASCO (Yi-Lan, Taiwan).[0089] Mice. Female C57BL6N mice aged 8-12 weeks were purchased from BioLASCO (Yi-Lan, Taiwan).

[0090] Modelo de dor crônica generalizada induzida por ácido. O modelo de fibromialgia foi modificado a partir do modelo de dor crônica induzida por ácido estabelecido pelo grupo de Sluka (Sluka et al, 2003 Pain 106:229-239). Os camundongos foram anestesiados por curto espaço de tempo com 2% de isoflurano vaporizado e receberam injeção intramuscular de 20 μL de genisteína (1 μM) no músculo gastrocnêmio esquerdo. Após 3 minutos, uma injeção 20 μL (pH 4,0) de solução ácido salina foi injetada no mesmo local. Os camundongos, em seguida, desenvolveram hiperalgesia mecânica de longa duração por mais de 2 semanas. Os efeitos analgésicos de T1-11 (por via oral com gavagem de 0,9-mm / 7-cm) foram testados 4 dias depois que os camundongos desenvolveram a hiperalgesia mecânica. A hiperalgesia mecânica foi testada por ensaios de resposta de retraimento de patas traseiras de camundongo a estimulação de 0,2 mN de filamentos de von Frey.[0090] Acid-induced chronic generalized pain model. The fibromyalgia model was modified from the acid-induced chronic pain model established by the Sluka group (Sluka et al, 2003 Pain 106:229-239). Mice were anesthetized for a short time with 2% vaporized isoflurane and received an intramuscular injection of 20 μL of genistein (1 μM) into the left gastrocnemius muscle. After 3 minutes, a 20 μL injection (pH 4.0) of acid saline solution was injected into the same site. The mice then developed long-lasting mechanical hyperalgesia for more than 2 weeks. The analgesic effects of T1-11 (orally with 0.9-mm/7-cm gavage) were tested 4 days after the mice developed mechanical hyperalgesia. Mechanical hyperalgesia was tested by mouse hindpaw retraction response assays to 0.2 mN stimulation of von Frey filaments.

[0091] Modelo de estresse frio intermitente. O modelo de fibromialgia foi desenvolvido pelo grupo de Ueda, em que os camundongos foram submetidos ao stress frio intermitente durante 2 dias (Nishiyori e Ueda 2008, Mol Pain. 4:52). Os camundongos tratados com o estresse frio intermitente de longa duração (> 2 semanas) desenvolveram hiperalgesia mecânica e térmica. Os efeitos analgésicos da JMF3464 (intraperitoneal ou por via oral) foram testados nestes camundongos 5 dias após o estresse de frio intermitente. A hiperalgesia mecânica foi testada por ensaios de resposta de retraimento de patas traseiras de camundongo a estimulação de 0,2 mN de filamentos de von Frey.[0091] Intermittent cold stress model. The fibromyalgia model was developed by Ueda's group, in which mice were subjected to intermittent cold stress for 2 days (Nishiyori and Ueda 2008, Mol Pain. 4:52). Mice treated with long-term intermittent cold stress (> 2 weeks) developed mechanical and thermal hyperalgesia. The analgesic effects of JMF3464 (intraperitoneal or orally) were tested in these mice 5 days after intermittent cold stress. Mechanical hyperalgesia was tested by mouse hindpaw retraction response assays to 0.2 mN stimulation of von Frey filaments.

[0092] A descrição anterior das concretizações exemplificativas da invenção foi apresentada apenas para fins de ilustração e descrição e não se destina a ser exaustiva ou a limitar a invenção às formas precisas reveladas. Muitas modificações e variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima.[0092] The foregoing description of exemplary embodiments of the invention has been presented for purposes of illustration and description only and is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms disclosed. Many modifications and variations are possible in light of the above teachings.

[0093] As concretizações e exemplos foram escolhidos e descritos de modo a explicar os princípios da invenção e a sua aplicação prática de modo a permitir que outros peritos na especialidade utilizem a invenção e várias concretizações e com várias modificações conforme sejam apropriadas ao uso particular contemplado. Concretizações alternativas serão evidentes aos peritos na técnica a que o presente invento pertence, sem se afastar do seu espírito e âmbito.[0093] The embodiments and examples have been chosen and described in order to explain the principles of the invention and its practical application so as to enable others skilled in the art to utilize the invention and various embodiments and with various modifications as appropriate to the particular use contemplated. . Alternative embodiments will be apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains, without departing from its spirit and scope.

[0094] Todas as referências citadas e discutidas nesta especificação são incorporadas por referência na sua totalidade e na mesma medida no presente pedido de patente como se cada referência fosse incorporada por referência individualmente.[0094] All references cited and discussed in this specification are incorporated by reference in their entirety and to the same extent in the present application as if each reference were incorporated by reference individually.

Claims (15)

1. Composto caracterizado por ter a fórmula (I) ou (IA):
Figure img0009
ou um sal seu farmaceuticamente aceitável, em que X é halogênio.1. Compound characterized by having the formula (I) or (IA):
Figure img0009
or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein X is halogen. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: ser selecionado dentre o grupo que consiste em N6- [(3-halotien-2-il)metila]adenosina, N6-[(4- halotien-2-il)metila]adenosina e N6-[(5-halotien-2- il)metila]adenosina.A compound according to claim 1, characterized in that: it is selected from the group consisting of N6-[(3-halothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-halothien-2-yl)methyl ]adenosine and N6-[(5-halothien-2-yl)methyl]adenosine. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por: ser selecionado do grupo que consiste em N6-[(5- bromotien-2-il)metil]adenosina, N6-[(4-bromotien-2- il)metil]adenosina, N6-[(3-bromotien-2- il)metil]adenosina, N6-[(5-clorotien-2- il)metil]adenosina, N6-[(4-clorotien-2- il)metil]adenosina e N6-[(3-chlorotien-2- il)metil]adenosina.A compound according to claim 2, characterized in that: it is selected from the group consisting of N6-[(5-bromothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-bromothien-2-yl)methyl] adenosine, N6-[(3-bromothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(5-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine and N6-[(3-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: ser selecionado do grupo que consiste em N6-[(2- halotien-3-il)metil]adenosina, N6-[(4-halotien-3- il)metil]adenosina e N6-[(5-halotien-3- il)metil]adenosina.A compound according to claim 1, characterized in that: it is selected from the group consisting of N6-[(2-halothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-halothien-3-yl)methyl] adenosine and N6-[(5-halothien-3-yl)methyl]adenosine. 5. Composto de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por: ser selecionado do grupo que consiste em N6-[(2- bromotien-3-il)metil]adenosina, N6-[(4-bromotien-3- il)metil]adenosina, N6-[(5-bromotien-3- il)metil]adenosina N6-[(2-clorotien-3- il)metil]adenosina, N6-[(4-clorotien-3- il)metil]adenosina e N6-[(5-clorotien-3- il)metil]adenosina.A compound according to claim 4, characterized in that: it is selected from the group consisting of N6-[(2-bromothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-bromothien-3-yl)methyl] adenosine, N6-[(5-bromothien-3-yl)methyl]adenosine N6-[(2-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine, N6-[(4-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine and N6 -[(5-chlorothien-3-yl)methyl]adenosine. 6. Método para a preparação de composto de fórmula (I) ou (IA) como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, que compreende a etapa (I) ou (II): (I) (a) reagir 6-cloropurina ribofuranosídeo na presença de uma base com (tienila) metanamina substituído caracterizado por ter a fórmula 3 ou 3A:
Figure img0010
caracterizado por: X ser flúor, cloro, bromo ou iodo, para obter o composto de fórmula (I) ou (IA); ou (a1) reagir (2',3'-O-isopropilideno)adenosina na presença de base com agente protetor de grupo hidroxila para obter derivado de (2',3'-O- isopropilideno)adenosina com grupo protetor hidroxila; (b) reagir o derivado de (2 ', 3'-O-isopropilideno) adenosina que possui o grupo protetor hidroxila com um agente protetor de grupo amina para proporcionar derivado de (2',3'-O- isopropilideno)adenosina que tenha grupo protetor hidroxila e grupo protetor amina; (c) realizar reação de acoplamento pela reação do derivado de (2',3'-O-isopropilideno)adenosina que possui os grupos protetores hidroxila e amina com composto que contenha grupo substituído (tienila)metila com a fórmula 7 ou 7A: caracterizado por:
Figure img0011
X ser F, Cl, Br, ou I, e Y ser X, OH, metanossulfonato (OSO2CH3, OMs), p- toluenossulfonato (p-OSO2C6H4-CH3, OTs), ou trifluorometanossulfonato (OSO2CF3, OTf) para obter produto que contenha os grupos de proteção e o grupo (tienila)metila substituído; (d) remover os grupos protetores do produto da etapa (II)(c) em condições ácidas para obter o composto da fórmula (I) ou (IA).A method for preparing a compound of formula (I) or (IA) as claimed in any of claims 1 to 5, which comprises step (I) or (II): (I) (a) reacting 6-chloropurine ribofuranoside in the presence of a base with (thienyl) substituted methanamine characterized by having the formula 3 or 3A:
Figure img0010
characterized in that: X is fluorine, chlorine, bromine or iodine, to obtain the compound of formula (I) or (IA); or (a1) reacting (2',3'-O-isopropylidene)adenosine in the presence of base with hydroxyl protecting agent to obtain hydroxyl protecting group (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative; (b) reacting the (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative having the hydroxyl protecting group with an amine group protecting agent to provide the (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative having hydroxyl protecting group and amine protecting group; (c) perform a coupling reaction by reacting the (2',3'-O-isopropylidene)adenosine derivative that has the hydroxyl and amine protecting groups with a compound that contains a substituted (thienyl)methyl group with formula 7 or 7A: characterized per:
Figure img0011
X is F, Cl, Br, or I, and Y is X, OH, methanesulfonate (OSO2CH3, OMs), p-toluenesulfonate (p-OSO2C6H4-CH3, OTs), or trifluoromethanesulfonate (OSO2CF3, OTf) to obtain product containing the protecting groups and the substituted (thienyl)methyl group; (d) removing protecting groups from the product of step (II)(c) under acidic conditions to obtain the compound of formula (I) or (IA). 7. Método da reivindicação 6, caracterizado por: na etapa (I)(a) a base ser a di-isopropiletilamina e a (tienila)metanamina substituída ser: (i) (5-bromotien-2-il)metanamina, para obter N6-[(5-bromotien-2-il) metila]adenosina; ou (ii) (5-clorotien-2-il)metanamina, para obter N6-[(5-clorotien-2-il) metila]adenosina.The method of claim 6, characterized in that: in step (I)(a) the base is diisopropylethylamine and the substituted (thienyl)methanamine is: (i) (5-bromothien-2-yl)methanamine, to obtain N6-[(5-bromothien-2-yl)methyl]adenosine; or (ii) (5-chlorothien-2-yl)methanamine, to obtain N6-[(5-chlorothien-2-yl)methyl]adenosine. 8. Método da reivindicação 6, caracterizado por: na etapa (II)(c) a reação de acoplamento ser conduzida na presença de trifenilfosfina e azodicarboxilato de di-isopropila; opcionalmente na etapa (II)(c) o composto que contém o grupo (tienila)metila substituído ser o (5-bromotien-2- il)metanol.The method of claim 6, characterized in that: in step (II)(c) the coupling reaction is conducted in the presence of triphenylphosphine and diisopropyl azodicarboxylate; optionally in step (II)(c) the compound containing the substituted (thienyl)methyl group is (5-bromothien-2-yl)methanol. 9. Composição caracterizada por compreender: (a) quantidade terapeuticamente eficaz de composto como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5 ou sal seu farmaceuticamente aceitável; e (b) transportador, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.A composition comprising: (a) a therapeutically effective amount of a compound as claimed in any of claims 1 to 5 or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and (b) a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or vehicle. 10. Uso de composto como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5 ou da composição como reivindicado na reivindicação 9 caracterizado por ser na fabricação de medicamento para o tratamento de doença neurodegenerativa e/ou dor num sujeito dele necessitado.Use of a compound as claimed in any of claims 1 to 5 or the composition as claimed in claim 9 in the manufacture of a medicament for the treatment of neurodegenerative disease and/or pain in a subject in need thereof. 11. O uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por: a doença neurodegenerativa ser selecionado a partir do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença do príon, doença de Huntington, ataxias cerebelares espinais.The use according to claim 10, characterized in that: the neurodegenerative disease is selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, prion disease, Huntington's disease, spinal cerebellar ataxias. 12. O uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por: a ataxia cerebelar espinal ser selecionada do grupo que consiste em ataxias cerebelares espinhais 2, ataxias cerebelares espinhais 3 e ataxias cerebelares espinhais 7.The use according to claim 11, characterized in that the cerebellar spinal ataxia is selected from the group consisting of cerebellar spinal ataxias 2, cerebellar spinal ataxias 3 and cerebellar spinal ataxias 7. 13. O uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por: a dor ser dor induzida por ácido; a dor sendo uma dor disfuncional; ou a dor sendo selecionada a partir do grupo que consiste em dor inflamatória, dor de câncer, dor no peito, dor nas costas, dor no pescoço, dor no ombro, enxaqueca, dor de cabeça, dor miofascial, dor nas articulações, síndromes de dor muscular, dor neuropática, dor periférica, dor simpática , dor pós-operatória, dor pós-traumática e dor de esclerose múltipla.Use according to claim 11, characterized in that: the pain is acid-induced pain; the pain being a dysfunctional pain; or the pain being selected from the group consisting of inflammatory pain, cancer pain, chest pain, back pain, neck pain, shoulder pain, migraine, headache, myofascial pain, joint pain, syndromes of muscle pain, neuropathic pain, peripheral pain, sympathetic pain, postoperative pain, post-traumatic pain and multiple sclerosis pain. 14. O uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por: (i) a dor induzida por ácido ser dor muscular induzida por ácido; opcionalmente dor muscular crônica induzida por ácido; ou (ii) a dor disfuncional ser selecionada a partir do grupo que consiste em fibromialgia, dor miofascial, síndrome da dor na bexiga e dor causada pela síndrome do intestino irritável.The use according to claim 13, characterized in that: (i) the acid-induced pain is acid-induced muscle pain; optionally acid-induced chronic muscle pain; or (ii) the dysfunctional pain is selected from the group consisting of fibromyalgia, myofascial pain, bladder pain syndrome and pain caused by irritable bowel syndrome. 15. O uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por: a doença neurodegenerativa ser doença de proteína dobrada erroneamente.The use according to claim 10, characterized in that: the neurodegenerative disease is a misfolded protein disease.
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