BR112015032789B1 - Composições, método para produzir anticorpos, composições farmacêuticas e uso de uma composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZ IR ANTICORPOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção fornece anticorpos que se ligam a FGFR2IIIb, em que os anticorpos são não fucosilados. A presente invenção fornece composições que compreendem anticorpos que se ligam a FGFR2IIIb, em que pelo menos 95% dos anticorpos na composição são não fucosilados. Em algumas realizações, são fornecidos métodos para tratar câncer que compreendem administrar anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] São fornecidos imunoconjugados que compreendem anticorpos anti-FGFR2IIIb.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os membros da família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) se ligam a quatro receptores tirosina quinase conhecidos, receptores do fator de crescimento de fibroblastos 1-4 (FGFR1-4) e suas isoformas, com diferentes FGFs que se ligam a diferentes FGFRs em graus diferentes (Zhang et al., J. Biol. Chem. 281:15694, 2006). Uma sequência de proteína de FGFR2 humana é fornecida, por exemplo, no GenBank Locus AF487553. Cada FGFR consiste em um domínio extracelular (ECD) que compreende três domínios similares à imunoglobulina (Ig) (D1, D2 e D3), uma hélice transmembrana única e um domínio quinase catalítico intracelular (Mohammadi et al., Cytokine Growth Factor Revs, 16:107, 2005). Há um trecho contíguo de aminoácidos ácidos no ligante entre D1 e D2, denominado “ácido box” (AB). Acredita-se que a região contendo D1 e AB está envolvida na autoinibição do receptor, que é aliviada por ligação ao ligante. FGFs se ligam aos receptores, principalmente através das regiões em D2 e D3 dos receptores. Os FGFRs são caracterizados por vários splicing alternativos de seus mRNAs, levando a uma variedade de isoformas (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271:15292, 1996; consulte também Swiss-Prot P21802 e isoformas P21802-1 a -20 para sequências de FGFR2 e suas isoformas). De forma notável, há formas contendo todos os três domínios Ig (isoforma α) ou somente os dois domínios D2 e D3 de Ig e sem domínio D1 (isoforma β). Em FGFR1- FGFR3, todas as formas contêm a primeira metade de D3 denotada IIIa, mas dois éxons alternativos podem ser utilizados para a segunda metade de D3, levando a formas IIIb e IIIc. Para FGFR2, essas são respectivamente denotadas FGFR2IIIb e FGFR2IIIc (ou apenas FGFR2b e FGFR2c); as formas beta correspondentes são denotadas FGFR2(beta)IIIb e FGFR2(beta)IIIc. A forma FGFR2IIIb de FGFR2 (também denotada K-sam-II) é um receptor de alta afinidade para ambos os membros da família FGF1 e KGF (FGF7, FGF10 e FGF22), enquanto que FGFR2IIIc (também denotada K-sam-I) se liga bem tanto a FGF1 como FGF2, mas não se liga aos membros da família KGF (Miki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:246, 1992). De fato, FGFR2IIIb é o único receptor para os membros da família KGF (Ornitz et al., 1996, op. cit.) e é, portanto, também designado KGFR.

[003] Os FGFRs e suas isoformas são diferencialmente expressos em diversos tecidos. FGFR2IIIb (e as formas IIIb de FGFR1 e FGFR3) é expresso em tecidos epiteliais, enquanto que FGFRIIIc é expresso em tecido mesenquimal (Duan et al., J. Biol. Chem. 267:16076, 1992; Ornitz et al., 1996, op. cit.). Determinados ligantes FGF desses receptores têm um padrão inverso de expressão. Dessa forma, membros da subfamília KGF, incluindo FGF7 (KGF), FGF10 e FGF22, se ligam somente a FGFRIIIb (Zhang et al., op. cit.) e são expressos nos tecidos mesequimais, de modo que podem ser efetores parácrinos de células epiteliais (Ornitz et al., 1996, op. cit.). Ao contrário, os membros FGF4-6 da subfamília FGF4 se ligam a FGFR2IIIc e são expressos em ambas as linhagens epiteliais e mesenquimais, de modo que eles têm tanto funções autócrinas como parácrinas. Devido ao fato dos padrões de expressão das isoformas de FGFR2 e seus ligantes, FGFR2 desempenha um papel importante nas interações epitelial-mesenquimal (Finch et al., Dev. Dyn. 203:223, 1995), então não é surpreendente que o knock-out de FGFR2IIIb em camundongos leva a graves defeitos embrionários e à letalidade (De Moerlooze et al., Development 127:483, 2000).

[004] KGF (FGF7) e KGFR (FGFR2IIIb) são superexpressos em muitos cânceres pancreáticos (Ishiwata et al., Am. J. Pathol. 153: 213, 1998), e sua coexpressão se correlaciona com prognóstico fraco (Cho et al., Am. J. Pathol. 170:1964, 2007). Mutações somáticas do gene FGFR2 foram encontradas em 12% de um grande painel de carcinomas do endométrio (útero), e vários casos testados foram necessário para sobrevivência da célula tumoral (DUTT et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8713, 2008). Em dois tumores, descobriu-se que a mutação FGFR2 á a mesma substituição S252W associada com a síndrome de Apert. A amplificação e superexpressão de FGFR2 estão associadas a um tipo de câncer gástrico difuso, indiferenciado, que tem um prognóstico particularmente fraco, e a inibição da atividade de FGFR2 por compostos de molécula pequena potentemente inibiram a proliferação dessas células cancerosas (Kunii et al., Cancer Res. 68:2340, 2008; Nakamura et al., Gastroenterol. 131:1530, 2006).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] Em algumas realizações, é fornecido um anticorpo anti- FGFR2IIIb, em que a região variável da cadeia pesada compreende: (i) HVR- H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (6); (ii) HVR- H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (iii) HVR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável da cadeia leve compreende: (iv) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (vi) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; em que o anticorpo é não fucosilado. Em algumas realizações, o anticorpo é desprovido de fucose em Asn297. Em algumas realizações, são fornecidas composições que compreendem uma pluralidade de anticorpos anti-FGFR2IIIb, em que a região variável da cadeia pesada de cada anticorpo anti-FGFR2IIIb na composição compreende: (i) HVR- H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (6); (ii) HVR- H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (iii) HVR- H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável da cadeia leve de cada anticorpo anti-FGFR2IIIb na composição compreende: (iv) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (vi) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; em que pelo menos 95% dos anticorpos na composição são não fucosilados. Em algumas realizações, a composição pode ser um sobrenadante de uma linhagem celular que produz anticorpo. Em algumas realizações, a composição pode ser uma composição tamponada. Em algumas realizações, o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas realizações, o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas realizações, o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas realizações, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas realizações, a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas realizações, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas realizações, é fornecida uma composição que compreende uma pluralidade de anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados, em que os anticorpos anti-FGFR2IIIb competem por ligação a FGFR2IIIb com um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e um domínio variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[006] Em algumas realizações, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Em algumas realizações, os anticorpos são anticorpos quiméricos. Em algumas realizações, os anticorpos são anticorpos humanizados. Em qualquer uma das realizações descritas no presente pedido, os anticorpos podem compreender uma região constante da cadeia leve K. Em qualquer uma das realizações descritas no presente pedido, os anticorpos podem compreender uma região constante da cadeia pesada de IgG1.

[007] Em algumas realizações, os anticorpos têm atividade de ADCC melhorada in vitro, em comparação aos anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados que têm a mesma sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, os anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados causam lise específica que é pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70 ou pelo menos 75 pontos de porcentagem maior que a lise específica com anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. Em algumas realizações, a atividade ADCC é determinada com o uso de células Ba/F3 que expressam FGFR2III como células alvo e PBMCs humanas isoladas como células efetoras.

[008] Em algumas realizações, os anticorpos têm afinidade melhorada a Fc gama RIIIA, em comparação a anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilado que têm a mesma sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, os anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados se ligam a Fc gama RIIIA com pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 17 vezes ou pelo menos 20 vezes mais afinidade que anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. Em algumas realizações, a afinidade para Fc gama RIIIA é determinada com o uso de ressonância plasmônica de superfície. Em algumas realizações, Fc gama RIIIA é selecionado a partir de Fc gama RIIIA(V158) e Fc gama RIIIA(F158). Em algumas realizações, Fc gama RIIIA é Fc gama RIIIA(V158).

[009] Em qualquer uma das realizações descritas no presente pedido, os anticorpos podem se ligar a FGFR2IIIb mas não a FGFR2IIIc.

[010] Em qualquer uma das realizações descritas no presente pedido, uma composição que compreende uma pluralidade de anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados compreende pelo menos 95% de anticorpos não fucosilados. Em qualquer uma das realizações descritas no presente pedido, uma composição que compreende uma pluralidade de anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados pode ter fucosilação não detectável. Em algumas realizações, a presença de fucose pode ser determinada por um método que compreende cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), eletroforese por capilaridade ou espectrometria de massa MALDI-TOF.

[011] Em algumas realizações, são fornecidas células hospedeiras que compreendem ácido nucleico que codificam um anticorpo anti- FGFR2IIIb descrito no presente pedido, em que a célula hospedeira funcional é desprovida de um gene alfa-1,6-fucosiltransferase (FUT8). Em algumas realizações, a célula hospedeira é uma célula de CHO.

[012] Em algumas realizações, são fornecidos métodos para produção de anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados. Em algumas realizações, um método compreende cultivar uma célula hospedeira sob condições adequadas para expressar ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-FGFR2IIIb, em que a célula hospedeira é desprovida de um gene alfa-1,6- fucosiltransferase (FUT8). Em algumas realizações, um método para produzir anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados compreende cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas para produzir o anticorpo anti- FGFR2 III não fucosilado. Em algumas realizações, o método ainda compreende recuperar o anticorpo anti-FGFR2IIIb produzido pela célula hospedeira. Em algumas realizações, menos de 5% dos anticorpos anti-FGFR2IIIb produzidos pela célula hospedeira compreende fucose. Em algumas realizações, pelo menos 95% dos anticorpos anti-FGFR2IIIb produzidos pela célula hospedeira são desprovidos de fucose (isto é, são não fucosilados). Em algumas realizações, a fucose é indetectável nos anticorpos anti-FGFR2IIIb produzidos pela célula hospedeira. Em algumas realizações, a presença de fucose é detectada por um método que compreende HPLC, eletroforese por capilaridade ou espectrometria de massa MALDI-TOF.

[013] Em algumas realizações, são fornecidas composições farmacêuticas em que a composição farmacêutica compreende anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados descritos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[014] Em algumas realizações, são fornecidos métodos para tratar câncer. Em algumas realizações, um método compreende administrar uma quantidade efetiva de uma composição farmacêutica que compreende anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados descritos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações, o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas e câncer esofágico. Em algumas realizações, o câncer é câncer gástrico. Em algumas realizações, o câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a amplificação do FGFR2 compreende a razão de FGFR2:CEN10 (centrômero do cromossomo 10) >3. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, o câncer que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a expressão ou superexpressão de FGFR2IIIb é determinada por IHQ. Em algumas realizações, a coloração 1+, 2+ ou 3+ de células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração 2+ ou 3+ em células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração IHQ é pontuada conforme descrito no Exemplo 6.

[015] Em algumas realizações, um método para tratar câncer ainda compreende administrar pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado a partir de um agente platina, paclitaxel, ABRAXANE®, docetaxel, gencitabina, capecitabina, irinotecano, epirrubicina, FOLFOX, FOLFIRI, leucovorina, fluorouracila, mitomicina C e cloridrato de doxorrubicina. Em algumas realizações, o agente platina é selecionado a partir de cisplatina, oxaliplatina e carboplatina. Em algumas realizações, um método para tratar câncer ainda compreende administração de paclitaxel. Em algumas realizações, um método para tratar câncer ainda compreende administração de cisplatina e/ou 5-FU.

[016] Em algumas realizações, são fornecidos usos de uma composição farmacêutica que compreendem anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados descritos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações, esse uso é para tratar câncer em um indivíduo com câncer. Em algumas realizações, o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas ou câncer de esôfago. Em algumas realizações, o câncer é câncer gástrico. Em algumas realizações, o câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a amplificação do FGFR2 compreende a razão de FGFR2:CEN10 (centrômero do cromossomo 10) >3. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, o câncer que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a expressão ou superexpressão de FGFR2IIIb é determinada por IHQ. Em algumas realizações, a coloração 1+, 2+ ou 3+ de células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração 2+ ou 3+ em células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração IHQ é pontuada conforme descrito no Exemplo 6.

[017] Em algumas realizações, as composições farmacêuticas para tratar câncer são fornecidas, em que a composição farmacêutica compreende anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados descritos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas realizações, o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas ou câncer de esôfago. Em algumas realizações, o câncer é câncer gástrico. Em algumas realizações, o câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a amplificação do FGFR2 compreende a razão de FGFR2:CEN10 (centrômero do cromossomo 10) >3. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, o câncer que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, o câncer superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a expressão ou superexpressão de FGFR2IIIb é determinada por IHQ. Em algumas realizações, a coloração 1+, 2+ ou 3+ de células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração 2+ ou 3+ em células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração IHQ é pontuada conforme descrito no Exemplo 6.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] As Figuras 1A a 1C mostram atividade ADCC de αFGFR2bA não fucosilado e αFGFR2bF fucosilado contra células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb, conforme discutido no Exemplo 3. Nas legendas, “αFGFR2bF/FGFR2b” indica que o anticorpo αFGFR2bF fucosilado foi testado contra células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb.

[019] As Figuras 2A a 2D mostram a eficácia de αFGFR2bA não fucosilado e αFGFR2bF fucosilado em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M, a (A e B) 10 mg/kg e (C e D) 3 mg/kg, conforme discutido no exemplo 4.

[020] As Figuras 3A e 3B mostram a eficácia dose-dependente de αFGFR2bA não fucosilado em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M, conforme discutido no Exemplo 4.

[021] As Figuras 4A e 4B mostram a eficácia da terapia de combinação com αFGFR2bA não fucosilado e paclitaxel em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M, conforme discutido no Exemplo 4.

[022] As Figuras 5A e 5B mostram a eficácia da terapia de combinação com αFGFR2bA não fucosilado e 5-FU/cisplatina em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M, conforme discutido no Exemplo 4.

[023] As Figuras 6A e 6B mostram a eficácia de αFGFR2bA não fucosilado em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico MFM-223, conforme discutido no Exemplo 4.

[024] A Figura 7mostra o perfil glicano de anticorpo αFGFR2b produzido em (A) células Potelligent® CHOK1SV e (B) células CHOK1SV, conforme descrito no Exemplo 1.

[025] A Figura 8 mostra diagramas esquemáticos de glicanos N- ligados encontrados em anticorpos.

[026] A Figura 9 mostra ADCC de células Ba/F3 FGF2b com concentrações crescentes de αFGFR2bA ou αFGFR2bF. Foram realizados ensaios com PBMC humana normal em uma razão E:T de 25:1, conforme descrito no Exemplo 5. Os dados estão esboçados como liberação LDH.

[027] A Figura 10 mostra ADCC de células OCUM-2M com concentrações crescentes de αFGFR2bA ou αFGFR2bF. Foram realizados ensaios com PBMC humana normal em uma razão E:T de 25:1, conforme descrito no Exemplo 5. Os dados estão plotados como percentual de lise específica.

[028] As Figuras 11A a 11F mostram a detecção de FGFR2IIIb em amostras de tecido tumoral com o uso de imuno-histoquímica, conforme descrito no Exemplo 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] São fornecidos anticorpos não fucosilados que se ligam a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, são também fornecidas cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpo não fucosilado que são capazes de formar anticorpos que se ligam a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, são fornecidas cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos não fucosilados que compreendem uma ou mais regiões hipervariáveis específicas (HVRs). Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm atividade de ADCC melhorada em relação aos anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA em relação aos anticorpos anti- FGFR2IIIb fucosilados. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(V158) em relação aos anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(F158) em relação aos anticorpos anti-FGFR2IIIb fucosilados. Em certas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados não se ligam a FGFR2IIIc.

[030] São fornecidos polinucleotídeos que codificam anticorpos que se ligam a FGFR2IIIb. São também fornecidos polinucleotídeos que codificam cadeias pesadas ou cadeias leves de anticorpo. São fornecidas células hospedeiras que expressam anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados. São fornecidos métodos de tratamento com o uso de anticorpos não fucosilados para FGFR2IIIb. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, métodos para tratar câncer, como câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas e câncer de esôfago.

[031] Os títulos de seção usados no presente são para propósitos de organização e não devem ser interpretados como limitantes do assunto descrito.

[032] Todas as referências citadas no presente pedido, incluindo pedidos de patentes, publicações de patentes, e número de acesso no GenBank são incorporadas ao presente pedido como referência, como se cada referência individual estivesse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada como referência em sua totalidade.

[033] As técnicas e procedimentos descritos ou com referência no presente pedido são geralmente bem conhecidos e comumente empregados com o uso de metodologia convencional pelos técnicos no assunto, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3â edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Pratical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, e Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller e M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993); e versões atualizadas dos mesmos.

I. DEFINIÇÕES

[034] A menos que definido de outro modo, termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção deverão ter os significados que são comumente entendidos por aqueles técnicos no assunto. Além disso, a menos que de outro modo exigido por contexto ou expressamente indicado, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[035] Entende-se que aspectos e realizações da invenção descritas no presente pedido incluem “consistem em” e/ou “consistem essencialmente em” aspectos e realizações. Como usado no presente pedido, a forma singular “um”, “uma”, e “o”, “a” inclui referências plurais a menos que indicado de outra forma.

[036] Nesse pedido, o uso do “ou” significa “e/ou”, a menos que expressamente declarado ou entendido por técnicos no assunto. No contexto de uma reivindicação múltipla dependente, o uso de “ou” refere-se novamente a mais de uma reivindicação anterior independente ou dependente.

[037] Conforme entendido por um técnico no assunto, a referência para “cerca de” um valor ou parâmetro no presente pedido inclui (e descreve) realizações que são direcionadas àquele valor ou parâmetro propriamente dito. Por exemplo, a descrição que se refere a “cerca de X” inclui a descrição de “X”.

[038] Os termos “molécula de ácido nucleico”, “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” podem ser usados de forma intercambiável, e referem-se a um polímero de nucleotídeos. Esses polímeros de nucleotídeos podem conter nucleotídeos naturais e/ou não naturais e incluem, mas não se limitam a, DNA, RNA e PNA. “Sequência de ácido nucleico” refere-se à sequência de nucleotídeos linear que compreende a molécula de ácido nucleico ou polinucleotídeo.

[039] Os termos “polipeptídeo” e proteína são usados de forma intercambiável para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos, e não estão limitados a um tamanho mínimo. Esses polímeros de resíduos de aminoácidos podem conter resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais, e incluem, mas não se limitam a, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácidos. Tanto proteínas inteiras como fragmentos das mesmas estão englobados pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação e similares. Além disso, para os propósitos da presente invenção, um “polipeptídeo” refere-se a uma proteína que inclui modificações, como deleções, adições e substituições (geralmente conservativa na natureza), para a sequência nativa, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese sítio-dirigida, ou pode ser acidental, como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou os erros devido à amplificação por PCR.

[040] “FGFR2IIIb” ou “FGFR2b” são usados de forma intercambiável para se referir à forma splice do receptor 2 IIIc do fator de crescimento de fibroblastos. Um FGFR2IIIb humano exemplar é mostrado no número de acesso no GenBank NP_075259.4, datado de 7 de julho de 2013. Uma sequência de aminoácidos FGFR2IIIb humana madura exemplar não limitante é mostrada na SEQ ID NO: 1.

[041] “FGFR2IIIc” ou “FGFR2c” são usados de forma intercambiável para se referir à forma splice do receptor 2 do fator de crescimento de fibroblastos IIIc. Um FGFR2IIIc humano exemplar é mostrado no número de acesso no GenBank NP_000132.3, datado de 7 de julho de 2013. Uma sequência de aminoácidos FGFR2IIIc madura exemplar não limitante é mostrada na SEQ ID NO: 12.

[042] O termo “epítopo” refere-se a um local em uma molécula alvo (por exemplo, um antígeno, como uma proteína, ácido nucleico, carboidrato ou lipídeo) ao qual uma molécula de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de arcabouço contendo anticorpo que se liga a regiões de ligação. Epítopos com frequência consistem em um agrupamento de superfície quimicamente ativa de moléculas como, cadeias laterais de aminoácidos, polipeptídeos ou de açúcar e, têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos podem ser formados tanto a partir de resíduos contíguos como não contíguos justapostos (por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, componente lipídeo) da molécula alvo. Epítopos formados a partir de resíduos contíguos (por exemplo, aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, componente lipídeo) tipicamente são mantidos em exposição para solventes de desnaturação enquanto que epítopos formados por enovelamento terciário tipicamente são perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo pode incluir, mas não se limita a pelo menos 3, pelo menos 5 ou 8 a 10 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos). Em alguns exemplos um epítopo é menor que 20 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos) de comprimento, menor que 15 resíduos ou menor que 12 resíduos. Dois anticorpos podem se ligar ao mesmo epítopo dentro de um antígeno se eles exibirem ligação competitiva para o antígeno.

[043] Um “epítopo não linear” ou “epítopo conformacional” compreende polipeptídeos não contíguos, aminoácidos e/ou açúcares dentro da proteína antigênica para o qual um anticorpo específico se liga ao epítopo.

[044] Um “epítopo linear” compreende polipeptídeos contíguos, aminoácidos e/ou açúcares dentro da proteína antigênica para o qual um anticorpo específico se liga ao epítopo.

[045] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.

[046] O termo anticorpo inclui, mas não se limita a, fragmentos que são capazes de se ligar ao antígeno, como Fv, Fv de cadeia única (scFv), Fab, Fab’ e (Fab’)2. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação ao antígeno e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de reticulação do antígeno. O termo anticorpo também inclui, mas não se limita a, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos de várias espécies como camundongo, humano, macaco cinomolgos, etc.

[047] O termo “região variável da cadeia pesada” refere-se a uma região que compreende estrutura HVR1 da cadeia pesada (FR) 2, HVR2, FR3 e HVR3. Em algumas realizações, a região variável da cadeia pesada também compreende pelo menos uma porção de uma FR1 e/ou pelo menos uma porção de uma FR4.

[048] O termo “região constante da cadeia pesada” refere-se a uma região que compreende pelo menos três domínios constantes da cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Regiões constantes da cadeia pesada exemplares não limitantes incluem Y, δ e α. Regiões constantes da cadeia pesada exemplares não limitantes também incluem ε e μ. Cada região constante pesada corresponde a um isotipo de anticorpo. Por exemplo, um anticorpo que compreende uma região constante y é um anticorpo IgG, um anticorpo que compreende uma região constante δ é um anticorpo IgD e um anticorpo que compreende uma região constante α é um anticorpo IgA. Além disso, um anticorpo que compreende uma região constante μ é um anticorpo IgM e um anticorpo que compreende uma região constante ε é um anticorpo IgE. Certos isotipos podem ser ainda divididos em subclasses. Por exemplo, anticorpos IgG incluem, mas não se limitam a, anticorpos IgG1 (que compreendem uma região constante y1), IgG2 (que compreendem uma região constante y2), IgG3 (que compreendem uma região constante y3) e IgG4 (que compreendem uma região constante y4); anticorpos IgA incluem, mas não se limitam a, anticorpos IgA1 (que compreendem uma região constante α1) e IgA2 (que compreendem uma região constante α2); e anticorpos IgM incluem, mas não se limitam a, IgM1 e IgM2.

[049] O termo “cadeia pesada” refere-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos uma região variável da cadeia pesada, com ou sem uma sequência líder. Em algumas realizações, uma cadeia pesada compreende pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia pesada. O termo “cadeia pesada inteira” refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região constante da cadeia pesada, com ou sem uma sequência líder.

[050] O termo “região variável da cadeia leve” refere-se a uma região que compreende estrutura HVR1 da cadeia leve (FR) 2, HVR2, FR3 e HVR3. Em algumas realizações, uma região variável da cadeia leve também compreende uma FR1 e/ou uma FR4.

[051] O termo “região constante da cadeia leve” refere-se a uma região que compreende um domínio constante da cadeia leve, CL. Regiões constantes da cadeia leve exemplar não limitantes incluem À e K.

[052] O termo “cadeia leve” refere-se a um polipeptídeo que compreende pelo menos uma região variável da cadeia leve, com ou sem uma sequência líder. Em algumas realizações, uma cadeia leve compreende pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia leve. O termo “cadeia leve inteira” refere-se a um polipeptídeo que compreende uma região variável da cadeia leve e uma região constante da cadeia leve, com ou sem uma sequência líder.

[053] O termo “região hipervariável” ou “HVR” refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formas estruturalmente definidas como alças (“alças hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo essa última de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3). (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 65 de H2, e 95 a 102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Os termos regiões hipervariáveis (HVRs) e regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são usados no presente pedido de forma intercambiável em referência a porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno.

[054] Uma “estrutura humana aceitante” para os propósitos no presente pedido é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável da cadeia pesada (VH) derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitante derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, o número de trocas de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas realizações, a estrutura humana aceitante VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura consenso humana.

[055] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Em algumas realizações, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X em relação a sua parceira Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os descritos no presente pedido.

[056] Um anticorpo de “afinidade maturada” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs) e/ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), em comparação a um anticorpo parental que não possui essas alterações, como alterações que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[057] Um “anticorpo quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente. Em algumas realizações, um anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo que compreende pelo menos uma região variável de uma primeira espécie (como camundongo, rato, macaco cinomolgo, etc.) e pelo menos uma região constante de uma segunda espécie (como humano, macaco cinomolgo, etc.). Em algumas realizações, um anticorpo quimérico compreende pelo menos uma região variável de camundongo e pelo menos uma região constante humana. Em algumas realizações, um anticorpo quimérico compreende pelo menos uma região variável de cinomolgo e pelo menos uma região constante humana. Em algumas realizações, todas as regiões variáveis de um anticorpo quimérico são de uma primeira espécie e todas as regiões constantes do anticorpo quimérico são de uma segunda espécie.

[058] Um “anticorpo humanizado” refere-se a um anticorpo em que pelo menos um aminoácido em uma região de estrutura de uma região variável não humana foi substituído pelo aminoácido correspondente de uma região variável humana. Em algumas realizações, um anticorpo humanizado compreende pelo menos uma região constante humana ou fragmento da mesma. Em algumas realizações, um anticorpo humanizado é um Fab, um scFv, um (Fab’)2, etc.

[059] Um “anticorpo enxertado HVR” refere-se a um anticorpo humanizado em que uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs) de uma primeira espécie (não humana) tenha sido enxertado sobre as regiões de estrutura (FRs) de uma segunda espécie (humana).

[060] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. “Funções efetoras” exemplares incluem ligação de receptor Fc; ligação C1q, CDC; ADCC; fagocitose, infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR), etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas com o uso de vários ensaios.

[061] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alótipos A e não A), região Fc de IgG2 humana de sequência nativa, região Fc de IgG3 humana de sequência nativa, região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como variantes das mesmas que ocorrem naturalmente.

[062] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido.

[063] “Receptor Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas realizações, um FCYR é um FcR humano nativo. Em algumas realizações, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FCYRI, FCYRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas desses receptores. Receptores de FCYRII incluem FCYRIIA (um “receptor de ativação”) e FCYRIIB (um “receptor de inibição”), que têm sequências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição de imunoreceptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (consulte, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203234 (1997)). FcRs são revisados, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” no presente pedido.

[064] O termo “receptor Fc” ou “FcR” também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), e regulação de homeostase de imunoglobulinas. Métodos para medir ligação ao FcRn são conhecidos (consulte, por exemplo, Ghetie e Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[065] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação Clq e citoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação do receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.

[066] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em certas realizações, as células expressam pelo menos FCYRIII e realizam função(ões) efetora(s) de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células exterminadoras naturais (Natural Killer - NK), monócitos, macrófagos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

[067] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual a Ig secretada ligada aos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo que produz antígeno e subsequentemente eliminam a célula alvo com citotoxinas. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FCYRIII, enquanto que monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio de ADCC in vitro, como descrito nas patentes US 5.500.362, 5.821.337 ou 6.737.056 (Presta). Células efetoras úteis para esses ensaios incluem PBMC e células NK. De maneira alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Anticorpos adicionais com sequências de aminoácidos de região Fc alteradas e atividade de ADCC aumentada ou diminuída são descritos, por exemplo, na patente US 7.923.538 e patente US 7.994.290.

[068] Um anticorpo que tem uma “atividade de ADCC melhorada” refere-se a um anticorpo que é mais efetivo na mediação de ADCC in vitro ou in vivo em comparação ao anticorpo parental, em que o anticorpo e o anticorpo parental se diferem em pelo menos um aspecto estrutural, e quando as quantidades desse anticorpo e anticorpo parental usadas no ensaio são essencialmente as mesmas. Em algumas realizações, o anticorpo e o anticorpo parental têm a mesma sequência de aminoácidos, mas o anticorpo é não fucosilado, enquanto o anticorpo parental é fucosilado. Em algumas realizações, a atividade de ADCC será determinada com o uso do ensaio de ADCC in vitro conforme divulgado no presente pedido, mas são contemplados outros ensaios ou métodos para determinação de atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal etc. Em algumas realizações, um anticorpo com atividade de ADCC melhorada tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA. Em algumas realizações, um anticorpo com atividade de ADCC melhorada tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (V158). Em algumas realizações, um anticorpo com atividade de ADCC melhorada tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (F158).

[069] Um anticorpo com afinidade de ligação ao FcR “alterada” ou atividade de ADCC é aquela em que tem tanto atividade de ligação ao FcR melhorada ou diminuída e/ou atividade de ADCC em comparação a um anticorpo parental, em que o anticorpo e o anticorpo parental se diferem em pelo menos um aspecto estrutural. Um anticorpo que “exibe ligação aumentada” a um FcR se liga a pelo menos um FcR com melhor afinidade que o anticorpo parental. Um anticorpo que “exibe ligação diminuída” a um FcR se liga a pelo menos um FcR com afinidade mais baixa que um anticorpo parental. Esses anticorpos que exibem ligação diminuída a um FcR podem possuir pouca ou nenhuma ligação notável a um FcR, por exemplo, 0 a 20% de ligação ao FcR em comparação a uma região Fc de IgG de sequência nativa.

[070] “Afinidade melhorada para Fc gama RIIIA” refere-se a um anticorpo que tem maior afinidade para Fc gama RIIIA (também citada, em alguns casos, como CD16a) do que um anticorpo parental, em que o anticorpo e o anticorpo parental se diferem em pelo menos um aspecto estrutural. Em algumas realizações, o anticorpo e o anticorpo parental têm a mesma sequência de aminoácidos, mas o anticorpo é não fucosilado, enquanto o anticorpo parental é fucosilado. Pode ser usado qualquer método adequado para determinar afinidade a Fc gama RIIIA. Em algumas realizações, a afinidade para Fc gama RIIIA é determinada por um método descrito no presente pedido. Em algumas realizações, um anticorpo com afinidade melhorada para Fc gama RIIIA tem atividade de ADCC melhorada. Em algumas realizações, um anticorpo com afinidade melhorada para Fc gama RIIIA tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(V158). Em algumas realizações, um anticorpo com afinidade melhorada para Fc gama RIIIA tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(F158).

[071] Anticorpo “não fucosilado” ou um anticorpo “desprovido de fucose” refere-se a um anticorpo isotipo IgG1 ou IgG3 que é desprovido de fucose em sua região constante de glicosilação. A glicosilação de IgG1 ou IgG3 humana ocorre em Asn297, como glicosilação de oligossacarídeo complexo biantenário fucosilado central terminado com até dois resíduos Gal. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado é desprovido de fucose em Asn297. Essas estruturas são designadas como resíduos de glicano G0, G1 (α1,6 ou α1,3) ou G2, dependendo da quantidade de resíduos Gal terminal. Consulte, por exemplo, Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003)) Glicosilação tipo CHO de anticorpo Fc é descrita, por exemplo, em Routier, F. H., Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997). Em algumas realizações, pelo menos 85% de uma batelada de anticorpos expressa de forma recombinante em células hospedeiras de CHO não glicomodificadas são fucosiladas em Asn297. Ao se referir a uma composição que compreende uma pluralidade de anticorpos, os anticorpos são considerados como sendo não fucosilado se < 5% dos anticorpos na composição compreendem fucose em Asn297. Métodos para medir fucose incluem quaisquer métodos conhecidos na técnica, incluindo os métodos descritos no presente pedido. Em algumas realizações, a fucose é detectada pelo método descrito no Exemplo 1. Em algumas realizações, a fucose é indetectável em uma composição que compreende uma pluralidade de anticorpos não fucosilados. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado tem atividade de ADCC melhorada. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (V158). Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (F158).

[072] “Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação da via de complemento tradicional é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada), que são ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano- Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado. Anticorpos com sequências de aminoácidos de região Fc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída são descritos, por exemplo, na patente US 6.194.551 B1, patente US 7.923.538, patente US 7.994.290 e documento WO 1999/51642. Consulte também, por exemplo, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000))

[073] O termo “substancialmente similar” ou “substancialmente o mesmo”, como usado no presente pedido, denota um grau suficientemente alto de similaridade entre dois ou mais valores numéricos como aquele que um técnico no assunto consideraria a diferença entre os dois ou mais valores ser de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelo dito valor. Em algumas realizações, os dois ou mais valores substancialmente similares se diferem por não mais que cerca de qualquer um dentre 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ou 50%.

[074] A expressão “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente”, como usada no presente pedido, denota um grau suficientemente alto de semelhança entre dois valores numéricos de modo que um técnico no assunto consideraria a diferença entre os dois valores serem de significância estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos ditos valores. Em algumas realizações, os dois valores numéricos substancialmente diferentes se diferem por mais de cerca de qualquer um dentre 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%.

[075] Os termos “sequência líder” e “sequência sinal” são usados de forma intercambiável para se referir a uma sequência de resíduos de aminoácidos localizados na terminação N de um polipeptídeo que facilita secreção de um polipeptídeo a partir de uma célula de mamífero. Uma sequência líder pode ser clivada mediante exportação do polipeptídeo da célula de mamífero, formando uma proteína madura. As sequências líderes podem ser naturais ou sintéticas, e elas podem ser heterólogas ou homólogas à proteína à qual elas são fixadas.

[076] Um polipeptídeo de “sequência nativa” compreende um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácidos como um polipeptídeo encontrado na natureza. Dessa forma, um polipeptídeo de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de ocorrência natural de qualquer mamífero. Esse polipeptídeo de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. O termo “polipeptídeo de sequência nativa” especificamente abrange formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural do polipeptídeo (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas do polipeptídeo de ocorrência natural.

[077] Um polipeptídeo “variante” significa um polipeptídeo biologicamente ativo que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de sequência nativa após alinhar as sequências e introduzir gaps, se necessário, para obter o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Essas variantes incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou deletados na terminação N ou C do polipeptídeo. Em algumas realizações, uma variante terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, uma variante terá pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, uma variante terá pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo de sequência nativa.

[078] Como usado no presente pedido, “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” e “homologia” em relação a uma sequência de peptídeo, polipeptídeo ou anticorpo são definidos como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de peptídeo ou polipeptídeo específica, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e sem considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou MEGALIGNTM (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas.

[079] Uma substituição de aminoácido pode incluir, mas não se limita a, substituição de um aminoácido em um polipeptídeo com outro aminoácido. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferenciais”. Mais mudanças substanciais são fornecidas na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplares”, e conforme ainda descritas abaixo, em referência às classes de cadeia laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/aprimorada, diminuição de imunogenicidade e ADCC ou CDC aprimorada. TABELA 1

[080] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[081] Substituições não conservativas irão implicar na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[082] O termo “vetor” é usado para descrever um polinucleotídeo que pode ser elaborado geneticamente para conter um polinucleotídeo clonado ou polinucleotídeos que podem ser propagados em uma célula hospedeira. Um vetor pode incluir um ou mais dos seguintes elementos: uma origem de replicação, uma ou mais sequências reguladoras (como, por exemplo, promotores e/ou enhancers) que regulam a expressão do polipeptídeo de interesse e/ou um ou mais genes marcadores selecionáveis (como, por exemplo, genes de resistência a antibióticos e genes que podem ser usados em ensaios colorimétricos, por exemplo, β-galactosidase). O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor que é usado para expressar um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira.

[083] Uma “célula hospedeira” se refere a uma célula que pode ser ou foi um receptor de um vetor ou polinucleotídeo isolado. Células hospedeiras podem ser células procariontes ou células eucariontes. Células eucariontes exemplares incluem células de mamíferos, como células de animais primatas ou não primatas; células fúngicas, como levedura; células vegetais; e células de inseto. Células de mamíferos exemplares não limitantes incluem, mas não se limitam a, células NSO, células PER.C6® (Crucell), e células 293 e CHO, e seus derivados, como células 293-6E e DG44, respectivamente.

[084] O termo “isolado” se refere a uma molécula que foi separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela é tipicamente encontrada na natureza ou produzida. Por exemplo, um polipeptídeo é citado como “isolado” quando é separado de pelo menos alguns dos componentes da célula na qual ele foi produzido. Quando um polipeptídeo é secretado por uma célula após expressão, considera-se “isolar” o polipeptídeo, separar fisicamente o sobrenadante contendo o polipeptídeo a partir da célula que o produziu. De maneira similar, um polinucleotídeo é citado como “isolado” quando ele não é parte do maior polinucleotídeo (como, por exemplo, DNA genômico ou DNA mitocondrial, no caso de um polinucleotídeo de DNA) na qual que ele é tipicamente encontrado na natureza, ou é separado de pelo menos alguns dos componentes da célula em que ele foi produzido, por exemplo, no caso de um polinucleotídeo de RNA. Dessa forma, um polinucleotídeo de DNA que está contido em um vetor dentro de uma célula hospedeira pode ser citado como “isolado”.

[085] Os termos “indivíduo” ou “sujeito” são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um animal; por exemplo, um mamífero. Em algumas realizações, são fornecidos métodos para tratar mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, humanos, roedores, símios, felinos, caninos, equinos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, animais mamíferos de laboratório, animais mamíferos de criação, animais mamíferos para esporte e animais mamíferos de estimação. Em alguns exemplos, um “indivíduo” ou “sujeito” refere-se a um indivíduo ou sujeito com necessidade de tratamento para uma doença ou disfunção.

[086] Uma “doença” ou “disfunção” refere-se a uma condição onde é necessário tratamento.

[087] O termo “câncer” refere-se a uma disfunção proliferativa maligna associado a proliferação celular descontrolada, crescimento celular sem restrições e morte celular diminuída através de apoptose. Os cânceres exemplares não limitantes incluem câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas e câncer esofágico. Em algumas realizações, um câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a amplificação do FGFR2 compreende a razão de FGFR2:CEN10 (centrômero do cromossomo 10) >3. Em algumas realizações, um câncer que compreende uma amplificação do gene FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, o câncer que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, um câncer superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, um câncer gástrico compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende uma amplificação do gene FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, um câncer gástrico superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a superexpressão é superexpressão de mRNA. Em algumas realizações, a superexpressão é superexpressão de proteína.

[088] O termo “tumor” é usado no presente pedido para se referir a um grupo de células que exibem níveis anormalmente altos de proliferação e crescimento. Um tumor pode ser benigno, pré-maligno ou maligno; as células de tumor maligno são cancerosas. As células tumorais podem ser células tumorais sólidas ou células tumorais leucêmicas. O termo “crescimento tumoral” é usado no presente pedido para se referir a proliferação ou crescimento por uma célula ou células que compreendem um tumor que leva a um correspondente aumento no tamanho do tumor.

[089] Como usado no presente pedido “tratamento” é uma abordagem para se obter resultados clínicos benéficos ou desejados. “Tratamento” como usado no presente pedido, abrange qualquer administração ou aplicação de uma terapêutica para doença em um mamífero, incluindo um humano. Para propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a, qualquer um ou mais dentre: alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, prevenção ou retardo da propagação (por exemplo, metástase, por exemplo, metástase para o pulmão ou para os linfonodos) da doença, prevenção ou retardo de reincidência da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhora do estado da doença, inibição da doença ou progressão da doença, inibição ou abrandamento da doença ou de sua progressão, interrompendo seu desenvolvimento e remissão (se parcial ou total). Também englobado por “tratamento” é uma redução da consequência patológica de uma doença proliferativa. Os métodos da invenção contemplam qualquer um ou mais desses aspectos de tratamento.

[090] No contexto de câncer, o termo “tratar” inclui qualquer ou todos dentre: inibir crescimento de células tumorais ou células cancerosas, inibir replicação de células tumorais ou células cancerosas, diminuição da massa tumoral total e melhora de um ou mais sintomas associado com a doença.

[091] Os termos “inibição” ou “inibir” se referem a uma diminuição ou cessação de qualquer característica fenotípica ou à diminuição ou cessação na incidência, grau ou probabilidade dessa característica. “Reduzir” ou “inibir” é diminuir, reduzir ou interromper uma atividade, função e/ou quantidade em comparação a uma referência. Em certas realizações, entende-se por “reduzir” ou “inibir” a capacidade de causar uma diminuição global de 20% ou mais. Em outra realização, entende-se por “reduzir” ou “inibir” a capacidade de causar uma diminuição global de 50% ou mais. Em ainda outra realização, entende-se por “reduzir” ou “inibir” a capacidade de causar uma diminuição global de 75%, 85%, 90%, 95% ou mais.

[092] Uma “referência”, como usado no presente pedido, refere- se a qualquer amostra, padrão ou nível que é utilizado para fins de comparação. Uma referência pode ser obtida junto à uma amostra saudável e/ou não doente. Em alguns exemplos, uma referência pode ser obtida junto à uma amostra não tratada. Em alguns exemplos, uma referência é obtida junto à uma amostra não doente ou não tratada de um sujeito individual. Em alguns exemplos, uma referência é obtida a partir de um ou mais indivíduos saudáveis que não são o sujeito ou o paciente.

[093] Como usado no presente pedido, “atrasar o desenvolvimento de uma doença” significa adiar, impedir, atrasar, retardar, estabilizar, suprimir e/ou postergar o desenvolvimento da doença (como câncer). Este atraso pode ser de vários períodos de tempo, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo que está sendo tratado. Como é evidente para um técnico no assunto, um atraso suficiente ou significativo pode, na realidade, englobar prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer de estágio tardio, como desenvolvimento de metástase, pode ser atrasado.

[094] “Prevenção”, como usado no presente pedido, inclui fornecer profilaxia em relação à ocorrência ou reincidência de uma doença em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença.

[095] Como usado no presente pedido, “suprimir” uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade quando comparado de outro modo às mesmas condições exceto para uma condição ou parâmetro de interesse, ou alternativamente, em comparação a outra condição. Por exemplo, um anticorpo que suprime o crescimento tumoral reduz a taxa de crescimento do tumor em comparação à taxa de crescimento do tumor na ausência do anticorpo.

[096] Uma “quantidade efetiva” de um agente refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessário, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[097] Uma “quantidade terapeuticamente efetiva” de uma substância/molécula da invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista obter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial da substância/molécula, agonista ou antagonista, são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade terapeuticamente efetiva pode ser distribuída em uma ou mais administrações.

[098] Uma “quantidade profilaticamente efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e para períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desde que uma dose profilática seja usada em sujeitos, antes ou em um estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.

[099] Os termos “formulação farmacêutica” e “composição farmacêutica” referem-se a uma preparação que está nessa forma para permitir que a atividade biológica do(s) ingrediente(s) ativo(s) esteja efetiva, e que não contenha componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos a um sujeito para o qual a formulação seria administrada. Essas formulações podem ser estéreis.

[0100] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um material sólido não tóxico, semissólido, diluente, ou enchimento líquido, formulação auxiliar ou veículo convencional na técnica para uso com um agente terapêutico que, em conjunto, compreendem uma “composição farmacêutica” para administração a um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável é não tóxico para receptores nas dosagens e concentrações empregadas e é compatível com outros ingredientes da formulação. O veículo farmaceuticamente aceitável é apropriado para a formulação empregada.

[0101] Uma formulação “estéril” é asséptica ou essencialmente livre de microrganismos vivos e seus esporos.

[0102] Administração “em combinação com” um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva ou sequencial, em qualquer ordem.

[0103] O termo “simultaneamente” é usado no presente pedido para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, quando pelo menos parte da administração se sobrepõe no tempo ou quando a administração do agente terapêutico se inclui em um curto período de tempo em relação à administração do outro agente terapêutico. Por exemplo, dois ou mais agentes terapêuticos são administrados com uma separação de tempo de não mais de cerca de 60 minutos, como não mais de cerca de qualquer um dentre 30, 15, 10, 5 ou 1 minuto.

[0104] O termo “sequencialmente” é usado no presente pedido para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, quando a administração de um ou mais agentes continua após a suspensão da administração de um ou mais outros agentes. Por exemplo, a administração de dois ou mais agentes terapêuticos são administrados com uma separação de tempo de mais de cerca de quinze minutos, como cerca de qualquer um dentre 20, 30, 40, 50 ou 60 minutos, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 1 semana, 2 semanas ou 1 mês ou mais.

[0105] Como usado no presente pedido, “em conjunto com” refere- se à administração de uma modalidade de tratamento em adição a outra modalidade de tratamento. Como tal, “em conjunto com” refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração da outra modalidade de tratamento para o indivíduo.

[0106] O termo “bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.

[0107] Um “artigo de fabricação” é qualquer fabricação (por exemplo, uma embalagem ou recipiente) ou kit que compreende pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para tratamento de uma doença ou disfunção (por exemplo, câncer), ou uma sonda para detectar especificamente um biomarcador descrito no presente pedido. Em certas realizações, a fabricação ou kit é promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para realizar os métodos descritos no presente pedido.

II. ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB

[0108] Em alguns aspectos, a invenção fornece um anticorpo não fucosilado direcionado contra FGFR2IIIb. Anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados incluem, mas não se limitam a, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de camundongos e anticorpos que compreendem HVRs da cadeia pesada e/ou da cadeia leve (por exemplo, CDRs) discutidas no presente pedido. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos não fucosilados isolados que se ligam a FGFR2IIIb. Em certas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado modula atividade de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado tem atividade de ADCC melhorada. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(V158). Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado tem afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(F158).

[0109] O anticorpo anti-FGFR2IIIb designado “αFGFR2b” descrito no presente pedido nos Exemplos e a lista de sequências tem a intenção de ter a mesma sequência de aminoácidos que o anticorpo HuGAL-FR21 na patente US 8.101.723 B2, emitida em 24 de janeiro de 2012. A patente US 8.101.723 B2 é especificamente incorporada ao presente pedido como referência para qualquer finalidade e, em específico, as Figuras 13 e 14 da patente US 8.101.723 B2, que apresenta as sequências de aminoácidos das regiões variáveis e as cadeias de anticorpos maduros inteiros de HuGAL-FR21, são incorporadas ao presente pedido como referência para qualquer finalidade. Além disso, as sequências de HVR do anticorpo HuGAL-FR21, que estão sublinhadas na Figura 13 da patente US 8.101.723 B2, são especificamente incorporadas ao presente pedido como referência para qualquer finalidade.

[0110] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- FGFR2IIIb não fucosilado que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs (por exemplo, CDRs) selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0111] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende pelo menos uma cadeia pesada que compreende uma região variável da cadeia pesada e pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia pesada, e pelo menos uma cadeia leve que compreende uma região variável da cadeia leve e pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia leve. Em algumas realizações, um anticorpo anti- FGFR2IIIb não fucosilado compreende duas cadeias pesadas, em que cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada e pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia pesada, e duas cadeias leves, em que cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve e pelo menos uma porção de uma região constante da cadeia leve. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0112] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- FGFR2IIIb não fucosilado que compreende seis HVRs compreendendo (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende seis HVRs, conforme descrito acima, e se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende seis HVRs conforme descrito acima, e se liga a FGFR2IIIb e tem pelo menos uma atividade selecionada a partir da atividade de ADCC melhorada e afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (como Fc gama RIIIA(V158) e/ou Fc gama RIIIA(F158)). Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFRIIIb não fucosilado não se liga a FGFR2IIIc.

[0113] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- FGFR2IIIb não fucosilado que compete com um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende seis HVRs compreendendo (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0114] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo não fucosilado que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0115] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo não fucosilado que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VL selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0116] Em outro aspecto, um anticorpo não fucosilado da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 8; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0117] Em outro aspecto, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 4. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 5, incluindo modificações pós- traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0118] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 5. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 4, incluindo modificações pós- traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0119] Em outro aspecto, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, e uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti- FGFR2III que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar a FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 4. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 5. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, o anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 4 e a sequência de VL de SEQ ID NO: 5, incluindo modificações pós-traducionais de uma ou ambas as sequências. Em uma realização específica, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0120] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e uma VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em uma realização, o anticorpo compreende as sequências de VH e VL na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.

[0121] Em outro aspecto, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em certas realizações, uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar a FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 2. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, a cadeia pesada do anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 2, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a cadeia pesada compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[0122] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em certas realizações, uma sequência da cadeia leve que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 3. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, a cadeia leve do anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 3, incluindo modificações pós- traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a cadeia leve compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

[0123] Em outro aspecto, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma sequência da cadeia leve que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em certas realizações, uma sequência da cadeia pesada que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, uma sequência da cadeia leve que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR2IIIb que compreende essa sequência mantém a capacidade para se ligar ao FGFR2IIIb. Em certas realizações, esse anticorpo anti-FGFR2IIIb mantém a capacidade para se ligar seletivamente a FGFR2IIIb sem se ligar a FGFR2IIIc. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 2. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 3. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). Opcionalmente, a cadeia pesada do anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência VH na SEQ ID NO: 2, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência e a cadeia leve do anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 3, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a cadeia pesada compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a cadeia leve compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

ANTICORPOS QUIMÉRICOS EXEMPLARES

[0124] Em certas realizações, um anticorpo, como um anticorpo não fucosilado, fornecido no presente pedido é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[0125] Anticorpos quiméricos não fucosilados exemplares não limitantes incluem anticorpos quiméricos que compreendem sequências de HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia pesada e/ou HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia leve, conforme descrito no presente pedido. Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb quimérico não fucosilado compreende as regiões variáveis descritas acima e se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb quimérico não fucosilado compreende as regiões variáveis conforme descrito acima, e se liga a FGFR2IIIb e tem pelo menos uma atividade selecionada a partir da atividade de ADCC melhorada e afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (como Fc gama RIIIA(V158) e/ou Fc gama RIIIA(F158)). Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFRIIIb quimérico não fucosilado não se liga a FGFR2IIIc.

[0126] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFRIIIb quimérico não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 4, em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFRIIIb quimérico não fucosilado compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFRIIIb quimérico não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 4; e uma cadeia leve que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 5; em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb.

[0127] Anticorpos anti-FGFR2IIIb quiméricos não fucosilados exemplares também incluem anticorpos quiméricos que competem para ligação a FGFR2IIIb com um anticorpo ou fragmento do mesmo descrito no presente pedido. Dessa forma, em algumas realizações, é fornecido um anticorpo anti- FGFR2IIIb quimérico que compete por ligação a FGFR2IIIb com um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas realizações, o anticorpo compete por ligação a FGFR2IIIb, mas não se liga a FGFR2 IIIc.

[0128] Em algumas realizações, um anticorpo quimérico descrito no presente pedido compreende uma ou mais regiões constantes humanas. Em algumas realizações, a região constante da cadeia pesada humana é de um isotipo selecionado a partir de IgA, IgG e IgD. Em algumas realizações, a região constante da cadeia leve humana é de um isotipo selecionado a partir de K e À. Em algumas realizações, um anticorpo quimérico descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG humana. Em algumas realizações, um anticorpo quimérico descrito no presente pedido compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 humana. Em algumas realizações, um anticorpo quimérico descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG4 humana e uma cadeia leve K humana.

[0129] Conforme apontado acima, se a função efetora é ou não desejável pode depender do método específico para tratamento destinado a um anticorpo. Dessa forma, em algumas realizações, quando a função efetora é desejável, é selecionado um anticorpo anti-FGFR2IIIb quimérico que compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 humana ou uma região constante da cadeia pesada de IgG3 humana. Em algumas realizações, quando a função efetora é desejável, é selecionado um anticorpo anti- FGFR2IIIb quimérico que compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 ou IgG2 humana.

ANTICORPOS HUMANIZADOS EXEMPLARES

[0130] Em algumas realizações, são fornecidos anticorpos humanizados não fucosilados que se ligam a FGFR2IIIb. Anticorpos humanizados são úteis como moléculas terapêuticas porque anticorpos humanizados reduzem ou eliminam a resposta imune humana a anticorpos não humanos (como resposta ao anticorpo anti-camundongo humano (HAMA)), que pode resultar em uma resposta imune a um anticorpo terapêutico e efetividade diminuída da terapêutica.

[0131] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[0132] Anticorpos humanizados e métodos para produzir os mesmos são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, (2008), Front. Biosci. 13: 1619-1633, e ainda são descritos, por exemplo, em Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; patentes US 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 (que descrevem enxerto de SDR (a- CDR)); Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498 (que descrevem “resurfacing”); Dall’Acqua et al., (2005), Methods 36:43-60 (que descrevem “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., (2005), Methods 36:61-68 e Klimka et al., 2000, Br. J. Cancer, 83:252-260 (que descrevem a abordagem “seleção guiada” para embaralhamento de FR).

[0133] Regiões de estrutura humana que podem ser usadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296); regiões de estrutura derivadas a partir da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (consulte, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; e Presta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro e Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633); e regiões de estrutura derivadas de triagem de bibliotecas de FR (consulte, por exemplo, Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 e Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618).

[0134] Anticorpos humanizados exemplares não limitantes incluem αFGFR2b, descrito no presente pedido. Anticorpos humanizados não fucosilados exemplares não limitantes incluem αFGFR2bA, descrito no presente pedido, que tem as mesmas sequências de aminoácidos como αFGFR2b que compreende fucose (também citado como αFGFR2bF). Anticorpos humanizados não fucosilados exemplares não limitantes também incluem anticorpos que compreendem uma região variável da cadeia pesada de αFGFR2b e/ou uma região variável de cadeia leve de αFGFR2b. Anticorpos humanizados não fucosilados exemplares não limitantes incluem anticorpos que compreendem uma região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 4 e/ou uma região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 5. Anticorpos humanizados exemplares também incluem, mas não se limitam a, anticorpos humanizado que compreendem HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia pesada e/ou HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia leve de αFGFR2b. Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado compreende as HVRs descritas acima (isto é, (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11) e se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, o anticorpo anti- FGFR2IIIb humanizado compreende as HVRs descritas acima, e se liga a FGFR2IIIb e tem pelo menos uma atividade selecionada a partir da atividade de ADCC melhorada e afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (como Fc gama RIIIA(V158) e/ou Fc gama RIIIA(F158)). Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFRIIIb humanizado não fucosilado não se liga a FGFR2IIIc.

[0135] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado compreende HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia pesada e/ou uma HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia leve de αFGFR2b. Anticorpos anti-FGFR2IIIb humanizados não fucosilados exemplares não limitantes incluem anticorpos que compreendem conjuntos de cadeia pesada HVR1, HVR2 e HVR3 apresentados nas SEQ ID NOs: 6, 7 e 8. Anticorpos anti- FGFR2IIIb humanizados não fucosilados exemplares não limitantes também incluem anticorpos que compreendem conjuntos de HVR1, HVR2 e HVR3 da cadeia pesada apresentados nas SEQ ID NOs: 9, 10 e 11.

[0136] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFRIIIb humanizado não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 4, e em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFRIIIb humanizado não fucosilado compreende uma cadeia leve que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um anticorpo anti- FGFRIIIb humanizado não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 4; e uma cadeia leve que compreende uma sequência de região variável que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 5; em que o anticorpo se liga a FGFR2IIIb.

[0137] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado compreende pelo menos uma das HVRs discutidas no presente pedido. Isso é, em algumas realizações, um anticorpo anti- FGFR2IIIb humanizado não fucosilado compreende pelo menos uma HVR selecionada a partir de uma HVR1 da cadeia pesada discutida no presente pedido, uma HVR2 da cadeia pesada discutida no presente pedido, uma HVR3 da cadeia pesada discutida no presente pedido, uma HVR1 da cadeia leve discutida no presente pedido, uma HVR2 da cadeia leve discutida no presente pedido, e uma HVR3 da cadeia leve discutida no presente pedido. Além disso, em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado compreende pelo menos uma HVR mutada com base em uma HVR discutida no presente pedido, em que a HVR mutada compreende 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácidos em relação à HVR discutida no presente pedido. Em algumas realizações, uma ou mais das substituições de aminoácidos são substituições de aminoácidos conservativas. Os técnicos no assunto podem selecionar um ou mais substituições conservativas de aminoácidos adequadas para uma sequência de HVR específica, em que não são previstas as substituições conservativas de aminoácidos adequadas alterarem significativamente as propriedades de ligação do anticorpo que compreende a HVR mutada.

[0138] Anticorpos anti-FGFR2IIIb humanizados não fucosilados exemplares também incluem anticorpos que competem para ligação a FGFR2IIIb com um anticorpo ou fragmento do mesmo descrito no presente pedido. Dessa forma, em algumas realizações, é fornecido um anticorpo anti- FGFR2IIIb humanizado que compete para ligação a FGFR2IIIb com αFGFR2b. Em algumas realizações, é fornecido um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado que compete para ligação a FGFR2IIIb com αFGFR2b e tem pelo menos uma atividade selecionada a partir da atividade de ADCC melhorada e afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (como Fc gama RIIIA(V158) e/ou Fc gama RIIIA(F158)). Em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFRIIIb humanizado não fucosilado não se liga a FGFR2IIIc.

[0139] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado compreende uma ou mais regiões constantes humanas. Em algumas realizações, a região constante da cadeia pesada humana é de um isotipo selecionado a partir de IgA, IgG e IgD. Em algumas realizações, a região constante da cadeia leve humana é de um isotipo selecionado a partir de K e À.

[0140] Em algumas realizações, um anticorpo humanizado não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG humano. Em algumas realizações, quando a função efetora é desejável, é selecionado um anticorpo anti-FGFR2IIIb humanizado não fucosilado que compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 humana ou uma região constante da cadeia pesada de IgG3 humana. Em algumas realizações, um anticorpo humanizado não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado humanizado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana, em que N297 não é fucosilado. Em algumas realizações, um anticorpo humano não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana e uma cadeia leve k humana.

[0141] Em algumas realizações, um anticorpo humanizado não fucosilado compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas realizações, um anticorpo humanizado não fucosilado compreende uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e quaisquer modificações pós- traducionais, e uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e quaisquer modificações pós-traducionais.

REGIÕES CONSTANTES DE ANTICORPOS EXEMPLARES

[0142] Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma ou mais regiões constantes humanas. Em algumas realizações, a região constante da cadeia pesada humana é de um isotipo selecionado a partir de IgA, IgG e IgD. Em algumas realizações, a região constante da cadeia leve humana é de um isotipo selecionado a partir de K e À.

[0143] Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG humana. Em algumas realizações, quando a função efetora é desejável, é selecionado um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado que compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG1 humana ou uma região constante da cadeia pesada de IgG3 humana. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana, em que N297 não é fucosilado. Em algumas realizações, um anticorpo não fucosilado descrito no presente pedido compreende uma região constante de IgG1 humana e uma cadeia leve k humana.

[0144] Ao longo do presente relatório descritivo e reivindicações, a menos que explicitamente declarado ou conhecido pelos técnicos no assunto, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada da imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5â Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), expressamente incorporada no presente pedido como referência. O “índice EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo EU de IgG1 humana.

[0145] Em certas realizações, um anticorpo da invenção compreende uma região Fc variante que tem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação à região Fc de uma IgG tipo selvagem ou de um anticorpo tipo selvagem. Em certas realizações, a região Fc variante tem duas ou mais substituições de aminoácidos na região Fc do anticorpo tipo selvagem. Em certas realizações, a região Fc variante tem três ou mais substituições de aminoácidos na região Fc do anticorpo tipo selvagem. Em certas realizações, a região Fc variante tem pelo menos uma, duas, três ou mais substituições de aminoácidos na região Fc descrita no presente pedido. Em certas realizações, a região Fc variante no presente pedido possuirá pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um anticorpo parental. Em certas realizações, a região Fc variante no presente pedido possuirá pelo menos cerca de 90% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um anticorpo parental. Em certas realizações, a região Fc variante no presente pedido possuirá pelo menos cerca de 95% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um anticorpo parental.

[0146] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é alterado para aumentar ou diminuir a medida na qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, de modo que um ou mais sítios de glicosilação são criados ou removidos.

[0147] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consulte, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar anticorpos com certas propriedades aprimoradas.

[0148] Em uma realização, são fornecidos anticorpos que têm uma estrutura de carboidrato desprovida de fucose fixada (diretamente ou indiretamente) a uma região Fc (isto é, anticorpos não fucosilados). Por exemplo, a quantidade de fucose em uma composição que compreende uma pluralidade desses anticorpos pode ser de 0% a cerca de 5%. Em algumas realizações, uma composição que compreende uma pluralidade desses anticorpos compreende pelo menos 95% de anticorpos não fucosilados. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose). Métodos exemplares não limitantes para detectar fucose em um anticorpo incluem espectrometria de massa MALDI-TOF (consulte, por exemplo, documento WO 2008/077546), medição de HPLC de oligossacarídeos marcados com fluorescência (consulte, por exemplo, Schneider et al., “N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection”, Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996), medição de eletroforese por capilaridade de oligossacarídeos marcados com fluorescência liberados (consulte, por exemplo, Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185-5192 (1999)), e HPLC com detecção amperométrica pulsada para medir composição de monossacarídeo (consulte, por exemplo, Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)) Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de mais ou menos 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência em anticorpos. Em anticorpo αFGFR2b descrito no presente pedido, Asn297 é encontrado na sequência QYNST, e está em negrito e sublinhado na Tabela de Sequências mostrada abaixo, SEQ ID NO: 2. Variantes de fucosilação podem ter função ADCC aprimorada. Consulte, por exemplo, publicação de patente US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos “não fucosilados” ou “deficientes em fucose” incluem: patente US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patente US 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140; patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento WO 2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos não fucosilados incluem células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como linhagens celulares desprovidas do gene alfa-1,6- fucosiltransferase funcional, FUT8, por exemplo, células CHO knockout (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO 2003/085107).

[0149] Anticorpos são ainda fornecidos com oligossacarídeos bifurcados, por exemplo, na qual um oligossacarídeo biantenário fixado à região Fc do anticorpo é bifurcado por GlcNAc. Esses anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC aprimorada. Exemplos desses anticorpos são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878 (Jean- Mairet et al.); patente US 6.602.684 (Umana et al.); e patente US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidos anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo fixado à região Fc. Esses anticorpos podem ter função CDC aprimorada. Esses anticorpos são descritos, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.); e documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0150] Anticorpos também são fornecidos com extensões líder amino-terminal. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência líder amino-terminal estão presentes na amino-terminação de qualquer uma ou mais cadeias pesadas ou leves de um anticorpo. Uma extensão líder amino-terminal exemplar compreende ou consiste em três resíduos de aminoácidos, VHS, presentes em uma ou ambas as cadeias leves de um anticorpo.

[0151] Polipeptídeos de ligação com alta afinidade ao FcRn humano in vivo ou a meia podem ser analisadas, por exemplo, em camundongos transgênicos, em humanos ou primatas não humanos aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. Consulte também, por exemplo, Petkova et al. International Immunology 18(12):1759- 1769 (2006).

[0152] Em algumas realizações da invenção, um anticorpo não fucosilado medeia ADCC na presença de células efetoras humanas de maneira mais efetiva que um anticorpo parental que compreende fucose. Geralmente, a atividade de ADCC será determinada com o uso do ensaio de ADCC in vitro conforme divulgado no presente pedido, mas são contemplados outros ensaios ou métodos para determinação de atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal, etc.

[0153] Em certas realizações, a “KD”, “Kd”, “Kd” ou “valor de Kd” do anticorpo é medida pelo uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um BIACORE®-2000 ou um BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Por curto tempo, chips biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/mL (aproximadamente 0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μL/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medidas cinéticas, diluições seriais de polipeptídeo, por exemplo, anticorpo inteiro, são injetados em PBS com tensoativo TWEEN-20TM 0,05% (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μL/min. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. O equilíbrio da constante de dissociação (Kd) é calculado como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação exceder 106 M-1s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de faixa de passagem) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno 20nM em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, como um espectrômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCOTM série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho misturador.

[0154] Uma “taxa-on”, “taxa de associação”, “taxa associação” ou “kon” do anticorpo também pode ser determinada conforme descrito acima com o uso de um sistema BIACORE®-2000 ou um BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.).

[0155] Em certas realizações, a diferença entre os ditos dois valores (por exemplo, valores de Kd) é substancialmente a mesma, por exemplo, menor que cerca de 50%, menor que cerca de 40%, menor que cerca de 30%, menor que cerca de 20% e/ou menor que cerca de 10%, como uma função do valor de referência/comparação).

[0156] Em certas realizações, a diferença entre os ditos dois valores (por exemplo, valores Kd) é substancialmente diferente, por exemplo, maior que cerca de 10%, maior que cerca de 20%, maior que cerca de 30%, maior que cerca de 40%, e/ou maior que cerca de 50%, como uma função do valor para a molécula de referência/comparação.

SEQUÊNCIAS LÍDER EXEMPLARES

[0157] A fim de que algumas proteínas secretadas expressem e secretem em grandes quantidades, pode ser desejável uma sequência líder de uma proteína heteróloga. Em algumas realizações, o uso de sequências líder heterólogas pode ser vantajoso pelo fato de um polipeptídeo maduro resultante poder permanecer inalterado conforme a sequência líder é removida no ER durante o processo de secreção. A adição de uma sequência líder heteróloga pode ser necessária para expressar e secretar algumas proteínas.

[0158] Certas sequências de sequência líder exemplares são descritas, por exemplo, no Banco de Dados de sequência Líder mantidos pelo Department of Biochemistry, National University of Singapore. Consulte Choo et al., BMC Bioinformatics, 6: 249 (2005); e publicação PCT documento WO 2006/081430.

III. PROPRIEDADES DE ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB NÃO FUCOSILADOS

[0159] Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm atividade de ADCC melhorada in vitro e/ou in vivo. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm atividade de ADCC melhorada in vitro. Em algumas realizações, a atividade de ADCC, in vitro é determinada por um método descrito no presente pedido, por exemplo, no Exemplo 3. Resumidamente, as células que expressam FGFR2IIIb são colocadas em contato com PBMCs humanas isoladas recentemente a uma razão de 25:1 células efetoras para alvo (PBMCs), na presença de anticorpo fucosilado ou anticorpo não fucosilado. Em algumas realizações, as células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb são usadas como células alvo. Em algumas realizações, a citotoxicidade é determinada por quantificação de liberação de LDH com o uso de Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativo CytoTox (Promega, Madison, WI). Em algumas realizações, a lise máxima é determinada com o uso de Triton X-100 5% e a liberação espontânea é determinada na ausência de anticorpo. Em algumas realizações, a porcentagem de lise específica pode ser determinada com o uso da fórmula: (experimental - liberação espontânea) / (máxima - liberação espontânea) x 100 = % de lise específica. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado que tem atividade de ADCC melhorada resulta em lise específica que é pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70 ou pelo menos 75 pontos de porcentagem maior que a lise específica com a mesma quantidade de um anticorpo não fucosilado, pelo menos uma concentração de anticorpo testado. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado que tem atividade de ADCC melhorada resulta em lise específica que é pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 65, pelo menos 70 ou pelo menos 75 pontos de porcentagem maior que a lise específica com um anticorpo fucosilado, onde cada anticorpo está em uma concentração entre 0,01 e 1 μg/mL e as células alvo são células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb. Em algumas realizações, os anticorpos são testados a uma concentração de 0,01 μg/mL, 0,1 μg/mL ou 1 μg/mL.

[0160] Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(V158). Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados têm afinidade melhorada para Fc gama RIIIA(F158). Em algumas realizações, a afinidade do anticorpo para Fc gama RIIIA é determinada com o uso de ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, conforme descrito no presente pedido no Exemplo 2, e/ou como a seguir, que é descrita com referência a Fc gama RIIIA(V158), mas que também é adequada para determinação de afinidade para Fc gama RIIIA(F158). Resumidamente, em algumas realizações, o anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado ou não fucosilado é um chip de dextrano revestido com proteína A. Fc gama RIIIA (V158) (disponível junto a, por exemplo, R&D Systems) é injetado em várias concentrações. A constante de associação, constante de dissociação e afinidade de Fc gama RIIIA (V158) para anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado e não fucosilado pode ser determinada por exemplo, com o uso de programa de computação fornecido com o sistema de ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, modelo de ligação 1:1 por Programa de Computação de Avaliação Biacore T200). Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado com afinidade melhorada para Fc gama RIIIA (como Fc gama RIIIA(V158) ou Fc gama RIIIA(F158)) se liga a Fc gama RIIIA com pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 12 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 17 vezes ou pelo menos 20 vezes mais afinidade que um anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado. Por exemplo, se um anticorpo anti-FGFR2IIIb se liga a Fc gama RIIIA (V158) com uma afinidade (KD) de 9,2 nM e um anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado se liga a Fc gama RIIIA (V158) com uma afinidade (KD) de 207 nM, então o anticorpo anti-FGFR2IIIb se liga a Fc gama RIIIA (V158) com 207/9,2=22,5 vezes mais afinidade do que o anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado.

IV. EXPRESSÃO DE ANTICORPO ANTI-FGFR2IIIB E PRODUÇÃO MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAM ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB

[0161] São fornecidas moléculas de ácido nucleico que compreendem polinucleotídeos que codificam uma ou mais cadeias de anticorpos anti-FGFR2IIIb. Em algumas realizações, uma molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou uma cadeia leve de um anticorpo anti-FGFR2IIIb. Em algumas realizações, uma molécula de ácido nucleico compreende tanto um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada e um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-FGFR2IIIb. Em algumas realizações, uma primeira molécula de ácido nucleico compreende um primeiro polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada e uma segunda molécula de ácido nucleico compreende um segundo polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve.

[0162] Em algumas dessas realizações, a cadeia pesada e a cadeia leve são expressas a partir de uma molécula de ácido nucleico, ou a partir de duas moléculas de ácido nucleico separadas, como dois polipeptídeos separados. Em algumas realizações, como quando um anticorpo é um scFv, um polinucleotídeo único codifica um polipeptídeo único que compreende tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve ligadas juntas.

[0163] Em algumas realizações, um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou cadeia leve de um anticorpo anti-FGFR2IIIb compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência líder, que, quando traduzida, está localizada na terminação N da cadeia pesada ou cadeia leve. Conforme discutido acima, a sequência líder pode ser a sequência líder da cadeia pesada ou leve nativa, ou pode ser outra sequência líder heteróloga.

[0164] As moléculas de ácido nucleico podem ser construídas com o uso de técnicas de DNA recombinante convencionais na técnica. Em algumas realizações, uma molécula de ácido nucleico é um vetor de expressão que é adequado para expressão em uma célula hospedeira selecionada.

VETORES

[0165] São fornecidos vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam cadeias pesadas anti-FGFR2IIIb e/ou cadeias leves anti- FGFR2IIIb. Também são fornecidos vetores que compreendem polinucleotídeos que codificam cadeias pesadas anti-FGFR2IIIb e/ou cadeias leves anti-FGFR2IIIb. Esses vetores incluem, mas não se limitam a, vetores de DNA, vetores de fago, vetores virais, vetores retrovirais, etc. Em algumas realizações, um vetor compreende uma primeira sequência de polinucleotídeos que codifica uma cadeia pesada e uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica uma cadeia leve. Em algumas realizações, a cadeia pesada e a cadeia leve são expressas a partir do vetor como dois polipeptídeos separados. Em algumas realizações, a cadeia pesada e a cadeia leve são expressas como parte de um polipeptídeo único, como, por exemplo, quando o anticorpo é um scFv.

[0166] Em algumas realizações, um primeiro vetor compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada e um segundo vetor compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve. Em algumas realizações, o primeiro vetor e o segundo vetor são transfectados em células hospedeiras em quantidades similares (como quantidades molares similares ou quantidades de massa similares). Em algumas realizações, uma razão de moles ou de massa entre 5:1 e 1:5 do primeiro vetor e do segundo vetor é transfectada em células hospedeiras. Em algumas realizações, é usada uma razão de massa entre 1:1 e 1:5 para o vetor que codifica a cadeia pesada e o vetor que codifica a cadeia leve. Em algumas realizações, é usada uma razão de massa de 1:2 para o vetor que codifica a cadeia pesada e o vetor que codifica a cadeia leve.

[0167] Em algumas realizações, é selecionado um vetor que é otimizado para expressão de polipeptídeos em CHO ou células derivadas de CHO, ou em células NSO. Exemplares desses vetores são descritos, por exemplo, em Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[0168] Em várias realizações, cadeias pesadas de anti-FGFR2IIIb e/ou cadeias leves de anti-FGFR2IIIb podem ser expressas em células procariontes, como células bacterianas; ou em células eucariontes, como células fúngicas (como levedura), células vegetais, células de inseto e células de mamíferos. Essa expressão pode ser realizada, por exemplo, de acordo com procedimentos conhecidos na técnica. Células eucariontes exemplares que podem ser usadas para expressar polipeptídeos incluem, mas não se limitam a, células COS, incluindo células COS 7; 293 células, incluindo células 293-6E; células CHO; incluindo CHO-S, DG44. Células CHO LEC13, e células CHO FUT8; células PER.C6® (Crucell); e células NSO. Em algumas realizações, cadeias pesadas anti-FGFR2IIIb e/ou cadeias leves anti- FGFR2IIIb podem ser expressas em levedura. Consulte, por exemplo, publicação de patente US 2006/0270045 A1. Em algumas realizações, uma célula hospedeira eucarionte específica é selecionada com base em sua capacidade para produzir modificações pós-traducionais nas cadeias pesadas de anti-FGFR2IIIb e/ou cadeias leves de anti-FGFR2IIIb. Por exemplo, em algumas realizações, células CHO produzem polipeptídeos que têm um nível mais alto de sialiação do que o mesmo polipeptídeo produzido em células 293.

[0169] A introdução de um ou mais ácidos nucleicos em uma célula hospedeira desejada pode ser realizada por qualquer método incluindo, mas não se limitando a, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, infecção, etc. Métodos exemplares não limitantes são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Ácidos nucleicos podem ser transfectados temporariamente ou de forma estável em células hospedeiras desejadas, de acordo com qualquer método adequado.

[0170] Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados são produzidos em células capazes de produzir anticorpos não fucosilados, como células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como linhagens celulares desprovidas do gene alfa-1,6-fucosiltransferase funcional, FUT8, por exemplo, células CHO knockout (consulte, por exemplo, Yamane- Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO 2003/085107). Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados são produzidos em células CHO desprovidas de um gene FUT8 funcional. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados são produzidos em células CHOK1SV Potelligent® (BioWa/Lonza, Allendale, NJ).

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB

[0171] Anticorpos anti-FGFR2IIIb podem ser purificados por qualquer método adequado. Esses métodos incluem, mas não se limitam ao uso de matrizes de afinidade ou cromatografia de interação hidrofóbica. Ligantes de afinidade adequados incluem o ECD FGFR2IIIb e ligantes que se ligam a regiões constantes do anticorpo. Por exemplo, uma Proteína A, Proteína G, Proteína A/G ou uma coluna de afinidade de anticorpo pode ser usada para ligar a região constante e purificar um anticorpo anti-FGFR2IIIb. Cromatografia interativa hidrofóbica, por exemplo, uma coluna de butila ou fenila, também pode ser adequado para purificar alguns polipeptídeos. Muitos métodos para purificar polipeptídeos são conhecidos na técnica.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB LIVRE DE CÉLULAS

[0172] Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb é produzido em um sistema livre de células. Sistemas livre de células exemplares não limitantes são descritos, por exemplo, em Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003))

V. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS TERAPÊUTICOS MÉTODOS PARA TRATAR DOENÇAS COM O USO DE ANTICORPOS ANTI-FGFR2IIIB

[0173] São fornecidos anticorpos da invenção e composições que compreendem anticorpos da invenção para uso em métodos de tratamento para humanos ou animais. São também fornecidos métodos para tratar doenças que compreendem administrar anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados. Doenças exemplares não limitantes que podem ser tratadas com anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados incluem, mas não se limitam a câncer. Em algumas realizações, são fornecidos métodos para tratar câncer que compreendem administrar um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado. Em algumas realizações, o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas ou câncer de esôfago. Em algumas realizações, são fornecidos métodos para tratar câncer gástrico que compreendem administrar um anticorpo anti- FGFR2IIIb não fucosilado.

[0174] Em algumas realizações, um câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, um câncer que compreende uma amplificação do gene FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, o câncer que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, um câncer superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, um câncer gástrico compreende uma amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende uma amplificação do gene FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende amplificação do FGFR2 superexpressa FGFR2IIIb em maior medida do que FGFR2IIIc. Em algumas realizações, um câncer gástrico que compreende amplificação do FGFR2 expressa FGFR2IIIb em um nível normalizado que é mais de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maior que o nível normalizado de expressão de FGFR2IIIc. Em algumas realizações, os níveis de expressão são normalizados para GUSB. Em algumas realizações, um câncer gástrico superexpressa FGFR2IIIb, mas não compreende amplificação do gene FGFR2. Em algumas realizações, a superexpressão é superexpressão de mRNA. Em algumas realizações, a superexpressão é superexpressão de proteína.

[0175] A amplificação do gene FGFR2IIIb pode ser determinada por qualquer método adequado na técnica incluindo, mas não se limitando a hibridização in situ (ISH). Em algumas realizações, a amplificação do FGFR2 compreende a razão de FGFR2:CEN10 (centrômero do cromossomo 10) >3.

[0176] A superexpressão de mRNA do gene FGFR2IIIb pode ser determinada por qualquer método adequado na técnica incluindo, mas não se limitando a métodos que compreendem PCR quantitativa (qPCR). O termo “superexpressão de mRNA de FGFR2IIIb” significa níveis elevados de mRNA de FGFR2IIIb, independente da causa desses níveis elevados (isto é, se os níveis elevados são um resultado da transcrição aumentada e/ou degradação diminuída de mRNA, outro mecanismo ou uma combinação de mecanismos).

[0177] A superexpressão de proteína FGFR2IIIb pode ser determinada por qualquer método adequado na técnica incluindo, mas não se limitando a métodos baseados em anticorpo como imuno-histoquímica (IHQ). Em algumas realizações, a coloração IHQ é pontuada de acordo com métodos na técnica. O termo “superexpressão de proteína FGFR2IIIb” significa níveis elevados de proteína FGFR2IIIb, independente da causa desses níveis elevados (isto é, se os níveis elevados são um resultado da tradução aumentada e/ou degradação diminuída de proteína, outro mecanismo ou uma combinação de mecanismos). Em algumas realizações, a coloração 1+, 2+ ou 3+ de células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração 2+ ou 3+ de células tumorais por IHQ indica superexpressão de FGFR2IIIb. Em algumas realizações, a coloração IHQ é pontuada conforme descrito no Exemplo 6.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0178] Em várias realizações, as composições que compreendem anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados são fornecido em formulações com uma grande variedade de veículos farmaceuticamente aceitáveis (consulte, por exemplo, Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20a ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Vários veículos farmaceuticamente aceitáveis, que incluem veículos, adjuvantes e diluentes, estão disponíveis. Além disso, várias substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como agentes de ajuste de pH e tamponantes, agentes de ajustamento de tonicidade, estabilizantes, agentes umectantes e similares, também estão disponíveis. Veículos não limitantes exemplares incluem solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos.

[0179] Em várias realizações, as composições que compreendem anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser formuladas para injeção, incluindo administração subcutânea, por dissolução, suspensão ou emulsificação das mesmas em um solvente aquoso ou não aquoso, como óleos vegetais ou outros óleos, glicerídeos de ácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores, ou propilenoglicol; e se desejável, com aditivos convencionais como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizantes e conservantes. Em várias realizações, as composições podem ser formuladas para inalação, por exemplo, com o uso de propulsores pressurizados aceitáveis como diclorodifluormetano, propano, nitrogênio e similares. As composições também podem ser formuladas, em várias realizações, em microcápsulas de liberação sustentada, como com polímeros biodegradáveis ou não biodegradáveis. Uma formulação biodegradável exemplar não limitante inclui polímero ácido poliláctico-ácido glicólico. Formulação não biodegradável exemplar não limitante inclui um éster de ácido graxo poliglicerina. Determinados métodos de produção dessas formulações são descritos, por exemplo, na patente EP 1125584 A1.

ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO

[0180] Em várias realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados in vivo por várias rotas, incluindo, mas não se limitando a, oral, intra-arterial, parenteral, intranasal, intramuscular, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, retal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, ou de outro modo, por implante ou inalação. As composições objeto podem ser formuladas em preparações sob a forma sólida, semissólida, líquida ou gasosa; incluindo, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, enemas, injeções, inalantes e aerossóis. A formulação e a rota de administração apropriada podem ser selecionadas de acordo com a aplicação pretendida.

[0181] Composições farmacêuticas são administradas em uma quantidade efetiva para tratamento ou profilaxia de câncer, como câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas ou câncer de esôfago. A quantidade terapeuticamente efetiva é tipicamente dependente do peso do sujeito sendo tratado, sua condição física ou de saúde, a extensão da condição a ser tratada, ou a idade do sujeito sendo tratado. Em geral, os anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 10 μg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 50 μg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas realizações, anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose. Em algumas realizações, anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados em uma quantidade na faixa de cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose.

[0182] Composições de anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados conforme necessário para sujeitos. A determinação da frequência de administração pode ser feita por técnicos no assunto, como um diagnóstico do médico com base nas considerações da condição a ser tratada, idade do sujeito a ser tratado, gravidade da condição a ser tratada, estado geral de saúde do sujeito a ser tratado e similares. Em algumas realizações, uma dose efetiva de um anticorpo anti-FGFR2IIIb é administrada a um sujeito uma ou mais vezes. Em várias realizações, uma dose efetiva de um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrada ao sujeito uma vez por mês, mais de uma vez por mês como, por exemplo, a cada dois meses ou a cada três meses. Em outras realizações, uma dose efetiva de um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrada menos que uma vez por mês como, por exemplo, a cada duas semanas ou a cada semana. Uma dose efetiva de um anticorpo anti-FGFR2 não fucosilado é administrada ao sujeito pelo menos uma vez. Em algumas realizações, a dose efetiva de um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado pode ser administrada várias vezes, incluindo por períodos de pelo menos um mês, pelo menos seis meses ou pelo menos um ano.

TERAPIA DE COMBINAÇÃO

[0183] Anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados podem ser administrados sozinhos ou com outros modos de tratamento. Eles podem ser fornecidos antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após outros modos de tratamento, por exemplo, cirurgia, quimioterapia ou radioterapia. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrado em conjunto com outro agente anticâncer. Os agentes anticâncer exemplares não limitantes que podem ser administrados com um anticorpo anti-FGFR2IIIb incluem agentes platina (como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina), paclitaxel (TAXOL®), albumina-elaborado geneticamente formulação de paclitaxel de nanopartícula elaborado geneticamente com albumina (ABRAXANE®), docetaxel (TAXOTERE®), gencitabina (GEMZAR®), capecitabina (XELODA®), irinotecano (CAMPTOSAR®), epirrubicina (ELLENCE®, PHARMORUBICIN®), FOLFOX (oxaliplatina combinada com 5-FU e leucovorina), FOLFIRI (combinação de leucovorina, 5-FU e irinotecano), leucovorina, fluorouracila (5- FU, EFUDEX®), mitomicina C (MITOZYTREX™, MUTAMYCIN®) e cloridrato de doxorrubicina (Adriamicina PFS, Adriamicina RDF RUBEX®). Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrado em conjunto com paclitaxel. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrado em conjunto com cisplatina e/ou 5-FU. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrado em conjunto com cisplatina e 5-FU. Em algumas realizações, um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado é administrado em conjunto com FOLFOX (oxaliplatina, 5-FU e leucovorina).

KITS/ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[0184] A invenção também fornece kits, medicamentos, composições e formas de dosagem unitária para uso em qualquer um dos métodos descritos no presente pedido.

[0185] Kits da invenção incluem um ou mais recipientes que compreendem um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado (ou formas de dosagem unitária e/ou artigos de fabricação). Em algumas realizações, uma dosagem unitária é fornecida, em que a dosagem unitária contém uma quantidade pré-determinada de uma composição que compreende um anticorpo anti-FGFR2IIIb não fucosilado, com ou sem um ou mais agentes adicionais. Em algumas realizações, uma dosagem unitária é fornecida em seringa pré-preenchida de uso único para injeção. Em várias realizações, a composição contida na dosagem unitária pode compreender solução salina, sacarose ou similares; um tampão, como fosfato, ou similares; e/ou ser formulada dentro de uma faixa de pH estável e efetiva. De maneira alternativa, em algumas realizações, a composição pode ser fornecida como um pó liofilizado que pode ser reconstituído mediante adição de um líquido apropriado, por exemplo, água estéril. Em algumas realizações, a composição compreende uma ou mais substâncias que inibem a agregação de proteínas, incluindo, mas não se limitando a sacarose e arginina. Em algumas realizações, uma composição da invenção compreende heparina e/ou um proteoglicano.

[0186] Em algumas realizações, kits da invenção ainda compreendem instruções para uso no tratamento de câncer, por exemplo (como câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer pancreático ou câncer de esôfago) de acordo com qualquer um dos métodos descritos no presente pedido. O kit pode ainda compreender uma descrição de seleção de um indivíduo adequado ou tratamento. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas as instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções carregadas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis. Em algumas realizações, o kit ainda compreende outro agente terapêutico.

[0187] Os kits da invenção estão em embalagem adequada. Embalagens adequadas incluem, mas não se limitam a, frascos, garrafas, potes, embalagens flexíveis (por exemplo, sacos Mylar lacrados ou sacolas plásticas), e similares. Kits podem fornecer opcionalmente componentes adicionais como tampões e informações interpretativas. O presente pedido também fornece, dessa forma, artigos de fabricação, que incluem frascos (como frascos lacrados), garrafas, potes, embalagens flexíveis e similares.

EXEMPLOS

[0188] Os exemplos discutidos a seguir são destinados a ser puramente exemplares da invenção e não devem ser considerados como limitamte da invenção de qualquer forma. Os exemplos não se destinam a representar que os experimentos estão todos a seguir ou o único experimento realizado. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser contabilizados. A menos que indicado de outra forma, partes são partes, em peso, peso molecular é peso molecular médio ponderal, temperatura é em graus Centígrados e a pressão é ou está próxima da pressão atmosférica.

EXEMPLO 1 PRODUÇÃO DE ANTICORPO ANTI-FGFR2IIIB NÃO FUCOSILADO

[0189] Construção de vetores de expressão. As sequências de nucleotídeos codificando a cadeia pesada (HC) e a cadeia leve (LC) de anticorpo monoclonal αFGFR2b foram clonadas no GS Gene Expression System (Lonza, Basileia, Suíça) conforme as instruções do fabricante. O sistema gera um vetor de gene duplo (DGV) contendo os cassetes de expressão tanto para cadeias leves como para cadeias pesadas.

[0190] Escolha da linhagem celular hospedeira Para gerar o anticorpo monoclonal não fucosilado αFGFR2bA (a designação “A” após αFGFR2b refere-se a “não fucosilado”), as células CHOK1SV Potelligent® (BioWa/Lonza, Allendale, NJ) foram escolhidas como linhagem celular hospedeira. As células CHOK1SV Potelligent® são desprovidas do gene FUT8 (α1,6-fucosiltransferase) e, portanto, produzem anticorpos livres de fucose (anticorpos não fucosilados).

[0191] Construção de linhagem celular estável para produção de anticorpo αFGR2bA não fucosilado: O vetor de expressão que compreende as sequências de nucleotídeos que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo αFGFR2b descrita acima foi transfectada em células CHOK1SV Potelligent® por eletroporação de acordo com as instruções do fabricante. Células eletroporadas foram semeadas em uma placa de 96 poços em cerca de 10.000 células/50μL/poço em meio CHO CD sem L-glutamina. O meio CD CHO seletivo contendo 67μM de L-metionina sulfoximina (MSX, SIGMA cat n° M5379, St. Louis, MO) foi adicionado no dia seguinte a 150 μL/poço. O crescimento celular e a formação de clones foram monitorados com um IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[0192] Após 4 a 6 semanas, as colônias sobreviventes foram triadas quanto à expressão do anticorpo αFGFR2bA com o uso de um Ensaio Homogêneo de Fluorescência Resolvida no Tempo (HTRF) contracurvas padrão geradas com o anticorpo αFGFR2b purificado, com o uso de XL665 conjugado à proteína A e lgG de coelho policlonal conjugado criptato (Cisbio, Bedford, MA). Os clones de expressão mais alta foram expandidos em uma série de processos de aumento de escala de produção, incluindo placas de 24 poços, tubos de centrífuga, frascos de agitação, biorreatores de balança de bancada e finalmente um processo de produção em plataforma. Em cada etapa, apenas um subconjunto compreendendo os clones de expressão mais alta foi tomado no processo seguinte. O clone de produção final foi selecionado com base na avaliação dos títulos de produto da proteína, características de crescimento celular, qualidade do produto, estabilidade, bem como escalabilidade em biorreatores. A linha de produção final teve um nível de expressão de cerca de 3,5g/L para αFGFR2bA. A ausência de fucosilação em αFGFR2bA produzida na linhagem celular final de produção foi confirmada com o uso de cromatografia HLPC de fase normal (N-HPLC).

[0193] O anticorpo αFGFR2bA foi purificado por cromatografia de coluna e ultrafiltração para concentrar o material purificado, então diafiltração para troca no tampão de formulação (histidina 20 mM, L-arginina 150 mM, polisorbato 20 0,01%, pH 6,0). O anticorpo foi armazenado abaixo de -70°C.

[0194]A análise de glicano de αFGFR2bA é realizada pela liberação dos glicanos a partir da proteína, marcação dos glicanos com ácido antranílico (2-AA), e então purificar os glicanos marcados. A HPLC de fase normal com detecção fluorescente é usada para separar os glicanos e medir a quantidade relativa de cada glicano no anticorpo. A Figura 7 mostra que αFGFR2b derivado da linhagem celular CHOK1SV Potelligent® e o αFGFR2b produzido a partir de CHOK1SV teve duas distribuições de glicanos diferentes. (A) Distribuição de glicano de αFGFR2b derivado da linhagem celular CHOK1SV Potelligent® mostra que o anticorpo é desprovido de fucose (“G0”). (B) Distribuição de glicano de αFGFR2b derivado da linhagem celular CHOK1SV mostra que o anticorpo contém fucose (“G0F”).

[0195] Os picos de glicano da separação HPLC de fase normal foram identificados com o uso de dois métodos ortogonais. Primeiramente, o αFGFR2b produzido por CHOK1SV Potelligent® foi marcado e separado com o uso do método HPLC de fase normal. Após a detecção fluorescente, os glicanos passaram por um espectrômetro de massa QTrap. A massa de cada pico foi determinada e usada para identificar positivamente cada glicano, e é mostrada na Tabela 2. TABELA 2 MASSA DE PICOS DE GLICANOS

[0196] A massa de cada forma de fucosilado dos glicanos (G0F, G1F e G2F) também foi pesquisada no αFGFR2b produzido por CHOK1SV Potelligent® e não foi observada. A Figura 8 mostra diagramas esquemáticos das estruturas de glicanos G0, G1, G2, G0F, G1F, G2F e manose-5 (ou Man- 5), tipicamente observadas nos anticorpos.

[0197] As identidades de pico do ensaio HPLC também foram confirmadas com o uso de glicanos padrão adquiridos junto à Prozyme e compatibilizando o tempo de retenção entre os padrões e os perfis de αFGFR2 de ambas, linhagem celular CHOK1SV Potelligent® e linhagem celular CHOK1SV. Esses padrões foram capazes de identificar G0, G0F, Man5, G1, G1F e G2F.

[0198] Os resultados do ensaio HPLC bem como os dados de caracterização confirmaram a ausência de fucosilação em αFGFR2 derivado da linhagem celular CHOK1SV Potelligent®.

EXEMPLO 2 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-FGFR2N NÃO FUCOSILADO

[0199] As afinidades de ligação de αFGFR2bA e αFGFR2bF (a designação “F” após αFGFR2b refere-se a “fucosilado”) para Fc gama RIIIA(V158) foi determinada por ressonância plasmônica de superfície. Resumidamente, a Proteína A foi ligada covalentemente a um chip de dextrano com o uso do Kit de Acoplamento de Amina (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) e etilenodiamina 100 mM (Sigma) em tampão brato de sódio, pH 8,0 (Sigma, St. Louis, MO) como o reagente de bloqueio. Aproximadamente 600-800RU de αFGFR2bA e αFGFR2bF foram capturados sobre células de fluxo separadas e um fluxo celular derivatizado de Proteína A (Pierce) serviu como um controle de referência. Fc gama RIIIA (V158) (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi diluído em HBS-P + tampão de corrida (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ) e foi injetado em 5 concentrações (0 nM, 12,3 nM, 37 nM, 111 nM, 333 nM e 1000 nM) em duplicata. A constante de associação, constante de dissociação e afinidade para o αFGFR2bA foram calculadas com o uso de um modelo de ligação 1:1 do Programa de Computação de Avaliação Biacore T200. A constante de afinidade para ligação de αFGFR2bF foi determinada com o uso do modelo de afinidade de estado de equilíbrio do Software de Avaliação Biacore T200. Os resultados são mostrados na Tabela 3. TABELA 3

[0200] Conforme mostrado na Tabela 3, Fc gama RIIIA(V158) se ligou a αFGFR2bA com afinidade maior que 20 vezes do que se ligou a αFGFR2bF.

EXEMPLO 3 ATIVIDADE ADCC DE ANTICORPO ANTI-FGFR2B NÃO FUCOSILADO

[0201] Ensaios in vitro para determinar a atividade ADCC de anticorpo αFGFR2bA versus anticorpo αFGFR2bF foram realizados. Células alvo que expressam Ba/F3 FGFR2IIIb foram produzidas como a seguir. Células Ba/F3 adquiridas junto ao Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, cat n° ACC300, Braunschweig, Alemanha) foram mantidas em RPMI (Mediatech, cat n° 10-041- CV, Manassas, VA), suplementado com soro bovino fetal 10% (Mediatech, cat n° 35-010-CV) IL-3 murino 1 ng/mL (Peprotech, cat n° 213-13, Rocky Hill, NJ), 1X BME (Invitrogen, cat n° 1047574, Grand Island, NY) e 1X Penicilina- estreptomicina (Mediatech cat n° 30-002-Cl). As células Ba/F3 foram transfectadas com um vetor de expressão que expressa FGFR2IIIb, pBNew- hFGFR2b, com o uso do Kit V da linhagem celular Nucleofector® (Lonza, cat n° VCA-1003), seguindo o protocolo do fabricante. O vetor pBNew contém um promotor CAG com um íntron β-actina de galinha e genes de seleção de crescimento de ampicilina e puromicina. As células transfectadas foram incubadas em meio de crescimento completo por 3 dias, então tratadas com 2 μg/mL de puromicina (InVivoGen, cat n° ant-pr-1, San Diego, CA). A seleção de puromocoma foi mantida durante o cultivo. Para gerar clones estáveis individuais, as células foram plaqueadas na densidade de 1 célula por 3 poços. A separação de células ativadas por fluorescente (FACS) com um anticorpo anti-FGFR2IIIb foi usada para selecionar os clones com o nível mais alto de expressão de FGFR2IIIb.

[0202] Células MFM-223 foram obtidas junto à Health Protection Agency, Reino Unido; células OCUM-2M foram obtidas junto à Osaka City University, Osaka, Japão; e células KATO III foram obtidas junto à ATCC, Rockville, MD. Todas as células foram cultivadas com o uso de métodos padrão. PMBC recentemente isoladas de doadores saudáveis foram obtidas junto à AllCells, Emeryville, Califórnia.

[0203] Ensaios de ADCC foram conduzidos com o uso de células efetoras de 3 doadores independentes em 3 dias diferentes. O ensaio de ADCC foi realizado com o uso de PBMCs humanas recém isoladas como células efetoras a uma razão de 25:1 de célula efetora para alvo (E/T). As células foram incubadas por 16 horas na presença de efetores e concentrações crescentes de anticorpo. O ensaio de ADCC foi validado com o usod e 2 anticorpos de controle positivo, HERCEPTIN® em células alvo SKOV-3 e RITUXIN® em células alvo Raji. Um anticorpo de controle negativo humano lgG1 inteiro (Eureka Therapeutics, Catálogo ET901, Emeryville, CA) foi usado para citotoxicidade celular não específica. A citotoxicidade foi determinada por quantificação de liberação de LDH conforme as instruções do fabricante (CytoTox Non Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, Madison, WI).

[0204] A lise máxima foi determinada na presença de Triton X-100 5%, e a liberação espontânea foi determinada na ausência do anticorpo. A porcentagem de lise específica foi calculada como a seguir, como uma porcentagem da lise máxima menos a liberação espontânea: (liberação experimental - espontânea) / (liberação máxima - espontânea) x 100 = % de lise específica.

[0205] Os resultados para células Ba/F3 são mostrados na Figura 1. O anticorpo αFGFR2bA não fucosilado induziu uma lise específica maior que o anticorpo αFGFR2bF não fucosilado em células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb. Em células OCUM-2M, MFM 223 e KATO III, αFGFR2bA mostrou maior atividade de ADCC em concentrações menores do que αFGFR2bF, embora a lise específica máxima dos anticorpos foi comparável em células OCUM-2M e MFM 223 (dados não mostrados). Além disso, αFGFR2b mostrou pouca ou nenhuma atividade de ADCC em células que expressam FGFR2IIIc. Consulte a Figura 1A.

EXEMPLO 4 ATIVIDADE DOE ANTICORPO ANTI-FGFR2B NÃO FUCOSILADO EM MODELOS DE XENOENXERTO DE CÂNCER GÁSTRICO E DE MAMA

[0206] Camundongos CB17 SCID fêmea com seis semanas foram adquiridos junto ao Charles River Laboratories (Wilmington, MA) e foram aclimatados por 1 semana antes do início do estudo. A linhagem celular OCUM-2M de carcinoma gástrico humano ou a linhagem celular MFM-223 de carcinoma celular de mama foram usadas como modelos tumorais. OCUM-2M foi adquirida junto à Public University Corporation Osaka City University (OCU, Osaka, Japan) e a MFM-223 foi adquirida junto à Culture Collections, Public Health England (98050130, HPA Culture Collections, Salisbury, UK). As células foram cultivadas pro até três passagens no meio de crescimento completo até expansão para implantação. As células OCUM-2M e MFM-223 foram cultivadas no Meio Essencial Mínimo da Dulbecco (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (MEM), respectivamente. Todos os meios foram suplementados com Soro Bovino Fetal 10% inativado pelo calor (FBS), L-Glutamina 2 mM e solução de Penicilina-Estreptomicina. As células foram cultivadas a 37°C em uma atmosferaumedecida com CO2 5%.

[0207] Quando as células cultivadas alcançaram confluência de 85 a 90%, as células foram colhidas e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) livre de Ca2+ and Mg2+, contendo Matrigel 50% (BD BioSciences, San Jose, CA). As células OCUM-2M foram implantadas subcutaneamente no flanco direito dos camundongos a 5 x 105 células/100 μL/camundongo. As células MFM-223 foram implantadas subcutaneamente no flanco direito dos camundongos a 5 x 105 células/100 μL/camundongo, e péletes de 0,72 mg com estradiol 17-β liberados em 90 dias (Innovative Research of America, Sarasota, FL) foram inoculados subcutaneamente no flanco direito. Os camundongos foram monitorados duas vezes por semana após a implantação celular para o crescimento tumoral. O tamanho do tumor foi medido de acordo com a fórmula: Tamanho do tumor (mm3) = (largura (mm) x comprimento (mm)2)/2. Quando os tumores MFM-223 alcançaram 80 mm3, os camundongos foram classificados e randomizados (n = 10) e o tratamento foi iniciado. Para tumores OCUM-2M, a monoterapia com anti-FGFR2b foi iniciada assim que os tumores alcançaram o tamanho médio de 100 mm3, e a terapia de combinação foi iniciada assim que os tumores alcançaram um tamanho médio de 250 mm3.

[0208] Anticorpo Anti-FGFR2IIIb humanizado (αFGFR2bA não fucosilado; αFGFR2bF fucosilado) ou albumina como um controle negativo foram administrados em doses variando de 1 a 10 mg/kg através de injeção intraperitoneal duas vezes por semana, conforme especificado nas legendas das Figuras. Agentes quimioterapêuticos foram administradas através de injeção intraperitoneal duas vezes por semana a 12 mg/kg para paclitaxel, 2,3 mg/kg para fluorouracila (5-FU) e 33 mg/kg para cisplatina. No início da terapia, os tamanhos dos tumores foram medidos em cada camundongo duas vezes por semana. O comprimento e a largura de cada tumor foi medido com o uso de paquímetros e o tamanho do tumor foi calculado conforme a fórmula acima. Os camundongos foram submetidos a eutanásia quando os volumes dos tumores subcutâneos excederam 2000 mm3 ou quando os tumores se tornaram excessivamente necróticos.

[0209] As comparações de volume tumoral como uma consequência foram determinadas como estatisticamente significativas se P < 0,05. Os valores P foram calculados com o uso de análise de teste t bicaudal não pareada dos volumes tumorais calculados no dia final em que os tumores foram medidos.

[0210] A Figura 2 mostra a eficácia de αFGFR2bA e αFGFR2bF em (A e B) 10 mg/kg e (C e D) 3 mg/kg em um modelo xenográfico de câncer gástrico humano OCUM-2M com amplificação de FGFR2. (A) Em 10 mg/kg, tanto o anticorpo fucosilado como o não fucosilado induziram a regressão tumoral imediata. No entanto, o αFGFR2bA não fucosilado induziu uma resposta mais durável do que o αFGFR2bF fucosilado. (B) O αFGFR2bA não fucosilado reduziu significativamente o tamanho final do tumor OCUM-2M em comparação ao αFGFR2bF fucosilado (p = 0,0153). A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal. (C) Quando dosado a 3 mg/kg, o αFGFR2bA não fucosilado reduziu o crescimento tumoral em comparação ao αFGFR2bF fucosilado. De fato, o αFGFR2bA não fucosilado induziu uma maior regressão tumoral e resposta durável em comparação ao αFGFR2bF fucosilado (nota: um animal foi removido do grupo do αFGFR2bF mais ou menos no dia 42, resultando em uma mudança na curva). (D) O αFGFR2bA não fucosilado a 3 mg/kg em comparação ao αFGFR2bF fucosilado reduziu de forma notável o tamanho final do tumor OCUM-2M (p = 0,0767). A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal.

[0211] A Figura 3 mostra a inibição tumoral dose-dependente por αFGFR2bA. (A) Camundongos SCID portadores de xenoenxertos OCUM-2M subcutâneos foram tratados com 1, 1,5, 2, 3 ou 5 mg/kg de αFGFR2bA não fucosilado quando o tamanho médio do tumor alcançou aproximadamente 100 mm3. Embora todas as doses de αFGFR2bA não fucosilado inibirem o crescimento tumoral, a maior supressão e resposta durável foram observadas com 3 e 5 mg/kg, com supressão reduzida de crescimento com 2, 1,5 e 1 mg/kg de αFGFR2bA. (B) O αFGFR2bA não fucosilado reduziu o tamanho do tumor OCUM-2M com doses maiores, mostrando uma supressão de crescimento mais potente. A supressão do crescimento tumoral foi estatisticamente significativa para todas as doses (5 mg/kg, p < 0,0001; 3 mg/kg, p < 0,0001; 2 mg/kg, p < 0,0001; 1,5 mg/kg, p = 0,0003; 1 mg/kg, p = 0,0013). A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal.

[0212] A Figura 4 mostra a melhora de atividade antitumoral de paclitaxel em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M por administração com αFGFR2bA não fucosilado. (A) Camudongos SCID portadores de xenoenxertos OCUM-2M subcutâneos foram tratados com αFGFR2bA não fucosilado (5 mg/kg), paclitaxel (12 mg/kg), ou uma combinação dos dois quando o tamanho médio do tumor alcançou aproximadamente 285 mm3. A combinação de αFGFR2bA não fucosilado com paclitaxel reduziu o tamanho do tumor em comparação tanto a αFGFR2bA como paclitaxel sozinho. (B) Terapia combinada de αFGFR2bA/paclitaxel reduziu significativamente o tamanho final do tumor OCUM-2M em comparação tanto a paclitaxel (p = 0,0005) como αFGFR2bA (p=0,0009) sozinho. A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal.

[0213] A Figura 5 mostra a melhora de atividade antitumoral de cisplatina/5-FU em um modelo de xenoenxerto de câncer gástrico OCUM-2M por administração com αFGFR2bA não fucosilado. (A) Camudongos SCID portadores de xenoenxertos OCUM-2M subcutâneos foram tratados com αFGFR2bA não fucosilado (5 mg/kg), fluorouracil (5-FU) mais cisplatina (2,3 e 33 mg/kg, respectivamente), ou com uma combinação dos três quando o tamanho médio do tumor alcançou aproximadamente 260 mm3. A combinação de αFGFR2bA não fucosilado com 5-FU/cisplatina reduziu o tamanho do tumor em comparação tanto a αFGFR2bA como 5-FU/cisplatina sozinho. (B) Terapia combinada de αFGFR2bA/5-FU/cisplatina reduziu significativamente o tamanho do tumor OCUM-2M em comparação a 5-FU/cisplatina (p = 0,0003). O aumento da redução no tamanho do tumor por terapia combinada de αFGFR2bA/5- FU/cisplatina em comparação a αFGFR2bA sozinho foi notável, mas estatisticamente não significativa. A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal.

[0214] A Figura 6 mostra a eficácia de αFGFR2bA em um modelo de xenoenxerto de câncer de mama humano MFM-223. (A) MFM-223, uma linhagem celular de carcinoma de mama humano com amplificação de FGFR2, foi implantada subcutaneamente em camundongos SCID e a terapia com αFGFR2bA não fucosilado foi iniciada quando o tamanho médio do tumor alcançou aproximadamente 80 mm3. O αFGFR2bA não fucosilado (5 mg/kg) reduziu dramaticamente o crescimento de tumores MFM-223 em comparação ao controle de albumina (5 mg/kg). (B) O αFGFR2bA não fucosilado reduziu significativamente o tamanho final do tumor MFM-223 em comparação ao controle de albumina (p = 0,0008). A significância estatística foi determinada através de teste t não pareado bicaudal.

EXEMPLO 5 ANTICORPO ANTI-FGFR2B NÃO FUCOSILADO MEDEIA ADCC MAIOR DO QUE O ANTICORPO ANTI-FGFR2G FUCOSILADO

[0215] Ensaios in vitro para determinar a atividade ADCC de anticorpo αFGFR2bA versus anticorpo αFGFR2bF foram realizados. Células alvo que expressam Ba/F3 FGFR2IIIb foram geradas conforme descrito acima. As células OCUM-2M foram obtidas junto à Osaka City University, Osaka, Japão. Todas as células foram cultivadas com o uso de métodos padrão. PMBC recentemente isoladas de doadores saudáveis foram obtidas junto à AllCells, Emeryville, Califórnia.

[0216] Os ensaios de ADCC foram conduzidos com o uso de PBMCs humanas recém isoladas como células efetoras a uma razão celular efetora para alvo (E:T) de 25:1. As células foram incubadas por 16 horas na presença de efetores e concentrações crescentes de anticorpo. Todas as condições foram testadas em triplicata. A citotixicidade foi determinada por quantificação de liberação de LDH de acordo com as recomendações do fabricante (Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativo CytoTox da Promega). Para as células OCUM-2M, a lise máxima foi determinada na presença de Triton X-100 5%, e a liberação espontânea foi determinada na ausência do anticorpo. A porcentagem de lise específica foi calculada como uma porcentagem da lise máxima menos a liberação espontânea, da seguinte forma: (liberação experimental - espontânea) / (liberação máxima - espontânea) x 100 = % de lise específica. A análise de ajuste de curva do programa de computação GraphPad foi usada para obter valores de EC50.

[0217] Os resultados para células Ba/F3 são mostrados na Figura 9. O anticorpo αFGFR2bA não fucosilado mostrou potência mais alta (maior atividade de ADCC em concentrações mais baixas) do que o anticorpo αFGFR2bF fucosilado em células Ba/F3 que expressam FGFR2IIIb. Resultados similares são mostrados para células OCUM-2M na Figura 10. A Tabela 4 mostra o aumento em vezes de potência do anticorpo anti-FGFRb não fucosilado em comparação ao anticorpo anti-FGFR2b fucosilado nas duas linhagens celulares diferentes mostradas nas Figuras 9 e 10. TABELA 4

EXEMPLO 6 DETECÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE PROTEÍNA FGFR2IIIB EM TECIDO TUMORAL

[0218] O anticorpo αFGFR2b murino que compreende as regiões variáveis murinas de GAL-FR21 (consulte a patente US 8.101.723 B2) e uma região constante IgG2a murina foram usados para detectar a proteína FGFR2IIIb em tecido tumoral gástrico incorporado em parafina fixada com formalina (FFPE). O tecido tumoral FFPE foi desparafinizado com sucessivas lavagens de xilenos e concentrações diminuídas de etanol e reidratado com água por cinco minutos. Os cortes de tecido montados em lâminas foram imersos em tampão citrato 0,1 mM (pH 6,0), aquecidos a 95°C a 99°C por 15 minutos. Os cortes de tecido foram resfriados e colocados em contato com H2O2 3% por 5 minutos à temperatura ambiente e então lavados duas vezes em TBST (Tris 0,05 M, NaCl 0,15M, Tween 20 0,05%) e bloqueados em tampão de bloqueio (soro de cavalo normal 2,5% em TBST) por 30 minutos à temperatura ambiente. Os cortes de tecido foram então incubados com 5 μg/mL de anticorpo αFGFR2b em tampão de bloqueio por 30 minutos à temperatura ambiente. Tempos de incubação entre 30 minutos e 2 horas produziram intensidades de coloração similares. Após três lavagens com tampão TBST, os cortes de tecido foram incubados com anticorpo anti- camundongo de cavalo secundário biotinilatado pronto para o uso (RTU) (10 μg/mL diluído em tampão de bloqueio (Vector Laboratories, Burlingame, CA; Cat. n° PK-7200) por 30 minutos à temperatura ambiente. Os cortes de tecido foram lavados duas vezes com tampão TSBT e incubados com peroxidase de rábano silvestre-estreptavidina (HRP; Vector Laboratories, Cat. n° PK-7200) por 30 minutos à temperatura ambiente. A detecção foi realizada com o uso de substrato de 3’,3’-diaminobenzidina (DAB) (Vector Laboratories, Cat. n° PK- 4105) por dez minutos à temperatura ambiente conforme as instruções do fabricante. Os cortes de tecido foram contra corados com hematoxilina (Dako North America, Carpinteria, CA, Cat. n° K-8008) conforme as instruções do fabricante. Os cortes de tecido foram desidratados com o uso de sucessivas lavagens com aumento de concentrações de etanol e xilenos e então cobertas com uma lamínula.

[0219] Descobriu-se que as concentrações de coloração de 0,1 a 5 mg/mL de anticorpo αFGFR2b foram particularmente efetivas para detecção de proteína.

[0220] A coloração recebeu escores da seguinte forma: 0 Sem coloração observada com anticorpo αFGFR2b 1+ Coloração fraca é observada em amostras coradas com o anticorpo αFGFR2b. A coloração está ausente nos correspondentes cortes corados com o anticorpo de controle negativo. 2+ A coloração da membrana citoplasmática específica para o anticorpo αFGFR2b é mais prevalente nos cortes. 3+ Coloração específica forte com anticorpo αFGFR2b com localização distinta da membrana em pelo menos um subconjunto de células tumorais coradas.

[0221] A Figura 11 mostra coloração exemplar 0 (A), 1+ (B, C), 2+ (D), e 3+ (E, F) de tecidos tumorais. Na Figura 11A, células ductais e células tumorais espalhadas mostraram uma ausência de coloração com o uso do anticorpo αFGFR2b. Na Figura 11B, que mostra uma amostra tumoral gástrica tipo intersticial, as células tumorais (setas) mostraram alguma coloração com o uso do anticorpo αFGFR2b, enquanto que as células ductais vizinhas não mostraram coloração. Na Figura 11C, que mostra uma amostra tumoral gástrica tipo difusa (setas), as células tumorais mostram alguma coloração com o uso do anticorpo αFGFR2b, enquanto que as células estromais vizinhas (pontas das setas) não mostram coloração. Na Figura 11D, as células tumorais (setas) mostram coloração intermediária com o uso do anticorpo αFGFR2b, enquanto que as células estromais vizinhas (pontas das setas) não mostram coloração. Na Figura 11E, as células tumorais (setas) mostram alta coloração localizada na membrana com o uso do anticorpo αFGFR2b, enquanto que as células estromais vizinhas (pontas das setas) não mostram coloração. Na Figura 11F, as células tumorais (setas) mostram alta coloração da membrana/citoplasma com o uso do anticorpo αFGFR2b, enquanto que as células estromais vizinhas (pontas das setas) não mostram coloração. TABELA DE SEQUÊNCIAS

Claims (39)

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos anti-FGFR2IIIb, em que cada anticorpo anti-FGFR2IIIb compreende regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende: (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; e (iii) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e a região variável da cadeia leve compreende: (iv) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; (v) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e (vi) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; em que pelo menos 95% dos anticorpos anti-FGFR2IIIb na composição são não fucosilados.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

8. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos anti-FGFR2IIIb não fucosilados, em que os anticorpos anti-FGFR2IIIb competem pela ligação a FGFR2IIIb com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que os anticorpos são anticorpos monoclonais.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que os anticorpos são anticorpos quiméricos ou humanizados.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que os anticorpos são desprovidos de fucose em Asn297.

12. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que os anticorpos compreendem uma região constante de cadeia leve K, uma região constante de cadeia pesada IgG1, ou ambas.

13. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que os anticorpos não fucosilados têm atividade ADCC melhorada in vitro em comparação a um anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado que tem a mesma sequência de aminoácidos.

14. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que os anticorpos não fucosilados têm afinidade a Fc gama RIIIA melhorada em comparação a um anticorpo anti-FGFR2IIIb fucosilado que tem a mesma sequência de aminoácidos.

15. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que os anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados se ligam a FGFR2IIIb, mas não se ligam a FGFR2IIIc.

16. MÉTODO PARA PRODUZIR ANTICORPOS ANTI- FGFR2IIIB NÃO FUCOSILADOS IN VITRO, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica anticorpos anti-FGFR2IIIb, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e desprovida de um gene alfa-1,6-fucosiltransferase funcional (FUT8), sob condições adequadas para expressar os anticorpos anti- FGFR2IIIb não fucosilados.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, recuperar os anticorpos anti-FGFR2IIIb produzidos pela célula hospedeira.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos 95% dos anticorpos anti-FGFR2IIIb produzidos pela célula hospedeira são não fucosilados.

19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definida na reivindicação 19, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.

22. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas ou câncer de esôfago.

23. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer gástrico.

24. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o câncer superexpressa FGFR2IIIb.

25. USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a expressão de FGFR2IIIb é determinada por imuno-histoquímica (IHQ).

26. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que o câncer não compreende amplificação do gene FGFR2.

27. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2.

28. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende, ainda, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado a partir de um agente de platina, paclitaxel, ABRAXANE®, docetaxel, gencitabina, capecitabina, irinotecano, epirrubicina, FOLFOX, FOLFIRI, leucovorina, fluorouracila, mitomicina C e cloridrato de doxorrubicina, para o tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo.

29. USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é FOLFOX.

30. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, para o tratamento de câncer em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-FGFR2IIIb, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

31. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.

32. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de câncer gástrico, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de pâncreas e câncer de esôfago.

33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o câncer é câncer gástrico.

34. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizada pelo fato de que o câncer superexpressa FGFR2IIIb.

35. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a expressão de FGFR2IIIb é determinada por imuno-histoquímica (IHQ).

36. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de que o câncer não compreende amplificação do gene FGFR2.

37. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizada pelo fato de que o câncer compreende uma amplificação do gene FGFR2.

38. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado a partir de um agente de platina, paclitaxel, ABRAXANE®, docetaxel, gencitabina, capecitabina, irinotecano, epirrubicina, FOLFOX, FOLFIRI, leucovorina, fluorouracila, mitomicina C e cloridrato de doxorrubicina.

39. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente terapêutico adicional é FOLFOX.