BR112015026210B1

BR112015026210B1 - Microrganismo recombinante que tem produtividade de l-triptofano aprimorada e método para produzir l-triptofano

Info

Publication number: BR112015026210B1
Application number: BR112015026210-4A
Authority: BR
Inventors: Hyung Joon Kim; Ju No Jang; Kyung Rim Kim; Keun Cheol Lee; Young Bin Hwang; Hyeong Pyo Hong
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2022-11-29
Also published as: WO2014171747A1; US9562246B2; JP6177995B2; PL2987854T3; EP2987854B1; EP2987854A4; CN105143440B; MY171291A; CN105143440A; KR101530817B1; US20160153014A1; ES2643442T3; BR112015026210A2; KR20140125314A; EP2987854A1; JP2016515400A

Abstract

MICRO-ORGANISMO QUE TEM PRODUTIVIDADE DE L-TRIPTOFANO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO COM USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a um micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia com produtividade de L-triptofano aprimorada, em que o micro-organismo é transformado para expressar antranilato fosforribosiltransferase a partir de levedura, produzindo, dessa forma, uma alta concentração de L-triptofano, e a um método para produzir L-triptofano, que compreende a etapa de cultivar o micro-organismo. O recombinante E. Coli tem a capacidade de produzir L-triptofano em alto rendimento e é, portanto útil nas indústrias medicinal e farmacêutica e na indústria alimentícia, particularmente para alimentação de animal.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante que tem produtividade de L-triptofano aprimorada e um método para produzir L-triptofano com o uso do micro-organismo.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[0002] L-triptofano, um tipo de aminoácido essencial, tem sido amplamente usado como um alimento e aditivo alimentar. L-triptofano é geralmente produzido por fermentação com o uso de microorganismos do gênero Corynebacterium, Bacillus ou Escherichia, e variantes dos mesmos. L-triptofano é biossintetizado de ácido corísmico que é um intermediário comum para a síntese de aminoácidos aromáticos. Especificamente, L-triptofano é biossintetizado pela ação de cinco enzimas, que são sintetizadas pelo operão de triptofano trpEDCBA, em ácido corísmico produzido através da via de ácido chiquímico comum que inicia de fosfoenolpiruvato e D- eritrose-4-fosfato. Primeiro, antranilato sintase (complexo TrpE-TrpD) atua no ácido corísmico para sintetizar ácido antranílico, então, antranilato fosforribosiltransferase (TrpD) atua no mesmo para sintetizar N-(5'-fosforribosil)-antranilato. Então, fosforribosilantranilato isomerase (TrpC) e indol-3-glicerol fosfato sintase (TrpC) atuam no N- (5'-fosforribosil)-antranilato para sintetizar indol-3-glicerol-fosfato, então, triptofano sintase complexo (TrpB-TrpA ) atua no mesmo para sintetizar L-triptofano (Figura 1; Bonggaerts et al., Metab Eng, 3, 289 a 300, 2001).

[0003] Em E. coli, uma proteína codificada por um complexo dos genes trpE e trpD forma antranilato sintase para sintetizar ácido antranílico. O ácido antranílico sintetizado reage com 5-fosforribosil 1- pirofosfato (PRPP) por antranilato fosforribosiltransferase codificado pelo gene trpD, sintetizando, assim, N-(5'-fosforribosil)-antranilato.

[0004] No presente documento, a proteína codificada pelo gene trpD atua como antranilato sintase em combinação com a proteína codificada pelo gene trpE ou atua sozinha como antranilato fosforribosiltransferase, e uma cepa E. coli do tipo selvagem mantém o equilíbrio de tais duas ações.

[0005] Em uma cepa de E. coli do tipo selvagem, a concentração de PRPP que é usada como um cofator em biossíntese de triptofano intracelular é cerca de 180 μM (Bennett et al., Nat Chem Biol, 5, 595 a 599, 2009). Em uma cepa de produção de L-triptofano com biossíntese aprimorada de ácido antranílico, a concentração acumulada de modo extracelular de ácido antranílico é no valor máximo, enquanto a concentração intracelular de PRPP é muito menor do que a concentração de ácido antranílico. Baixa concentração de PRPP atua como um fator limitante na produção de N-(5'-fosforribosil)-antranilato para reduzir a taxa de síntese geral de L-triptofano e aumentar o acúmulo intracelular e extracelular de ácido antranílico. Desse modo, o uso de um antranilato fosforribosiltransferase que tem maior afinidade para PRPP torna possível evitar o acúmulo intracelular e extracelular de ácido antranílico e aumentar a taxa de biossíntese de L-triptofano.

[0006] Entre relatos anteriores sobre aperfeiçoamento em cepas de produção de L-triptofano, uma tecnologia para aprimorar a via de biossíntese enquanto mantém o equilíbrio de atividades de antranilato sintase e antranilato fosforribosiltransferase ainda não foi relatado.

[0007] De acordo com estudos, o valor de Km de E. coli para PRPP é 50, enquanto o valor de Km de levedura para PRPP é cerca de 22,4 ± 2,6 (Hommel et al., Eur J Biochem, 180, 33 a 40, 1989). Desse modo, a afinidade de antranilato fosforribosiltransferase de levedura para PRPP é maior do que aquela de antranilato fosforribosiltransferase de E. coli. Desse modo, espera-se que o uso de antranilato fosforribosiltransferase de levedura tenha maiores efeitos na prevenção do acúmulo intracelular e extracelular de ácido antranílico e um aumento na biossíntese de L-triptofano em micro-organismos com vias de biossíntese de L-triptofano aprimoradas.

[0008] Durante uma tentativa de aprimorar a via de biossíntese de ácido corísmico e via de operão de trp em E. coli a fim de produzir uma grande quantidade de L-triptofano utilizável industrialmente, os presentes inventores constataram que, como as duas vias acima são aprimoradas, o ácido antranílico é acumulado de modo intracelular e extracelular e, por essa razão, cultura anormal aparece. Consequentemente, os presentes inventores continuaram a estudar sob a expectativa de que o aprimoramento da expressão de antranilato fosforribosiltransferase em micro-organismos que têm uma via de biossíntese de L-triptofano aprimorada pode evitar o acúmulo intracelular e extracelular de ácido antranílico e aumentar a biossíntese de L-triptofano, completando, assim, a presente invenção.

DESCRIÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[0009] Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer um micro-organismo que tem produtividade de L-triptofano aprimorada, que foi modificado para expressar antranilato fosforribosiltransferase de levedura (trp4).

[0010] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir L-triptofano com o uso do micro-organismo acima.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[0011] A fim de realizar os objetivos acima, a presente invenção fornece um micro-organismo do gênero Escherichia que tem produtividade de L-triptofano aprimorada, que foi modificado para expressar antranilato fosforribosiltransferase de levedura.

[0012] A presente invenção também fornece um método para produzir L-triptofano, sendo que o método compreende as etapas de: cultivar o micro-organismo do gênero Escherichia; e recuperar L- triptofano da cultura.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0013] O micro-organismo, de acordo com a presente invenção, pode produzir L-triptofano em alto rendimento e, desse modo, pode ser usado de modo vantajoso na indústria farmacêutica e na indústria alimentícia, particularmente no campo de alimentação de animal. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] A Figura 1 é uma vista esquemática que mostra a via de biossíntese de L-triptofano em E. coli e proteínas que são envolvidas na mesma.

[0015] A Figura 2 mostra a homologia de sequência de aminoácido de antranilato fosforribosiltransferases de levedura.

[0016] A Figura 3 mostra vetores pCL-PCJ1-trpD e pCL-PCJ1-trp4.

[0017] A Figura 4 mostra uma comparação de produtividade de L- triptofano em 40 horas de fermentação entre uma cepa mãe de produção de L-triptofano e uma cepa transformada com o vetor pCL- PCJ1-trpD ou pCL-PCJ1-trp4.

[0018] A Figura 5 mostra uma comparação do acúmulo do ácido antranílico precursor de triptofano após fermentação entre uma cepa de origem de produção de L-triptofano e uma cepa transformada com o vetor pCL-PCJ1-trpD ou pCL-PCJ1-trp4.

[0019] A Figura 6 mostra uma comparação de produtividade de L- triptofano em 40 horas de fermentação entre uma cepa de origem de produção de L-triptofano e cepas que têm um cassete de expressão de gene trp4 inserido no genoma.

[0020] A Figura 7 mostra uma comparação do acúmulo de ácido antranílico após fermentação entre uma cepa de origem de produção de L-triptofano e cepas que tem um cassete de expressão de gene trp4 inserido no genoma.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0021] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0022] A presente invenção fornece um micro-organismo do gênero Escherichia que tem produtividade de L-triptofano aprimorada, que foi modificado para expressar antranilato fosforribosiltransferase de levedura.

[0023] Antranilato fosforribosiltransferase é uma enzima que sintetiza fosforribosil antranilato com o uso de ácido antranílico e PRPP. Em cepas que tem produtividade de L-triptofano aprimorada, a síntese de ácido corísmico é aumentada através de uma via de ácido chiquímico aprimorada, resultando em um aumento de ácido antranílico. O ácido antranílico aumentado é acumulado de modo intracelular e extracelular para interferir com a atividade de fisiológica normal das células para inibir, assim, a produção de L-triptofano.

[0024] Desse modo, a presente invenção é destinada a evitar o acúmulo intracelular e extracelular de ácido antranílico através de aprimoramento da expressão de antranilato fosforribosiltransferase para aprimorar, assim, a biossíntese de L-triptofano.

[0025] No presente documento, a presente invenção é destinada a aumentar adicionalmente a taxa de síntese de fosforribosil antranilato usando-se antranilato fosforribosiltransferase de levedura que tem uma maior afinidade para PRPP quando comparado a um antranilato fosforribosiltransferase que é codificado pelo gene trpD em E. coli.

[0026] O antranilato fosforribosiltransferase que é usado na presente invenção é derivado de levedura, e pode ser visto que antranilato fosforribosiltransferases de várias espécies de levedura têm uma homologia de sequência de aminoácido de 87% ou mais (Figura 2). Especificamente, o antranilato fosforribosiltransferase que é usado na presente invenção tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1. Entretanto, o antranilato fosforribosiltransferase que é usado na presente invenção não é limitado à mesma, porque a sequência de aminoácido de uma enzima que mostra atividade de antranilato fosforribosiltransferase pode diferir dependendo da espécie ou cepa de micro-organismos. Especificamente, o antranilato fosforribosiltransferase que é usado na presente invenção pode ser um mutante ou variante artificial que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido que compreende uma substituição, exclusão, inserção ou adição de um ou diversos aminoácidos em uma ou mais posições da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou uma mutação silenciosa que causa uma mudança em um aminoácido similar, desde que a atividade do antranilato fosforribosiltransferase possa ser mantida ou aprimorada. Conforme usado no presente documento, o termo "diversos aminoácidos" significa 2 a 20 aminoácidos, preferencialmente 2 a 10 aminoácidos e, mais preferencialmente, 2 a 5 aminoácidos, dependendo do tipo ou das posições de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína. Além disso, as substituições, exclusões, inserções, adições ou inversões de aminoácidos podem incluir mutantes que ocorrem naturalmente ou variantes artificiais, com base em diferenças individuais e/ou diferenças de espécie do micro-organismo que tem o antranilato fosforribosiltransferase de levedura.

[0027] Na presente invenção, aprimoramento do antranilato fosforribosiltransferase de levedura pode ser alcançado tanto por transformação com um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica o antranilato fosforribosiltransferase de levedura ou por inserção do polinucleotídeo no cromossomo.

[0028] O polinucleotídeo que codifica o antranilato fosforribosiltransferase de levedura é representado por SEQ ID NO: 9. O polinucleotídeo pode ser transformado em uma célula hospedeira. Para isso, o polinucleotídeo pode ser substituído por um códon favorecido pela célula hospedeira, ou a terminação N ou terminação C do mesmo pode ser estendida ou eliminada, ou o códon inicial do mesmo pode ser modificado para controlar nível de expressão. Desse modo, o polinucleotídeo da presente invenção pode ter uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína que tem uma homologia de pelo menos 80%, especificamente pelo menos 90%, mais especificamente pelo menos 95%, de modo particularmente específico pelo menos 97%, para a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, desde que possa manter ou aprimorar a atividade do antranilato fosforribosiltransferase de levedura da variante da presente invenção. Mais especificamente, o polinucleotídeo da presente invenção pode ter uma sequência de polinucleotídeo representada por SEQ ID NO: 9.

[0029] Conforme usado no presente documento, o termo "homologia" se refere à identidade entre duas sequências de aminoácido. A homologia pode ser determinada com o uso de métodos bem conhecidos àqueles versados na técnica, por exemplo, BLAST 2.0 que calcula parâmetros tais como pontuação, identidade ou similaridade.

[0030] Além disso, a sequência de polinucleotídeo, de acordo com a presente invenção, pode ser um antranilato fosforribosiltransferase de levedura que codifica variante, que pode hibridizar à sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 9 ou uma sonda derivada da sequência de polinucleotídeo sob condições rigorosas e que normalmente funciona.

[0031] Conforme usado no presente documento, o termo "condições rigorosas" significa condições que permitem hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições rigorosas são descritas em detalhes em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, que descrevem, por exemplo, hibridização em um tampão de hibridização (3,5 X SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidona, 0,02% de albumina de soro bovino, NaH2PO4 a 2,5 mM (pH 7), 0,5% SDS, 2mM EDTA) a 65 °C. No presente documento, SSC é cloreto de sódio a0,15 M/citrato de sódio a 0,15 M (pH 7). Após a hibridização, a membrana que tem DNA transferido para a mesma é lavada com 2 X SSC à temperatura ambiente e, então, lavada com 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a uma temperatura de 68 °C.

[0032] O vetor que é usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser qualquer vetor conhecido na técnica, desde que o mesmo possa replicar em um hospedeiro. Exemplos dos vetores que são comumente usados incluem plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, o vetor de fago ou vetor de cosmídeo que é usado na presente invenção pode ser pWE15, M13, ÀMBL3, ÀMBL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A ou similares, e o vetor de plasmídeo que é usado na presente invenção pode ser tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo pGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET ou similares. Mais preferencialmente, um vetor pACYC177, pCL ou pCC1BAC pode ser usado.

[0033] Além disso, um novo polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo pode ser inserido em um locus genético específico no cromossomo através de um fragmento de DNA que compreende um polinucleotídeo para inserção no cromossomo bacteriano. A inserção do novo polinucleotídeo no cromossomo pode ser alcançada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga. O polinucleotídeo para inserção no cromossomo, de acordo com a presente invenção, pode compreender adicionalmente um marcador de seleção para confirmar se o polinucleotídeo foi inserido no cromossomo, porque o mesmo pode ser inserido no cromossomo causando recombinação homóloga. O marcador de seleção pode ser usado para selecionar células transformadas, ou seja, confirmar se o polinucleotídeo de interesse foi inserido. Desse modo, os marcadores que conferem fenótipos selecionáveis tais como resistência a fármaco, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou a expressão de proteínas de superfície podem ser usados na presente invenção. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção sobrevivem ou mostram um fenótipo diferente e, desse modo, células transformadas podem ser selecionadas.

[0034] Conforme usado no presente documento, o termo "transformação" significa introduzir um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira de modo a ter a capacidade de expressar uma proteína codificado pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. O polinucleotídeo transformado pode ser inserido e localizado no cromossomo da célula hospedeira ou localizado fora do cromossomo, desde que o mesmo possa ser expresso na célula hospedeira. Além disso, os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, que codificam a proteína-alvo. Desde que o polinucleotídeo possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma, o mesmo pode ser introduzido em qualquer forma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão que é um construto de polinucleotídeo incluindo todos os elementos exigidos para autoexpressão. O cassete de expressão geralmente inclui um promotor que é ligado de modo operável à fase de leitura aberta (doravante abreviado como "ORF") do gene, um sinal de terminação de transcrição, um sítio de ligação de ribossoma, e um sinal de terminação de tradução. O promotor que é usado na presente invenção não é especificamente limitado e pode ser qualquer promotor conhecido na técnica, desde que o mesmo inicie a transcrição do polinucleotídeo que codifica proteína-alvo em uma célula hospedeira. Especificamente, promotor T7, promotor trc, promotor tac, promotor CJ1 (Patente no KR 0620092), etc., podem ser usados. Mais especificamente, promotor trc ou promotor CJ1 podem ser usados.

[0035] O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira por si só e ligado de modo operável à sequência necessária para expressão na célula hospedeira.

[0036] O micro-organismo da presente invenção inclui qualquer micro-organismo procariótico, desde que o mesmo possa produzir L- triptofano. Por exemplo, o mesmo pode incluir um micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium ou ao gênero Brevibacterium. Especificamente, o micro-organismo da presente invenção é um micro-organismo que pertence ao gênero Escherichia. Mais especificamente, o mesmo é Escherichia coli.

[0037] A fim de que o micro-organismo da presente invenção produza L-triptofano, a atividade de pelo menos uma enzima selecionada do grupo que consiste em antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato deidrogenase (serA), 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato- 7-fosfato sintase (aroG), 3-deidroquinato sintase (aroB), shiquimato deidrogenase (aroE), chiquimato quinase (aroL), 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (aroA), corismato sintase (aroC), prefenato deidratase, corismato mutase, e triptofano sintase (trpAB), no micro-organismo, pode ser adicionalmente aprimorada, ou a atividade de corismato mutase/ prefenato deidratase ou corismato mutase/ prefenato deidrogenase no micro-organismo pode ser adicionalmente atenuada. Além disso, o micro-organismo da presente invenção pode ser modificado de modo que um ou mais dentre antranilato sintase e fosfoglicerato deidrogenase sejam liberados da inibição de retroalimentação por L-triptofano e L-serina.

[0038] Em um exemplo específico da presente invenção, E. coli foi transformado com um vetor que compreende o gene (trp4) que codifica o antranilato fosforribosiltransferase de levedura representado por SEQ ID NO: 1, e a cepa construída foi nomeada CA04-2006, e depositada com o Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (361-221, Honje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Coreia do Sul South Korea), uma autoridade depositária internacional, em 8 de abril de 2013 sob o número de acesso KCCM11408P.

[0039] Além disso, a presente invenção fornece um método para produzir L-triptofano, que compreende as etapas de: cultivar um microorganismo do gênero Escherichia que tem produtividade de L- triptofano, que foi modificado para expressar um antranilato fosforribosiltransferase de levedura que tem uma sequência de aminoácido estabelecida em SEQ ID NO: 1; e recuperar L-triptofano da cultura.

[0040] O processo de cultura na presente invenção pode ser realizado em condições de cultura e meios adequadas conhecidas na técnica. Esse processo de cultura pode ser facilmente modificado por qualquer pessoa versada na técnica dependendo do tipo de cepa selecionada. Exemplos do processo de cultura incluem, mas sem limitação, cultura em batelada, cultura contínua e cultura de batelada alimentada.

[0041] As condições de meio e cultura que são usadas em cultura do micro-organismo da presente invenção podem ser qualquer uma daquelas que são geralmente usadas em cultura de micro-organismos do gênero Escherichia, mas esses devem satisfazer de modo apropriado as exigências do micro-organismo da presente invenção.

[0042] Em uma modalidade específica, o micro-organismo da presente invenção pode ser cultivado em um meio convencional contendo fontes de carbono, fontes de nitrogênio, aminoácidos, vitaminas adequadas e similares sob condições aeróbicas enquanto ajusta temperatura, pH e similares.

[0043] As fontes de carbono que podem ser usadas na presente invenção incluem carboidratos tais como glicose, frutose, sucrose, maltose, manitol, sorbitol; álcoois e ácidos orgânicos tais como álcool de açúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico e ácido cítrico; e aminoácidos tais como ácido glutâmico, metionina e lisina, mas não é limitado às mesmas. Além disso, fontes de nutriente orgânico natural tais como hidrolisados de amido, melaços, melaços blackstrap, farelo de arroz, mandioca, água de maceração de milho e bagaço podem ser usadas, mas não é limitado às mesmas. Especificamente, carboidratos tais como glicose e melaço pretratado esterilizado (isto é, melaço convertido em açúcares reduzidos) podem ser usados, mas não é limitado aos mesmos. Além disso, quantidades adequadas de outras fontes de carbono podem ser usadas sem limitação. As fontes de nitrogênio que podem ser usadas na presente invenção incluem fontes de nitrogênio inorgânico tais como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio; aminoácidos tais como ácido glutâmico, metionina e glutamina; e fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, NZ- amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, água de maceração de milho, hidrolisado de caseína, carne de peixe ou o produto digerido da mesma, farelo de soja desengordurado ou o produto digerido do mesmo, etc. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação, mas não é limitada às mesmas. O meio pode conter, como fontes de fósforo, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e sais contendo sódio correspondentes. O meio pode conter compostos inorgânicos que podem conter cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto férrico, sulfato de magnésio, sulfato férrico, sulfato de manganês e carbonato de cálcio, mas não é limitado aos mesmos. Além disso, o meio pode conter aminoácidos, vitaminas e precursores adequados. Essas fontes ou precursores podem ser adicionados ao meio de um modo em batelada ou contínuo.

[0044] Os compostos tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados ao meio de um modo adequado durante cultura para ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, durante a cultura, um agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graxo pode ser usado para suprimir a formação de bolhas. Adicionalmente, a fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbico, oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado no meio de cultura. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado anaeróbico ou não aeróbico, nenhum gás é injetado, ou gás nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono pode ser injetado no meio de cultura. O meio de cultura é tipicamente mantido a uma temperatura na faixa de 27 °C a 37 °C e, especificamente, de 30 °C a 35 °C. A cultura do microorganismo pode ser continuada até o nível desejado da substância utilizável ser obtido. Especificamente, o período de cultura pode ser 10 a 100 horas.

[0045] O método da presente invenção pode compreender adicionalmente purificar ou recuperar o L-triptofano produzido na etapa de cultura. O processo de purificação ou recuperação pode ser realizado purificando-se ou recuperando o L-triptofano desejado do meio de cultura com o uso de um método adequado, por exemplo, um método de cultura de batelada, contínuo ou batelada alimentada.

[0046] Doravante, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. Deve-se entender, entretanto, que esses exemplos são para fins ilustrativos e não são destinados a limitar o escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE QUE COMPREENDE PROMOTOR CJ1 E GENE TRPD DE E. COLI OU GENE TRP4 DE LEVEDURA 1-1: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE PROMOTOR DE CJ1

[0047] A fim de obter um fragmento de DNA que compreende promotor CJ1, a reação em cadeia de polimerase (doravante abreviada como "PCR") foi realizada com o uso de, como um modelo, um plasmídeo pECCG117-CJ1 (Patente no US 8048648) que compreende promotor CJ1. A reação de PCR foi realizada com o uso de um kit de pre-mistura de HL de PCR (BIONEER, doravante o mesmo) e iniciadores de SEQ ID NOS: 2 e 3 sob as condições a seguir: 30 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94 °C por 30s, recozimento a 55 °C por 30s, e alongamento a 72 °C por 30s.

[0048] Realizou-se eletroforese no produto de PCR (doravante denominado "fragmento de PCJ1") em 1% de agarose gel e, então, uma faixa que tem um tamanho desejado foi coletada por eluição.

1-2: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTOS DE GENE TRPD E TRP4

[0049] Para obter o ORF do gene trpD, a cepa W3110 derivada de K-12 de E. coli de tipo selvagem foi comprada do Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos, e para obter o ORF do gene trp4, uma cepa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi comparada da Coleção de Micro-organismos Norte-americana.

[0050] A partir das cepas, os DNAs genômicos foram preparados com o uso de um kit de extração de DNA genômico (QIAGEN). Com o uso do DNA genômico de E. coli como um modelo, um fragmento de DNA (1,607 pb) que corresponde ao ORF do gene trpD de SEQ ID NO: 6 foi amplificado por PCR com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 4 e 5. Além disso, com o uso do DNA genômico de levedura, um fragmento de DNA (1,154 pb) que corresponde ao ORF do gene trp4 de SEQ ID NO: 9 foi amplificado por PCR com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8. Realizou-se eletroforese nos produtos de PCR (doravante denominado "fragmento de trpD" e "fragmento de trp4", respectivamente) em 0,8% de agarose gel e, então, faixas que têm um tamanho desejado foram coletadas por eluição.

1-3: CONSTRUÇÃO DE VETORES RECOMBINANTES PCL-PCJ1- TRPD E PCL-PCJ1-TRP4

[0051] O fragmento PCJ1 preparado no Exemplo 1-1 e um vetor pCL1920 foram tratados com a enzima de restrição EcoRI e, então, realizou-se eletroferese em 0,8% de agarose gel. Cada um dos fragmentos de DNA foi ligado ao vetor com o uso de um kit de ligação de DNA rápido (ROCHE, doravante o mesmo) por 30 minutos e, então, transformado em células de DH5α de E. coli que foram, então, colocadas em uma placa de LB contendo espectinomicina, e as células transformadas foram selecionadas.

[0052] As células selecionadas foram inoculadas em 20 ml de meio líquido de LB contendo espectinomicina por uma alça de platina e cultivadas ao longo da noite, após o qual um DNA de plasmídeo foi coletado com o uso de um kit de extração de plasmídeo (QIAGEN, doravante o mesmo). O tamanho do vetor recombinante foi determinado por tratamento com a enzima de restrição EcoRI (dados não mostrados), e o clone foi identificado realizando-se PCR com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 2 e 3. O vetor recombinante foi nomeado "pCL-PCJ1".

[0053] O fragmento de trpD ou fragmento de trp4 preparado no Exemplo 1-2 e o vetor pCL-PCJ1 foram tratados com as enzimas de restrição EcoRV e PstI e, então, realizou-se eletroforese em 0,8% de agarose gel. Cada um dos fragmentos de DNA foi ligado no vetor com o uso de um kit de ligação de DNA rápida (ROCHE, doravante o mesmo) por 30 minutos e, então, transformado em células DH5α de E. coli. As células transformadas foram selecionadas do mesmo modo conforme descrito acima, e um DNA de plasmídeo foi coletado do mesmo modo conforme descrito acima. Os tamanhos dos vetores recombinantes foram determinados por tratamento com as enzimas de restrição EcoRI e PstI (dados não mostrados), e os clones foram identificados realizando-se PCR com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 2 e 5. Os vetores recombinantes foram "pCL-PCJ1-trpD" e "pCL- PCJ1-trp4", respectivamente (Figura 3).

EXEMPLO 2: CONSTRUÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO TRANSFORMADA COM O VETOR RECOMBINANTE PCL-PCJ1-TRPD OU PCL-PCJ1-TRP4

[0054] Cada um dos vetores recombinantes pCL-PCJ1-trpD e pCL- PCJ1-trp4 construídos no Exemplo 1 foi introduzido em uma cepa de origem de produção de L-triptofano com o uso de reagente TSS (solução de transformação e armazenamento) fornecido por EPICENTRE.

[0055] Nesse Exemplo, KCCM11166P de E. coli foi usada como a cepa de origem de produção de L-triptofano. KCCM11166P de E. coli é uma cepa de produção de L-triptofano construída a partir de KCCM10812P de E. coli (Patente no KR 10-0792095) e é caracterizada pelo fato de que o gene tehB cromossomal foi inativado e a atividade de quinase NAD foi aumentada (Publicação de Patente Aberta à Inspeção Pública no KR 10-2012-0083795).

[0056] Uma alça de platina da cepa de origem de produção de L- triptofano foi inoculada em 4 ml de meio de LB e cultivada por 3 horas, seguido de centrifugação. 50 ng do plasmídeo de vetor pCL-PCJ1-trpD ou o plasmídeo de vetor pCL-PCJ1-trp4 e 100 μL de reagente TSS foram adicionados a e misturados de modo suficiente com as células separadas. A seguir, as células foram introduzidas na cepa de origem de produção de L-triptofano por uma técnica de transformação de uma etapa (Chung et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 86, 2.172 a 2.175, 1989), e as cepas foram colocadas em uma placa de LB contendo espectinomicina, e as cepas transformadas foram selecionadas. Para confirmar as cepas transformadas, DNA de plasmídeo foi isolado das cepas transformadas, e tratado com enzimas de restrição e submetido a PCR do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 1-3. As cepas transformadas foram nomeadas "Con/pCL-PCJ1-trpD" e "Con/pCL-PCJ1- trp4", respectivamente.

EXEMPLO 3: COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L- TRIPTOFANO E ATIVIDADE FISIOLÓGICA ENTRE CEPAS TRANSFORMADAS

[0057] As cepas transformadas preparadas no Exemplo 2 foram cultivadas em frascos Erlenmeyer com o uso do meio de título de triptofano mostrado na Tabela 1 abaixo, e as produtividades de L- triptofano das mesmas foram analisadas.TABELA 1: COMPOSIÇÃO DE MEIO DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO (POR LITRO)

[0058] Uma alça de platina de cada uma dentre a cepa de origem de produção de L-triptofano (Con) e cepas Con/pCL-PCJ1-trpD e Con/pCL-PCJ1-trp4, cultivadas ao longo da noite em meios sólidos de LB em um incubador a 37 °C, foi inoculada em 25 ml do meio de título mostrado na Tabela 1 acima e, então, cada uma das cepas foi cultivada em um incubador a 37 °C e 200 rpm durante 40 horas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo.TABELA 2: COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE TRIPTOFANO ENTRE A CEPA DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO E A CEPA QUE EXPRESSOU O GENE TRPD OU TRP4 PELO VETOR

TABELA 3: COMPARAÇÃO DE ATIVIDADE FISIOLÓGICA ENTRE A CEPA DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO E A CEPA QUE EXPRESSOU O GENE TRPD OU TRP4 PELO VETOR

[0059] Conforme pode ser visto na Tabela 2 acima, a cepa de origem de produção de L-triptofano produziu 6,9 g/l de L-triptofano durante 40 horas de cultura, mas a cepa Con/pCL-PCJ1-trp4 e a Con/pCL-PCJ1-trp4 produziram 8,0 g/l e 10,3 g/l de L-triptofano, respectivamente e, desse modo, mostrou aumentos em produtividade de L-triptofano de 1,1 g/l e 3,4 g/l, respectivamente, quando comparado à cepa de origem (aumentos de 16% e 49%, respectivamente).

[0060] Além disso, conforme pode ser visto na Tabela 3 acima, as cepas transformadas foram similares à cepa de origem de produção de L-triptofano em termos de taxa de consumo de glicose ou crescimento celular, e o acúmulo do acetado de subproduto de fermentação na cepa transformada também foi similar a ou menor do que àquele na cepa de origem de produção de L-triptofano (dados não mostrados). Desse modo, pode-se ver que as cepas transformadas mostraram atividade fisiológica substancialmente similar à cepa de origem de produção de L-triptofano.

[0061] Particularmente, na cepa de origem de produção de L- triptofano, o fenômeno de que fermentação normal não é mantida devido à fermentação anormal que envolve o acúmulo de ácido antranílico durante fermentação aparece com frequência. Desse modo, na fermentação da cepa de origem de produção de L-triptofano, é importante controlar fatores de fermentação de modo a evitar o acúmulo excessivo de ácido antranílico, e monitoramento contínuo é exigido de modo não vantajoso. Desse modo, uma cepa de produção de L-triptofano em que ácido antranílico é menos acumulado é considerada importante em que a mesma pode diminuir a frequência de fermentação anormal. Conforme pode ser visto nas Tabelas 2 e 3, as cepas transformadas que expressaram o gene trpD ou trp4 pelo vetor pCL mostraram um acúmulo menor de ácido antranílico quando comparado à cepa de produção de L-triptofano.

[0062] A partir de uma comparação entre as cepas transformadas que expressam antranilato fosforribosiltransferase de E. coli e antranilato fosforribosiltransferase de levedura, respectivamente, pode ser visto que a cepa transformada que expressa o gene trp4 que tem alta afinidade para PRPP foi melhor em termos de um aumento em produtividade de L-triptofano e uma diminuição no acúmulo de ácido antranílico.

[0063] Desse modo, pode-se concluir que, quando a cepa transformada que expressa o gene trp4 é usada para produzir L- triptofano, L-triptofano pode ser produzido com maior produtividade e a produtividade geral de L-triptofano pode ser mantida a um alto nível mantendo-se maior estabilidade de fermentação.

EXEMPLO 4: TRANSFORMAÇÃO DE VETOR RECOMBINANTE PCL-PCJ1-TRP4 EM CEPAS DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO E COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L-TRIPTOFANO ENTRE CEPAS TRANSFORMADAS

[0064] A fim de examinar se o efeito descrito no Exemplo também aparece em outras cepas de produção de L-triptofano, os vetores pCL- PCJ1-trp4 foram transformados nas cepas, e a produtividade de L- triptofano foi comparada entre as cepas transformadas do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 3.

[0065] As cepas de E. coli de produção de L-triptofano usadas nesse Exemplo foram KCCM10805P (Patente no KR 0850853) e KCCM10814P (Patente no KR 0838036). A cepa mutante de E. coli KCCM10805P é uma cepa de E. coli de produção de L-triptofano derivada da cepa de E. coli de produção de L-triptofano CJ285 (Publicação de Patente no KR 10-2005-0059685) que tem resistência ao hidroxamato de triptofano análogo ao triptofano e é caracterizada pelo fato de que o gene nrfE que é envolvido em redução de nitrito foi inativado por recombinação homóloga. A cepa mutante de E. coli, KCCM10814P, é uma cepa de E. coli de produção de L-triptofano derivada de CJ285 e é caracterizada pelo fato de que o gene yjeO que codifica uma proteína exigida para sintetizar uma membrana interna foi excluído.

4-1: CONSTRUÇÃO DE VÁRIAS CEPAS DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANOTRANSFORMADAS COM VETOR RECOMBINANTE PCL-PCJ1-TRP4

[0066] O vetor recombinante pCL-PCJ1-trp4 foi introduzido nas cepas de produção de L-triptofano KCCM10805P e KCCM10814P do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 2 para construir cepas transformadas. As cepas transformadas foram nomeadas "KCCM10805P/pCL-PCJ1-trp4" e "KCCM10814P/pCL-PCJ1-trp4", respectivamente.

4-2: COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE L-TRIPTOFANO ENTRE VÁRIAS CEPAS DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO TRANSFORMADAS COM VETOR RECOMBINANTE PCL-PCJ1-TRP4

[0067] As cepas transformadas construídas no Exemplo 4-1 acima foram cultivadas em frascos Erlenmeyer do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 3, e as produtividades de L-triptofano das mesmas foram comparadas. Os resultados da comparação são mostrados na Tabela 4 abaixo.TABELA 4

[0068] Conforme pode ser visto na Tabela 4 acima, quando o gene de trp4 de levedura foi expresso nas três cepas de produção de L- triptofano pelos vetores, a produtividade de L-triptofano foi aumentada em cerca de 0,9 a 3,7 g/l. Além disso, mostrou-se que, quando o gene trp4 de levedura foi expresso nas três cepas de produção de L- triptofano pelos vetores, a quantidade de ácido antranílico diminuiu bastante. Isso sugere que a expressão do gene de trp4 de levedura na cepa de produção de L-triptofano tem os efeitos de aprimorar a produtividade de L-triptofano da cepa enquanto suprime o acúmulo de ácido antranílico na cepa.

EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO RECOMBINANTE QUE TEM O PROMOTOR CJ1 E GENE TRP4 INTRODUZIDOS NO CROMOSSOMO DA CEPA DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO

[0069] Na cepa Con/pCL-PCJ1-trp4 construída no Exemplo 3, a cepa transformada pode perder o plasmídeo durante divisão celular e, desse modo, pode perder o cassete de expressão de gene trp4. Nesse caso, a cepa transformada é retornada para a cepa de produção de L- triptofano, indicando que é difícil manter de modo estável o cassete de expressão de gene de trp4. Além disso, há um risco em que o marcador de seleção resistente a antibiótico no plasmídeo pode ser introduzido no genoma da cepa de origem de produção de L-triptofano para gerar uma cepa mutante que tem resistência ao antibiótico.

[0070] Por essa razão, na presente invenção, apenas o cassete de expressão de gene trp4 foi inserido no locus de gene ybiX no genoma da cepa de origem de produção de L-triptofano a fim de solucionar esse problema.

5-1: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE COMPREENDE FRAGMENTO DE PCJ1-TRP4 E GENE DE CLORAMFENICOL ACETILTRANSFERASE

[0071] Como um marcador de seleção para confirmar inserção do cassete de expressão de gene trp4 no genoma, o gene de cloramfenicol acetiltransferase que confere resistência ao cloramfenicol foi usado. Para isso, um vetor de pUCprmfmloxC (Publicação de Patente Aberta à Inspeção Pública no KR 2009-0075549) que compreende o gene de cloramfenicol acetiltransferase foi usado.

[0072] Com o uso de pCL-PCJ1-trp4 construído no Exemplo 1-3 como modelo, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11 para preparar um fragmento de PCJ1-trp4. O fragmento preparado e o vetor pUCprmfmloxC foram tratados com as enzimas de restrição KpnI e SpeI e, então, realizou-se eletroforese em 0,8% de agarose gel. Cada um dos fragmentos de DNA foi ligado no vetor com o uso de um kit de ligação de DNA rápida (ROCHE, doravante o mesmo) por 30 minutos e, então, transformado em células DH5α de E. coli. As células transformadas foram selecionadas em um meio sólido de LB contendo cloramfenicol. A colônia selecionada foi cultivada em meio líquido de LB, e o DNA de plasmídeo foi recuperado, tratado com uma enzima de restrição, e sequenciado para confirmar que um vetor que compreende o gene PCJ1-trp4 e o gene de cloramfenicol acetiltransferase foi construído de modo apropriado. O vetor confirmado foi nomeado "pmlox-Cmt-PCJ1-trp4".

5-2: PREPARAÇÃO DE FRAGMENTO DE DNA PARA INSERIR FRAGMENTO DE DNA QUE COMPREENDE GENE PCJ1-TRP4 E GENE CLORAMFENICOL ACETILTRANSFERASE EM LOCUS DE GENE YBIX

[0073] O gene ybiX (ID de Gene: 12930961) é um gene cuja função ainda não foi claramente elucidada, e sabe-se que exclusão do gene leva a um aumento no nível intracelular de ATP (Hara et al., FEMS Microbiol Lett, 297, 217 a 224, 2009). Sabe-se que, até mesmo quando o gene de ybiX é excluído de uma cepa de E. coli, a atividade fisiológica da cepa de E. coli não é muito influenciada. Desse modo, na presente invenção, o cassete de expressão de gene trp4 foi inserido sobre o locus de gene de ybiX no genoma da cepa de origem de produção de L-triptofano.

[0074] Um fragmento de cassete de expressão de trp4 a ser inserido sobre o locus de gene de ybiX foi preparado realizando-se PCR com o uso do plasmídeo pmlox-Cmt-PCJ1-trp4, construído no Exemplo 5-1, como um modelo e iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13. Realizou-se eletroforese no fragmento de DNA preparado em 0,8% de agarose gel. Com o uso do fragmento de DNA que passou por eletroforese como um modelo, PCR foi realizado novamente com iniciadores de SEQ ID NOS: 14 e 15. Realizou-se eletroforese de fragmento de DNA resultante em 0,8% de agarose gel.

[0075] O fragmento de DNA preparado é um fragmento que compreende uma sequência 100-pb igual ao gene ybiX em cada uma das extremidades 5' e 3', e pode ser inserido no locus de gene ybiX no genoma da cepa de produção de L-triptofano por recombinase. A concentração do fragmento de DNA preparado foi medida com o uso de NanoDrop (Thermo SCIENTIFIC). O fragmento de DNA preparado foi nomeado "ybiX:Cm-PCJ1-trp4", e a sequência do mesmo é representada por SEQ ID NO: 16.

5-3: INSERÇÃO DE CASSETE DE EXPRESSÃO DE ANTRANILATO FOSFORRIBOSILTRANSFERASE DE LEVEDURA DE PCJ1-TRP4 EM LOCUS DE GENE YBIX DE CEPA DE PRODUÇÃO DE L- TRIPTOFANO

[0076] O cassete de expressão de gene trp4 foi inserido no locus de gene ybiX por recombinase. Por essa inserção, a técnica de inativação de uma etapa com o uso de recombinase lambda vermelho desenvolvida por Datsenko KA et al. foi usada (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 97, 6.640 a 6.645, 2000).

[0077] O plasmídeo de vetor pKD46 que expressa recombinase lambda vermelho foi transformado na cepa de produção de L-triptofano (KCCM 10812P) do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 2. A cepa de produção de L-triptofano transformada com o vetor pKD46 foi selecionada em um meio sólido de LB contendo ampicilina. Para induzir a expressão de recombinase lambda vermelho, a cepa de produção de L-triptofano selecionada transformada com o vetor pKD46 foi cultivada em 20 ml de um meio de LB líquido contendo 5 mM de arabinose. Quando a concentração das células alcançou 5 x 108 de células/ml, as células foram recuperadas e lavadas três vezes com uma solução de glicerol fria de 10%.

[0078] 500 ng do fragmento de DNA ybiX::Cm-PCJ1-trp4 preparado no Exemplo 5-2 foi introduzido na cepa de produção de L-triptofano resultante por eletroporação. Na cepa de produção de L-triptofano que tem o fragmento de DNA introduzido na mesma, o gene resistente a cloramfenicol e o cassete de expressão de gene trp4 foram inseridos no locus de gene ybiX por recombinação homóloga causada por recombinase lambda Red. Como essa cepa mostrou resistência a cloramfenicol, a mesma foi selecionada em um meio sólido de LB contendo cloramfenicol. A cepa selecionada foi submetida a PCR de colônia com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 18 e, como resultado, confirmou-se que o fragmento de Cm-PCJ1-trp4 foi inserido no locus de gene ybiX da cepa.

[0079] Como o vetor pKD46 tinha uma origem de replicação sensível à temperatura, a cepa selecionada foi, então, incubada a uma temperatura de 40 °C ou mais para remover o vetor de pKD46 das células. Essa remoção foi confirmada pelo fato de que a cepa selecionada não se desenvolveu em um meio de LB sólido contendo ampicilina.

[0080] A seguir, a fim de remover o gene resistente a cloramfenicol do genoma da cepa de produção de L-triptofano, um plasmídeo pJW168 (Palmeros et al., Gene, 247, 255 a 264, 2000) foi introduzido na cepa do mesmo modo conforme descrito no Exemplo 2. A fim de expressar Cre-recombinase do plasmídeo pJW168 introduzido, isopropil-β-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG) foi colocado em placas em um meio de LB sólido contendo ampicilina, e uma cepa foi selecionada. Na cepa selecionada, o gene resistente a cloramfenicol foi removido por recombinação genética causada por Cre-recombinase na posição loxP mutante, e essa remoção foi confirmada com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 18. A cepa confirmada conforme descrito acima foi uma cepa de produção de L-triptofano que tem o cassete de expressão de gene trp4 inserido na mesma e foi nomeada "Con/ybiX::PCJ1-trp4".

EXEMPLO 6: COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE L- TRIPTOFANO E ATIVIDADE FISIOLÓGICA DE CEPA TRANSFORMADA QUE TEM CASSETE DE EXPRESSÃO DE GENE TRP4 INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0081] A cepa transformada preparada no Exemplo 5 foi cultivada em um frasco Erlenmeyer com o uso do meio de título de triptofano mostrado na Tabela 1 acima, e a produtividade de L-triptofano da mesma foi analisada.

[0082] Uma alça de platina de cada uma dentre a cepa de origem de produção de L-triptofano (Con) e cepa Con/ybiX::PCJ1-trp4 cultivadas ao longo da noite em um meio sólido de LB em um incubador a 37 °C foi inoculada em 25 ml do meio de título mostrado na Tabela 1 acima, e foi, então, cultivada em um incubador a 37 °C e 200 rpm por 40 horas. Os resultados da cultura são mostrados nas Tabelas 5 e 6 abaixo.TABELA 5: COMPARAÇÃO DE PRODUTIVIDADE DE TRIPTOFANO ENTRE A CEPA DE ORIGEM DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO E A CEPA QUE TEM O CASSETE DE EXPRESSÃO DE GENE TRP4 INSERIDO NO CROMOSSOMO

TABELA 5: COMPARAÇÃO DE ATIVIDADE FISIOLÓGICA ENTRE A CEPA DE ORIGEM DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO E A CEPA QUE TEM O CASSETE DE EXPRESSÃO DE GENETRP4 INSERIDO NO CROMOSSOMO

[0083] Conforme pode ser visto na Tabela 5 acima, a cepa de origem produziu 6,3 g/l de L-triptofano durante 40 horas de cultura, mas a cepa Con/ybiX::PCJ1-trp4 produziu 9,2 g/l de L-triptofano e, desse modo, mostrou um aumento na produtividade de L-triptofano de 2,9 g/l (46% de aumento) quando comparado à cepa de origem.

[0084] Além disso, conforme pode ser visto na Tabela 6 acima, a cepa Con/ybiX::PCJ1-trp4 foi similar à cepa de origem em termos de taxa de consumo de glicose e crescimento celular, como a cepa transformada que tem o cassete de expressão de gene trp4 introduzido pelo vetor. Adicionalmente, o acúmulo do acetato de subproduto de fermentação na cepa Con/ybiX::PCJ1-trp4 foi similar ou menor do que aquele na cepa de origem (dados não mostrados).

[0085] Desse modo, pode-se ver que a cepa Con/ybiX::PCJ1-trp4 mostrou atividade fisiológica substancialmente similar àquela da cepa de origem de produção de L-triptofano, como a cepa transformada que tem a cepa transformada que tem o cassete de expressão de gene trp4 introduzido pelo vetor. Além disso, observou-se que o acúmulo de ácido antranílico na cepa de Con/ybiX::PCJ1-trp4 durante fermentação diminuiu bastante quando comparado àquele na cepa de origem de produção de L-triptofano, como o caso da cepa transformada que tem a cepa transformada que tem o cassete de expressão de gene trp4 introduzido pelo vetor. Portanto, pode-se concluir que, quando a cepa de Con/ybiX::PCJ1-trp4 é usada para produzir L-triptofano, L-triptofano pode ser produzido com maior produtividade e a produtividade total de L-triptofano pode ser mantida em um nível alto mantendo-se maior estabilidade de fermentação. NÚMERO DE ACESSO Autoridade Depositória: Centro de Cultura Coreano de Microorganismos; Número de acesso KCCM11408P; Data de depósito: 8 de abril de 2013.

Claims

1. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-triptofano aprimorada em relação a um micro-organismo não modificado, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante foi modificado para expressar antranilato fosforribosiltransferase de levedura, em que o micro-organismo recombinante compreende um polinucleotídeo que codifica a fosforribosiltransferase de antranilato de levedura, e em que o polinucleotídeo tem a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 9 ou sequência degenerada da mesma.

2. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antranilato fosforribosiltransferase de levedura tem uma sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1.

3. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modificação é alcançada tanto por transformação com um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica o antranilato fosforribosiltransferase ou por inserção do polinucleotídeo em um cromossomo,em que o polinucleotídeo tem a sequência nucleotídica representada pela SEQ ID NO: 9 ou sequência degenerada da mesma.

4. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo do gênero Escherichia é Escherichia coli.

5. Método para produzir L-triptofano caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar um micro-organismo recombinante do gênero Escherichia que tem produtividade de L-triptofano aprimorada em relação a um micro-organismo não modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e recuperar L-triptofano da cultura.