BR112015022988B1 - INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTAGONIST ISOLATED MONOCLONAL ANTIBODY, ITS USE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING THE MENTIONED ANTIBODY - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTAGONISTAS DO INTERFERON ALFA E ÔMEGA. A presente invenção refere-se a anticorpos antagonistas amplamente neutralizantes de interferon-a e interferon ? , polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou fragmentos, e métodos para produzir e usar os anteriormente mencionados que são úteis no tratamento de doenças associadas com a produção aumentada de IFNa e IFN?. Os IFNs do tipo I são uma família de citocinas que sinalizam através de um receptor heterodimérico expresso ubiquamente (IFNAR) resultando em efeitos antivirais, antiproliferativos e imunomodulatórios.INTERFERON ALPHA AND OMEGA ANTAGONIST ANTIBODIES. The present invention relates to broadly neutralizing antagonist antibodies of interferon-α and interferon ? , polynucleotides encoding the antibodies or fragments, and methods for making and using the aforementioned which are useful in the treatment of diseases associated with increased production of IFNα and IFN?. Type I IFNs are a family of cytokines that signal through a ubiquitously expressed heterodimeric receptor (IFNAR) resulting in antiviral, antiproliferative, and immunomodulatory effects.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos antagonistas do interferon-α e interferon-w amplamente neutralizantes, polinucleotí- deos que codificam os anticorpos ou fragmentos dos mesmos e a métodos de preparo e uso dos supracitados.[001] The present invention relates to widely neutralizing interferon-α and interferon-w antagonist antibodies, polynucleotides encoding antibodies or fragments thereof, and methods of preparing and using the aforementioned.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[002] Os IFNs do tipo I são uma família de citocinas que sinali zam através de um receptor heterodimérico expresso ubiquamente (IFNAR) resultando em efeitos antivirais, antiproliferativos e imunomo- dulatórios. Em humanos, o IFN do tipo I é composto de pelo menos 12 subtipos de proteínas IFNα e 1 subtipo cada, para o IFNβ, IFNε, IFNK e IFNw. A indução de IFN do tipo I ocorre em resposta a ambos os ligan- tes estéreis e microbianos. Embora os efeitos antivirais e antiprolifera- tivos do IFN do tipo I tenham sido explorados na prática clínica para doenças infecciosas e indicações oncológicas, antagonistas de IFN do tipo I estão sendo desenvolvidos para indicações inflamatórias mediadas pelo sistema imune.[002] Type I IFNs are a family of cytokines that signal through a ubiquitously expressed heterodimeric receptor (IFNAR) resulting in antiviral, antiproliferative, and immunomodulatory effects. In humans, type I IFN is composed of at least 12 IFNα protein subtypes and 1 subtype each for IFNβ, IFNε, IFNK, and IFNw. Type I IFN induction occurs in response to both sterile and microbial ligands. While the antiviral and antiproliferative effects of type I IFN have been explored in clinical practice for infectious disease and oncological indications, type I IFN antagonists are being developed for immune-mediated inflammatory indications.

[003] Várias doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune, como lúpus (SLE), diabetes tipo I, psoríase, doença de Sjogren primária, esclerose sistêmica e artrite reumatoide, exibem evidência do tipo elevado de IFN em vários graus, conforme determinado pela superabundância de genes induzíveis por IFN transcritos, comumente denominados como assinatura de IFN presente no sangue total e/ou tecido.[003] Several immune-mediated inflammatory diseases, such as lupus (SLE), type I diabetes, psoriasis, primary Sjogren's disease, systemic sclerosis, and rheumatoid arthritis, exhibit evidence of elevated IFN type to varying degrees, as determined by the overabundance of IFN-inducible gene transcripts, commonly referred to as the IFN signature present in whole blood and/or tissue.

[004] Abordagens antagonistas do IFN do tipo I atualmente em desenvolvimento clínico para o lúpus incluem múltiplas abordagens para neutralizar os subtipos de IFNα e não outros IFNs do tipo I (β, ε, K, w) usando anticorpos anti-IFN, como os descritos na patente US n° 7.087.726; patente US n° 8.025.882 e publicação de pedido de patente US n° US2008/0160030. Dados de testes clínicos indicam a redução parcial da assinatura de IFN do tipo I em pacientes tratados com anticorpos anti-IFNα (Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009) e melhora nos sinais e sintomas de SLE, em taxa de exacerbação, e sobrecarga de esteroi- des na semana 24 em um grupo definido com biomarcador pré- especificado de indivíduos com lúpus moderadamente baixo a severamente ativo em Métrica de Assinatura de Interferon (ISM). Nenhuma eficácia foi observada em pacientes predefinidos como ISM-Alta (Ka- lunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).[004] Type I IFN antagonist approaches currently in clinical development for lupus include multiple approaches to neutralize IFNα subtypes rather than other type I IFNs (β, ε, K, w) using anti-IFN antibodies, such as those described in US Patent No. 7,087,726; US Patent No. 8,025,882 and US Patent Application Publication No. US2008/0160030. Clinical trial data indicate partial reduction of type I IFN signature in patients treated with anti-IFNα antibodies (Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009) and improvement in SLE signs and symptoms, exacerbation rate, and week-long steroid overload 24 in a group defined with pre-specified biomarker of individuals with lupus moderately low to severely active on Interferon Signature Metric (ISM). No efficacy was observed in patients predefined as ISM-High (Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).

[005] Os anticorpos anti-IFNAR1 são uma alternativa para o tra tamento de lúpus (Wang et al., 2013; Clinical Pharmacology & Therapeutics, pré-visualização do artigo aceito em 14 de fevereiro de 2013; doi: 10.1038/clpt.2013.35). É previsto que o bloqueio de IFNAR1 anule a sinalização de IFN induzida por todos os IFNs do tipo I, incluindo IFNβ. O IFNβ pode desempenhar um papel de importância mais crítica na defesa antiviral, já que a deleção específica do gene que codifica o IFNβ acarreta substancial susceptibilidade a uma série de vírus quando comparados aos camundongos da mesma forma expostos tendo IFNβ funcional (Lazear et al., J Virol 85:7186-7194, 2011; Deonarain et al., J Virol 74: 3404-340, 2000; Deonarain et al., Circulation 110: 35403543, 2004; Gerlach, et al., J Virol 80: 3438-3444, 2006).[005] Anti-IFNAR1 antibodies are an alternative for the treatment of lupus (Wang et al., 2013; Clinical Pharmacology & Therapeutics, article preview accepted Feb 14, 2013; doi: 10.1038/clpt.2013.35). Blockade of IFNAR1 is predicted to abrogate IFN signaling induced by all type I IFNs, including IFNβ. IFNβ may play a more critically important role in antiviral defense, as specific deletion of the gene encoding IFNβ leads to substantial susceptibility to a range of viruses when compared to similarly exposed mice having functional IFNβ (Lazear et al., J Virol 85:7186-7194, 2011; Deonarain et al., J Virol 74: 3404-340, 2000; Deonarain et al., Circulation 110: 35403543, 2004; Gerlach, et al., J Virol 80: 3438-3444, 2006).

[006] Portanto, existe uma necessidade por anticorpos adicionais para o tratamento do lúpus e outras doenças inflamatórias mediado pelo sistema imune.[006] Therefore, there is a need for additional antibodies for the treatment of lupus and other immune-mediated inflammatory diseases.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[007] A Figura 1 mostra a inibição da liberação de IP-10 no san- gue total induzida por Figura 1A) 100 U/ml de IFN leucocitário endógeno (induzido por vírus) ou Figura 1B) 250 U/mL de IFNw humano re- combinante em concentrações especificadas.[007] Figure 1 shows the inhibition of IP-10 release in whole blood induced by Figure 1A) 100 U/ml endogenous leukocyte IFN (virus-induced) or Figure 1B) 250 U/ml recombinant human IFNw at specified concentrations.

[008] A Figura 2 mostra a inibição do IFN do Tipo I, induzida pelo complexo imune derivado do paciente com lúpus eritematoso sistêmico (SLE) por vários anticorpos, como indicado. A combinação de anticorpo anti-IFNα1 e anti-IFNw, anti-IFNα2 e anti-IFNw ou anti-IFNα3 e anti-IFNw proporciona inibição mais pronunciada quando comparada com o anticorpo anti-IFNα sozinho. O anticorpo (M43) amplamente neutralizante anti-IFNα/IFNw demonstrou adicionalmente, a supressão da atividade total.[008] Figure 2 shows the inhibition of Type I IFN, induced immune complex derived from the patient with systemic lupus erythematosus (SLE) by various antibodies, as indicated. The combination of anti-IFNα1 and anti-IFNw, anti-IFNα2 and anti-IFNw or anti-IFNα3 and anti-IFNw antibody provides more pronounced inhibition when compared to anti-IFNα antibody alone. The broadly neutralizing anti-IFNα/IFNw antibody (M43) additionally demonstrated suppression of total activity.

[009] A Figura 3 mostra a porcentagem (%) de inibição da assinatu ra gênica de SLE elevada com anti-IFNw, anti-IFNα ou uma combinação dos dois. A expressão gênica induzível por IFN de linha de base elevada na ausência de tratamento com o anticorpo é normalizada para 100%.[009] Figure 3 shows the percentage (%) inhibition of elevated SLE gene signature with anti-IFNw, anti-IFNα or a combination of the two. Elevated baseline IFN-inducible gene expression in the absence of antibody treatment is normalized to 100%.

[0010] A Figura 4 mostra a estrutura molecular total do complexo IFNw/FabM43. O identificado com H é VH; o identificado com L é VL, e na parte superior esquerda é IFNw.[0010] Figure 4 shows the total molecular structure of the IFNw/FabM43 complex. The one identified with H is VH; the one labeled L is VL, and at the top left is IFNw.

[0011] A Figura 5 mostra as estruturas moleculares totais dos complexos Figura 5A) IFNα4A/Fab357 e Figura 5B) IFNw/Fab357. Apenas a parte de Fv é mostrada no Fab. Fab537 é Fab de C2595.[0011] Figure 5 shows the total molecular structures of the complexes Figure 5A) IFNα4A/Fab357 and Figure 5B) IFNw/Fab357. Only the Fv part is shown in the Fab. Fab537 is Fab of C2595.

[0012] A Figura 6 A) mostra a estrutura molecular total do comple xo IFNα4A/FabM88. Figura 6B) Densidade de elétrons representativa (2mFo-DFc em 1,5a) em torno da parte da região de epitopo no sítio da combinação do antígeno. O identificado com H é VH; o identificado com L é VL; a parte superior esquerda é IFNα4A.[0012] Figure 6A) shows the total molecular structure of the IFNα4A/FabM88 complex. Figure 6B) Representative electron density (2mFo-DFc at 1.5a) around part of the epitope region at the antigen combining site. The one identified with H is VH; the one identified with L is VL; upper left is IFNα4A.

[0013] A Figura 7 mostra a estrutura de IFNα4A e a comparação com IFNw e IFNα. Figura 7A) IFNα4A. As cinco principais hélices são identificadas. A alça longa de ligação AB também é identificada junto ao segmento helicoidal curto. Figura 7B) IFNw (código PDB 3se4) e Figura 7C) IFNp (pdb id 1au1). Figura 7D) Comparação estrutural com IFNβ. As principais diferenças em torno do segmento helicoidal AB estão indicadas por uma forma oval.[0013] Figure 7 shows the structure of IFNα4A and comparison with IFNw and IFNα. Figure 7A) IFNα4A. The five main helices are identified. The long connecting loop AB is also identified next to the short helical segment. Figure 7B) IFNw (PDB code 3se4) and Figure 7C) IFNp (pdb id 1au1). Figure 7D) Structural comparison with IFNβ. The main differences around the helical segment AB are indicated by an oval shape.

[0014] Figura 8. Modo de neutralização por M88. A estrutura IFNW/IFNAR1/IFNAR2 (pdb id 3se4) e M88/IFNα4 estão sobrepostas sobre os IFNs.[0014] Figure 8. Mode of neutralization by M88. The structure IFNW/IFNAR1/IFNAR2 (pdb id 3se4) and M88/IFNα4 are superimposed on the IFNs.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[0015] Um aspecto da invenção é um anticorpo monoclonal isola do, que se liga e neutraliza a atividade do interferon ômega humano (IFNw) e ao menos de quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez sub- tipos de interferon alfa humano (IFNα).[0015] One aspect of the invention is an isolated monoclonal antibody that binds to and neutralizes the activity of human omega interferon (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of human interferon alpha (IFNα).

[0016] Em outros aspectos da invenção, o anticorpo isolado com pete pela ligação ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo:[0016] In other aspects of the invention, the isolated antibody comprises binding to human IFNw and the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with an isolated antibody comprising:

[0017] uma sequência de aminoácidos da região variável da ca deia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28.[0017] a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0018] Em aspectos adicionais da invenção, o anticorpo isolado se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1; o anticorpo isolado se liga ao IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19; o anticorpo isolado inibe a atividade do complexo imune de lúpus eritematoso sistêmico (LES) induzido por IFN.[0018] In additional aspects of the invention, the isolated antibody binds to IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1; the isolated antibody binds to IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19; the isolated antibody inhibits IFN-induced systemic lupus erythematosus (SLE) immune complex activity.

[0019] Aspectos adicionais da invenção é um polinucleotídeo iso lado que codifica um anticorpo da invenção; composição farmacêutica compreendendo o anticorpo da invenção e um veículo farmaceutica- mente aceitável.[0019] Additional Aspects of the Invention is an isolated polynucleotide encoding an antibody of the invention; pharmaceutical composition comprising the antibody of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0020] Um aspecto adicional da invenção é um método para tra tamento ou prevenção de uma doença associada ao aumento da produção de IFNα e IFNw, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo isolado da invenção a um paciente que necessite do mesmo durante tempo suficiente para tratar e prevenir a doença. Em um aspecto adicional da invenção, a doença associada ao aumento da produção de IFNα e IFNw é o lúpus eritematoso sistêmico (LES).[0020] A further aspect of the invention is a method of treating or preventing a disease associated with increased production of IFNα and IFNw, comprising administering a therapeutically effective amount of an isolated antibody of the invention to a patient in need thereof long enough to treat and prevent the disease. In a further aspect of the invention, the disease associated with increased production of IFNα and IFNw is systemic lupus erythematosus (SLE).

[0021] Um outro aspecto da invenção é um método de inibição da interação de IFNw e dos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNaF, IFNaG e/ou IFNαJ1 com IFNAR em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de um anticorpo isolado da invenção a um paciente durante tempo suficiente para prevenir a interação de IFNw e dos subtipos de IFNα IFNaB2, IFNaC, IFNaF, IFNaG e/ou IFNαJ1 com IFNAR.[0021] Another aspect of the invention is a method of inhibiting the interaction of IFNw and the IFNα subtypes IFNαB2, IFNaF, IFNaG and/or IFNαJ1 with IFNAR in a patient in need thereof, comprising administering an isolated antibody of the invention to a patient for a time sufficient to prevent the interaction of IFNw and the IFNα subtypes IFNaB2, IFNaC, IFNaF, IFNaG and/or IFNαJ1 with IFNAR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0022] Todas as publicações, incluindo, mas não se limitando a, pa tentes e pedidos de patente, citadas neste relatório descritivo estão aqui incorporadas a título de referência como se fossem descritas na íntegra.[0022] All publications, including but not limited to patents and patent applications, cited in this specification are incorporated herein by reference as if they were described in full.

[0023] Deve-se entender que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de apenas descrever modalidades particulares e não pretende ser limitadora. Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence.[0023] It is to be understood that the terminology used in the present invention is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting. Except where otherwise defined, all technical and scientific terms used in the present invention have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which the invention pertains.

[0024] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva lentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática dos testes da presente invenção, são descritos aqui materiais e métodos exempli- ficadores. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usada.[0024] While any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in practicing the tests of the present invention, exemplary materials and methods are described herein. In describing and claiming the present invention, the following terminology will be used.

[0025] O termo "ligação específica" ou "que se liga especificamen te" ou "liga-se", como usado na presente invenção, refere-se ao anticorpo que se liga a um antígeno predeterminado com maior afinidade do que a outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo se liga a um antí- geno predeterminado com uma constante de dissociação (KD) de 1x10- 7 M ou menos, por exemplo, 1x10-8 M ou menos, 1x10-9 M ou menos, 1x10-10 M ou menos, 1x10-11 M ou menos, ou 1x10-12 M ou menos, tipicamente com um KD que é pelo menos dez vezes menor que seu KD para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína). A constante de dissociação pode ser medida com o uso de procedimentos-padrão. Anticorpos que se ligam especificamente a um antí- geno predeterminado podem, no entanto, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, com o mesmo antígeno predeterminado de outras espécies (homólogas), como humanos ou macacos, por exemplo Macaca fascicularis (cinomolgus) ou Pan troglodytes (chimpanzé, chimp). Os anticorpos que especificamente se ligam a um antígeno predeterminado podem ligar-se ainda a um epitopo que é partilhado entre dois ou mais antígenos diferentes, como o interferon alfa (IFNα) e interferon ômega (IFNw); ou seja, os anticorpos reagem de forma cruzada com IFNα e IFNw.[0025] The term "specifically binding" or "specifically binding" or "binds", as used in the present invention, refers to the antibody that binds to a predetermined antigen with greater affinity than to other antigens. Typically, the antibody binds to a predetermined antigen with a dissociation constant (KD) of 1x10-7 M or less, for example, 1x10-8 M or less, 1x10-9 M or less, 1x10-10 M or less, 1x10-11 M or less, or 1x10-12 M or less, typically with a KD that is at least ten times less than its KD for binding to a non-specific antigen (eg, BSA, casein). The dissociation constant can be measured using standard procedures. Antibodies that bind specifically to a predetermined antigen may, however, show cross-reactivity with other related antigens, for example with the same predetermined antigen from other (homologous) species, such as humans or monkeys, for example Macaca fascicularis (cynomolgus) or Pan troglodytes (chimpanzee, chimp). Antibodies that specifically bind to a predetermined antigen may further bind to an epitope that is shared between two or more different antigens, such as interferon alpha (IFNα) and interferon omega (IFNw); that is, the antibodies cross-react with IFNα and IFNw.

[0026] O termo "neutralização" ou "neutraliza" ou "anticorpo neu- tralizante" ou "anticorpo antagonista", conforme usado na presente invenção, refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inibe parcialmente ou completamente, por qualquer mecanismo, a atividade biológica de interferon alfa (IFNα) e/ou interferon ômega (IFNw). Os anticorpos neutralizantes podem ser identificados usando ensaios para atividade biológica de IFNα e/ou IFNw, como descrito abaixo. Os anticorpos neutralizantes IFNα e/ou IFNw podem inibir a atividade biológica de IFNα e IFNw medida por 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.[0026] The term "neutralizing" or "neutralizes" or "neutralizing antibody" or "antagonist antibody", as used in the present invention, refers to an antibody or antibody fragment that partially or completely inhibits, by any mechanism, the biological activity of interferon alpha (IFNα) and/or interferon omega (IFNw). Neutralizing antibodies can be identified using assays for IFNα and/or IFNw biological activity, as described below. IFNα and/or IFNw neutralizing antibodies can inhibit the biological activity of IFNα and IFNw measured by 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.

[0027] O termo "interferon-α" (IFNα), como usado na presente in venção, refere-se a todos os subtipos nativos de interferons alfa humanos. IFNα nativo consiste em mais de 23 subtipos de proteínas intimamente relacionados codificados por genes distintos com um elevado grau de homologia estrutural (Weissmann e Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 33: 251,1986; Roberts et al., J. Interferon Cytokine Res. 18: 805-816, 1998). Os subtipos de IFNα humano são pelo menos IFNαA (IFNα2) (SEQ ID NO: 5), IFNαB2 (IFNα8) (SEQ ID NO: 6), IFNαC (IFNα10) (SEQ ID NO: 7), IFNαD (IFNα1) (SEQ ID NO: 8), IFNαF (IFNα21) (SEQ ID NO: 9), IFNαG (IFNα5) (SEQ ID NO: 10), e IFNαH (IFNα14) (SEQ ID NO: 11), com IFNαI com substituição de P34H (IFNα17) (SEQ ID NO: 12), IFNαJ1 (IFNα7) (SEQ ID NO: 14), IFNαK (IFNα6) (SEQ ID NO: 14), IFNα4b (IFNα4) (SEQ ID NO: 15), e IFNαWA (IFNα6) (SEQ ID NO: 16). A nomenclatura para interferons humanos é encontrada em: http://www_genenames_org/genefa- milies/_IFN.[0027] The term "interferon-α" (IFNα), as used in the present invention, refers to all native subtypes of human alpha interferons. Native IFNα consists of more than 23 closely related protein subtypes encoded by distinct genes with a high degree of structural homology (Weissmann and Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol., 33: 251,1986; Roberts et al., J. Interferon Cytokine Res. 18: 805-816, 1998). The human IFNα subtypes are at least IFNαA (IFNα2) (SEQ ID NO: 5), IFNαB2 (IFNα8) (SEQ ID NO: 6), IFNαC (IFNα10) (SEQ ID NO: 7), IFNαD (IFNα1) (SEQ ID NO: 8), IFNαF (IFNα21) (SEQ ID NO: 9), IFNαG ( IFNα5) (SEQ ID NO: 10), and IFNαH (IFNα14) (SEQ ID NO: 11), with P34H-substituted IFNαI (IFNα17) (SEQ ID NO: 12), IFNαJ1 (IFNα7) (SEQ ID NO: 14), IFNαK (IFNα6) (SEQ ID NO: 14), IFNα4b (IFNα4) (SEQ ID NO: 15), and IFNαWA (IFNα6) (SEQ ID NO: 16). Nomenclature for human interferons is found at: http://www_genenames_org/genefamilies/_IFN.

[0028] O termo IFNw, como usado na presente invenção, refere-se a IFNw humano tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 e número de acesso UniProt P05000.[0028] The term IFNw, as used in the present invention, refers to human IFNw having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and UniProt accession number P05000.

[0029] O termo "interferon tipo I" refere-se a todos os subtipos na tivas de interferon-α humano e um subtipo de interferon-β, interferon-ε, interferon-w e interferon-K que se ligam a um receptor do interferon comum IFNAR.[0029] The term "type I interferon" refers to all native subtypes of human interferon-α and a subtype of interferon-β, interferon-ε, interferon-w and interferon-K that bind to a common interferon receptor IFNAR.

[0030] Como usado na presente invenção, o termo "IFNAR" refere- se ao receptor de interferon bem conhecido que é um heterodímero de IFNAR1 e IFNAR2. Sequências de proteínas de IFNAR1 e IFNAR2 são mostradas nas SEQ ID NOs: 31 e 32, respectivamente. O domínio extracelular maduro de IFNAR1 abrange os resíduos 28-436 da SEQ ID NO: 31 e o domínio extracelular maduro de IFNAR2 abrange os resíduos 27-243 da SEQ ID NO: 32.[0030] As used in the present invention, the term "IFNAR" refers to the well-known interferon receptor which is a heterodimer of IFNAR1 and IFNAR2. IFNAR1 and IFNAR2 protein sequences are shown in SEQ ID NOs: 31 and 32, respectively. The mature extracellular domain of IFNAR1 spans residues 28-436 of SEQ ID NO: 31 and the mature extracellular domain of IFNAR2 spans residues 27-243 of SEQ ID NO: 32.

[0031] O termo "anticorpos", como usado na presente invenção, é usado em sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina incluindo anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais incluindo anticorpos monoclonais murinos, humanos, adaptados para seres humanos, humanizados e quiméricos, fragmentos de anticorpos, anticorpos biespe- cíficos ou multiespecíficos formados de pelo menos dois anticorpos intactos ou fragmentos de anticorpo, anticorpos diméricos, tetraméri- cos ou multiméricos e anticorpos de cadeia única.[0031] The term "antibodies" as used in the present invention is used in a broad sense and includes immunoglobulin molecules including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies including murine, human, human-adapted, humanized and chimeric monoclonal antibodies, antibody fragments, bispecific or multispecific antibodies formed from at least two intact antibodies or antibody fragments, dimeric, tetrameric or multimeric antibodies and single chain antibodies.

[0032] As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependendo da sequência de aminoácidos de domínio constante de cadeia pesada. IgA e IgG são ainda subclassificadas como os isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, kappa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoá- cidos de seus domínios constantes.[0032] Immunoglobulins can be divided into five major classes, namely IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, depending on the amino acid sequence of the heavy chain constant domain. IgA and IgG are further subclassified as the isotypes IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. The light chains of antibodies from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinct types, namely, kappa (K) and lambda (À), based on the amino acid sequences of their constant domains.

[0033] O termo "fragmentos de anticorpo" refere-se a uma porção de uma molécula de imunoglobulina que retém o sítio de ligação do antígeno da cadeia pesada e/ou cadeia leve, como regiões determinantes de complementaridadede uma cadeia pesada (HCDR) 1, 2 e 3, regiões determinantes de complementaridade de uma cadeia leve (LCDR) 1, 2 e 3, uma região variável da cadeia pesada (VH) ou uma região variável da cadeia leve (VL). Os fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos bem conhecidos Fab, F(ab')2, Fd e Fv, assim como anticorpos de um domínio (dAb) consistindo de um domínio VH. Os domínios VH e VL podem ser unidos por um conector sintético para formar diversos tipos de designs de anticorpo de cadeia única onde os domínios VH/VL se emparelham de forma intramolecular ou intermole- cular, nos casos em que os domínios VH e VL são expressos por construtos separados de anticorpo de cadeia única, para formar um sítio de ligação de antígeno monovalente, como a cadeia única Fv (scFv) ou diacorpo; descrito, por exemplo, na publicação de patente internacional n° WO1998/44001, publicação de patente internacional n° WO1988/01649; publicação de patente internacional n° WO1994/13804; publicação de patente internacional n° WO1992/01047.[0033] The term "antibody fragments" refers to a portion of an immunoglobulin molecule that retains the antigen binding site of the heavy chain and/or light chain, such as heavy chain complementarity determining regions (HCDR) 1, 2 and 3, light chain complementarity determining regions (LCDR) 1, 2 and 3, a heavy chain variable region (VH) or a light chain variable region (VL). Antibody fragments include the well-known Fab, F(ab')2, Fd and Fv fragments, as well as single-domain (dAb) antibodies consisting of a VH domain. The VH and VL domains can be joined by a synthetic connector to form several types of single-chain antibody designs where the VH/VL domains pair intramolecularly or intermolecularly, in cases where the VH and VL domains are expressed by separate single-chain antibody constructs, to form a monovalent antigen-binding site, such as a single-chain Fv (scFv) or diabody; described, for example, in International Patent Publication No. WO1998/44001, International Patent Publication No. WO1988/01649; International Patent Publication No. WO1994/13804; International Patent Publication No. WO1992/01047.

[0034] Um anticorpo da região variável é constituído por uma regi ão de "arcabouço" interrompida por três "sítios de ligação ao antíge- no". Os sítios de ligação ao antígeno são definidos com o uso de vários termos: (i) As regiões determinantes de complementaridade (CDRs), três na VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três na VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) baseiam-se na variabilidade da sequência (Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiões hipervariáveis", "HVR", ou "HV", três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3), referem-se às regiões dos domínios variáveis de anticorpos que têm es-trutura hipervariável, conforme definido por Chothia e Lesk (Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). Outros termos incluem "IMGT- CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) e "Uso de Resíduo Determinante de Especificidade" (SDRU) (Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004). A base de dados da International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_imgt_org) fornece uma numeração e uma definição padronizadas de sítios de ligação ao antígeno. A correspondência entre as delineações de CDRs, HVs e IMGT é descrita em Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.[0034] An antibody variable region consists of a "framework" region interrupted by three "antigen-binding sites". Antigen-binding sites are defined using various terms: (i) The complementarity determining regions (CDRs), three in the VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) and three in the VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) are based on sequence variability (Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Im Munological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Hypervariable regions", "HVR", or "HV", three in the VH (H1, H2, H3) and three in the VL (L1, L2, L3), refer to regions of antibody variable domains that have hypervariable structure, as defined by Chothia and Lesk (Chothia and Lesk, Mol Biol 196:901-17, 1987). Other terms include "IMGT-CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) and "Specificity Determining Residue Use" (SDRU) (Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004). The International ImMunoGeneTics (IMGT) database (http://www_imgt_org) provides a standardized numbering and definition of antigen binding sites. The correspondence between the delineations of CDRs, HVs and IMGT is described in Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.

[0035] "Resíduos de Chothia", como usado na presente invenção, são os resíduos de anticorpo VL e VH numerados de acordo com Al- Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).[0035] "Chothia residues", as used in the present invention, are the VL and VH antibody residues numbered according to Al-Lazikani ( Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997 ).

[0036] "Arcabouço" ou "sequências do arcabouço" são as sequên- cias remanescentes de uma região variável diferente daquelas definidas para serem o sítio de ligação ao antígeno. Como o sítio de ligação ao antígeno pode ser definido por vários termos, conforme descrito acima, a sequência de aminoácidos exata de um arcabouço depende de como o sítio de ligação ao antígeno foi definido.[0036] "Framework" or "framework sequences" are the remaining sequences of a variable region other than those defined to be the antigen-binding site. As the antigen binding site can be defined by several terms as described above, the exact amino acid sequence of a scaffold depends on how the antigen binding site was defined.

[0037] "Anticorpo humano" ou "anticorpo completamente humano" refere-se a um anticorpo contendo sequências de região variável e de região constante derivadas das sequências da imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir substituições de modo que eles podem não ser cópias exatas das sequências da imu- noglobulina humana expressa ou do gene da linhagem germinativa. Entretanto, os anticorpos nos quais os sítios de ligação ao antígeno são derivados de uma espécie não humana não são incluídos na definição de "anticorpo humano".[0037] "Human antibody" or "fully human antibody" refers to an antibody containing variable region and constant region sequences derived from human immunoglobulin sequences. The human antibodies of the invention may include substitutions so that they may not be exact copies of the expressed human immunoglobulin or germline gene sequences. However, antibodies in which the antigen-binding sites are derived from a non-human species are not included in the definition of "human antibody".

[0038] Anticorpos "adaptados para seres humanos" ou anticorpos "adaptados para arcabouço humano (HFA)" refere-se a anticorpos adaptados de acordo com os métodos descrito na Publicação de Patente US n° US2009/0118127 e também refere-se a anticorpos nos quais as sequências do sítio de ligação ao antígeno derivadas de espécies não humanas são enxertadas em arcabouços humanos.[0038] "Human-adapted" antibodies or "human framework-adapted (HFA)" antibodies refer to antibodies adapted according to the methods described in U.S. Patent Publication No. US2009/0118127, and also refer to antibodies in which antigen-binding site sequences derived from non-human species are grafted onto human frameworks.

[0039] "Anticorpos humanizados" referem-se a anticorpos em que os sítios de ligação ao antígeno são derivados de espécies não humanas, e os arcabouços de região variável são derivados das sequências da imunoglobulina humana. Anticorpos humanizados podem incluir substituições nas regiões do arcabouço de modo que o arcabouço pode não ser uma cópia exata das sequências da imunoglobulina humana expressas ou do gene da linhagem germinativa.[0039] "Humanized antibodies" refer to antibodies in which the antigen-binding sites are derived from non-human species, and the variable region frameworks are derived from human immunoglobulin sequences. Humanized antibodies may include substitutions in framework regions such that the framework may not be an exact copy of the expressed human immunoglobulin or germline gene sequences.

[0040] O termo "anticorpo monoclonal", como usado na presente invenção, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclo nal apresenta uma especificidade de ligação única e afinidade por um epitopo particular.[0040] The term "monoclonal antibody", as used in the present invention, refers to a preparation of antibody molecules of unique molecular composition. A monoclonal antibody composition exhibits unique binding specificity and affinity for a particular epitope.

[0041] O termo "substancialmente idêntico", como usado na pre sente invenção, significa que as sequências de aminoácidos da região variável de dois anticorpos sendo comparadas são idênticas ou têm "diferenças insubstanciais". Diferenças insubstanciais são substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 aminoácidos em um anticorpo ou sequência da região variável do anticorpo que não afetam adversamente as propriedades do anticorpo. As sequências de aminoácidos substancialmente idênticas a sequências de região variável aqui apresentadas estão dentro do escopo da aplicação. Em algumas modalidades, a identidade de sequência pode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais alta. O percentual de identidade pode ser determinado, por exemplo, pelo alinhamento de pares de sequências com o uso das configurações-padrão do módulo AlignX do Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA, EUA). As sequências de proteínas da presente invenção podem ser usadas como uma sequência de consulta para executar uma busca em bases de dados públicas ou de patentes para, por exemplo, identificar as sequências relacionadas. Programas exemplificadores usados para executar tais buscas são os programas XBLAST ou BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), ou o conjunto de programas integrados GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA, EUA) com o uso das configurações-padrão.[0041] The term "substantially identical" as used herein means that the variable region amino acid sequences of two antibodies being compared are identical or have "insubstantial differences". Insubstantial differences are substitutions of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 amino acids in an antibody or antibody variable region sequence that do not adversely affect the properties of the antibody. Amino acid sequences substantially identical to variable region sequences presented herein are within the scope of application. In some embodiments, the sequence identity can be about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher. Percent identity can be determined, for example, by aligning sequence pairs using the default settings of the Vector NTI v.9.0.0 AlignX module (Invitrogen, Carslbad, CA, USA). The protein sequences of the present invention can be used as a query string to perform a search on public or patent databases to, for example, identify related sequences. Example programs used to perform such searches are the XBLAST or BLASTP programs (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), or the GenomeQuest™ suite of built-in programs (GenomeQuest, Westborough, MA, USA) using default settings.

[0042] O termo "epitopo", conforme é usado aqui significa uma porção de um antígeno à qual um anticorpo se liga especificamente. Os epitopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa (como polar, não polar ou hidrofóbica) de porções como aminoácidos ou cadeias laterais de polissacarídeos e podem ter características estruturais tridimensionais específicas, assim como ca- racterísticas de carga específicas. Um epitopo pode ser composto por aminoácidos contíguos ou não contíguos que formam uma unidade espacial conformacional. Para um epitopo não contíguo, os aminoáci- dos de porções diferentes da sequência linear do antígeno aproximam- se estreitamente no espaço tridimensional através do enovelamento da molécula de proteína.[0042] The term "epitope" as used herein means a portion of an antigen to which an antibody specifically binds. Epitopes typically consist of chemically surface-active (such as polar, non-polar, or hydrophobic) groupings of moieties such as amino acids or polysaccharide side chains, and may have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. An epitope can be composed of contiguous or non-contiguous amino acids that form a conformational spatial unit. For a non-contiguous epitope, amino acids from different portions of the antigen's linear sequence closely approximate each other in three-dimensional space through folding of the protein molecule.

[0043] O termo "parátopo", como usado na presente invenção, significa uma porção de um anticorpo à qual um antígeno especificamente se liga. Um parátopo pode ser linear na natureza ou pode ser descontínuo, formado por uma relação espacial entre aminoácidos não contíguos de um anticorpo e não para uma série linear de aminoáci- dos. Um "parátopo de cadeia leve" e um "parátopo de cadeia pesada" ou "resíduos de aminoácidos de parátopo de cadeia leve" e "resíduos de aminoácidos de parátopo de cadeia pesada" referem-se a resíduos de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo em contato com um antígeno, respectivamente.[0043] The term "paratope", as used in the present invention, means a portion of an antibody to which an antigen specifically binds. A paratope can be linear in nature or it can be discontinuous, formed by a spatial relationship between non-contiguous amino acids of an antibody and not to a linear series of amino acids. A "light chain paratope" and a "heavy chain paratope" or "light chain paratope amino acid residues" and "heavy chain paratope amino acid residues" refer to light chain and heavy chain residues of an antibody in contact with an antigen, respectively.

[0044] "Biespecífico", como usado na presente invenção, refere-se a um anticorpo que se liga a dois antígenos distintos ou a dois epitopos distintos dentro de um antígeno. Os anticorpos biespecíficos podem ligar dois ou mais antígenos diferentes nos casos em que os anticorpos biespecíficos reagem de forma cruzada com IFNα e IFNw.[0044] "Bispecific", as used in the present invention, refers to an antibody that binds to two distinct antigens or to two distinct epitopes within one antigen. Bispecific antibodies can bind two or more different antigens in cases where bispecific antibodies cross-react with IFNα and IFNw.

[0045] "Monoespecífico", como usado aqui, refere-se a um anti corpo que se liga a um antígeno ou a um epitopo. Os anticorpos mo- noespecificos podem ligar dois ou mais antígenos diferentes nos casos em que os anticorpos monoespecíficos reagem de forma cruzada com IFNα e IFNw.[0045] "Monospecific", as used herein, refers to an antibody that binds to an antigen or an epitope. Monospecific antibodies can bind two or more different antigens in cases where monospecific antibodies cross-react with IFNα and IFNw.

[0046] O termo "em combinação com", como usado na presente invenção, significa que os agentes descritos podem ser administrados a um animal juntos em uma mistura, simultaneamente como agentes únicos ou sequencialmente como agentes únicos em qualquer ordem.[0046] The term "in combination with", as used in the present invention, means that the described agents can be administered to an animal together in a mixture, either simultaneously as single agents or sequentially as single agents in any order.

[0047] O termo "atividade biológica de IFNα" e "atividade biológica de IFNw", como usado na presente invenção, refere-se a qualquer atividade que ocorre como resultado de IFNα e IFNw, respectivamente, se ligando ao seu receptor IFNAR. Uma atividade biológica de IFNα e IFNw é a capacidade de IFNα e IFNw para induzir a expressão de fos- fatase alcalina embrionária (SEAP) segregada sob o promotor induzí- vel de interferon tal como ISG54 em células HEK293 que expressam estavelmente o transdutor de sinal e o ativador de transcrição 2 (STAT2), o fator regulador de interferon 9 (IRF9) e SEAP, usando métodos convencionais. Outra atividade biológica de IFNα e IFNw é a indução da produção de quimiocina IP-10 (CXCL10) a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou de sangue total como descrito na presente invenção. [0047] The term "IFNα biological activity" and "IFNw biological activity", as used in the present invention, refers to any activity that occurs as a result of IFNα and IFNw, respectively, binding to their IFNAR receptor. A biological activity of IFNα and IFNw is the ability of IFNα and IFNw to induce expression of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) under the interferon-inducible promoter such as ISG54 in HEK293 cells that stably express transcriptional signal transducer and activator 2 (STAT2), interferon regulatory factor 9 (IRF9) and SEAP, using conventional methods. Another biological activity of IFNα and IFNw is the induction of chemokine production IP-10 (CXCL10) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or whole blood as described in the present invention.

[0048] O termo "vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser du plicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido entre esses sistemas. Polinucleotídeos vetores contêm tipicamente elementos, como as origens de replicação, sinais de poliadenilação ou marcadores de seleção, que funcionam para facilitar a duplicação ou manutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico. Exemplos desses sistemas biológicos podem incluir uma célula, vírus, animal, planta, e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotídeo que compreende um vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido das mesmas.[0048] The term "vector" means a polynucleotide capable of being duplicated within a biological system or which can be moved between such systems. Vector polynucleotides typically contain elements, such as origins of replication, polyadenylation signals, or selection markers, that function to facilitate the duplication or maintenance of these polynucleotides in a biological system. Examples of such biological systems may include a cell, virus, animal, plant, and reconstituted biological systems that utilize biological components capable of duplicating a vector. The polynucleotide comprising a vector can be DNA or RNA molecules or a hybrid thereof.

[0049] O termo "vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utilizado em um sistema biológico ou em um sistema biológico re-constituído para direcionar a translação de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo presente no vetor de expressão.[0049] The term "expression vector" means a vector that can be used in a biological system or in a reconstituted biological system to direct the translation of a polypeptide encoded by a polynucleotide sequence present in the expression vector.

[0050] O termo "polinucleotídeo" significa uma molécula que com preende uma cadeia de nucleotídeos ligados covalentemente por uma cadeia principal de açúcar-fosfato ou outra ligação química covalente equivalente. DNAs e RNAs de dupla-hélice e única-hélice são exemplos típicos de polinucleotídeos.[0050] The term "polynucleotide" means a molecule comprising a chain of nucleotides covalently linked by a sugar-phosphate backbone or other equivalent covalent chemical bond. Double-stranded and single-stranded DNAs and RNAs are typical examples of polynucleotides.

[0051] O termo "polipeptídeo" ou "proteína" significa uma molécula que compreende pelo menos dois resíduos de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica para formar um polipeptídeo. Pequenos po- lipeptídeos com menos de 50 aminoácidos podem ser chamados de "peptídeos".[0051] The term "polypeptide" or "protein" means a molecule comprising at least two amino acid residues linked by a peptide bond to form a polypeptide. Small polypeptides with less than 50 amino acids may be called "peptides".

[0052] Códigos de aminoácidos de uma letra e de três letras con vencionais são usados na presente invenção conforme mostrado na Tabela 1.[0052] Conventional one-letter and three-letter amino acid codes are used in the present invention as shown in Table 1.

Composições de substânciasSubstance compositions

[0053] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais que se ligam a, e neutralizam a atividade de interferon ômega humano (IFNw) e subtipos múltiplos de interferon alfa humano (IFNα) (IFNα/wanticorpos). A invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação de um epitopo neutralizante mínimo partilhada por IFNw e subtipos múltiplos de IFNα ao qual os anticorpos IFNα/w da invenção se ligam. Os anticorpos para IFNα/w da invenção são mais potentes nas preparações de neutralização relevantes para LES de assinaturas de IFN tipo I e IFN que os anticorpos neutralizantes de subtipos de IFNα, mas não de IFNw, e, portanto, podem ser mais eficazes no tratamento de qualquer doença que esteja associada com o aumento da produção de IFNα e IFNw, como doenças inflamatórias imunome- diadas. Como os anticorpos para IFNα/w da invenção não neutralizam IFNβ, podem ter perfis de segurança e FC mais favoráveis quando comparados com as terapias anti-IFNAR, que são esperadas bloquear todos os IFNs tipo I. "Anticorpos para IFNα/w", como usado na presente invenção, refere-se a anticorpos que se ligam e neutralizam INFw e múltiplos subtipos de IFNα como exemplificado na presente invenção.[0053] The present invention provides monoclonal antibodies that bind to and neutralize the activity of human omega interferon (IFNw) and multiple subtypes of human interferon alpha (IFNα) (IFNα/wantibodies). The invention is based, at least in part, on the identification of a minimal neutralizing epitope shared by IFNw and multiple subtypes of IFNα to which the IFNα/w antibodies of the invention bind. The IFNα/w antibodies of the invention are more potent in SLE-relevant neutralizing preparations of type I and IFN IFN signatures than antibodies neutralizing IFNα subtypes but not IFNw, and therefore may be more effective in treating any disease that is associated with increased IFNα and IFNw production, such as immune-mediated inflammatory diseases. As the IFNα/w antibodies of the invention do not neutralize IFNβ, they may have more favorable safety and PK profiles when compared to anti-IFNAR therapies, which are expected to block all type I IFNs.

[0054] Uma modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal que se liga e neutraliza a atividade do interferon ômega humano (IFNw) e pelo menos de quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humano (IFNα).[0054] One embodiment of the invention is a monoclonal antibody that binds to and neutralizes the activity of human omega interferon (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of human interferon alpha (IFNα).

[0055] Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos αIFNαB2, IFNαF, IFNαG e IFNαJ1. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG e IFNαJ1. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1 e IFNαA. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA e IFNαH2. Os anticorpos da invenção podem neutrali- zar os subtipos αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2 e IFNαK. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos α IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK e IFNαWA. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os subtipos α IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA IFNαH2, IFNαK, IFNαWA e IFNα4a.[0055] The antibodies of the invention can neutralize the subtypes αIFNαB2, IFNαF, IFNαG and IFNαJ1. Antibodies of the invention can neutralize αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG and IFNαJ1 subtypes. Antibodies of the invention can neutralize αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1 and IFNαA subtypes. Antibodies of the invention can neutralize αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA and IFNαH2 subtypes. The antibodies of the invention can neutralize the subtypes αIFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2 and IFNαK. The antibodies of the invention can neutralize the α subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK and IFNαWA. The antibodies of the invention can neutralize the α subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK, IFNαWA and IFNα4a.

[0056] Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto à sua capacidade de neutralizar IFNα e IFNw em um ensaio de gene repórter usando linhagens de células que expressam genes repórter sob um promotor responsivo a interferon, e estimular as células com vários subtipos de IFNα e/ou IFNw. Por exemplo, células HEK-Blue™ IFNα/β (Invivogen, San Diego, CA) modificadas para expressar uma via de sinalização de IFN tipo I totalmente ativa (que expressam esta- velmente STAT2 e IRF9) e transfectadas com um gene repórter SEAP sob o controle do promotor ISG54 induzível para IFNα/β podem ser usadas como descrito na presente invenção. O sinal de fosfatase alcalina pode ser detectado usando reagentes bem conhecidos e o sinal pode ser lido num espectrofotômetro, e um valor de IC50 pode ser calculado para a inibição usando métodos padrão.[0056] Antibodies of the invention can be tested for their ability to neutralize IFNα and IFNw in a reporter gene assay using cell lines that express reporter genes under an interferon-responsive promoter, and stimulate the cells with various subtypes of IFNα and/or IFNw. For example, HEK-Blue™ IFNα/β cells (Invivogen, San Diego, CA) engineered to express a fully active type I IFN signaling pathway (which stably express STAT2 and IRF9) and transfected with a SEAP reporter gene under the control of the IFNα/β inducible ISG54 promoter can be used as described in the present invention. The alkaline phosphatase signal can be detected using well known reagents and the signal can be read on a spectrophotometer, and an IC50 value can be calculated for inhibition using standard methods.

[0057] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção inibem a atividade do IFNw humano com um valor de IC50 de cerca de 5x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos ou cerca de 1x10-12 M ou menos, e inibe a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com um valor de IC50 de cerca de 5x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10- 9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos ou cerca de 1x10-12 M ou menos, quando a atividade de IFNw humano e subtipos de IFNα humano é a inibição da expressão de fos- fatase alcalina embrionária secretada (SEAP) sob o promotor ISG54 induzível para interferon em células HEK293 expressando estavelmen- te o transdutor de sinal e o ativador de transcrição 2 (STAT2), fator de regulação de interferon 9 (IRF9) e SEAP. Os anticorpos da invenção "neutralizam" IFNw e/ou qualquer subtipo de IFNα quando o valor de IC50 é de cerca de 5x10-8 ou menos, por exemplo cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, ou cerca de 1x10-12 M ou menos no "ensaio de gene repórter ISRE" como descrito na presente invenção no Exemplo 3.[0057] In one embodiment, antibodies of the invention inhibit human IFNw activity with an IC50 value of about 5x10-8 M or less, about 1x10-8 M or less, about 1x10-9 M or less, about 1x10-10 M or less, about 1x10-11 M or less, or about 1x10-12 M or less, and inhibit the activity of subtypes s of human IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG, or IFNαJ1 with an IC50 value of about 5x10-8 M or less, about 1x10-8 M or less, about 1x10-9 M or less, about 1x10-10 M or less, about 1x10-11 M or less, or about 1x10-12 M or less, when the activity of human IFNw and human IFNα subtypes is inhibition of expression of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) under the interferon-inducible ISG54 promoter in HEK293 cells stably expressing transcription signal transducer and activator 2 (STAT2), interferon regulatory factor 9 (IRF9) and SEAP. Antibodies of the invention "neutralize" IFNw and/or any IFNα subtype when the IC50 value is about 5x10-8 M or less, for example about 1x10-8 M or less, about 1x10-9 M or less, about 1x10-10 M or less, about 1x10-11 M or less, or about 1x10-12 M or less in the "gene assay" ISRE reporter" as described in the present invention in Example 3.

[0058] Os anticorpos da invenção também podem ser testados quanto à sua capacidade de neutralização de IFNα e IFNw avaliando a sua capacidade de inibir a liberação de citocina induzida por IFN, como liberação de IP-10 a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) induzidas por IFN ou de sangue inteiro. Por exemplo, as PBMC são isoladas de sangue inteiro heparinizado de voluntários saudáveis usando protocolos padrão, tratadas com um complexo pré-formado de IFN e o anticorpo a ser testado, e a liberação de IP-10 é medida usando métodos convencionais, tais como o kit Milliplex de citocina/quimiocina (Millipore, Premixed 39 plex). Anticorpos que neutralizam IFNα e IFNw podem inibir a liberação de IP-10 por pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, quando comparada à liberação de IP-10 induzida por IFN na ausência do anticorpo.[0058] Antibodies of the invention can also be tested for their ability to neutralize IFNα and IFNw by evaluating their ability to inhibit IFN-induced cytokine release such as IP-10 release from IFN-induced peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or whole blood. For example, PBMC are isolated from heparinized whole blood of healthy volunteers using standard protocols, treated with a preformed complex of IFN and the antibody to be tested, and IP-10 release is measured using conventional methods, such as the Milliplex cytokine/chemokine kit (Millipore, Premixed 39 plex). Antibodies that neutralize IFNα and IFNw can inhibit IP-10 release by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100%, when compared to IFN-induced IP-10 release in the absence of the antibody.

[0059] Os anticorpos da invenção podem se ligar e neutralizar pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de IFNα além de neutralizar o IFNw. Os subtipos de IFNα e IFNw podem ser produzidos por meio de expressão recombinante usando métodos convencionais. Sequências sinal exemplificadoras que podem ser usadas para direcionamento da secreção são mostradas na SEQ ID NOs: 17-21.[0059] The antibodies of the invention can bind and neutralize at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of IFNα in addition to neutralizing IFNw. IFNα and IFNw subtypes can be produced by recombinant expression using conventional methods. Exemplary signal sequences that can be used to target secretion are shown in SEQ ID NOs: 17-21.

[0060] Os anticorpos da invenção se ligam ao IFNw humano com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 5x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 5x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, cerca de 5x10-12 M ou menos ou cerca de 1x10-12 M ou menos, e se liga aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com um KD de cerca de 5x10-9 M ou menos, cerca de 1x10- 9 M ou menos, cerca de 5x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, cerca de 5x10-12 M ou menos, ou cerca de 1x10-12 M ou menos.[0060] Antibodies of the invention bind human IFNw with a dissociation constant (KD) of about 5x10-9 M or less, about 1x10-9 M or less, about 5x10-10 M or less, about 1x10-10 M or less, about 5x10-11 M or less, about 1x10-11 M or less, about 5x10-1 2 M or less or about 1x10-12 M or less, and binds to the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG, or IFNαJ1 with a KD of about 5x10-9 M or less, about 1x10-9 M or less, about 5x10-10 M or less, about 1x10-10 M or less, about 5x1 0-11 M or less, about 1x10-11 M or less, about 5x10-12 M or less, or about 1x10-12 M or less.

[0061] A afinidade de um anticorpo por IFNw ou subtipos de IFNα pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. Tais métodos podem usar instrumentação ProteOn XPR36, Biacore 3000 ou KinExA, ELISA ou testes de ligação competitiva conhecidos pelos versados na técnica. A afinidade medida de uma interação específica entre IFNw ou subtipos de IFNα pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Dessa forma, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com condições padronizadas e um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito. O versado na técnica vai entender que o erro interno das medições de afinidade, por exemplo, usando Biacore 3000 ou ProteOn (medido como desvio padrão, DP) pode tipicamente estar dentro de 5-33% para as medições dentro dos limites de detecção típicos. Portanto, o termo "cerca de" reflete o desvio padrão típico no ensaio. Por exemplo, o DP típico para uma KD de 1x10-9 M é de até ±0,33x10-9 M.[0061] The affinity of an antibody for IFNw or IFNα subtypes can be determined experimentally using any suitable method. Such methods may use ProteOn XPR36, Biacore 3000 or KinExA instrumentation, ELISA or competitive binding assays known to those skilled in the art. The measured affinity of a specific interaction between IFNw or IFNα subtypes can vary if measured under different conditions (eg osmolarity, pH). Therefore, measurements of affinity and other antigen-binding parameters (eg, KD, Kon, Koff) are preferably done with standardized conditions and a standardized buffer, such as the buffer described here. One skilled in the art will understand that the internal error of affinity measurements, for example using Biacore 3000 or ProteOn (measured as standard deviation, SD) can typically be within 5-33% for measurements within typical detection limits. Therefore, the term "about" reflects the typical standard deviation in the assay. For example, the typical DP for a 1x10-9 M KD is up to ±0.33x10-9 M.

[0062] Os anticorpos de ligação ao IFNw humano e subtipos de IFN α com um perfil de afinidade e neutralização desejado podem ser selecionados de bibliotecas de variantes ou fragmentos por imunoad- sorção com IFNw humano e subtipos de IFNα e opcionalmente por maturação adicional da afinidade do anticorpo. Em uma promoção de imunoadsorção exemplificadora, bibliotecas de fagos podem ser imu- noadsorvidas sequencialmente ou usando uma mistura de IFN w de chimpanzé e subtipos de IFNα humanos IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG e IFNαF. Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser preparados por imunização de camundongos com IFN w de chimpanzé e macacos cynomolgus, subtipos de IFNα humanos IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNα Um, IFNα4a, IFNαL, IFNαF, IFNαWA e IFNαI, e triagem dos hibriomas usando métodos padrão.[0062] Antibodies binding to human IFNw and IFNα subtypes with a desired affinity and neutralization profile can be selected from libraries of variants or fragments by immunoadsorption with human IFNw and IFNα subtypes and optionally by further antibody affinity maturation. In an exemplary immunoadsorption promotion, phage libraries can be immunoadsorbed sequentially or using a mixture of chimpanzee IFN w and human IFNα subtypes IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, and IFNαF. Alternatively, antibodies of the invention can be prepared by immunizing mice with IFN w from chimpanzee and cynomolgus monkeys, human IFNα subtypes IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNα Um, IFNα4a, IFNαL, IFNαF, IFNαWA and IFNαI, and screening the hi bryomes using standard methods.

[0063] Os anticorpos podem ser identificados com base na sua inibição da atividade biológica de IFNw e IFNα usando qualquer método adequado e os métodos descritos na presente invenção.[0063] Antibodies can be identified based on their inhibition of the biological activity of IFNw and IFNα using any suitable method and the methods described in the present invention.

[0064] Uma modalidade da invenção é um anticorpo monoclonal isolado que se liga e neutraliza a atividade do interferon ômega humano (IFNw) e pelo menos, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humanos (IFNα Subtipos), sendo que o anticorpo compete pela ligação ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo:[0064] One embodiment of the invention is an isolated monoclonal antibody that binds and neutralizes the activity of human omega interferon (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten human interferon alpha subtypes (IFNα Subtypes), wherein the antibody competes for binding to human IFNw and the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG or IFNαJ1 with an isolated antibody comprising:

[0065] uma sequência de aminoácidos da região variável da ca deia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou[0065] a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or

[0066] uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28.[0066] a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0067] A competição entre a ligação específica ao IFNw humano e os subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com os anticorpos da invenção compreendendo certas sequências de VH e VL podem ser testados in vitro usando métodos bem conhecidos. Por exemplo, a ligação do anticorpo marcado com MSD Sulfo-Tag™ NHS-éster ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 na presença de um anticorpo não marcado pode ser avaliada por ELISA, ou a análise Biacore ou a citometria de fluxo podem ser usadas para demonstrar a competição com os anticorpos da presente invenção. Alternativamente, ensaios de ligação competitiva isentos de marcador em tempo real usando Octet (ForteBio, Menlo Park, CA) podem ser usados como descrito na presente invenção. A capacidade de um anticorpo de teste inibir a ligação do anticorpo compreendendo a VH da SEQ ID NO: 23 e a VL da SEQ ID NO: 24 ou a VH da SEQ ID NO: 27 e a VL da SEQ ID NO: 28 ao IFN w humano e aos subtipos de IFN α humanos IFN α B2, IFN α F, IFN α G e/ou IFN α J1 demonstra que o anticorpo de teste compete com estes anticorpos pela ligação ao IFN w humano e aos subtipos de IFN α humanos IFN α B2, IFN α F, IFN α G e/ou IFN α J1.[0067] Competition between specific binding to human IFNw and the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with antibodies of the invention comprising certain VH and VL sequences can be tested in vitro using well known methods. For example, binding of MSD Sulfo-Tag™ NHS-ester labeled antibody to human IFNw and human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG or IFNαJ1 in the presence of an unlabeled antibody can be evaluated by ELISA, or Biacore analysis or flow cytometry can be used to demonstrate competition with antibodies of the present invention. Alternatively, real-time marker-free competitive binding assays using Octet (ForteBio, Menlo Park, CA) can be used as described in the present invention. The ability of a test antibody to inhibit the binding of antibody comprising the VH of SEQ ID NO: 23 and the VL of SEQ ID NO: 24 or the VH of SEQ ID NO: 27 and the VL of SEQ ID NO: 28 to human IFN w and the human IFN α subtypes IFN α B2, IFN α F, IFN α G and/or IFN α J1 demonstrates that the test antibody competes with these antibodies for binding to human IFN w and the human IFN α subtypes IFN α B2, IFN α F, IFN α G and/or IFN α J1.

[0068] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1.[0068] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1.

[0069] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga a IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19.[0069] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19.

[0070] Os resíduos F27, L30 e R33 em ambos IFNw e IFNα4a de finem um epitopo mínimo necessário para ampla atividade neutralizan- te dos anticoorpos para IFNα/w da invenção. A estrutura cristalina de vários complexos anticorpo/IFNα ou anticorpo/IFNw revelou os três resíduos que proporcionam contribuições predominantes para a ligação do anticorpo. O IFNα4a humano compartilha, ao menos, 83% de identidade com outros IFNαs humanos e 59% de identidade com o IFN whumano. O resíduo F27 é conservado em todos os IFNαs humanos, exceto o IFNαD (α1). F27 também é conservado no IFNw humano. Tanto L30 como R33 são conservados em todos os IFNαs humanos, bem como no IFNwhumano.[0070] Residues F27, L30 and R33 in both IFNw and IFNα4a define a minimum epitope necessary for broad neutralizing activity of the IFNα/w antibodies of the invention. The crystal structure of various antibody/IFNα or antibody/IFNw complexes revealed the three residues that provide predominant contributions to antibody binding. Human IFNα4a shares at least 83% identity with other human IFNαs and 59% identity with human IFNα. The F27 residue is conserved in all human IFNαs except IFNαD (α1). F27 is also conserved in human IFNw. Both L30 and R33 are conserved in all human IFNαs, as well as in human IFNw.

[0071] Em uma outra modalidade da invenção, o anticorpo mono clonal isolado da invenção que se liga e neutraliza a atividade do inter- feron ômega humano (IFNw) e ao menos de quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humano (IFNα) não se liga e não neutraliza o IFNαD.[0071] In another embodiment of the invention, the isolated monoclonal antibody of the invention that binds and neutralizes the activity of human interferon omega (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of human interferon alpha (IFNα) does not bind and does not neutralize IFNαD.

[0072] Os anticorpos da invenção que se ligam a resíduos especí ficos de IFNw e IFNα, podem ser produzidos pela imunização de camundongos expressando os loci de imunoglobulina humana (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, Patentes US n°s 5.770.429, 7.041.870 e 5.939.598) ou camundongos Balb/c com os peptídeos compreendendo os resíduos de contato do epitopo, por exemplo, um peptídeo tendo uma sequência de aminoáci- dos de uma alça AB de IFNw (resíduos de aminoácidos 22 a 34 do IFNw da SEQ ID NO:1) ou uma alça AB de IFNα4a (resíduos de ami- noácidos 22 a 34 do IFNα4a da SEQ ID NO: 19), ou uma mistura de IFNw e subtipos de IFNα conforme descrito aquie usando o método de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975. Os anticorpos resultantes são testados quanto à sua capacidade de competir com os anticorpos da presente invenção, como os anticorpos tendo a VH da SEQ ID NO: 23 e a VL da SEQ ID NO: 24 e testados quanto à sua ligação com o epitopo com o uso de métodos padrão. Por exemplo, quando as estruturas de ambos os componentes individuais são conhecidas, o acoplamento proteína-proteína in silico pode ser executado a fim de identificar sítios compatíveis de interação. A troca de hi- drogênio-deutério (H/D) pode ser executada com o complexo de anticorpo e antígeno a fim de mapear as regiões no antígeno que podem ser ligadas através do anticorpo. A mutagênese do ponto ou segmento do antígeno pode ser usada para localizar os aminoácidos importantes para a ligação de anticorpo. A estrutura cocristalina do complexo anti- corpo-antígeno pode ser usada para identificar resíduos que contribuem para o epitopo e o parátopo. Os mAbs identificados podem ser ainda modificados pela incorporação de resíduos de apoio de arcabouço alterados para preservar a afinidade de ligação, por técnicas como aquelas apresentadas em Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989 e Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991[0072] Antibodies of the invention that bind to specific residues of IFNw and IFNα can be produced by immunizing mice expressing human immunoglobulin loci (Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15 :146-56, 1997, US Patent Nos. 5,770,429, 7,041,870, and 5,939,598) or Balb/c mice with the peptides comprising the epitope contact residues, for example, a peptide having an amino acid sequence of an AB loop of IFNw (amino acid residues 22 to 34 of IFNw of SEQ ID NO:1) or an AB loop of IFNα4a (amino acid residues 22 to 34 of IFNα4a of SEQ ID NO:19), or a mixture of IFNw and IFNα subtypes as described here and using the hybridoma method of Kohler et al., Nature 256:495-97, 1975. The resulting antibodies are tested for their ability to compete. with the antibodies of the present invention, such as antibodies having the VH of SEQ ID NO: 23 and the VL of SEQ ID NO: 24 and tested for their binding to the epitope using standard methods. For example, when the structures of both individual components are known, in silico protein-protein coupling can be performed in order to identify compatible sites of interaction. Hydrogen-deuterium (H/D) exchange can be performed with the antibody and antigen complex in order to map the regions on the antigen that can be bound by the antibody. Antigen point or segment mutagenesis can be used to localize amino acids important for antibody binding. The cocrystalline structure of the antibody-antigen complex can be used to identify residues that contribute to the epitope and paratope. Identified mAbs can be further modified by incorporating altered framework support residues to preserve binding affinity, by techniques such as those set forth in Queen et al., Proc Natl Acad Sci (USA) 86:10029-32, 1989 and Hodgson et al., Bio/Technology 9:421, 1991

[0073] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNw em um ou mais resíduos F27, L30 e R33, e se liga adicionalmente, ao menos, a um resíduo de IFNw selecionado do grupo consistindo nos resíduos P26, K31 e R34 da SEQ ID: 1.[0073] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNw at one or more residues F27, L30 and R33, and additionally binds to at least one IFNw residue selected from the group consisting of residues P26, K31 and R34 of SEQ ID: 1.

[0074] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNw em um ou mais resíduos F27, L30 e R33, e se liga adicionalmente, ao menos, a um resíduo de IFNw selecionado do grupo consistindo nos resíduos R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 e L154 da SEQ ID: 1.[0074] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNw at one or more residues F27, L30 and R33, and additionally binds to at least one residue of IFNw selected from the group consisting of residues R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 and L154 of SEQ ID: 1.

[0075] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNw da SEQ ID NO: 1 em um ou mais resíduos R22, P26, F27, L30, K31, D32, R33, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 e L154.[0075] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNw of SEQ ID NO: 1 at one or more residues R22, P26, F27, L30, K31, D32, R33, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 and L154.

[0076] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNw da SEQ ID NO: 1 em um ou mais resíduos R23, I24, S25, P26, F27, L30, K31, R33, R34, M146, E147, K150 e M149.[0076] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNw of SEQ ID NO: 1 at one or more residues R23, I24, S25, P26, F27, L30, K31, R33, R34, M146, E147, K150 and M149.

[0077] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNα a um ou mais resíduos F27, L30 e R33, e se liga adicionalmente, ao menos, a um resíduo de IFNα4a selecionado do grupo consistindo nos resíduos H26, K31 e R34 da SEQ ID NO: 19.[0077] In another embodiment, the antibody of the invention binds IFNα to one or more residues F27, L30 and R33, and additionally binds to at least one residue of IFNα4a selected from the group consisting of residues H26, K31 and R34 of SEQ ID NO: 19.

[0078] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNα4a em um ou mais resíduos F27, L30 e R33, e se liga adicionalmente, ao menos, a um resíduo de IFNα4a selecionado do grupo consistindo nos resíduos A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 e S153 da SEQ ID NO: 19.[0078] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNα4a at one or more residues F27, L30 and R33, and additionally binds to at least one residue of IFNα4a selected from the group consisting of residues A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 and S153 of SEQ ID NO: 19.

[0079] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNα4a da SEQ ID NO: 19 em um ou mais resíduos A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 e S153 da SEQ ID NO: 19.[0079] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNα4a of SEQ ID NO: 19 at one or more residues A19, H26, F27, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 and S153 of SEQ ID NO: 19.

[0080] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção se liga ao IFNα4a da SEQ ID NO: 19 em um ou mais resíduos G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, R33, H34 V143, A146, E147 e R150 e S153 da SEQ ID NO: 19.[0080] In another embodiment, the antibody of the invention binds to IFNα4a of SEQ ID NO: 19 at one or more residues G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, R33, H34 V143, A146, E147 and R150 and S153 of SEQ ID NO: 19.

[0081] Em outras modalidades, os anticorpos da presente inven ção inibem a atividade do interferon leucocitário induzido por vírus.[0081] In other embodiments, the antibodies of the present invention inhibit virus-induced leukocyte interferon activity.

[0082] Em algumas modalidades, a atividade do interferon leucoci- tário induzido por vírus é a libertação de IP-10 no sangue total, induzida por 100 U/ml de interferon.[0082] In some embodiments, the virus-induced leukocyte interferon activity is the release of IP-10 in whole blood, induced by 100 U/ml of interferon.

[0083] Os anticorpos da invenção podem neutralizar o interferon produzido por leucócitos ativados, tal como avaliado pela sua capacidade de inibir a libertação de IP-10 no sangue total induzida por 100 U / ml de interferon conforme descrito aqui. Os anticorpos da invenção podem neutralizar os efeitos do interferon produzido por leucócitos ativados em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, na presença de 50 μg/ml de anticorpo.[0083] Antibodies of the invention can neutralize interferon produced by activated leukocytes, as judged by their ability to inhibit whole blood IP-10 release induced by 100 U/ml of interferon as described herein. Antibodies of the invention can neutralize the effects of interferon produced by activated leukocytes by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%, in the presence of 50 µg/ml of antibody.

[0084] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção ini bem a liberação de IP-10 no sangue total em mais de 50% na presença de 50 μg/ml de anticorpo.[0084] In some embodiments, antibodies of the invention inhibit the release of IP-10 in whole blood by more than 50% in the presence of 50 µg/ml of antibody.

[0085] Em outra modalidade, os anticorpos ou a invenção inibem a produção de IFN induzida pelo complexo imune de SLE. O complexo imune SLE representa o IFN do tipo I circulante presente no SLE. A produção de IFN pode ser medida usando o ensaio de gene repórter conforme descrito aqui.[0085] In another embodiment, the antibodies or the invention inhibit IFN production induced by the SLE immune complex. The SLE immune complex represents the circulating type I IFN present in SLE. IFN production can be measured using the reporter gene assay as described herein.

[0086] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção po- dem inibir a produção de interferon induzido pelo complexo imune de SLE em ao menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.[0086] In some embodiments, antibodies of the invention can inhibit SLE immune complex-induced interferon production by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.

[0087] Os anticorpos da invenção podem ser humanos, humaniza dos ou adaptados a humanos.[0087] The antibodies of the invention may be human, humanized or adapted to humans.

[0088] Os anticorpos da invenção podem ser do tipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Os anticorpos da invenção podem ser do tipo IIgG1, IgG2, IgG3, IgG4.[0088] The antibodies of the invention may be of the IgA, IgD, IgE, IgG or IgM type. The antibodies of the invention can be of type IIgG1, IgG2, IgG3, IgG4.

[0089] Outra modalidade da invenção é um anticorpo isolado com preendendo:[0089] Another embodiment of the invention is an isolated antibody comprising:

[0090] uma sequência de aminoácidos da região variável da ca deia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24;[0090] a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;

[0091] uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 25 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 26; ou[0091] a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 26; or

[0092] uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28.[0092] a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[0093] mAbs humanos desprovidos de quaisquer sequências não humanas podem ser preparados e aprimorados de bibliotecas de "apresentação de fago" ou meio das técnicas citadas em, por exemplo, Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; E Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84 2001. Em um método exemplificador, os anticorpos da invenção são isolados de bibliotecas que expressam regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos como proteínas de fusão com proteína de revestimento pIX de bacteriófago. As bibliotecas de anticorpos são selecionadas pela ligação ao IFNw humano e IFNα, e os clones positivos obtidos são adicionalmente caracterizados, os Fabs são isolados dos lisados do clone, e expressos como IgGs de comprimento total. Bibliotecas de anticorpo exemplificadoras e métodos de triagem são descritos em Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; publi- cação de patente internacional n° WO2009/085462, e US n° de série 12/546850; patente U.S. n°s 5.223.409, 5.969.108, e 5.885.793).[0093] Human mAbs lacking any non-human sequences can be prepared and improved from "phage display" libraries or by techniques cited in, for example, Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; E Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84 2001 . In an exemplary method, antibodies of the invention are isolated from libraries that express antibody heavy and light chain variable regions as fusion proteins with bacteriophage pIX coat protein. Antibody libraries are selected for binding to human IFNw and IFNα, and the positive clones obtained are further characterized, Fabs are isolated from clone lysates, and expressed as full-length IgGs. Exemplary antibody libraries and screening methods are described in Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010; International Patent Publication No. WO2009/085462, and US Serial No. 12/546850; US patent Nos. 5,223,409, 5,969,108, and 5,885,793).

[0094] Os mAbs resultantes podem ser modificados adicionalmen te em suas regiões de arcabouço para alterar certos resíduos de arcabouço para aqueles presentes em uma linhagem germinativa humana correspondente.[0094] The resulting mAbs can be further modified in their framework regions to change certain framework residues to those present in a corresponding human germline.

[0095] As propriedades de atuador imunológico dos anticorpos da invenção podem ser acentuadas ou silenciadas através de modificações Fc por técnicas conhecidas para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as funções efetoras de Fc como a ligação de C1q, cito- toxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação descendente de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas peo meio da modificação dos resíduos no Fc responsável por essas atividades. As propriedades farmacocinéticas também poderiam ser acentuadas pela mutação dos resíduos no domínio Fc que estendem a meia-vida do anticorpo (Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).[0095] The immune activating properties of the antibodies of the invention can be enhanced or silenced through Fc modifications by techniques known to those skilled in the art. For example, Fc effector functions like C1q binding, complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, down regulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor; BCR), etc. can be provided and/or controlled by modifying the residuals in the Fc responsible for these activities. Pharmacokinetic properties could also be enhanced by mutating residues in the Fc domain that extend the half-life of the antibody ( Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009 ).

[0096] Adicionalmente, os anticorpos da invenção podem ser mo dificados pós-traducionalmente por processos como glicosilação, iso- merização, deglicosilação ou modificação covalente de ocorrência não natural, como a adição de porções químicas de polietileno glicol (PEG) (peguilação) e lipidação. Tais modificações podem ocorrer in vivo ou in vitro. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser conjugados a polietileno glicol (PEGilados) para otimizar seus perfis farmacocinéti- cos. A conjugação pode ser realizada por técnicas conhecidas àqueles versados na técnica. Foi demonstrado que a conjugação de anticorpos terapêuticos com PEG acentua a farmacodinâmica enquanto não interfere com a função (Knighet al., Platelets 15:409-18, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001; Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003).Additionally, the antibodies of the invention can be post-translationally modified by processes such as glycosylation, isomerization, deglycosylation, or non-naturally occurring covalent modification, such as the addition of polyethylene glycol (PEG) chemical moieties (pegylation) and lipidation. Such modifications can occur in vivo or in vitro. For example, antibodies of the invention can be conjugated to polyethylene glycol (PEGylated) to optimize their pharmacokinetic profiles. Conjugation can be performed by techniques known to those skilled in the art. Conjugation of therapeutic antibodies with PEG has been shown to enhance pharmacodynamics while not interfering with function ( Knight et al., Platelets 15:409-18, 2004 ; Leong et al., Cytokine 16:106-19, 2001 ; Yang et al., Protein Eng 16:761-70, 2003 ).

[0097] Os anticorpos ou fragmentos dos mesmos da invenção mo dificados para otimizar a estabilidade, a seletividade, a reatividade cruzada, a afinidade, a imunogenicidade ou outras propriedades biológicas ou biofísicas desejadas são contidos no escopo da invenção. A estabilidade de um anticorpo é influenciada por inúmeros fatores, incluindo (1) o empacotamento do núcleo dos domínios individuais que afetam sua estabilidade intrínseca, (2) as interações de interface prote- ína/proteína que têm impacto no pareamento de HC e LC, (3) a disposição de resíduos polares e carregados, (4) a rede de ligação H a resíduos polares e carregados; e (5) a distribuição na superfície dos resíduos polares e carregados entre outras forças intra e intermoleculares (Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001). Resíduos com o potencial para desestabilizar estruturas podem ser identificados com base na estrutura cristalina do anticorpo ou através de modelagem molecular em determinados casos, e o efeito dos resíduos sobre a estabilidade do anticorpo pode ser testado através da geração e da avaliação de variantes que abrigam mutações nos resíduos identificados. Uma das maneiras de aumentar a estabilidade do anticorpo é elevar o ponto médio de transição térmica (Tm) conforme medido através de calorimetria de varredura diferencial (CVD). De modo geral, a Tm da proteína está correlacionada com a sua estabilidade e inversamente correlacionada com a sua suscetibilidade ao desdobramento e desnaturação em solução e aos processos de degradação que dependem da tendência da proteína a se desdobrar (Remmele et al., Biopharm 13:3646, 2000). Inúmeros estudos revelaram a correlação entre a classificação da estabilidade física das formulações medida como estabilidade térmica por calorimetria de varredura diferencial (DSC) e a estabilidade física medida por outros métodos (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004; Remmele et al., Pharm Res 15:200-8, 1997). Os estudos de formulação sugerem que uma Tm de Fab implica na estabilidade física de longo prazo de um mAb correspondente. As diferenças nos amino- ácidos no arcabouço ou dentro das CDRs poderiam ter efeitos significativos sobre a estabilidade térmica do domínio Fab (Yasui et al., FEBS Lett 353:143-6, 1994).[0097] Antibodies or fragments thereof of the invention modified to optimize stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desired biological or biophysical properties are contained within the scope of the invention. The stability of an antibody is influenced by numerous factors, including (1) the core packaging of individual domains that affect its intrinsic stability, (2) the protein/protein interface interactions that impact HC and LC pairing, (3) the arrangement of polar and charged residues, (4) the H-binding network for polar and charged residues; and (5) the surface distribution of polar and charged residues among other intra- and intermolecular forces ( Worn et al., J Mol Biol 305:989-1010, 2001 ). Residues with the potential to destabilize structures can be identified based on the crystal structure of the antibody or through molecular modeling in certain cases, and the effect of residues on antibody stability can be tested through the generation and evaluation of variants that harbor mutations in the identified residues. One of the ways to increase antibody stability is to raise the thermal transition midpoint (Tm) as measured by differential scanning calorimetry (CVD). In general, the Tm of the protein is correlated with its stability and inversely correlated with its susceptibility to unfolding and denaturing in solution and degradation processes that depend on the tendency of the protein to unfold (Remmele et al., Biopharm 13:3646, 2000). Numerous studies have revealed the correlation between the classification of the physical stability of formulations measured as thermal stability by differential scanning calorimetry (DSC) and the physical stability measured by other methods (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J Pharm Sci 93:3076-89, 2004; Maa et al., Int J Pharm 140:155-68, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm Res 21:1353-61, 2004; Remmele et al., Pharm Res 15:200-8, 1997). Formulation studies suggest that a Fab Tm implies the long-term physical stability of a corresponding mAb. Differences in amino acids in the framework or within the CDRs could have significant effects on the thermal stability of the Fab domain ( Yasui et al., FEBS Lett 353:143-6, 1994 ).

[0098] Os anticorpos para IFNα/w da invenção podem ser manipula dos em anticorpos biespecíficos que são também abrangidos dentro do escopo da invenção. As regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser manipuladas com o uso dos métodos publicados para formar anticorpos biespecíficos de cadeia única, como estruturas tal como os designs TandAb® (publicação de patente internacional n° WO1999/57150; Publicação de patente US n° US2011/0206672) ou scFVs biespecíficos como estruturas, como as reveladas na patente US n° US5869620; publicação de patente internacional n° WO1995/15388A, publicação de patente internacional n° WO1997/14719 ou publicação de patente internacional n° WO2011/036460.[0098] The IFNα/w antibodies of the invention can be engineered into bispecific antibodies which are also encompassed within the scope of the invention. The VL and/or VH regions of antibodies of the invention can be engineered using published methods to form bispecific single chain antibodies as frameworks such as TandAb® designs (International Patent Publication No. WO1999/57150; US Patent Publication No. US2011/0206672) or bispecific scFVs as frameworks such as those disclosed in US Patent No. US5869620; International Patent Publication No. WO1995/15388A, International Patent Publication No. WO1997/14719 or International Patent Publication No. WO2011/036460.

[0099] As regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser manipuladas para formar anticorpos biespecíficos de comprimento total, onde cada braço do anticorpo se liga a um antígeno ou epitopo distinto. Esses anticorpos biespecíficos são tipicamente produzidos através da modulação das interações CH3 entre as cadeias pesadas dos dois anticorpos para formar anticorpos biespecíficos com o uso de tecnologias, como descrito nas patentes US n° 7.695.936; publicação de patente internacional n° WO04/111233; publicação de patente US n° US2010/0015133; publicação de patente US n° US2007/0287170; publicação de patente internacional n° WO2008/119353; publicação de patente US n° US2009/0182127; publicação de patente US n° US2010/0286374; publicação de patente US n° US2011/0123532; publicação de patente internacional n° WO2011/131746; publicação de patente internacional n° WO2011/143545; ou publicação de patente US n° US2012/0149876. Estruturas adicionais biespecíficas às quais as regiões VL e/ou VH dos anticorpos da invenção podem ser incorporadas são, por exemplo, as Imunoglobulinas de Domínio Variável Dual (publicação de patente internacional n° WO2009/134776), ou estruturas que incluem vários domínios de dimerização para conectar os dois braços do anticorpo com especificidades diferentes, como os domínios do zíper da leucina ou de dimerização do colágeno (publicação de patente internacional n° WO2012/022811, patente US n° 5.932.448; patente US n° 6.833.441).[0099] The VL and/or VH regions of the antibodies of the invention can be engineered to form full-length bispecific antibodies, where each arm of the antibody binds to a distinct antigen or epitope. These bispecific antibodies are typically produced by modulating the CH3 interactions between the heavy chains of two antibodies to form bispecific antibodies using technologies such as described in US Pat. Nos. 7,695,936; International Patent Publication No. WO04/111233; US Patent Publication No. US2010/0015133; US Patent Publication No. US2007/0287170; International Patent Publication No. WO2008/119353; US Patent Publication No. US2009/0182127; US Patent Publication No. US2010/0286374; US Patent Publication No. US2011/0123532; International Patent Publication No. WO2011/131746; International Patent Publication No. WO2011/143545; or US Patent Publication No. US2012/0149876. Additional bispecific structures to which the VL and/or VH regions of the antibodies of the invention can be incorporated are, for example, Dual Variable Domain Immunoglobulins (International Patent Publication No. WO2009/134776), or structures that include several dimerization domains to connect the two arms of the antibody with different specificities, such as the leucine zipper or collagen dimerization domains (International Patent Publication No. WO2012/022811 , US Patent No. 5,932,448; US Patent No. 6,833,441).

[00100] Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer das regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo ou regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo ou fragmentos das mesmas da invenção ou seu complemento. Dada a degeneração do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão, polinucleotídeos que codificam os anticorpos antagonistas da invenção também estão abrangidos no escopo da invenção.[00100] Another aspect of the invention is an isolated polynucleotide encoding any of the antibody heavy chain variable regions or antibody light chain variable regions or fragments thereof of the invention or complement thereof. Given the degeneracy of the genetic code or codon preferences in a given expression system, polynucleotides encoding the antagonistic antibodies of the invention also fall within the scope of the invention.

[00101] Uma outra modalidade da invenção é um vetor compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Tais vetores podem ser vetores plasmidiais, vetores virais, vetores para expressão de baculovirus, vetores à base de transposon ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução dos polinucleotídeos da invenção em um dado organismo ou antecedente genético por quaisquer meios.[00101] Another embodiment of the invention is a vector comprising the polynucleotide of the invention. Such vectors may be plasmid vectors, viral vectors, baculovirus expression vectors, transposon-based vectors, or any other suitable vectors for introducing the polynucleotides of the invention into a given organism or genetic background by any means.

[00102] Uma outra modalidade da invenção é uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Tais células hospedeiras podem ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetais ou células de arquea. As células eucarióticas exemplificadoras podem ser de origem mamífera, de inseto, de aves ou de outra origem animal. As células eucarióticas de mamífero incluem linhagens celulares imortalizadas, como linhagens celulares de hibridoma ou mieloma, como linhagens celulares de murino SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC n° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) e Ag653 (ATCC CRL- 1580). Uma linhagem celular de mieloma humana exemplificadora é U266 (ATTC CRL-TIB-196). Outras linhagens celulares úteis incluem aquelas derivadas de células do ovário do hamster chinês (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD, EUA), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ou DG44.[00102] Another embodiment of the invention is a host cell comprising the polynucleotide of the invention. Such host cells can be eukaryotic cells, bacterial cells, plant cells or archaeal cells. Exemplary eukaryotic cells may be of mammalian, insect, avian or other animal origin. Mammalian eukaryotic cells include immortalized cell lines such as hybridoma or myeloma cell lines such as murine cell lines SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) and Ag6 53 (ATCC CRL-1580). An exemplary human myeloma cell line is U266 (ATTC CRL-TIB-196). Other useful cell lines include those derived from Chinese Hamster Ovary (CHO) cells such as CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD, USA), CHO-K1 (ATCC CRL-61) or DG44.

[00103] Outra modalidade da invenção é um método de produção de um anticorpo da invenção, compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira da invenção e a recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira. Os métodos de produção de anticorpos e de purificação dos mesmos são bem conhecidos na técnica.[00103] Another embodiment of the invention is a method of producing an antibody of the invention, comprising growing a host cell of the invention and recovering the antibody produced by the host cell. Methods of producing antibodies and purifying them are well known in the art.

[00104] Outra modalidade da invenção é um método de inibição da interação de IFNw e dos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNaF, IFNaG e/ou IFNαJ1, com IFNAR em um paciente que necessita do mesmo, incluindo a administração de um anticorpo isolado que compete pela ligação ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo: uma região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma VH da SEQ ID NO: 27 e uma VH da SEQ ID NO: 28 a um paciente durante tempo suficiente para evitar a interação de IFNw e dos subtipos de IFN α IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com IFNAR. A competição entre um anticorpo e IFNAR pode ser testada usando métodos padrão e aqueles aqui descritos com o uso, por exemplo, de porções extracelu- lares de IFNAR1 (SEQ ID NO: 31) e IFNAR2 (SEQ ID NO: 32) ou suas proteínas de fusão Fc.[00104] Another embodiment of the invention is a method of inhibiting the interaction of IFNw and the IFNα subtypes IFNαB2, IFNaF, IFNaG and/or IFNαJ1, with IFNAR in a patient in need thereof, including administering an isolated antibody that competes for binding to human IFNα and the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or I FNαJ1 with an isolated antibody comprising: a heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 24; or a VH of SEQ ID NO: 27 and a VH of SEQ ID NO: 28 to a patient long enough to prevent interaction of IFNw and the IFN α subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with IFNAR. Competition between an antibody and IFNAR can be tested using standard methods and those described herein using, for example, extracellular portions of IFNAR1 (SEQ ID NO: 31) and IFNAR2 (SEQ ID NO: 32) or their Fc fusion proteins.

Métodos de tratamentotreatment methods

[00105] Os anticorpos para IFNα/w da invenção podem ser utilizados para tratar ou prevenir qualquer doença que esteja associada com um aumento da produção de IFNα e IFNw. No método de invenção, qualquer anticorpo para IFNα/w da invenção pode ser usado. Em alternativa, qualquer anticorpo competindo pela ligação ao IFNw humano e aos sub- tipos de IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoá- cidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28 pode ser usado. Adicionalmente, qualquer anticorpo isolado que se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1 e IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19 pode ser usado.[00105] The IFNα/w antibodies of the invention can be used to treat or prevent any disease that is associated with an increased production of IFNα and IFNw. In the method of invention, any IFNα/w antibody of the invention can be used. Alternatively, any antibody competing for binding to human IFNw and IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with an isolated antibody comprising: a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 can be used. Additionally, any isolated antibody that binds IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1 and IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19 can be used.

[00106] Os métodos da invenção podem ser usados para tratar um paciente animal pertencente a qualquer classificação. Exemplos de tais animais incluem mamíferos como humanos, roedores, cães, gatos e animais da fazenda. Por exemplo, os anticorpos da invenção são úteis na profilaxia e no tratamento de doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune, como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I, psoríase, doença de Sjogren primária, esclerose sistêmica, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal (DII; Incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca), tireoidite inflamatória mediada pelo sistema imune e glomerulonefrite. Além disso, as composições de anticorpos da invenção podem ser usadas para inibir ou evitar a rejeição a transplantes ou no tratamento de doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD).[00106] The methods of the invention can be used to treat an animal patient belonging to any classification. Examples of such animals include mammals such as humans, rodents, dogs, cats and farm animals. For example, antibodies of the invention are useful in the prophylaxis and treatment of immune-mediated inflammatory diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE), type I diabetes, psoriasis, primary Sjogren's disease, systemic sclerosis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease (IBD; including Crohn's disease, ulcerative colitis, and celiac disease), immune-mediated inflammatory thyroiditis, and glomerulonephritis. Furthermore, the antibody compositions of the invention can be used to inhibit or prevent transplant rejection or in the treatment of graft versus host disease (GVHD).

[00107] Os anticorpos da invenção são úteis, também, na preparação de um medicamento para tal tratamento, sendo que o medicamento é preparado para administração nas dosagens aqui definidas.[00107] The antibodies of the invention are also useful in the preparation of a medicament for such treatment, the medicament being prepared for administration in the dosages defined herein.

[00108] Sem se ater à teoria, é sugerido que o SLE desencadeie, tal como complexos imunes, invocar respostas de IFN do tipo I, incluindo o IFNα e IFNw, mas não o IFNβ. Portanto, os anticorpos para IFNα/w da invenção podem proporcionar um tratamento para SLE mais eficaz inibindo amplamente estes IFNs do Tipo I patogênicos, enquanto poupa a função de IFNβ, que pode desempenhar um papel de importância mais crítica na defesa antiviral. Na presente invenção, anticorpos para IFNα/w amplamente neutralizantes têm sido gerados e um exclusivo epitopo neutralizante presente no IFNα e IFNw identificado, embora os desafios proporcionem a sugestão de que IFNα e IFNw sejam antigenicamente exclusivos (Adolf, J Gen Virol 68:16691676, 1987.[00108] Without being bound by theory, it is suggested that SLE triggers, like immune complexes, invoke type I IFN responses, including IFNα and IFNw, but not IFNβ. Therefore, the IFNα/w antibodies of the invention may provide a more effective treatment for SLE by largely inhibiting these pathogenic Type I IFNs, while sparing IFNβ function, which may play a more critically important role in antiviral defense. In the present invention, broadly neutralizing antibodies to IFNα/w have been generated and a unique neutralizing epitope present on IFNα and IFNw identified, although the challenges provide the suggestion that IFNα and IFNw are antigenically exclusive (Adolf, J Gen Virol 68:16691676, 1987.

[00109] A relação entre IFNα e SLE foi descrita pela primeira vez em 1979, quando foi demonstrado que esta citocina está elevada no soro de pacientes portadores de SLE (Hooks et al., N Engl J Med 301:5-8, 1979; Preble et al., Science 216:429-431, 1982). Mais recentemente, uma assinatura gênica de IFN do tipo I foi extensivamente descrita em um subconjunto de pacientes com SLE e foi relatado que a extensão da expressão da assinatura de IFN correlaciona-se positivamente com características clínicas e sorológicas da doença (Kara- georgas et al., J Biomed Biotechnol 273907, 2011; Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615, 2003; Bennett et al., J Exp Med 197:711-723, 2003; Dall'era et al., Ann Rheum Dis 64: 1692-1697, 2005; Niewold et al., Genes Immun 8: 492-502, 2007). Vários estudos de associação genética têm indicado um papel potencial para a via de IFN do tipo I na mediação de doença em alguns pacientes com lupus (Delgado-Vega et al., Arthritis Res Ther 12 Suppl 1 S2; Elkon e Stone; J Interferon Cytokine Res 11:803-812, 2011). Outros estudos têm revelado que o IFNα modula a expressão de um conjunto de produtos gê- nicos envolvidos com mecanismos patogênicos no SLE. Por exemplo, o IFNα pode induzir a expressão de BLyS, um importante fator de so-brevivência de células B, e também o alvo de Benlysta® (belimumab). Existe uma correlação positiva com a atividade de IFN do tipo I e os níveis de BLyS solúvel em pacientes portadores de SLE (Ritterhouse et al., Arthritis Rheum 63:3931-3941, 2011), e o bloqueio de IFNα em pacientes com SLE resultou em uma diminuição na expressão gênica de BLyS nas biópsias lesionais de pele de um pequeno número de pacientes com SLE onde tecido foi coletado (Yao et al., Arthritis Rheum 60:1785-1796, 2009). Em conjunto com a IL-6, foi também mostrado que IFNα é importante para a geração de plasmócitos secretores de Ig (Jego et al., Curr Dir autoimmune 8:124-139, 2005). Fora os efeitos diretos sobre o compartimento das células B, IFNα exibe efeitos sobre outros importantes mediadores da patogênese do lúpus. Blanco et al. demonstraram que o IFNα pode induzir a diferenciação de monócitos para DCs apresentadoras de antígenos (Blanco et al., Science 294:1540-1543, 2001). A neutralização do IFNα presente em amostras de soro de SLE diminuiu significativamente a capacidade do soro de SLE de induzir a diferenciação de monócitos a DC demonstrando um papel proeminente desta citocina na diminuição da tolerância a antíge- nos próprios, em alguns pacientes com SLE. A terapia com IFNα para indicações oncológicas ou infecciosas tem sido capaz de induzir doença similar a SLE em alguns pacientes, a qual regride após a terapia ser interrompida (Burdick et al., Expert Opin Drug Saf 8:459-472, 2009; Biggioggero et al., Autoimmunity 43:248-254, 2010).[00109] The relationship between IFNα and SLE was first described in 1979, when it was demonstrated that this cytokine is elevated in the serum of patients with SLE (Hooks et al., N Engl J Med 301:5-8, 1979; Preble et al., Science 216:429-431, 1982). More recently, a type I IFN gene signature has been extensively described in a subset of patients with SLE and the extent of IFN signature expression has been reported to positively correlate with clinical and serological features of the disease (Karageorgas et al., J Biomed Biotechnol 273907, 2011; Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:2610-2615, 2 003; Bennett et al., J Exp Med 197:711-723, 2003; Dall'era et al., Ann Rheum Dis 64: 1692-1697, 2005; Niewold et al., Immun Genes 8: 492-502, 2007). Several genetic association studies have indicated a potential role for the type I IFN pathway in mediating disease in some patients with lupus (Delgado-Vega et al., Arthritis Res Ther 12 Suppl 1 S2; Elkon and Stone; J Interferon Cytokine Res 11:803-812, 2011). Other studies have revealed that IFNα modulates the expression of a set of gene products involved with pathogenic mechanisms in SLE. For example, IFNα can induce the expression of BLyS, an important B-cell survival factor, and also the target of Benlysta® (belimumab). There is a positive correlation with type I IFN activity and soluble BLyS levels in patients with SLE (Ritterhouse et al., Arthritis Rheum 63:3931-3941, 2011), and IFNα blockade in SLE patients resulted in a decrease in BLyS gene expression in lesional skin biopsies from a small number of patients with SLE where tissue was collected (Yao et al., Art hritis Rheum 60:1785-1796, 2009). Along with IL-6, IFNα has also been shown to be important for the generation of Ig-secreting plasma cells ( Jego et al., Curr Dir autoimmune 8:124-139, 2005 ). In addition to direct effects on the B cell compartment, IFNα exhibits effects on other important mediators of lupus pathogenesis. Blanco et al. demonstrated that IFNα can induce differentiation of monocytes to antigen-presenting DCs ( Blanco et al., Science 294:1540-1543, 2001 ). Neutralization of IFNα present in SLE serum samples significantly decreased the ability of SLE serum to induce monocyte differentiation to DC demonstrating a prominent role for this cytokine in decreasing tolerance to self antigens in some patients with SLE. IFNα therapy for oncologic or infectious indications has been able to induce SLE-like disease in some patients, which regresses after therapy is discontinued (Burdick et al., Expert Opin Drug Saf 8:459-472, 2009; Biggioggero et al., Autoimmunity 43:248-254, 2010).

[00110] O IFN é rapidamente produzido em resposta a agentes infecciosos como vírus, para ajudar controlar a infecção. Acredita-se que autoanticorpos ligados aos ligantes de ácido nucleico são indutores predominantes do IFN do tipo I no SLE. A preponderância de autoanti- corpos em conjunto com uma depuração deficiente de autoantígenos leva a um ciclo de realimentação da produção de IFN onde a internali- zação dependente de receptor de Fc de complexos imunes em células dendríticas plasmocitoides (PDC) leva a um aumento das quantidades de IFN e, então, o estabelecimento da assinatura de IFN. Receptores de ácido nucleico, tais como os receptores do tipo toll (TLR) 7 e TLR9 são enriquecidos no compartimento endossomal de pDCs e considerados como sentinelas predominantes destes complexos imunes contendo o ácido nucleico iniciando uma cascata que leva à libertação de IFN do tipo I. Para esse fim, vários inibidores de TLR 7 e 9 estão em desenvolvimento clínico para o SLE.[00110] IFN is rapidly produced in response to infectious agents such as viruses to help control the infection. It is believed that autoantibodies linked to nucleic acid ligands are predominant inducers of type I IFN in SLE. The preponderance of autoantibodies in conjunction with impaired clearance of autoantigens leads to a feedback loop of IFN production where Fc receptor-dependent internalization of immune complexes in plasmacytoid dendritic cells (PDC) leads to increased amounts of IFN and thus the establishment of the IFN signature. Nucleic acid receptors such as toll-like receptors (TLR) 7 and TLR9 are enriched in the endosomal compartment of pDCs and considered to be the predominant sentinels of these immune complexes containing the nucleic acid initiating a cascade that leads to the release of type I IFN. To that end, several inhibitors of TLR 7 and 9 are in clinical development for SLE.

[00111] Ambos IFN α e IFN w estão elevados no SLE e podem induzir efeitos imunomodulatórios similares. O agonismo de TLR7 e TLR9 usando ligantes sintéticos (Gibson et al., Cell Immunol 218:7486, 2002) ou complexos imunes derivados de paciente com SLE (conforme descrito aqui) induziu tanto a proteína IFNα quanto IFNw Os transcritos de IFNw (Han et al., Genes Immun 4:177-186, 2003) e a proteína (dados não mostrados) são regulados positivamente em pacientes com SLE.[00111] Both IFN α and IFN w are elevated in SLE and can induce similar immunomodulatory effects. TLR7 and TLR9 agonism using synthetic ligands (Gibson et al., Cell Immunol 218:7486, 2002) or SLE patient-derived immune complexes (as described herein) induced both IFNα and IFNw protein. shown) are up-regulated in patients with SLE.

[00112] Os autoanticorpos contra IFN do tipo I também são encontrados em pacientes com SLE, possivelmente como resultado de IFN elevado nestes pacientes, juntamente com um excesso de resposta imunológica humoral exuberante. Foi encontrado que autoanticorpos contra IFNw são mais prevalentes do que aqueles contra o IFNα nas coortes de SLE analisadas, apenas vestígios de autoanticorpos contra IFNβ foram detectados (Slavikova et al., J Interferon Cytokine Res 23:143-147, 2003). As atividades gerais conferidas por IFN w assemelham-se aos efeitos de IFNα, sugerindo que o IFNw elevado em pacientes com SLE pode contribuir para a patogênese da doença (Adolf et al., J Biol Chem 265:9290-9295, 1990; Adolf, Mult Scler 1 Suppl 1:S44- 47, 1995; Kubes et al., J Interferon Res 14:57-59, 1994; Tiefenthaler et al., J Interferon Cytokine Res 17:327-329, 1997). A presença e o papel do IFNβ no SLE são menos certos. A neutralização específica de IFNα com o uso de soros de paciente com SLE como estímulos,resultou em uma redução substancial da atividade de IFN do tipo I, enquanto a neutralização de IFNβ conferiu efeitos insignificantes co o uso das amostras de soro do paciente testadas, sugerindo o envolvimento mínimo do IFNβ na patogênese da doença (Hua et al., Arthritis Rheum 54:1906-1916, 2006).[00112] Type I IFN autoantibodies are also found in patients with SLE, possibly as a result of elevated IFN in these patients along with an exuberant humoral excess immune response. Autoantibodies against IFNw were found to be more prevalent than those against IFNα in the SLE cohorts analyzed, only trace amounts of autoantibodies against IFNβ were detected ( Slavikova et al., J Interferon Cytokine Res 23:143-147, 2003 ). The general activities conferred by IFN w resemble the effects of IFNα, suggesting that elevated IFNw in patients with SLE may contribute to the pathogenesis of the disease (Adolf et al., J Biol Chem 265:9290-9295, 1990; Adolf, Mult Scler 1 Suppl 1:S44-47, 1995; Kubes et al., J Interferon Res 1 4:57-59, 1994; Tiefenthaler et al., J Interferon Cytokine Res 17:327-329, 1997). The presence and role of IFNβ in SLE is less certain. Specific neutralization of IFNα using SLE patient sera as stimuli resulted in a substantial reduction in type I IFN activity, while IFNβ neutralization conferred negligible effects using the patient serum samples tested, suggesting minimal involvement of IFNβ in disease pathogenesis (Hua et al., Arthritis Rheum 54:1906-1916, 2006).

[00113] As abordagens antagonistas atuais de IFN do tipo I em de-senvolvimento clínico estão focadas na neutralização de um espectro de subtipos de IFN α e não outros IFNs do tipo I (β, ε, K, W), na neutralização da cadeia IFNAR1 do receptor de interferon bloqueando, dessa forma, a transdução de sinal de todos os IFN do tipo I, ou utilizando abordagens de vacinação específica para IFNα (Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Zagury et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:5294-5299, 2009). Em testes clínicos, anticorpos anti-IFNα em pacientes com SLE demonstraram uma redução parcial da assinatura do IFN do tipo I em pacientes exibindo a assinatura de IFN e ligeira eficácia na análise exploratória (Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:19051913, 2011). Em estudos de Fase 2, o tratamento com anti-INFα na ausência de imunosupressores foi associado com a melhora nos sinais e sintomas de SLE, em taxas de exacerbação, e sobrecarga de este- roides na semana 24 em um grupo definido com biomarcador pré- especificado de indivíduos com lúpus de baixa moderada a severamente ativa Métrica de Assinatura de Interferon (ISM). De forma interessante, nenhuma eficácia foi observada em pacientes predefinido como ISM- Alta (Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).[00113] Current type I IFN antagonist approaches in clinical development are focused on neutralizing a spectrum of IFN α subtypes and not other type I IFNs (β, ε, K, W), neutralizing the IFNAR1 chain of the interferon receptor, thereby blocking the signal transduction of all type I IFNs, or using IFNα-specific vaccination approaches (Merrill et al. , Ann Rheum Dis 70:1905-1913, 2011; Zagury et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:5294-5299, 2009). In clinical trials, anti-IFNα antibodies in SLE patients demonstrated a partial reduction of the type I IFN signature in patients exhibiting the IFN signature and slight efficacy in exploratory analysis ( Merrill et al., Ann Rheum Dis 70:19051913, 2011 ). In Phase 2 studies, anti-INFα treatment in the absence of immunosuppressants was associated with improvement in signs and symptoms of SLE, in exacerbation rates, and steroid overload at week 24 in a prespecified biomarker-defined group of individuals with lupus with moderately to severely active low Interferon Signature Metric (ISM). Interestingly, no efficacy was observed in patients predefined as ISM-High (Kalunian et al., 2012 ACR/ARHP Annual Meeting; Abstract # 2622, 2012).

[00114] O anticorpo monoclonal contra IFNAR1 seria preditor da abolição da sinalização de IFN induzida por todos os IFNs do tipo I, incluindo IFNβ. Apesar da falta de dados para apoiar um papel signifi- cativo de IFNβ na patogênese do SLE, o IFNβ pode desempenhar um papel de importância mais crítica na defesa antiviral. A deleção específica do gene que codifica o IFNβ acarreta substancial susceptibilidade a uma série de vírus quando comparados aos camundongos da mesma forma expostos tendo IFNβ funcional (Lazear et al., J Virol 85:7186-94; Deonarain et al., J Virol 74:3403-09, 2000; Deonarain et al., Circulation 110:3540-3543, 2004; Gerlach et al., J Virol 80:34383444, 2006; Koerner et al., J Virol 81:2025-2030, 2007).[00114] The monoclonal antibody against IFNAR1 would be predictive of the abolition of IFN signaling induced by all type I IFNs, including IFNβ. Despite the lack of data to support a significant role for IFNβ in the pathogenesis of SLE, IFNβ may play a more critically important role in antiviral defense. Specific deletion of the gene encoding IFNβ entails substantial susceptibility to a number of viruses when compared to similarly exposed mice having functional IFNβ (Lazear et al., J Virol 85:7186-94; Deonarain et al., J Virol 74:3403-09, 2000; Deonarain et al., Circulation 110:3540-3543, 2004; Gerlach et al., J Virol 80:34383444, 2006; Koerner et al., J Virol 81:2025-2030, 2007).

[00115] Uma modalidade da invenção é um método para tratamento ou prevenção de uma doença associada com um aumento da produção de IFNα e IFNw, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo isolado que se liga e neutraliza atividade do interferon ômega humano (IFNw) e, ao menos, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humano (IFNα), ou um anticorpo que compete pela ligação ao IFN w humano e subtipos de IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1, com um anticorpo isolado compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28 a um paciente com necessidade do mesmo durante tempo suficiente para tratar ou evitar a doença.[00115] One embodiment of the invention is a method for treating or preventing a disease associated with increased production of IFNα and IFNw, comprising administering a therapeutically effective amount of an isolated antibody that binds to and neutralizes the activity of human omega interferon (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of human interferon alpha (IFNα), or an antibody that competes for binding to human IFNw and I subtypes FNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG or IFNαJ1, with an isolated antibody comprising: a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 to a patient in need thereof long enough to treat or prevent disease.

[00116] Outra modalidade da invenção é um método de evitar a interação de IFNw e dos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com IFNAR em um paciente que necessite do mesmo, compreendendo a administração de um anticorpo isolado que se liga e neutraliza atividade do interferon ômega humano (IFNw) e, ao menos, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humano (IFNα), ou um anticorpo que compete pela ligação ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1, com um anticorpo isolado compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoá- cidos de VL da SEQ ID NO: 28 a um paciente durante tempo suficiente para evitar a interação de IFNw e dos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNaF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com IFNAR.[00116] Another embodiment of the invention is a method of preventing the interaction of IFNw and IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG or IFNαJ1 with IFNAR in a patient in need thereof, comprising the administration of an isolated antibody that binds and neutralizes the activity of human interferon omega (IFNw) and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of interferon alpha human (IFNα), or an antibody which competes for binding to human IFNw and the IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1, with an isolated antibody comprising: a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or a VH amino acid sequence from SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence from SEQ ID NO: 28 to a patient long enough to prevent interaction of IFNw and the IFNα subtypes IFNαB2, IFNaF, IFNαG and/or IFNαJ1 with IFNAR.

[00117] Em outras modalidades, o anticorpo que pode ser usado nos métodos da invenção compreende um anticorpo que se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1 e IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19.[00117] In other embodiments, the antibody that can be used in the methods of the invention comprises an antibody that binds to IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1 and IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19.

[00118] Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto a sua eficácia em modelos animais de lúpus, que incluem cepas camundongos propensos a lúpus e camundongos em que fenótipos similares ao de lúpus são induzidos ou acelerados utilizando vários agentes (Perry, et al., J Biomed Biotechnol, 2011:271694, 2011. Por exemplo, camundongos NZB/NZW F1 exibem uma doença dependente do tempo e influência do gênero feminino, tendo várias características do lúpus humano incluindo glomerulonefrite. Como múltiplos e distintos subtipos de IFNα são produzidos em camundongo quando comparado aos humanos (van Pesch, et al., J Virol, 78:8219-28, 2004) e a falta de expressão de IFNw em camundongo, testes in vitro em células relevantes para a doença com o uso de preparações de IFN relevantes para a doença podem ser usados para avaliar a eficácia e o potencial de modificação da doença dos anticorpos da invenção. Tais ensaios in vitro sã, por exemplo, a avaliação da inibição da produção de IFN induzida pelo complexo imune de SLE no sangue total, ou a avaliação da capacidade dos anticorpos de reduzir a assinatura de IFN, conforme descrito aqui.[00118] Antibodies of the invention can be tested for their efficacy in animal models of lupus, which include lupus-prone mouse strains and mice in which lupus-like phenotypes are induced or accelerated using various agents (Perry, et al., J Biomed Biotechnol, 2011:271694, 2011. For example, NZB/NZW F1 mice exhibit a dependent disease of time and female gender influence, having several features of human lupus including glomerulonephritis. Because multiple and distinct subtypes of IFNα are produced in mice compared to humans (van Pesch, et al., J Virol, 78:8219-28, 2004) and the lack of IFNw expression in mice, in vitro testing on disease-relevant cells using disease-relevant IFN preparations can be used to assess efficacy and the disease modifying potential of the antibodies of the invention Such in vitro assays are, for example, the evaluation of inhibition of IFN production induced by the SLE immune complex in whole blood, or the evaluation of the ability of antibodies to reduce the IFN signature, as described herein.

[00119] Os domínios VH e VL dos anticorpos para IFNα/w da invenção podem ser incorporados em anticorpos biespecíficos e nas moléculas aqui descritas, nas quais o anticorpo biespecífico se liga especificamente e neutraliza o IFNw e, ao menos, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dos subtipos de interferon alfa humano (IFNα), por exemplo IFNαB2, IFNαF, IFNαG e IFNαJ1, e um segundo antígeno tal como BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, família 4 de domínio de lectina do tipo C, membro C), ou a subunidade p40 de IL- 12 e IL-23. Alternativamente, os domínios VH e VL de qualquer anticorpo competindo pela ligação ao IFNw humano e aos subtipos de IFNα IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo: uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoáci- dos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28 podem ser usados. Adicionalmente, os domínios VH e VL de qualquer anticorpo isolado que se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1 e IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19 podem ser usados.[00119] The VH and VL domains of the IFNα/w antibodies of the invention can be incorporated into bispecific antibodies and molecules described herein, in which the bispecific antibody specifically binds and neutralizes IFNw and at least four, five, six, seven, eight, nine or ten of the subtypes of human interferon alpha (IFNα), for example IFNαB2, IFNαF, IFNαG and IFNαJ1, and a second antigen such as BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, C-type lectin domain family 4, member C), or the p40 subunit of IL-12 and IL-23. Alternatively, the VH and VL domains of any antibody competing for binding to human IFNw and IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with an isolated antibody comprising: a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 24; or a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 can be used. Additionally, the VH and VL domains of any isolated antibody that binds IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1 and IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19 can be used.

[00120] Anticorpos que se ligam a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, família 4 de domínio de lectina do tipo C, membro C) ou à subunidade p40 de IL-12 e IL-23 podem ser gerados usando os métodos aqui descritos, como imunização de camundongos expressando os loci da imunoglobulina humana(Lonberg et al., Nature 368:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, patentes US n°s 5.770.429, 7.041.870 e 5.939.598) ou camundongos Balb/c com as proteínas ou domínios extracelulares correspondentes das proteínas, ou com o uso de bibliotecas de apresentação de fago conforme des- crito aqui. Alternativamente, os anticorpos existentes para BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, família 4 de domínio de lectina do tipo C, membro C) ou a subunidade p40 de IL-12 e IL-23 podem ser usados para gerar as moléculas biespecíficas.[00120] Antibodies that bind to BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, C-type lectin domain family 4, member C) or the p40 subunit of IL-12 and IL-23 can be generated using the methods described herein, such as immunization of mice expressing the human immunoglobulin loci(Lonberg et al., Nature 36 8:856-9, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-56, 1997, US Patent Nos. 5,770,429, 7,041,870, and 5,939,598) or Balb/c mice with the extra proteins or domains corresponding cellular expressions of the proteins, or with the use of phage display libraries as described herein. Alternatively, existing antibodies to BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 (CLEC4C, C-type lectin domain family 4, member C) or the p40 subunit of IL-12 and IL-23 can be used to generate the bispecific molecules.

Administração/composições farmacêuticasPharmaceutical administration/compositions

[00121] A "quantidade terapeuticamente eficaz" de anticorpos para IFNα/w da presente invenção eficazes no tratamento de condições associadas com um aumento da produção de IFNα e IFNw pode ser determinada por técnicas de pesquisa padrão. Por exemplo, a dosagem de anticorpos para IFNα/w da invenção que será eficaz no tratamento de doenças inflamatórias mediadas pelo sistema imune, como o SLE, pode ser determinada por meio da administração dos anticorpos para IFNα/w a modelos animais relevantes bem conhecidos na técnica.[00121] The "therapeutically effective amount" of IFNα/w antibodies of the present invention effective in treating conditions associated with an increased production of IFNα and IFNw can be determined by standard screening techniques. For example, the dosage of IFNα/w antibodies of the invention that will be effective in treating immune-mediated inflammatory diseases such as SLE can be determined by administering the IFNα/w antibodies to relevant animal models well known in the art.

[00122] Testes in vitro podem, opcionalmente, ser empregados para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem. A seleção de uma dosagem eficaz particular pode ser determinada (por exemplo, através de testes clínicos) por versados na técnica, com base na consideração de vários fatores. Tais fatores incluem a doença a ser tratada ou evitada, os sintomas envolvidos, a massa corpórea do paciente, o estado imune do paciente e outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica. A dosagem que precisa ser empregada na formulação também irá depender da via de administração e da severidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta à dosagem, derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro. Os anticorpos da invenção podem ser testados quanto a sua eficácia e dosagem eficaz com o uso de qualquer um dos modelos descritos aqui.[00122] In vitro tests can optionally be used to help identify optimal dosage ranges. Selection of a particular effective dosage can be determined (eg, through clinical trials) by those skilled in the art, based on consideration of various factors. Such factors include the disease to be treated or prevented, the symptoms involved, the patient's body mass, the patient's immune status, and other factors known to those skilled in the art. The dosage that needs to be employed in the formulation will also depend on the route of administration and the severity of the disease, and must be decided according to the judgment of the professional and the circumstances of each patient. Effective dosages can be extrapolated from dose-response curves derived from animal model or in vitro test systems. Antibodies of the invention can be tested for efficacy and effective dosage using any of the models described herein.

[00123] O modo de administração para uso terapêutico do anticorpo da invenção pode ser qualquer via adequada que distribui o agente ao hospedeiro. As composições farmacêuticas desses anticorpos são par-ticularmente úteis para a administração parenteral, por exemplo, intra- dérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea ou intranasal.[00123] The mode of administration for therapeutic use of the antibody of the invention can be any suitable route that delivers the agent to the host. Pharmaceutical compositions of such antibodies are particularly useful for parenteral administration, for example, intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously or intranasally.

[00124] O anticorpo da invenção pode ser preparado como uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz do agente, como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipien- te ou veículo com o qual o composto ativo é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, isentas de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas (por exemplo, fil-tração). As composições podem conter substâncias auxiliares farma- ceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas, como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração do anticorpo da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos de cerca de 0,5%, usualmente ou pelo menos cerca de 1%, até 15 ou 20%, em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo específico de administração selecionado.[00124] The antibody of the invention can be prepared as a pharmaceutical composition that contains an effective amount of the agent, as an active ingredient in a pharmaceutically acceptable vehicle. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the active compound is administered. Such pharmaceutical carriers can be liquids, such as water and oils, including those derived from petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. For example, 0.4% saline and 0.3% glycine can be used. These solutions are sterile and generally free of particulate matter. They can be sterilized by conventional well known sterilization techniques (eg filtration). The compositions may contain pharmaceutically acceptable auxiliary substances as required to approximate physiological conditions, such as buffering and pH adjusting agents, stabilizers, thickeners, lubricants and colorants, and the like. The concentration of the antibody of the invention in such a pharmaceutical formulation can vary widely, i.e., from less than about 0.5%, usually at least about 1%, up to 15 or 20%, by weight, and will be selected primarily on the basis of the required dosage, fluid volume, viscosities, etc., according to the specific mode of administration selected.

[00125] Deste modo, uma composição farmacêutica da invenção para injeção intramuscular poderia ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril, e entre cerca de 1 ng a cerca 100 mg, por exemplo, cerca de 50 ng a cerca de 30 mg ou, com mais preferência, de cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, de um anticorpo da invenção. De maneira similar, uma composição farmacêutica da invenção para infusão intravenosa poderia ser preparada para conter cerca de 250 ml de solução de Ringer estéril, e cerca de 1 mg a cerca de 30 mg e, de preferência, 5 mg a cerca de 25 mg de um antagonista da invenção. Os métodos atuais para preparar as composições parenteralmente administráveis são bem conhecidos e são descritos em mais detalhes em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", 15a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA.[00125] Thus, a pharmaceutical composition of the invention for intramuscular injection could be prepared to contain 1 ml of sterile buffered water, and between about 1 ng to about 100 mg, for example, about 50 ng to about 30 mg, or more preferably, from about 5 mg to about 25 mg, of an antibody of the invention. Similarly, a pharmaceutical composition of the invention for intravenous infusion could be prepared to contain about 250 ml of sterile Ringer's solution, and about 1 mg to about 30 mg, and preferably 5 mg to about 25 mg, of an antagonist of the invention. Current methods for preparing parenterally administrable compositions are well known and are described in more detail in, for example, "Remington's Pharmaceutical Science", 15th edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.

[00126] Os anticorpos da invenção podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos em um veículo adequado antes do uso. Esta técnica mostrou-se eficaz com imunoglobulinas convencionais e em preparações de proteínas e as técnicas de reconstituição e de liofi- lização conhecidas na técnica podem ser empregadas.[00126] The antibodies of the invention can be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable vehicle before use. This technique has been shown to be effective with conventional immunoglobulins and in protein preparations, and reconstitution and lyophilization techniques known in the art can be employed.

Modalidades adicionais da invençãoAdditional embodiments of the invention

[00127] A seguir são numeradas certas modalidades adicionais da invenção de acordo com as revelações em outras partes da presente invenção. As características das modalidades da invenção definidas acima,referem-se também a cada uma destas modalidades adicionais enumeradas.[00127] Below are numbered certain additional embodiments of the invention in accordance with the disclosures in other parts of the present invention. The characteristics of the embodiments of the invention defined above also refer to each of these additional embodiments listed.

[00128] 1) O anticorpo monoclonal isolado que se liga e neutraliza a atividade do(a) interferon ômega humano (IFNw) e (b) ao menos de quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez subtipos de interferon alfa humano (IFNα).[00128] 1) Isolated monoclonal antibody that binds to and neutralizes the activity of (a) human omega interferon (IFNw) and (b) at least four, five, six, seven, eight, nine or ten subtypes of human interferon alpha (IFNα).

[00129] 2) O anticorpo, de acordo com a modalidade 1, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαF, IFNαG e IFNαJ1.[00129] 2) The antibody, according to embodiment 1, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and IFNαJ1.

[00130] 3) O anticorpo, de acordo com a modalidade 1 ou 2, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG e IFNαJ1.[00130] 3) The antibody, according to modality 1 or 2, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG and IFNαJ1.

[00131] 4) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 3, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1 e IFNαA.[00131] 4) The antibody according to any one of embodiments 1 to 3, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1 and IFNαA.

[00132] 5) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 4, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA e IFNαH2.[00132] 5) The antibody according to any one of embodiments 1 to 4, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA and IFNαH2.

[00133] 6) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 5, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2 e IFNαK.[00133] 6) The antibody according to any one of embodiments 1 to 5, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2 and IFNαK.

[00134] 7) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 6, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK e IFNαWA.[00134] 7) The antibody according to any one of embodiments 1 to 6, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK and IFNαWA.

[00135] 8) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 7, sendo que o anticorpo se liga e neutraliza a atividade dos subtipos de IFNα humano IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA IFNαH2, IFNαK, IFNαWA e IFNα4a.8) The antibody according to any one of embodiments 1 to 7, wherein the antibody binds and neutralizes the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαJ1, IFNαA, IFNαH2, IFNαK, IFNαWA and IFNα4a.

[00136] 9) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 8, sendo que a atividade do IFNw humano e dos subtipos de IFNα humano é a inibição da expressão da fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP) sob o promotor induzível por interferon ISG54 em células HEK293, que expressam de maneira estável o transdutor de sinal e ativador de transcrição 2 (STAT2), o fator regulador de interferon 9 (IRF9) e a SEAP.[00136] 9) The antibody according to any one of embodiments 1 to 8, wherein the activity of human IFNw and human IFNα subtypes is the inhibition of expression of secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) under the interferon-inducible promoter ISG54 in HEK293 cells, which stably express the signal transducer and activator of transcription 2 (STAT2), the regulatory factor of interferon 9 (IRF9) and SEAP.

[00137] 10) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 9, sendo que o anticorpo inibe a atividade do IFNw humano com um valor de IC50 de cerca de 5x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos ou cerca de 1x10-12 M ou menos, e inibe a atividade dos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com um valor de IC50 de cerca de 5x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-8 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos ou cerca de 1x10-12 M ou menos, sob as condições definidas no Exemplo 3, na seção "medições de afinidade".[00137] 10) The antibody according to any one of embodiments 1 to 9, wherein the antibody inhibits human IFNw activity with an IC50 value of about 5x10 -8 M or less, about 1x10 -8 M or less, about 1x10 -9 M or less, about 1x10 -10 M or less, about 1x10 -11 M or less or about 1x10-12 M or less, and inhibits the activity of the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG, or IFNαJ1 with an IC50 value of about 5x10-8 M or less, about 1x10-8 M or less, about 1x10-9 M or less, about 1x10-10 M or less, about 1x10-11 M or less or about 1x10 -12 M or less under the conditions defined in Example 3 in the "Affinity Measurements" section.

[00138] 11) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 10, sendo que o anticorpo se liga ao IFNw humano com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 5x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 5x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, cerca de 5x10-12 M ou menos ou cerca de 5x10-12 M ou menos se liga aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG ou IFNαJ1 com uma KD de cerca de 5x10-9 M ou menos, cerca de 1x10-9 M ou menos, cerca de 5x10-10 M ou menos, cerca de 1x10-10 M ou menos, cerca de 5x10-11 M ou menos, cerca de 1x10-11 M ou menos, cerca de 5x10-12 M ou menos ou cerca de 5x10-12 M ou menos, sendo que a KD é medida usando as condições exemplificadas no Exemplo 3 na seção "medições de afinidade".[00138] 11) The antibody according to any one of embodiments 1 to 10, wherein the antibody binds human IFNw with a dissociation constant (KD) of about 5x10 -9 M or less, about 1x10 -9 M or less, about 5x10 -10 M or less, about 1x10 -10 M or less, about 5x10 -11 M or less , about 1x10-11 M or less, about 5x10-12 M or less, or about 5x10-12 M or less binds to the human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG, or IFNαJ1 with a KD of about 5x10-9 M or less, about 1x10-9 M or less, about 5x10-10 M or less , about 1x10-10 M or less, about 5x10-11 M or less, about 1x10-11 M or less, about 5x10-12 M or less, or about 5x10-12 M or less, where the KD is measured using the conditions exemplified in Example 3 in the "Affinity Measurements" section.

[00139] 12) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 11, sendo que o anticorpo compete pela ligação ao IFN w humano e aos subtipos de IFNα humanos IFNαB2, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com um anticorpo isolado compreendendo:[00139] 12) The antibody according to any one of embodiments 1 to 11, wherein the antibody competes for binding to human IFN w and human IFNα subtypes IFNαB2, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with an isolated antibody comprising:

[00140] a) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou[00140] a) an amino acid sequence of the variable region of the heavy chain (VH) of SEQ ID NO: 23 and an amino acid sequence of the variable region of the light chain (VL) of SEQ ID NO: 24; or

[00141] b) uma sequência de aminoácidos de VH da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos de VL da SEQ ID NO: 28.[00141] b) a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 28.

[00142] 13) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 12, sendo que o anticorpo se liga ao IFNw em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1.[00142] 13) The antibody according to any one of embodiments 1 to 12, wherein the antibody binds to IFNw at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1.

[00143] 14) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 13, sendo que o anticorpo se liga ao IFNw nos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 1.[00143] 14) The antibody according to any one of embodiments 1 to 13, wherein the antibody binds to IFNw at residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 1.

[00144] 15) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 14, sendo que o anticorpo se liga adicionalmente a pelo menos um resíduo de IFNw selecionado do grupo consistindo nos resíduos P26, K31 e R34 da SEQ ID NO: 1.[00144] 15) The antibody according to any one of embodiments 1 to 14, wherein the antibody additionally binds to at least one IFNw residue selected from the group consisting of residues P26, K31 and R34 of SEQ ID NO: 1.

[00145] 16) O anticorpo, de acordo com a modalidade 14 ou 15, sendo que o anticorpo se liga adicionalmente a pelo menos um resíduo de IFNw selecionado do grupo consistindo nos resíduos R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 e L154 da SEQ ID NO: 1.[00145] 16) The antibody according to embodiment 14 or 15, wherein the antibody additionally binds to at least one IFNw residue selected from the group consisting of residues R22, R23, I24, S25, P26, K31, D32, R34, D35, Q40, K134, M146, E147, M149, K150, F153 and L154 of SEQ ID NO: 1.

[00146] 17) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 16, sendo que o anticorpo se liga ao IFNα4a em um ou mais dos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19.[00146] 17) The antibody according to any one of embodiments 1 to 16, wherein the antibody binds to IFNα4a at one or more of residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19.

[00147] 18) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 17, sendo que o anticorpo se liga ao IFNα4a nos resíduos F27, L30 e R33 da SEQ ID NO: 19.[00147] 18) The antibody according to any one of embodiments 1 to 17, wherein the antibody binds to IFNα4a at residues F27, L30 and R33 of SEQ ID NO: 19.

[00148] 19) O anticorpo, de acordo com a modalidade 17 ou 18, sendo que o anticorpo se liga adicionalmente a pelo menos um resíduo de IFNα4a selecionado do grupo consistindo nos resíduos H26, K31 e R34 da SEQ ID NO: 19.[00148] 19) The antibody according to embodiment 17 or 18, wherein the antibody additionally binds to at least one residue of IFNα4a selected from the group consisting of residues H26, K31 and R34 of SEQ ID NO: 19.

[00149] 20) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 17 a 19, sendo que o anticorpo se liga adicionalmente a pelo menos um resíduo de IFNα4a selecionado do grupo consistindo nos resíduos A19, G22, R23, I24, S25, H26, C29, K31, D32, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 e S153 da SEQ ID NO: 19.[00149] 20) The antibody according to any one of embodiments 17 to 19, wherein the antibody additionally binds to at least one residue of IFNα4a selected from the group consisting of residues A19, G22, R23, I24, S25, H26, C29, K31, D32, H34, D35, V143, A146, E147, M149 , R150 and S153 of SEQ ID NO: 19.

[00150] 21) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 20, sendo que o anticorpo inibe a atividade de interferon leucocitário induzido por vírus.[00150] 21) The antibody according to any one of embodiments 1 to 20, wherein the antibody inhibits virus-induced leukocyte interferon activity.

[00151] 22) O anticorpo, de acordo com a reivindicação 21, sendo que a atividade do interferon leucocitário induzido por vírus é a libertação de IP-10 no sangue total, induzida por 100 U/ml de interferon.[00151] 22) The antibody according to claim 21, wherein the virus-induced leukocyte interferon activity is the release of IP-10 in whole blood induced by 100 U/ml of interferon.

[00152] 23) O anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, sendo que a atividade é inibida em mais de 50% na presença de 50 μg/ml de anticorpo.[00152] 23) The antibody according to claim 22, wherein the activity is inhibited by more than 50% in the presence of 50 μg/ml of antibody.

[00153] 24) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1a 23, sendo que o anticorpo inibe a atividade do complexo imune de lúpus eritematoso sistêmico (SLE) induzido por IFN.[00153] 24) The antibody according to any one of embodiments 1 to 23, wherein the antibody inhibits IFN-induced systemic lupus erythematosus (SLE) immune complex activity.

[00154] 25) O anticorpo, de acordo com a modalidade 24, sendo que a atividade é inibida em mais que cerca de 50%.[00154] 25) The antibody, according to embodiment 24, wherein the activity is inhibited by more than about 50%.

[00155] 26) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 25, compreendendo:[00155] 26) The antibody, according to any one of embodiments 1 to 25, comprising:

[00156] a) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou[00156] a) an amino acid sequence of the variable region of the heavy chain (VH) of SEQ ID NO: 23 and an amino acid sequence of the variable region of the light chain (VL) of SEQ ID NO: 24; or

[00157] b) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28.[00157] b) an amino acid sequence of the variable region of the heavy chain (VH) of SEQ ID NO: 27 and an amino acid sequence of the variable region of the light chain (VL) of SEQ ID NO: 28.

[00158] 27) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 26, sendo que o anticorpo não se liga ou neutraliza o interferon humano-β (IFNβ).[00158] 27) The antibody according to any one of embodiments 1 to 26, wherein the antibody does not bind or neutralize human interferon-β (IFNβ).

[00159] 28) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalida des 1 a 27, sendo que o anticorpo não se liga ou neutraliza o IFNαD.[00159] 28) The antibody according to any one of embodiments 1 to 27, wherein the antibody does not bind or neutralize IFNαD.

[00160] 29) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 28, sendo que o anticorpo é humano, humanizado ou adaptado a humano.[00160] 29) The antibody according to any one of embodiments 1 to 28, wherein the antibody is human, humanized or adapted to human.

[00161] 30) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 29, sendo que o anticorpo ser do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.[00161] 30) The antibody, according to any one of embodiments 1 to 29, wherein the antibody is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.

[00162] 31) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 30, sendo que o anticorpo é biespecífico.[00162] 31) The antibody according to any one of embodiments 1 to 30, wherein the antibody is bispecific.

[00163] 32) O anticorpo de acordo com a modalidade 31, sendo que o anticorpo se liga a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 ou à subuni- dade p40 de IL-12 ou IL-23.[00163] 32) The antibody according to embodiment 31, wherein the antibody binds to BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 or to the p40 subunit of IL-12 or IL-23.

[00164] 33) Uma composição farmacêutica compreendendo o anti corpo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, e um veículo farmaceuticamente aceitável.[00164] 33) A pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of Embodiments 1 to 32 and a pharmaceutically acceptable carrier.

[00165] 34) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 32, ou a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 33 para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com o aumento da produção de IFNα e/ou IFNw.[00165] 34) The antibody according to any one of embodiments 1 to 32, or the pharmaceutical composition according to embodiment 33 for use in the treatment or prevention of a disease associated with increased production of IFNα and/or IFNw.

[00166] 35) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 32, ou a composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 33 para uso de acordo com a modalidade 34, em que a doença associada com o aumento da produção de IFNα e/ou IFNw é uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune, opcionalmente em que a doença inflamatória mediada pelo sistema imune é lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I, psoríase, doença de Sjogren primária, esclerose sistêmica ou artrite reumatoide.[00166] 35) The antibody according to any one of embodiments 1 to 32, or the pharmaceutical composition according to embodiment 33 for use according to embodiment 34, wherein the disease associated with increased production of IFNα and/or IFNw is an immune-mediated inflammatory disease, optionally wherein the immune-mediated inflammatory disease is systemic lupus erythematosus (SLE), type I diabetes, p soriasis, primary Sjogren's disease, systemic sclerosis, or rheumatoid arthritis.

[00167] 36) O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 32, ou a composição farmacêutica de acordo com a modalidades 33 para uso de acordo com a modalidade 34 ou 35, em que o paciente exibe uma assinatura de interferon do Tipo I.[00167] 36) The antibody according to any one of embodiments 1 to 32, or the pharmaceutical composition according to embodiments 33 for use according to embodiment 34 or 35, wherein the patient exhibits a Type I interferon signature.

[00168] 37) O anticorpo de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 32 ou a composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 33 para uso de acordo com as modalidades 34 a 36, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, opcionalmente, em que o anticorpo biespecífico se liga a BLyS, CD40L, IL- 6, CD27, BDCA2 ou à subunidade p40 de IL-12 ou IL-23.[00168] 37) The antibody according to any one of embodiments 1 to 32 or the pharmaceutical composition according to embodiment 33 for use according to embodiments 34 to 36, wherein the antibody is a bispecific antibody, optionally, wherein the bispecific antibody binds BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 or the p40 subunit of IL-12 or IL-23.

[00169] 38) O anticorpo de acordo com qualquer uma das modali dades 1 a 32 ou 37 ou a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 33 para uso na inibição da interação de IFNw e dos subti- pos de IFNαFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG e/ou IFNαJ1 com IFNAR, em um paciente.[00169] 38) The antibody according to any one of embodiments 1 to 32 or 37 or the pharmaceutical composition according to embodiment 33 for use in inhibiting the interaction of IFNw and the subtypes of IFNαFNαB2, IFNαC, IFNαF, IFNαG and/or IFNαJ1 with IFNAR, in a patient.

[00170] 39) O anticorpo ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a modalidade 38, em que o paciente tem uma doença inflamatória mediada pelo sistema imune, opcionalmente, em que a doença inflamatória mediada pelo sistema imune é SLE, diabetes tipo I, psoríase, doença de Sjogren primária, esclerose sistêmica ou artrite reumatoide.[00170] 39) The antibody or pharmaceutical composition for use according to embodiment 38, wherein the patient has an immune-mediated inflammatory disease, optionally, wherein the immune-mediated inflammatory disease is SLE, type I diabetes, psoriasis, primary Sjogren's disease, systemic sclerosis, or rheumatoid arthritis.

[00171] 40) O anticorpo ou a composição farmacêutica de acordo com a modalidade 38 ou 39, em que o paciente exibe uma assinatura de interferon do Tipo I.[00171] 40) The antibody or pharmaceutical composition according to embodiment 38 or 39, wherein the patient exhibits a Type I interferon signature.

[00172] 41) O anticorpo ou a composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 38 a 40, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico, opcionalmente, em que o anticorpo biespecífico se liga a BLyS, CD40L, IL- 6, CD27, BDCA2 ou à subuni- dade p40 de IL-12 ou IL-23, ou BDCA2.[00172] 41) The antibody or pharmaceutical composition for use according to any one of embodiments 38 to 40, wherein the antibody is a bispecific antibody, optionally wherein the bispecific antibody binds to BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 or the p40 subunit of IL-12 or IL-23, or BDCA2.

[00173] A presente invenção será agora descrita com relação aos seguintes exemplos específicos não limitadores. Exemplo 1 Geração de antígenos de IFN de Tipo I humano usados para imunização, adsorção de fago, caracterização de anticorpos, e estudos de cristalografia:[00173] The present invention will now be described with respect to the following non-limiting specific examples. Example 1 Generation of human Type I IFN antigens used for immunization, phage adsorption, antibody characterization, and crystallographic studies:

[00174] Doze IFN alfas do tipo I humanos recombinantes individuais, incluindo Alfa A (alfa 2a) (SEQ ID NO: 5), Alfa B2 (alfa 8) (SEQ ID NO: 6), Alfa C (alfa 10) (SEQ ID NO: 7), Alfa D (alfa 1) (SEQ ID NO: 8), Alfa F (alfa 21) (SEQ ID NO: 9), Alfa G (alfa 5) (SEQ ID NO: 10), Alfa H2 (alfa 14) (SEQ ID NO: 11), Alfa I (alfa 17) (SEQ ID NO: 12), Alfa J1 (alfa 7) (SEQ ID NO: 13), Alfa K (alfa 6) (SEQ ID NO: 14), Alfa 4b (alfa 4) (SEQ ID NO: 15), Alfa WA (alfa 16) (SEQ ID NO: 16) e IFN ômega de chimpanzé (IFNwde chimpanzé) (SEQ ID NO: 3) foram expressos em células HEK 293 usando métodos padrão usando sequências sinal, tais como as SEQ ID NOs: 17-21. Para otimizar o nível de expressão e solubilidade, um mutante de aminoácido único na posição 80 do IFN ômega IFN-Ômega (T80E) foi gerado e expresso em células HEK 293. A variante T80E de IFNw (SEQ ID NO: 2) teve atividade comparável à proteína selvagem. Exemplo 2. Geração de anticorpos que se ligam e neutralizam IFN α e IFN w Imunizações de camundongo Geração de C2595[00174] Twelve individual recombinant human type I IFN alphas, including Alpha A (alpha 2a) (SEQ ID NO: 5), Alpha B2 (alpha 8) (SEQ ID NO: 6), Alpha C (alpha 10) (SEQ ID NO: 7), Alpha D (alpha 1) (SEQ ID NO: 8), Alpha F (alpha 21) (SEQ ID NO: 9), Alpha G (alpha 5) (SE Q ID NO: 10), Alpha H2 (alpha 14) (SEQ ID NO: 11), Alpha I (alpha 17) (SEQ ID NO: 12), Alpha J1 (alpha 7) (SEQ ID NO: 13), Alpha K (alpha 6) (SEQ ID NO: 14), Alpha 4b (alpha 4) (SEQ ID NO: 15), Alpha WA (alpha 16) (SEQ ID NO: 16 ) and chimpanzee omega IFN (chimpanzee IFNw) (SEQ ID NO: 3) were expressed in HEK 293 cells using standard methods using signal sequences such as SEQ ID NOs: 17-21. To optimize the level of expression and solubility, a single amino acid mutant at position 80 of IFN omega IFN-Omega (T80E) was generated and expressed in HEK 293 cells. The IFNw variant T80E (SEQ ID NO: 2) had comparable activity to the wild-type protein. Example 2. Generation of antibodies that bind and neutralize IFN α and IFN w Mouse immunizations Generation of C2595

[00175] Camundongos BALB/c foram imunizados por via intraperitoneal várias vezes com a mistura IFN-alfa humanos, IFN-ômega de chimpanzé e IFN-ômega de macacos cynomolgus. No dia 0, os camundongos foram imunizados com IFN-ômega de chimpanzé. No dia 14, os mesmos camundongos foram imunizados com a mistura de IFNômega de chimpanzé e cynomolgus IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNαA, IFNα4a, IFNαG, IFNαF, IFNαWA e IFNαI humanos No dia 208, os mesmos camundongos foram imunizados com a mistura de IFN-ômega de macacos cynomolgus, IFNα4b, IFNαA, IFNαD e IFNαK humanos. No dia 221, os mesmos camundongos foram imunizados com a mistura de IFN-ômega de macacos cynomolgus, IIFNαJ, IFNαI, IFNα4a, IFNαA e IFNαF humanos. Os títulos de IgG específicos foram avaliados após a imunização. Depois que títulos suficientes foram obtidos, os esplenócitos foram isolados e fundidos com células FO. Os hibridomas resultantes foram colocados em placas de 96 poços e cultivados por 10 dias. Clones antígeno específicos foram identificados por meio de uma traigem primária para a ligação de IFN-ômega de chimpanzé e ligação da mistura de IFNαA, IFNαH2, IFNαD e IFNα4a com ELISA. A ligação dos hibridomas ao IFN-alfa e/ou IFN-ômega foi adicionalmente testada por meio do ensaio Luminex multiplex. Clones de ligação de forma ampla pela maioria dos IFN alfas e humanos e IFN ômega de macacos cyno foram selecionados para estudos posteriores.[00175] BALB/c mice were immunized intraperitoneally several times with the mixture of human IFN-alpha, chimpanzee IFN-omega and cynomolgus monkey IFN-omega. On day 0, mice were immunized with chimpanzee IFN-omega. On day 14, the same mice were immunized with the mixture of chimpanzee and cynomolgus IFNαD, IFNαJ1, IFNαC, IFNαB2, IFNαH2, IFNαA, IFNα4a, IFNαG, IFNαF, IFNαWA and IFNαI On day 208, the same mice were immunized unified with the mixture of IFN-omega from cynomolgus monkeys, human IFNα4b, IFNαA, IFNαD and IFNαK. On day 221, the same mice were immunized with the mixture of IFN-omega from cynomolgus monkeys, human IIFNαJ, IFNαI, IFNα4a, IFNαA and IFNαF. Specific IgG titers were assessed after immunization. After sufficient titers were obtained, splenocytes were isolated and fused with FO cells. The resulting hybridomas were plated in 96-well plates and cultured for 10 days. Specific antigen clones were identified by means of a primary screening for chimpanzee IFN-omega binding and mixture binding of IFNαA, IFNαH2, IFNαD and IFNα4a with ELISA. Binding of hybridomas to IFN-alpha and/or IFN-omega was further tested using the Luminex multiplex assay. Clones binding broadly by most alpha and human IFN and cyno monkey IFN omega were selected for further study.

Bibliotecas de apresentação em fagoPhage display libraries

[00176] Fabs que se ligam ao IFN do tipo I humano foram selecionados de bibliotecas de apresentação em fagos pIX de novo descritas em Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010; publicação de patente internacional n° WO2009/085462; publicação de patente US n° US2010/0021477; publicação de patente US n° US2012/0108795.[00176] Fabs that bind human type I IFN were selected from de novo pIX phage display libraries described in Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010; International Patent Publication No. WO2009/085462; US Patent Publication No. US2010/0021477; US Patent Publication No. US2012/0108795.

Seleção de IFWM43Selection of IFWM43

[00177] As bibliotecas de exibição em fagos pIX foram imunoadsor- vidas contra o IFN alfa A do tipo I purificado (IFNα2) gerado a partir da expressão da sequência do IFN-alfa A humano selvagem com um marcador de poli-histidina C-terminal e purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Três etapas de imunoadsorção foram usadas. 100 nM, 10 nM e 1 nM de antígeno biotinilado foram usadas para as primeira, segunda e terceira etapas de imunoadsorção, respectivamente. Os Fabs monoclonais derivados de clones fagemídeos coletados após as três etapas de imunoadsorção foram primeiro testados para a sua ligação ao IFN ômega de chimpanzé, IFNα2 humano, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, IFNαF e avidina com um ELISA padrão. Os fragmentos Fab (Fabs) que se ligaram especificamente aos IFN Alfas e IFN-ômega no ELISA foram sequenciados e identificados como li- gantes de IFN exclusivos se eles têm diferentes sequências de re- giãoV. Os Fabs foram convertidos para mAb IgG1 humano e identifi- cados como ligantes de IFN após testados adicionalmente quanto sua atividade neutralizante em uma gama de ensaios baseados em células relevantes para a identificação da atividade anti-inflamatória.[00177] pIX phage display libraries were immunoadsorbed against purified type I IFN alpha A (IFNα2) generated from expression of wild-type human IFN-alpha A sequence with a C-terminal polyhistidine tag and purified by immobilized metal affinity chromatography. Three steps of immunoadsorption were used. 100 nM, 10 nM and 1 nM of biotinylated antigen were used for the first, second and third steps of immunoadsorption, respectively. Monoclonal Fabs derived from phagemid clones collected after the three immunoadsorption steps were first tested for their binding to chimpanzee omega IFN, human IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαG, IFNαF and avidin with a standard ELISA. Fab fragments (Fabs) that specifically bound IFN Alphas and IFN-omega in the ELISA were sequenced and identified as unique IFN binders if they have different V-region sequences. Fabs were converted to human IgG1 mAb and identified as IFN binders after further testing for their neutralizing activity in a range of cell-based assays relevant to the identification of anti-inflammatory activity.

Identificação de IFWM88Identification of IFWM88

[00178] As bibliotecas de exibição em fagos pIX foram imunoadsor- vidas contra o IFN alfa G do tipo I purificado (a5) gerado a partir da expressão da sequência do IFN-alfa A humano selvagem com um marcador de poli-histidina C-terminal e purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Três etapas de imunoadsorção foram usadas. 100 nM, 10 nM e 1 nM de antígeno biotinilado foram usadas para as primeira, segunda e terceira etapas de imunoadsorção, respectivamente. Os Fabs monoclonais derivados de clones fagemídeos coletados após as três etapas de imunoadsorção foram primeiro testados para a sua ligação ao IFN ômega de chimpanzé, IFNα2 humano, IFNα1, IFNαH2, IFNαL, IFNαF e avidina com um ELISA padrão. Os fragmentos Fab (Fabs) que se ligaram especificamente aos IFN Alfas e IFN-ômega no ELISA foram sequenciados e identificados como li- gantes de IFN exclusivos se eles têm diferentes sequências de região V. OsFabs foram convertidos para mAbs IgG1 humano e identificados como ligantes de IFN após teste adicional quanto sua atividade neutra- lizante em uma gama de ensaios baseados em células relevantes para a identificação da atividade anti-inflamatória.[00178] pIX phage display libraries were immunoadsorbed against purified type I IFN alpha G (a5) generated from expression of wild-type human IFN-alpha A sequence with a C-terminal polyhistidine tag and purified by immobilized metal affinity chromatography. Three steps of immunoadsorption were used. 100 nM, 10 nM and 1 nM of biotinylated antigen were used for the first, second and third steps of immunoadsorption, respectively. Monoclonal Fabs derived from phagemid clones collected after the three immunoadsorption steps were first tested for their binding to chimpanzee omega IFN, human IFNα2, IFNα1, IFNαH2, IFNαL, IFNαF and avidin with a standard ELISA. Fab fragments (Fabs) that specifically bound IFN Alphas and IFN-omega in the ELISA were sequenced and identified as unique IFN binders if they have different V region sequences. Fabs were converted to human IgG1 mAbs and identified as IFN binders after further testing for their neutralizing activity in a range of cell-based assays relevant to the identification of anti-inflammatory activity.

[00179] As sequências de aminoácidos das regiões variáveis dos anticorpos gerados são as seguintes: IFWM43 VH: SEQ ID NO: 23; IFWM43 VL: SEQ ID NO: 24; E IFWM88 VH: SEQ ID NO: 25; IFWM88 VL: SEQ ID NO: 26; C2595 VH: SEQ ID NO: 27,C2494 VL: SEQ ID NO: 28. As regiões variáveis C2595 foram transferidas para região constante da IgG1 humana e a o anticorpo resultante foi denominado M3239. IFWM43 também é referido como M43 e IFWM88 é referido como M88. Exemplo 3. Caracterização de anticorpos que se ligam e neutralizam IIFN-α e IFN-w Métodos Medições de afinidade[00179] The amino acid sequences of the variable regions of the generated antibodies are as follows: IFWM43 VH: SEQ ID NO: 23; IFWM43 VL: SEQ ID NO: 24; E IFWM88 VH: SEQ ID NO: 25; IFWM88 VL: SEQ ID NO: 26; C2595 VH: SEQ ID NO: 27, C2494 VL: SEQ ID NO: 28. The C2595 variable regions were transferred to human IgG1 constant region and the resulting antibody was named M3239. IFWM43 is also referred to as M43 and IFWM88 is referred to as M88. Example 3. Characterization of antibodies that bind and neutralize IIFN-α and IFN-w Methods Affinity measurements

[00180] As afinidades de ligação dos anticorpos foram realizadas usando a tecnologia SPR com ProteOn (Bio-Rad Hercules, CA). Anticorpos de cabra anti-Fc humano (produção) foram acoplados à amina aos chips GLC (Bio-Rad, Hercules, CA) usando química NHS/EDC padrão como produção recomendada. Os mAbs anti-IFN foram então carregados sobre o chip acoplado de anticorpo por 2 minutos em uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Após lavagem com tampão de corrida (composição do tampão) por 2 minutos a uma taxa de fluxo de 50 μl/ml, os antígenos recombinantes de IFN em 5 concentrações diferentes variando de 100 nM a 1,23 nM com diluições 1:3 foram deixados associar por 3 minutos e dissociar por 10 minutos, ambos à taxa de fluxo de 50 μl/ml. Os chips foram gerados com ácido fosfórico 100 mM em cada direção entre a corrida de diferentes antígenos. A análise dos dados foi realizada usando o ProteOn manager (Bio-Rad Hercules, CA). Os sensogramas foram agrupados por mAbs. Depois da aplicação do alinhamento e correção de referência (usando interspot ou canal de referência em branco), os dados de SPR foram ajustados globalmente para modelo de Langmuir para constantes de velocidade cinética (KD = koff/kon, onde KD = constante de dissociação em equilíbrio, kon = constante de taxa de associação e koff = constante de taxa de dissociação).[00180] Antibody binding affinities were performed using SPR technology with ProteOn (Bio-Rad Hercules, CA). Goat anti-human Fc antibodies (production) were amine-coupled to GLC chips (Bio-Rad, Hercules, CA) using standard NHS/EDC chemistry as recommended production. The anti-IFN mAbs were then loaded onto the antibody-coupled chip for 2 minutes at a flow rate of 30 µl/min. After washing with running buffer (buffer composition) for 2 minutes at a flow rate of 50 μl/ml, the recombinant IFN antigens at 5 different concentrations ranging from 100 nM to 1.23 nM with 1:3 dilutions were allowed to associate for 3 minutes and dissociate for 10 minutes, both at a flow rate of 50 μl/ml. Chips were generated with 100 mM phosphoric acid in each direction between runs of different antigens. Data analysis was performed using the ProteOn manager (Bio-Rad Hercules, CA). Sensorgrams were grouped by mAbs. After application of alignment and reference correction (using interspot or blank reference channel), the SPR data were globally fit to Langmuir model for kinetic rate constants (KD = koff/kon, where KD = equilibrium dissociation constant, kon = association rate constant, and koff = dissociation rate constant).

Ensaio de gene repórter ISRE ("ensaio gene repórter ISRE")ISRE reporter gene assay ("ISRE reporter gene assay")

[00181] Células HEK-Blue™ IFNα/β (Invivogen, San Diego, CA) modificadas para expressar uma via de sinalização de IFN tipo I totalmente ativa (que expressam estavelmente STAT2 e IRF9) e transfec- tadas com um gene repórter SEAP sob o controle do promotor ISG54 induzível para IFN-α/β foram usadas. As células foram cultivadas em frascos T150 revestidos com colágeno tipo I em meio Eagle modificado por Dulbecco com 10% de soro fetal bovino, 100 ug/ml de blastici- dina e 30 ug/ml de zeocina a 37°C, 5% de CO2. As células foram coletadas e semeadas em placas de 384 poços em 50 μl por poço a 50.000 células por ml. As células plaqueadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 24 horas. As amostras de interferon testadas foram preparadas e diluídas em meio consumido isento de soro HEK ISRE e 50 μl de amostra de IFN foram adicionados a cada poço. As células plaqueadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 20 horas. A fosfa- tase alcalina foi detectada a partir de 20 μl de sobrenadantes celulares com 60 μl/poço de QUANTI-Blue™ ressuspenso em água filtrada após incubação por 20 min à temperatura ambiente. A densidade ótica foi lida em um leitor de placas Biotek Synergy a 650 nm.[00181] HEK-Blue™ IFNα/β cells (Invivogen, San Diego, CA) modified to express a fully active type I IFN signaling pathway (which stably express STAT2 and IRF9) and transfected with a SEAP reporter gene under the control of the IFN-α/β inducible ISG54 promoter were used. Cells were grown in T150 flasks coated with type I collagen in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal bovine serum, 100 ug/ml blasticidin and 30 ug/ml zeocin at 37°C, 5% CO2. Cells were harvested and seeded into 384-well plates at 50 µl per well at 50,000 cells per ml. The plated cells were incubated at 37°C, 5% CO2 for 24 hours. Interferon samples tested were prepared and diluted in HEK ISRE serum-free consumed medium and 50 µl of IFN sample was added to each well. The plated cells were incubated at 37°C, 5% CO2 for 20 hours. Alkaline phosphatase was detected from 20 μl of cell supernatants with 60 μl/well of QUANTI-Blue™ resuspended in filtered water after incubation for 20 min at room temperature. Optical density was read on a Biotek Synergy plate reader at 650 nm.

[00182] Alguns ensaios de gene repórter ISRE foram feitos em placas de 96 poços, da seguinte forma: Células HEK-Blue™ IFN-α/β (In- vivoGen, San Diego, CA) foram plaqueadas em 50.000 células por poço em 100 μl meio isento de seleção (DMEM + Glutamax/ 10% FBS, Gibco) e permitido incubar de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, os estímulos de IFN do tipo I foram preparados (ou seja, interferon recombinante, IFN leucocitário, preps de IFN induzidas por IC, soro, etc) com ou sem inibidores de IFN do tipo I em uma placa de transferência de fundo em U de 96 poços (BD Falcon) e pré-aquecidos a 37°C por 10 minutos. A placa de células foi removida da incubadora e o meio foi removido e substituído por 100 μl de tratamentos apropriados preparados em placa de transferência de 96 poços com fundo em U. As células foram colocadas de volta a 37°C por 24 horas. No dia seguinte, 40 μl de sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 poços de fundo plano (BD Falcon) contendo 160 μl de substrato QUANTI-Blue™ SEAP (Invivogen). A placa foi deixada desenvolver por cerca de 15 minutos, tempo no qual foi lida usando um espectrô- metro a uma absorvância de 650 nm.[00182] Some ISRE reporter gene assays were performed in 96-well plates as follows: HEK-Blue™ IFN-α/β cells (In-vivoGen, San Diego, CA) were plated at 50,000 cells per well in 100 µl selection-free medium (DMEM + Glutamax/10% FBS, Gibco) and allowed to incubate overnight at 37°C. The next day, Type I IFN stimuli were prepared (i.e., recombinant interferon, leukocyte IFN, IC-induced IFN preps, serum, etc) with or without Type I IFN inhibitors in a 96-well U-bottom transfer plate (BD Falcon) and pre-warmed at 37°C for 10 minutes. The plate of cells was removed from the incubator and the medium was removed and replaced with 100 µl of appropriate treatments prepared in a 96-well U-bottomed transfer plate. The cells were placed back at 37°C for 24 hours. The next day, 40 µl of supernatant was transferred to a 96-well flat bottom plate (BD Falcon) containing 160 µl of QUANTI-Blue™ SEAP substrate (Invivogen). The plate was allowed to develop for about 15 minutes, during which time it was read using a spectrometer at an absorbance of 650 nm.

Ensaio de libertação de IP-10:IP-10 release test:

[00183] Sangue total heparinizado de voluntários saudáveis foi pla- queado em uma placa de 96 poços com fundo em U contendo vários tipos diferentes de inibidores de IFN do tipo I junto com controles isotí- picos. Os inibidores e controles isotípicos adequados foram diluídos em meio RPMI com 10% de FBS. Os IFNs e os inibidores ou controles isotípicos foram diluídos em um volume de 30 μl de meio RPMI contendo 10% de FBS. Após a pré-incubação das amostras por 15 a 20 minutos, 240 μl de sangue total heparinizado foram adicionados às placas contendo as diluições para produzir um volume final de 270 μl. As amostras foram misturadas e deixadas incubar a 37°C por 20 a 22 horas. Após as incubações, as amostras foram centrifugadas a 400Xg por 5 minutos e o plasma foi coletado e congelado para análise posterior. O perfil de IP-10 foi feito pelo kit Milliplex de citocina/quimiocina (Millipore, Premixed 39 plex. A preparação da amostra e o ensaio foram realizados de acordo com a recomendação do fabricante usando o sistema da BioRad modelo (Bioplex™ 200) eBioplex manager ™ software 4.1 para a aquisição dos dados. A análise estatística foi feita pelo programa Graph Pad Prism V.5. Em alguns casos, IP-10 foi quantificada usando um kit Single analyte ELISA disponível junto a Qiagen.[00183] Heparinized whole blood from healthy volunteers was plated in a 96-well U-bottom plate containing several different types of type I IFN inhibitors along with isotypic controls. Appropriate isotypic inhibitors and controls were diluted in RPMI medium with 10% FBS. IFNs and inhibitors or isotypic controls were diluted in a 30 µl volume of RPMI medium containing 10% FBS. After preincubating the samples for 15 to 20 minutes, 240 μl of heparinized whole blood was added to the plates containing the dilutions to produce a final volume of 270 μl. The samples were mixed and allowed to incubate at 37°C for 20 to 22 hours. After the incubations, the samples were centrifuged at 400Xg for 5 minutes and the plasma was collected and frozen for later analysis. IP-10 profiling was done by Milliplex cytokine/chemokine kit (Millipore, Premixed 39 plex. Sample preparation and assay were performed according to manufacturer's recommendation using BioRad model system (Bioplex™ 200) and Bioplex manager™ software 4.1 for data acquisition. Statistical analysis was performed by Graph Pad Prism V.5 program. In some cases, IP-10 was quantified using a Single ana kit lyte ELISA available from Qiagen.

Ensaio de assinatura gênica de SLE no sangue total:Whole blood SLE gene signature assay:

[00184] O sangue total de um doador com SLE foi obtido comercialmente através da Asterand. A análise da expressão gênica do sangue total foi realizada usando um cartão de arranjo de baixa densidade TaqMan contendo iniciadores e sondas enriquecidos para os genes estimulados pelo IFN (ISGs). Os genes incluídos no arranjo foram da seguinte forma: ACTB, IL6, IL10, IL13, FAS, IL15, IL21, IL17A, EIF2AK2, OASL, 18S, STAT1, LY6E, PLSCR1, MX1, IFIT1, IFI44, IFI44L, IFI27, ISG15, RSAD2, CXCL10, LAG3, e TNFSF10. A amplificação por RT- PCR foi realizada num sistema ABI Prism 7900 HT Sequence Detection (Applied Biosystems, CA, EUA), conforme as instruções do fabricante. Os valores de expressão relativa foram calculados usando o método do ciclo limiar comparativo (Ct). Resumidamente, esta técnica utiliza a fórmula 2-ΔΔCt para calcular a expressão de genes alvo normalizada por um grupo calibrador (Sangue total não tratado normal e saudável). Acti- na beta (ACTB) foi selecionado como o controle endógeno. O ciclo limiar (Ct) indica o número do ciclo em que a quantidade do alvo amplificado atingir um limiar fixado. Os dados de Ct para todos os genes alvo induzidos por interferon e ACTB foram usados para criar valores ΔCt [ΔCt = Ct (gene lavo)-Ct (ACTB)]. Valores de ΔΔCt foram calculados por meio da subtração da média do grupo controle (5 dadores de sangue total saudáveis normais não tratados) a partir do valorΔCt de cada alvo. Os valores de expressão relativa foram calculados usando a equação 2- ΔΔC. Os 3 doadores com SLE neste experimento tiveram a expressão gênica no mínimo 2 vezes maior em relação ao grupo controle para 9 dos ISGs no arranjo de baixa densidade. Para comparar os efeitos do IFN do tipo I em todos os 3 dadores, a % de inibição foi primeiro determinada usando a seguinte fórmula para cada tratamento/inibidor: (2-ΔΔCt sangue de SLE não tratado - 2-ΔΔCt inibidor / 2-ΔΔCt sangue de SLE não tratado) x 100 = % inibição. Em seguida, a % da linha de base para cada tratamento em todos os três doadores foi calculada pela seguinte equação: 100 -% de inibição =% da linha de base.[00184] Whole blood from a donor with SLE was obtained commercially through Asterand. Whole blood gene expression analysis was performed using a TaqMan low-density array card containing enriched primers and probes for IFN-stimulated genes (ISGs). The genes included in the array were as follows: ACTB, IL6, IL10, IL13, FAS, IL15, IL21, IL17A, EIF2AK2, OASL, 18S, STAT1, LY6E, PLSCR1, MX1, IFIT1, IFI44, IFI44L, IFI27, ISG15, RSAD2, CXCL10, LAG3, and TNFSF10. RT-PCR amplification was performed on an ABI Prism 7900 HT Sequence Detection system (Applied Biosystems, CA, USA) as per the manufacturer's instructions. Relative expression values were calculated using the comparative threshold cycle (Ct) method. Briefly, this technique uses the 2-ΔΔCt formula to calculate target gene expression normalized by a calibrator group (normal and healthy untreated whole blood). Actin beta (ACTB) was selected as the endogenous control. The threshold cycle (Ct) indicates the cycle number at which the amount of the amplified target reaches a fixed threshold. The Ct data for all interferon- and ACTB-induced target genes were used to create ΔCt values [ΔCt = Ct (lavo gene)-Ct (ACTB)]. ΔΔCt values were calculated by subtracting the mean of the control group (5 untreated normal healthy whole blood donors) from the ΔCt value of each target. Relative expression values were calculated using the 2-ΔΔC equation. The 3 SLE donors in this experiment had at least 2-fold higher gene expression than the control group for 9 of the ISGs in the low-density array. To compare the effects of type I IFN in all 3 donors, % inhibition was first determined using the following formula for each treatment/inhibitor: (2-ΔΔCt untreated SLE blood - 2-ΔΔCt inhibitor / 2-ΔΔCt untreated SLE blood) x 100 = % inhibition. Then the % of baseline for each treatment in all three donors was calculated by the following equation: 100 -% inhibition =% of baseline.

[00185] A % média de linha de base de todos os 3 dadores agrupados por grupos de tratamento foi então determinada para cada um dos 9 genes. O grupo de SLE não tratado ("sangue de SLE sozinho") foi definido como 100, para indicar que este grupo é 100% da linha de base. A linha de base indica que há 0% de expressão gênica induzida por IFN. Finalmente, a média e o desvio padrão de cada grupo de tra- tamento em todos os 9 genes foram determinados e representados graficamente. A significância estatística foi determinada por meio da realização do teste-T de Student. Preparação de Complexo Imune de SLE:[00185] The mean % baseline of all 3 donors grouped by treatment groups was then determined for each of the 9 genes. The untreated SLE group ("SLE blood alone") was set to 100, to indicate that this group is 100% baseline. The baseline indicates that there is 0% IFN-induced gene expression. Finally, the mean and standard deviation of each treatment group across all 9 genes were determined and plotted. Statistical significance was determined by performing Student's t-test. SLE Immune Complex Preparation:

[00186] Plasma de paciente com SLE foi obtido de SCIPAC (Kent, Reino Unido). As amostras de plasma tendo atividade de IFN do tipo I, tal como determinada por um ensaio de gene repórter baseado em IS- RE foram adicionalmente utilizadas para a purificação de IgG. A IgG foi purificada usando a colunaNAB™ Protein A/G Spin conforme recomendado pelo fabricante (Thermo SCIENTIFIC) e o ensaio de proteína foi executado para determinar a concentração (Pierce BCA). Os lisados de autoantígenos foram preparados usando células HEK293T suspensas em 5x107 células/ml em salina tamponada por fosfato 1X (PBS). Para romper as células HEK293T, congelamento-descongelamento foi realizado por 4 ciclos de, pelo menos, 10 minutos de congelamento a -80°C e descongelamento a 37°C, exceto para um congelamento inicial de pelo menos 30 minutos; após o congelamento-descongelamento, restos celulares foram removidos por centrifugação (400 g por 5 minutos) e a quantidade de antígeno solúvel foi quantificada pela ensaio de proteína. A uma razão de 1:1, a IgG purificada e o lisado celular necrótico foram incubados em conjunto por 30 minutos à temperatura ambiente para formar complexos imunes. Uma concentração final de 400 μg/ml de complexo imune foi então adicionada a 3 poços de uma placa de 6 poços, em um volume total de 4 ml de meio de PBMC por poço. A IgG de dador saudável foi purificada e "complexada" da mesma maneira agora descrita e usada para estimular PBMC para servir como um controle. Os meios condicionados a partir destes estudos foram aliquotados e usados como uma fonte de IFN endógeno para os experimentos de inibição. Nenhuma atividade de IFN foi vista com preps preparadas a partir de IgG isolada de voluntários saudáveis. Resultados Afinidade e neutralização de IFNs do tipo I recombinantes[00186] Plasma from patient with SLE was obtained from SCIPAC (Kent, UK). Plasma samples having type I IFN activity as determined by an IS-RE-based reporter gene assay were further used for IgG purification. IgG was purified using the NAB™ Protein A/G Spin column as recommended by the manufacturer (Thermo SCIENTIFIC) and the protein assay was run to determine concentration (Pierce BCA). Autoantigen lysates were prepared using HEK293T cells suspended at 5x10 7 cells/ml in 1X phosphate buffered saline (PBS). To disrupt HEK293T cells, freeze-thaw was performed for 4 cycles of at least 10 minutes of freezing at -80°C and thawing at 37°C, except for an initial freeze of at least 30 minutes; after freezing-thawing, cell debris was removed by centrifugation (400 g for 5 minutes) and the amount of soluble antigen was quantified by protein assay. At a 1:1 ratio, purified IgG and necrotic cell lysate were incubated together for 30 minutes at room temperature to form immune complexes. A final concentration of 400 µg/ml of immune complex was then added to 3 wells of a 6-well plate, in a total volume of 4 ml of PBMC medium per well. Healthy donor IgG was purified and "complexed" in the same manner just described and used to stimulate PBMC to serve as a control. Conditioned media from these studies were aliquoted and used as a source of endogenous IFN for the inhibition experiments. No IFN activity was seen with preps prepared from IgG isolated from healthy volunteers. Results Affinity and neutralization of recombinant type I IFNs

[00187] A Tabela 2 apresenta as constantes de dissociação (KD) dos anticorpos M43, M88 e M3239 interferons do tipo I humanos individuais recombinantes (IFNs). M43, M88 e C2595 neutralizaram pelo menos quatro moléculas de IFNα: alfaB2, alfaF, alfaG e alfaJ1. Nenhuma ligação foi observada para alfaD.[00187] Table 2 presents the dissociation constants (KD) of antibodies M43, M88 and M3239 recombinant individual human type I interferons (IFNs). M43, M88 and C2595 neutralized at least four IFNα molecules: alphaB2, alphaF, alphaG and alphaJ1. No binding was observed for alphaD.

[00188] A Tabela 3 mostra os valores de IC50 dos anticorpos M43, M88 e M3239 (C2595) para IFNs do tipo I humanos individuais recom- binantes medidos em um ensaio de gene repórter. M43 foi amplamente neutralizante, inibindo pelo menos 10 moléculas de IFN α. M3239 neutralizou IFNw com uma IC50 sub pM enquanto M43 neutralizou IFNw com uma IC50 na faixa de nM. M88 não demonstrou atividade neutralizante em relação ao IFNw no ensaio específico devido à sua muito fraca ligação ao mesmo. No entanto, após a maturação da afinidade, os anticorpos derivados de M88 mostraram forte atividade neu- tralizante de IFNw ao manter suas amplas atividades neutralizantes de IFNα (dados não mostrados). Nenhum dos anticorpos se ligou ou neutralizou o IFNβ. NB = sem ligação ND = não testado M3239: IgG1 quimérica humano/camundongo derivada do c2595 NA: nenhuma atividade neutralizante PA: atividade neutralizante parcial ND: não testado[00188] Table 3 shows the IC50 values of antibodies M43, M88 and M3239 (C2595) for individual recombinant human type I IFNs measured in a reporter gene assay. M43 was largely neutralizing, inhibiting at least 10 IFN α molecules. M3239 neutralized IFNw with a sub pM IC50 while M43 neutralized IFNw with an IC50 in the nM range. M88 did not demonstrate neutralizing activity towards IFNw in the specific assay due to its very weak binding to it. However, after affinity maturation, the M88-derived antibodies showed strong IFNw neutralizing activity while retaining their broad IFNα neutralizing activities (data not shown). None of the antibodies bound or neutralized IFNβ. NB = no binding ND = not tested M3239: human/mouse chimeric IgG1 derived from c2595 NA: no neutralizing activity PA: partial neutralizing activity ND: not tested

Neutralização de IFN do tipo I endógenoNeutralization of endogenous type I IFN

[00189] A capacidade dos anticorpos de neutralizar o IFN do Tipo I endógeno foi avaliada em um ensaio de avaliação da liberação da quimioquina IP-10 (CXCL10) a partir de sangue total humano estimulado com IFN leucocitário endógeno (induzido por vírus) ou IFN wre- combinante. A inibição dependente da dose de ambos IFN leucocitário (Figura 1A) e IFNw recombinante (Figura 1B) foi vista com M43 e C2595 indicando a capacidade dos anticorpos de neutralizar a atividade de um amplo espectro de tipo I, como os produzidos por leucócitos induzidos viralmente. O IFN leucocitário endógeno foi adquirido junto à Sigma (número de catálogo # I4784-1MU). Neutralização da doença associada IFN circulante[00189] The ability of antibodies to neutralize endogenous Type I IFN was evaluated in an assay evaluating the release of chemokine IP-10 (CXCL10) from human whole blood stimulated with endogenous (virus-induced) leukocyte IFN or wre-combinant IFN. Dose-dependent inhibition of both leukocyte IFN (Figure 1A) and recombinant IFNw (Figure 1B) was seen with M43 and C2595 indicating the ability of the antibodies to neutralize the activity of a broad spectrum of type I, such as those produced by virally induced leukocytes. Endogenous leukocyte IFN was purchased from Sigma (catalog number # I4784-1MU). Neutralization of disease associated circulating IFN

[00190] Os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade de reduzir o complexo imune de SLE induzido por IFN como estímulo para representar melhor o IFN do tipo I circulante presente no SLE. O IFN induzido pelo complexo imune de SLE foi preparado por meio da estimulação de PBMC humanos com complexos imunes derivados do paciente com SLE e este meio condicionado foi utilizado em um tipo de ensaio de gene repórter induzível por IFN do tipo I (ensaio de gene repórter ISRE como descrito acima) na presença de mAbs inibidores e mAbs controle. A adição de um mAb neutralizantes de IFNw seletivo em combinação com 3 diferentes mAbs antagonistas de IFNα reduziu ainda mais a atividade total do IFN induzido pelo complexo imune, em comparação com os mAbs anti IFNα na presença de uma quantidade equivalente de mAb de controle isotípico (Figura 2). Além disso, o mAb M43 anti IFN α/w demonstrou uma supressão da atividade em compa-ração com o mAb inibidor de IFNα, sugerindo que um duplo bloqueio de IFNα e IFNw pode reduzir a atividade de IFN total mais do que a neutralização de IFNα por si só (Figura 2).[00190] The antibodies were tested for their ability to reduce the IFN-induced immune complex of SLE as a stimulus to better represent the circulating type I IFN present in SLE. SLE immune complex-induced IFN was prepared by stimulating human PBMC with immune complexes derived from the SLE patient and this conditioned medium was used in a type I IFN-inducible reporter gene assay (ISRE reporter gene assay as described above) in the presence of inhibitor mAbs and control mAbs. The addition of a selective IFNw neutralizing mAb in combination with 3 different IFNα antagonist mAbs further reduced the total IFN activity induced by the immune complex compared to the anti IFNα mAbs in the presence of an equivalent amount of isotypic control mAb (Figure 2). Furthermore, the anti IFN α/w mAb M43 demonstrated a suppression of activity compared to the IFNα inhibitor mAb, suggesting that a double blockade of IFNα and IFNw may reduce total IFN activity more than neutralizing IFNα alone (Figure 2).

O IFN^ contribui para IFN circulante associado com SLEIFN^ contributes to circulating IFN associated with SLE

[00191] Um ensaio para a assinatura gênica de SLE foi desenvolvido como descrito acima, utilizando uma combinação de nove genes induzidos por IFN. A capacidade de vários anticorpos de inibir a assi-natura gênica foi testada. Um mAb antagonista específico para IFNw (anti-w) regula negativamente a assinatura de IFN em comparação a uma concentração equivalente de mAb controle isotípico, sugerindo que o IFN-w faz parte do IFN do tipo I ativo circulante que induz um assinatura de IFN no SLE. A combinação de um anticorpo para IFN w com um anticorpo para IFN α resultou em uma supressão mais pronunciada da assinatura de IFN perpetuada no sangue destes pacientes do que um inibidor de IFN α ou IFN w sozinho (Figura 3). Exemplo 4. ligação competitiva de epitopo[00191] An assay for the gene signature of SLE was developed as described above, using a combination of nine IFN-induced genes. The ability of various antibodies to inhibit gene signature was tested. An IFNw-specific antagonist mAb (anti-w) down-regulates the IFN signature compared to an equivalent concentration of isotypic control mAb, suggesting that IFN-w is part of the active circulating type I IFN that induces an IFN signature in SLE. Combining an antibody to IFN w with an antibody to IFN α resulted in a more pronounced suppression of the IFN signature perpetuated in the blood of these patients than an IFN α inhibitor or IFN w alone ( Figure 3 ). Example 4. Competitive epitope binding

[00192] Os experimentos de ligação a epitopos foram realizados usando ensaios competitivos de ligação em tempo real, isento de marcador usando Octet (ForteBio, Menlo Park, CA). Foram usados dois formatos de ensaio: o formato de ensaio em conjunto e o formato de ensaio de sanduíche clássico.[00192] Epitope binding experiments were performed using competitive real-time, marker-free binding assays using Octet (ForteBio, Menlo Park, CA). Two trial formats were used: the tandem trial format and the classic sandwich trial format.

[00193] No formato em conjunto pontas biossensoras de estreptavi- dina (forteBio, Menlo Park, CA) foram imersas em 0,5 μg/ml interferon alfa recombinante biotinilado por 5 minutos enquanto o sinal cinético em tempo real foi medido. Em seguida, as pontas foram imersas no primeiro conjunto de mAbs (10 μg/ml) por 15 minutos. As pontas foram subsequentemente imersas no segundo conjunto de mAbs (10 μg/ml) por outros 10 ou 15 minutos. O sinal de ligação positivo das pontas imersas no segundo conjunto de mAbs mostra a sua ligação a epitopos diferentes do primeiro conjunto de mAbs e o sinal negativo indica a sua ligação aos mesmos epitopos. Para eliminar os resultados falsos devido à diferença de afinidade de dois conjuntos de mAbs, o experimento foi repetido com a ordem inversa, isto é, as pontas foram imersas no segundo conjunto de mAbs primeiro e, em seguida, no primeiro conjunto de mAbs. Todos os anticorpos e antígenos foram diluídos em PBS com 1 mg/ml de BSA e 0,02% de Tween 20.[00193] In the tandem format, streptavidin biosensor tips (forteBio, Menlo Park, CA) were immersed in 0.5 μg/ml biotinylated recombinant interferon alpha for 5 minutes while the real-time kinetic signal was measured. Then, the tips were immersed in the first set of mAbs (10 μg/ml) for 15 minutes. The tips were subsequently immersed in the second set of mAbs (10 µg/ml) for another 10 or 15 minutes. The positive binding signal of the tips dipped in the second set of mAbs shows their binding to different epitopes from the first set of mAbs and the negative sign indicates their binding to the same epitopes. To eliminate false results due to difference in affinity of two sets of mAbs, the experiment was repeated in reverse order, i.e., the tips were immersed in the second set of mAbs first and then in the first set of mAbs. All antibodies and antigens were diluted in PBS with 1 mg/ml BSA and 0.02% Tween 20.

[00194] No formato de ensaio em sanduíche clássico o primeiro conjunto de mAbs foi acoplado sobre pontas biossensoras com amina reativa usando a química mediada por NHS/EDC padrão seguindo o protocolo do fabricante (forteBio, Menlo Park, CA). Após extinção por 5 minutos em etanolamina, as pontas foram imersas em interferons re- combinantes (2 μg/ml) por 10 minutos antes de serem imersas na segunda série de mAbs (15 μg/ml) por 10 ou 15 minutos. Os mAbs de acoplamento foram diluídos em tampão MES 6,0, enquanto os mAbs de binagem e os antígenos foram diluídos em PBS com 1 mg/ml de BSA e 0,02% de Tween 20.[00194] In the classic sandwich assay format the first set of mAbs were coupled onto reactive amine biosensor tips using standard NHS/EDC mediated chemistry following the manufacturer's protocol (forteBio, Menlo Park, CA). After quenching for 5 minutes in ethanolamine, the tips were immersed in recombinant interferons (2 μg/ml) for 10 minutes before being immersed in the second series of mAbs (15 μg/ml) for 10 or 15 minutes. Coupling mAbs were diluted in MES 6.0 buffer, while binding mAbs and antigens were diluted in PBS with 1 mg/ml BSA and 0.02% Tween 20.

[00195] Três experimentos de binagem de epitopo foram realizados usado-se ambos os formatos de ensaio, usando os seguintes anticorpos: M43, M88 e C2595 (ligação a múltiplos subtipos de IFNα e IFNw), C2601 e M42 (se liga ao IFNw mas fracamente ao subtipos de IFNα) e C2605 (ligação a múltiplos subtipos de IFNαmas não de IFNw). Várias moléculas de IFN- α foram testadas no teste de competição (subtipos de IFN α humano IFNαA, IFNαB, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαH, IFNαJ, IFNα2, IFNα4a, bem como IFN w de chimpanzé e a molécula IFNAR2-Fc humana.[00195] Three epitopus binage experiments were performed if both test formats were used, using the following antibodies: M43, M88 and C2595 (connection to multiples of IFNα and IFNW), C2601 and M42 (binds to IFNW but weakly to IFNα subtypes) and C2605 (multiple binding subtypes of IFNαmas not from IFNW). Several IFN-α molecules were tested in the competition test (human IFN-α subtypes IFNαA, IFNαB, IFNαC, IFNαF, IFNαG, IFNαH, IFNαJ, IFNα2, IFNα4a, as well as chimpanzee IFN w and the human IFNAR2-Fc molecule.

[00196] Tabela 4 mostra os resultados da competição na presença de M43 e a Tabela 5 mostra a competição na presença de IFNAR2-Rc. M43 e M88 competiram entre si pela ligação a todas as moléculas de IFNα e IFNw de chimpanzé testadas. M42, que não se liga ao IFNw não compete pela ligação às moléculas de IFN testadas com M43. M43 competiu com C2595 e IFNAR-Fc pela ligação ao IFNw de chimpanzé e várias moléculas de IFNα. C2605 não competiu pela ligação com M43 para a maioria dos IFNα, indicando que os dois anticorpos se ligam a um epitopo diferente. C2601, uma forte ligante de IFNw, mas fraco ligante de IFNα não competiu pela ligação com M43 a IFNw com M43, indicando que os dois anticorpos se ligam em um epitopo distin- to. C2595, mas não C2601 ou C2605 competiu pela ligação ao IFNw de chimpanzé e/ou IFNα A com IFNAR2-Fc. Os anticorpos que se ligam ao IFNw e múltiplos subtipos de IFNα e, portanto, definem epito- po distintos passam por binagem da seguinte forma: BinA: mabs M43, M88, C2595. Anticorpos que se ligam somente ao IFNα ou IFNw formam epitopos distintos por binagem. "-" indica que não há ligação "+" ou "++" indicou ligação NT: não testado 1 c2601 não se liga a IFNaA com afinidade elevada 2 * c2605 não se liga ao IFNw de chimpanzé * c2601 não se liga a IFNaA com afinidade elevada 3 * c2605 não se liga ao IFNw de chimpanzé Exemplo 5. Epitopo de M43 derivado da estrutura cristalina do anticorpo M43 anti-IFNα/^ em complexo com IFN^ mutante T80E[00196] Table 4 shows the results of the competition in the presence of M43 and Table 5 shows the competition in the presence of IFNAR2-Rc. M43 and M88 competed with each other for binding to all tested chimpanzee IFNα and IFNw molecules. M42, which does not bind to IFNw, does not compete for binding to the IFN molecules tested with M43. M43 competed with C2595 and IFNAR-Fc for binding to chimpanzee IFNw and various IFNα molecules. C2605 did not compete for binding with M43 for most IFNα, indicating that the two antibodies bind a different epitope. C2601, a strong IFNw binding but weak IFNα binding did not compete for binding with M43 to IFNw with M43, indicating that the two antibodies bind on a distinct epitope. C2595, but not C2601 or C2605 competed for binding to chimpanzee IFNw and/or IFNα A with IFNAR2-Fc. Antibodies that bind to IFNw and multiple subtypes of IFNα and therefore define distinct epitopes are binned as follows: BinA: mabs M43, M88, C2595. Antibodies that bind only to IFNα or IFNw form distinct epitopes by binning. "-" indicates no binding "+" or "++" indicated binding NT: not tested 1 c2601 does not bind high affinity IFNaA 2 * c2605 does not bind chimpanzee IFNw * c2601 does not bind to IFNα with high affinity 3 * c2605 does not bind to chimpanzee IFNγ Example 5. M43 epitope derived from the crystal structure of anti-IFNγ antibody M43 in complex with mutant IFNγ T80E

[00197] IFWM43 (a seguir designado M43 e FabM43 para mAb e Fab, respectivamente) neutraliza amplamente moléculas de IFNa humano e IFNw e mostra a ligação a vários subtipos de IFNa e IFNw humano. De modo a revelar a base estrutural para sua especificidade para subtipos de IFNa e IFNw, a estrutura cristalina do IFN-w em complexo com FabM43 foi determinada. Materiais e métodos Proteínas[00197] IFWM43 (hereinafter referred to as M43 and FabM43 for mAb and Fab, respectively) broadly neutralizes human IFNa and IFNw molecules and shows binding to several subtypes of human IFNa and IFNw. In order to reveal the structural basis for its specificity for IFNα and IFNw subtypes, the crystal structure of IFN-γ in complex with FabM43 was determined. Materials and methods Proteins

[00198] O FabM43 marcado com His (isotipo IgG1/K) e um IFNw humano com a mutação T80E (neste exemplo IFNw e IFNwT80E são sinônimos) foram expressos em células HEK293F e purificados usando cromatografia por afinidade e de exclusão de tamanho. As proteínas estavam em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM. Cristalização do complexo IFN^/FabM43[00198] His-tagged FabM43 (IgG1/K isotype) and a human IFNw with the T80E mutation (in this example IFNw and IFNwT80E are synonymous) were expressed in HEK293F cells and purified using affinity and size exclusion chromatography. Proteins were in 20 mM Tris, pH 7.4, 50 mM NaCl. Crystallization of the IFN^/FabM43 complex

[00199] O complexo foi preparado por mistura de IFNw com FabM43 em razão molar de 1,05:1,0 (IFNw em excesso), p urificado sobre a coluna Superdex 200 equilibrada com acetato de Na 20 mM, pH 5,5, NaCl 0,1 M e glicerol 10%. O complexo purificado foi concentrado até 10,24 mg/ml usando Amicon-Ultra com corte de 10 kDa. Cristais apropriados para difração de raios X foram obtidos em gotas sentadas de MES 0,1 M, pH 6,5, PEG 3350 26%, LiCl 1 M, 1- butanol 0,7% com semeadura de MMS como descrito (Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-33, 2010). Coleta de dados de raios X e determinação da estrutura[00199] The complex was prepared by mixing IFNw with FabM43 in a molar ratio of 1.05:1.0 (IFNw in excess), purified on a Superdex 200 column equilibrated with 20 mM Na acetate, pH 5.5, 0.1 M NaCl and 10% glycerol. The purified complex was concentrated to 10.24 mg/ml using Amicon-Ultra with 10 kDa cutoff. Crystals suitable for X-ray diffraction were obtained from seated drops of 0.1 M MES, pH 6.5, 26% PEG 3350, 1 M LiCl, 0.7% 1-butanol with MMS seeding as described (Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-33, 2010). X-ray data collection and structure determination

[00200] Para a coleta dos raios X, cristais foram mergulhados por alguns segundos em um licor-mãe sintético (MES 0,1 M, pH 6,5, PEG 3350 20%, LiCl 1 M) e foram congelados em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios-X foram coletados em Swiss Light Source. Os dados de raios-X foram tratados com o programa XDS (Kabsch, Acta Crystallographica 66:125-132, 2010). As estatísticas dos dados de raios X são dadas na Tabela 6.[00200] For the collection of X-rays, crystals were immersed for a few seconds in a synthetic mother liquor (MES 0.1 M, pH 6.5, PEG 3350 20%, LiCl 1 M) and were frozen in liquid nitrogen. X-ray diffraction data were collected at Swiss Light Source. X-ray data were processed with the XDS program (Kabsch, Acta Crystallographica 66:125-132, 2010). X-ray data statistics are given in Table 6.

[00201] A estrutura foi resolvida por substituição molecular (MR) com Phaser (Read, Acta Crystallogr D Bio Crystallogr 57:1373-82, 2001). Os modelos de pesquisa para MR foram a estrutura cristalina do Fab15 ((PDB ID 3NCJ; Luo et al., J Mol Biol 402:708-719, 2010) e IFN-α2 (PDB ID 1RH2; Radhakrishnan et al., Structure 4:14531463, 1996)), o modelo de Cα que estava disponível no PDB. Para usar MR, o modelo molecular completo de IFN-α2 foi obtido por MR usando Phaser com as coordenadas de Ca e dados de reflexão no PDB, e refinado com PHENIX (Adams et al., J Syncrhrotron Radiat 11:53-55, 2004). A estrutura de IFN-w/FabM43 foi refinada usando PHENIX e os ajustes do modelo foram realizados utilizando COOT (Emsley and Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:21262132, 2004). Todos os outros cálculos cristalográficos foram realizados com a suíte de programas CCP4 (Collaborative Computational project, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255, 1994). O ângulo de cotovelo entre os domínios constante e variável foi calculado com o programa RBOW (Stanfield et al., J Mol Biol 357:1566-1574, 2006). Os gráficos moleculares foram gerados com PyMOL (DeLano, Palo Alto, CA, USA, Delano-Scientific). As estatísticas de refinamento são dadas na Tabela 6. Tabela 6. Dados da cristalografia e estatísticas de refinamento. aRmerge = ∑|I - <I>| / ∑I, onde I é a intensidade da reflexão medida e <I> é a intensidade média de todas as medições desta reflexão. bRcrist = ∑ ||Fobs| - |Fcalc|| / ∑ |Fobs|, onde Fobs e Fcalc são fatores de estru-tura observados e calculados e Rlivre é calculado para um conjunto de 5% escolhidos aleatoriamente de reflexões antes do refinamento. cA plotagem de Ramachandran foi calculada com MolProbity. dOs limites de resolução anisotrópica em a*, b* e c* são 3,0, 2,5 e 2,5 Â, de acordo com o servidor da escala de anisotropia de difração (http://_services_mbi_ucla.edu/_anisoscale/). As estatísticas dos dados de difração são para o conjunto de dados após truncamento aniso- trópico e alteração de escala usando esses limites. Resultados[00201] The structure was resolved by molecular replacement (MR) with Phaser (Read, Acta Crystallogr D Bio Crystallogr 57:1373-82, 2001). The research models for MR were the crystal structure of Fab15 ((PDB ID 3NCJ; Luo et al., J Mol Biol 402:708-719, 2010) and IFN-α2 (PDB ID 1RH2; Radhakrishnan et al., Structure 4:14531463, 1996)), the Cα model that was available in the PDB. To use MR, the complete molecular model of IFN-α2 was obtained by MR using Phaser with the Ca coordinates and reflection data in the PDB, and refined with PHENIX (Adams et al., J Syncrhrotron Radiat 11:53-55, 2004). The structure of IFN-w/FabM43 was refined using PHENIX and model fits were performed using COOT ( Emsley and Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:21262132, 2004 ). All other crystallographic calculations were performed with the CCP4 suite of programs (Collaborative Computational project, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53:240-255, 1994). The elbow angle between constant and variable domains was calculated with the RBOW program (Stanfield et al., J Mol Biol 357:1566-1574, 2006). Molecular plots were generated with PyMOL (DeLano, Palo Alto, CA, USA, Delano-Scientific). Refinement statistics are given in Table 6. Table 6. Crystallographic data and refinement statistics. aRmerge = ∑|I - <I>| / ∑I, where I is the intensity of the measured reflection and <I> is the average intensity of all measurements of this reflection. bRcrist = ∑ ||Fobs| - |Fcalc|| / ∑ |Fobs|, where Fobs and Fcalc are observed and calculated structure factors and Rfree is calculated for a randomly chosen 5% set of reflections before refinement. cThe Ramachandran plot was calculated with MolProbity. dAnisotropic resolution limits at a*, b*, and c* are 3.0, 2.5, and 2.5 Å, as per the Diffraction Anisotropy Scale Server (http://_services_mbi_ucla.edu/_anisoscale/). Diffraction data statistics are for the data set after anisotropic truncation and scaling using these limits. Results

A estrutura totalthe overall structure

[00202] Há seis complexos de IFNw/FabM43 na unidade assimétrica. Todos estes complexos são muito similares. A estrutura representativa molecular total do complexo é mostrada na Figura 4. Na Figura: O marcado com H é VH; o marcado com L é VL, e na parte superior esquerda é IFNw.[00202] There are six IFNw/FabM43 complexes in the asymmetric unit. All these complexes are very similar. The representative full molecular structure of the complex is shown in Figure 4. In the Figure: The one marked with H is VH; the one marked with L is VL, and at the top left is IFNw.

[00203] As moléculas de IFNw têm conformação essencialmente idêntica a um rmsd de Cα médio de menos de 0,35 Â. A estrutura molecular de IFNw é um feixe helicoidal que é muito similar ao IFN-α2 com um rmsd de Ca médio de 0,53 Â e quase idêntico ao IFN-w publicado (pdb id 3se4) com rmsd de Cα de 0,47 Â e IFNβ (rmsd de Cα de 0,85 Â para 94 resíduos). Entretanto, há algumas diferenças significativas entre IFNα/w e IFN-β porque a alça AB de IFNp é um resíduo mais curto. As moléculas de Fab também têm estruturas idênticas exceto para uma pequena extensão em CDR-H1 (G26GTF29) (SEQ ID NO: 33), que adota conformações ligeiramente diferentes da cadeia principal. As interações de epitopo, parátopo e Ab/Ag[00203] IFNw molecules have essentially identical conformation with an average Cα rmsd of less than 0.35 Å. The molecular structure of IFNw is a helical bundle that is very similar to IFN-α2 with an average Ca rmsd of 0.53 Å and nearly identical to published IFN-w (pdb id 3se4) with Cα rmsd of 0.47 Å and IFNβ (Cα rmsd of 0.85 Å for 94 residues). However, there are some significant differences between IFNα/w and IFN-β because the AB loop of IFNp is one residue shorter. The Fab molecules also have identical structures except for a small stretch in CDR-H1 (G26GTF29) (SEQ ID NO: 33), which adopts slightly different conformations from the main chain. The epitope, paratope, and Ab/Ag interactions

[00204] M43 reconhece um epitopo conformacional que é composto de resíduos de alça AB (entre R22 e P40) e os resíduos K134, M146, M149, K150, L154 e F153 da hélice E (Tabela 7). O parátopo é composto de resíduos de cinco das seis CDRs. Os resíduos de parátopo são principalmente hidrofóbicos, que formam uma série de bolsos em que se encaixam as cadeias laterais dos resíduos F27, L30, K31 e R33 do curto hélice AB. As interações de anticorpo e antígeno parecem ser principalmente vdw e empacotamento hidrofóbico. Há apenas um pequeno número de ligações H entre o anticorpo e o antígeno, e a maioria delas envolve interações de cadeia principal-cadeia principal ou cadeia lateral-cadeia principal. Vários resíduos F27, L30, K31 e R33 da hélice AB são levados em consideração para a maioria das interações Ab/Ag. Dessa forma, esta região de IFNw parece constituir a parte principal do epitopo. Tabela 7 Epitopo e parátopo do anticorpo M43. Os resíduos de contato para todos os seis complexos são mostrados. A numeração do resíduo de acordo com IFN^ humano da SEQ ID NO: 1 [00204] M43 recognizes a conformational epitope that is composed of AB loop residues (between R22 and P40) and residues K134, M146, M149, K150, L154 and F153 of the E helix (Table 7). The paratope is composed of residues from five of the six CDRs. Paratope residues are primarily hydrophobic, forming a series of pockets into which the side chains of residues F27, L30, K31 and R33 of the short AB helix fit. Antibody and antigen interactions appear to be primarily vdw and hydrophobic packaging. There are only a small number of H bonds between antibody and antigen, and most of these involve main-chain-main-chain or side-chain-main-chain interactions. Several residues F27, L30, K31 and R33 of the AB helix are taken into account for most Ab/Ag interactions. Thus, this region of IFNw appears to constitute the main part of the epitope. Table 7 Epitope and paratope of M43 antibody. Contact residues for all six complexes are shown. Residue numbering according to human IFNγ of SEQ ID NO: 1

[00205] Todos os resíduos dentro de 3,9 Â dos parceiros de ligação são considerados resíduos de contato. Os resíduos VL e VH do anticorpo são numerados sequencialmente. Modo de neutralização de anticorpo[00205] All residues within 3.9 Â of the binding partners are considered contact residues. The VL and VH residues of the antibody are numbered sequentially. Antibody Neutralization Mode

[00206] A estrutura cristalina de IFNα/w em complexo com IFNAR1 e/ou IFNAR2 tem sido recentemente relatada (Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011). Comparando a estrutura de M43/IFNα4 e do complexo IFNw/IFNAR1/IFNAR2 indica claramente que a cadeia pesada de M43 e IFNAR2 iriam se sobrepor. Dessa forma, M43 neutraliza pelo bloqueio das interações de IFNAR2/IFN. Exemplo 6. Epitopo de C2595 das estruturas cristalinas de Fab357 (Fab de C2595) em complexos com IFN^T80E ou IFNα4A[00206] The crystal structure of IFNα/w in complex with IFNAR1 and/or IFNAR2 has recently been reported ( Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011 ). Comparing the structure of M43/IFNα4 and the IFNw/IFNAR1/IFNAR2 complex clearly indicates that the heavy chain of M43 and IFNAR2 would overlap. Thus, M43 neutralizes by blocking IFNAR2/IFN interactions. Example 6. C2595 epitope from crystal structures of Fab357 (C2595 Fab) in complexes with IFNγT80E or IFNα4A

[00207] C2595 (a seguir chamado de C2595 e Fab357 para mAb e Fab, respectivamente) é um anticorpo que neutraliza múltiplas moléculas de IFN-α humano e IFNw obtidos a partir do hibridoma de camun- dongo. As regiões V foram clonadas e quimerizadas para cadeias pe-sadas e leves humanas (isotipo IgGlK) para produzir o Fab357 recom- binante. As estruturas cristalinas dos complexos de IFN-w/Fab357 e IFN-α4A/Fab357 foram determinadas.[00207] C2595 (hereinafter called C2595 and Fab357 for mAb and Fab, respectively) is an antibody that neutralizes multiple molecules of human IFN-α and IFNw obtained from mouse hybridoma. V regions were cloned and chimerized to human heavy and light chains (IgGlK isotype) to produce recombinant Fab357. The crystal structures of the IFN-w/Fab357 and IFN-α4A/Fab357 complexes were determined.

Materiais e MétodoMaterials and Method ProteínasProteins

[00208] O Fab357 marcado com His (isotipo IgGlK) e um IFNw humano com a mutação T80E (a seguir chamado de IFNwT80E. IFNw e IFNw com T80E são sinônimos neste exemplo) foram expressos em células HEK293F e purificados usando cromatografia por afinidade e de exclusão de tamanho. As proteínas estavam em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM.). IFNα4A foi obtido junto a Crown Bioscience Inc. em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM.[00208] His-tagged Fab357 (IgGlK isotype) and a human IFNw with the T80E mutation (hereinafter referred to as IFNwT80E. IFNw and IFNw with T80E are synonymous in this example) were expressed in HEK293F cells and purified using affinity and size exclusion chromatography. Proteins were in 20 mM Tris, pH 7.4, 50 mM NaCl.). IFNα4A was obtained from Crown Bioscience Inc. in 20 mM Tris, pH 7.4, 50 mM NaCl.

Cristalização de complexos de IFNα4A/Fab357 e IFN^/Fab357Crystallization of IFNα4A/Fab357 and IFNα4/Fab357 complexes

[00209] O complexo de IFNα4A/Fab357 foi preparado por mistura de IFNα4A com Fab357 em razão molar de 1,05:1,0 e purificado através de uma coluna Superdex 200 em MES 20 mM, pH 6,5 com NaCl 0,1 M. O complexo purificado foi concentrado para 5,5 mg/ml. Cristais de qualidade de difração foram cultivados em gotas sentadas compostas de mistura igual da solução de proteína e PEG 3350 20% e citrato de amônio 0,2 M com semeadura.[00209] The IFNα4A/Fab357 complex was prepared by mixing IFNα4A with Fab357 in a molar ratio of 1.05:1.0 and purified through a Superdex 200 column in 20 mM MES, pH 6.5 with 0.1 M NaCl. The purified complex was concentrated to 5.5 mg/ml. Diffractive quality crystals were grown in sitting beads composed of equal mixture of protein solution and 20% PEG 3350 and 0.2 M ammonium citrate with seeding.

[00210] O complexo de IFNw/Fab357 foi preparado por mistura de IFNw com Fab357 em razão molar de 1,17:1,0 (IFNw em excesso), incubado a 4°C por 2 horas, e o complexo de IFNw/Fab357 foi purificado em uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare), equilibrada com HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 0,1 M, e concentrado a 6,8 mg/ml. Cristais apropriados para difração de raios X foram obtidos de gotas sentadas compostas de mistura igual do complexo de proteína e MES 100 mM pH 6,5, PEG 3K 18%, LiCl 0,2 M com semeadura. Coleta de dados de raios X e determinação da estrutura[00210] The IFNw/Fab357 complex was prepared by mixing IFNw with Fab357 in a molar ratio of 1.17:1.0 (IFNw in excess), incubated at 4°C for 2 hours, and the IFNw/Fab357 complex was purified on a Superdex 200 column (GE Healthcare), equilibrated with 20 mM HEPES pH 7.5, 0.1 M NaCl, and concentrated at 6.8 mg/ml. Crystals suitable for X-ray diffraction were obtained from seated beads composed of equal mixture of protein complex and 100 mM MES pH 6.5, 18% PEG 3K, 0.2 M LiCl with seeding. X-ray data collection and structure determination

[00211] Para a coleta de dados de raios-X, cristais de IFNα4A/Fab357 e IFNw/Fab357 foram mergulhados durante alguns segundos nos licores-mães sintéticos (PEG 3350 20%, citrato de amô- nio 0,2 M, Placa 10/20/11-MMS-A10; MES 0,1 pH 6,5, PEG 3350 18%, LiCl 0,2 M, Placa 12/21/2011-B11(R), respectivamente) suplementados com glicerol 20%, e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. Os dados de difração de raios-X foram coletados no Advance Photon Source do Argonne National Lab e Swiss Light Source, respectivamente. Os dados de raios X foram processados com o programa XDS. As estatísticas dos dados de raios X são dadas na Tabela 8.[00211] For the collection of X-ray data, crystals of IFNα4A/Fab357 and IFNw/Fab357 were immersed for a few seconds in synthetic mother liquors (PEG 3350 20%, ammonium citrate 0.2 M, Plate 10/20/11-MMS-A10; MES 0.1 pH 6.5, PEG 3350 18%, 0.2 M LiCl, Plate 12/21/2011-B11(R), respectively) supplemented with 20% glycerol, and rapidly frozen in liquid nitrogen. X-ray diffraction data were collected from Argonne National Lab's Advance Photon Source and Swiss Light Source, respectively. X-ray data were processed with the XDS program. X-ray data statistics are given in Table 8.

[00212] As estruturas foram resolvidas por substituição molecular (MR) com Phaser. Os modelos de pesquisa para MR foram a estrutura cristalina de Fab15 (PDB ID 3NCJ) e IFNw no complexo com M43. As estruturas foram refinadas utilizando PHENIX5 e os ajustes do modelo foram realizados utilizando COOT. Todos os outros cálculos cristalo- gráficos foram realizados com a suíte de programas CCP4. Os gráficos moleculares foram gerados com PyMOL. As estatísticas de refinamento são dadas na Tabela 8. Tabela 8. Dados do cristal e estatísticas de refinamento. aRmerge = ∑|I - <I>| / ∑I, onde I é a intensidade da reflexão medida e <I> é a intensidade média de todas as medições desta reflexão. bRcrist = ∑ ||Fobs| - |Fcaic|| / ∑ |Fobs|, onde Fobs e Fcaic são fatores de estru-tura observados e calculados e Rlivre é calculado para um conjunto de 5% escoihidos aieatoriamente de refiexões antes do refinamento.[00212] The structures were resolved by molecular replacement (MR) with Phaser. The research models for MR were the crystal structure of Fab15 (PDB ID 3NCJ) and IFNw in complex with M43. The structures were refined using PHENIX5 and model adjustments were performed using COOT. All other crystallographic calculations were performed with the CCP4 suite of programs. Molecular graphs were generated with PyMOL. Refinement statistics are given in Table 8. Table 8. Crystal data and refinement statistics. aRmerge = ∑|I - <I>| / ∑I, where I is the intensity of the measured reflection and <I> is the average intensity of all measurements of this reflection. bRcrist = ∑ ||Fobs| - |Fcaic|| / ∑ |Fobs|, where Fobs and Fcaic are observed and calculated structure factors and Rfree is calculated for a randomly chosen 5% set of reflections before refinement.

[00213] A piotagem de Ramachandran foi caicuiada com MoiProbity. Resultados A estrutura total[00213] Ramachandran hacking was handled with MoiProbity. Results The total structure

[00214] Há um complexo antígeno/anticorpo na unidade assimétrica em ambas as estruturas cristalinas. As estruturas moleculares repre-sentativas totais são mostradas na Figura 5. A molécula de Fab é muito similar em ambos os cristais. A conformação de IFNα4A é muito similar àquela em IFNα4A/FabM88. Para a estrutura de IFNw/Fab357, o modelo de IFNw inclui somente os resíduos R22-P39 e L118-L154. Os resíduos ausentes de IFNw não são um resultado da desordem no porque o empacotamento cristalino cristal impede a sua presença. Aparentemente, a clivagem proteolítica de IFNw ocorreu durante a cristalização. Houve evidência de que parte do mesmo complexo estando no refrigerador tenha sofrido alguma degradação de protease, apesar de o padrão não ser idêntico ao que foi identificado no cristal (dados não mostrados). No entanto, as regiões de ligação de IFNw foram bem ordenadas. As interações de epitopo, parátopo e Ab/Ag[00214] There is an antigen/antibody complex in the asymmetric unit in both crystal structures. The overall representative molecular structures are shown in Figure 5. The Fab molecule is very similar in both crystals. The conformation of IFNα4A is very similar to that of IFNα4A/FabM88. For the IFNw/Fab357 structure, the IFNw template only includes residues R22-P39 and L118-L154. The missing IFNw residues are not a result of the disorder because crystalline crystal packing prevents their presence. Apparently, proteolytic cleavage of IFNw occurred during crystallization. There was evidence that part of the same complex being in the refrigerator had undergone some protease degradation, although the pattern was not identical to what was identified in the crystal (data not shown). However, the IFNw binding regions were well ordered. The epitope, paratope, and Ab/Ag interactions

[00215] C2595 reconhece um epitopo conformacional quase idênti co tanto em IFNα4A como IFNw que é composto de resíduos da alça AB (entre R/G22 e R/H34) e os resíduos V143, M/A146, E147 e R/K150 da hélice E (Tabela 9). O parátopo é composto de resíduos de quatro das seis CDRs (CDR-L1, L3, H2 e H3). Os resíduos de paráto- po são principalmente hidrofóbicos, que formam uma série de bolsos em que se encaixam as cadeias laterais dos resíduos F27, L30, K31 e R33 da curta hélice AB. As interações de anticorpo e antígeno parecem ser principalmente vdw e empacotamento hidrofóbico. Há apenas um pequeno número de ligações H entre o anticorpo e o antígeno, e a maioria delas envolve interações de cadeia principal-cadeia principal ou cadeia lateral-cadeia principal. Vários resíduos F27, L30, K31 e R33 da hélice AB são levados em consideração para a maioria das interações Ab/Ag. Dessa forma, esta região de IFNw parece constituir a parte principal do epitopo. Tabela 9. Epitopo e parátopo do anticorpo C2595. Os resíduos de contato para todos os seis complexos são mostrados. Numeração de resíduos de acordo com IFN-w SEQ ID NO: 1 e IFN-α4a da SEQ ID NO: 19. [00215] C2595 recognizes a nearly identical conformational epitope in both IFNα4A and IFNw that is composed of AB loop residues (between R/G22 and R/H34) and residues V143, M/A146, E147, and R/K150 of the E helix (Table 9). The paratope is composed of residues from four of the six CDRs (CDR-L1, L3, H2 and H3). Paratope residues are primarily hydrophobic, forming a series of pockets into which the side chains of residues F27, L30, K31, and R33 of the short AB helix fit. Antibody and antigen interactions appear to be primarily vdw and hydrophobic packaging. There are only a small number of H bonds between antibody and antigen, and most of these involve main-chain-main-chain or side-chain-main-chain interactions. Several residues F27, L30, K31 and R33 of the AB helix are taken into account for most Ab/Ag interactions. Thus, this region of IFNw appears to constitute the main part of the epitope. Table 9. Epitope and paratope of the C2595 antibody. Contact residues for all six complexes are shown. Residue numbering according to IFN-w SEQ ID NO: 1 and IFN-α4a of SEQ ID NO: 19.

[00216] Todos os resíduos dentro de 3,9 Â dos parceiros de ligação são considerados resíduos de contato. Os resíduos VL e VH do anticorpo são numerados sequencialmente. Modo de neutralização de anticorpo[00216] All residues within 3.9 Â of the binding partners are considered contact residues. The VL and VH residues of the antibody are numbered sequentially. Antibody Neutralization Mode

[00217] C2595 neutraliza pelo bloqueio das interações de IFNAR2/IFN. Exemplo 7. Epitopo de M88 derivado da estrutura cristalina do anticorpo M88 anti-IFNα em complexo com IFNα4A[00217] C2595 neutralizes by blocking IFNAR2/IFN interactions. Example 7. M88 epitope derived from the crystal structure of anti-IFNα antibody M88 in complex with IFNα4A

[00218] A estrutura cristalina do anticorpo M88 anti-IFN em complexo com IFNα4A foi determinada a 2,5 Â. O principal epitopo é o elemento helicoidal A19-D35 da alça AB de IFN. A ligação de M88 irá evitar as inte-rações de IFNAR2. Dessa forma, M88 é um bloqueador de IFNAR2. A estrutura esclarece a reatividade cruzada da ligação de M88.[00218] The crystal structure of the anti-IFN antibody M88 in complex with IFNα4A was determined at 2.5 Å. The main epitope is the helical element A19-D35 of the AB loop of IFN. Binding of M88 will avoid IFNAR2 interactions. In this way, M88 is an IFNAR2 blocker. The structure accounts for the cross-linking reactivity of M88.

[00219] IFWM88 (a seguir chamado de M88 e FabM88 para mAb e Fab, respectivamente) é um anticorpo que neutraliza IFNa humano. O mAb M88 mostra ligação a vários subtipos de IFNα, mas pouca ligação ao IFNw humano. Materiais e Métodos Proteínas[00219] IFWM88 (hereinafter referred to as M88 and FabM88 for mAb and Fab, respectively) is an antibody that neutralizes human IFNa. mAb M88 shows binding to several subtypes of IFNα, but little binding to human IFNw. Materials and Methods Proteins

[00220] O FabM88 marcado com His (isotipo IgG1/kappa) foi clona- do e expresso em células HEK293F e purificado usando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. O Fab foi recebido em Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM. IFNα4A foi obtido a partir da coroa Bioscience Inc. (em 20 mM de Tris, pH 7,4, NaCl 50 mM. Cristalização do complexo de IFNα4A/FabM88[00220] His-tagged FabM88 (IgG1/kappa isotype) was cloned and expressed in HEK293F cells and purified using affinity and size exclusion chromatography. The Fab was received in 20 mM Tris, pH 7.4, 50 mM NaCl. IFNα4A was obtained from Crown Bioscience Inc. (in 20 mM Tris, pH 7.4, 50 mM NaCl. Crystallization of the IFNα4A/FabM88 complex

[00221] O complexo foi preparado pela mistura de IFNα4A com FabM88 na razão molar de 1,05:1,0 (IFNα4A em excesso), incubado a 4°C durante uma hora, diluído 20 vezes com Tris 20 mM, pH 8,0, glicerol 10%, NaCl 0,1 M, em seguida, concentrada até 9,25 mg/ml usando Ami- con-Ultra com corte de 10 kDa. A cristalização inicial foi configurada com o conjunto IH1, IH2 e PEGs (Qiagen). A cristalização do complexo foi executada pelo método de difusão de vapor a 20°C utilizando um robô Oryx4 (Douglas Instruments). Cristais apareceram de IH2#E12- 25% PEG 3K, citrato de amônio 0,2M. Estes cristais iniciais foram usados para preparar as sementes de cristalização. Para otimizar a qualidade do cristal, o complexo IFNα4A/FabM88 foi purificado numa coluna Superdex 200 (GE Healthcare), equilibrada com MES 20 mM pH 6,5, NaCl 0,1 M, glicerol 10% e concentrada até 8,16 mg/ml. Cristais apropriados para di- fração de raios X foram obtidos a partir de PEG 3K 28%, citrato de amô- nio 0,2 M com semeadura de MMS como descrito (Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-935, 2010). Coleta de dados de raios X e determinação da estrutura[00221] The complex was prepared by mixing IFNα4A with FabM88 in a molar ratio of 1.05:1.0 (IFNα4A in excess), incubated at 4°C for one hour, diluted 20-fold with 20 mM Tris, pH 8.0, 10% glycerol, 0.1 M NaCl, then concentrated to 9.25 mg/ml using Amicon-Ultra with a cutoff of 1 0 kDa. The initial crystallization was set up with the IH1, IH2 and PEGs set (Qiagen). Crystallization of the complex was performed by the vapor diffusion method at 20°C using an Oryx4 robot (Douglas Instruments). Crystals appeared from IH2#E12- 25% PEG 3K, 0.2M ammonium citrate. These starter crystals were used to prepare crystallization seeds. To optimize crystal quality, the IFNα4A/FabM88 complex was purified on a Superdex 200 column (GE Healthcare), equilibrated with 20 mM MES pH 6.5, 0.1 M NaCl, 10% glycerol and concentrated to 8.16 mg/ml. Crystals suitable for X-ray diffraction were obtained from 28% PEG 3K, 0.2 M ammonium citrate with MMS seeding as described (Obmolova et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66:927-935, 2010). X-ray data collection and structure determination

[00222] Para coleta de dados de raios X, um cristal foi mergulhado por alguns segundos em um licor-mãe sintético suplementado com gli- cerol 20% e congelado rapidamente na corrente de nitrogênio a 95 K. Os dados de difração de raios X foram coletados usando um gerador de raios X de microfoco Rigaku MicroMax™-007HF equipado com elementos óticos Osmic™ VariMax™ confocais, detector Saturn 944 CCD e um sistema de criocongelamento X-stream™ 2000 (Rigaku, TX). As intensidades de difração foram detectadas ao longo de uma rotação de cristal de 235° em imagens de meio-grau. Os dados de raios X foram processados com o programa XDS. As estatísticas dos dados de raios X são dadas na Tabela 10.[00222] For X-ray data collection, a crystal was immersed for a few seconds in a synthetic mother liquor supplemented with 20% glycerol and quickly frozen in a stream of nitrogen at 95 K. X-ray diffraction data were collected using a Rigaku MicroMax™-007HF microfocus X-ray generator equipped with confocal Osmic™ VariMax™ optical elements, Saturn 944 CCD detector and an X cryo-freezing system -stream™ 2000 (Rigaku, TX). Diffraction intensities were detected over a crystal rotation of 235° in half-degree images. X-ray data were processed with the XDS program. X-ray data statistics are given in Table 10.

[00223] A estrutura foi resolvida por substituição molecular (MR) com Phaser. Os modelos de pesquisa para MR foram a estrutura cristalina de Fab15 (PDB ID 3NCJ) e IFNα2 (PDB ID 1RH2), o modelo de Cα que estava disponível no PDB. Para usar MR, o modelo molecular completo de IFN-α2 foi obtido por MR usando Phaser com as coordenadas de Cα e dados de reflexão no PDB, e refinado com PHENIX. A estrutura de IFNα4A/FabM88 foi refinada utilizando PHENIX e os ajustes do modelo foram realizados utilizando COOT. Todos os outros cálculos cristalográficos foram realizados com a suíte de programas CCP4. O ângulo de cotovelo entre os domínios constante e variável foi calculado com o programa RBOW. Todos os gráficos moleculares foram gerados com Pymol. As estatísticas de refinamento da estrutura são dadas na Tabela 10. Tabela 10. Dados de cristalografia e estatísticas de refinamento. aValores para o envoltório com alta resolução estão entre parênteses bBaixa totalidade porque os envoltórios de resolução mais alta contêm apenas as reflexões nos cantos do detector. Resultados A estrutura total[00223] The structure was resolved by molecular replacement (MR) with Phaser. The research models for MR were the crystal structure of Fab15 (PDB ID 3NCJ) and IFNα2 (PDB ID 1RH2), the Cα model that was available in the PDB. To use MR, the complete molecular model of IFN-α2 was obtained by MR using Phaser with the Cα coordinates and reflection data in the PDB, and refined with PHENIX. The structure of IFNα4A/FabM88 was refined using PHENIX and model fits were performed using COOT. All other crystallographic calculations were performed with the CCP4 suite of programs. The elbow angle between the constant and variable domains was calculated using the RBOW program. All molecular plots were generated with Pymol. Structure refinement statistics are given in Table 10. Table 10. Crystallographic data and refinement statistics. aValues for the high resolution envelope are in parentheses bLow totality because the higher resolution envelopes only contain the reflections at the corners of the detector. Results The total structure

[00224] A estrutura molecular global do complexo de IFNα4A/FabM88 é mostrada na figura 6. Há dois destes complexos na unidade assimétrica. Os modelos moleculares para as duas moléculas de IFNα4A independentes incluem os resíduos 7 a 102 e 113 a 160 para um e 12 a 102 e 113 a 160 para o outro. A alça de ligação entre os resíduos 103 e 112 em ambas moléculas é desordenada. As duas moléculas de Fab contêm os resíduos 1 a 212 para a cadeia leve e de 1 a 221 para a cadeia pesada. O marcador 6xHis C-terminal e ligação dissulfeto intercadeia são desordenados.[00224] The overall molecular structure of the IFNα4A/FabM88 complex is shown in figure 6. There are two of these complexes in the asymmetric unit. Molecular models for the two independent IFNα4A molecules include residues 7 to 102 and 113 to 160 for one and 12 to 102 and 113 to 160 for the other. The connecting loop between residues 103 and 112 in both molecules is scrambled. The two Fab molecules contain residues 1 to 212 for the light chain and 1 to 221 for the heavy chain. The C-terminal 6xHis tag and interchain disulfide bond are scrambled.

[00225] As duas moléculas de IFNα4A têm conformação essencialmente idêntica a um rmsd médio de 0,132 A para 122 átomos de Cα. As duas moléculas de Fab também têm estruturas idênticas a um rmsd médio menor que 0,5 Â para o Fab total. De forma interessante, os dois Fabs têm ângulos de cotovelo quase idênticos (172 e 174 graus) de acordo com RBOW. Estrutura de IFNα[00225] The two IFNα4A molecules have essentially identical conformation at an average rmsd of 0.132 A for 122 Cα atoms. The two Fab molecules also have identical structures with an average rmsd of less than 0.5 Å for total Fab. Interestingly, the two Fabs have nearly identical elbow angles (172 and 174 degrees) according to RBOW. IFNα structure

[00226] A estrutura molecular de IFNα4A (Figura 7A) é muito similar à IFNα2 com um rmsd de Ca médio de 0,5 a 0,7 Â. Também é muito similar a IFNw (Figura 7B, rmsd de Cα de 0,61 Â para 112 resíduos) e IFNβ (Figura 7C, rmsd de Cα de 0,85 Â para 94 resíduos). Existem algumas diferenças significativas entre IFNα/w e IFNβ devido a um resíduo mais curto na alça AB de IFNβ (Figura 7D). As interações de epitopo, parátopo e Ab/Ag[00226] The molecular structure of IFNα4A (Figure 7A) is very similar to IFNα2 with an average Ca rmsd of 0.5 to 0.7 Å. It is also very similar to IFNw (Figure 7B, Cα rmsd of 0.61 Å for 112 residues) and IFNβ (Figure 7C, Cα rmsd of 0.85 Å for 94 residues). There are some significant differences between IFNα/w and IFNβ due to a shorter residue in the AB loop of IFNβ (Figure 7D). The epitope, paratope, and Ab/Ag interactions

[00227] M43 reconhece um epitopo conformacional que é com posto de resíduos da alça AB (entre A19 e D35) e os resíduos V143, A146, E147 e R150 da hélice E (Tabela 11). O parátopo é composto de resíduos de todas as seis CDR. Os resíduos de parátopo são principalmente hidrofóbicos, que formam uma série de bolsos em que se encaixam as cadeias laterais dos resíduos F27, L30, K31 e R33 da curta hélice AB. As interações de anticorpo e antígeno parecem ser principalmente vdw e empacotamento hidrofóbico. Há apenas um pequeno número de ligações H entre o anticorpo e o antíge- no, e a maioria delas envolve interações de cadeia principal-cadeia principal ou cadeia lateral-cadeia principal. Vários resíduos F27, L30, K31 e R33 da hélice AB são levados em consideração para a maioria das interações Ab/Ag. Dessa forma, esta região da IFNα4A constitui a parte principal do epitopo. F50 de VL não está em contato direto com o antígeno na estrutura. Mas a sua cadeia lateral está na vizinhança de Y32 (VL) e P105 (VH), que estão envolvidos na ligação. Talvez este resíduo foi selecionado por seu apoio à estrutura local de CDR-H3 para favorecer a ligação. Tabela 11. Epitopo e parátopi o do anticorpo M88. [00227] M43 recognizes a conformational epitope that is composed of AB loop residues (between A19 and D35) and residues V143, A146, E147 and R150 of the E helix (Table 11). The paratope is composed of residues from all six CDRs. The paratope residues are mainly hydrophobic, which form a series of pockets into which the side chains of residues F27, L30, K31 and R33 of the short AB helix fit. Antibody and antigen interactions appear to be primarily vdw and hydrophobic packaging. There are only a small number of H bonds between antibody and antigen, and most of these involve main-chain-main-chain or side-chain-main-chain interactions. Several residues F27, L30, K31 and R33 of the AB helix are taken into account for most Ab/Ag interactions. Thus, this region of IFNα4A constitutes the main part of the epitope. VL F50 is not in direct contact with the antigen in the structure. But its side chain is in the vicinity of Y32 (VL) and P105 (VH), which are involved in binding. Perhaps this residue was selected for its support for the local structure of CDR-H3 to favor binding. Table 11. Epitope and paratope of the M88 antibody.

[00228] Todos os resíduos dentro de 3,9 A dos parceiros de ligação são considerados resíduos de contato. Os resíduos VL e VH do anti- corpo são numerados sequencialmente. LHI e ABJ representam os dois complexos. Projeto baseado em estrutura de bibliotecas para aprimorar a reativi- dade cruzada e afinidade[00228] All residues within 3.9 A of the binding partners are considered contact residues. The VL and VH residues of the antibody are numbered sequentially. LHI and ABJ represent the two complexes. Framework-based design of libraries to improve cross-reactivity and affinity

[00229] M88 liga-se fortemente a vários subtipos de IFNα, mas liga se fracamente a IFNw. Duas estratégias são possíveis com base na estrutura complexa corrente, bem como de modelagem molecular usando as estruturas de IFNw. Uma estratégia é estender a CDR-L1 (biblioteca extL1), pela criação de interações Ab/Ag adicionais, mantendo todos os contatos correntes na estrutura de IFNα4A/M88. Com- paração estrutural e de sequência mostram que um fragmento de su-perfície de 5 resíduos (D32, H34, D35, Y130 e K134) é 100% conservado entre todos os subtipos de IFNα (Tabela 12). [00229] M88 binds strongly to several subtypes of IFNα, but binds weakly to IFNw. Two strategies are possible based on the current complex structure, as well as molecular modeling using the IFNw structures. One strategy is to extend the CDR-L1 (extL1 library) by creating additional Ab/Ag interactions while maintaining all current contacts in the IFNα4A/M88 structure. Structural and sequence comparison show that a 5-residue surface fragment (D32, H34, D35, Y130 and K134) is 100% conserved among all IFNα subtypes (Table 12).

[00230] Quatro destes 5 resíduos também estão conservados exceto R34, em vez de H34 em IFN w. A CDR-L1 está distante deste fragmento de superfície bem conservado. Dessa forma, acredita-se na hipótese de que uma CDR-L1 mais longa, por exemplo, aquela da linhagem germinativa IGKV4-1 (B3), que tem um adicional de 6 resíduos em uma estrutura canônica 3-1-1, será longa o suficiente para entrar em contato com este fragmento. A CDR-L1 mais longa forneceria interações adicionais para todos os subtipos de IFNα e IFNw, dessa forma, melhorando a afinidade e ampliando a especificidade. A sequência da CDR-L1 estendida pode ser otimizada por apresentação de fagos a partir de uma biblioteca. O design da biblioteca de apresentação em fago é mostrado na Tabela 13. As posições de extL1 voltadas para o lado oposto do antígeno não são selecionadas aleatoriamente. A posição F50 de VL é o único resíduo de linhagem germinativa não humana. Estruturalmente aparece para fornecer apoio para CDR-L3. Dessa forma, esta posição também é randomizada para otimizar seu apoio à CDR-L1 estendida. X é qualquer aminoácido Modo de neutralização de anticorpo[00230] Four of these 5 residues are also conserved except R34 instead of H34 in IFN w. CDR-L1 is distant from this well-conserved surface fragment. Thus, it is hypothesized that a longer CDR-L1, for example, that of the germline IGKV4-1 (B3), which has an additional 6 residues in a canonical 3-1-1 structure, will be long enough to come into contact with this fragment. The longer CDR-L1 would provide additional interactions for all IFNα and IFNw subtypes, thereby improving affinity and increasing specificity. The extended CDR-L1 sequence can be optimized by phage display from a library. The design of the phage display library is shown in Table 13. Positions of extL1 facing away from the antigen are not randomly selected. Position F50 of VL is the only non-human germline residue. Structurally it appears to provide support for CDR-L3. Therefore, this position is also randomized to optimize its support for extended CDR-L1. X is any amino acid Antibody Neutralization Mode

[00231] A estrutura cristalina de IFNα/w em complexo com IFNAR1 e/ou IFNAR2 tem sido recentemente relatada (Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011). A figura 8 mostra a sobreposição de M88/IFNα4 no complexo IFNw/IFNAR1/IFNA2. É nítido que HC e IFNAR2 iriam se sobrepor. Dessa forma, M88 neutraliza pelo bloqueio das interações de IFNAR2/IFN. Exemplo 8. Epitopo mínimo em IFNα e IFN^ fornece ampla atividade neutralizante de IFNα/IFN^[00231] The crystal structure of IFNα/w in complex with IFNAR1 and/or IFNAR2 has recently been reported ( Thomas et al., Cell 146:621-632, 2011 ). Figure 8 shows the overlap of M88/IFNα4 in the IFNw/IFNAR1/IFNA2 complex. It is clear that HC and IFNAR2 would overlap. Thus, M88 neutralizes by blocking IFNAR2/IFN interactions. Example 8. Minimal epitope on IFNα and IFNα provides broad IFNα/IFNα neutralizing activity

[00232] As estruturas cristalinas de IFNwT80E/FabM43, IFNα4A/FabM88, IFNα4A/Fab357 (c2595) e IFNw/Fab357 definem um epitopo comum mínimo necessário para uma ampla neutralização de IFNw e múltiplos subtipos de IFNα (Tabela 14). As análises da interação anticorpo/antígeno das quatro estruturas cristalinas indicam que três resíduos na alça AB em IFNα4a (SEQ ID NO: 19) e IFNw (SEQ ID NO: 1), F27, L30 e R33 formam contatos extensos com os anticorpos. Estes resíduos provavelmente fornecem contribuições predominantes ao anticorpo. Dessa forma, F27, L30 e R33 são elementos-chave do epitopo de neutralização cruzada de IFNw/IFNα.[00232] The crystal structures of IFNwT80E/FabM43, IFNα4A/FabM88, IFNα4A/Fab357 (c2595) and IFNw/Fab357 define a minimum common epitope required for broad neutralization of IFNw and multiple IFNα subtypes (Table 14). Analyzes of the antibody/antigen interaction of the four crystal structures indicate that three residues in the AB loop in IFNα4a (SEQ ID NO: 19) and IFNw (SEQ ID NO: 1), F27, L30 and R33 form extensive contacts with the antibodies. These residues likely provide predominant contributions to the antibody. Thus, F27, L30 and R33 are key elements of the cross-neutralizing epitope of IFNw/IFNα.

[00233] O epitopo conformacional é composto de resíduos da alça AB (resíduos 22-34 de IFNw da SEQ ID NO: 1 e de IFNα4a da SEQ ID NO: 19) com um segmento curto helicoidal (27-29) e de resíduos na helicoidal E (134-154 são os mesmos resíduos helicoidais E para IFNw e todos os subtipos de IFNα exceto IFNα2, que é 133 a 153). Em particular, as posições P26, F27, L30, K31, R33 e H34 de IFNw da SEQ ID NO: 1 e os resíduos H26, F27, L30, K31, R33 e H34 de IFNα4a da SEQ ID NO: 19 são reconhecidos pelos anticorpos neutrali- zantes. Estes resíduos são amplamente conservados entre diferentes subtipos de IFNα e IFNw, representando, dessa forma, a reatividade cruzada e especificidade diferencial destes anticorpos, apesar de per- tencerem a diferentes fontes. Os resíduos adicionais de epitopos são R22, R23, I24, S25, D32, D35, M149, K150 ou L154 de IFNw e os re-síduos R19, G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A146, E147, M149, R150 ou S153 de IFNα4a. [00233] The conformational epitope is composed of AB loop residues (residues 22-34 of IFNw of SEQ ID NO: 1 and of IFNα4a of SEQ ID NO: 19) with a short helical segment (27-29) and residues in the E-helical (134-154 are the same E-helical residues for IFNw and all IFNα subtypes except IFNα 2, which is 133 to 153). In particular, positions P26, F27, L30, K31, R33 and H34 of IFNw of SEQ ID NO: 1 and residues H26, F27, L30, K31, R33 and H34 of IFNα4a of SEQ ID NO: 19 are recognized by neutralizing antibodies. These residues are largely conserved among different subtypes of IFNα and IFNw, thus representing the cross-reactivity and differential specificity of these antibodies, despite belonging to different sources. Additional epitope residues are R22, R23, I24, S25, D32, D35, M149, K150 or L154 of IFNw and residues R19, G22, R23, I24, S25, H26, F27, C29, L30, K31, D32, R33, H34, D35, V143, A14 IFNα4a 6, E147, M149, R150 or S153.

Claims (9)

1. Anticorpo monoclonal isolado que se liga e neutraliza uma atividade de (a) interferon ômega humano (IFNw) e (b) pelo menos quatro subtipos de interferon alfa humano (IFNα), caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 23 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 24; ou b) uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 27 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 28.1. Isolated monoclonal antibody that binds to and neutralizes an activity of (a) human omega interferon (IFNw) and (b) at least four subtypes of human interferon alpha (IFNα), characterized in that it comprises: a) an amino acid sequence of the variable region of the heavy chain (VH) of SEQ ID NO: 23 and an amino acid sequence of the variable region of the light chain (VL) of SEQ ID NO: 24; or b) a heavy chain variable region (VH) amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 and a light chain variable region (VL) amino acid sequence of SEQ ID NO: 28. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1(a), caracterizado pelo fato de que o anticorpo é humano.2. Antibody according to claim 1(a), characterized in that the antibody is human. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.3. Antibody according to claim 1 or 2, characterized in that the antibody is of the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype. 4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é biespecífico.4. Antibody according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the antibody is bispecific. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 ou à subunidade p40 de IL-12 ou IL-23.5. Antibody according to claim 4, characterized in that the antibody binds to BLyS, CD40L, IL-6, CD27, BDCA2 or to the p40 subunit of IL-12 or IL-23. 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.6. Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises the antibody as defined in any one of claims 1 to 5, and a pharmaceutically acceptable vehicle. 7. Anticorpo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.7. Isolated antibody according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it is for use in therapy. 8. Uso de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser para preparação de uma composição para o tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória imuno mediada.8. Use of an antibody as defined in any one of claims 1 to 5, characterized in that it is for preparing a composition for the treatment or prevention of an immune-mediated inflammatory disease. 9. Uso de anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença é lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I, psoríase, doença de Sjogren primária, esclerose sistêmica ou artrite reumatoide.9. Use of antibody according to claim 8, characterized by the fact that the disease is systemic lupus erythematosus (SLE), type I diabetes, psoriasis, primary Sjogren's disease, systemic sclerosis or rheumatoid arthritis.