BR112015022736B1 - METHODS TO CONTROL THE METABOLIC PROFILE OF A FERMENTATION CULTURE - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA CONTROLAR O PERFIL METABÓLICO DE UMA CULTURA DE FER-MENTAÇÃO E PARA A PRODUÇÃO DE UM OU MAIS PRODUTOS POR FERMEN-TAÇÃO MICROBIANA DE UM SUBSTRATO GASOSO É proporcionado um método para o controle de um perfil metabólico de uma cultura de fermentação microbiana anaeróbica. Em particular, um perfil metabólico de um processo de fermentação é controlado através do controle da quantidade de CO2 dissolvido forneci-da a uma cultura. Além disso, é proporcionado um método para produzir um ou mais pro-dutos por fermentação microbiana de um substrato gasoso através da alimentação de gás residual de CO2 a partir de um reator para um segundo reator, ou por reciclagem de CO2 do gás residual para o mesmo reator.METHODS FOR CONTROLLING THE METABOLIC PROFILE OF A FERMENTATION CULTURE AND FOR PRODUCING ONE OR MORE PRODUCTS BY MICROBIAL FERMENTATION OF A GASEOUS SUBSTRATE A method is provided for controlling a metabolic profile of an anaerobic microbial fermentation culture. In particular, a metabolic profile of a fermentation process is controlled by controlling the amount of dissolved CO2 supplied to a culture. Furthermore, a method is provided for producing one or more products by microbial fermentation of a gaseous substrate by feeding CO2 waste gas from one reactor to a second reactor, or by recycling CO2 from the waste gas to the second reactor. same reactor.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF THE INVENTION

[001] Esta invenção refere-se genericamente aos métodos para controlar a produção de um ou mais produtos, por fermentação microbiana. Em particular, a invenção refere-se aos métodos para controlar a quantidade de dióxido de carbono fornecido a uma cultura microbiana. Em modalidades particulares, um perfil metabólico de um processo de fermentação é controlado através do controlo da quantidade de CO2 dissolvido fornecida a uma cultura.[001] This invention generally relates to methods for controlling the production of one or more products by microbial fermentation. In particular, the invention relates to methods for controlling the amount of carbon dioxide supplied to a microbial culture. In particular embodiments, a metabolic profile of a fermentation process is controlled by controlling the amount of dissolved CO2 supplied to a culture.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION

[002] O etanol está rapidamente se tornando um importante combustível para o transporte líquido rico em hidrogênio em todo o mundo. O consumo mundial de etanol em 2002 foi estimado em 10,8 bilhões de litros. O mercado global para a indústria de etanol combustível também foi prevista para crescer acentuadamente no futuro, devido a um aumento do interesse em etanol na Europa, Japão, EUA e vários países em desenvolvimento.[002] Ethanol is rapidly becoming an important fuel for transporting hydrogen-rich liquid around the world. World consumption of ethanol in 2002 was estimated at 10.8 billion liters. The global market for the ethanol fuel industry is also predicted to grow sharply in the future due to an increased interest in ethanol in Europe, Japan, the USA and several developing countries.

[003] Por exemplo, nos EUA, o etanol é usado para produzir E10, uma mistura de 10% de etanol na gasolina. Em misturas E10 o componente etanol atua como um agente de oxigenação, melhorando a eficiência da combustão e reduzindo a produção de poluentes atmosféricos. No Brasil, o etanol satisfaz cerca de 30% da demanda de combustíveis para transportes, como um agente oxigenante misturado na gasolina, ou como combustível puro por si só. Além disso, na Europa, as preocupações ambientais em torno das consequências das emissões de gases do efeito estufa (GHG) têm sido o estímulo para a União Europeia (UE) para definir aos países membros uma meta do mandato para o consumo de combustíveis para transportes sustentáveis como etanol derivado de biomassa.[003] For example, in the US, ethanol is used to produce E10, a 10% blend of ethanol in gasoline. In E10 blends, the ethanol component acts as an oxygenating agent, improving combustion efficiency and reducing the production of atmospheric pollutants. In Brazil, ethanol satisfies around 30% of transport fuel demand, as an oxygenating agent mixed with gasoline, or as a pure fuel on its own. Furthermore, in Europe, environmental concerns surrounding the consequences of greenhouse gas (GHG) emissions have been the stimulus for the European Union (EU) to set member countries a mandated target for the consumption of transport fuels. sustainable sources such as biomass-derived ethanol.

[004] A grande maioria do etanol combustível é produzida através de processos de fermentação tradicionais à base de leveduras que utilizam carboidratos derivados de culturas, como a sacarose extraída a partir da cana de açúcar, ou amido extraído de culturas de grãos, como a principal fonte de carbono. No entanto, o custo desses estoques de matérias-primas de carboidratos é influenciado por seu valor como alimento humano ou ração animal, enquanto o cultivo de amido ou de culturas produtoras de sacarose para produção de etanol não é economicamente sustentável em todas as geografias. Portanto, é do interesse desenvolver tecnologias para converter recursos de carbono de custos mais baixos e/ou mais abundantes em etanol combustível.[004] The vast majority of fuel ethanol is produced through traditional yeast-based fermentation processes that use culture-derived carbohydrates, such as sucrose extracted from sugarcane, or starch extracted from grain cultures, as the main carbon source. However, the cost of these carbohydrate feedstock stocks is influenced by their value as human food or animal feed, while growing starch or sucrose-producing crops for ethanol production is not economically sustainable in all geographies. Therefore, it is of interest to develop technologies to convert lower cost and/or more abundant carbon resources into fuel ethanol.

[005] CO é um importante subproduto livre rico em energia da combustão incompleta de materiais orgânicos, como carvão ou óleo e produtos derivados. Por exemplo, a indústria do aço na Austrália relata produzir e liberar para a atmosfera mais de 500.000 toneladas de CO por ano.[005] CO is an important energy-rich free by-product of the incomplete combustion of organic materials such as coal or oil and derivative products. For example, the steel industry in Australia reports producing and releasing over 500,000 tonnes of CO per year into the atmosphere.

[006] Tem sido desde há muito reconhecido que os processos catalíticos podem ser utilizados para converter os gases que consistem principalmente em CO e/ou CO e hidrogênio (H2) em uma variedade de combustíveis e produtos químicos. No entanto, os micro-organismos podem também ser usados para transformar estes gases em combustíveis e produtos químicos. Estes processos biológicos, embora geralmente mais lentos do que as reações químicas, tem várias vantagens sobre os processos catalíticos, incluindo uma maior especificidade, rendimentos mais elevados, menores custos de energia e maior resistência ao envenenamento.[006] It has long been recognized that catalytic processes can be used to convert gases consisting primarily of CO and/or CO and hydrogen (H2) into a variety of fuels and chemicals. However, microorganisms can also be used to transform these gases into fuels and chemicals. These biological processes, although generally slower than chemical reactions, have several advantages over catalytic processes, including greater specificity, higher yields, lower energy costs and greater resistance to poisoning.

[007] A capacidade de micro-organismos para crescer em CO como a sua única fonte de carbono foi descoberta pela primeira vez em 1903. Isto foi mais tarde determinado como sendo uma propriedade de organismos que utilizam a via bioquímica de acetil-coenzima A (acetil CoA) de crescimento autotrófico (também conhecida como a via Woods-Ljungdahl e a via de monóxido de carbono desidrogenase/acetil CoA sintase (CODH/ACS)). Um grande número de organismos anaeróbicos incluindo organismos carboxidotróficos, fotossintéticos, metanogênicos e acetogênicos demonstraram metabolizar CO para diferentes produtos finais, ou seja, CO2, H2; metano, n-butanol, acetato e etanol. Enquanto utilizando CO como única fonte de carbono todos esses organismos produzem, pelo menos, dois destes produtos finais.[007] The ability of microorganisms to grow on CO as their sole carbon source was first discovered in 1903. This was later determined to be a property of organisms utilizing the biochemical pathway of acetyl-coenzyme A ( acetyl CoA) of autotrophic growth (also known as the Woods-Ljungdahl pathway and the carbon monoxide dehydrogenase/acetyl CoA synthase (CODH/ACS) pathway). A large number of anaerobic organisms including carboxytropic, photosynthetic, methanogenic and acetogenic organisms have been shown to metabolize CO to different end products, ie CO2, H2; methane, n-butanol, acetate and ethanol. While using CO as the sole carbon source all these organisms produce at least two of these end products.

[008] As bactérias anaeróbicas, como aquelas do gênero Clostridium, demonstraram produzir etanol a partir de CO, CO2 e H2 através da via bioquímica acetil CoA. Por exemplo, várias cepas de Clostridium ljungdahlii que produzem etanol a partir de gases estão descritas em WO 00/68407, EP 117.309, patentes US 5.173.429, 5.593.886, e 6.368.819, WO 98/00558 e WO 02/08438. A bactéria Clostridium autoethanogenum sp também é conhecida por produzir etanol a partir de gases (Abrini et al, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).[008] Anaerobic bacteria, such as those of the genus Clostridium, have been shown to produce ethanol from CO, CO2 and H2 through the biochemical pathway of acetyl CoA. For example, various strains of Clostridium ljungdahlii that produce ethanol from gases are described in WO 00/68407, EP 117,309, US patents 5,173,429, 5,593,886, and 6,368,819, WO 98/00558 and WO 02/08438 . The bacterium Clostridium autoethanogenum sp is also known to produce ethanol from gases (Abrini et al, Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).

[009] No entanto, a produção de etanol por micro-organismos por fermentação de gases está sempre associada a coprodução de acetato e/ou ácido acético. Como uma parte do carbono disponível é convertido no acetato/ácido acético em vez de etanol, a eficiência de produção de etanol a partir de tais processos de fermentação pode ser menos do que desejável. Além disso, a menos que o subproduto acetato/ácido acético possa ser utilizado para algum outro propósito, ele pode representar um problema de eliminação de resíduo. Acetato/ácido acético é convertido em metano por micro-organismos e, portanto, tem o potencial de contribuir para as emissões de gás do efeito estuda.[009] However, the production of ethanol by microorganisms by gas fermentation is always associated with the co-production of acetate and/or acetic acid. As some of the available carbon is converted to acetate/acetic acid rather than ethanol, the efficiency of ethanol production from such fermentation processes can be less than desirable. Furthermore, unless the acetate/acetic acid by-product can be utilized for some other purpose, it can pose a waste disposal problem. Acetate/acetic acid is converted to methane by micro-organisms and therefore has the potential to contribute to study effect gas emissions.

[0010] A importância do controle dos parâmetros do meio nutriente líquido utilizado para a cultura de bactérias ou micro-organismos dentro de um biorreator usado para a fermentação foi reconhecido na técnica. NZ 556.615, depositado em 18 de Julho de 2007 e aqui incorporado por referência, descreve, em particular, a manipulação do pH e o potencial redox de um referido meio nutriente líquido. Por exemplo, na cultura de bactérias acetogênicas anaeróbicas, elevar o pH da cultura a acima de cerca de 5,7, embora mantendo o potencial redox da cultura a um nível baixo (-400 mV ou abaixo), as bactérias convertem acetato produzido como um subproduto de fermentação de etanol a uma taxa muito mais elevada do que em condições de pH mais baixos. NZ 556.615 reconhece ainda que diferentes níveis de pH e do potencial redox podem ser usados para otimizar as condições dependendo da função primária que as bactérias estão executando (isto é, crescimento, produção de etanol a partir de acetato e um substrato que contém CO gasoso, ou produzir etanol a partir de um substrato contendo gasoso).[0010] The importance of controlling the parameters of the liquid nutrient medium used for culturing bacteria or microorganisms within a bioreactor used for fermentation has been recognized in the art. NZ 556,615, filed July 18, 2007 and incorporated herein by reference, describes in particular manipulation of the pH and redox potential of a said liquid nutrient medium. For example, in the culture of anaerobic acetogenic bacteria, raising the pH of the culture above about 5.7, while keeping the redox potential of the culture at a low level (-400 mV or below), the bacteria convert acetate produced as a ethanol fermentation by-product at a much higher rate than under lower pH conditions. NZ 556615 further recognizes that different levels of pH and redox potential can be used to optimize conditions depending on the primary function the bacteria are performing (i.e. growth, production of ethanol from acetate and a substrate containing CO gas, or produce ethanol from a gaseous-containing substrate).

[0011] US 7.078.201 e WO 02/08438 também descrevem melhoras de processos de fermentação para a produção de etanol por diferentes condições (por exemplo, pH e do potencial redox) do meio nutriente líquido em que a fermentação é realizada.[0011] US 7,078,201 and WO 02/08438 also describe improvements of fermentation processes for the production of ethanol by different conditions (for example, pH and redox potential) of the liquid nutrient medium in which the fermentation is carried out.

[0012] O pH do meio nutriente líquido pode ser ajustado por adição de um ou mais agentes de pH ou tampões de ajuste para o meio. Por exemplo, bases como NaOH e ácidos como o ácido sulfúrico podem ser usadas para aumentar ou diminuir o pH como necessário. O potencial redox pode ser ajustado pela adição de um ou mais agentes de redução (por exemplo, metil viologen) ou agentes oxidantes. Alternativamente, o pH do meio pode ser ajustado através de uma quantidade em excesso do substrato gasoso para a fermentação de tal forma que os micro-organismos recebem “excesso de oferta” com gás.[0012] The pH of the liquid nutrient medium can be adjusted by adding one or more pH agents or adjustment buffers to the medium. For example, bases such as NaOH and acids such as sulfuric acid can be used to raise or lower the pH as needed. The redox potential can be adjusted by adding one or more reducing agents (eg methyl viologen) or oxidizing agents. Alternatively, the pH of the medium can be adjusted by adding an excess amount of the gaseous substrate to the fermentation such that the microorganisms are "oversupplied" with gas.

[0013] Processos semelhantes podem ser utilizados para produzir outros álcoois, como butanol, tal como seria evidente para um especialista na técnica.[0013] Similar processes can be used to produce other alcohols such as butanol, as would be apparent to one skilled in the art.

[0014] É um objeto da presente invenção proporcionar um sistema e/ou um processo que irá, pelo menos, de alguma maneira no sentido de superar as desvantagens acima mencionadas, ou pelo menos proporcionar ao público uma escolha útil.[0014] It is an object of the present invention to provide a system and/or a method that will at least go some way towards overcoming the aforementioned disadvantages, or at least provide the public with a useful choice.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[0015] Em um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um método para controlar o perfil metabólico de uma cultura de fermentação que compreende pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, o método compreendendo: a. fluir substrato gasoso compreendendo CO e CO2 para um biorreator que compreende uma cultura do micro-organismo em um meio nutriente líquido; e b. ajustar a quantidade de CO2 dissolvido na cultura de tal modo que o metabolismo da cultura é alterado.[0015] In a first aspect of the invention, there is provided a method for controlling the metabolic profile of a fermentation culture comprising at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism, the method comprising: a. flowing gaseous substrate comprising CO and CO2 into a bioreactor comprising a culture of the microorganism in a liquid nutrient medium; and b. adjust the amount of CO2 dissolved in the culture such that the metabolism of the culture is altered.

[0016] Em uma modalidade a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido é ajustada, controlando o fluxo de CO2 para o biorreator. Em uma modalidade, o aumento da quantidade de CO2 dissolvido no meio líquido nutriente altera o metabolismo do micro-organismo de tal modo que a produção de um ou mais produtos derivados de piruvato é aumentado. Em uma modalidade, a diminuição da quantidade de CO2 dissolvido no meio líquido nutriente altera o metabolismo do micro-organismo de tal modo que a produção de um ou mais produtos derivados de piruvato é diminuída.[0016] In one embodiment, the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is adjusted, controlling the flow of CO2 to the bioreactor. In one embodiment, increasing the amount of CO 2 dissolved in the liquid nutrient medium alters the metabolism of the microorganism such that production of one or more pyruvate-derived products is increased. In one embodiment, decreasing the amount of CO 2 dissolved in the liquid nutrient medium alters the metabolism of the microorganism such that production of one or more pyruvate-derived products is decreased.

[0017] Em uma modalidade os um ou mais produtos derivados de piruvato são selecionados a partir do grupo que consiste em 2,3-butanodiol (2,3-BDO), lactato, succinato, metil etil cetona (MEK), 2-butanol, propanodiol, 2-propanol, isopropanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno e ácido poli láctico (PLA).[0017] In one embodiment the one or more products derived from pyruvate are selected from the group consisting of 2,3-butanediol (2,3-BDO), lactate, succinate, methyl ethyl ketone (MEK), 2-butanol , propanediol, 2-propanol, isopropanol, acetoin, iso-butanol, citramalate, butadiene and polylactic acid (PLA).

[0018] Em uma modalidade, a fermentação é realizada a uma pressão de cerca de 250 a cerca de 450 kPag (ou superior a 500 kPag), de tal modo que a concentração de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido é aumentada. Em certas modalidades, a pressão é superior a 250 kPag ou superior a 300 kPag, ou superior a 350 kPag, ou superior a 400 kPag, ou superior a 450 kPag, ou superior a 500 kPag.[0018] In one embodiment, the fermentation is carried out at a pressure of about 250 to about 450 kPag (or greater than 500 kPag), such that the concentration of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is increased. In certain embodiments, the pressure is greater than 250 kPag or greater than 300 kPag, or greater than 350 kPag, or greater than 400 kPag, or greater than 450 kPag, or greater than 500 kPag.

[0019] Em uma modalidade alternativa, a pressão no reator é reduzida ou minimizada para promover a produção de um ou mais produtos derivados de acetil coA em relação a um ou mais produtos derivados de piruvato. Em certas modalidades, a pressão no biorreator é de cerca de atmosférica a cerca de 200 kPag ou é mantida abaixo de 200 kPag, ou inferior a 150 kPag, ou inferior a 100 kPag, inferior a 50 kPag, ou à pressão atmosférica.[0019] In an alternative embodiment, the pressure in the reactor is reduced or minimized to promote the production of one or more acetyl coA derivative products relative to one or more pyruvate derivative products. In certain embodiments, the pressure in the bioreactor is from about atmospheric to about 200 kPag or is maintained below 200 kPag, or less than 150 kPag, or less than 100 kPag, less than 50 kPag, or at atmospheric pressure.

[0020] Em uma modalidade a pressão parcial de CO2 é aumentada, para aumentar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido.[0020] In one embodiment the partial pressure of CO2 is increased, to increase the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium.

[0021] Em uma modalidade, a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido é aumentada através do aumento da quantidade de CO2 no substrato gasoso fornecido à fermentação. Em uma modalidade a concentração de CO2 no substrato fornecida para o biorreator é pelo menos 10%, ou, pelo menos, 15%, ou, pelo menos, 18%, ou, pelo menos, 20%, ou, pelo menos, 25%, ou, pelo menos, 30%, ou, pelo menos, 35%, ou, pelo menos, 40%, ou, pelo menos, 45%. Em certas modalidades, a concentração de CO2 no substrato fornecida para o biorreator é entre 15% e 65%, ou desde cerca de 20% a cerca de 50%, ou desde cerca de 25% a cerca de 45%. Em modalidades em que a pressão é aplicada para a fermentação, a quantidade de CO2 exigido pela fermentação é reduzida. Na presença de pressão maior do que cerca de 50 kPag, a quantidade fornecida de CO2 na fluxo de substrato é substancialmente menor do que quando fornecida à pressão atmosférica. Em modalidades particulares, a concentração de CO2 no substrato fornecida para o biorreator é de cerca de 1% a cerca de 50%, quando fornecido a uma pressão superior a cerca de 50 kPag.[0021] In one embodiment, the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is increased by increasing the amount of CO2 in the gaseous substrate supplied to the fermentation. In one embodiment the substrate CO2 concentration supplied to the bioreactor is at least 10%, or at least 15%, or at least 18%, or at least 20%, or at least 25% , or at least 30%, or at least 35%, or at least 40%, or at least 45%. In certain embodiments, the substrate CO2 concentration supplied to the bioreactor is between 15% and 65%, or from about 20% to about 50%, or from about 25% to about 45%. In embodiments where pressure is applied for fermentation, the amount of CO2 required by fermentation is reduced. In the presence of pressure greater than about 50 kPag, the amount of CO2 delivered into the substrate stream is substantially less than when delivered at atmospheric pressure. In particular embodiments, the CO2 concentration in the substrate supplied to the bioreactor is from about 1% to about 50% when supplied at a pressure greater than about 50 kPag.

[0022] Em um segundo aspecto da invenção, é proporcionado um método para aumentar a produção de pelo menos um produto derivado do piruvato, o método compreendendo: a. fluir um substrato compreendendo CO e CO2 para um biorreator que compreende uma cultura de pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico em um meio nutriente líquido; e b. ajustar a quantidade de CO2 fluída para o biorreator de tal modo que a quantidade de CO2 dissolvido fornecida no meio nutriente líquido é aumentada.[0022] In a second aspect of the invention, there is provided a method for increasing the production of at least one pyruvate derivative product, the method comprising: a. flowing a substrate comprising CO and CO2 into a bioreactor comprising a culture of at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism in a liquid nutrient medium; and b. adjust the amount of CO2 flowed into the bioreactor such that the amount of dissolved CO2 supplied in the liquid nutrient medium is increased.

[0023] Em um terceiro aspecto da invenção, é proporcionado um método para controlar uma proporção de produtos derivados de piruvato em produtos derivados de acetil co-A, o método compreendendo; a. fluir um substrato compreendendo CO e CO2 para um biorreator que compreende uma cultura de pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico em um meio nutriente líquido; e b. ajustar o fluxo de dióxido de carbono para o biorreator de tal modo que a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido, controla, assim, a proporção de produtos derivados do piruvato em derivados de acetil CoA.[0023] In a third aspect of the invention, there is provided a method for controlling a ratio of pyruvate derivative products to acetyl co-A derivative products, the method comprising; The. flowing a substrate comprising CO and CO2 into a bioreactor comprising a culture of at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism in a liquid nutrient medium; and b. adjusting the flow of carbon dioxide to the bioreactor such that the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium, thereby controlling the ratio of pyruvate derivative products to acetyl CoA derivatives.

[0024] Em uma modalidade da invenção, o aumento da quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido aumenta a proporção de produtos derivados do piruvato em derivados de acetil CoA, aumentando a produção de produtos derivados de piruvato. Em uma modalidade, a diminuição da quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido diminui a proporção de produtos derivados do piruvato em derivados de acetil CoA através da diminuição da produção de produtos derivados de piruvato.[0024] In one embodiment of the invention, increasing the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium increases the proportion of pyruvate-derived products in acetyl CoA derivatives, increasing the production of pyruvate-derived products. In one embodiment, decreasing the amount of CO 2 dissolved in the liquid nutrient medium decreases the ratio of pyruvate derivative products to acetyl CoA derivatives by decreasing the production of pyruvate derivative products.

[0025] Em um quarto aspecto é proporcionado um método para controlar o perfil metabólico de uma cultura de fermentação que compreende pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, o método compreendendo a. fluir substrato gasoso compreendendo CO e CO2 para um biorreator que compreende uma cultura do micro-organismo em um meio nutriente líquido; b. monitorar a concentração de CO2 em uma corrente de saída que sai do biorreator; e c. ajustar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido, tal que o metabolismo da cultura é controlado.[0025] In a fourth aspect there is provided a method for controlling the metabolic profile of a fermentation culture comprising at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism, the method comprising a. flowing gaseous substrate comprising CO and CO2 into a bioreactor comprising a culture of the microorganism in a liquid nutrient medium; B. monitoring the CO2 concentration in an output stream leaving the bioreactor; and c. adjust the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium, such that the metabolism of the culture is controlled.

[0026] Em um quinto aspecto, é proporcionado um método para aumentar a produção de um ou mais produtos o método compreendendo; a. proporcionar um substrato compreendendo CO para um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos em um meio nutritivo líquido; e b. fermentar o substrato para produzir um ou mais produtos líquidos e CO2.[0026] In a fifth aspect, there is provided a method of increasing the production of one or more products the method comprising; The. providing a substrate comprising CO to a bioreactor containing a culture of one or more microorganisms in a liquid nutrient medium; and b. ferment the substrate to produce one or more liquid products and CO2.

[0027] Em uma modalidade uma ou mais das condições de fermentação são ajustadas para aumentar a quantidade de CO consumida pela cultura e a quantidade de CO2 produzido pela cultura. Em uma modalidade a quantidade de CO consumida pela cultura é aumentada alterando a transferência de massa na fermentação. Em uma modalidade, a quantidade de CO consumida pela cultura é aumentada através do aumento da taxa de fluxo do substrato gasoso para o biorreator. Em uma modalidade a quantidade de CO consumida pela cultura é aumentada através do aumento da taxa de agitação do meio nutriente líquido no biorreator. Em uma modalidade a quantidade de CO consumida pela cultura é aumentada através do aumento da área de superfície de bolha.[0027] In one embodiment one or more of the fermentation conditions are adjusted to increase the amount of CO consumed by the culture and the amount of CO2 produced by the culture. In one embodiment the amount of CO consumed by the culture is increased by altering mass transfer in fermentation. In one embodiment, the amount of CO consumed by the culture is increased by increasing the flow rate of the gaseous substrate into the bioreactor. In one embodiment the amount of CO consumed by the culture is increased by increasing the agitation rate of the liquid nutrient medium in the bioreactor. In one embodiment the amount of CO consumed by the culture is increased by increasing the bubble surface area.

[0028] Em uma modalidade, o aumento da quantidade de CO consumido pela cultura microbiana aumenta a quantidade de CO2 em uma corrente de saída que sai do biorreator. Em uma modalidade, a quantidade de CO2 na corrente de saída é pelo menos 30%, ou, pelo menos, 35%, ou, pelo menos, 40%, ou, pelo menos, 45%, ou pelo menos 50%.[0028] In one embodiment, increasing the amount of CO consumed by the microbial culture increases the amount of CO2 in an output stream exiting the bioreactor. In one embodiment, the amount of CO2 in the output stream is at least 30%, or at least 35%, or at least 40%, or at least 45%, or at least 50%.

[0029] Em um sexto aspecto, é proporcionado um método para aumentar a quantidade de CO2 dissolvido em um meio nutriente líquido que compreende uma cultura de pelo menos um micro-organismo, o método compreendendo; a. introduzir uma corrente de gás de alimentação compreendendo CO e um meio nutriente líquido a pelo menos um biorreator para formar um caldo de fermentação, compreendendo o biorreator ainda um tubo de descida para a circulação de uma porção do caldo de fermentação a partir de um ponto perto do topo do biorreator para um ponto próximo a parte inferior do biorreator; b. fermentar o CO no biorreator para produtos líquidos e um fluxo de saída de gás que compreende CO2; c. passar, pelo menos, uma porção da fluxo de saída de gás, no tubo de descida do biorreator, que é a fonte da fluxo de saída de gás localizado perto da parte superior do biorreator ou um segundo biorreator; e d. misturar o fluxo de saída de gás e o meio nutriente líquido ao longo do tubo de descida de modo a formar uma mistura de gás-líquido aumentando assim a pressão hidrostática sobre a mistura de gás-líquido, de tal modo que CO2 do fluxo de gás de saída é dissolvido no meio nutriente líquido na parte inferior do canto de baixo.[0029] In a sixth aspect, there is provided a method for increasing the amount of CO 2 dissolved in a liquid nutrient medium comprising a culture of at least one microorganism, the method comprising; The. introducing a feed gas stream comprising CO and a liquid nutrient medium to at least one bioreactor to form a fermentation broth, the bioreactor further comprising a downpipe for circulating a portion of the fermentation broth from a point near from the top of the bioreactor to a point near the bottom of the bioreactor; B. fermenting the CO in the bioreactor to liquid products and an outgassing stream comprising CO2; w. passing at least a portion of the outgassing flow into the bioreactor downpipe that is the source of the outgassing flow located near the top of the bioreactor or a second bioreactor; and d. mixing the gas outlet stream and the liquid nutrient medium along the downcomer to form a gas-liquid mixture thereby increasing the hydrostatic pressure on the gas-liquid mixture such that CO2 from the gas stream outlet is dissolved in the liquid nutrient medium at the bottom of the bottom corner.

[0030] Em uma modalidade específica o fluxo de gás de saída a partir do primeiro biorreator é passado para o tubo de descida de um segundo biorreator. Em outra modalidade o fluxo de gás de saída a partir do primeiro biorreator é reciclado para o tubo de descida do primeiro biorreator. Alternativamente, o fluxo de gás de saída a partir do primeiro biorreator é passado para a entrada de gás, do primeiro ou segundo biorreator. Além disso, o fluxo de alimentação para o segundo reator pode ser uma porção do fluxo de gás de saída ou residual do primeiro reator, opcionalmente misturados com fluxo de gás de alimentação fresco. Biorreatores adicionais podem ser adicionados em série e fluxos de gás de saída transmitidos para os mesmos ou diferentes biorreatores, como descrito acima.[0030] In a specific embodiment, the output gas flow from the first bioreactor is passed to the downcomer of a second bioreactor. In another embodiment the outlet gas flow from the first bioreactor is recycled to the first bioreactor downpipe. Alternatively, the output gas stream from the first bioreactor is passed to the gas inlet of the first or second bioreactor. Furthermore, the feed stream to the second reactor may be a portion of the first reactor outlet or residual gas stream, optionally mixed with fresh feed gas stream. Additional bioreactors can be added in series and output gas streams transmitted to the same or different bioreactors as described above.

[0031] Em um aspecto adicional é proporcionado um método para a produção de um ou mais produtos por fermentação microbiana de um substrato gasoso, o método compreendendo: a. Em um primeiro reator que compreende uma cultura de um ou mais micro-organismo carboxidotrófico em um meio nutriente líquido, de um substrato gasoso compreendendo CO; b. fermentar o substrato gasoso compreendendo CO para produzir um ou mais produtos líquidos e uma saída de gás de CO2 que compreende; c. alimentar o gás de saída que compreende CO2 a um segundo biorreator, o referido segundo biorreator compreende uma cultura de um ou mais micro-organismos carboxidotróficos em um meio nutriente líquido; e d. fermentação do gás de saída compreendendo CO2 para produzir um ou mais produtos.[0031] In a further aspect there is provided a method for producing one or more products by microbial fermentation of a gaseous substrate, the method comprising: a. In a first reactor comprising a culture of one or more carboxydotrophic microorganism in a liquid nutrient medium, a gaseous substrate comprising CO; B. fermenting the gaseous substrate comprising CO to produce one or more liquid products and a CO 2 gas output comprising; w. feeding the output gas comprising CO 2 to a second bioreactor, said second bioreactor comprising a culture of one or more carboxydotrophic microorganisms in a liquid nutrient medium; and d. fermenting off-gas comprising CO2 to produce one or more products.

[0032] Em uma modalidade, o gás de saída que compreende CO2 é misturado com um ou mais substratos gasosos antes de ser alimentado ao segundo biorreator. Em uma modalidade, um substrato gasoso adicional é adicionado ao segundo biorreator para utilização como substratos na fermentação microbiana.[0032] In one embodiment, the off-gas comprising CO2 is mixed with one or more gaseous substrates before being fed to the second bioreactor. In one embodiment, an additional gaseous substrate is added to the second bioreactor for use as substrates in microbial fermentation.

[0033] Em uma modalidade os um ou mais micro-organismos fornecidos no primeiro biorreator e o segundo biorreator sai os mesmos. Em uma modalidade a fermentação microbiana produz, pelo menos, dois produtos. Em uma modalidade a razão de produção dos dois produtos é diferente entre o primeiro biorreator e o segundo biorreator. Em uma modalidade, a fermentação produz pelo menos um álcool e pelo menos um subproduto. Em uma modalidade a razão entre o pelo menos um produto para pelo menos um subproduto é diferente nos primeiro e segundo biorreatores. Em uma modalidade, o produto é o etanol e o subproduto é 2,3-butanodiol (2,3-BDO). Em uma modalidade a razão de etanol (EtOH) a 2,3-BDO é menor no segundo biorreator.[0033] In one embodiment the one or more microorganisms supplied in the first bioreactor and the second bioreactor come out the same. In one embodiment, microbial fermentation produces at least two products. In one embodiment the production ratio of the two products is different between the first bioreactor and the second bioreactor. In one embodiment, the fermentation produces at least one alcohol and at least one by-product. In one embodiment the ratio of the at least one product to the at least one by-product is different in the first and second bioreactors. In one embodiment, the product is ethanol and the by-product is 2,3-butanediol (2,3-BDO). In one embodiment the ratio of ethanol (EtOH) to 2,3-BDO is lower in the second bioreactor.

[0034] Em uma modalidade os um ou mais micro-organismos são selecionados a partir do grupo que compreende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljundgahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, e Clostridium coskatii.[0034] In one embodiment the one or more microorganisms are selected from the group comprising Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljundgahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carbidivorans, and Clostridium coskatii.

[0035] Em uma modalidade um gás residual que sai do segundo biorreator pode ser reciclado para o primeiro biorreator para ser utilizado como um substrato.[0035] In one embodiment a waste gas exiting the second bioreactor may be recycled to the first bioreactor for use as a substrate.

[0036] Em um aspecto adicional da invenção é proporcionado um método para controlar o perfil metabólico de uma cultura de fermentação que compreende pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, o método compreendendo; a. fluir substrato gasoso compreendendo CO para um biorreator que compreende uma cultura do micro-organismo em um meio nutriente líquido para proporcionar um caldo de fermentação; e b. aumentar a taxa de oxidação de CO através de uma monóxido de carbono desidrogenase dependente de ferredoxina para aumentar a um nível reduzido de ferredoxina no caldo de fermentação; em que o aumento do nível de ferredoxina reduzida aumenta a uma taxa de fermentação de piruvato a partir de acetil CoA.[0036] In a further aspect of the invention there is provided a method for controlling the metabolic profile of a fermentation culture comprising at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism, the method comprising; The. flowing gaseous substrate comprising CO into a bioreactor comprising a culture of the microorganism in a liquid nutrient medium to provide a fermentation broth; and b. increasing the rate of CO oxidation by a ferredoxin-dependent carbon monoxide dehydrogenase to increase a reduced level of ferredoxin in the fermentation broth; wherein increasing the level of reduced ferredoxin increases the rate of fermentation of pyruvate from acetyl CoA.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0037] A Figura 1 mostra a via metabólica dos micro-organismos da presente invenção.[0037] Figure 1 shows the metabolic pathway of microorganisms of the present invention.

[0038] A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito da pressão sobre as concentrações do metabólito durante a fermentação.[0038] Figure 2 is a graph showing the effect of pressure on metabolite concentrations during fermentation.

[0039] A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido sobre a produção de 2,3-butanodiol.[0039] Figure 3 is a graph showing the effect of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium on the production of 2,3-butanediol.

[0040] A Figura 4 é um gráfico que mostra a utilização de CO da cultura microbiana do exemplo 2.[0040] Figure 4 is a graph showing the use of CO from the microbial culture of example 2.

[0041] A Figura 5 é um gráfico que mostra o efeito da concentração de CO2 no fluxo de entrada, sobre a concentração do metabólito do exemplo 3A.[0041] Figure 5 is a graph showing the effect of CO2 concentration in the inlet flow on the concentration of the metabolite of Example 3A.

[0042] A Figura 6 é um gráfico que mostra a absorção de CO, CO2 e H2 pela cultura microbiana do exemplo 3A.[0042] Figure 6 is a graph showing the uptake of CO, CO2 and H2 by the microbial culture of example 3A.

[0043] A Figura 7 é um gráfico que mostra a concentração de metabólitos ao longo do tempo do exemplo 3B.[0043] Figure 7 is a graph showing the metabolite concentration over time of example 3B.

[0044] A Figura 8 é um gráfico que mostra a composição de gás do exemplo 3B.[0044] Figure 8 is a graph showing the gas composition of example 3B.

[0045] A Figura 9 é um gráfico que mostra a absorção de vários componentes do fluxo de gás de entrada do Exemplo 3C pela cultura microbiana.[0045] Figure 9 is a graph showing the uptake of various components of the inlet gas stream of Example 3C by the microbial culture.

[0046] A Figura 10 é um gráfico que mostra o efeito de aumentar incrementalmente o CO2 no fluxo de gás de entrada, a concentração de metabólito do exemplo 3C.[0046] Figure 10 is a graph showing the effect of incrementally increasing CO2 on the inlet gas stream, the metabolite concentration of Example 3C.

[0047] A Figura 11 é um gráfico que mostra as concentrações do metabólito em que a concentração de CO2 no fluxo de entrada é ciclada de acordo com o exemplo 3D.[0047] Figure 11 is a graph showing the metabolite concentrations where the CO2 concentration in the inflow is cycled according to the 3D example.

[0048] A Figura 12 é um gráfico que mostra a absorção de vários componentes no fluxo de entrada do exemplo 3D pela cultura microbiana.[0048] Figure 12 is a graph showing the uptake of various components in the input stream of the 3D example by the microbial culture.

[0049] A Figura 13 é um gráfico que mostra as concentrações do metabólito do exemplo 3E.[0049] Figure 13 is a graph showing metabolite concentrations from Example 3E.

[0050] A Figura 14 é um gráfico que mostra a absorção de vários componentes no fluxo de entrada do Exemplo 3E pela cultura microbiana.[0050] Figure 14 is a graph showing the uptake of various components in the inflow of Example 3E by the microbial culture.

[0051] A Figura 15 é um gráfico que mostra as concentrações do metabólito do exemplo 4.[0051] Figure 15 is a graph showing the metabolite concentrations of example 4.

[0052] A Figura 16 é um gráfico de CO2 dissolvido calculado em função da taxa de produção de 2,3 butanodiol.[0052] Figure 16 is a plot of dissolved CO2 calculated as a function of the production rate of 2.3 butanediol.

[0053] A Figura 17 é uma representação de um sistema de acordo com uma modalidade da invenção.[0053] Figure 17 is a representation of a system according to an embodiment of the invention.

[0054] A Figura 18 é um gráfico que mostra a absorção de vários componentes no fluxo de entrada do exemplo 4 por cultura microbiana.[0054] Figure 18 is a graph showing the uptake of various components in the inflow of Example 4 by microbial culture.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[0055] Os inventores descobriram métodos e sistemas para controle dos produtos metabólicos produzidos por uma cultura de um ou mais microorganismos acetogênicos carboxidotróficos. Em particular, os inventores descobriram um método para aumentar a produção de um ou mais produtos derivados de piruvato em um processo de fermentação.[0055] The inventors have discovered methods and systems for controlling the metabolic products produced by a culture of one or more carboxydotrophic acetogenic microorganisms. In particular, the inventors have discovered a method for increasing the production of one or more pyruvate-derived products in a fermentation process.

[0056] O que se segue é uma descrição da presente invenção, incluindo modalidades preferidas da mesma, dadas em termos gerais. A invenção é ainda exemplificada na descrição dada no cabeçalho “Exemplos” aqui a seguir, que fornece os dados experimentais que apoiam a invenção, os exemplos específicos dos aspectos da invenção, e os meios de realização da invenção.[0056] The following is a description of the present invention, including preferred embodiments thereof, given in general terms. The invention is further exemplified in the description given under the heading "Examples" hereinafter, which provides experimental data supporting the invention, specific examples of aspects of the invention, and means for carrying out the invention.

DefiniçõesDefinitions

[0057] Conforme aqui utilizado, “butanodiol” refere-se a todos os isômeros estruturais do diol, incluindo 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,4- butanodiol e 2,3-butanodiol e os seus estereoisômeros. O termo “2,3- butanodiol” deve ser interpretado para incluir todas as formas enantioméricas e diastereoisoméricas dos compostos, incluindo (R,R), (S,S) e, em formas meso racêmicas, formas parcialmente estereoisomericamente puras e/ou substancialmente estereoisomericamente puras.[0057] As used herein, "butanediol" refers to all structural isomers of diol, including 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol and 2,3-butanediol and their stereoisomers. The term "2,3-butanediol" shall be interpreted to include all enantiomeric and diastereomeric forms of the compounds, including (R,R), (S,S) and, in mesoracemic forms, partially stereomerically pure and/or substantially pure forms. stereoisomerically pure.

[0058] O termo “biorreator” inclui um dispositivo de fermentação que consiste em um ou mais vasos e/ou torres ou arranjo de tubulação, que inclui o reator de taque agitado contínuo (CSTR), Reator celular Imobilizado (ICR), reator de leito em gotejamento (TBR), coluna de bolhas, fermentador com elevação a gás, misturador estático, ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para o contato gás-líquido. Como é aqui descrito, depois de, em algumas modalidades o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, quando se refere à adição de um substrato, por exemplo, um substrato que contém o monóxido de carbono, para a reação de fermentação ou biorreator deve ser entendido para incluir a adição a um ou ambos destes reatores, onde apropriado.[0058] The term "bioreactor" includes a fermentation device consisting of one or more vessels and/or towers or piping arrangement, which includes continuous stirred tank reactor (CSTR), Immobilized Cell Reactor (ICR), drip bed (TBR), bubble column, gas lift fermenter, static mixer, or other suitable vessel or device for gas-liquid contact. As described herein, after, in some embodiments the bioreactor may comprise a first growth reactor and a second fermentation reactor. As such, when referring to the addition of a substrate, for example a substrate containing carbon monoxide, to the fermentation reaction or bioreactor it should be understood to include addition to one or both of these reactors, where appropriate.

[0059] O termo “substrato que contém o monóxido de carbono” e termos similares devem ser entendidos para incluir qualquer substrato no qual o monóxido de carbono está disponível para uma ou mais cepas de bactérias para crescimento e/ou fermentação, por exemplo.[0059] The term "carbon monoxide-containing substrate" and similar terms shall be understood to include any substrate on which carbon monoxide is available to one or more strains of bacteria for growth and/or fermentation, for example.

[0060] “Substratos gasoso contendo o monóxido de carbono” incluem qualquer gás que contém um nível de monóxido de carbono. O substrato gasoso irá tipicamente conter uma proporção importante de CO, de preferência pelo menos cerca de 15% a cerca de 95% de CO, em volume.[0060] “Gaseous substrates containing carbon monoxide” include any gas that contains a level of carbon monoxide. The gaseous substrate will typically contain a substantial proportion of CO, preferably at least about 15% to about 95% CO, by volume.

[0061] “Substrato compreendendo CO2” inclui qualquer fluxo de substrato que contém um nível de dióxido de carbono. No entanto, deve notar- se que o substrato gasoso pode ser proporcionado em formas alternativas. Por exemplo, o substrato que contém CO2 gasoso pode ser fornecido dissolvido em um líquido. Essencialmente, um líquido é saturado com um gás contendo dióxido de carbono e, em seguida, aquele líquido é adicionado ao biorreator. Isto pode ser conseguido utilizando metodologia padrão. A título de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak et al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Número 3/Outubro de 2002) pode ser utilizado. A título de exemplo adicional, o substrato gasoso contendo CO2 e H2 pode ser adsorvido sobre um suporte sólido.[0061] “Substrate comprising CO2” includes any substrate stream that contains a level of carbon dioxide. However, it should be noted that the gaseous substrate may be provided in alternative forms. For example, substrate containing gaseous CO2 can be supplied dissolved in a liquid. Essentially, a liquid is saturated with a gas containing carbon dioxide and then that liquid is added to the bioreactor. This can be achieved using standard methodology. As an example, a microbubble dispersion generator (Hensirisak et al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/October 2002) can be used. By way of further example, the gaseous substrate containing CO2 and H2 can be adsorbed onto a solid support.

[0062] Os termos “aumentar a eficiência”, “aumento da eficiência” e semelhantes, quando utilizados em relação a um processo de fermentação, incluem, entre outros, aumentar uma ou mais a taxa de crescimento dos micro-organismos que catalisam a fermentação, a taxa de crescimento e/ou produção de produto em concentrações elevadas de butanodiol, o volume do produto desejado produzido por volume de substrato consumido, a taxa de produção ou o nível de produção do produto desejado, e a proporção relativa do produto desejado produzida comparada com outros subprodutos da fermentação.[0062] The terms "increasing efficiency", "increasing efficiency" and the like, when used in relation to a fermentation process, include, but are not limited to, increasing one or more of the growth rate of microorganisms that catalyze fermentation , the rate of growth and/or production of product at high concentrations of butanediol, the volume of the desired product produced per volume of substrate consumed, the rate of production or production level of the desired product, and the relative proportion of the desired product produced compared to other fermentation by-products.

[0063] Os termos “produtividade” ou “taxa de produção” é a produtividade volumétrica de um produto. Em sistemas contínuos a produtividade volumétrica é calculada como a razão entre a concentração em estado estacionário do produto e o tempo de retenção de líquido. Em sistemas de lote a produtividade volumétrica é calculada como a concentração e o tempo necessário para produzir a referida concentração em sistema de lote. A produtividade volumétrica é relatada em g/L/dia.[0063] The terms “productivity” or “production rate” is the volumetric productivity of a product. In continuous systems the volumetric productivity is calculated as the ratio between the steady state concentration of the product and the liquid retention time. In batch systems the volumetric productivity is calculated as the concentration and the time required to produce said concentration in a batch system. Volumetric productivity is reported in g/L/day.

[0064] A menos que o contexto exija de outra forma, as frases “fermentação”, “processo de fermentação” ou “reação de fermentação” e semelhantes, como aqui utilizadas, destinam-se a abranger tanto a fase de crescimento quanto a fase biossíntese do produto do processo.[0064] Unless the context otherwise requires, the phrases “fermentation”, “fermentation process” or “fermentation reaction” and the like, as used herein, are intended to encompass both the growth phase and the fermentation phase. biosynthesis of the product of the process.

[0065] O termo “produtos derivados de piruvato” ou termos semelhantes, como aqui utilizados pretendem abranger produtos de fermentação que têm um precursor piruvato. Estes produtos incluem, entre outros, 2,3-butanodiol, lactato, succinato, Metil Etil Cetona (MEK), 2- butanol, propanodiol, 2-propanol, isopropanol, acetoína, iso-butanol, citramalato, butadieno, e ácido poli láctico.[0065] The term "pyruvate-derived products" or similar terms as used herein are intended to encompass fermentation products that have a pyruvate precursor. These products include, but are not limited to, 2,3-butanediol, lactate, succinate, Methyl Ethyl Ketone (MEK), 2-butanol, propanediol, 2-propanol, isopropanol, acetoin, iso-butanol, citramalate, butadiene, and polylactic acid .

[0066] O termo “produtos derivados de Acetil CoA”, “produtos derivados de acetil CoA” ou termos similares, como aqui utilizados pretendem abranger produtos de fermentação tendo um precursor acetil CoA. Estes produtos incluem, entre outros, etanol, ácido acético, acetona, butanol, 3-hidroxibutirato e isobutileno, 3-hidroxi propionato (3HP) e ácidos graxos.[0066] The term "Acetyl CoA derivative products", "Acetyl CoA derivative products" or similar terms as used herein is intended to encompass fermentation products having an acetyl CoA precursor. These products include, but are not limited to, ethanol, acetic acid, acetone, butanol, 3-hydroxybutyrate and isobutylene, 3-hydroxy propionate (3HP) and fatty acids.

[0067] Foi descoberto que a produção de 2,3-butanodiol em processos de fermentação aumenta durante períodos em que a cultura microbiana está apresentando sinais de estresse. Os inventores identificaram vários indicadores de estresse que correspondem a um aumento na quantidade de 2,3-butanodiol, incluindo a produção de lactato pela cultura microbiana, aumento do pH da cultura microbiana, e uma diminuição na concentração de biomassa da cultura microbiana. Curiosamente, os inventores demonstraram que a produção de 2,3-butanodiol por cultura microbiana não é um indicador de estresse, e que é possível fornecer uma cultura microbiana saudável e estável tendo uma produtividade aumentada para 2,3-butanodiol.[0067] It has been found that the production of 2,3-butanediol in fermentation processes increases during periods when the microbial culture is showing signs of stress. The inventors have identified several indicators of stress that correspond to an increase in the amount of 2,3-butanediol, including lactate production by the microbial culture, increase in pH of the microbial culture, and a decrease in the biomass concentration of the microbial culture. Interestingly, the inventors have demonstrated that 2,3-butanediol production per microbial culture is not an indicator of stress, and that it is possible to provide a healthy and stable microbial culture having increased productivity for 2,3-butanediol.

[0068] Foi anteriormente demonstrado que o aumento da produtividade de 2,3-butanodiol foi influenciado por uma taxa de consumo de hidrogênio, por uma cultura microbiana (WO2012131627).[0068] It was previously shown that the increase in productivity of 2,3-butanediol was influenced by a rate of hydrogen consumption by a microbial culture (WO2012131627).

Efeito de CO2 em FermentaçãoEffect of CO2 on Fermentation

[0069] Os inventores descobriram que através da alteração da quantidade de CO2 fornecida para a cultura microbiana, a via metabólica do micro-organismo é afetada. Ao alterar a quantidade de CO2 fornecida para a cultura microbiana, o metabolismo da cultura pode ser manipulado.[0069] The inventors found that by altering the amount of CO2 supplied to the microbial culture, the metabolic pathway of the microorganism is affected. By altering the amount of CO2 supplied to the microbial culture, the culture's metabolism can be manipulated.

[0070] Os inventores surpreendentemente demonstraram que a produção de produtos derivados de piruvato é aumentada quando a cultura microbiana é fornecida com um aumento da quantidade de dióxido de carbono. Correspondentemente, verificou-se que a produção de produtos derivados a partir de acetil CoA é aumentada, e a produção de produtos derivados de piruvato é reduzida quando a quantidade de CO2 dissolvido na cultura microbiana é diminuída.[0070] The inventors have surprisingly demonstrated that the production of pyruvate-derived products is increased when the microbial culture is provided with an increased amount of carbon dioxide. Correspondingly, it was found that the production of products derived from acetyl CoA is increased, and the production of products derived from pyruvate is reduced when the amount of CO2 dissolved in the microbial culture is decreased.

[0071] Foi demonstrado anteriormente que o fornecimento de uma cultura de carboxidotróficos com um substrato compreendendo CO e hidrogênio, opcionalmente, sob condições de fermentação, resulta na produção de álcoois e ácidos. Também foi anteriormente demonstrado a produção de etanol, com a produção de subprodutos adicionais, incluindo 2,3- butanodiol e ácido acético.[0071] It has been previously demonstrated that supplying a culture of carboxydotrophs with a substrate comprising CO and hydrogen, optionally, under fermentation conditions, results in the production of alcohols and acids. It has also previously been shown to produce ethanol, with the production of additional by-products including 2,3-butanediol and acetic acid.

[0072] Os inventores descobriram agora que, adicionalmente, pelo fornecimento da cultura microbiana com dióxido de carbono, o metabolismo do braço piruvato da via metabólica pode ser controlado. A via metabólica descrita acima é mostrada em mais detalhe na Figura 1 e abaixo.

[0072] The inventors have now discovered that, additionally, by supplying the microbial culture with carbon dioxide, the metabolism of the pyruvate arm of the metabolic pathway can be controlled. The metabolic pathway described above is shown in more detail in Figure 1 and below.

[0073] Carboxidotróficos acetogenos utilizam a via de Wood- Ljungdahl para fixar carbono em acetil CoA (Drake, Küsel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006; Wood, 1991), que serve como um precursor para os produtos como o acetato e etanol e para a biossíntese de ácidos graxos. Ao lado de acetil CoA, o outro intermediário chave na célula é o piruvato (ácido pirúvico), que serve como precursor para produtos como o 2,3-butanodiol, o ácido láctico, ou ácido succínico, bem como aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos ou requeridos para o crescimento e formação de biomassa. Acetil- CoA pode ser diretamente convertido em piruvato ou vice-versa, em uma única etapa enzimática, reversível catalisada por um piruvato:ferredoxina oxidorredutase (PFOR), por vezes também referido como piruvato sintase (EC 1.2.7.1). A reação PFOR parece como a seguir na reação 1: (1) Acetil CoA + CO2 + ferredoxina reduzida + 2H+ <-> Piruvato + ferredoxina oxidada AG°'= -4,6 kcal/mol (19,2 kJ/mol) (Thauer, Jungermann, Decker, & Pi, 1977)[0073] Carboxidotrophs acetogens use the Wood-Ljungdahl pathway to fix carbon in acetyl CoA (Drake, Küsel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006; Wood, 1991), which serves as a precursor for products such as acetate and ethanol and for the biosynthesis of fatty acids. Next to acetyl CoA, the other key intermediate in the cell is pyruvate (pyruvic acid), which serves as a precursor for products such as 2,3-butanediol, lactic acid, or succinic acid, as well as amino acids, vitamins, nucleic acids or required for growth and biomass formation. Acetyl-CoA can be directly converted to pyruvate or vice versa, in a single, reversible enzymatic step catalyzed by a pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFOR), sometimes also referred to as pyruvate synthase (EC 1.2.7.1). The PFOR reaction looks as follows in reaction 1: (1) Acetyl CoA + CO2 + reduced ferredoxin + 2H+ <-> Pyruvate + oxidized ferredoxin AG°'= -4.6 kcal/mol (19.2 kJ/mol) ( Thauer, Jungermann, Decker, & Pi, 1977)

[0074] Em carboxidotróficos acetogens que crescem autotroficamente todo piruvato produzido tem que passar por acetil CoA em primeiro lugar. Como acetil CoA é um composto C2 e piruvato um composto C3, uma molécula de CO2 precisa de ser incorporada (reação 1). A energia para esta reação é proporcionada por ferredoxina reduzida (E0'= -398 mV).[0074] In carboxydotrophic acetogens that grow autotrophically all pyruvate produced has to pass through acetyl CoA first. As acetyl CoA is a C2 compound and pyruvate is a C3 compound, a CO2 molecule needs to be incorporated (reaction 1). The energy for this reaction is provided by reduced ferredoxin (E0'= -398 mV).

[0075] Uma estratégia para aumentar a taxa de formação de piruvato é aumentar o nível de edutos ou reagentes nesta reação (equilíbrio dinâmico). Por exemplo, aumentando o nível de CO2 no gás de alimentação vai aumentar a taxa de formação de piruvato a partir de acetil-CoA, enquanto a reação inversa diminui até um ponto em que a reação está praticamente irreversível no sentido da formação de piruvato. Da mesma forma, o nível de ferredoxina reduzida pode ser aumentado por, por exemplo, aumentando a taxa de oxidação de CO através de monóxido de carbono desidrogenase dependente de ferredoxina.[0075] One strategy to increase the rate of pyruvate formation is to increase the level of educts or reactants in this reaction (dynamic equilibrium). For example, increasing the CO2 level in the feed gas will increase the rate of pyruvate formation from acetyl-CoA, while the reverse reaction slows down to a point where the reaction is virtually irreversible towards pyruvate formation. Likewise, the level of reduced ferredoxin can be increased by, for example, increasing the rate of CO oxidation by ferredoxin-dependent carbon monoxide dehydrogenase.

[0076] O piruvato (ácido pirúvico) é um ácido com um pKa muito baixo de 2,5 e, assim, em concentrações mais elevadas é uma ameaça para as bactérias, destruindo o gradiente essencial de prótons através da membrana, necessária para a formação de ATP (Kopke & Dürre, 2011). Um depósito para as bactérias é a produção de 2,3-butanodiol, que permitirá neutralizar o ácido pirúvico e salvar a célula. O aumento do nível de CO2 no gás de alimentação vai, portanto, aumentar a formação de 2,3-butanodiol indiretamente através do aumento das taxas de formação de piruvato. A reação para a produção de 2,3-butanodiol a partir do piruvato é como se segue na reação 2: (2) 2 Piruvato <-> acetoína + 2 CO2 Acetoína + NAD (P) H + H + <-> 2,3-butanodiol + NAD(P)+[0076] Pyruvate (pyruvic acid) is an acid with a very low pKa of 2.5 and thus in higher concentrations is a threat to bacteria by destroying the essential proton gradient across the membrane, necessary for the formation of ATP (Kopke & Dürre, 2011). A deposit for bacteria is the production of 2,3-butanediol, which will neutralize pyruvic acid and save the cell. Increasing the level of CO2 in the feed gas will therefore increase 2,3-butanediol formation indirectly through increased rates of pyruvate formation. The reaction for the production of 2,3-butanediol from pyruvate is as follows in reaction 2: (2) 2 Pyruvate <-> Acetoin + 2 CO2 Acetoin + NAD (P) H + H + <-> 2, 3-butanediol + NAD(P)+

[0077] O ácido láctico e ácido succínico são os produtos derivados do piruvato que representam outro depósito e embora eles sejam ácidos mais fracos (pKa 4,2 e 5,6, respectivamente), causam também uma ameaça para as bactérias em níveis elevados. Por outro lado, o que limita a sua produção poderia aumentar o pool de piruvato e resultar em um aumento da produção de 2,3-butanodiol.[0077] Lactic acid and succinic acid are the derivative products of pyruvate that represent another depot and although they are weaker acids (pKa 4.2 and 5.6 respectively), they also pose a threat to bacteria at high levels. On the other hand, limiting its production could increase the pyruvate pool and result in an increased production of 2,3-butanediol.

[0078] Os inventores demonstraram que aumentar a concentração de CO2 no reator e/ou aumentar a concentração do CO no reator ou a taxa de oxidação de CO pelo CODH levando a um aumento do nível de ferredoxina reduzida, a produção de piruvato em relação a acetil-CoA pode ser aumentada.[0078] The inventors demonstrated that increasing the CO2 concentration in the reactor and/or increasing the CO concentration in the reactor or the rate of CO oxidation by CODH leading to an increased level of reduced ferredoxin, pyruvate production relative to acetyl-CoA can be increased.

[0079] Em particular, os inventores demonstraram que a razão de produtos derivados de acetil-CoA, por exemplo, etanol, para produtos derivados de piruvato, por exemplo, 2,3-butanodiol, pode ser aumentada, aumentando a concentração de CO2 dissolvido no meio líquido do reator. A quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido pode ser aumentada, aumentando a quantidade de CO2 no substrato gasoso fornecido à fermentação. Em uma modalidade a concentração de CO2 no substrato fornecido para o biorreator é pelo menos 10%, ou, pelo menos, 15%, ou, pelo menos, 18%, ou, pelo menos, 20%, ou, pelo menos, 25%, ou, pelo menos, 30%, ou, pelo menos, 35%, ou, pelo menos, 40%, ou, pelo menos, 45%. Em certas modalidades, a concentração de CO2 no substrato fornecido para o biorreator é entre 15% e 65%, ou desde cerca de 20% a cerca de 50%, ou desde cerca de 25% a cerca de 45%.[0079] In particular, the inventors have demonstrated that the ratio of products derived from acetyl-CoA, e.g. ethanol, to products derived from pyruvate, e.g. 2,3-butanediol, can be increased by increasing the concentration of dissolved CO2 in the liquid medium of the reactor. The amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium can be increased by increasing the amount of CO2 in the gaseous substrate supplied to the fermentation. In one embodiment the CO2 concentration in the substrate supplied to the bioreactor is at least 10%, or at least 15%, or at least 18%, or at least 20%, or at least 25% , or at least 30%, or at least 35%, or at least 40%, or at least 45%. In certain embodiments, the concentration of CO2 in the substrate supplied to the bioreactor is between 15% and 65%, or from about 20% to about 50%, or from about 25% to about 45%.

[0080] Enquanto as concentrações baixas de CO2 dissolvido (por exemplo, 0 a 10% de CO2 no fluxo de gás de entrada) fornecidas para a cultura irão produzir etanol em 2,3-butanodiol a uma razão de cerca de 30:1 a cerca de 20:1, os inventores mostraram que as concentrações aumentadas de CO2 (por exemplo, 10-65% de CO2 no fluxo de gás de entrada) fornecidas para a cultura irão produzir etanol a razão de 2,3-butanodiol a partir de cerca de 20:1 a 1:1, preferencialmente 10:1 a 1:1.[0080] While low concentrations of dissolved CO2 (e.g., 0 to 10% CO2 in the inlet gas stream) supplied to the culture will produce ethanol in 2,3-butanediol at a ratio of about 30:1 to about 20:1, the inventors have shown that increased concentrations of CO2 (e.g., 10-65% CO2 in the inlet gas stream) fed to the culture will produce ethanol at the ratio of 2,3-butanediol from about 20:1 to 1:1, preferably 10:1 to 1:1.

[0081] Nos casos em que é desejada a baixa produção de produtos derivados de piruvato, uma concentração baixa de CO2 dissolvido pode ser alvejada. Este método também pode ser utilizado a fim de aumentar a produção de produtos derivados de acetil-CoA. Por exemplo, um fluxo de entrada de gás com 0-10% de CO2 no fluxo de gás de entrada irá resultar em uma alta razão de etanol para 2,3-butanodiol.[0081] In cases where low production of pyruvate-derived products is desired, a low concentration of dissolved CO2 can be targeted. This method can also be used in order to increase the production of acetyl-CoA derivative products. For example, an inlet gas stream with 0-10% CO2 in the inlet gas stream will result in a high ratio of ethanol to 2,3-butanediol.

[0082] Além disso, verificou-se que o aumento da quantidade de CO consumida pela cultura aumenta a quantidade de CO2 produzido, que por sua vez aumenta a produção de produtos derivados de piruvato. A quantidade de CO consumida pela cultura pode ser aumentada alterando a transferência de massa na fermentação, aumentando a taxa de fluxo do substrato gasoso para o biorreator e/ou aumentando uma velocidade de agitação do meio nutriente líquido no biorreator. A quantidade de CO consumida pela cultura pode também ser aumentada através do aumento da área de superfície da bolha. Tipicamente, elevada de transferência de massa pode ser alcançada através da introdução do substrato gasoso na forma de bolhas finas. Os especialistas na técnica apreciarão meios para introdução de substrato gasoso, como aspersores.[0082] Furthermore, it was found that increasing the amount of CO consumed by the crop increases the amount of CO2 produced, which in turn increases the production of pyruvate-derived products. The amount of CO consumed by the culture can be increased by altering the mass transfer in the fermentation, increasing the flow rate of the gaseous substrate into the bioreactor and/or increasing the agitation speed of the liquid nutrient medium in the bioreactor. The amount of CO consumed by the crop can also be increased by increasing the bubble surface area. Typically, high mass transfer can be achieved by introducing the gaseous substrate in the form of fine bubbles. Those skilled in the art will appreciate means for introducing gaseous substrate, such as sprinklers.

CO2 dissolvido e PressãoDissolved CO2 and Pressure

[0083] Os inventores identificaram uma série de métodos para controlar e ajustar a quantidade de CO2 dissolvido fornecida a uma cultura microbiana para controlar o perfil metabólico da fermentação. Um tal método para ajustar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido inclui o ajuste da pressão para o sistema.[0083] The inventors have identified a number of methods for controlling and adjusting the amount of dissolved CO2 supplied to a microbial culture to control the metabolic profile of the fermentation. One such method for adjusting the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium includes adjusting the pressure to the system.

[0084] Os inventores demonstraram que o aumento da pressão no biorreator irá levar a um aumento da quantidade de CO2 dissolvido no meio de fermentação. A fim de aumentar a produção de produtos derivados de piruvato, a fermentação deve ser realizada a uma pressão de cerca de 250 a cerca de 450 kPag (ou superior a 500 kPag), de tal modo que a concentração de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido é aumentada. Em certas modalidades, a pressão é superior a 250 kPag ou superior a 300 kPag ou superior a 350 kPag ou superior a 400 kPag, ou superior a 450 kPag ou superior a 500 kPag.[0084] The inventors have demonstrated that increasing the pressure in the bioreactor will lead to an increase in the amount of CO2 dissolved in the fermentation medium. In order to increase the production of pyruvate-derived products, the fermentation should be carried out at a pressure of about 250 to about 450 kPag (or greater than 500 kPag), such that the concentration of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is increased. In certain embodiments, the pressure is greater than 250 kPag or greater than 300 kPag or greater than 350 kPag or greater than 400 kPag or greater than 450 kPag or greater than 500 kPag.

[0085] Em casos em que o CO2 é fornecido para o reator a uma pressão de 50 kPag ou maior, uma menor concentração de CO2 é necessária no substrato, a fim de produzir níveis mais elevados de produtos derivados de piruvato. À medida que a cultura produz CO2, através da utilização de CO, um fluxo de gás de entrada com uma concentração mínima de CO2 pode ser fornecido ao reator, se a pressão é substancialmente elevada. Em certas modalidades, a quantidade de CO2 fornecida ao reator a uma pressão de 50 kPag ou superior, é inferior a 10%, ou inferior a 5%, ou inferior a 1%. Em certas modalidades substancialmente nenhum CO2 é fornecido ao reator a uma pressão de 50 kPag ou maior. De preferência, a concentração de CO2 de um fluxo de gás de entrada fornecido a uma pressão de 50 kPag ou superior é de cerca de 0% a 50%.[0085] In cases where CO2 is supplied to the reactor at a pressure of 50 kPag or greater, a lower concentration of CO2 is required in the substrate in order to produce higher levels of pyruvate-derived products. As the culture produces CO2, through the use of CO, an inlet gas stream with a minimum concentration of CO2 can be supplied to the reactor, if the pressure is substantially high. In certain embodiments, the amount of CO2 supplied to the reactor at a pressure of 50 kPag or greater is less than 10%, or less than 5%, or less than 1%. In certain embodiments substantially no CO2 is supplied to the reactor at a pressure of 50 kPag or greater. Preferably, the CO2 concentration of an inlet gas stream delivered at a pressure of 50 kPag or greater is about 0% to 50%.

[0086] Os inventores mostraram que a produção de 2,3-butanodiol é influenciada pela quantidade de pressão parcial de CO2 no fermentador, que por sua vez altera a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido. Pressões parciais de CO2 superiores do fluxo de gás irão aumentar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido. Em modalidades preferidas, o CO2 será fornecido ao reator a uma pressão parcial entre cerca de 50 kPag a cerca de 500 kPag.[0086] The inventors have shown that the production of 2,3-butanediol is influenced by the amount of CO2 partial pressure in the fermenter, which in turn changes the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium. Higher CO2 partial pressures from the gas stream will increase the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium. In preferred embodiments, CO2 will be supplied to the reactor at a partial pressure of between about 50 kPag to about 500 kPag.

[0087] Além disso, os inventores demonstraram também que é possível aumentar gradualmente a quantidade de CO2 dissolvido, aumentando gradualmente a quantidade de CO2 fornecida ao reator.[0087] Furthermore, the inventors also demonstrated that it is possible to gradually increase the amount of dissolved CO2 by gradually increasing the amount of CO2 supplied to the reactor.

[0088] A quantidade de CO2 em alguns fluxos gasosos podem não ser suficientes para permitir uma quantidade suficiente de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido. De modo a ultrapassar este problema, os inventores proporcionaram um método e sistema para aumentar a quantidade de CO2 por reciclagem de uma cauda ou gás de saída a partir da saída do biorreator para a entrada do biorreator. A fim de alterar a quantidade de pressão parcial de CO2, e, por conseguinte, CO2 dissolvido, independentemente, entre a pressão parcial de CO e a pressão total, o gás de saída/gás residual pode ser reciclado para o mesmo reator. O processo de fermentação no interior do reator irá resultar em alta conversão de CO e H2, e, por conseguinte, o gás residual consistirá principalmente de CO2 e qualquer espécie de gases inertes. Assim, a reciclagem do gás de cauda permitiria que a pressão parcial de CO2 a ser controlada independentemente da pressão parcial de CO e a pressão total.[0088] The amount of CO2 in some gaseous streams may not be sufficient to allow a sufficient amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium. In order to overcome this problem, the inventors have provided a method and system for increasing the amount of CO2 by recycling a tail or outlet gas from the bioreactor outlet to the bioreactor inlet. In order to change the amount of CO2 partial pressure, and therefore dissolved CO2, independently between the CO partial pressure and the total pressure, the outlet gas/waste gas can be recycled to the same reactor. The fermentation process inside the reactor will result in high conversion of CO and H2, and therefore the waste gas will mainly consist of CO2 and any kind of inert gases. Thus, recycling the tail gas would allow the partial pressure of CO2 to be controlled independently of the partial pressure of CO and the total pressure.

[0089] O uso de um sistema de dois reatores permite que um gás de saída compreendendo CO2 saindo de um primeiro biorreator seja passado para um segundo biorreator. Ao alimentar o gás de saída compreendendo CO2 ao tubo de descida do segundo biorreator, em vez de para o vaso de reator, a pressão parcial de CO2 no reator é aumentada. À medida que a mistura líquido-CO2 viaja para baixo no tubo de descida, os a pressão hidrostática aumenta, aumentando assim a quantidade de CO2 dissolvido na solução.[0089] The use of a two-reactor system allows an off-gas comprising CO2 exiting a first bioreactor to be passed to a second bioreactor. By feeding the off-gas comprising CO2 to the downcomer of the second bioreactor, instead of to the reactor vessel, the partial pressure of CO2 in the reactor is increased. As the liquid-CO2 mixture travels down the downcomer, the hydrostatic pressure increases, thereby increasing the amount of CO2 dissolved in the solution.

[0090] Para reciclar o gás residual a partir de um primeiro reator para um segundo ou reator receptor, a pressão de espaço aéreo do primeiro reator deverá ser ligeiramente mais elevada do que a pressão no tubo de descida do reator receptor, para superar perda de linhas e queda de pressão aspersor. Para reciclar o “gás residual” de seu próprio espaço aéreo, o gás residual podia ser reciclado para a entrada de gás ou tubo de descida, em que o tubo de descida precisaria de um edutor para capturar o gás residual (usando o fluxo de líquido no tubo de descida para arrastar o gás residual). A quantidade de CO2 sendo reciclado para o tubo de descida seria controlada de modo a que o CO2 dissolvido no meio nutriente líquido seria otimizado durante a aceleração. A Figura 17 proporciona uma representação de um reator de circuito fechado circulado com um substrato rico em CO2 fornecido para o tubo de descida, em que (1) é o tubo de subida; (2) é o tubo de descida; (3) é o gás de alimentação; (4) é o gás residual/de saída; (5) é o ponto onde o gás rico em CO2 do gás residual de ou um reator separado ou no mesmo reator entra no tubo de descida; e (6) representa a bomba de circuito que circula a mistura de gás/líquido através do tubo de subida e de descida.[0090] To recycle waste gas from a first reactor to a second or receiver reactor, the airspace pressure of the first reactor should be slightly higher than the pressure in the receiver reactor downpipe, to overcome loss of lines and sprinkler pressure drop. To recycle “waste gas” from your own airspace, the waste gas could be recycled to the gas inlet or downpipe, where the downpipe would need an eductor to capture the waste gas (using liquid flow in the downcomer to carry off the residual gas). The amount of CO2 being recycled to the downcomer would be controlled so that the CO2 dissolved in the liquid nutrient medium would be optimized during acceleration. Figure 17 provides a representation of a loop reactor looped with a CO2 rich substrate supplied to the downpipe, where (1) is the riser; (2) is the downpipe; (3) is the feed gas; (4) is the residual/outlet gas; (5) is the point where CO2-rich gas from tail gas from either a separate reactor or in the same reactor enters the downcomer; and (6) represents the circuit pump that circulates the gas/liquid mixture through the riser and the fall tube.

O BiorreatorThe Bioreactor

[0091] A fermentação pode ser realizada em qualquer biorreator apropriado, tal como um reator de tanque contínuo agitado (CSTR), um reator de célula imobilizada, um reator de ascensão de gás, um reator de coluna de bolhas (BCR), um reator de membrana, tal como um biorreator de membrana de fibra oca (HFM BR) ou um reator de leito gotejante (TBR). Além disso, em algumas modalidades da invenção, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento, na qual os micro-organismos são cultivados, e um segundo reator de fermentação, para o qual o caldo de fermentação a partir do reator de crescimento pode ser alimentado e em que mais de o produto de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) pode ser produzido. O biorreator da presente invenção está adaptado para receber um substrato contendo CO e/ou H2.[0091] The fermentation can be carried out in any suitable bioreactor, such as a continuous stirred tank reactor (CSTR), an immobilized cell reactor, a gas riser reactor, a bubble column reactor (BCR), a such as a hollow fiber membrane bioreactor (HFM BR) or a trickle bed reactor (TBR). Furthermore, in some embodiments of the invention, the bioreactor may comprise a first growth reactor, in which microorganisms are cultured, and a second fermentation reactor, into which fermentation broth from the growth reactor may be fed. fed and where more of the fermentation product (eg ethanol and acetate) can be produced. The bioreactor of the present invention is adapted to receive a substrate containing CO and/or H2.

O substrato da fermentaçãoThe fermentation substrate

[0092] Um substrato que contém o monóxido de carbono e pelo menos um átomo de hidrogênio ou dióxido de carbono é utilizado na reação de fermentação para produzir um ou mais produtos nos métodos da invenção. De preferência o substrato é um substrato gasoso. O substrato gasoso pode ser um gás residual obtido como um subproduto de um processo industrial ou de outra fonte, como a partir de gases de escape de motor de combustão (por exemplo, do automóvel). Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste em produtos metálicos ferroso de fabricação, como a fabricação de moinho de aço, produtos não ferrosos, processos de refinamento de petróleo, a gaseificação do carvão, a produção de energia elétrica, a produção de negro de carbono, a produção de amônia, produção de metanol, fabricação de coque e reforma de gás natural. Nestas modalidades, o substrato gasoso pode ser capturado a partir do processo industrial, antes de ser emitido para a atmosfera, utilizando qualquer método conveniente. Dependendo da composição do substrato gasoso, pode também ser desejável trata-lo para remover quaisquer impurezas indesejadas, como as partículas de poeira antes de introduzi-lo para a fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou esfregado utilizando métodos conhecidos.[0092] A substrate containing carbon monoxide and at least one atom of hydrogen or carbon dioxide is used in the fermentation reaction to produce one or more products in the methods of the invention. Preferably the substrate is a gaseous substrate. The gaseous substrate can be a waste gas obtained as a by-product of an industrial process or from another source, such as from combustion engine exhaust (e.g., automobile). In certain embodiments, the industrial process is selected from the group consisting of manufacturing ferrous metal products, such as steel mill manufacturing, non-ferrous products, petroleum refining processes, coal gasification, electric power production , carbon black production, ammonia production, methanol production, coke making and natural gas reforming. In these embodiments, the gaseous substrate can be captured from the industrial process, before being emitted to the atmosphere, using any convenient method. Depending on the composition of the gaseous substrate, it may also be desirable to treat it to remove any unwanted impurities such as dust particles before introducing it for fermentation. For example, the gaseous substrate can be filtered or scrubbed using known methods.

[0093] Em outras modalidades da invenção, o substrato gasoso pode ser originado a partir da gaseificação de biomassa. O processo de gaseificação envolve a combustão parcial da biomassa em um fornecimento restrito de ar ou oxigênio. O gás resultante compreende, tipicamente, principalmente CO e H2, com volumes mínimos de CO2, metano, etano e etileno. Por exemplo, subprodutos de biomassa obtidos durante a extração e processamento de produtos alimentares, como açúcar a partir de cana de açúcar, ou amido de milho ou grãos, ou resíduos de biomassa não alimentar gerada pela indústria florestal podem ser gaseificados para produzir um gás contendo CO adequado para uso na presente invenção.[0093] In other embodiments of the invention, the gaseous substrate can be originated from the gasification of biomass. The gasification process involves the partial combustion of biomass in a restricted supply of air or oxygen. The resulting gas typically comprises primarily CO and H2, with minor volumes of CO2, methane, ethane and ethylene. For example, biomass by-products obtained during the extraction and processing of food products, such as sugar from sugar cane, or starch from corn or grains, or non-food biomass residues generated by the forest industry can be gasified to produce a gas containing CO suitable for use in the present invention.

[0094] O substrato contendo CO conterá tipicamente uma proporção importante de CO, tal como pelo menos cerca de 15% a cerca de 100% de CO, em volume, de 40% a 95% de CO, em volume, de 40% a 60% de CO, em volume, e de 45% a 55% de CO, em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% de CO, em volume. Substratos com concentrações mais baixas de CO, tal como de 6%, podem também ser adequadas, particularmente quando H2 e CO2 estão também presentes.[0094] The CO-containing substrate will typically contain a major proportion of CO, such as at least about 15% to about 100% CO, by volume, from 40% to 95% CO, by volume, from 40% to 60% CO by volume and 45% to 55% CO by volume. In particular embodiments, the substrate comprises about 25%, or about 30%, or about 35%, or about 40%, or about 45%, or about 50% CO, or about 55% CO, or about 60% CO by volume. Substrates with lower CO concentrations, such as 6%, may also be suitable, particularly when H2 and CO2 are also present.

[0095] Tipicamente, o monóxido de carbono será adicionado à reação de fermentação no estado gasoso. No entanto, a invenção não deve ser considerada limitada à adição do substrato, neste estado. Por exemplo, o monóxido de carbono pode ser fornecido em um líquido. Por exemplo, um líquido pode ser saturado com um gás contendo monóxido de carbono e, em seguida, aquele líquido adicionado a um biorreator. Isto pode ser conseguido utilizando metodologia padrão. A título de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas tal como descrito acima pode ser utilizado.[0095] Typically, carbon monoxide will be added to the fermentation reaction in the gaseous state. However, the invention should not be considered limited to the addition of the substrate in this state. For example, carbon monoxide can be supplied in a liquid. For example, a liquid can be saturated with a gas containing carbon monoxide and then that liquid added to a bioreactor. This can be achieved using standard methodology. By way of example, a microbubble scatter generator as described above can be used.

[0096] Em uma modalidade o dióxido de carbono é adicionado à fermentação no estado gasoso. Na modalidade alternativa, o dióxido de carbono é fornecido como um carbonato ou bicarbonato.[0096] In one embodiment carbon dioxide is added to the fermentation in the gaseous state. In the alternative embodiment, the carbon dioxide is provided as a carbonate or bicarbonate.

[0097] Em uma modalidade da invenção, uma combinação de dois ou mais substratos diferentes pode ser usada na reação de fermentação.[0097] In one embodiment of the invention, a combination of two or more different substrates can be used in the fermentation reaction.

[0098] Em adição, é muitas vezes desejável aumentar a concentração de CO de uma corrente de substrato (ou pressão parcial de CO em um substrato gasoso) e, assim, aumentar a eficiência de reações de fermentação, onde CO é um substrato. O aumento da pressão parcial de CO em um substrato gasoso aumenta a transferência de massa de CO em um meio de fermentação. A composição dos fluxos de gases utilizados para alimentar uma reação de fermentação pode ter um impacto significativo sobre a eficiência e/ou custos daquela reação. Por exemplo, O2 pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbio. Processamento de gases indesejados ou desnecessários em estágios de um processo de fermentação antes ou depois da fermentação pode aumentar a carga sobre esses estágios (por exemplo, onde o fluxo de gás é comprimido antes de entrar em um biorreator, energia desnecessária pode ser utilizada para comprimir gases que não são necessários na fermentação). Por conseguinte, pode ser desejável tratar correntes de substrato, particularmente correntes de substratos derivadas de fontes industriais, para remover componentes indesejáveis e aumentar a concentração de componentes desejáveis.[0098] In addition, it is often desirable to increase the CO concentration of a substrate stream (or partial pressure of CO in a gaseous substrate) and thereby increase the efficiency of fermentation reactions where CO is a substrate. Increasing the partial pressure of CO in a gaseous substrate increases the mass transfer of CO in a fermentation medium. The composition of the gas streams used to feed a fermentation reaction can have a significant impact on the efficiency and/or costs of that reaction. For example, O2 can reduce the efficiency of an anaerobic fermentation process. Processing unwanted or unnecessary gases in stages of a fermentation process before or after fermentation can increase the load on these stages (e.g. where the gas stream is compressed before entering a bioreactor, unnecessary energy can be used to compress gases that are not needed in fermentation). Therefore, it may be desirable to treat substrate streams, particularly substrate streams derived from industrial sources, to remove undesirable components and increase the concentration of desirable components.

[0099] Em certas modalidades, pouco ou nenhum hidrogênio é fornecido no substrato compreendendo CO.[0099] In certain embodiments, little or no hydrogen is provided in the substrate comprising CO.

Mistura de CorrentesCurrent Mixing

[00100] Pode ser desejável misturar uma corrente de substrato reformado compreendendo CO e H2 com um ou mais outros fluxos, a fim de melhorar a eficiência, produção de álcool e/ou captura de carbono total da reação de fermentação. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, em algumas modalidades da presente invenção, as bactérias carboxidotróficas convertem CO em etanol de acordo com o seguinte: 6CO + 3H2O ^ C2H5OH + 4CO2[00100] It may be desirable to mix a reformed substrate stream comprising CO and H2 with one or more other streams in order to improve the efficiency, alcohol production and/or total carbon capture of the fermentation reaction. Without wishing to be bound by theory, in some embodiments of the present invention, carboxytrophic bacteria convert CO to ethanol according to the following: 6CO + 3H2O ^ C2H5OH + 4CO2

[00101] No entanto, na presença de H2, a conversão global pode ser como se segue: 6CO + 12H2 ^ 3C2H5OH + 3H2O[00101] However, in the presence of H2, the overall conversion can be as follows: 6CO + 12H2 ^ 3C2H5OH + 3H2O

[00102] Por conseguinte, fluxos com elevado teor de CO carbono podem ser misturados com correntes de substrato reformados compreendendo CO e H2 para aumentar a relação CO:H2 para otimizar a eficiência da fermentação. A título de exemplo, os fluxos de resíduos industriais, como gás de exaustão a partir de um moinho de aço têm um elevado teor de CO, mas incluem um mínimo ou nenhum H2. Como tal, pode ser desejável misturar um ou mais fluxos compreendendo CO e H2 com o fluxo de resíduos que compreende CO, antes de fornecer o fluxo de substrato misturado com o fermentador. A eficiência global, a produtividade de álcool e/ou captura de carbono total da fermentação serão dependentes da estequiometria da CO e H2 no fluxo misturado. No entanto, em modalidades particulares o fluxo combinado pode compreender substancialmente CO e H2 nas seguintes proporções molares: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 ou 1:2.[00102] Therefore, streams with high CO carbon content can be mixed with reformed substrate streams comprising CO and H2 to increase the CO:H2 ratio to optimize fermentation efficiency. By way of example, industrial waste streams such as exhaust gas from a steel mill have a high CO content but include minimal or no H2. As such, it may be desirable to mix one or more streams comprising CO and H2 with the waste stream comprising CO, prior to supplying the mixed substrate stream to the fermenter. The overall efficiency, alcohol productivity and/or total carbon capture from the fermentation will be dependent on the stoichiometry of CO and H2 in the mixed stream. However, in particular embodiments the combined flux may substantially comprise CO and H2 in the following molar ratios: 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 or 1:2.

[00103] Além disso, pode ser desejável fornecer CO e H2 em proporções particulares em diferentes fases da fermentação. Por exemplo, correntes de substrato com um teor relativamente elevado de H2 (como 1:2 de CO:H2) podem ser fornecidos à fase de fermentação durante o arranque e/ou fases de crescimento microbiano rápido. No entanto, quando a fase de crescimento diminui, de tal forma que a cultura é mantida a uma densidade microbiana substancialmente constante, o teor de CO pode ser aumentado (por exemplo, pelo menos 1:1 ou 2:1 ou superior, em que a concentração de H2 pode ser maior ou igual a zero).[00103] Furthermore, it may be desirable to supply CO and H2 in particular proportions at different stages of fermentation. For example, substrate streams with a relatively high H2 content (such as 1:2 CO:H2) can be fed to the fermentation stage during start-up and/or rapid microbial growth stages. However, when the growth phase decreases, such that the culture is maintained at a substantially constant microbial density, the CO content can be increased (e.g. at least 1:1 or 2:1 or higher, where the H2 concentration can be greater than or equal to zero).

[00104] Mistura de fluxos também podem ter outras vantagens, particularmente nos casos em que um fluxo de resíduos que compreende CO é de natureza intermitente. Por exemplo, um fluxo de resíduos intermitente que compreende CO pode ser misturado com uma corrente de substrato reformado substancialmente contínuo compreendendo CO e H2 e fornecido ao fermentador. Em modalidades particulares da invenção, a composição e a vazão do fluxo misturado substancialmente contínuo podem ser variados de acordo com o fluxo intermitente, a fim de manter o fornecimento de um fluxo de composição de substrato substancialmente contínuo e a vazão para o fermentador.[00104] Mixing streams can also have other advantages, particularly in cases where a waste stream comprising CO is intermittent in nature. For example, an intermittent waste stream comprising CO can be mixed with a substantially continuous stream of reformed substrate comprising CO and H2 and supplied to the fermenter. In particular embodiments of the invention, the composition and flow rate of the substantially continuous mixed stream may be varied according to the intermittent flow, in order to maintain supply of a substantially continuous stream of substrate composition and flow rate to the fermenter.

MeioQuite

[00105] Será apreciado que para o crescimento de um ou mais microorganismos e substrato para fermentação de etanol e/ou acetato ocorrer, além do substrato, um meio nutriente adequado terá de ser alimentado ao biorreator. Um meio nutriente conterá componentes, como vitaminas e minerais, suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo utilizado. A título de exemplo apenas, meios anaeróbicos apropriados para o crescimento de Clostridium autoethanogenum são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, por Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., Na Aerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide; Arch. Microbiol. 161: 345-351 (1994)). A seção de “Exemplos” aqui depois fornece mais exemplos de meios adequados.[00105] It will be appreciated that for growth of one or more microorganisms and substrate for ethanol and/or acetate fermentation to occur, in addition to the substrate, a suitable nutrient medium will have to be fed to the bioreactor. A nutrient medium will contain components, such as vitamins and minerals, sufficient to allow growth of the microorganism used. By way of example only, appropriate anaerobic media for the growth of Clostridium autoethanogenum are known in the art, as described, for example, by Abrini et al (Clostridium autoethanogenum, sp. Nov., Na Aerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide; Arch Microbiol 161: 345-351 (1994)). The "Examples" section here later provides more examples of suitable means.

FermentaçãoFermentation

[00106] Os processos para a produção de etanol e outros álcoois de substratos gasosos são conhecidos. Processos exemplificativos incluem os descritos, por exemplo, no documento WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925, WO2009/064200, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111, cada um dos quais está aqui incorporado por referência.[00106] Processes for producing ethanol and other alcohols from gaseous substrates are known. Exemplary processes include those described, for example, in WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925, WO2009/064200, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 and US 5,821. 111, each of which is incorporated herein by reference.

Condições de fermentaçãofermentation conditions

[00107] A fermentação deve desejavelmente ser realizada sob condições apropriadas para o substrato para fermentação de etanol e/ou acetato ocorrer. As condições de reação que devem ser consideradas incluem a temperatura, a taxa de fluxo de meios, pH, potencial redox de meio, velocidade de agitação (se usando um reator tanque agitado contínuo), nível de inoculação, as concentrações máximas de substrato e as taxas de introdução do substrato ao biorreator para assegurar que nível do substrato não se torne limitante, e as concentrações máximas do produto para evitar a inibição do produto.[00107] Fermentation should desirably be carried out under conditions appropriate for the substrate for ethanol and/or acetate fermentation to occur. Reaction conditions that should be considered include temperature, media flow rate, pH, media redox potential, agitation speed (if using a continuous stirred tank reactor), inoculation level, maximum substrate concentrations, and rates of substrate introduction to the bioreactor to ensure substrate levels do not become limiting, and maximum product concentrations to avoid product inhibition.

[00108] As condições ótimas de reação irão depender em parte do micro-organismo particular usado. No entanto, em geral, é preferencial que a fermentação seja realizada a uma pressão superior à pressão ambiente. Operando em pressões aumentadas permite um aumento significativo da taxa de transferência de CO a partir da fase gasosa para a fase líquida onde pode ser absorvida pelo micro-organismo como uma fonte de carbono para a produção de etanol. Isto por sua vez significa que o tempo de retenção (definido como o volume de líquido no biorreator dividido pela vazão de gás de entrada) pode ser reduzido quando biorreatores são mantidos a uma pressão elevada, em vez de a pressão atmosférica.[00108] The optimal reaction conditions will depend in part on the particular microorganism used. However, in general, it is preferred that the fermentation is carried out at a pressure greater than ambient pressure. Operating at increased pressures allows for a significant increase in the transfer rate of CO from the gas phase to the liquid phase where it can be taken up by the microorganism as a carbon source for ethanol production. This in turn means that retention time (defined as the volume of liquid in the bioreactor divided by the inlet gas flow rate) can be reduced when bioreactors are maintained at elevated pressure rather than atmospheric pressure.

[00109] Além disso, uma vez que uma determinada taxa de conversão de CO para produto é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato, e alcançar um tempo de retenção desejado, por sua vez determina o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir grandemente o volume do biorreator necessário, e, consequentemente, o custo capital do equipamento de fermentação. De acordo com os exemplos apresentados na patente US 5.593.886, volume do reator pode ser reduzido em proporção linear com o aumento da pressão de operação do reator, isto é, biorreatores operados a 10 atmosferas de pressão precisam ser apenas um décimo do volume dos operados a 1 atmosfera de pressão.[00109] Furthermore, since a given conversion rate of CO to product is, in part, a function of substrate retention time, achieving a desired retention time in turn determines the required volume of a bioreactor , the use of pressurized systems can greatly reduce the required bioreactor volume, and hence the capital cost of the fermentation equipment. According to the examples presented in US patent 5,593,886, reactor volume can be reduced in linear proportion with the increase in reactor operating pressure, i.e., bioreactors operated at 10 atmospheres of pressure need to be only one tenth of the volume of the reactors. operated at 1 atmosphere of pressure.

[00110] As vantagens da realização de uma fermentação de gás para o produto a pressões elevadas também foram descritas em outro local. Por exemplo, o documento WO 02/08438 descreve fermentações gás para etanol realizadas sob pressões de 30 psig e 75 psig, gerando produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia, respectivamente. No entanto, exemplos de fermentações realizadas utilizando meios semelhantes e as composições de gás de entrada em pressão atmosférica demonstraram produzir entre 10 e 20 vezes menos do etanol por litro por dia.[00110] The advantages of performing a gas fermentation for the product at elevated pressures have also been described elsewhere. For example, WO 02/08438 describes gas-to-ethanol fermentations carried out under pressures of 30 psig and 75 psig, generating ethanol productivities of 150 g/l/day and 369 g/l/day, respectively. However, examples of fermentations carried out using similar media and input gas compositions at atmospheric pressure have been shown to produce between 10 and 20 times less ethanol per liter per day.

[00111] Exemplos de condições de fermentação adequadas para a fermentação anaeróbia de um substrato compreendendo CO são detalhados em WO2007/1 17.157, WO2008/115080, WO2009/022925 e WO2009/064200. Reconhece-se que as condições de fermentação reportadas nestes podem ser facilmente modificadas de acordo com os métodos da presente invenção.[00111] Examples of suitable fermentation conditions for the anaerobic fermentation of a substrate comprising CO are detailed in WO2007/117157, WO2008/115080, WO2009/022925 and WO2009/064200. It is recognized that the fermentation conditions reported in these can be easily modified according to the methods of the present invention.

Micro-organismosMicroorganisms

[00112] Em várias modalidades, a fermentação é realizada utilizando uma cultura de uma ou mais cepas de bactérias carboxidotróficas. Em várias modalidades, a bactéria carboxidotrófica é selecionada a partir de Moorella, Clostridium, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Methanosarcina, e Desulfotomaculum. Um número de bactérias anaeróbias é conhecido por serem capazes de realizar a fermentação do CO para álcoois, incluindo n-butanol e etanol, e ácido acético, e são adequados para utilização no processo da presente invenção. Exemplos de tais bactérias que são adequadas para utilização na presente invenção incluem as do gênero Clostridium, como cepas de Clostridium ljungdahlii, incluindo as descritas em WO 00/68407, EP 117.309, Patentes US 6.368.819, 5.173.429, 5.593.886, e, WO 98/00558 e WO 02/08438, Clostridium carboxidivorans (Liou et al, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), Clostridium ragsdalei (WO/2008/028055) e Clostridium autoethanogenum (Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pp 345-351). Outras bactérias adequadas incluem as do gênero Moorella, incluindo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), e os do gênero Carboxidothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Outros exemplos incluem Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simple et. al., Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26 Pp41-65). Além disso, deve ser entendido que outras bactérias anaeróbicas acetogênicas podem ser aplicáveis para a presente invenção tal como seria entendido por uma pessoa com conhecimentos na técnica. Será também apreciado que a invenção pode ser aplicada a uma cultura mista de duas ou mais bactérias.[00112] In various embodiments, the fermentation is carried out using a culture of one or more strains of carboxydotrophic bacteria. In various embodiments, the carboxydotrophic bacterium is selected from Moorella, Clostridium, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Methanosarcina, and Desulfotomaculum. A number of anaerobic bacteria are known to be capable of fermenting CO to alcohols, including n-butanol and ethanol, and acetic acid, and are suitable for use in the process of the present invention. Examples of such bacteria that are suitable for use in the present invention include those of the genus Clostridium, such as strains of Clostridium ljungdahlii, including those described in WO 00/68407, EP 117,309, US Patents 6,368,819, 5,173,429, 5,593,886, and, WO 98/00558 and WO 02/08438, Clostridium carboxidivorans (Liou et al, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pp 2085-2091), Clostridium ragsdalei (WO/2008/028055) and Clostridium autoethanogenum (Abrini et al , Archives of Microbiology 161: pp 345-351). Other suitable bacteria include those of the genus Moorella, including Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: pp 1607-1612), and those of the genus Carboxidothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Other examples include Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simple et. al., Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26 Pp41- 65). Furthermore, it should be understood that other acetogenic anaerobic bacteria may be applicable to the present invention as would be understood by a person skilled in the art. It will also be appreciated that the invention can be applied to a mixed culture of two or more bacteria.

[00113] Em uma modalidade, o micro-organismo é selecionado a partir do grupo de organismos carboxidotróficos acetogênicos compreendendo as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovata, Butyribacterium methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.[00113] In one embodiment, the microorganism is selected from the group of acetogenic carboxydotrophic organisms comprising the species Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carbidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum , Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovata, Butyribacterium methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.

[00114] Estes carboxidotróficos acetogênicos são definidos pela sua capacidade de utilizar e crescer quimioautotroficamente em fontes de um carbono gasoso (C1) como monóxido de carbono (CO) e dióxido de carbono (CO2) com monóxido de carbono (CO) e/ou hidrogênio (H2) como fonte de energia, sob condições anaeróbicas, formando acetil-CoA, acetato e outros produtos. Eles partilham o mesmo modo de fermentação, a via Wood- Ljungdahl ou redutiva de acetil-CoA, e são definidos pela presença de conjunto de enzima constituído por monóxido de carbono desidrogenase (CODH), Hidrogenase, formato desidrogenase formil-tetrahidrofolato, sintetase, metileno-tetrahidrofolato desidrogenase, Formil-tetrahidrofolato ciclohidrolase, metileno tetrahidrofolato redutase, e monóxido de carbono desidrogenase/acetil CoA sintetase (CODH/ACS), cuja combinação é característica e exclusiva para este tipo de bactérias (Drake, Küsel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006).[00114] These acetogenic carboxydotrophs are defined by their ability to utilize and grow chemoautotrophically on sources of a gaseous carbon (C1) such as carbon monoxide (CO) and carbon dioxide (CO2) with carbon monoxide (CO) and/or hydrogen (H2) as an energy source, under anaerobic conditions, forming acetyl-CoA, acetate and other products. They share the same mode of fermentation, the Wood-Ljungdahl or acetyl-CoA reductive pathway, and are defined by the presence of an enzyme pool consisting of carbon monoxide dehydrogenase (CODH), Hydrogenase, formate dehydrogenase, formyl-tetrahydrofolate, synthetase, methylene -tetrahydrofolate dehydrogenase, formyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase, methylene tetrahydrofolate reductase, and carbon monoxide dehydrogenase/acetyl CoA synthetase (CODH/ACS), whose combination is characteristic and exclusive for this type of bacteria (Drake, Küsel, Matthies, Wood, & Ljungdahl , 2006).

[00115] Em contraste com o crescimento de bactérias quimioheterotróficas fermentadoras de açúcar que convertem o substrato em biomassa, metabólitos secundários e de piruvato a partir da qual, em seguida, os produtos são formados (através da acetil-CoA ou diretamente), em acetogênicas o substrato é canalizado diretamente para acetil-CoA, a partir dos quais, em seguida, os produtos, a biomassa, e metabólitos secundários são formados.[00115] In contrast to the growth of sugar-fermenting chemoheterotrophic bacteria that convert the substrate into biomass, secondary metabolites and pyruvate from which the products are then formed (via acetyl-CoA or directly), in acetogens the substrate is channeled directly to acetyl-CoA, from which products, biomass, and secondary metabolites are then formed.

[00116] Em uma outra modalidade, o micro-organismo é selecionado a partir de um cluster de Clostridia carboxidotrófica compreendendo a espécie C. autoethanogenum, C. ljungdahln, e C. ragsdalei e isolados relacionados.[00116] In another embodiment, the microorganism is selected from a cluster of carboxydotrophic Clostridia comprising the species C. autoethanogenum, C. ljungdahln, and C. ragsdalei and related isolates.

[00117] Estes incluem, entre outros, cepas de C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, e Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente US 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente US 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente US 6.368.819), ou “C. ragsdalei P11T” (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), e produtos relacionados isolados como “C. coskatii” (patente US 2011/0229947), “Clostridium sp. MT351” (Tyurin & Kiriukhin, 2012), “Clostridium sp. MT 653” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012a), “Clostridium sp. MT683 “(Berzin, 2012), “Clostridium sp. MT962”(Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2013) “Clostridium sp. MTT 121” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012b), “Clostridium sp. MT1230” (Kiriukhin & Tyurin, 2013), ou “Clostridium sp. MT1962” (Berzin, Tyurin, & Kiriukhin, 2013), e cepas mutantes dos mesmos, como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanik from Synthesus Gas Using Clostridium ljungdahlii. Tese de doutorado, North Carolina State University, 2010) ou “Clostridium sp. MT896” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012c).[00117] These include, among others, strains of C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, and Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (US patent 5,593,886), C. ljungdahlii C-01 ( ATCC 55988) (US Patent 6,368,819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (US Patent 6,368,819), or “C. ragsdalei P11T” (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), and related products isolated as “C. coskatii” (US patent 2011/0229947), “Clostridium sp. MT351” (Tyurin & Kiriukhin, 2012), “Clostridium sp. MT 653” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012a), “Clostridium sp. MT683” (Berzin, 2012), “Clostridium sp. MT962”(Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2013) “Clostridium sp. MTT 121” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012b), “Clostridium sp. MT1230” (Kiriukhin & Tyurin, 2013), or “Clostridium sp. MT1962” (Berzin, Tyurin, & Kiriukhin, 2013), and mutant strains thereof, such as C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanik from Synthesus Gas Using Clostridium ljungdahlii. Doctoral thesis, North Carolina State University , 2010) or “Clostridium sp. MT896” (Berzin, Kiriukhin, & Tyurin, 2012c).

[00118] Estas cepas formam um subgrupo dentro do cluster de rRNA I de Clostridium (Collins et al., 1994), tendo pelo menos 99% de identidade no nível do gene 16S de rRNA, mesmo sendo espécies distintas, conforme determinado por reassociação DNA-DNA e experimentos de impressão digital de DNA (WO 2008/028055, patente US 2011/0229947).[00118] These strains form a subgroup within the Clostridium rRNA I cluster (Collins et al., 1994), having at least 99% identity at the 16S rRNA gene level, even though they are distinct species, as determined by DNA reassociation -DNA and DNA fingerprinting experiments (WO 2008/028055, US patent 2011/0229947).

[00119] As cepas deste cluster são definidas por características comuns, tendo ambos um genótipo e fenótipo semelhantes, e todos eles compartilham o mesmo modo de conservação de energia e metabolismo fermentativo. As cepas de este cluster são desprovidas de citocromos e conservam energia através de um complexo Rnf.[00119] The strains in this cluster are defined by common characteristics, having both a similar genotype and phenotype, and they all share the same mode of energy conservation and fermentative metabolism. Strains in this cluster are devoid of cytochromes and conserve energy through an Rnf complex.

[00120] Todas as cepas deste aglomerado têm um genótipo semelhante com um tamanho de genoma de cerca de 4,2 MBP (Kopke et al, 2010) e uma composição de CG de cerca de 32% mol (Abrini et al, 1994; Kopke et al, 2010; Tanner et al, 1993) (WO 2008/028055; patente US 2011/0229947), e óperons de gene chave essencial conservados que codificam para enzimas de via de Wood-Ljungdahl (monóxido de carbono desidrogenase, formil- tetrahidrofolato sintetase, metileno-tetrahidrofolato desidrogenase, formil- tetrahidrofolato ciclohidrolase, metileno-tetrahidrofolato redutase, e monóxido de carbono desidrogenase/acetil CoA-sintase), hidrogenase, formato desidrogenase, complexo de Rnf (rnfCDGEAB), piruvato: ferredoxina oxidorredutase, aldeído:ferredoxina oxidorredutase (Kopke et al, 2010, 2011). A organização e o número de genes da via Wood-Ljungdahl, responsável pela absorção de gás, demonstrou ser a mesma em todas as espécies, apesar das diferenças nas sequências de ácido nucleico e de aminoácidos (Kopke et al, 2011).[00120] All strains in this cluster have a similar genotype with a genome size of about 4.2 MBP (Kopke et al, 2010) and a GC composition of about 32 mol% (Abrini et al, 1994; Kopke et al, 2010; Tanner et al, 1993) (WO 2008/028055; US patent 2011/0229947), and conserved essential key gene operons that encode Wood-Ljungdahl pathway enzymes (carbon monoxide dehydrogenase, formyl-tetrahydrofolate synthetase, methylene tetrahydrofolate dehydrogenase, formyl tetrahydrofolate cyclohydrolase, methylene tetrahydrofolate reductase, and carbon monoxide dehydrogenase/acetyl CoA synthase), hydrogenase, formate dehydrogenase, Rnf complex (rnfCDGEAB), pyruvate:ferredoxin oxidoreductase, aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (Kopke et al, 2010, 2011). The organization and number of genes in the Wood-Ljungdahl pathway, responsible for gas uptake, has been shown to be the same in all species, despite differences in nucleic acid and amino acid sequences (Kopke et al, 2011).

[00121] As cepas têm uma morfologia e de tamanho semelhantes (células em crescimento logarítmico são entre 0,5-0,7 x 3-5 μm), são mesófilas (temperatura de crescimento ideal entre 30-37°C) e estritamente anaeróbica (Abrini et al., 1994; Tanner et al, 1993) (WO 2008/028055). Além disso, todos eles compartilham as mesmas características principais filogenéticas, como a mesma faixa de pH (pH 4-7,5, com um pH inicial ideal de 5,5-6), o forte crescimento autotrófico nos gases contendo CO com taxas de crescimento semelhantes, e um perfil metabólico semelhante com etanol e ácido acético como principal produto final da fermentação, e pequenas quantidades de 2,3-butanodiol e ácido láctico formadas sob certas condições (Abrini et al, 1994; Kopke et al, 2011; Tanner et al, 1993) (WO 2008/028055). Produção de indol foi observada com todas as espécies. No entanto, as espécies diferenciam em utilização do substrato de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por exemplo, arginina, histidina), ou outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Além disso, algumas das espécies demonstraram ser auxotróficas para certas vitaminas (tiamina por exemplo, biotina), enquanto outras não. Também a redução de ácidos carboxílicos nos seus álcoois correspondentes, tem sido demonstrada em uma variedade destes organismos (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012). Esses traços são, portanto, não específicos para um organismo como C. autoethanogenum ou C ljungdahlii, mas sim traços gerais para Clostridia carboxidotrófica que sintetiza etanol e pode-se prever que mecanismo de trabalho semelhante entre essas cepas, embora possa haver diferenças de desempenho (Perez et al, 2012).[00121] The strains have a similar morphology and size (cells in logarithmic growth are between 0.5-0.7 x 3-5 μm), are mesophilic (ideal growth temperature between 30-37°C) and strictly anaerobic (Abrini et al., 1994; Tanner et al, 1993) ( WO 2008/028055 ). Furthermore, they all share the same key phylogenetic characteristics, such as the same pH range (pH 4-7.5, with an optimal initial pH of 5.5-6), strong autotrophic growth in CO-containing gases with rates of similar growth, and a similar metabolic profile with ethanol and acetic acid as the main end product of fermentation, and small amounts of 2,3-butanediol and lactic acid formed under certain conditions (Abrini et al, 1994; Kopke et al, 2011; Tanner et al, 1993) ( WO 2008/028055 ). Indole production was observed with all species. However, species differ in substrate utilization of various sugars (eg, rhamnose, arabinose), acids (eg, gluconate, citrate), amino acids (eg, arginine, histidine), or other substrates (eg, betaine , butanol). Furthermore, some of the species have been shown to be auxotrophic for certain vitamins (eg thiamine, biotin), while others have not. Also, the reduction of carboxylic acids to their corresponding alcohols has been demonstrated in a variety of these organisms (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012). These traits are therefore not specific for an organism such as C. autoethanogenum or C ljungdahlii, but rather general traits for ethanol-synthesizing carboxydotrophic Clostridia, and it can be predicted that similar mechanism of work between these strains, although there may be differences in performance ( Perez et al, 2012).

[00122] Um micro-organismo exemplar apropriado para utilização na presente invenção é Clostridium autoethanogenum. Em uma modalidade, o Clostridium autoethanogenum é um Clostridium autoethanogenum possuindo as características identificadoras da cepa depositada no Centro de Recursos alemão de Material Biológico (DSMZ) com o número de depósito de identificação 19630. Em outra modalidade, o Clostridium autoethanogenum é um Clostridium autoethanogenum tendo as características de identificação de número DSMZ de depósito DSMZ 10061. Estas cepas possuem uma tolerância especial a alterações na composição do substrato, em particular, de H2 e CO e, como tal, são particularmente bem adequadas para utilização em combinação com um processo de reformação a vapor.[00122] An exemplary microorganism suitable for use in the present invention is Clostridium autoethanogenum. In one embodiment, Clostridium autoethanogenum is a Clostridium autoethanogenum having the identifying characteristics of the strain deposited at the German Resource Center for Biological Material (DSMZ) under deposit identification number 19630. In another embodiment, Clostridium autoethanogenum is a Clostridium autoethanogenum having the identifying features of DSMZ deposit number DSMZ 10061. These strains have a special tolerance to changes in substrate composition, in particular H2 and CO, and as such are particularly well suited for use in combination with a reforming process steam.

[00123] Um micro-organismo exemplar apropriado para utilização na produção de acetato a partir de um substrato que compreende CO2 e H2, em conformidade com um aspecto da presente invenção é Acetobacterium woodii.[00123] An exemplary microorganism suitable for use in the production of acetate from a substrate comprising CO2 and H2 in accordance with one aspect of the present invention is Acetobacterium woodii.

[00124] A cultura das bactérias utilizada nos métodos da invenção pode ser conduzida utilizando qualquer número de processos conhecidos na técnica para a cultura e fermentação de substratos utilizando as bactérias anaeróbicas. A título de exemplo, os processos geralmente descritos nos seguintes artigos usando substratos gasosos para a fermentação podem ser utilizados: (i) K.T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentation resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K.T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K.T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquido r gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J.L. Vega, et al. (1989). Study og Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J.L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering.34. 6. 774-784; (vi) J.L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recyclig. 3. 149-160; todos os quais são aqui incorporados por referência.[00124] Culturing the bacteria used in the methods of the invention can be conducted using any number of processes known in the art for culturing and fermenting substrates using anaerobic bacteria. By way of example, the processes generally described in the following articles using gaseous substrates for the fermentation can be used: (i) K.T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentation resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K.T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605-614; (iii) K.T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J.L. Vegas, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34.6.785-793; (v) J.L. Vegas, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Batch culture. Biotechnology and Bioengineering.34. 6, 774-784; (vi) J.L. Vegas, et al. (nineteen ninety). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160; all of which are incorporated herein by reference.

Produtos de fermentaçãofermentation products

[00125] Os métodos da invenção podem ser utilizados para produzir qualquer um de uma variedade de produtos de hidrocarbonetos. Isto inclui álcoois, ácidos e/ou diois. Mais particularmente, a invenção pode ser aplicável a fermentação para produção de butirato, propionato, caproato, etanol, propanol, butanol, 2,3-butanodiol, propileno, butadieno, iso-butileno e de etileno. Em uma modalidade da invenção pode ser utilizado para produzir álcoois, incluindo, entre outros, propanol e butanol. Os álcoois podem então ser reagidos com acetato de produzir produtos, incluindo o acetato de propil ou acetato de butil. Um especialista compreenderá que a invenção não está limitada aos álcoois e produtos mencionados, qualquer álcool apropriado e ou ácido pode ser usado para produzir um produto.[00125] The methods of the invention can be used to produce any of a variety of hydrocarbon products. This includes alcohols, acids and/or diols. More particularly, the invention may be applicable to fermentation to produce butyrate, propionate, caproate, ethanol, propanol, butanol, 2,3-butanediol, propylene, butadiene, iso-butylene and ethylene. In one embodiment of the invention it can be used to produce alcohols, including but not limited to propanol and butanol. The alcohols can then be reacted with acetate to produce products including propyl acetate or butyl acetate. One skilled in the art will understand that the invention is not limited to the alcohols and products mentioned, any suitable alcohol and/or acid can be used to produce a product.

[00126] Estes e outros produtos podem ser de valor para uma série de outros processos, como a produção de plásticos, produtos farmacêuticos e agroquímicos. Em uma modalidade, o produto de fermentação é utilizado para a produção de hidrocarbonetos na faixa da gasolina (cerca de 8 carbonos), hidrocarbonetos diesel (cerca de 12 carbonos) ou hidrocarbonetos combustíveis de jato (cerca de 12 carbonos).[00126] These and other products can be of value to a number of other processes such as the production of plastics, pharmaceuticals and agrochemicals. In one embodiment, the fermentation product is used to produce hydrocarbons in the gasoline range (about 8 carbons), diesel hydrocarbons (about 12 carbons), or jet fuel hydrocarbons (about 12 carbons).

[00127] Os métodos da invenção também podem ser aplicados para fermentações aeróbicas, para fermentações anaeróbias ou aeróbicas de outros produtos, incluindo, entre outros, isopropanol. Os métodos da invenção também podem ser aplicada para fermentações aeróbicas, para fermentações anaeróbias e aeróbicas de outros produtos, incluindo, entre outros, isopropanol.[00127] The methods of the invention can also be applied for aerobic fermentations, for anaerobic or aerobic fermentations of other products, including but not limited to isopropanol. The methods of the invention can also be applied for aerobic fermentations, for anaerobic and aerobic fermentations of other products, including but not limited to isopropanol.

[00128] A invenção também prevê que pelo menos uma porção de um produto de hidrocarbonetos produzido por fermentação é reutilizada no processo de reformação a vapor. Isto pode ser realizado porque outros hidrocarbonetos de CH4 são capazes de reagir com vapor sobre um catalisador para produzir H2 e CO. Em uma modalidade particular, o etanol é reciclado para ser utilizado como uma matéria-prima para o processo de reformação a vapor. Em outra modalidade, a matéria-prima e/ou o produto de hidrocarboneto é passada através de um pré-reformador antes de ser utilizada no processo de reformação a vapor. Passando através de um pré-reformador parcialmente completa a etapa de reformação a vapor do processo de reformação a vapor, que pode aumentar a eficiência de produção de hidrogênio e reduzir a capacidade necessária da fornalha de reformação a vapor.[00128] The invention also provides that at least a portion of a hydrocarbon product produced by fermentation is reused in the steam reforming process. This can be accomplished because other CH4 hydrocarbons are capable of reacting with steam over a catalyst to produce H2 and CO. In a particular embodiment, ethanol is recycled to be used as a feedstock for the steam reforming process. In another embodiment, the hydrocarbon feedstock and/or product is passed through a pre-reformer before being used in the steam reforming process. Passing through a pre-reformer partially completes the steam reforming step of the steam reforming process, which can increase hydrogen production efficiency and reduce the required capacity of the steam reforming furnace.

[00129] Os métodos da invenção também podem ser aplicados para fermentações aeróbicas e para fermentações anaeróbicas ou aeróbicas de outros produtos, incluindo, entre outros, isopropanol.[00129] The methods of the invention can also be applied to aerobic fermentations and to anaerobic or aerobic fermentations of other products, including but not limited to isopropanol.

[00130] Mais particularmente, a invenção pode ser aplicável a fermentação para etanol e/ou acetato. Estes produtos podem então ser reagidos em conjunto para produzir os produtos químicos, incluindo ésteres. Em uma modalidade da invenção, o etanol e acetato produzidos por fermentação são reagidos em conjunto para produzir acetato de etila. O acetato de etila pode ser de valor para uma série de outros processos, como a produção de solventes incluindo revestimento de superfície, e diluentes, bem como na fabricação de produtos farmacêuticos e essências e aromas. Recuperação do produto[00130] More particularly, the invention may be applicable to fermentation to ethanol and/or acetate. These products can then be reacted together to produce chemicals including esters. In one embodiment of the invention, ethanol and acetate produced by fermentation are reacted together to produce ethyl acetate. Ethyl acetate can be of value for a number of other processes, such as the production of solvents including surface coating, and diluents, as well as in the manufacture of pharmaceuticals and essences and flavors. product recovery

[00131] Os produtos da reação de fermentação podem ser recuperados usando métodos conhecidos. Exemplos de métodos incluem aqueles descritos em WO07/117157, WO08/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 e US 5.821.111. No entanto, brevemente e a título de exemplo o etanol pode ser recuperado a partir do caldo de fermentação por métodos como a destilação fracionada ou a evaporação, e a fermentação extrativa.[00131] The fermentation reaction products can be recovered using known methods. Examples of methods include those described in WO07/117157, WO08/115080, US 6,340,581, US 6,136,577, US 5,593,886, US 5,807,722 and US 5,821,111. However, briefly and by way of example, ethanol can be recovered from the fermentation broth by methods such as fractional distillation or evaporation, and extractive fermentation.

[00132] A destilação do etanol a partir de um caldo de fermentação produz uma mistura azeotrópica de água e etanol (isto é, 95% de etanol e 5% de água). O etanol anidro pode subsequentemente ser obtido através do uso de tecnologia de desidratação de etanol por crivo molecular, que também é bem conhecido na técnica.[00132] The distillation of ethanol from a fermentation broth produces an azeotropic mixture of water and ethanol (ie, 95% ethanol and 5% water). Anhydrous ethanol can subsequently be obtained through the use of molecular sieve ethanol dehydration technology, which is also well known in the art.

[00133] Os procedimentos de fermentação extrativa envolvem o uso de um solvente miscível em água que apresenta um baixo risco de toxicidade para o organismo de fermentação, para recuperar o etanol a partir do caldo de fermentação diluído. Por exemplo, o álcool oleil é um solvente que pode ser usado neste tipo de processo de extração. Álcool oleil é continuamente introduzido em um fermentador, após o qual este solvente forma uma camada na parte superior do fermentador que é extraída continuamente e alimentada através de uma centrífuga. Água e, em seguida, as células são facilmente separadas a partir do álcool oleil e devolvido para o fermentador, enquanto o solvente carregado com etanol é introduzido em uma unidade de vaporização flash. A maior parte do etanol é vaporizada e condensada, enquanto o álcool oleil é não volátil e é recuperado para reutilização na fermentação.[00133] Extractive fermentation procedures involve the use of a water-miscible solvent that presents a low risk of toxicity to the fermentation organism, to recover ethanol from the diluted fermentation broth. For example, oleyl alcohol is a solvent that can be used in this type of extraction process. Oleyl alcohol is continuously introduced into a fermenter, after which this solvent forms a layer on top of the fermenter which is continuously drawn and fed through a centrifuge. Water and then cells are easily separated from the oleyl alcohol and returned to the fermenter while the ethanol laden solvent is introduced into a flash vaporization unit. Most ethanol is vaporized and condensed, while oleyl alcohol is non-volatile and is recovered for reuse in fermentation.

[00134] Acetato, que pode ser produzido como um subproduto na reação de fermentação, também pode ser recuperado a partir do caldo de fermentação, utilizando métodos conhecidos na técnica.[00134] Acetate, which can be produced as a by-product in the fermentation reaction, can also be recovered from the fermentation broth using methods known in the art.

[00135] Por exemplo, pode ser utilizado um sistema de adsorção que envolve um filtro de carvão ativado. Neste caso, prefere-se que as células microbianas sejam primeiro removidas do caldo de fermentação, utilizando uma unidade de separação adequada. Numerosos métodos de filtração à base de geração de um caldo de fermentação isento de células para a recuperação do produto são conhecidos na técnica. O etanol livre de célula - e acetato - contendo permeado é então passado através de uma coluna que contém carvão ativado para adsorver o acetato. Acetato na forma de ácido (ácido acético), em vez de forma de sal (acetato) é mais facilmente adsorvido pelo carvão ativado. Por conseguinte, é preferível que o pH do caldo de fermentação seja reduzido para menos do que cerca de 3 antes de ser passado através da coluna de carvão ativado, para converter a maior parte do acetato na forma de ácido acético.[00135] For example, an adsorption system involving an activated carbon filter can be used. In this case, it is preferred that the microbial cells are first removed from the fermentation broth using a suitable separation unit. Numerous filtration-based methods of generating a cell-free fermentation broth for product recovery are known in the art. The cell-free ethanol - and acetate - containing permeate is then passed through a column containing activated charcoal to adsorb the acetate. Acetate in acid form (acetic acid) rather than salt form (acetate) is more easily adsorbed by activated charcoal. Therefore, it is preferred that the pH of the fermentation broth be lowered to less than about 3 before passing it through the activated carbon column to convert most of the acetate to the acetic acid form.

[00136] O ácido acético adsorvido para o carvão ativado pode ser recuperado por eluição utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o etanol pode ser usado para eluir o acetato ligado. Em certas modalidades, o etanol produzido pelo processo de fermentação em si pode ser usado para eluir o acetato. Porque o ponto de ebulição de etanol é de 78,8°C e o do ácido acético é de 107°C, etanol e acetato podem ser facilmente separados uns dos outros utilizando um método à base de volatilidade tal como destilação.[00136] The adsorbed acetic acid to the activated carbon can be recovered by elution using methods known in the art. For example, ethanol can be used to elute bound acetate. In certain embodiments, ethanol produced by the fermentation process itself can be used to elute the acetate. Because the boiling point of ethanol is 78.8°C and that of acetic acid is 107°C, ethanol and acetate can be easily separated from each other using a volatility-based method such as distillation.

[00137] Outros métodos para a recuperação de acetato a partir de um caldo de fermentação também são conhecidos na técnica e podem ser utilizados. Por exemplo, a patentes US 6.368.819 e 6.753.170 descrevem um sistema cossolvente e solvente que pode ser utilizado para a extração de ácido acético a partir de caldos de fermentação. Tal como acontece com o exemplo do sistema à base de álcool oleil descrito para a fermentação extrativa de etanol, os sistemas descritos nas patentes US 6.368.819 6.753.170 descrevem um solvente/cossolvente imiscível em água que podem ser misturados com o caldo de fermentação em presença ou ausência de micro-organismos fermentados, a fim de extrair o produto de ácido acético. O solvente/cossolvente que contém o produto de ácido acético é então separado a partir do caldo por destilação. Uma segunda etapa de destilação, em seguida, pode ser usada para purificar o ácido acético a partir do sistema de solvente/cossolvente.[00137] Other methods for recovering acetate from a fermentation broth are also known in the art and can be used. For example, US patents 6,368,819 and 6,753,170 describe a co-solvent and solvent system that can be used for the extraction of acetic acid from fermentation broths. As with the example of the oleyl alcohol-based system described for the extractive fermentation of ethanol, the systems described in US patents 6,368,819 6,753,170 describe a water-immiscible solvent/cosolvent that can be mixed with the fermentation broth in the presence or absence of fermented microorganisms, in order to extract the acetic acid product. The solvent/cosolvent containing the acetic acid product is then distilled off from the broth. A second distillation step can then be used to purify the acetic acid from the solvent/cosolvent system.

[00138] Os produtos da reação de fermentação (por exemplo, etanol e acetato) podem ser recuperados a partir do caldo de fermentação por remoção contínua de uma porção do caldo de cultura a partir do biorreator de fermentação, que separa as células microbianas a partir do caldo (convenientemente por meio de filtração), e recuperando um ou mais produto a partir do caldo simultaneamente ou sequencialmente. No caso de etanol este pode ser convenientemente recuperado por destilação, e o acetato pode ser recuperado por adsorção sobre carvão ativado, utilizando os métodos descritos acima. As células microbianas são separadas de preferência devolvidas ao biorreator de fermentação. O permeado isento de células remanescentes após o etanol e acetato terem sido removidos é também, de preferência devolvido ao biorreator de fermentação. Nutrientes adicionais (como vitaminas B) podem ser adicionados ao permeado isento de células para repor o meio nutriente antes de ser devolvido ao biorreator. Além disso, se o pH do caldo foi ajustado tal como descrito acima, para aumentar a adsorção de ácido acético para o carvão ativado, o pH deve ser reajustado para um pH semelhante ao do caldo no biorreator de fermentação, antes de ser retornado para o biorreator.[00138] The fermentation reaction products (for example, ethanol and acetate) can be recovered from the fermentation broth by continuously removing a portion of the culture broth from the fermentation bioreactor, which separates the microbial cells from from the broth (conveniently by means of filtration), and recovering one or more products from the broth simultaneously or sequentially. In the case of ethanol this can conveniently be recovered by distillation, and the acetate can be recovered by adsorption on activated charcoal, using the methods described above. The microbial cells are separated preferably returned to the fermentation bioreactor. The cell-free permeate remaining after the ethanol and acetate have been removed is also preferably returned to the fermentation bioreactor. Additional nutrients (such as B vitamins) can be added to the cell-free permeate to replenish the nutrient medium before it is returned to the bioreactor. Furthermore, if the pH of the broth has been adjusted as described above to increase the adsorption of acetic acid to the activated carbon, the pH must be readjusted to a pH similar to that of the broth in the fermentation bioreactor before being returned to the bioreactor.

[00139] A biomassa recuperada a partir do biorreator pode ser submetida a digestão anaeróbia em uma digestão para produzir um produto de biomassa, de preferência metano. Este produto de biomassa pode ser usado como matéria-prima para o processo de reformação a vapor ou utilizado para produzir calor suplementar para conduzir uma ou mais das reações aqui definidas. EXEMPLOS A invenção será agora ainda explicada por meio dos exemplos seguintes.[00139] The biomass recovered from the bioreactor can be subjected to anaerobic digestion in a digest to produce a biomass product, preferably methane. This biomass product can be used as a feedstock for the steam reforming process or used to produce supplemental heat to drive one or more of the reactions defined herein. EXAMPLES The invention will now be explained further by means of the following examples.

Exemplo 1: Experimentos de MicroarranjoExample 1: Microarray Experiments FermentaçãoFermentation

[00140] As fermentações com C. autoethanogenum DSM23693 foram realizadas em biorreatores de 1,5 L a 37°C e contendo CO como única fonte de energia e carbono como descrito abaixo. Um meio líquido definido, contendo por litro: MgCl, CaCl2 (2 mM), KCl (25 mM), H3PO4 (5 mM), Fe (100μM), Ni, Zn (5μM), Mn, B, W, Mo, Se (2 μM) foi utilizado para crescimento da cultura. O meio foi transferido para o biorreator e foi suplementado com uma solução de vitamina B e reduzido com uma solução 0,2 mM de Cr (II). Para atingir anaerobicidade do vaso o reator foi lavado com nitrogênio. Antes da inoculação, o gás foi trocado para uma mistura gasosa contendo 30% de CO e 70% de N2, alimentado continuamente ao reator. O fluxo de gás foi inicialmente regulado para 100 ml/min e a agitação foi regulada para 300 rpm. Na2S foi doseado para dentro do biorreator em 0,3 ml/h. A agitação foi aumentada para intervalos de 900 rpm a 50 rpm durante a fase de crescimento da fermentação. Após 0,8 dia no modo de lote, o biorreator foi trocado para um modo contínuo a uma velocidade de líquido de 1,8 ml/min (taxa de diluição de 1,7 d-1). O fluxo de gás foi subsequentemente ajustado para alcançar 4 mol/L/d de absorção de CO. O fluxo de gás máximo foi de 435 ml/l por volume de fermentador. Depois de atingir a fase estável a experiência foi iniciada através da variação da concentração de CO2 a partir de 0% a 25%. A fim de evitar qualquer alteração na absorção de CO, o fluxo de CO e o fluxo de gás total foi mantido constante durante o ajuste de fluxos de CO2 e N2 em relação um ao outro. A composição do gás foi apenas trocada uma vez que 95% dos metabólitos do regime de alimentação anterior foram lavados e os metabólitos foram estabilizados novamente em um novo nível para pelo menos dois dias de modo a que os dados pudessem ser extraídos para a análise. As amostras de meio foram retiradas para medir a biomassa e os metabólitos e uma análise do espaço aéreo de gás entrando e saindo foi realizada em uma base regular.[00140] Fermentations with C. autoethanogenum DSM23693 were carried out in 1.5 L bioreactors at 37°C and containing CO as the only source of energy and carbon as described below. A defined liquid medium, containing per liter: MgCl, CaCl2 (2 mM), KCl (25 mM), H3PO4 (5 mM), Fe (100μM), Ni, Zn (5μM), Mn, B, W, Mo, Se (2 µM) was used for culture growth. The medium was transferred to the bioreactor and was supplemented with a vitamin B solution and reduced with a 0.2 mM Cr(II) solution. To achieve vessel anaerobicity, the reactor was flushed with nitrogen. Before inoculation, the gas was switched to a gaseous mixture containing 30% CO and 70% N2, fed continuously to the reactor. The gas flow was initially set at 100 ml/min and the agitation was set at 300 rpm. Na2S was dosed into the bioreactor at 0.3 ml/h. Agitation was increased to ranges from 900 rpm to 50 rpm during the growth phase of the fermentation. After 0.8 day in batch mode, the bioreactor was switched to a continuous mode at a liquid velocity of 1.8 ml/min (dilution rate 1.7 d-1). The gas flow was subsequently adjusted to achieve 4 mol/L/d of CO uptake. The maximum gas flow was 435 ml/l per fermenter volume. After reaching the stable phase the experiment was initiated by varying the CO2 concentration from 0% to 25%. In order to avoid any change in CO uptake, the CO flow and total gas flow were kept constant while adjusting CO2 and N2 flows relative to each other. The gas composition was only changed once 95% of the metabolites from the previous feeding regimen had been washed out and the metabolites were stabilized again at a new level for at least two days so that data could be extracted for analysis. Media samples were taken to measure biomass and metabolites, and an airspace analysis of incoming and outgoing gas was performed on a regular basis.

Procedimento de amostragemsampling procedure

[00141] As amostras foram coletadas a partir do biorreator utilizando tubos pré-refrigerados; a quantidade de amostra coletada foi equivalente a OD 2, medida a 600 nm. Três amostras foram coletadas a partir do biorreator para a análise de Microarranjo para comparar a composição do gás e efeito de tempo durante o perfil de expressão gênica em relação a diferentes proporções de EtOH:BDO. A primeira amostra foi coletada a partir de uma mistura gasosa de 30% de CO e N2 a 70% e uma proporção EtOH: BDO de 23: 1 presente no reator. A segunda amostra foi coletada a partir de uma mistura gasosa de 30% de CO, 40% de N2 e 30% de CO2 com proporção EtOH:BDO de 13: 1, esta amostra foi coletada 7 horas após a composição do gás ser modificada. A terceira amostra foi coletada a partir da mesma mistura de gás como a segunda amostra, mas com uma proporção EtOH: BDO de 4: 1, esta amostra foi coletada 3 dias depois da adição de CO2 para a composição do gás. Após a colheita, as amostras foram centrifugadas a 4000 RPM, durante 10 min, a 4°C e o sobrenadante foi removido, subsequentemente, o pellet foi congelado rapidamente em N2 líquido e armazenado a -80°C até sua utilização.[00141] Samples were collected from the bioreactor using pre-cooled tubes; the amount of sample collected was equivalent to OD 2, measured at 600 nm. Three samples were collected from the bioreactor for Microarray analysis to compare gas composition and time effect during gene expression profiling in relation to different EtOH:BDO ratios. The first sample was collected from a gaseous mixture of 30% CO and 70% N2 and an EtOH:BDO ratio of 23:1 present in the reactor. The second sample was collected from a gaseous mixture of 30% CO, 40% N2 and 30% CO2 with EtOH:BDO ratio of 13: 1, this sample was collected 7 hours after the gas composition was changed. The third sample was collected from the same gas mixture as the second sample but with an EtOH:BDO ratio of 4:1, this sample was collected 3 days after adding CO2 to the gas composition. After collection, the samples were centrifuged at 4000 RPM, for 10 min, at 4°C and the supernatant was removed, subsequently, the pellet was quickly frozen in liquid N2 and stored at -80°C until use.

Extração de RNARNA extraction

[00142] Após a recuperação de amostras de -80°C, as amostras foram extraídas utilizando Kit RiboPure™-Bacteria (Ambion, Número de Peça AM 1925).[00142] After sample recovery from -80°C, samples were extracted using RiboPure™-Bacteria Kit (Ambion, Part Number AM 1925).

Análise de MicroarranjoMicroarray Analysis

[00143] A análise de microarranjo foi realizada por Roche utilizando técnicas convencionais.[00143] The microarray analysis was performed by Roche using conventional techniques.

Exemplo 2: Os efeitos da pressão sobre a fermentaçãoExample 2: The effects of pressure on fermentation

[00144] A Figura 2, Figura 3 e Figura 4 mostram os resultados das corridas de fermentações a baixa e alta pressão, para demonstrar os efeitos de ambas a quantidade de CO2 presente dissolvido no caldo de fermentação, e a concentração dos metabólitos produzidos pela fermentação. Em cada um destes experimentos em um biorreator contendo um meio nutriente líquido foi inoculada com uma cultura de Clostridium autoethanogenum. Um substrato gasoso compreendendo CO e CO2 foi fornecido para o biorreator.[00144] Figure 2, Figure 3 and Figure 4 show the results of fermentation runs at low and high pressure, to demonstrate the effects of both the amount of CO2 present dissolved in the fermentation broth, and the concentration of metabolites produced by fermentation . In each of these experiments a bioreactor containing a liquid nutrient medium was inoculated with a culture of Clostridium autoethanogenum. A gaseous substrate comprising CO and CO2 was supplied to the bioreactor.

[00145] A Figura 2 mostra os resultados de uma primeira experiência, em que a fermentação foi realizada a pressões diferentes, para determinar o efeito da pressão sobre a quantidade de CO2 e dissolvido na concentração de 2,3-butanodiol (2,3-BDO) produzida no reator.[00145] Figure 2 shows the results of a first experiment, in which fermentation was carried out at different pressures, to determine the effect of pressure on the amount of CO2 and dissolved in the concentration of 2,3-butanediol (2,3- BDO) produced in the reactor.

[00146] A Figura 2 mostra que a alta pressão a partir de 0-6 dias (320 kPag no espaço aéreo do reator, e cerca de 420 kPag na parte inferior do reator), ambos a quantidade de CO2 dissolvido no caldo de fermentação, e a concentração de 2,3-BDO produzida aumentaram. Quando a fermentação foi operada a baixa pressão a partir de 6-22 dias (50 kPag no espaço aéreo, e cerca de 150 kPag na parte inferior), ambas a quantidade de CO2 dissolvido no caldo de fermentação e a concentração de 2,3-BDO diminuíram.[00146] Figure 2 shows that at high pressure from 0-6 days (320 kPag in the reactor airspace, and about 420 kPag in the bottom of the reactor), both the amount of CO2 dissolved in the fermentation broth, and the concentration of 2,3-BDO produced increased. When the fermentation was operated at low pressure from 6-22 days (50 kPag in the airspace, and about 150 kPag in the bottom), both the amount of CO2 dissolved in the fermentation broth and the concentration of 2,3- BDO decreased.

[00147] A figura 3 demonstra claramente a correlação entre a quantidade de CO2 dissolvido no caldo de fermentação e a concentração de 2,3-butanodiol.[00147] Figure 3 clearly demonstrates the correlation between the amount of CO2 dissolved in the fermentation broth and the concentration of 2,3-butanediol.

[00148] A figura 4 demonstra o efeito da conversão de CO para CO2 na fermentação. Quando a fermentação foi operada de tal modo que a quantidade de CO consumido pelas bactérias foi aumentada, CO2 foi produzido como um subproduto da fermentação. A conversão de CO para CO2 por CODH (dióxido de carbono desidrogenase) criou ferredoxina reduzida. Altos níveis de ferredoxina reduzida são necessários para converter acetil CoA em piruvato, o que resultou em um aumento da produção de 2,3-butanodiol, e um aumento na produção de outros produtos derivados do piruvato.[00148] Figure 4 demonstrates the effect of converting CO to CO2 on fermentation. When the fermentation was operated in such a way that the amount of CO consumed by the bacteria was increased, CO2 was produced as a by-product of the fermentation. The conversion of CO to CO2 by CODH (carbon dioxide dehydrogenase) created reduced ferredoxin. High levels of reduced ferredoxin are required to convert acetyl CoA to pyruvate, which results in an increased production of 2,3-butanediol, and an increase in the production of other pyruvate-derived products.

Exemplo 3: Concentrações crescentes de CO2 dissolvido.Example 3: Increasing concentrations of dissolved CO2.

[00149] Um conjunto de experimentos foi realizado, que demonstrou que o nível de CO2 dissolvido na fermentação resultou em um aumento da produção de 2,3-butanodiol. 3A: Mudanças na concentração de CO2 de entrada como uma[00149] A set of experiments was carried out which demonstrated that the level of CO2 dissolved in the fermentation resulted in an increased production of 2,3-butanediol. 3A: Changes in inlet CO2 concentration as a

forma de aumentar a produção de 2,3 BDOway to increase the production of 2.3 BDO

[00150] Durante esta experiência, a concentração do CO2 do gás de entrada para o caldo de fermentação foi alterada de 0% a 25% em uma etapa, após 28 dias de operação. A absorção de CO foi mantida constante durante todo o experimento e a concentração de CO foi mantida a 30% no gás de entrada. Como mostrado na Figura 5 um grande aumento na produção de 2, 3 butanodiol foi observada quando o CO2 foi alterado de 0% a 25%.[00150] During this experiment, the CO2 concentration of the inlet gas for the fermentation broth was changed from 0% to 25% in one step, after 28 days of operation. The CO uptake was kept constant throughout the experiment and the CO concentration was maintained at 30% in the inlet gas. As shown in Figure 5 a large increase in 2, 3 butanediol production was observed when CO2 was changed from 0% to 25%.

[00151] A Figura 6 representa as mudanças na concentração de CO2 no caldo de fermentação entre os dias 25-31. No dia 25 a quantidade de CO2 no fluxo de entrada fornecido para a fermentação foi de 0%. No dia 28, a concentração de CO2 do fluxo de entrada foi aumentada para 25%. A Figura 6 mostra claramente que a absorção de CO permaneceu a mesma depois do aumento de CO2, o que indica que o aumento da produção de BDO detalhado abaixo não pode ser explicado por mais carbono que entra no sistema. Além disso, a produção de CO2 permaneceu a mesma após o aumento. A Figura 5 demonstra claramente as alterações correspondentes na produção de metabólitos da fermentação. Quando CO2 foi adicionado ao caldo de fermentação a concentração de 2,3-BDO aumentou de uma concentração de cerca de 0,6 g/L no dia 28 para 2,0 g/L no dia 31. A concentração de etanol diminuiu, e a proporção etanol de 2,3-BDO diminuiu de cerca de 20:1 no dia 20 a cerca de 5:1 no dia 31. 3B: concentração de entrada CO2 alta na partida[00151] Figure 6 represents the changes in CO2 concentration in the fermentation broth between days 25-31. On day 25 the amount of CO2 in the inflow supplied to the fermentation was 0%. On day 28, the inflow CO2 concentration was increased to 25%. Figure 6 clearly shows that the CO uptake remained the same after the CO2 increase, which indicates that the increase in BDO production detailed below cannot be explained by more carbon entering the system. Furthermore, the CO2 production remained the same after the increase. Figure 5 clearly demonstrates the corresponding changes in fermentation metabolite production. When CO2 was added to the fermentation broth the 2,3-BDO concentration increased from a concentration of about 0.6 g/L on day 28 to 2.0 g/L on day 31. The ethanol concentration decreased, and the ethanol ratio of 2,3-BDO decreased from about 20:1 on day 20 to about 5:1 on day 31. 3B: high CO2 input concentration at start-up

[00152] Esta experiência foi concebida para mostrar o impacto da alta concentração de CO2 para a produção de 2,3-BDO quando o CO2 estava presente no início da fermentação. Como mostrado na Figura 7, uma vez que as condições de funcionamento estáveis foram alcançadas houve uma produção significativa de 2,3-BDO com a proporção de etanol: 2,3-BDO a 2: 1. A concentração média de CO2 de entrada era de 42% e a concentração média de CO2 de saída foi de 67,4%. Durante todo o experimento 50% de CO foi usado o fluxo de gás e a absorção de CO foram ajustadas para maximizar a produção de etanol e 2,3-BDO. A concentração de CO, CO2 e H2 no fluxo de gás de saída ao longo de vários dias é mostrada na Figura 8.[00152] This experiment was designed to show the impact of high CO2 concentration on 2,3-BDO production when CO2 was present at the start of fermentation. As shown in Figure 7, once stable operating conditions were achieved there was significant production of 2,3-BDO with the ratio ethanol:2,3-BDO at 2:1. of 42% and the average concentration of outgoing CO2 was 67.4%. Throughout the experiment 50% CO was used and the gas flow and CO uptake were adjusted to maximize ethanol and 2,3-BDO production. The concentration of CO, CO2 and H2 in the outgoing gas stream over several days is shown in Figure 8.

3C: Aumento gradual na concentração de entrada de CO23C: Gradual increase in CO2 input concentration

[00153] Durante o período desta experiência a concentração de CO2 no fluxo de gás de entrada para o caldo de fermentação foi gradualmente aumentado para determinar o efeito de CO2 no perfil de produção de metabólitos da fermentação. A Figura 10 mostra o efeito do aumento de CO2 no fluxo de entrada sobre as concentrações de metabólito. A concentração de CO2 foi aumentada de 0% para 10% no dia 6; de 10% para 15% no dia 9, e de 15% para 20% no dia 13. A cada aumento da concentração de CO2 no fluxo de entrada um aumento correspondente na concentração de 2,3-BDO foi observado. A Figura 9 mostra a absorção de CO, CO2 e H2 da cultura microbiana ao longo da duração da experiência.[00153] During the period of this experiment the CO2 concentration in the inlet gas stream to the fermentation broth was gradually increased to determine the effect of CO2 on the metabolite production profile of the fermentation. Figure 10 shows the effect of increasing CO2 in the inflow on metabolite concentrations. The CO2 concentration was increased from 0% to 10% on day 6; from 10% to 15% on day 9, and from 15% to 20% on day 13. With each increase in CO2 concentration in the inflow a corresponding increase in 2,3-BDO concentration was observed. Figure 9 shows the CO, CO2 and H2 uptake of the microbial culture over the duration of the experiment.

3D: Ciclagem de CO23D: CO2 cycling

[00154] Esta experiência foi realizada para determinar o efeito dos ciclos de concentração de entrada de CO2. A fermentação foi configurada de modo que a quantidade de CO2 no fluxo de entrada foi repetido entre 0% e 20% a cada hora. A Figura 11 mostra a produção de metabólitos ao longo do curso do experimento. O ciclismo de concentrações de entrada CO2 teve o efeito de manter a produção de 2,3-BDO em um ligeiro aumento de concentração. A Figura 12 mostra a absorção de vários componentes do gás de admissão pela cultura microbiana ao longo da duração da experiência.[00154] This experiment was performed to determine the effect of CO2 input concentration cycles. Fermentation was set up so that the amount of CO2 in the inflow was repeated between 0% and 20% every hour. Figure 11 shows metabolite production over the course of the experiment. Cycling of CO2 input concentrations had the effect of maintaining 2,3-BDO production at a slight concentration increase. Figure 12 shows the uptake of various components of the inlet gas by the microbial culture over the duration of the experiment.

3E: Aumento da concentração de CO2 para o segundo reator de um sistema de dois reatores.3E: Increased CO2 concentration for the second reactor of a two-reactor system.

[00155] Esta experiência foi concebida para demonstrar o efeito de passagem do fluxo de gás de saída a partir de um primeiro biorreator para o fluxo de entrada de um segundo biorreator, aumentando assim a concentração CO2. A Figura 13 apresenta gráficos da concentração de metabólitos no segundo biorreator do sistema de dois reatores entre os dias 14 e 20 do processo de fermentação. No dia 14 a quantidade de CO2 fornecida para o segundo biorreator a partir do primeiro biorreator foi aumentada de tal modo que a quantidade total de CO2 no segundo biorreator foi de 17,8% para 43,8%. Entre os dias 14 e 21, a concentração de 2,3-BDO no reator aumentou de cerca de 8 g/L a cerca de 14g/L. A proporção de etanol para 2,3-BDO diminuiu de 4: 1 no dia 14 para 2:1 em torno do dia 20 e mantiveram-se relativamente constante para o período remanescente da experiência. A Figura 14 mostra a absorção de CO, CO2 e H2 para a cultura microbiana no decurso da fermentação.[00155] This experiment was designed to demonstrate the effect of passing the output gas stream from a first bioreactor to the inlet stream of a second bioreactor, thereby increasing the CO2 concentration. Figure 13 presents plots of metabolite concentration in the second bioreactor of the two-reactor system between days 14 and 20 of the fermentation process. On day 14 the amount of CO2 supplied to the second bioreactor from the first bioreactor was increased such that the total amount of CO2 in the second bioreactor went from 17.8% to 43.8%. Between days 14 and 21, the concentration of 2,3-BDO in the reactor increased from about 8 g/L to about 14 g/L. The ratio of ethanol to 2,3-BDO decreased from 4:1 on day 14 to 2:1 around day 20 and remained relatively constant for the remainder of the experiment. Figure 14 shows the uptake of CO, CO2 and H2 into the microbial culture during the course of fermentation.

Exemplo 4: O aumento da produção de 2,3-BDO controlando a utilização CO. Demonstrando efeito do fluxo de gás e agitação na produção de metabólitos.Example 4: Increasing 2,3-BDO production by controlling CO utilization. Demonstrating effect of gas flow and agitation on metabolite production.

[00156] Esta experiência foi concebida para demonstrar o efeito das alterações na transferência de massa na produção de metabólitos de uma cultura microbiana. Ao longo do curso do experimento, as taxas de fluxo de gás de agitação foram variadas resultando em alterações no gás que sai do reator, e o perfil dos metabólitos da fermentação.[00156] This experiment was designed to demonstrate the effect of changes in mass transfer on the metabolite production of a microbial culture. Over the course of the experiment, the agitation gas flow rates were varied resulting in changes in the gas exiting the reactor, and the profile of fermentation metabolites.

[00157] Referindo-nos à Figura 15, um aumento na concentração de 2,3-BDO pode ser visto a partir do dia 6 ao dia 8, o que corresponde a um aumento da velocidade de agitação dentro do biorreator e uma diminuição do fluxo de gás para o reator. Como mostrado na Figura 18, no dia 5,6 absorção de CO foi mantida constante, mas a utilização de CO melhorou, por conseguinte, CO2 no gás de saída aumentou. Isto foi feito através do aumento da velocidade de agitação (rpm), e diminuindo o fluxo de gás, de modo que o CO no gás de saída diminuiu de 26% para 12,5%. A absorção de CO permaneceu a mesma uma vez que o fluxo de gás foi reduzido de 240 mL/min/L a 160 mL/min/L. CO2 no fluxo de saída aumentou de 37% para 48%. A utilização de CO aumentou de 53% para 79%. Como resultado deste aumento da CO2 dissolvido aumentou sem qualquer aumento na absorção de CO. O aumento da utilização de CO positivamente correlacionou com um aumento na produção de 2,3-BDO, quanto maior utilização CO corresponde com mais CO2 dissolvido. Efeito de CO2 dissolvido no caldo de fermentação na taxa de produtividade de 2, 3-butanodiol.[00157] Referring to Figure 15, an increase in the concentration of 2,3-BDO can be seen from day 6 to day 8, which corresponds to an increase in stirring speed within the bioreactor and a decrease in flow of gas to the reactor. As shown in Figure 18, at day 5.6 CO uptake was held constant, but CO utilization improved, therefore CO2 in the outlet gas increased. This was done by increasing the agitation speed (rpm), and decreasing the gas flow, so that the CO in the outlet gas decreased from 26% to 12.5%. CO uptake remained the same once the gas flow was reduced from 240 mL/min/L to 160 mL/min/L. CO2 in the outflow increased from 37% to 48%. CO utilization increased from 53% to 79%. As a result of this increase dissolved CO2 increased without any increase in CO uptake. Increased CO utilization positively correlated with an increase in 2,3-BDO production, as greater CO utilization corresponds with more dissolved CO2. Effect of CO2 dissolved in the fermentation broth on the productivity rate of 2, 3-butanediol.

[00158] Os dados combinados a partir de um número de corridas com diferentes concentrações de CO2 de saída em diferente pressão no espaço aéreo foram representados graficamente para mostrar a relação de CO2 dissolvido no caldo de fermentação para a produção de 2,3-butanodiol. A Figura 16 é um gráfico de CO2 dissolvido contra taxa de produção de 2,3- BDO. O gráfico mostra que um aumento na quantidade de CO2 dissolvido no caldo de fermentação corresponde a um aumento na taxa de produtividade de 2,3-butanodiol.[00158] The combined data from a number of runs with different output CO2 concentrations at different airspace pressure were plotted to show the ratio of CO2 dissolved in the fermentation broth to the production of 2,3-butanediol. Figure 16 is a plot of dissolved CO2 versus 2,3-BDO production rate. The graph shows that an increase in the amount of CO2 dissolved in the fermentation broth corresponds to an increase in the productivity rate of 2,3-butanediol.

[00159] A tabela apresenta os resultados de uma série de experimentos que mais uma vez mostra a correlação entre o CO2 dissolvido e concentração e produtividade de 2,3-BDO e. A Tabela

[00159] The table presents the results of a series of experiments that once again shows the correlation between dissolved CO2 and concentration and productivity of 2,3-BDO e. The Table

[00160] A invenção foi aqui descrita com referência a certas modalidades preferidas, a fim de permitir que o leitor pratique a invenção sem experimentação indevida. Os especialistas na técnica apreciarão que a invenção é susceptível a invenção inclui todas essas variações e modificações. Além disso, títulos, cabeçalhos ou análogos são fornecidos para melhorar a compreensão do leitor do presente documento, e não devem ser lidos como limitantes do escopo da presente invenção.[00160] The invention has been described herein with reference to certain preferred embodiments, in order to enable the reader to practice the invention without undue experimentation. Those skilled in the art will appreciate that the invention is likely to include all such variations and modifications. Furthermore, titles, headings or the like are provided to enhance the reader's understanding of the present document, and should not be read as limiting the scope of the present invention.

[00161] As descrições completas de todos os pedidos, patentes e publicações, acima e abaixo citados, se houver, são aqui incorporadas por referência.[00161] The complete descriptions of all applications, patents and publications, cited above and below, if any, are incorporated herein by reference.

[00162] A referência a qualquer técnica anterior nesta especificação não é, e não deve ser tomada como um aviso ou qualquer forma de sugestão de que a técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum nos Estados Unidos da América ou de qualquer país do mundo.[00162] Reference to any prior art in this specification is not, and should not be taken as a warning or any form of suggestion that the prior art forms part of common general knowledge in the United States of America or any country in the world.

[00163] Ao longo deste relatório descritivo e de todas as reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreende”, “compreendendo” e semelhantes devem ser entendidas em um sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo, ou seja, no sentido de “incluindo, entre outros.”[00163] Throughout this specification and all claims that follow, unless the context otherwise requires, the words "comprises", "comprising" and the like are to be understood in an inclusive sense as opposed to a exclusive, i.e., in the sense of “including but not limited to.”

Claims (10)

1. Método para controlar o perfil metabólico de uma cultura de fermentação que compreende pelo menos um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a. fluir um substrato gasoso compreendendo CO e de CO2 para um biorreator que compreende uma cultura do micro-organismo em um meio nutriente líquido para produzir pelo menos um produto derivado de acetil CoA e pelo menos um produto derivado de piruvato; b. ajustar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido de tal modo que a produção de pelo menos um produto derivado de piruvato seja controlada; em que a quantidade de CO2 dissolvido no meio é aumentada de tal forma que a produção de pelo menos um produto derivado do piruvato seja aumentada; e em que a quantidade de CO2 dissolvido no meio é diminuída de tal modo que a produção de pelo menos um produto derivado do piruvato seja diminuída.1. Method for controlling the metabolic profile of a fermentation culture comprising at least one carboxydotrophic acetogenic microorganism, the method characterized in that it comprises: a. flowing a gaseous substrate comprising CO and CO 2 into a bioreactor comprising culturing the microorganism in a liquid nutrient medium to produce at least one acetyl CoA derivative product and at least one pyruvate derivative product; B. adjusting the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium such that the production of at least one pyruvate-derived product is controlled; wherein the amount of CO2 dissolved in the medium is increased such that the production of at least one product derived from pyruvate is increased; and wherein the amount of CO2 dissolved in the medium is decreased such that the production of at least one pyruvate-derived product is decreased. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de CO2 dissolvido no meio é ajustada controlando o fluxo de CO2 para o biorreator.2. Method according to claim 1, characterized in that the amount of CO2 dissolved in the medium is adjusted by controlling the flow of CO2 to the bioreactor. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pressão parcial de CO2 é ajustada a fim de ajustar a quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido.3. Method according to claim 1, characterized in that the CO2 partial pressure is adjusted in order to adjust the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação é realizada a uma pressão superior a 250 kPag de tal modo que a concentração de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido seja aumentada.4. Method according to claim 1, characterized in that the fermentation is carried out at a pressure greater than 250 kPag in such a way that the concentration of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is increased. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação é realizada a uma pressão inferior a 200 kPag de tal modo que a concentração de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido seja reduzida.5. Method according to claim 1, characterized in that the fermentation is carried out at a pressure of less than 200 kPag in such a way that the concentration of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium is reduced. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de CO2 no substrato gasoso fornecido ao biorreator é de 15% a 65%.6. Method according to claim 1, characterized by the fact that the concentration of CO2 in the gaseous substrate supplied to the bioreactor is from 15% to 65%. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de CO2 no substrato gasoso fornecido ao biorreator é aumentada gradualmente ao longo do tempo.7. Method according to claim 1, characterized by the fact that the concentration of CO2 in the gaseous substrate supplied to the bioreactor is gradually increased over time. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um produto derivado do piruvato é selecionado a partir do grupo que consiste em 2,3-butanodiol, lactato, succinato, metil etil cetona (MEK), 2-butanol, propanodiol, 2-propanol, isopropanol, acetoína, isobutanol, citramalato, butadieno e ácido poli láctico (PLA).8. Method according to claim 1, characterized in that the at least one product derived from pyruvate is selected from the group consisting of 2,3-butanediol, lactate, succinate, methyl ethyl ketone (MEK), 2 -butanol, propanediol, 2-propanol, isopropanol, acetoin, isobutanol, citramalate, butadiene and polylactic acid (PLA). 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda monitorar a concentração de CO2 em um fluxo de saída que sai do biorreator, a fim de monitorar a quantidade de CO2 utilizado pela cultura dentro do biorreator.9. Method according to claim 1, characterized in that it further comprises monitoring the concentration of CO2 in an output stream leaving the bioreactor, in order to monitor the amount of CO2 used by the culture within the bioreactor. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ajuste da quantidade de CO2 dissolvido no meio nutriente líquido controla a relação de produtos derivados do piruvato em derivados de acetil CoA.10. Method according to claim 1, characterized by the fact that adjusting the amount of CO2 dissolved in the liquid nutrient medium controls the ratio of products derived from pyruvate to derivatives of acetyl CoA.

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