BR112015021838B1 - Amatoxina e seu uso, método de síntese e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

amatoxina, método de síntese, composição farmacêutica. a invenção diz respeito ao tratamento de tumores. em um aspecto, a presente invenção refere-se a conjugados de uma amatoxina e uma parte de ligação ao alvo, por exemplo, um anticorpo, conectado por certas ligações, que são úteis no tratamento do câncer e outras desordens e doenças. em um outro aspecto, a invenção trata de composições farmacêuticas compreendendo tais conjugados.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A invenção diz respeito ao tratamento de tumores. Em um aspecto, a presente invenção trata de conjugados de uma amatoxina e parte de ligação ao alvo, por exemplo, um anticorpo, conectados por certas ligações, os quais são úteis no tratamento do câncer e outras desordens e doenças. Em ainda outro aspecto, a invenção trata de compostos farmacêuticos compreendendo tais conjugados.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Amatoxinas são peptídeos cíclicos compostos por 8aminoácidos. Elas podem, por exemplo, ser isoladas a partir de cogumelos Amanita phalloides ou preparados sinteticamente. como Amatoxinasinibem especificamente a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos, e deste modo também a transcrição e biosíntese de proteínas das células afetadas. A inibição da transcrição em uma célula causa a parada do crescimento e da proliferação. Apesar de não ser ligado de forma covalente, o complexo entre a amanitina e a RNA polimerase II é muito firme (KD = 3nM). A dissociação deamanitina da enzima é um processo muito lento, tornando assim improvável a recuperação de uma célula afetada. Quando a inibição da transcrição demorar muito, a célula sofrerá a morte programada da célula (apoptose).
[0003] O uso de Amatoxinas como partes (moieties) citotóxicas para o tratamento de tumores já havia sido explorada em 1981 pelo pareamento de um anticorpo anti-Timina 1.2 a uma α-amanitina itilizadno um ligador conectado ao anel indol de Trp (aminoácido 4; ver Figura 1) através de diazotação (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388).Davis & Preston identificaram o local de conexão como posição 7’. Morris & Venton demonstraram o quão bem a substituição na posição 7’ resulta em uma derivativa, a qual mantém a atividade citotóxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Proteína Res 1983, 21 419-430).
[0004] O pedido de patente EP 1 859 811 A1 (publicado em 28 de Novembro de 2007) descreveu conjugados, nos quais o y C-átomo de aminoácido de amatoxina 1 de β-amanitina foi diretamente pareado, i.e. sem uma estrutura de ligação, à albuminaa ou ao anticorpo monoclonais HEA125, OKT3, ou PA-1. Além disto, notou- se o efeito inibitório destes conjugados na proliferação de células de câncer de mama (MCF-7), de células de linfoma de Burkitt (Raji), e de células de T-linfoma (Jurkat). O uso de ligadores foi sugerido, incluindo ligadores compreendendo elementos tais como amida, éster, éter, tioéter, disulfureto, ureia, tioureia, partes de hidrocarboneto e afins, mas nenhuma construção do tipo foi realmente exibida, e mais nenhum detalhe, como os locais de conexão nas Amatoxinas, foram fornecidos.
[0005] Os pedidos de patente WO 2010/115629 e WO 2010/115630(ambos publicados em 14 de Outubro de 2010) descrevem conjugados, nos quais anticorpos, tais como anticorpos anti- EpCAM, tais como huHEA125 humanizado, são pareados a Amatoxinas através de (i) o y C-átomo de aminoácido de amatoxina 1, (ii) o 6’ C-átomo de aminoácido de amatoxina 4, ou (iii) através do δ C-átomo de aminoácido de amatoxina 3, em cada caso diretamente através de um ligador entre o anticorpo e as Amatoxinas. Os ligadores sugeridos compreendem elementos tais como um éster, um éter, um uretano, uma ligação peptídica e afins. Além disso, foram notados os efeitos inibitórios destes conjugados na proliferação de células de câncer de mama (linha celular MCF-7), carcinoma pancreático (linha celular Capan-1), câncer de cólon (linha celular Colo205), e colangiocarcinoma (linha celular OZ).
[0006] A relação da atividade de estruturas de Amatoxinas érevisada por Wieland (T. Wieland, Peptídeos de Poisonous Amanita Cogumelos, Springer series em molecular biology, Springer Verlag New York, 1986). O grupo hidroxilo de aminoácido 2 (prolina hidroxi) e o D-grupo hidroxi de aminoácido 3 (di-hidroxi- isoleucina) são tidos comoessenciais para a atividade, enquanto que as funcionalidades no aminoácido 1 (aspartato ou asparagina), no aminoácido 4 (6- hidroxi - triptofano) e no grupo D-hidroxi no aminoácido 3 são mais tolerantes para modificações químicas. Isto indicas que essas últimas posições são os locais preferenciais para a conexão do ligador, enquanto que modificações dos primeiros devem ser evitadas.
[0007] Sabe-se que Amatoxinas são relativamente não-tóxicas quando pareadas a grandes transportadores de biomoléculas, tais como moléculas de anticorpos, e que elas exercem suas atividades citotóxicas somente após o transportador de biomolécula ser clivado. À luz da toxicidade de Amatoxinas, particularmente para células do fígado, é da maior importância que os conjugados de amatoxina para o tratamento de tumores selecionados permaneçam altamente estáveis após a administração em plasma, e que a liberação da amatoxina ocorra após a internalização nas células-alvo. Nesse contexto, pequenas melhorias da estabilidade do conjugado podem ter consequências drásticas para a janela terapêutica e para a segurança dos conjugados de amatoxina para abordagens terapêuticas.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO
[0008] Um dos propósitos da presente invenção é fornecer mais conjugados de amatoxina de partes de ligação ao alvo que sejam estáveis em plasma, de modo que os efeitos colaterais prejudiciais nas células não-alvo sejam minimizados.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0009] A presente invenção baseia-se na inesperadaobservação de que a formação de um anel pelos dois átomos deoxigênio ligados aos átomos γ e δ C de aminoácido de amatoxina3 podem melhorar a tolerabilidade de conjugados de amatoxina departes de ligação ao alvo sem interferir na interação de taisAmatoxinas com seus alvos, o RNA dependente de DNA polimeraseII de células de mamíferos. Até a presente data, a presença dogrupo hidroxilo ligado ao átomo γ C de aminoácido de amatoxina3 foi considerada essencial para a eficácia de Amatoxinas econjugados de amatoxina. Wieland (T. Wieland, Peptídeos dePoisonous Amanita Cogumelos, Springer Series em MolecularBiology, Springer Verlag New York, 1986; Wieland T, Rempel D,Gebert U, Buku A, Boehringer H. Über die Inhaltsstoffe desgrünen Knollenblätterpilzes. XXXII. ChromatographischeAuftrennung der Gesamtgifte und Isolierung der neuenNebentoxine Amanina und Phallisin sowie des ungiftigenAmanulinas. Liebigs Ann Chem. 1967;704:226–236) relata aocorrência natural de Amatoxinas como amanulina que não possunogrupo γ-hidroxilo de toxicidade consideravelmente reduzida.
[0010] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-sea uma amatoxina de Fórmula I
Figure img0001
onde:R1 é selecionado a partir de C=O, C=S, C=NR6 e CR7R8;R2 é selecionado a partir de S=O, SO2 e S;R3 é selecionado a partir de NHR5 e OR5;R4 é selecionado a partir de H, OR5, e OC1-6-alquil; R6 é selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno- R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;onde:(i) cada R5 é H;(ii) um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n éselecionado a partir de 0 e 1, e X é uma fração químicaque pode ser pareada com uma parte de direcionamento, e onde os R5 restantes são H; ou(iii) um dos R5 é -Ln-X*-Y, onde L é um agente de ligação, n é selecionado a partir de 0 e 1, Y é uma parte de direcionamento, e X* é uma fração química resultante do pareamento de X com um grupo funcional de Y, e onde os R5 restantes são H.
[0011] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma amatoxina da presente invenção para uso como um medicamento.
[0012] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma amatoxina da presente invenção para uso no tratamento do câncer em um paciente, particularmente onde o câncer por selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, cânceres gastrointestinais, e.g. câncer colorretal, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular, osteosarcoma, câncer de pulmão, câncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, câncer de ovário, carcinoma do testículo, carcinoma da bexiga, câncer de estômago, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma do colo, câncer do rim, gliomas, câncer de pele, e.g. melanoma maligno, câncer de tireoide, leucemia, e linfoma maligno.
[0013] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo a amatoxina de acordo com a presente invenção e compreendendo ainda um ou mais diluentes farmaceuticamente aceitos, transportadores, excipientes, enchimentos (fillers), aglutinantes, lubrificantes, deslizantes (glidants), desintegrantes, adsorventes; e/ou conservantess.
[0014] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para sintetizar a amatoxina da presente invenção, compreendendo a etapa de reagir uma amatoxina de Fórmula II
Figure img0002
onde: R2 é selecionado a partir de S=O, SO2, e S;R3 é selecionado a partir de NHR5 e OR5;R4 é selecionado a partir de H, OR5, e OC1-6-alquil;R6 é selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno- R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;onde um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n é selecionado a partir de 0 e 1, e X é uma fração química que pode ser pareada com a parte de direcionamento, e onde os R5 restantes são H;com (i) carbonato N,N’-disuccinimidilo (DSC), (ii) um reagente de tiocarbonilação, particularmente tiofosgênio, 1,1’-tiocarbonildiimidazole ou 1,1’-tiocarbonildi-2(1 H)- piridona; (iii) um reagente de iminocarbonilação, particularmente um dicloreto de isocianato ou fenilisotiocianato; ou (iv) um aldeído, cetona ou acetal acíclico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0015] A Fig. 1 mostra a fórmulas estruturais de diferentes Amatoxinas. Os números em negrito (de 1 a 8) indicam a numeração convencional dos oito aminoácidos que compõem a amatoxina. As indicações convencionais dos átomos nos aminoácidos 1, 3 e 4 também são mostrados (letras gregas de αa Y, letras gregas de α a δ, e números de 1’ a 7‘, respectivamente).
[0016] A Fig. 2 mostra a atividade citotóxica de diferentes conjugados de amatoxina-Trastuzumab (de nome comercial Herceptin®) em células SK-OV-3 (câncer de ovário) em um ensaio BrdU após incubação por 72h.
[0017] A Fig. 3 mostra a atividade citotóxica de diferente conjugados de amatoxina-Trastuzumab em células SK-OV-3 (câncer de ovário) em um ensaio BrdU após incubação por 72h.
[0018] A Fig. 4 mostra a atividade citotóxica de diferentes conjugados de amatoxina-Trastuzumab em células SKBR-3 (câncer de mama) em um ensaio BrdU após incubação por 72h.
[0019] A Fig. 5 mostra a atividade citotóxica de diferentes conjugados de amatoxina-Trastuzumab em células JIMT-1 (câncer de mama) em um ensaio BrdU após incubação por 72h.
[0020] A Fig. 6 mostra e eficácia in vivo de dois diferentes conjugados de amatoxina-Trastuzumab em um modelo de xenoenxerto de câncer de mama JIMT-1.
[0021] A Fig. 7 mostra a tolerância in vivo de dois diferentes conjugados de amatoxina-Trastuzumab em camundongos fêmeas nu/nu NMRI.
DESCRIÇÃO DETALHADA PARA A INVENÇÃO
[0022] A presente invenção pode ser melhor compreendida por referência à seguinte descrição detalhada da invenção e aos exemplos ali inclusos.
[0023] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-sea uma amatoxina de Fórmula I
Figure img0003
onde: R6 é selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno- R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;onde:(i) cada R5 é H;(ii) um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n éselecionado a partir de 0 e 1, e X é uma fração químicaque pode ser pareada com uma parte de direcionamento, e onde os R5 restantes são H; ou(iii) um dos R5 é -Ln-X*-Y, onde L é um agente de ligação, n é selecionado a partir de 0 e 1, Y é uma parte de direcionamento, e X* é uma fração química resultante do pareamento de X com um grupo funcional de Y, e onde os R5 restantes são H.
[0024] O termo “parte de ligação ao alvo”, tal como aquiutilizado, refere-se a uma molécula ou parte de uma molécula que pode se ligar especificamente a uma molécula alvo ou epitopo alvo. As frações de ligação ao alvo preferidas no contexto da presente aplicação são (i) anticorpos ou fragmentos de ligação a antígenos destes; (ii) proteínas semelhantes a anticorpos; e (iii) aptâmeros de ácido nucleico. “Frações de ligação ao alvo” adequadas para uso na presente invenção tipicamente possuem uma massa molecular de 40 000 Da (40 kDa) ou mais.
[0025] Tal como aqui utilizado, um primeiro composto (e.g. um anticorpo) é considerado “ligado especificamente” a um segundo composto (e.g. um antígeno, tal como uma proteína alvo), se possuir uma constante de dissociação KD do referido segundo composto de 100 μM ou menos, preferivelmente 50 μM ou menos, preferivelmente 30 μM ou menos, preferivelmente 20 μM ou menos, preferivelmente 10 μM ou menos, preferivelmente 5 μM ou menos, mais preferivelmente 1 μM ou menos, mais preferivelmente 900 nM ou menos, mais preferivelmente 800 nM ou menos, mais preferivelmente 700 nM ou menos, mais preferivelmente 600 nM ou menos, mais preferivelmente 500 nM ou menos, mais preferivelmente 400 nM ou menos, mais preferivelmente 300 nM ou menos, mais preferivelmente 200 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 100 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 90 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 80 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 70 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 60 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 50 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 40 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 30 nM ou menos, ainda mais preferivelmente 20 nM ou menos, e ainda mais preferivelmente 10 nM ou menos.
[0026] No contexto da presente aplicação, os termos “molécula alvo” e “epitopo alvo”, respectivamente, referem-se a um antígeno e a um epitopo de um antígeno, respectivamente, que é ligado especificamente por uma parte de ligação ao alvo. Preferivelmente, a molécula alvo é um antígeno associado a um tumor, em particular um antígeno ou um epitopo que está presente na superfície de um ou mais tipos de célula de tumor ou associado a células tumorosas em uma concentração aumentada e/ou em uma diferente configuração estérica se comparada à superfície de células não-tumorosas. Preferivelmente, o referido antígeno ou epitopo está presente na superfície de um ou mais tumores ou tipos de célula de estroma tumoral, mas não na superfície de células não-tumorosas. Em formas de realização particulares, a parte de ligação ao alvo está ligada especificamente a um epitopo de HER-2/neu ou molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM). Em outras formas de realização, o referido antígeno ou epitopo é preferencialmente expresso em células envolvidas em doenças autoimunes. Em tais formas de realização em particular, a parte de ligação ao alvo está ligada especificamente a um epitopo do receptor IL-6 (IL- 6R). Em outras formas de realização, o referido antígeno ou epitopo é preferencialmente expresso em células envolvidas em uma doença inflamatória.
[0027] O termo “anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste”, como usado aqui, refere-se a moléculas de imunoglobina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobina, i.e. moléculas que contém um local de ligação ao antígeno que é immunoligado especificamente a um antígeno. Também estão compreendidas proteínas semelhantes à imunoglobina que são selecionadas através de técnicas que incluem, por exemplo, apresentação de fagos ligados especificamente a uma molécula alvo, e.g. à proteína alvo Her- 2/neu ou EpCAM. As moléculas de imunoglobina da invenção podem ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobina. “Anticorpos e fragmentos de ligação a antígenos destes” adequados para uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a, anticorpos policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados (em particular enxertados por CDR), desimunizados, ou quiméricos, de cadeia simples (e.g. scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressões Fab, dicorpos ou tetracorpos (Holliger P. et al., 1993), nanocorpos, anti-idiotípicos (anti-Id) anticorpos (incluindo, e.g., anticorpos anti-Id para anticorpos da invenção), e fragmentos de ligação a epitopos de qualquer tipo acima.
[0028] Em algumas formas de realização, os fragmentos deligação a antígenos são fragmentos de anticorpos de ligação a antígenos humanos da presente invenção e incluem, mas não se limitam a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados a disulfureto (dsFv) e fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH. Os fragmentos de anticorpos de ligação a antígenos, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender o domínio variável(s) sozinho ou em conjunto com a totalidade ou uma porção dos seguintes domínios: região de dobra (hingeregion), CL, CH1, CH2, e CH3. Também se incluem na invenção fragmentos de ligação a antígenos compreendendo ainda qualquer combinação de domínio variável(s) com um domínio de região de dobra, CL, CH1, CH2, e CH3.
[0029] Anticorpos utilizáveis na invenção podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são de origem em humanos, roedores (e.g. camundongos, camundongos, porquinhos da índia, ou coelhos), frangos, porcos, ovelhas, cabras, camelos, vacas, cavalos, burros, gatos, ou cachorros. É particularmente preferido que os anticorpos sejam de origem humana ou murina. Tal como aqui utilizado, “anticorpos humanos” incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobina humana ou a partir de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, no pedido de patente U.S. 5,939,598 por Kucherlapati & Jakobovits.
[0030] O termo “proteína semelhante a anticorpos” refere-se a uma proteína que tenha sido desenvolvida (e.g. por mutagênese de sequências) para ser ligada especificamente a uma molécula alvo. Tipicamente, uma tal proteína semelhante a anticorpos compreende pelo menos uma sequência variável de peptídeos ligada a ambas as extremidades de uma plataforma de proteínas. Esta restrição estrutural dupla aumenta muito a afinidade de ligação da proteína semelhante a anticorpos a níveis comparáveis aos de um anticorpo. O comprimento da sequência variável de peptídeos consiste tipicamente de 10 a 20 aminoácidos. A plataforma de proteína pode ser qualquer proteína que possua boas propriedades de solubilidade. Preferivelmente, a plataforma de proteína é uma proteína globular pequena. Proteínas semelhantes a anticorpos incluem sem limitações aficorpos (affybodies), anticalinas(anticalins), e proteínas de repetição de anquirina (ankyrin) projetadas (para crítica, veja: Binz et al. 2005). Proteínas semelhantes a anticorpos podem ser derivadas a partir de grandes bibliotecas de mutantes, e.g. ser deslocadas de grandes apresentações de bibliotecas de fagos e podem ser isoladas em analogia a anticorpos comuns. Além disso, proteínas de ligação semelhantes a anticorpos podem ser obtidas por mutagênese combinatória de resíduos expostos à superfície em proteínas globulares.
[0031] O termo “aptâmero de ácido nucleico” refere-se a umamolécula de ácido nucleico que foi produzida através de rodadas repetidas de seleção in vitro ou SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial) para ligar a uma molécula alvo (para crítica, veja: Brody e Gold, 2000). O aptâmero de ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou de RNA. Os aptâmeros podem conter modificações, e.g. nucleotídeos modificados tais como pirimidinas substituídas com 2’-flúor.
[0032] Como utilizado aqui, um “conjugado de aptâmero” refere-se a um conjugado de toxina de parte de ligação ao alvo no qual a parte de ligação ao alvo é um aptâmero de ácido nucleico de acordo com a alternativa acima (iii).
[0033] Um “ligador” no contexto da presente invenção refere- se a uma molécula que é conectada a dois componentes, cada um ligado a uma extremidade do agente de ligação, e a qual aumenta a distância entre dois componentes e alivia a interferência estérica entre estes componentes, tais como no presente caso entre a parte de ligação ao alvo e a amatoxina. No ausência de um agente de ligação, uma ligação direta de amatoxina a uma parte de ligação ao alvo pode reduzir a capácidoade da amatoxina em interagir com a polimerase II do RNA. Em formas de realização particulares, um ligador possui cadeias contínuas de entre 1 e 30 átomos (e.g. 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 átomos) em seu alicerce,i.e. O comprimento do ligador é definido como a conexão mais curta como medida pelo número de átomos ou ligações entre a fração de amatoxina e a parte de ligação ao alvo, onde um lado do alicerce do ligador reagiu com a amatoxina, e o outro lado com uma parte de ligação ao alvo. No contexto da presente invenção, um ligador é, preferivelmente, um C1-20-alquileno, C1- 20-heteroalquileno, C2-20-alcenileno, C2-20-heteroalcenileno, C2- 20-alcinileno, C2-20-heteroalcinileno, cicloalquileno,heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralquileno, opcionalmente substituído. O ligador pode conter um ou mais elementos estruturais tais como carboxamida, éster, éter, tioéter, disulfureto, ureia, tioureia, frações de hidrocarboneto e afins. O ligador pode conter ainda combinações de dois ou mais destes elementos estruturais. Cada um destes elementos estruturais pode estar presente no ligador mais de uma vez, e.g. duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, ou seis vezes. Em algumas formas de realização, o ligador pode compreender uma ligação de disulfureto. Entende-se que o ligador precisa estar ligado na etapa simples ou em duas ou mais etapas subsequentes à amatoxina e à parte de ligação ao alvo. Para este fim, o candidato a ligador deve transportar dois grupos, preferivelmente a uma extremidade proximal e distal, que pode (i) formar uma ligação covalente com um grupo presente em um dos componentes a ser ligado, preferivelmente um grupo ativado em uma amatoxina ou no peptídeo de ligação ao alvo ou (ii) o qual é ou pode ser ativado para formar uma ligação covalente com um grupo em uma amatoxina. Conforme isto, é preferido que grupos químicos estejam nas extremidades distal e proximal do agente de ligação, que são o resultado de tal reação de pareamento, e.g. um éster, um éter, um uretano, uma ligação peptídica etc.
[0034] No contexto da presente invenção, o termo “amatoxina” inclui todos os peptídeos cíclicos compostos de 8 aminoácidos como isolados a partir do gênero Amanita e descrito em Wieland, T. e Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. Dezembro de 1978;5(3):185-260), e além disso inclui todos os derivados químicos deste; e ainda todos os análogos semisintéticos deste; e ainda todos os análogos sintéticos deste cosntruído a partir de blocos de construção de acordo com a estrutura mestre dos compostos naturais (cíclicos, 8 aminoácidos), e ainda todos os análogos sintéticos ou semisintéticos contendo aminoácidos não- hidroxilados ao invés dos aminoácidos hidroxilados, e ainda todos os análogos sintéticos ou semisintéticos, nos quais a fraçao de sulfóxido de tioéter é substituída por um enxofreeto, sulfona, ou por átomos diferentes de enxofre, e.g. um átomo de carbono como no carboanálogo de amanitina, em cada caso onde qualquer derivativo ou análogo seja funcionalmente ativo pela inibição da polimerase II de RNA de mamíferos.
[0035] Como utilizado aqui, um “derivado químico” (ou emresumo: um “derivado”) de um composto refere-se a uma espécieque possua uma estrutura quimica que é similar à do composto, embora contendo pelo menos um grupo químico não presente no composto e/ou deficiente de pelo menos um grupo químico que está presente no composto. O composto ao qual o derivado é comparado é conhecido como o composto “pai”. Tipicamente, um "derivado" pode ser prodzido a partir do composto pai em uma ou mais etapas de reação química.
[0036] Como utilizado aqui, um “análogo” de um composto éestruturalmente relacionado mas não idêntico ao composto e exibe pelo menos uma atividade do composto. O composto ao qual o análogo é comparedo é conhecido como o composto “pai”. As atividades acima mencionadas incluem, sem limitação: atividade de ligação a outro composto; atividade inibitória, e.g. atividade inibitória de enzimas; efeitos tóxicos; atividade de ativação, e.g. atividade de ativação de enzimas. Não é exigido que o análogo exiba uma atividade na mesma medida que o composto pai. O composto é considerado como um análogo no contexto da presente aplicação, se ele exibe a atividade relevante a um grau de pelo menos 1% (mais preferivelmente pelo menos 5%, mais preferivelmente pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, e mais preferivelmente pelo menos 50%) da atividade do composto pai. Assim, um “análogo de uma amatoxina”, como aqui utilizado, refere-se a um composto que é estruturalmente relacionado a qualquer α-amanitina, β-amanitina, Y—amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninaamida, amanulina, e ácido amanulínico como mostardo na Fig. 1 e que exibe pelo menos 1% (mais preferivelmente pelo menos 5%, mais preferivelmente pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, e mais preferivelmente pelo menos 50%) da atividade inibitória contra a polimerase II de RNA de mamíferos como comparado a pelo menos um dentre α-amanitina, β-amanitina, Y—amanitina, ε- amanitina, amanina, amaninaamida, amanulina, e ácidoamanulínico. Um “análogo de uma amatoxina” adequada para uso na presente invenção pode até exibir uma maior atividade inibitória contra a polimerase II de RNA de mamíferos que qualquer um dentre α-amanitina, β-amanitina, Y-amanitina, ε- amanitina, amanina, amaninaamida, amanulina, ou ácido amanulínico. A atividade inibitória pode ser medida determinando-se a concentração na qual ocorre 50% de inibição (valor IC50). A atividade inibitória contra a polimerase II de RNA de mamíferos pode ser determinada indiretamente medindo-se a atividade inibitória na proliferação da célula. Um ensaio adequado para a medição da inibição da proliferação da célula é descrita nos exemplos.
[0037] Um “análogo semisintético” refere-se a um análogo que foi obtido por síntese química utilizando compostos de fontes naturais (e.g. materiais vegetais, culturas bacterianas, culturas de fungos ou culturas de células) como material de partida. Tipicamente, um “análogo semisintético” da presente invenção foi sintetizado a partir de um composto isolado de um cogumelo da família Amanitaceae. Em contraste, um “análogo sintético” refere-se a um análogo sintetizado pela assim chamada síntese total a partir de blocos de construção pequenos (tipicamente petroquímicos). Geralmente, esta síntese total é executada sno auxílio de processos biológicos.
[0038] Funcionalmente, as Amatoxinas são definidas como peptídeos ou depsipéptidos que inibem a polimerase II de RNA de mamíferos. As Amatoxinas preferidas são aquelas com um grupo funcional (e.g. um grupo carboxílico, um grupo amino, um grupo hidroxi, um grupo tiol ou de captura de tiol) que pode ser reagido com moléculas de ligação ou frações de ligação ao alvo como definido acima. As Amatoxinas que são particularmente adequadas para os conjugados da presente invenção são α-amanitina, β-amanitina, Y—amanitina, ε- amanitina, amanina, amaninaamida, amanulina, e ácido amanulínico, como mostrado na Fig. 1, como também sais, derivados químicos, análogos semisintéticos, e análogos sintéticos destes. As Amatoxinas particularmente preferidas para utilização na presente invenção são α-amanitina, β- amanitina, e amaninaamida.
[0039] Em uma forma de realização paricular da presente invenção, uma amatoxina de (iii), onde o grupo funcional de Y da amatoxina de (iii), é um grupo amino.
[0040] Em uma tal forma de realização paricular, X* é aparte de ureia.
[0041] Em uma forma de realização paricular da presenteinvenção, o referido resíduo R5 sendo -Ln-X*-Y está:presente em R1;presente em R3; presente em R4; oupresente em R5.
[0042] Em uma forma de realização paricular da presenteinvenção, a referida amatoxina ser selecionada a partir de α- amanitina, β-amanitina, amanina, amaninaamida, ou a partir de sais ou análogos destes.
[0043] Em formas de realização particulares, o ligador L de(ii) ou (iii) é uma cadeia linear de entre 1 e 20 átomos independentemente selecioandos a partir de C, O, N e S, particularmente entre 2 e 16 átomos, mais particularmente entre 5 e 14 átomos, e ainda mais particularmente entre 6 e 12 átomos. Em formas de realização particulares, pelo menos 60% dos átomos na cadeia linear são átomos de C. Em formas de realização particulares, os átomos na cadeia linear são liagdos por ligações simples.
[0044] Em formas de realização particulares, o ligador de(ii) ou (iii) possui um comprimento de até 12 átomos, particularmente de 2 a 10, mais particularmente de 4 a 9, e mais particularmente de 6 to 8 átomos.
[0045] Em formas de realização particulares, o ligador L é um alquileno, heteroalquileno, alcenileno, heteroalcenileno, alcinileno, heteroalcinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralquileno, compreendendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S, onde o referido ligador é opcionalmente substituído.
[0046] O termo “alquileno” refere-se a grupos hidrocarbonetos saturados de cadeia bivalente reta possuindo de 1 a 20 átomos de carbono, incluindo grupos que possuem de 1 a 10 átomos de carbono. Em determinadas formas de realização, grupos de alquilenos podem ser grupos de alquilenos inferiores. O termo “alquilenos inferiores” refere-se a grupos de alquilenos que possuem de 1 a 6 átomos de carbono, e, em determinadas formas de realização, de 1 a 5 ou de 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos de alquilenos incluem, mas não se limitam a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n- propileno, n-butileno, n-pentileno, e n-hexileno.
[0047] O termo “alcenileno” refere-se a grupos de cadeias bivalentes retas possuindo de 2 a 20 átomos de carbono, onde pelo menos uma das ligações carbono-carbono é uma ligação dupla, enquanto que as outras ligações podem ser ligações simples ou ligações duplas adicionais. O termo “alcinileno” refere-se aqui a grupos possuind de 2 a 20 átomos de carbono, onde pelo menos uma das ligações carbono-carbono é uma ligação tripla, enquanto que as outras ligações podem ser simples, duplas ou triplas adicionais. Exemplos de grupos de alcenileno incluem etenileno (-CH=CH-), 1-propenileno, 2-propenileno, 1- butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno, e afins. Exemplos de grupos de alcinileno incluem etinileno, 1-propinileno, 2- propinileno, e assim em diante.
[0048] Como utilizado aqui, “cicloalquileno” refere-se a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, onde tal anel possui entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e onde tal anel é completamente saturado, e o termo “cicloalcenileno” refere-se a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, onde tal anel possui entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e onde tal anel é pelo menos parcialmente insaturado (mas excetuando-se qualquer anel de arileno). Exemplos de cicloalquilenos incluem, mas não se limitam a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, e cicloheptileno. Exemplos de cicloalcenilenos incluem, mas não se limitam a, ciclopentenileno e ciclohexenileno.
[0049] Como utilizado aqui, os termos “heterocicloalquileno”e “heterocicloalcenileno” referem-se a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema de anéis monocíclicos ou policíclicos estável, onde tal anel possui entre 3 e cerca de 12 átomos, e onde tal anel consiste de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo, particularmente pelo menos um heteroátomo independentemente selecionados a partir de o grupo que consiste em N, O e S, com um heterocicloalquileno referente a um anel que é completamente saturado, e um heterocicloalcenileno referente a um anel que é pelo menos parcialmente insaturado (mas excetuando-se qualquer anel de arileno ou de heteroarileno).
[0050] O termo “arileno” refere-se a um anel bivalente ousistema de anéis sendo parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, onde tal anel ou sistema de anéis possui entre 3 e 20 átomos de carbono, mas não possui heteroátomo, cujo anel ou sistema de anéis consiste em uma fração aromática como definida pela regra do elétron “4n+2" π, incluindo fenileno.
[0051] Como utilizado aqui, o termo “heteroarileno” refere- se a um anel bivalente ou sistema de anéis sendo parte de qualquer sistema monocíclico ou policíclico estável, onde tal anel ou sistema de anéis possui entre 3 e 20 átomos, cujo anel ou sistema de anéis consiste em uma fração aromática como definida pela regra do elétron “4n+2" π e contém átomos de carbono e um ou mais heteroátomos de nitrogênio, enxofre, e/ou oxigênio.
[0052] No context da presente invenção, o termo “substituído” indica que um ou mais hidrogênios presentes no alicerce de um ligador é substituído com uma seleção a partir dos grupos indicados, dado que a valência normal do átomo indicado, ou a do átomo apropriado do grupo que é substituído, não é excedida, e que a substituição resulta em um composto estável. O termo “opcionalmente substituído” refere-se ao ligador que é substituído ou não, como aqui definido, com um ou mais substituintes, como aqui definido. Quando um substituinte é um grupo ceto (or oxo, i.e. =O), tio, imino ou afim, então dois hidrogênios no alicerce do átomo ligador são substituídos. Substituintes exemplares incluem, por exemplo, alquil, alcenilo, alquinilo, cicloalquil, heterocicloalquil, aril, heteroaril, aralquil, heteroaralquil, acilo, aroilo, heteroaroilo, carboxilo, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonilo, halogênio, (tio)éster, ciano, fosforil, amino, imino, (tio)amido, sulfidrila, alquiltio, acilotio, sulfonil, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoil, um sulfonamido, nitro, azido, haloalquil, incluindo perfluoroalquil (tais como trifluorometil), haloalcoxi, alquilsulfanilo, alquilsulfinilo, alquilsulfonil, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforil, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- ou di- substituído, e.g. por alquil, aril, ou heteroaril), imino, carboxamida, carbamoil (opcionalmente mono- ou di-substituído, e.g. por alquil, aril, ou heteroaril), amidino, aminosulfonil, aciloamino, aroiloamino, (tio)ureido, ariltio)ureido, alquil(tio)ureido, cicloalquil(tio)ureido, ariloxi, aralcoxi, ou -O(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, - C(O)O(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(O)OR, ou -N(R)S(O)2R onde n é 1-4 e R é independentemente selecionado a partir de hidrogênio, - alquil, -alcenilo, -alquinilo, -cicloalquil, -cicloalcenilo, - (C-heterocicloalquil ligado), -(C-heterocicloalcenilo ligado), -aril, e -heteroaril, com múltiplos graus de substituição permitidos. Será compreendido pelos peritos na técnica que os substituintes, tais como heterocicloalquil, aril, heteroaril, alquil, etc., ou grupos funcionais tais como -OH, -NHR etc., podem ser eles mesmos substituídos, se aprorpiado. Também será compreendido pelos peritos na técnica que as próprias frações substituídas também podem ser substituídas quando apropriado.
[0053] Em formas de realização particulares, o ligador Lcompreende as frações selecionadas a partir de uma das seguintes frações: um disulfureto (-S-S-), um éter (-O-), um tioéter (-S-), um amina (-NH-), um éster (-O-C(=O)- ou -C(=O)- O-), uma carboxamida (-NH-C(=O)- ou -C(=O)-NH-), um uretano (- NH-).
[0054] Em formas de realização particulares da presente invenção, o ligador L de (ii) ou (iii) compreende m grupos selecionados a partir da lista de: alquileno, alcenileno, alcinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalcenileno, heteroalcinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, e um grupo heteroaralquileno, onde cada grupo pode opcionalmente ser independentemente substituído, o ligador compreendendo ainda uma fração n independentemente selecionada a partir de uma das seguintes frações: um disulfureto (-S-S-), um éter (-O-), um tioéter (S-), um amina (-NH-), um éster (-O-C(=O)- ou -C(=O)-O-), uma carboxamida (-NH-C(=O)- ou -C(=O)-NH-), um uretano (-NH-C(=O)- O- ou -O-C(=O)-NH-), e uma fração de ureia (-NH-C(=O)-NH-), onde m = n+1. Em formas de realização particulares, m é 2 e n é 1, ou m é 3 e n é 2. Em formas de realização particulares, o ligador compreende 2 ou 3 grupos de alquileno não substituídos, e 1 ou 2, respectivamente, disulfureto, éter, tioéter, amina, éster, carboxamida, uretano ou frações de ureia ligando os grupos de alquileno não substituídos.
[0055] Em formas de realização particulares, o Átomos de Cna cadeia linear são independentemente parte de grupos de metileno (-CH2-) opcionalmente substituídos. Em tais formas de realização em particular, os substituintes opcionais são independentemente selecionados a partir de halogênio e C1-6- alquil, particularmente metil.
[0056] Em formas de realização particulares, o ligador L,particularmente o ligador L como mostardo em seção, pode ser selecionado a partir do seguinte grupo de ligadores:lado da amatoxina: -(CH2)2- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)3- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)4- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)5- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)6- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)7- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)8- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)9- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)10- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)11- parte de ligação ao lado doalvo; lado da amatoxina: -(CH2)12- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)16- parte de ligação ao lado doalvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-S-S-(CH2)2- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)3-S-S-(CH2)2- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-S-S-(CH2)3- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)3-S-S-(CH2)3- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)4-S-S-(CH2)4- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2- parte de ligação aolado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-parte de ligação ao lado do alvo; lado da amatoxina: -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-target-binding fração side;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Val-Val-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-His-Val-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo;lado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Met-Val-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo; elado da amatoxina: -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-(CH2)6- parte deligação ao lado do alvo.
[0057] Em formas de realização particulares, as partes de ligação ao alvo ligadas especificamente a um epitopo que está presentes em uma célula tumorosa, particularmente onde as partes de ligação ao alvo ligadas especificamente a um epitopo de receptor de fator 2 de crescimento epidérmico humano (HER2).
[0058] Em formas de realização particulares, o anticorpo éTrastuzumab ou HEA125, ou um fragmento de anticorpo compreendendo o fragmento de ligação ao antígeno de Trastuzumab ou HEA125.
[0059] Em formas de realização particulares, mais que umamolécula de amatoxina é pareada a uma parte de ligação ao alvo. Um aumento do número de Amatoxinas por conjugado também aumentará a toxicidade. De acordo com isso, nesta forma de realização em particular a proporção de parte de ligação ao alvo para amatoxina é entre 1 parte de ligação ao alvo para entre 1 e 15 moléculas de amatoxinas, particularmente 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Para fins decálculo da proporção do caso de dímeros de anticorpos tais como IgGs, o dímero é considerado como uma parte de ligação ao alvo.
[0060] Em formas de realização particulares, a parte de ligação ao alvo é selecionada a partir do grupo que consiste em:(i) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígenodestes;(ii) proteínas semelhante a anticorpos; e(iii) aptâmeros de ácido nucleico.
[0061] Em formas de realização particulares, os anticorposou fragmentos de ligação ao antígeno destes são selecionado a partir de um diacorpo, um tetracorpo, um nanocorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo desimunizado, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
[0062] Em formas de realização particulares, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, F(ab’)2, Fd, Fv, de cadeias simples Fv, e Fvs ligados a disulfureto (dsFv).
[0063] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma amatoxina da presente invenção para utilização como um medicamento.
[0064] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma amatoxina da presente invenção para uso no tratamento de câncer em um paciente, particularmente onde o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de estômago, câncer do rim, melanoma maligno, leucemia, e linfoma malign.
[0065] Como utilizado aqui, um “paciente” significa qualquer mamífero ou ave que pode se beneficiar a partir de um tratamento com os conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo descritos aqui. Preferivelmente, um “paciente” é selecionado a partir do grupo que consiste em animais de laboratório (e.g. camundongo ou camundongos), animais domésticos (incluindo e.g. porquinhos da índia, coelhos, frangos, porcos, ovelhas, cabras, camelos, vacas, cavalos, burros, gatos, ou cachorros), ou primatas incluindo seres humanos. É particularmente preferido que o “paciente” seja um ser humano.
[0066] Como utilizado aqui, "tratar", "tratando" ou “tratamento” de uma doença ou enfermidade significa realizar um ou mais do seguinte: (a) reduzir a gravidade da enfermidade; (b) limitar ou prevenir o desenvolvimento de semmas característicos da enfermidade sendo tratada; (c) inibir a piora de semmas característicos da enfermidade sendo tratada; (d) limitar ou prevenir a recorrência da enfermidade em pacientes que já manifestaram enfermidade anteriormente; e (e) limitar ou prevenir a recorrência de semmas em pacientes que foram semmáticos anteriormente à enfermidade.
[0067] Como utilizado aqui, o tratamento pode compreender a administração de um conjugado ou de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para um paciente, onde "administração" inclui a administração in vivo, assim como a administração diretamente para o tecido ex vivo, tais como enxertos de veia.
[0068] Em formas de realização particulares, utiliza-se uma quantidade terapeuticamente eficiente do conjugado da presente invenção.
[0069] A “quantidade terapeuticamente eficiente” é uma quantidade de um agente terapêutico suficiente para se obter o propósito desejado. A quantidade efetiva de um dado agente terapêutico ira variar Segundo fatores tais como a natureza do agente, a forma de administração, o tamanho e espécie do animal a receber o agente terapêutico, e o propósito da administração. A quantidade efetiva em cada caso individual pode ser determinado empiricamente por um perito na especialidade de acordo com os métodos estabelecidos na técnica.
[0070] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à composição farmacêutica compreendendo a amatoxina de acordo com a presente invenção, e compreendendo ainda um ou mais diluentes farmaceuticamente aceitáveis, transportadores, excipientes, enchimentos, aglutinantes, lubrificantes, deslizantes, desintegrantes, adsorventes; e/ou conservantes.
[0071] “Farmaceuticamente aceitáveis” significa aprovados por uma agência reguladora do Governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopéia dos Estados Unidos ou outra farmacopéia universalmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos.
[0072] Em formas de realização particulares, a composição farmacêutica é utilizada na forma de um medicamento administrado sistemicamente. Isto inclui parenterais, que compreendem, entre outros, injetáveis e infusões. Injetáveis são formulados no forma de ampolas ou como os assim chamados injetáveis de pronta utilização (ready-for-use), e.g. seringas de pronta utilização ou seringas de uso único e afora isso em frascos puncionáveis para retiradas múltiplas. A administração de injetáveis pode ser em forma de aplicação subcutânea (subcutaneamente), intramuscular (i.m.), intravenosa (intravenosamente) ou intracutânea (i.c.). Em particular, é possível produzir as formulações de injeção respectivamente adequadas como uma suspensão de cristais, soluções, nanopartículas ou sistemas de uma colóide dispersa como, e.g. hidrosoluções.
[0073] Formulações injetáveis podem ainda ser produzidas como concentrados, que podem ser dissolvidas ou dispersas com diluentes isotônicos aquosos. A infusão também pode ser preparada na forma de soluções isotônicas, emulsões de gordura, formulações lipossômicas e micro-emulsões. Simelhantemente aos injetáveis, as formulações de infusão também podem ser preparadas na forma de concentrados para diluição. Formulações injetáveis também podem ser aplicadas na forma de infusões permanentes tanto em terapias de internação quanto ambulatorias, e.g. através de mini-bombas.
[0074] É possível adicionar formulações de drogas parenterais, por exemplo, albumina, plasma, expansor, substâncias de superfície ativa, diluentes orgânicos, substâncias influenciadoras de pH, substâncias complexantes ou substâncias poliméricas, em particular como substâncias para influenciar a adsorção dos conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção a proteínas ou polímeros ou eles podem também ser adicionados com o objetivo de reduzir a adsorção dos conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção para materiaiss como instrumentos de injeção ou materiais de embalagem, por exemplo, plástico ou vidro.
[0075] As Amatoxinas da presente invenção compreendendo a parte de ligação ao alvo podem ser ligadas a microtransportadores ou nanopartículas em parenterais como, por exemplo, para partículas finamente dispersas baseadas em poli (met) acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoácidos ou uretanos de poliéter. Formulações parenterais também podem ser modificadas como preparações de depósito, e.g. com base no “princípio da unidade múltipla”, se os conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção são introduzidos nas formas finamente dispersa, dispersa e suspensa, respectivamente, ou como uma suspensão de cristais no medicamento ou com base no “princípio da unidade mais simples” se os conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção estão inclusos na formulação, e.g. no comprimido ou em uma haste que é posteriormente implantada. Estes implantes ou medicamentos de depósito em formulações de unidades simples e unidades multiple muitas vezes consistem dos assim chamados polímeros biodegradáveis como e.g. poliésters de ácido lático e ácido glicólico, uretanos de poliéter, poliaminoácidos, poli (met) acrilatos oupolissacáridos.
[0076] Adjuvantes e transportadores adicionados durante a produção das composições farmacêuticas da presente invenção formuladas como parenterais são preferivelmente aqua sterilisata (água esterilizada), substâncias influenciadoras do valor do pH como, e.g. ácidos orgânicos ou inorgânicos ou bases bem como sais destes, substâncias de tamponamento para ajustar os valores do pH, substâncias para isotonização como e.g. cloreto de sódio, carbonato de hidrogênio de sódio, glucose e frutose, tensionantes (tensionantes) e surfactantes, respectivamente, e emulsificantes como, e.g. ésters parciais de ácidos graxos de sorbitanos de polioxietileno (por exemplo, Tween®) ou, e.g. ácido graxo de ésters de polioxietilenos (por exemplo, Cremophor®), óleos gordos como, e.g. óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo de castor, ésters sintéticos de ácidos graxos como, e.g. Oleato de etilo, miristato de isopropilo e óleo neutro (por exemplo, Miglyol®) assim como adjuvantes poliméricos como, e.g. gelatina, dextrano,polivinilpirrolidona, aditivos que aumentam a solubilidade de solventes orgânicos como, e.g. propilenoglicol, etanol, N,N- dimetilacetamida, propilenoglicol ou substâncias de formação complexa como, e.g. citrato e ureia, conservantes como, e.g. ácido benzóico hidroxipropil éster e metil éster, álcool benzílico, antioxidantes como e.g. sulfito de sódio e estabilizadores como e.g. EDTA.
[0077] Ao formular as composições farmacêuticas da presenteinvenção como suspensões na forma de realização referencial, são adicionados agentes espessantes para prevenir a fixação dos conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção, ou tensionantes e polieletrólitos para garantir a ressuspensão de sedimentos e/ou agentes de formação complexa como, por exemplo, EDTA. Também é possível alcançar complexos do ingrediente ativo com diversos polímeros. Exemplos de tais polímeros são polietileno glicol, poliestireno, carboximetil celulose, Pluronics® ou éster de ácido graxo sorbitol polietileno glicol. Os conjugados de toxina de parte de ligação ao alvo da invenção também podem ser incorporados em formulações líquidas na forma de compostos de inclusão e.g. com ciclodextrinas. Em formas de realização particulares, agentes dispersantes podem ser adicionados como adjuvants adicionais. Para a produção de agentes de plataforma liofilizados como manitol, dextrano, sacarose, albumina humana, lactose, PVP ou variedades de gelatine podem ser utilizados.
[0078] Em formas de realização particulares da presente invenção, X é um ácido carbâmico derivado -NH-C(O)-Z, onde Z é um grupo lábil que pode ser substituído por um grupo nucleofílico da parte de ligação ao alvo, particularmente por uma amina primária da parte de ligação ao alvo.
[0079] Em formas de realização particulares, Z é selecionado a partir de: -tbutiloxi, -succinimidiloxi, -1-O- succinimidiloxi-3-sulfonato (-Sulfo-NHS), -O-(4- nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4- dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6-nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5- triclorofeniloxi), -O-(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3- benzotriazina-3-il), -O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3- dicarboximida-1-il), -1-ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza-benzotriazolil)oxi,), e -N-imidazolil.
[0080] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para sintetizar a amatoxina da presente invenção, compreendendo a etapa de reagir uma amatoxina de Fórmula II
Figure img0004
onde:R2 é selecionado a partir de S=O, SO2, e S;R3 é selecionado a partir de NHR5 e OR5;R4 é selecionado a partir de H, OR5, e OC1-6-alquil;R6 é selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5,cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, eheteroarileno-R5;R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno- R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;onde um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n é selecionado a partir de 0 e 1, e X é uma fração química que pode ser pareada com a parte de direcionamento, e ondeos R5 restantes são H;com (i) N,N’-disuccinimidil carbonato (DSC), (ii) um reagente de tiocarbonilação, particularmente tiofosgênio, 1,1‘-tiocarbonildiimidazola ou 1,1‘-tiocarbonildi-2(1H)- piridona; (iii) um reagente iminocarbonilante, particularmente um dicloreto de isocianato ou fenilisotiocianato; ou (iv) um aldeído, cetona ou acetal acíclico.EXEMPLOSExemplo 1 Síntese de moléculas de conjugação de amatoxinaSíntese de 6'- N-Boc-(6-aminohexil)-α-amanitina HDP30.0132
Figure img0005
[0081] Sob argônio e à temperatura ambiente, 180 mg (196 μmol) de α-amanitina seca a vácuo foram dissolvidos em 5000 μl de dimetil sulfóxido (DMSO) seco. Foram adicionados N- Boc-aminohexilbromida (439 mg, 8 equivalentes) e 1M hidróxido de sódio (215.5 μl, 1.1 eq.). Após 2h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi ácidoificada para pH = 5 com 100 μl da solução de ácido acético 1 M em DMSO. Os voláteis foram evaporados em vácuo e o resíduo foi dissolvido em 500 μl de metanol e adicionado a 40 ml de metil tert-butil éter (MTBE) refrigerado em gelo. O precipitado foi centrifugado e lavado por resuspensão em 40 ml de MTBE. O precipitado foi e retomadoem 4000 μl de metanol filtrado e purificado em doses de 500 μlpor HPLC preparativo emu ma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Â). Solvente A: água, solvente B: metanol;Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100%B; 27 min 5% B, 35 min 5% B; Fluxo 30 ml/min. As frações com uma tempo de retenção de 18.4-19.1 min foram coletadas e os solventes evaporados para 126 mg (57%) HDP 30.0132 como uma sólido incolor.MS (ESI+) 1118.5 [M+H]+, 1140.5 [M+Na]+
[0082] Pela evaporação das frações com uma tempo de retençãoHDP 30.0132 HDP 30.0134
Figure img0006
[0083] 6'-NH-boc-6-aminohexil-α-amanitina (HDP 30.0132,81.82 mg, 73.17 μmol) foi dissolvida em 300 μl de ácido trifluoroacético (TFA). A mistura de reação foi agitada sob argônio à temperatura ambiente. Após 2 min, o ácido foi removido a vácuo a 20°C e resíduos de TFA são removidos por co-evaporação com 2x 3 ml de tolueno seco. O resíduo foi dissolvido em 3000 μl de água/metanol 95:5 contendo 0.05% TFA e purificado em doses de 500 μl por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Â). SolventeA: água (contendo 0.05% TFA), Solvente B: metanol (contendo0.05% TFA.) Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5% B ; Fluxo 30 ml/min. A fração com o tempo de retenção de 13.4-13.9 min foi coletada e os solventes evaporados para fornecer 75.52 mg (89%) HDP 30.0134 como um sólido incolor.HR-MS (ESI+) 1018.46749 calc. 1018.46679 por C45H68N11O14S [M+H]+1.3 Síntese de 6'-(6-(Succinimidiloxi-carbonil)-aminohexil-α-amanitina HDP 30.0643
Figure img0007
[0084] HDP 30.0134 (160.52 mg, 141.78 μmol) foi dissolvidaem 1000 μl de dimetilformamida (DMF) seca, e 363.19 mg (10 eq.) de N,N'-disuccinimidil carbonato (DSC) em 4000 μl de DMF seco foram adicionados de uma só vez, seguidos por 39.3 μl (2 eq.) de trietilamina e a mistura foi agitada à temperatura ambiente. Após 30 min, a mistura de reação recebeu gota a gota em partes iguais em dois tubos de centrifugação preenchidos com 40 ml de MTBE rerigerados a gelo. Os precipitados resultantes foram centrifugados e lavados por resuspensão em 40 ml de MTBE cada. Os precipitados foram secos a vácuo, dissolvidos e combinados em 2400 μl de metanol 95% contendo 0.05% TFA e purificados em doses de 400 μl por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm,100 Â). Solvente A: água (contendo 0.05% TFA) . Solvente B:metanol (contendo 0.05% TFA). Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5% B ; Fluxo 30 ml/min. A fração com o tempo de retenção de 15.4-16.5 min foi coletada e os solventes evaporados e o resíduo foi liofilizado a partir de 8 ml terc-butanol para 151.46 mg (92%) de HDP 30.0643 como um pó branco.MS (ESI+) 1159.1 [M+H]+, 1181.0 [M+Na]+ 1.4 Síntese de Derivativo Carbonado Cíclico HDP 30.1165
Figure img0008
[0085] 10.23 mg (9.04 μmol) de HDP 30.0134 foram dissolvidosem 500 μl de dimetilformamida (DMF) seca, e 452 μl (10 equivalentes) da solução de N,N'-disuccinimidil carbonato (DSC) 0.2 M em DMF seco foi adicionado de uma só vez. Trietilamina (2.51 μl, 2 equivalentes) foi adicionada, e a mistura foi agitada por 90 min à temperatura ambiente. Subseqüentemente, os voláteis foram removidos a vácuo à temperatura de banho de 40°C. O resíduo foi dissolvido em 500 μl 95% de metanol contendo 0.05% TFA e purificado por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm,100 Â). Solvente A: água (0.05% TFA). Solvente B: metanol(0.05% TFA). Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5%B; Fluxo 30 ml/min. A fração com o tempo de retenção de 15.4-16.5 min foi coletada e os solventes evaporados e o resíduo foi liofilizado a partir de 2 ml terc-butanol to 9.06 mg (85%) HDP 30.1065 como um pó branco.MS (ESI+) 1185.10 [M+H]+, 1207.07 [M+Na]+ 1.5 Síntese de 6'-N-Boc-(6-aminohexil)-S-desoxi-α-amanitinaHDP 30.0741
Figure img0009
[0086] A uma solução de HDP 30.0132 (18.64 mg, 16.67 μmol)em 2 ml de etanol foi adicionado Molibdêniohexacarbonilo (51 mg, 11.6 equivalentes) e a mistura foi aquecida no tubo selado a 75°C por 25h. Subseqüentemente, os voláteis foram removidos a vácuo e o resíduo foi retomado em 2 ml de metanol. Materiais insolúveis foram removidos por centrifugação e o flutuante é concentrado a 500 μl e purificado por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Â). SolventeA: água, Solvente B: metanol; Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5%B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5% B ; Fluxo 30 ml/min. A fração com o tempo de retenção de 17.9-18.6min foi coletada e os solventes evaporados to 10.95 mg (60%) HDP 30.0741 como um sólido incolor.MS (ESI+) 1102.3 [M+H]+, 1124.5 [M+Na]+ 1.6 Síntese de 6'-(6-Aminohexil)-S-desoxi-α-amanitina HDP30.0743
Figure img0010
[0087] HDP 30.0741 (10.95 mg, 9.93 μmol) foi dissolvida em500 μl de TFA e incubada por 2 min à temperatura ambiente. Então os voláteis foram evaporados a vácuo e os resíduos de TFA foram removidos por co-evaporação com 2x 1 ml de tolueno seco. Os 12.38 mg de produto bruto são utilizados na próxima etapa sem mais purificação.MS (ESI+) 1002.4 [M+H]+, 1024.3 [M+Na]+1.7 Síntese de 6'-(6-(Succinimidiloxi-carbonil)—aminohexil-S-
Figure img0011
[0088] HDP 30.0743 (12.38 mg, 10.51 μmol) foi dissolvida em500 μl de dimetilformamida (DMF) seca, e 525 (10 eq.) de uma solução de N,N'-disuccinimidil carbonato (DSC) 0.2N em DMF seco foram adicionadas de uma só vez, seguidas por 2.91 μl (2 eq.) de trietilamina, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente. Após 30 min, a mistura de reação foi adicionada gota a gota no tubo de centrifugação preenchido com 10 ml de MTBErerigerados a gelo. O precipitado resultante foi centrifugado e lavado por resuspensão em 10 ml MTBE cada. O precipitado foiseco a vácuo, dissolvido em 500 μl de metanol 95% contendo 0.05% TFA e purificado por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm, 100 Â). Solvente A: água(contendo 0.05% TFA). Solvente B: metanol (contendo 0.05%TFA). Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5% B ; Fluxo 30 ml/min.. A fração com o tempo de retenção de 16.0-17.2 min foi coletada e os solventes evaporados e o resíduo foi liofilizado a partir de 3 ml terc-butanol to 10.93 mg (91%) HDP 30.1033 como um pó brancoMS (ESI+) 1143.3 [M+H]+1.8 Síntese de Derivativo Carnobado Cíclico HDP 30.1036
Figure img0012
[0089] HDP 30.0743 (12.38 mg, 9.93 μmol) bruto foidissolvida em 500 μl de dimetilformamida (DMF) seca, e 497 μl (10 equivalentes) de uma solução de N,N'-disuccinimidil carbonato 0.2 M em DMF seco foi adicionado de uma só vez. Trietilamina (2.75 μl, 2 equivalentes) foi adicionada, e a mistura foi agitada por 90 min à temperatura ambiente. Subseqüentemente, os voláteis foram removidos a vácuo a uma temperatura de banho de 40°C. O resíduo foi dissolvido em 500 μl de metanol 95% contendo 0.05% TFA e purificado por HPLC preparativo em uma coluna C18 (250x21.2 mm, Luna RP-18, 10 μm,100 Â). Solvente A: água (0.05% TFA). Solvente B: metanol(0.05% TFA). Gradiente: 0 min 5% B; 5 min 5% B 20 min 100% B; 25 min 100% B; 27 min 5% B, 35 min 5% B; Fluxo 30 ml/min. A fração com o tempo de retenção de 15.9-17.2 min foi coletada e os solventes evaporados e o resíduo foi liofilizado a partir de 3 ml terc-butanol to 10.06 mg (87%) HDP 30.1036 como um pó branco.MS (ESI+) 1191.08 [M+Na]+Exemplo 2 Síntese de Conjugados de Anticorpos de amatoxina - conjugação de Trastuzumab com amatoxina-NHS-carbamatos pré- ativados1.1 Trastuzumab-30.0643
[0090] 1.15mg de derivado de ligador de amatoxina pré-ativado HDP 30.0643 foi dissolvido em 230 µl dedimetilsulfóxido (DMSO) seco e adicionado a 3.33 ml de soluçãode anticorpos 6 mg/ml em salina tamponada com fosfato (PBS,pH = 7.4). A solução resultante foi agitada a 4°C durante anoite e separada por filtração em gel Sephadex G-25 (ColunaPD-10; GE Healthcare Life Sciences). As Colunas PD-10 forampré-lavadas com soluções de PBS 6 x 5 ml, pH = 7.4. As fraçõesde conjugados foram detectadas por Solução de Bradford ecombinadas a uma solução. A solução foi então dialisadas nacassete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000MWCO) contra 1L de PBS pH 7.4 durante a noite a 4°C. Aconcentração de proteínas foi determinada por Ensaio RotiQuant(Carl Roth; Germany). A concentração de ADC foi aumentada emFiltros Centrífugos Amicon Ultra de 50´000 MWCO (Millipore;centrifugação a 4000rpm) e finalmente ajustadas para 3mg/ml. Acarga de Amanitina do Trastuzumab foi determinada pordeterminação da Absorção UV a A = 280 nm e A = 310 nm.1.2 Trastuzumab-30.1033
[0091] 2.00 mg de ligador pré-ativado de derivado deamatoxina HDP 30.1033 foram dissolvidos em 400 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) seco e adicionado a 2.62 ml de solução de anticorpos 10 mg/ml em salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7.4). A solução resultante foi agitada a 4°C durante anoite e separada por Filtração em gel Sephadex G-25 (Coluna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). As colunas PD-10 foram pré-lavadas com Soluções de PBS 6 x 5 ml, pH = 7.4. As fraçõesde conjugados foram detectadas por Solução de Bradford e combinadas a uma solução. A solução foi então dialisada na cassete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000MWCO) contra 1L de PBS pH 7.4 durante a noite a 4°C. A concentração de proteínas foi determinada por Ensaio RotiQuant (Carl Roth; Germany). A Concentração ADC foi aumentada em Filtros Centrífugos Amicon Ultra 50'000 MWCO (Millipore; centrifugação a 4000rpm) e finalmente ajustadas para 3mg/ml. ACarga de Amanitina de Trastuzumab foi determinada por determinação de Absorção UV a A = 280 nm e A = 310 nm.1.3 Trastuzumab-30.1036
[0092] 2.00 mg de ligador pré-ativado de derivado deamatoxina HDP 30.1036 foram dissolvidos em 400 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) seco e adicionados a 2.57 ml de solução de anticorpos 10 mg/ml em salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7.4). A solução resultante foi agitada a 4°Cdurante a noite e separada por filtração em gel Sephadex G-25(Coluna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). As Colunas PD-10foram pré-lavadas com Soluções de PBS 6 x 5 ml, pH = 7.4. Asfrações de conjugados foram detectadas por Solução de Bradford e combinadas a uma solução. A solução foi então dialisada na Cassete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000MWCO) contra 1L de PBS pH 7.4 durante a noite a 4°C. A concentração de proteínas foi determinada por Ensaio RotiQuant (Carl Roth; Germany). A concentração de ADC foi aumentada em Filtros Centrífugos Amicon Ultra 50'000 MWCO (Millipore; centrifugação at 4000rpm) e finalmente ajustada para 3mg/ml. A carga de Amanitina de Trastuzumab foi determinada por determinação de Absorção UV a A = 280 nm e A = 310 nm.1.4 Trastuzumab-30.1165
[0093] 0.90 mg de ligador pré-ativado de derivado deamatoxina HDP 30.1165 foi dissolvido em 180 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) seco e adicionada a 2.00 ml de solução de anticorpos 5 mg/ml em salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7.4). A solução resultante foi agitada a 4°C durante anoite e separada por filtração em gel Sephadex G-25 (Coluna PD-10; GE Healthcare Life Sciences). As Colunas PD-10 foram pré-lavadas com Soluções de PBS 6 x 5 ml, pH = 7.4. As fraçõesde conjugados foram detectadas por Solução de Bradford e combinadas a uma solução. A solução foi então dialisada na Cassete Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific; 0.5-3ml; 20.000MWCO) contra 1L de PBS pH 7.4 durante a noite a 4°C. A concentração de proteínas foi determinada por Ensaio RotiQuant (Carl Roth; Germany). A concentração de ADC foi aumentada em Filtros Centrífugos Amicon Ultra 50'000 MWCO (Millipore; centrifugação at 4000rpm) e finalmente ajustada para 3mg/ml. A carga de Amanitina de Trastuzumab foi determinada por determinação de Absorção UV a A = 280 nm e A = 310 nm.
Figure img0013
Exemplo 3 Citotoxicidade de Her-30.0643 [4.4], Her-30.1033[3.9], Her-30.1036 [4.0] e Her-30.1165 [5.0] em linhas detumores celulares in vitro HER2-positivas
[0094] A atividade citotóxica de Conjugados de Amatoxina deTrastuzumab foi avaliada in vitro com as linhas de célula tumorosas HER2-positivas SK-OV-3 (ovários), SKBR-3 (mama) e JIMT-1 (mama) e o ensaio de incorporação de BrdU quimioluminescente (Roche Diagnostics). A viabilidade da célula foi determinada após 72h de incubação com diferentes concentrações de conjugados a 37°C e CO2 5% pela medição decélulas fixadas e permeabilizadas com um anticorpo anti-BrdU- HRP no Leitor de microplacas BMG Labtech Optima. O valor EC50 da curva de resposta à dosagem foi calculada pelo software Graphpad Prism 4.0.
[0095] Os valores EC50 dos conjugados de Amatoxina deTrastuzumab em diferentes Linahs de células Her2 positivas (veja também as Figuras 2 a 5):
Figure img0014
Exemplo 4 Eficácia in vivo de Her-30.0643 [4.4] e Her-30.1036 [4.0] no modelo de Xenoenxerto JIMT-1 resistente a Trastuzumab
[0096] Camundongos atímicos fêmeas intactas NMRI nu/nu de seis meses foram compradas (Janvier) e aleatoriamente divididos em três grupos de oito camundongos cada. Células 5 x 106 JIMT-1 foram injetadas subcutaneamente no flanco de cada camundongo. Os conjugados de Amatoxina de Trastuzumab Her- 30.0643 [4.4] e Her-30.1036 [4.0] foram injetados uma vez intravenosamente a uma dose de 30 μg/kg e 150 μg/kg em relação à amanitina no 14° dia após a inoculação do tumor, enquanto que o controle negativo foi injetado com um meio de transporte (Tampão PBS). O volume do tumor foi registrado (veja a Figura 6). Ambos os conjugados mostraram alta atividade antitumoral resultando na redução completa do tumor a 30 μg e 150 μg/kg. Exemplo 5 Tolerabilidade de Her-30.0643 [4.4] e Her-30.1036[4.0] em camundongos
[0097] Camundongos atímicos fêmeas intactas NMRI nu/nu desete semansa foram compradas (Janvier) e aleatoriamente divididas em três grupos de três camundongos por grupo. Os Conjugados de Amatoxina de Herceptina Her-30.0643 [4.4] e Her-30.1036 [4.0] foram injetadas uma vez intravenosamente a umadose de 300 μg/kg, enquanto que o controle negativo foi injetado com um meio de transporte (Tampão PBS). O peso dos camundongos foi registrado (veja a Figura 7). Todos os animaiss tratados com Her-30.0643 [4.4] morreram dentro denove dias após a aplicação, enquanto que todos animaiss tratados com Her-30.1036 [4.0] mostraram pesos corporalcomparável ao grupo de controle negativo após o 14° dia.

Claims (18)

1. Amatoxina de Fórmula I
Figure img0015
caracterizada por:R1 ser selecionado a partir de C=O, C=S, C=NR6 e CR7R8;R2 ser selecionado a partir de S=O, SO2, e S;R3 ser selecionado a partir de NHR5 e OR5;R4 ser selecionado a partir de H, OR5, e OC1-6-alquilo;R6 ser selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5, cicloalquilenoR5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5; R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6- alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5,arileno-R5, e heteroarileno-R5;onde:(i) cada R5 é H;(ii) um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n é selecionado de 0 e 1, e X é uma fração química que pode ser pareada com uma fração de direcionamento, e onde os R5 restantes são H; ou(iii) um dos R5 é -Ln-X*-Y, onde L é um agente de ligação, n é selecionado de 0 e 1, Y é uma fração de direcionamento, e X* é uma fração química resultante do pareamento de X com o grupo funcional de Y, e onde os R5 restantes são H.
2. Amatoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo referido grupo funcional de Y ser um grupo amino.
3. Amatoxina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapor X* ser uma fração de ureia.
4. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações1, 2 e 3, caracterizada por o resíduo R5 sendo -Ln-X*-Y estar:(i) presente em R1;(ii) presente em R3;(iii) presente em R4; ou(iv) presente em R5.
5. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 a 4, caracterizada por n ser 1, e onde o agente de ligação possui um comprimento de até 12 átomos, particularmente de 2 a 10 átomos, mais particularmente de 4 a 9 átomos, e mais particularmente de 6 a 8 átomos.
6. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo agente de ligação L ser um alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquenileno, heteroalquenileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralquileno, compreendendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O, e S, onde o referido agente de ligação é opcionalmente substituído.
7. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 a 6, caracterizada pelo agente de ligação L compreender uma fração selecionada a partir de uma das seguintes partes: um dissulfureto, um éter, um tioéter, uma amina, um éster, uma carboxamida, um uretano, e uma fração de ureia.
8. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pela parte de ligação ao alvo ligar-se especificamente a um epítopo que está presente numa célula tumoral, em particular onde especificamente a parte de ligação ao alvo se liga a um epítopo de um receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2).
9. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizada pela parte de ligação ao alvo ser selecionada a partir do grupo que consiste em:(i) anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste;(ii) proteína tipo anticorpo; e(iii) ácido nucleico aptâmero.
10. Amatoxina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste ser selecionado a partir de um diacorpo, um tetracorpo, um nanocorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo desimunizado, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
11. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizada pelo fragmento de ligação ao antígeno ser selecionado a partir do grupo que consiste em Fab, F(ab’)2, Fd, Fv, Fv de cadeia simples, e Fvs ligada por dissulfureto (dsFv).
12. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por ser para utilização como um medicamento.
13. Amatoxina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por ser para utilização no tratamento do câncer em um paciente, particularmente onde o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia, e linfoma maligno.
14. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a amatoxina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e compreendendo ainda um ou mais diluentes farmacêuticos aceitáveis, transportadores, excipientes, enchimentos, ligantes, lubrificantes, deslizantes, desintegrantes, adsorventes; e/ou conservantes.
15. Amatoxina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por X ser um derivado do ácido carbâmico -NH-C(O)-Z, onde Z é um grupo lábil que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma parte de ligação ao alvo, particularmente por um amina primária de uma parte de ligação ao alvo.
16. Amatoxina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por Z ser selecionado a partirde: -tbutiloxi, -succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3-sulfonato (-Sulfo-NHS), -O-(4-nitrofeniloxi),-O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-dinitrofeniloxi),-O-(2,4-dicloro-6- nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O- (2,4,5-triclorofeniloxi), -O-(3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina-3-il), -O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida-1-il), -1-ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza-benzotriazolil)oxi, ), e -N-imidazolil.
17. Método para a síntese da amatoxina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 ou 16 caracterizado por compreender a etapa de reagir a parte di-hidroxi-isoleucina de uma amatoxina de Fórmula II
Figure img0016
onde:R2 ser selecionado a partir de S=O, SO2, e S;R3 ser selecionado a partir de NHR5 e OR5;R4 ser selecionado a partir de H, OR5, e OC1-6-alquil;R6 ser selecionado a partir de C1-6-alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;R7 e R8 são independentemente selecionados a partir de H, C1-6- alquileno-R5, cicloalquileno-R5, heterocicloalquileno-R5, arileno-R5, e heteroarileno-R5;em que um dos R5 é -Ln-X, onde L é um agente de ligação, n é selecionado de 0 e 1, e X é uma fração química que pode ser pareada com uma fração de direcionamento, e onde os R5 restantes são H; com (i) N,N’-disuccinimidil carbonato (DSC), (ii) um reagente tiocarbonilante, particularmente o tiofosgeno, 1,1’- tiocarbonildiimidazola ou 1,1’-tiocarbonildi-2(1 H )-piridona; (iii) um reagente iminocarbonilante, particularmente um dicloreto de isocianida ou fenilisotiocianate; ou (iv) um aldeído, cetona ou acetal acíclico, em que a reação da referida parte di-hidroxi-isoleucina com um reagente de acordo com (i), (ii), (iii) ou (iv) resulta na formação da estrutura cíclica
Figure img0017
de acordo com a fórmula I.
18. Uso da amatoxina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizada por ser na preparação de um medicamento para tratar o câncer em um paciente, particularmente onde o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia, e linfoma maligno.
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