BR112015019721B1 - ISOLATED OR PURIFIED SOLUBLE LIGAND BINDING POLYPEPTIDE, SOLUBLE LIGAND BINDING MOLECULE, ISOLATED OR PURIFIED POLYNUCLEOTIDE, VECTOR, ISOLATED MICROORGANISM HOST CELL OR MICROORGANISM CELL LINE, METHOD FOR PRODUCING A LI POLYPEPTIDE LIGAND BINDING OR A LINK BINDING MOLECULE BINDING, COMPOSITION AND USE OF A COMPOSITION - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE ISOLADO OU PURIFICADO, MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE LIGANTE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, CÉLULA ISOLADA OU LINHAGEM DE CÉLULAS, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE OU UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE LIGANTE, COMPOSIÇÃO, E USOS DE UMA COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de ligante e uso das mesmas para modular a angiogênese e/ou a linfangiogênese.ISOLATED OR PURIFIED LIGAND-BINDING POLYPEPTIDE, LIGAND-BINDING MOLECULE, ISOLATED POLYNUCLEOTIDE, VECTOR, ISOLATED CELL OR CELL LINE, METHOD FOR PRODUCING A LIGAND-BINDING POLYPEPTIDE OR A LIGAND-BINDING MOLECULE, COMPOSITION, AND USES OF A COMPOSITION. The present invention relates to ligand-binding molecules and the use thereof to modulate angiogenesis and/or lymphangiogenesis.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

[001] Esta invenção refere-se, de modo geral, à modulação de crescimento de vaso, especialmente em oftalmologia e oncologia.[001] This invention generally relates to the modulation of vessel growth, especially in ophthalmology and oncology.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIASSEQUENCE LISTING

[002] A listagem eletrônica de sequências forma parte da descrição.[002] The electronic sequence listing forms part of the description.

ANTECEDENTESBACKGROUND

[003] As proteínas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores (VEGFRs) exercem papéis importantes na vasculogênese, no desenvolvimento da vasculatura embrionária de células endoteliais de diferenciação precoce, na angiogênese, o processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, e na linfangiogênese, o processo de formação de novos vasos linfáticos. As proteínas de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e seus receptores (PDGFRs) estão envolvidos na regulação da proliferação, sobrevivência e migração celular de diversos tipos de células.[003] Vascular endothelial growth factor (VEGF) proteins and their receptors (VEGFRs) play important roles in vasculogenesis, in the development of the embryonic vasculature of early differentiating endothelial cells, in angiogenesis, the process of formation of new blood vessels to from pre-existing vessels, and in lymphangiogenesis, the process of formation of new lymphatic vessels. Platelet-derived growth factor (PDGF) proteins and their receptors (PDGFRs) are involved in the regulation of cell proliferation, survival and migration of various cell types.

[004] A disfunção do sistema regulador de células endoteliais é uma característica importante de câncer e várias doenças associadas à vasculogênese, angiogênese e linfangiogênse anormais.[004] Dysfunction of the endothelial cell regulatory system is an important feature of cancer and several diseases associated with abnormal vasculogenesis, angiogenesis and lymphangiogenesis.

[005] A angiogênese ocorre no desenvolvimento embrionário e no crescimento, reparo e regeneração de tecido normal, no ciclo reprodutivo feminino, no estabelecimento e na manutenção da gravidez, no reparo de feridas e fraturas. Adicionalmente à angiogênese que ocorre no indivíduo adulto, os eventos angiogênicos estão envolvidos em diversos processos patológicos, notavelmente crescimento e metástase tumorais, e outras afecções em que a proliferação de vasos sanguíneos, especialmente do sistema microvascular, é aumentada, tal como retinopatia diabética, psoríase e artropatias. A inibição da angiogênese é útil na prevenção ou alívio desses processos patológicos ou retardamento da progressão dos mesmos.[005] Angiogenesis occurs in embryonic development and in the growth, repair and regeneration of normal tissue, in the female reproductive cycle, in the establishment and maintenance of pregnancy, in the repair of wounds and fractures. In addition to the angiogenesis that occurs in adults, angiogenic events are involved in several pathological processes, notably tumor growth and metastasis, and other conditions in which the proliferation of blood vessels, especially the microvascular system, is increased, such as diabetic retinopathy, psoriasis and arthropathies. Inhibition of angiogenesis is useful in preventing or alleviating these pathological processes or slowing their progression.

[006] Embora terapias direcionadas ao bloqueio de sinalização de VEGF/PDGF através de seus receptores tenham prometido inibição de angiogênese e crescimento tumoral, permanece uma necessidade de compostos e terapias novas ou aprimoradas para o tratamento de tais doenças.[006] Although therapies aimed at blocking VEGF/PDGF signaling through their receptors have promised inhibition of angiogenesis and tumor growth, there remains a need for new or improved compounds and therapies for the treatment of such diseases.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

[007] A presente invenção refere-se a composições inovadoras e métodos de uso das mesmas para a inibição de angiogênese, linfangiogênese anormal ou ambas, e inibição de outros efeitos de Fator C de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF-C) e Fator D de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF- D), cada um dos quais pode ligar pelo menos uma tirosina quinase receptora de fator de crescimento (isto é, VEGFR-2 ou VEGFR-3) e estimular sua fosforilação. As composições da invenção incluem moléculas de ligação de ligante que ligam um ou ambos dentre VEGF-C humano e VEGF-D humano. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende um polipeptídeo, por exemplo, um fragmento de um domínio extracelular (ECD) de tirosina quinase receptora de fator de crescimento. O fragmento pode variar a partir da sequência do tipo selvagem de formas que não eliminam a ligação de fator de crescimento e o fragmento, de preferência, é modificado das formas descritas no presente documento para aprimorar suas propriedades como um produto terapêutico para administração a sujeitos/pacientes que precisam.[007] The present invention relates to innovative compositions and methods of using them for inhibiting angiogenesis, abnormal lymphangiogenesis or both, and inhibiting other effects of Vascular Endothelial Growth Factor C (VEGF-C) and Vascular Endothelial Growth Factor D (VEGF-C) Vascular Endothelial Growth (VEGF-D), each of which can bind at least one growth factor receptor tyrosine kinase (i.e., VEGFR-2 or VEGFR-3) and stimulate its phosphorylation. The compositions of the invention include ligand binding molecules that bind one or both of human VEGF-C and human VEGF-D. In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises a polypeptide, for example, a fragment of a growth factor receptor tyrosine kinase extracellular domain (ECD). The fragment may vary from the wild-type sequence in ways that do not eliminate growth factor binding and the fragment preferably is modified in the ways described herein to enhance its properties as a therapeutic product for administration to subjects/ patients in need.

[008] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam tais moléculas de ligação de ligante. Os ácidos nucleicos são úteis para expressar as moléculas de ligação de ligante de polipeptídeo e também são úteis, em algumas modalidades, como um produto terapêutico para atingir expressão das moléculas de ligação de ligante de polipeptídeo in vivo, de uma forma biologicamente ativa.[008] The invention also provides nucleic acids that encode such ligand-binding molecules. Nucleic acids are useful for expressing polypeptide ligand binding molecules and are also useful, in some embodiments, as a therapeutic product for achieving expression of polypeptide ligand binding molecules in vivo in a biologically active manner.

[009] A administração das composições que compreendem uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento (ou polinucleotídeo que codifica a mesma) a pacientes que precisam da mesma inibe a estimulação de fator de crescimento de receptores de VEGF (por exemplo, inibe a fosforilação dos receptores) e, assim, inibe as respostas biológicas mediadas através de receptores, incluindo, porém, sem limitação, angiogênese mediada por VEGFR, linfangiogênese ou ambas.[009] Administration of compositions comprising a ligand-binding molecule described herein (or polynucleotide encoding the same) to patients in need thereof inhibits growth factor stimulation of VEGF receptors (e.g., inhibits phosphorylation of receptors) and thereby inhibits biological responses mediated through receptors, including, but not limited to, VEGFR-mediated angiogenesis, lymphangiogenesis, or both.

[010] VEGF-C e D ligam-se com alta afinidade a pelo menos um receptor VEGF, e estimulam a fosforilação do mesmo (ou heterodímero de receptor), selecionado dentre VEGFR-2 e VEGFR-3. Essa afirmação refere-se a propriedades bem conhecidas dos fatores de crescimento em relação a seus receptores cognatos e não pretende ser uma característica limitante por si só das moléculas de ligação de ligante da invenção. No entanto, as moléculas de ligação de ligante preferenciais da invenção fazem mais do que simplesmente ligar-se a seus fatores de crescimento alvo. Uma molécula de ligação de ligante preferencial também inibe o(s) fator(es) de crescimento ao qual se liga a partir de estimulação de fosforilação de pelo menos um (e, de preferência, todas) das tirosina quinases receptoras às quais o(s) fator(es) de crescimento se liga(m). A estimulação de fosforilação de tirosina é facilmente medida com o uso de ensaios baseados em célula in vitro e anticorpos antifosfotirosina. Devido ao fato de que a fosforilação das tirosina quinases receptoras é uma etapa inicial em uma cascata de sinalização, a mesma é um indicador conveniente de se a molécula de ligação de ligante pode inibir a transdução de sinal medida por fator de crescimento que leva à migração celular, crescimento celular e outras respostas. Diversos outros ensaios baseados em célula e in vivo podem ser usados para confirmar as propriedades de neutralização de fator de crescimento de moléculas de ligação de ligante da invenção.[010] VEGF-C and D bind with high affinity to at least one VEGF receptor, and stimulate its phosphorylation (or receptor heterodimer), selected from VEGFR-2 and VEGFR-3. This statement refers to well-known properties of growth factors in relation to their cognate receptors and is not intended to be a limiting characteristic in itself of the ligand-binding molecules of the invention. However, the preferred ligand binding molecules of the invention do more than simply bind to their target growth factors. A preferential ligand-binding molecule also inhibits the growth factor(s) to which it binds by stimulating phosphorylation of at least one (and preferably all) of the receptor tyrosine kinases to which it binds. ) growth factor(s) binds. Stimulation of tyrosine phosphorylation is easily measured using in vitro cell-based assays and antiphosphotyrosine antibodies. Because phosphorylation of receptor tyrosine kinases is an early step in a signaling cascade, it is a convenient indicator of whether the ligand-binding molecule can inhibit growth factor-mediated signal transduction that leads to migration. cellular, cell growth and other responses. Various other cell-based and in vivo assays can be used to confirm the growth factor neutralizing properties of ligand-binding molecules of the invention.

[011] As moléculas de ligação de ligante que são “específicas” para um fator de crescimento particular são as moléculas de ligação de ligante que reconhecem especificamente uma forma ativa do fator de crescimento (por exemplo, uma forma encontrada em circulação no corpo). De preferência, as moléculas de ligação de ligante ligam especificamente outras formas dos fatores de crescimento também. A título de exemplo, VEGF-C (e VEGF-D) é traduzido como uma pré-pró-molécula com pró-peptídeos de amino-terminal e carbóxi-terminal extensivos que são clivados para render uma forma “completamente processada” de VEGF-C (ou VEGF-D) que liga e estimula VEGFR-2 e VEGFR-3. As moléculas de ligação de ligante específicas para VEGF-C (ou VEGF-D) ligam- se pelo menos à forma completamente processada de VEGF-C (ou VEGF-D) e, de preferência, também se ligam às formas parcialmente processadas e formas não processadas.[011] Ligand-binding molecules that are “specific” for a particular growth factor are ligand-binding molecules that specifically recognize an active form of the growth factor (e.g., a form found circulating in the body). Preferably, the ligand binding molecules specifically bind other forms of the growth factors as well. By way of example, VEGF-C (and VEGF-D) is translated as a pre-promolecule with extensive amino-terminal and carboxy-terminal propeptides that are cleaved to yield a “completely processed” form of VEGF- C (or VEGF-D) that binds and stimulates VEGFR-2 and VEGFR-3. Ligand binding molecules specific for VEGF-C (or VEGF-D) bind at least the fully processed form of VEGF-C (or VEGF-D) and preferably also bind the partially processed forms and forms unprocessed.

[012] Em um aspecto, a molécula de ligação de ligante descrita no presente documento é um polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado que compreende uma primeira sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 115 de SEQ ID NO: 2 ou posições 25 a 115 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T (em que X representa qualquer aminoácido), em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre as famílias VEGF ou PDGF de fatores de crescimento, tal como VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D humanos. A SEQ ID NO: 2 contém uma sequência de aminoácidos para VEGFR-3 humano, com as posições 1 a 24 de SEQ ID NO: 2 correspondendo a um peptídeo sinal putativo e a posição 25 em diante de SEQ ID NO: 2 correspondendo a uma forma madura putativa do receptor que carece de um peptídeo sinal putativo. Os seguimentos precedentes de SEQ ID NO: 2 correspondem aproximadamente a ou incluem o primeiro domínio do tipo imunoglobulina do ECD de VEGFR-3 humano (“D1 de VEGFR-3”). Os construtos que compreende domínios do tipo Ig de VEGFR-3 ou outros receptores, fixados de uma maneira que resulta em um polipeptídeo de ligação de ligante, são especificamente contemplados, e os construtos que ligam ligantes diferentes são construídos por variação de componentes receptores usados para produzir o polipeptídeo de ligação de ligante. Em algumas variações, o polipeptídeo de ligação de ligante é baseado primariamente no domínio extracelular de VEGFR-3, e, em outras modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante é baseado em uma fusão de segmentos de outras tirosina quinases receptoras, tal como VEGFR-1 e/ou VEGFR-2 e/ou PDGFR-α e/ou PDGFR-β. Nas modalidades baseadas principalmente em VEGFR-3, o pelo menos um ligante é um ligante natural para VEGFR-3, tal como um polipeptídeo VEGF-C ou VEGF-D.[012] In one aspect, the ligand-binding molecule described herein is an isolated or purified ligand-binding polypeptide comprising a first amino acid sequence that is at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 115 of SEQ ID NO: 2 or positions 25 to 115 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T (wherein represents any amino acid), wherein the polypeptide binds to at least one linker polypeptide selected from the VEGF or PDGF families of growth factors, such as VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, Human PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C and PDGF-D. SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence for human VEGFR-3, with positions 1 to 24 of SEQ ID NO: 2 corresponding to a putative signal peptide and position 25 onwards of SEQ ID NO: 2 corresponding to a putative mature form of the receptor that lacks a putative signal peptide. The preceding segments of SEQ ID NO: 2 approximately correspond to or include the first immunoglobulin-like domain of the human VEGFR-3 ECD (“VEGFR-3 D1”). Constructs comprising Ig-like domains of VEGFR-3 or other receptors, attached in a manner that results in a ligand-binding polypeptide, are specifically contemplated, and constructs that bind different ligands are constructed by varying receptor components used to produce the ligand-binding polypeptide. In some variations, the ligand-binding polypeptide is based primarily on the extracellular domain of VEGFR-3, and, in other embodiments, the ligand-binding polypeptide is based on a fusion of segments of other receptor tyrosine kinases, such as VEGFR-3. 1 and/or VEGFR-2 and/or PDGFR-α and/or PDGFR-β. In embodiments based primarily on VEGFR-3, the at least one ligand is a natural ligand for VEGFR-3, such as a VEGF-C or VEGF-D polypeptide.

[013] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante compreende uma segunda sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos definida pelas posições 154 a 210 de SEQ ID NO:2 ou pelas posições 248 a 314 de SEQ ID NO:2, em que o resíduo N-terminal da segunda sequência de aminoácidos é conectado ao resíduo C-terminal da primeira sequência de aminoácidos ou diretamente ou através de um espaçador, em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre as famílias VEGF ou PDGF de fatores de crescimento, tais como VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D humanos. A sequência de aminoácidos definida pelas posições do polipeptídeo correspondentes às posições 154 a 210 corresponde aproximadamente a ou inclui o segundo domínio do tipo imunoglobulina do ECD de VEGFR-3 humano (“D2 de VEGFR- 3”). A sequência de aminoácidos definida pelas posições do polipeptídeo correspondentes às posições 248 a 314 corresponde aproximadamente a ou inclui o terceiro domínio do tipo imunoglobulina do ECD de VEGFR-3 humano (“D3 de VEGFR- 3”). Nos casos em que a segunda sequência de aminoácidos compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde aproximadamente a ou inclui D2 de VEGFR-3, é preferencial que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende uma terceira sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos definida pelas posições 248 a 314 de SEQ ID NO:2, em que o resíduo N- terminal da terceira sequência de aminoácidos é conectado ao resíduo C-terminal da segunda sequência de aminoácidos ou diretamente ou através de um espaçador, em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre as famílias VEGF ou PDGF de fatores de crescimento, tal como VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D humanos. Em outras palavras, nas modalidades em que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende sequências de aminoácidos que correspondem aproximadamente a ou que incluem o D1 e o D2 de VEGFR-3, é preferencial que o polipeptídeo de ligação de ligante também compreenda uma sequência de aminoácidos que corresponde aproximadamente a ou que inclui o D3 de VEGFR-3.[013] In some embodiments, the ligand-binding polypeptide comprises a second amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence defined by positions 154 to 210 of SEQ ID NO:2 or positions 248 to 314 of SEQ ID NO:2 , wherein the N-terminal residue of the second amino acid sequence is connected to the C-terminal residue of the first amino acid sequence either directly or through a spacer, wherein the polypeptide binds to at least one linker polypeptide selected from the VEGF families or PDGF from growth factors, such as human VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C and PDGF-D. The amino acid sequence defined by the polypeptide positions corresponding to positions 154 to 210 approximately corresponds to or includes the second immunoglobulin-like domain of the human VEGFR-3 ECD (“D2 of VEGFR-3”). The amino acid sequence defined by the polypeptide positions corresponding to positions 248 to 314 approximately corresponds to or includes the third immunoglobulin-like domain of the human VEGFR-3 ECD (“VEGFR-3 D3”). In cases where the second amino acid sequence comprises an amino acid sequence that approximately corresponds to or includes D2 of VEGFR-3, it is preferred that the ligand-binding polypeptide comprises a third amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%. %, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence defined by positions 248 to 314 of SEQ ID NO:2, in which the N-terminal residue of the third amino acid sequence is connected to the C-terminal residue of the second amino acid sequence either directly or through a spacer, in which the polypeptide binds to at least one binding polypeptide selected from the VEGF or PDGF families of growth factors, such as VEGF-A (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF- Human C and PDGF-D. In other words, in embodiments where the ligand-binding polypeptide comprises amino acid sequences that approximately correspond to or include D1 and D2 of VEGFR-3, it is preferred that the ligand-binding polypeptide also comprises an amino acid sequence which approximately corresponds to or includes D3 of VEGFR-3.

[014] Nas modalidades em que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende sequências de aminoácidos que correspondem aproximadamente a dois ou mais domínios de componente de VEGFR-3, os domínios de componente podem ser conectados diretamente um ao outro através de um ou mais espaçadores. De preferência, os domínios de componente são conectados por um ou mais espaçadores. Em uma modalidade, o espaçador compreende uma ou mais sequências de peptídeos entre os domínios de componente que têm entre 1 a 100 aminoácidos, de preferência, 1 a 50 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o espaçador entre dois domínios de componente consiste substancialmente entre sequências de peptídeos conectadas naturalmente ao domínio de componente em VEGFR-3 nativo.[014] In embodiments in which the ligand-binding polypeptide comprises amino acid sequences that approximately correspond to two or more VEGFR-3 component domains, the component domains can be directly connected to each other through one or more spacers. Preferably, the component domains are connected by one or more spacers. In one embodiment, the spacer comprises one or more peptide sequences between the component domains that are between 1 to 100 amino acids, preferably 1 to 50 amino acids in length. In one embodiment, the spacer between two component domains substantially consists of peptide sequences naturally connected to the component domain in native VEGFR-3.

[015] Nas modalidades em que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende sequências de aminoácidos que correspondem aproximadamente a ou que incluem domínios de componente contíguos de VEGFR-3 (por exemplo, D1-D2 ou D1-D2- D3), os domínios de componente são conectados através de um ou mais espaçadores que compreendem uma ou mais sequências de peptídeo entre os domínios de componente que têm entre 1 a 100 aminoácidos, de preferência, 1 a 50 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o espaçador entre dois domínios de componente consiste substancialmente em sequências de peptídeos que correspondem àquelas que conectam os respectivos domínios de componente contíguos no VEGFR-3 nativo. Em algumas modalidades, o espaçador entre dois domínios de componente contíguos compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos que conecta o domínio contíguo no VEGFR-3 nativo.[015] In embodiments in which the ligand-binding polypeptide comprises amino acid sequences that approximately correspond to or that include contiguous VEGFR-3 component domains (e.g., D1-D2 or D1-D2-D3), the component are connected through one or more spacers comprising one or more peptide sequences between the component domains that are between 1 to 100 amino acids, preferably 1 to 50 amino acids in length. In one embodiment, the spacer between two component domains substantially consists of peptide sequences that correspond to those connecting respective contiguous component domains in native VEGFR-3. In some embodiments, the spacer between two contiguous component domains comprises an amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96 %, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence connecting the contiguous domain in native VEGFR-3.

[016] Em uma modalidade, em que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende sequências de aminoácidos que correspondem aproximadamente a ou que incluem o D1 e o D2 de VEGFR-3, os domínios de componente D1 e D2 são conectados através de uma sequência de aminoácidos espaçadora que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 116 a 153 de SEQ ID NO: 2. Nos casos em que o polipeptídeo de ligação de ligante compreende sequências de aminoácidos que correspondem aproximadamente a e que incluem o D1, o D2 e o D3 de VEGFR-3, os domínios de componente D2 e D3 são conectados através de um espaçador sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 211 a 247 de SEQ ID NO: 2.[016] In one embodiment, in which the ligand-binding polypeptide comprises amino acid sequences that approximately correspond to or include D1 and D2 of VEGFR-3, the D1 and D2 component domains are connected through a sequence of spacer amino acids that are at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% , or at least 99% identity to the amino acid sequence defined by positions 116 to 153 of SEQ ID NO: 2. In cases where the ligand-binding polypeptide comprises amino acid sequences approximately corresponding to and including D1, D2 and D3 of VEGFR-3, the D2 and D3 component domains are connected through a spacer amino acid sequence that is at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity to the amino acid sequence defined by positions 211 to 247 of SEQ ID NO: 2.

[017] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 210 de SEQ ID NO: 2 ou posições 25 a 210 de SEQ ID NO: 2 ou posições 47 a 314 de SEQ ID NO: 2 ou posições 25 a 314 de SEQ ID NO: 2 ou posições 47 a 752 ou 47 a 775 de SEQ ID NO: 2 ou posições 25 a 752 ou 25 a 775 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T, em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre VEGF-A, VEGF-C, VEGF-C, VEGF-D e PlGF humanos. Em uma variação, o aminoácido correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por outro aminoácido (tal como glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina). As posições 47 a 210 incluem os primeiros dois domínios do tipo imunoglobulina do ECD de VEGFR-3 humano, assim como a sequência de ECD de VEGFR-3 entre os primeiros dois motivos do tipo Ig. As posições 47 a 314 incluem os primeiros três domínios do tipo imunoglobulina do ECD de VEGFR-3 humano, assim como a sequência de ECD de VEGFR-3 entre esses motivos do tipo Ig.[017] In some embodiments, the isolated or purified ligand-binding polypeptide comprises an amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to the amino acid sequence defined by positions 47 to 210 of SEQ ID NO: 2 or positions 25 to 210 of SEQ ID NO: 2 or positions 47 to 314 of SEQ ID NO: 2 or positions 25 to 314 of SEQ ID NO: 2 or positions 47 to 752 or 47 to 775 of SEQ ID NO: 2 or positions 25 to 752 or 25 to 775 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the positions of the polypeptide corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T, wherein the polypeptide binds to at least one ligand polypeptide selected from VEGF-A , human VEGF-C, VEGF-C, VEGF-D and PlGF. In one variation, the amino acid corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with another amino acid (such as glutamine, aspartate, glutamate, arginine and lysine). Positions 47 to 210 include the first two immunoglobulin-like domains of the human VEGFR-3 ECD, as well as the VEGFR-3 ECD sequence between the first two Ig-like motifs. Positions 47 to 314 include the first three immunoglobulin-like domains of the human VEGFR-3 ECD, as well as the VEGFR-3 ECD sequence between these Ig-like motifs.

[018] De modo mais geral, um polipeptídeo de ligação de ligante da invenção compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a um fragmento da sequência de aminoácidos de VEGFR- 3 apresentada na SEQ ID NO: 2, em que o amino-terminal do fragmento é qualquer aminoácido selecionado dentre as posições 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50 de SEQ ID NO: 2; e em que o terminal carbóxi do fragmento é qualquer aminoácido selecionado dentre as posições 110 a 775 de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, as posições 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762 ,763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775), com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T. Por razões que serão facilmente percebidas a partir da descrição no presente documento, a variação permitida não é uma variação que introduz novos sequons de glicosilação que não são encontrados em VEGFR-3 do tipo selvagem.[018] More generally, a ligand-binding polypeptide of the invention comprises an amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to a fragment of the VEGFR-3 amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the amino terminus of the fragment is any amino acid selected from positions 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 and 50 of SEQ ID NO: 2; and wherein the carboxy terminus of the fragment is any amino acid selected from positions 110 to 775 of SEQ ID NO: 2 (e.g., positions 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 7 74, 775), with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T. For reasons that will be readily apparent from the description herein, the permitted variation is not a variation that introduces new glycosylation sequons that are not found in wild-type VEGFR-3.

[019] Em outro aspecto, a molécula de ligação de ligante descrita no presente documento é um polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos definidas pelas posições do polipeptídeo correspondentes às posições 47 a 115 de SEQ ID NO: 2, 47 a 210 de SEQ ID NO: 2, 47 a 314 de SEQ ID NO: 2, 47 a 752 ou 47 a 775 de SEQ ID NO: 2, ou 25 a 752 ou 25 a 775 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T. Em uma variação, o aminoácido correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por outro aminoácido (tal como glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina).[019] In another aspect, the ligand-binding molecule described herein is an isolated or purified ligand-binding polypeptide comprising an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence defined by the positions of the polypeptide corresponding to positions 47 to 115 of SEQ ID NO: 2, 47 to 210 of SEQ ID NO: 2, 47 to 314 of SEQ ID NO: 2, 47 to 752 or 47 to 775 of SEQ ID NO: 2, or 25 to 752 or 25 to 775 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T. In one variation, the amino acid corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with another amino acid (such as glutamine, aspartate, glutamate, arginine and lysine).

[020] Em outro aspecto, a molécula de ligação de ligante descrita no presente documento é um polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 115 de SEQ ID NO: 2, em que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 são um sequon de glicosilação de VEGFR-3 putativo e em que o sequon de glicosilação putativo é eliminado da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de ligação de ligante. O termo “eliminado”, conforme usado nesse contexto, significa uma alteração da sequência de aminoácidos primária em pelo menos uma posição (por substituição, deleção ou inserção) para destruir o motivo de sequon N-X-T.[020] In another aspect, the ligand-binding molecule described herein is an isolated or purified ligand-binding polypeptide comprising an amino acid sequence that is at least 80%, or at least 85%, or at least 90 %, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 115 of SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are a putative VEGFR-3 glycosylation sequon and wherein the putative glycosylation sequon is deleted from the amino acid sequence of the polypeptide ligand binding. The term “deleted,” as used in this context, means an alteration of the primary amino acid sequence in at least one position (by substitution, deletion, or insertion) to destroy the N-X-T sequon motif.

[021] A invenção também inclui construtos de ligação de ligantes multiméricos que compreendem duas ou mais moléculas de ligação de ligante, conforme descrito no presente documento, fixadas de modo covalente ou não covalente uma a outra para formar uma estrutura dimérica ou multimérica. Em algumas variações, a fixação ocorre entre as sequências do tipo VEGFR-3 dos polipeptídeos de ligação de ligantes; em outras variações, a ligação ocorre entre polipeptídeos heterólogos ligados a uma ou ambas as sequências do tipo VEGFR-3.[021] The invention also includes multimeric ligand binding constructs comprising two or more ligand binding molecules, as described herein, covalently or non-covalently attached to each other to form a dimeric or multimeric structure. In some variations, attachment occurs between the VEGFR-3-like sequences of the ligand-binding polypeptides; in other variations, binding occurs between heterologous polypeptides linked to one or both VEGFR-3-like sequences.

[022] A referência no presente documento a uma molécula de ligação de ligante ou um polipeptídeo de ligação de ligante descrito no presente documento inclui a referência a variantes dos mesmos, conforme definido acima, com a condição de que tais polipeptídeos ou moléculas de ligação de ligante (seja monomérico, dimérico ou um multímero superior) contenham pelo menos um motivo do tipo Ig similar ou idêntico ao motivo 1 do tipo Ig de VEGFR-3 (por exemplo, cerca de 47 a 115 de SEQ ID NO: 2), com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 (que representa um sequon de glicosilação N-ligado na sequência de VEGFR-3 nativa) não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[022] Reference in this document to a ligand-binding molecule or a ligand-binding polypeptide described herein includes reference to variants thereof, as defined above, with the proviso that such polypeptides or ligand-binding molecules linker (whether monomeric, dimeric, or a higher multimer) contain at least one Ig-like motif similar or identical to VEGFR-3 Ig-like motif 1 (e.g., about 47 to 115 of SEQ ID NO: 2), with the condition that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 (which represents an N-linked glycosylation sequon in the native VEGFR-3 sequence) are not identical to N-X-S or N-X-T.

[023] Em outro aspecto, é descrita no presente documento uma molécula de ligação de ligante que é um polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado que compreende o primeiro domínio do tipo imunoglobulina de um polipeptídeo VEGFR-3ΔN2. Conforme usado no presente documento, o termo “polipeptídeo VEGFR-3ΔN2” refere-se a um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade à sequência de aminoácidos que define o ECD de VEGFR-3 humano, com a condição de que a porção da sequência de polipeptídeo que corresponde ao sequon de glicosilação putativa, NDT, tenha sofrido mutação de modo não se adeque mais ao motivo de SEQUON N-X-S/T, por exemplo, devido à substituição em uma das posições. Em algumas modalidades, o polipeptídeo purificado compreende os primeiros dois domínios do tipo imunoglobulina do polipeptídeo VEGFR-3ΔN2 e, de preferência, inclui a sequência VEGFR-3 entre esses domínios. Em algumas modalidades, o polipeptídeo purificado compreende os primeiros três domínios do tipo imunoglobulina do polipeptídeo VEGFR-3ΔN2 e, de preferência, inclui a sequência VEGFR-3 entre esses domínios.[023] In another aspect, herein described is a ligand-binding molecule that is an isolated or purified ligand-binding polypeptide comprising the first immunoglobulin-like domain of a VEGFR-3ΔN2 polypeptide. As used herein, the term “VEGFR-3ΔN2 polypeptide” refers to a polypeptide that has at least 95% identity to the amino acid sequence that defines the human VEGFR-3 ECD, with the proviso that the polypeptide sequence corresponding to the putative glycosylation sequon, NDT, has been mutated so that it no longer fits the N-X-S/T SEQUON motif, for example, due to substitution in one of the positions. In some embodiments, the purified polypeptide comprises the first two immunoglobulin-like domains of the VEGFR-3ΔN2 polypeptide and preferably includes the VEGFR-3 sequence between these domains. In some embodiments, the purified polypeptide comprises the first three immunoglobulin-like domains of the VEGFR-3ΔN2 polypeptide and preferably includes the VEGFR-3 sequence between these domains.

[024] Em ainda outro aspecto, é descrita no presente documento uma molécula de ligação de ligante que é um polipeptídeo que compreende um fragmento de ECD de VEGFR-3 humano, fundido a um parceiro de fusão em que a sequência de aminoácidos do fragmento de ECD de VEGFR-3 é modificada a partir de VEGFR-3 do tipo selvagem para eliminar o segundo sequon de glicosilação N-ligado putativo de VEGFR-3 do tipo selvagem, em que o polipeptídeo é solúvel em soro humano e liga VEGF-C humano ou VEGF-D humano; e em que o parceiro de fusão aprimora a solubilidade ou a meia-vida sérica do fragmento de ECD (por exemplo, em comparação a um fragmento idêntico que não é fundido a um parceiro de fusão). Em algumas modalidades, o parceiro de fusão é um polipeptídeo heterólogo.[024] In yet another aspect, herein described is a ligand binding molecule which is a polypeptide comprising a human VEGFR-3 ECD fragment, fused to a fusion partner in which the amino acid sequence of the VEGFR-3 fragment is ECD of VEGFR-3 is modified from wild-type VEGFR-3 to eliminate the second putative N-linked glycosylation sequon of wild-type VEGFR-3, in which the polypeptide is soluble in human serum and binds human VEGF-C or human VEGF-D; and wherein the fusion partner enhances the solubility or serum half-life of the ECD fragment (e.g., compared to an identical fragment that is not fused to a fusion partner). In some embodiments, the fusion partner is a heterologous polypeptide.

[025] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante ou molécula de ligação de ligante liga VEGF-C humano ou VEGF-D humano. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante ou a molécula de ligação de ligante inibe a ligação de VEGF-C ou VEGF-D a VEGFR-3 ou inibe a estimulação mediada por VEGF-C ou VEGF-D de VEGFR-3 em uma célula que expressa VEGFR-3 em sua superfície. A inibição de estimulação pode ser demonstrada, por exemplo, por medição de fosforilação de receptor, ou por medição de crescimento celular in vitro ou in vivo, ou por medição de crescimento de vaso ou outras alterações no nível de tecido in vivo.[025] In some embodiments, the ligand-binding polypeptide or ligand-binding molecule binds human VEGF-C or human VEGF-D. In some embodiments, the ligand-binding polypeptide or ligand-binding molecule inhibits the binding of VEGF-C or VEGF-D to VEGFR-3 or inhibits VEGF-C or VEGF-D-mediated stimulation of VEGFR-3 in a cell that expresses VEGFR-3 on its surface. Inhibition of stimulation can be demonstrated, for example, by measuring receptor phosphorylation, or by measuring cell growth in vitro or in vivo, or by measuring vessel growth or other changes at the tissue level in vivo.

[026] A molécula de ligação de ligante, de preferência, liga VEGF-C humano com uma Kd de cerca de 1 nM ou menos (por exemplo, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM ou menos). A molécula de ligação de ligante, de preferência, liga VEGF-D humano com um Kd de cerca de 5 nM ou menos (por exemplo, 2 nM, 1 nM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM ou menos).[026] The ligand binding molecule preferably binds human VEGF-C with a Kd of about 1 nM or less (e.g., 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM or less). The ligand-binding molecule preferably binds human VEGF-D with a Kd of about 5 nM or less (e.g., 2 nM, 1 nM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM or less).

[027] Em outro aspecto, a molécula de ligação de ligante purificada ou isolada compreende aminoácidos 22 a 290 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos 23 a 290 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos 23 a 537 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos 22 a 537 de SEQ ID NO: 3. Em ainda outras variações, a molécula compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a qualquer uma das sequências anteriores, com a condição de que a sequência da polipeptídeo que corresponde (alinha-se) ao sequon N2 de VEGFR-3 não é uma sequência de glicosilação.[027] In another aspect, the purified or isolated ligand binding molecule comprises amino acids 22 to 290 of SEQ ID NO: 3, amino acids 23 to 290 of SEQ ID NO: 3, amino acids 23 to 537 of SEQ ID NO: 3, amino acids 22 to 537 of SEQ ID NO: 3. In still other variations, the molecule comprises an amino acid sequence of at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95 %, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identical to any of the preceding sequences, with the proviso that the sequence of the polypeptide that corresponds (aligns) to the sequon N2 of VEGFR-3 is not a glycosylation sequence.

[028] Conforme descrito no presente documento, as moléculas de ligação de ligante podem ser modificadas quimicamente (por exemplo, glicosilação, peguilação, etc.) para conferir as características desejadas, enquanto mantêm suas propriedades de ligação de fator de crescimento específicas. Os domínios do tipo Ig I a III de VEGFR-3 compreendem cinco sítios de N-glicosilação putativos (referidos no presente documento como sequons N1, N2, N3, N4 e N5 de VEGFR-3, respectivamente). N1 corresponde aos aminoácidos 33 a 35 de SEQ ID NO: 2; N2 corresponde aos aminoácidos 104 a 106 de SEQ ID NO 2; N3 corresponde aos aminoácidos 166 a 168 de SEQ ID NO 2; N4 corresponde aos aminoácidos 251 a 253 de SEQ ID NO: 2 e N5 corresponde aos aminoácidos 299 a 301 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante descrita no presente documento compreende uma modificação no sequon N2 da molécula. Por exemplo, em algumas modalidades, o aminoácido na molécula de ligação de ligante que corresponde à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por outro aminoácido. Substituições conservadoras são preferenciais. Em algumas modalidades, o aminoácido que corresponde à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por outro aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina. Nas modalidades em que o sequon N2 de SEQ ID NO: 2 é modificado conforme descrito acima, os sequons N1, N3, N4 e N5 de SEQ ID NO: 2 são, de preferência, inalterados em termos de sequência de aminoácidos.[028] As described herein, ligand binding molecules can be chemically modified (e.g., glycosylation, pegylation, etc.) to impart desired characteristics, while maintaining their specific growth factor binding properties. The Ig-like domains I to III of VEGFR-3 comprise five putative N-glycosylation sites (referred to herein as VEGFR-3 sequons N1, N2, N3, N4, and N5, respectively). N1 corresponds to amino acids 33 to 35 of SEQ ID NO: 2; N2 corresponds to amino acids 104 to 106 of SEQ ID NO 2; N3 corresponds to amino acids 166 to 168 of SEQ ID NO 2; N4 corresponds to amino acids 251 to 253 of SEQ ID NO: 2 and N5 corresponds to amino acids 299 to 301 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, the ligand binding molecule described herein comprises a modification in sequon N2 of the molecule . For example, in some embodiments, the amino acid in the ligand binding molecule corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with another amino acid. Conservative substitutions are preferred. In some embodiments, the amino acid corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with another amino acid selected from the group consisting of glutamine, aspartate, glutamate, arginine and lysine. In embodiments in which sequon N2 of SEQ ID NO: 2 is modified as described above, sequons N1, N3, N4 and N5 of SEQ ID NO: 2 are preferably unchanged in terms of amino acid sequence.

[029] Conforme descrito no presente documento, as moléculas de ligação de ligante podem ser conectadas a um parceiro de fusão ou diretamente ou através de um elemento de ligação. Um parceiro de fusão pode ser qualquer componente heterólogo que intensifica a funcionalidade da molécula de ligação de ligante. Um parceiro de fusão de peptídeo exemplificativo compreende um fragmento de domínio constante de imunoglobulina (Fc). Em algumas modalidades, o fragmento constante de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade, ou que tem 100% de identidade aos aminoácidos 306 a 537 de SEQ ID NO: 3.[029] As described herein, ligand binding molecules can be connected to a fusion partner either directly or through a linker. A fusion partner can be any heterologous component that enhances the functionality of the ligand-binding molecule. An exemplary peptide fusion partner comprises an immunoglobulin constant domain (Fc) fragment. In some embodiments, the immunoglobulin constant fragment comprises an amino acid sequence that is at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96% , or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity, or which has 100% identity to amino acids 306 to 537 of SEQ ID NO: 3.

[030] Conforme descrito no presente documento, as moléculas de ligação de ligante podem ser modificadas quimicamente, por exemplo, para facilitar a conexão a um parceiro de fusão (tal como, por exemplo, um peptídeo heterólogo) ou conferir características desejadas (tal como, por exemplo, aumentar a meia-vida sérica, aumentar a solubilidade em um meio aquoso e possibilitar alvejamento a uma população de células específica, por exemplo, células tumorais ou células da retina tumor).[030] As described herein, ligand binding molecules can be chemically modified, for example, to facilitate connection to a fusion partner (such as, for example, a heterologous peptide) or impart desired characteristics (such as , for example, increasing serum half-life, increasing solubility in an aqueous medium and enabling targeting of a specific cell population, e.g. tumor cells or retinal tumor cells).

[031] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento compreende opcionalmente pelo menos uma porção química de PEG fixada à molécula. Por exemplo, em algumas modalidades, PEG de cerca de 20 a 40 kDa é fixado ao amino-terminal da molécula de ligação de ligante.[031] In some embodiments, a ligand-binding molecule described herein optionally comprises at least one PEG chemical moiety attached to the molecule. For example, in some embodiments, PEG of about 20 to 40 kDa is attached to the amino terminus of the ligand-binding molecule.

[032] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de ligante, conforme descrito no presente documento, compreende opcionalmente um elemento de ligação que conecta o parceiro de fusão, tal como, por exemplo, um peptídeo heterólogo ao polipeptídeo de ligação de ligante, tal como a sequência de elemento de ligação de fator Xa PIEGRGGGGG (SEQ ID NO: 4). Em outras modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende um polipeptídeo em que um aminoácido C- terminal do polipeptídeo de ligação de ligante está diretamente fixado a um aminoácido N-terminal do parceiro de fusão de peptídeo heterólogo por uma ligação peptídica. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de ligação de ligante e o peptídeo heterólogo são fixados (diretamente ou através de um polipeptídeo de elemento de ligação) por ligação amida para formar uma única cadeia polipeptídica.[032] In some embodiments, a ligand-binding molecule as described herein optionally comprises a linker that connects the fusion partner, such as, for example, a heterologous peptide to the ligand-binding polypeptide, such as as the factor Xa binding element sequence PIEGRGGGGG (SEQ ID NO: 4). In other embodiments, the ligand-binding molecule comprises a polypeptide in which a C-terminal amino acid of the ligand-binding polypeptide is directly attached to an N-terminal amino acid of the heterologous peptide fusion partner by a peptide bond. In some embodiments, the ligand-binding polypeptide and the heterologous peptide are attached (either directly or through a linker polypeptide) by amide bonding to form a single polypeptide chain.

[033] Em algumas variações, a molécula de ligação de ligante compreende um peptídeo sinal que direciona a secreção da molécula a partir de uma célula que expressa a molécula.[033] In some variations, the ligand-binding molecule comprises a signal peptide that directs secretion of the molecule from a cell that expresses the molecule.

[034] Os ácidos nucleicos (polinucleotídeos) da invenção incluem ácidos nucleicos que codificam moléculas de ligação de ligante de polipeptídeo, que podem ser usadas para tais aplicações como terapia de gene e expressão recombinante in vitro de moléculas de ligação de ligante de polipeptídeo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são purificados ou isolados. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreende adicionalmente uma sequência promotora conectada de modo operativo a um nucleotídeo sequência que codifica um polipeptídeo, em que a sequência promotora promove a transcrição da sequência que codifica o polipeptídeo em uma célula hospedeira. Os polinucleotídeos pode também compreender uma sequência sinal de poliadenilação. Em algumas variações, o ácido nucleico tem uma sequência de nucleotídeos de codificação similar a um ácido nucleico de codificação de VEGFR-3 humano do tipo selvagem. Por exemplo, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo de codificação que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de VEGFR-3 humano apresentada na SEQ ID NO: 1, ou a um fragmento da mesma. A título de exemplo, no contexto de uma sequência de nucleotídeos que codifica aminoácidos 47 a 314 de SEQ ID NO: 2, modificada no sequon N2, um ácido nucleico exemplificativo compreende uma sequência de nucleotídeos de codificação que tem pelo menos 80%, ou pelo menos 85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade à sequência de VEGFR-3 humano apresentada nas posições 157 a 961 de SEQ ID NO: 1, que correspondem aos códons 47 a 314.[034] The nucleic acids (polynucleotides) of the invention include nucleic acids that encode polypeptide ligand binding molecules, which can be used for such applications as gene therapy and in vitro recombinant expression of polypeptide ligand binding molecules. In some embodiments, the nucleic acids are purified or isolated. In some embodiments, the polynucleotides further comprise a promoter sequence operatively connected to a nucleotide sequence encoding a polypeptide, wherein the promoter sequence promotes transcription of the sequence encoding the polypeptide in a host cell. The polynucleotides may also comprise a polyadenylation signal sequence. In some variations, the nucleic acid has a coding nucleotide sequence similar to a wild-type human VEGFR-3 coding nucleic acid. For example, the nucleic acid comprises a coding nucleotide sequence that is at least 80%, or at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity to the human VEGFR-3 sequence shown in SEQ ID NO: 1, or to a fragment thereof. By way of example, in the context of a nucleotide sequence encoding amino acids 47 to 314 of SEQ ID NO: 2, modified in sequon N2, an exemplary nucleic acid comprises a nucleotide sequence encoding that is at least 80%, or at least at least 85%, or at least 90%, or at least 92%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98%, or at least 99% identity to the sequence of Human VEGFR-3 presented at positions 157 to 961 of SEQ ID NO: 1, which correspond to codons 47 to 314.

[035] Vetores que compreendem polinucleotídeos são também aspectos da invenção. Tais vetores podem compreender uma sequência de controle de expressão conectada de modo operativo à sequência que codifica o polipeptídeo. Em algumas variações, o vetor é selecionado para otimizar a expressão recombinante in vitro em uma célula hospedeira escolhida, tal como uma célula hospedeira eucariótica. Em algumas variações, o vetor é selecionado para entrega in vivo. Por exemplo, o vetor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um vetor de lentivírus, um vetor viral adenoassociado, um vetor adenoviral, um vetor lipossomal e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o vetor compreende um adenovírus de replicação deficiente, em que o dito adenovírus compreende o polinucleotídeo conectado de modo operacional a um promotor e flanqueado por sequências de polinucleotídeos adenovirais.[035] Vectors comprising polynucleotides are also aspects of the invention. Such vectors may comprise an expression control sequence operatively connected to the sequence encoding the polypeptide. In some variations, the vector is selected to optimize in vitro recombinant expression in a chosen host cell, such as a eukaryotic host cell. In some variations, the vector is selected for in vivo delivery. For example, the vector may be selected from the group consisting of a lentivirus vector, an adeno-associated viral vector, an adenoviral vector, a liposomal vector, and combinations thereof. In some embodiments, the vector comprises a replication-deficient adenovirus, wherein said adenovirus comprises the polynucleotide operatively connected to a promoter and flanked by adenoviral polynucleotide sequences.

[036] Células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, vetores e outros ácidos nucleicos, e métodos para usar as mesmas para expressão e isolar as moléculas de ligação de ligante são também aspectos da invenção. Células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) e outra linhagem de células de mamífero que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação de ligante ou uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento são especificamente contempladas. Em algumas variações, a linhagem de células é selecionada ou modificada para introduzir uma glicosilação humana ou do tipo humano em sequons de glicosilação de polipeptídeos produzidos nas células.[036] Host cells comprising polynucleotides, vectors and other nucleic acids, and methods for using them for expression and isolating ligand-binding molecules are also aspects of the invention. Eukaryotic host cells, including Chinese Hamster Ovary (CHO) cells and other mammalian cell lines that comprise a polynucleotide encoding a ligand-binding polypeptide or a ligand-binding molecule described herein are specifically contemplated. In some variations, the cell line is selected or modified to introduce human or human-like glycosylation into glycosylation sequons of polypeptides produced in the cells.

[037] Métodos para produzir um polipeptídeo ou uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento são também contempladas. (Tais métodos podem também ser descritos como usos dos polinucleotídeos ou das células da invenção.) Em um aspecto, o método compreende cultivar uma célula que foi transformada ou transfectada com um polinucleotídeo ou vetor descrito no presente documento sob condições em que o polipeptídeo de ligação de ligante ou molécula de ligação de ligante codificada pelo polinucleotídeo é expressa. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente purificar ou isolar o polipeptídeo de ligação de ligante ou a molécula de ligação de ligante a partir da célula ou a partir de um meio de crescimento da célula. Em algumas modalidades, o método inclui adicionalmente fixar um ou mais polietileno glicol (PEG) ou outras porções químicas ao polipeptídeo expresso e purificado/isolado.[037] Methods for producing a polypeptide or ligand-binding molecule described herein are also contemplated. (Such methods may also be described as uses of the polynucleotides or cells of the invention.) In one aspect, the method comprises culturing a cell that has been transformed or transfected with a polynucleotide or vector described herein under conditions in which the binding polypeptide of ligand or ligand-binding molecule encoded by the polynucleotide is expressed. In some embodiments, the method further comprises purifying or isolating the ligand-binding polypeptide or ligand-binding molecule from the cell or from a cell growth medium. In some embodiments, the method further includes attaching one or more polyethylene glycol (PEG) or other chemical moieties to the expressed and purified/isolated polypeptide.

[038] A invenção também inclui composições que compreendem um polipeptídeo, molécula de ligação de ligante ou ácido nucleico que codifica o mesmo, juntamente com um meio carreador, adjuvante ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição é formulada para administração local ao olho (por exemplo, uma formulação tópica, tal como uma pomada ou colírio, ou uma formulação adequada para injeção intravítrea). Em outras modalidades, a composição é formulada para administração local a um tumor ou ao órgão ou tecido do qual o tumor foi removido cirurgicamente, por exemplo, por injeção intravenosa ou injeção diretamente no tecido afetado, ou aplicação por meio de dispositivo durante a resseção do tumor.[038] The invention also includes compositions comprising a polypeptide, ligand-binding molecule or nucleic acid encoding the same, together with a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant or diluent. In some embodiments, the composition is formulated for local administration to the eye (e.g., a topical formulation, such as an ointment or eye drops, or a formulation suitable for intravitreal injection). In other embodiments, the composition is formulated for local administration to a tumor or to the organ or tissue from which the tumor was surgically removed, for example, by intravenous injection or injection directly into the affected tissue, or application via device during resection of the tumor. tumor.

[039] A invenção também inclui métodos para usar os materiais descritos no presente documento (polipeptídeos, moléculas e construtos, polinucleotídeos e vetores, células transformadas, composições) para inibir o crescimento de vaso (vaso sanguíneo e/ou vaso linfático) em contextos terapêuticos ou profiláticos. Os métodos de uso, conforme descritos no presente documento, podem ser alternativamente caracterizados como usos dos vários materiais para a indicação determinada. Os sujeitos exemplificativos para tratamento incluem humanos e outros primatas, gado (por exemplo, bovinos, equinos, porcinos), animais de zoológico (por exemplo, felinos, caninos, paquidermes, cervídeos) e animais de estimação (por exemplo, cães, gatos) e roedores.[039] The invention also includes methods for using the materials described herein (polypeptides, molecules and constructs, polynucleotides and vectors, transformed cells, compositions) to inhibit vessel growth (blood vessel and/or lymphatic vessel) in therapeutic contexts or prophylactic. The methods of use as described herein can alternatively be characterized as uses of the various materials for the given indication. Exemplary subjects for treatment include humans and other primates, livestock (e.g., cattle, equine, porcine), zoo animals (e.g., felines, canines, pachyderms, deer), and pets (e.g., dogs, cats). and rodents.

[040] Em algumas variações, a invenção inclui um método de inibição neovascularização em um sujeito, em que o método compreende administrar ao sujeito qualquer um dos materiais ou composições anteriores, em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização no sujeito. As afecções neovasculares patogênicas exemplificativas incluem aquelas dos olhos e neovascularização de tumor.[040] In some variations, the invention includes a method of inhibiting neovascularization in a subject, wherein the method comprises administering to the subject any of the above materials or compositions, in an amount effective to inhibit neovascularization in the subject. Exemplary pathogenic neovascular conditions include those of the eye and tumor neovascularization.

[041] Em algumas variações, a invenção inclui um método de inibição neovascularização de retina em um sujeito, em que o método compreende administrar ao sujeito materiais ou composições, conforme descritos no presente documento, em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização de retina no sujeito. Em variações relacionadas, a invenção inclui um método para tratar um sujeito que tem uma doença ocular associada com neovascularização de retina, em que o método compreende administrar ao sujeito um material ou composição, conforme descrito no presente documento e sumarizado acima, em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização de retina no sujeito. Por exemplo, uma composição, conforme descrito no presente documento, é administrada localmente ao olho do sujeito, tal como por colírio ou outra administração tópica, por administração subconjuntival (por exemplo, injeção), por injeção intravítrea ou por implante intravítreo.[041] In some variations, the invention includes a method of inhibiting retinal neovascularization in a subject, wherein the method comprises administering to the subject materials or compositions, as described herein, in an amount effective to inhibit retinal neovascularization in the subject. . In related variations, the invention includes a method for treating a subject who has an ocular disease associated with retinal neovascularization, wherein the method comprises administering to the subject a material or composition, as described herein and summarized above, in an effective amount. to inhibit retinal neovascularization in the subject. For example, a composition as described herein is administered locally to the subject's eye, such as by eye drops or other topical administration, by subconjunctival administration (e.g., injection), by intravitreal injection, or by intravitreal implant.

[042] As composições, de preferência, são administradas em uma quantidade e a uma frequência de dosagem repetida e duração eficaz para inibir que VEGF-C e/ou VEGF-D no olho do sujeito liguem-se a ou estimulem VEGFR-2 e/ou VEGFR-3 expressos em células do olho ou vasos do olho. Tal efeito benéfico pode ser medido em termos de retardamento ou interrupção da deterioração/progressão na afecção ocular patológica (tal como degeneração macular, retinopatia diabética e telangiectasia macular) ou aprimoramento em sintomas clínicos. O efeito benéfico também pode ser observável em termos de monitoramento de crescimento de vaso em e em torno do tecido alvejado.[042] The compositions, preferably, are administered in an amount and at a repeated dosage frequency and duration effective to inhibit VEGF-C and/or VEGF-D in the subject's eye from binding to or stimulating VEGFR-2 and /or VEGFR-3 expressed in cells of the eye or vessels of the eye. Such a beneficial effect can be measured in terms of delay or arrest of deterioration/progression in pathological eye disease (such as macular degeneration, diabetic retinopathy and macular telangiectasia) or improvement in clinical symptoms. The beneficial effect may also be observable in terms of monitoring vessel growth in and around the targeted tissue.

[043] Os métodos e os usos descritos no presente documento podem ser praticados em combinação com agentes terapêuticos ou tratamento adicionais (por exemplo, formas de radiação), conforme descrito no presente documento em detalhes.[043] The methods and uses described in this document can be practiced in combination with additional therapeutic agents or treatment (e.g., forms of radiation), as described in detail in this document.

[044] Os métodos (ou usos) da invenção descritos no presente documento podem ser executados com uma ou mais moléculas de ligação de ligante, ou com pelo menos uma molécula de ligação de ligante em combinação com outro agente terapêutico (tal como um padrão de produto terapêutico de cuidado para o tratamento de câncer ou para o tratamento de um distúrbio do fundo do olho). Nas modalidades em que as moléculas de ligação de ligante são para o tratamento de um distúrbio do fundo do olho, as terapias adicionais contempladas incluem tratamento com laser focal (ou fotocoagulação), tratamento com laser difuso (ou fotocoagulação panretinal) e vitrectomia. Em algumas modalidades, antibióticos são também administrados ao sujeito que recebe o tratamento.[044] The methods (or uses) of the invention described herein can be carried out with one or more ligand-binding molecules, or with at least one ligand-binding molecule in combination with another therapeutic agent (such as a pattern of therapeutic care product for the treatment of cancer or for the treatment of a disorder of the fundus of the eye). In embodiments where the ligand-binding molecules are for treating a fundus disorder, additional therapies contemplated include focal laser treatment (or photocoagulation), diffuse laser treatment (or panretinal photocoagulation), and vitrectomy. In some embodiments, antibiotics are also administered to the subject receiving the treatment.

[045] Nas modalidades em que as moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são para uso no tratamento de câncer, o padrão contemplado de agentes terapêuticos de cuidado inclui RNA antissenso, interferência de RNA, anticorpos biespecíficos, outros tipos de anticorpos e moléculas pequenas, por exemplo, agentes quimioterápicos, que alvejam fatores de crescimento e/ou seus receptores. Uma citocina, um agente radioterápico ou uma terapia por radiação pode ser também usada em combinação com uma molécula de ligação de ligante descrito no presente documento. O agente quimioterápico ou o agente radioterápico pode ser um membro da classe de agentes que inclui um antimetabólito; um agente de danificação de DNA; uma citocina ou um fator de crescimento; um fármaco de ligação covalente de DNA; um inibidor de topoisomerase; um agente antimicótico; um antibiótico antitumoral; um agente de diferenciação; um agente de alquilação; um agente de metilação; um hormônio ou um antagonista de hormônio; uma mostarda de nitrogênio; um radiossensibilizador; e um fotossensibilizador. Os exemplos específicos desses agentes são descritos em outra parte no pedido. As terapias de combinação são, de preferência, sinergéticas, mas não precisam ser, e as terapias aditivas são também consideradas aspectos da invenção.[045] In embodiments in which the ligand-binding molecules described herein are for use in treating cancer, the contemplated standard of care therapeutic agents includes antisense RNA, RNA interference, bispecific antibodies, other types of antibodies and molecules small, for example, chemotherapy agents, which target growth factors and/or their receptors. A cytokine, radiotherapeutic agent or radiation therapy can also be used in combination with a ligand-binding molecule described herein. The chemotherapeutic agent or radiotherapeutic agent may be a member of the class of agents that includes an antimetabolite; a DNA damaging agent; a cytokine or growth factor; a covalent DNA binding drug; a topoisomerase inhibitor; an antimycotic agent; an antitumor antibiotic; an agent of differentiation; an alkylating agent; a methylating agent; a hormone or a hormone antagonist; a nitrogen mustard; a radiosensitizer; and a photosensitizer. Specific examples of these agents are described elsewhere in the application. Combination therapies are preferably synergistic, but need not be, and additive therapies are also considered aspects of the invention.

[046] Adicionalmente a seu uso nos métodos, as moléculas de ligação de ligante podem ser combinadas ou empacotadas com outros agentes terapêuticos em kits ou como doses unitárias. As doenças neoplásticas não são as únicas doenças que podem ser tratadas com as moléculas de ligação de ligante. As moléculas de ligação de ligante podem ser usadas como agentes terapêuticos para qualquer doença associada à angiogênese ou linfangiogênese anormal.[046] In addition to their use in the methods, ligand binding molecules can be combined or packaged with other therapeutic agents in kits or as unit doses. Neoplastic diseases are not the only diseases that can be treated with ligand-binding molecules. Ligand-binding molecules can be used as therapeutic agents for any disease associated with abnormal angiogenesis or lymphangiogenesis.

[047] A invenção pode ser também descrita nas modalidades adicionais a seguir:[047] The invention can also be described in the following additional embodiments:

[048] Um polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 115 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T, em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre VEGF-C, VEGF-D e PlGF humanos.[048] An isolated or purified ligand-binding polypeptide comprising an amino acid sequence that has at least 95% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 115 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the positions of the polypeptide corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T, wherein the polypeptide binds to at least one binding polypeptide selected from human VEGF-C, VEGF-D and PlGF.

[049] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0048], que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 210 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[049] The ligand-binding polypeptide isolated or purified according to paragraph [0048], which comprises an amino acid sequence that has at least 95% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 210 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T.

[050] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0048], que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 314 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[050] The ligand-binding polypeptide isolated or purified according to paragraph [0048], which comprises an amino acid sequence that has at least 95% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 314 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T.

[051] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0048], que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade à sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 752 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 de SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[051] The ligand-binding polypeptide isolated or purified according to paragraph [0048], which comprises an amino acid sequence that has at least 95% identity to the amino acid sequence defined by positions 47 to 752 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T.

[052] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0051] que retém quatro sítios de sequon de N-glicosilação correspondentes às posições 33 a 35 de SEQ ID NO: 2, posições 251 a 253 de SEQ ID NO: 2 e posições 299 a 301 de SEQ ID NO: 2.[052] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0051] that retains four N-glycosylation sequon sites corresponding to positions 33 to 35 of SEQ ID NO: 2, positions 251 to 253 of SEQ ID NO: 2 and positions 299 to 301 of SEQ ID NO: 2.

[053] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0052], que é glicosilado nos ditos quatro sítios de sequon de N- glicosilação.[053] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to paragraph [0052], which is glycosylated at said four N-glycosylation sequon sites.

[054] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0053] que é um polipeptídeo solúvel.[054] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0053] which is a soluble polypeptide.

[055] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0054], que compreende uma sequência de aminoácidos que é idêntica à sequência de aminoácidos definidas pelas posições 47 a 115 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 210 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 314 de SEQ ID NO: 2 ou posições 47 a 752 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 da SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[055] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0054], which comprises an amino acid sequence that is identical to the amino acid sequence defined by positions 47 to 115 of SEQ ID NO : 2, positions 47 to 210 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 314 of SEQ ID NO: 2 or positions 47 to 752 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T.

[056] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0055] que liga VEGF-C humano ou VEGF-D humano.[056] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0055] that binds human VEGF-C or human VEGF-D.

[057] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0056], que inibe as ligações de VEGF-C ou VEGF-D a VEGFR-3 ou inibe estimulação mediada por VEGF-C ou VEGF-D de VEGFR-3 em uma célula que expressa VEGFR-3 na sua superfície.[057] The ligand-binding polypeptide isolated or purified according to paragraph [0056], which inhibits the binding of VEGF-C or VEGF-D to VEGFR-3 or inhibits VEGF-C or VEGF-D-mediated stimulation of VEGFR-3 in a cell that expresses VEGFR-3 on its surface.

[058] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0057] que liga VEGF-C humano com um Kd ou 1 nM ou menos.[058] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0057] that binds human VEGF-C with a Kd or 1 nM or less.

[059] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0057] que liga VEGF-C humano com um Kd ou 1 nM ou menos.[059] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0057] that binds human VEGF-C with a Kd or 1 nM or less.

[060] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0059], em que o aminoácido no polipeptídeo correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado ou substituído por outro aminoácido.[060] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0059], wherein the amino acid in the polypeptide corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted or replaced by another amino acid .

[061] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0055], em que o aminoácido na posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado ou substituído por outro aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste de glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina.[061] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to paragraph [0055], wherein the amino acid at position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted or replaced by another amino acid selected from the group consisting of glutamine , aspartate, glutamate, arginine and lysine.

[062] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0056], em que o polipeptídeo compreende aminoácidos 23 a 290 de SEQ ID NO: 3.[062] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0056], wherein the polypeptide comprises amino acids 23 to 290 of SEQ ID NO: 3.

[063] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0062], que compreende adicionalmente um peptídeo sinal.[063] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0062], which additionally comprises a signal peptide.

[064] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0063] compreende adicionalmente pelo menos uma porção polietileno glicol fixada ao polipeptídeo.[064] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0063] further comprises at least one polyethylene glycol moiety attached to the polypeptide.

[065] O polipeptídeo de ligação de ligante isolado ou purificado de acordo com o parágrafo [0064], que compreende polietileno glicol de cerca de 20 a 40 kDa fixado ao amino-terminal do polipeptídeo.[065] The isolated or purified ligand-binding polypeptide according to paragraph [0064], which comprises polyethylene glycol of about 20 to 40 kDa attached to the amino-terminus of the polypeptide.

[066] Uma molécula de ligação de ligante que compreende o polipeptídeo de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0065] conectado à um peptídeo heterólogo.[066] A ligand-binding molecule comprising the ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0065] connected to a heterologous peptide.

[067] A molécula de ligação de ligante de acordo com o parágrafo [0066], em que o peptídeo heterólogo compreende um fragmento de domínio constante de imunoglobulina.[067] The ligand-binding molecule according to paragraph [0066], wherein the heterologous peptide comprises an immunoglobulin constant domain fragment.

[068] A molécula de ligação de ligante de acordo com o parágrafo [0066], em que o fragmento de domínio constante de imunoglobulina é um fragmento de domínio constante de IgG.[068] The ligand binding molecule according to paragraph [0066], wherein the immunoglobulin constant domain fragment is an IgG constant domain fragment.

[069] A molécula de ligação de ligante de acordo com o parágrafo [0067], em que o fragmento constante de imunoglobulina compreende aminoácidos 306 a 537 de SEQ ID NO: 3.[069] The ligand-binding molecule according to paragraph [0067], wherein the immunoglobulin constant fragment comprises amino acids 306 to 537 of SEQ ID NO: 3.

[070] A molécula de ligação de ligante de acordo com o parágrafo 19, em que a molécula de ligação de ligante compreende aminoácidos 23 a 537 de SEQ ID NO: 3.[070] The ligand-binding molecule according to paragraph 19, wherein the ligand-binding molecule comprises amino acids 23 to 537 of SEQ ID NO: 3.

[071] A molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0070], que compreende opcionalmente um conector que conecta o peptídeo heterólogo ao polipeptídeo de ligação de ligante.[071] The ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [0070], which optionally comprises a connector that connects the heterologous peptide to the ligand-binding polypeptide.

[072] A molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0070] que compreende um polipeptídeo no qual um aminoácido C-terminal do polipeptídeo de ligação de ligante é diretamente fixado a um aminoácido N- terminal do peptídeo heterólogo por uma ligação peptídica.[072] The ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [0070] comprising a polypeptide in which a C-terminal amino acid of the ligand-binding polypeptide is directly attached to an N-terminal amino acid of the heterologous peptide by a peptide bond.

[073] A molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0072], que compreende adicionalmente um peptídeo sinal que direciona a secreção da molécula a partir de uma célula que expressa a molécula.[073] The ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [0072], which further comprises a signal peptide that directs secretion of the molecule from a cell expressing the molecule.

[074] A molécula de ligação de ligante de acordo com o parágrafo [0066], em que a molécula compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3.[074] The ligand binding molecule according to paragraph [0066], wherein the molecule comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

[075] A molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0070], em que o polipeptídeo de ligação de ligante e o peptídeo heterólogo são conectados por ligação amida para formar uma cadeia polipeptídica individual.[075] The ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [0070], wherein the ligand-binding polypeptide and the heterologous peptide are connected by amide bond to form an individual polypeptide chain.

[076] O polipeptídeo de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0065] ou a molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos 19 a 28 que compreende adicionalmente um marcador detectável.[076] The ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs [0048] to [0065] or the ligand-binding molecule according to any one of paragraphs 19 to 28 that additionally comprises a detectable label.

[077] Um conjugado que compreende o polipeptídeo de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18 ou a molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0075] e um agente quimioterápico.[077] A conjugate comprising the ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs 1 to 18 or the ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [0075] and a chemotherapeutic agent.

[078] Um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de codificação de nucleotídeo, o polipeptídeo de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18 ou a molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0066] a [0075].[078] An isolated polynucleotide comprising a nucleotide coding sequence, the ligand-binding polypeptide according to any one of paragraphs 1 to 18 or the ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0066] to [ 0075].

[079] O polinucleotídeo de acordo com o parágrafo [0078], que compreende adicionalmente uma sequência promotora conectada de modo operacional à sequência de codificação de nucleotídeo para promover a transcrição da sequência de codificação de nucleotídeo em uma célula hospedeira.[079] The polynucleotide according to paragraph [0078], which further comprises a promoter sequence operatively connected to the nucleotide coding sequence to promote transcription of the nucleotide coding sequence in a host cell.

[080] Um vetor que compreende o polinucleotídeo do parágrafo [0078] ou do parágrafo [0079].[080] A vector comprising the polynucleotide of paragraph [0078] or paragraph [0079].

[081] O vetor de acordo com o parágrafo [0080], que compreende adicionalmente uma sequência de controle de expressão conectada de modo operacional à sequência de codificação de nucleotídeo.[081] The vector according to paragraph [0080], which further comprises an expression control sequence operatively connected to the nucleotide coding sequence.

[082] O vetor de acordo com o parágrafo [0080], em que o dito vetor é selecionado a partir do grupo que consiste de um vetor de lentivírus, um vetor viral adenoassociado, um vetor adenoviral, um vetor lipossomal e combinações dos mesmos.[082] The vector according to paragraph [0080], wherein said vector is selected from the group consisting of a lentivirus vector, an adeno-associated viral vector, an adenoviral vector, a liposomal vector and combinations thereof.

[083] O vetor de acordo com o parágrafo [0080], em que o dito vetor compreende um adenovírus de replicação deficiente, em que o dito adenovírus compreende o polinucleotídeo conectado de modo operacional a um promotor e flanqueado por sequências de polinucleotídeos adenovirais.[083] The vector according to paragraph [0080], wherein said vector comprises a replication-deficient adenovirus, wherein said adenovirus comprises the polynucleotide operatively connected to a promoter and flanked by adenoviral polynucleotide sequences.

[084] Uma célula isolada ou linhagem de células transformada ou transfectada com um polinucleotídeo de acordo com o parágrafo [0078] ou [0079] ou com um vetor de acordo com o parágrafo [0080] a [0083].[084] An isolated cell or cell line transformed or transfected with a polynucleotide according to paragraph [0078] or [0079] or with a vector according to paragraph [0080] to [0083].

[085] A célula isolada ou linhagem de células de acordo com o parágrafo [0084] que é uma célula eucariótica.[085] The isolated cell or cell line according to paragraph [0084] that is a eukaryotic cell.

[086] A célula isolada ou linhagem de células de acordo com o parágrafo [0084] que é uma célula humana.[086] The isolated cell or cell line according to paragraph [0084] that is a human cell.

[087] A célula isolada ou linhagem de células de acordo com o parágrafo [0084], que é uma célula de Ovário de Hamster-Chinês (CHO).[087] The isolated cell or cell line according to paragraph [0084], which is a Chinese Hamster Ovary (CHO) cell.

[088] Um método para produzir um polipeptídeo de ligação de ligante que compreende cultivar uma célula de acordo com qualquer um dos parágrafos [0084] a [0087] sob condições em que o polipeptídeo de ligação de ligante ou molécula de ligação de ligante codificada pelo polinucleotídeo é expressa.[088] A method for producing a ligand-binding polypeptide comprising culturing a cell according to any one of paragraphs [0084] to [0087] under conditions in which the ligand-binding polypeptide or ligand-binding molecule encoded by the polynucleotide is expressed.

[089] O método de acordo com o parágrafo [0088], que compreende adicionalmente purificar ou isolar o polipeptídeo de ligação de ligante ou a molécula de ligação de ligante a partir da célula ou a partir de um meio de crescimento da célula.[089] The method according to paragraph [0088], which further comprises purifying or isolating the ligand-binding polypeptide or the ligand-binding molecule from the cell or from a cell growth medium.

[090] Uma composição que compreende um polipeptídeo purificado de ligação de ligantes ou molécula de ligação de ligante de acordo com qualquer um dos parágrafos [0048] a [0076] e um diluente, um adjuvante, um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceito.[090] A composition comprising a purified ligand-binding polypeptide or ligand-binding molecule according to any one of paragraphs [0048] to [0076] and a pharmaceutically accepted diluent, adjuvant, excipient or carrier.

[091] Uma composição que compreende um polinucleotídeo ou vetor de acordo com qualquer um dos parágrafos [0078] a [0083] e um diluente, um adjuvante, um excipiente ou um carreador farmaceuticamente aceito.[091] A composition comprising a polynucleotide or vector according to any one of paragraphs [0078] to [0083] and a pharmaceutically accepted diluent, adjuvant, excipient or carrier.

[092] A composição de acordo com o parágrafo [0090] ou parágrafo [0091], que é formulada para administração tópica.[092] The composition according to paragraph [0090] or paragraph [0091], which is formulated for topical administration.

[093] A composição de acordo com o parágrafo [0092], que está na forma de um sólido, uma pasta, uma pomada, um gel, um líquido, um aerossol, um borrifador, um polímero, uma película, uma emulsão ou uma suspensão.[093] The composition according to paragraph [0092], which is in the form of a solid, a paste, an ointment, a gel, a liquid, an aerosol, a spray, a polymer, a film, an emulsion or a suspension.

[094] A composição de acordo com o parágrafo [0090] ou parágrafo [0091], que é formulada para administração intravítrea.[094] The composition according to paragraph [0090] or paragraph [0091], which is formulated for intravitreal administration.

[095] Um método de inibição neovascularização em um sujeito, em que o método compreende administrar ao sujeito uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos [0090] a [0094] em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização no sujeito.[095] A method of inhibiting neovascularization in a subject, wherein the method comprises administering to the subject a composition according to any one of paragraphs [0090] to [0094] in an amount effective to inhibit neovascularization in the subject.

[096] Um método de inibição neovascularização de retina em um sujeito, em que o método compreende administrar ao sujeito uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos [0090] a [0094], em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização de retina no sujeito.[096] A method of inhibiting retinal neovascularization in a subject, wherein the method comprises administering to the subject a composition according to any one of paragraphs [0090] to [0094], in an amount effective to inhibit retinal neovascularization in the subject .

[097] Um método para tratar um sujeito que tem uma doença ocular associada com neovascularização de retina, em que o método compreende administrar ao sujeito uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos [0090] a [0095], em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização de retina no sujeito.[097] A method for treating a subject who has an ocular disease associated with retinal neovascularization, wherein the method comprises administering to the subject a composition according to any one of paragraphs [0090] to [0095], in an amount effective to inhibit retinal neovascularization in the subject.

[098] Uso de uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos [0090] a [0094] para inibir neovascularização, como neovascularização de retina ou neovascularização de tumor, em um sujeito com necessidade da mesma.[098] Use of a composition according to any one of paragraphs [0090] to [0094] to inhibit neovascularization, such as retinal neovascularization or tumor neovascularization, in a subject in need thereof.

[099] O método ou uso de acordo com qualquer um dos parágrafos [0096] a [0098], em que a composição é administrada localmente ao olho do sujeito.[099] The method or use according to any one of paragraphs [0096] to [0098], wherein the composition is administered locally to the subject's eye.

[0100] O método ou uso de acordo com o parágrafo [0099], em que a composição é administrada por injeção intravítrea.[0100] The method or use according to paragraph [0099], wherein the composition is administered by intravitreal injection.

[0101] O método ou uso de acordo com o parágrafo [0099], em que a composição é administrada por administração tópica.[0101] The method or use according to paragraph [0099], wherein the composition is administered by topical administration.

[0102] O método ou uso de acordo com qualquer um dos parágrafos [0096] a [00101], em que a composição é administrada em uma quantidade eficaz para inibir VEGF-C e/ou VEGF-D no olho do sujeito de se ligar ou estimular VEGFR-2 e/ou VEGFR-3 expressos nas células do olho ou vasos do olho.[0102] The method or use according to any one of paragraphs [0096] to [00101], wherein the composition is administered in an amount effective to inhibit VEGF-C and/or VEGF-D in the subject's eye from binding or stimulate VEGFR-2 and/or VEGFR-3 expressed in cells of the eye or vessels of the eye.

[0103] O método ou uso do parágrafo [0097] ou [0098], em que a doença ocular é selecionada a partir do grupo que consiste de degeneração macular, retinopatia diabética e telangiectasia macular.[0103] The method or use of paragraph [0097] or [0098], wherein the eye disease is selected from the group consisting of macular degeneration, diabetic retinopathy and macular telangiectasia.

[0104] O método ou uso de acordo com qualquer um dos parágrafos [0096] a [00103], que compreende adicionalmente administrar um antibiótico ao sujeito.[0104] The method or use according to any one of paragraphs [0096] to [00103], which further comprises administering an antibiotic to the subject.

[0105] O método de acordo com o parágrafo [00104], em que o antibiótico é selecionado a partir do grupo que consiste em amicacina, gentamicina, canamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, teicoplanina, vancomicina, azitromicina, claritromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, clozacilina, dicloxacilina, flucozacilina, meziocilina, nafcilina, penicilina, piperacilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, polimixina B, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, oflazacina, trovafloxacina, mafenida, sulfacetamida, sulfametizol, sulfassalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, cotrimoxazol, demeclociclina, soxiciclina, minociclina, oxitetraciclina e tetraciclina.[0105] The method according to paragraph [00104], wherein the antibiotic is selected from the group consisting of amikacin, gentamicin, kanamycin, neomycin, netilmycin, streptomycin, tobramycin, teicoplanin, vancomycin, azithromycin, clarithromycin, clarithromycin , dirithromycin, erythromycin, roxithromycin, troleandomycin, amoxicillin, ampicillin, azlocillin, carbenicillin, clozacillin, dicloxacillin, flucozacillin, meziocillin, nafcillin, penicillin, piperacillin, ticarcillin, bacitracin, colistin, polymyxin B, ciprofloxacin, enoxacin, gatifloxacin, levofloxa cin, lomefloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, oflazacin, trovafloxacin, mafenide, sulfacetamide, sulfamethizole, sulfasalazine, sulfisoxazole, trimethoprim, co-trimoxazole, demeclocycline, soxycycline, minocycline, oxytetracycline and tetracycline.

[0106] O método ou uso de acordo com o parágrafo [0095] ou [0098], em que o sujeito foi diagnosticado com um tumor, e em que a composição é administrada em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização no tumor.[0106] The method or use according to paragraph [0095] or [0098], wherein the subject has been diagnosed with a tumor, and wherein the composition is administered in an amount effective to inhibit neovascularization in the tumor.

[0107] O método ou uso de acordo com o parágrafo [00106], em que a composição é administrada localmente ao tumor ou ao órgão ou tecido a partir do qual o tumor foi cirurgicamente removido.[0107] The method or use according to paragraph [00106], wherein the composition is administered locally to the tumor or to the organ or tissue from which the tumor was surgically removed.

[0108] O método ou uso de acordo com o parágrafo [00106], em que a composição é administrada em uma quantidade eficaz para inibir VEGF-C e/ou VEGF-D no tumor do sujeito de se ligar ou estimular VEGFR-2 e/ou VEGFR-3 expresso em células tumorais.[0108] The method or use according to paragraph [00106], wherein the composition is administered in an amount effective to inhibit VEGF-C and/or VEGF-D in the subject's tumor from binding to or stimulating VEGFR-2 and /or VEGFR-3 expressed in tumor cells.

[0109] Este sumário da invenção não pretende ser limitante ou completo, e modalidades adicionais são descritas nos desenhos e na descrição detalhada, incluindo os exemplos. Todas tais modalidades são aspectos da invenção. Além disso, para fins de brevidade, vários detalhes que são aplicáveis a múltiplas modalidades não foram repetidos para cada modalidade. Várias combinações e reorganizações refletivas das modalidades descritas no presente documento destinam-se a ser aspectos da invenção. Adicionalmente ao anterior, a invenção inclui, como um aspecto adicional, todas as modalidades da invenção mais restritas em escopo de qualquer forma que as variações especificamente mencionadas acima. Por exemplo, para aspectos descritos como um gênero ou uma faixa, cada subgênero, subfaixa ou espécie é especificamente contemplado como uma modalidade da invenção.[0109] This summary of the invention is not intended to be limiting or complete, and additional embodiments are described in the drawings and detailed description, including examples. All such embodiments are aspects of the invention. Additionally, for brevity, several details that are applicable to multiple modalities have not been repeated for each modality. Various combinations and rearrangements reflective of the embodiments described herein are intended to be aspects of the invention. In addition to the foregoing, the invention includes, as a further aspect, all embodiments of the invention more restricted in scope in any way than the variations specifically mentioned above. For example, for aspects described as a genus or a range, each subgenus, subrange or species is specifically contemplated as an embodiment of the invention.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF FIGURES

[0110] A Figura 1A mostra os perfis de PK de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 produzidos por expressão de CHO transiente. A Figura 1B mostra os perfis de PK de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 produzidos por expressão de HEK transiente.[0110] Figure 1A shows the PK profiles of VGX-300 and VGX-301-ΔN2 produced by transient CHO expression. Figure 1B shows the PK profiles of VGX-300 and VGX-301-ΔN2 produced by transient HEK expression.

[0111] A Figura 2 demonstra que tanto VGX-300 como VGX-301-ΔN2 se ligam especificamente a tanto VEGF-C como VEGF-D.[0111] Figure 2 demonstrates that both VGX-300 and VGX-301-ΔN2 specifically bind to both VEGF-C and VEGF-D.

[0112] A Figura 3 mostra que VGX-300 bloquei a ligação e reticulação de VEGF-C e VEGF-D de a) VEGFR-2 e b) VEGFR-3.[0112] Figure 3 shows that VGX-300 blocked the binding and cross-linking of VEGF-C and VEGF-D of a) VEGFR-2 and b) VEGFR-3.

[0113] A Figura 4 mostra que VGX-300 e VGX-300- N2 bloqueiam a ligação e a reticulação de a) VEGF-C e b) VEGF-D de VEGFR-3 em um ensaio Ba/F3 baseado em célula. Os pontos de dados representam a média de n>2 ±SD.[0113] Figure 4 shows that VGX-300 and VGX-300-N2 block the binding and cross-linking of a) VEGF-C and b) VEGF-D of VEGFR-3 in a cell-based Ba/F3 assay. Data points represent the mean of n>2 ±SD.

[0114] A Figura 5 mostra a farmacocinética e a biodistribuição em coelhos após a administração intravítrea.[0114] Figure 5 shows pharmacokinetics and biodistribution in rabbits after intravitreal administration.

DESCRIÇÃO DETALHADADETAILED DESCRIPTION

[0115] A presente invenção é baseada em parte em pesquisas que demonstram que fragmentos do ECD de VEGFR-3 humano que têm um ou mais modificações em uma região de N- glicano do ECD podem ligar-se a e neutralizar VEGF-C humano e VEGF-D humano in vitro e pode também inibir o desenvolvimento de vasos em modelos animais de degeneração macular relacionada à idade.[0115] The present invention is based in part on research demonstrating that fragments of the human VEGFR-3 ECD that have one or more modifications in an N-glycan region of the ECD can bind to and neutralize human VEGF-C and VEGF -D human in vitro and may also inhibit vessel development in animal models of age-related macular degeneration.

[0116] As tirosina quinases receptoras de fator de crescimento compreende, de modo geral, três domínios principais: um domínio extracelular (ECD), um domínio de transmembrana e um domínio intracelular. O ECD liga ligantes, o domínio de transmembrana ancora o receptor a uma membrana celular e o domínio intracelular possui um ou mais domínio enzimáticos de tirosina quinase e interage com moléculas de transdução de sinal a jusante. Os receptores de fator de crescimento endoteliais vasculares (VEGFRs) ligam seu ligante através de seus ECDs, que são compreendidos por múltiplos domínios do tipo imunoglobulina (domínios do tipo Ig). Os domínios do tipo Ig são identificados no presente documento com o uso da designação “Dno”. Por exemplo, “D1” refere-se ao primeiro domínio do tipo Ig de um ECD de receptor particular. “D1 a 3” refere-se a um construto que tem pelo menos os primeiros três domínios do tipo Ig e sequência intermediária entre domínios 1 e 2 e 2 e 3, de uma molécula de ligação de ligante particular.[0116] Growth factor receptor tyrosine kinases generally comprise three main domains: an extracellular domain (ECD), a transmembrane domain and an intracellular domain. The ECD binds ligands, the transmembrane domain anchors the receptor to a cell membrane, and the intracellular domain has one or more tyrosine kinase enzymatic domains and interacts with downstream signal transduction molecules. Vascular endothelial growth factor receptors (VEGFRs) bind their ligand through their ECDs, which are comprised of multiple immunoglobulin-like domains (Ig-like domains). Ig-type domains are identified in this document using the designation “Dno”. For example, “D1” refers to the first Ig-like domain of a particular receptor ECD. “D1 to 3” refers to a construct that has at least the first three Ig-like domains and intermediate sequence between domains 1 and 2 and 2 and 3, of a particular ligand-binding molecule.

[0117] O ECD completo de VEGFRs não é exigido para ligação de ligante (fator de crescimento). O ECD de VEGFR-3 tem seis domínios do tipo Ig intactos e um domínio do tipo Ig clivado -- D5 de VEGFR-3 é clivado após tradução em subunidades ligadas por bissulfeto, deixando VEGFR-3. Veikkola, T., et al., Cancer Res. 60:203 a 212 (2000). Em algumas modalidades, os fragmentos de receptor que compreendem pelo menos os três primeiros domínios do tipo Ig para essa família são suficientes para ligar o ligante. Os receptores solúveis que pode ligar VEGF-C e VEGF-D, inibindo, assim, a atividade ou a sinalização de VEGF-C ou VEGF-D através de VEGFR-3, são também revelados nos documentos WO2000/023565, WO2000/021560, WO2002/060950 e WO2005/087808, cujas revelações são incorporadas em sua totalidade ao presente a título de referência. Aqueles receptores solúveis, modificados com a alteração de sequon ΔN2 e, opcionalmente, outras modificações descritas no presente documento, são contemplados como aspectos da invenção[0117] The complete ECD of VEGFRs is not required for ligand (growth factor) binding. The ECD of VEGFR-3 has six intact Ig-like domains and one cleaved Ig-like domain -- D5 of VEGFR-3 is posttranslationally cleaved into disulfide-linked subunits, leaving VEGFR-3. Veikkola, T., et al., Cancer Res. 60:203 to 212 (2000). In some embodiments, receptor fragments comprising at least the first three Ig-like domains for this family are sufficient to bind the ligand. Soluble receptors that can bind VEGF-C and VEGF-D, thereby inhibiting the activity or signaling of VEGF-C or VEGF-D through VEGFR-3, are also disclosed in WO2000/023565, WO2000/021560, WO2002/060950 and WO2005/087808, the disclosures of which are incorporated in their entirety herein by reference. Those soluble receptors, modified with the ΔN2 sequon change and, optionally, other modifications described herein, are contemplated as aspects of the invention.

[0118] A Tabela 1 define limites aproximados dos domínios do tipo Ig para VEGFR-3 humano. Esses limites são significativos já que os limites escolhidos podem ser usados para formar moléculas de ligação de ligante e assim podem influenciar as propriedades de ligação dos construtos resultantes. Tabela 1: Domínios do tipo imunoglobulina para [0118] Table 1 defines approximate limits of the Ig-like domains for human VEGFR-3. These thresholds are significant as the chosen thresholds can be used to form ligand-binding molecules and thus can influence the binding properties of the resulting constructs. Table 1: Immunoglobulin-like domains for

[0119] O ECD completo estende-se até cerca da posição 775 de SEQ ID NO: 2.[0119] The entire ECD extends to about position 775 of SEQ ID NO: 2.

[0120] Os construtos de receptor solúveis para uso como uma molécula de ligação de ligante para VEGF-C humano ou VEGF-D, de preferência, compreendem pelo menos um domínio do tipo Ig de VEGFR-3, conforme descrito na Tabela 1, até tantos quanto sete. A molécula de ligação de ligante opcionalmente incluirá uma sequência antes do domínio do tipo Ig posicionado de modo mais N-terminal, opcionalmente incluirá uma sequência além do domínio do tipo Ig mais C- terminal e opcionalmente incluirá uma sequência entre os domínios do tipo Ig também. Variantes, por exemplo, com uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos de um resíduo de aminoácido, são também contempladas. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende um fragmento de VEGFR-3 humano que compreende pelo menos os três primeiros domínios do tipo Ig de VEGFR-3 humano.[0120] Soluble receptor constructs for use as a ligand-binding molecule for human VEGF-C or VEGF-D preferably comprise at least one VEGFR-3 Ig-like domain as described in Table 1, up to as many as seven. The ligand-binding molecule will optionally include a sequence before the more N-terminally positioned Ig-like domain, optionally include a sequence beyond the more C-terminal Ig-like domain, and optionally include a sequence between the Ig-like domains as well. . Variants, for example, with one or more amino acid substitutions, additions or deletions of an amino acid residue, are also contemplated. In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises a fragment of human VEGFR-3 that comprises at least the first three Ig-like domains of human VEGFR-3.

[0121] Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é um polipeptídeo que compreende uma porção de um ECD de VEGFR-3 humano, em que a porção se liga a um ou ambos dentre VEGF-C humano e VEGF-D humano e compreende pelo menos o primeiro, o segundo e o terceiro domínios do tipo Ig do ECD de VEGFR-3, em que a sequência de aminoácidos do fragmento de ECD de VEGFR-3 é modificada a partir de VEGFR-3 do tipo selvagem para eliminar o segundo sequon de glicosilação N-ligado putativo de VEGFR-3 do tipo selvagem e em que o polipeptídeo carece de domínios do tipo Ig 4 a 7 de VEGFR-3 e, de preferência, qualquer domínio de transmembrana e, de preferência, qualquer domínio intracelular.[0121] In some embodiments, the ligand-binding molecule is a polypeptide comprising a portion of a human VEGFR-3 ECD, wherein the portion binds to one or both of human VEGF-C and human VEGF-D and comprises at least the first, second and third Ig-like domains of the VEGFR-3 ECD, wherein the amino acid sequence of the VEGFR-3 ECD fragment is modified from that of wild-type VEGFR-3 to eliminate the second putative N-linked glycosylation sequon of wild-type VEGFR-3 and wherein the polypeptide lacks Ig-like domains 4 to 7 of VEGFR-3 and preferably any transmembrane domain and preferably any intracellular domain .

[0122] Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende um polipeptídeo similar ou idêntico em sequência de aminoácidos a um polipeptídeo de VEGFR-3 humano (SEQ ID NO: 2) ou fragmento do mesmo, com a condição de que as posições da molécula de ligação de ligante correspondentes às posições 104 a 106 do polipeptídeo de VEGFR-3 humano apresentado em SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T, em que a molécula de ligação de ligante liga um ou mais fatores de crescimento selecionados a partir do grupo que consiste em VEGF-C humano e VEGF-D humano. I fragmento compreende minimamente o suficiente da sequência de VEGFR-3 para ligar o ligante e pode compreender o receptor completo. Fragmentos de ECD são preferenciais. Os polipeptídeos preferenciais têm uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a um fragmento de ligação de ligante dos mesmos. Os fragmentos que são mais similares, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%, são altamente preferenciais. Os fragmentos que são 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% e 75% são também contemplados. Um gênero de polipeptídeos similares pode ser alternativamente definido pela capacidade de codificar polinucleotídeos para hibridização ao complemento de uma sequência de nucleotídeos que corresponde à sequência de cDNA que codifica o receptor VEGFR-3.[0122] In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises a polypeptide similar or identical in amino acid sequence to a human VEGFR-3 polypeptide (SEQ ID NO: 2) or fragment thereof, with the proviso that the positions of the ligand-binding molecule corresponding to positions 104 to 106 of the human VEGFR-3 polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T, wherein the ligand-binding molecule binds one or more selected growth factors from the group consisting of human VEGF-C and human VEGF-D. The fragment comprises minimally enough of the VEGFR-3 sequence to bind the ligand and may comprise the entire receptor. ECD fragments are preferred. Preferred polypeptides have an amino acid sequence at least 80% identical to a ligand-binding fragment thereof. The fragments that are most similar, for example, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 100% , are highly preferred. Fragments that are 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% and 75% are also covered. A genus of similar polypeptides can alternatively be defined by the ability to encode polynucleotides for hybridization to the complement of a nucleotide sequence that corresponds to the cDNA sequence encoding the VEGFR-3 receptor.

[0123] O termo “identidade”, conforme conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, conforme determinada por comparação das sequências. Na técnica, “identidade” também significa o grau de afinidade de sequência de moléculas de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pela correlação entre cadeias de dois ou mais nucleotídeos ou duas ou mais sequências de aminoácidos. “Identidade” mede a porcentagem de correlações idênticas entre a menor dentre duas ou mais de sequências com alinhamento de lacunas (caso haja) endereçada por modelo matemático particular de um programa de computador (isto é, “algoritmos”). Os algoritmos apropriados para determinar as identidades percentuais da invenção incluem BLASTP e BLASTN, que usam os parâmetros-padrão mais comuns e aceitos.[0123] The term “identity”, as known in the art, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by comparing the sequences. In the art, "identity" also means the degree of sequence affinity of nucleic acid molecules or polypeptide sequences, as the case may be, as determined by the correlation between chains of two or more nucleotides or two or more amino acid sequences. “Identity” measures the percentage of identical correlations between the smallest of two or more gap-aligned sequences (if any) addressed by a computer program's particular mathematical model (i.e., “algorithms”). Appropriate algorithms for determining the percent identities of the invention include BLASTP and BLASTN, which use the most common and accepted standard parameters.

[0124] As moléculas de ligação de ligante podem ser também descritas como tendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% idêntica a um fragmento de SEQ ID NO: 1 que codifica um fragmento de ligação de ligante de VEGFR-3, com a condição de que as posições da molécula de ligação de ligante correspondentes às posições 104 a 106 do fragmento de ligação de ligante codificado de VEGFR-3 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T. Os fragmentos de ácido nucleico que são mais simulares, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%, são altamente preferenciais. Os fragmentos que são 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% e 75% são também contemplados. Por exemplo, uma molécula de ligação de ligante preferencial compreende uma sequência de aminoácidos que liga VEGF-C humano e/ou VEGF-D humano e que é codificada por uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza ao complemente de SEQ ID NO: 1 sob condições moderada ou altamente estringentes discutidas no presente documento.[0124] Ligand-binding molecules can also be described as having an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence at least 80% identical to a fragment of SEQ ID NO: 1 that encodes a ligand-binding fragment of VEGFR -3, with the proviso that the positions of the ligand-binding molecule corresponding to positions 104 to 106 of the VEGFR-3-encoded ligand-binding fragment are not identical to N-X-S or N-X-T. Nucleic acid fragments that are most simulated, e.g., 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% or 100%, are highly preferred. Fragments that are 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% and 75% are also covered. For example, a preferred ligand binding molecule comprises an amino acid sequence that binds human VEGF-C and/or human VEGF-D and that is encoded by a nucleotide sequence that hybridizes to the complement of SEQ ID NO: 1 under conditions moderate or highly stringent conditions discussed in this document.

[0125] Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende um polipeptídeo que compreende um fragmento de VEGFR-3 humano (SEQ ID NO: 2) selecionado a partir do grupo que consiste nas posições 1 a 226 ou 25 a 226 de SEQ ID NO: 2, posições 1 a 229 ou 25 a 229 de SEQ ID NO: 2 e posições 1 a 329 a 25 a 229 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições 104 a 106 do fragmento de ligação de ligante codificado de VEGFR-3 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é um polipeptídeo que compreende um fragmento de VEGFR-3 humano (SEQ ID NO: 2) selecionado a partir do grupo que consiste nas posições 47 a 224 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 225 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 226 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 227 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 228 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 229 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 230 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 231 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 232 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 236 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 240 de SEQ ID NO: 2 e posições 47 a 245 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições 104 a 106 do fragmento de ligação de ligante codificado de VEGFR-3 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é um polipeptídeo que compreende um fragmento de VEGFR-3 humano (SEQ ID NO: 2) selecionado a partir do grupo que consiste nas posições 47 a 314 de SEQ ID NO: 2, posições 47 a 210 de SEQ ID NO: 2 e posições 47 a 247 de SEQ ID NO: 2, com a condição de que as posições 104 a 106 do fragmento de ligação de ligante codificado de VEGFR-3 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.[0125] In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises a polypeptide comprising a fragment of human VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2) selected from the group consisting of positions 1 to 226 or 25 to 226 of SEQ ID NO: 2, positions 1 to 229 or 25 to 229 of SEQ ID NO: 2 and positions 1 to 329 to 25 to 229 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that positions 104 to 106 of the VEGFR-3 encoded ligand are not identical to N-X-S or N-X-T. In some embodiments, the ligand-binding molecule is a polypeptide comprising a fragment of human VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2) selected from the group consisting of positions 47 to 224 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 225 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 226 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 227 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 228 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 229 of SEQ ID NO : 2, positions 47 to 230 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 231 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 232 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 236 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 240 of SEQ ID NO: 2 and positions 47 to 245 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that positions 104 to 106 of the VEGFR-3 encoded ligand binding fragment are not identical to N-X-S or N-X-T. In some embodiments, the ligand-binding molecule is a polypeptide comprising a fragment of human VEGFR-3 (SEQ ID NO: 2) selected from the group consisting of positions 47 to 314 of SEQ ID NO: 2, positions 47 to 210 of SEQ ID NO: 2 and positions 47 to 247 of SEQ ID NO: 2, with the proviso that positions 104 to 106 of the VEGFR-3 encoded ligand binding fragment are not identical to N-X-S or N-X-T.

[0126] As moléculas de ligação de ligante podem ser também descritas como tendo uma sequência de aminoácidos que é similar ou idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3. Os polipeptídeos preferenciais têm uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3, com a condição de que as posições 80 a 82 do polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 3 não sejam idênticas a N-X-S ou N- X-T, em que a molécula de ligação de ligante liga um ou mais fatores de crescimento selecionados a partir do grupo que consiste em VEGF-C humano e VEGF-D humano. Os polipeptídeos que são mais similares, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100%, são altamente preferenciais. Os fragmentos que são 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% e 75% são também contemplados. Um gênero de polipeptídeos similares pode ser alternativamente definido pela capacidade de codificar polinucleotídeos para hibridização ao complemento de uma sequência de nucleotídeos que corresponde à sequência de cDNA que codifica o receptor VEGFR-3.[0126] Ligand binding molecules can also be described as having an amino acid sequence that is similar or identical to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Preferred polypeptides have an amino acid sequence that is at least 80% identical to that amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, with the proviso that positions 80 to 82 of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 3 are not identical to N-X-S or N-X-T, in which the ligand binding molecule binds a or more growth factors selected from the group consisting of human VEGF-C and human VEGF-D. The polypeptides that are most similar, for example, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 100% , are highly preferred. Fragments that are 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% and 75% are also covered. A genus of similar polypeptides can alternatively be defined by the ability to encode polynucleotides for hybridization to the complement of a nucleotide sequence that corresponds to the cDNA sequence encoding the VEGFR-3 receptor.

[0127] Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende uma sequência de aminoácidos que compreende aminoácidos 22 a 290 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende uma sequência de aminoácidos que compreende aminoácidos 23 a 290 de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante compreende aminoácidos 22 a 537 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos 23 a 537 de SEQ ID NO: 3 ou aminoácidos 1 a 537 de SEQ ID NO: 3.[0127] In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises an amino acid sequence comprising amino acids 22 to 290 of SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the ligand-binding molecule comprises an amino acid sequence comprising amino acids 23 to 290 of SEQ ID NO: 3. In some embodiments, the ligand binding molecule comprises amino acids 22 to 537 of SEQ ID NO: 3, amino acids 23 to 537 of SEQ ID NO: 3, or amino acids 1 to 537 of SEQ ID NO: : 3.

[0128] O termo “domínio de componente”, conforme usado no presente documento, refere-se a um domínio dentro de uma molécula de ligação de ligante que é derivado de ou baseado em um domínio de proteína dentro da porção extracelular de uma proteína receptora. Por exemplo, cada domínio de Ig de VEGFR-3 (D1 a D7) e outros membros da família de receptores tirosina quinase (por exemplo, tal como VEGFR-1 e VEGFR-2) constituem domínios de componente. A referência no presente documento a um domínio de componente inclui tanto o domínio do tipo selvagem nativo completo como também variantes por inserção, deleção e/ou substituição do mesmo que podem reter substancialmente as características funcionais do domínio intacto. Será facilmente percebido por um versado na técnica que podem ser obtidas inúmeras variantes dos domínios acima (por exemplo, domínios de Ig) que reterão substancialmente as mesmas características funcionais que o domínio do tipo selvagem.[0128] The term “component domain”, as used herein, refers to a domain within a ligand-binding molecule that is derived from or based on a protein domain within the extracellular portion of a receptor protein. . For example, each Ig domain of VEGFR-3 (D1 to D7) and other members of the receptor tyrosine kinase family (e.g., such as VEGFR-1 and VEGFR-2) constitute component domains. Reference herein to a component domain includes both the complete native wild-type domain and also insertion, deletion and/or substitution variants thereof that may substantially retain the functional characteristics of the intact domain. It will be readily appreciated by one skilled in the art that numerous variants of the above domains (e.g., Ig domains) can be obtained that will retain substantially the same functional characteristics as the wild-type domain.

[0129] Os receptores de fator de crescimento, dos quais as moléculas de ligação de ligante podem ser derivadas, incluem variantes de emenda e variações alélicas de ocorrência natural. As variações alélicas são bem conhecidas na técnica e presentam formas alternativas ou uma sequência de ácidos nucleicos que compreende substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos, mas que não resultam em qualquer alteração funcional substancial do polipeptídeo codificado. As variantes alélicas exemplificativas de VEGFR-3 foram relatadas na literatura, por exemplo, em http<colon>//www.uniprot.org/uniprot/P35916, e incluem as posições 149, 378, 494, 527 e 641 dentro do ECD. Os métodos-padrão podem ser facilmente usados para gerar tais polipeptídeos, incluindo mutagênese direcionada por sítio de polinucleotídeos ou clivagem ou ligação enzimática específica. Similarmente, é contemplado o uso de compostos peptidomiméticos ou compostos em que um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos por um aminoácido de ocorrência não natural ou um análogo de aminoácido que retém atividade de ligação. De preferência, nos casos em que substituição de aminoácido é usada, a substituição é conservadora, isto é, um aminoácido é substituído por um de tamanho similar e com propriedades de carga similares. Conforme usado no presente documento, o termo “substituição conservadora” denota a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo biologicamente similar. Os exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina, norleucina ou metionida por outro ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina e similares. Os aminoácidos hidrofílicos neutros que podem ser substituídos um pelo outro incluem asparagina, glutamina, serina e treonina. O termo “substituição conservadora” também inclui o uso de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido não substituído.[0129] Growth factor receptors, from which ligand-binding molecules can be derived, include naturally occurring splice variants and allelic variations. Allelic variations are well known in the art and present alternative forms or a nucleic acid sequence that comprises substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, but which do not result in any substantial functional alteration of the encoded polypeptide. Exemplary allelic variants of VEGFR-3 have been reported in the literature, for example at http<colon>//www.uniprot.org/uniprot/P35916, and include positions 149, 378, 494, 527 and 641 within the ECD. Standard methods can be readily used to generate such polypeptides, including site-directed mutagenesis of polynucleotides or specific enzymatic cleavage or ligation. Similarly, the use of peptidomimetic compounds or compounds in which one or more amino acid residues are replaced by a non-naturally occurring amino acid or an amino acid analogue that retains binding activity is contemplated. Preferably, in cases where amino acid substitution is used, the substitution is conservative, that is, one amino acid is replaced by one of similar size and with similar charge properties. As used herein, the term “conservative substitution” denotes the replacement of an amino acid residue with another biologically similar residue. Examples of conservative substitutions include replacing one hydrophobic residue such as isoleucine, valine, leucine, alanine, cysteine, glycine, phenylalanine, proline, tryptophan, tyrosine, norleucine or methionide with another or replacing one polar residue with another. such as replacing arginine with lysine, glutamic acid with aspartic acid or glutamine with asparagine and the like. Neutral hydrophilic amino acids that can be substituted for one another include asparagine, glutamine, serine, and threonine. The term “conservative substitution” also includes the use of a substituted amino acid in place of an unsubstituted amino acid.

[0130] Alternativamente, os aminoácidos conservadores podem ser agrupados conforme descrito em Lehninger, (Biochemistry, Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY:NY, páginas 71 a 77 (1975)) conforme apresentado no seguinte:[0130] Alternatively, conservative amino acids can be grouped as described in Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY, pages 71 to 77 (1975)) as presented in the following:

[0131] Não polar (hidrofóbico) B. Alifático: A, L, I, V, P, C. Aromático: F, W, D. Contendo enxofre: M, E. Limítrofe: G.[0131] Non-polar (hydrophobic) B. Aliphatic: A, L, I, V, P, C. Aromatic: F, W, D. Sulfur-containing: M, E. Borderline: G.

[001] Polar não carregado A. Hidroxila: S, T, Y, B. Amidas: N, Q, C. Sulfidrila: C, D. Limítrofe: G.[001] Uncharged polar A. Hydroxyl: S, T, Y, B. Amides: N, Q, C. Sulfhydryl: C, D. Borderline: G.

[002] Carregado positivamente (Básico): K, R, H.[002] Positively charged (Basic): K, R, H.

[003] Carregado negativamente (Ácido): D, E.[003] Negatively charged (Acid): D, E.

[004] Para evitar dúvidas, “domínio de componente” inclui um domínio correspondente a D1 de VEGFR-3 em que o motivo de sequon N-X-S/T na posição 104 a 106 de SEQ ID No: 2 sofreu mutação, por exemplo, devido à substituição.[004] For the avoidance of doubt, “component domain” includes a domain corresponding to D1 of VEGFR-3 in which the N-X-S/T sequon motif at position 104 to 106 of SEQ ID No: 2 has been mutated, for example, due to replacement.

[005] Nas modalidades em que a molécula de ligação de ligante compreende múltiplos domínios de componente, por exemplo, domínios de componente D1, D2 e D3 de VEGFR-3, os domínios de componente podem estar diretamente conectados um ao outro ou podem estar conectados através de um ou mais espaçadores. De modo geral, o termo “espaçador” significa uma ou mais moléculas, por exemplo, ácidos nucleicos ou aminoácidos, ou porções químicas de não peptídeo, tais como pontes de polietileno glicol ou bissulfeto, que podem ser inseridas entre um ou mais domínios de componentes que formam uma ligação covalente. As sequências espaçadoras podem ser usadas para fornecer um sítio desejável de interesse entre componentes para facilitar a manipulação. Um espaçador pode ser também fornecido para intensificar a expressão do polipeptídeo de ligação de ligante a partir de uma célula hospedeira, para diminuir o impedimento estérico de modo que o componente ou o grupo de componente possa assumir sua estrutura terciária ideal e/ou interagir apropriadamente com sua molécula alvo. Para espaçadores e métodos para identificar espaçadores desejáveis, consultar, por exemplo, George et al. (2003) Protein Engineering 15:871 a 879, incorporado especificamente a título de referência. Uma sequência espaçadora pode incluir um ou mais aminoácidos conectados naturalmente a um componente receptor, ou pode ser uma sequência adicionada usada para intensificar a expressão do polipeptídeo de ligação de ligante, fornecer sítios especificamente desejados de interesse, permitir domínios de componente para formar estruturas terciárias ideais e/ou intensificar a interação de um componente ou um grupo de componente com sua molécula alvo. Em uma modalidade, o espaçador compreende uma ou mais sequências de peptídeos entre um ou mais componentes que têm entre 1 a 100 aminoácidos, de preferência, 1 a 50 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade preferencial, o espaçador entre dois domínios de componente consiste substancialmente em aminoácidos conectados naturalmente ao componente receptor no receptor do tipo selvagem. No caso de uma molécula de ligação de ligante que compreende múltiplos domínios de componente do mesmo receptor cujos domínios são adjacentes um ao outro no receptor nativo, tal como, por exemplo, D1, D2 e D3 de VEGFR-3, em uma modalidade, os domínios são conectados um ao outro (por exemplo, D1 a D2 e D2 a D3) com o uso de espaçadores correspondentes às sequências de ligação de aminoácido de ocorrência natural.[005] In embodiments in which the ligand-binding molecule comprises multiple component domains, e.g., D1, D2, and D3 component domains of VEGFR-3, the component domains may be directly connected to each other or may be connected through one or more spacers. Generally, the term “spacer” means one or more molecules, e.g., nucleic acids or amino acids, or non-peptide chemical moieties, such as polyethylene glycol or disulfide bridges, that may be inserted between one or more component domains. that form a covalent bond. Spacer sequences can be used to provide a desirable site of interest between components to facilitate manipulation. A spacer may also be provided to enhance expression of the ligand-binding polypeptide from a host cell, to decrease steric hindrance so that the component or group of components can assume its ideal tertiary structure and/or interact appropriately with its target molecule. For spacers and methods for identifying desirable spacers, see, for example, George et al. (2003) Protein Engineering 15:871 to 879, specifically incorporated by reference. A spacer sequence may include one or more amino acids naturally connected to a receptor component, or may be an added sequence used to enhance expression of the ligand-binding polypeptide, provide specifically desired sites of interest, allow component domains to form ideal tertiary structures. and/or intensify the interaction of a component or group of components with its target molecule. In one embodiment, the spacer comprises one or more peptide sequences between one or more components that are between 1 to 100 amino acids, preferably 1 to 50 amino acids in length. In a preferred embodiment, the spacer between two component domains substantially consists of amino acids naturally connected to the receptor component in the wild-type receptor. In the case of a ligand-binding molecule comprising multiple component domains of the same receptor whose domains are adjacent to each other in the native receptor, such as, for example, D1, D2 and D3 of VEGFR-3, in one embodiment, the Domains are connected to each other (e.g., D1 to D2 and D2 to D3) with the use of spacers corresponding to naturally occurring amino acid binding sequences.

[006] Em algumas variações, cada polipeptídeo de ligação de ligante é expresso como uma fusão com uma proteína parceira de fusão, tal como uma região constante de imunoglobulina, e os parceiros de fusão heterólogos são ligados para formar a molécula de ligação de ligante. Multímeros,Componentes de Multimerização, Parceiros de fusão e Elementos de ligação[006] In some variations, each ligand-binding polypeptide is expressed as a fusion with a fusion partner protein, such as an immunoglobulin constant region, and the heterologous fusion partners are linked to form the ligand-binding molecule. Multimers, Multimerization Components, Fusion Partners and Binding Elements

[007] O parceiro de fusão é qualquer componente heterólogo que intensifica a funcionalidade da molécula de ligação de ligante. Portanto, por exemplo, um parceiro de fusão pode aumentar a solubilidade, modular a liberação, facilitar o alvejamento de tipos de célula ou tecido particulares, intensificar a atividade biológica, auxiliar a produção e/ou recuperação, intensificar uma propriedade farmacológica ou intensificar um perfil farmacocinético (PK) do polipeptídeo de ligação de ligante. Em relação a intensificar o perfil de PK, isso pode ser atingido por, por exemplo, intensificação da meia-vida sérica, penetrabilidade de tecido, falta de imunogenicidade ou estabilidade da molécula de ligação de ligante. Em modalidades preferenciais, um parceiro de fusão é selecionado a partir do grupo que consiste em um componente de multimerização, uma proteína sérica ou uma molécula que pode ligar uma proteína sérica.[007] The fusion partner is any heterologous component that enhances the functionality of the ligand-binding molecule. Therefore, for example, a fusion partner may increase solubility, modulate release, facilitate targeting of particular cell or tissue types, enhance biological activity, aid production and/or recovery, enhance a pharmacological property, or enhance a profile. pharmacokinetics (PK) of the ligand-binding polypeptide. In relation to enhancing the PK profile, this can be achieved by, for example, enhancement of serum half-life, tissue penetrability, lack of immunogenicity or stability of the ligand-binding molecule. In preferred embodiments, a fusion partner is selected from the group consisting of a multimerization component, a serum protein, or a molecule that can bind a serum protein.

[008] Quando o parceiro de fusão é uma proteína sérica ou um fragmento da mesma, o mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste em α-1-microglobulina, AGP-1, orosomucoide, α-1-glicoproteina ácida, proteína de ligação de vitamina D (DBP), hemopexina, albumina sérica humana (hSA), transferrina, ferritina, afamina, haptoglobina, α- fetoproteína tiroglobulina, α-2-HS-glicoproteina, β-2- glicoproteína, proteína de ligação de hialuronano, sintaxina, C1R, cadeia C1q a, proteína de ligação de galectina3-Mac2, fibrinogênio, receptor de Ig polimérico (PIGR), α-2- macroglobulina, proteína de transporte de ureia, haptoglobina, IGFBPs, receptores de sequestrante de macrófago, fibronectina, giantina, Fc, α-1- antiquiromotripsina, α-1-antitripsina, antitrombina III, apolipoproteína A-1, apolipoproteína B, β-2-microglobulina, ceruloplasmina, componente de complemento C3 ou C4, inibidor de CI esterase, proteína C-reativa, cistatina C e proteína C. Em uma modalidade mais específica, o parceiro de fusão é selecionado a partir do grupo que consiste em α-1- microglobulina, AGP-1, orosomucoide, α-1-glicoproteina ácida, proteína de ligação de vitamina D (DBP), hemopexina, albumina sérica humana (hSA), afamina e haptoglobina. A inclusão de um componente de parceiro de fusão pode estender a meia-vida sérica do polipeptídeo de fusão da invenção quando desejado. Consultar, por exemplo, as Patentes no U.S. 6.423.512, 5.876.969, 6.593.295 e 6.548.653, incorporadas especificamente ao presente a título de referência em sua totalidade, para exemplos de polipeptídeos de fusão de albumina sérica. hSA é amplamente distribuído por todo o corpo, particularmente nos componentes intestinais e sanguíneos e tem um papel importante na manutenção da osmolaridade e volume plasmático. O mesmo é lentamente eliminado no fígado e, tipicamente, tem uma meia-vida in vivo de 14 a 20 dias em humanos (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; páginas 255 a 275).[008] When the fusion partner is a serum protein or a fragment thereof, it is selected from the group consisting of α-1-microglobulin, AGP-1, orosomucoid, α-1-acid glycoprotein, vitamin D binding (DBP), hemopexin, human serum albumin (hSA), transferrin, ferritin, afamine, haptoglobin, α- fetoprotein thyroglobulin, α-2-HS-glycoprotein, β-2- glycoprotein, hyaluronan binding protein, syntaxin, C1R, C1q a chain, galectin3-Mac2 binding protein, fibrinogen, polymeric Ig receptor (PIGR), α-2- macroglobulin, urea transport protein, haptoglobin, IGFBPs, macrophage scavenger receptors, fibronectin, giantin, Fc, α-1- antichiromotrypsin, α-1-antitrypsin, antithrombin III, apolipoprotein A-1, apolipoprotein B, β-2-microglobulin, ceruloplasmin, complement component C3 or C4, CI esterase inhibitor, protein C- reactive, cystatin C and protein C. In a more specific embodiment, the fusion partner is selected from the group consisting of α-1-microglobulin, AGP-1, orosomucoid, α-1-acid glycoprotein, vitamin D (DBP), hemopexin, human serum albumin (hSA), afamin and haptoglobin. The inclusion of a fusion partner component can extend the serum half-life of the fusion polypeptide of the invention when desired. See, for example, U.S. Patents 6,423,512, 5,876,969, 6,593,295, and 6,548,653, specifically incorporated herein by reference in their entirety, for examples of serum albumin fusion polypeptides. hSA is widely distributed throughout the body, particularly in intestinal and blood components, and plays an important role in maintaining osmolarity and plasma volume. It is slowly eliminated in the liver and typically has an in vivo half-life of 14 to 20 days in humans (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; pages 255 to 275).

[009] Quando um parceiro de fusão é uma molécula que pode ligar uma proteína sérica, a molécula pode ser uma molécula pequena sintética, um lipídio ou lipossomo, um ácido nucleico, incluindo um ácido nucleico sintético, tal como um aptômero, um peptídeo ou um oligossacarídeo. A molécula pode ser, adicionalmente, uma proteína, tal como, por exemplo, FCYRI, FCYR2, FCYR3, receptor de Ig polimérico (PIGR), ScFv e outros fragmentos de anticorpo específicos para uma proteína sérica.[009] When a fusion partner is a molecule that can bind a serum protein, the molecule may be a synthetic small molecule, a lipid or liposome, a nucleic acid, including a synthetic nucleic acid, such as an aptomere, a peptide or an oligosaccharide. The molecule may additionally be a protein, such as, for example, FCYRI, FCYR2, FCYR3, polymeric Ig receptor (PIGR), ScFv and other antibody fragments specific to a serum protein.

[010] Quando o parceiro de fusão é um componente de multimerização, o mesmo é qualquer sequência ou composto natural ou sintético que pode ligar de modo operativo uma primeira molécula de ligação de ligante a outra molécula de ligação de ligante ou outro componente de multimerização de outra molécula de ligação de ligante para formar uma estrutura de ordem superior, por exemplo, um dímero, um trímero, etc. Os componentes de multimerização adequados podem inclui um zíper de leucina, incluindo domínios de zíper de leucina derivados de c-jun ou c-fos; sequências derivadas de regiões constantes de cadeias leves kappa ou lambda; sequências sintéticas, tais como motivos de hélice-laço- hélice (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45 a 49), motivos de espiral-espiral, etc., ou outros domínios de multimerização aceitos de modo geral conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o componente de fusão compreende um domínio derivado de imunoglobulina de, por exemplo, IgG, IgM ou IgA humanas.[010] When the fusion partner is a multimerization component, it is any natural or synthetic sequence or compound that can operatively link a first ligand-binding molecule to another ligand-binding molecule or other multimerization component of another ligand-binding molecule to form a higher-order structure, e.g., a dimer, a trimer, etc. Suitable multimerization components may include a leucine zipper, including leucine zipper domains derived from c-jun or c-fos; sequences derived from constant regions of kappa or lambda light chains; synthetic sequences, such as helix-loop-helix motifs (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45 to 49), coiled-coil motifs, etc., or other generally accepted multimerization domains known in the art. technique. In some embodiments, the fusion component comprises an immunoglobulin-derived domain of, for example, human IgG, IgM, or IgA.

[011] Em um aspecto, uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento é produzida como um multímero. Cada subunidade do multímero compreende ou consiste em uma molécula de ligação de ligante, por exemplo, um polipeptídeo de ligação de ligante. Esses multímeros podem ser receptores solúveis homodiméricos, heterodiméricos ou multiméricos, com os receptores multiméricos consistindo em 9 ou menos subunidades, de preferência, 6 ou menos subunidade, de preferência ainda maior, 3 ou menos subunidades e, de preferência máxima, 2 unidades. De preferência, esses receptores solúveis multiméricos são homodímeros de moléculas de ligação de ligante.[011] In one aspect, a ligand binding molecule described herein is produced as a multimer. Each subunit of the multimer comprises or consists of a ligand-binding molecule, for example, a ligand-binding polypeptide. These multimers may be homodimeric, heterodimeric or multimeric soluble receptors, with the multimeric receptors consisting of 9 or fewer subunits, preferably 6 or fewer subunits, even more preferably 3 or fewer subunits, and most preferably 2 units. Preferably, these multimeric soluble receptors are homodimers of ligand-binding molecules.

[012] As pelo menos duas subunidades em um multímero são ligadas de modo operativo uma a outra. O termo “ligado de modo operativo” indica que as subunidades estão associadas através de ligação covalente e/ou não covalente. As subunidades podem ser ligadas de modo covalente por qualquer meio adequado, tal como através de um reagente de reticulação ou um elemento de ligação, tal como um elemento de ligação de polipeptídeo ou peptídeo. Em outra modalidade, as subunidades são ligadas através de ligações não covalentes. Em algumas variações, as duas subunidades (por exemplo, dois polipeptídeos de ligação de ligante) são fixadas por uma ligação de peptídeo, ou diretamente ou através de um “elemento de ligação de peptídeo”. O elemento de ligação de peptídeo pode ser tão curto quanto 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento (de preferência, consistindo em aminoácidos pequenos, tais como glicina, serina, treonina ou alanina) ou mais longo, por exemplo, 13, 15 ou 16 resíduos de aminoácido de comprimento, introduzidos entre as subunidades. De preferência, o elemento de ligação de peptídeo é um peptídeo que é imunologicamente inerte. O dito elemento de ligação pode ser um tripeptídeo da sequência E-F-M (Glu-Phe- Met), por exemplo, uma sequência de elemento de ligação de 13 aminoácidos que consiste em Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu- Gly-Gly-Gln-Phe-Met (SEQ ID NO: 7), uma sequência de elemento de ligação de 15 aminoácidos que consiste em (G4S)3 (SEQ ID NO: 8), uma sequência de elemento de ligação de 16 aminoácidos que consiste em GGSGG SGGGG S (SEQ ID NO: 9) ou a região de charneira de IgG humana (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Em algumas variações, as duas subunidades são polipeptídeos de ligação de ligante que compreendem duas cadeias polipeptídicas distintas que são ligadas uma a outra, por exemplo, por ligação de bissulfeto ou outras ligações.[012] The at least two subunits in a multimer are operatively linked to each other. The term “operatively linked” indicates that the subunits are associated through covalent and/or non-covalent bonding. The subunits may be covalently linked by any suitable means, such as through a cross-linking reagent or a linker, such as a polypeptide or peptide linker. In another embodiment, the subunits are linked through non-covalent bonds. In some variations, the two subunits (e.g., two ligand-binding polypeptides) are attached by a peptide bond, either directly or through a “peptide-binding element.” The peptide binding member can be as short as 1 to 3 amino acid residues in length (preferably consisting of small amino acids such as glycine, serine, threonine or alanine) or longer, e.g. 13, 15 or 16 long amino acid residues, introduced between subunits. Preferably, the peptide binding member is a peptide that is immunologically inert. Said linker may be a tripeptide of the sequence E-F-M (Glu-Phe-Met), for example, a 13 amino acid linker sequence consisting of Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu - Gly-Gly-Gln-Phe-Met (SEQ ID NO: 7), a 15 amino acid linker sequence consisting of (G4S)3 (SEQ ID NO: 8), a 16 amino acid linker sequence amino acids consisting of GGSGG SGGGG S (SEQ ID NO: 9) or the hinge region of human IgG (e.g. IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4). In some variations, the two subunits are ligand-binding polypeptides that comprise two distinct polypeptide chains that are linked to each other, for example, by disulfide bond or other linkages.

[013] Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante está na forma de uma proteína de fusão que compreende pelo menos duas subunidades, em que cada uma compreende um polipeptídeo de ligação de ligante. Dessa maneira, a proteína de fusão pode ser produzida de modo recombinante, por expressão direta em uma célula hospedeira de uma molécula de ácido nucleico que codifica a mesma como um único quadro de leitura aberta.[013] In some embodiments, the ligand-binding molecule is in the form of a fusion protein comprising at least two subunits, each of which comprises a ligand-binding polypeptide. In this way, the fusion protein can be produced recombinantly, by direct expression in a host cell of a nucleic acid molecule that encodes it as a single open reading frame.

[014] Em algumas variações, um polipeptídeo de ligação de ligante é expresso como uma fusão com um parceiro de fusão de proteína heterólogo, tal como uma região constante de imunoglobulina, e os parceiros de fusão heterólogos são ligados para formar uma molécula de ligação de ligante multimérica. Em uma modalidade, as subunidades estão ligadas de modo operativo a um componente de multimerização. Um componente de multimerização inclui qualquer sequência natural ou sintética que pode ligar duas ou mais subunidades para formar uma estrutura de ordem superior, por exemplo, um dímero, um trímero, etc. Um componente de multimerização pode ligar de modo operativo dias ou mais subunidades por interação “diretamente” com as subunidades. Alternativamente, um componente de multimerização para uma subunidade pode interagir com outro componente de multimerização para outra subunidade para ligar de modo operativo as subunidades.[014] In some variations, a ligand-binding polypeptide is expressed as a fusion with a heterologous protein fusion partner, such as an immunoglobulin constant region, and the heterologous fusion partners are linked to form a ligand-binding molecule. multimeric ligand. In one embodiment, the subunits are operatively linked to a multimerization component. A multimerization component includes any natural or synthetic sequence that can link two or more subunits to form a higher order structure, e.g., a dimer, a trimer, etc. A multimerization component can operatively link days or more subunits by interacting “directly” with the subunits. Alternatively, a multimerization component for one subunit may interact with another multimerization component for another subunit to operatively link the subunits.

[015] Em uma modalidade, as subunidades são ligadas de modo operativo a um domínio de aminoácido adicional que fornece para a multimerização das subunidades (em particular, os domínios adicionais compreendem qualquer região funcional que fornece dimerização das subunidades). O termo “ligado de modo operativo” indica que a subunidade baseada em VEGFR-3 e o domínio de aminoácido adicional estão associados através de ligação de peptídeo, ou diretamente ou através de um “elemento de ligação de peptídeo” (conforme definido no presente documento), e a subunidade baseada em VEGFR-3 retém propriedades de ligação de ligante. O domínio de aminoácido adicional pode estar localizado a montante (N-ter) ou a jusante (C-ter) da sequência de subunidades de VEGFR-3. De preferência, está localizado a jusante (isto é, afastado do primeiro domínio do tipo imunoglobulina (domínio de Ig-I). Dessa maneira, a proteína de fusão pode ser produzida de modo recombinante, por expressão direta em uma célula hospedeira de uma molécula de ácido nucleico que codifica a mesma. Em tais modalidades, uma molécula de ligação de ligante descrito no presente documento é um multímero de proteínas de fusão que contêm polipeptídeos de ligação de ligante e um componente de multimerização que pode interagir com o componente de multimerização presente em outra proteína de fusão para formar uma estrutura de ordem superior, tal como um dímero. Esses tipos de proteínas de fusão podem ser preparados por ligação operativa da sequência de subunidades de VEGFR-3 (isto é, polipeptídeo de ligação de ligante) a domínios isolados de outras proteínas, permitindo a formação de dímeros, trímeros, etc. Os exemplos para sequencias de proteínas que permitem a multimerização dos polipeptídeos de ligante descritos no presente documento incluem, porém, sem limitação, domínios isolados de proteínas, tais como imunoglobulinas, hCG (WO 97/30161), colágeno X (WO 04/33486), C4BP (WO 04/20639), proteínas Erb (WO 98/02540) ou peptídeos de espiral enrolada (WO 01/00814), cujas revelações são incorporadas ao presente a título de referência em sua totalidade.[015] In one embodiment, the subunits are operatively linked to an additional amino acid domain that provides for multimerization of the subunits (in particular, the additional domains comprise any functional region that provides dimerization of the subunits). The term “operatively linked” indicates that the VEGFR-3-based subunit and the additional amino acid domain are associated through peptide binding, either directly or through a “peptide binding element” (as defined herein). ), and the VEGFR-3-based subunit retains ligand-binding properties. The additional amino acid domain may be located upstream (N-ter) or downstream (C-ter) of the VEGFR-3 subunit sequence. Preferably, it is located downstream (i.e., away from the first immunoglobulin-like domain (Ig-I domain). In this way, the fusion protein can be produced recombinantly, by direct expression in a host cell of a molecule of nucleic acid encoding the same. In such embodiments, a ligand-binding molecule described herein is a multimer of fusion proteins that contain ligand-binding polypeptides and a multimerization component that can interact with the present multimerization component. into another fusion protein to form a higher order structure, such as a dimer. These types of fusion proteins can be prepared by operatively linking the VEGFR-3 subunit sequence (i.e., ligand-binding polypeptide) to domains isolated from other proteins, allowing the formation of dimers, trimers, etc. Examples for protein sequences that allow multimerization of the linker polypeptides described herein include, but are not limited to, isolated domains of proteins, such as immunoglobulins, hCG (WO 97/30161), collagen for reference in its entirety.

[016] O componente de multimerização pode, por exemplo, ser selecionado dentre (i) uma sequência de aminoácidos entre 1 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento, (ii) zíperes de leucina, (iii) motivos de hélice e laço e (iv) motivos de espiral-espiral. Quando o componente de multimerização compreende uma sequência de aminoácidos entre 1 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento, a sequência pode conter um ou mais resíduos de cisteína que podem formar uma ligação de bissulfeto com um resíduo de cisteína correspondente em outro polipeptídeo de fusão que compreende um componente de multimerização com um ou mais resíduos de cisteína.[016] The multimerization component can, for example, be selected from (i) an amino acid sequence between 1 to about 500 amino acids in length, (ii) leucine zippers, (iii) helix and loop motifs and (iv ) spiral-spiral motifs. When the multimerization component comprises an amino acid sequence between 1 to about 500 amino acids in length, the sequence may contain one or more cysteine residues that may form a disulfide bond with a corresponding cysteine residue in another fusion polypeptide comprising a multimerization component with one or more cysteine residues.

[017] Em um aspecto particular, os multímeros são dímeros de polipeptídeo de ligação de ligante em que os polipeptídeos estão ligados de modo operativo a uma imunoglobulina ou uma porção de uma imunoglobulina como o parceiro de fusão, que pode também atuar como o componente de multimerização. O termo “ligado de modo operativo” indica que o polipeptídeo de ligação de ligante e a imunoglobulina ou porção da mesma estão associados através de ligação de peptídeo, ou diretamente ou através de um “elemento de ligação de peptídeo” (conforme definido no presente documento) e as propriedades de ligação de ligante do polipeptídeo de ligação de ligante são mantidas. Nessa modalidade, os polipeptídeo de ligação de ligante são ligados de modo operativo a toda ou uma porção de uma imunoglobulina, particularmente uma imunoglobulina humana, ainda mais particularmente a porção Fc de uma imunoglobulina humana. Tipicamente, uma porção Fc de uma imunoglobulina humana contém dois domínios de região constante (os domínios CH2 e CH3) e uma região de charneira, mas carece da região variável. (Consultar, por exemplo, as Patentes no US 6.018.026 e 5.750.375, incorporadas ao presente a título de referência). A imunoglobulina pode ser selecionada a partir de qualquer uma das classes principais de imunoglobulinas, incluindo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e qualquer subclasse ou isotipo, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA-I e IgA-2. Em uma modalidade, a porção química Fc é de IgG4 humana, que é estável em solução e tem pouca ou nenhuma atividade de ativação de complemento. Em outra modalidade, a porção química Fc é de IgG1 humana. A parte Fc pode sofrer mutação a fim de impedir atividades indesejadas, tal como ligação de complemento, ligação a receptores Fc ou similares. A sequência de aminoácidos derivada da imunoglobulina pode ser ligada ao C-terminal ou ao N-terminal do polipeptídeo de ligação de ligante, de preferência, ao C-terminal. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas por transfecção de células com DNA que codifica subunidade de VEGFR-3:proteína de fusão Fc e que expressa os dímeros nas mesmas células. Em uma modalidade particular, os polipeptídeos de ligação de ligante são os mesmos em cada subunidade de monômero (isto é, o dímero é um homodímero). Os métodos para produzir proteínas de fusão de imunoglobulina são bem conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Hollenbaugh e Aruffo (“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, em Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, páginas 10.19.1 a 10.19.11, 1992) ou o documento WO 01/03737, por exemplo, ambos incorporados ao presente a título de referência.[017] In a particular aspect, multimers are ligand-binding polypeptide dimers in which the polypeptides are operatively linked to an immunoglobulin or a portion of an immunoglobulin as the fusion partner, which can also act as the fusion component. multimerization. The term “operatively linked” indicates that the ligand-binding polypeptide and the immunoglobulin or portion thereof are associated through peptide binding, either directly or through a “peptide binding element” (as defined herein). ) and the ligand-binding properties of the ligand-binding polypeptide are maintained. In this embodiment, the ligand-binding polypeptides are operatively linked to all or a portion of an immunoglobulin, particularly a human immunoglobulin, even more particularly the Fc portion of a human immunoglobulin. Typically, an Fc portion of a human immunoglobulin contains two constant region domains (the CH2 and CH3 domains) and a hinge region, but lacks the variable region. (See, for example, US Patent Nos. 6,018,026 and 5,750,375, incorporated herein by reference). The immunoglobulin can be selected from any of the major classes of immunoglobulins, including IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and any subclass or isotype, for example, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4; IgA-I and IgA-2. In one embodiment, the Fc chemical moiety is from human IgG4, which is stable in solution and has little or no complement activating activity. In another embodiment, the Fc chemical portion is from human IgG1. The Fc part may be mutated in order to prevent unwanted activities, such as complement binding, binding to Fc receptors, or the like. The immunoglobulin-derived amino acid sequence can be linked to the C-terminus or the N-terminus of the ligand-binding polypeptide, preferably to the C-terminus. Such fusion proteins can be prepared by transfecting cells with DNA encoding VEGFR-3 subunit:Fc fusion protein and expressing the dimers in the same cells. In a particular embodiment, the ligand-binding polypeptides are the same in each monomer subunit (i.e., the dimer is a homodimer). Methods for producing immunoglobulin fusion proteins are well known in the art, such as those described in Hollenbaugh and Aruffo (“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, in Current Protocols in Immunology, Supplement 4, pages 10.19.1 to 10.19.11, 1992) or document WO 01/03737, for example, both incorporated herein by reference.

[018] Alternativamente, os dímeros de polipeptídeo de ligação de ligante da presente invenção podem ser preparados por ligação operativa de um dos polipeptídeos de ligação de ligante à região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina e ligação operativa do outro polipeptídeo de ligação de ligante à região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação de ligante pode ser ligado de modo operativo à região CH1- charneira-CH2-CH3 de IgG1 humana e outro ou o mesmo polipeptídeo de ligação de ligante pode ser ligado de modo operativo à região kappa C da cadeia leve kappa de Ig. Em uma modalidade, a cadeia constante pesada é Y4 humana, que é estável em solução e tem pouca ou nenhuma atividade de ativação de complemento. Em outra modalidade, a cadeia constante pesada é Y1 humana. A cadeia constante pesada pode sofrer mutação a fim de impedir atividades indesejadas, tal como ligação de complemento, ligação a receptores Fc ou similares.[018] Alternatively, the ligand-binding polypeptide dimers of the present invention can be prepared by operatively attaching one of the ligand-binding polypeptides to the constant region of an immunoglobulin heavy chain and operatively attaching the other ligand-binding polypeptide to the constant region of an immunoglobulin light chain. For example, one ligand-binding polypeptide can be operably linked to the CH1-hinge-CH2-CH3 region of human IgG1 and another or the same ligand-binding polypeptide can be operably linked to the kappa C region of the light chain. Ig kappa. In one embodiment, the constant heavy chain is human Y4, which is stable in solution and has little or no complement activating activity. In another embodiment, the constant heavy chain is human Y1. The constant heavy chain may be mutated in order to prevent unwanted activities, such as complement binding, binding to Fc receptors, or the like.

[019] Além disso, se desejado, as proteínas de fusão descritas no presente documento podem compreender qualquer região funcional que facilite a purificação ou a produção. Os exemplos específicos de tais sequências de aminoácidos adicionais incluem uma sequência GST ou uma sequência de etiqueta His. Em algumas variações, a região que facilita a purificação é removida para formulação de uma composição para uso farmacêutico.[019] Furthermore, if desired, the fusion proteins described herein can comprise any functional region that facilitates purification or production. Specific examples of such additional amino acid sequences include a GST sequence or a His tag sequence. In some variations, the region that facilitates purification is removed to formulate a composition for pharmaceutical use.

[020] A sequência de aminoácidos derivada da imunoglobulina pode ser ligada ao C-terminal ou ao N-terminal do polipeptídeo de ligação de ligante, de preferência, ao C- terminal. As células transfretadas com DNA que codifica a proteína de fusão de cadeia leve de imunoglobulina e a proteína de fusão de cadeia pesada de imunoglobulina expressam heterodímeros de cadeia pesada/cadeia leve que contêm, cada um, um polipeptídeo de ligação de ligante. Ambos os polipeptídeos de ligação de ligante compreendem vantajosamente um peptídeo sinal nativo ou heterólogo quando inicialmente sintetizados, para promover a secreção da célula, mas a sequência sinal é clivada mediante a secreção. Variações de qualquer uma das modalidades anteriores que incluem o peptídeo sinal são contempladas. O peptídeo sinal nativo de VEGFR-3 humano compreende resíduos 1 a 24 de SEQ ID NO: 2. Inúmeras outras proteínas de peptídeo sinal são ensinadas na literatura.[020] The amino acid sequence derived from the immunoglobulin can be linked to the C-terminus or the N-terminus of the ligand-binding polypeptide, preferably to the C-terminus. Cells transshipped with DNA encoding the immunoglobulin light chain fusion protein and the immunoglobulin heavy chain fusion protein express heavy chain/light chain heterodimers that each contain a ligand-binding polypeptide. Both ligand-binding polypeptides advantageously comprise a native or heterologous signal peptide when initially synthesized, to promote secretion from the cell, but the signal sequence is cleaved upon secretion. Variations of any of the above embodiments that include the signal peptide are contemplated. The native signal peptide of human VEGFR-3 comprises residues 1 to 24 of SEQ ID NO: 2. Numerous other signal peptide proteins are taught in the literature.

[021] Em outro aspecto particular da presente invenção, os polipeptídeos de ligação de ligante dos multímeros são ligados através de ligações não covalentes. A ligação não covalente das subunidades pode ser atingida por qualquer meio adequado que não interfira em sua atividade biológica (isto é, sua capacidade de ligar VEGF-C humano e/ou VEGF-D). Em um aspecto particular, esses multímeros são dímeros de polipeptídeo de ligação de ligante em que um polipeptídeo de ligação de ligante é ligado de modo operativo a um primeiro composto e outro ou o mesmo polipeptídeo de ligação de ligante é ligado de modo operativo a um segundo composto que será ligado de modo covalente ao primeiro composto. Os exemplos de tais compostos são biotina e avidina. Os dímeros de polipeptídeo de ligação de ligante podem ser preparados por ligação operativa de uma subunidade de VEGFR-3 à biotina e ligação operativa de outro polipeptídeo de ligação de ligante à avidina. O receptor é, assim, formado através das interações não covalentes de biotina com avidina. Outros exemplos incluem subunidades de hormônio proteico heterodimérico. Nessas modalidades, um construto de DNA que codifica uma proteína de ligação de ligante é fundido a um construto de DNA que codifica uma subunidade de um hormônio proteico heterodimérico, tal como hCG, e um construto de DNA que codifica o outro polipeptídeo de ligação de ligante é fundido a DNA que codifica a outra subunidade do hormônio proteico heterodimérico, tal como hCG (conforme revelado no documento US 6.193.972). Esses construtos de DNA são coexpressos nas mesmas células que levam à expressão de uma molécula de ligação de ligante, já que cada sequência coexpressa contém uma subunidade de hormônio correspondente de modo a formar um heterodímero mediante expressão. A sequência de aminoácidos derivada do hormônio proteico heterodimérico pode ser ligada ao C- terminal ou ao N-terminal do polipeptídeo de ligação de ligante, de preferência, ao C-terminal. Ambas as subunidades compreendem vantajosamente um peptídeo sinal nativo ou heterólogo quando inicialmente sintetizados, para promover a secreção da célula, mas a sequência sinal é clivada mediante a secreção.[021] In another particular aspect of the present invention, the ligand-binding polypeptides of the multimers are linked through non-covalent bonds. Non-covalent binding of the subunits can be achieved by any suitable means that does not interfere with their biological activity (i.e., their ability to bind human VEGF-C and/or VEGF-D). In a particular aspect, these multimers are ligand-binding polypeptide dimers in which one ligand-binding polypeptide is operatively linked to a first compound and another or the same ligand-binding polypeptide is operatively linked to a second. compound that will be covalently linked to the first compound. Examples of such compounds are biotin and avidin. Ligand-binding polypeptide dimers can be prepared by operatively linking a VEGFR-3 subunit to biotin and operatively linking another ligand-binding polypeptide to avidin. The receptor is thus formed through the noncovalent interactions of biotin with avidin. Other examples include heterodimeric protein hormone subunits. In these embodiments, a DNA construct encoding a ligand-binding protein is fused to a DNA construct encoding a subunit of a heterodimeric protein hormone, such as hCG, and a DNA construct encoding the other ligand-binding polypeptide. is fused to DNA encoding another heterodimeric protein hormone subunit, such as hCG (as disclosed in US 6,193,972). These DNA constructs are coexpressed in the same cells that lead to the expression of a ligand-binding molecule, as each coexpressed sequence contains a corresponding hormone subunit so as to form a heterodimer upon expression. The amino acid sequence derived from the heterodimeric protein hormone can be linked to the C-terminus or the N-terminus of the ligand-binding polypeptide, preferably to the C-terminus. Both subunits advantageously comprise a native or heterologous signal peptide when initially synthesized, to promote secretion from the cell, but the signal sequence is cleaved upon secretion.

[022] Em uma modalidade, a molécula de ligação de ligante é ligada de modo operativo a uma unidade de ligação derivada de não VEGFR-3, isto é, uma unidade de ligação que não contém domínios de componente derivado de VEGFR-3. Tais moléculas de ligação de ligante quiméricas, por exemplo, compreendem unidades de ligação heterólogas baseadas em outros receptores tirosina quinase. Em uma modalidade, tais subunidades de ligação heterólogas ligam-se a pelo menos um polipeptídeo de ligante selecionado dentre VEGF-A (VEGF), VEGF-B, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D. Em uma modalidade preferencial, tais unidades de ligação heterólogas ligam-se a pelo menos VEGF-A (VEGF).[022] In one embodiment, the ligand binding molecule is operatively linked to a non-VEGFR-3 derived binding unit, that is, a binding unit that does not contain VEGFR-3 derived component domains. Such chimeric ligand-binding molecules, for example, comprise heterologous binding units based on other tyrosine kinase receptors. In one embodiment, such heterologous binding subunits bind to at least one ligand polypeptide selected from VEGF-A (VEGF), VEGF-B, PlGF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C and PDGF-D. In a preferred embodiment, such heterologous binding units bind to at least VEGF-A (VEGF).

[023] Em uma modalidade, tais unidades de ligação heterólogas compreendem domínios de componente derivados de VEGFR-1 ou VEGFR-2 ou ambos. Um exemplo de unidades de ligação heterólogas que podem ser empregadas, em combinação com as moléculas de ligação de ligante da presente invenção na forma de moléculas de ligação de ligante quiméricas, inclui as moléculas de captura de VEGF descritas, por exemplo, nos documentos WO 2000/75319, WO 2005/000895 e WO 2006/088650. Uma unidade de ligação heteróloga preferencial compreende o domínio 2 de Ig de VEGFR-1 (R1D2) e domínio 3 de Ig de VEGFR-2 (R2D3), opcionalmente, fundidos a uma porção Fc de uma imunoglobulina. Em uma modalidade, é contemplada uma molécula quimérica que compreende um polipeptídeo de ligação de ligante da presente invenção ligado a uma porção Fc de uma imunoglobulina ligada de modo operativo a uma unidade de ligação de R1D2R2D3 fundida a uma porção Fc de uma imunoglobulina. As duas unidades de ligação são ligadas de modo operativo através de uma ligação de bissulfeto entre as duas porções Fc.[023] In one embodiment, such heterologous binding units comprise component domains derived from VEGFR-1 or VEGFR-2 or both. An example of heterologous binding units that may be employed, in combination with the ligand binding molecules of the present invention in the form of chimeric ligand binding molecules, includes the VEGF capture molecules described, for example, in WO 2000 /75319, WO 2005/000895 and WO 2006/088650. A preferred heterologous binding moiety comprises VEGFR-1 Ig domain 2 (R1D2) and VEGFR-2 Ig domain 3 (R2D3), optionally fused to an Fc portion of an immunoglobulin. In one embodiment, a chimeric molecule comprising a ligand-binding polypeptide of the present invention linked to an Fc portion of an immunoglobulin operatively linked to an R1D2R2D3-binding moiety fused to an Fc portion of an immunoglobulin is contemplated. The two linker units are operatively linked via a disulfide bond between the two Fc moieties.

[024] Elementos de ligação[024] Connection elements

[025] Apesar de domínios do tipo Ig de VEGFR-3 humano poderem ser diretamente fixados um ao outro (através de um peptídeo, bissulfeto ou outro tipo de ligação covalente) ou a domínios do tipo Ig de outros receptores, as moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento compreende, ainda, opcionalmente, um (um ou mais) elemento de ligação que conecta em conjunto duas ou mais unidades de ligação diferentes, por exemplo, fragmentos de ECD de VEGFR-3 com outro fragmento de ECD de VEGFR-3, ou mesmo uma cópia do mesmo. Um elemento de ligação pode também ligar uma unidade de ligação a outros substituintes descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o elemento de ligação compreende um polipeptídeo heterólogo. Por exemplo, em algumas modalidades, o elemento de ligação compreende um peptídeo que liga as unidades de ligação para formar um único peptídeo contínuo que pode ser expresso como uma única molécula de ligação de ligante. Os elementos de ligação podem ser escolhidos de modo que tenham menos probabilidade de induzir uma reação alérgica. Os polissacarídeos ou outras porções químicas também podem ser usados para ligar unidades de ligação para formar uma molécula de ligação de ligante.[025] Although Ig-like domains of human VEGFR-3 can be directly attached to each other (through a peptide, disulfide or other type of covalent bond) or to Ig-like domains of other receptors, the Ig-like domains of other receptors The linker described herein further optionally comprises one (one or more) linker that connects together two or more different linker units, e.g., VEGFR-3 ECD fragments with another VEGFR-3 ECD fragment. 3, or even a copy of it. A linker may also link a linker to other substituents described herein. In some embodiments, the binding element comprises a heterologous polypeptide. For example, in some embodiments, the binding element comprises a peptide that links the binding moieties to form a single continuous peptide that can be expressed as a single ligand-binding molecule. Binding elements can be chosen so that they are less likely to induce an allergic reaction. Polysaccharides or other chemical moieties can also be used to link linker units to form a ligand-binding molecule.

[026] Mais de um elemento de ligação pode ser usado por molécula de ligação de ligante. O elemento de ligação pode ser selecionado para liberdade (estérica) conformacional ideal entre as várias unidades de ligação de ligante para permitir que as mesmas interajam uma com a outra se desejado, por exemplo, para formar dímeros, ou para permitir que as mesmas interajam com o ligante. O elemento de ligação pode ser linear de modo que unidades de ligação consecutivas sejam ligadas em série ou o elemento de ligação pode ser vir como um arcabouço ao qual várias unidades de ligação são fixadas, por exemplo, um elemento de ligação ramificado. Um elemento de ligação pode também ter múltiplas ramificações, por exemplo, conforme revelado em Tam, J. Immunol. Methods 196:17 (1996). As unidades de ligação podem ser fixadas uma a outra ou ao arcabouço do elemento de ligação através de grupos N- terminais de aminoácido, grupos carboxila C-terminais, cadeias laterais, grupos quimicamente modificados, cadeias laterais ou outros meios.[026] More than one binding element can be used per ligand binding molecule. The linker may be selected for optimal conformational (steric) freedom between the various ligand binding units to allow them to interact with each other if desired, for example, to form dimers, or to allow them to interact with the binder. The connection element may be linear so that consecutive connection units are connected in series or the connection element may be provided as a framework to which several connection units are attached, for example, a branched connection element. A binding member may also have multiple branches, for example, as disclosed in Tam, J. Immunol. Methods 196:17 (1996). The linker moieties may be attached to each other or to the linker framework via N-terminal amino acid groups, C-terminal carboxyl groups, side chains, chemically modified groups, side chains or other means.

[027] Os peptídeos de elemento de ligação podem ser projetados para ter sequências que permite características desejadas. Por exemplo, o uso de resíduos de glicila permite um grau relativamente grande de liberdade conformacional, enquanto uma prolina poderia tender a ter o efeito oposto. Os elementos de ligação de peptídeo podem ser escolhidos de modo que atinjam estruturas secundárias e terciárias particulares, por exemplo, hélices alfa, lâminas beta ou barris beta. A estrutura quaternária pode ser também utilizada para criar elementos de ligação que unem unidades de ligação em conjunto de modo não covalente. Por exemplo, fundir um domínio de proteína com uma face hidrofóbica a cada unidade de ligação pode permitir a união das unidades de ligação através da interação entre a interação hidrofóbica das duas moléculas. Em algumas modalidades, o elemento de ligação pode fornecer interações polares. Por exemplo, um domínio de zíper de leucina das proto-oncoproteínas Myc e Max, respectivamente, pode ser usado. Luscher e Larsson, Ongogene 18:2.955 a 2.966 (1999). Em algumas modalidades, o elemento de ligação permite a formação de uma ponte de sal ou ligação de bissulfeto. Os elementos de ligação podem compreender aminoácidos de ocorrência não natural, assim como aminoácidos de ocorrência natural, que não são incorporados naturalmente em um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o elemento de ligação compreende um complexo de coordenação entre um metal ou outro íon e vários resíduos dos múltiplos peptídeos unidos pelo mesmo.[027] Binding element peptides can be designed to have sequences that allow for desired characteristics. For example, the use of glycyl residues allows a relatively large degree of conformational freedom, whereas a proline could tend to have the opposite effect. Peptide binding elements can be chosen to target particular secondary and tertiary structures, e.g., alpha helices, beta sheets, or beta barrels. The quaternary structure can also be used to create linkers that join linkers together non-covalently. For example, fusing a protein domain with a hydrophobic face to each binding unit can allow the joining of the binding units through the interaction between the hydrophobic interaction of the two molecules. In some embodiments, the binding element may provide polar interactions. For example, a leucine zipper domain from the proto-oncoproteins Myc and Max, respectively, can be used. Luscher and Larsson, Ongogene 18:2955–2966 (1999). In some embodiments, the linker allows the formation of a salt bridge or disulfide bond. The linkers may comprise non-naturally occurring amino acids, as well as naturally occurring amino acids, which are not naturally incorporated into a polypeptide. In some embodiments, the binding element comprises a coordination complex between a metal or other ion and several residues of the multiple peptides linked thereto.

[028] Elementos de ligação de peptídeo lineares de pelo menos um resíduo de aminoácido são contemplados. Em algumas modalidades, o elemento de ligação tem mais de 10.000 resíduos. Em algumas modalidades, o elemento de ligação tem de 1 a 10.000 resíduos, 1 a 1000 resíduos, 1 a 100 resíduos, 1 a 50 resíduos ou 1 a 10 resíduos. Em algumas modalidades, o elemento de ligação de peptídeo linear compreende resíduos com cadeias laterais relativamente inertes. Os resíduos de aminoácido de elemento de ligação de peptídeo não precisam ser ligados inteiramente ou de nenhuma maneira através de grupos alfa-carbóxi e alfa-amino. Ou seja, os peptídeos podem ser ligados através de grupos de cadeia lateral de vários resíduos.[028] Linear peptide binding elements of at least one amino acid residue are contemplated. In some embodiments, the linker has more than 10,000 residues. In some embodiments, the linker has 1 to 10,000 residues, 1 to 1000 residues, 1 to 100 residues, 1 to 50 residues, or 1 to 10 residues. In some embodiments, the linear peptide binding element comprises residues with relatively inert side chains. Peptide binding member amino acid residues do not need to be linked entirely or in any way through alpha-carboxy and alpha-amino groups. That is, peptides can be linked through side chain groups of various residues.

[029] O elemento de ligação pode afetar se o(s) polipeptídeo(s) ao qual o mesmo está fundido é capaz de dimerizar um ao outro ou a outro polipeptídeo. O elemento de ligação serve a diversas funções. Os monômeros de receptor nativos restritos ao plano aproximadamente bidimensional da membrana celular desfrutam de uma concentração local relativamente alta e na disponibilidade de correceptores (unidades de ligação), aumentando a probabilidade de encontrar um parceiro. Os receptores livres em solução que carecem de tais vantagens podem ser auxiliados por um elemento de ligação que aumenta a concentração eficaz dos monômeros.[029] The binding element can affect whether the polypeptide(s) to which it is fused are capable of dimerizing each other or another polypeptide. The connecting element serves several functions. Native receptor monomers restricted to the approximately two-dimensional plane of the cell membrane enjoy a relatively high local concentration and availability of coreceptors (binding units), increasing the likelihood of finding a partner. Free receptors in solution that lack such advantages can be aided by a linker that increases the effective concentration of the monomers.

[030] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de ligante pode compreende mais de um tipo de elemento de ligação. Os elementos de ligação podem também compreender as modificações químicas discutidas acima.[030] In some embodiments, a ligand binding molecule may comprise more than one type of binding element. The binding elements may also comprise the chemical modifications discussed above.

[031] As moléculas de ligação de ligante descrito no presente documento podem compreender um resíduo de aminoácido N-terminal adicional, de preferência, uma metionina. De fato, dependendo do sistema de expressão e das condições, os polipeptídeos podem ser expressos em uma célula hospedeira recombinante com uma Metionina de partida. Esse aminoácido adicional pode ser então ou mantido na proteína recombinante resultante ou eliminado por meio de uma exopeptidase, tal como Metionina Aminopeptidase, de acordo com os métodos revelados na literatura (Van Valkenburgh HA e Kahn RA, Methods Enzymol. (2002) 344:186 a 193; Ben-Bassat A, Bioprocess Technol. (1991) 12:147 a 59). Substituintes e Outras Modificações Químicas[031] The ligand binding molecules described herein may comprise an additional N-terminal amino acid residue, preferably a methionine. In fact, depending on the expression system and conditions, polypeptides can be expressed in a recombinant host cell with a starting Methionine. This additional amino acid can then be either maintained in the resulting recombinant protein or eliminated by means of an exopeptidase, such as Methionine Aminopeptidase, according to methods disclosed in the literature (Van Valkenburgh HA and Kahn RA, Methods Enzymol. (2002) 344:186 at 193; Ben-Bassat A, Bioprocess Technol. (1991) 12:147 at 59). Substitutes and Other Chemical Modifications

[032] As moléculas de ligação de ligante descrito no presente documento são, opcionalmente, modificadas de modo químico com vários substituintes. Tais modificações, de preferência, não reduzem substancialmente as afinidades ou as especificidades de ligação de fator de crescimento da molécula de ligação de ligante. Em vez disso, as modificações químicas conferem características desejáveis adicionais, conforme discutido no presente documento. As modificações químicas podem tomar diversas formas diferentes, tais como heterólogos de peptídeo, polissacarídeos, lipídios, radioisótopos, resíduos de aminoácido não padrão e ácidos nucleicos, quelatos metálicos e várias toxinas.[032] The ligand binding molecules described herein are optionally chemically modified with various substituents. Such modifications preferably do not substantially reduce the growth factor binding affinities or specificities of the ligand binding molecule. Instead, chemical modifications impart additional desirable characteristics, as discussed herein. Chemical modifications can take several different forms, such as peptide heterologs, polysaccharides, lipids, radioisotopes, nonstandard amino acid residues and nucleic acids, metal chelates, and various toxins.

[033] Os fragmentos de receptor (ou “unidades de ligação” ou “domínios de componente”) e as moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são opcionalmente fundidas a parceiros de fusão heterólogos, tais como polipeptídeos heterólogos, para conferir várias propriedades, por exemplo, solubilidade aumentada, modulação de eliminação, alvejamento a tipos de célula ou tecido particulares. Em algumas modalidades, o fragmento de receptor é ligado a um domínio Fc de IgG ou outra imunoglobulina. Em algumas modalidades, um fragmento de receptor é fundido à fosfatase alcalina (AP). Métodos para produzir construtos de fusão Fc ou AP são encontrados no documento WO 02/060950. Fundindo-se o polipeptídeo ou a molécula de ligação de ligante com domínios de proteína que têm propriedades específicas (por exemplo, meia-vida, biodisponibilidade, parceiros de interação), é possível conferir essas propriedades à molécula de ligação de ligante (por exemplo, as moléculas são projetadas para ter uma distribuição de tecido específica ou meia-vida biológica específica). Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante inclui um correceptor e um fragmento de VEGFR.[033] The receptor fragments (or “binding units” or “component domains”) and ligand binding molecules described herein are optionally fused to heterologous fusion partners, such as heterologous polypeptides, to impart various properties , for example, increased solubility, modulation of elimination, targeting particular cell or tissue types. In some embodiments, the receptor fragment is linked to an Fc domain of IgG or other immunoglobulin. In some embodiments, a receptor fragment is fused to alkaline phosphatase (AP). Methods for producing Fc or AP fusion constructs are found in WO 02/060950. By fusing the polypeptide or ligand-binding molecule with protein domains that have specific properties (e.g., half-life, bioavailability, interaction partners), it is possible to impart these properties to the ligand-binding molecule (e.g., molecules are designed to have a specific tissue distribution or specific biological half-life). In some embodiments, the ligand-binding molecule includes a coreceptor and a VEGFR fragment.

[034] O parceiro de fusão particular (por exemplo, polipeptídeo heterólogo) usado em uma molécula de ligação de ligante particular pode influenciar se um fragmento de VEGR-3 será ou não dimerizado, o que, por sua vez, pode afetar a ligação de ligante.[034] The particular fusion partner (e.g., heterologous polypeptide) used in a particular ligand-binding molecule can influence whether or not a VEGR-3 fragment will dimerize, which, in turn, can affect the binding of binder.

[035] Para substituintes, tal como uma região Fc de IgG humana, a fusão pode ser fundida diretamente a uma molécula de ligação de ligante ou fundida através de uma sequência intermediária. Por exemplo, uma região de charneira de IgG humana, CH2 e CH3 pode ser fundida em qualquer um dentre o N-terminal ou C-terminal de uma molécula de ligação de ligante para fixar a região Fc. O construto de fusão de Fc resultante possibilita a purificação através de uma colina de afinidade de Proteína A (Pierce, Rockford, III.). O peptídeo e as proteínas fundidos a uma região Fc podem exibir um meia- vida substancialmente maior in vivo que a contraparte não fundida. Uma fusão a uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptídeo de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural ou pode ser modificada para características superiores, por exemplo, qualidades terapêuticas, tempo de circulação, agregação reduzida.[035] For substituents, such as a human IgG Fc region, the fusion can be fused directly to a ligand-binding molecule or fused through an intermediate sequence. For example, a hinge region of human IgG, CH2 and CH3 can be fused to either the N-terminus or C-terminus of a ligand-binding molecule to secure the Fc region. The resulting Fc fusion construct enables purification via a Protein A affinity choline (Pierce, Rockford, III.). Peptide and proteins fused to an Fc region can exhibit a substantially longer half-life in vivo than the unfused counterpart. A fusion to an Fc region allows dimerization/multimerization of the fusion polypeptide. The Fc region may be a naturally occurring Fc region or may be modified for superior characteristics, e.g., therapeutic qualities, circulation time, reduced aggregation.

[036] Os polipeptídeos podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação, ou pela criação de sais de adição de ácido, amidas, ésteres, em particular, ésteres C-terminais e derivados de N-acila. Os domínios do tipo Ig I a III de VEGFR-3 compreendem 5 sítios de N-glicosilação putativos (referidos no presente documento como sequons N1, N2, N3, N4 e N5 ou regiões de VEGFR-3, respectivamente) . N1 corresponde aos aminoácidos 33 a 35 de SEQ ID NO: 2; N2 corresponde aos aminoácidos 104 a 106 de SEQ ID NO: 2; N3 corresponde aos aminoácidos 166 a 168 de SEQ ID NO: 2; N4 corresponde aos aminoácidos 251 a 253 de SEQ ID NO: 2 e N2 corresponde aos aminoácidos 299 a 301 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de ligante descrito no presente documento compreende uma modificação na região N2 da molécula. Por exemplo, em algumas modalidades, o aminoácido na molécula de ligação de ligante correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por outro aminoácido. Substituições conservadoras são preferenciais. Em algumas modalidades, o aminoácido correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 é deletado e substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste em glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina. Em ainda outras variações, a posição 106 é substituída para eliminar o sequon N2. Nas modalidades em que o sequon N2 de SEQ ID NO: 2 é modificado conforme descrito acima, os sequons N1, N3, N4 e N5 de SEQ ID NO: 2 são, de preferência, não modificados.[036] Polypeptides can be modified, for example, by glycosylation, amidation, carboxylation or phosphorylation, or by creating acid addition salts, amides, esters, in particular, C-terminal esters and N-acyl derivatives. The Ig-like domains I to III of VEGFR-3 comprise 5 putative N-glycosylation sites (referred to herein as N1, N2, N3, N4, and N5 sequons or VEGFR-3 regions, respectively). N1 corresponds to amino acids 33 to 35 of SEQ ID NO: 2; N2 corresponds to amino acids 104 to 106 of SEQ ID NO: 2; N3 corresponds to amino acids 166 to 168 of SEQ ID NO: 2; N4 corresponds to amino acids 251 to 253 of SEQ ID NO: 2 and N2 corresponds to amino acids 299 to 301 of SEQ ID NO: 2. In some embodiments, a ligand-binding molecule described herein comprises a modification in the N2 region of the molecule. . For example, in some embodiments, the amino acid in the ligand binding molecule corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with another amino acid. Conservative substitutions are preferred. In some embodiments, the amino acid corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted and replaced with an amino acid selected from the group consisting of glutamine, aspartate, glutamate, arginine and lysine. In still other variations, position 106 is substituted to eliminate the N2 sequon. In embodiments in which sequon N2 of SEQ ID NO: 2 is modified as described above, sequons N1, N3, N4 and N5 of SEQ ID NO: 2 are preferably unmodified.

[037] As proteínas também podem ser modificadas para criar derivados de peptídeo por formação de complexos covalentes ou não covalentes com outras porções químicas. Os complexos ligados de modo covalente podem ser preparados por ligação das porções químicas a grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos dos polipeptídeos ou no N ou C- terminal.[037] Proteins can also be modified to create peptide derivatives by forming covalent or non-covalent complexes with other chemical moieties. Covalently linked complexes can be prepared by linking the chemical moieties to functional groups on the amino acid side chains of the polypeptides or at the N- or C-terminus.

[038] Os polipeptídeos podem ser conjugados a um grupo repórter, incluindo, porém, sem limitação, uma identificação radioativa, uma identificação fluorescente, uma enzima (por exemplo, que catalisa uma reação calorimétrica ou fluorométrica), um substrato, uma matriz sólida ou um carreador (por exemplo, biotina ou avidina). Os exemplos de análogos são descritos no documento WO 98/28621 e em Olofsson, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA, 95:11.709 a 11.714 (1998), as Patentes no U.S. 5.512.545 e 5.474.982; os Pedidos de Patente no U.S. 20020164687 e 20020164710.[038] Polypeptides can be conjugated to a reporter group, including, but not limited to, a radioactive label, a fluorescent label, an enzyme (for example, which catalyzes a calorimetric or fluorometric reaction), a substrate, a solid matrix or a carrier (e.g. biotin or avidin). Examples of analogues are described in WO 98/28621 and in Olofsson, et al., Proc. Nat'l. Academic. Sci. USA, 95:11,709 to 11,714 (1998), U.S. Patents 5,512,545 and 5,474,982; U.S. Patent Applications 20020164687 and 20020164710.

[039] Os resíduos de cisteinila são mais comumente reagidos com haloacetatos (e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados de carboximetila ou carbociamidometila. Os resíduos de cisteinila são também derivados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β(5- imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, bissulfeto de 3-nitro-2-piridila, bissulfeto de metil 2-piridila, p-cloromercuribenzoato, 2- cloromercuri-4-nitrofenol, orcloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol.[039] Cysteinyl residues are most commonly reacted with haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to generate carboxymethyl or carbacyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also derived by reaction with bromotrifluoroacetone, α-bromo-β(5-imidozoyl)propionic acid, chloroacetyl phosphate, N-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl 2-pyridyl disulfide, p-chloromercuribenzoate, 2-chloromercuri-4-nitrophenol, orchloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

[040] Os resíduos de histidila são derivados por reação com dietilprocarbonato em pH 5,5 a 7,0 devido ao fato de que esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidila. Brometo de para-bromofenacila também é útil; a reação é, de preferência, realizada em cacodilato de sódio a 0,1 M a pH 6,0.[040] Histidyl residues are derived by reaction with diethylprocarbonate at pH 5.5 to 7.0 due to the fact that this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromphenacyl bromide is also useful; the reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0.

[041] Os resíduos terminais de lisinila e amino são reagidos com anidridos de ácido succínico ou carboxílico. A derivação com esses agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para derivar resíduos contendo α-amino incluem imidoésteres, tal como picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboroidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilissureia; 2,4 pentanediona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.[041] The terminal lysinyl and amino residues are reacted with succinic or carboxylic acid anhydrides. Derivation with these agents has the effect of reversing the charge of the lysinyl residues. Other reagents suitable for derivatizing α-amino containing residues include imidoesters, such as methyl picolinimidate; pyridoxal phosphate; pyridoxal; chloroborohydride; trinitrobenzenesulfonic acid; O-methylisosurea; 2,4 pentanedione; and transaminase-catalyzed reaction with glyoxylate.

[042] Os resíduos de arginila são modificados por reação com um ou diversos reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-cicloexanodiona e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina exige que a reação seja realizada em condições alcalinas devido ao pK alto do grupo funcional guanidina. Além disso, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como o grupo épsilon-amino de arginina.[042] Arginyl residues are modified by reaction with one or several conventional reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. The derivatization of arginine residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pK of the guanidine functional group. Furthermore, these reagents can react with the lysine groups as well as the epsilon-amino group of arginine.

[043] A modificação específica de resíduos de tirosila por si foi estudada extensivamente, com interesse particular na introdução de identificações espectrais em resíduos de tirosila por reação com compostos de diazônio aromático ou tetranitrometano. Mais comumente, N- acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosila são iodados com o uso de 125I ou 131I para preparar proteínas identificadas para uso em imunoensaio radioativo.[043] The specific modification of tyrosyl residues per se has been studied extensively, with particular interest in the introduction of spectral identifications on tyrosyl residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. Most commonly, N-acetylimidizole and tetranitromethane are used to form O-acetyl tyrosyl species and 3-nitro derivatives, respectively. Tyrosyl residues are iodinated using 125I or 131I to prepare identified proteins for use in radioactive immunoassay.

[044] Grupos de laterais carboxila (aspartila ou glutamila) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R1), tal como 1-cicloexil-3-(2-morfolinil-(4- etil)carbodiimida ou 1-etil-3 (4 azônia 4,4- dimetilpentil)carbodiimida. Além disso, resíduos de aspartila e glutamila são convertidos em resíduos de asparaginila e glutaminila por reação com íons de amônio.[044] Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (R1), such as 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)carbodiimide or 1-ethyl-3 (4 azonia 4,4- dimethylpentyl)carbodiimide.In addition, aspartyl and glutamyl residues are converted to asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.

[045] A derivação com agentes bifuncionais é suada para reticular a molécula de ligação de ligante a matrizes de suporte insolúveis em água. Tal derivação pode também fornecer o elemento de ligação que pode conectar elementos de ligação adjacentes em uma molécula de ligação de ligante, ou um elemento de ligação a um peptídeo heterólogo, por exemplo, um fragmento Fc. Os agentes de reticulação comumente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homo- bifuncionais, incluindo ésteres disuccinimidílico, tal como 3,3'-ditiiobis(succinimidilpropioonato), e maleimidas bifuncionais, tal como bis-N-maleimido-1,8-octano. Os agentes de derivação, tal como metil-3-[(p-azidofenil)ditio] propioimidato, rendem intermediários fotoativáveis que podem formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, matrizes insolúveis em água reativas, tal como carboidratos ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Patentes No U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440, incorporadas ao presente a título de referência, são empregadas para imobilização de proteína.[045] Derivation with bifunctional agents is used to cross-link the ligand binding molecule to water-insoluble support matrices. Such a derivatization may also provide the linker that can connect adjacent linkers in a ligand-binding molecule, or a linker to a heterologous peptide, for example, an Fc fragment. Commonly used cross-linking agents include, for example, 1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, e.g. 4-azidosalicylic acid esters, homo-bifunctional imidoesters, including disuccinimidyl esters. , such as 3,3'-dithiiobis(succinimidylpropionate), and bifunctional maleimides, such as bis-N-maleimido-1,8-octane. Shunting agents, such as methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio] propioimidate, yield photoactivatable intermediates that can form crosslinks in the presence of light. Alternatively, reactive water-insoluble matrices, such as cyanogen bromide-activated carbohydrates and the reactive substrates described in U.S. Patent No. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; and 4,330,440, incorporated herein by reference, are used for protein immobilization.

[046] Os resíduos de glutaminila e asparaginila são frequentemente desaminados nos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes. Alternativamente, esses resíduos são desaminados sob condições brandamente ácidas. Qualquer forma desses resíduos está dentro do escopo desta invenção.[046] Glutaminyl and asparaginyl residues are often deaminated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues. Alternatively, these residues are deaminated under mild acidic conditions. Any form of such waste is within the scope of this invention.

[047] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila e treonila, metilação dos grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86,1983), acetilação da amina N-terminal e, em alguns casos, amidação dos grupos carboxila C-terminais. Tais derivados são composições polipeptídicas quimicamente modificadas em que o polipeptídeo de molécula de ligação de ligante é ligado a um polímero. O polímero selecionado é tipicamente solúvel em água de modo que a proteína a qual o mesmo está fixado não precipite em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. O polímero selecionado é usualmente modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilação ou um aldeído para alquilação, de modo que o grau de polimerização possa ser controlado conforme fornecido nos métodos presentes. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Está incluída dentro do escopo dos polímeros de polipeptídeo de molécula de ligação de ligante uma mistura de polímeros. De preferência, para uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceito.[047] Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl and threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine and histidine side chains (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pages 79 to 86, 1983), acetylation of the N-terminal amine and, in some cases, amidation of the C-terminal carboxyl groups. Such derivatives are chemically modified polypeptide compositions in which the ligand-binding molecule polypeptide is linked to a polymer. The selected polymer is typically water-soluble so that the protein to which it is attached does not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. The selected polymer is usually modified to have a single reactive group, such as an active ester for acylation or an aldehyde for alkylation, so that the degree of polymerization can be controlled as provided in the present methods. The polymer can be of any molecular weight and can be branched or unbranched. Included within the scope of ligand binding molecule polypeptide polymers is a mixture of polymers. Preferably, for therapeutic use in final product preparation, the polymer will be pharmaceutically acceptable.

[048] Os polímeros podem ser, cada um, de qualquer peso molecular e podem ser ramificados ou não ramificados. Os polímeros têm, cada um, tipicamente um peso molecular médio de entre cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa (em que o termo “cerca de” indica que, em preparações de um polímero solúvel em água, algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, que o peso molecular determinado). O peso molecular médio de cada polímero está entre cerca de 5 kDa e cerca de 50 kDa, de maior preferência, entre cerca de 12 kDa a cerca de 40 kDa e, de preferência máxima, entre cerca de 20 kDa a cerca de 35 kDa.[048] The polymers can each be of any molecular weight and can be branched or unbranched. The polymers each typically have an average molecular weight of between about 2 kDa to about 100 kDa (where the term “about” indicates that, in preparations of a water-soluble polymer, some molecules will weigh more, some less than the determined molecular weight). The average molecular weight of each polymer is between about 5 kDa and about 50 kDa, more preferably between about 12 kDa and about 40 kDa, and most preferably between about 20 kDa and about 35 kDa.

[049] Os polímeros solúveis em água adequados ou misturas dos mesmos incluem, porém, sem limitação, carboidratos N-ligados ou O-ligados, açúcares, fosfatos, carboidratos; açúcares; fosfatos; polietileno glicol (PEG) (incluindo as formas de PEG que foram usadas para derivar proteínas, incluindo mono-(C1-C10) alcóxi ou arilóxi- polietileno glicol); monometóxi-polietileno glicol; dextrano (tal como dextrano com peso molecular baixo, de, por exemplo, cerca de 6 kD), celulose; celulose; outros polímeros à base de carboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico. São também contemplados pela presente invenção moléculas de reticulação bifuncionais que podem ser suadas para preparar multímeros ligados de modo covalente.[049] Suitable water-soluble polymers or mixtures thereof include, however, without limitation, N-linked or O-linked carbohydrates, sugars, phosphates, carbohydrates; sugars; phosphates; polyethylene glycol (PEG) (including forms of PEG that have been used to derive proteins, including mono-(C1-C10) alkoxy or aryloxy-polyethylene glycol); monomethoxy-polyethylene glycol; dextran (such as low molecular weight dextran, for example about 6 kD), cellulose; cellulose; other carbohydrate-based polymers, poly-(N-vinyl pyrrolidone)polyethylene glycol, propylene glycol homopolymers, a polypropylene oxide/ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyols (e.g., glycerol) and polyvinyl alcohol. Also contemplated by the present invention are bifunctional cross-linking molecules that can be used to prepare covalently linked multimers.

[050] Em geral, a derivação química pode ser realizada sob qualquer condição adequada usada para reagir uma proteína com uma molécula de polímero ativada. Os métodos para preparar derivados químicos de polipeptídeos compreenderá, de modo geral, as etapas de (a) reagir o polipeptídeo com a molécula de polímero ativada (tal como um derivado de éster ou aldeído reativo da molécula de polímero) sob condições segundo as quais a molécula de ligação de ligante torna-se fixada a uma ou mais moléculas de polímero e (b) obter o(s) produto(s) de reação. As condições de reação ideais serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e nos resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a razão entre moléculas de polímero:proteína, maior a quantidade de molécula de polímero fixada. Em uma modalidade, o derivado de polipeptídeo de molécula de ligação de ligante pode ter uma única porção química de molécula de polímero no amino-terminal. (Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 5.234.784).[050] In general, chemical derivatization can be carried out under any suitable condition used to react a protein with an activated polymer molecule. Methods for preparing chemical derivatives of polypeptides will generally comprise the steps of (a) reacting the polypeptide with the activated polymer molecule (such as a reactive ester or aldehyde derivative of the polymer molecule) under conditions whereby the ligand binding molecule becomes attached to one or more polymer molecules and (b) obtain the reaction product(s). Optimal reaction conditions will be determined based on known parameters and desired results. For example, the greater the polymer:protein molecule ratio, the greater the amount of polymer molecule attached. In one embodiment, the ligand-binding molecule polypeptide derivative may have a single polymer molecule chemical moiety at the amino terminus. (See, for example, U.S. Patent No. 5,234,784).

[051] Um polímero solúvel em água particularmente preferencial para uso no presente documento é polietileno glicol (PEG). Conforme usado no presente documento, polietileno glicol pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que pode ser usada para derivar outras proteínas, tal como mono-(C1-C10) alcóxi ou arilóxi-polietileno glicol. PEG é um poliéter neutro linear ou ramificado, disponível em uma faixa ampla de pesos moleculares e é solúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos. PEG é efetivo na exclusão de outros polímeros ou peptídeos quando presente em água, principalmente através de sua alta mobilidade de cadeia dinâmica e natureza hidrofílica, criando, assim, uma carcaça de água ou esfera de hidratação quando fixado a outras proteínas ou superfície poliméricas. PEG é não tóxico, não imunogênico e aprovado pela Administração de Alimentos e Medicamentos para consumo interno.[051] A particularly preferred water-soluble polymer for use herein is polyethylene glycol (PEG). As used herein, polyethylene glycol is intended to encompass any of the forms of PEG that can be used to derive other proteins, such as mono-(C1-C10) alkoxy or aryloxy-polyethylene glycol. PEG is a linear or branched neutral polyether available in a wide range of molecular weights and is soluble in water and most organic solvents. PEG is effective in excluding other polymers or peptides when present in water, primarily through its high dynamic chain mobility and hydrophilic nature, thus creating a water shell or sphere of hydration when attached to other proteins or polymeric surfaces. PEG is non-toxic, non-immunogenic and approved by the Food and Drug Administration for internal consumption.

[052] As proteínas ou as enzimas quando conjugadas a PEG demonstraram bioatividade, propriedades não antigênicas e taxas de eliminação diminuídas quando administradas em animais. F. M. Veronese et al., Preparation and Properties of Monomethoxipoly(etilene glycol)-modified Enzymes for Therapeutic Applications, em J. M. Harris ed., Poly(Etilene Glycol) Chemistry--Biotechnical and Biomedical Applications, 127 a 136, 1992, incorporado ao presente a título de referência. Esses fenômenos devem-se às propriedades de exclusão de PEG no impedimento do reconhecimento pelo sistema imunológico. Adicionalmente, o PEG tem sido amplamente usado em procedimento de modificação de superfície para diminuir a adsorção de proteína e aprimorar a compatibilidade sanguínea. S. W. Kim et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 516: 116 a 130 1987; Jacobs et al., Artif. Organs 12: 500 a 501, 1988; Park et al., J. Poli. Sci, Part A 29:1.725 a 1.731, 1991, incorporado ao presente ao título de referência. As superfícies de polímero hidrofóbicas, tais como poliuretanos e poliestireno, podem ser modificadas pelo enxerto de PEG (MW 3.400) e empregadas como superfícies não trombogênicas. As propriedades de superfície (ângulo de contato) podem ser mais consistentes com superfícies hidrofóbicas, devido ao efeito de hidratação de PEG. De modo mais importante, a adsorção de proteína (albumina e outras proteínas plasmáticas) pode ser consideravelmente reduzida, resultante da alta mobilidade de cadeia, esfera de hidratação e propriedades de exclusão de proteína de PEG.[052] Proteins or enzymes when conjugated to PEG demonstrated bioactivity, non-antigenic properties and decreased elimination rates when administered to animals. F. M. Veronese et al., Preparation and Properties of Monomethoxypoly(ethylene glycol)-modified Enzymes for Therapeutic Applications, in J. M. Harris ed., Poly(Ethylene Glycol) Chemistry--Biotechnical and Biomedical Applications, 127 to 136, 1992, incorporated herein for reference. These phenomena are due to the exclusion properties of PEG in preventing recognition by the immune system. Additionally, PEG has been widely used in surface modification procedures to decrease protein adsorption and improve blood compatibility. S. W. Kim et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 516: 116 to 130 1987; Jacobs et al., Artif. Organs 12: 500 to 501, 1988; Park et al., J. Poli. Sci, Part A 29:1,725 to 1,731, 1991, incorporated herein by reference. Hydrophobic polymer surfaces, such as polyurethanes and polystyrene, can be modified by PEG grafting (MW 3,400) and employed as non-thrombogenic surfaces. Surface properties (contact angle) may be more consistent with hydrophobic surfaces due to the hydration effect of PEG. Most importantly, protein (albumin and other plasma proteins) adsorption can be considerably reduced, resulting from the high chain mobility, hydration sphere, and protein exclusion properties of PEG.

[053] O PEG (MW 3.400) foi determinado como um tamanho ideal em estudos de imobilização de superfície, Park et al., J. Biomed. Mat. Res. 26:739 a 745, 1992, em quando o PEG (MW 5.000) foi mais benéfico na diminuição de antigenicidade de proteína. (F. M. Veronese et al., Em J. M. Harris, et al., Poly(Etilene Glycol) Chemistry - Biotechnical and Biomedical Applications, 127 a 136.)[053] PEG (MW 3,400) was determined to be an ideal size in surface immobilization studies, Park et al., J. Biomed. Mat. Res. 26:739 to 745, 1992, when PEG (MW 5,000) was more beneficial in decreasing protein antigenicity. (F. M. Veronese et al., In J. M. Harris, et al., Poly(Ethylene Glycol) Chemistry - Biotechnical and Biomedical Applications, 127 to 136.)

[054] Os métodos para preparar moléculas de ligação de ligante peguiladas compreenderão, de modo geral, as etapas de (a) reagir o polipeptídeo com polietileno glicol (tal como um derivado de éster ou aldeído reativo de PEG) sob condições segundo as quais a molécula de ligante torna-se fixada a um ou mais grupos PEG e (b) obter o(s) produto(s) de reação. Em geral, as condições de reação ideais para as reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e nos resultados desejados. Por exemplo, quanto maior a razão entre PEG: Proteína, maior a porcentagem de produto polipeguilado. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante terá uma única porção química de PEG no N- terminal. Consultar, a Patente no U.S. 8.234.784, incorporada ao presente a título de referência. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento opcionalmente compreende pelo menos uma porção química de PEG fixada à molécula. Por exemplo, em algumas modalidades, o PEG de cerca de 20 a 40 kDa é fixado ao amino-terminal da molécula de ligação de ligante.[054] Methods for preparing pegylated ligand-binding molecules will generally comprise the steps of (a) reacting the polypeptide with polyethylene glycol (such as an ester or reactive aldehyde derivative of PEG) under conditions whereby the ligand molecule becomes attached to one or more PEG groups and (b) obtain the reaction product(s). In general, the ideal reaction conditions for acylation reactions will be determined based on known parameters and desired results. For example, the higher the PEG:Protein ratio, the higher the percentage of polypegylated product. In some embodiments, the ligand binding molecule will have a single PEG moiety at the N-terminus. See, U.S. Patent No. 8,234,784, incorporated herein by reference. In some embodiments, a ligand-binding molecule described herein optionally comprises at least one PEG moiety attached to the molecule. For example, in some embodiments, PEG of about 20 to 40 kDa is attached to the amino terminus of the ligand-binding molecule.

[055] As moléculas de ligação de ligante derivadas reveladas no presente documento podem ter atividades adicionais, atividade biológica intensificada ou reduzida ou outras características, tal como meia-vida aumentada ou diminuída, em comparação às moléculas não derivadas. Polinucleotídeos que codificam Moléculas de ligação de ligante e Sistemas de expressão[055] Derivative ligand binding molecules disclosed herein may have additional activities, enhanced or reduced biological activity or other characteristics, such as increased or decreased half-life, compared to non-derivative molecules. Polynucleotides Encoding Ligand Binding Molecules and Expression Systems

[056] A invenção compreende não apenas as moléculas de ligação de ligante, unidades de ligação e polipeptídeos descritos no presente documento, mas também ácidos nucleicos que codificam tais moléculas, vetores que compreende tais moléculas e células hospedeiras que compreendem tais vetores. Os métodos que empregam qualquer uma das moléculas, unidades, polipeptídeos, ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras são todos considerados aspectos da invenção.[056] The invention comprises not only the ligand-binding molecules, binding units and polypeptides described herein, but also nucleic acids encoding such molecules, vectors comprising such molecules and host cells comprising such vectors. Methods employing any of the molecules, units, polypeptides, nucleic acids, vectors and host cells are all considered aspects of the invention.

[057] Uma sequência de codificação de VEGFR-3 humano exemplificativa é apresentada na SEQ ID NO: 1 e fragmentos de SEQ ID NO: 1 (modificada no sequon N2) são contemplados como sequências de codificação para polipeptídeos de ligação de ligante descritos no presente documento. (Por exemplo, fragmentos que codificam todo ou porções do ECD de VEGFR-3 são contemplados.) Devido à degeneração bem conhecida do código genético, inúmeras sequências de codificação equivalentes são possíveis para qualquer sequência de codificação de polipeptídeo e todos tais equivalentes são contemplados como aspectos da invenção.[057] An exemplary human VEGFR-3 coding sequence is presented in SEQ ID NO: 1 and fragments of SEQ ID NO: 1 (modified in sequon N2) are contemplated as coding sequences for ligand-binding polypeptides described herein document. (For example, fragments encoding all or portions of the VEGFR-3 ECD are contemplated.) Due to the well-known degeneracy of the genetic code, numerous equivalent coding sequences are possible for any polypeptide coding sequence and all such equivalents are contemplated as aspects of the invention.

[058] Além disso, da mesma forma que a variação de sequência de aminoácidos a partir de ECD do tipo selvagem de VEGFR-3 é contemplada, conforme descrito acima, a variação de sequência de ácidos nucleicos é também contemplada. A variação de sequência de ácidos nucleicos pode ser caracterizada como identidade percentual em relação a SEQ ID NO: 1 (por exemplo, pelo menos 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade).[058] Furthermore, in the same way that amino acid sequence variation from VEGFR-3 wild-type ECD is contemplated, as described above, nucleic acid sequence variation is also contemplated. Nucleic acid sequence variation can be characterized as percent identity relative to SEQ ID NO: 1 (e.g., at least 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 99% of identity).

[059] A variação de sequência de nucleotídeos também pode ser caracterizada por capacidade de hibridização ao complemento de uma sequência de codificação preferencial. As moléculas de ácido nucleico incluem aquelas moléculas que compreendem sequências de nucleotídeo que se hibridizam sob condições moderada ou altamente estringentes definidas no presente documento com a sequência de codificação de ECD da molécula de ácido nucleico apresentada em SEQ ID NO: 1, ou de uma molécula que codifica um polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de tirosina quinase receptora apresentada em SEQ ID NOs: 2 e 3, ou de um fragmento de ácido nucleico conforme descrito no presente documento, ou de um fragmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo conforme descrito no presente documento.[059] Nucleotide sequence variation can also be characterized by the ability to hybridize to the complement of a preferred coding sequence. Nucleic acid molecules include those molecules that comprise nucleotide sequences that hybridize under moderately or highly stringent conditions defined herein to the ECD coding sequence of the nucleic acid molecule set forth in SEQ ID NO: 1, or of a molecule encoding a polypeptide, wherein the polypeptide comprises the receptor tyrosine kinase amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 2 and 3, or a nucleic acid fragment as described herein, or a nucleic acid fragment encoding a polypeptide as described herein.

[060] O termo “condições altamente estringentes” refere-se àquelas condições que são projetadas para permitir a hibridização de filamentos de DNA cujas sequências são altamente complementares e excluir a hibridização de DNAs significativamente incompatíveis. A estringência de hibridização é principalmente determinada por temperatura, resistência iônica e a concentração de agentes de desnaturação, tal como formamida. Os exemplos ode “condições altamente estringentes” para hibridização e lavagem são cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M a 65 a 68 °C ou cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M e formamida a 50% a 42 °C. Consultar Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989); e Anderson et al., Acid Nucleic Hybridization: a Practical approach, Capítulo 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra).Limited, Oxford, Inglaterra. Outros agentes podem estar incluídos nos tampões de hibridização e lavagem para o propósito de reduzir hibridização não específica e/ou de segundo plano. Os exemplos são albumina sérica bovina a 0,1%, polivinil- pirrolidona a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, dodecilsulfato de sódio a 0,1% (NaDodSO4 ou SDS), ficoll, solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (ou outro DNA não complementar) e sulfato de dextrano, embora outros agentes adequados podem ser também usados. A concentração e os tipos desses aditivos podem ser alterados sem afetar substancialmente a estringência das condições de hibridização. Os experimentos de hibridização são usualmente executados a pH 6,8 a 7,4; no entanto, em condições de resistência iônica típicas, a taxa de hibridização é quase independente de pH. Consultar Anderson et al., Acid Nucleic Hybridization: a Practical approach, Capítulo 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra).[060] The term “highly stringent conditions” refers to those conditions that are designed to allow the hybridization of DNA strands whose sequences are highly complementary and exclude the hybridization of significantly incompatible DNAs. Hybridization stringency is mainly determined by temperature, ionic strength and the concentration of denaturing agents such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for hybridization and washing are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 65 to 68 °C, or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate and 50% formamide at 42°C. See Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989); and Anderson et al., Acid Nucleic Hybridization: a Practical approach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).Limited, Oxford, England. Other agents may be included in hybridization and wash buffers for the purpose of reducing nonspecific and/or background hybridization. Examples are 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO4 or SDS), giroll, Denhardt's solution, Sonicated salmon sperm DNA (or other non-complementary DNA) and dextran sulfate, although other suitable agents may also be used. The concentration and types of these additives can be changed without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8 to 7.4; however, under typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is nearly independent of pH. See Anderson et al., Acid Nucleic Hybridization: a Practical approach, Chapter 4, IRL Press Limited (Oxford, England).

[061] Os fatores que afetam a estabilidade de um duplex de DNA incluem composição base, comprimento e grau de incompatibilidade de par de bases. As condições de hibridização podem ser ajustadas por um versado na técnica a fim de acomodar essas variáveis e permite que DNAs de diferentes relações de sequências formem híbridos. A temperatura de fusão de um duplex de DNA perfeitamente compatível pode ser estimada pela equação a seguir:[061] Factors that affect the stability of a DNA duplex include base composition, length and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by one skilled in the art to accommodate these variables and allow DNAs of different sequence relationships to form hybrids. The melting temperature of a perfectly matched DNA duplex can be estimated by the following equation:

[062] Tm(°C) = 81,5 + 16,6(log[Na+]) + 0,41(%G+C) - 600/N - 0,72(%formamida)[062] Tm(°C) = 81.5 + 16.6(log[Na+]) + 0.41(%G+C) - 600/N - 0.72(%formamide)

[063] Em que N é o comprimento do duplex formado, [Na+] é a concentração molar do íon de sódio na solução de hibridização ou lavagem, %G+C é a porcentagem de bases (guanina+citosina) no híbrido. Para híbridos imperfeitamente compatíveis, a temperatura de fusão é reduzida por aproximadamente 1 °C para cada 1% de compatibilidade.[063] Where N is the length of the duplex formed, [Na+] is the molar concentration of the sodium ion in the hybridization or washing solution, %G+C is the percentage of bases (guanine+cytosine) in the hybrid. For imperfectly compatible hybrids, the melting temperature is reduced by approximately 1°C for every 1% of compatibility.

[064] O termo “condições moderadamente estringentes” referem-se a condições sob as quais um duplex de DNA com um grau maior de incompatibilidade de par de bases que poderia ocorrer sob “condições altamente estringentes” pode ser formado. Os exemplos ode “condições moderadamente estringentes” são cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M a 50 a 65 °C ou cloreto de sódio a 0,015 M, citrato de sódio a 0,0015 M e formamida a 20% a 37 a 50 °C. A título de exemplo, uma condição “moderadamente estringente” de 50 °C em íon de sódio a 0,015 M permitirá uma incompatibilidade de cerca de 21%.[064] The term “moderately stringent conditions” refers to conditions under which a DNA duplex with a greater degree of base pair incompatibility than would occur under “highly stringent conditions” can be formed. Examples of “moderately stringent conditions” are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 50 to 65 °C, or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate, and 20 M formamide. % at 37 to 50 °C. By way of example, a “moderately stringent” condition of 50 °C in 0.015 M sodium ion will allow an incompatibility of about 21%.

[065] Uma boa estimativa da temperatura de fusão em NaCl* a 1 M para sondas de oligonucleotídeo até cerca de 20 nt é dada por:[065] A good estimate of the melting temperature in 1 M NaCl* for oligonucleotide probes up to about 20 nt is given by:

[066] Tm = 2 °C por par de bases A-T + 4 °C por par de bases G-C[066] Tm = 2 °C per A-T base pair + 4 °C per G-C base pair

[067] *A concentração de íon de sódio em sal de citrato de sódio 6x (SSC) é 1 M. Consultar Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes, página 683, Brown e Fox (eds.) (1981).[067] *The sodium ion concentration in 6x sodium citrate salt (SSC) is 1 M. See Suggs et al., Developmental Biology Using Purified Genes, page 683, Brown and Fox (eds.) (1981).

[068] As condições de lavagem de alta estringência para oligonucleotídeos estão usualmente a uma temperatura de 0 a 5 °C abaixo da Tm do oligonucleotídeo em 6x SSC, SDS a 0,1%.[068] High stringency washing conditions for oligonucleotides are usually at a temperature of 0 to 5 °C below the Tm of the oligonucleotide in 6x SSC, 0.1% SDS.

[069] Diferenças na sequência de ácidos nucleicos podem resultar em modificações conservadoras e/ou não conservadoras da sequência de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. A invenção é também direcionada a um DNA isolado e/ou purificado que corresponde a ou que se hibridiza sob condições estringentes com qualquer uma das sequências de DNA anteriores.[069] Differences in the nucleic acid sequence may result in conservative and/or non-conservative modifications of the amino acid sequence in relation to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. The invention is also directed to a DNA isolated and/or purified that corresponds to or hybridizes under stringent conditions to any of the above DNA sequences.

[070] Uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou uma parte de um polipeptídeo da invenção, tal como uma molécula de ligação de ligante ou uma unidade de ligação descrita no presente documento, pode ser produzida de uma variedade de formas, incluindo, sem limitação, síntese química, triagem de biblioteca genômica ou de cDNA, triagem e biblioteca de expressão e/ou amplificação por PCR de cDNA ou DNA genômico. Esses métodos e outros úteis para isolar tal DNA são apresentados, por exemplo, por Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), por Ausubel, et al., eds., “Current Protocols In Molecular Biology”, Current Protocols Press (1994) e por Berger e Kimmel, “Methods In Enzymology: Guide To Molecular Cloning Techniques”, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987). As sequências de ácidos nucleicos preferenciais são sequências de mamífero, tal como humano, rato e camundongo.[070] A nucleic acid molecule that encodes all or a part of a polypeptide of the invention, such as a ligand-binding molecule or a binding unit described herein, can be produced in a variety of ways, including, without limitation, chemical synthesis, genomic or cDNA library screening, expression library screening and/or PCR amplification of cDNA or genomic DNA. These methods and others useful for isolating such DNA are presented, for example, by Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), by Ausubel, et al ., eds., “Current Protocols In Molecular Biology”, Current Protocols Press (1994) and by Berger and Kimmel, “Methods In Enzymology: Guide To Molecular Cloning Techniques”, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif . (1987). Preferred nucleic acid sequences are mammalian sequences, such as human, rat and mouse.

[071] A síntese química de moléculas de ácido nucleico pode ser realizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica, tais como aqueles apresentados por Engels, et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716 a 734 (1989). Esses métodos incluem, entre outros, os métodos de fosfotriéster, fosforamidita e H-fosfonato de síntese de ácido nucleico. Ácidos nucleicos maiores que cerca de 100 nucleotídeos de comprimento podem ser sintetizados como diversos fragmentos, em que cada fragmento tem até cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Os fragmentos podem ser então ligados em conjunto, conforme descrito abaixo, para formar o ácido nucleico de comprimento completo de interesse. Um método preferencial é síntese suportada por polímero com o uso de química de fosforamidita-padrão.[071] The chemical synthesis of nucleic acid molecules can be carried out using methods well known in the art, such as those presented by Engels, et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716 to 734 (1989). These methods include, but are not limited to, the phosphotriester, phosphoramidite, and H-phosphonate methods of nucleic acid synthesis. Nucleic acids greater than about 100 nucleotides in length can be synthesized as several fragments, wherein each fragment is up to about 100 nucleotides in length. The fragments can then be ligated together, as described below, to form the full-length nucleic acid of interest. A preferred method is polymer-supported synthesis using standard phosphoramidite chemistry.

[072] O termo “vetor” refere-se a um veículo de amplificação, replicação e/ou expressão de molécula de ácido nucleico, frequentemente a partir de ou na forma de um sistema de DNA ou RNA plasmídeo ou viral, em quem o DNA ou RNA plasmídeo ou viral é funcional em uma célula hospedeira selecionada, tais como células hospedeiras de bactéria, levedura, planta, invertebrado e/ou mamífero. O vetor pode permanecer independente de DNA genômico de célula hospedeira ou pode integrar em todo ou em parte o DNA genômico. O vetor conterá todos os elementos necessários de modo a ser funcional em qualquer célula hospedeira com o qual é compatível. Tais elementos são apresentados abaixo.[072] The term “vector” refers to a vehicle for amplification, replication and/or expression of a nucleic acid molecule, often from or in the form of a plasmid or viral DNA or RNA system, in which the DNA or plasmid or viral RNA is functional in a selected host cell, such as bacterial, yeast, plant, invertebrate and/or mammalian host cells. The vector may remain independent of host cell genomic DNA or may integrate all or part of the genomic DNA. The vector will contain all necessary elements in order to be functional in any host cell with which it is compatible. Such elements are presented below.

[073] No caso em que o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou fragmento do mesmo foi isolado, o mesmo é, de preferência, inserido em um vetor de amplificação e/ou expressão a fim de aumentar o número de cópias do gene e/ou para expressar o polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira adequada e/ou para transformar células em um organismo alvo (para expressar o polipeptídeo in vivo). Inúmeros vetores comercialmente disponíveis são adequados, embora vetores “personalizados” possam ser usados também. O vetor é selecionado para ser funcional em uma célula hospedeira ou tecido hospedeiro particular (isto é, para replicação e/ou expressão). O polipeptídeo ou fragmento do mesmo pode ser amplificado/expresso em células hospedeiras procarióticas e/ou eucarióticas, por exemplo, células de levedura, inseto (sistemas de baculovírus), planta e mamífero. A seleção da célula hospedeira dependerá pelo menos em parte de se o polipeptídeo ou fragmento do mesmo deve ser glicosilado. Se sim, células hospedeiras de levedura, inseto ou mamífero são preferenciais; as células de levedura e mamífero glicosilarão o polipeptídeo se um sítio de glicosilação estiver presente na sequência de aminoácidos.[073] In the case where the nucleic acid encoding a polypeptide or fragment thereof has been isolated, it is preferably inserted into an amplification and/or expression vector in order to increase the number of copies of the gene and/or or to express the encoded polypeptide in a suitable host cell and/or to transform cells into a target organism (to express the polypeptide in vivo). Numerous commercially available vectors are suitable, although “custom” vectors can be used as well. The vector is selected to be functional in a particular host cell or host tissue (i.e., for replication and/or expression). The polypeptide or fragment thereof can be amplified/expressed in prokaryotic and/or eukaryotic host cells, for example, yeast, insect (baculovirus systems), plant and mammalian cells. Host cell selection will depend at least in part on whether the polypeptide or fragment thereof should be glycosylated. If so, yeast, insect, or mammalian host cells are preferred; yeast and mammalian cells will glycosylate the polypeptide if a glycosylation site is present in the amino acid sequence.

[074] Tipicamente, os vetores usados em qualquer uma das células hospedeiras conterá sequência de flanqueamento 5' e outros elementos reguladores, tal como um intensificador, um promotor, uma origem de elemento de replicação, um elemento de terminação de transcrição, uma sequência de íntrons completa contendo um sítio de emenda doador e aceitante, uma sequência de peptídeos sinal, um elemento de sítio de ligação de ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região de polielemento de ligação para inserir o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo a ser expresso e um elemento marcador selecionável. Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência “etiqueta”, isto é, uma sequência de oligonucleotídeos localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência de codificação que codifica poliHis (tal como hexaHis) ou outra sequência imunogênica pequena. Essa etiqueta será expressa juntamente com a proteína e pode servir como uma etiqueta de afinidade para purificação do polipeptídeo da célula hospedeira. Opcionalmente, a etiqueta pode ser subsequentemente removida do polipeptídeo purificado por vários meios, tal como com o uso de uma peptidase selecionada.[074] Typically, vectors used in any of the host cells will contain 5' flanking sequence and other regulatory elements, such as an enhancer, a promoter, an origin of replication element, a transcription termination element, a sequence of complete introns containing a donor and acceptor splice site, a signal peptide sequence, a ribosome binding site element, a polyadenylation sequence, a polyelement linker region for inserting the nucleic acid encoding the polypeptide to be expressed, and a selectable marker element. Optionally, the vector may contain a “tag” sequence, that is, an oligonucleotide sequence located at the 5' or 3' end of the coding sequence encoding polyHis (such as hexaHis) or other short immunogenic sequence. This tag will be expressed along with the protein and can serve as an affinity tag for purification of the polypeptide from the host cell. Optionally, the tag may subsequently be removed from the purified polypeptide by various means, such as using a selected peptidase.

[075] O vetor/construto de expressão pode conter opcionalmente elementos, tal como uma sequência de flanqueamento 5', uma origem de replicação, uma sequência de terminação de transcrição, uma sequência marcadora selecionável, um sítio de ligação de ribossomo, uma sequência sinal e uma ou mais sequências de íntrons. A sequência de flanqueamento 5' pode ser homóloga (isto é, da mesma espécie e/ou cepa que a célula hospedeira), heteróloga (isto é, de uma espécie diferente da espécie ou da cepa da célula hospedeira), híbrida (isto é, uma combinação de sequências de flanqueamento 5' de mais de uma fonte), sintética ou pode ser a sequência de flanqueamento 5' de polipeptídeos nativa. Como tal, a fonte da sequência de flanqueamento 5' pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico unicelular, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado, ou qualquer planta, contanto que a sequência de flanqueamento 5' seja funcional no mecanismo da célula hospedeira e possa ser ativada pelo mesmo.[075] The expression vector/construct may optionally contain elements such as a 5' flanking sequence, an origin of replication, a transcription termination sequence, a selectable marker sequence, a ribosome binding site, a signal sequence and one or more intron sequences. The 5' flanking sequence may be homologous (i.e., from the same species and/or strain as the host cell), heterologous (i.e., from a different species than the host cell species or strain), hybrid (i.e., a combination of 5' flanking sequences from more than one source), synthetic or may be the native polypeptide 5' flanking sequence. As such, the source of the 5' flanking sequence may be any single-celled prokaryotic or eukaryotic organism, any vertebrate or invertebrate organism, or any plant, as long as the 5' flanking sequence is functional in the host cell machinery and can be activated by the same.

[076] Um elemento de terminação de transcrição está tipicamente localizado 3' à extremidade da sequência de codificação de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição do polipeptídeo. Usualmente, o elemento de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C seguido por uma sequência de poli T. Tais elementos podem ser clonados a partir de uma biblioteca, adquiridos comercialmente como parte de um vetor e facilmente sintetizados.[076] A transcription termination element is typically located 3' to the end of the polypeptide coding sequence and serves to terminate transcription of the polypeptide. Usually, the transcription termination element in prokaryotic cells is a G-C-rich fragment followed by a poly T sequence. Such elements can be cloned from a library, purchased commercially as part of a vector, and easily synthesized.

[077] Os genes marcadores selecionáveis codificam proteínas necessárias para a sobrevivência e o crescimento de uma célula hospedeira em um meio de cultura seletivo. Os genes marcadores selecionáveis típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas, (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) suprem nutrientes essenciais não disponíveis a partir de meios complexos.[077] Selectable marker genes encode proteins necessary for the survival and growth of a host cell in a selective culture medium. Typical selectable marker genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, e.g., ampicillin, tetracycline, or kanamycin to prokaryotic host cells, (b) complement auxotrophic deficiencies of the cell; or (c) supply essential nutrients not available from complex media.

[078] Um elemento de ligação de ribossomo, comumente chamado de sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou a sequência de Kozak (eucariotas), é necessário para iniciação de tradução de mRNA. O elemento está tipicamente localizado 3' ao promotor e 5' à sequência de codificação do polipeptídeo a ser sintetizado. A sequência de Shine-Dalgarno é variada, mas é tipicamente uma polipurina (isto é, que tem um alto teor de A-G). Muitas sequências de Shine-Dalgarno foram identificadas, cada uma das quais pode ser facilmente sintetizada com o uso dos métodos apresentados acima.[078] A ribosome binding element, commonly called the Shine-Dalgarno sequence (prokaryotes) or the Kozak sequence (eukaryotes), is necessary for initiation of mRNA translation. The element is typically located 3' to the promoter and 5' to the coding sequence of the polypeptide to be synthesized. The Shine-Dalgarno sequence is varied, but is typically a polypurine (i.e., having a high A-G content). Many Shine-Dalgarno sequences have been identified, each of which can be easily synthesized using the methods presented above.

[079] Todos os elementos apresentados acima, assim como outros úteis nesta invenção, são bem conhecidos pelo versado e são descritos, por exemplo, em Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Berger, et al., eds., “Guide To Molecular Cloning Techniques”, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987).[079] All of the elements presented above, as well as others useful in this invention, are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Berger, et al., eds., “Guide To Molecular Cloning Techniques,” Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987).

[080] Para aquelas modalidades da invenção em que o polipeptídeo recombinante deve ser secretado, uma sequência sinal é, de preferência, incluída para direcionar a secreção da célula em que a mesma é sintetizada. Tipicamente, o polinucleotídeo que codifica a sequência sinal está posicionado na extremidade 5' da região de codificação. Muitas sequências sinal foram identificadas e qualquer uma das mesmas que seja funcional em uma célula ou espécie alvo pode ser suada em conjunto com o transgene.[080] For those embodiments of the invention in which the recombinant polypeptide must be secreted, a signal sequence is preferably included to direct secretion from the cell in which it is synthesized. Typically, the polynucleotide encoding the signal sequence is positioned at the 5' end of the coding region. Many signal sequences have been identified and any of them that are functional in a target cell or species can be used in conjunction with the transgene.

[081] Em muitos casos, a transcrição de gene é aumentada pela presença de um ou mais íntrons no vetor. O íntron pode ser de ocorrência natural, especialmente nos casos em que o transgene é um comprimento completo ou num fragmento de uma sequência de DNA genômico. O íntron pode ser homólogo ou heterólogo ao transgene e/ou ao mamífero transgênico em que o gene será inserido. A posição do íntron em relação ao promotor e ao transgene é importante, já que o íntron precisa ser transcrito para ser efetivo. Uma posição preferencial para um íntron é 3' ao sítio de início de transcrição e 5' à sequência de terminação de transcrição. Para transgenes de cDNA, um íntron está posicionado em um lado e outro, isto é, 5' ou 3') da sequência de codificação de transgene. Um íntron de qualquer fonte, incluindo quaisquer organismos virais, procariótico e eucarióticos (planta ou animal), pode ser usado para expressar o polipeptídeo, contato que seja compatível com a(s) célula(s) hospedeira(s) em que está inserido. Estão também incluídos íntrons sintéticos. Opcionalmente, mais de um íntron pode ser usado no vetor.[081] In many cases, gene transcription is increased by the presence of one or more introns in the vector. The intron may be naturally occurring, especially in cases where the transgene is a full length or a fragment of a genomic DNA sequence. The intron may be homologous or heterologous to the transgene and/or the transgenic mammal into which the gene will be inserted. The position of the intron in relation to the promoter and transgene is important, as the intron needs to be transcribed to be effective. A preferred position for an intron is 3' to the transcription start site and 5' to the transcription termination sequence. For cDNA transgenes, an intron is positioned on either side, i.e., 5' or 3') of the transgene coding sequence. An intron from any source, including any viral, prokaryotic, and eukaryotic organisms (plant or animal), can be used to express the polypeptide, which is compatible with the host cell(s) in which it is inserted. Synthetic introns are also included. Optionally, more than one intron can be used in the vector.

[082] Os vetores exemplificativos para expressão recombinante são aqueles que são compatíveis com célula hospedeiras de bactéria, inseto e mamífero. Tais vetores incluem, entre outros, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.) e pETL (BlueBacII; Invitrogen).[082] Exemplary vectors for recombinant expression are those that are compatible with bacterial, insect and mammalian host cells. Such vectors include, among others, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), and pETL (BlueBacII; Invitrogen).

[083] Após o vetor ter sido construído e um ácido nucleico ter sido inserido no sítio apropriado do vetor, o vetor contemplado pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão de polipeptídeo. Os comumente usados incluem: Células procarióticas, tais como bactérias gram-negativas ou gram-positivas, isto é, qualquer cepa de E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, e similares; células eucarióticas, tais como células de CHO (ovários de Hamster-Chinês); células 293 de rim humano; células COS-7; células de inseto, tal como Sf4, Sf5, Sf9 e Sf21 e High 5 (todos da Invitrogen Company, San Diego, Calif.); células de planta e várias células de levedura, tal como Saccharomyces e Pichia. Qualquer célula ou linhagem de células transformável ou transfectável derivada de qualquer organismo, tal como bactérias, leveduras, fungos, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, células de planta e animais, é adequada.[083] After the vector has been constructed and a nucleic acid has been inserted into the appropriate site of the vector, the contemplated vector can be inserted into a suitable host cell for amplification and/or polypeptide expression. Commonly used ones include: Prokaryotic cells, such as gram-negative or gram-positive bacteria, that is, any strain of E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Salmonella, and the like; eukaryotic cells, such as CHO cells (Chinese Hamster ovaries); human kidney 293 cells; COS-7 cells; insect cells, such as Sf4, Sf5, Sf9 and Sf21 and High 5 (all from Invitrogen Company, San Diego, Calif.); plant cells and various yeast cells, such as Saccharomyces and Pichia. Any transformable or transfectable cell or cell line derived from any organism, such as bacteria, yeast, fungi, monocotyledonous and dicot plants, plant and animal cells, is suitable.

[084] A inserção (também referida como “transformação” ou “transfecção”) do vetor na célula hospedeira selecionada pode ser realizada com o uso de tais métodos, tal como cloreto de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção ou o método de DEAE-dextrano. O método selecionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada. Esses métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos pelo versado na técnica e são apresentados, por exemplo, em Sambrook, et al., supra.[084] Insertion (also referred to as “transformation” or “transfection”) of the vector into the selected host cell can be carried out using such methods, such as calcium chloride, electroporation, microinjection, lipofection or the DEAE method. dextran. The method selected will, in part, be a function of the type of host cell to be used. These methods and other suitable methods are well known to those skilled in the art and are set forth, for example, in Sambrook, et al., supra.

[085] As células hospedeiras que contêm o vetor (isto é, transformadas ou transfectadas) podem ser cultivadas com o uso de meios-padrão bem conhecidos pelo versado. Os meios usualmente conterão todos os nutrientes necessários para o crescimento e a sobrevivência das células. Os meios adequados para cultivar células de E. coli são, por exemplo, Caldo Luria (LB) e/ou Caldo Terrific (TB). Os meios adequados para cultivar células eucarióticas são RPMI 1640, MEM, DMEM, todos os quais podem ser suplementados com soro e/ou fatores de crescimento conforme exigido pela linhagem de células particular que é cultivada. Um meio adequado para culturas de inseto é o meio de Grace suplementado com extrato de levedura, hidrolisado de lactalbumina e/ou soro fetal de bezerro, conforme necessário.[085] Host cells containing the vector (that is, transformed or transfected) can be cultured using standard media well known to the skilled artisan. The media will usually contain all the nutrients necessary for cell growth and survival. Suitable media for cultivating E. coli cells are, for example, Luria Broth (LB) and/or Terrific Broth (TB). Suitable media for culturing eukaryotic cells are RPMI 1640, MEM, DMEM, all of which can be supplemented with serum and/or growth factors as required by the particular cell line being cultured. A suitable medium for insect cultures is Grace's medium supplemented with yeast extract, lactalbumin hydrolyzate and/or fetal calf serum as needed.

[086] Tipicamente, um antibiótico ou outro composto útil para crescimento seletivo das células transformadas é apenas adicionado como um suplemento aos meios. O composto a ser usado será determinado pelo elemento marcador selecionável presente no plasmídeo com o qual a célula hospedeira foi transformada. Por exemplo, nos casos em que o elemento marcador selecionável é resistência à canamicina, o composto adicionado ao meio de cultura será canamicina.[086] Typically, an antibiotic or other compound useful for selective growth of transformed cells is only added as a supplement to the media. The compound to be used will be determined by the selectable marker element present in the plasmid with which the host cell was transformed. For example, in cases where the selectable marker element is kanamycin resistance, the compound added to the culture medium will be kanamycin.

[087] A quantidade de polipeptídeo produzida na célula hospedeira pode ser avaliada com o uso de métodos- padrão conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, análise por Western blot, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, eletroforese em não de não desnaturação, separação por HPLC, imunoprecipitação e/ou ensaios de ligação.[087] The amount of polypeptide produced in the host cell can be evaluated using standard methods known in the art. Such methods include, without limitation, Western blot analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing electrophoresis, HPLC separation, immunoprecipitation and/or binding assays.

[088] Se o polipeptídeo tiver sido projetado para ser secretado a partir das células hospedeiras, a maior parte do polipeptídeo provavelmente será encontrada no meio de cultura de células. Se, no entanto, o polipeptídeo não for secretado a partir das células hospedeiras, o mesmo estará presente no citoplasma (para células eucarióticas, de bactérias gram-positivas e de inseto) ou no periplasma (para células hospedeiras de bactérias gram-negativas).[088] If the polypeptide has been designed to be secreted from host cells, most of the polypeptide will likely be found in the cell culture medium. If, however, the polypeptide is not secreted from the host cells, it will be present in the cytoplasm (for eukaryotic, gram-positive bacteria and insect cells) or in the periplasm (for gram-negative bacteria host cells).

[089] Para polipeptídeos intracelulares, as células hospedeiras são primeiramente rompidas de modo mecânico ou osmótico para liberar os conteúdos citoplásmicos em uma solução tamponada. O polipeptídeo é então isolado dessa solução.[089] For intracellular polypeptides, host cells are first disrupted mechanically or osmoticly to release cytoplasmic contents into a buffered solution. The polypeptide is then isolated from this solution.

[090] Para produção a longo prazo e de alto rendimento de um polipeptídeo recombinante, expressão estável é preferencial. Por exemplo, a linhagem de células que expressa estavelmente o polipeptídeo de interesse pode ser transformada com o uso de vetores de expressão que podem conter origens virais de replicação e/ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável no mesmo vetor ou em um vetor separado. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção e sua presença permite o crescimento e a recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Os clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados com o uso de técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Uma linhagem de células substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isolada para fornecer uma linha de células estável.[090] For long-term, high-yield production of a recombinant polypeptide, stable expression is preferred. For example, the cell line that stably expresses the polypeptide of interest can be transformed using expression vectors that may contain viral origins of replication and/or endogenous expression elements and a selectable marker gene in the same vector or in a vector separate. After vector introduction, cells can be allowed to grow for 1 to 2 days in enriched medium before being switched to selective medium. The purpose of the selectable marker is to confer resistance to selection and its presence allows the growth and recovery of cells that successfully express the introduced sequences. Resistant clones of stably transformed cells can be proliferated using tissue culture techniques appropriate for the cell type. A cell line substantially enriched in such cells can then be isolated to provide a stable cell line.

[091] Um método particularmente preferencial de produção de alto rendimento de um polipeptídeo recombinante da presente invenção é através do uso de amplificação de diidrofolato redutase (DHFR) em células de CHO deficientes de DHFR, pelo uso de níveis sucessivamente crescentes de metotrexato, conforme descrito no documento U.S. 4.889.803. O polipeptídeo obtido pode estar na forma glicosilada.[091] A particularly preferred method of high-yield production of a recombinant polypeptide of the present invention is through the use of amplification of dihydrofolate reductase (DHFR) in DHFR-deficient CHO cells, by the use of successively increasing levels of methotrexate, as described in U.S. 4,889,803. The polypeptide obtained may be in glycosylated form.

[092] A purificação do polipeptídeo a partir da solução pode ser realizada com o uso de uma variedade de técnicas. Se o polipeptídeo tiver sido sintetizado de modo que contenha uma etiqueta, tal como hexaistidina ou outro peptídeo pequeno em qualquer um dentre seu carboxil ou amino-terminal, o mesmo pode ser essencialmente purificado em um processo de uma etapa, passando-se a solução através de uma coluna de afinidade em que a matriz de coluna tem alta afinidade para a etiqueta ou for o polipeptídeo diretamente (isto é, um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente o polipeptídeo). Por exemplo, a poliistidina liga-se com grande afinidade e especificidade ao níquel, portanto, uma coluna de afinidade de níquel (tal como as colunas de níquel Qiagen) pode ser usada para purificação do polipeptídeo etiquetado com His. (Consultar, por exemplo, Ausubel, et al., eds., “Current Protocols In Molecular Biology”, Seção 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)).[092] Purification of the polypeptide from solution can be carried out using a variety of techniques. If the polypeptide has been synthesized so that it contains a tag, such as hexahistidine or another small peptide at either its carboxyl or amino terminus, it can essentially be purified in a one-step process by passing the solution through of an affinity column in which the column matrix has high affinity for the tag or polypeptide directly (i.e., a monoclonal antibody that specifically recognizes the polypeptide). For example, polyhistidine binds with great affinity and specificity to nickel, therefore a nickel affinity column (such as Qiagen nickel columns) can be used for purification of the His-tagged polypeptide. (See, e.g., Ausubel, et al., eds., “Current Protocols In Molecular Biology,” Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)).

[093] A forte afinidade de um ligante a seu receptor permite purificação por afinidade de moléculas de ligação de ligante e moléculas de ligação de ligante que usam uma matriz de afinidade que compreende um parceiro de ligação complementar. Cromatografia por afinidade pode ser empregada, por exemplo, com o uso ou de parceiros de ligação naturais (por exemplo, um ligante quando purifica uma molécula de ligação de ligante com afinidade para a mesma) ou anticorpos gerados com o uso de procedimento-padrão (por exemplo, imunização de um camundongo, coelho ou outro animal com um polipeptídeo apropriado). Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para gerar tais anticorpos. Anticorpos reconhecidos ou anticorpos para reconhecer receptores de fator de crescimento podem ser empregados quando compartilham um epítopo com uma molécula de ligação de ligante alvejada.[093] The strong affinity of a ligand to its receptor allows affinity purification of ligand-binding molecules and ligand-binding molecules using an affinity matrix comprising a complementary binding partner. Affinity chromatography can be employed, for example, with the use of either natural binding partners (e.g., a ligand when purifying a ligand-binding molecule with affinity for it) or antibodies generated using a standard procedure ( e.g., immunization of a mouse, rabbit, or other animal with an appropriate polypeptide). The peptides of the present invention can be used to generate such antibodies. Recognized antibodies or antibodies to recognize growth factor receptors can be employed when they share an epitope with a targeted ligand-binding molecule.

[094] Adicionalmente, outros procedimentos bem conhecidos para purificação podem ser usados. Tais procedimentos incluem, sem limitação, cromatografia por troca iônica, cromatografia por peneira molecular, HPLC, eletroforese por gel nativo em combinação com eluição e focagem isoelétrica preparativa (máquina/técnica “Isoprime”, Hoefer Scientific). Em alguns casos, duas ou mais dessas técnicas podem ser combinadas para atingir pureza aumentada. Os métodos preferenciais para purificação incluem etiquetagem com poliistidina e cromatografia por troca iônica em combinação com focagem isoelétrica preparativa.[094] Additionally, other well-known purification procedures can be used. Such procedures include, without limitation, ion exchange chromatography, molecular sieve chromatography, HPLC, native gel electrophoresis in combination with elution and preparative isoelectric focusing (“Isoprime” machine/technique, Hoefer Scientific). In some cases, two or more of these techniques can be combined to achieve increased purity. Preferred methods for purification include polyhistidine labeling and ion exchange chromatography in combination with preparative isoelectric focusing.

[095] O polímero encontrado no espaço periplásmico das bactérias ou no citoplasma de células eucarióticas, os teores do periplasma ou do citoplasma, incluindo corpos de inclusão (bactérias), se o polipeptídeo processado tiver formado tais complexos, podem ser extraídos da célula hospedeira com o uso de qualquer técnica-padrão conhecida pelo versado na técnica. Por exemplo, as células hospedeiras podem ser lisadas para liberar os conteúdos do periplasma por prensa de French, homogenização e/ou sonicação. O homogenato pode ser então centrifugado.[095] The polymer found in the periplasmic space of bacteria or in the cytoplasm of eukaryotic cells, the contents of the periplasm or cytoplasm, including inclusion bodies (bacteria), if the processed polypeptide has formed such complexes, can be extracted from the host cell with the use of any standard technique known to the person skilled in the art. For example, host cells can be lysed to release periplasm contents by French press, homogenization and/or sonication. The homogenate can then be centrifuged.

[096] Se o polipeptídeo tiver formado corpos de inclusão no periplasma, os corpos de inclusão podem ligar-se frequentemente às membranas celulares interna e/ou externa e, assim, serão encontrados principalmente no material de pélete após a centrifugação. O material de pélete pode ser então tratado com um agente caotrópico, tal como guanidina ou ureia, para liberar, decompor e solubilizar os corpos de inclusão. O polipeptídeo solubilizado pode então ser analisado com o uso de eletroforese em gel, imunoprecipitação ou similares. Se for desejado isolar o polipeptídeo, o isolamento pode ser realizado com o uso de métodos-padrão, tais como aqueles apresentados abaixo e em [Marston, et al., Meth. Enz., 182:264 a 275 (1990)][096] If the polypeptide has formed inclusion bodies in the periplasm, the inclusion bodies may frequently bind to the inner and/or outer cell membranes and will therefore be found mainly in the pellet material after centrifugation. The pellet material can then be treated with a chaotropic agent, such as guanidine or urea, to release, decompose and solubilize the inclusion bodies. The solubilized polypeptide can then be analyzed using gel electrophoresis, immunoprecipitation or the like. If it is desired to isolate the polypeptide, isolation can be accomplished using standard methods, such as those presented below and in [Marston, et al., Meth. Enz., 182:264 to 275 (1990)]

[097]Terapia de Gene[097]Gene Therapy

[098] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos da invenção compreendem, ainda, sequências adicionais para facilitar a terapia de gene. Em uma modalidade, um transgene “nu” que codifica uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento (isto é, um transgene se um vetor viral, lipossomal ou outro vetor para facilitar a transfecção) é empregado para terapia de gene.[098] In some embodiments, the polynucleotides of the invention further comprise additional sequences to facilitate gene therapy. In one embodiment, a “naked” transgene encoding a ligand-binding molecule described herein (i.e., a transgene whether a viral, liposomal, or other vector to facilitate transfection) is employed for gene therapy.

[099] Os vetores são também úteis para regimes de tratamento por “terapia de gene”, em que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou uma molécula de ligação de ligante é introduzido em um sujeito que precisa de inibição de neovascularização, em uma forma que faz com que as células no sujeito expressam a molécula de ligação de ligante da invenção in vivo. Os aspectos da terapia de gene que são descritos nas Publicações de Patente no 2002/0151680 e WO 01/62942, ambas as quais são incorporadas ao presente a título de referência, são também aplicáveis no presente documento.[099] Vectors are also useful for “gene therapy” treatment regimens, in which a polynucleotide encoding a polypeptide or ligand-binding molecule is introduced into a subject in need of inhibition of neovascularization, in a form that causes cells in the subject to express the ligand-binding molecule of the invention in vivo. Aspects of gene therapy that are described in Patent Publications No. 2002/0151680 and WO 01/62942, both of which are incorporated herein by reference, are also applicable herein.

[0100] Qualquer vetor adequado pode ser usado para introduzir um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento, no hospedeiro. Os vetores exemplificativos que foram descritos na literatura incluem vetores retrovirais deficientes em replicação, incluindo, porém, sem limitação, vetores de lentivírus (Kim et al., J. Virol., 72(1): 811 a 816,1998; Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, outubro de 1998, páginas 43 a 46) ; vetores virais adenoassociados (AAV) (Patentes no U.S. 5.474.935l; 5.139.941; 5.622.856; 5.658.776; 5.773.289; 5.789.390; 5.834.441; 5.863.541; 5.851.521; 5.252.479; Gnatenko et al., J. Invest. Med., 45: 87 a 98, 1997); vetores adenovirais (AV) (Patentes no U.S. 5.792.453; 5.824.544; 5.707.618; 5.693.509; 5.670.488; 5.585.362; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89: 2.581 a 2.584, 1992; Stratford Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90:626 a 630, 1992; e Rosenfeld et al., Cell, 68: 143 a 155, 1992); um quimérico adenoviral ou viral adenoassociado (Patente no U.S. 5.856.152) ou um viral da varíola ou um herpesviral (Patentes no U.S. 5,879,934; 5,849,571; 5,830,727; 5,661,033; 5,328,688); Transferência de gene mediada por lipofectina (BRL); vetores lipossomais (Patente no U.S. 5.631.237, Lipossomos que compreendem proteínas de vírus Sendai); e combinações dos mesmos. Todos os documentos anteriores são incorporados ao presente a título de referência em sua totalidade.[0100] Any suitable vector can be used to introduce a polynucleotide encoding a ligand-binding molecule described herein into the host. Exemplary vectors that have been described in the literature include replication-deficient retroviral vectors, including, but not limited to, lentivirus vectors (Kim et al., J. Virol., 72(1): 811 to 816, 1998; Kingsman & Johnson , Script Magazine, October 1998, pages 43 to 46); adeno-associated viral (AAV) vectors (U.S. Patents 5,474,935l; 5,139,941; 5,622,856; 5,658,776; 5,773,289; 5,789,390; 5,834,441; 5,863,541; 5,851,521; 5,252,479; Gnatenko et al., J. Invest. Med., 45: 87 to 98, 1997); adenoviral vectors (AV) (U.S. Patents 5,792,453; 5,824,544; 5,707,618; 5,693,509; 5,670,488; 5,585,362; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581 to 2584, 1992; Stratford Perricadet et al., J. Clin. Invest., 90:626 to 630, 1992; and Rosenfeld et al., Cell, 68: 143 to 155, 1992); a chimeric adenoviral or adeno-associated viral (U.S. Patent 5,856,152) or a smallpox viral or a herpesviral (U.S. Patent 5,879,934; 5,849,571; 5,830,727; 5,661,033; 5,328,688); Lipofectin-mediated gene transfer (BRL); liposomal vectors (U.S. Patent No. 5,631,237, Liposomes comprising Sendai virus proteins); and combinations thereof. All previous documents are incorporated herein by reference in their entirety.

[0101] Outros mecanismos de entrega não virais contemplados incluem, porém, sem limitação, precipitação de fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, Virology, 52:456 a 467, 1973; Chen e Okayama, Mol. Cell Biol., 7:2.745 a 2.752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689 a 695, 1990) DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1.188 a 1.190, 1985), eletroporação (Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716 a 718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA, 81:7.161 a 7.165, 1984), microinjeção direta (Harland e Weintraub, J. Cell Biol., 101:1.094 a 1.099, 1985.), lipossomos carregados em DNA (Nicolau e Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185 a 190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 76:3.348 a 3.352, 1979; Felgner, Sci Am. 276(6):102 a 106, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(15): 1.791 a 1.793, 1996), sonicação celular (Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 84:8.463 a 8.467, 1987), bombardeio de gene com o uso de microprojéteis em alta velocidade (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA, 87:9.568 a 9.572, 1990) e transfecção mediada por receptor (Wu e Wu, J. Biol. Chem., 262:4.429 a 4.432, 1987; Wu e Wu, Biochemistry, 27:887 a 892, 1988; Wu e Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159 a 167, 1993).[0101] Other contemplated non-viral delivery mechanisms include, but are not limited to, calcium phosphate precipitation (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456 to 467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7 :2745 to 2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689 to 695, 1990) DEAE-dextran (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188 to 1190, 1985), electroporation (Tur -Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716 to 718, 1986; Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:7,161 to 7,165, 1984), direct microinjection (Harland and Weintraub , J. Cell Biol., 101:1094 to 1099, 1985.), DNA-loaded liposomes (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185 to 190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 76:3,348 to 3,352, 1979; Felgner, Sci Am. 276(6):102 to 106, 1997; Felgner, Hum Gene Ther. 7(15): 1,791 to 1,793, 1996), cell sonication ( Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8,463 to 8,467, 1987), gene bombardment using high-velocity microprojectiles (Yang et al., Proc. Natl. Academic. Sci USA, 87:9,568 to 9,572, 1990) and receptor-mediated transfection (Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4,429 to 4,432, 1987; Wu and Wu, Biochemistry, 27:887 to 892, 1988; Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159 to 167, 1993).

[0102] O construto de expressão (ou, de fato, uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento) pode ser aprisionado em um lipossomo. Os lipossomos são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana de bicamada de fosfolipídio e um meio aquoso interno. Os lipossomos multilamelares têm múltiplas camadas de lipídio separadas por meio aquoso. Os mesmos formam-se espontaneamente quando fosfolipídios estão suspensos em um excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem autorreorganização antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas de lipídio (Ghosh e Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, páginas 87 a 104, 1991). A adição de DNA a lipossomos catiônicos causa uma transição topológica de lipossomos para glóbulos condensados cristalinos líquidos opticamente birrefringentes (Radler et al., Science, 275(5301):810 a 814, 1997). Esses complexos de DNA-lipídio são vetores não virais para uso em terapia de gene e entrega.[0102] The expression construct (or, in fact, a ligand-binding molecule described herein) can be entrapped in a liposome. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer membrane and an internal aqueous medium. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in an excess of aqueous solution. Lipid components undergo self-reorganization before the formation of closed structures and trap water and dissolved solutes between the lipid bilayers (Ghosh and Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C ed., New York: Marcel Dekker, pages 87 to 104, 1991). The addition of DNA to cationic liposomes causes a topological transition from liposomes to optically birefringent liquid crystalline condensed globules (Radler et al., Science, 275(5301):810 to 814, 1997). These DNA-lipid complexes are non-viral vectors for use in gene therapy and delivery.

[0103] A entrega de ácido nucleico mediada por lipossomo e a expressão de DNA estranho in vitro foram bem- sucedidas. São também contempladas na presente invenção várias abordagens comerciais que envolvem tecnologia de “lipofecção”. Em certas modalidades da invenção, o lipossomo pode ser complexado com um vírus de hemaglutinação (HVJ). Isso mostrou facilitar a fusão com a membrana celular e promover a entrada celular de DNA encapsulado por lipossomo (Kaneda et al., Science, 243:375 a 378, 1989). Em outras modalidades, o lipossomo pode ser complexado ou empregado em conjunto com proteínas cromossômicas não histona nucleares (HMG-1) (Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3.361 a 3.364, 1991). Em ainda outras modalidades, o lipossomo pode ser complexado ou empregado em conjunto com tanto HVJ como HMG-1. Pelo fato de que tais construtos de expressão foram empregados com sucesso na transferência e expressão de ácido nucleico in vitro e in vivo, então os mesmos são aplicáveis para a presente invenção.[0103] Liposome-mediated nucleic acid delivery and foreign DNA expression in vitro were successful. Also contemplated in the present invention are several commercial approaches involving “lipofection” technology. In certain embodiments of the invention, the liposome can be complexed with a hemagglutination virus (HVJ). This has been shown to facilitate fusion with the cell membrane and promote cellular entry of liposome-encapsulated DNA (Kaneda et al., Science, 243:375 to 378, 1989). In other embodiments, the liposome can be complexed or used in conjunction with nuclear non-histone chromosomal proteins (HMG-1) (Kato et al., J. Biol. Chem., 266:3361 to 3364, 1991). In still other embodiments, the liposome can be complexed or used in conjunction with both HVJ and HMG-1. Because such expression constructs have been successfully used in the transfer and expression of nucleic acid in vitro and in vivo, they are applicable to the present invention.

[0104] Outra modalidade da invenção para transferir um construto de expressão de DNA nu em células pode envolver bombardeio de partículas. Esse método depende da capacidade de acelerar os microprojéteis revestidos com DNA até uma velocidade alta que permite que os mesmos perfurem membranas celulares e entrem nas células sem matar as mesmas (Klein et al., Nature, 327:70-73, 1987). Diversos dispositivos para aceleração de partículas pequenas têm sido desenvolvidos. Tal dispositivo conta com uma descarga de alta tensão para gerar uma corrente elétrica, que, por sua vez, fornece a força motriz (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA, 87:9.568 a 9.572, 1990). Os microprojéteis usados consistiram em substâncias biologicamente inertes, tais como microesferas de tungstênio ou ouro.[0104] Another embodiment of the invention for transferring a naked DNA expression construct into cells may involve particle bombardment. This method depends on the ability to accelerate DNA-coated microprojectiles to a high speed that allows them to pierce cell membranes and enter cells without killing them (Klein et al., Nature, 327:70-73, 1987). Several devices for accelerating small particles have been developed. Such a device relies on a high voltage discharge to generate an electrical current, which, in turn, provides the driving force (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87:9,568 to 9,572, 1990). The microprojectiles used consisted of biologically inert substances, such as tungsten or gold microspheres.

[0105] Em modalidades que empregam um vetor viral, polinucleotídeos preferenciais incluem ainda um promotor adequado e sequência de poliadenilação, conforme descrito acima. Além disso, será facilmente percebido que, nessas modalidades, o polinucleotídeo inclui adicionalmente sequências de polinucleotídeos de vetor (por exemplo, sequências de polinucleotídeos adenovirais) conectadas de modo operativo à sequência que codifica um polipeptídeo da invenção. Usos Terapêuticos das Moléculas de Ligação de Ligante[0105] In embodiments that employ a viral vector, preferred polynucleotides further include a suitable promoter and polyadenylation sequence, as described above. Furthermore, it will be readily appreciated that, in these embodiments, the polynucleotide additionally includes vector polynucleotide sequences (e.g., adenoviral polynucleotide sequences) operatively linked to the sequence encoding a polypeptide of the invention. Therapeutic Uses of Ligand-Binding Molecules

[0106] O polipeptídeo de ligação de ligante e as moléculas descritas no presente documento, e os polinucleotídeos e os vetores que codificam os mesmos, são úteis para inibir processos celulares que são mediados através de fatores de crescimento endoteliais que induzem transdução de sinal através de VEGFR-2 ou VEGFR-3 e têm indicações para profilaxia ou terapia de distúrbios associados com angiogênese e/ou linfangiogênese anormal (por exemplo, várias doenças oculares e câncer) que é estimulada pelas ações de tais fatores de crescimento nesses receptores. O polipeptídeo de ligação de ligante e as moléculas descritas no presente documento, e os polinucleotídeos e vetores que codificam os mesmos, são terapeuticamente úteis para tratar ou prevenir qualquer doença de afecção que é aprimorada, melhorada, inibida ou prevenida pela remoção, inibição ou redução de VEGF-C e/ou VEGF-D. Uma lista não exaustiva de afecções específicas melhoradas por inibição ou redução de VEGF-C e/ou VEGF-D (e, em particular, pelo menos VEGF-C) incluem: Afecções clínicas que são caracterizadas por proliferação de células endoteliais excessiva, permeabilidade vascular, edema ou inflamação, tal como edema cerebral associado à lesão, derrame ou tumor; edema associado a doenças inflamatórias, tal como psoríase ou artrite, incluindo artrite reumatoide; asma; edema generalizado associado a queimaduras; ascites e efusão pleural associada a tumores, inflamação ou trauma; inflamação crônica das vias respiratórias; síndrome de extravasamento capilar; sepse; doença renal associada a vazamento aumentado de proteína; e doenças dos olhos, tal como degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética.[0106] The ligand-binding polypeptide and molecules described herein, and the polynucleotides and vectors encoding the same, are useful for inhibiting cellular processes that are mediated through endothelial growth factors that induce signal transduction through VEGFR-2 or VEGFR-3 and have indications for prophylaxis or therapy of disorders associated with abnormal angiogenesis and/or lymphangiogenesis (e.g., various ocular diseases and cancer) that is stimulated by the actions of such growth factors at these receptors. The ligand-binding polypeptide and molecules described herein, and the polynucleotides and vectors encoding the same, are therapeutically useful for treating or preventing any disease condition that is ameliorated, ameliorated, inhibited or prevented by removing, inhibiting or reducing of VEGF-C and/or VEGF-D. A non-exhaustive list of specific conditions ameliorated by inhibition or reduction of VEGF-C and/or VEGF-D (and, in particular, at least VEGF-C) include: Clinical conditions that are characterized by excessive endothelial cell proliferation, vascular permeability , edema or inflammation, such as cerebral edema associated with injury, stroke or tumor; edema associated with inflammatory diseases such as psoriasis or arthritis, including rheumatoid arthritis; asthma; generalized edema associated with burns; ascites and pleural effusion associated with tumors, inflammation or trauma; chronic inflammation of the airways; capillary leak syndrome; sepsis; kidney disease associated with increased protein leakage; and eye diseases, such as age-related macular degeneration and diabetic retinopathy.

[0107] Embora para brevidade muitos dos métodos sejam descritos abaixo em relação a composições que compreendem uma molécula de ligação de ligante, deve-se entender que a prática da invenção com qualquer um dos construtos descritos no presente documento (polipeptídeos de ligação de ligante, moléculas e construtos, e polinucleotídeos que codificam os mesmos, dímeros e outros multímeros, etc.) é contemplada.[0107] Although for brevity many of the methods are described below in relation to compositions comprising a ligand-binding molecule, it should be understood that the practice of the invention with any of the constructs described herein (ligand-binding polypeptides, molecules and constructs, and polynucleotides that encode them, dimers and other multimers, etc.) is contemplated.

[0108] Um uso terapêutico exemplificativo é o método de inibição neovascularização em um sujeito com necessidade da mesma que compreende administrar ao sujeito uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante descrito no presente documento, em uma quantidade eficaz para inibir neovascularização no sujeito. Em algumas modalidades, a neovascularização compreende neovascularização coroidal ou de retina. Em algumas modalidades, a neovascularização é neovascularização de tumor que ocorre em cânceres malignos e outros tumores.[0108] An exemplary therapeutic use is the method of inhibiting neovascularization in a subject in need thereof which comprises administering to the subject a composition comprising a ligand binding molecule described herein, in an amount effective to inhibit neovascularization in the subject. In some embodiments, the neovascularization comprises choroidal or retinal neovascularization. In some embodiments, neovascularization is tumor neovascularization that occurs in malignant cancers and other tumors.

[0109] Em outro aspecto, é descrito no presente documento um método de profilaxia ou terapia para um distúrbio ocular associado à neovascularização que compreende administrar a um sujeito que precisa de profilaxia ou terapia para o distúrbio ocular uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento.[0109] In another aspect, herein described is a method of prophylaxis or therapy for an ocular disorder associated with neovascularization comprising administering to a subject in need of prophylaxis or therapy for the ocular disorder a composition comprising a binder described in this document.

[0110] Em outro aspecto, é descrito no presente documento um método de profilaxia ou terapia para um distúrbio ocular que resulta em edema de retina que compreende administrar a um sujeito que precisa de profilaxia ou terapia para o distúrbio ou doença ocular uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento.[0110] In another aspect, herein described is a method of prophylaxis or therapy for an ocular disorder resulting in retinal edema comprising administering to a subject in need of prophylaxis or therapy for the ocular disorder or disease a composition comprising a ligand binding molecule described herein.

[0111] Os exemplos de distúrbios oculares que podem ser tratados incluem neovascularização coroidal, edema macular diabético, degeneração macular relacionada à idade, retinopatia diabética proliferativa, oclusão da veia de retina e neovascularização córnea/rejeição de transplante. De preferência, a quantidade da molécula de ligação de ligante empregada é eficaz para inibir a ligação de ligante de VEGF-C e/ou VEGF-D a VEGFR-3 (e, de preferência, também a VEGFR-2) ou o efeito estimulante de VEGF-C e/ou VEGF-D em VEGFR-3 (e, de preferência, também VEGFR-2).[0111] Examples of ocular disorders that can be treated include choroidal neovascularization, diabetic macular edema, age-related macular degeneration, proliferative diabetic retinopathy, retinal vein occlusion, and corneal neovascularization/transplant rejection. Preferably, the amount of ligand-binding molecule employed is effective to inhibit the ligand binding of VEGF-C and/or VEGF-D to VEGFR-3 (and preferably also VEGFR-2) or the stimulatory effect. of VEGF-C and/or VEGF-D in VEGFR-3 (and preferably also VEGFR-2).

[0112] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é degeneração macular relacionada à idade. Os exemplos de degeneração macular relacionada à idade são degeneração macular não neovascular (também conhecida como “Seca”) e neovascular (também conhecida como “Molhada”). Em uma modalidade preferencial, o distúrbio ocular é degeneração macular relacionada à idade molhada. Tratar ou prevenir degeneração macular relacionada à idade molhada também abrange tratar ou prevenir neovascularização coroidal ou descolamento do epitélio pigmentar.[0112] In one embodiment, the eye disorder is age-related macular degeneration. Examples of age-related macular degeneration are non-neovascular (also known as “Dry”) and neovascular (also known as “Wet”) macular degeneration. In a preferred embodiment, the ocular disorder is wet age-related macular degeneration. Treating or preventing wet age-related macular degeneration also encompasses treating or preventing choroidal neovascularization or detachment of the pigment epithelium.

[0113] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é vasculopatia coroidal polipoidal. A vasculopatia coroidal polipoidal é caracterizada por uma lesão de uma rede vascular coroidal interna de vasos que terminam em um abaulamento aneurismático ou projeção para fora (Ciardella et al. (2004) Surv Ophthalmol. 49:25 a 37).[0113] In one embodiment, the ocular disorder is polypoidal choroidal vasculopathy. Polypoidal choroidal vasculopathy is characterized by a lesion of an internal choroidal vascular network of vessels that terminate in an aneurysmal bulge or outward projection (Ciardella et al. (2004) Surv Ophthalmol. 49:25 to 37).

[0114] Em uma modalidade, do distúrbio ocular é uma afecção associada à neovascularização coroidal. Os exemplos de afecções associadas à neovascularização coroidal incluem uma afecção degenerativa, inflamatória, traumática ou idiopática. Tratar ou prevenir um distúrbio degenerativo associado à neovascularização coroidal também abrange tratar ou prevenir um distúrbio heterodegenerativo. Os exemplos de distúrbios heterodegenerativos incluem distrofia macular viteliforme, fundo flavimaculatus e drusas da cabeça do nervo óptico. Os exemplos de afecções degenerativas associadas à neovascularização coroidal incluem degeneração por miopia ou estrias angioides. Tratar ou prevenir um distúrbio inflamatório associado à neovascularização coroidal também abrange tratar ou prevenir síndrome da histoplasmose ocular, coroidite multifocal, coroidite serpiginosa, toxoplasmose, toxocaríase, rubéola, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, síndrome de Behcet ou oftalmia simpatética. Tratar ou prevenir um distúrbio traumático associado à neovascularização coroidal também abrange tratar ou prevenir ruptura coroidal ou uma afecção traumática causada por fotocoagulação intenso.[0114] In one embodiment, the ocular disorder is a condition associated with choroidal neovascularization. Examples of conditions associated with choroidal neovascularization include a degenerative, inflammatory, traumatic or idiopathic condition. Treating or preventing a degenerative disorder associated with choroidal neovascularization also encompasses treating or preventing a heterodegenerative disorder. Examples of heterodegenerative disorders include vitelliform macular dystrophy, fundus flavimaculatus, and optic nerve head drusen. Examples of degenerative conditions associated with choroidal neovascularization include myopia degeneration or angioid streaks. Treating or preventing an inflammatory disorder associated with choroidal neovascularization also includes treating or preventing ocular histoplasmosis syndrome, multifocal choroiditis, serpiginous choroiditis, toxoplasmosis, toxocariasis, rubella, Vogt-Koyanagi-Harada syndrome, Behcet syndrome, or sympathetic ophthalmia. Treating or preventing a traumatic disorder associated with choroidal neovascularization also encompasses treating or preventing choroidal rupture or a traumatic condition caused by intense photocoagulation.

[0115] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é retinopatia hipertensiva.[0115] In one embodiment, the ocular disorder is hypertensive retinopathy.

[0116] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é retinopatia diabética. A retinopatia diabética pode ser retinopatia diabética não proliferativa ou proliferativa. Os exemplos de retinopatia diabética não proliferativa incluem edema macular e isquemia macular.[0116] In one embodiment, the ocular disorder is diabetic retinopathy. Diabetic retinopathy can be non-proliferative or proliferative diabetic retinopathy. Examples of nonproliferative diabetic retinopathy include macular edema and macular ischemia.

[0117] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é retinopatia falciforme.[0117] In one embodiment, the ocular disorder is sickle cell retinopathy.

[0118] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é uma afecção associada à neovascularização de retina periférica. Os exemplos de afecções associados à neovascularização de retina periférica incluem doença vascular isquêmica, doença inflamatória com possível isquemia, incontinência pigmentar, retinite pigmentosa, retinosquise ou descolamento de retina crônico.[0118] In one embodiment, the ocular disorder is a condition associated with neovascularization of the peripheral retina. Examples of conditions associated with peripheral retinal neovascularization include ischemic vascular disease, inflammatory disease with possible ischemia, incontinence pigmenti, retinitis pigmentosa, retinoschisis or chronic retinal detachment.

[0119] Os exemplos de doença vascular isquêmica incluem retinopatia diabética proliferativa, oclusão do ramo da veia da retina, oclusão arteriolar de retina ramificada, fístula cavernosa da carótida, hemoglobinopatia falciforme, hemoglobinopatia não falciforme, síndrome IRVAN (distúrbio vasculítico de retina caracterizado por vasculite de retina idiopática, um aneurisma e neurorretinite), embolização de retina, retinopatia de prematuridade, vitreorretinopatia exsudativa familiar, síndrome de hiperviscosidade, síndrome de arco aórtico ou doença de Eales. Os exemplos de hemoglobinopatia falciforme incluem hemoglobinopatia SS e hemoglobinopatia SC. Os exemplos de hemoglobinopatia não falciforme incluem hemoglobinopatia AC e hemoglobinopatia AS. Os exemplos de síndrome de hiperviscosidade incluem leucemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma múltiplo, policitemia ou distúrbio mieloproliferativo.[0119] Examples of ischemic vascular disease include proliferative diabetic retinopathy, branch retinal vein occlusion, branch retinal arteriolar occlusion, carotid cavernous fistula, sickle cell hemoglobinopathy, non-sickle cell hemoglobinopathy, IRVAN syndrome (retinal vasculitic disorder characterized by vasculitis idiopathic retinal disease, an aneurysm and neuroretinitis), retinal embolization, retinopathy of prematurity, familial exudative vitreoretinopathy, hyperviscosity syndrome, aortic arch syndrome or Eales disease. Examples of sickle cell hemoglobinopathy include SS hemoglobinopathy and SC hemoglobinopathy. Examples of non-sickle cell hemoglobinopathy include hemoglobinopathy AC and hemoglobinopathy AS. Examples of hyperviscosity syndrome include leukemia, Waldenstrom's macroglobulinemia, multiple myeloma, polycythemia, or myeloproliferative disorder.

[0120] Tratar ou prevenir uma doença inflamatória com possível isquemia também abrange tratar ou prevenir vasculite de retina associada à doença sistêmica, vasculite de retina associada a um agente infeccioso, uveíte ou retinopatia de Birdshot. Os exemplos de doenças sistêmicas incluem lúpus sistêmico eritematoso, doença de Behcet, doença inflamatória intestinal, sarcoidose, esclerose múltipla, granulomatose de Wegener e poliarterite nodosa. Os exemplos de agentes infecciosos incluem um agente bacteriano que é o agente causador da sífilis, tuberculose, doença de Lyme ou doença da arranhadura do gato, um vírus tal como herpesvírus, ou um parasita, tal como Toxocara canis ou Toxoplasma gondii. Os exemplos de uveíte incluem pars planite ou síndrome da uveíte de Fuchs.[0120] Treating or preventing an inflammatory disease with possible ischemia also encompasses treating or preventing retinal vasculitis associated with systemic disease, retinal vasculitis associated with an infectious agent, uveitis or Birdshot retinopathy. Examples of systemic diseases include systemic lupus erythematosus, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, sarcoidosis, multiple sclerosis, Wegener's granulomatosis, and polyarteritis nodosa. Examples of infectious agents include a bacterial agent that is the causative agent of syphilis, tuberculosis, Lyme disease or cat scratch disease, a virus such as herpesvirus, or a parasite such as Toxocara canis or Toxoplasma gondii. Examples of uveitis include pars planitis or Fuchs uveitis syndrome.

[0121] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é retinopatia prematuridade. A retinopatia de prematuridade pode resultar de crescimento anormal de vasos sanguíneos no leito vascular que sustenta a retina em desenvolvimento (Pollan C (2009) Neonatal Netw. 28:93 a 101).[0121] In one embodiment, the ocular disorder is retinopathy prematurity. Retinopathy of prematurity may result from abnormal growth of blood vessels in the vascular bed that supports the developing retina (Pollan C (2009) Neonatal Netw. 28:93 to 101).

[0122] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é doença oclusiva venosa. Os exemplos de doença oclusiva venosa incluem oclusão do ramo da veia da retina e oclusão da veia central da retina. Uma oclusão do ramo da veia da retina pode ser um bloqueio da porção da circulação que drena a retina de sangue. O bloqueio pode causar pressão de recuo nos capilares, que pode levar a hemorragias e também a extravasamento de fluido e outros constituintes do sangue.[0122] In one embodiment, the ocular disorder is venous occlusive disease. Examples of venous occlusive disease include branch retinal vein occlusion and central retinal vein occlusion. A branch retinal vein occlusion may be a blockage of the portion of the circulation that drains the retina of blood. The blockage can cause back pressure in the capillaries, which can lead to bleeding and also leakage of fluid and other blood constituents.

[0123] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é doença oclusiva arterial. Os exemplos de doença oclusiva arterial incluem oclusão do ramo da artéria da retina, oclusão da artéria central da retina ou síndrome isquêmica ocular. Uma oclusão do ramo da artéria da retina (BRAO) pode ocorrer quando um dos ramos do suprimento arterial para a retina torna-se ocluído.[0123] In one embodiment, the ocular disorder is arterial occlusive disease. Examples of arterial occlusive disease include branch retinal artery occlusion, central retinal artery occlusion, or ocular ischemic syndrome. A branch retinal artery occlusion (BRAO) can occur when one of the branches of the arterial supply to the retina becomes occluded.

[0124] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é coriorretinopatia serosa central (CSC). Em uma modalidade, a CSC é caracterizada por extravasamento de fluido na mácula central.[0124] In one embodiment, the ocular disorder is central serous chorioretinopathy (CSC). In one embodiment, CSC is characterized by fluid extravasation in the central macula.

[0125] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é edema macular cistoide (CME). Em uma modalidade, o CME afeta a retina central ou mácula. Em outra modalidade, o CME ocorre após cirurgia de catarata.[0125] In one embodiment, the ocular disorder is cystoid macular edema (CME). In one embodiment, the CME affects the central retina or macula. In another modality, CME occurs after cataract surgery.

[0126] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é telangiectasia de retina. Em uma modalidade, a telangiectasia de retina é caracterizada por dilatação e tortuosidade de vasos da retina e formação de múltiplos aneurismas. JXT idiopático, aneurismas miliares de Leber e doença de Coats são três tipos de telangiectasias de retina.[0126] In one embodiment, the ocular disorder is retinal telangiectasia. In one embodiment, retinal telangiectasia is characterized by dilation and tortuosity of retinal vessels and the formation of multiple aneurysms. Idiopathic JXT, Leber miliary aneurysms, and Coats disease are three types of retinal telangiectasias.

[0127] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é macroaneurisma arterial.[0127] In one embodiment, the ocular disorder is arterial macroaneurysm.

[0128] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é angiomatose de retina. Em uma modalidade, a angiomatose de retina ocorre quando os vasos oculares formam múltiplos angiomas.[0128] In one embodiment, the ocular disorder is retinal angiomatosis. In one embodiment, retinal angiomatosis occurs when ocular vessels form multiple angiomas.

[0129] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é retinopatia induzida por radiação (RIRP). Em uma modalidade, a RIRP pode exibir sintomas, tais como edema macular e retinopatia não proliferativa e proliferativa.[0129] In one embodiment, the ocular disorder is radiation-induced retinopathy (RIRP). In one embodiment, RIRP may exhibit symptoms such as macular edema and non-proliferative and proliferative retinopathy.

[0130] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é rubeosis iridis. Em outra modalidade, a rubeosis iridis resulta na formação de glaucoma neovascular. Em outra modalidade, a rubeosis iridis é causada por retinopatia diabética, oclusão da veia central da retina, síndrome isquêmica ocular ou descolamento crônico da retina.[0130] In one embodiment, the ocular disorder is rubeosis iridis. In another embodiment, rubeosis iridis results in the formation of neovascular glaucoma. In another embodiment, rubeosis iridis is caused by diabetic retinopathy, central retinal vein occlusion, ocular ischemic syndrome, or chronic retinal detachment.

[0131] Em uma modalidade, o distúrbio ocular é um neoplasma. Os exemplos de neoplamas incluem um tumor da pálpebra, um tumor conjuntival, um tumor coroidal, um tumor da íris, um tumor do nervo óptico, um tumor da retina, um tumor intraocular infiltrativo ou um tumor orbital. Os exemplos de um tumor da pálpebra incluem, carcinoma de célula basal, carcinoma escamoso, carcinoma sebáceo, melanoma maligno, hemangioma capilar, hidrocistoma, neve ou queratose seborreica. Os exemplos de tumor conjuntival incluem sarcoma conjuntival de Kaposi, carcinoma escamoso, neoplasia intraepitelial da conjuntiva, dermoide epibulbar, linfoma da conjuntiva, melanoma, pinguécula ou pterígio. Os exemplos de um tumor coroidal incluem nevo coroidal, hemangioma coroidal, tumor coroidal metastático, osteoma coroidal, melanoma coroidal, melanoma do corpo ciliar ou nevo de Ota. Os exemplos de um tumor da íris incluem metástase uveal anterior, cisto da íris, melanocitoma da íris, melanoma da íris ou cisto de pérola da íris. Os exemplos de um tumor de nervo óptico incluem melanocitoma de nervo óptico, meningioma de bainha do nervo óptico, melanoma coroidal que afeta o nervo óptico ou metástase circumpapilar com neuropatia óptica. Os exemplos de um tumor da retina incluem hipertrofia do epitélio pigmentar da retina (RPE), adenoma de RPE, carcinoma de RPE, retinoblastoma, hamartoma do RPE ou angioma de von Hippel. Os exemplos de um tumor intraocular infiltrativo incluem leucemia linfoide crônica, coroidopatia infiltrativa ou linfoma intraocular. Os exemplos de um tumor orbital incluem carcinoma cístico da adenoide da glândula lacrimal, hemangioma cavernoso da órbita, linfangioma da órbita, mucocele orbital, pseudotumor orbital, rabdomiossarcoma orbital, hemangioma periocular da infância ou psuedotumor orbital esclerosante.[0131] In one embodiment, the ocular disorder is a neoplasm. Examples of neoplasms include an eyelid tumor, a conjunctival tumor, a choroidal tumor, an iris tumor, an optic nerve tumor, a retinal tumor, an infiltrative intraocular tumor, or an orbital tumor. Examples of an eyelid tumor include, basal cell carcinoma, squamous carcinoma, sebaceous carcinoma, malignant melanoma, capillary hemangioma, hydrocystoma, nevus, or seborrheic keratosis. Examples of conjunctival tumor include Kaposi's conjunctival sarcoma, squamous cell carcinoma, conjunctival intraepithelial neoplasia, epibulbar dermoid, conjunctival lymphoma, melanoma, pinguecula, or pterygium. Examples of a choroidal tumor include choroidal nevus, choroidal hemangioma, metastatic choroidal tumor, choroidal osteoma, choroidal melanoma, ciliary body melanoma, or nevus of Ota. Examples of an iris tumor include anterior uveal metastasis, iris cyst, iris melanocytoma, iris melanoma, or iris pearl cyst. Examples of an optic nerve tumor include optic nerve melanocytoma, optic nerve sheath meningioma, choroidal melanoma affecting the optic nerve, or circumpapillary metastasis with optic neuropathy. Examples of a retinal tumor include hypertrophy of the retinal pigment epithelium (RPE), RPE adenoma, RPE carcinoma, retinoblastoma, RPE hamartoma, or von Hippel angioma. Examples of an infiltrative intraocular tumor include chronic lymphoblastic leukemia, infiltrative choroidopathy, or intraocular lymphoma. Examples of an orbital tumor include lacrimal gland adenoid cystic carcinoma, cavernous hemangioma of the orbit, lymphangioma of the orbit, orbital mucocele, orbital pseudotumor, orbital rhabdomyosarcoma, periocular hemangioma of infancy, or sclerosing orbital psuedotumor.

[0132] Em um aspecto adicional, a invenção apresenta um método para tratar uma lesão no olho, que compreende administrar localmente uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento a um sujeito que precisa da mesma, de modo que a lesão no olho seja melhorada ou aliviada. De preferência, a lesão no olho é uma lesão na córnea ou uma lesão conjuntival e o método de tratamento reduz a angiogênese e a inflamação associadas à lesão no olho. Em algumas modalidades, o método é útil para tratar lesão na córnea ou lesão conjuntival subaguda. A lesão aguda da córnea pode ser tratada dentro de 24 horas da ocorrência e inclui lesão na córnea ou lesão conjuntival causada por objeto penetrante, um corpo estranho uma lesão química ou por queimadura. Uma lesão subaguda pode ser tratada até duas semanas após a lesão e pode incluir as lesões listadas acima assim como etiologias infecciosas. Em algumas modalidades, a lesão no olho é causada por trauma, por exemplo, lesões cirúrgicas, queimadura química, transplante de córnea, doenças infecciosas ou inflamatórias.[0132] In a further aspect, the invention provides a method for treating an injury to the eye, which comprises locally administering an effective amount of a ligand-binding molecule described herein to a subject in need thereof, so that the eye injury is improved or alleviated. Preferably, the eye injury is a corneal injury or a conjunctival injury and the treatment method reduces angiogenesis and inflammation associated with the eye injury. In some embodiments, the method is useful for treating corneal injury or subacute conjunctival injury. Acute corneal injury can be treated within 24 hours of occurrence and includes corneal injury or conjunctival injury caused by a penetrating object, a foreign body, chemical injury, or burn injury. A subacute injury can be treated up to two weeks after the injury and may include the injuries listed above as well as infectious etiologies. In some embodiments, the injury to the eye is caused by trauma, e.g., surgical injuries, chemical burns, corneal transplants, infectious or inflammatory diseases.

[0133] A extensão do tratamento variará de acordo com a lesão, mas a duração do tratamento pode ser curta, por exemplo, até um mês, e pode incluir um período de observação de 3 a 6 meses, durante o qual um novo tratamento pode ser fornecido. A administração pode também incluir um segundo agente, tal como um agente imunossupressor, por exemplo, um ou mais dentre um corticosteroide, dexametasona ou ciclosporina A. A administração local inclui, por exemplo, administração da molécula de ligação de ligante em colírio aplicado ao olho ou injeção subconjuntival ao olho.[0133] The extent of treatment will vary according to the injury, but the duration of treatment may be short, for example, up to one month, and may include an observation period of 3 to 6 months, during which further treatment may be provided. Administration may also include a second agent, such as an immunosuppressive agent, for example, one or more of a corticosteroid, dexamethasone or cyclosporine A. Local administration includes, for example, administration of the ligand-binding molecule in eye drops applied to the eye. or subconjunctival injection into the eye.

[0134] Em um aspecto adicional, é descrito no presente documento um método para cicatrizar uma lesão no olho, que compreende administrar localmente uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento a um sujeito que precisa da mesma, de modo que a lesão no olho cicatrize.[0134] In a further aspect, there is described herein a method for healing an injury to the eye, which comprises locally administering an effective amount of a ligand-binding molecule described herein to a subject in need thereof, so as to the eye injury to heal.

[0135] Em um aspecto adicional, é descrito no presente documento um método para reduzir ou melhorar angiogênese associada a uma lesão no olho, que compreende administrar localmente uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento a um sujeito que precisa da mesma, de modo que a angiogênese associada à lesão no olho seja reduzida ou melhore.[0135] In a further aspect, described herein is a method for reducing or improving angiogenesis associated with an injury to the eye, which comprises locally administering an effective amount of a ligand-binding molecule described herein to a subject in need. of the same, so that the angiogenesis associated with the injury to the eye is reduced or improved.

[0136] Em um aspecto adicional, é descrito no presente documento um método para reduzir ou melhorar inflamação associada a uma lesão no olho, que compreende administrar localmente uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento a um sujeito que precisa da mesma, de modo que a inflamação associada à lesão no olho seja reduzida ou melhore.[0136] In a further aspect, described herein is a method for reducing or ameliorating inflammation associated with an injury to the eye, which comprises locally administering an effective amount of a ligand-binding molecule described herein to a subject in need. of the same, so that the inflammation associated with the injury to the eye is reduced or improved.

[0137] Em um aspecto adicional, é descrito no presente documento um método para administrar uma molécula de ligação de ligante da presente invenção para tratamento de angiogênese e/ou inflamação associada à lesão ou infecção no olho, que compreende administração local por colírio que compreende uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento ou administração subconjuntival por injeção ou implante.[0137] In a further aspect, described herein is a method for administering a ligand-binding molecule of the present invention for treating angiogenesis and/or inflammation associated with injury or infection in the eye, which comprises local administration by eye drops comprising a ligand binding molecule described herein or subconjunctival administration by injection or implant.

[0138] Em um aspecto adicional, é descrito no presente documento um método para estender a sobrevivência de enxerto de córnea após transplante de córnea em um paciente por administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que contém uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento (segundo a qual a angiogênese e/ou a linfangiogênese é suprimida na córnea do paciente).[0138] In a further aspect, described herein is a method for extending corneal graft survival after corneal transplantation in a patient by administering to the patient an effective amount of a pharmaceutical composition containing a ligand-binding molecule. described in this document (whereby angiogenesis and/or lymphangiogenesis is suppressed in the patient's cornea).

[0139] Os estudos de resposta de dose permitem determinação precisa de uma quantidade apropriada de molécula de ligação de ligante a aplicar. As quantidades eficazes podem ser estimadas, por exemplo, a partir de medições da afinidade de ligação de um polipeptídeo a um receptor alvo, da quantidade de receptor presente em células alvo, do volume de diluição esperado (por exemplo, peso do paciente e volume sanguíneo para modalidades in vivo) e de taxas de eliminação de polipeptídeo. Por exemplo, a literatura existente em relação à dosagem de anticorpos VEGF-C conhecidos também fornece orientação para dosagem das moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento. A literatura que descreve a dosagem de Aflibercept (Regeneron), uma captura de ligante à base de VEGFR-1/VEGFR-2, também pode ser usada para fornecer orientação para dosagem de moléculas terapêuticas descritas no presente documento.[0139] Dose response studies allow precise determination of an appropriate amount of ligand binding molecule to apply. Effective amounts can be estimated, for example, from measurements of the binding affinity of a polypeptide to a target receptor, the amount of receptor present on target cells, the expected dilution volume (e.g., patient weight and blood volume for in vivo modalities) and polypeptide elimination rates. For example, existing literature regarding dosing of known VEGF-C antibodies also provides guidance for dosing the ligand-binding molecules described herein. The literature describing dosing of Aflibercept (Regeneron), a VEGFR-1/VEGFR-2-based ligand capture, can also be used to provide guidance for dosing of therapeutic molecules described herein.

[0140] Em algumas modalidades, ao ser administrado por injeção intravítrea, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 2 mg a cerca de 4 mg por olho (ou cerca de 1 mg a cerca de 3 mg, ou cerca de 1 mg a cerca de 4 mg, ou cerca de 3 mg a cerca de 4 mg, ou cerca de 1 mg a cerca de 2 mg por olho). Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 1 mg, ou cerca de 2 mg, ou cerca de 3 mg, ou cerca de 4 mg, ou cerca de 5 mg, ou cerca de 6 mg por olho. A molécula de ligação de ligante, em algumas modalidades, está presente em qualquer uma das concentrações listadas acima em um volume de 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl, 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl ou 100 μl. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada a uma concentração de cerca de 2 a 4 mg/50 μl.[0140] In some embodiments, when administered by intravitreal injection, the ligand binding molecule is administered at a concentration of about 2 mg to about 4 mg per eye (or about 1 mg to about 3 mg, or about 1 mg to about 4 mg, or about 3 mg to about 4 mg, or about 1 mg to about 2 mg per eye). In some embodiments, the ligand binding molecule is administered at a concentration of about 1 mg, or about 2 mg, or about 3 mg, or about 4 mg, or about 5 mg, or about 6 mg. per eye. The ligand binding molecule, in some embodiments, is present in any of the concentrations listed above in a volume of 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl , 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl or 100 μl. In some embodiments, the ligand-binding molecule is administered at a concentration of about 2 to 4 mg/50 μl.

[0141] A molécula de ligação de ligante descrita no presente documento pode ser puramente como um tratamento profilático para impedir a neovascularização em sujeitos em risco de desenvolver uma doença ocular associada à neovascularização (por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular) ou como um tratamento terapêutico para sujeitos afligidos pela doença ocular, para o propósito de inibir a neovascularização no olho de um sujeito que precisa do mesmo.[0141] The ligand-binding molecule described herein may be purely as a prophylactic treatment to prevent neovascularization in subjects at risk of developing an ocular disease associated with neovascularization (e.g., diabetic retinopathy, macular degeneration) or as a treatment therapeutic for subjects afflicted by ocular disease, for the purpose of inhibiting neovascularization in the eye of a subject in need thereof.

[0142] Os sujeitos que estão em risco de desenvolver retinopatia diabética ou degeneração macular incluem sujeitos acima da idade de cinquenta; sujeitos afligidos com artrite reumatoide, sujeitos com diabetes, sujeitos com anomalias da tireoide, sujeitos com asma, sujeitos com catarata, sujeitos com glaucoma, sujeitos com lúpus, sujeitos com pressão sanguínea alta e sujeitos com descolamento de retina. Outros fatores de risco incluem genética, dieta, fumo e exposição à luz solar.[0142] Subjects who are at risk of developing diabetic retinopathy or macular degeneration include subjects over the age of fifty; subjects afflicted with rheumatoid arthritis, subjects with diabetes, subjects with thyroid abnormalities, subjects with asthma, subjects with cataracts, subjects with glaucoma, subjects with lupus, subjects with high blood pressure and subjects with retinal detachment. Other risk factors include genetics, diet, smoking and exposure to sunlight.

[0143] Em algumas modalidades, é descrito no presente documento um método para selecionar um regime terapêutico para um sujeito que precisa do mesmo que compreende triar um sujeito por um ou mais sintomas de um distúrbio ocular associado à neovascularização de retina e prescrever para o sujeito a administração de uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento. Em outra modalidade, é descrito no presente documento um método para tratar um sujeito afetado com um distúrbio ocular associado à neovascularização de retina que compreende identificar um sujeito como tendo um ou mais sintomas do distúrbio ocular e administrar uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante ao sujeito. Os sintomas associadas a um distúrbio ocular associado à neovascularização de retina incluem, porém, sem limitação, visão embaçada e perda de visão lenta ao longo do tempo, pequenas partículas flutuando dentro do olho, sombras ou áreas ausentes de visão, visão distorcida e cegueira noturna.[0143] In some embodiments, there is described herein a method for selecting a therapeutic regimen for a subject in need thereof which comprises screening a subject for one or more symptoms of an ocular disorder associated with retinal neovascularization and prescribing to the subject administering a composition comprising a ligand binding molecule described herein. In another embodiment, there is described herein a method for treating a subject affected with an ocular disorder associated with retinal neovascularization comprising identifying a subject as having one or more symptoms of the ocular disorder and administering a composition comprising a binder to the subject. Symptoms associated with an eye disorder associated with retinal neovascularization include, but are not limited to, blurred vision and slow loss of vision over time, small particles floating within the eye, shadows or missing areas of vision, distorted vision, and night blindness. .

[0144] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem adicionalmente prescrever (ou administrar) um padrão de regime de cuidado para o tratamento de doença do olho seco. No contendo dos métodos descritos no presente documento, “padrão de cuidado” refere-se a um tratamento que é, de modo geral, aceito por médicos para um determinado tipo de paciente diagnosticado com um tipo de enfermidade. Para retinopatia diabética e degeneração macular, por exemplo, um aspecto da invenção é para aprimorar a terapia de padrão de cuidado com coterapia com uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento que inibe a neovascularização de retina. Os padrões exemplificativos de agente terapêutico de cuidado para retinopatia diabética e degeneração macular incluem, porém, sem limitação, higiene da pálpebra, antibióticos tópicos (incluindo, porém, sem limitação, pomadas de eritromicina ou bacitracina), tetraciclinas orais (tetraciclina, doxiciclina ou minociclina), compostos anti-inflamatórios (incluindo, porém, sem limitação, ciclosporina), corticosteroides, fotocoagulação a laser e terapia fotodinâmica.[0144] In some embodiments, the methods described herein further comprise prescribing (or administering) a standard of care regimen for the treatment of dry eye disease. In the context of the methods described in this document, “standard of care” refers to a treatment that is generally accepted by physicians for a specific type of patient diagnosed with a type of illness. For diabetic retinopathy and macular degeneration, for example, one aspect of the invention is to enhance standard of care therapy with cotherapy with a ligand-binding molecule described herein that inhibits retinal neovascularization. Exemplary therapeutic agent standards of care for diabetic retinopathy and macular degeneration include, but are not limited to, eyelid hygiene, topical antibiotics (including, but are not limited to, erythromycin or bacitracin ointments), oral tetracyclines (tetracycline, doxycycline, or minocycline ), anti-inflammatory compounds (including, but not limited to, cyclosporine), corticosteroids, laser photocoagulation, and photodynamic therapy.

[0145] São também fornecidos métodos para tratar um sujeito mamífero com um distúrbio ocular associado à neovascularização de retina que é hiporresponsivo a um padrão de regime de cuidado para o tratamento do distúrbio ocular que compreende administrar uma molécula de ligação de ligante ao sujeito em uma quantidade eficaz para tratar o distúrbio.[0145] Also provided are methods for treating a mammalian subject with an ocular disorder associated with retinal neovascularization that is hyporesponsive to a standard of care regimen for treating the ocular disorder comprising administering a ligand-binding molecule to the subject in a effective amount to treat the disorder.

[0146] O sujeito mamífero é, de preferência, um sujeito humano. A prática de métodos da invenção em outros sujeitos mamíferos, especialmente mamíferos que são convencionalmente usados como modelos para demonstrar eficácia terapêutica em humanos (por exemplo, animais primatas, porcinos, caninos ou coelhos), é também contemplada. Terapias de Combinação e agentes ativos adicionais[0146] The mammalian subject is preferably a human subject. Practicing methods of the invention on other mammalian subjects, especially mammals that are conventionally used as models to demonstrate therapeutic efficacy in humans (e.g., primate animals, porcines, canines or rabbits), is also contemplated. Combination Therapies and Additional Active Agents

[0147] A terapia de combinação e as modalidades profiláticas da invenção incluem produtos e métodos. Os compostos exemplificativos que podem ser administrados em combinação com uma ou mais dentre as moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento incluem, porém sem limitação, os compostos fornecidos abaixo na Tabela 2. [0147] The combination therapy and prophylactic modalities of the invention include products and methods. Exemplary compounds that may be administered in combination with one or more of the ligand binding molecules described herein include, but are not limited to, the compounds provided below in Table 2.

[0148] As moléculas de ligação de ligante podem ser administradas em combinação com um ou mais compostos ativos ou terapias adicionais, incluindo uma segunda molécula coletora de receptor, um agente citotóxico, cirurgia, dispositivos de cateter e radiação. Os produtos de combinação exemplificativos incluem dois ou mais agentes formulados como uma única composição ou embalados em conjunto em composições separadas, por exemplo, como um kit ou embalagem de dose unitária. Os métodos de combinação exemplificativos incluem prescrever para administração ou administração de dois ou mais agentes simultânea ou concomitantemente ou em tempo escalonados (isto é, sequencialmente).[0148] The ligand-binding molecules can be administered in combination with one or more active compounds or additional therapies, including a second receptor-harvesting molecule, a cytotoxic agent, surgery, catheter devices, and radiation. Exemplary combination products include two or more agents formulated as a single composition or packaged together in separate compositions, for example, as a kit or unit dose package. Exemplary combination methods include prescribing for administration or administration of two or more agents simultaneously or concomitantly or at staggered times (i.e., sequentially).

[0149] O termo "agente citotóxico" conforme usado no presente documento refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição das células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos das mesmas.[0149] The term "cytotoxic agent" as used herein refers to a substance that inhibits or impedes cell function and/or causes cell destruction. The term is intended to include radioactive isotopes (e.g. I131, I125, Y90 and Re186), chemotherapeutic agents and toxins such as enzymatically active toxins of bacterial, fungal, vegetable or animal origin or fragments thereof.

[0150] Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento do câncer. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida (Cytoxan®); sulfonatos de alquila tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; mostardas nitrogenadas tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estrainustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por exemplo, paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e docetaxel (Taxotere®; Aventis Antony, France); clorambucila; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; e derivados, ácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores. Também estão incluídos nessa definição agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores tais como antiestrogênios incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazois inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY 117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolídeo, e goserelina; e derivados, ácidos ou sais farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.[0150] A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound useful in treating cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (Cytoxan®); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and poposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquone, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylamelamines including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphaoramide and trimethylolomelamine; nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornafazine, colophosphamide, estrainustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembiquine, phenesterine, prednimustine, trophosphamide, uracil mustard; nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine; antibiotics such as aclacinomysins, actinomycin, authramycin, azaserine, bleomycins, cactinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carzinophylline, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin , marcelomycin, mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin, olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, chelamycin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate; purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogues such as ancitabine, azacytidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepitiostane, testolactone; antiadrenals such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane; folic acid replenishers such as frolinic acid; aceglatone; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; ansacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraxate; defofamine; demecolcine; diaziquone; elfornithine; elliptinium acetate; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidamine; mitoguazone; mitoxantrone; mopidamol; nitracrine; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podophyllinic acid; 2-ethylhydrazide; procarbazine; PSK®; razoxane; sizophyran; spirogermanium; tenuazonic acid; triaziquone; 2,2',2"-trichlorotriethylamine; urethane; vindesine; dacarbazine; manomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacytosine; arabinoside ("Ara-C"); cyclophosphamide; thiotepa; taxanes, e.g. paclitaxel (Taxol®, Bristol -Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) and docetaxel (Taxotere®; Aventis Antony, France); chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP- 16); ifosfamide; mitomycin C; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine; navelbine; novantron; teniposide; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronate; CPT-11; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluoromethylornithine (DMFO); retinoic acid; esperamycins; capecitabine; and pharmaceutically acceptable derivatives, acids or salts of any of the foregoing. Also included in this definition are antihormonal agents that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors such as antiestrogens including, for example, tamoxifen, raloxifene, 4(5 aromatase inhibitors )-imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxyfen, ceoxifen, LY 117018, onapristone and toremifene (Fareston); and antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; and pharmaceutically acceptable derivatives, acids or salts of any of the foregoing.

[0151] Um "agente inibidor de crescimento" quando usado no presente documento refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de câncer ou in vitro ou in vivo. Os exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão de ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a interrupção de G 1 e interrupção de fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), Taxol ® e inibidores de topo II tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposídeo e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G 1 também se propaga para a interrupção de fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5- fluorouracila e ara-C.[0151] A "growth inhibitory agent" when used herein refers to a compound or composition that inhibits the growth of a cell, especially a cancer cell, either in vitro or in vivo. Examples of growth inhibitory agents include agents that block cell cycle progression (at a location other than S phase), such as agents that induce G 1 arrest and M phase arrest. Classic M phase blockers include the vincas (vincristine and vinblastine), Taxol ® and topo II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide and bleomycin. Those agents that arrest G 1 also propagate to S phase arrest, for example, DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil and ara-C.

[0152] Produtos Inibidores VEGF-A (VEGF)[0152] VEGF-A (VEGF) Inhibitor Products

[0153] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem opcionalmente administrar um ativo terapêutico para inibir a ligação de VEGF-A a um ou mais de seus receptores, especialmente VEGFR- 2. Um produto inibidor de VEGF-A pode ser administrado em combinação com uma ou mais das moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento. Em algumas modalidades, o produto inibidor de VEGF-A e a molécula de ligação de ligante são coadministrados em uma única composição. Em outras modalidades, o produto inibidor de VEGF-A é administrado como uma composição separada da molécula de ligação de ligante.[0153] In some embodiments, the methods described herein optionally comprise administering a therapeutic active to inhibit the binding of VEGF-A to one or more of its receptors, especially VEGFR-2. A VEGF-A inhibitor product can be administered in combination with one or more of the ligand binding molecules described herein. In some embodiments, the VEGF-A inhibitor product and the ligand-binding molecule are co-administered in a single composition. In other embodiments, the VEGF-A inhibitor product is administered as a separate composition from the ligand-binding molecule.

[0154] Em uma modalidade, o produto inibidor de VEGF-A é selecionado dentre ranibizumabe, bevacizumabe, aflibercept, proteína de fusão de Fc de receptor KH902 VEGF, anticorpo 2C3, ORA102, pegaptanibe, bevasiranibe, SIRNA-027, decursina, decursinol, picropodofilina, gugulsterona, PLG101, eicosanoide LXA4, PTK787, pazopanibe, axitinibe, CDDO-Me, CDDO-Imm, shikonina, beta-hidroxiisovalerilshikonina, EYE001, gangliosídeo GM3, anticorpo DC101, anticorpo Mab25, anticorpo Mab73, anticorpo 4A5, anticorpo 4E10, anticorpo 5F12, anticorpo VA01, anticorpo BL2, proteína relacionada a VEGF, sFLT01, sFLT02, Peptídeo B3, TG100801, sorafenibe ou anticorpo G6-31 ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos mencionados anteriormente.[0154] In one embodiment, the VEGF-A inhibitor product is selected from ranibizumab, bevacizumab, aflibercept, KH902 VEGF receptor Fc fusion protein, antibody 2C3, ORA102, pegaptanib, bevasiranib, SIRNA-027, decursin, decursinol, picropodophyllin, gugulsterone, PLG101, eicosanoid LXA4, PTK787, Pazopanib, axitinib, CDDO-Me, CDDO-Imm, shikonin, beta-hydroxyisovalerylshikonin, EYE001, GM3 ganglioside, DC101 antibody, Mab25 antibody, Mab73 antibody, 4A5 antibody, 4E10 antibody, antibody 5F12, VA01 antibody, BL2 antibody, VEGF-related protein, sFLT01, sFLT02, Peptide B3, TG100801, sorafenib or antibody G6-31 or a pharmaceutically acceptable salt of any of the aforementioned.

[0155] Sequências de aminoácidos e cDNA de ECD de VEGFR-2 humano são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 5 e 6, respectivamente. O “produto inibidor de VEGF-A” pode ser qualquer molécula que atua com especificidade para reduzir as interações de VEGF-A/VEGFR-2, por exemplo, bloqueando-se a ligação de VEGF-A a VEGFR-2 ou reduzindo a expressão de VEGFR-2. O termo “VEGF-A” conforme usado no presente documento refere-se ao fator de crescimento endotelial vascular que induz a angiogênese ou um processo angiogênico e inclui os vários subtipos de VEGF que surgem, por exemplo, pela emenda alternativa do gene VEGF-A incluindo VEGF121, VEGF165 e VEGF189 que induzem a angiogênese ou um processo angiogênico. O termo “VEGF” pode ser usado para se referir a um polipeptídeo de “VEGF” ou um ácido nucleico ou gene que codifica “VEGF”.[0155] Human VEGFR-2 ECD amino acid and cDNA sequences are set forth in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. The “VEGF-A inhibitor product” can be any molecule that acts with specificity to reduce VEGF-A/VEGFR-2 interactions, for example, by blocking the binding of VEGF-A to VEGFR-2 or reducing expression of VEGFR-2. The term “VEGF-A” as used herein refers to vascular endothelial growth factor that induces angiogenesis or an angiogenic process and includes the various subtypes of VEGF that arise, for example, by alternative splicing of the VEGF-A gene. including VEGF121, VEGF165 and VEGF189 that induce angiogenesis or an angiogenic process. The term “VEGF” may be used to refer to a polypeptide of “VEGF” or a nucleic acid or gene that encodes “VEGF”.

[0156] O termo “produto inibidor de VEGF-A” refere-se a um agente que reduz ou inibe, ou parcial ou completamente, a atividade ou produção do VEGF-A. Um produto inibidor de VEGF-A pode reduzir ou inibir direta ou indiretamente a atividade ou a produção de um VEGF-A específico tal como VEGF165. Ademais, os “produtos inibidores de VEGF-A” incluem agentes que atuam ou em um ligante de VEGF-A ou seu receptor cognato de modo a reduzir ou inibir um sinal de receptor associado a VEGF-A. Os exemplos de “produtos inibidores de VEGF-A” incluem moléculas antissenso, ribozimas ou RNAi que alvejam um ácido nucleico de VEGF-A; aptâmeros de VEGF-A; anticorpos de VEGF-A; receptores chamariz de VEGF solúveis que impedem a ligação de um VEGF-A a seu receptor cognato; moléculas antissenso, ribozimas ou RNAi que alvejam um ácido nucleico de receptor de VEGF-A cognato (VEGFR-1 e/ou VEGFR-2); aptâmeros de VEGFR-1 e VEGFR- 2 ou anticorpos de VEGFR-1 e VEGFR-2; e inibidores de tirosina quinase de VEGFR-1 e/ou VEGFR-2 .[0156] The term “VEGF-A inhibitor product” refers to an agent that reduces or inhibits, either partially or completely, the activity or production of VEGF-A. A VEGF-A inhibitor product can directly or indirectly reduce or inhibit the activity or production of a specific VEGF-A such as VEGF165. Furthermore, “VEGF-A inhibitory products” include agents that act on either a VEGF-A ligand or its cognate receptor to reduce or inhibit a VEGF-A-associated receptor signal. Examples of “VEGF-A inhibitory products” include antisense molecules, ribozymes, or RNAi that target a VEGF-A nucleic acid; VEGF-A aptamers; VEGF-A antibodies; soluble VEGF decoy receptors that prevent the binding of a VEGF-A to its cognate receptor; antisense molecules, ribozymes or RNAi that target a cognate VEGF-A receptor nucleic acid (VEGFR-1 and/or VEGFR-2); VEGFR-1 and VEGFR-2 aptamers or VEGFR-1 and VEGFR-2 antibodies; and VEGFR-1 and/or VEGFR-2 tyrosine kinase inhibitors.

[0157] O inibidor de VEGF-A pode ser um polipeptídeo que compreende um fragmento de ECD de VEGFR-2 solúvel (aminoácidos 20 a 764 da SEQ ID NO: 6) que liga VEGF; um fragmento de ECD de VEGFR-1 solúvel, um coletor de ligante com base em VEGFR-1/R2 solúvel, tal como Af1ibercept (Regeneron); polinucleotídeos antissenso de VEGFR-2 ou RNA de interferência curta (siRNA); anticorpos anti-VEGFR-2; um polipeptídeo inibidor de VEGFR-2 que compreende um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo anti-VEGFR-2 que inibe a ligação entre VEGFR-2 e VEGF; um aptâmero que inibe a ligação entre VEGFR-2 e VEGF-A. Em algumas variações, o coletor de ligante com base em VEGFR-2 compreende uma proteína de fusão que compreende o fragmento de polipeptídeo de VEGFR-2 solúvel fundido a um fragmento de região constante de imunoglobulina (Fc). Em algumas modalidades, um fragmento de polipeptídeo de VEGFR-2 é fundido à fosfatase alcalina (AP). Os métodos para formar os construtos de fusão de Fc ou AP são revelados no documento no WO 02/060950, a revelação do qual é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.[0157] The VEGF-A inhibitor may be a polypeptide comprising a soluble VEGFR-2 ECD fragment (amino acids 20 to 764 of SEQ ID NO: 6) that binds VEGF; a soluble VEGFR-1 ECD fragment, a soluble VEGFR-1/R2-based ligand collector, such as Af1ibercept (Regeneron); VEGFR-2 antisense polynucleotides or short interfering RNA (siRNA); anti-VEGFR-2 antibodies; a VEGFR-2 inhibitory polypeptide comprising an antigen-binding fragment of an anti-VEGFR-2 antibody that inhibits binding between VEGFR-2 and VEGF; an aptamer that inhibits the binding between VEGFR-2 and VEGF-A. In some variations, the VEGFR-2-based ligand collector comprises a fusion protein comprising the soluble VEGFR-2 polypeptide fragment fused to an immunoglobulin constant region (Fc) fragment. In some embodiments, a VEGFR-2 polypeptide fragment is fused to alkaline phosphatase (AP). Methods for forming Fc or AP fusion constructs are disclosed in WO 02/060950, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0158] Vários anticorpos de VEGF-A foram descritos, consultar, por exemplo, as Patentes no U.S. 8.349.322; 8.236.312; 8.216.571; 8.101.177; 8092.797; 8.088.375; 8.034.905; 5.730.977; 6.342.219. 6.524.583. 6.451.764. 6.448.077. 6.416.758. 6.342.221 e as Publicações PCT WO 96/30046, WO 97/44453 e WO 98/45331, os conteúdos das quais são incorporados a título de referência em sua totalidade. Os anticorpos de VEGF-A exemplificativos incluem Bevacizumabe (Avastin®) e Ranibizumabe (Lucentis®). Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são administradas em combinação com bevacizumabe. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são administradas em combinação com ranibizumabe.[0158] Various VEGF-A antibodies have been described, see, for example, U.S. Patents 8,349,322; 8,236,312; 8,216,571; 8,101,177; 8092,797; 8,088,375; 8,034,905; 5,730,977; 6,342,219. 6,524,583. 6,451,764. 6,448,077. 6,416,758. 6,342,221 and PCT Publications WO 96/30046, WO 97/44453 and WO 98/45331, the contents of which are incorporated by reference in their entirety. Exemplary VEGF-A antibodies include Bevacizumab (Avastin®) and Ranibizumab (Lucentis®). In some embodiments, one or more ligand-binding molecules described herein are administered in combination with bevacizumab. In some embodiments, one or more ligand-binding molecules described herein are administered in combination with ranibizumab.

[0159] Em algumas modalidades, o inibidor de VEGF-A é EYE001 (anteriormente referido como NX1838), que é um aptâmero peguilado modificado que se liga com afinidade alta e específica à principal isoforma de VEGF humana solúvel (consultar as Patentes no U.S. 6.011.020; 6.051.698; e 6.147.204). O aptâmero liga e inativa o VEGF de uma maneira similar a esta de um anticorpo de alta afinidade direcionado a VEGF. Outro aptâmero de VEGF útil é EYE001 em sua forma não peguilada.[0159] In some embodiments, the VEGF-A inhibitor is EYE001 (formerly referred to as NX1838), which is a modified pegylated aptamer that binds with high and specific affinity to the major soluble human VEGF isoform (see U.S. Patent No. 6,011 .020; 6,051,698; and 6,147,204). The aptamer binds and inactivates VEGF in a manner similar to that of a high-affinity antibody targeting VEGF. Another useful VEGF aptamer is EYE001 in its nonpegylated form.

[0160] Em uma modalidade preferencial, uma ou mais moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são administradas em combinação com aflibercept (Eylea®) (Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 99:11.393 a 11.398, 2002, a revelação do qual é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.[0160] In a preferred embodiment, one or more ligand-binding molecules described herein are administered in combination with aflibercept (Eylea®) (Holash et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:11,393 a 11,398, 2002, the disclosure of which is incorporated into this document by reference in its entirety.

[0161] Vários anticorpos de VEGFR-2 foram descritos, consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 6.334.339 e as Publicações de Patente no U.S. 2002/0064528, 2005/0214860 e 2005/0234225 (todas as quais são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades). Os anticorpos são uteis para modular as interações de VEGFR-2/VEGF devido à capacidade de gerar facilmente anticorpos com especificidade relativa e devido às melhoras continuadas nas tecnologias para adotar os anticorpos para a terapia humana. Assim, a invenção contempla o uso de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos, anticorpos bifuncionais/biespecíficos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e anticorpos enxertados em região de determinação complementar (CDR), incluindo os compostos que incluem sequências CDR que reconhecem especificamente um polipeptídeo da invenção) específicos para VEGFR-2. Anticorpos humanos podem também ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)]. Similarmente, os anticorpos humanos podem ser feitos pela introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inativados. Mediante estímulo, a produção de anticorpo humano é observada, que se assemelha intimamente a esta vista em humanos em todos os aspectos, incluindo redisposição de genes, montagem e repertório de anticorpo. Essa abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes no U.S. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 e nas publicações científicas a seguir: Marks et al., Bio/Technology 10, 779 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856 859 (1994); Morrison, Nature 368, 812 a 813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845 a 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65 a 93 (1995). Produtos Inibidores de PDGF[0161] Various VEGFR-2 antibodies have been described, see, for example, U.S. Patent 6,334,339 and U.S. Patent Publications 2002/0064528, 2005/0214860 and 2005/0234225 (all of which are incorporated herein document for reference in its entirety). Antibodies are useful for modulating VEGFR-2/VEGF interactions due to the ability to easily generate antibodies with relative specificity and due to continued improvements in technologies to adopt antibodies for human therapy. Thus, the invention contemplates the use of antibodies (for example, monoclonal and polyclonal antibodies, single-chain antibodies, chimeric antibodies, bifunctional/bispecific antibodies, humanized antibodies, human antibodies and antibodies grafted in a complementary determination region (CDR), including those compounds that include CDR sequences that specifically recognize a polypeptide of the invention) specific for VEGFR-2. Human antibodies can also be produced using various techniques known in the art, including phage display libraries [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. The techniques of Cole et al. and Boerner et al. are also available for the preparation of human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, page 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86 95 (1991)]. Similarly, human antibodies can be made by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, e.g., mice in which the endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated. Upon stimulation, human antibody production is observed, which closely resembles this seen in humans in all aspects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. This approach is described, for example, in U.S. Patents 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825 ; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 and in the following scientific publications: Marks et al., Bio/Technology 10, 779 783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856 859 (1994); Morrison, Nature 368, 812 to 813 (1994);Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845 to 851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65 to 93 (1995). PDGF Inhibitor Products

[0162] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem opcionalmente administrar um ativo terapêutico para inibir a ligação de PDGF a um ou mais de seus receptores. Um Produto Inibidor de PDGF pode ser administrado em combinação com uma ou mais das moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento. Em algumas modalidades, o produto inibidor de PDGF e a molécula de ligação de ligante são coadministrados em uma única composição. Em outras modalidades, o produto inibidor de PDGF é administrado como uma composição separada da molécula de ligação de ligante.[0162] In some embodiments, the methods described herein optionally comprise administering a therapeutic active to inhibit the binding of PDGF to one or more of its receptors. A PDGF Inhibitor Product can be administered in combination with one or more of the ligand binding molecules described herein. In some embodiments, the PDGF inhibitor product and the ligand-binding molecule are co-administered in a single composition. In other embodiments, the PDGF inhibitor product is administered as a composition separate from the ligand-binding molecule.

[0163] O termo “PDGF” refere-se a um fator de crescimento derivado de plaqueta que regula a divisão ou o crescimento celular. Conforme usado no presente documento, o termo “PDGF” inclui os vários subtipos de PDGF incluindo PDGF-B, PDGF-A, PDGF-C, PDGF-D, formas variantes dos mesmos e formas dimerizadas dos mesmos, incluindo PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC e PDGF-DD. Os fatores de crescimento derivados de plaqueta incluem homo ou heterodímeros de cadeia A (PDGF-A) e cadeia B (PDGF-B) que exercem sua ação por meio da ligação e dimerização de dois receptores de superfície celular de fator de crescimento derivado de plaqueta de tirosina quinase de receptor relacionados (isto é, PDGFRs), PDGFR-α e PDGFR-β. Adicionalmente, PDGF-C e PDGF-D, dois ligantes ativados por protease adicionais para os complexos de PDGFR foram identificados (Li et al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2: 302 a 309; Bergsten et al., (2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512 a 516; e Uutele et al., (2001) Circulation 103: 2242 a 2247). Devido às diferentes especificidades de ligação de ligante dos PDGFRs, sabe-se que PDGFR-α/α liga PDGF-AA, PDGF- BB, PDGF-AB e PDGF-CC; PDGFR-β/β liga PDGF-BB e PDGF-DD; enquanto que PDGFR-α/β liga PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC e PDGF- DD (Betsholtz et al., (2001) BioEssays 23: 494 a 507). Conforme usado no presente documento, o termo “PDGF” também se refere àqueles membros da classe dos fatores de crescimento que induzem a síntese de DNA e a mitogênese através da ligação e da ativação de um PDGFR em um tipo de célula responsivo. PDGFs podem efetuar, por exemplo: migração célula direcionada (quimiotaxia) e ativação celular; ativação de fosfolipase; renovação de fosfatidilinositol aumentada e metabolismo de prostaglandina; estimulação da síntese tanto de colágeno quanto de colagenase por células responsivas; alteração das atividades metabólicas celulares, incluindo síntese de matriz, produção de citoncina e ingestão de lipoproteína; indução, indiretamente, de uma resposta proliferativa em células sem receptores de PDGF; e atividade vasoconstritora potente. O termo “PDGF” pode ser usado para se referir a um polipeptídeo de “PDGF”, um ácido nucleico ou gene que codifica “PDGF” ou uma forma dimerizada dos mesmos.[0163] The term “PDGF” refers to a platelet-derived growth factor that regulates cell division or growth. As used herein, the term “PDGF” includes the various subtypes of PDGF including PDGF-B, PDGF-A, PDGF-C, PDGF-D, variant forms thereof and dimerized forms thereof, including PDGF-AA, PDGF -AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD. Platelet-derived growth factors include homo- or heterodimers of chain A (PDGF-A) and chain B (PDGF-B) that exert their action through binding and dimerization of two platelet-derived growth factor cell surface receptors. of related receptor tyrosine kinases (i.e., PDGFRs), PDGFR-α and PDGFR-β. Additionally, PDGF-C and PDGF-D, two additional protease-activated ligands for the PDGFR complexes have been identified (Li et al., (2000) Nat. Cell. Biol. 2: 302 to 309; Bergsten et al., ( 2001) Nat. Cell. Biol. 3: 512 to 516; and Uutele et al., (2001) Circulation 103: 2242 to 2247). Due to the different ligand binding specificities of PDGFRs, PDGFR-α/α is known to bind PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, and PDGF-CC; PDGFR-β/β binds PDGF-BB and PDGF-DD; while PDGFR-α/β binds PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD (Betsholtz et al., (2001) BioEssays 23: 494 to 507). As used herein, the term “PDGF” also refers to those members of the class of growth factors that induce DNA synthesis and mitogenesis through binding and activating a PDGFR in a responsive cell type. PDGFs can effect, for example: directed cell migration (chemotaxis) and cell activation; phospholipase activation; increased phosphatidylinositol turnover and prostaglandin metabolism; stimulation of the synthesis of both collagen and collagenase by responsive cells; alteration of cellular metabolic activities, including matrix synthesis, cytokine production and lipoprotein intake; indirectly inducing a proliferative response in cells without PDGF receptors; and potent vasoconstrictor activity. The term “PDGF” may be used to refer to a polypeptide of “PDGF”, a nucleic acid or gene encoding “PDGF” or a dimerized form thereof.

[0164] O termo “produto inibidor de PDGF” refere-se a um agente que reduz ou inibe, ou parcial ou completamente, a atividade ou produção de um PDGF. Um produto inibidor de PDGF pode reduzir ou inibir direta ou indiretamente a atividade ou a produção de um PDGF específico tal como PDGF-B. Ademais, os “produtos inibidores de PDGF” incluem agentes que atual em um ligante de PDGF ou seu receptor cognato de modo a reduzir ou inibir um sinal de receptor associado a PDGF. Os exemplos de “produtos inibidores de PDGF” incluem moléculas antissenso, ribozimas ou RNAi que alvejam um ácido nucleico de PDGF; aptâmeros de PDGF; anticorpos de PDGF para o próprio PDGF ou seu receptor; receptores chamariz de VEGF solúveis que impedem a ligação de um PDGF a seu receptor cognato; moléculas antissenso, ribozimas ou RNAi que alvejam um ácido nucleico de receptor de PDGF cognato (PDGFR); aptâmeros de PDGFR ou anticorpos de PDGFR que se ligam a um receptor PDGFR cognato; e inibidores de tirosina quinase de PDGFR.[0164] The term “PDGF inhibitor product” refers to an agent that reduces or inhibits, either partially or completely, the activity or production of a PDGF. A PDGF inhibitor product can directly or indirectly reduce or inhibit the activity or production of a specific PDGF such as PDGF-B. Furthermore, “PDGF inhibitor products” include agents that act on a PDGF ligand or its cognate receptor in order to reduce or inhibit a PDGF-associated receptor signal. Examples of “PDGF inhibitory products” include antisense molecules, ribozymes, or RNAi that target a PDGF nucleic acid; PDGF aptamers; PDGF antibodies to PDGF itself or its receptor; soluble VEGF decoy receptors that prevent the binding of a PDGF to its cognate receptor; antisense molecules, ribozymes, or RNAi that target a cognate PDGF receptor nucleic acid (PDGFR); PDGFR aptamers or PDGFR antibodies that bind to a cognate PDGFR receptor; and PDGFR tyrosine kinase inhibitors.

[0165] Em uma modalidade, o produto inibidor de PDGF é selecionado dentre: um composto de Formula A, B, C, D ou E conforme descrito e definido no documento no US 2012/0100136 (os conteúdos inteiros do qual são incorporados no presente documento a título de referência), anticorpo p1B3, CDP860, IMC-3G3, anticorpo 162.62, anticorpo 163.31, anticorpo 169.14, anticorpo 169.31, anticorpo αR1, anticorpo 2A1E2, anticorpo M4TS.11, anticorpo M4TS.22, anticorpo Hyb 120.1.2.1.2, anticorpo Hyb 121.6.1.1.1, anticorpo Hyb 127.5.7.3.1, anticorpo Hyb 127.8.2.2.2, anticorpo Hyb 1.6.1, anticorpo Hyb 1.11.1, anticorpo Hyb 1.17.1, anticorpo Hyb 1.18.1, anticorpo Hyb 1.19.1, anticorpo Hyb 1.23.1, anticorpo Hyb 1.24, anticorpo Hyb 1.25, anticorpo Hyb 1.29, anticorpo Hyb 1.33, anticorpo Hyb 1.38, anticorpo Hyb 1.39, anticorpo Hyb 1.40, anticorpo Hyb 1.45, anticorpo Hyb 1.46, anticorpo Hyb 1.48, anticorpo Hyb 1.49, anticorpo Hyb 1.51, anticorpo Hyb 6.4.1, anticorpo F3, anticorpo F3 humanizado, anticorpo C1, anticorpo C1 humanizado, anticorpo 6.4, anticorpo de IgG de cabra anti-mPDGF-C, anticorpo C3.1, anticorpo monoclonal PDGFR-B1, anticorpo monoclonal PDGFR-B2, anticorpo monoclonal 6D11, anticorpo monoclonal Sis 1, anticorpo monoclonal PR7212, anticorpo monoclonal PR292, anticorpo monoclonal HYB 9610, anticorpo monoclonal HYB 9611, anticorpo monoclonal HYB 9612 ou anticorpo monoclonal HYB 9613 ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um dos mencionados anteriormente.[0165] In one embodiment, the PDGF inhibitor product is selected from: a compound of Formula A, B, C, D or E as described and defined in US 2012/0100136 (the entire contents of which are incorporated herein document for reference), antibody p1B3, CDP860, IMC-3G3, antibody 162.62, antibody 163.31, antibody 169.14, antibody 169.31, antibody αR1, antibody 2A1E2, antibody M4TS.11, antibody M4TS.22, antibody Hyb 120.1.2.1. 2, Hyb antibody 121.6.1.1.1, Hyb antibody 127.5.7.3.1, Hyb antibody 127.8.2.2.2, Hyb antibody 1.6.1, Hyb antibody 1.11.1, Hyb antibody 1.17.1, Hyb antibody 1.18.1, Hyb antibody 1.19.1, Hyb antibody 1.23.1, Hyb antibody 1.24, Hyb antibody 1.25, Hyb antibody 1.29, Hyb antibody 1.33, Hyb antibody 1.38, Hyb antibody 1.39, Hyb antibody 1.40, Hyb antibody 1.45, Hyb antibody 1.46, Hyb antibody 1.48, Hyb antibody 1.49, Hyb antibody 1.51, Hyb antibody 6.4.1, F3 antibody, humanized F3 antibody, C1 antibody, humanized C1 antibody, antibody 6.4, goat IgG anti-mPDGF-C antibody, C3.1 antibody, antibody monoclonal PDGFR-B1, monoclonal antibody PDGFR-B2, monoclonal antibody 6D11, monoclonal antibody Sis 1, monoclonal antibody PR7212, monoclonal antibody PR292, monoclonal antibody HYB 9610, monoclonal antibody HYB 9611, monoclonal antibody HYB 9612 or monoclonal antibody HYB 9613 or a salt pharmaceutically acceptable of any of the aforementioned.

[0166] Em uma modalidade preferencial, uma ou mais moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento são administradas em combinação com um anticorpo PDGFR-beta (tal como esse sendo desenvolvido por Regeneron Inc. para indicações oculares) ou um aptâmetro anti-PDGF (tal como E10030 sendo desenvolvido por Ophthotech Inc. para indicações oculares).[0166] In a preferred embodiment, one or more ligand-binding molecules described herein are administered in combination with a PDGFR-beta antibody (such as that being developed by Regeneron Inc. for ocular indications) or an anti-PDGF aptameter (such as E10030 being developed by Ophthotech Inc. for ocular indications).

[0167] Os fragmentos de anticorpo, por exemplo, de um produto inibidor de VEGF-A e PGDF, incluindo Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv são também contemplados. O termo “específico para”, quando usado para descrever os anticorpos da invenção, indica que as regiões variáveis dos anticorpos da invenção reconhecem e ligam o polipeptídeo de interesse exclusivamente (isto é, têm a capacidade de distinguir os polipeptídeos de interesse de outros polipeptídeos conhecidos da mesma família, em virtude das diferenças mensuráveis na afinidade de ligação, apesar existência possível da similaridade, homologia ou identidade de sequência localizada entre os membros da família). Será entendido que anticorpos específicos podem também interagir com outras proteínas (por exemplo, proteína de A S. aureus ou outros anticorpos nas técnicas de ELISA) através das interações com sequências fora da região variável dos anticorpos e, particularmente, na região constante da molécula. Os ensaios de triagem para determinar a especificidade de ligação de um anticorpo da invenção são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Para uma discussão compreensiva de tais ensaios, consultar Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos com o uso de qualquer método bem conhecido e rotineiramente praticado na técnica.[0167] Antibody fragments, for example, of a VEGF-A and PGDF inhibitory product, including Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv are also contemplated. The term “specific for,” when used to describe the antibodies of the invention, indicates that the variable regions of the antibodies of the invention recognize and bind the polypeptide of interest exclusively (i.e., have the ability to distinguish the polypeptides of interest from other known polypeptides). of the same family, due to measurable differences in binding affinity, despite the possible existence of localized sequence similarity, homology or identity between family members). It will be understood that specific antibodies can also interact with other proteins (for example, A S. aureus protein or other antibodies in ELISA techniques) through interactions with sequences outside the variable region of the antibodies and, particularly, in the constant region of the molecule. Screening assays for determining the binding specificity of an antibody of the invention are well known and routinely practiced in the art. For a comprehensive discussion of such trials, see Harlow et al. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. The antibodies of the invention can be produced using any method well known and routinely practiced in the art.

[0168] Em outra modalidade, os métodos descritos no presente documento compreendem opcionalmente administrar uma molécula de ácido nucleico antissenso (por exemplo, antissenso para VEGFR-2) ao sujeito. As moléculas de ácido nucleico antissenso para uma proteína particular (por exemplo, VEGFR-2) são úteis para inibir terapeuticamente a tradução de mRNAs que codificam essa proteína (por exemplo, VEGFR-2) em que o objetivo terapêutico envolve um desejo de eliminar a presença da proteína para reduzir seus níveis. O RNA antissenso de VEGFR-2, por exemplo, poderia ser útil como um agente de antagonização de VEGFR-2 no tratamento de doenças nas quais VEGFR-2 está envolvido como um agente causativo, por exemplo, doenças inflamatórias.[0168] In another embodiment, the methods described herein optionally comprise administering an antisense nucleic acid molecule (e.g., antisense to VEGFR-2) to the subject. Antisense nucleic acid molecules to a particular protein (e.g., VEGFR-2) are useful for therapeutically inhibiting the translation of mRNAs encoding that protein (e.g., VEGFR-2) where the therapeutic goal involves a desire to eliminate the presence of protein to reduce its levels. VEGFR-2 antisense RNA, for example, could be useful as a VEGFR-2 antagonizing agent in the treatment of diseases in which VEGFR-2 is involved as a causative agent, e.g., inflammatory diseases.

[0169] Um ácido nucleico antissenso compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a um ácido nucleico “senso” que codifica uma proteína (por exemplo, complementar ao filamento de codificação de uma molécula de cDNA de filamento duplo ou complementar a uma sequência de mRNA). (Consultar, por exemplo, a sequência de cDNA de VEGFR- 3 de SEQ ID NO: 1). Os métodos para projetar e otimizar os nucleotídeos antissenso são descritos em Lima et al., (J Biol Chem; 272:626 a 638. 1997) e Kurreck et al., (Nucleic Acids Res.; 30:1.911 a 1.918. 2002). Em aspectos específicos, moléculas de ácido nucleico antissenso são fornecidas que compreendem uma sequência complementar a pelo menos cerca de 10, 25, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos ou um filamento de codificação de proteína inteira (por exemplo, VEGFR-2) ou a apenas uma porção dos mesmos. Moléculas de ácido nucleico que codificam fragmentos, homólogos, derivados e análogos de uma proteína (por exemplo, VEGFR-2) ou ácidos nucleicos antissenso complementares a uma sequência de ácidos nucleicos de proteína (VEGFR-2) são também contemplados.[0169] An antisense nucleic acid comprises a nucleotide sequence that is complementary to a “sense” nucleic acid encoding a protein (e.g., complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence ). (See, for example, the VEGFR-3 cDNA sequence of SEQ ID NO: 1). Methods for designing and optimizing antisense nucleotides are described in Lima et al., (J Biol Chem; 272:626 to 638. 1997) and Kurreck et al., (Nucleic Acids Res.; 30:1911 to 1918. 2002) . In specific aspects, antisense nucleic acid molecules are provided that comprise a sequence complementary to at least about 10, 25, 50, 100, 250, or 500 nucleotides or an entire protein-coding strand (e.g., VEGFR-2) or to just a portion of them. Nucleic acid molecules that encode fragments, homologues, derivatives and analogues of a protein (e.g., VEGFR-2) or antisense nucleic acids complementary to a protein nucleic acid sequence (VEGFR-2) are also contemplated.

[0170] Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico antissenso é antissenso a uma “região de codificação” do filamento de codificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína tal como, por exemplo, VEGFR-2. O termo “região de codificação” refere-se à região da sequência de nucleotídeos que compreende códons que são traduzidos em resíduos de aminoácidos. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico antissenso é antissenso a uma “região concedente” do filamento de codificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína tal como, por exemplo, VEGFR-2. O termo “região concedente” refere-se às sequências 5' e 3' que flanqueiam a região de codificação que não são traduzidas em aminoácidos (isto é, também referidas como regiões não traduzidas 5' e 3').[0170] In one embodiment, an antisense nucleic acid molecule is antisense to a “coding region” of the coding strand of a nucleotide sequence that encodes a protein such as, for example, VEGFR-2. The term “coding region” refers to the region of the nucleotide sequence that comprises codons that are translated into amino acid residues. In another embodiment, the antisense nucleic acid molecule is antisense to a "grant region" of the coding strand of a nucleotide sequence encoding a protein such as, for example, VEGFR-2. The term “grant region” refers to the 5' and 3' sequences flanking the coding region that are not translated into amino acids (i.e., also referred to as 5' and 3' untranslated regions).

[0171] Os ácidos nucleicos antissenso da invenção podem ser projetados de acordo com as regras de pareamento de base de Watson e Crick ou Hoogsteen. A molécula de ácido nucleico antissenso pode ser complementar à região de codificação inteira do mRNA de proteína, mas é, de maior preferência, um oligonucleotídeo que é antissenso a apenas uma porção da região de codificação ou não codificação do mRNA de proteína. Um oligonucleotídeo antissenso pode ter, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos de comprimento. Um ácido nucleico antissenso da invenção pode ser construído com o uso de reações de síntese química ou ligação enzimática com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, um ácido nucleico antissenso (por exemplo, um oligonucleotídeo antissenso) pode ser quimicamente sintetizado com o uso de nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados de modo variado projetados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do dúplex formado entre os ácidos nucleicos antissenso e senso (por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina podem ser usados).[0171] The antisense nucleic acids of the invention can be designed according to the Watson and Crick or Hoogsteen base pairing rules. The antisense nucleic acid molecule may be complementary to the entire coding region of the protein mRNA, but is, more preferably, an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of the protein mRNA. An antisense oligonucleotide may be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides in length. An antisense nucleic acid of the invention can be constructed using chemical synthesis reactions or enzymatic ligation using procedures known in the art. For example, an antisense nucleic acid (e.g., an antisense oligonucleotide) can be chemically synthesized using naturally occurring nucleotides or variously modified nucleotides designed to increase the biological stability of the molecules or to increase the physical stability of the duplex formed. between antisense and sense nucleic acids (e.g., phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides can be used).

[0172] Os exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar o ácido nucleico antissenso incluem: 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5- iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxiidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1- metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5- metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracila, 5- metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metiléster ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2- tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracila, (acp3)w e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, o ácido nucleico antissenso pode ser produzido biologicamente com o uso de um vetor de expressão no qual um ácido nucleico foi subclonado em uma orientação antissenso.[0172] Examples of modified nucleotides that can be used to generate antisense nucleic acid include: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl) uracil , 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3 -methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosine, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid (v), wibutoxosin, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil acid -5-oxyacetic acid (v), 5-methyl-2-thiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3)w and 2,6-diaminopurine. Alternatively, antisense nucleic acid can be produced biologically using an expression vector in which a nucleic acid has been subcloned in an antisense orientation.

[0173] As moléculas de ácido nucleico antissenso são tipicamente administradas a um sujeito ou geradas in situ de modo que as mesmas hibridizem ou se liguem ao mRNA celular e/ou DNA genômico que codifica uma proteína (por exemplo, VEGFR-2) para inibir, assim, a expressão da proteína (por exemplo, inibindo-se a transcrição e/ou tradução). A hibridização pode ser por complementaridade de nucleotídeo convencional para formar um dúplex estável ou, por exemplo, no caso de uma molécula de ácido nucleico antissenso que se liga aos dúplex de DNA, através das interações específicas no sulco principal da hélice dupla.[0173] Antisense nucleic acid molecules are typically administered to a subject or generated in situ so that they hybridize or bind to cellular mRNA and/or genomic DNA encoding a protein (e.g., VEGFR-2) to inhibit , thus, the expression of the protein (for example, by inhibiting transcription and/or translation). Hybridization can be by conventional nucleotide complementarity to form a stable duplex or, for example, in the case of an antisense nucleic acid molecule that binds to DNA duplexes, through specific interactions in the major groove of the double helix.

[0174] Em ainda outra modalidade, o RNA de proteína pode ser usado para a indução da interferência de RNA (RNAi), com o uso de sequências de RNA de filamento duplo (dsRNA) (Fire et al., Nature 391: 806 a 811. 1998) ou de interferência curta (siRNA) (Yu et al., Proc Natl Acad Sci EUA. 99:6.047 a 6.052, 2002). “RNAi” é o processo pelo qual o dsRNA induz a degradação dependente de homologia do mRNA complementar. Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico da invenção é hibridizada pelo pareamento de base complementar com um ácido ribonucleico “senso” da invenção para formar o RNA de filamento duplo. Moléculas de ácido nucleico antissenso e senso de dsRNA são fornecidas que correspondem a pelo menos cerca de 20, 25, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos ou um filamento de codificação de proteína inteiro (por exemplo, VEGFR-2) ou a apenas uma porção dos mesmos. Em uma modalidade alternativa, os siRNAs têm 30 nucleotídeos ou menos de comprimento e, de maior preferência, 21 a 23 nucleotídeos, com extremidades salientes 3’ de 2 a 3 nucleotídeos características que são geradas pela clivagem de ribonuclease III de dsRNAs mais longos. Consultar, por exemplo, Tuschl T. (Nat Biotechnol. 20:446 a 448. 2002). A preparação e o uso dos compostos de RNAi são descritos na Publicação de Patente no U.S. 2004/0023390, a revelação das quais é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.[0174] In yet another embodiment, protein RNA can be used for the induction of RNA interference (RNAi), with the use of double-stranded RNA (dsRNA) sequences (Fire et al., Nature 391: 806 a 811. 1998) or short interference (siRNA) (Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA. 99:6047 to 6052, 2002). “RNAi” is the process by which dsRNA induces the homology-dependent degradation of complementary mRNA. In one embodiment, a nucleic acid molecule of the invention is hybridized by complementary base pairing with a “sense” ribonucleic acid of the invention to form double-stranded RNA. Antisense and sense dsRNA nucleic acid molecules are provided that correspond to at least about 20, 25, 50, 100, 250, or 500 nucleotides or an entire protein-coding strand (e.g., VEGFR-2) or just one portion of them. In an alternative embodiment, the siRNAs are 30 nucleotides or less in length, and more preferably 21 to 23 nucleotides, with characteristic 2 to 3 nucleotide 3' protruding ends that are generated by ribonuclease III cleavage of longer dsRNAs. See, for example, Tuschl T. (Nat Biotechnol. 20:446 to 448. 2002). The preparation and use of RNAi compounds are described in U.S. Patent Publication 2004/0023390, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0175] A transcrição intracelular de moléculas de RNA pequenas pode ser alcançada pela clonagem de modelos de siRNA em unidades de transcrição de RNA polimerase III (Pol III), que normalmente codificam o RNA nuclear pequeno (snRNA) U6 ou o RNA H1 de RNAse P humano. Duas abordagens podem ser usadas para expressar as siRNAs: em uma modalidade, filamentos senso e antissenso que constituem o dúplex de siRNA são transcritos por promotores individuai (Lee, et al. Nat. Biotechnol. 20, 500 a 505. 2002); em uma modalidade alternativa, siRNAs são expressos como estruturas de RNA em haste-alça ou grampo que dão origem a siRNAs após o processamento intracelular (Brummelkamp et al. Science 296:550-553. 2002) (incorporado no presente documento a título de referência).[0175] Intracellular transcription of small RNA molecules can be achieved by cloning siRNA templates into RNA polymerase III (Pol III) transcription units, which typically encode U6 small nuclear RNA (snRNA) or RNAse H1 RNA P human. Two approaches can be used to express siRNAs: in one embodiment, sense and antisense strands that constitute the siRNA duplex are transcribed by individual promoters (Lee, et al. Nat. Biotechnol. 20, 500 to 505. 2002); In an alternative embodiment, siRNAs are expressed as stem-loop or hairpin RNA structures that give rise to siRNAs after intracellular processing (Brummelkamp et al. Science 296:550-553. 2002) (incorporated herein by reference ).

[0176] O dsRNA/siRNA é mais comumente administrado pela hibridização de filamentos de RNA senso e antissenso in vitro antes da entrega para o organismo. Em uma modalidade alternativa, o RNAi pode ser executado administrando os ácidos nucleicos senso e antissenso da invenção na mesma solução sem hibridização antes da administração e pode ser ainda realizado administrando os ácidos nucleicos em veículos separados dentro de um intervalo de tempo muito próximo. Moléculas de ácido nucleico que codificam fragmentos, homólogos, derivados e análogos de uma proteína (tal como, por exemplo, VEGFR-2) ou ácidos nucleicos antissenso complementares a uma sequência de ácidos nucleicos de mVEGFR-2 são também contemplados.[0176] dsRNA/siRNA is most commonly administered by hybridizing sense and antisense RNA strands in vitro prior to delivery to the organism. In an alternative embodiment, RNAi can be performed by administering the sense and antisense nucleic acids of the invention in the same solution without hybridization prior to administration and can further be performed by administering the nucleic acids in separate vehicles within a very close time interval. Nucleic acid molecules that encode fragments, homologues, derivatives and analogues of a protein (such as, for example, VEGFR-2) or antisense nucleic acids complementary to a mVEGFR-2 nucleic acid sequence are also contemplated.

[0177] Os aptâmeros são outro método com base em ácido nucleico para interferir com a interação de receptor e seu ligante cognato, tal como, por exemplo, um VEGFR-2 com VEGF-A e um PDGFR com PGDF. Os aptâmeros são moléculas de DNA ou RNA que foram selecionados de agrupamentos aleatórios com base em sua capacidade de ligar outras moléculas. Aptâmeros foram selecionados que ligam ácido nucleico, proteínas, compostos orgânicos pequenos e até mesmo organismos inteiros. Os métodos e composições para identificar e fazer aptâmeros são conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente no U.S. 5.840.867 e na Patente no U.S. 5.582.981, cada uma incorporada no presente documento a título de referência em suas totalidades.[0177] Aptamers are another nucleic acid-based method for interfering with the interaction of receptor and its cognate ligand, such as, for example, a VEGFR-2 with VEGF-A and a PDGFR with PGDF. Aptamers are DNA or RNA molecules that have been selected from random groupings based on their ability to bind other molecules. Aptamers have been selected that bind nucleic acid, proteins, small organic compounds, and even entire organisms. Methods and compositions for identifying and making aptamers are known to those skilled in the art and are described, for example, in U.S. Patent No. 5,840,867 and U.S. Patent No. 5,582,981, each incorporated herein by reference in their totalities.

[0178] Os avanços recentes no campo de ciências combinatórias identificaram sequências de polímero curto com afinidade e especificidade altas a um alvo dado. Por exemplo, a tecnologia SELEX foi usada para identificar aptâmeros de DNA e RNA com propriedades de ligação que rivalizar anticorpos de mamíferos, o campo de imunologia gerou e isolou anticorpos ou fragmentos de anticorpo que se ligam a uma miríade de compostos e a exibição de fago pode ser utilizada para revelar novas sequências de peptídeo com propriedades de ligação muito favoráveis. Com base no sucesso dessas técnicas de evolução molecular, é certo que moléculas podem ser criadas que se ligam a qualquer molécula alvo. Uma estrutura de alça é frequentemente envolvida com o fornecimento dos atributos de ligação desejados como no caso de: aptâmetros que frequentemente utilizam alças de grampo criados a partir de regiões curtos sem anticorpos derivados naturalmente de pareamento de base complementar que utilizam disposição combinatória de regiões hipervariáveis de alça e novas bibliotecas de exibição de fago que utilizam peptídeos cíclicos que mostraram resultados melhorados em comparação aos resultados de exibição de fago de peptídeo linear. Assim, evidência suficiente foi gerada para sugerir que ligantes de alta afinidade podem ser criados e identificados por técnicas de evolução molecular combinatórias. Para a presente invenção, técnicas de evolução molecular podem ser usadas para isolar moléculas de ligação de ligante específicas para ligantes descritos no presente documento. Para mais sobre aptâmeros, consultar, de modo geral, Gold, L., Singer, B., He, Y.Y., Brody. E., "Aptamers As Therapeutic And Diagnostic Agents," J. Biotechnol. 74:5 a 13 (2000). As técnicas relevantes para gerar aptâmeros podem ser encontradas na Patente no U.S. 6.699.843, que é incorporada a título de referência em sua totalidade.[0178] Recent advances in the field of combinatorial sciences have identified short polymer sequences with high affinity and specificity to a given target. For example, SELEX technology has been used to identify DNA and RNA aptamers with binding properties that rival mammalian antibodies, the field of immunology has generated and isolated antibodies or antibody fragments that bind to a myriad of compounds, and phage display can be used to reveal new peptide sequences with very favorable binding properties. Based on the success of these molecular evolution techniques, it is certain that molecules can be created that bind to any target molecule. A loop structure is often involved with providing the desired binding attributes as in the case of: aptameters that often utilize hairpin loops created from short regions without complementary base pairing naturally derived antibodies that utilize combinatorial arrangement of hypervariable regions of loop and new phage display libraries utilizing cyclic peptides that showed improved results compared to linear peptide phage display results. Thus, sufficient evidence has been generated to suggest that high-affinity ligands can be created and identified by combinatorial molecular evolution techniques. For the present invention, molecular evolution techniques can be used to isolate specific ligand binding molecules for ligands described herein. For more on aptamers, see generally Gold, L., Singer, B., He, Y.Y., Brody. E., "Aptamers As Therapeutic And Diagnostic Agents," J. Biotechnol. 74:5 to 13 (2000). Relevant techniques for generating aptamers can be found in U.S. Patent No. 6,699,843, which is incorporated by reference in its entirety.

[0179] Em algumas modalidades, o aptâmero pode ser gerado preparando-se uma biblioteca de ácidos nucleicos; contatando a biblioteca de ácidos nucleicos com um fator de crescimento, em que os ácidos nucleicos que têm maior afinidade de ligação para o fator de crescimento (em relação a outros ácidos nucleicos de biblioteca) são selecionados e amplificados para render uma mistura de ácidos nucleicos enriquecidos para ácidos nucleicos com afinidade e especificidade relativamente maiores para a ligação ao fator de crescimento. Os processos podem ser repetidos e os ácidos nucleicos selecionados mutados e triados novamente, através dos quais um aptâmero de fator de crescimento é identificado.[0179] In some embodiments, the aptamer can be generated by preparing a library of nucleic acids; contacting the nucleic acid library with a growth factor, wherein nucleic acids that have the highest binding affinity for the growth factor (relative to other library nucleic acids) are selected and amplified to yield an enriched nucleic acid mixture for nucleic acids with relatively greater affinity and specificity for growth factor binding. The processes can be repeated and selected nucleic acids mutated and screened again, through which a growth factor aptamer is identified.

[0180] Em outra variação, o produto inibidor de VEGF-A compreende um fragmento de ECD solúvel de VEGFR-1 que liga VEGF e inibe a ligação de VEGF a VEGFR-2. Sequencias de aminoácidos e cDNA de VEGFR-1 são estabelecidas nas SEQ ID NOs: 10 e 11. Os fragmentos de ECD exemplificativos de VEGFR- 1 são descritos na Publicação de Patente no U.S. 2006/0030000 e na Publicação de Patente Internacional no WO 2005/087808, as revelações da qual são incorporadas no presente documento a título de referência em suas totalidades.[0180] In another variation, the VEGF-A inhibitor product comprises a soluble ECD fragment of VEGFR-1 that binds VEGF and inhibits the binding of VEGF to VEGFR-2. Amino acid and cDNA sequences of VEGFR-1 are set forth in SEQ ID NOs: 10 and 11. Exemplary VEGFR-1 ECD fragments are described in U.S. Patent Publication 2006/0030000 and International Patent Publication No. WO 2005/ 087808, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0181] Agentes Anti-inflamatórios[0181] Anti-inflammatory Agents

[0182] Em outra modalidade, os métodos descritos no presente documento compreendem opcionalmente administrar um ou mais agentes anti-inflamatórios ao sujeito. Em algumas modalidades, o agente anti-inflamatório e a molécula de ligação de ligante são coadministrados em uma única composição. Em outras modalidades, o agente anti-inflamatório é administrado como uma composição separada da molécula de ligação de ligante. Combinações que envolvem uma molécula de ligação de ligante, um produto inibidor de VEGF-A e um agente anti-inflamatório são especificamente contemplados. Conforme usado no presente documento, o termo “agente anti- inflamatório” refere-se geralmente a qualquer agente que reduz a inflamação ou inchamento em um sujeito. Vários agentes anti-inflamatórios são citados no presente documento, mas será apreciado que pode haver agentes anti-inflamatórios adequados adicionais não especificamente citados no presente documento, mas que são abrangidos pela presente invenção.[0182] In another embodiment, the methods described herein optionally comprise administering one or more anti-inflammatory agents to the subject. In some embodiments, the anti-inflammatory agent and the ligand-binding molecule are co-administered in a single composition. In other embodiments, the anti-inflammatory agent is administered as a composition separate from the ligand-binding molecule. Combinations involving a ligand-binding molecule, a VEGF-A inhibitory product, and an anti-inflammatory agent are specifically contemplated. As used herein, the term “anti-inflammatory agent” generally refers to any agent that reduces inflammation or swelling in a subject. Various anti-inflammatory agents are cited herein, but it will be appreciated that there may be additional suitable anti-inflammatory agents not specifically cited herein, but which are encompassed by the present invention.

[0183] Em uma variação, o agente anti- inflamatório é um fármaco anti-inflamatório não esteroidal (NSAID). Os NSAIDs exemplificativos incluem, porém sem limitação: aspirina, SulfasalazineTM, AsacolTM, DipendtumTM, PentasaTM, AnaproxTM, Anaprox DSTM (naproxeno sódico); AnsaidTM (flurbiprofeno); ArthrotecTM (diclofenaco sódico + misoprostila); CataflamTM/VoltarenTM (diclofenaco potássico); ClinorilTM (sulindaco); DayproTM (oxaprozina); DisalcidTM (salsalato); DolobidTM (diflunisal); EC NaprosynTM (naproxeno sódico); FeldeneTM (piroxicame); IndocinTM, Indocin SRTM (indometacina); LodineTM, Lodine XLTM (etodolaco); MotrinTM (ibuprofeno); NaprelanTM (naproxeno); NaprosynTM (naproxeno); OrudisTM, (cetoprofeno); OruvailTM (cetoprofeno); RelafenTM (nabumetona); TolectinTM, (tolmetina sódica); TrilisateTM (trissalicilato de magnésio colina); inibidores de Cox-1; inibidores de Cox-2 tais como VioxxTM (rofecoxibe); Arcoxiatm (etoricoxibe), CelebrexTM (celecoxibe); MobicTM (meloxicame); BextraTM (valdecoxibe), DynastatTM paracoxibe sódico; PrexigeTM (lumiracoxibe) e nambumetona. Os NSAIDs adequados adicionais incluem, porém sem limitação, os seguintes: ácido 5- aminossalicíclico (5-ASA, mesalamina, lesalazina), ácido ε- acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4- hidroxibutírico, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazaco, lisinato de bendazaco, benzidamina, beprozina, broperamol, bucolome, bufezolaco, ciproquazona, cloximato, dazidamina, deboxamete, detomidina, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluproquazona, fopirtolina, fosfsal, guaimesal, guaiazolna, isonixirna, HCl de lefetamina, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina, meseclazona, nabumetona, nictindol, nimesulida, orgoteína, orpanoxina, oxaceprolm, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxime, piproxeno, pirazolaco, pirfenidona, proquazona, proxazol, tielavina B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida e aqueles designados por número de código de companhia tais como 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4- benzoil-1-indancarboxílico), TVX2706, U60257, UR2301 e WY41770.[0183] In one variation, the anti-inflammatory agent is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID). Exemplary NSAIDs include, but are not limited to: aspirin, SulfasalazineTM, AsacolTM, DipendtumTM, PentasaTM, AnaproxTM, Anaprox DSTM (naproxen sodium); AnsaidTM (flurbiprofen); ArthrotecTM (diclofenac sodium + misoprostil); CataflamTM/VoltarenTM (diclofenac potassium); ClinorilTM (sulindac); DayproTM (oxaprozin); DisalcidTM (salsalate); DolobidTM (diflunisal); EC NaprosynTM (naproxen sodium); FeldeneTM (piroxicam); IndocinTM, Indocin SRTM (indomethacin); LodineTM, Lodine XLTM (ethodolac); MotrinTM (ibuprofen); NaprelanTM (naproxen); NaprosynTM (naproxen); OrudisTM, (ketoprofen); OruvailTM (ketoprofen); RelafenTM (nabumetone); TolectinTM, (tolmetin sodium); TrilisateTM (choline magnesium trisalicylate); Cox-1 inhibitors; Cox-2 inhibitors such as VioxxTM (rofecoxib); Arcoxiatm (etoricoxib), CelebrexTM (celecoxib); MobicTM (meloxicam); BextraTM (valdecoxib), DynastatTM paracoxib sodium; PrexigeTM (lumiracoxib) and nambumetone. Additional suitable NSAIDs include, but are not limited to, the following: 5-aminosalicylic acid (5-ASA, mesalamine, lesalazine), ε-acetamidocaproic acid, S-adenosylmethionine, 3-amino-4-hydroxybutyric acid, amixetrin, anitrazafen, antrafenine , bendazac, bendazac lysinate, benzydamine, beprozine, broperamole, bucolome, bufezolac, cyproquazone, cloximate, dazidamine, deboxameth, detomidine, diphenpyramide, diphenpyramide, difisalamine, ditazol, emorphazone, fanetizole mesylate, fenflumizole, floctafenine, flumizole, flunixin , fluproquazone , fopirtoline, phosfsal, guaimesal, guaiazolne, isonixirne, lefetamine HCl, leflunomide, lofemizole, lotifazole, lysine clonixinate, meseclazone, nabumetone, nictindol, nimesulide, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paraniline, perisoxal, perisoxal citrate , pifoxime , piproxene, pyrazolac, pirfenidone, proquazone, proxazole, thielavin B, tiflamizole, timegadine, tolectin, tolpadol, trytamide and those designated by company code number such as 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R 830, RS2131, SCR152, SH440 , SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoyl-1-indancarboxylic acid), TVX2706, U60257, UR2301 and WY41770.

[0184] Em outra variação, o agente anti- inflamatório compreende um composto que inibe a interação de citocinas inflamatórias com seus receptores. Os exemplos de inibidores de citocina úteis em combinação com os agentes de ligação específicos da invenção incluem, por exemplo, antagonistas (tais como anticorpos) de TGF-α (por exemplo, Remicade), assim como antagonistas (tais como anticorpos) direcionados contra interleucinas envolvidas na inflamação. Tais interleucinas são descritas no presente documento e incluem, de preferência, porém sem limitação, IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17 e IL-18. Consultar Feghali, et al., Frontiers in Biosci., 2:12 a 26 (1997).[0184] In another variation, the anti-inflammatory agent comprises a compound that inhibits the interaction of inflammatory cytokines with their receptors. Examples of cytokine inhibitors useful in combination with the specific binding agents of the invention include, for example, antagonists (such as antibodies) of TGF-α (e.g., Remicade), as well as antagonists (such as antibodies) directed against interleukins. involved in inflammation. Such interleukins are described herein and preferably include, but are not limited to, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL -12, IL-13, IL-17 and IL-18. See Feghali, et al., Frontiers in Biosci., 2:12 to 26 (1997).

[0185] Em outra variação, o agente anti- inflamatório é um corticosteroide. Os corticosteroides exemplificativos incluem, porém sem limitação, diacetato de difloroasona, propionato de clobetasol, propionato de halobetasol, betametasona, dipropionato de betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, fluocinonida, halcinonida desoximetasona, triancinolona, propionato de fluticasona, acetonida de fluocinolona, flurandrenolida, furoato de mometasona, betametosona, propionato de fluticasona, acetonida de fluocinolona, dipropionato de aclometasome, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamicinolona, desonida e hidrocortisona.[0185] In another variation, the anti-inflammatory agent is a corticosteroid. Exemplary corticosteroids include, but are not limited to, difloroasone diacetate, clobetasol propionate, halobetasol propionate, betamethasone, betamethasone dipropionate, budesonide, cortisone, dexamethasone, fluocinonide, deoximethasone halcinonide, triamcinolone, fluticasone propionate, fluocinolone acetonide, flurandrenolide, mometasone furoate, betamethosone, fluticasone propionate, fluocinolone acetonide, aclometasome dipropionate, methylprednisolone, prednisolone, prednisone, triamicinolone, desonide and hydrocortisone.

[0186] Em outra variação, o agente anti- inflamatório é ciclosporina.[0186] In another variation, the anti-inflammatory agent is cyclosporine.

[0187] Antibióticos[0187] Antibiotics

[0188] Em outra modalidade, os métodos descritos no presente documento compreendem opcional e adicionalmente administrar um antibiótico ao sujeito. Em algumas modalidades, o antibiótico e a molécula de ligação de ligante são coadministrados em uma única composição. Em outras modalidades, o antibiótico é administrado como uma composição separada da molécula de ligação de ligante. Os antibióticos exemplificativos incluem, porém sem limitação, tetraciclina, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, fármacos de sulfonamida, succinato sódico de cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, amantidina, idoxuridina, ácido p-amino salicíclico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina e carboxamida de imidazol.[0188] In another embodiment, the methods described herein optionally comprise and additionally administering an antibiotic to the subject. In some embodiments, the antibiotic and the ligand-binding molecule are co-administered in a single composition. In other embodiments, the antibiotic is administered as a composition separate from the ligand-binding molecule. Exemplary antibiotics include, but are not limited to, tetracyclines, aminoglycosides, penicillins, cephalosporins, sulfonamide drugs, chloramphenicol sodium succinate, erythromycin, vancomycin, lincomycin, clindamycin, nystatin, amphotericin B, amantidine, idoxuridine, p-amino salicyclic acid, isoniazid , rifampin, antinomycin D, mithramycin, daunomycin, adriamycin, bleomycin, vinblastine, vincristine, procarbazine and imidazole carboxamide.

[0189] Inibidores de tirosina quinase[0189] Tyrosine kinase inhibitors

[0190] Em outra modalidade, os métodos descritos no presente documento compreendem opcional e adicionalmente administrar um inibidor de tirosina quinase que inibe a atividade de VEGFR-2 e/ou VEGFR-3.[0190] In another embodiment, the methods described herein optionally comprise and additionally administering a tyrosine kinase inhibitor that inhibits the activity of VEGFR-2 and/or VEGFR-3.

[0191] Os inibidores de tirosina quinase exemplificativos para o uso nos métodos descritos no presente documento incluem, porém sem limitação, AEE788 (TKI, VEGFR-2, EGFR: Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2,-3, EGFR: Zactima: AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2: AstraZeneca); SU 11248 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR: Sunitinibe: Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, -2,-3: Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); GW7S6024 (TKL VEGFR-1, -2, -3: GlaxoSmithKline); GW786034 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: GlaxoSmithKline); sorafenibe (TKI, Bay 43-9006, VEGFR-1, -2, PDGFR: Bayer/Onyx); SU4312 (TKI, VEGFR-2, PDGFR: Pfizer); AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: Amgen); XL647 (TKI, EGFR, HER2, VEGFR, ErbB4: Exelixis); XL999 (TKl, FGFR, VEGFR, PDGFR, Fll- 3: Exelixis); PKC412 (TKI, KIT, PDGFR, PKC, FLT3, VEGFR-2: Novartis); AEE788 (TKI, EGFR, VEGFR2, VEGFR-1: Novartis): OSI-030 (TKI, c-kil, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); OS1-817 (c- kit de TKI, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); DMPQ (TKI, ERGF, PDGFR, ErbB2. p56. pkA, pkC); MLN518 (TKI, Flt3, PDGFR, c-KIT (T53518: Millennium Pharmaceuticals); lestaurinibe (TKI, FLT3, CEP-701, Cephalon); ZD 1839 (TKI, EGFR: gefitinibe, Iressa: AstraZcneca); OSI-774 (TKI, EGFR: Erlotinibe: Tarceva: OSI Pharmaceuticals); lapatinibe (TKI, ErbB-2, EGFR e GD-2016: Tykerb: GlaxoSmithKline).[0191] Exemplary tyrosine kinase inhibitors for use in the methods described herein include, but are not limited to, AEE788 (TKI, VEGFR-2, EGFR: Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, EGFR: Zactima: AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2: AstraZeneca); SU 11248 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR: Sunitinib: Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1, -2: Pfizer); GW7S6024 (TKL VEGFR-1, -2, -3: GlaxoSmithKline); GW786034 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: GlaxoSmithKline); sorafenib (TKI, Bay 43-9006, VEGFR-1, -2, PDGFR: Bayer/Onyx); SU4312 (TKI, VEGFR-2, PDGFR: Pfizer); AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3: Amgen); XL647 (TKI, EGFR, HER2, VEGFR, ErbB4: Exelixis); XL999 (TKl, FGFR, VEGFR, PDGFR, Fll-3: Exelixis); PKC412 (TKI, KIT, PDGFR, PKC, FLT3, VEGFR-2: Novartis); AEE788 (TKI, EGFR, VEGFR2, VEGFR-1: Novartis): OSI-030 (TKI, c-kil, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); OS1-817 (c- TKI kit, VEGFR: OSI Pharmaceuticals); DMPQ (TKI, ERGF, PDGFR, ErbB2. p56. pkA, pkC); MLN518 (TKI, Flt3, PDGFR, c-KIT (T53518: Millennium Pharmaceuticals); lestaurinib (TKI, FLT3, CEP-701, Cephalon); ZD 1839 (TKI, EGFR: gefitinib, Iressa: AstraZcneca); OSI-774 (TKI , EGFR: Erlotinib: Tarceva: OSI Pharmaceuticals); lapatinib (TKI, ErbB-2, EGFR and GD-2016: Tykerb: GlaxoSmithKline).

[0192] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem opcional e adicionalmente administrar um inibidor de tirosina quinase que inibe a angiogênese ao sujeito. Inibidores de tirosina quinase exemplificativos e seus alvos são fornecidos abaixo na Tabela 2.[0192] In some embodiments, the methods described herein optionally comprise and additionally administering a tyrosine kinase inhibitor that inhibits angiogenesis to the subject. Exemplary tyrosine kinase inhibitors and their targets are provided below in Table 2.

[0193] Tabela 2. Inibidores de receptor de tirosina quinase antiangiogênicos e seus alvos [0193] Table 2. Antiangiogenic tyrosine kinase receptor inhibitors and their targets

[0195] As moléculas de ligação de ligante podem ser administradas em combinação com mais do que um composto ativo ou terapias adicionais. Em uma modalidade, uma molécula de ligação de ligante da presente invenção é administrada em combinação com um produto inibidor de PDGF e um produto inibidor de VEGF-A. Por exemplo, uma molécula de ligação de ligante (tal como essa que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3) pode ser administrada em combinação com (i) Aflibercept (Eylea®) e (ii) um anticorpo de PDGFR (tal como este sendo desenvolvido por Regeneron Inc. para indicações oculares) ou um aptâmero de PDGF (tal como E10030 (FovistaTM) sendo desenvolvido por Ophthotech Inc. para indicações oculares). Administração da Terapia de Combinação[0195] Ligand binding molecules can be administered in combination with more than one active compound or additional therapies. In one embodiment, a ligand-binding molecule of the present invention is administered in combination with a PDGF inhibitory product and a VEGF-A inhibitory product. For example, a ligand-binding molecule (such as one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) can be administered in combination with (i) Aflibercept (Eylea®) and (ii) a PDGFR antibody (such such as this being developed by Regeneron Inc. for ocular indications) or a PDGF aptamer (such as E10030 (FovistaTM) being developed by Ophthotech Inc. for ocular indications). Administration of Combination Therapy

[0196] A terapia de combinação com um ou mais dos agentes ativos adicionais descritos no presente documento pode ser alcançada administrando-se a um sujeito uma única composição ou formulação farmacológica que inclui a molécula de ligação de ligante e os um ou mais agentes ativos adicionais ou administrando ao sujeito duas (ou mais) composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui uma molécula de ligação de ligante e a outra inclui um agente ativo adicional.[0196] Combination therapy with one or more of the additional active agents described herein can be achieved by administering to a subject a single pharmacological composition or formulation that includes the ligand-binding molecule and the one or more additional active agents or administering to the subject two (or more) distinct compositions or formulations at the same time, wherein one composition includes a ligand-binding molecule and the other includes an additional active agent.

[0197] Alternativamente, a terapia de combinação que emprega uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento pode preceder ou seguir o segundo tratamento por intervalos que estão na faixa de minutos a semanas. Nas modalidades em que o segundo agente a molécula de ligação de ligante são administrados separadamente, se asseguraria geralmente que um período de tempo significativo não expirou entre os tempos de cada entrega, de modo que o agente e a molécula de ligação de ligante ainda tenham a capacidade de exercer um efeito vantajosamente combinado. Em tais ocorrências, contempla-se que se administraria ambas as modalidades dentro de cerca de 12 a 24 horas entre si e, de maior preferência, dentro de cerca de 6 a 12 hours entre si, com um tempo de atraso de apenas cerca de 12 horas sendo mais preferencial. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para o tratamento significativamente, entretanto, em que diversos dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a diversas semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) passam entre as respectivas administrações. Os tratamentos repetidos com um ou ambos os agentes são especialmente contemplados. Formulação e carreadores farmaceuticamente aceitáveis[0197] Alternatively, the combination therapy employing a ligand-binding molecule described herein may precede or follow the second treatment by intervals that are in the range of minutes to weeks. In embodiments in which the second agent and ligand-binding molecule are administered separately, it would generally be ensured that a significant period of time has not expired between the times of each delivery, such that the agent and the ligand-binding molecule still have the ability to exert an advantageously combined effect. In such instances, it is contemplated that both modalities would be administered within about 12 to 24 hours of each other and, more preferably, within about 6 to 12 hours of each other, with a delay time of only about 12 hours. hours being more preferred. In some situations, it may be desirable to extend the time period for treatment significantly, however, where several days (2, 3, 4, 5, 6, or 7) to several weeks (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8) pass between the respective administrations. Repeated treatments with one or both agents are especially contemplated. Pharmaceutically acceptable formulation and carriers

[0198] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas que compreendem uma molécula de ligação de ligante da invenção. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais moléculas de ligação de ligante e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, tais composições compreendem uma ou mais moléculas de ligação de ligante e, opcionalmente, um ou mais agentes ativos adicionais (no caso de uma terapia de combinação). Em uma modalidade, tais composições compreendem uma ou mais moléculas de ligação de ligante e opcionalmente um ou mais agentes ativos adicionais selecionados dentre um produto inibidor de PDGF e um produto inibidor de VEGF-A. Em outra modalidade, uma composição que compreende uma ou mais moléculas de ligação de ligante da invenção e outra composição que compreende um produto inibidor de PDGF ou um produto inibidor de VEGF-A são administradas.[0198] The present invention also provides pharmaceutical compositions comprising a ligand-binding molecule of the invention. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of one or more ligand binding molecules and a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, such compositions comprise one or more ligand-binding molecules and, optionally, one or more additional active agents (in the case of a combination therapy). In one embodiment, such compositions comprise one or more ligand binding molecules and optionally one or more additional active agents selected from a PDGF inhibitory product and a VEGF-A inhibitory product. In another embodiment, a composition comprising one or more ligand binding molecules of the invention and another composition comprising a PDGF inhibitory product or a VEGF-A inhibitory product are administered.

[0199] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listada na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e, mais particularmente, em humanos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o agente terapêutico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejada, pode também conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH.[0199] The term "pharmaceutically acceptable" means approved by a federal or state government regulatory agency or listed in the United States Pharmacopoeia or other generally recognized pharmacopoeia for use in animals and, more particularly, in humans. The term "carrier" refers to a diluent, adjuvant, excipient or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids, such as water and oils, including those of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry skimmed milk, glycerol, propylene, glycol , water, ethanol and similar. The composition, if desired, may also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents or pH buffering agents.

[0200] As composições podem estar na forma de soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, granulados, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, dispositivos de entrega, formulações de liberação prolongada, supositórios, injetáveis, implantes, aspersões, gotículas, aerossóis e similares. As composições que compreendem uma molécula de ligação de ligante, um ou mais agentes ativos adicionais ou ambos podem ser formulados de acordo com a prática farmacêutica convencional (consultar, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20a edição) ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. e Enciclopedia of Pharmaceutical Technology, eds., J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988 a 2002, Marcel Dekker, Nova York). Os exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.[0200] The compositions may be in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, granules, gels including hydrogels, pastes, ointments, creams, delivery devices, extended release formulations, suppositories, injectables, implants , sprays, droplets, aerosols and similar. Compositions comprising a ligand-binding molecule, one or more additional active agents, or both may be formulated in accordance with conventional pharmaceutical practice (see, for example, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (20th edition) ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds., J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988 to 2002, Marcel Dekker, New York). Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin.

[0201] A administração das composições pode ser por qualquer meio adequado que resulta em uma quantidade de molécula de ligação de ligante e/ou agentes ativos adicionais que é eficaz para o tratamento ou prevenção da doença ou distúrbio particular. Cada molécula de ligação de ligante, por exemplo, pode ser misturada por adição com uma substância carreadora adequada e está geralmente presente em uma quantidade de 1 a 95% em peso do peso total da composição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para a administração oftálmica, oral, parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea), retal, transdérmica, nasal ou inalante. Em uma modalidade, a composição está em uma forma que é adequada para a injeção diretamente no olho[0201] Administration of the compositions may be by any suitable means that results in an amount of ligand-binding molecule and/or additional active agents that is effective for treating or preventing the particular disease or disorder. Each ligand binding molecule, for example, can be mixed by addition with a suitable carrier substance and is generally present in an amount of 1 to 95% by weight of the total weight of the composition. The composition may be provided in a dosage form that is suitable for ophthalmic, oral, parenteral (e.g., intravenous, intramuscular, subcutaneous), rectal, transdermal, nasal or inhalant administration. In one embodiment, the composition is in a form that is suitable for injection directly into the eye.

[0202] As moléculas de ligação de ligante da invenção e, quando presentes em terapias de combinação, os um ou mais agentes ativos adicionais podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres tais como aqueles derivados de ácidos clorídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc. e aqueles formados com grupos carboxila livres tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.[0202] The ligand-binding molecules of the invention and, when present in combination therapies, the one or more additional active agents can be formulated as neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include those formed with free amino groups such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc. and those formed with free carboxyl groups such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, ferric hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylamino ethanol, histidine, procaine, etc.

[0203] As moléculas de ligação de ligante e os agentes ativos adicionais da presente invenção podem possuir um grupo funcional suficientemente básico que pode reagir com qualquer um dentre vários ácidos inorgânicos e orgânicos para formar um sal farmaceuticamente aceitável. Um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável é formado a partir de um ácido farmaceuticamente aceitável, conforme é bem conhecido na técnica. Tais sais incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis listados em Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 a 19 (1977) e The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl e C. G. Wermuth (ED.s), Verlag, Zurich (Suíça) 2002, que são incorporados ao presente a título de referência em sua totalidade.[0203] The ligand binding molecules and additional active agents of the present invention may have a sufficiently basic functional group that can react with any of a number of inorganic and organic acids to form a pharmaceutically acceptable salt. A pharmaceutically acceptable acid addition salt is formed from a pharmaceutically acceptable acid as is well known in the art. Such salts include the pharmaceutically acceptable salts listed in Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 to 19 (1977) and The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (ED.s), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002, which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0204] Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, saccarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p- toluenossulfonato, canforossulfonato, pamoato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, cloro benzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o- acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, alfa-hidroxibutirato, butina-1,4- dicarboxilato, hexina-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato, glicolato, heptanoato, hipurato, malato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, fthalato, terafthalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p- bromobenzenossulfonato, clorobenzenossulfonato, etilsulfonato, 2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, naftaleno-1,5- sulfonato, xilenossulfonato e tartarato.[0204] Pharmaceutically acceptable salts include salts of sulfate, citrate, acetate, oxalate, chloride, bromide, iodide, nitrate, bisulfate, phosphate, acid phosphate, isonicotinate, lactate, salicylate, acid citrate, tartrate, oleate, tannate, pantothenate, bitartrate, ascorbate, succinate, maleate, gentilinate, fumarate, gluconate, glucaronate, saccharate, formate, benzoate, glutamate, methanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, camphorsulfonate, pamoate, phenylacetate, trifluoroacetate, acrylate, chlorobenzoate, dinitrobenzo act , hydroxybenzoate, methoxybenzoate, methylbenzoate, o-acetoxybenzoate, naphthalene-2-benzoate, isobutyrate, phenylbutyrate, alpha-hydroxybutyrate, butyn-1,4-dicarboxylate, hexin-1,4-dicarboxylate, caprate, caprylate, cinnamate, glycolate, heptanoate , hippurate, malate, hydroxymaleate, malonate, mandelate, mesylate, nicotinate, phthalate, teraphthalate, propiolate, propionate, phenylpropionate, sebacate, suberate, p-bromobenzenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, ethylsulfonate, 2-hydroxyethylsulfonate, methylsulfonate, naphthalene-1-sulfonate, naphthalene -2-sulfonate, naphthalene-1,5-sulfonate, xylenesulfonate and tartrate.

[0205] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" também se refere a um sal de uma molécula de ligação de ligante e agente ativo adicional que tem um grupo funcional ácido, tal como um grupo funcional de ácido carboxílico e uma base. As bases adequadas incluem, porém sem limitação, hidróxidos de metais alcalinos tais como sódio, potássio e lítio; hidróxidos de metal alcalino terroso tais como cálcio e magnésio; hidróxidos de outros metais, tais como alumínio e zinco; amônia e aminas orgânicas, tais como mono, di ou tri- alquilaminas substituídas por hidróxi ou não substituídas, dicicloexilamina; tributil amina; piridina; N-metila, N- etilamina; dietilamina; trietilamina; mono, bis ou tris-(2- OH-alquilaminas inferiores), tais como mono, bis ou tris-(2- hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina ou tris(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquila inferior- N(hidroxil-alquila inferior)-aminas, tais como N,N-dimetil-N- (2-hidroxietil)amina ou tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D- glucamina; e aminoácidos tais como arginina, lisina e similares. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" também inclui um hidrato de um composto da invenção.[0205] The term "pharmaceutically acceptable salt" also refers to a salt of an additional active agent and ligand binding molecule that has an acidic functional group, such as a carboxylic acid functional group and a base. Suitable bases include, but are not limited to, alkali metal hydroxides such as sodium, potassium and lithium; alkaline earth metal hydroxides such as calcium and magnesium; hydroxides of other metals, such as aluminum and zinc; ammonia and organic amines, such as hydroxy-substituted or unsubstituted mono-, di- or trialkylamines, dicyclohexylamine; tributyl amine; pyridine; N-methyl, N-ethylamine; diethylamine; triethylamine; mono, bis or tris-(2-OH-lower alkylamines), such as mono, bis or tris-(2-hydroxyethyl)amine, 2-hydroxy-tert-butylamine or tris(hydroxymethyl)methylamine, N,N-di- lower alkyl-N(hydroxyl-lower alkyl)-amines, such as N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl)amine or tri-(2-hydroxyethyl)amine; N-methyl-D-glucamine; and amino acids such as arginine, lysine and the like. The term "pharmaceutically acceptable salt" also includes a hydrate of a compound of the invention.

[0206] As composições são, em um aspecto útil, administradas de modo parental (por exemplo, por injeção ou implante intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, intraocular, intravítreo, retrobulbar, subconjuntival, subtenoniano ou subcutâneo) ou de modo sistêmico. As formulações para administração parenteral ou sistêmica incluem soluções, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, solução salina e similares. Os exemplos de outros veículos adequados incluem polipropileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, gelatina, hidrogéis, naftalenos hidrogenados e sais orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Tais formulações podem também conter substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes, de tamponamento, emulsificantes e/ou dispersantes. Polímero de lactídeo biodegradável e biocompatível, copolímero de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno podem ser usados para controlar a liberação dos ingredientes ativos.[0206] The compositions are, in a useful aspect, administered parentally (for example, by intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraocular, intravitreal, retrobulbar, subconjunctival, subtenonal or subcutaneous injection or implant) or systemically. Formulations for parenteral or systemic administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. A variety of aqueous carriers can be used, for example, water, buffered water, saline and the like. Examples of other suitable carriers include polypropylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, gelatin, hydrogels, hydrogenated naphthalenes and injectable organic salts such as ethyl oleate. Such formulations may also contain auxiliary substances, such as wetting, buffering, emulsifying and/or dispersing agents. Biodegradable and biocompatible lactide polymer, lactide/glycolide copolymer or polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers can be used to control the release of active ingredients.

[0207] Alternativamente, as composições podem ser administradas por ingestão. As composições pretendidas para o uso oral podem ser preparadas em formas sólidas ou líquidas, de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação das composições farmacêuticas.[0207] Alternatively, the compositions can be administered by ingestion. Compositions intended for oral use may be prepared in solid or liquid form, according to any method known in the art for manufacturing pharmaceutical compositions.

[0208] As formas de dosagem sólidas para a administração oral incluem cápsulas, tabletes, pílulas, pós e grânulos. Geralmente, essas preparações farmacêuticas contêm ingredientes ativos misturados por adição com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. Os mesmos incluem, por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, sacarose, glicose, manitol, celulose, amido, fosfato de cálcio, fosfato de sódio, caulim e similares. Agentes de ligação, agentes de tamponamento e/ou agentes lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio) podem ser também usados. Tabletes e pílulas podem ser adicionalmente preparados com revestimentos entéricos. As composições podem conter opcionalmente agentes edulcorantes, flavorizantes, colorantes, perfumantes e conservantes a fim de fornecer uma preparação mais palatável.[0208] Solid dosage forms for oral administration include capsules, tablets, pills, powders and granules. Generally, these pharmaceutical preparations contain active ingredients mixed by addition with non-toxic pharmaceutically acceptable excipients. They include, for example, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, lactose, sucrose, glucose, mannitol, cellulose, starch, calcium phosphate, sodium phosphate, kaolin and the like. Binding agents, buffering agents and/or lubricating agents (e.g. magnesium stearate) may also be used. Tablets and pills can additionally be prepared with enteric coatings. The compositions may optionally contain sweetening, flavoring, coloring, perfuming and preservative agents in order to provide a more palatable preparation.

[0209] As formas de dosagem sólidas podem ser úteis para o tratamento de distúrbios oculares. As composições úteis para o uso ocular incluem tabletes que compreendem uma ou mais moléculas de ligação de ligante na mistura por adição com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes ou cargas inertes (por exemplo, sacarose e sorbitol), agentes lubrificantes, deslizantes e antiadesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco).[0209] Solid dosage forms may be useful for treating ocular disorders. Compositions useful for ocular use include tablets comprising one or more ligand-binding molecules in admixture with a pharmaceutically acceptable excipient. Such excipients may be, for example, diluents or inert fillers (e.g. sucrose and sorbitol), lubricating, gliding and anti-adhesive agents (e.g. magnesium stearate, zinc stearate, stearic acid, silicas, hydrogenated vegetable oils or talc) .

[0210] As composições da presente invenção podem ser administradas de modo intraocular por injeção intravítrea no olho assim como por injeções subconjuntival e subtenoniana. Outras rotas de administração incluem transescleral, retrobulbar, intraperitoneal, intramuscular e intravenosa. Alternativamente, as composições podem ser administradas com o uso de um dispositivo de entrega de fármaco ou um implante intraocular.[0210] The compositions of the present invention can be administered intraocularly by intravitreal injection into the eye as well as by subconjunctival and subtenon injections. Other routes of administration include transscleral, retrobulbar, intraperitoneal, intramuscular, and intravenous. Alternatively, the compositions can be administered using a drug delivery device or an intraocular implant.

[0211] As formas de dosagem líquidas para a administração podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e cápsulas de gelatina moles farmaceuticamente aceitáveis. Essas formas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tal como água ou um meio oleoso e podem também incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de suspensão.[0211] Liquid dosage forms for administration may include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups and soft gelatin capsules. These forms may contain inert diluents commonly used in the art, such as water or an oily medium, and may also include adjuvants, such as wetting agents, emulsifying agents and suspending agents.

[0212] Em algumas ocorrências, as composições podem também ser administradas topicamente, por exemplo, por emplastro ou por aplicação direta a uma região, tal como a epiderme ou o olho, suscetíveis a ou afetadas um distúrbio neovascular ou por iontoforese.[0212] In some instances, the compositions may also be administered topically, for example, by patch or by direct application to a region, such as the epidermis or the eye, susceptible to or affected by a neovascular disorder or by iontophoresis.

[0213] No caso das terapias de combinação da presente invenção, as moléculas de ligação de ligante e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser misturados por adição em um tablete ou outro veículo ou podem ser divididos. Em um exemplo, a molécula de ligação de ligante está contida no interior do tablete e um agente ativo adicional está no exterior, de modo que uma porção substancial do agente ativo adicional seja liberada antes da liberação da molécula de ligação de ligante contida.[0213] In the case of the combination therapies of the present invention, the ligand binding molecules and one or more additional active agents can be mixed by addition in a tablet or other vehicle or can be divided. In one example, the ligand-binding molecule is contained within the tablet and an additional active agent is on the exterior, such that a substantial portion of the additional active agent is released prior to release of the contained ligand-binding molecule.

[0214] Em uma modalidade, as composições que compreendem uma molécula de ligação de ligante (e opcionalmente um ou mais agentes ativos adicionais) podem compreender um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em uma modalidade, tais excipientes incluem, porém sem limitação, agentes de tamponamento, tensoativos não iônicos, conservantes, agentes de tonicidade, aminoácidos, açúcares e agentes de ajuste de pH. Os agentes de tamponamento adequados incluem, porém sem limitação, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico e acetato de sódio. Os tensoativos não iônicos adequados incluem, porém sem limitação, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano tais como polissorbato 20 e polissorbato 80. Os conservantes adequados incluem, porém sem limitação, álcool benzílico. Os agentes de tonicidade adequados incluem, porém sem limitação, cloreto de sódio, manitol e sorbitol. Os açúcares adequados incluem, porém sem limitação, α,α-trealose desidratada. Os aminoácidos adequados incluem, porém sem limitação, glicina e histidina. Os agentes de ajuste de pH adequado, porém sem limitação, ácido clorídrico, ácido acético e hidróxido de sódio. Em uma modalidade, o agente ou agentes de ajuste de pH estão presentes em uma quantidade eficaz para fornecer um pH de cerca de 3 a cerca de 8, cerca de 4 a cerca de 7, cerca de 5 a cerca de 6, cerca de 6 a cerca de 7 ou cerca de 7 a cerca de 7,5. Em uma modalidade, uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante não compreende um conservante. Em outra modalidade, uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante não compreende um agente antimicrobiano. Em outra modalidade, uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante não compreende um bacteriostático.[0214] In one embodiment, compositions comprising a ligand binding molecule (and optionally one or more additional active agents) may comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients. In one embodiment, such excipients include, but are not limited to, buffering agents, nonionic surfactants, preservatives, tonicity agents, amino acids, sugars and pH adjusting agents. Suitable buffering agents include, but are not limited to, monobasic sodium phosphate, dibasic sodium phosphate and sodium acetate. Suitable non-ionic surfactants include, but are not limited to, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20 and polysorbate 80. Suitable preservatives include, but are not limited to, benzyl alcohol. Suitable tonicizing agents include, but are not limited to, sodium chloride, mannitol and sorbitol. Suitable sugars include, but are not limited to, dehydrated α,α-trehalose. Suitable amino acids include, but are not limited to, glycine and histidine. Suitable but not limited to pH adjusting agents are hydrochloric acid, acetic acid, and sodium hydroxide. In one embodiment, the pH adjusting agent or agents are present in an amount effective to provide a pH of about 3 to about 8, about 4 to about 7, about 5 to about 6, about 6. to about 7 or about 7 to about 7.5. In one embodiment, a composition comprising a ligand binding molecule does not comprise a preservative. In another embodiment, a composition comprising a ligand-binding molecule does not comprise an antimicrobial agent. In another embodiment, a composition comprising a ligand-binding molecule does not comprise a bacteriostat.

[0215] Em uma modalidade, uma composição que compreende uma molécula de ligação de ligante (e opcionalmente um ou mais agentes ativos adicionais) está na forma de uma solução aquosa que é adequada para injeção. Em uma modalidade, uma composição compreende uma molécula de ligação de ligante, um agente de tamponamento, um agente de ajuste de pH e água para injeção. Em outra modalidade, uma composição compreende uma molécula de ligação de ligante, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, cloreto de sódio, ácido clorídrico e hidróxido de sódio. Em outra modalidade, uma composição compreende uma molécula de ligação de ligante, fosfato (por exemplo, fosfato de sódio monobásico), trealose, cloreto de sódio e polissorbato.[0215] In one embodiment, a composition comprising a ligand binding molecule (and optionally one or more additional active agents) is in the form of an aqueous solution that is suitable for injection. In one embodiment, a composition comprises a ligand binding molecule, a buffering agent, a pH adjusting agent, and water for injection. In another embodiment, a composition comprises a ligand binding molecule, monobasic sodium phosphate, dibasic sodium phosphate, sodium chloride, hydrochloric acid and sodium hydroxide. In another embodiment, a composition comprises a ligand binding molecule, phosphate (e.g., monobasic sodium phosphate), trehalose, sodium chloride, and polysorbate.

[0216] As composições aquosas úteis para praticar os métodos da invenção em uma estrutura ocular têm osmolaridade e pH oftalmicamente compatível. Um ou mais agentes de ajuste de pH e/ou agentes de tamponamento oftalmicamente podem ser incluídos em uma composição da invenção, incluindo ácidos tais como ácidos acético, bórico, cítrico, lático, fosfórico e clorídrico; bases tais como hidróxido de sódio, fosfato de sódio, borato de sódio, citrato de sódio, acetato de sódio e lactato de sódio; e tampões tais como citrato/dextrose, bicarbonato de sódio e cloreto de amônio. Tais ácidos, bases e tampões são incluídos em uma quantidade exigida para manter o pH da composição em uma faixa oftalmicamente aceitável. Um ou mais sais oftalmicamente aceitáveis podem ser incluídos na composição em uma quantidade suficiente para colocar a osmolaridade da composição em uma faixa oftalmicamente aceitável. Tais sais incluem aqueles que têm cátions de sódio, potássio ou amônio e ânions de cloreto, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiossulfato ou bissulfito.[0216] Aqueous compositions useful for practicing the methods of the invention on an ocular structure have ophthalmically compatible osmolarity and pH. One or more pH-adjusting agents and/or ophthalmically buffering agents may be included in a composition of the invention, including acids such as acetic, boric, citric, lactic, phosphoric and hydrochloric acids; bases such as sodium hydroxide, sodium phosphate, sodium borate, sodium citrate, sodium acetate and sodium lactate; and buffers such as citrate/dextrose, sodium bicarbonate and ammonium chloride. Such acids, bases and buffers are included in an amount required to maintain the pH of the composition in an ophthalmically acceptable range. One or more ophthalmically acceptable salts may be included in the composition in an amount sufficient to bring the osmolarity of the composition into an ophthalmically acceptable range. Such salts include those that have sodium, potassium, or ammonium cations and chloride, citrate, ascorbate, borate, phosphate, bicarbonate, sulfate, thiosulfate, or bisulfite anions.

[0217] Em algumas modalidades, a composição que compreende uma molécula de ligação de ligante da presente invenção é formulada para a entrega ao olho de um sujeito. Os carreadores oftálmicos adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica e todos os carreadores convencionais podem ser empregados na presente invenção. Os compostos exemplificativos incorporados para facilitar e promover a entrega transdérmica de composições tópicas em tecidos oculares ou tecidos anexos incluem, porém sem limitação, álcool (etanol, propanol e nonanol), álcool graxo (álcool laurílico), ácido graxo (ácido valérico, ácido caproico e ácido cáprico ), éster de ácido graxo (miristato de isopropila e n-hexanoato de isopropila), éster alquílico (acetato de etila e acetato de butila), poliol (propileno glicol, propanediona e hexanetriol), sulfóxido (dimetilsulfóxido e decilmetilsulfóxido), amida (ureia, dimetilacetamida e derivados de pirrolidona), tensoativo (lauril sulfato de sódio, brometo de cetiltrimetilamônio, polaxâmeros, spans, tweens, sais biliares e lecitina), terpeno (d-limoneno, alfaterpeneol, 1,8-cineol e mentona) e alcanona (N-heptano e N-nonano). Além disso, as composições topicamente administradas compreendem agentes de modulação de molécula de adesão de superfície incluindo, porém sem limitação, um antagonista de caderina, um antagonista de selectina e um antagonista de integrina. Assim, um carreador particular pode tomar a forma de uma dispersão, solução, gel, creme ou pomada oftálmica estéril. Incluindo também como carreadores oftálmicos adequados estão os polímeros de liberação lenta, por exemplo, polímeros "Ocusert", polímeros "Hydron", etc.[0217] In some embodiments, the composition comprising a ligand binding molecule of the present invention is formulated for delivery to the eye of a subject. Suitable ophthalmic carriers are known to those skilled in the art and all conventional carriers can be employed in the present invention. Exemplary compounds incorporated to facilitate and promote transdermal delivery of topical compositions to ocular tissues or adnexal tissues include, but are not limited to, alcohol (ethanol, propanol and nonanol), fatty alcohol (lauryl alcohol), fatty acid (valeric acid, caproic acid and capric acid), fatty acid ester (isopropyl myristate and isopropyl n-hexanoate), alkyl ester (ethyl acetate and butyl acetate), polyol (propylene glycol, propanedione and hexanetriol), sulfoxide (dimethyl sulfoxide and decylmethyl sulfoxide), amide (urea, dimethylacetamide and pyrrolidone derivatives), surfactant (sodium lauryl sulfate, cetyltrimethylammonium bromide, polaxamers, spans, tweens, bile salts and lecithin), terpene (d-limonene, alfaterpeneol, 1,8-cineole and menthone) and alkanone (N-heptane and N-nonane). Furthermore, topically administered compositions comprise surface adhesion molecule modulating agents including, but not limited to, a cadherin antagonist, a selectin antagonist, and an integrin antagonist. Thus, a particular carrier may take the form of a sterile ophthalmic dispersion, solution, gel, cream or ointment. Also including as suitable ophthalmic carriers are slow release polymers, e.g. "Ocusert" polymers, "Hydron" polymers, etc.

[0218] Os intensificadores de viscosidade oftálmicos exemplificativos que podem ser usados na presente formulação incluem: carboximetil celulose sódica; metilcelulose; hidroxipropil celulose; hidroxipropilmetil celulose; hidroxietil celulose; polietileno glicol 300; polietileno glicol 400; álcool polivinílico; e providona.[0218] Exemplary ophthalmic viscosity enhancers that can be used in the present formulation include: sodium carboxymethyl cellulose; methylcellulose; hydroxypropyl cellulose; hydroxypropylmethyl cellulose; hydroxyethyl cellulose; polyethylene glycol 300; polyethylene glycol 400; polyvinyl alcohol; and providone.

[0219] Alguns produtos naturais, tais como goma vê, alginatos, goma xantana, gelatina, acácia e tragacanto, podem também ser usados para aumentar a viscosidade das soluções oftálmicas.[0219] Some natural products, such as gum, alginates, xanthan gum, gelatin, acacia and tragacanth, can also be used to increase the viscosity of ophthalmic solutions.

[0220] Uma tonicidade é importante porque colírios hipotônicos causam um edema da córnea e colírios hipertônicos causam deformação da córnea. A tonicidade ideal é aproximadamente 300 mOsM. A tonicidade pode ser alcançada pelos métodos descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, conhecidos por aqueles versados na técnica.[0220] Tonicity is important because hypotonic eye drops cause corneal edema and hypertonic eye drops cause corneal deformation. The ideal tonicity is approximately 300 mOsM. Tonicity can be achieved by the methods described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, known to those skilled in the art.

[0221] Os estabilizadores podem também ser usados tais como, por exemplo, agentes quelantes, por exemplo, EDTA. Antioxidantes podem também ser usados, por exemplo, bissulfito de sódio, tiossulfito de sódio, 8-hidroxi quinolina ou ácido ascórbico. A esterilidade será tipicamente mantida por conservantes oftálmicos convencionais, por exemplo, clorobutanol, cloreto de benzalcônio, cloreto de cetilpirídio, sais fenil mercúricos, timerosal, etc. para as formulações aquosas e usada em quantidades que são não tóxicas e que variam geralmente de cerca de 0,001 a cerca de 0,1% em peso da solução aquosa. Os conservantes convencionais para pomadas incluem metil e propil parabenos. As bases de pomada típicas incluem petrolato branco e óleo mineral ou petrolato líquido. Entretanto, carreadores aquosos preservados são preferenciais. As soluções podem ser manualmente entregues ao olho na forma de dosagem adequada, por exemplo, colírio ou entregues pelo aparelho de aspersão ou microgotícula adequado que rende tipicamente uma dose medida do medicamento. Os exemplos de carreadores oftálmicos adequados incluem soluções aquosas substancialmente isotônicas estéreis que contêm quantidades menores, isto é, menores do que cerca de 5% em peso de hidroxipropilmetilcelulose, álcool polivinílico, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, glierina e EDTA. As soluções são preferencialmente mantidas a um pH substancialmente neutro e isotônicas com quantidades apropriadas de tampões convencionais, por exemplo, fosfato, borato, acetato, tris.[0221] Stabilizers can also be used such as, for example, chelating agents, for example, EDTA. Antioxidants can also be used, for example sodium bisulfite, sodium thiosulfite, 8-hydroxy quinoline or ascorbic acid. Sterility will typically be maintained by conventional ophthalmic preservatives, e.g., chlorobutanol, benzalkonium chloride, cetylpyridium chloride, phenyl mercuric salts, thimerosal, etc. for aqueous formulations and used in amounts that are non-toxic and generally range from about 0.001 to about 0.1% by weight of the aqueous solution. Conventional preservatives for ointments include methyl and propyl parabens. Typical ointment bases include white petrolatum and mineral oil or liquid petrolatum. However, preserved aqueous carriers are preferred. The solutions may be manually delivered to the eye in the appropriate dosage form, e.g., eye drops, or delivered by the appropriate spray or microdroplet apparatus which typically yields a measured dose of the medication. Examples of suitable ophthalmic carriers include sterile substantially isotonic aqueous solutions that contain minor amounts, i.e., less than about 5% by weight of hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, glycerin and EDTA. The solutions are preferably maintained at a substantially neutral pH and isotonic with appropriate amounts of conventional buffers, e.g., phosphate, borate, acetate, tris.

[0222] Em algumas modalidades, intensificadores de penetração são adicionados ao carreador oftalmológicos.[0222] In some embodiments, penetration enhancers are added to the ophthalmic carrier.

[0223] A quantidade da molécula de ligação de ligante que será eficaz para seu uso terapêutico pretendido pode ser determinada por técnicas clínicas-padrão com base na descrição presente. Adicionalmente, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para auxiliar a identificar faixas de dosagem ideais. A quantidade de molécula de ligação de ligante que é misturada por adição aos materiais carreadores para produzir uma única dosagem pode variar dependendo do mamífero que é tratado e do modo particular de administração.[0223] The amount of the ligand-binding molecule that will be effective for its intended therapeutic use can be determined by standard clinical techniques based on the present description. Additionally, in vitro assays can optionally be employed to help identify ideal dosage ranges. The amount of ligand binding molecule that is mixed by addition to the carrier materials to produce a single dosage can vary depending on the mammal being treated and the particular mode of administration.

[0224] A dosagem da molécula de ligação de ligante pode depender de diversos fatores incluindo a severidade da afecção, se a afecção deve ser tratada ou prevenida e da idade, peso e saúde da pessoa a ser tratada. Adicionalmente, as informações farmacogenômicas (o efeito do genótipo no perfil farmacocinético, farmacodinâmico ou de eficácia de um agente terapêutico) sobre um paciente particular pode afetar a dosagem usada. Ademais, as dosagens individuais exatas podem ser ajustadas de algum modo dependendo de uma variedade de fatores, incluindo as terapias de combinação específicas que são administradas, o tempo de administração, a rota de administração, a natureza da formulação, a taxa de excreção, a doença particular sendo tratada (por exemplo, o distúrbio ocular particular sendo tratado), a severidade do distúrbio e a localização anatômica do distúrbio neovascular. Algumas variações na dosagem podem ser esperadas.[0224] The dosage of the ligand binding molecule may depend on several factors including the severity of the condition, whether the condition should be treated or prevented and the age, weight and health of the person being treated. Additionally, pharmacogenomic information (the effect of genotype on the pharmacokinetic, pharmacodynamic, or efficacy profile of a therapeutic agent) about a particular patient may affect the dosage used. Furthermore, exact individual dosages may be adjusted somewhat depending on a variety of factors, including the specific combination therapies that are administered, the time of administration, the route of administration, the nature of the formulation, the rate of excretion, the particular disease being treated (e.g., the particular ocular disorder being treated), the severity of the disorder, and the anatomical location of the neovascular disorder. Some variations in dosage can be expected.

[0225] Em geral, quando administrada oralmente a um mamífero, a dosagem de uma molécula de ligação de ligante da presente invenção é normalmente 0,001 mg/kg/dia a 100 mg/kg/dia, 0,01 mg/kg/dia a 50 mg/kg/dia ou 0,1 mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia. Em geral, quando administrada oralmente a um humano, a dosagem de antagonista da presente invenção é normalmente 0,001 mg a 300 mg por dia, 1 mg a 200 mg por dia ou 5 mg a 50 mg por dia. Dosagens até 200 mg por dia podem ser necessárias.[0225] In general, when administered orally to a mammal, the dosage of a ligand binding molecule of the present invention is typically 0.001 mg/kg/day to 100 mg/kg/day, 0.01 mg/kg/day to 50 mg/kg/day or 0.1 mg/kg/day to 10 mg/kg/day. In general, when administered orally to a human, the antagonist dosage of the present invention is typically 0.001 mg to 300 mg per day, 1 mg to 200 mg per day, or 5 mg to 50 mg per day. Dosages up to 200 mg per day may be necessary.

[0226] Para a administração de um antagonista da presente invenção por injeção parenteral, a dosagem é normalmente 0,1 mg a 250 mg por dia, 1 mg a 20 mg por dia ou 3 mg a 5 mg por dia. Injeções podem ser dadas até quatro vezes diariamente.[0226] For administration of an antagonist of the present invention by parenteral injection, the dosage is typically 0.1 mg to 250 mg per day, 1 mg to 20 mg per day, or 3 mg to 5 mg per day. Injections can be given up to four times daily.

[0227] Em geral, quando administrada oral ou parentericamente, a dosagem de uma molécula de ligação de ligante para o uso na presente invenção é normalmente 0,1 mg a 1.500 mg por dia ou 0,5 mg a 10 mg por dia ou 0,5 mg a 5 mg por dia. Uma dosagem de até 3.000 mg por dia pode ser administrada.[0227] In general, when administered orally or parenterally, the dosage of a ligand binding molecule for use in the present invention is typically 0.1 mg to 1,500 mg per day or 0.5 mg to 10 mg per day or 0. .5 mg to 5 mg per day. A dosage of up to 3,000 mg per day can be administered.

[0228] Quando administrado de modo oftalmológico a um humano, por exemplo, de modo intravítreo, a dosagem de uma molécula de ligação de ligante por olho por administração está normalmente em uma faixa de 0,003 mg, 0,03 mg, 0,03 mg, 0,1 mg ou 0,5 mg a 5,0 mg, 4 mg, 3 mg, 2 mg ou 1 mg ou 0,5 mg a 1,0 mg. A dosagem de uma molécula de ligação de ligante está normalmente na faixa de 0,003 mg a 5,0 mg por olho por administração ou 0,03 mg a 4,0 mg por olho por administração ou 0,1 mg a 4,0 mg por olho por administração ou 0,03 mg a 3,0 mg por olho por administração ou 0,1 mg a 3,0 mg por olho por administração ou 0,1 mg a 1,0 mg por olho por administração ou 0,5 mg a 4,0 mg por olho por administração ou 0,5 mg a 3,0 mg por olho por administração, 0,5 mg a 2,0 mg por olho por administração ou 1,0 mg a 4,0 mg por olho por administração ou 1,0 mg a 3,0 mg por olho por administração ou 1,0 mg a 2,0 mg por olho por administração. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 1 mg ou cerca de 2 mg ou cerca de 3 mg ou cerca de 4 mg ou cerca de 5 mg ou cerca de 6 mg por administração por olho. A molécula de ligação de ligante, em algumas modalidades, está presente em qualquer uma das concentrações listadas acima em um volume de 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl, 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl ou 100 μl. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 2 a 4 mg/50 μl. O volume de dosagem pode estar na faixa de 0,01 ml a 0,2 ml administrado por olho ou 0,03 ml a 0,15 ml administrado por olho ou 0,05 ml a 0,10 ml administrado por olho.[0228] When administered ophthalmically to a human, e.g., intravitreally, the dosage of one ligand-binding molecule per eye per administration is typically in a range of 0.003 mg, 0.03 mg, 0.03 mg , 0.1 mg or 0.5 mg to 5.0 mg, 4 mg, 3 mg, 2 mg or 1 mg or 0.5 mg to 1.0 mg. The dosage of a ligand-binding molecule is normally in the range of 0.003 mg to 5.0 mg per eye per administration or 0.03 mg to 4.0 mg per eye per administration or 0.1 mg to 4.0 mg per administration. eye per administration or 0.03 mg to 3.0 mg per eye per administration or 0.1 mg to 3.0 mg per eye per administration or 0.1 mg to 1.0 mg per eye per administration or 0.5 mg to 4.0 mg per eye per administration or 0.5 mg to 3.0 mg per eye per administration, 0.5 mg to 2.0 mg per eye per administration or 1.0 mg to 4.0 mg per eye per administration administration or 1.0 mg to 3.0 mg per eye per administration or 1.0 mg to 2.0 mg per eye per administration. In some embodiments, the ligand binding molecule is administered at a concentration of about 1 mg or about 2 mg or about 3 mg or about 4 mg or about 5 mg or about 6 mg per administration per eye. The ligand binding molecule, in some embodiments, is present in any of the concentrations listed above in a volume of 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl , 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl or 100 μl. In some embodiments, the ligand-binding molecule is administered at a concentration of about 2 to 4 mg/50 μl. The dosage volume may be in the range of 0.01 ml to 0.2 ml administered per eye or 0.03 ml to 0.15 ml administered per eye or 0.05 ml to 0.10 ml administered per eye.

[0229] Em algumas modalidades, quando sendo administrada por injeção intravítrea, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 2 mg a cerca de 4 mg por olho (ou cerca de 1 mg a cerca de 3 mg ou cerca de 1 mg a cerca de 4 mg ou cerca de 3 mg a cerca de 4 mg ou cerca de 1 mg a cerca de 2 mg por olho). Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 1 mg ou cerca de 2 mg ou cerca de 3 mg ou cerca de 4 mg ou cerca de 5 mg ou cerca de 6 mg por olho. A molécula de ligação de ligante, em algumas modalidades, está presente em qualquer uma das concentrações listadas acima em um volume de 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl, 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl ou 100 μl. Em algumas modalidades, a molécula de ligação de ligante é administrada em uma concentração de cerca de 2 a 4 mg/50 μl.[0229] In some embodiments, when administered by intravitreal injection, the ligand binding molecule is administered at a concentration of about 2 mg to about 4 mg per eye (or about 1 mg to about 3 mg or about from 1 mg to about 4 mg or about 3 mg to about 4 mg or about 1 mg to about 2 mg per eye). In some embodiments, the ligand binding molecule is administered at a concentration of about 1 mg or about 2 mg or about 3 mg or about 4 mg or about 5 mg or about 6 mg per eye. The ligand binding molecule, in some embodiments, is present in any of the concentrations listed above in a volume of 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl , 60 μl, 70 μl, 80 μl, 90 μl, 95 μl or 100 μl. In some embodiments, the ligand-binding molecule is administered at a concentration of about 2 to 4 mg/50 μl.

[0230] Geralmente, as faixas de dosagem adequadas para a administração intravenosa são geralmente cerca de 50 a 5.000 microgramas de composto ativo por quilograma de peso corporal. As faixas de dosagem adequadas para a administração intranasal são geralmente cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. As doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de resposta de dose derivadas de sistemas de teste de modelo animal ou in vitro.[0230] Generally, suitable dosage ranges for intravenous administration are generally about 50 to 5,000 micrograms of active compound per kilogram of body weight. Suitable dosage ranges for intranasal administration are generally about 0.01 pg/kg of body weight to 1 mg/kg of body weight. Effective doses can be extrapolated from dose response curves derived from in vitro or animal model test systems.

[0231] Para a administração sistêmica, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixa de concentração de circulação que inclui o IC50 conforme determinado na cultura celular. Tais informações podem ser usadas para determinar mais precisamente doses úteis em humanos. As dosagens iniciais podem também ser estimadas de dados in vivo, por exemplo, modelos animais, com o uso de técnicas que são bem conhecidas na técnica. Um versado na técnica poderia otimizar prontamente a administração a humanos com base nos dados de animal.[0231] For systemic administration, a therapeutically effective dose can be estimated initially from in vitro assays. For example, a dose may be formulated in animal models to achieve a circulating concentration range that includes the IC50 as determined in cell culture. Such information can be used to more accurately determine useful doses in humans. Initial dosages can also be estimated from in vivo data, e.g., animal models, using techniques that are well known in the art. One of skill in the art could readily optimize administration to humans based on the animal data.

[0232] A quantidade e o intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis de plasma dos compostos que são suficientes para manter o efeito terapêutico. Em casos de administração local ou ingestão seletiva, a concentração local eficaz dos compostos pode não ser relacionada à concentração de plasma. Um versado na técnica terá a capacidade de otimizar as dosagens locais terapeuticamente eficazes sem desfazer a experimentação.[0232] The dosage amount and interval can be individually adjusted to provide plasma levels of the compounds that are sufficient to maintain the therapeutic effect. In cases of local administration or selective ingestion, the effective local concentration of the compounds may not be related to the plasma concentration. One skilled in the art will have the ability to optimize therapeutically effective local dosages without undoing the experimentation.

[0233] A quantidade de composto administrada será, certamente, dependente do sujeito sendo tratado, do peso do sujeito, da severidade da afecção, da maneira de administração e do julgamento do médico prescritor. A terapia pode ser repetida intermitentemente enquanto os sintomas são detectáveis ou até mesmo quando os mesmos não são detectáveis. A terapia pode ser fornecida sozinha ou em combinação com outros fármacos.[0233] The amount of compound administered will certainly depend on the subject being treated, the subject's weight, the severity of the condition, the manner of administration and the judgment of the prescribing physician. Therapy can be repeated intermittently while symptoms are detectable or even when they are not detectable. Therapy can be provided alone or in combination with other drugs.

[0234] A administração da molécula de ligação de ligante e, quando presente em terapias de combinação, um agente adicional, pode, independentemente, ser uma a quatro vezes por dia ou uma a quatro vezes por mês ou uma a seis vezes por ano ou uma vez a cada dois, três, quatro ou cinco anos. A administração pode ser pela duração de um dia ou um mês, dois meses, três meses, seis meses, um ano, dois anos, três anos e pode até mesmo ser pela vida do paciente. Em uma modalidade, a administração é realizada uma vez ao mês por três meses. A administração crônica, a longo prazo, será indicada em muitos casos. A dosagem pode ser administrada como uma dose única ou dividida em múltiplas doses. Em geral, a dosagem desejada deve ser administrada em intervalos definidos por um período prolongado, usualmente pelo menos por diversas semanas ou meses, embora períodos mais longos de administração de diversos meses ou anos ou mais possam ser necessários.[0234] Administration of the ligand-binding molecule and, when present in combination therapies, an additional agent, may independently be one to four times per day or one to four times per month or one to six times per year or once every two, three, four or five years. Administration may be for the duration of one day or one month, two months, three months, six months, one year, two years, three years and may even be for the life of the patient. In one embodiment, administration is performed once a month for three months. Chronic, long-term administration will be indicated in many cases. The dosage may be administered as a single dose or divided into multiple doses. In general, the desired dosage should be administered at defined intervals over an extended period, usually at least for several weeks or months, although longer periods of administration of several months or years or more may be necessary.

[0235] Adicionalmente a tratar distúrbios pré- existentes, as composições podem ser administradas profilaticamente a fim de prevenir ou retardar o início desses distúrbios. Em aplicações profiláticas, a composição pode ser administrada a um paciente suscetível a ou de outro modo em risco de um distúrbio particular, tal como um distúrbio ocular.[0235] In addition to treating pre-existing disorders, the compositions can be administered prophylactically in order to prevent or delay the onset of these disorders. In prophylactic applications, the composition may be administered to a patient susceptible to or otherwise at risk for a particular disorder, such as an ocular disorder.

[0236] Vias de Administração[0236] Routes of Administration

[0237] A composição contendo as moléculas de ligação de ligante descritas no presente documento pode ser administrada a um paciente por uma variedade de meios, dependendo, em parte, do tipo de agente a ser administrado e o histórico, fatores de risco e sintomas do paciente. As vias de administração adequadas para os métodos da invenção incluem tanto administração sistêmica como local. Conforme usado no presente documento, o termo “administração sistêmica” significa um modo de administração que resulta em entrega de uma composição farmacêutica a essencialmente todo o corpo do paciente. Os modos exemplificativos de administração sistêmica incluem, sem limitação, injeção intravenosa e administração oral. O termo “administração local”, conforme usado no presente documento, significa um modo de administração que resulta em significativamente mais composição farmacêutica ser entregue aos e cerca dos olhos (ou tumor ou outro tecido alvo) que a regiões distais em relação aos olhos (ou tumor ou outro tecido alvo).[0237] The composition containing the ligand-binding molecules described herein can be administered to a patient by a variety of means, depending, in part, on the type of agent to be administered and the history, risk factors, and symptoms of the condition. patient. Suitable routes of administration for the methods of the invention include both systemic and local administration. As used herein, the term “systemic administration” means a mode of administration that results in delivery of a pharmaceutical composition to essentially the entire patient's body. Exemplary modes of systemic administration include, without limitation, intravenous injection and oral administration. The term "local administration" as used herein means a mode of administration that results in significantly more pharmaceutical composition being delivered to and about the eye (or tumor or other target tissue) than to regions distal to the eye (or tumor or other target tissue).

[0238] As vias de administração sistêmicas ou locais úteis nos métodos da invenção abrangem, sem limitação, gavagem oral; injeção intravenosa; injeção intraperitoneal; injeção intramuscular; injeção subcutânea; difusão transdérmica e eletroforese; colírios tópicos e pomadas; injeção periocular e intraocular, incluindo injeção subconjuntival; dispositivos de entrega de liberação estendida, incluindo dispositivos de liberação estendida implantados localmente; e implantes intraoculares e perioculares, incluindo implantes biodegradáveis e baseados em reservatório.[0238] Systemic or local routes of administration useful in the methods of the invention include, without limitation, oral gavage; intravenous injection; intraperitoneal injection; intramuscular injection; subcutaneous injection; transdermal diffusion and electrophoresis; topical eye drops and ointments; periocular and intraocular injection, including subconjunctival injection; extended release delivery devices, including locally deployed extended release devices; and intraocular and periocular implants, including biodegradable and reservoir-based implants.

[0239] Assim, em um aspecto, um método para tratar um distúrbio ocular associado à neovascularização de retina é praticado por administração local da molécula de ligação de ligante ao sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende as moléculas de ligação de ligante é administrada por via tópica ou por injeção local (por exemplo, por injeção intraocular, por exemplo, intravítrea) ou é liberada a partir de um implante intraocular ou periocular, tal como um implante biodegradável ou baseado em reservatório. A composição é, de preferência, administrada em uma quantidade eficaz para inibir VEGF-C e/ou VEGF-D no olho do sujeito de ligar-se a ou estimular VEGFR-2 e/ou VEGFR-3 expresso em células do olho ou vasos do olho.[0239] Thus, in one aspect, a method for treating an ocular disorder associated with retinal neovascularization is practiced by locally administering the ligand-binding molecule to the subject. For example, in some embodiments, a pharmaceutical composition comprising ligand binding molecules is administered topically or by local injection (e.g., by intraocular injection, e.g., intravitreal) or is delivered from an intraocular implant or periocular implant, such as a biodegradable or reservoir-based implant. The composition is preferably administered in an amount effective to inhibit VEGF-C and/or VEGF-D in the subject's eye from binding to or stimulating VEGFR-2 and/or VEGFR-3 expressed in eye cells or vessels. of the eye.

[0240] No caso de terapias de combinação, a administração das moléculas de ligação de ligante e do agente adicional pode ser sequencial em tempo ou concomitante. Quando administrada sequencialmente, a administração de cada um pode ser por rota igual ou diferente. Em uma modalidade, um agente adicional (por exemplo, um produto inibidor de VEGF-A ou PDGF) é administrado dentro de 90 dias, 30 dias, 10 dias, 5 dias, 24 horas, 1 hora, 30 minutos, 10 minutos, 5 minutos ou um minuto de administração de uma molécula de ligação de ligante. Nos casos em que o agente adicional é administrado antes da molécula de ligação de ligante, a molécula de ligação de ligante é administrada dentro de um tempo e em uma quantidade de modo que a quantidade total de agente adicional e molécula de ligação de ligante seja eficaz para tratar ou prevenir a indicação alvejada, por exemplo, distúrbio ocular. Nos casos em que a molécula de ligação de ligante é administrada antes do agente adicional, o agente adicional é administrado dentro de um tempo e em uma quantidade de modo que a quantidade total de agente adicional e molécula de ligação de ligante seja eficaz para tratar ou prevenir a indicação alvejada, por exemplo, distúrbio ocular.[0240] In the case of combination therapies, the administration of the ligand-binding molecules and the additional agent may be sequential in time or concomitant. When administered sequentially, administration of each may be by the same or different route. In one embodiment, an additional agent (e.g., a VEGF-A or PDGF inhibitor product) is administered within 90 days, 30 days, 10 days, 5 days, 24 hours, 1 hour, 30 minutes, 10 minutes, 5 minutes or one minute of administration of a ligand-binding molecule. In cases where the additional agent is administered prior to the ligand-binding molecule, the ligand-binding molecule is administered within a time and in an amount such that the total amount of additional agent and ligand-binding molecule is effective. to treat or prevent the targeted indication, e.g., eye disorder. In cases where the ligand-binding molecule is administered before the additional agent, the additional agent is administered within a time and in an amount such that the total amount of additional agent and ligand-binding molecule is effective to treat or prevent the targeted indication, for example, eye disorder.

[0241] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para liberar a molécula de ligação de ligante e opcionalmente o agente adicional em uma terapia de combinação de modo substancialmente imediato mediante a administração ou em qualquer período de tempo após a administração, com o uso de formulação de liberação controlada. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode ser fornecida na forma de liberação prolongada. O uso de composições de liberação imediata ou prolongada depende da natureza da afecção que é tratada. Ser a afecção consistir em um distúrbio agudo, o tratamento com uma forma de liberação imediata pode ser utilizado em relação a uma composição de liberação prolongada. Para determinados tratamentos preventivos ou a longo-prazo, uma composição de liberação prolongada pode ser também apropriada.[0241] The pharmaceutical compositions according to the invention can be formulated to release the ligand binding molecule and optionally the additional agent in a combination therapy substantially immediately upon administration or at any period of time after administration, with the use of controlled release formulation. For example, a pharmaceutical composition may be provided in extended release form. The use of immediate or prolonged release compositions depends on the nature of the condition being treated. If the condition is an acute disorder, treatment with an immediate-release form may be used in relation to an extended-release composition. For certain preventative or long-term treatments, an extended-release composition may also be appropriate.

[0242] A administração da molécula de ligação de ligante ou tanto da molécula de ligação de ligante como de um ou mais agentes adicionais em formulações de liberação controlada pode ser útil nos casos em que a molécula de ligação de ligante, ou sozinha ou em combinação, tem (i) um índice terapêutico restrito (por exemplo, a diferença entre a concentração plasmática que leva a efeitos colaterais ou reações tóxicas prejudiciais e a concentração plasmática que leva a um efeito terapêutico é pequena; de modo geral, o índice terapêutico, TI, é definido como a razão entre dose letal mediana (LD50) e dose eficaz mediana (ED50)); (ii) um intervalo de absorção estreito no trato gastrointestinal; ou (iii) uma meia vida biológica curta, de modo que a dosagem frequente durante um dia seja exigida a fim de manter o nível plasmático em um nível terapêutico.[0242] Administration of the ligand-binding molecule or both the ligand-binding molecule and one or more additional agents in controlled-release formulations may be useful in cases where the ligand-binding molecule, either alone or in combination , has (i) a restricted therapeutic index (e.g., the difference between the plasma concentration that leads to side effects or harmful toxic reactions and the plasma concentration that leads to a therapeutic effect is small; generally speaking, the therapeutic index, TI , is defined as the ratio between median lethal dose (LD50) and median effective dose (ED50)); (ii) a narrow absorption range in the gastrointestinal tract; or (iii) a short biological half-life such that frequent dosing over a day is required in order to maintain the plasma level at a therapeutic level.

[0243] Muitas estratégias podem ser seguidas para obter liberação controlada em que a taxa de liberação supera a taxa de degradação ou o metabolismo dos componentes ativos. Por exemplo, a liberação controlada pode ser obtida pela seleção apropriada de parâmetros e ingredientes de formulação, incluindo, por exemplo, composições e revestimentos de liberação controlada apropriados. Os exemplos incluem composições em tablete ou cápsula de unidade única ou múltipla, soluções em óleo, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, emplastros e lipossomos. Os métodos para preparar tais formulações de liberação prolongada ou controlada são bem conhecidos na técnica.[0243] Many strategies can be followed to obtain controlled release in which the rate of release exceeds the rate of degradation or metabolism of the active components. For example, controlled release can be achieved by appropriate selection of formulation parameters and ingredients, including, for example, appropriate controlled release compositions and coatings. Examples include single or multiple unit tablet or capsule compositions, oil solutions, suspensions, emulsions, microcapsules, microspheres, nanoparticles, patches and liposomes. Methods for preparing such sustained or controlled release formulations are well known in the art.

[0244] A molécula de ligação de ligante e, se presente, um agente adicional, pode ser também entregue com o uso de um dispositivo de entrega de fármaco, tal como um implante. Conforme usado no presente documento, o termo "implante" refere-se a qualquer material que não migra significativamente do sítio de inserção após o implante. Um implante pode ser biodegradável, não biodegradável ou composto por materiais tanto biodegradáveis como não biodegradáveis. Um implante não biodegradável pode incluir, se desejado, um reservatório recarregável. Os implantes úteis nos métodos da invenção incluem, por exemplo, emplastros, partículas, lâminas, placas, microcápsulas e similares e podem ser de qualquer formato e tamanho compatíveis com o sítio de inserção selecionado, que pode ser, sem limitação, a câmara posterior, a câmara anterior, supracoroide ou subconjuntiva. Entende-se que um implante útil na invenção, de modo geral, libera a composição farmacêutica implantada em uma dosagem eficaz para o olho do paciente durante um período de tempo estendido.[0244] The ligand binding molecule and, if present, an additional agent, can also be delivered using a drug delivery device, such as an implant. As used herein, the term "implant" refers to any material that does not migrate significantly from the insertion site after implantation. An implant can be biodegradable, non-biodegradable or composed of both biodegradable and non-biodegradable materials. A non-biodegradable implant may include, if desired, a refillable reservoir. Implants useful in the methods of the invention include, for example, patches, particles, sheets, plates, microcapsules and the like and may be of any shape and size compatible with the selected insertion site, which may be, without limitation, the posterior chamber, the anterior chamber, suprachoroidal or subconjunctiva. It is understood that an implant useful in the invention generally delivers the implanted pharmaceutical composition in an effective dosage to the patient's eye over an extended period of time.

[0245] Uma variedade de implantes oculares e formulações de liberação estendida adequadas para liberação ocular são bem conhecidas na técnica, conforme descrito, por exemplo, nas Patentes no U.S. 5.869.079 e 5.443.505, cujas revelações são incorporadas ao presente a título de referência em sua totalidade. Os dispositivos de entrega de fármaco ocular podem ser inseridos em uma câmara do olho, tal como a câmara anterior ou posterior ou podem ser implantados em ou sobre a esclera, espaço coroidal ou uma região não vascularizada externa ao vítreo. Em uma modalidade, o implante pode estar posicionado sobre uma região avascular, tal como na esclera, de modo a permitir difusão transcleral das moléculas de ligação de ligante e quaisquer agentes adicionais até o sítio de tratamento desejado, por exemplo, o espaço intraocular e mácula do olho. Além disso, o sítio de difusão transcleral pode ser proximal a um sítio de neovascularização, tal como um sítio proximal à mácula. Dispositivos de entrega de fármaco adequados são descritos, por exemplo, nas Publicações no U.S. 2008/0286334; 2008/0145406; 2007/0184089; 2006/0233860; 2005/0244500; 2005/0244471; e 2005/0244462, e nas Patentes no U.S. 6.808.719 e 5.322.691, cujo conteúdo estão incorporados ao presente a título de referência em sua totalidade.[0245] A variety of ocular implants and extended release formulations suitable for ocular delivery are well known in the art, as described, for example, in U.S. Patents 5,869,079 and 5,443,505, the disclosures of which are incorporated herein by way of reference in its entirety. Ocular drug delivery devices may be inserted into a chamber of the eye, such as the anterior or posterior chamber, or may be implanted in or on the sclera, choroidal space, or a nonvascularized region external to the vitreous. In one embodiment, the implant may be positioned over an avascular region, such as in the sclera, so as to allow transcleral diffusion of the ligand-binding molecules and any additional agents to the desired treatment site, e.g., the intraocular space and macula. of the eye. Furthermore, the site of transcleral diffusion may be proximal to a site of neovascularization, such as a site proximal to the macula. Suitable drug delivery devices are described, for example, in U.S. Publications 2008/0286334; 2008/0145406; 2007/0184089; 2006/0233860; 2005/0244500; 2005/0244471; and 2005/0244462, and in U.S. Patents 6,808,719 and 5,322,691, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0246] Em outras modalidades, uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento é aplicada ao olho através e lipossomos. Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação de ligante está contida dentro de um dispositivo de liberação contínua ou seletiva, por exemplo, membranas, tais como, porém, sem limitação, aquelas empregadas no Ocusert™System (Alza Corp., Palo Alto, Calif.). Como uma modalidade adicional, a molécula de ligação de ligante está contida dentro, é transportada por ou está fixada às lentes de contato que são colocadas no olho. Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação de ligante está contida dentro de uma zaragatoa ou esponja que pode ser aplicada à superfície ocular. Outra modalidade da presente invenção envolve a molécula de ligação de ligante contida dentro de uma aspersão de líquido que pode ser aplicada à superfície ocular.[0246] In other embodiments, a ligand-binding molecule described herein is applied to the eye via liposomes. In yet another embodiment, the ligand binding molecule is contained within a continuous or selective release device, e.g., membranes, such as, but not limited to, those employed in the Ocusert™System (Alza Corp., Palo Alto, Calif.). As a further embodiment, the ligand binding molecule is contained within, transported by, or attached to contact lenses that are placed in the eye. In yet another embodiment, the ligand binding molecule is contained within a swab or sponge that can be applied to the ocular surface. Another embodiment of the present invention involves the ligand binding molecule contained within a spray of liquid that can be applied to the ocular surface.

[0247] Em uma modalidade, o implante compreende uma molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, disperso em uma matriz polimérica biodegradável. A matriz pode compreender PLGA (copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico), um polímero capeado em extremidade de éster, um polímero capeado em extremidade de ácido ou uma mistura dos mesmos. Em outra modalidade, o implante compreende uma molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, um tensoativo e um composto lipofílico. O composto lipofílico pode estar presente em uma quantidade de cerca de 80 a 99% em peso do implante. Os compostos lipofílicos adequados incluem, porém, sem limitação, palmitoestearato de glicerila, monoestearato de dietileno glicol, monoestearato de propileno glicol, monoestearato de glicerila, monolinoleato de glicerila, monooleato de glicerila, monopalmitato de glicerila, monolaurato de glicerila, dilaurato de glicerila, monomiristato de glicerila, dimiristato de glicerila, monopalmitato de glicerila, dipalmitato de glicerila, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, monooleato de glicerila, dioleato de glicerila, monolinoleato de glicerila, dilinoleato de glicerila, monoaraquidato de glicerila, diaraquidato de glicerila, monobeenato de glicerila, dibeenato de glicerila e misturas dos mesmos. Em outra modalidade, o implante compreende uma molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, alojado dentro de uma manga oca. A molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, são entregues ao olho por inserção da manga no olho, liberando o implante da manga no olho e, então, removendo a manga do olho. Um exemplo desse dispositivo de entrega é descrito na Publicação no U.S. 2005/0244462, que é incorporada ao presente a título de referência em sua totalidade.[0247] In one embodiment, the implant comprises a ligand binding molecule and, optionally, if present, an additional agent, dispersed in a biodegradable polymeric matrix. The matrix may comprise PLGA (polylactic acid-polyglycolic acid copolymer), an ester end capped polymer, an acid end capped polymer or a mixture thereof. In another embodiment, the implant comprises a ligand binding molecule and, optionally, if present, an additional agent, a surfactant and a lipophilic compound. The lipophilic compound may be present in an amount of about 80 to 99% by weight of the implant. Suitable lipophilic compounds include, but are not limited to, glyceryl palmitostearate, diethylene glycol monostearate, propylene glycol monostearate, glyceryl monostearate, glyceryl monolinoleate, glyceryl monooleate, glyceryl monopalmitate, glyceryl monolaurate, glyceryl dilaurate, monomyristate glyceryl, glyceryl dimyristate, glyceryl monopalmitate, glyceryl dipalmitate, glyceryl monostearate, glyceryl distearate, glyceryl monooleate, glyceryl dioleate, glyceryl monolinoleate, glyceryl dilinoleate, glyceryl monoarachidate, glyceryl diarachidate, glyceryl monobehenate glyceryl , glyceryl dibeenate and mixtures thereof. In another embodiment, the implant comprises a ligand binding molecule and, optionally, if present, an additional agent, housed within a hollow sleeve. The ligand binding molecule and, optionally, if present, an additional agent, are delivered to the eye by inserting the sleeve into the eye, releasing the sleeve implant into the eye, and then removing the sleeve from the eye. An example of such a delivery device is described in U.S. Publication 2005/0244462, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0248] Em uma modalidade, o implante é um dispositivo de inserto ocular flexível adaptado para a liberação prolongada controlada de uma molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, no olho. Em uma modalidade, o dispositivo inclui um corpo alongado de um material polimérico na forma de uma haste ou um tubo contendo uma molécula de ligação de ligante e, opcionalmente, se presente, um agente adicional, e com pelo menos duas protrusões de ancoragem que se estendem radialmente para fora do corpo. O dispositivo pode ter um comprimento de pelo menos 8 mm e o diâmetro de sua porção de corpo, incluindo as protrusões não excede 1,9 mm. O mecanismo de liberação prolongada pode ser, por exemplo, por difusão ou por osmose ou bioerosão. O dispositivo de inserto pode ser inserido no fórnice superior ou inferior do olho de modo a ser independente de movimento do olho em virtude da anatomia do fórnice. As protrusões podem ser de vários formatos, tal como, por exemplo, nervuras, roscas de parafuso, cavidades ou protuberâncias, segmentos em formato de cone truncados ou segmentos trançados de enrolamento. Em uma modalidade adicional, o material polimérico para o corpo é selecionado como um que incha em um ambiente líquido. Portanto, um dispositivo de tamanho inicial menor pode ser empregado. Um dispositivo de inserto pode ser de um tamanho e uma configuração de modo que, mediante inserção no fórnice superior ou inferior, o dispositivo permaneça fora do campo de visão assim como esteja bem retido em posição e imperceptível por um receptor ao longo de um período prolongado de uso. O dispositivo pode ser retino no fórnice superior ou inferior por 7 a 14 dias ou mais. Um exemplo desse dispositivo é descrito na Patente no U.S. 5.322.691, que é incorporada ao presente a título de referência em sua totalidade.[0248] In one embodiment, the implant is a flexible ocular insert device adapted for controlled sustained release of a ligand-binding molecule, and optionally, if present, an additional agent, into the eye. In one embodiment, the device includes an elongated body of a polymeric material in the form of a rod or tube containing a ligand binding molecule and, optionally, if present, an additional agent, and having at least two anchoring protrusions that engage extend radially outward from the body. The device may have a length of at least 8 mm and the diameter of its body portion including protrusions does not exceed 1.9 mm. The prolonged release mechanism can be, for example, by diffusion or by osmosis or bioerosion. The insertion device may be inserted into the upper or lower fornix of the eye so as to be independent of movement of the eye due to the anatomy of the fornix. The protrusions may be of various shapes, such as, for example, ribs, screw threads, cavities or protuberances, truncated cone-shaped segments or twisted winding segments. In a further embodiment, the polymeric material for the body is selected as one that swells in a liquid environment. Therefore, a smaller initial size device can be employed. An insertion device may be of a size and configuration such that, upon insertion into the superior or inferior fornix, the device remains out of the field of view as well as being well retained in position and unnoticeable by a recipient over an extended period of time. of use. The device may be placed in the upper or lower fornix for 7 to 14 days or longer. An example of such a device is described in U.S. Patent No. 5,322,691, which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0249] Em outro aspecto, o método de inibição de neovascularização em um sujeito que foi diagnosticado com um tumor é praticado por administração local da molécula de ligação de ligante ao sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende a moléculas de ligação de ligante é administrada localmente ao tumor ou ao órgão ou tecido do qual o tumor foi cirurgicamente removido. Em tais modalidades, a composição é, de preferência, administrada em uma quantidade eficaz para inibir a neovascularização no tumor.[0249] In another aspect, the method of inhibiting neovascularization in a subject who has been diagnosed with a tumor is practiced by local administration of the ligand-binding molecule to the subject. For example, in some embodiments, a pharmaceutical composition comprising ligand-binding molecules is administered locally to the tumor or to the organ or tissue from which the tumor has been surgically removed. In such embodiments, the composition is preferably administered in an amount effective to inhibit neovascularization in the tumor.

[0250] Nos casos em que a molécula de ligação de ligante é uma molécula de ácido nucleico, a administração de uma composição farmacêutica contendo a molécula de ácido nucleico pode ser executada com o uso de inúmeros métodos bem conhecidos na técnica de terapia de gene. Tais métodos incluem, porém, sem limitação, transformação lentiviral, transformação adenoviral, transformação citomegaloviral, microinjeção e eletroporação. Kits e Doses Unitárias[0250] In cases where the ligand-binding molecule is a nucleic acid molecule, administration of a pharmaceutical composition containing the nucleic acid molecule can be performed using numerous methods well known in the art of gene therapy. Such methods include, but are not limited to, lentiviral transformation, adenoviral transformation, cytomegaloviral transformation, microinjection and electroporation. Kits and Unit Doses

[0251] A invenção também se refere a kits que compreende uma ou mais composições farmacêuticas e instruções para uso. Uma molécula de ligação de ligante pode ser embalada e formulada juntamente com outra molécula de ligação de ligante ou outro agente terapêutico descrito no presente documento, por exemplo, em um kit ou embalagem ou dose unitária, para permitir a coadministração; esses dois componentes podem ser formulados em conjunto (isto é, em mistura por adição) ou em composições separadas (isto é, em mistura por adição) e em quantidades de dosagem individuais. Cada uma das composições dos kits pode estar contida em um recipiente. Em algumas modalidades, os dois componentes para o kit/dose unitária são embalados com instruções para administrar os dois compostos a um sujeito humano para tratamento de um dos distúrbios e doenças descritos no presente documento.[0251] The invention also relates to kits comprising one or more pharmaceutical compositions and instructions for use. A ligand-binding molecule may be packaged and formulated together with another ligand-binding molecule or other therapeutic agent described herein, for example, in a kit or package or unit dose, to allow for co-administration; These two components can be formulated together (i.e., in addition mixing) or in separate compositions (i.e., in addition mixing) and in individual dosage amounts. Each of the kit compositions can be contained in a container. In some embodiments, the two components for the kit/unit dose are packaged with instructions for administering the two compounds to a human subject for treating one of the disorders and diseases described herein.

[0252] Os kits podem compreender um recipiente. O recipiente pode ser usado para separar componente e inclui, por exemplo, uma garrafa dividida ou uma embalagem laminada dividida. As composições separadas podem também, se desejado, estar contidas dentro de um único recipiente não dividido. Os kits podem também compreender orientações para a administração dos componentes. Os kits são particularmente vantajosos quando os componentes separados são administrados em diferentes formas de dosagem, são administrados em diferentes níveis de dosagem ou quando a titulação dos antagonistas individuais é desejada.[0252] Kits may comprise a container. The container may be used to separate component and includes, for example, a split bottle or a split laminate package. The separate compositions may also, if desired, be contained within a single, undivided container. The kits may also include guidelines for administering the components. Kits are particularly advantageous when the separate components are administered in different dosage forms, are administered at different dosage levels, or when titration of individual antagonists is desired.

[0253] Todas as publicações e as patentes mencionadas no presente documento são incorporadas ao presente a título de referência em sua totalidade como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada a título de referência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições no presente documento, prevalecerá. EXEMPLOS Exemplo 1- Fragmentos ECD de proteínas de VEGFR[0253] All publications and patents mentioned herein are incorporated herein by reference in their entirety as if each individual publication or patent were specifically and individually indicated as being incorporated by reference. In the event of a conflict, this order, including any definitions herein, will control. EXAMPLES Example 1- ECD fragments of VEGFR proteins

[0254] Os experimentos foram realizados para caracterizar fragmentos e variantes e fusões de VEGFR-3 e/ou VEGFR-2 e/ou VEGFR-1 que são eficazes para ligar ligantes alvo, tal como VEGF-C e/ou VEGF-D e/ou VEGF-A. Consultar as Publicações de Patente Internacionais no: WO 2005/087808, WO 2005/000895, WO 2006/088650, WO 2006/099154, WO 2004/106378, WO 2005/123104 e a Patente no U.S. 7.855.178, todas as quais são incorporadas ao presente a título de referência em sua totalidade. Esses estudos demonstram que os ECDs desses receptores podem ser truncados e também que os domínios de diferentes receptores podem ser recombinados, para formar moléculas de ligação de ligante. Exemplo 2 - Geração de Molécula de ligação de ligante VGX-301-ΔN2[0254] Experiments were performed to characterize fragments and variants and fusions of VEGFR-3 and/or VEGFR-2 and/or VEGFR-1 that are effective in binding target ligands, such as VEGF-C and/or VEGF-D and /or VEGF-A. See International Patent Publications No: WO 2005/087808, WO 2005/000895, WO 2006/088650, WO 2006/099154, WO 2004/106378, WO 2005/123104 and U.S. Patent No. 7,855,178. all of which are incorporated herein by reference in its entirety. These studies demonstrate that the ECDs of these receptors can be truncated and also that the domains of different receptors can be recombined to form ligand-binding molecules. Example 2 - Generation of VGX-301-ΔN2 Ligand Binding Molecule

[0255] Uma molécula de ligação de ligante que compreende domínios do tipo Ig I a III de VEGFR-3 (referido no presente documento como “VGX-300”) foi preparada conforme descrito em Makinen et al., Nat. Med., 7:199 a 205, 2001, cuja revelação é incorporada ao presente a título de referência em sua totalidade.[0255] A ligand-binding molecule comprising Ig type I to III domains of VEGFR-3 (referred to herein as “VGX-300”) was prepared as described in Makinen et al., Nat. Med., 7 :199 to 205, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety.

[0256] Uma característica principal da molécula VGX-300 é que a mesma contém 12 sítios de glicosilação; 2 x 6 sítios de glicosilação N-ligados potenciais, 5 em cada fragmento de receptor (domínios do tipo IG de VEGFR-3 I, II e III) e 1 em cada cadeia gama de região de Fc. Não há evidência de glicosilação O-ligada.[0256] A main characteristic of the VGX-300 molecule is that it contains 12 glycosylation sites; 2 x 6 potential N-linked glycosylation sites, 5 on each receptor fragment (VEGFR-3 IG-like domains I, II, and III) and 1 on each Fc region gamma chain. There is no evidence of O-linked glycosylation.

[0257] As características de glicosilação podem ter um efeito sobre PK, mas glicanos de Fc têm pouco efeito sobre PK (Jones et al, Glycobiology, 17(5), 2007 páginas 529 a 540). Em suma, o receptor de asialoglicoproteína liga-se às estruturas de glicano N-ligadas do tipo complexo em que dois ou mais ácidos siálicos estão ausentes, em que os resíduos de galactose (Gal) subjacentes tornam-se sacarídeos terminais. Adicionalmente, o receptor de manose (Man) reconhece glicanos N-ligados com alto teor de Man e resíduos de N- acetilglicosamina terminais (tGlcNAc). Ambos esses receptores podem causar eliminação metabólica rápida de proteínas.[0257] Glycosylation characteristics can have an effect on PK, but Fc glycans have little effect on PK (Jones et al, Glycobiology, 17(5), 2007 pages 529 to 540). In short, the asialoglycoprotein receptor binds to complex-type N-linked glycan structures in which two or more sialic acids are absent, in which the underlying galactose (Gal) residues become terminal saccharides. Additionally, the mannose receptor (Man) recognizes N-linked glycans with high Man content and terminal N-acetylglucosamine residues (tGlcNAc). Both of these receptors can cause rapid metabolic elimination of proteins.

[0258] A fim de identificar quais sítios de glicosilação são importantes para a atividade de produto, a deleção sequencial de cada um dos cinco sítios N-ligados putativos foi realizada. Cinco pares de iniciadores foram usados para introduzir mutações únicas na região de codificação de VGX-300 para destruir a fixação consenso para cada um dos cinco glicanos N-ligados (N-Q).[0258] In order to identify which glycosylation sites are important for product activity, sequential deletion of each of the five putative N-linked sites was performed. Five pairs of primers were used to introduce single mutations into the coding region of VGX-300 to destroy the consensus fixation for each of the five N-linked (N-Q) glycans.

[0259] Os pares de iniciadores usados são conforme segue:[0259] The primer pairs used are as follows:

[0260] N1 senso: 5’ GACCCCCCCGACCTTGCAGATCACGGAGGAGTCACAC 3’ (SEQ ID NO: 12)[0260] N1 sense: 5' GACCCCCCCGACCTTGCAGATCACCGGAGGAGTCACAC 3' (SEQ ID NO: 12)

[0261] N1 antissenso: 5’ GTGTGACTCCTCCGTGATCTGCAAGGTCGGGGG GGTC 3’ (SEQ ID NO: 13) i. N2 senso: 5’ CTGCACGAGGTACATGCCCAGGACACAGGCAGCTACG TC 3’ (SEQ ID NO: 14)[0261] Antisense N1: 5' GTGTGACTCCTCCGTGATCTGCAAGGTCGGGGG GGTC 3' (SEQ ID NO: 13) i. N2 sense: 5’ CTGCACGAGGTACATGCCCAGGACACAGGCAGCTACG TC 3’ (SEQ ID NO: 14)

[0262] N2 antissenso: 5’ GACGTAGCTGCCTGTGTCCTGGGCATGTACCTC GTGCAG 3’ (SEQ ID NO: 15)[0262] Antisense N2: 5' GACGTAGCTGCCTGTGTCCTGGGCATGTACCTC GTGCAG 3' (SEQ ID NO: 15)

[0263] N3 senso: 5’ GTCCATCCCCGGCCTCCAAGTCACGCTGCGCTCGC 3’ (SEQ ID NO: 16)[0263] N3 sense: 5' GTCCATCCCCGGCCTCCAAGTCACGCTGCGCTCGC 3' (SEQ ID NO: 16)

[0264] N3 antissenso: 5’ GCGAGCGCAGCGTGACTTGGAGGCCGGGGATGG AC 3’ (SEQ ID NO: 17) ii. N4 senso: 5’ GGGAGAAGCTGGTCCTCCAGTGCACCGTGTGGGCTGA 3’ (SEQ ID NO: 18)[0264] Antisense N3: 5' GCGAGCGCAGCGTGACTTGGAGGCCGGGGATGG AC 3' (SEQ ID NO: 17) ii. N4 sense: 5' GGGAGAAGCTGGTCCTCCAGTGCACCGTGTGGGCTGA 3' (SEQ ID NO: 18)

[0265] N4 antissenso: 5’ TCAGCCCACACGGTGCACTGGAGGACCAGCTTC TCCC 3’ (SEQ ID NO: 19)[0265] Antisense N4: 5' TCAGCCCACACGGTGCACTGGAGGACCAGCTTC TCCC 3' (SEQ ID NO: 19)

[0266] N5 senso: 5’ AGCATCCTGACCATCCACCAGGTCAGCCAGCACGACCT 3’ (SEQ ID NO: 20)[0266] N5 sense: 5' AGCATCCTGACCATCCACCAGGTCAGCCAGCACGACCT 3' (SEQ ID NO: 20)

[0267] N5 antissenso: 5’ AGGTCGTGCTGGCTGACCTGGTGGATGGTCAGG ATGCT 3’ (SEQ ID NO: 21)[0267] Antisense N5: 5' AGGTCGTGCTGGCTGACCTGGTGGATGGTCAGG ATGCT 3' (SEQ ID NO: 21)

[0268] A presença de mutações foi confirmada por sequenciamento, após o qual os vetores plasmídeos foram transfectados transientemente em células 293T (HEK). As amostras de cultura foram analisadas por western blot. Os construtos viáveis foram então progredidos para células 293F (HEK) adaptadas à suspensão transientes e os sobrenadantes purificados por cromatografia ProSepA e filtração em gel, para teste adicional por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e bioensaio de BaF/3 para determinar rendimento e atividade. A Tabela 3 abaixo sumariza dados de expressão e a atividade de cada mutante resultante. Tabela 3. [0268] The presence of mutations was confirmed by sequencing, after which the plasmid vectors were transiently transfected into 293T (HEK) cells. Culture samples were analyzed by western blot. Viable constructs were then progressed to transient suspension-adapted 293F (HEK) cells and the supernatants purified by ProSepA chromatography and gel filtration for further testing by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and BaF/3 bioassay to determine yield and activity. Table 3 below summarizes expression data and activity for each resulting mutant. Table 3.

[0269] A Tabela 3 mostra que apenas o mutante N2 (referido no presente documento como “VGX-301-ΔN2”) exibiu características de expressão e atividade favoráveis em relação à molécula progenitora (isto é, VGX-300). Os progenitores de VGX-301-ΔN2 e VGX-300 foram produzidos em células CHO e HEK por expressão transiente e a farmacocinética (PK) de cada molécula foi examinada conforme segue. Ratos Sprague-Dawley foram alocados em qualquer um dos grupos de 2, 3 ou 5 por composto em cada experimento. Os ratos em cada grupo receberam uma única dose de VGX-300 ou VGX-301-ΔN2 através de administração intravenosa como uma injeção de bolus a uma concentração de dose de 1 mg/kg. Amostras de sangue intermediárias foram coletadas por punção da veia lateral da cauda no Dia 1 (pré- dose) e um total de 12 pontos no tempo após dose, entanto na faixa de 5 min a 14 dias após o tratamento inicial. Amostras de soro foram preparadas a partir de cada amostra de sangue e testadas com o uso de um ELISA de coletor de ligante de VEGF quantitativo para determinar a concentração em circulação de cada composto. Os resultados dessas análises foram então usados para cálculo dos parâmetros farmacocinéticos. Dados de PK de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 são fornecidos abaixo na Tabela 4. [0269] Table 3 shows that only the N2 mutant (referred to herein as “VGX-301-ΔN2”) exhibited favorable expression and activity characteristics relative to the parent molecule (i.e., VGX-300). The progenitors of VGX-301-ΔN2 and VGX-300 were produced in CHO and HEK cells by transient expression and the pharmacokinetics (PK) of each molecule were examined as follows. Sprague-Dawley rats were allocated to any of the groups of 2, 3, or 5 per compound in each experiment. Rats in each group received a single dose of VGX-300 or VGX-301-ΔN2 via intravenous administration as a bolus injection at a dose concentration of 1 mg/kg. Intermediate blood samples were collected by lateral tail vein puncture on Day 1 (pre-dose) and a total of 12 time points post-dose, however in the range of 5 min to 14 days after initial treatment. Serum samples were prepared from each blood sample and tested using a quantitative VEGF ligand collector ELISA to determine the circulating concentration of each compound. The results of these analyzes were then used to calculate pharmacokinetic parameters. PK data of VGX-300 and VGX-301-ΔN2 are provided below in Table 4.

[0270] As curvas de PK fornecidas na Figura 1 e os dados da Tabela 4 mostram que o VGX-301-ΔN2 pode ter um efeito benéfico sobre PK em comparação a VGX-300 produzido no mesmo sistema de expressão. Exemplo 3 - VGX-301-ΔN2 Liga VEGF-C e VEGF-D[0270] The PK curves provided in Figure 1 and the data in Table 4 show that VGX-301-ΔN2 can have a beneficial effect on PK compared to VGX-300 produced in the same expression system. Example 3 - VGX-301-ΔN2 Binds VEGF-C and VEGF-D

[0271] Para determinar a especificidade da ligação de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 a VEGF-C e VEGF-D, VEGF-C ou VEGF-D (2 μg/ml) foram pré-revestidos em placas de ELISA e usados como antígenos de captura. Concentrações crescentes ou de VGX-300 ou de VGX-301-ΔN2 (0 a 10 μg/ml) foram aplicadas à placa e detectadas com conjugado de IgG anti-humana de coelho-peroxidase de raiz forte com o uso de um kit de substrato de tetrametilbenzidina. Os resultados indicaram que tanto VGX-300 quanto VGX-301-ΔN2 ligaram tanto VEGF-C quanto VEGF-D. Consultar a Figura 2. Surpreendentemente, VGX-301-ΔN2 demonstrou ligação mais forte a ambos os ligantes do que VGX- 300.[0271] To determine the specificity of binding of VGX-300 and VGX-301-ΔN2 to VEGF-C and VEGF-D, VEGF-C or VEGF-D (2 μg/ml) were pre-coated on ELISA plates and used as capture antigens. Increasing concentrations of either VGX-300 or VGX-301-ΔN2 (0 to 10 μg/ml) were applied to the plate and detected with rabbit anti-human IgG-horseradish peroxidase conjugate using a substrate kit. of tetramethylbenzidine. The results indicated that both VGX-300 and VGX-301-ΔN2 bound both VEGF-C and VEGF-D. See Figure 2. Surprisingly, VGX-301-ΔN2 demonstrated stronger binding to both ligands than VGX-300.

Exemplo 4 - Afinidade de Ligação de VGX-300 e VGX- 301-ΔN2Example 4 - Binding Affinity of VGX-300 and VGX-301-ΔN2

[0272] A ligação de VEGF-C e VEGF-D a VGX-300 ou VGX-301-ΔN2 foi analisada por ressonância de plasmon de superfície (SPR) realizada com o uso do biossensor ProteOn XPR36 (Bio-Rad) . Ou VGX-300 ou VGX-301-ΔN2 foi capturado na proteína G’ imobilizada em um chip de sensor GLM e a afinidade da molécula a VEGF-C ou VEGF-D foi medida. Os resultados do experimento de afinidade são fornecidos abaixo na Tabela 5. [0272] The binding of VEGF-C and VEGF-D to VGX-300 or VGX-301-ΔN2 was analyzed by surface plasmon resonance (SPR) performed using the ProteOn XPR36 biosensor (Bio-Rad). Either VGX-300 or VGX-301-ΔN2 was captured on the G' protein immobilized on a GLM sensor chip and the affinity of the molecule to VEGF-C or VEGF-D was measured. The results of the affinity experiment are given below in Table 5.

[0273] Os dados apresentados na Tabela 5 acima mostra que as amostras de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 ligaram VEGF- C e VEGF-D humanos com afinidades quase idênticas, com ambas as moléculas mostrando ligação mais forte a VEGF-C do que VEGF-D. Exemplo 5 - VGX-301-ΔN2 Bloqueia a Ligação de VEGF- C e VEGF-D e Reticulação de VEGFR-3[0273] The data presented in Table 5 above shows that the VGX-300 and VGX-301-ΔN2 samples bound human VEGF-C and VEGF-D with almost identical affinities, with both molecules showing stronger binding to VEGF-C than VEGF-D. Example 5 - VGX-301-ΔN2 Blocks VEGF-C and VEGF-D Binding and VEGFR-3 Cross-linking

[0274] Os ensaios com base em célula foram desenvolvidos para avaliar a capacidade dos ligantes de família de VEGF para ligar ou reticular VEGFR-2 e VEGFR-3. Esses bioensaios foram empregados para estudar a atividade de neutralização de VGX-300 e VGX-301-ΔN2. As linhagens de células de bioensaio consistem na linhagem de células Ba/F3 pró-B dependente de IL-3 de camundongo, estavelmente transfectada com um receptor quimérico que consiste no ECD de VEGFR-2 ou VEGFR-3, fundido em quadro à transmembrana e domínios intracelulares do receptor de eritropoietina de camundongo (conforme descrito no Exemplo 5 do documento no WO 2005/087808, a revelação do qual é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade). Na ausência de IL-3, essas células sobrevivem e proliferam apenas na presença de fatores de crescimento que têm a capacidade de ligar e reticular o ECD do respectivo VEGFR.[0274] Cell-based assays have been developed to evaluate the ability of VEGF family ligands to bind or cross-link VEGFR-2 and VEGFR-3. These bioassays were employed to study the neutralization activity of VGX-300 and VGX-301-ΔN2. The bioassay cell lines consist of the mouse IL-3-dependent Ba/F3 pro-B cell line, stably transfected with a chimeric receptor consisting of the ECD of VEGFR-2 or VEGFR-3, fused in frame to the transmembrane and intracellular domains of the mouse erythropoietin receptor (as described in Example 5 of WO 2005/087808, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety). In the absence of IL-3, these cells survive and proliferate only in the presence of growth factors that have the ability to bind and cross-link the ECD of the respective VEGFR.

[0275] Em resumo, as células Ba/F3 transfectadas com VEGFR-2 ou VEGFR-3 (10.000 células/cavidade; placa de 96 cavidades) foram cultivadas em meio suplementado com VEGF-C ou VEGF-D na presença de concentrações crescentes de VGX-300 de VGX-301-ΔN2 (0 a 100 μg/ml) por 48 horas a 37 °C. A proliferação de células foi medida com o uso do reagente WST 1; as células foram incubadas por 4 horas a 37 °C com WST-1 e a absorbância a 450 nm (n=3; barras de erro = erro-padrão da média, SEM).[0275] Briefly, Ba/F3 cells transfected with VEGFR-2 or VEGFR-3 (10,000 cells/well; 96-well plate) were cultured in medium supplemented with VEGF-C or VEGF-D in the presence of increasing concentrations of VGX-300 of VGX-301-ΔN2 (0 to 100 μg/ml) for 48 hours at 37 °C. Cell proliferation was measured using WST 1 reagent; cells were incubated for 4 hours at 37 °C with WST-1 and absorbance at 450 nm (n=3; error bars = standard error of the mean, SEM).

[0276] Os resultados indicaram que VGX-300 neutralizou a atividade de VEGF-C e VEGF-D, conforme demonstrado pela inibição responsiva à dose de VEGF-C e VEGF- D nos bioensaios Ba/F3 de VEGFR-2 e VEGFR-3. VGX-300 mostrou potência intensificada na neutralização de VEGF-C em comparação a VEGF-D em ambos os ensaios de VEGFR-2 e -3. Consultar as Figuras 3 e 4.[0276] The results indicated that VGX-300 neutralized the activity of VEGF-C and VEGF-D, as demonstrated by the dose-responsive inhibition of VEGF-C and VEGF-D in the VEGFR-2 and VEGFR-3 Ba/F3 bioassays . VGX-300 showed enhanced potency in neutralizing VEGF-C compared to VEGF-D in both VEGFR-2 and -3 assays. See Figures 3 and 4.

[0277] A análise de VGX-301-ΔN2 demonstrou que essa molécula tinha também a capacidade de bloquear tanto VEGF-C quanto VEGF-D de se ligar a VEGFR-3. A atividade de neutralização de VGX-301-N2 foi um pouco mais forte do que esta do VGX-300. Consultar a Figura 4. A Tabela 6 mostra a ligação (IC50) de VGX-300 e VGX-301-ΔN2 a VEGF-C e VEGF-D no bioensaio Ba/F3 de VEGFR-3 [0277] Analysis of VGX-301-ΔN2 demonstrated that this molecule also had the ability to block both VEGF-C and VEGF-D from binding to VEGFR-3. The neutralization activity of VGX-301-N2 was slightly stronger than that of VGX-300. See Figure 4. Table 6 shows binding (IC50) of VGX-300 and VGX-301-ΔN2 to VEGF-C and VEGF-D in the VEGFR-3 Ba/F3 bioassay

Exemplo 6 - Distribuição Ocular e Farmacocinética de VGX-300 e VGX-301ΔN2 seguindo a administração intravítreaExample 6 - Ocular Distribution and Pharmacokinetics of VGX-300 and VGX-301ΔN2 Following Intravitreal Administration

[0278] Esse estudo foi conduzido para investigar a distribuição ocular e a farmacocinética de VGX-300, VGX- 301-ΔN2 e Aflibercept (EYLEA) seguindo uma única dose intravítrea para coelhos pigmentados.[0278] This study was conducted to investigate the ocular distribution and pharmacokinetics of VGX-300, VGX-301-ΔN2 and Aflibercept (EYLEA) following a single intravitreal dose to pigmented rabbits.

[0279] O projeto de estudo consistiu em 3 grupos, 8 coelhos fêmeas alocados por grupo. São administrados aos animais 500 μg de VGX-300, VGX-301-ΔN2 ou Aflibercept etiquetado radioativamente por meio de uma injeção intravítrea de bolus de 50 μL em ambos os olhos. [0279] The study design consisted of 3 groups, 8 female rabbits allocated per group. Animals are administered 500 μg of radioactively labeled VGX-300, VGX-301-ΔN2, or Aflibercept via a 50 μL intravitreal bolus injection into both eyes.

[0280] Um animal por grupo foi eutanasiado em 1, 12, 24, 72, 168, 366, 504 e 672 horas seguindo a administração de dose. Sangue, processado em soror, e tecidos oculares selecionados foram coletados em cada ponto de tempo e a concentração da radioatividade determinada por radioanálise. Os tecidos oculares coletados incluíram o humor aquoso, coroide, córnea, íris e corpo ciliar (ICB), lente, nervo óptico, retina, epitélio pigmentado da retina (RPE), esclera, rede trabecular e humor vítreo. A Figura 5 mostra as concentrações médias de radioatividade em vários tecidos e soro ao longo do período de tempo monitorado.[0280] One animal per group was euthanized at 1, 12, 24, 72, 168, 366, 504 and 672 hours following dose administration. Blood, processed in serum, and selected ocular tissues were collected at each time point and the concentration of radioactivity determined by radioanalysis. The collected ocular tissues included the aqueous humor, choroid, cornea, iris and ciliary body (ICB), lens, optic nerve, retina, retinal pigmented epithelium (RPE), sclera, trabecular meshwork, and vitreous humor. Figure 5 shows the average radioactivity concentrations in various tissues and serum over the monitored time period.

[0281] Os artigos de teste, [125I]VGX-300, [125I]Aflibercept (EYLEA) e [125I]VGX-301-ΔN2, foram bem tolerados, estáveis no humor vítreo e tiveram exposição prolongada a tecidos ocular tanto do segmento posterior quanto do segmento anterior. Embora houvesse diferenças na exposição de soro de [125I]VGX-300 e [125I]VGX-301-ΔN2 seguindo a administração intravítrea, tanto [125I]VGX-300 quanto [125I]VGX-301-ΔN2 tiveram apenas uma exposição sistêmica menor em comparação a esta de aflibercept (EYLEA), provavelmente como um resultado do espaçamento por meio da absorção na coroide e também pelo efluxo de humor aquoso. A PK e a biodistribuição de [125I]VGX-300 e [125I]VGX-301-ΔN2 observadas nesse estudo foram similares para ambos os compostos e comparáveis a essas do [125I]Aflibercept (EYLEA).[0281] The test articles, [125I]VGX-300, [125I]Aflibercept (EYLEA) and [125I]VGX-301-ΔN2, were well tolerated, stable in the vitreous humor and had prolonged exposure to ocular tissues from both the posterior and anterior segments. Although there were differences in serum exposure of [125I]VGX-300 and [125I]VGX-301-ΔN2 following intravitreal administration, both [125I]VGX-300 and [125I]VGX-301-ΔN2 had only minor systemic exposure. compared to that of aflibercept (EYLEA), probably as a result of spacing through absorption in the choroid and also through efflux of aqueous humor. The PK and biodistribution of [125I]VGX-300 and [125I]VGX-301-ΔN2 observed in this study were similar for both compounds and comparable to those of [125I]Aflibercept (EYLEA).

Exemplo 7 - Retinopatia do Modelo de PrematuridadeExample 7 - Retinopathy of the Prematurity Model

[0282] O Exemplo a seguir é um ensaio exemplificativo para avaliar VGX-300 e VGX-301-ΔN2 quanto a sua capacidade de inibir o início da neovascularização retinal com o uso do modelo ROP. Nesse modelo, camundongos de 7 dias pós-natal (P7) são expostos à hiperóxia (75% de oxigênio) por 5 dias (a P12). Após a exposição hiperóxica, os camundongos P12 são retornados à normóxia e recebem uma injeção intravítrea de anticorpo de controle de isótipo humano, VGX-300, VGX-301-ΔN2, Eylea (Coletor de VEGF), VGX- 300 + Eylea ou VGX-301-ΔN2 + Eylea. Todos os camundongos são, então, alojados sob condições normóxicas por 5 dias antes do sacrifício a P17, enucleação e fixação em formalina/PBS 10%. Os vasos serão quantificados em cada grupo com o uso de métodos de manchamento H&E e/ou IHC. Exemplo 8 - Neovascularização Coroidal Induzida por Laser de Argônio (CNV)[0282] The following Example is an exemplary assay to evaluate VGX-300 and VGX-301-ΔN2 for their ability to inhibit the initiation of retinal neovascularization using the ROP model. In this model, postnatal day 7 (P7) mice are exposed to hyperoxia (75% oxygen) for 5 days (at P12). After hyperoxic exposure, P12 mice are returned to normoxia and receive an intravitreal injection of human isotype control antibody, VGX-300, VGX-301-ΔN2, Eylea (VEGF Collector), VGX- 300 + Eylea, or VGX- 301-ΔN2 + Eylea. All mice are then housed under normoxic conditions for 5 days prior to sacrifice at P17, enucleation, and fixation in 10% formalin/PBS. Vessels will be quantified in each group using H&E and/or IHC staining methods. Example 8 - Argon Laser Induced Choroidal Neovascularization (CNV)

[0283] Nesse modelo de degeneração macular relacionada à idade (AMD), CNV é induzida pela ruptura induzida por laser de argônio da membrana de Bruch em camundongos no Dia 0 (3 queimaduras por camundongo). Grupos de 10 camundongos são estudados e o tratamento administrado por meio de injeções intravítreas semanais (no dia 0 e dia 7) do anticorpo de controle de isótipo humano, VGX-301-ΔN2, VGX- 300, Eylea (Coletor de VEGF), VGX-301-ΔN2 + Eylea ou VGX-300 + Eylea. No dia 14, os animais são sacrificados e montagens planas coroidais preparadas e manchadas com ICAM-2 para visualizar a neovascularização por microscopia de fluorescência.[0283] In this model of age-related macular degeneration (AMD), CNV is induced by argon laser-induced rupture of Bruch's membrane in mice on Day 0 (3 burns per mouse). Groups of 10 mice are studied and treatment administered via weekly intravitreal injections (on day 0 and day 7) of the human isotype control antibody, VGX-301-ΔN2, VGX-300, Eylea (VEGF Collector), VGX -301-ΔN2 + Eylea or VGX-300 + Eylea. On day 14, animals are sacrificed and choroidal flat mounts prepared and stained with ICAM-2 to visualize neovascularization by fluorescence microscopy.

[0284] Contempla-se que VGX-301-ΔN2, como um agente único, inibirá significativamente a neovascularização coroidal em um modelo de camundongo de AMD neovascular, em comparação ao efeito demonstrado por Eylea®. Exemplo 9 - Efeito Inibidor de Moléculas de Ligação de Ligantes na Metástase e Crescimento de Tumor Mediado por VEGF-C[0284] It is contemplated that VGX-301-ΔN2, as a single agent, will significantly inhibit choroidal neovascularization in a mouse model of neovascular AMD, compared to the effect demonstrated by Eylea®. Example 9 - Inhibitory Effect of Ligand Binding Molecules on VEGF-C Mediated Metastasis and Tumor Growth

[0285] Para demonstrar a capacidade de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento de inibir o crescimento e/ou metástase de tumor, qualquer modelo de tumor aceito pode ser empregado. Os modelos exemplificativos incluem mamíferos predispostos a desenvolver vários tipos de cânceres, animais injetados com tumores células tumorais ou linhagens de células de tumor de espécies iguais ou diferentes, incluindo opcionalmente células transformadas para superexpressar de modo recombinante um ou mais fatores de crescimento tais como VEGF-C ou VEGF-D. Para fornecer um modelo para tumores in vivo nos quais múltiplos fatores de crescimento são detectáveis, é possível transformar as linhagens de células de tumor com DNA exógeno para causar a expressão de múltiplos fatores de crescimento.[0285] To demonstrate the ability of a ligand-binding molecule described herein to inhibit tumor growth and/or metastasis, any accepted tumor model may be employed. Exemplary models include mammals predisposed to developing various types of cancers, animals injected with tumors, tumor cells or tumor cell lines from the same or different species, optionally including cells transformed to recombinantly overexpress one or more growth factors such as VEGF- C or VEGF-D. To provide a model for in vivo tumors in which multiple growth factors are detectable, it is possible to transform tumor cell lines with exogenous DNA to cause expression of multiple growth factors.

[0286] Uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento pode ser administrada diretamente, por exemplo, na forma de proteína por transfusão i.v. ou por microbombas implantadas ou na forma de ácido nucleico como parte de um regime de terapia de gene. Os sujeitos são, de preferência, agrupados por sexo, peso, idade e histórico médico para auxiliar a minimizar as variações dentre os sujeitos.[0286] A ligand-binding molecule described herein can be administered directly, for example, in protein form by i.v. transfusion or by implanted micropumps or in nucleic acid form as part of a gene therapy regimen. Subjects are ideally grouped by sex, weight, age, and medical history to help minimize variations among subjects.

[0287] A eficácia é medida por uma diminuição no tumor, tamanho (volume) e peso. Pode-se também examinar a natureza do efeito no tamanho de tumor, espalhamentos (metástases) e quantidade de tumores. Por exemplo, o uso de marcadores celulares específicos pode ser usado para mostrar o efeito na angiogênese em relação à linfangiogênese, um construto de ligação de VEGF-A esperado a ter um efeito maior no primeiro e um construto de ligação de VEGF-C esperado a ter um efeito maior no último. Os animais podem ser observados como um todo para o tempo de sobrevida e alterações no peso. Os tumores e espécimes são examinados para a evidência de angiogênese, linfangiogênese e/ou necrose.[0287] Efficacy is measured by a decrease in tumor size (volume) and weight. One can also examine the nature of the effect on tumor size, spread (metastases) and number of tumors. For example, the use of specific cellular markers can be used to show the effect on angiogenesis relative to lymphangiogenesis, a VEGF-A binding construct expected to have a greater effect on the former and a VEGF-C binding construct expected to have a greater effect on the former and a VEGF-C binding construct expected to have a greater effect on lymphangiogenesis. have a greater effect on the latter. Animals can be observed as a whole for survival time and changes in weight. Tumors and specimens are examined for evidence of angiogenesis, lymphangiogenesis, and/or necrosis.

[0288] Os camundongos SCID podem ser usados como sujeitos para a capacidade de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento de inibir ou impedir o crescimento de tumores. A molécula de ligação de ligante usada na terapia é geralmente escolhida de modo que a mesma se ligue a um ligante de fator de crescimento expresso pela célula tumoral, especialmente fatores de crescimento que são superexpressos pela célula tumoral em relação às células não neoplásticas no sujeito. No modelo SCID, as células tumorais, por exemplo, células MCF-7, podem ser transfectadas com um vírus que codifica um fator de crescimento particular sob o controle de um promotor ou outra sequência de controle de expressão que fornece a superexpressão do fator de crescimento conforme descrito no documento no WO 02/060950. Alternativamente, outra linhagem de células pode ser empregada, por exemplo, HT-1080, conforme descrito na Patente no U.S. 6.375.929. Pode-se transfectar as células tumorais com quantos ligantes de fator de crescimento quanto desejado para superexpressar ou uma linhagem de células de tumor pode ser escolhida que já superexpressa um ou mais ligantes de fator de crescimento de interesse. Um grupo de sujeitos é implantado com células que foram transfectadas de modo simulado, isto é, com um vetor que não tem um inserto de ligante de fator de crescimento.[0288] SCID mice can be used as subjects for the ability of a ligand-binding molecule described herein to inhibit or prevent the growth of tumors. The ligand-binding molecule used in therapy is generally chosen so that it binds to a growth factor ligand expressed by the tumor cell, especially growth factors that are overexpressed by the tumor cell relative to non-neoplastic cells in the subject. In the SCID model, tumor cells, for example MCF-7 cells, can be transfected with a virus encoding a particular growth factor under the control of a promoter or other expression control sequence that provides overexpression of the growth factor. as described in WO 02/060950. Alternatively, another cell line may be employed, for example, HT-1080, as described in U.S. Patent No. 6,375,929. One can transfect the tumor cells with as many growth factor ligands as desired to overexpress or a tumor cell line can be chosen that already overexpresses one or more growth factor ligands of interest. A group of subjects is implanted with cells that have been mock transfected, that is, with a vector that does not have a growth factor ligand insert.

[0289] Seja antes, concomitantemente ou após a implantação de tumor das células descritas acima, os sujeitos são tratados com uma molécula de ligação de ligante particular. Há vários modos diferentes de administrar a molécula de ligação de ligante. A terapia de gene in vivo e/ou ex vivo pode ser empregada. Por exemplo, as células podem ser transfectadas com um adenovírus ou outro vetor que codifica a molécula de ligação de ligante e implantadas com células tumorais que expressam o(s) fator(es) de crescimento, as células transfectadas com a molécula de ligação de ligante podem ser iguais àquelas transformadas com fator(es) de crescimento (ou que já superexpressam o(s) fator(es) de crescimento). Em algumas modalidades, um adenovírus que codifica essa molécula de ligação de ligante é injetado in vivo, por exemplo, de modo intravenoso. Em algumas modalidades, a própria molécula de ligação de ligante (por exemplo, na forma de proteína) é administrada ou sistêmica ou localmente, por exemplo, com o uso de uma microbomba. Ao testar a eficácia de um construto de ligação particular, pelo menos um controle é normalmente empregado. Por exemplo, no caso de uma terapia com base em vetor, um vetor com um inserto vazio ou LacZ é empregado ou o inserto pode ser uma molécula de ligação de ligante que compreende um ECD completo de VEGFR-3 que tem a capacidade de ligar VEGF-C ou VEGF-D, tal controle pode empregar mais do que um construto de ECD se necessário (por exemplo, para ligar múltiplos ligantes se os construtos de ligação com múltiplas afinidades de ligação de ligante forem empregados).[0289] Whether before, concomitantly or after tumor implantation of the cells described above, subjects are treated with a particular ligand-binding molecule. There are several different ways of administering the ligand binding molecule. In vivo and/or ex vivo gene therapy can be employed. For example, the cells can be transfected with an adenovirus or other vector encoding the ligand-binding molecule and implanted with tumor cells expressing the growth factor(s), the cells transfected with the ligand-binding molecule may be equal to those transformed with growth factor(s) (or which already overexpress the growth factor(s)). In some embodiments, an adenovirus encoding such a ligand-binding molecule is injected in vivo, for example, intravenously. In some embodiments, the ligand-binding molecule itself (e.g., in protein form) is administered either systemically or locally, for example, with the use of a micropump. When testing the effectiveness of a particular binding construct, at least one control is typically employed. For example, in the case of a vector-based therapy, a vector with an empty insert or LacZ is employed or the insert may be a ligand-binding molecule comprising a complete ECD of VEGFR-3 that has the ability to bind VEGF. -C or VEGF-D, such control may employ more than one ECD construct if necessary (e.g., to bind multiple ligands if binding constructs with multiple ligand binding affinities are employed).

[0290] A. Procedimentos exemplificativos[0290] A. Exemplary procedures

[0291] Preparação de Vetores de Expressão de Plasmídeo, Transfecção de Células e Realização de Testes dos Mesmos[0291] Preparation of Plasmid Expression Vectors, Transfection of Cells and Testing Thereof

[0292] Um cDNA que codifica VEGF-C ou VEGF-D ou combinações dos mesmos são introduzidos no plasmídeo pEBS7 (Peterson e Legerski, Gene, 107: 279 a 284, 1991.). Esse mesmo vetor pode ser usado para a expressão da molécula de ligação de ligante.[0292] A cDNA encoding VEGF-C or VEGF-D or combinations thereof are introduced into the pEBS7 plasmid (Peterson and Legerski, Gene, 107: 279 to 284, 1991.). This same vector can be used for expression of the ligand-binding molecule.

[0293] O subclone MCF-7S1 da linhagem de células de carcinoma de mama MCF-7 humana é transfectado com o DNA de plasmídeo pela eletroporação e agrupamentos de células estáveis são selecionados e cultivados conforme anteriormente descrito (Egeblad e Jaattela, Int. J. Cancer, 86: 617 a 625, 2000). As células são metabolicamente etiquetadas em MEM livre de metionina e cisteína (Gibco) suplementado com 100 μCi/ml de [35S]-metionina e [35S]-cisteína (Redivue Pro-Mix, Amersham Pharmacia Biotech). Os fatores de crescimento etiquetados são imunoprecipitados a partir do meio condicionado com o uso de anticorpos contra o(s) fator(es) de crescimento expresso(s). Os imunocomplexos e os complexos de ligação são precipitados com o uso da proteína A sefarose (Amersham Pharmacia Biotech), lavados duas vezes em BSA 0,5%, Tween 20 0,02% em PBS e uma vez em PBS e analisados em SDS- PAGE sob condições de redução.[0293] The MCF-7S1 subclone of the human MCF-7 breast carcinoma cell line is transfected with plasmid DNA by electroporation and stable cell clusters are selected and cultured as previously described (Egeblad and Jaattela, Int. J. Cancer, 86: 617 to 625, 2000). Cells are metabolically labeled in methionine- and cysteine-free MEM (Gibco) supplemented with 100 μCi/ml [35S]-methionine and [35S]-cysteine (Redivue Pro-Mix, Amersham Pharmacia Biotech). The labeled growth factors are immunoprecipitated from the conditioned medium using antibodies against the expressed growth factor(s). Immune complexes and binding complexes are precipitated using protein A sepharose (Amersham Pharmacia Biotech), washed twice in 0.5% BSA, 0.02% Tween 20 in PBS and once in PBS and analyzed on SDS- PAGE under reducing conditions.

[0294] Tratamento e Preparação de Sujeito[0294] Subject Treatment and Preparation

[0295] As células (20.000/cavidade) são plaqueadas em quadruplicado em 24 cavidades, tripinizadas em placas replicadas após 1, 4, 6 ou 8 dias e contadas com o uso de um hemocitômetro. Meio fresco é fornecido após 4 e 6 dias. Para o ensaio de tumorigênese, culturas subconfluentes são coletadas por tripsinação, lavadas duas vezes e 107 células em PBS são inoculadas nos coxins de gordura da segunda glândula mamária (axilar) de camundongos SCID ovariectomizados, carregando péletes de libração lenta subcutânea de 60 dias que contêm 0,72 mg de 17β-estradiol (Innovative Research of America). A ovariectomia e a implantação os péletes são realizadas 4 a 8 dias antes da inoculação de célula de tumor.[0295] Cells (20,000/well) are plated in quadruplicate in 24 wells, trypinized in replicate plates after 1, 4, 6 or 8 days and counted using a hemocytometer. Fresh medium is provided after 4 and 6 days. For the tumorigenesis assay, subconfluent cultures are collected by trypsination, washed twice, and 107 cells in PBS are inoculated into the fat pads of the second (axillary) mammary gland of ovariectomized SCID mice, carrying 60-day subcutaneous slow release pellets that contain 0.72 mg of 17β-estradiol (Innovative Research of America). Ovariectomy and pellet implantation are performed 4 to 8 days before tumor cell inoculation.

[0296] A codificação de cDNA para o(s) construto(s) de ligação é subclonada no plasmídeo pAdBglII e os adenovírus produzidos conforme anteriormente descritos (Laitinen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1.481 a 1.486, 1998). A(s) molécula(s) de ligação de ligante ou adenovírus de controle de LacZ (Laitinen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1.481 a 1.486, 1998), 109 pfu/camundongo, são injetados de modo intravenoso nos camundongos SCID 3 horas antes da inoculação de célula de tumor.[0296] The cDNA encoding for the binding construct(s) is subcloned into the pAdBglII plasmid and adenoviruses produced as previously described (Laitinen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1,481 to 1,486, 1998) . The ligand-binding molecule(s) or LacZ control adenovirus (Laitinen et al., Hum. Gene Ther., 9: 1481 to 1486, 1998), 109 pfu/mouse, are injected intravenously into the SCID mice 3 hours before tumor cell inoculation.

[0297] Análise da Eficácia de Tratamento[0297] Treatment Efficacy Analysis

[0298] O comprimento e a largura de tumor são medidos duas vezes por semana de uma maneira não identificada e o volume de tumor é calculado como o comprimento x largura x profundidade x 0,5, presumindo que o tumor é um hemielipsoide e a profundidade é igual à largura (Benz et al., Breast Cancer Res. Treat., 24: 85 a 95, 1993).[0298] Tumor length and width are measured twice a week in a de-identified manner and tumor volume is calculated as length x width x depth x 0.5, assuming the tumor is a hemielipsoid and the depth is equal to the width (Benz et al., Breast Cancer Res. Treat., 24: 85 to 95, 1993).

[0299] Os tumores são extirpados, fixados em paraformaldeído 4% (pH 7,0) por 24 horas e incorporados em parafina. As seções (7 μm) são imunomanchadas com anticorpos monoclonais contra, por exemplo, PECAM-1 (Pharmingen), VEGFR- 1, VEGFR-2, VEGFR-3 (Kubo et al., Blood, 96: 546 a 553, 2000) ou PCNA (Zymed Laboratories), PDGFR-α, PDGFR-β ou anticorpos policlonais contra LYVE-1 (Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789 a 801, 1999), VEGF-C (Joukov et al., EMBO J., 16: 3.898 a 3.911, 1997), laminina de acordo com os protocolos publicados (Partanen et al., Cancer, 86: 2.406 a 1.412, 1999) ou qualquer um dos fatores de crescimento. A média da quantidade dos vasos positivos PECAM-1 é determinada a partir de três áreas (60x de magnificação) da maior densidade vascular (áreas quentes vasculares) em uma seção. Todas as análises histológicas são realizadas com o uso de amostras de tumor não identificadas.[0299] The tumors are excised, fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.0) for 24 hours and embedded in paraffin. Sections (7 μm) are immunostained with monoclonal antibodies against, for example, PECAM-1 (Pharmingen), VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 (Kubo et al., Blood, 96: 546 to 553, 2000) or PCNA (Zymed Laboratories), PDGFR-α, PDGFR-β or polyclonal antibodies against LYVE-1 (Banerji et al., J Cell Biol, 144: 789 to 801, 1999), VEGF-C (Joukov et al., EMBO J., 16: 3898 to 3911, 1997), laminin according to published protocols (Partanen et al., Cancer, 86: 2406 to 1412, 1999) or any of the growth factors. The average number of PECAM-1 positive vessels is determined from three areas (60x magnification) of highest vascular density (vascular hot areas) in a section. All histological analyzes are performed using deidentified tumor samples.

[0300] Três semanas após a injeção dos construtos de adenovírus e/ou terapia de proteína, quatro camundongos de cada grupo são narcotizados, a pele ventral é aberta e alguns microlitros de corante azul de Evan 3% (Sigma) em PBS são injetados no tumor. A drenagem do corante do tumor é seguida macroscopicamente.[0300] Three weeks after injection of the adenovirus constructs and/or protein therapy, four mice from each group are narcotized, the ventral skin is opened, and a few microliters of 3% Evan's blue dye (Sigma) in PBS are injected into the tumor. Drainage of dye from the tumor is followed macroscopically.

[0301] O imageamento e o monitoramento de sangue e proteínas de sangue para fornecer a indicação da saúde dos sujeitos e da extensão da vasculatura de tumor podem também ser realizados. Exemplo 10- Efeitos na Progressão de Tumor em Sujeitos Com o Uso de uma Terapia Combinada de uma Molécula de Ligação de Ligante e um Agente Quimioterápico[0301] Imaging and monitoring of blood and blood proteins to provide indication of the health of subjects and the extent of tumor vasculature can also be performed. Example 10- Effects on Tumor Progression in Subjects With the Use of a Combination Therapy of a Ligand-Binding Molecule and a Chemotherapeutic Agent

[0302] Esse estudo é executado para testar a eficácia do uso de uma molécula de ligação de ligante descrita no presente documento em combinação com outras terapias anticâncer. Tais terapias incluem quimioterapia, terapia de radiação, terapia antissenso, interferência de RNA e anticorpos monoclonais direcionados a alvos de câncer. O efeito combinatório pode ser aditivo, mas é, de preferência, sinérgico em seus efeitos anticâncer, por exemplo, prevenção, supressão, regressão e eliminação de canceres, prolongação da vida e/ou redução nos efeitos colaterais.[0302] This study is performed to test the effectiveness of using a ligand-binding molecule described herein in combination with other anticancer therapies. Such therapies include chemotherapy, radiation therapy, antisense therapy, RNA interference, and monoclonal antibodies directed at cancer targets. The combinatorial effect may be additive, but is preferably synergistic in its anti-cancer effects, for example, prevention, suppression, regression and elimination of cancers, prolongation of life and/or reduction in side effects.

[0303] Os sujeitos são divididos em grupos com um grupo recebendo um agente quimioterápico, um grupo que recebe uma molécula de ligação de ligante e um grupo recebendo tanto um agente quimioterápico quanto uma molécula de ligação de ligante em intervalos periódicos regulares, por exemplo, diária, semanal ou mensalmente. Em estudos humanos, os sujeitos são geralmente agrupados por sexo, peso, idade e histórico médico para auxiliar a minimizar as variações dentre os sujeitos. Idealmente, os sujeitos foram diagnosticados com o mesmo tipo de câncer. Em sujeitos humanos ou não humanos, o progresso pode ser seguido pela medição do tamanho de tumor, metástases, ganho/perda de peso, vascularização em tumores e contagens de glóbulos brancos.[0303] Subjects are divided into groups with one group receiving a chemotherapeutic agent, a group receiving a ligand-binding molecule, and a group receiving both a chemotherapeutic agent and a ligand-binding molecule at regular periodic intervals, e.g. daily, weekly or monthly. In human studies, subjects are generally grouped by sex, weight, age, and medical history to help minimize variations among subjects. Ideally, the subjects were diagnosed with the same type of cancer. In human or non-human subjects, progress can be followed by measuring tumor size, metastasis, weight gain/loss, vascularity in tumors, and white blood cell counts.

[0304] As biópsias de tumores são retiradas em intervalos regulares tanto antes quanto após o começo do tratamento. Por exemplo, as biópsias são retiradas logo antes do tratamento, em uma semana e, então, em intervalos de um mês, posteriormente, ou sempre que possível, por exemplo, na medida em que os tumores são extirpados. Examina-se as biópsias para marcadores de células e a morfologia de tecido e célula geral para avaliar a eficácia do tratamento. Adicionalmente ou na alternativa, técnicas de imageamento podem ser empregadas.[0304] Tumor biopsies are taken at regular intervals both before and after the start of treatment. For example, biopsies are taken just before treatment, within a week, and then at one-month intervals thereafter, or whenever possible, for example, as tumors are excised. Biopsies are examined for cell markers and overall tissue and cell morphology to assess treatment effectiveness. Additionally or alternatively, imaging techniques can be employed.

[0305] Para estudos de animal não humano, um controle de placebo adicional pode ser empregado. Os estudos de animal, realizados em concordância com as diretrizes NIH, também fornecem a vantagem da inserção da população de célula de câncer relativamente uniforme e tumores que superproduzem seletivamente os um ou mais fatores de crescimento alvejados pela molécula de ligação de ligante.[0305] For non-human animal studies, an additional placebo control may be employed. Animal studies, performed in accordance with NIH guidelines, also provide the advantage of inserting relatively uniform cancer cell populations and tumors that selectively overproduce the one or more growth factors targeted by the ligand-binding molecule.

Claims (15)

1. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE SOLÚVEL ISOLADO OU PURIFICADO, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de aminoácidos definida pelas posições 47 a 115 da SEQ ID NO: 2, 47 a 210 da SEQ ID NO: 2 ou 47 a 314 da SEQ ID NO: 2 com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 da SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T, em que o polipeptídeo se liga a pelo menos um polipeptídeo ligante selecionado dentre VEGF-C, VEGF-D e PlGF humanos.1. ISOLATED OR PURIFIED SOLUBLE LINK BINDING POLYPEPTIDE, characterized in that it comprises an amino acid sequence having the amino acid sequence defined by positions 47 to 115 of SEQ ID NO: 2, 47 to 210 of SEQ ID NO: 2 or 47 to 314 of SEQ ID NO: 2 with the proviso that the polypeptide positions corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T, wherein the polypeptide binds to at least one linker polypeptide selected from among Human VEGF-C, VEGF-D and PlGF. 2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos que tem a sequência de aminoácidos definida pelas posições 25 a 314 da SEQ ID NO: 2 com a condição de que as posições do polipeptídeo correspondentes às posições 104 a 106 da SEQ ID NO: 2 não sejam idênticas a N-X-S ou N-X-T.2. POLYPEPTIDE, according to claim 1, characterized by comprising an amino acid sequence having the amino acid sequence defined by positions 25 to 314 of SEQ ID NO: 2 with the condition that the positions of the polypeptide corresponding to positions 104 to 106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T. 3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por reter quatro sítios de sequon de N-glicosilação correspondentes às posições 33 a 35 da SEQ ID NO: 2, posições 166 a 168 da SEQ ID NO, posições 251 a 253 da SEQ ID NO: 2 e posições 299 a 301 da SEQ ID NO: 2.3. POLYPEPTIDE according to any one of claims 1 or 2, characterized by retaining four N-glycosylation sequon sites corresponding to positions 33 to 35 of SEQ ID NO: 2, positions 166 to 168 of SEQ ID NO, positions 251 to 253 of SEQ ID NO: 2 and positions 299 to 301 of SEQ ID NO: 2. 4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser glicosilado nos ditos quatro sítios de sequon de N-glicosilação.4. POLYPEPTIDE, according to claim 3, characterized in that it is glycosylated in said four N-glycosylation sequon sites. 5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo aminoácido no polipeptídeo correspondente à posição 104 de SEQ ID NO: 2 ser deletado ou substituído por outro aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina, aspartato, glutamato, arginina e lisina.5. POLYPEPTIDE according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the amino acid in the polypeptide corresponding to position 104 of SEQ ID NO: 2 is deleted or replaced by another amino acid, selected from the group consisting of glutamine, aspartate, glutamate, arginine and lysine. 6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE LIGANTE SOLÚVEL, caracterizada por compreender o polipeptídeo de ligação de ligante solúvel, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, conectado a um peptídeo heterólogo.6. SOLUBLE LIGAND BINDING MOLECULE, characterized in that it comprises the soluble ligand binding polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 5, connected to a heterologous peptide. 7. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo peptídeo heterólogo compreender um fragmento de domínio constante de imunoglobulina.7. MOLECULE according to claim 6, characterized in that the heterologous peptide comprises an immunoglobulin constant domain fragment. 8. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.8. MOLECULE, according to claim 6, characterized by comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. 9. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO OU PURIFICADO, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos de codificação que codifica o polipeptídeo de ligação de ligante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou a molécula de ligação de ligante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, cuja sequência de codificação compreende os nucleotídeos 157-361 da SEQ ID NO:1, 157-649 da SEQ ID NO: 1 ou 157-961 da SEQ ID NO: 1, com a condição de que a sequência de codificação codifique um polipeptídeo no qual os aminoácidos em posição correspondente às posições 104-106 da SEQ ID NO: 2 não são idênticas a N-X-S ou N-X-T.9. ISOLATED OR PURIFIED POLYNUCLEOTIDE, characterized in that it comprises a coding nucleotide sequence that encodes the ligand-binding polypeptide, as defined in any one of claims 1 to 5 or the ligand-binding molecule, as defined in any one of the claims 6 to 8, the coding sequence of which comprises nucleotides 157-361 of SEQ ID NO: 1, 157-649 of SEQ ID NO: 1 or 157-961 of SEQ ID NO: 1, with the proviso that the coding sequence encodes a polypeptide in which the amino acids in position corresponding to positions 104-106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T. 10. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 9, cuja sequência de codificação compreende os nucleotídeos 157-361 da SEQ ID NO:1, 157-649 da SEQ ID NO: 1 ou 157-961 da SEQ ID NO: 1, com a condição de que a sequência de codificação codifique um polipeptídeo no qual os aminoácidos em posição correspondente às posições 104-106 da SEQ ID NO: 2 não são idênticas a N-X-S ou N-X-T.10. VECTOR, characterized in that it comprises the polynucleotide, as defined in claim 9, whose coding sequence comprises nucleotides 157-361 of SEQ ID NO: 1, 157-649 of SEQ ID NO: 1 or 157-961 of SEQ ID NO: : 1, with the proviso that the coding sequence encodes a polypeptide in which the amino acids in position corresponding to positions 104-106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T. 11. CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICRORGANISMO ISOLADA OU LINHA CELULAR DE MICRORGANISMO, caracterizada por ser transformada ou transfectada com um polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 9, ou com um vetor, conforme definido na reivindicação 10.11. ISOLATED MICROORGANISM HOST CELL OR MICROORGANISM CELL LINE, characterized in that it is transformed or transfected with a polynucleotide, as defined in claim 9, or with a vector, as defined in claim 10. 12. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE LIGANTE OU UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE LIGANTE, caracterizado por compreender cultivar uma célula, conforme definida na reivindicação 11, sob condições em que o polipeptídeo de ligação de ligante ou a molécula de ligação de ligante codificada pelo polinucleotídeo é expressa, e opcionalmente purificar ou isolar o polipeptídeo de ligação de ligante ou a molécula de ligação de ligante a partir da célula ou a partir de um meio de crescimento da célula.12. METHOD FOR PRODUCING A LIGAND-BINDING POLYPEPTIDE OR A LIGAND-BINDING MOLECULE, characterized in that it comprises culturing a cell, as defined in claim 11, under conditions in which the ligand-binding polypeptide or the encoded ligand-binding molecule by the polynucleotide is expressed, and optionally purifying or isolating the ligand-binding polypeptide or the ligand-binding molecule from the cell or from a cell growth medium. 13. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender: (i) um polipeptídeo purificado de ligação de ligante ou uma molécula de ligação de ligante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 9, ou vetor, conforme definido na reivindicação 10, cuja sequência de codificação compreende os nucleotídeos 157-361 da SEQ ID NO:1, 157-649 da SEQ ID NO: 1 ou 157-961 da SEQ ID NO: 1, com a condição de que a sequência de codificação codifique um polipeptídeo no qual os aminoácidos em posição correspondente às posições 104-106 da SEQ ID NO: 2 não são idênticas a N-X-S ou N-X-T; e (ii) um diluente, adjuvante, excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitáveis.13. COMPOSITION, characterized in that it comprises: (i) a purified ligand-binding polypeptide or a ligand-binding molecule, as defined in any one of claims 1 to 8, or a polypeptide, as defined in claim 9, or vector, as defined in claim 10, the coding sequence of which comprises nucleotides 157-361 of SEQ ID NO: 1, 157-649 of SEQ ID NO: 1 or 157-961 of SEQ ID NO: 1, with the proviso that the sequence coding encodes a polypeptide in which the amino acids in position corresponding to positions 104-106 of SEQ ID NO: 2 are not identical to N-X-S or N-X-T; and (ii) a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant, excipient or carrier. 14. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 13, caracterizado por ser destinado à fabricação de um medicamento para inibir a neovascularização em um indivíduo com necessidade da mesma.14. USE OF A COMPOSITION, as defined in claim 13, characterized in that it is intended for the manufacture of a medicine to inhibit neovascularization in an individual in need thereof. 15. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 13, caracterizado por ser destinado à fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças associadas com angiogênese e/ou linfangiogênese anormal; condições clínicas associadas à proliferação de células endoteliais excessiva, permeabilidade vascular, edema ou inflamação, edema cerebral associado à lesão, derrame ou tumor; edema associado a doenças inflamatórias, psoríase, artrite, artrite reumatoide; asma; edema generalizado associado a queimaduras; ascites e efusão pleural associada a tumores, inflamação ou trauma; inflamação crônica das vias respiratórias; síndrome de extravasamento capilar; sepse; doença renal associada a vazamento aumentado de proteína; doenças dos olhos associadas à neovascularização; neovascularização coroidal; edema macular diabético; degeneração macular relacionada à idade; retinopatia diabética proliferativa; oclusão da veia de retina; neovascularização córnea/rejeição de transplante; degeneração macular relacionada à idade neovascular (molhada); retinopatia hipertensiva; retinopatia diabética; retinopatia falciforme; neovascularização de retina periférica; retinopatia de prematuridade; doença oclusiva venosa; doença oclusiva arterial; coriorretinopatia serosa central; edema macular cistoide; telangiectasia macular; macroaneurisma arterial; angiomatose de retina; retinopatia induzida por radiação (RIRP); rubeosis iridis; neoplasmas oculares incluindo tumor da pálpebra, tumor conjuntival, tumor coroidal, tumor da íris, tumor do nervo óptico, tumor da retina, tumor intraocular infiltrativo e tumor orbital.15. USE OF A COMPOSITION, as defined in claim 13, characterized in that it is intended for the manufacture of a medicine to treat or prevent diseases associated with abnormal angiogenesis and/or lymphangiogenesis; clinical conditions associated with excessive endothelial cell proliferation, vascular permeability, edema or inflammation, cerebral edema associated with injury, stroke or tumor; edema associated with inflammatory diseases, psoriasis, arthritis, rheumatoid arthritis; asthma; generalized edema associated with burns; ascites and pleural effusion associated with tumors, inflammation or trauma; chronic inflammation of the airways; capillary leak syndrome; sepsis; kidney disease associated with increased protein leakage; eye diseases associated with neovascularization; choroidal neovascularization; diabetic macular edema; age-related macular degeneration; proliferative diabetic retinopathy; retinal vein occlusion; corneal neovascularization/transplant rejection; neovascular (wet) age-related macular degeneration; hypertensive retinopathy; diabetic retinopathy; sickle cell retinopathy; peripheral retinal neovascularization; retinopathy of prematurity; venous occlusive disease; arterial occlusive disease; central serous chorioretinopathy; cystoid macular edema; macular telangiectasia; arterial macroaneurysm; retinal angiomatosis; radiation-induced retinopathy (RIRP); rubeosis iridis; ocular neoplasms including eyelid tumor, conjunctival tumor, choroidal tumor, iris tumor, optic nerve tumor, retinal tumor, infiltrative intraocular tumor and orbital tumor.