BR112015016420B1

BR112015016420B1 - Composto de oligonucleotídeo imunorregulatório, composição farmacêutica e uso do composto iro ou da composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015016420B1
Application number: BR112015016420-0A
Authority: BR
Inventors: Ekambar R. Kandimalla; Daqing Wang; Dong Yu; Ireneusz Nowak; Sudhir Agrawal
Original assignee: Idera Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2022-12-06
Also published as: CA2896537C; JP6385957B2; EP2943251A1; US20140193396A1; AU2014205544A2; HK1214191A1; AU2014205544A1; WO2014110081A1; CA2896537A1; US10041076B2; KR20150103739A; JP2016510213A; KR101898177B1; AU2018247308B2; US10066230B2; BR112015016420A2; US20160312225A1; AU2018247308A1; US9260719B2; EP2943251B1

Abstract

COMPOSTO DE OLIGONUCLEOTÍDEO IMUNORREGULATÓRIO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO COMPOSTO OU DA COMPOSIÇÃO. A invenção provê oligonucleotídeos imunorregulatórios (IRO) como antagonista de TLRs e métodos de uso para os mesmos. Esses IROs possuem sequências singulares que inibem a sinalização mediada por TLR em resposta a um ligante de TLR ou agonista de TLR. Os métodos podem ser utilizados na prevenção e tratamento de câncer, distúrbio autoimune, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, distúrbios dermatológicos, alergia, asma, ou doença causada por patógeno.

Description

Campo técnico

[0001] A invenção se refere geralmente ao campo de imunologia e imunoterapia, e mais especificamente a composições de oligonucleotídeo imunorregulatório (IRO) e seu uso para inibição e/ou supressão de respostas imunes mediadas por receptor tipo Toll. Em particular, a invenção se refere a antagonistas de Receptores tipo Toll 9 (TLR7), TLR7 e/ou TLR8 que excepcionalmente inibem citocinas normalmente produzidas através de estimulação de TLR9, TLR7 e/ou TLR8.

Sumário do Estado da Técnica

[0002] Receptores do tipo Toll (TLRs) estão presentes em muitas células do sistema imune e demonstraram estar envolvidos na resposta imune inata (Hornung V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537). Nos vertebrados ou mamíferos, essa família consiste de dez proteínas denominadas TLR1 à TLR10, que são conhecidas por reconhecerem padrões moleculares associados a patógeno de bactérias, fungos, parasitas e vírus (Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811815; Hayashi, F.et al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167:416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303: 1526-1529; Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531. Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943). As TLRs são o principal meio pelo qual os mamíferos reconhecem e montam uma resposta imune a moléculas estranhas e também proporcionam um meio pelo qual respostas imunes inatas e adaptativas são ligadas (Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). TLRs também desempenham papel na patogênese de muitas doenças, inclusive autoimunidade, doença infecciosa e inflamação (Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979) e a regulação de ativação mediada por TLR utilizando agentes apropriados pode prover meios para intervenção na doença.

[0003] Algumas TLRs estão localizadas sobre a superfície da célula para detectar e iniciar uma resposta a patógenos extracelulares e outras TLRs estão localizadas dentro da célula para detectar e iniciar uma resposta a patógenos intracelulares. A Tabela 1 apresenta uma representação de TLRs, sua localização celular, e os agonistas conhecidos (Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. el al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol. 3:196-200; Jurk M et al. (2002) Nat Immunol. 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:66466651); (Alexopoulou, L. (2001) Nature 413-732-738). Tabela 1

[0004] Certos motivos CpG não metilados presentes em DNA bacteriano e sintético demonstraram ativar o sistema imune e induzir a atividade antitumoral. (Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H Cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73). Outros estudos utilizando olinucleotídeos antisentido contendo dinucleotídeos CpG demonstraram estimular respostas imunes (Zhao Q, et al. (19965) Biochem. Pharmacol. 26:173-182). Estudos posteriores demonstraram que a TLR9 reconhece os motivos CpG não- metilados presentes em DNA bacteriano e sintético (Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745). Outras modificações de oligonucleotídeos fosforotioato contendo CpG podem também afetar sua capacidade de atuar como moduladores de resposta imune através de TLR9 (vide, por exemplo, Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Boorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054; Yu, D. et al.(2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; e Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813). Além disso, estudos de relação de atividade estrutural permitiram a identificação de motivos sintéticos e de compostos novos à base de DNA que induzem perfis de resposta imune específicas, distintas das que resultam de dinucleotídeos CpG não-metilados. (Kandimalla, E. al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308; Cong, Y. et al. (2003) Biochem. Biophys Res. Commun. 310:1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11:459-464; Braghat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem. 45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconj. Chem. 13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238.

[0005] A localização seletiva de TLRs e a sinalização deles gerada lança alguma luz sobre seu papel na resposta imune. A resposta imune envolve tanto uma resposta inata como adaptativa com base no subgrupo de células envolvidas na resposta. Por exemplo, as células T auxiliares (Th) envolvidas nas funções clássicas mediadas por células, tal como hipersensibilidade tipo tardia e ativação de linfócitos T citotóxicos (CTLs), são células Th1. Essa é a resposta inata do organismo ao antígeno (ex: infecções virais, patógenos intracelulares, e células tumorais) e resulta em secreção de IFN-gama e a concomitante ativação de CTLs. Alternativamente, as células Th envolvidas como células auxiliares para ativação de célula B, são células Th2. As células Th2 demonstraram ser ativadas em resposta a bactérias e parasitas e podem mediar a resposta imune adaptativa do organismo (ex: produção de IgE e ativação de eosinófilos) através da secreção de IL-4 e IL-5. O tipo de resposta imune é influenciado pelas citocinas produzidas em resposta à exposição ao antígeno e as diferenças nas citocinas secretadas por células Th1 e Th2 podem ser o resultado das diferentes funções biológicas desses dois subgrupos.

[0006] Embora a ativação das TLRs esteja envolvida na montagem de uma resposta imune, uma estimulação descontrolada do sistema imune através de TLRs pode exacerbar certas doenças em indivíduos imunocomprometidos. Nos últimos anos, vários grupos demonstraram o uso de oligodesoxioligonucleotídeos sintéticos (ODNs) como inibidores de citocinas inflamatórias (Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22 (10):621-631).

[0007] Utilizando certos ODNs sintéticos, Lenert et al. relatam a capacidade de produzir ODNs inibitórios (Lenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22 (10):621-631). Esses ODNs inibitórios requerem duas sequências tripleto, um tripleto “CCT” proximal e um tripleto “GGG” distal. Além desses ODNs inibitórios contendo tripleto, vários grupos reportaram outras sequências de DNA específicas que poderiam inibir a ativação mediada por TLR-9 através de ODNs contendo CpG. Esses motivos “inibitórios” e “supressivos” são ricos em poli “G” (ex: “GGGG”) ou sequências “GC”, tendem a ser metilados, e estão presentes no DNA de mamíferos e de certos vírus (vide, por exemplo, Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. 32: 1212-1222 (2002). Duramad, O. et al., J. Immunol., 174: 5193-5200 (2005) e Jurk et al. (US 2005/0239733), descrevem uma estrutura para oligonucleotídeos inibitórios de DNA contendo motivo GGGG nas sequências. Patole et al. demonstram que ODNs contendo GGGG suprimem o lúpus sistêmico (Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280). Adicionalmente, Gursel, I. et al., J. Immunol., 171:1393-1400 (2003), descrevem que elementos TTAGGG repetitivos, presentes em alta frequência em telômeros de mamíferos, infrarregulam a atividade imune induzida por CpG. Shirota, H. et al., J. Immunol. 173:50025007 (2004), demonstram que oligonucleotídeos sintéticos contendo o elemento TTAGGG imitam essa atividade, podendo ser eficazes na prevenção/tratamento de certas doenças autoimunes Th1-dependentes.

[0008] Alguns estudos, pelo contrário, questionaram o ponto de vista de que ODNs contendo poli G podem atuar como antagonistas de TLRs. Por exemplo, US 6.426.334, Agrawal et al., demonstram que a administração de oligonucleotídeos CpG contendo sequências GGGG possui potente atividade antiviral e anticâncer e que a administração desses compostos causa aumento na concentração sérica de IL-12. Além disso, oligos CpG contendo sequências poliG são conhecidas por induzir respostas imunes através da ativação de TLR9 (Verthelyi D et al, J. Immunol. 166, 2372, 2001; Gursel M et al., J. Leukoc Biol, 71, 813, 2001, Krug A et al, Eur J Immunol, 31, 2154, 2001) e demonstram atividades antitumorais e antivirais (Ballas GK et al, J Immunol, 167, 4878, 2001; Verthelyi D et al, J. Immunol, 170, 4717, 2003). Além disso, oligonucleotídeos poliG são conhecidos por inibir HIV e Rel A (McShan WM, et al., J Biol Chem., 267(8):5712-21, 1992; Rando, RF et al., J Biol Chem, 270(4): 1754-60, 1995; Benimetskaya L, et al., Nucleic Acids Res., 25(13):2648-56, 1997); e as ODNs contendo um motivo CpG imunoestimulatório e 4 nucleotídeos G consecutivos (conhecidos como ODNs classe A) induzem a produção de interferon-Y e uma mudança de Th1 na resposta imune. Além disso, em modelos pré-clínicos de doença, ODNs de classe A demonstraram induzir uma resposta imune mediada pela TLR.

[0009] Em outra limitação, oligonucleotídeos contendo sequências de guanosina demonstraram formar estruturas tetraplex, atuar como aptâmeros, e inibir a atividade da trombina (Bock LC et al., Nature, 355:564-6, 1992; Padmanabham, K. et al., J. Biol. Chem. 268(24):17651-4, 1993). Assim, não fica claro se as estruturas de fita simples ou de fita múltipla são eficazes na supressão da ativação de TLR9.

[00010] Kandimalla et al. (11/549.0487) descrevem uma nova classe de antagonistas de TLR que não requerem sequência PliG. Kandimalla et al. também descrevem a aplicação dessas composições novas no tratamento e prevenção de várias doenças e distúrbios (11/549.048; 11/743.876; 12/140.334; 12/140.338; 12/244.199). Porém, permanece o desafio de se desenvolver antagonistas de TLR adicionais que não requeiram uma sequência de poliG e que, desta forma, não apresentem o problema de formar estruturas secundárias. Adicionalmente, existem ainda os desafios apresentados pela variabilidade de doenças e complexidade de tratamento de doenças e pacientes. Esse desafio pode ser enfrentado através do projeto de novos compostos à base de oligonucleotídeo e composições que possam atuar como inibidores singulares de TLRs 9, 7 e/ou 8 que possam ser adaptados às necessidades específicas do paciente. Esses compostos e composições novos encontram utilidade em muitas aplicações clinicamente relevantes, inclusive no tratamento e prevenção de doenças e distúrbios com componente imunoestimulatório.

Breve Sumário da Invenção

[00011] A invenção provê antagonistas de TLR7 e/ou TLR9 que antagonizam distintamente os perfis in vitro e in vivo de citocina e quimiocina normalmente gerados através de estimulação de TLR9, TLR7 e/ou TLR8. A capacidade de singularmente antagonizar a resposta de citocina e quimiocina a um agonista de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 permite prevenir e/tratar várias condições patológicas de forma doença- específica e ainda paciente-específica.

[00012] Assim, a invenção provê um composto de oligonucleotídeo imunorregulatório (IRO) selecionado do composto número 1 ao composto número 15, conforme descrito abaixo. Os compostos e composições de IRO, de acordo com a invenção, preferivelmente inibem respostas imunes mediadas por TLR9, TLR7 e/ou TLR8 em vários tipos de célula e em vários modelos experimentais in vitro e in vivo, com cada composto ou composição provendo um perfil de inibição de resposta imune.

[00013] A invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo um composto de IRO, de acordo com a invenção, e um portador farmaceuticamente aceitável.

[00014] A invenção também provê um método para inibir uma resposta imune mediada por TLR9, TLR7 e/ou TLR8 em um vertebrado ou mamífero, o método compreendendo administrar ao mamífero um composto ou composição de IRP, de acordo com a invenção.

[00015] A invenção também provê um método para inibir a atividade de um agonista de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 compreendendo administrar um composto de IRO, de acordo com a invenção, sendo que o composto de IRO é administrado concomitantemente, antes ou após o agonista de TLR.

[00016] A invenção também provê um método para terapeuticamente tratar um vertebrado ou mamífero, sofrendo de uma doença ou distúrbio em que a inibição de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 poderia ser benéfica, tal método compreendendo administrar ao mamífero um composto de IRO de acordo com a invenção.

[00017] A invenção também provê um método para prevenir uma doença ou distúrbio em um vertebrado ou mamífero, sendo que a inibição de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 poderia ser benéfica, tal método compreendendo administrar ao vertebrado ou mamífero um composto de IRP, de acordo com a invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

[00018] A Figura 1 ilustra a capacidade de os antagonistas de TLR7/9, de acordo com a invenção, inibirem citocinas induzidas por TLR9 IN VIVO em camundongos tratados de acordo com o Exemplo 3. Os dados demonstram mais geralmente a capacidade de os antagonistas de TLR, de acordo com a invenção, inibirem citocinas induzidas por TLR9 IN VIVO.

[00019] A Figura 2 ilustra a capacidade de os antagonistas de TLR7/9, de acordo com a invenção, inibirem citocinas induzidas por TLR7 IN VIVO em camundongos tratados de acordo com o Exemplo 3. Os dados demonstram mais geralmente a capacidade de os antagonistas de TLR, de acordo com a invenção, inibirem citocinas induzidas por TLR7 IN VIVO.

[00020] A Figura 3 ilustra os valores de concentração inibitória de 50% (IC50) de antagonista de TLR9, TLR7, TLR8, de acordo com a invenção em ensaios de cultura de células descritos no Exemplo 4.

Descrição Detalhada da Invenção

[00021] A presente invenção se refere ao uso terapêutico de compostos à base de oligonucleotídeo como agentes imunomoduladores para aplicações imunoterápicas. A invenção provê compostos à base de oligonucleotídeos que oferecem perfis distintos de inibição de resposta imune através de sua interação com TLR9, TLR7 e/ou TLR8. Especificamente, a invenção provê compostos de Oligonucleotídeo Imunorregulatório (IRO) como antagonistas de receptores tipo Toll 9, 7, e/ou 8 (TLR9, TLR7 e/ou TLR8) para inibir e/ou suprimir uma resposta imune mediada por TLR9, TLR7 e/ou TLR8. Esses IROs possuem modificações químicas e/ou ligações de internucleotídeo que proporcionam inibição de supressão de sinalização mediada por TLR9, TLR7 e/ou TLR8 em resposta a ligantes ou agonistas de TLR endógenos e/ou exógenos. As referências aqui citadas refletem o nível de conhecimento no campo da técnica e são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Quaisquer conflitos entre os ensinamentos das referências citadas e este relatório devem ser resolvidos a favor deste último.

[00022] A invenção também provê métodos para inibir uma resposta imune causada por TLR9, TLR7 e/ou TLR8, que possa ser usada em aplicações imunoterápicas tais como, embora não restritas a tratamento de câncer, distúrbios autoimunes, asma, alergias respiratórias, alergias alimentares, alergias dermatológicas, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite, pleurisia, infecções crônicas, doenças inflamatórias, síndrome intestinal inflamatória, sepse, e infecções bacterianas, parasitárias e virais em adultos, bem como aplicações pediátricas, humanas e veterinárias. Assim, a invenção provê compostos de IRO com ótimos níveis de efeito imunomodulador para imunoterapia e métodos para preparar e utilizar tais compostos. Além disso, os compostos de IRO são úteis quando combinados, por exemplo, com vacinas, antígenos, anticorpos, alérgenos, agentes quimioterápicos (tanto quimioterapia como terapias direcionadas) e/ou oligonucleotídeos antisentido para prevenção e tratamento de doenças.

Definições

[00023] O termo “oligonucleotídeo” geralmente se refere a um polinucleosídeo compreendendo uma pluralidade de unidades nucleosídicas ligadas. Tais oligonucleotídeos podem ser obtidos de fontes de ácido nucleico existentes, inclusive genômicas ou de cDNA, embora sejam preferivelmente produzidos através de métodos sintéticos. Em concretizações preferidas, cada unidade nucleosídica pode abranger várias modificações químicas e substituições, em comparação com oligonucleotídeos do tipo selvagem, inclusive, embora não restritos à base nucleosídica modificada e/ou unidade de açúcar modificada. Exemplos de modificações químicas são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Uhlmann, E. et al. (1990) Chem. Rev. 90:543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; e Hunziker, J. et al. (1995) Mod. Syn. Methods 7:331-417; e Crooke, S. et al. (1996) Ann. Rev. Pharm. Tox. 36:107-129. Os resíduos nucleosídeo podem ser acoplados entre si através de qualquer uma das numerosas ligações de internucleosídeo conhecidas. Tais ligações de internucleosídeo incluem, sem limitação, ligações fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioéter, fosforamidato em ponte, fosfonato de metileno em ponte, fosforotioato em ponte e ligações de sulfona internucleosídeo. O termo “oligonucleotídeo” também abrange polinucleosídeos contendo uma ou mais ligações de internucleosídeo estereoespecífico (ex: ligações (RP)- ou (Sp)-fosforotioato, alquilfosfonato, ou fosfotriéster). Conforme aqui utilizados, os termos “oligonucleotídeo” e “dinucleotídeo” pretende expressamente incluir polinucleosídeos e dinucleosídeos contendo qualquer tal ligação de internucleosídeo, quer a ligação compreenda ou não um grupo fosfato. Em certas concretizações preferidas, essas ligações de internucleosídeo podem ser ligações fosfodiéster, fosforotioato e fosforoditioato, ou suas combinações.

[00024] O termo “ribonucleosídeo 2’-substituído” ou “arabinosídeo 2’-substituídeo” geralmente inclui ribonucleosídeos ou arabinonucleosídeos nos quais o grupo hidroxila na posição 2’ da porção pentose é substituído para produzir um ribonucleosídeo 2’-substituído ou 2’-O- substituído. Em certas concretizações, tal substituição é conduzida com um grupo hidrocarbila inferior contendo de 1-6 átomos de carbono saturados ou insaturados, com um átomo de halogênio, ou com um grupo arila contendo de 6-10 átomos de carbono, onde tal grupo hidrocarbila ou arila possa ser não substituído ou substituído, por exemplo, com grupos halo, hidroxi, trifluorometila, ciano, nitro, acila, aciloxi, alcoxi, carboxila, carboalcoxi, ou amino. Exemplos de ribonucleosídeos 2’-O-substituídos ou arabinosídeos 2’-O- substituídos incluem, sem limitação, 2’-amino, 2’-fluoro, 2’- alila, 2’-O-alquil e 2’-propargil rubonucleosídeos ou arabinosídeos, 2’-O-metilrribonucleosídeos ou 2’-O- metilarabinosídeos e 2’-O-metoxietoxirribonucleosídeos ou 2’- O-metoxietoxiarabinosídeos.

[00025] O termo “3’”, quando utilizado direcionalmente, se refere geralmente a uma região ou posição 3’ em um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo (a jusante) de outra região ou posição no mesmo polinucleotídeo ou oligonucleotídeo.

[00026] O termo “5’”, quando utilizado direcionalmente, se refere geralmente a uma região ou posição 5’ em um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo (a montante) de outra região ou posição no mesmo polinucleotídeo ou oligonucleotídeo.

[00027] O termo “cerca de” geralmente significa que o número exato não é crítico. Assim, o número de resíduos nucleosídeo nos oligonucleotídeos não é crítico, e os oligonucleotídeos contendo um ou dois resíduos nucleosídeo, ou de um a vários resíduos nucleosídeo adicionais, são previstos como equivalentes de cada uma das concretizações acima descritas.

[00028] O termo “agonista” geralmente se refere a uma substância que se liga a um receptor de uma célula e que induz uma resposta. Um agonista muitas vezes imita a ação de uma substância de ocorrência natural, tal como um ligante.

[00029] O termo “antagonista” geralmente se refere a uma substância que atenua ou inibe os efeitos de um agonista ou ligante.

[00030] O termo “adjuvante” geralmente se refere a uma substância que, quando adicionada a um agente imunogênico, tal como vacina ou antígeno, aumenta ou potencializa uma resposta imune ao agente no hospedeiro receptor mediante exposição à mistura.

[00031] O termo “inflamação das vias aéreas” geralmente inclui, sem restrição, asma.

[00032] O termo “alérgeno” geralmente se refere a um antígeno ou porção antigênica de uma molécula, geralmente uma proteína, que induz uma resposta alérgica mediante exposição a um indivíduo. Tipicamente, o indivíduo é alérgico ao alérgeno, conforme indicado, por exemplo, através do teste de pápula e rubor ou qualquer método conhecido no estado da técnica. Afirma-se que uma molécula é um alérgeno ainda que somente um pequeno subgrupo de indivíduos apresente uma resposta imune alérgica quando exposto à molécula.

[00033] O termo “alergia” geralmente se refere a uma resposta imune caracterizada por inflamação e inclui, sem restrição, alergias alimentares e alergias respiratórias.

[00034] O termo “antígeno” geralmente se refere a uma substância que é reconhecida e seletivamente ligada por um anticorpo ou por um receptor de antígeno de célula T, resultando em indução de uma resposta imune. Antígenos podem incluir, embora não se restrinjam a peptídeos, proteínas, nucleosídeos, nucleotídeos e suas combinações. Antígenos podem ser naturais ou sintéticos e geralmente induzem uma resposta imune que é específica para aquele antígeno.

[00035] Os termos “doença autoimune” e “distúrbio autoimune” geralmente se referem a doenças ou distúrbios nos quais os “próprios” componentes sofrem ataque do sistema imune.

[00036] O termo “doença mediada por TLR” ou “distúrbio mediado por TLR” geralmente significa qualquer condição patológica para a qual a ativação de um ou mais TLRs é um fator de contribuição. Tais condições incluem, embora não se restrinjam a câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamação das vias aéreas, distúrbios e doenças inflamatórias, doenças infecciosas, distúrbios dermatológicos, alergias, asma e doenças causadas por patógeno.

[00037] O termo “fisiologicamente aceitável” geralmente se refere a um material que não interfere com a eficácia de um composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção e que é compatível com um sistema biológico, tal como uma célula, cultura de células, tecido ou organismo. Preferivelmente, o sistema biológico é um organismo vivo, tal como um vertebrado ou mamífero.

[00038] O termo “portador” geralmente abrange qualquer excipiente, diluente, cargas, sal, tampão, estabilizante, solubilizante, óleo, lipídeo, vesícula contendo lipídeo, microesferas, encapsulação lipossomal, ou outro material conhecido no estado da técnica, para uso em formulações farmacêuticas. Fica entendido que as características do portador, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação específica. A preparação de formulações farmaceuticamente aceitáveis contendo esses materiais é descrita, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18o.edição, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

[00039] O termo “coadministração” geralmente se refere à administração de pelo menos duas substâncias diferentes de forma suficientemente próxima quanto ao tempo para modular, suprimir ou inibir uma resposta imune. Coadministração se refere à administração simultânea, bem como temporariamente espaçada com intervalo de até sete dias, de pelo menos duas substâncias diferentes em qualquer ordem, seja em dose única ou separada.

[00040] O termo “complementar” geralmente significa ter a capacidade de hibridização a um ácido nucleico. Essa hibridização é geralmente resultado de ligação de hidrogênio entre fitas complementares, preferivelmente para formar pares de bases Watson-Crick ou Hoogsteen, embora outros modos de ligação de hidrogênio, bem como empilhamento de base, possam também levar à hibridização.

[00041] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” geralmente se refere a uma quantidade suficiente para efetuar um efeito biológico desejado, tais como resultados benéficos. Assim, “quantidade eficaz” ou “quantidade suficiente” dependerá do contexto no qual o termo for empregado. No contexto de administrar um composto ou composição que module uma resposta imune a um antígeno coadministrado, uma quantidade eficaz de um composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção e antígeno é uma quantidade suficiente para atingir a modulação, inibição ou supressão desejada, em comparação com a resposta imune obtida quando o antígeno é administrado isoladamente. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

[00042] O termo “em combinação com” geralmente significa no decurso do tratamento de uma doença ou distúrbio em um paciente, administrar um composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção, e um agente útil para tratar a doença ou distúrbio que não diminua o efeito inibitório imune do composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção. O referido tratamento combinado pode também incluir mais de uma administração única de um composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção e/ou independentemente de um agente. A administração do composto ou composição de IRO, de acordo com a invenção, e/ou do agente pode ser através de vias iguais ou diferentes.

[00043] O termo “indivíduo” ou “sujeito” ou “vertebrado” geralmente se refere a um mamífero. Mamíferos geralmente incluem, embora não se restrinjam a humanos, primatas não humanos, ratos, camundongos, gatos, cães, cavalos, gado, vacas, porcos, ovelhas e coelhos.

[00044] O termo “inibidor de cinase” geralmente se refere a moléculas que antagonizam ou que inibem a sinalização de célula dependente de fosforilação e/ou vias de crescimento em uma célula. Inibidores de cinase podem ser sintéticos ou de ocorrência natural e incluem moléculas pequenas com potencial para serem administradas como agentes terapêuticos orais. Inibidores de cinase têm a capacidade de rápida e especificamente inibir a ativação das moléculas de cinase alvo. As proteínas cinase são alvos farmacológicos atrativos, em parte pelo fato de regularem uma grande variedade de vias de sinalização e crescimento e incluírem muitas proteínas diferentes. Como tal, possuem grande potencial no tratamento de doenças envolvendo sinalização de cinase, inclusive câncer, doença cardiovascular, distúrbios inflamatórios, diabetes, degeneração macular e distúrbios neurológicos. Exemplos de inibidores de cinase incluem sorafenib (Nexavar®) , Sutent®, dasatinib, DasatinibTM, ZactimaTM, TykerbTM e ST571.

[00045] O termo “nucleosídeo” geralmente se refere a compostos consistindo de um açúcar, geralmente ribose ou desoxirribose, e uma base de purina ou pirimidina.

[00046] O termo “nucleotídeo” geralmente se refere a um nucleosídeo compreendendo um grupo fosfato ligado ao açúcar.

[00047] Conforme aqui utilizado, o termo “pirimidina nucleosídeo” se refere a um nucleosídeo em que o componente base do nucleosídeo é uma base de pirimidina (ex: citosina (C) ou timina (T) ou Uracil (U)). De forma similar, o termo “purina nucleosídeo” se refere a um nucleosídeo em que o componente base do nucleosídeo é uma base de purina (ex: adenina (A) ou guanina (G)).

[00048] Os termos “análogo” ou “derivado” podem ser usados de forma intercambiável para geralmente se referir a qualquer purina e/ou pirimidina nucleotídeo ou nucleosídeo que tenha uma base e/ou açúcar. Base modificada é uma base que não guanina, citosina, adenina, timina, nem uracil. Um açúcar modificado é qualquer açúcar que não ribose ou 2’- desoxirribose e pode ser usado na cadeia principal para um oligonucleotídeo.

[00049] O termo “inibir” geralmente se refere a uma redução ou prevenção de uma resposta ou diferença qualitativa numa resposta, que poderia de outra forma decorrer da indução e/ou estímulo de uma resposta.

[00050] O termo “ligante não-nucleotídico” geralmente se refere a qualquer ligação ou porção que possa ligar ou ser ligada aos oligonucleotídeos que não através de uma ligação contendo fósforo. Preferivelmente, tal ligante tem de cerca de 2 Angstroms a cerca de 200 Angstroms de comprimento.

[00051] O termo “ligante nucleotídico” geralmente se refere a uma ligação 3’-5’ direta que conecta diretamente os grupos hidroxila 3’ e 5’ de dois nucleosídeos através de uma ligação contendo fósforo.

[00052] O termo “tratamento” geralmente se refere a uma abordagem visando obter resultados benéficos ou desejados, que pode incluir alívio de sintomas e/ou retardo e/ou melhora na progressão de uma doença ou distúrbio.

[00053] Em um primeiro aspecto, a invenção provê compostos de oligonucleotídeo imunorregulatório (IRO) conforme mostra a Tabela 2. O termo “IRO” se refere a um composto à base de oligonucleotídeo imunorregulatório que é um antagonista para TLR9, TLR7 e/ou TLR8. Na Tabela 2, os compostos de IRO possuem todas as ligações fosforotioato (PS) e todos os nucleotídeos são desoxinucleotídeos, salvo indicação em contrário. Tabela 2

G1 = 7-deaza-dG; C* = 5-Me-dC; G = 2’-O-Me-G; U = 2’-O-Me-U; dU = desoxi-U; G2 = AraG; C = 2’-O-Me-C; C* = 2’-Ome-5-Me-C; C6=2’-MOE-C; C7=2’O-Propargil-C

[00054] Em concretizações preferidas, o composto de IRO não é um oligonucleotídeo antisentido.

[00055] Em algumas concretizações, os oligonucleotídeos do composto de IRO podem ter de cerca de 6 a cerca de 35 resíduos nucleosídeo, preferivelmente de cerca de 9 a cerca de 30 resíduos nucleosídeo, mais preferivelmente de cerca de 11 a cerca de 23 resíduos nucleosídeo. Em algumas concretizações, os oligonucleotídeos possuem de cerca de 6 a cerca de 18 resíduos nucleotídeo. Em algumas concretizações, o composto de IRO tem 18 resíduos nucleotídeo de comprimento.

[00056] Em algumas concretizações, os compostos de IRO podem ser combinados com uma ou mais vacinas, antígenos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos antisentido, antagonista de TLR, peptídeos, proteínas, vetores de terapia gênica, vacinas de DNA, adjuvantes ou inibidores de cinase.

[00057] Em um segundo aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um composto de IRO, de acordo com a invenção, e um portador fisiologicamente aceitável.

[00058] Em concretizações deste aspecto da invenção, a composição pode ainda compreender uma ou mais vacinas, antígenos, anticorpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos antisentido, antagonista de TLR, peptídeos, proteínas, vetores de terapia gênica, vacinas de DNA, adjuvantes ou inibidores de cinase.

[00059] Em um terceiro aspecto, a invenção provê métodos para inibir ou suprimir indução de uma resposta imune mediada por TLR9, TLR7 e/ou TLR8 em um mamífero, tais métodos compreendendo administrar ao mamífero um composto de IRO de acordo com a invenção. Em algumas concretizações, o mamífero é um humano. Em concretizações preferidas, o composto de IRO é administrado a um mamífero necessitado de imunosupressão.

[00060] De acordo com este aspecto da invenção, um composto de IRO é capaz de suprimir uma resposta imune baseada em TLR9, TLR7 e/ou TLR8 a outro ligante de TLR ou agonista de TLR. Conforme discutido mais adiante nos Exemplos abaixo, a ativação de uma resposta imune baseada em TLR9, TLR7 e/ou TLR8 por um agonista de TLR ou ligante de TLR (por exemplo, um oligonucleotídeo imunoestimulatório) pode ser antagonizada, inibida, suprimida ou impedida pela administração simultânea, pré- e pós-administração de um composto de IRO, e tal antagonismo, inibição, supressão ou prevenção pode ser mantido por um período prolongado de tempo (por exemplo, dias) após administração. Essa propriedade benéfica da presente invenção tem uma vantagem singular para a prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio. Por exemplo, a aplicação de certos antagonistas TLR no curso de tratamento da doença pode causar imunoestimulação indesejada que um composto de IRO poderia antagonizar, suprimir, inibir ou impedir. A administração do IRO simultaneamente, pré- e/ou pós-administração do agonista TLR pode prover benefícios terapêuticos do agonista TLR, ao mesmo tempo antagonizando, suprimindo, inibindo ou impedindo o(s) efeito(s) colaterais indesejado(s). Adicionalmente, a pré-administração de um composto de IRO, de acordo com a invenção, poderia antagonizar, suprimir, inibir ou impedir uma resposta imune (por exemplo, uma reação alérgica) a um desafio subsequente ou posterior por um agonista TLR. Preferivelmente, um agonista TLR9, TLR7 e/ou TLR8.

[00061] Nos métodos de acordo com este aspecto da invenção, a administração do composto IRO, de acordo com a invenção, pode ser através de qualquer via apropriada, inclusive, sem restrição, parenteral, liberação em mucosa, oral, sublingual, transdérmica, tópica, inalação, intragástrica, intranasal, aerossol, intraocular, intratraqueal, intrarretal, vaginal, arma de genes, adesivo transdérmico, ou na forma de colírio e enxaguante bucal. A administração de composições terapêuticas do composto de IRO pode ser conduzida utilizando-se os procedimentos conhecidos nas dosagens e por períodos de tempo que sejam eficazes na redução de sintomas ou marcadores substitutos da doença. Quando administrada sistemicamente, a composição terapêutica é preferivelmente administrada em uma dosagem suficiente para obter concentração sanguínea de composto de IRO de cerca de 0,0001 micromolar a cerca de 100 micromolares. Mais preferivelmente, a administração sistêmica seria em uma dosagem suficiente para obter uma concentração sanguínea do composto de IRO de cerca de 0,001 micromolar a cerca de 10 micromolares. Para administração localizada, concentrações muito mais baixas que esta podem ser eficazes e as muito mais altas podem ser toleráveis. Preferivelmente, uma dosagem total de composto IRO varia de cerca de 0,001 mg por paciente por dia a cerca de 200 mg por kg de peso corpóreo por dia. Pode ser desejável administrar o composto de IRO, de acordo com a invenção, diariamente, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias ou semanalmente. Pode ser desejável administrar simultânea ou sequencialmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou mais composições terapêuticas contendo IRP da invenção a um indivíduo como episódio de tratamento único.

[00062] O composto de IRO pode opcionalmente ser ligado a e/ou combinado com um ou mais alérgenos e/ou antígenos (próprios ou estranhos), uma proteína imunogênica, tal como hemocianina de lapa (KLH) (“keyhole limpet”), subunidade de toxina B de cólera, ou qualquer outra proteína portadora imunogênica. IRO pode também ser usado em combinação com outros compostos (por exemplo, adjuvantes) inclusive, sem limitação, agonistas de TLR (ex: agonistas de TLR2, agonistas de TLR4, agonistas de TLR (ex: agonistas de TLR2, agonistas de TLR4, e agonistas de TLR9), adjuvante incompleto de Freund, KLH, monofosforil lipídeo A (MPL), alumínio, adjuvante de alumínio Merck (MAA), e saponinas, inclusive QS- 21 e imiquimod, ou suas combinações.

[00063] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção são úteis para estudos de modelo do sistema imune. Os métodos são também úteis no tratamento profilático ou terapêutico de doença em humano ou animal. Por exemplo, os métodos são úteis para aplicações pediátricas, em adulto, e vacina veterinária.

[00064] Em um quarto aspecto, a invenção provê métodos para tratar terapeuticamente um paciente que sofre de doença e distúrbio, para o qual a inibição de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 seria benéfica, tais métodos compreendendo administrar ao paciente um composto de IRO, de acordo com a invenção. Em várias concretizações, a doença ou distúrbio a ser tratado é câncer, um distúrbio autoimune, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, malária, doença de Lyme, infecções oculares, conjuntivite, distúrbios dermatológicos, psoríase, escleroderma, doença cardiovascular, aterosclerose, síndrome da fadiga crônica, sarcoidose, rejeição de transplante, alergia, asma ou doença causada por patógeno. Distúrbios autoimunes preferidos incluem, sem limitação, lúpus eritematoso, esclerose múltipla, diabetes melitus tipo I, síndrome do intestino irritável, doença de Crohn, artrite reumatóide, choque séptico, alopécia universal, encafalomielite disseminada aguda, doença de Addison, espondilite anquilosante, síndrome de anticorpo antifosfolipídeo, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, penfigóide bolhoso, doença de Chagas, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença celíaca, dermatomiosite, endometriose, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática, cistite intersticial, morfeia, miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotonia, pênfigo, anemia perniciosa, polimiosite, cirrose biliar primária, esquizofrenia, síndrome de Sjogren, arterite temporal (“arterite de célula gigante”), vasculite, vitiligo, vulvodinia e granulomatose de Wegener. Distúrbios inflamatórios preferidos incluem, sem limitação, inflamação das vias aéreas, asma, doenças autoimunes, inflamação crônica, prostatite crônica, glomerulonefrite, doença de Behcet, hipersensibilidades, doença intestinal inflamatória, lesão de reperfusão, artrite reumatóide, rejeição de transplante, colite ulcerativa, uveíte, conjuntivite, e vasculite. Patógenos incluem bactérias, parasitas, fungos, vírus, viróides, e príons. A administração é conduzida conforme descrito para o terceiro aspecto da invenção.

[00065] Em um quinto aspecto, a invenção provê métodos para prevenir uma doença ou distúrbio para a qual a inibição de TLR9, TLR7 e/ou TLR8 seria benéfica, tais métodos compreendendo administrar ao paciente um composto de IRO, de acordo com a invenção. Em várias concretizações, a doença ou distúrbio a ser prevenido é câncer, um distúrbio autoimune, inflamação das vias aéreas, distúrbios inflamatórios, doença infecciosa, malária, doença de Lyme, infecções oculares, conjuntivite, distúrbios dermatológicos, psoríase, escleroderma, doença cardiovascular, aterosclerose, síndrome da fadiga crônica, sarcoidose, rejeição de transplante, alergia, asma ou doença causada por patógeno. Distúrbios autoimunes preferidos incluem, sem limitação, lúpus eritematoso, esclerose múltipla, diabetes melitus tipo I, síndrome do intestino irritável, doença de Crohn, artrite reumatóide, choque séptico, alopécia universal, encafalomielite disseminada aguda, doença de Addison, espondilite anquilosante, síndrome de anticorpo antifosfolipídeo, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, penfigóide bolhoso, doença de Chagas, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença celíaca, dermatomiosite, endometriose, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática, cistite intersticial, morfeia, miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotonia, pênfigo, anemia perniciosa, polimiosite, cirrose biliar primária, esquizofrenia, síndrome de Sjogren, arterite temporal (“arterite de célula gigante”), vasculite, vitiligo, vulvodinia e granulomatose de Wegener. Distúrbios inflamatórios preferidos incluem, sem limitação, inflamação das vias aéreas, asma, doenças autoimunes, inflamação crônica, prostatite crônica, glomerulonefrite, doença de Behcet, hipersensibilidades, doença intestinal inflamatória, lesão de reperfusão, artrite reumatóide, rejeição de transplante, colite ulcerativa, uveíte, conjuntivite, e vasculite. Patógenos incluem bactérias, parasitas, fungos, vírus, viróides, e príons. A administração é conduzida conforme descrito para o terceiro aspecto da invenção.

[00066] Em qualquer um dos métodos, de acordo com o terceiro, quarto e quinto aspectos da invenção, o composto de IRO pode ser administrado em combinação com qualquer outro agente útil para tratar ou prevenir a doença ou condição que não elimine o efeito ou atividade antagonista imune, inibitório, supressivo ou de prevenção do composto de IRO. Em qualquer um dos métodos de acordo com a invenção, o agente útil para tratar ou prevenir a doença ou condição inclui, embora não se restrinja a uma ou mais vacinas, antígenos, anticorpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos antisentido, antagonista TLR, peptídeos, proteínas, vetores de terapia gênica, vacinas de DNA, adjuvantes ou inibidores de cinase. Por exemplo, no tratamento do câncer, é previsto que o composto de IRO pode ser administrado em combinação com um ou mais compostos quimioterapêuticos, agente terapêutico direcionado e/ou anticorpo monoclonal; e na prevenção de uma doença, é previsto que o composto de IRO pode ser administrado em combinação com uma ou mais vacinas. Alternativamente, o agente inclui vetores de DNA codificando o antígeno ou alérgeno. Nessas concretizações, os compostos de IRO da invenção podem atuar, de diversas maneiras, como adjuvantes e/ou produzir efeitos imunomoduladores diretos.

[00067] Os exemplos a seguir pretendem também ilustrar certas concretizações representativas da invenção e não pretendem limitar seu escopo. Por exemplo, ligantes-TLR representativos são mostrados nos exemplos a seguir, mas não restringem o escopo de ligantes para os quais os IROs da invenção atuam como antagonistas.

Exemplo 1 Síntese de Oligonucleotídeos contendo Porções Imunorregulatórias:

[00068] Todos os compostos de IRO da invenção foram sintetizados de acordo com procedimentos padrão (vide, por exemplo, publicação de patente americana No. 20040097719).

[00069] Os oligonucleotídeos foram sintetizados em uma escala de 1 μ M utilizando sintetizador de DNA automatizado (Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.), de acordo com procedimentos de síntese linear ou de síntese paralela (vide, por exemplo, Figs. 5 e 6 da publicação de patente americana No. 20040097719).

[00070] Desoxirribonucleosídeo fosforamiditas foram obtidas de (Aldrich-Sigma, St Louis, Mo). 1’,2’-didesoxirribose fosforamidita, propil-1-fosforamidita, 2-desoxiuridina fosforamidita, 1,3-bis-[5-(4,4’-dimetoxitritil)pentilamidil]- 2-propanol fosforamidita e metil fosforamidita foram obtidos de Glen Research (Sterling, Va), beta-L-2’- desoxirribonucleosídeo fosforamidita, alfa-2’- desoxirribonucleosídeo fosforamidita, mono-DMT-glicerol fosforamidita e di-DMT-glicerol fosforamidita foram obtidos de ChemGenes (Willmington, Mass.). (4-aminobutil)-1,3- propanodiol fosforamidita foi obtido de Clontech (Palo Alto, Calif.) Arabinoguanosina foi obtida de Reliable Pharmaceutical (St. Louis, Mo.). Arabinoguanosina fosforamidita foi sintetizada na Idera Pharmaceuticals, Inc. (Cambridge, Mass.) (Noronha et al. (2000) Biochem., 39:7050- 7062).

[00071] Todas as nucleosídeo fosforamiditas foram caracterizadas por espectros NMR 31P e 1H. Nucleosídeos modificados foram incorporados em sítios específicos utilizando ciclos normais de acoplamento. Após síntese, os oligonucleotídeos foram desprotegidos utilizando hidróxido de amônio concentrado e purificados através de HPLC de fase reversa, seguido por diálise. Oligonucleotídeos purificados na forma de sal sódico foram liofilizados antes do uso. A pureza foi testada com CGE e MALDI-TOF MS.

Exemplo 2 Inibição in vivo da estimulação de TLR7 e TLR9

[00072] Camundongos C57BL/6 foram injetados subcutaneamente na axila esquerda com 5 mg/kg de um composto de IRO em 0 hora e 0,25 mg/kg de agonista de TLR9 ou 10 mg/kg de agonista TLR7 em 24 horas. Amostras de soro foram coletadas 2 horas após injeção do agonista de TLR9 ou TLR7, sendo a concentração de IL-12 determinada por ELISA. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Esses resultados demonstram que compostos de IRO, de acordo com a invenção, podem inibir a atividade in vivo de TLR7 e/ou TLR9 e mais geralmente que os compostos de IRO, de acordo com a invenção, podem inibir a ativação de TLR.

Exemplo 3 Estudo in vivo de antagonista de TLR7/TLR8

[00073] Camundongos fêmea C57BL/6 (2/grupo) foram injetados subcutaneamente com 5 mg/kg de composto antagonista em 0 hora no flanco direito. Os camundongos foram então injetados com agonistas TLR9 (0,25 mg/kg) ou TLR7 (10 mg/kg) em 24 horas no flanco esquerdo. O sangue foi coletado por sangramento orbital 2 horas após administração do agonista. As respostas de citocina/quimiocina foram então avaliadas em amostras de soro através de ensaios multiplex utilizando o sistema XMAP Luminex. Os resultados são mostrados nas Figuras 1 e 2.

Exemplo 4 Ensaios de cultura celular de células HEK293 expressando TLR4, 7, 8 e 9:

[00074] Células de rim humano embrionário (HEK)293 expressando de forma estável TLR4/CD14/MD-2 ou mTLR9 humano e células HEK293 XL humanas expressando de forma estável TLR7 ou TLR8 humano foram obtidas da Invivogen (San Diego, CA). Células HEK foram transitoriamente transfectadas com gene repórter (SEAP, Invivogen) por 6 horas. Agonistas de TLR apropriados foram adicionados às culturas na presença ou ausência de várias concentrações de antagonistas, e as culturas prosseguiram por 18 horas. No final do tratamento, 20 ml de sobrenadante de cultura foram coletados de cada tratamento e testados quanto à atividade SEAP utilizando 150 ml de substrato Quanti-Blue de acordo com protocolo do fabricante (Invivogen). Os resultados são calculados como dupla mudança na ativação de NF-KB em relação a células tratadas com PBS, sendo determinados valores de concentração inibitória (IC50) em 50%. Os resultados são mostrados na Figura 3.

Claims

1. Composto de oligonucleotídeo imunorregulatório, ou seja, um composto IRO, caracterizado pelo fato de ser da sequência 5’-C*TATC*TGUC*G1TTC*TC*TGU-3’, onde G1 = 7-deaza-dG; C* = 5- Me-dC; G = 2’-O-Me-G; e U = 2’-O-Me-U.

2. Composto IRO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as ligações de internucleosídeo do referido composto serem ligações fosforotioato.

3. Composto IRO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o citado composto estar na forma de um sal de sódio.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto IRO conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um portador farmaceuticamente aceitável.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de a referida composição farmacêutica compreender adicionalmente uma ou mais vacinas, antígenos, anticorpos, agentes citotóxicos, alérgenos, antibióticos, oligonucleotídeos antissentido, antagonistas de TLR, peptídeos, proteínas, vetores de terapia gênica, vacinas de DNA, ou adjuvantes.

6. Uso do composto IRO ou da composição farmacêutica, conforme respectivamente definidos nas reivindicações 1 a 3, ou 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ser dirigido à produção de um medicamento para inibir uma resposta imune mediada por TLR9-, TLR7- e/ou TLR8 em um mamífero.

7. Uso do composto IRO ou da composição farmacêutica, conforme respectivamente definidos nas reivindicações 1 a 3, ou 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ser dirigido à produção de um medicamento para inibir a atividade de um agonista de TLR9, TLR7 ou TLR8.

8. Uso do composto IRO ou da composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de dito uso do referido composto ou da citada composição farmacêutica ser antes do ou ao mesmo tempo que de um agonista de TLR9, TLR7 ou TLR8.

9. Uso do composto IRO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 ou uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de serem usados para a produção de um medicamento útil no tratamento e prevenção de uma doença autoimune selecionada a partir do grupo consistindo de psoríase, artrite reumatóide, alopécia universal, encefalomielite disseminada aguda, doença de Addison, espondilite anquilosante, síndrome de anticorpo antifosfolipídeo, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, penfigóide bolhoso, doença de Chagas, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença celíaca, dermatomiosite, endometriose, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática, cistite intersticial, morfeia, miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotonia, pênfigo, anemia perniciosa, polimiosite, cirrose biliar primária, esquizofrenia, síndrome de Sjogren, arterite temporal, vasculite, vitiligo, vulvodinia, granulomatose de Wegener, lúpus eritematoso, esclerose múltipla, diabetes mielitus tipo I, síndrome do intestino irritável, doença de Crohn e choque séptico em um paciente.

10. Uso do composto IRO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3 ou uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de serem usados para a produção de um medicamento útil no tratamento e prevenção de câncer em um paciente.

11. Uso do composto IRO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, ou uma composição farmacêutica, conforme definida nas reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de serem usados para a produção de um medicamento útil no tratamento e prevenção de um distúrbio inflamatório selecionado a partir do grupo consistindo de inflamação das vias aéreas, asma, doenças autoimunes, inflamação crônica, prostatite crônica, glomerulonefrite, doença de Behcet, hipersensibilidades, doença intestinal inflamatória, lesão de reperfusão, artrite reumatóide, rejeição de transplante, colite ulcerativa, uveíte, conjuntivite e vasculite em um paciente.

12. Uso do composto IRO ou composição farmacêutica, conforme definido respectivamente em qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de serem usados para a produção de um medicamento de liberação via parenteral, liberação em mucosa, oral, sublingual, transdérmica, tópica, inalação, intranasal, aerossol, intraocular, intratraqueal, intrarretal, vaginal, por arma de genes, adesivo dérmico, ou na forma de colírio e enxaguante bucal.