BR112015014897B1 - Uso de uma sequência de peptídeo quimérico - Google Patents
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Abstract
USO DE UMA SEQUÊNCIA DE PEPTÍDEO QUIMÉRICO, MÉTODO PARA IDENTIFICAR UMA SEQUÊNCIA PEPTÍDICA QUE MODULA A HO MEOSTASE DE ÁCIDOS BILIARES A invenção refere-se a variantes e fusões do fator de crescimento de fibroblastos 19 (FGF19), variantes e fusões do fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21), fusões de FGF19 e/ou FGF21, e variantes ou fusões de proteínas e sequências peptídicas de FGF19 e/ou FGF21 (e peptidomiméticos), possuindo uma ou mais atividades, tal como a atividade de modulação da homeostase de ácido biliar, e métodos e usos no tratamento do ácido biliar e outras desordens.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido dos EUA de N° de Série 61/746.499 depositado em 27 de dezembro de 2012, pedido dos EUA de N° de Série 61/779.604 depositado em 13 de março de 2013, e pedido dos EUA de N° de Série 61/887.129 depositado em 04 de outubro de 2013, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0002] A invenção refere-se a variantes de proteínas e sequências peptídicas do fator de crescimento de fibroblastos 19 (FGF19) (e peptidomiméticos) e fusões de proteínas e sequências peptídicas de FGF19 e/ou fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21) (e peptidomiméticos), e variantes de fusões de proteínas e sequências peptídicas de FGF19 e/ou FGF21 (e peptidomiméticos) que modulam a homeostasia de ácido biliar, e métodos e uso das variantes e fusões no tratamento de distúrbios relacionados e associados ao ácido biliar.
[0003] Os ácidos biliares, ácidos esteroides que são predominantemente encontrados na bílis de mamíferos, regulam o colesterol, triglicerídeos, glicose e homeostase da energia, e facilitam a digestão e absorção de lipídios no intestino delgado. A emulsificação de lipídios e de vitaminas solúveis em gordura no intestino permite a formação de micelas que podem então ser transportadas através do sistema lácteo. Outras funções dos ácidos biliares incluem a condução do fluxo de bílis para eliminar catabólitos do fígado e ajudar na redução da flora de bactérias encontrada no intestino delgado e das vias biliares. Os ácidos biliares também estão envolvidos na regulação da sua própria síntese e circulação entero-hepática. Ver, por exemplo, Staels et al., Diabetes Care (2009) vol. 32 no. suppl 2 S237- S245.
[0004] Em seres humanos, a produção de ácidos biliares ocorre principalmente nos hepatócitos perivenosos através de uma série de reações enzimáticas que convertem o colesterol nos dois ácidos biliares primários, ácido cólico e ácido quenodesoxicólico. Os ácidos biliares primários são sintetizados por duas vias distintas. Na via "clássica" ou "neutra", os ácidos biliares primários são produzidos por hidroxilação de colesterol através de catálise pela enzima do citocromo P450 colesterol 7α- hidroxilase (cyp7a1), que cataliza a primeira e limitante (em velocidade) etapa na via de síntese do ácido biliar clássica. (Ver, por exemplo, Inagaki et al., Cell Metabolism 2:217-25 (Oct 2005).
[0005] Tal como descrito mais adiante, a atividade de cyp7a1 é regulada para baixo pelo ácido cólico e regulada para cima por colesterol; assim, cyp7a1 é regulada pelos próprios ácidos biliares. A conversão de colesterol em ácidos biliares é efetuada principalmente por esta via. Além disso, na maior parte dos indivíduos, aproximadamente, 6% dos ácidos biliares são sintetizados por uma via "alternativa" ou "ácida". Esta via é regulada pela enzima cyp27a1, que converte oxiesterois para ácidos biliares. Em contraste à cyp7a1, a cyp27a1 não é regulada pelos próprios ácidos biliares.
[0006] Quando o ácido cólico e o ácido quenodesoxicólico são secretados para o lúmen do intestino, as bactérias intestinais desidroxilam uma porção de cada para formar os ácidos biliares secundários, ácido desoxicólico (derivado do ácido cólico) e ácido litocólico (derivado do ácido quenodesoxicólico). Células hepáticas podem conjugar estes quatro biliares com um dos dois aminoácidos, glicina ou taurina, para formar um total de oito possíveis ácidos biliares conjugados, referidos como sais biliares. Assim, no total os principais ácidos biliares são ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido deoxicólico e ácido litocólico. Todos os quatro destes ácidos biliares podem ser transportados de volta para a corrente sanguínea, serem devolvidos para o fígado, e serem re-secretados através da circulação entero-hepática. Ver, por exemplo, Staels et al., Diabetes Care (2009) vol. 32 suppl 2 S237-S245.
[0007] Os ácidos biliares primários (ácido cólico e ácido quenodesoxicólico) são sintetizados no fígado, enquanto os ácidos biliares secundários (ácido deoxicólico e ácido litocólico) são feitos por bactérias. Os quatro ácidos biliares são secretados para o lúmen biliar canalicular para armazenamento na vesícula biliar como micelas misturadas com fosfolipídios e colesterol. Após a ingestão de uma refeição, a colecistoquinina estimula a contração da vesícula biliar, resultando na sua liberação de ácidos biliares micelares para o lúmen intestinal para ajudar a digestão. A circulação enterro- hepática permite que ~90-95% de ácidos biliares sejam reabsorvidos do íleo distal e transportados de volta para o fígado; esta absorção de ácidos biliares e transporte ocorre principalmente pelos hepatócitos pericentrais. Os cerca de 5% de ácidos biliares que não são reabsorvidos são eliminados nas fezes, e essa quantidade de perda é subsequentemente substituída por síntese de novo dos ácidos biliares no fígado. Ver, por exemplo, Rose et al., Cell Metabolism, 14:1, pp 123-130 (6 July 2011).
[0008] Os ácidos biliares primários (ácido quenodesoxicólico e ácido cólico) são ligantes/ativadores fisiológicos do receptor farnesoide X (FXR), receptor pregnano X (PXR) e receptor do androstano constitutivo (CAR), e o ácido litocólico é um ligante para o receptor da vitamina D (VDR) e o receptor acoplado à proteína G TGR5. FXR demonstra uma elevada seletividade para os ácidos biliares; inversamente, PXR e CAR atuam em cima de uma série de receptores que integram a homeostase de lipídios com o metabolismo xenobiótico. FXR, PXR, CAR e TGR5 exercem atividades sinérgicas na regulação da homeostase da glicose e de lipídios e gasto de energia, bem como na regulação do fígado e sensibilidade periférica à insulina. Como surfactantes ou detergentes, os ácidos biliares são potencialmente tóxicos para as células, e o tamanho do pool de ácidos biliares é estreitamente regulado no fígado e no intestino para evitar a acumulação citotóxica. Quando o tamanho do pool de ácidos biliares aumenta, um mecanismo de feedback que envolve a interação de vários receptores nucleares, incluindo FXR, é ativado para inibir a síntese de novo de ácidos biliares. Ver, por exemplo, Fiorucci et al., Prog Lipid Res. 2010, Abril; 49(2):171-85. Epub 2 Dez 2009.
[0009] A síntese de ácidos biliares no fígado é regulada negativamente pelo hormônio FGF19. O FGF19 é secretado a partir do intestino e sinaliza ao fígado para reprimir CYP7A1. Em comparação, a ativação de FXR intestinal devido ao fluxo de ácido biliar transintestinal após uma refeição também induz a expressão de FGF19, que é liberado por células epiteliais do intestino delgado e circula para se ligar aos receptores de receptor FGF de hepatócitos 4 (FGFR4); os receptores FGFR4 sinalizam uma redução na síntese de ácidos biliares através da ativação da via da quinase c-Jun-NH2-terminal (JNK). A repressão de CYP7A1 resulta na diminuição da síntese de ácidos biliares a partir do colesterol intra-hepático em resposta ao ciclo de alimentação-jejum diário.
[0010] Tal como aqui descrito, a homeostasia anormal de ácido biliar pode resultar em, ou exacerbar, uma série de distúrbios, incluindo colestase, derivação portosistêmica, doença de Crohn, e displasia microvascular hepática. Além disso, os ácidos biliares desempenham um papel na modulação da síndrome metabólica, um conjunto de fatores de risco de doenças cardiovasculares que incluem obesidade visceral, resistência à insulina, dislipidemia, aumento da pressão sanguínea, e hipercoagulabilidade. Assim, a modulação da atividade do ácido biliar pode proporcionar uma série de efeitos terapêuticos benéficos.
[0011] A ativação do FXR por ácidos biliares (ou agonistas de FXR não esteroides sintéticos) reduz os triglicerídeos no plasma e tem demonstrado melhorar a hiperglicemia em ratos diabéticos. Os ácidos biliares também podem regular o gasto de energia de um modo independente de FXR em ratinhos através da ativação do receptor acoplado à proteína G TGR5. Assim, a modulação da atividade de FXR e do metabolismo de ácidos biliares pode fornecer uma abordagem terapêutica para o tratamento de, por exemplo, a síndrome metabólica e diabetes tipo 2. Ver, por exemplo, Lefebvre et al., Physiol Rev. 2009 Jan;89(1):147-91.
[0012] A síntese de ácidos biliares (juntamente com ressecção do íleo) interrompe a circulação entero-hepática dos ácidos biliares, diminui o colesterol total e de LDL no plasma e aumenta os níveis de colesterol HDL, apolipoproteína (apo)-AI, e triglicerídeos. Como uma consequência direta de interromper o retorno de ácidos biliares no fígado, a expressão de CYP7A1 torna-se desreprimida, e a conversão de colesterol em ácidos biliares é estimulada. Assim, os agentes que sequestram os ácidos biliares no intestino (por exemplo, colestiramina) impedem a sua reabsorção, resultando em, como um mecanismo de compensação, mais colesterol endógeno sendo desviado para a produção de ácidos biliares, levando a níveis reduzidos de colesterol.
[0013] A depleção de colesterol hepático devido ao aumento do desvio para a síntese de ácidos biliares leva ao aumento da expressão do receptor de LDL hepático, o que resulta na expressão do receptor de LDL que leva em conta a diminuição nos níveis de colesterol total e LDL produzidos por síntese de ácido biliar ou ressecção ileal. Acredita-se haver um papel regulador independente para FXR em ambos colesterol HDL e metabolismo de triglicerídeos.
[0014] Como referido, a síntese de ácidos biliares também foi descoberta ser associada com diabetes do tipo 2. Uma série de fatores pode contribuir para a regulação da glicemia, incluindo os efeitos na dimensão e composição do pool de ácidos biliares, alterações mediadas por FXR na produção hepática de glicose e absorção intestinal da glicose, influências sobre a sensibilidade periférica à insulina, efeitos de incretinas, e uso de energia. Não apenas é a modulação da síntese de ácidos biliares útil no tratamento de diabetes, como também pode encontrar utilidade clínica no tratamento de pré-diabetes.
[0015] O excesso de concentrações de ácidos biliares no cólon, resultantes, por exemplo, da má absorção de ácidos biliares, é uma causa da diarreia crônica. Quando grandes quantidades de ácidos biliares entram no cólon, elas estimulam a secreção de água e a motilidade intestinal causando diarreia crônica, uma condição referida como uma diarreia de ácido biliar (BAD). Mais particularmente, quando a expressão intestinal dos transportadores dos ácidos biliares é reduzida, o intestino é menos eficiente na reabsorção de ácidos biliares (má absorção de ácidos biliares Tipo 1). Da mesma forma, se a motilidade intestinal é afetada por cirurgia gastrointestinal, ou ácidos biliares são desconjugados pelo supercrescimento bacteriano no intestino delgado, a absorção é menos eficiente (má absorção de ácidos biliares Tipo 3). Há também um grupo muito pequeno de pacientes que não apresentam quaisquer sinais óbvios de doença (má absorção de ácidos biliares tipo 2). (Ver de forma geral, Walters et al., Clin. Gastroenterol Hepatol. 7:1189-94 (Nov 2009)).
[0016] O estado da colestase é causado por interrupção aguda ou crônica na excreção de bílis (por meio, por exemplo, obstrução), dentro ou fora do fígado. A falha para formar a bile resulta em lesão hepática colestática progressiva e morte. A obstrução faz com que sais biliares, pigmentos biliares, bilirrubina e lipídios se acumulem na corrente sanguínea em vez de serem eliminados normalmente. Os sintomas da colestase crônica incluem descoloração da pele, cicatrizes ou lesões de pele causadas por arranhões, dor óssea, xantoma, ou xantelasma. Pacientes com colestase avançada se sentem mal, se cansam facilmente, e muitas vezes têm náuseas. Dor abdominal e sintomas sistêmicos tais como anorexia, vômitos e febre são geralmente devidos à doença subjacente que causa a colestase.
[0017] A colestase intra-hepática é geralmente causada por hepatite ou por medicamentos que produzem sintomas semelhantes à hepatite. Agentes derivados da fenotiazina, inclusive clorpromazina, podem causar febre repentina e inflamação, embora os sintomas geralmente desapareçam após a interrupção dos agentes. Em casos raros, uma condição que se assemelha a cirrose biliar crônica, discutida mais abaixo, persiste mesmo após a interrupção da medicação. Alguns pacientes experimentam uma reação semelhante em resposta a, por exemplo, os antidepressivos tricíclicos (por exemplo, amitriptilina e imipramina) e fenilbutazona. A colestase intra-hepática também pode ter outras causas, incluindo a doença hepática alcoólica, cirrose biliar primária, e o câncer que sofreu metástase.
[0018] Em comparação, existem várias origens de colestaseextra-hepática, incluindo como um efeito adverso de certos medicamentos, uma complicação da cirurgia, lesão grave, infecção destruindo tecido, ou alimentação intravenosa. A colestase extra-hepática pode ser causada por condições tais como tumores e cálculos biliares que bloqueiam o fluxo da bílis a partir da vesícula biliar para o duodeno (por exemplo, por uma pedra obstruindo o ducto biliar comum). A colestase extra-hepática também pode ser causada por câncer do pâncreas e, menos frequentemente, como um resultado de estreitamento não canceroso do duto comum, carcinoma ductal, ou distúrbios do pâncreas.
[0019] Os sintomas de ambas colestase intra-hepática e extra-hepática incluem icterícia, urina escura e fezes claras. O prurido sobre a pele pode ser grave se a condição é avançada.
[0020] A colestase intra-hepática da gravidez (ICP) desenvolve-se frequentemente durante os segundo e terceiro trimestres da gravidez, e é a segunda causa mais comum de icterícia durante a gravidez. Embora os sintomas geralmente desapareçam dentro de duas a quatro semanas após o nascimento do bebê, eles podem reaparecer se a mãe posteriormente se tornar novamente. Uma condição similar afeta algumas mulheres que tomam contraceptivos orais, mas os sintomas desaparecem após a cessação do uso de contraceptivos orais.
[0021] Erros inatos da síntese de ácidos biliares são doenças genéticas raras que às vezes se apresentam como colestase neonatal. São caracterizadas por uma incapacidade de produzir ácidos biliares normais e uma acumulação de ácidos biliares pouco comuns e intermediários de ácido biliar. Se não diagnosticados ou se forem diagnosticados incorretamente, esses erros inatos podem resultar em insuficiência hepática ou doença hepática crônica progressiva.
[0022] A colestase induzida por drogas pode ser uma complicação da quimioterapia ou de outras medicações. Os dois principais tipos de colestase induzida por drogas são reações idiossincráticas e lesão tóxica direta. Reações idiossincráticas podem ocorrer no início de tratamento ou posteriormente. As respostas alérgicas são variadas e não estão relacionadas com a quantidade de medicamento que é tomado.
[0023] Na lesão tóxica direta, a gravidade dos sintomas é paralela à quantidade de medicamento envolvido. Esta condição se desenvolve em um curto período de tempo depois do início do tratamento, segue um padrão previsível, e normalmente provoca danos no fígado. Reações tóxicas diretas se desenvolvem em 1% de todos os pacientes que tomam clorpromazina.
[0024] A rara condição de colestase recorrente familial benigna é caracterizada por breves episódios repetidos de prurido e icterícia, embora os sintomas frequentemente desapareçam e a condição não causa cirrose. (Ver em geral, Rose et al., Cell Metabolism 14(1):123-30 (July 2011).
[0025] A cirrose biliar primária (PBC) é uma doença hepática progressiva que resulta de uma destruição autoimune das vias biliares que transportam os ácidos biliares para fora do fígado, resultando na colestase. Conforme a doença progride, o acúmulo tóxico persistente de ácidos biliares causa danos progressivos ao fígado marcados por inflamação crônica e fibrose.
[0026] Enquanto PBC é rara, é a doença hepática colestática mais comum e é a quinta causa mais comum de transplante de fígado nos Estados Unidos. A maioria dos pacientes PBC são assintomáticos no momento do diagnóstico inicial, mas a maioria desenvolve sintomas tais como fadiga e prurido, ao longo do tempo. A icterícia pode resultar da doença avançada. Embora não seja necessário, uma biópsia do fígado pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico de PBC, e a bilirrubina é frequentemente monitorada para fornecer uma indicação da função hepática. Níveis séricos elevados de ALP, uma enzima liberada por células hepáticas em resposta à toxicidade mediada por ácidos biliares, são de forma geral cuidadosamente monitorizados em pacientes como um indicador da resposta ao tratamento e prognóstico.
[0027] Apesar de receber ursodiol, o padrão de cuidado terapêutico para PBC, uma porção significativa de pacientes em PBC declarada avançada irão progredir para insuficiência hepática, transplante ou morte dentro de cinco a dez anos. Como resultado, terapias alternativas estão atualmente sendo avaliadas. Um agente potencialmente promissor é OCA, é um análogo do ácido biliar e agonista de FXR derivado do ácido biliar primário humano do ácido quenodesoxicólico, ou CDCA. OCA está sendo avaliado para pacientes com uma resposta terapêutica inadequada ao ursodiol ou que são incapazes de tolerar ursodiol (Intercept Pharmaceuticals, Nova Iorque).
[0028] A colangite esclerosante primária é um processo inflamatório fibrosante crônico que resulta na destruição da árvore biliar e cirrose biliar. As estenoses estão localizadas em ambos os dutos intra e extra-hepáticos em mais de 80% dos pacientes, mas cerca de 10% destes pacientes têm apenas estenoses intra-hepáticas, enquanto que menos de 5% terá apenas estenoses extra-hepáticas. Remissões e recaídas caracterizam o curso da doença. Embora a causa da colangite esclerosante primária seja desconhecida, acredita-se que os danos para o ducto biliar ocorram através de uma ou mais das anormalidades genéticas de regulação imune, infecções virais, toxinas de bactérias intestinais, bactérias no sistema venoso portal, lesão vascular isquêmica, e ácidos biliares tóxicos das bactérias intestinais.
[0029] A maioria dos pacientes com colangite esclerosante primária tem doença subjacente inflamatória do intestino (colite ulcerosa ou doença de Crohn). Os pacientes são mais propensos a ter a colite ulcerosa do que a doença de Crohn (85% versus 15%), com cerca de 2,5-7,5% de todos os pacientes com colite ulcerativa possuindo colangite esclerosante primária. A colangite esclerosante primária pode permanecer quiescente por longos períodos de tempo em alguns pacientes; na maioria dos casos, no entanto, é progressiva.
[0030] A prevalência da colangite esclerosante primária nos Estados Unidos é de aproximadamente 1-6 casos por 100.000 habitantes, e a grande maioria é caucasiana. Aproximadamente 75% dos pacientes com colangite esclerosante primária são homens com uma idade média de cerca de 40 anos no momento do diagnóstico. A gestão desta doença nos estágios iniciais envolve a utilização de medicamentos para prevenir a progressão da doença. Abordagens endoscópicas e cirúrgicas são reservadas para a época em que os sintomas se desenvolvem. O transplante de fígado pode vir a ser necessário e oferece a única chance de cura completa. Os pacientes com colangite esclerosante primária apresentam um risco aumentado para o colangiocarcinoma (10-15%).
[0031] A maioria dos pacientes com colangite esclerosante primária não apresentam sintomas e são geralmente diagnosticados pela detecção de testes bioquímicos anormais da função hepática em exames de sangue de rotina. Quando os sintomas se desenvolvem, eles são um resultado da obstrução ao fluxo biliar e incluem icterícia, prurido, dor no quadrante superior direito do abdome, febre, e calafrios. Os sintomas podem incluir perda de peso e fadiga. Os pacientes podem permanecer assintomáticos durante muitos anos apesar da presença de doença avançada, e o desenvolvimento de sintomas normalmente sugere a presença de doença avançada.
[0032] A má absorção de ácidos biliares é facilmente diagnosticada pelo teste de medicina nuclear de SeHCAT (ácido 23-seleno-25-homo-tauro-cólico (taurina de ácido homocólico de selênio ou ácido tauroselcólico)). Um teste de diagnóstico alternativo envolve a medição no soro de 7-alfa-hidroxi-4- colesteno-3-ona, um precursor do ácido biliar.
[0033] Sequestrantes dos ácidos biliares (por exemplo, colestiramina e colestipol que são em forma de pó) são os principais agentes usados para tratar a má absorção de ácidos biliares. Infelizmente, muitos pacientes não toleram colestiramina e colestipol, muitas vezes por causa da má textura e sabor do pó de resina. Felizmente, o sequestrador dos ácidos biliares colesevelam está disponível em forma de comprimido e é frequentemente melhor tolerado.
[0034] Todos os sequestrantes dos ácidos biliares são capazes de se ligar a outros compostos, e também é possível que deficiências de vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K) possam ocorrer, o que requer a administração de suplementos vitamínicos.
[0035] A terapia de deslocamento e reposição também tem se mostrado útil em certas desordens associadas com a homeostase de ácido biliar. Na terapia de deslocamento, a composição dos ácidos biliares em circulação é alterada, ou para diminuir a citotoxicidade de ácidos biliares endógenos ou para modular o metabolismo do colesterol para diminuir a secreção biliar de colesterol. Por outro lado, a substituição de ácido biliar tem como objetivo corrigir uma deficiência de ácido biliar.
[0036] Foi demonstrado que a administração do ácido biliar primário ácido quenodesoxicólico (CDCA) diminui a secreção biliar de colesterol e a dissolução gradual dos cálculos biliares. CDCA foi gradualmente substituído por ácido ursodesoxicólico (UDCA) porque o último não resultou em qualquer hepatotoxicidade. O ácido quenodesoxicólico é ligeiramente hepatotóxico em seres humanos, mas em certos animais é altamente hepatotóxico. Apesar da eficácia e segurança da administração de UDCA para a dissolução do cálculo biliar de colesterol, não é frequentemente usada hoje por causa do sucesso da colecistectomia laparoscópica, que fornece uma cura rápida para a doença sintomática. A terapia médica, em contraste, requer meses de terapia, nem sempre dissolve pedras, e é seguida por recorrência gradual em alguns pacientes.
[0037] A terapia de UDCA tem mostrado melhorar os resultados do teste do fígado em pacientes com cirrose biliar primária, um efeito que provavelmente envolve mecanismos múltiplos. A terapia de UDCA também tem mostrado efeitos favoráveis em outras condições de colestase, tais como colestase associada à gravidez e colestase associada à nutrição parenteral total.
[0038] A substituição dos ácidos biliares é usada em erros inatos da biossíntese de ácido biliar, geralmente com uma mistura de ácido quenodesoxicólico (CDCA) ou ácido ursodesoxicólico (UDCA) e ácido cólico, para suprimir a síntese de precursores de ácidos biliares citotóxicos e restaurar a entrada dos ácidos biliares primários para a circulação entero-hepática.
[0039] Em pacientes com a síndrome do intestino curto, uma deficiência de ácido biliar ocorre no intestino delgado proximal, levando a solubilização micelar debilitada. Isto, mais a área de superfície diminuída e o tempo de trânsito rápido, leva à grave má absorção de gordura. Colilsarcosina (colil-N- metilglicina), um análogo de ácido biliar sintético, tem demonstrado aumentar a absorção de lipídios em um paciente com síndrome do intestino curto, e é resistente à desconjugação e desidroxilação.
[0040] Os doentes com diarreia de ácido biliar secundária a ileíte de Crohn serão ajudados com tratamento de glicocorticoides, e a colite microscópica também é ajudada por esteroides. A administração de budesonida e outros agentes, incluindo antibióticos, são úteis em certas situações.
[0041] Tal como descrito acima, o tratamento de PBC geralmente implica na administração de ursodiol, embora terapias alternativas estejam sendo avaliadas para pacientes com uma resposta terapêutica inadequada ao ursodiol ou que são incapazes de tolerar ursodiol.
[0042] Consequentemente, existe uma necessidade pelo tratamento de distúrbios de ácidos biliares, tais como os distúrbios anteriores e incluindo, mas não limitados a: síndrome metabólica; uma desordem de lipídio ou de glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, cirrose biliar primária (PBC), colestase intra-hepática familiar primária (PFIC) (por exemplo, PFIC progressiva), coangite esclerosante primária (PSC), colestase intra-hepática da gravidez (PIC), colestase neonatal e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar a partir de tumor, bloqueio do ducto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), desordens prejudicando a absorção de ácidos biliares não caracterizadas de outra forma (idiopáticas) levando a diarreia (por exemplo, diarreia de ácidos biliares (BAD)), sintomas gastrointestinais, cânceres gastrointestinais, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon, câncer hepatocelular); anormalidades de síntese de ácido biliar, tais como as que contribuem para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose e hipertensão portal; por exemplo, em mamíferos, tais como humanos. A presente invenção satisfaz essa necessidade e proporciona vantagens relacionadas.
[0043] A invenção é baseada, em parte, em variantes de sequências peptídicas de FGF19, fusões de FGF19 e/ou sequências peptídicas variantes de FGF21 e variantes de fusões (quimeras) de FGF19 e/ou sequências peptídicas de FGF21 possuindo uma ou mais atividades, tal como a atividade de modulação da homeostase de ácido biliar. Tais variantes e fusões (quimeras) de FGF19 e/ou sequências peptídicas de FG21 incluem sequências que são utilizadas para o tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar. Tais variantes e fusões (quimeras) de FGF19 e/ou sequências peptídicas de FGF21 também incluem sequências que não aumentam ou induzem substancialmente ou significativamente a formação de carcinoma hepatocelular (HCC) ou tumorigênese de HCC. Tais variantes e fusões (quimeras) de FGF19 e/ou sequências peptídicas de FGF21 ainda incluem sequências que não induzem uma elevação substancial ou aumento no perfil lipídico.
[0044] Numa concretização, um método ou utilização da modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar inclui: administração de uma sequência peptídica quimérica, que compreende: a) uma região N-terminal que compreende pelo menos sete resíduos de aminoácidos, a região N-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região N-terminal compreende DSSPL ou DASPH; e b) uma região C-terminal compreendendo uma porção de SEQ ID NO: 99 [FGF19], a região C-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região C-terminal compreende os resíduos de aminoácidos 16-29 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] (WGDPIRLRHLYTSG; SEQ ID NO: 169), em que o resíduo W corresponde à primeira posição de aminoácidos da região C-terminal, para modular a homeostase de ácido biliar ou tratar o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0045] Numa outra concretização, um método ou utilização da modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar inclui: administração de uma sequência peptídica quimérica, que compreende: a) uma região N-terminal que compreende uma porção de SEQ ID NO: 100 [FGF21], a região N-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região N-terminal compreende resíduos de aminoácidos GQV, e em que o resíduo V corresponde à última posição de aminoácido da região de N-terminal; e b) uma região C-terminal compreendendo uma porção de SEQ ID NO: 99 [FGF19], a região C-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região C-terminal compreende os resíduos de aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO: 185), e em que o resíduo R corresponde à primeira posição da região C-terminal, para modular a homeostase de ácido biliar ou tratar o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0046] Numa outra concretização, um método ou utilização da modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar inclui: administração de uma sequência peptídica quimérica, que compreende: a) uma região N-terminal que compreende uma porção de SEQ ID NO: 100 [FGF21], a região N-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região N-terminal compreende pelo menos 5 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 100 [FGF21] incluindo os resíduos de aminoácido GQV, e em que o resíduo V corresponde à última posição de aminoácido da região N-terminal; e b) uma região C-terminal compreendendo uma porção de SEQ ID NO: 99 [FGF19], a região C-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região C-terminal compreende os resíduos de aminoácidos 21-29 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO: 185), e em que o resíduo R corresponde à primeira posição da região C-terminal, para modular a homeostase de ácido biliar ou tratar o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0047] Numa concretização adicional, um método ou utilização da modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar inclui: administração de uma sequência peptídica, compreendendo ou consistindo em qualquer um dos seguintes: a) uma variante de sequência de FGF19 tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF19 de tipo selvagem; b) uma variante de sequência de FGF21 tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF21 de tipo selvagem; c) uma porção de uma sequência de FGF19 fundida com uma porção de uma sequência de FGF21; ou d) uma porção de uma sequência de FGF19 fundida com uma porção de uma sequência de FGF21, em que a(s) porção(ões) de sequência de FGF19 e/ou FGF21 tem uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF19 e/ou FGF21 do tipo selvagem, para modular a homeostase de ácido biliar ou tratar o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0048] Em várias concretizações particulares, uma sequência peptídica quimérica tem uma região N-terminal com pelo menos 6 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 100 [FGF21] incluindo os resíduos de aminoácido GQ; ou tem uma região N-terminal com pelo menos 7 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 100 [FGF21], incluindo os resíduos de aminoácido GQV.
[0049] Em várias concretizações adicionais, uma sequência peptídica possui os aminoácidos amino-terminais 1-16 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 21194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], ou em que a sequência peptídica possui os aminoácidos amino-terminal 1-147 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] fundidos com os aminoácidos carboxi-terminais 147-181 da SEQ ID NO: 100 [FGF21] (M41), ou em que a sequência peptídica de aminoácidos amino-terminais 1-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 17-181 da SEQ ID NO: 100 [FGF21] (M44), ou em que a sequência peptídica tem aminoácidos amino-terminais 1-146 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] fundidos com os aminoácidos carboxi-terminais de 148-194 da SEQ ID NO: 99 [FGF19] (M45), ou em que a sequência peptídica tem aminoácidos amino-terminais 1-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] fundidos com os aminoácidos internos 17-146 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] fundidos com os aminoácidos carboxi-terminais 148-194 da SEQ ID NO: 99 [FGF19] (M46).
[0050] Em várias outras concretizações, uma sequência peptídica possui pelo menos uma substituição de aminoácido aos resíduos de aminoácidos 125-129 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], EIRPD; pelo menos uma substituição de aminoácido aos resíduos de aminoácidos 126-128 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], IRP; ou pelo menos uma substituição de aminoácido aos resíduos de aminoácidos 127128 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], RP, ou pelo menos uma substituição de aminoácido aos resíduos de aminoácidos 1-124 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] e/ou aos resíduos de aminoácidos 130-194 da SEQ ID NO: 99 [FGF19]. Mais especificamente, por exemplo, uma sequência peptídica com uma substituição de um dos resíduos de aminoácidos 127-128 da SEQ ID NO: 99 [FGF19], IRP, em que pelo menos uma substituição de aminoácidos é R127L ou P128E.
[0051] Os métodos e utilizações da presente invenção podem ser praticados utilizando uma sequência peptídica ou quimérica, como aqui estabelecido. Por exemplo, uma sequência que inclui ou consiste em qualquer sequência peptídica apresentada aqui como M1 a M98, ou M101 a M160, ou SEQ ID NOs: 1 a 98, 101 a 135, ou 138 a 196, uma sequência peptídica que inclui ou consiste em qualquer sequência apresentada nas Tabelas 1-10, ou uma sequência peptídica que inclui ou consiste em qualquer sequência apresentada na Listagem de Sequências neste documento.
[0052] Os métodos e utilizações da presente invenção podem ser praticados utilizando uma sequência peptídica ou quimérica de qualquer comprimento adequado. Em concretizações particulares, a região N-terminal ou C-terminal da sequência de peptídeos ou quimérica é de cerca de 20 a cerca de 200 resíduos de aminoácidos de comprimento. Em outros aspectos particulares, uma sequência peptídica ou quimérica tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais deleções de aminoácidos a partir do terminal amino, o terminal carboxi, ou internamente. De acordo com outras concretizações particulares, um peptídeo ou sequência quimérica possui uma região N-terminal, ou uma região C-terminal que inclui ou consiste em uma sequência de aminoácidos de cerca de 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais aminoácidos. Em concretizações mais específicas adicionais, uma sequência peptídica ou quimérica possui uma porção da sequência de FGF19, ou uma porção da sequência de FGF21 que inclui ou consiste em uma sequência de aminoácidos de cerca de 5 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais aminoácidos de FGF19 ou FGF21.
[0053] Em vários aspectos, uma sequência peptídica possui: um motivo de sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) que corresponde à sequência WGDPI de aminoácidos 16-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]; tem um motivo de sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) substituído, mutado ou ausente correspondente à sequência de WGDPI de FGF19 (SEQ ID NO: 170) de aminoácidos 16-20 de FGF19; tem uma sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) com um ou mais aminoácidos substituídos, mutados ou ausentes. Em vários outros aspectos adicionais, a sequência peptídica é distinta de uma sequência variante de FGF 19 possuindo qualquer uma das GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para sequência de WGDPI de FGF19 (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20.
[0054] Em vários outros aspectos, a região N-terminal compreende resíduos de aminoácidos VHYG (SEQ ID NO: 101), em que a região N-terminal compreende resíduos de aminoácidos DASPHVHYG (SEQ ID NO: 102), ou a região N-terminal compreende os resíduos de aminoácidos DSSPLVHYG (SEQ ID NO: 103). Mais particularmente, num aspecto, o G corresponde à última posição da região N- terminal.
[0055] Em vários aspectos adicionais, a região N-terminal compreende resíduos de aminoácidos DSSPLLQ (SEQ ID NO: 104), em que Q é o resíduo da última posição de aminoácidos da região N- terminal, ou compreende os resíduos de aminoácidos DSSPLLQFGGQV ( SEQ ID NO: 105), em que o resíduo V corresponde à última posição da região N-terminal.
[0056] Mais particularmente, uma região N-terminal inclui ainda: RHPIP (SEQ ID NO: 106), em que R é a primeira posição de aminoácidos da região N-terminal; ou HPIP (SEQ ID NO: 107), em que H é a primeira posição de aminoácidos da região N-terminal; ou RPLAF (SEQ ID NO: 108), em que R é a primeira posição de aminoácidos da região N-terminal; ou PLAF (SEQ ID NO: 109), onde P é a primeira posição de aminoácidos da região N-terminal; ou R, em que R é a primeira posição de aminoácidos da região N- terminal.
[0057] Em vários outros aspectos, uma sequência peptídica ou quimérica possui: resíduos de aminoácidos HPIP (SEQ ID NO: 107), que são os 4 primeiros resíduos de aminoácidos da região N- terminal. Ainda em vários outros aspectos, uma sequência peptídica ou quimérica tem: um resíduo R na primeira posição da região N-terminal, a primeira posição da região N-terminal é um resíduo de M, ou em que as primeira e segunda posições da região N-terminal são uma sequência de MR, ou as primeira e segunda posições da região N-terminal são uma sequência de RM, ou as primeira e segunda posições da região N-terminal são uma sequência de RD, ou as primeira e segunda posições da região N- terminal são uma sequência de DS, ou as primeira e segunda posições da região N-terminal são uma sequência de MD, ou as primeira e segunda posições da região N-terminal são uma sequência de MS, ou as primeira a terceira posições da região N- terminal são uma sequência de MDS, ou as primeira a terceira posições da região N-terminal são uma sequência de RDS, ou as primeira a terceira posições da região N-terminal são uma sequência de MSD, ou as primeira a terceira posições da região N-terminal são uma sequência de MSS, ou as primeira a terceira posições da região N-terminal são uma sequência de DSS, ou as primeira a quarta posições da região N-terminal são uma sequência de RDSS (SEQ ID NO: 115), ou as primeira a quarta posições da região N-terminal são uma sequência de MDSS (SEQ ID NO: 116), ou as primeira a quinta posições da região N-terminal são uma sequência de MRDSS (SEQ ID NO: 117), ou as primeira a quinta posições da região N-terminal são uma sequência de MSSPL (SEQ ID NO: 113), ou as primeira a sexta posições da região N-terminal são uma sequência de MDSSPL (SEQ ID NO: 110), ou as primeira a sétima posições da região N-terminal são uma sequência de MSDSSPL (SEQ ID NO: 111).
[0058] Em vários outros aspectos particulares, uma sequência peptídica ou quimérica tem na primeira posição de aminoácidos da região N-terminal um resíduo de "M", um resíduo de "R", um resíduo de "S", um resíduo de "H", uma resíduo "P", um resíduo de "L" ou um resíduo de "D". Em vários aspectos particulares alternativos, uma sequência peptídica de sequência peptídica ou quimérica não tem um resíduo de "M" ou um resíduo de "R" na primeira posição de aminoácido da região N-terminal.
[0059] Em vários outros aspectos adicionais, uma sequência peptídica ou quimérica possui uma região N-terminal com qualquer uma das seguintes sequências: MDSSPL (SEQ ID NO:110), MSDSSPL (SEQ ID NO:111), SDSSPL (SEQ ID NO:112), MSSPL (SEQ ID NO:113) ou SSPL (SEQ ID NO:114).
[0060] Ainda em vários aspectos adicionais, uma sequência peptídica ou quimérica tem um resíduo na última posição da região C-terminal que corresponde a cerca do resíduo 194 da SEQ ID NO: 99 [FGF19].
[0061] Em vários aspectos mais particulares, uma sequência peptídica tem ou consiste em qualquer uma das seguintes sequências:RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M3) (SEQ ID NO:3); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M140) (SEQ ID NO:194); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M160) (SEQ ID NO:196); RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQR QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPS FEK (M69) (SEQ ID NO: 69); RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M52) (SEQ ID NO:52); RHPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M5) (SEQ ID NO:5); HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M5-R) (SEQ ID NO:160); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71) (SEQ ID NO:71); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72) (SEQ ID NO:72); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHP ENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73) (SEQ ID NO:73); RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M1) (SEQ ID NO:1 ou 139); RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M2) (SEQ ID NO:2 ou 140); RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M48) (SEQ ID NO:48 ou 6 ou 148); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVA LRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVR SPSFEK (M49) (SEQ ID NO:49 ou 7 ou 149); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M50) (SEQ ID NO:50); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M51) (SEQ ID NO:51 ou 36 ou 155); MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M53) (SEQ ID NO:192); MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDS16MDPFGLVTGLEAVR SPSFEK (M70) (SEQ ID NO:70); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO:193); ou RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO:195); ou uma subsequência ou fragmento seu de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores. Em certas concretizações de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores, o resíduo do terminal R é deletado.
[0062] Em vários aspectos particulares adicionais, o Nterminal da sequência peptídica inclui ou consiste em um dos seguintes: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5-R) (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO:160); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6-R) (aminoácidos 2-22 de SEQ ID NO:6); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:7); HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO:8); HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO:9); HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO:10); RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:11); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:12); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:13); HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO:14); RPLAFSDAGPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M15) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:15); RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M16) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:16); RPLAFSDAGPHVGWGDPIRLRHLYTSG (M17) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:17); RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:18); RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:19); RPLAFSDAGPVHGWGDPIRLRHLYTSG (M20) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:20); RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:21); RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:22); RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:23); RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:24); RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:25); RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:26); RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M27) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:27); RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:28); RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSG (M29) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:29); RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:30); RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:31); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:32); RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG (M33) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:33); RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:34); RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:35); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:36); RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:37); RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG (M38) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:38); RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG (M39) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:39); RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:40); DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74-R) (aminoácidos 2-24 de SEQ ID NO:74); VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75-R) (aminoácidos 2-19 de SEQ ID NO:75); RLRHLYTSG (M77-R) (aminoácidos 2-10 de SEQ ID NO:77); RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:9); RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:8); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:12); RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:10); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:13); RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:14); RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG (M43) aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:43); ou RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO:6).
[0063] Em vários outros aspectos particulares, uma sequência peptídica inclui ou consiste em: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (SEQ ID NO:160); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY KNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:138 ou 161); RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:1 ou 139); RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK(SEQ ID NO:2 ou 140); ou DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV AIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSF EK (SEQ ID NO:141); ou uma subsequência ou fragmento seu de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores. Em certas concretizações de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores, o resíduo do terminal R é deletado.
[0064] Ainda em vários aspectos particulares adicionais, uma sequência peptídica inclui a adição de resíduos de aminoácidos 30-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] na extremidade C-terminal, resultando num polipeptídeo quimérico.
[0065] Em várias outras concretizações, uma sequência peptídica ou quimérica tem uma substituição, uma adição, inserção ou é uma subsequência de aminoácido que tem pelo menos um aminoácido deletado. Tais substituições, adições, inserções e deleções de aminoácidos de uma sequência peptídica podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácidos (10-20, 20-30, 30-40, 40-50, etc.), por exemplo, no N-terminal ou C-terminal, ou interno. Por exemplo, uma subsequência que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20 ou mais deleções de aminoácidos a partir do terminal amino, o terminal carboxi, ou internamente. Num aspecto particular, a substituição ou deleção de aminoácidos está em qualquer uma das posições de aminoácidos 8-20 de FGF19 (AGPHVHYGWGDPI) (SEQ ID NO: 187).
[0066] Em vários aspectos ainda mais particulares, uma sequência peptídica ou quimérica inclui a totalidade ou uma porção de uma sequência de FGF19 definida como: PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLL QYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEE PEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 188) posicionada na extremidade C-terminal do peptídeo, ou o resíduo de "R" do terminal amino é deletado da sequência.
[0067] Em várias concretizações, uma sequência peptídica ou quimérica possui uma função ou atividade maior ou menor do que uma sequência de comparação. Em concretizações particulares, uma sequência peptídica reduziu a formação de HCC em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19 possuindo qualquer uma das GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; ou tem uma maior atividade de diminuição de glicose em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19 possuindo qualquer uma das GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; possui menos atividade de aumento de lipídios em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19 possuindo qualquer uma das GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; ou tem menos atividade de aumento de triglicerídeos, colesterol, não-HDL ou HDL em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF19 possuindo qualquer uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; ou a sequência peptídica tem menos atividade de redução de massa magra em comparação com FGF21. Tais funções e atividades podem ser determinadas in vitro ou in vivo, por exemplo, em um ratinho db/db.
[0068] Em várias concretizações adicionais, uma sequência peptídica ou quimérica tem um efeito sobre a função ou atividade de outras moléculas. Em um aspecto, uma sequência peptídica mantém ou aumenta a atividade mediada por FGFR4. Em outro aspecto, uma sequência peptídica se liga ao receptor do fator de crescimento de fibroblastos 4 (FGFR4) ou ativa o FGFR4, ou não se liga de forma detectável ao FGFR4 ou ativa o FGFR4. Em um aspecto adicional, uma sequência peptídica liga-se ao FGFR4 com uma afinidade menor, comparável ou maior do que a afinidade de ligação de FGF19 para FGFR4. Em um aspecto adicional, uma sequência peptídica ativa o FGFR4 a uma extensão ou quantidade inferior, comparável ou superior a que FGF19 ativa FGFR4.
[0069] De acordo com outras várias concretizações adicionais, uma sequência peptídica ou quimérica inclui um ou mais L- aminoácidos, D-aminoácidos, aminoácidos de ocorrência não natural, ou miméticos de aminoácidos, derivados ou análogos. Ainda em outras diversas concretizações, uma sequência peptídica ou quimérica possui uma região N-terminal, ou uma região C- terminal, ou uma porção da sequência de FGF19, ou uma porção da sequência de FGF21, unidas por um ligante ou espaçador.
[0070] Ainda em concretizações adicionais, um peptídeo quimérico ou sequência peptídica está incluída numa composição farmacêutica, que por sua vez pode ser utilizada para a prática dos métodos da invenção e as utilizações. Tais composições incluem combinações de ingredientes inativos ou outros ativos. Numa concretização, uma composição, tal como uma composição farmacêutica inclui uma sequência pepetídica quimérica ou sequência peptídica e um agente que melhora a homeostase dos ácidos biliares.
[0071] Usos e métodos de tratamento que incluem a administração ou entrega de um peptídeo quimérico ou sequência peptídica também são fornecidos. Em concretizações particulares, um uso ou o método de tratamento de um sujeito inclui a administração de um peptídeo quimérico da invenção ou uma sequência peptídica a um indivíduo, tal como um sujeito possuindo, ou em risco de possuir, uma doença tratável por uma sequência peptídica da invenção, em uma quantidade eficaz para tratar o distúrbio. Numa outra concretização, um método ou uso inclui a administração de um peptídeo quimérico da invenção ou uma sequência peptídica a um sujeito, tal como um sujeito possuindo um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0072] Em aspectos particulares dos métodos e usos da invenção, uma sequência peptídica quimérica, ou uma sequência peptídica é administrada a um sujeito numa quantidade eficaz para melhorar ou proporcionar a homeostase dos ácidos biliares. Exemplos não limitativos de desordens associadas ou relacionadas aos ácidos biliares tratáveis de acordo com os métodos e usos da invenção incluem: síndrome metabólica; um distúrbio de glicose ou lipídio ou metabolismo de triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra- hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra-hepática (por exemplo, compressão de corte biliar a partir de tumor, bloqueio do ducto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), desordens prejudicando a absorção de ácidos biliares não caracterizadas de outra forma (idiopáticas) levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, cânceres gastrointestinais, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácido biliar, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal. Numa concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é a má absorção de ácidos biliares. Numa outra concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é a diarreia. Numa outra concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é a colestase (por exemplo, colestase intra-hepática ou extra-hepática). Numa outra concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é a cirrose biliar primária. Numa outra concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é a colangite esclerosante primária. Numa outra concretização, o distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar é o PFIC (por exemplo, PFIC progressiva).
[0073] Os métodos e usos para análise e/ou identificação de uma sequência peptídica ou uma sequência peptídica quimérica também são fornecidos, tais como sequências peptídicas quiméricas e sequências peptídicas que modulam a homeostasia de ácidos biliares, opcionalmente sem ter atividade de HCC substancial ou significativa. Numa concretização, um método ou uso inclui: a) fornecer uma sequência peptídica candidata; b) administrar a sequência peptídica candidata a um animal de teste; c) medir os níveis de ácido biliar do animal após a administração da sequência peptídica candidata para determinar se a sequência peptídica candidata modula a homeostase de ácido biliar; e d) analisar a sequência peptídica candidata para a indução de HCC no animal, ou expressão de um marcador que se correlaciona com a atividade de HCC. Um peptídeo candidato que modula a homeostase do ácido biliar, mas não possui atividade substancial de HCC identifica assim a sequência peptídica candidata como uma sequência peptídica que modula a homeostase de ácidos biliares sem atividade substancial de HCC.
[0074] Em um aspecto particular, a sequência peptídica quimérica ou sequência peptídica também é analisada quanto à indução de HCC no animal (por exemplo, avaliando uma amostra de tecido hepático do animal de teste), ou expressão de um marcador que se correlaciona com a atividade de HCC. Tais métodos e usos identificam o candidato como possuindo atividade moduladora da homeostase de ácidos biliares, opcionalmente também sem atividade substancial ou significativa de HCC.
[0075] A FIG. 1 mostra a expressão de CYP7A1 em ratinhos db/db doseados intraperitonealmente com as concentrações indicadas de FGF19 e FGF21 (SEQ ID NOs: 99 e 100).
[0076] As FIG. 2A-2D mostram a expressão de CYP7A1 em hepatócitos primários humanos após administração de A) variante M1 (SEQ ID NO: 1); B) variante M2 (SEQ ID NO: 2); C) variante M5 (SEQ ID NO: 5); e D) variante M32 (SEQ ID NO: 32).
[0077] AS FIG. 3A-3D mostram a expressão de CYP7A1 em hepatócitos primários humanos após administração de A) variante M69 (SEQ ID NO: 69); B) variante M75 (SEQ ID NO: 75); C) variante M70 (SEQ ID NO: 70); e D) variante M76 (SEQ ID NO: 76).
[0078] A FIG. 4A-4D mostram expressão de CYP7A1 em hepatócitos primários humanos após administração de A) variante M85 (SEQ ID NO: 85); B) variante M96 (SEQ ID NO: 96); C) variante M90 (SEQ ID NO: 90); e D) variante M98 (SEQ ID NO: 98).
[0079] A FIG. 5 é uma tabela que mostra o IC50 de CYP7A1 (pM), expressão de CYP7A1 relativa e núcleo de HCC das variantes indicadas: M1, M2, M5, M32, M69, M70, M75, M76, M85, M90, M96 e M98.
[0080] A FIG. 6 representa os resultados de um ensaio clínico em humanos, mostrando que a administração de M70 é capaz de suprimir 7a-hidroxi-4-cholsten-3-ona (C4), um marcador da síntese de ácido biliar, em comparação com um placebo.
[0081] A FIG. 7 mostra que a expressão do complexo FGFR4/β- Klotho em células L6 potencia a ativação de vias de sinalização intracelulares por FGF19, M3 e M70.
[0082] A presente invenção fornece sequências quiméricas e peptídicas que modulam a homeostasia de ácidos biliares e são capazes de tratar um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar. Numa concretização, uma sequência peptídica quimérica inclui ou consiste em uma região N-terminal possuindo pelo menos sete resíduos de aminoácidos e a região N-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região N-terminal possui uma sequência DSSPL (SEQ ID NO: 121) ou DASPH (SEQ ID NO: 122); e uma região C- terminal que tem uma porção de FGF19 e a região C-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região C-terminal inclui os resíduos de aminoácidos 16-29 de FGF19 (WGDPIRLRHLYTSG; SEQ ID NO: 169) e o resíduo W corresponde à primeira posição de aminoácidos da região C-terminal.
[0083] Numa outra concretização, uma sequência peptídica quimérica inclui ou consiste em uma região N-terminal que tem uma porção de FGF21 e a região N-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido, em que a região N-terminal tem uma sequência GQV e o resíduo V corresponde à última posição de aminoácido da região N-terminal; e uma região C-terminal que tem uma porção de FGF19 e a região C-terminal possuindo uma primeira posição de aminoácido e uma última posição de aminoácido em que a região C-terminal inclui os resíduos de aminoácidos 21-29 de FGF19 (RLRHLYTSG; SEQ ID NO: 185) e o resíduo R corresponde à primeira posição da região C- terminal.
[0084] De acordo com outras concretizações, uma sequência peptídica inclui ou consiste em uma variante de sequência de FGF19 tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF19 de tipo selvagem. Em concretizações adicionais, uma sequência peptídica inclui ou consiste em uma variante de sequência de FGF21 possuindo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF21 de tipo selvagem. Ainda em concretizações adicionais, uma sequência peptídica inclui ou consiste em uma porção de uma sequência de FGF19 fundida com uma porção de uma sequência de FGF21. Ainda em concretizações adicionais, uma sequência peptídica inclui ou consiste em uma porção de uma sequência de FGF19 fundida com uma porção de uma sequência de FGF21, onde a(s) porção(ões) da sequência de FGF19 e/ou FGF21 tem uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos em comparação com uma referência ou FGF19 e/ou FGF21 de tipo selvagem.
[0085] A invenção também proporciona métodos e usos de tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de possuir um distúrbio tratável utilizando variantes e fusões de sequências peptídicas de FGF19 e/ou FGF21. Numa concretização, um método ou utilização inclui o contato ou a administração a um sujeito de uma ou mais sequências peptídicas variantes ou de fusão de FGF19 e/ou FGF21 numa quantidade eficaz para o tratamento de um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar. Numa outra concretização, um método ou utilização inclui o contato ou administração a um sujeito de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam para uma sequência peptídica variante ou de fusão de FGF19 e/ou FGF21 (por exemplo, um elemento de controle da expressão em ligação operativa com o ácido nucleico que codifica a sequência peptídica, incluindo opcionalmente um vetor), numa quantidade eficaz para o tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0086] Uma sequência de FGF19 de referência ou de tipo selvagem representativa é definida como: RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:99).
[0087] Uma sequência de FGF21 de referência ou de tipo selvagem representativa é definida como: HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:100). Variantes alélicas de FGF21 incluem, por exemplo, M70, M71 e M72.
[0088] Os termos sequência de "peptídeo", "proteína" e "polipeptídeo" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a dois ou mais aminoácidos, ou "resíduos", incluindo modificações químicas e derivados de aminoácidos, ligados covalentemente por uma ligação amida ou equivalente. Os aminoácidos que formam a totalidade ou uma parte de um peptídeo podem ser de entre os 21 aminoácidos conhecidos que ocorrem naturalmente, os quais são referidos por sua abreviatura de letra única ou abreviatura comum de três letras. Nas sequências peptídicas da invenção, os resíduos de aminoácidos convencionais têm o seu significado convencional. Assim, "Leu" é a leucina, "Ile" é isoleucina, "Nle" é norleucina, e assim por diante.
[0089] São aqui exemplificadas sequências peptídicas, distintas dos polipeptídeos de FGF19 e FGF21 de referência aqui estabelecidos, que modulam a homeostase de ácido biliar, in vivo (por exemplo, Tabelas 1-10 e Listagem das Sequências). Exemplos não limitativos específicos são uma sequência peptídica com aminoácidos amino-terminais 1-16 de FGF21 fundidos com os aminoácidos carboxi-terminais 21-194 de FGF19; uma sequência peptídica com aminoácidos amino-terminais 1-147 de FGF19 fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 147-181 de FGF21; uma sequência peptídica com aminoácidos amino-terminais 1-20 de FGF19 fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 17-181 de FGF21; uma sequência peptídica com aminoácidos amino-terminais 1-146 de FGF21 fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 148194 de FGF19; e uma sequência peptídica com aminoácidos amino- terminais 1-20 de FGF19 fundidos com os aminoácidos internos 17146 de FGF21 fundidos com aminoácidos carboxi-terminais 148-194 de FGF19.
[0090] Sequências peptídicas particulares adicionais possuem um motivo de sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) que corresponde à sequência de WGDPI dos aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99), não têm um motivo da sequência WGDPI (SEQ ID NO: 170) que corresponde à sequência WGDPI dos aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99), ou têm um motivo de sequência substituído (isto é, mutante) WGDPI (SEQ ID NO: 170) correspondente à sequência WGDPI de FGF19 dos aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99).
[0091] Sequências peptídicas particulares da invenção também incluem sequências distintas de FGF19 e FGF21 (por exemplo, tais como aqui definidas), e sequências variantes de FGF 19 possuindo qualquer uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177),WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI de FGF19 (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20. Por conseguinte, o FGF19 e FGF21 do tipo selvagem (por exemplo, tal como aqui definido como SEQ ID NOS: 99 e 100, respectivamente) podem ser sequências excluídas, e FGF19 possuindo qualquer uma das GQV, GDI, WGPI(SEQ ID NO:171), WGDPV(SEQ ID NO:172), WGDI(SEQ ID NO:173), GDPI(SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19 também podem ser excluídas. Esta exclusão, no entanto, não se aplica a onde uma sequência tenha, por exemplo, três resíduos de FGF21 fundidos com FGF19 tendo, por exemplo, qualquer uma de GQV, GQV, GDI, ou GPI, ou dois resíduos de FGF21 fundidos com qualquer um de WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), ou WGDP (SEQ ID NO: 183).
[0092] Exemplos particulares não limitativos de sequências peptídicas incluem ou consistem em toda ou uma parte de uma variante de sequência aqui especificada como M1-M98 (SEQ ID NO: 1-52, 192, e 54-98, respectivamente). Exemplos não limitativos mais particulares de sequências peptídicas incluem ou consistem em toda ou uma parte de uma sequência apresentada como: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M5-R) (SEQ ID NO:160) (sequências de FGF21 também podem incluir um resíduo de "R" no terminal amino); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLY KNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:138 e 161); RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M1) (SEQ ID NO:1 ou 139); RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M2) (SEQ ID NO:2 ou 140); DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV AIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSF EK (SEQ ID NO:141); RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQR QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPS FEK (M69) (SEQ ID NO:69); RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M52) (SEQ ID NO:52); HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M5-R) (SEQ ID NO:160); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71) (SEQ ID NO:71); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72) (SEQ ID NO:72); HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHP ENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73) (SEQ ID NO:73); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M3) (SEQ ID NO:3); RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M48) (SEQ ID NO:48, 6 ou 148); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVA LRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVR SPSFEK (M49) (SEQ ID NO:49, 7 ou 149); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M50) (SEQ ID NO:50); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M51) (SEQ ID NO:51, 36 ou 155); MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K (M53) (SEQ ID NO:192); MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M70) (SEQ ID NO:70); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO:193); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M140) (SEQ ID NO:194); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO:195); ou RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M160) (SEQ ID NO:196); ou uma subsequência ou fragmento seu de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores. Em certas concretizações de qualquer uma das sequências peptídicas anteriores, o resíduo do terminal R é excluído.
[0093] Exemplos não limitativos particulares adicionais de sequências peptídicas, possuindo na extremidade N-terminal, uma sequência peptídica incluindo ou consistindo na totalidade ou uma parte de qualquer uma de: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5-R) (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 160); HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5-R) (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO:160); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (M6-R) (aminoácidos 2-22 de SEQ ID NO:6); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:7); HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO:8); HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO:9); HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO:10); RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:11); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:12); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:13); HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO:14); RPLAFSDAGPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M15) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:15); RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M16) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:16); RPLAFSDAGPHVGWGDPIRLRHLYTSG (M17) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:17); RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:18); RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:19); RPLAFSDAGPVHGWGDPIRLRHLYTSG (M20) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:20); RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:21); RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:22); RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:23); RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:24); RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:25); RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:26); RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M27) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:27); RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:28); RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSG (M29) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:29); RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:30); RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:31); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:32); RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG (M33) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:33); RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:34); RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:35); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:36); RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:37); RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG (M38) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:38); RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG (M39) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:39); RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:40); DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74-R) (aminoácidos 2-24 de SEQ ID NO:74); VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75-R) (aminoácidos 2-19 de SEQ ID NO:75); RLRHLYTSG (M77-R) (aminoácidos 2-10 de SEQ ID NO:77); RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:9); RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:8); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO:12); RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO:10); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:13); RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:14); RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG (M43) aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO:43); ou RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO:6); e para qualquer uma das sequências peptídicas anteriores o resíduo do amino terminal R pode ser deletado.
[0094] As sequências peptídicas da invenção adicionalmente incluem aquelas com indução ou formação de HCC reduzida ou ausente em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19, possuindo qualquer uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19. As sequências peptídicas da invenção incluem também aquelas com maior atividade de diminuição de glicose em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19, possuindo qualquer uma de GQV, GDI, WGPI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19. As sequências peptídicas da invenção incluem, além disso, aquelas com menos atividade de aumento de lipídios (por exemplo, triglicerídeos, colesterol, não-HDL ou HDL) em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19, possuindo qualquer uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19.
[0095] Tipicamente, o número de resíduos ou aminoácidos de uma sequência peptídica da invenção terá um total de menos de cerca de 250 (por exemplo, aminoácidos ou seus miméticos). Em várias concretizações particulares, o número de resíduos compreende desde cerca de 20 até cerca de 200 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou miméticos dos mesmos). Em concretizações adicionais, o número de resíduos compreende desde cerca de 50 até cerca de 200 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou miméticos dos mesmos). Noutras concretizações, o número de resíduos compreendem desde cerca de 100 até cerca de 195 resíduos (por exemplo, aminoácidos ou miméticos dos mesmos) em comprimento.
[0096] Os aminoácidos ou resíduos podem ser ligados por ligações químicas de amida ou não-naturais e não-amida, incluindo, por exemplo, os formados com glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais, ou N,N'- diciclo-hexilcarbodiimida (DCC). Ligações não-amida incluem, por exemplo, cetometileno, aminometileno, olefina, éter, tioéter e semelhantes (ver, por exemplo, Spatola em Chemistry and Biochemistry de Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357 (1983), “Peptide and Backbone Modifications,” Marcel Decker, NY). Assim, quando um peptídeo da presente invenção inclui uma porção de uma sequência de FGF19 e uma porção de uma sequência de FGF21, as duas porções não necessitam ser unidas uma a outra por uma ligação amida, mas podem ser unidas por qualquer outra porção química ou conjugadas juntas através de uma porção ligante.
[0097] A invenção também inclui subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo as variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), desde que o último retenha pelo menos uma atividade ou função detectável ou mensurável. Por exemplo, certos peptídeos variantesexemplificados têm uma sequência de FGF19 C-terminal, PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLL QYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEE PEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:188) na porção C-terminal, por exemplo, seguindo os resíduos de aminoácidos "TSG" da variante.
[0098] Além disso, certos peptídeos variantes exemplificados,por exemplo, aqueles que têm toda ou uma porção da sequência de FGF21 no terminal amino, têm um resíduo "R" posicionado na extremidade N-terminal, que pode ser omitido. Da mesma forma, certos peptídeos variantes exemplificados incluem um resíduo de "M" posicionado na extremidade N-terminal, que pode ser anexado a, ou adicionalmente substituídos por, um resíduo omitido, tal como um resíduo de "R". Mais particularmente, em várias concretizações, sequências peptídicas na extremidade N-terminal incluem qualquer um de: RDSS (SEQ ID NO: 115), DSS, MDSS (SEQ ID NO: 116) ou MRDSS (SEQ ID NO: 117). Além disso, em células em que um resíduo de "M" é adjacente a um resíduo de "S", o resíduo "M" pode ser clivado de modo que o resíduo "M" é apagado da sequência peptídica, enquanto que quando o resíduo de "M" é adjacente a um resíduo "D", o resíduo "M" não pode ser clivado. Assim, a título de exemplo, em várias concretizações, sequências peptídicas incluem aquelas com os seguintes resíduos no N- terminal: MDSSPL (SEQ ID NO: 119), MSDSSPL (SEQ ID NO: 120) (clivada para SDSSPL (SEQ ID NO: 112)) e MSSPL (SEQ ID NO: 113) (clivada para SSPL (SEQ ID NO: 114)).
[0099] Por conseguinte, as sequências de "peptídeo","polipeptídeo" e "proteína" da invenção incluem subsequências, variantes e formas modificadas dos variantes de FGF19 e FGF21 e subsequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, e as fusões FGF19/FGF21 e quimeras listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, desde que a subsequência, variante ou forma modificada (por exemplo, fusão ou quimera) retenha pelo menos uma atividade ou função detectável, por exemplo, modular a homeostase dos ácidos biliares.
[0100] Conforme aqui utilizado, o termo "modificar" e suas variações gramaticais, significa que a composição se desvia em relação a uma composição de referência, tal como uma sequência peptídica. Tais sequências peptídicas, ácidos nucleicos e outras composições modificadas podem ter maior ou menor atividade ou função, ou ter uma função ou atividade distinta em comparação com uma sequência peptídica de referência, ácido nucleico, ou outra composição não modificada, ou pode ter uma propriedade desejável numa proteína formulada para terapia (por exemplo, meia-vida no soro), para eliciar anticorpos para utilização num ensaio de detecção, e/ou para a purificação de proteínas. Por exemplo, uma sequência peptídica da invenção pode ser modificada para aumentar a meia-vida no soro, para aumentar a estabilidade in vitro e/ou in vivo da proteína, etc.
[0101] Exemplos particulares de tais subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, uma sequência peptídica listada nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) incluem substituições, deleções e/ou inserções/adições de um ou mais aminoácidos, para ou a partir do terminal amino, terminal carbóxi, ou internamente. Um exemplo é uma substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido dentro da sequência peptídica. Outro é uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência peptídica, ou uma inserção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência peptídica.
[0102] O número de resíduos substituídos, eliminados ou inseridos/adicionados é de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 7080, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250, ou mais) de uma sequência peptídica. Assim, uma sequência de FGF19 ou FGF21 pode ter poucos ou muitos aminoácidos substituídos, eliminados ou inseridos/adicionados (por exemplo, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 7080, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250, ou mais). Além disso, uma sequência de aminoácidos de FGF19 pode incluir ou consistir em uma sequência de aminoácidos de cerca de 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 7080, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250, ou mais aminoácidos de FGF21; ou um aminoácido ou sequência de FGF21 pode incluir ou consistir em uma sequência de aminoácidos de cerca de 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250, ou mais aminoácidos de FGF19.
[0103] Exemplos específicos de substituições incluem substituição de um resíduo D para um resíduo L. Por conseguinte,estejam listados na configuração de isômero L,D-aminoácidos em qualquer particular ou todas as posições das sequências peptídicas da invenção estão incluídos, a não ser que um isômero D leve a uma sequência que não tem qualquer função detectável ou mensurável.
[0104] Exemplos específicos adicionais são substituições não conservadoras e conservadoras. Uma "substituição conservadora" é a substituição de um aminoácido por um resíduo biologicamente, quimicamente ou estruturalmente semelhante. Biologicamente semelhante significa que a substituição é compatível com uma atividade biológica, por exemplo, atividade hipoglicemiante (diminuição de glicose). Estruturalmente semelhante significa que os aminoácidos têm cadeias laterais com comprimentos semelhantes, tal como alanina, glicina e serina, ou possuindo tamanho semelhante, ou a estrutura de uma primeira, segunda ou sequência peptídica adicional é mantida. Semelhança química significa que os resíduos têm a mesma carga ou são ambos hidrofílicos e hidrofóbicos. Exemplos particulares incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro, ou a substituição de um resíduo polar por um outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácidos glutâmico por aspártico, ou glutamina por asparagina, serina para treonina, etc. Ensaios de rotina podem ser utilizados para determinar se uma subsequência, variante ou forma modificada possui uma atividade, por exemplo, atividade hipoglicemiante.
[0105] Exemplos particulares de subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, uma sequência peptídica listada nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) tem 50%-60%, 60%-70%, 70%-75%, 75%- 80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, ou 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma sequência peptídica de referência (por exemplo, uma sequência peptídica em qualquer uma das Tabelas 110 e Listagem de Sequências). O termo "identidade" e "homologia" e suas variações gramaticais significa que duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas. Assim, quando duas sequências de aminoácidos são idênticas, elas possuem a sequência de aminoácidos idêntica. "Áreas, regiões ou domínios de identidade" significa que uma porção de duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas. Assim, quando duas sequências de aminoácidos são idênticas ou homólogas sobre uma ou mais regiões da sequência, elas partilham identidade nestas regiões.
[0106] O grau de identidade entre duas sequências pode ser determinado utilizando um programa de computador e um algoritmo matemático conhecido no estado da técnica. Tais algoritmos que calculam a percentagem de identidade de sequência (homologia) geralmente respondem por gaps de sequência e descombinações sobre a região de comparação. Por exemplo, um algoritmo de busca BLAST (por exemplo, BLAST 2.0) (ver, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990), disponível ao público através de NCBI) tem parâmetros de busca exemplificativos como se segue: Mismatch - 2; gap open 5; gap extension 2. Para comparações de sequências peptídicas, um algoritmo BLASTP é tipicamente utilizado em combinação com uma matriz de pontuação, tal como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Programas de comparação de sequências FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH são também utilizados para quantificar o grau de identidade Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Programas para a quantificação da semelhança estrutural de proteína utilizando o mapeamento topológico baseado em Delaunay também têm sido desenvolvidos (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
[0107] Na presente invenção as sequências peptídicas, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) um "aminoácido" ou "resíduo" inclui alfa-aminoácidos convencionais, bem como beta-aminoácidos, aminoácidos alfa e alfa dissubstituídos e aminoácidos N-substituídos em que pelo menos uma cadeia lateral é um grupamento de cadeia lateral de aminoácido tal como aqui definido. Um "aminoácido" inclui também os alfa-aminoácidos N-alquil em que o grupo amino do N-terminal tem um grupo substituinte alquil C1 a C6 linear ou ramificado. O termo "aminoácido" inclui, por conseguinte, estereoisômeros e modificações de aminoácidos de ocorrência natural proteicos, aminoácidos não proteicos, aminoácidos modificados após a tradução (por exemplo, por glicosilação, fosforilação, clivagem de éster ou amida, etc.), enzimaticamente modificados ou aminoácidos sintetizados aminoácidos derivatizados, construções ou estruturas concebidas para mimetizar aminoácidos, aminoácidos com um grupamento de cadeia lateral modificado, derivados de grupamentos de ocorrência natural, ou sintéticos, ou que não ocorrem naturalmente, etc. Aminoácidos modificados e incomuns estão incluídos nas sequências peptídicas da invenção (ver, por exemplo, em Synthetic Peptides: A User’s Guide; Hruby et al., Biochem. J. 268:249 (1990); and Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287 (1990)).
[0108] Além disso, a proteção e a modificação de grupos de aminoácidos são incluídas. O termo "grupamento de cadeia lateral de aminoácido", tal como aqui utilizado, inclui qualquer cadeia lateral de qualquer aminoácido, conforme o termo "aminoácido" aqui definido. Isto inclui, por conseguinte, a porção da cadeia lateral em aminoácidos que ocorrem naturalmente. Ela inclui ainda grupamentos de cadeia lateral de aminoácidos que ocorrem naturalmente modificados, como aqui estabelecidos e conhecidos para um versado na técnica, tais como grupamentos de cadeia lateral em estereoisômeros e modificações de aminoácidos proteicos de ocorrência natural, aminoácidos não proteicos, aminoácidos modificado pós-tradução, aminoácidos enzimaticamente modificados ou sintetizados, aminoácidos derivatizados, construções ou estruturas concebidas para mimetizar aminoácidos, etc. Por exemplo, o grupamento de cadeia lateral de qualquer aminoácido aqui divulgado ou conhecido para um versado na técnica é incluído dentro da definição.
[0109] Um "derivado de um grupamento de cadeia lateral de aminoácido" está incluído dentro da definição de um grupamento de cadeia lateral de aminoácido. Exemplos não limitativos de derivados de grupamento de cadeia lateral de aminoácido incluem, por exemplo: (a) adição de um ou mais átomos de carbono saturados ou insaturados a um grupo de cadeia de alquil, aril, ou aralquil existente; (b) substituição de um carbono na cadeia lateral com um outro átomo, de preferência oxigênio ou nitrogênio; (c) adição de um grupo terminal a um átomo de carbono da cadeia lateral, incluindo metil (--CH3), metoxi (--OCH3), nitro (--NO2), hidroxila (-OH), ou ciano (--C=N); (d) para grupamentos de cadeia lateral incluindo um grupo hidroxi, tiol ou amino, adição de um grupo de proteção hidroxi, tiol ou amino adequado; ou (e) para grupamentos de cadeia lateral incluindo uma estrutura em anel, adição de um ou mais substituintes do anel, incluindo hidroxila, halogêneo, alquil, ou grupos aril ligados diretamente ou através de uma ligação éter. Para grupos amino, grupos de proteção adequados são conhecidos dos versados na técnica. Dado que a derivatização fornece uma atividade desejada na sequência peptídica final (por exemplo, redução da glicemia, melhoria do metabolismo de glicose ou de lipídios, atividade anti-diabética, ausência de formação de HCC substancial ou tumorigênese, ausência de modulação significativa da massa magra ou gorda, etc.).
[0110] Um "grupamento de cadeia lateral de aminoácido" inclui todas as tais derivatizações, e exemplos não limitativos particulares incluem: ácido gama-amino-butírico, ácido 12-amino dodecanoico, ácido alfa-aminoisobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 4-(aminometil)-ciclo-hexano carboxílico, ácido 8-amino octanoico, bifenilalanina, Boc--t-butoxicarbonil, benzil, benzoíl, citrulina, ácido diaminobutírico, pirrollisina, ácido diaminopropiônico, 3,3-difenilalanina, ortonina, citrulina, ácido 1,3-di-hidro-2H-isoindolecarboxílico, etil, Fmoc-fluorenilmetoxicarbonil, heptanoíl (CH3--(CH2)5--C(=O)--), hexanoíl (CH3--(CH2)4--C(=O)--), homoarginina, homocisteína, homolisina, homofenilalanina, homoserina, metil, sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, norvalina (NVA), fenilglicina, propil, isopropil, sarcosina (SAR), terc-butilalanina, e benziloxicarbonil.
[0111] Um único aminoácido, incluindo estereoisômeros e modificações de aminoácidos proteicos de ocorrência natural, aminoácidos não proteicos, aminoácidos modificados após a tradução, aminoácidos enzimaticamente sintetizados, aminoácidos de ocorrência não-natural, incluindo os aminoácidos derivatizados, um aminoácido alfa, alfa dissubstituído derivado a partir de qualquer um dos anteriores (isto é, um aminoácido alfa, alfa dissubstituído, em que pelo menos uma cadeia lateral é a mesma que a do resíduo a partir do qual é derivado), um beta- aminoácido derivado qualquer um dos anteriores (isto é, um beta- aminoácido, que não para a presença de uma beta-carbono é de outra forma o mesmo que o resíduo a partir do qual é derivado), etc., incluindo todo o anterior pode ser aqui referido como um "resíduo". Substituintes adequados, além do grupamento de cadeia lateral do alfa-aminoácido, incluem alquil C1 a C6 linear ou ramificado. Aib é um exemplo de um aminoácido alfa, alfa dissubstituído. Enquanto aminoácidos alfa, alfa dissubstituídos podem ser referidos usando referências convencionais de L- e D- isoméricos, deve ser compreendido que essas referências são por conveniência, e que quando os substituintes na posição-alfa são diferentes, tais aminoácidos podem indiferentemente ser referidos como um aminoácido alfa, alfa dissubstituído derivado a partir do isômero L ou D, conforme apropriado, de um resíduo com o grupamento de cadeia lateral de aminoácido designado. Assim, o ácido (S)-2-amino-2-metil-hexanoico pode ser referido tanto como um aminoácido alfa, alfa dissubstituído derivado a partir da L-Nle (norleucina) ou como um aminoácido alfa, alfa dissubstituído derivado a partir de D-Ala. Da mesma forma, Aib pode ser referido como um aminoácido alfa, alfa dissubstituído derivado a partir de Ala. Sempre que um aminoácido alfa, alfa dissubstituído é fornecido, deve ser entendido como incluindo todas as configurações (R) e (S) dos mesmos.
[0112] Um "aminoácido N-substituído" inclui qualquer aminoácido em que um grupamento de cadeia lateral de aminoácido é covalentemente ligado ao grupo amino do esqueleto, opcionalmente em que não existem outros substituintes que não o H na posição alfa-carbono. A sarcosina é um exemplo de um aminoácido N-substituído. A título de exemplo, a sarcosina pode ser referida como um derivado de aminoácido N-substituído de Ala, em que o grupamento de cadeia lateral de aminoácido da sarcosina e Ala é o mesmo, isto é, metil.
[0113] Modificações covalentes das sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) estão incluídas na invenção. Um tipo de modificação covalente inclui fazer reagir resíduos de aminoácidos alvo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos N- ou C-terminal do peptídeo. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para a ligação cruzada (reticulação) do peptídeo a uma matriz de suporte insolúvel em água ou superfície para uso no método para purificar anticorpos anti-peptídeos, e vice- versa. Agentes de reticulação comumente utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidil tais como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tais como bis- N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato.
[0114] Outras modificações incluem desamidação de resíduos de glutaminil e asparaginil aos resíduos glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos seril ou treonil, metilação dos grupos alfa-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal, etc.
[0115] Sequências peptídicas exemplificadas e subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 110 e Listagem de Sequências) também podem incluir alterações do esqueleto para a estabilidade, derivados e peptidomiméticos. O termo "peptidomimético" inclui uma molécula que é um mímico de um resíduo (referido como um "mimético"), incluindo, mas não se limitando a, moléculas de núcleo de piperazina, moléculas de núcleo de ceto-piperazina e moléculas de núcleo de diazepina. A menos que de outra forma especificado, um mimético de aminoácido de uma sequência peptídica da invenção inclui tanto um grupo carboxil e um grupo amino, e um grupo que corresponde a uma cadeia lateral de aminoácido, ou no caso de um mimético de Glicina, nenhuma cadeia lateral diferente de hidrogênio.
[0116] A título de exemplo, estas incluem compostos que mimetizam os estéricos, distribuição da carga de superfície, polaridade, etc. de um aminoácido que ocorre naturalmente, mas não precisa ser um aminoácido, o que iria conferir estabilidade no sistema biológico. Por exemplo, a Prolina pode ser substituída por outras lactamas ou lactonas de tamanho e substituição adequados; a Leucina pode ser substituída por uma alquil-cetona, amida N-substituída, bem como variações no comprimento da cadeia lateral de aminoácidos usando alquil, alquenil ou outros substituintes, outros podem ser evidentes para o versado na técnica. O elemento essencial para fazer tais substituições é proporcionar uma molécula de aproximadamente o mesmo tamanho e carga e configuração que o resíduo utilizado para projetar a molécula. O refinamento destas modificações será feito por meio da análise dos compostos em um ensaio funcional (por exemplo, redução da glicemia) ou outro ensaio, e comparação da relação entre estrutura e atividade. Tais métodos estão dentro do âmbito do versado na técnica que trabalha em química medicinal e desenvolvimento de drogas.
[0117] Outro tipo de modificação das sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes de sequências e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os peptídeos listados nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) é a glicosilação. Tal como aqui utilizado, "glicosilação" refere-se amplamente à presença, adição ou inserção de um ou mais açúcares (por exemplo, carboidrato) a grupamentos de proteínas, lipídios ou outras moléculas orgânicas. O uso do termo "desglicosilação" aqui geralmente pretende significar a remoção ou eliminação, de um ou mais grupamentos de açúcares (por exemplo, carboidrato). Além disso, a frase inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas envolvendo uma alteração no tipo e proporções (quantidades) dos diferentes grupamentos de açúcares (por exemplo, carboidrato) presentes.
[0118] A glicosilação pode ser conseguida por modificação de um resíduo de aminoácido, ou por adição de um ou mais locais de glicosilação que podem ou não estar presentes na sequência nativa. Por exemplo, tipicamente um resíduo não-glicosilado pode ser substituído por um resíduo que pode ser glicosilado. A adição de locais de glicosilação pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos. A alteração da sequência peptídica pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina (para locais de glicosilação ligados a O) ou resíduos de asparagina (para locais de glicosilação ligados a N). As estruturas de oligossacarídeos ligados a N e ligados a O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo podem ser diferentes. Um tipo de açúcar que é comumente encontrado em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (a seguir referido como ácido siálico). O ácido siálico é normalmente o resíduo terminal de ambos os oligossacarídeos ligados a N e ligados a O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas à glicoproteína.
[0119] As sequências peptídicas da invenção podem opcionalmente ser alteradas através de alterações ao nível de nucleotídeo (por exemplo, DNA), particularmente por mutação do DNA que codifica o peptídeo em bases pré-selecionadas de modo que sejam gerados códons que irão traduzir nos aminoácidos desejados. Outro meio de aumentar o número de grupamentos de carboidratos no peptídeo é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo (ver, por exemplo, em WO 87/05330). A de-glicosilação pode ser realizada através da remoção do local de glicosilação subjacente, ao eliminar a glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos, ou por substituição dos códons que codificam resíduos de aminoácido que são glicosilados. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas, e a clivagem enzimática de grupamentos de carboidratos em polipeptídeos pode ser conseguida pela utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases.
[0120] Várias linhas celulares podem ser utilizadas para produzir proteínas que são glicosiladas. Um exemplo não limitativo é a dihidrofolato redutase (DHFR) - células deficientes de Ovário de Hamster Chinês (CHO), que são uma célula hospedeira comumente utilizada para a produção de glicoproteínas recombinantes. Estas células não expressam a enzima beta- galactosídeo alfa-2,6-sialiltransferase e, portanto, não adicionam ácido siálico na ligação alfa-2,6 a oligossacarídeos ligados a N de glicoproteínas produzidas nestas células.
[0121] Outro tipo de modificação é o de conjugar (por exemplo, ligar) um ou mais componentes ou moléculas adicionais no terminal N e/ou C de uma sequência peptídica de invenção, tal como uma outra proteína (por exemplo, uma proteína que possua uma sequência de aminoácidos heteróloga à proteína sujeito), ou uma molécula transportadora. Assim, uma sequência peptídica exemplar pode ser um conjugada com um outro componente ou molécula.
[0122] Em certas concretizações, o terminal amino ou carboxi de uma sequência peptídica da invenção pode ser fundido com uma região Fc de imunoglobulina (por exemplo, Fc humano) para formar um conjugado de fusão (ou molécula de fusão). Conjugados de fusão Fc podem aumentar a meia-vida sistêmica de biofarmacêuticos, e, assim, o produto biofarmacêutico pode ter atividade prolongada ou requerer uma administração menos frequente. Fc liga-se ao receptor de Fc neonatal (FcRn) nas células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos, e, após a ligação, a molécula de fusão de Fc é protegida da degradação e re-liberada para a circulação, mantendo a molécula em circulação por mais tempo. Acredita-se que esta ligação de Fc é o mecanismo pelo qual o IgG endógeno mantém a sua meia-vida longa no plasma. Drogas de fusão Fc bem conhecidas e validadas consistem em duas cópias de um biofarmacêutico ligado à região de Fc de um anticorpo para melhorar a farmacocinética, a solubilidade, e a eficiência da produção. Tecnologias de fusão de Fc mais recentes ligam uma única cópia de um biofarmacêutico à região de Fc de um anticorpo para otimizar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do biofarmacêutico em comparação com os conjugados de fusão de Fc tradicionais.
[0123] Uma modificação do conjugado pode ser usada para produzir uma sequência peptídica que retém a atividade com uma função ou atividade adicional ou complementar da segunda molécula. Por exemplo, uma sequência peptídica pode ser conjugada com uma molécula, por exemplo, para facilitar a solubilidade, armazenamento, in vivo ou meia-vida de prateleira ou estabilidade, redução da imunogenicidade, liberação retardada ou controlada in vivo, etc. Outras funções ou atividades incluem um conjugado que reduz a toxicidade em relação a uma sequência peptídica não conjugada, um conjugado que tem como alvo um tipo de célula ou órgão mais eficientemente do que uma sequência peptídica não conjugada, ou uma droga para combater melhor as causas ou efeitos associados com um distúrbio ou doença como aqui estabelecido (por exemplo, diabetes).
[0124] A eficácia clínica da terapêutica de proteínas pode ser limitada por uma meia-vida curta no plasma e susceptibilidade para degradação. Estudos de várias proteínas terapêuticas mostraram que várias modificações, incluindo a conjugação ou ligação da sequência peptídica a qualquer um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, (ver, por exemplo, tipicamente através de um grupamento de ligação ligado covalentemente a ambos a proteína e o polímero não proteináceo (por exemplo, um PEG) pode prolongar a meia-vida. Tais biomoléculas conjugadas com PEG tem demonstrado possuir propriedades úteis clinicamente, incluindo uma melhor estabilidade física e térmica, proteção contra a susceptibilidade à degradação enzimática, solubilidade aumentada, meia-vida in vivo circulante mais prolongada e depuração (clearance) diminuída, imunogenicidade e antigenicidade reduzidas, e toxicidade reduzida.
[0125] PEGs adequados para conjugação a uma sequência peptídica da invenção são geralmente solúveis em água à temperatura ambiente, e têm a fórmula geral R(O-CH2-CH2)nO-R, em que R é hidrogênio ou um grupo protetor tal como um grupo alquil ou alcanol, e em que n é um número inteiro de 1 a 1000. Quando R é um grupo de proteção, ele possui geralmente de 1 a 8 átomos de carbono. O PEG conjugado com a sequência peptídica pode ser linear ou ramificado. Derivados de PEG ramificados, "PEG estrela" e PEG multi-braços são incluídos na invenção. Um peso molecular do PEG utilizado na presente invenção não está restrito a qualquer intervalo particular, mas certas concretizações possuem um peso molecular entre 500 e 20.000, enquanto outras concretizações possuem um peso molecular entre 4.000 e 10.000.
[0126] A invenção inclui composições de conjugados em que os PEGs têm diferentes valores de "n" e, assim, vários PEGs diferentes estão presentes em proporções específicas. Por exemplo, algumas composições compreendem uma mistura de conjugados em que n = 1, 2, 3 e 4. Em algumas composições, a percentagem de conjugados em que n = 1 é 18-25%, a percentagem de conjugados em que n = 2 é 50-66%, a percentagem de conjugados em que n = 3 é 12-16%, e a percentagem de conjugados em que n = 4 é de até 5%. Tais composições podem ser produzidas por condições de reação e métodos de purificação conhecidos na técnica.
[0127] O PEG pode diretamente ou indiretamente (por exemplo, através de um intermediário) ligar-se às sequências peptídicas da invenção. Por exemplo, numa concretização, o PEG se liga através de um grupo reativo terminal (um "espaçador"). O espaçador é, por exemplo, um grupo reativo terminal que media uma ligação entre os grupos amino ou carboxil livres de uma ou mais das sequências peptídicas e polietileno glicol. O PEG possuindo o espaçador que pode estar ligado ao grupo amino livre inclui N-hidroxisuccinilimida polietileno glicol que pode ser preparado por ativação de éster do ácido succínico de polietileno glicol com N-hidroxisuccinilimida. Outro polietilenoglicol ativado que pode ser ligado ao grupo amino livre é a 2,4-bis(O- metoxipolietilenoglicol)-6-cloro-s-triazina que pode ser preparada por reação de éter monometílico de polietileno glicol com cloreto cianúrico. O polietilenoglicol ativado que está ligado ao grupo carboxil livre inclui polioxietilenodiamina.
[0128] A conjugação de uma ou mais das sequências peptídicas da invenção ao PEG possuindo um espaçador pode ser efetuada através de vários métodos convencionais. Por exemplo, a reação de conjugação pode ser realizada em solução a um pH de 5 a 10, a uma temperatura de 4° C até à temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando uma razão molar de reagente para proteína de 4:1 a 30:1. As condições reacionais podem ser selecionadas para conduzir a reação no sentido de produzir predominantemente um grau de substituição desejado. Em geral, baixa temperatura, baixo pH (por exemplo, pH = 5), e tempo de reação curto tendem a diminuir o número de PEGs ligados, ao passo que alta temperatura, pH neutro a alto (por exemplo, pH>7), e maior tempo de reação tendem a aumentar o número de PEGs ligados. Vários métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados para terminar a reação. Em algumas concretizações, a reação é terminada por acidificação da mistura reacional e congelamento a, por exemplo, -20° C.
[0129] Sequências peptídicas da invenção incluindo subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os peptídeos listados nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) incluem ainda a conjugação de macromoléculas lentamente metabolizadas e grandes, tais como proteínas; polissacarídeos, tais como sefarose, agarose, celulose, esferas de celulose; aminoácidos poliméricos tais como o ácido poliglutâmico, polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de vírus inativados; toxinas bacterianas inativadas tais como toxóide da difteria, tétano, cólera, moléculas de leucotoxina; bactérias inativadas; e células dendríticas. Tais formas conjugadas, se desejado, podem ser utilizadas para produzir anticorpos contra sequências peptídicas da invenção.
[0130] Componentes adequados e moléculas adicionais para conjugação incluem, por exemplo, a tiroglobulina; albuminas tal como albumina do soro humano (HSA); o toxóide do tétano; toxóide da difteria; poliaminoácidos tal como poli(D-lisina:D-ácido glutâmico); polipeptídeos VP6 de rotavírus; hemaglutinina do vírus influenza, nucleoproteína do vírus influenza; Hemocianina de Keyhole limpet (KLH); e proteína do núcleo do vírus da hepatite B e antígeno de superfície; ou qualquer combinação dos anteriores.
[0131] A fusão de albumina a uma sequência peptídica da invenção pode, por exemplo, ser conseguida por manipulação genética, de tal modo que o DNA que codifica para a HSA (albumina do soro humano), ou um fragmento seu, está unido ao DNA que codifica para uma sequência peptídica. Depois disso, um hospedeiro adequado pode ser transformado ou transfectado com a sequência de nucleotídeos fundida sob a forma de, por exemplo, um plasmídeo adequado, de modo a expressar um polipeptídeo de fusão. A expressão pode ser efetuada in vitro a partir de, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas, ou in vivo a partir de, por exemplo, um organismo transgênico. Em algumas concretizações da invenção, a expressão da proteína de fusão é realizada em linhas celulares de mamíferos, por exemplo, linhas celulares CHO.
[0132] Meios adicionais para fundir geneticamente as proteínas ou os peptídeos alvo à albumina incluem uma tecnologia conhecida como Albufuse® (Novozymes Biopharma A/S, Dinamarca), e as sequências peptídicas terapêuticas conjugadas frequentemente tornam-se muito mais eficaz com melhor absorção no corpo. A tecnologia tem sido utilizada comercialmente para produzir Albuferon® (Human Genome Sciences), uma combinação de albumina e interferon α-2B usada para tratar a infecção por hepatite C.
[0133] Uma outra concretização envolve o uso de um ou mais anticorpos humanos de domínio (dAb). Os dAbs são as menores unidades funcionais de ligação de anticorpos humanos (IgGs) e têm características de estabilidade e de solubilidade favoráveis. A tecnologia envolve um dAb(s) conjugado com HSA (formando assim um "AlbudAb"; ver, por exemplo, EP1517921B, WO2005/118642 e WO2006/051288) e uma molécula de interesse (por exemplo, uma sequência peptídica da invenção). AlbudAbs são frequentemente menores e mais fáceis de fabricar em sistemas de expressão microbianos, tais como bactérias ou leveduras, do que as atuais tecnologias utilizadas para prolongar a meia-vida no soro de peptídeos. Como HSA tem uma meia-vida de cerca de três semanas, a molécula conjugada resultante melhora a meia-vida. O uso da tecnologia de dAb também pode aumentar a eficácia da molécula de interesse.
[0134] Componentes adequados e moléculas adicionais para conjugação incluem as que são adequadas para o isolamento ou purificação. Exemplos particulares não limitativos incluem moléculas de ligação, tais como biotina (par de ligação específico biotina-avidina), um anticorpo, um receptor, um ligante, uma lectina, ou moléculas que compreendem um suporte sólido, incluindo, por exemplo, grânulos de plástico ou de poliestireno, placas ou grânulos, esferas magnéticas, tiras de teste e membranas.
[0135] Métodos de purificação, tal como cromatografia de troca catiônica, podem ser usados para separar conjugados por diferença de carga, o que separa efetivamente os conjugados nos seus vários pesos moleculares. Por exemplo, a coluna de troca catiônica pode ser carregada e depois lavada com ~ 20 mM de acetato de sódio, pH ~ 4, e depois eluída com um gradiente de NaCl linear (0 M a 0,5 M) tamponado a um pH de 3 a 5,5, de preferência a pH ~ 4,5. O conteúdo das frações obtidas por cromatografia de troca catiônica pode ser identificado pelo peso molecular usando métodos convencionais, por exemplo, espectroscopia de massa, SDS-PAGE, ou outros métodos conhecidos para separar entidades moleculares pelo peso molecular. Uma fração é então identificada, por conseguinte, a qual contém o conjugado possuindo o número desejado de PEGs ligados, purificado livre de sequências de proteínas não modificadas e de conjugados que têm outros números de PEGs ligados.
[0136] Ainda em outras concretizações, uma sequência peptídica da invenção está relacionada com um agente químico (por exemplo, uma imunotoxina ou agente quimioterapêutico), incluindo, mas não se limitando a, um agente citotóxico, incluindo o taxol, citocalasina B, gramicidina D, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, e análogos ou homólogos destes. Outros agentes químicos incluem, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina); agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, carmustina e lomustina,ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cisplatina); antibióticos (por exemplo, bleomicina); e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). As citotoxinas podem ser conjugadas com um peptídeo da invenção utilizando a tecnologia de ligante conhecida na técnica e aqui descrita.
[0137] Componentes adequados adicionais e moléculas para conjugação incluem os que são adequados para a detecção em um ensaio. Exemplos particulares não limitativos incluem marcadores detectáveis, tal como um radioisótopo (por exemplo, 125I; 35S, 32P; 33P), uma enzima que gera um produto detectável (por exemplo, luciferase, β-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre e fosfatase alcalina), uma proteína fluorescente, uma proteína cromogênica, corante (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína); metais emissores de fluorescência (por exemplo,152Eu); compostos quimioluminescentes (por exemplo, luminol e sais de acridínio); compostos bioluminescentes (por exemplo, luciferina); e proteínas fluorescentes. Marcações indiretas incluem anticorpos marcados ou detectáveis que se ligam a uma sequência peptídica, em que o anticorpo pode ser detectado.
[0138] Em certas concretizações, uma sequência peptídica da invenção é conjugada com um isótopo radioativo para gerar um radiofármaco citotóxico (radioimunoconjugados) útil como um agente de diagnóstico ou terapêutico. Exemplos de tais isótopos radioativos incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Métodos para a preparação de radioimunoconjugados são conhecidos dos versados na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados que estão disponíveis comercialmente incluem ibritumomab, tiuxetano, e tositumomab.
[0139] Outros meios e métodos incluídos na presente invenção para prolongar a meia-vida de circulação, aumentar a estabilidade, reduzir a depuração ou alterar a imunogenicidade ou alergenicidade de uma sequência peptídica da presente invenção envolvem a modificação da sequência peptídica por "HESylation" que utiliza derivados de amido hidroxietil ligados a outras moléculas a fim de modificar as características da molécula. Vários aspectos da HESylation são descritos em, por exemplo, Pedido de Patente dos EUA Nos. 2007/0134197 e 2006/0258607.
[0140] Qualquer um dos componentes e moléculas anteriores utilizados para modificar sequências peptídicas da invenção podem opcionalmente ser conjugados através de um ligante. Ligantes adequados incluem "ligantes flexíveis", que possuem geralmente um comprimento suficiente para permitir algum movimento entre as sequências peptídicas modificadas e os componentes e moléculas ligadas. As moléculas ligantes possuem geralmente cerca de 6-50 átomos de comprimento. As moléculas ligantes também podem ser, por exemplo, aril acetileno, oligômeros de etileno-glicol contendo 2-10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos ou suas combinações. Ligantes adequados podem ser facilmente selecionados e podem ser de qualquer comprimento adequado, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 aminoácidos (por exemplo, Gli).
[0141] Ligantes flexíveis exemplares incluem polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por exemplo, (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO:129) e GGGSn (SEQ ID NO:130), em que n é um número inteiro de pelo menos um), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, e outros ligantes flexíveis. Os polímeros de glicina e glicina-serina são relativamente não estruturados e, portanto, podem servir como uma amarra neutra entre componentes. Ligantes flexíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a GGSG (SEQ ID NO:131), GGSGG (SEQ ID NO:132), GSGSG (SEQ ID NO:133), GSGGG (SEQ ID NO:134), GGGSG (SEQ ID NO:189), e GSSSG (SEQ ID NO:135).
[0142] As sequências peptídicas da invenção, incluindo os variantes de FGF19 e FGF21 e subsequências e as fusões de FGF19/FGF21 e quimeras listados nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, bem como subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, têm uma ou mais atividades como aqui estabelecidas. Um exemplo de uma atividade é a modulação da homeostase de ácidos biliares. Outro exemplo de uma atividade é a estimulação reduzida ou formação de HCC, por exemplo, em comparação com FGF19. Um exemplo adicional de uma atividade é a atividade de aumento de lipídio (por exemplo, triglicerídeos, colesterol, não-HDL) ou HDL reduzida ou inferior, por exemplo, em comparação com FGF21. Um exemplo adicional de uma atividade é a atividade de redução de massa muscular magra inferior ou reduzida, por exemplo, em comparação com FGF21. Ainda, um outro exemplo de atividade é a ligação a FGFR4, ou ativação de FGFR4, por exemplo, sequências peptídicas que se ligam a FGFR4 com uma afinidade comparável ou superior a afinidade de ligação de FGF19para FGFR4; e sequências peptídicas que ativam FGFR4 a uma extensão ou quantidade comparável ou superior da que FGF19 ativa FGFR4. Ainda outros exemplos de atividades incluem o tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0143] Mais particularmente, sequências peptídicas da invenção, incluindo as variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 e as fusões de FGF19/FGF21 e quimeras listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, assim como subsequências, variantes e formas modificadas das sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências incluem aquelas com as seguintes atividades: sequências peptídicas que modulam ahomeostasia de ácido biliar ou tratamento de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar enquanto possui formação reduzida de HCC em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19, com qualquer uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; sequências peptídicas que possuem a maior atividade de modulação de ácido biliar em comparação com FGF19, ou sequência variante de FGF 19 com uma de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; sequências peptídicas possuindo menos atividade de aumento de lipídios (por exemplo, menos triglicerídeos, colesterol, não-HDL) ou mais atividade de aumento de HDL em comparação com FGF19, ou uma sequência variante de FGF 19 possuindo qualquer um de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO:171), WGDPV (SEQ ID NO:172), WGDI (SEQ ID NO:173), GDPI (SEQ ID NO:174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO:175), WGAPI (SEQ ID NO:176), AGDPI (SEQ ID NO:177), WADPI (SEQ ID NO:178), WGDAI (SEQ ID NO:179), WGDPA (SEQ ID NO:180), WDPI (SEQ ID NO:181), WGDI (SEQ ID NO:182), WGDP (SEQ ID NO:183) ou FGDPI (SEQ ID NO: 184) substituída para a sequência de WGDPI (SEQ ID NO: 170) nos aminoácidos 16-20 de FGF19; e sequências peptídicas possuindo menos atividade de redução de massa magra em comparação com FGF21.
[0144] Mais particularmente, sequências peptídicas da invenção, incluindo as variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 e as fusões de FGF19/FGF21 e quimeras listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, assim como subsequências, variantes e formas modificadas das sequências listadas nas Tabelas 1-10 e a Listagem de Sequências incluem aquelas com as seguintes atividades: sequências peptídicas que modulam a homeostasia de ácido biliar; sequências peptídicas que tratam um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar, sequências peptídicas que se ligam a FGFR4, ou ativam FGFR4, tais como sequências peptídicas que se ligam a FGFR4 com uma afinidade comparável ou superior à afinidade de ligação de FGF19 para FGFR4; sequências peptídicas que ativam FGFR4 a uma extensão ou quantidade equivalente ou maior do que FGF19 ativa FGFR4; sequências peptídicas que regulam para baixo (negativamente) ou reduzem a expressão do gene da aldo-ceto redutase, por exemplo, em comparação com FGF19; e sequências peptídicas que regulam para cima (positivamente) ou aumentam a expressão do gene família portadora de soluto 1, membro 2 (Slc1a2) em comparação com FGF21.
[0145] Tal como aqui descrito, as variantes incluem várias modificações e/ou truncagens N-terminais de FGF19, incluindo as variantes em que tenha havido uma substituição de um ou vários aminoácidos N-terminais de FG19 com aminoácidos de FGF21. Tais variantes incluem variantes possuindo atividade de abaixamento de glicose, bem como um perfil favorável de lipídios e não são tumorigênicos de forma mensurável ou detectável.
[0146] Em vários aspectos particulares, as alterações à região do Loop-8 de FGF19 (resíduos 127-129 são definidos como constituindo a região do Loop-8) são aqui divulgados e que têm atividade hipoglicemiante e também possuem parâmetros metabólicos favoráveis sem exibir tumorigenicidade substancial. Aqui, os resíduos 127-129 de FGF19 são definidos como constituindo a região do Loop-8, embora na literatura a região do loop-8 seja por vezes definida como incluindo ou consistindo em outros resíduos (por exemplo, resíduos 125-129). Como apresentado nos Exemplos 8 e 9, certas combinações de substituições de R127L e P128E ao quadro de FGF19 tiveram um efeito positivo inesperadamente positivo sobre a formação de HCC. Ainda mais surpreendentemente, uma combinação de substituições de R127L e P128E e uma substituição de Gln (Q) por Leu (L) na região do núcleo de FGF19 (ver, por exemplo, a sequência da região do núcleo indicada nas Tabelas 1-4, 9 e 10)tiveram um efeito ainda mais significativo na prevenção da formação de HCC. Assim, variantes da região do Loop-8 de FGF19 estão incluídas uma vez que podem reduzir ou eliminar a formação de HCC significativa, mensurável ou detectável. Além disso, o efeito de redução da formação de HCC pode ser melhorada por modificações aos resíduos de aminoácidos fora da região do Loop 8 (por exemplo, substituições de resíduos de aminoácidos na região do núcleo).
[0147] As atividades como, por exemplo, a modulação da homeostase do ácido biliar, atividade de abaixamento de glicose, análise de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar, formação de HCC ou tumorigênese, atividade de aumento de lipídios, ou atividade de redução da massa magra podem ser determinadas em um animal, tal como um ratinho db/db. A medição da ligação a FGFR4 ou ativação de FGFR4 pode ser determinada através de ensaios aqui revelados ou conhecidos do versado na técnica.
[0148] O termo "ligar", ou "ligação", quando utilizado em referência a uma sequência peptídica, significa que a sequência peptídica interage a nível molecular. Assim, uma sequência peptídica que se liga a FGFR4 se liga à totalidade ou a uma parte da sequência de FGFR4. A ligação específica e seletiva pode ser distinguida da ligação não específica utilizando ensaios conhecidos na técnica (por exemplo, ligação de competição, imunoprecipitação, ELISA, citometria de fluxo, Western blot).
[0149] Peptídeos e peptidomiméticos podem ser produzidos e isolados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os peptídeos podem ser sintetizados, no todo ou em parte, usando métodos químicos (ver, por exemplo, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); e Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). A síntese de peptídeos pode ser realizada usando várias técnicas de fase sólida (ver, Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3 (1997)) e a síntese automática pode ser conseguida, por exemplo, utilizando o ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante. Os peptídeos e miméticos de peptídeos também podem ser sintetizados utilizando metodologias combinatórias. Resíduos sintéticos e polipeptídeos incorporando miméticos podem ser sintetizados utilizando uma variedade de processos e metodologias conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY). Modified peptides can be produced by chemical modification methods (ver, por exemplo, Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995); e Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994)). Variações de sequências peptídicas, derivados, substituições e modificações também podem ser feitas utilizando métodos tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos (local-dirigida), varrimento de alaninas, e mutagênese baseada em PCR. A mutagênese dirigida ao local (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487 (1987)), mutagênese de cassete (Wells et al., Gene 34:315 (1985)), mutagênese de seleção de restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986)) e outras técnicas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir sequências peptídicas da invenção, variantes, fusões e quimeras, e variações, derivados, substituições e modificações destes.
[0150] Uma sequência peptídica "sintetizada" ou "fabricada" é um peptídeo feito por qualquer método que envolva a manipulação pela mão do homem. Tais métodos incluem, mas não estão limitados ao acima mencionado, tal como a síntese química, a tecnologia de DNA recombinante, a fragmentação bioquímica ou enzimática de moléculas maiores, e combinações dos anteriores.
[0151] As sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), também podem ser modificadas de modo a formar uma molécula quimérica. De acordo com a invenção, existem sequências peptídicas previstas que incluem um domínio heterólogo. Tais domínios podem ser adicionados ao terminal amino ou ao terminal carboxil da sequência peptídica. Domínios heterólogos também podem ser posicionados dentro da sequência peptídica, e/ou alternativamente flanqueados por sequências de aminoácidos derivadas de FGF19 e/ou FGF21.
[0152] O termo "peptídeo" inclui também dímeros ou multímeros (oligômeros) de peptídeos. De acordo com a invenção, são também proporcionados dímeros ou multímeros (oligômeros) das sequências peptídicas exemplificadas, bem como subsequências e variantes, formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 1-10 e na Listagem de Sequências).
[0153] A invenção proporciona ainda moléculas de ácido nucleico que codificam para sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências listadas nas Tabelas 1-10 e na Listagem de Sequências, e vetores que incluem o ácido nucleico que codifica o peptídeo. Por conseguinte, "ácidos nucleicos" incluem aqueles que codificam as sequências peptídicas exemplificadas aqui descritas, bem como as subsequências de codificação funcionais, variantes de sequência e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas, desde que os precedentes retenham pelo menos atividade ou função detectável ou mensurável. Por exemplo, uma subsequência, uma variante ou uma forma modificada de uma sequência peptídica exemplificada aqui divulgada (por exemplo, uma sequência listada nas Tabelas 1-10 e na Listagem de Sequências), que retém alguma capacidade para diminuir ou reduzir a glicose, fornecer a homeostase normal da glicose, ou reduzir as condições histopatológicas relacionadas com a hiperglicemia crônica ou aguda in vivo, etc.
[0154] O ácido nucleico, que também pode ser referido aqui como um gene, polinucleotídeo, sequência de nucleotídeos, iniciador, oligonucleotídeo ou sonda refere-se a polímeros contendo pirimidina e purina naturais ou modificados e de qualquer comprimento, seja polirribonucleotídeos ou polidesoxirribonucleotídeos ou polirribo-polidesoxirribo nucleotídeos misturados e formas a-anoméricas dos mesmos. Os dois ou mais polímeros contendo pirimidina e purina são tipicamente ligados por uma ligação fosfoéster ou análoga. Os termos podem ser utilizados intercambiavelmente para se referir a todas as formas de ácido nucleico, incluindo ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples, dupla ou triplex, linear ou circular. Os ácidos nucleicos incluem DNA genômico e cDNA. O ácido nucleico RNA pode ser RNAm excisado ou não excisado, rRNA, tRNA ou antissenso. Os ácidos nucleicos incluem nucleotídeos de ocorrência natural, sintéticos, bem como seus análogos e derivados.
[0155] Como resultado da degenerescência do código genético, as moléculas de ácido nucleico incluem sequências degeneradas no que diz respeito a moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências peptídicas da invenção. Assim, as sequências de ácido nucleico degeneradas que codificam sequências peptídicas, incluindo variantes e subsequências, e formas modificadas das sequências peptídicas aqui exemplificadas (por exemplo, sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), são fornecidas. O termo "complementar", quando usado em referência a uma sequência de ácido nucleico, significa que as regiões mencionadas são 100% complementares, isto é, exibem 100% de emparelhamento de bases com nenhum desemparelhamento.
[0156] O ácido nucleico pode ser produzido utilizando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos de síntese química e clonagem padrão, e pode ser alterado intencionalmente por mutagênese dirigida ao local ou outras técnicas recombinantes conhecidas de um versado na técnica. A pureza de polinucleotídeos pode ser determinada através de sequenciamento, eletroforese em gel, espectrometria de UV.
[0157] Os ácidos nucleicos podem ser inseridos em uma construção de ácido nucleico em que a expressão do ácido nucleico é influenciada ou regulada por um "elemento de controle de expressão", aqui referido como um "cassete de expressão". O termo "elemento de controle de expressão" refere-se a um ou mais elementos de sequência de ácido nucleico que regulam a expressão ou a influência de uma sequência de ácido nucleico à qual ele está operacionalmente ligado. Um elemento de controle de expressão pode incluir, conforme apropriado, promotores, potenciadores, terminadores de transcrição, silenciadores de gene, um códon de partida (por exemplo, ATG) na frente de um gene que codifica proteína, etc.
[0158] Um elemento de controle de expressão operativamente ligado a uma sequência de ácido nucleico controla a transcrição e, quando apropriado, a tradução da sequência de ácido nucleico. O termo "ligado operacionalmente" refere-se a uma justaposição em que os componentes referidos estão numa relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Tipicamente, os elementos de controle de expressão são justapostos nas extremidades 5' ou 3' dos genes, mas também podem ser intrônicos.
[0159] Os elementos de controle de expressão incluem elementos que ativam a transcrição de forma constitutiva, que são induzíveis (isto é, requerem um sinal externo ou estímulos para ativação), ou desrepressíveis (isto é, necessitam de um sinal para desligar a transcrição; quando o sinal não está presente, a transcrição é ativada ou "desreprimida"). Também incluídos nos cassetes de expressão da presente invenção estão elementos de controle suficientes para tornar a expressão gênica controlável para tipos de células ou tecidos específicos (isto é, elementos de controle específicos do tecido). Tipicamente, tais elementos estão localizados a montante ou a jusante (isto é, 5' e 3') da sequência de codificação. Os promotores estão geralmente posicionados a 5' da sequência de codificação. Os promotores, produzidos por técnicas de DNA recombinante ou sintéticas, podem ser utilizados para proporcionar a transcrição dos polinucleotídeos da invenção. Um "promotor" significa tipicamente um elemento de sequência mínima suficiente para direcionar a transcrição.
[0160] Os ácidos nucleicos podem ser inseridos num plasmídeo para a transformação numa célula hospedeira e para a expressão subsequente e/ou manipulação genética. Um plasmídeo é um ácido nucleico que pode ser estavelmente propagado numa célula hospedeira; plasmídeos podem, opcionalmente, conter os elementos de controle da expressão, a fim de dirigir a expressão do ácido nucleico. Para os fins desta invenção, um vetor é sinônimo de um plasmídeo. Os plasmídeos e vetores contêm geralmente pelo menos uma origem de replicação para a propagação em uma célula e um promotor. Os plasmídeos e vetores também podem incluir um elemento de controle de expressão para a expressão numa célula hospedeira, e são, portanto, úteis para a expressão e/ou manipulação genética de sequências peptídicas que codificam ácidos nucleicos, expressando sequências peptídicas em células hospedeiras e organismos (por exemplo, um sujeito em necessidade de tratamento), ou produzindo sequências peptídicas, por exemplo.
[0161] Tal como aqui utilizado, o termo "transgene" significa um polinucleotídeo que foi introduzido numa célula ou organismo de artifício. Por exemplo, uma célula possuindo um transgene, o transgene foi introduzido por manipulação genética ou "transformação" da célula. Uma célula ou progenia dela em que o transgene foi introduzido é referida como uma "célula transformada" ou "transformante". Tipicamente, o transgene está incluído na progenitura do transformante ou torna-se uma parte do organismo que se desenvolve a partir da célula. Os transgenes podem ser inseridos no DNA cromossômico ou mantidos como um plasmídeo auto-replicante, YAC, minicromossomo, ou semelhantes.
[0162] Promotores do sistema bacteriano incluem promotores T7 e induzíveis tais como pL de bacteriófago À, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e promotores responsivos de tetraciclina. Os promotores do sistema de células de inseto incluem promotores constitutivos ou induzíveis (por exemplo, ecdisona). Promotores constitutivos de células de mamíferos incluem SV40, RSV, vírus do papiloma bovino (BPV) e outros promotores de vírus, ou promotores induzíveis derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína IIA; promotor de choque térmico) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o adenovírus promotor tardio; o vírus do tumor mamário do camundongo de repetição terminal longa induzida). Alternativamente, um genoma retroviral pode ser geneticamente modificado para introduzir e dirigir a expressão de uma sequência peptídica em células hospedeiras apropriadas.
[0163] Como os métodos e utilizações da presente invenção incluem distribuição in vivo, os sistemas de expressão incluem adicionalmente vetores concebidos para utilização in vivo. Exemplos particulares não limitativos incluem vetores adenovirais (Patentes dos EUA Nos. 5.700.470 e 5.731.172), vetores adeno-associados (Patente dos EUA No. 5.604.090), vetores de vírus herpes simplex (Patente dos EUA No. 5.501.979), vetores retrovirais (Patentes dos EUA Nos. 5.624.820, 5.693.508 e 5.674.703), vetores BPV (Patente dos EUA N° 5.719.054), vetores de CMV (Patente dos EUA No. 5.561.063) e parvovírus, rotavírus, vírus de Norwalk e vetores lentivirais (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 6.013.516). Os vetores incluem aqueles que entregam genes às células do trato intestinal, incluindo as células estaminais (Croyle et al., Gene Ther. 5:645 (1998); S.J. Henning, Adv. Drug Deliv. Rev. 17:341 (1997), Patentes dos EUA Nos. 5.821.235 e 6.110.456). Muitos desses vetores foram aprovados para estudos em seres humanos.
[0164] Os vetores de levedura incluem promotores constitutivos e induzíveis (ver, por exemplo, Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; e, Strathern et al., The Molecular Biology de the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II). Um promotor constitutivo de levedura tal como um ADH ou LEU2 ou um promotor induzível tal como GAL pode ser utilizado ((R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Os vetores que facilitam a integração das sequências de ácidos nucleicos estranhos num cromossomo de levedura, através de recombinação homóloga, por exemplo, são conhecidos na técnica. Cromossomos artificiais de levedura (YAC) são normalmente utilizados quando os polinucleotídeos inseridos são muito grandes para os vetores mais convencionais (por exemplo, superior a cerca de 12 Kb).
[0165] Os vetores de expressão também podem conter um marcador selecionável que confere resistência a uma pressão seletiva ou marcador identificável (por exemplo, beta-galactosidase), permitindo assim que as células que possuem o vetor a ser selecionado, sejam cultivadas e expandidas. Alternativamente, um marcador selecionável pode ser um segundo vetor que é co- transfectado a uma célula hospedeira com um primeiro vetor contendo um ácido nucleico que codifica para uma sequência peptídica. Sistemas de seleção incluem, mas não estão limitados ao gene da timidina-quinase do vírus herpes simplex (Wigler et al., Cell. 11:223 (1977)), gene da hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), e genes da adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell. 22:817 (1980)) que podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, a resistência antimetabólito pode ser utilizada como a base de seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); o gene gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); gene da neomicina, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); puromicina; e o gene da higromicina, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Genes selecionáveis adicionais incluem o trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); e ODC (ornitina descarboxilase), que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).
[0166] De acordo com a invenção, são proporcionadas célula(s) transformadas (in vitro, ex vivo e in vivo) e células hospedeiras que produzem uma variante ou fusão de FGF19 e/ou FGF21 como aqui estabelecido, onde a expressão da variante ou fusão de FGF19 e/ou FGF21 é conferida por um ácido nucleico que codifica a variante ou fusão de FGF19 e/ou FGF21. Células transformadas e hospedeiras que expressam as sequências peptídicas da invenção incluem tipicamente um ácido nucleico que codifica a sequência peptídica da invenção. Numa concretização, uma célula hospedeira ou transformada é uma célula procariótica. Numa outra concretização, uma célula hospedeira ou transformada é uma célula eucariótica. Em vários aspectos, a célula eucariótica é uma célula de levedura ou mamífero (por exemplo, humano, primata, etc.).
[0167] Tal como aqui utilizado, uma célula "transformada" ou "hospedeira" é uma célula na qual um ácido nucleico é introduzido que pode ser propagado e/ou transcrito para a expressão de uma sequência peptídica codificada. O termo inclui também qualquer descendência ou subclones da célula hospedeira.
[0168] Células transformadas e hospedeiras incluem, mas não estão limitados a, microrganismos tais como bactérias e leveduras; e células de plantas, insetos e mamíferos. Por exemplo, as bactérias transformadas com vetores de expressão de ácido nucleico de bacteriófago recombinante, ácido nucleico de plasmídeo ou ácido nucleico de cosmídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (p.ex., plasmídeo Ti); sistemas de células de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus); e sistemas de células animais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, retrovírus, adenovírus, vírus vaccinia) ou sistemas de células animais transformadas por engenharia para a propagação ou expressão transiente ou estável.
[0169] Para os usos de terapia de genes e métodos, uma célula transformada pode estar em um sujeito. Uma célula num indivíduo pode ser transformada com um ácido nucleico que codifica uma sequência peptídica da invenção como aqui estabelecida in vivo. Alternativamente, uma célula pode ser transformada in vitro com um transgene ou polinucleotídeo, e em seguida transplantada para um tecido do sujeito, a fim de efetuar o tratamento. Alternativamente, um isolado de células primárias ou uma linha celular estabelecida pode ser transformada com um transgene ou um polinucleotídeo que codifica uma variante de FGF19 e/ou FGF21 ou uma fusão/sequência quimérica (ou variante) do mesmo, tal como uma sequência peptídica quimérica, incluindo a totalidade ou uma porção de FGF19, ou incluindo a totalidade ou uma porção de FGF21, e em seguida opcionalmente transplantada para um tecido de um sujeito.
[0170] Células-alvo não limitativas para a expressão de sequências peptídicas, particularmente para a expressão in vivo, incluem células do pâncreas (células ilhotas), células musculares, células das mucosas e células endócrinas. Tais células endócrinas podem proporcionar a produção induzível (secreção) de uma variante de FGF19 e/ou FGF21, ou uma fusão/sequência quimérica (ou variante) seu, tal como uma sequência peptídica quimérica incluindo a totalidade ou uma porção de FGF19, ou incluindo a totalidade ou uma porção de FGF21. Células adicionais para transformar incluem células estaminais ou outras células multipotentes ou pluripotentes, por exemplo, as células progenitoras que se diferenciam em várias células do pâncreas (células de ilhotas), células musculares, células das mucosas e células endócrinas. O alvejamento de células estaminais fornece uma expressão de longo prazo de sequências peptídicas da invenção.
[0171] Tal como aqui utilizado, o termo "cultura", quando utilizado em referência a uma célula, significa que a célula é cultivada in vitro. Um exemplo particular de tal célula é uma célula isolada de um indivíduo e cultivada ou adaptada para crescimento em cultura de tecidos. Outro exemplo é uma célula geneticamente manipulada in vitro, e transplantada de volta para o mesmo sujeito ou diferente.
[0172] O termo "isolado", quando utilizado em referência a uma célula, significa uma célula que é separada do seu ambiente in vivo que ocorre naturalmente. Células "cultivadas" e "isoladas" podem ser manipuladas pela mão do homem, tais como geneticamente transformadas. Estes termos incluem toda a descendência das células, incluindo as células de progenia que podem não ser idênticas à célula parental, devido a mutações que ocorrem durante a divisão celular. Os termos não incluem um ser humano inteiro.
[0173] Ácidos nucleico que codificam sequências peptídicas da invenção podem ser introduzidos para a expressão estável em células de um organismo inteiro. Tais organismos, incluindo animais transgênicos não humanos, são úteis para estudar o efeito da expressão de peptídeos em todo o animal e o benefício terapêutico. Por exemplo, como aqui divulgado, a produção de uma variante de FGF19 e/ou FGF21 ou uma fusão/sequência quimérica (ou variante) da mesma, tal como uma sequência peptídica quimérica, incluindo a totalidade ou uma porção de FGF19, ou incluindo a totalidade ou uma porção de FGF21 como aqui estabelecido, em camundongos modulou a homeostase de ácido biliar.
[0174] Linhagens de ratinhos que desenvolvem ou são susceptíveis ao desenvolvimento de uma doença em particular (por exemplo, diabetes, desordens degenerativas, câncer, etc.) também são úteis para a introdução de proteínas terapêuticas tal como aqui descrito a fim de estudar o efeito da expressão da proteína terapêutica no rato suscetível à doença. Modelos transgênicos e genéticos animais que são susceptíveis a doença específica ou condições fisiológicas, tais como ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ), são alvos adequados para a expressão de variantes de FGF19 e/ou FGF21, fusões/sequências quiméricas (ou variantes) destas, tal como uma sequência peptídica quimérica, incluindo a totalidade ou uma porção de FGF19, ou incluindo a totalidade ou uma porção de FGF21, como aqui estabelecido. Assim, de acordo com a invenção, são proporcionados animais transgênicos não humanos que produzem uma variante de FGF19 e/ou FGF21, ou uma fusão/sequência quimérica (ou variante) do mesmo, tal como uma sequência peptídica quimérica, incluindo a totalidade ou uma porção de FGF19, ou incluindo a totalidade ou uma porção de FGF21, cuja produção não ocorre naturalmente no animal que é conferido por um transgene presente em células somáticas ou germinais do animal.
[0175] O termo "animal transgênico" refere-se a um animal cujas células de linha somática ou germinal contém informação genética recebida, direta ou indiretamente, através de manipulação genética deliberada a nível subcelular, tal como por microinjeção ou infecção com vírus recombinante. O termo "transgênico" inclui ainda as células ou tecidos (isto é, "célula transgênica", "tecido transgênico") obtidos a partir de um animal transgênico geneticamente manipulado como aqui descrito. No presente contexto, um "animal transgênico" não abrange animais produzidos por cruzamento clássico ou fertilização in vitro, mas sim indica animais nos quais uma ou mais células recebem uma molécula de ácido nucleico. Animais transgênicos da invenção podem ser heterozigóticos ou homozigóticos no que diz respeito ao transgene. Métodos para produzir animais transgênicos, incluindo ratinhos, ovelhas, porcos e sapos, são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patentes dos EUA Nos. 5.721.367, 5.695.977, 5.650.298, e 5.614.396) e, como tal, estão adicionalmente incluídos.
[0176] Sequências peptídicas, ácidos nucleicos que codificam sequências peptídicas, vetores e células hospedeiras transformadas que expressam as sequências peptídicas incluem formas isoladas e purificadas. O termo "isolado", quando utilizado como um modificador de uma composição da invenção, significa que a composição é separada, substancialmente de modo completo ou pelo menos em parte, de um ou mais componentes de um ambiente. Em geral, as composições que existem na natureza, quando isoladas, são substancialmente isentas de um ou mais materiais com os quais normalmente se associam em natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácido nucleico, lipídio, carboidrato ou membrana celular. O termo "isolado" não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como as variantes, modificações ou formas derivatizadas, fusões e quimeras, multímeros/oligômeros, etc., ou formas expressas em células hospedeiras. O termo "isolado" também não exclui formas (por exemplo, composições farmacêuticas, composições de combinação, etc.) nas quais existem combinações, qualquer uma das quais é produzida pela mão do homem.
[0177] Uma composição "isolada" também pode ser "purificada" quando livre de alguns, um número substancial de, ou a maioria ou a totalidade de um ou mais outros materiais, tais como um contaminante ou a substância indesejada ou material. As sequências peptídicas da invenção geralmente são não conhecidas ou acreditadas de existir na natureza. No entanto, para uma composição que existe na natureza, uma composição isolada será geralmente livre de alguns, um número substancial de, ou a maioria ou todos os outros materiais com os quais tipicamente se associa na natureza. Assim, uma sequência peptídica isolada que também ocorre na natureza não inclui polipeptídeos ou polinucleotídeos presentes entre milhões de outras sequências, tais como proteínas de uma biblioteca de proteínas ou ácidos nucleicos de uma biblioteca genômica ou de cDNA, por exemplo. Uma composição "purificada" inclui combinações com uma ou mais outras moléculas inativas ou ativas. Por exemplo, uma sequência peptídica da presente invenção combinada com outra droga ou agente, tal como uma droga de redução da glicemia ou agente terapêutico, por exemplo.
[0178] Tal como aqui utilizado, o termo "recombinante", quando utilizado como um modificador de sequências peptídicas, sequências peptídicas de codificação de ácidos nucleicos, etc., significa que as composições foram manipuladas (isto é, engenheiradas) de uma forma que geralmente não ocorre na natureza (por exemplo, in vitro). Um exemplo particular de um peptídeo recombinante seria onde uma sequência peptídica da invenção é expressa por uma célula transfectada com um ácido nucleico que codifica a sequência peptídica. Um exemplo particular de um ácido nucleico recombinante seria onde um ácido nucleico (por exemplo,DNA genômico ou cDNA) que codifica uma sequência peptídica clonado num plasmídeo, com ou sem regiões 5', 3' ou de íntrons que o gene é normalmente contíguo no genoma do organismo. Outro exemplo de um peptídeo recombinante ou ácido nucleico é uma sequência híbrida ou de fusão, tal como uma sequência peptídica quimérica compreendendo uma porção de FGF19 e uma porção de FGF21.
[0179] De acordo com a invenção, são proporcionadas composições e misturas de sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 listadas nas Tabelas 1-10 e a Listagem de Sequências, e as fusões de FGF19/FGF21 e quimeras nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências). Numa concretização, uma mistura inclui uma ou mais sequências peptídicas e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Numa outra concretização, uma mistura inclui uma ou mais sequências peptídicas e uma droga adjuvante ou agente terapêutico, tal como uma droga ou agente terapêutico de modulação da homeostase de ácido biliar ou antidiabético, ou de redução da glicemia. As combinações, tais como uma ou mais sequências peptídicas em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, com um ou mais de uma droga ou agente terapêutico de modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento para um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar, ou antidiabético, ou de redução da glicemia também são fornecidos. Tais combinações de sequência peptídica da invenção com uma outra droga ou agente, tais como uma droga ou agente terapêutico de modulação da homeostase de ácido biliar ou tratamento relacionado ou associado ao ácido biliar, ou de redução da glicemia, por exemplo, são úteis de acordo com os métodos da invenção e as utilizações, por exemplo, para o tratamento de um sujeito.
[0180] As combinações também incluem a incorporação de sequências peptídicas ou ácidos nucleicos da invenção em partículas ou substâncias poliméricas, tais como poliésteres, carboidratos, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinila, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina, ou copolímeros de lactídeo/glicolídeo, copolímeros de polilactídeo/glicolídeo ou copolímeros de etilenovinilacetato; aprisionamento em microcápsulas preparadas por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, pelo uso de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas, ou microcápsulas de poli(metilmetacrolato), respectivamente; incorporação na entrega de drogas e de dispersão de sistemas coloidais tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas baseados em lipídios (por exemplo, grupos acil N-graxos, tais como N-lauroíl, N-oleoíl, aminas graxas tais como dodecilamina, amina oleoíla, etc., ver Patente dos EUA No. 6.638.513), incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomos, por exemplo.
[0181] Os peptídeos da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, e a fusões de FGF19/FGF21 e quimeras listados nas Tabelas 1-10 e a Listagem de Sequências) como aqui descritas podem ser utilizadas para modular o metabolismo da glicose e facilitar o transporte de glicose do sangue para os órgãos metabólicos fundamentais, tais como o músculo, fígado e tecido adiposo. Tais sequências peptídicas podem ser produzidas em quantidades suficientes ou eficazes para restaurar a tolerância à glicose e/ou para melhorar ou proporcionar a homeostase normal da glicose.
[0182] Tal como aqui divulgado, a administração de várias sequências peptídicas de fusão e variantes de FGF19 e FGF21 a ratos modulou com sucesso a homeostasia de ácido biliar. Além disso, em contraste com FGF19, certas sequências peptídicas não estimularam ou induziram a formação de HCC ou tumorigênese em ratinhos. Assim, a administração de peptídeos da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os variantes e subsequências de FGF19 e FGF21 listados nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências, e fusões de FGF19/FGF21 e quimeras listados nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), num animal, seja direta ou indiretamente por métodos in vivo ou ex vivo (por exemplo, administrando a variante ou peptídeo de fusão, um ácido nucleico que codifica a variante ou o peptídeo de fusão, ou uma célula transformada ou vetor de terapia de gene expressando a variante ou peptídeo de fusão), pode ser utilizada para tratar vários distúrbios, tais como distúrbios associados ou relacionados ao ácido biliar.
[0183] Consequentemente, a invenção inclui métodos e usos in vitro, ex vivo e in vivo (por exemplo, sobre ou dentro de um sujeito). Esses métodos e utilizações podem ser praticados com qualquer uma das sequências peptídicas da invenção aqui estabelecidas.
[0184] De acordo com a invenção, são proporcionados métodos de tratamento de um sujeito possuindo, ou em risco de possuir, um distúrbio. Em várias concretizações, um método inclui a administração de uma sequência peptídica, tal como um variante de FGF19 ou FGF21, fusão ou quimera aqui revelados (ver, por exemplo, Tabelas 1-10), ou uma subsequência, uma variante ou uma forma modificada de uma variante de FGF19 ou FGF21, fusão ou quimera aqui revelados (ver, por exemplo, as Tabelas 1-10 e a Listagem de Sequências), a um sujeito numa quantidade eficaz para tratar o distúrbio.
[0185] Distúrbios exemplares que podem ser tratados, prevenidos, e semelhantes com os peptídeos da invenção, e métodos e utilizações, incluem desordens relacionadas ou associadas ao ácido biliar. Exemplos não limitantes de doenças e distúrbios incluem: síndrome metabólica; uma desordem relacionadas com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio do duto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)) levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades da síntese de ácidos biliares, tais como as que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal. Para o tratamento, as sequências peptídicas da invenção podem ser administradas a sujeitos com necessidade de modulação da homeostase de ácido biliar ou possuindo um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar. As sequências peptídicas da invenção também podem ser úteis em outras desordens hiperglicêmicas relacionadas, incluindo lesão renal (por exemplo, danos do túbulo ou nefropatia), degeneração do fígado, lesões oculares (por exemplo, retinopatia diabética ou cataratas), e desordens do pé diabético; Dislipidemias e suas sequelas, tais como, por exemplo, aterosclerose, doenças da artéria coronária, doenças cerebrovasculares e semelhantes.
[0186] Outras condições que podem ser associadas com a síndrome metabólica, tais como a obesidade e a massa corporal elevada (incluindo as condições co-mórbidas destes, tais como, mas não limitadas a, doença hepática não alcoólica gordurosa (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), e síndrome do ovário policístico (PCOS)), e também incluem tromboses, estados de hipercoagulabilidade e pró-trombóticos (arteriais e venosos), hipertensão (incluindo hipertensão portal (definida como um gradiente de pressão venoso hepático (HVPG) superior a 5 mm Hg), doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral e insuficiência cardíaca; distúrbios ou condições em que as reações inflamatórias estão envolvidas, incluindo a aterosclerose, doenças crônicas do intestino inflamatório (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerativa), asma, lúpus eritematoso, artrite, ou outras desordens inflamatórias reumáticas, distúrbios do ciclo celular ou processos de diferenciação celular, tais como tumores de células adiposas, carcinomas lipomatosos, incluindo, por exemplo, lipossarcoma, tumores sólidos, e neoplasmas; doenças neurodegenerativas e/ou desordens dos sistemas nervosos central e periférico e/ou doenças neurológicas que envolvem processos neuro-inflamatórios e/ou outras neuropatias periféricas, incluindo a doença de Alzheimer, esclerose múltipla, doença de Parkinson, leucoencefalopatia multifocal progressiva e síndrome de Guillain-Barre desmielinizante; doenças de pele e dermatológicas e/ou distúrbios de processos de cura de feridas, incluindo dermatoses eritêmato-escamosas; e outras doenças tais como a síndrome X, osteoartrite, e síndrome de angústia respiratória aguda.
[0187] Tal como aqui utilizado, o termo "distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar", quando utilizado em referência a uma condição de um indivíduo significa um nível anormal crônico ou transiente de um ácido biliar (um ou mais ácidos biliares) presente no sujeito. A condição pode ser causada por inibição, redução ou um atraso na síntese, metabolismo ou absorção de ácidos biliares de modo que o sujeito apresenta um nível de ácidos biliares que não é normalmente encontrado em indivíduos normais.
[0188] Tal como aqui descrito, a invenção inclui métodos de prevenção (por exemplo, em indivíduos predispostos a ter uma desordem(ns) em particular), atraso, retardo ou inibição da progressão de, o início de, ou tratamento de (por exemplo, melhoramento de) um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar em relação a um sujeito combinado apropriado de idade comparável, sexo, raça, etc.). Assim, em várias concretizações, um método da invenção para, por exemplo, modular a homeostase de ácido biliar ou tratar um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar inclui o contato ou a administração de um peptídeo da invenção, tal como definido no presente documento (por exemplo, uma variante ou fusão de FGF19 e/ou FGF21 como apresentado nas Tabelas 1-10 ou Listagem de Sequências, por exemplo) em uma quantidade eficaz para modular a homeostase de ácido biliar ou tratar um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar.
[0189] Além disso, a invenção inclui métodos de prevenção (por exemplo, em indivíduos predispostos a ter uma desordem(ns) em particular), retardo ou inibição da progressão de, retardo do surgimento de, ou tratamento de níveis indesejáveis ou níveis anormalmente baixos de ácidos biliares, todos os quais, por si só ou em combinação, podem levar, por exemplo, a uma desordem relacionada ou associada ao ácido biliar. Estas perturbações podem ser devido a, por exemplo, a predisposição genética ou dieta, por exemplo.
[0190] O termo "sujeito" ou "indivíduo" refere-se a um animal.Tipicamente, o animal é um mamífero que se beneficiaria do tratamento com uma sequência peptídica da invenção. Exemplos particulares incluem primatas (por exemplo, seres humanos), cães, gatos, cavalos, vacas, porcos e ovelhas.
[0191] Os indivíduos incluem os que têm uma desordem, por exemplo, um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar, tal como a síndrome metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio dos dutos biliares por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal; ou indivíduos que não têm uma doença, mas podem estar em risco de desenvolver a doença. Os indivíduos em risco de desenvolver um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar incluem, por exemplo, aqueles cuja dieta pode contribuir para o desenvolvimento de síndrome aguda ou metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de dutos biliares por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal; bem como aqueles que podem ter um histórico familiar ou predisposição genética para o desenvolvimento de um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar, tal como a síndrome metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra-hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de dutos biliares por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades da síntese de ácidos biliares, tais como as que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal.
[0192] Tal como aqui descrito, os métodos de tratamento incluem contatar ou administrar um peptídeo da invenção tal como aqui definido (por exemplo, uma variante ou fusão de FGF19 e FGF21 ou tal como estabelecido nas Tabelas 1-10 ou Listagem de Sequências, por exemplo) numa quantidade eficaz para alcançar uma resposta ou resultado desejado num sujeito. Um tratamento que resulta em uma resposta ou resultado desejado inclui diminuir, reduzir ou prevenir a gravidade ou frequência de um ou mais sintomas da condição no sujeito, por exemplo, uma melhoria na condição do sujeito ou um "efeito benéfico" ou "efeito terapêutico". Portanto, o tratamento pode aumentar ou reduzir ou impedir a gravidade ou a frequência de um ou mais sintomas da doença, estabilizar ou inibir a progressão ou agravamento da doença, e em alguns casos, inverter a desordem, transientemente (por exemplo, por 1-6, 6-12, ou 12-24 horas), a médio prazo (por exemplo, 1-6, 6-12, 12-24 ou 24-48 dias) ou a longo prazo (por exemplo, por 1-6, 6-12, 12-24, 24-48 semanas, ou mais do que 24 48 semanas). Assim, no caso de uma desordem relacionada ou associada ao ácido biliar, tal como síndrome metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra-hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de duto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal; por exemplo, o tratamento pode diminuir ou reduzir um ou mais sintomas ou efeitos do distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar.
[0193] Uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade suficiente" para utilização e/ou para o tratamento de um sujeito referem-se a uma quantidade que proporciona, em doses únicas ou múltiplas, por si só, ou em combinação com uma ou mais outras composições (agentes terapêuticos tal como uma droga ou tratamento para hiperglicemia), tratamentos, protocolos ou agentes de regimes terapêuticos, uma resposta detectável de qualquer período de tempo (transiente, médio ou longo prazo), um resultado desejado ou um benefício objetivo ou subjetivo para um sujeito de qualquer grau mensurável ou detectável ou por qualquer período de tempo (por exemplo, por horas, dias, meses, anos, ou curado). Tais quantidades são normalmente eficazes para melhorar uma doença, ou um, múltiplos, ou todos os sintomas adversos, consequências ou complicações da doença, a uma extensão mensurável, embora a redução ou inibição de uma progressão ou agravamento da doença seja considerada um resultado satisfatório.
[0194] Tal como aqui utilizado, o termo "melhorar" significa uma melhoria no distúrbio do sujeito, uma redução na severidade da doença, ou uma inibição da progressão ou agravamento da doença (por exemplo, a estabilização do distúrbio). No caso de um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar (por exemplo, síndrome metabólica, uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes do tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, o PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida droga (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra-hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio do duto biliar por cálculos biliares); má absorção de ácidos biliares e outros distúrbios que envolvem a intestino delgado distal, incluindo ressecção ileal, doenças inflamatórias intestinais (por exemplo, a doença de Crohn e colite ulcerosa), doenças que prejudicam a absorção de ácidos biliares não de outra forma caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado, e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal; por exemplo, uma melhoria pode ser uma diminuição ou uma redução em um ou mais sintomas ou os efeitos da doença.
[0195] Por conseguinte, um benefício terapêutico ou melhoria não precisa ser ablação completa de qualquer um, maioria ou todos os sintomas, complicações, consequências ou causas subjacentes associadas com a desordem ou doença. Assim, um ponto final satisfatório é obtido quando há uma melhoria incremental transiente, em médio ou longo prazo, ou uma redução parcial na ocorrência, frequência, gravidade, progressão, ou duração, ou inibição ou reversão, de um ou mais sintomas adversos associados ou complicações ou consequências ou causas subjacentes, agravamento ou progressão (por exemplo, estabilização de um ou mais sintomas ou complicações da condição, distúrbio ou doença), do distúrbio ou doença, ao longo de um período de tempo (horas, dias, semanas, meses, etc.).
[0196] Assim, no caso de uma doença tratável por uma sequência peptídica da invenção, a quantidade de peptídeo suficiente para melhorar uma doença dependerá do tipo, gravidade e extensão, ou duração da doença, o efeito terapêutico ou resultado desejado, e pode ser facilmente determinada pelo versado na técnica. As quantidades apropriadas também irão depender do sujeito individual (por exemplo, a biodisponibilidade no sujeito, sexo, idade, etc.). Por exemplo, uma restauração transiente ou parcial da homeostase do ácido biliar normal num sujeito pode reduzir a quantidade de dosagem ou a frequência de um medicamento utilizado para tratar a síndrome metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de duto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal; mesmo que não tenha resultado a liberdade completa de tratamento. Uma quantidade eficaz pode ser determinada, por exemplo, medindo um ou mais efeitos fisiológicos relevantes.
[0197] Os métodos e utilizações da presente invenção para tratar um sujeito são aplicáveis para a profilaxia para evitar ou reduzir a probabilidade de uma desordem num indivíduo, tal como um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar. Alternativamente, os métodos e utilizações podem ser praticados durante ou após o tratamento de um sujeito. Por exemplo, antes, durante ou após o tratamento de um sujeito para melhorar a homeostase de ácido biliar utilizando outro medicamento ou agente terapêutico, por exemplo, um método ou utilização da invenção, por exemplo, uma sequência peptídica da invenção pode ser administrada ao sujeito. Além disso, uma composição tal como uma sequência peptídica da invenção pode ser combinada com outro fármaco ou agente, tal como um fármaco de estabilização do ácido biliar ou agente terapêutico, por exemplo.
[0198] Assim, os métodos e utilizações da presente invenção para tratar um sujeito podem ser praticados antes, substancialmente contemporaneamente com ou seguindo um outro tratamento, e podem ser complementados com outras formas de terapia. Terapias complementares incluem outros tratamentos de diminuição de glicose, como a insulina, um melhorador da sensibilidade à insulina e outros tratamentos com drogas, uma mudança na dieta (baixo açúcar, gorduras, etc.), cirurgia de perda de peso (redução do volume de estômago por bypass gástrico, gastrectomia), banda gástrica, balão gástrico, manga gástrica, etc. Por exemplo, um método ou utilização da presente invenção para o tratamento de uma desordem hiperglicêmica ou de resistência à insulina podem ser utilizados em combinação com outros medicamentos ou composições farmacêuticas que baixam a glicose ou aumentam a sensibilidade à insulina num sujeito.
[0199] A presente invenção contempla a terapia de combinaçãocom vários agentes (e classes dos mesmos), incluindo 1) insulina,por exemplo, bolus e análogos basais), miméticos de insulina e agentes que acarretam na estimulação da secreção de insulina, incluindo sulfonilureias (por exemplo, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, glibenclamida, glimepirida, glipizida) e meglitinidas (por exemplo, repaglinida (PRANDIN) e Nateglinida (STARLIX)); 2) biguanidas (por exemplo, metformina (GLUCOPHAGE)) e outros agentes que atuam através da promoção da utilização de glicose, reduzindo a produção de glicose hepática e/ou diminuindo a produção de glicose intestinal; 3) inibidores da alfa-glicosidase (por exemplo, acarbose e miglitol) e outros agentes que retardam a digestão de carboidratos e, consequentemente, a absorção a partir do intestino e reduzem a hiperglicemia pós-prandial; 4) tiazolidinedionas (por exemplo, rosiglitazona (AVANDIA), troglitazona (REZULIN), pioglitazona (ACTOS), glipizida, balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazone, darglitazona que melhora a ação da insulina (por exemplo, por sensibilização à insulina), promovendo assim a utilização de glicose em tecidos periféricos; 5) peptídeos semelhantes ao glucagon, incluindo os inibidores DPP-IV (por exemplo, a vildagliptina (GALVUS) e sitagliptina (JANUVIATM)) e Peptídeo Semelhante ao Glucagon-1 (GLP-1) e agonistas de GLP-1 e análogos (por exemplo, exenatida (BYETTA e ITCA 650 (uma bomba osmótica inserida subcutaneamente que fornece um análogo de exenatida ao longo de um período de 12 meses; Intarcia, Boston, MA)); 6) e análogos resistentes a DPP- IV (incretinomiméticos), agonistas de PPAR gama, agonistas de PPAR de dupla atuação, agonistas de PPAR de pan-atuação, inibidores de PTP1B, inibidores de SGLT, secretagogos de insulina, agonistas de RXR, inibidores da glicogênio sintase quinase-3, moduladores imunes, agonistas do receptor adrenérgico beta-3, inibidores de 11beta-HSD1, e análogos de amilina.
[0200] Outros exemplos de agentes que podem ser utilizados, em certas concretizações, em combinação com os peptídeos quiméricos e métodos aqui proporcionados incluem inibidores de dipeptidil peptidase-4 (DPP-4), formulações de bromocriptina (por exemplo, os sequestrantes de ácido biliar (por exemplo, colesevelam) e inibidores de SGLT-2. Medicamentos supressores do apetite também são bem conhecidos e podem ser utilizados em combinação com as composições e métodos aqui fornecidos. Terapias suplementares podem ser administradas antes de, contemporaneamente com ou em seguida aos métodos e utilizações da invenção.
[0201] As sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), podem ser formuladas numa dose unitária ou forma de dosagem unitária. Numa concretização particular, uma sequência peptídica está em uma quantidade eficaz para tratar um sujeito com necessidade de tratamento, por exemplo, devido à homeostase anormal ou aberrante de ácido biliar, tal como a síndrome metabólica; uma desordem relacionada com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra-hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de duto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades da síntese de ácidos biliares, tais como as que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal. Exemplos de doses unitárias variam de cerca de 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 ou 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 ng; de cerca de 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 ou 2500-5000, 500025.000, 25.000-50.000 μg; e de cerca de 25-250, 250-500, 5001000, 1000-2500 ou 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 mg.
[0202] As sequências peptídicas da invenção incluindo subsequências, variantes de sequência e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) podem ser administradas para proporcionar o efeito pretendido como uma dose única ou doses múltiplas, por exemplo, numa quantidade eficaz ou suficiente. Exemplos de doses variam de cerca de 25-250, 250500, 500-1000, 1000-2500 ou 2500-5000, 5000-25.000, 25.00050.000 pg/kg; de cerca de 50-500, 500-5000, ou 5000-25.000 25.000-50.000 ng/kg; e de cerca de 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 ou 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 μg/kg. Doses únicas ou múltiplas podem ser administradas, por exemplo, várias vezes por dia, em dias consecutivos, dias alternados, semanalmente ou intermitentemente (por exemplo, duas vezes por semana, uma vez a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas, ou uma vez a cada 2, 3, 4, 5 ou 6 meses).
[0203] As sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) podem ser administradas e métodos podem ser praticados por administração sistêmica, regional ou local, por qualquer via. Por exemplo, uma sequência peptídica pode ser administrada por via parentérica (por exemplo, subcutaneamente, intravenosamente, intramuscularmente, ou por via intraperitoneal), oralmente (por exemplo, ingestão, bucal ou sublingual), inalação, por via intradérmica, intracavidade, intracraniana, transdermicamente (tópica), por via transmucosa ou retal. As sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) e os métodos da invenção, incluindo composições farmacêuticas podem ser administradas por meio de um sistema de entrega (micro)encapsulado ou empacotado num implante para administração.
[0204] Um exemplo particular não limitante de administração parentérica (por exemplo, subcutânea) implica na utilização de um sistema de entrega subcutânea de Intarcia (Intarcia Therapeutics, Inc.; Hayward, CA). O sistema compreende uma bomba osmótica em miniatura que proporciona uma quantidade consistente de um agente terapêutico ao longo de um período de tempo desejado. Além de manter os níveis da droga dentro de uma faixa terapêutica adequada, o sistema pode ser utilizado com formulações que mantêm a estabilidade de agentes terapêuticos proteicos à temperatura do corpo humano por períodos de tempo prolongados.
[0205] A invenção proporciona ainda "composições farmacêuticas", que incluem uma sequência peptídica (ou sequências) da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências), e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluente fisiologicamente aceitável, veículo ou excipiente. Em concretizações particulares, uma sequência ou sequências peptídicas estão presentes em uma quantidade terapeuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser utilizadas de acordo com os métodos e utilizações da invenção. Assim, por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas ex vivo ou in vivo a um sujeito de modo a praticar os métodos de tratamento e utilizações da presente invenção.
[0206] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para serem compatíveis com o método pretendido ou a via de administração; rotas de administração exemplares são aqui apresentadas. Além disso, as composições farmacêuticas podem ainda compreender outros agentes terapeuticamente ativos ou compostos aqui revelados (por exemplo, agentes ou drogas de estabilização do ácido biliar) ou conhecidos do versado na técnica que podem ser utilizados no tratamento ou prevenção de várias doenças e desordens dos ácidos biliares como aqui estabelecidas.
[0207] As composições farmacêuticas compreendem, tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma das sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (sequências listadas nas Tabelas 1-10 e Listagem de Sequências) e um ou mais agentes de formulação farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis. Diluentes, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico e bissulfato de sódio), conservantes (por exemplo, álcool benzílico, parabenos de metila, etila ou n-propila, p- hidroxibenzoato), agentes emulsionantes, agentes de suspensão, agentes dispersantes, solventes, enchimentos, agentes encorpantes, tampões, veículos, diluentes e/ou adjuvantes. Por exemplo, um veículo adequado pode ser uma solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com citrato, possivelmente suplementada com outros materiais comuns em composições farmacêuticas para administração parentérica. A solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina do soro são veículos adicionalmente exemplares. Os versados na técnica reconhecerão facilmente uma variedade de tampões que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas e formas de dosagem utilizadas na invenção. Tampões típicos incluem, mas não estão limitados a, ácidos fracos farmaceuticamente aceitáveis, bases fracas, ou suas misturas. Componentes tampão também incluem materiais solúveis em água, tais como ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutâmico, e seus sais.
[0208] Um solvente primário num veículo pode ser ou aquoso ou não aquoso em natureza. Além disso, o veículo pode conter outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, osmolaridade, viscosidade, estabilidade ou esterilidade da composição farmacêutica. Em certas concretizações, o veículo farmaceuticamente aceitável é um tampão aquoso. Em outras concretizações, um veículo compreende, por exemplo, cloreto de sódio e/ou citrato de sódio.
[0209] As composições farmacêuticas da invenção podem ainda conter outros agentes de formulação farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter a taxa de liberação de um peptídeo da invenção. Tais agentes de formulação incluem aquelas substâncias conhecidas por versados na técnica na preparação de formulações de liberação sustentada. Para mais referências relativas a agentes de formulação farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pags 1435-1712, The Merck Index, 12th Ed. (1996, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ); e Pharmaceutical Principles de Solid Dosage Forms (1993, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.). Composições farmacêuticas adicionais adequadas para administração são conhecidas na técnica e são aplicáveis nos métodos e composições da invenção.
[0210] Uma composição farmacêutica pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou pó desidratado ou liofilizado. Tais composições podem ser armazenadas tanto numa forma pronta para usar, uma forma liofilizada que requer a reconstituição antes do uso, uma forma líquida que requer diluição antes da sua utilização, ou outra forma aceitável. Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica é proporcionada num recipiente de uso único (por exemplo, um frasco de uso único, ampola, seringa, ou autoinjetor (semelhante a, por exemplo, um EpiPen®)), enquanto um recipiente multiuso (por exemplo, um frasco multiuso) é fornecido em outras concretizações. Qualquer aparelho de distribuição de droga pode ser utilizado para entregar os peptídeos da invenção, incluindo implantes (por exemplo, bombas implantáveis) e sistemas de cateter, ambos dos quais são conhecidos dos versados na técnica. Injeções de depósito, que são geralmente administradas por via subcutânea ou por via intramuscular, também podem ser utilizadas para liberar os peptídeos da invenção durante um período de tempo definido. Injeções de depósito são geralmente à base de sólido ou óleo e compreendem geralmente pelo menos um dos componentes da formulação aqui estabelecidos. O versado na técnica está familiarizado com possíveis formulações e utilizações de injeções de depósito.
[0211] Uma composição farmacêutica pode ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Assim, as composições farmacêuticas incluem transportadores, diluentes ou excipientes adequados para administração por vias incluindo parentérica (por exemplo, subcutânea (s.c.), intravenosa, intramuscular, ou intraperitoneal), intradérmica, oral (por exemplo, ingestão), inalação, intracavidade, intracraniana, e transdérmica (tópica).
[0212] As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma solução aquosa injetável estéril ou suspensão oleaginosa. Esta suspensão pode ser formulada utilizando agentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes de suspensão aqui revelados ou conhecidos do versado na técnica. A preparação estéril injetável também pode ser uma solução ou suspensão estéril injetável num diluente ou solvente parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Diluentes, solventes e meios de dispersão adequados que podem ser empregados incluem água, solução de Ringer, solução de cloreto de sódio isotônica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glycol líquido), e suas misturas adequadas. Além disso, óleos estéreis e fixos são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregue incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tal como o ácido oleico, encontram utilização na preparação de injetáveis. A absorção prolongada de formulações injetáveis particulares pode ser conseguida através da inclusão de um agente que retarda a absorção (por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina).
[0213] As composições farmacêuticas podem estar numa forma adequada para utilização oral, por exemplo, como comprimidos, cápsulas, hóstias, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsões, cápsulas duras ou moles, ou xaropes, soluções, micropérolas ou elixires. As composições farmacêuticas destinadas à utilização oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de composições farmacêuticas. Tais composições podem conter um ou mais agentes, tais como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes conservantes a fim de proporcionar preparações farmaceuticamente elegantes e saborosas. Os comprimidos que contêm um peptídeo da invenção podem estar em mistura com excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para a fabricação de comprimidos. Estes excipientes incluem, por exemplo, diluentes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e de desintegração, por exemplo, amido de milho, ou ácido algínico;agentes aglutinantes, por exemplo, amido, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, por exemplo estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
[0214] Comprimidos, cápsulas e semelhantes adequados para administração oral podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e assim proporcionar uma ação sustentada durante um período mais longo. Por exemplo, um material de retardamento de tempo tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empregado. Eles também podem ser revestidos por técnicas conhecidas na técnica para formar comprimidos terapêuticos osmóticos para liberação controlada. Agentes adicionais incluem partículas biodegradáveis ou biocompatíveis ou uma substância polimérica, como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianidridos, ácido poliglicólico, copolímeros de etileno-acetato de vinila, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina, ou copolímeros de lactídeo/glicolídeo, copolímeros de polilactídeo/glicolídeo, ou copolímeros de etilenovinilacetato, a fim de controlar o fornecimento de uma composição administrada. Por exemplo, o agente oral pode ser aprisionado em microcápsulas preparadas por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, pela utilização de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina ou microcápsulas de poli(metilmetacrolato), respectivamente, ou num sistema de administração de fármaco coloidal. Os sistemas de dispersão coloidais incluem complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microesferas, e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomos. Métodos para a preparação de tais formulações são conhecidos pelos versados na técnica e estão disponíveis comercialmente.
[0215] As formulações para utilização oral também podem ser apresentadas como cápsulas duras de gelatina em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, caulim ou celulose microcristalina, ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida, ou óleo de oliva.
[0216] As suspensões aquosas contêm os materiais ativos em mistura com excipientes adequados para a fabricação dos mesmos. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxi- propilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinil-pirrolidona, goma de tragacanto e goma de acácia; agentes dispersantes ou molhantes podem ser um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo, lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato de polioxi- etileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetilenoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes.
[0217] As suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o ingrediente ativo num óleo vegetal, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de sésamo ou óleo de coco, ou num óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo, cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes tais como os estabelecidos acima, e agentes aromatizantes podem ser adicionados para proporcionar uma preparação oral palatável.
[0218] Pós dispersáveis e grânulos adequados para preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou molhante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes de dispersão ou agentes molhantes e de suspensão adequados são exemplificados aqui.
[0219] As composições farmacêuticas da invenção também podem estar na forma de emulsões de óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo, óleo de oliva ou óleo de amendoim, ou um óleo mineral, por exemplo, parafina líquida, ou misturas destes. Agentes emulsionantes adequados podem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo, goma arábica ou goma adragante; fosfatídeos de ocorrência natural, por exemplo, feijão de soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos; anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de sorbitano; e produtos de condensação de ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo, monooleato de polioxietileno sorbitano.
[0220] As composições farmacêuticas também podem incluir transportadores para proteger a composição contra a degradação rápida ou eliminação do corpo, tais como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, lipossomos, hidrogéis, pró-fármacos e sistemas de entrega microencapsulados. Por exemplo, um material de retardamento de tempo tal como monoestearato de glicerila ou estearato de glicerila por si só, ou em combinação com uma cera, pode ser empregado. A absorção prolongada de composições farmacêuticas injetáveis pode ser conseguida através da inclusão de um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina. A prevenção da ação de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outros semelhantes.
[0221] A invenção também inclui peptídeos da invenção sob a forma de supositórios para administração retal. Os supositórios podem ser preparados através da mistura de um peptídeo da invenção com um excipiente não irritante adequado que é sólido a temperaturas normais, mas líquido à temperatura retal e irá, portanto, derreter no reto para liberar o fármaco. Tais materiais incluem, mas não estão limitados a, manteiga de cacau e polietileno glicóis.
[0222] De acordo com a invenção, proporcionam-se métodos de identificação de um peptídeo (ou uma subsequência, variante ou forma modificada como aqui estabelecido) que modula a homeostase de ácidos biliares sem atividade substancial de HCC. Numa concretização, um método inclui: fornecer uma sequência peptídica candidata; administrar a sequência peptídica candidata a um animal de teste; medir os níveis de ácido biliar do animal após a administração da sequência peptídica candidata, para determinar se a sequência peptídica candidata modula a homeostase de ácido biliar; e analisar a sequência de peptídeo candidato para a indução de HCC no animal, ou expressão de um marcador que correlaciona com a atividade de HCC. Um peptídeo candidato que modula a homeostase do ácido biliar, mas não possui atividade substancial de HCC identifica assim uma sequência peptídica que modula a homeostase dos ácidos biliares sem atividade substancial de HCC.
[0223] Os termos "ensaio" e "medição" e suas variações gramaticais são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a tanto determinações qualitativas ou quantitativas, ou ambas as determinações qualitativas e quantitativas. Quando os termos são usados em referência a detecção, qualquer meio para avaliar a quantidade relativa é contemplada, incluindo os vários métodos aqui apresentados e conhecidos na técnica. Por exemplo, os ácidos biliares e precursores, tal como 7 alfa-hidroxi-4-colesteno-3- ona, podem ser ensaiados ou medidos numa amostra (por exemplo, soro) a partir de um sujeito. Outros exemplos não limitativos é um método de duas reações (Randox Laboratories, Ltd.) utilizando soro ou plasma heparinizado. Na primeira reação, ácidos biliares são oxidados por 3-α-hidroxiesteroide desidrogenase com a subsequente redução de Tio-NAD para Tio-NADH. Na segunda reação, os ácidos biliares oxidados são reduzidos pela mesma enzima com a subsequente oxidação de NADH a NAD. A taxa de formação de tio- NADH é determinada pela medição da alteração da absorbância específica a 405 nm.
[0224] Os fatores de risco para HCC, o tipo mais comum de câncer de fígado, incluem diabetes tipo 2 (provavelmente agravada pela obesidade). O risco de HCC em diabéticos tipo 2 é maior (de ~2,5 a ~7 vezes o risco de não-diabéticos), dependendo da duração da diabetes e protocolo de tratamento.
[0225] Várias metodologias podem ser utilizadas no rastreio e diagnóstico de HCC e são bem conhecidos dos versados na técnica. Indicadores para HCC incluem detecção de um fabricante de tumor, tal como altos níveis de alfa-fetoproteína (AFP) ou des-gama carboxiprotrombina (DCP). Uma série de diferentes técnicas de rastreio e imagem também é útil, incluindo ultrassom, tomografia computadorizada e ressonância magnética. Em relação à invenção, a avaliação de se um peptídeo (por exemplo, um peptídeo candidato) apresenta evidência de indução de HCC pode ser determinada in vivo por, por exemplo, quantificação da formação de nódulos de HCC num modelo animal, tal como um ratinho db/db, administrado um peptídeo, em comparação com a formação de nódulos de HCC por FGF19 do tipo selvagem. Macroscopicamente, o câncer de fígado pode ser nodular, onde os nódulos tumorais (que são de arredondados a ovais, cinza ou verde, bem circunscrito, mas não encapsulado) aparecem tanto como uma massa grande ou múltiplas massas menores. Alternativamente, o HCC pode estar presente como um tumor infiltrativo que é difuso e mal circunscrito e frequentemente se infiltra nas veias portais.
[0226] A avaliação patológica de amostras de tecido hepático geralmente é realizada após os resultados de uma ou mais das técnicas acima mencionadas indicarem a presença provável de HCC. Assim, os métodos da invenção podem ainda incluir avaliar uma amostra de tecido hepático de um modelo animal in vivo (por exemplo, um rato db/db) útil em estudos de HCC a fim de determinar se uma sequência peptídica exibe evidência de indução de HCC. Por avaliação microscópica, um patologista pode determinar se um dos quatro tipos de arquitetura geral e citológicos (padrões) de HCC estão presentes (ou seja, fibrolamelar, pseudoglandular (adenoide), pleomórfico (células gigantes) e células claras).
[0227] A invenção também inclui a geração e utilização de anticorpos, e os seus fragmentos, que se ligam às sequências peptídicas da invenção, incluindo subsequências, variantes de sequências e formas modificadas das sequências peptídicas exemplificadas (incluindo os peptídeos listados nas Tabelas 110 e Listagem das Sequências).
[0228] Tais como aqui utilizados, os termos "anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) referem-se a glicoproteínas possuindo as mesmas características estruturais. Enquanto que os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antígeno, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos que podem não ter especificidade antigênica.
[0229] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpos de ligação, incluindo fragmentos Fab e F(ab')2, desde que estes exibam a atividade biológica desejada. A unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero, e cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. Em contraste, a porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kappa e lambda, ao passo que as cadeias pesadas humanas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. Fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia simples.
[0230] Cada cadeia pesada possui numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Nas cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região de "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo igualmente uma região de "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. As cadeias de anticorpos exibem todas as mesmas estruturas gerais de regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hiper-variáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As CDRs das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo ligação a um epítopo específico. A partir de N-terminal para C-terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0231] Um anticorpo intacto tem dois locais de ligação e, exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois locais de ligação são os mesmos. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial, tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'.
[0232] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um sítio único antigênico. Em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno.
[0233] Um "anticorpo neutralizante" é uma molécula de anticorpo que é capaz de eliminar ou reduzir significativamente uma função efetora de um antígeno alvo ao qual se liga.
[0234] Os fragmentos de ligação de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. A digestão de anticorpos com a enzima papaína resulta em dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, também conhecidas como fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc", que não tem atividade de ligação ao antígeno. A digestão de anticorpos com a enzima pepsina resulta em um fragmento F(ab')2 em que os dois braços da molécula de anticorpo permanecem ligados e compreendem dois locais de ligação ao antígeno. O fragmento F(ab')2 tem a capacidade de reticular o antígeno.
[0235] O termo "Fab" refere-se a um fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. O termo "Fv" quando aqui utilizado refere- se ao fragmento mínimo de um anticorpo que retém os locais de reconhecimento do antígeno e de ligação ao antígeno. Numa espécie de Fv de duas cadeias, esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente. Numa espécie Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante peptídico flexível tal que as cadeias leve e pesada podem se associar numa estrutura "dimérica" análoga a aquela em uma espécie de Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Enquanto as seis CDRs, em conjunto, conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno.
[0236] O termo "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR" refere-se a partes de receptores imunológicos que fazem contato com um ligante específico e determinam a sua especificidade. O termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" e/ou os resíduos de um "loop hipervariável".
[0237] Tal como aqui utilizado, o termo "epítopo" refere-se a anticorpos para locais de ligação para antígenos proteicos. Os determinantes epitópicos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, bem como características estruturais tridimensionais específicas e de carga. Um anticorpo diz-se ligar a um antígeno quando a constante de dissociação é < 1 μM, de preferência < 100 nM, e mais preferencialmente < 10 nM. Um aumento da constante de equilíbrio ("KD") significa que há menos afinidade entre o epítopo e o anticorpo, ao passo que uma diminuição da constante de equilíbrio significa que existe uma maior afinidade entre o epítopo e o anticorpo. Um anticorpo com uma KD de "não mais do que" uma certa quantidade significa que o anticorpo se liga ao epítopo com a dada KD ou mais fortemente. Enquanto KD descreve as características de ligação de um epítopo e um anticorpo, a "potência" descreve a eficácia do próprio anticorpo para uma função do anticorpo. Não há necessariamente uma correlação entre uma constante de equilíbrio e potência; assim, por exemplo, uma KD relativamente baixa não significa automaticamente uma potência elevada.
[0238] O termo "liga-se seletivamente" em referência a um anticorpo não significa que o anticorpo liga-se unicamente a uma única substância, mas sim que a KD do anticorpo para uma primeira substância é menor do que a KD do anticorpo para uma segunda substância. Um anticorpo que se liga exclusivamente a um epítopo apenas se liga a aquele único epítopo.
[0239] Quando administrados a humanos, os anticorpos que contêm regiões constantes de roedor (de murino ou de rato) variáveis e/ou constantes são, por vezes, associados com, por exemplo, a depuração rápida do corpo ou geração de uma resposta imunitária pelo organismo contra o anticorpo. A fim de evitar a utilização de anticorpos derivados de roedores, anticorpos totalmente humanos podem ser gerados através da introdução da função de anticorpo humano num roedor, de modo que o roedor produza anticorpos totalmente humanos. A menos que aqui especificamente identificados, anticorpos "humanos" e "completamente humanos" podem ser aqui utilizados indistintamente. O termo "completamente humanos" pode ser útil para distinguir os anticorpos que são apenas parcialmente humanos daqueles que são completamente ou totalmente humanos. O versado na técnica está ciente de diversos métodos de produção de anticorpos completamente humanos.
[0240] A fim de resolver possíveis respostas de anticorpos humanos anti-ratinho, quiméricos ou de outro modo, os anticorpos humanizados podem ser utilizados. Os anticorpos quiméricos têm uma região constante humana e uma região variável de murino, e, como tal, as respostas de anticorpos humanos anti-quiméricos podem ser observadas em alguns pacientes. Portanto, é vantajoso proporcionar anticorpos totalmente humanos contra enzimas multiméricas a fim de evitar possíveis respostas de anticorpo humano anti-ratinho ou de anticorpos humanos anti-quiméricos.
[0241] Os anticorpos monoclonais totalmente humanos podem ser preparados, por exemplo, através da geração de linhas celulares de hibridoma por técnicas conhecidas dos versados na técnica. Outros métodos de preparação envolvem a utilização de sequências que codificam anticorpos específicos para a transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada, tal como uma célula CHO. A transformação pode ser realizada por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, o empacotamento do polinucleotídeo em um vírus (ou num vetor viral) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica. Métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, e microinjeção direta do DNA em núcleos. As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, células CHO, células HeLa, e células de carcinoma hepatocelular humano.
[0242] Anticorpos podem ser utilizados para diagnóstico e/ou terapeuticamente. Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados como um diagnóstico através da detecção do nível de um ou mais peptídeos da invenção num indivíduo, e comparando o nível detectado ao nível do controle padrão ou a um nível de linha de base em um indivíduo previamente determinado (por exemplo, antes de qualquer doença). Os anticorpos podem ser utilizados como um agente terapêutico para modular a atividade de um ou mais peptídeos da invenção, tendo assim um efeito sobre uma condição ou distúrbio.
[0243] A invenção proporciona kits incluindo, mas não limitado a, sequências peptídicas da invenção, opcionalmente em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, composições e composições farmacêuticas dos mesmos, embalados em material de embalagem adequado. Um kit inclui, opcionalmente, uma etiqueta ou inserção de embalagem incluindo uma descrição dos componentes ou instruções para utilização in vitro, in vivo, ou ex vivo, dos seus componentes. Instruções exemplificativas incluem instruções para o tratamento de um distúrbio relacionado ou associado ao ácido biliar, tal como síndrome metabólica; uma desordem relacionadas com lipídios ou glicose; metabolismo de colesterol ou triglicerídeos; diabetes tipo 2; colestase, incluindo, por exemplo, doenças de colestase intra-hepática (por exemplo, PBC, PFIC, PSC, PIC, colestase neonatal, e colestase induzida por drogas (por exemplo, estrogênio)), e doenças de colestase extra- hepática (por exemplo, compressão de corte biliar de tumor, bloqueio de duto biliar por pedras na vesícula); má absorção de ácidos biliares e outras desordens envolvendo o intestino delgado distal, incluindo ressecção do íleo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, doença de Crohn e colite ulcerosa), distúrbios que afetam a absorção de ácidos biliares não de outro modo caracterizada (idiopática)), levando a diarreia (por exemplo, BAD) e sintomas gastrointestinais, e câncer gastrointestinal, de fígado e/ou das vias biliares (por exemplo, câncer de cólon e câncer hepatocelular); e/ou anormalidades de síntese de ácidos biliares, tais como aquelas que contribuem para NASH, cirrose e hipertensão portal, etc.
[0244] Um kit pode conter um conjunto de tais componentes, por exemplo, duas ou mais sequências peptídicas, por si só ou uma combinação de uma sequência peptídica com uma outra composição terapeuticamente útil (por exemplo, uma droga de modulação da homeostase de ácido biliar).
[0245] O termo "material de embalagem" refere-se a uma estrutura física que aloja os componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes de forma estéril, e pode ser feito de material normalmente utilizado para tais fins (por exemplo, de papel, cartão canelado, vidro, plástico, papel, ampolas, frascos, tubos, etc.).
[0246] Os kits da invenção podem incluir etiquetas ou inserções. Etiquetas ou inserções incluem "material impresso", por exemplo, papel ou papelão, separado ou fixado a um componente, um material de embalagem ou kit (por exemplo, uma caixa), ou ligado a, por exemplo, uma ampola, frasco ou tubo contendo um componente do kit. Etiquetas ou inserções podem adicionalmente incluir um meio de leitura por computador, tal como um disco (por exemplo, disco rígido, cartão, disco de memória), disco óptico, como CD ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética, ou um meio elétrico de armazenamento tal como RAM e ROM ou híbridos destes, tais como meios magnéticos/ópticos de armazenamento, mídia FLASH ou cartões do tipo de memória.
[0247] As etiquetas ou inserções podem incluir informação de identificação de um ou mais componentes neles, quantidades de dose, farmacologia clínica do ingrediente(s) ativo, incluindo o mecanismo de ação, farmacocinética e farmacodinâmica. Etiquetas ou inserções podem incluir informação identificando as informações do fabricante, número de lote, localização do fabricante e a data.
[0248] As etiquetas ou inserções podem incluir informações sobre uma condição, distúrbio, doença ou sintoma para a qual pode ser utilizado um componente do kit. Etiquetas ou inserções podem incluir instruções para o médico ou para um indivíduo para utilizar um ou mais dos componentes do kit em um método, protocolo de tratamento ou regime terapêutico. As instruções podem incluir quantidades de dosagem, frequência ou duração, e as instruções para a prática de qualquer um dos métodos, protocolos de tratamento ou regimes terapêuticos aqui estabelecidos. Instruções exemplificativas incluem instruções para o tratamento ou utilização de uma sequência peptídica como aqui estabelecida. Os kits da invenção podem adicionalmente incluir, por conseguinte, as etiquetas ou as instruções para a prática de qualquer um dos métodos e utilizações da presente invenção aqui descritos, incluindo os métodos de tratamento e utilizações.
[0249] As etiquetas ou inserções podem incluir informações sobre qualquer benefício que um componente pode oferecer, como um benefício profilático ou terapêutico. Etiquetas ou inserções podem incluir informações sobre os potenciais efeitos colaterais adversos, tais como avisos para o indivíduo ou médico sobre situações em que não seria apropriado usar uma composição particular. Os efeitos colaterais adversos também podem ocorrer quando o sujeito tomou, tomará ou está atualmente tomando um ou mais outros medicamentos que podem ser incompatíveis com a composição, ou o sujeito passou, passará ou está passando por um outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico que seria incompatível com a composição e, portanto, as instruções podem incluir informações relativas a tais incompatibilidades.
[0250] Os kits da invenção podem adicionalmente incluir outros componentes. Cada componente do kit pode ser fechado dentro de um recipiente individual e todos os diversos recipientes podem estar dentro de um único pacote. Os kits da invenção podem ser concebidos para armazenamento refrigerado. Os kits da invenção podem ainda ser concebidos para conter sequências peptídicas da invenção, ou que contêm ácidos nucleicos que codificam sequências peptídicas. As células do kit podem ser mantidas sob condições de armazenamento adequadas até estarem prontas para usar.
[0251] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são aqui descritos.
[0252] Todos os pedidos, publicações, patentes e outras referências, citações GenBank e citações ATCC aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o relatório descritivo, incluindo definições, terá o controle. Tal como aqui utilizado, as formas singulares "um", "e", e "o" incluem os plurais referentes a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma sequência peptídica" ou "tratamento" inclui uma pluralidade de tais sequências, tratamentos, e assim por diante.
[0253] Tais como aqui utilizados, os valores numéricos são frequentemente apresentados num formato de intervalo ao longo deste documento. A utilização de um formato de intervalo é apenas por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o âmbito da invenção a menos que o contexto indique claramente o contrário. Consequentemente, a utilização de uma faixa inclui expressamente todos os subintervalos possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa e todos os valores numéricos ou intervalos numéricos incluindo números inteiros dentro dessas faixas e os valores de frações ou números inteiros dentro das faixas a menos que o contexto indique claramente o contrário. Esta construção é aplicável independentemente da largura do intervalo e em todos os contextos ao longo deste documento de patente. Assim, por exemplo, a referência a uma faixa de 90-100% inclui 91-99%, 9298%, 93-95%, 91-98%, 91-97%, 91-96%, 91-95%, 91-94%, 91-93%, e assim por diante. A referência a um intervalo de 90-100%, também inclui 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, etc., assim como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, etc., e assim por diante.
[0254] Além disso, a referência a uma faixa de 1-3, 3-5, 510, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc. Num outro exemplo, a referência a uma faixa de 25-250, 250500, 500-1000, 1000-2500 ou 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 inclui qualquer valor numérico ou intervalo no interior ou englobando tais valores, por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29... 250, 251, 252, 253, 254... 500, 501, 502, 503, 504..., etc.
[0255] Como também aqui utilizado, uma série de intervalos está descrita ao longo deste documento. A utilização de uma série de faixas incluem combinações dos intervalos superior e inferior para fornecer um outro intervalo. Esta construção é aplicável independentemente da largura do intervalo e em todos os contextos ao longo deste documento de patente. Assim, por exemplo, a referência a uma série de intervalos, tal como 5-10, 10-20, 2030, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150, inclui faixas como 520, 5-30, 5-40, 5-50, 5-75, 5-100, 5-150, e 10-30, 10-40, 1050, 10-75, 10-100, 10-150, e 20-40, 20-50, 20-75, 20-100, 20150, e assim por diante.
[0256] Por razões de concisão, certas abreviaturas são aqui usadas. Um exemplo é a abreviatura de única letra para representar os resíduos de aminoácidos. Os aminoácidos e os seus correspondentes de três letras e as abreviaturas de letra única são os seguintes:
[0257] A invenção é aqui divulgada de forma geral usando uma linguagem afirmativa para descrever as várias concretizações. A invenção também inclui especificamente concretizações em que determinado assunto é excluído, no todo ou em parte, como substâncias ou materiais, etapas de métodos e condições, protocolos, procedimentos, ensaios ou análises. Assim, ainda que a invenção não esteja aqui expressa de forma geral em termos do que a invenção não inclui, aspectos que não estejam expressamente incluídos na presente invenção são, no entanto, aqui revelados.
[0258] Uma série de concretizações da invenção foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e âmbito da invenção. Por conseguinte, os exemplos seguintes pretendem ilustrar, mas não limitar o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
[0259] O que se segue é uma descrição de vários métodos e materiais utilizados nos estudos deste documento.
[0260] Animais. Ratos db/db foram adquiridos da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), os ratos foram mantidos de acordo com as diretrizes de bem-estar sob condições de luz controlada (ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro, escuro de 18:306:30), de temperatura (22 ± 4° C) e de umidade (50% ± 20%). Os ratos tiveram livre acesso à água (água destilada autoclavada) e foram alimentados ad libitum com uma dieta comercial (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, Irradiated 2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet) contendo 17 kcal% de gordura, 23 kcal% de proteína e 60 kcal% de carboidratos. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional NGM de Uso e Cuidado Animal.
[0261] Sequências de DNA e de aminoácidos. cDNA da ORF que codifica variantes de FGF19 humano (FGF19 de Homo sapiens, número de acesso GenBank NM_005117.2). Sequência de proteína codificada pelo cDNA (número de acesso GenBank NP_005108.1).
[0262] PCR. ORF de FGF19 foi amplificado com reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando DNA recombinante (cDNA) preparado a partir de tecido de intestino delgado humano. Kits de reagentes de PCR com DNA polimerase de alta fidelidade da Phusion® foram adquiridos de New England Biolabs (F-530L, Ipswich, MA). Foram utilizados os seguintes iniciadores: iniciador de PCR forward: 5’ CCGACTAGTCACCatgcggagcgggtgtgtgg (SEQ ID NO:136) e iniciador de PCR reverse: 5’ ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTCTCAAAGCTGGGACTCCTC (SEQ ID NO:137).O fragmento de DNA amplificado foi digerido com as enzimas de restrição Spe I e Not I (os locais de restrição foram incluídos nos iniciadores de PCR 5' ou 3', respectivamente) e foi em seguida ligado com vetores de transgene AAV que tinham sido digeridos com as mesmas enzimas de restrição. O vetor utilizado para a expressão continha um marcador selecionável e uma cassete de expressão constituído por um promotor eucariota forte 5' de um local para a inserção da sequência de codificação clonada, seguido por uma região 3' não traduzida e cauda de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. A construção de expressão também é flanqueado por repetições terminais internas nas extremidades 5' e 3'.
[0263] Ensaio de repressão de CYP7A1 em hepatócitos humanos primários. Hepatócitos humanos primários foram plaqueados em placas revestidas com colágeno (Becton Dickinson Biosciences) em meio Williams E (Invitrogen) suplementado com 100 nM de dexametasona (Sigma) e 0,25 mg/ml de Matrigel™ (Becton Dickinson Biosciences). As células foram tratadas com FGF19 ou variantes a 37° C durante 6 horas. A expressão de CYP7A1 foi avaliada em triplicata por RT-PCR quantitativa (TaqMan® ABI Prism 7700, Applied Biosystems) e normalizada para a expressão de GAPDH.
[0264] Ensaio de repressão de CYP7A1 in vivo. Ratos db/db machos de nove semanas de idade (Jackson Laboratories) foram injetados intraperitonealmente com as proteínas recombinantes FGF19 ou FGF21 a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg. Os animais foram sacrificados cinco horas após a injeção. O fígado foi coletado e homogeneizado em reagente TRIzol® (Invitrogen). O RNA total foi extraído e tratado com DNAase (Ambion), seguido por análise de RT-PCR quantitativa e normalizado para a expressão de GAPDH.
[0265] Produção e purificação de AAV. Células AAV293 (obtidas a partir da Agilent Technologies, Santa Clara, CA) foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Mediatech, Inc. Manassas, VA) suplementado com 10% de soro fetal bovino e solução antibiótica-antimicótica 1x (Mediatech, Inc. de Dulbeco Manassas, VA). As células foram plaqueadas a uma densidade de 50% no dia 1 em placas de cultura de células de 150 mm transfectadas no dia 2, utilizando o método de precipitação com fosfato de cálcio com os três plasmídeos seguintes (20 μg/placa de cada): plasmídeo de transgene AAV, plasmídeos pHelper™ (Agilent Technologies) e plasmídeo AAV2/9 (Gao et al, J. Virol. 78:6381 (2004)). Quarenta e oito (48) horas após a transfecção, as células foram raspadas das placas, sedimentadas por centrifugação a 3000xg e ressuspendidas em tampão contendo Tris 20 mM pH 8,5, NaCl 100 mM e MgCl2 1 mM. A suspensão foi congelada num banho de gelo seco e álcool foi então descongelada em banho de água a 37° C. Os ciclos de congelamento e descongelamento foram repetidos três vezes; Benzonase® (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionado a 50 unidades/ml; foi adicionado desoxicolato até uma concentração final de 0,25%. Após uma incubação a 37° C durante 30 minutos, os detritos celulares foram sedimentados por centrifugação a 5000 xg durante 20 min. As partículas virais presentes no sobrenadante foram purificadas utilizando um gradiente de iodixanal descontinuado (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tal como descrito anteriormente (Zolotukhin S. et al (1999) Gene Ther. 6:973). O estoque viral foi concentrado utilizando Vivaspin® 20 (MW cutoff 100.000 Dalton, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, França) e ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 10% de glicerol e armazenado a -80° C. Para determinar o número de cópias do genoma viral, 2 μl de estoque viral foram incubados em 6 μl de uma solução contendo 50 unidades/ml de Benzonase®, 50 mM Tris- HCl pH 7,5, MgCl2 10 mM e CaCl2 10 mM a 37° C durante 30 minutos.
[0266] Em seguida, 15 μl da solução contendo 2 mg/ml de Proteinase K, SDS a 0,5% e EDTA 25 mM foram adicionados e a mistura foi incubada durante mais 20 min a 55° C para liberar o DNA viral. O DNA viral foi limpo com Mini Kit DNeasy® (Qiagen, Valencia, CA) e eluído com 40 μl de água. A cópia viral do genoma (GC) foi determinada utilizando PCR quantitativo.
[0267] O estoque viral foi diluído com PBS para uma GC/ml desejável. A solução de trabalho viral (200 μl) foi entregue aos ratinhos através de injeção na veia da cauda.
[0268] Ensaio de carcinoma hepatocelular (HCC). Amostras de fígado foram colhidas a partir de ratinhos db/db 24 semanas após a injeção de AAV. Pontuações de HCC foram registradas como o número de nódulos de HCC na superfície de todo o fígado de ratos injetados com variantes dividido pelo número de nódulos de HCC de ratos injetados com FGF19 do tipo selvagem.
[0269] Ensaio do nível de exposição a FGF19/FGF21/variants do soro. O sangue total (cerca de 50 μL/rato) a partir de recortes de cauda de rato foi recolhido em tubos capilares planos (BD Clay Adams SurePrep™, Becton Dickenson e Co. Sparks, MD). Células do sangue e do soro foram separadas por centrifugação dos tubos numa Autocrit™ Ultra 3 (Becton Dickinson e Co. Sparks, MD). Os níveis de exposição de FGF19, FGF21, e variante no soro foram determinados utilizando kits EIA (Biovendor) seguindo as instruções do fabricante.
[0270] Ligação de FGFR4 e ensaios de atividade. ELISA de fase sólida (ligante) e ensaio de fosforilação de ERK podem ser realizados usando proteínas recombinantes purificadas. O ensaio de ligação de FGFR pode ser realizado utilizando ELISA de fase sólida. Resumidamente, uma placa de 96 poços pode ser revestida com 2 μg/mL de anticorpo anti-hFc e pode ser incubada com 1 μg/ml de FGFR1-hFc ou FGFR4-hFc. A ligação às variantes de FGF19 na presença de 1 μg/ml de β-Klotho solúvel e 20 μg/ml de heparina pode ser detectada por anticorpos biotinilados anti-FGF19 (0,2 μg/mL), seguido por incubação com estreptavidina HRP (100 ng/ml). Para o ensaio de ativação de FGFR4, células Hep3B podem ser estimuladas com variantes de FGF19 durante 10 minutos a 37° C, e em seguida podem ser imediatamente lisadas e ensaiadas quanto à fosforilação de ERK utilizando um kit disponível comercialmente a partir de cis-Bio.
[0271] A fim de confirmar que as variantes de FGF19, tais como as aqui apresentadas, reprimem a expressão de CYP7A1, a inibição da expressão de CYP7A1 por FGF19 tipo selvagem foi determinada após a administração de várias concentrações. Os efeitos de FGF21 foram avaliados de um modo comparável.
[0272] Resumidamente, no tempo 0, os ratinhos db/db foram doseados intraperitonealmente com FGF19 recombinante (0,1 mg/kg; 1 mg/kg; 10 mg/kg) ou FGF21 recombinante (0,1 mg/kg; 1 mg/kg; 10 mg/kg). Cinco horas após a dosagem, os fígados foram recolhidos, o RNA foi extraído, e a expressão de CYP7A1 foi determinada por PCR em tempo real (QPCR) usando GADPH como um controle de normalização. Em cada grupo de ratos, n = 3, e os valores de expressão de CYP7A1 para as várias concentrações de FGF19 e FGF21 foram comparadas com ratos doseados com veículo de controle de PBS.
[0273] Tal como apresentado na FIG. 1, FGF19 diminuiu dramaticamente a expressão de CYP7A1 de um modo dependente da concentração. Embora a administração de FGF21 tenha causado uma redução da expressão de CYP7A1, o efeito foi comprovadamente menor do que o observado com FGF19.
[0274] O efeito da variante M70 na expressão de CYP7A1 em hepatócitos humanos primários foi comparado com o de FGF19. Como observado na FIG. 2, a variante M70 reprimiu a expressão de CYP7A1 numa quantidade comparável à de FGF19.
[0275] Utilizando os ensaios descritos acima, a repressão de CYP7A1 em hepatócitos humanos primários foi determinada para uma série de variantes de FGF19. Tal como indicado nas FIG. 3 - FIG.5, várias variantes (por exemplo, M1, M2, etc.) apresentaram forte repressão de CYP7A1.
[0276] Para avaliar os efeitos de algumas variantes de FGF19 adicionais sobre a repressão de CYP7A1, o ensaio in vitro baseado em células (hepatócitos humanos primários) e o ensaio in vivo (dosagem de proteína em ratinhos db/db) foram utilizados nos quais as variantes foram comparadas com os controles tratados com solução salina. A FIG. 5 apresenta os resultados (IC50 e CYP7A1 (%)) em forma de tabela. Enquanto a maioria das variantes de FGF19 que foram avaliadas exibiu atividade inibidora da CYP7A1, algumas variantes (por exemplo, M90, M96, M98, M32 e M5) não reprimiram mais CYP7A1.
[0277] As variantes de FGF19 que retêm a atividade de repressão de CYP7A1 podem ser ainda avaliadas no ensaio de HCC (ou outro ensaio ou modelo relevante) descrito acima para identificar as variantes que possam ser úteis para modular o metabolismo de ácidos biliares e/ou para o tratamento de doenças relacionadas com o ácido biliar (por exemplo, diarreia de ácidos biliares e cirrose biliar primária) sem causar indução de HCC. As figuras estabelecem os dados para as variantes que foram avaliadas no ensaio de HCC.
[0278] A seguir, um resumo dos dados de 25 peptídeos variants adicionais analisados para a atividade de elevação de lipídios e tumorigênese. Os dados mostram claramente uma correlação positiva entre a elevação de lipídios e a tumorigênese, tal como determinado pela formação de HCC em ratinhos db/db.
[0279] As tabelas resumem diferentes peptídeos variantes. Tais peptídeos variantes exemplificados têm sequência C-terminal de FGF19:PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLL QYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEE PEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO:188) na porção C-terminal, por exemplo, seguindo os resíduos de aminoácidos "TSG". Notavelmente, os peptídeos variantes (total de 7, incluindo M5) que não causam um aumento estatisticamente significativo de lipídios não induziram a formação de HCC. Em contraste, todos os peptídeos variantes (17 no total) que causaram um aumento estatisticamente significativo de lipídios também causou a formação de HCC em ratinhos. Estes dados indicam que existe uma forte correlação positiva entre a atividade de elevação de lipídios e a formação de HCC. Por conseguinte, a atividade de elevação de lipídios pode ser utilizada como um indicador e/ou preditor de formação de HCC em animais.Tabela 1: Triglicerídeos e colesterol elevados em ratos db/db parecem se correlacionar positivamente com a Formação de HCC (ver SEQ ID NOs: 99, 5 e 74 a 81).
Tabela 2: Triglicerídeos e colesterol elevados em ratos db/db parecem se correlacionar positivamente com a Formação de HCC (ver SEQ ID NOs:99, 100 e 82 a 98).
Tabela 3: Triglicerídeos e colesterol elevados em ratos db/db parecem se correlacionar positivamente com a Formação de HCC (ver SEQ ID NOs:99, 100 e 88 a 98).
[0280] M88 (H31A/S141A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPAGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:88)
[0281] M89 (H31A/H142A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPAGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:89)
[0282] M90 (K127A/R129A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQAQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:90)
[0283] M91 (K127A/S141A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQRQLYKNRGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:91)
[0284] M92 (K127A/H142A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQRQLYKNRGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:92)
[0285] M93 (R129A/S141A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQAQLYKNRGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:93)
[0286] M94 (S141A/H142A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLAAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:94)
[0287] M95 (K127A/H142A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQRQLYKNRGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO: 95)
[0288] M96 (K127A/R129A/S141A):RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQAQLYKNRGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO: 96)
[0289] M97 (K127A/R129A/H142A): RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQAQLYKNRGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO: 97)
[0290] M98 (K127A/R129A/S141A/H142A):RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAAQAQLYKNRGFLPLAAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:98)
[0291] A seguir, um resumo dos dados de peptídeos variants de FGF19 adicionais analisados para a atividade de redução da glicemia e atividade de elevação de lipídios.
[0292] A Tabela 4 ilustra as sequências de "núcleo" peptídicas de 35 variantes de FGF19 adicionais, denotadas M5 a M40. Tais peptídeos variantes exemplificados têm sequência C-terminal de FGF19 , PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLL QYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEE PEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 188) na porção C-terminal, por exemplo, seguindo os resíduos de aminoácidos "TSG" da sequência de núcleo. Os dados mostram claramente que as variantes M6, M7, M8, mM38 e M39 têm as características desejadas de atividade de diminuição de glicose e atividade de elevação de lipídios não estatisticamente significativa em ratinhos db/db. Tabela 4: Variantes adicionais e Mapeamento fino do domínio N- terminal (ver SEQ ID NOs: 99, 100, e 5 a 40)
Tabela 4a: (ver SEQ ID NOs:99, 100, 5, 9, 8, 12, 10, 13, 15, 14, 43, 6 e 7)
Tabela 4b: (ver SEQ ID NOs:99, 5 e 31 a 40)
Tabela 4c: (ver SEQ ID NOs:99, 100, 5, 52, 54, a 68, 4, 69, 70 e 53)
[0293] A Tabela 5 ilustra as sequências peptídicas de variantes adicionais. Tabela 5: Variantes Adicionais (SEQ ID NOs:41, 42 e 44-46)
[0294] A Tabela 6 ilustra as sequências peptídicas de 3 variantes de FGF19, denotadas M1, M2 e M69. Os dados mostram claramente que estas três variantes possuem as características desejadas de atividade de abaixamento de glicose em ratos db/db. Estas três variantes parecem elevar os lipídios em ratos db/db. Tabela 6: Variantes adicionais (SEQ ID NOs: 1, 2 e 69)
[0295] A seguir, um resumo de dados mostrando que FGF19 reduz o peso corporal em ratos obesos induzidos por dieta e em ratinhos ob/ob, e atividade de formação de tumor do fígado e do peso corporal em ratos db/db.
[0296] Os ratos foram injetados com FGF19 ou FGF21 no vetor de AAV. O peso corporal foi registrado 4 semanas após a injeção.Tabela 7: FGF19 reduz o peso corporal em ratos obesos induzidos por dieta e em ratos ob/ob (sequências correspondem aos aa 1-29 da SEQ ID NO: 99 e aa 1-25 de SEQ ID NO: 100, respectivamente)
Tabela 8: Correlação de peso corporal e formação de tumor do fígado de FGF19, FGF21 e variantes selecionadas em ratinhos db/db (ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 99, 100, 5, 6, 32, 52 e 69)
[0297] O que se segue é um estudo mostrando que os peptídeos elvage M5 e M69 reduzem a elvage no sangue.
[0298] Os ratinhos (ob/ob) foram injetados (por via subcutânea) com M5 (0,1 e 1 mg/kg, s.c.) ou FGF19 (1 mg/kg, s.c.), ou variante M69 (0,1 e 1 mg/kg, s.c.) ou FGF19 (1 mg/kg, s.c.). Os níveis de elvage no plasma foram medidos a 2, 4, 7, e 24 horas após a injeção. Os resultados da variante M5 e variante M69 mostraram efeitos de redução de elvage semelhantes a de FGF19 do tipo elvage (dados não mostrados).
[0299] Este exemplo estabelece diversos polipeptídeos variantes e características específicas dos mesmos, incluindo o efeito das variações na redução da glicemia, parâmetros do perfil lipídico, e formação de HCC.
[0300] Em particular, a Tabela 9 compara os dados gerados para as variantes M5 (SEQ ID NO: 5), M6 (SEQ ID NO: 6) e M50 (SEQ ID NO: 50) com os dados gerados para os polipeptídeos variantes correspondentes (denotados como M144, M145, e M146 respectivamente) possuindo deleções N-terminais de Arg(R). Apenas certos domínios de sequência para cada variante estão listados: domínio N-terminal, núcleo, e região Sheet-8/Loop-8/ Sheet-9.Tabela 9
[0301] Como os dados da Tabela 9 indicam, a deleção de Arg (R) N-terminal não teve um impacto significativo sobre a diminuição da glicemia, a redução de peso corporal, elevação de HDL e triglicerídeos, e formação de HCC.
[0302] Este exemplo descreve vários peptídeos variantes com substituições de aminoácidos na região do Loop 8 de FGF19, juntamente com o efeito das variantes no peso corporal, certos parâmetros metabólicos, e formação de HCC.
[0303] Os dados na Tabela 10 são associados com polipeptídeos variantes designados por M3, M139, M140, M141 e M160. A sequência de aminoácidos para M3 é definida aqui em outro local, e as sequências de aminoácidos para M139, M140, M141 e M160 são as seguintes: RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO: 193); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M140) (SEQ ID NO: 194); RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO: 195); e RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M160) (SEQ ID NO: 196).
[0304] Apenas os seguintes domínios de sequência para cada uma das variantes acima mencionados estão listados na Tabela 10: região do domínio N-terminal, Núcleo, e Sheet-8/Loop-8/Sheet-9. Enquanto os resíduos de aminoácidos particulares que constituem a região do Loop 8 não são universalmente aceitos na literatura, são aqui definidos como constituindo a região do Loop-8.Tabela 10
[0305] Com referência à Tabela 10, a substituição P128E parece necessária para prevenir significativamente a formação de HCC, mas é insuficiente por si só para prevenir a formação de HCC. Em particular, uma melhoria na prevenção da formação de HCC é observada com a substituição P128E em M140. Por outro lado, por si só, a substituição R127L não previne a formação de HCC (ver M139). Tal como indicado em comparação a M3, uma combinação das substituições R127L e P128E diminui a formação de HCC, mas não elimina a formação de HCC. Surpreendentemente, no entanto, uma combinação das substituições R127L e P128E juntamente com uma substituição de Gln (Q) por Leu (L) na região do núcleo de FGF19 impede significativamente a formação de HCC (ver M160).
[0306] Estes dados indicam que a região de Loop 8 de FGF19 desempenha um papel na formação de HCC. Os resíduos de aminoácidos fora da região do Loop 8 (por exemplo, as substituições na região do núcleo) podem melhorar a prevenção da formação de HCC.
[0307] Ml (SEQ ID NO:1) RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK
[0308] M2 (SEQ ID NO:2) RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK
[0309] M3 (SEQ ID NO:3) RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK
[0310] M5 (SEQ ID NO:5) RHPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK
[0311] M5-R (SEQ ID NO:160) HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK
[0312] M48 (SEQ ID NO:48) RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K
[0313] M49 (SEQ ID NO:49) RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVA LRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSA KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVR SPSFEK
[0314] M50 (SEQ ID NO:50) RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK
[0315] M51 (SEQ ID NO:51) RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK
[0316] M52 (SEQ ID NO:52) RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K
[0317] M53 (SEQ ID NO:192) MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQL YKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K
[0318] M69 (SEQ ID NO:69) RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQR QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPS FEK
[0319] M70 (SEQ ID NO:70) MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK
[0320] M71 (SEQ ID NO:71) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
[0321] M72 (SEQ ID NO:72) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS
[0322] M73 (SEQ ID NO:73) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSP HRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHP ENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE
[0323] M75 (SEQ ID NO:75) RVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKG VHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK
[0324] M76 (SEQ ID NO:76) RGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVR YLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLP LSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK
[0325] FGF19 (SEQ ID NO:99) RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK
[0326] Este exemplo mostra que a administração de M70 em pacientes humanos resulta na supressão de 7a-hidroxi-4-cholsten- 3-ona (C4), um marcador da síntese de ácidos biliares.
[0327] Indivíduos do estudo: adultos saudáveis na faixa etária de 18-65 anos e com peso normal (índice de massa corporal, IMC 20-35) foram incluídos no estudo. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Austrália, e o consentimento informado por escrito foi obtido de cada sujeito. Para inclusão no estudo, cada sujeito tinha de estar em boa saúde determinada por não haver achados clinicamente significativos no histórico médico, exame físico, ECG de 12- chumbo, achados laboratoriais clínicos, e sinais vitais na triagem. Indivíduos com histórico ou manifestação clínica de qualquer distúrbio metabólico significativo, alérgico, dermatológico, hepático, renal, hematológico, pulmonar, cardiovascular, gastrointestinal, neurológico, ou psiquiátrico foram excluídos da inscrição.
[0328] Design do Estudo: O estudo foi um design duplo-cego,randomizado e controlado com placebo. A pré-triagem dos indivíduos foi realizada 7-30 dias antes da entrada, e avaliações de base foram realizadas antes do tratamento. Cada sujeito recebeu injeção subcutânea de M70 em doses de 3 mg/dia numa única dose bolus diariamente durante 7 dias. Amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados por meio de um cateter. Foram analisadas amostras de sangue colhidas no Dia 1 e Dia 7 em 4,5 horas ou 24 horas após a administração de M70 ou placebo. Os níveis séricos de 7a-hidroxi-4-colesteno-3-ona (C4) foram utilizados para monitorar a atividade enzimática de CYP7A1 (síntese de ácidos biliares). Foram analisados a partir de amostras de soro individuais após extração da amostra, seguida de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) tal como descrito anteriormente (Galman et al. (2003) J Lipid Res. 2003;44(4):859- 66).
[0329] Resultados: Os dados apresentados na FIG. 6 mostram que nos dias 1 e 7, em ambas 4,5 horas e 24 horas após a dose, os níveis séricos de C4 foram suprimidos de forma significativa nos pacientes, em comparação com pacientes que receberam um placebo.
[0330] Este exemplo mostra ativação da sinalização de FGFR4- β-Klotho de rato por FGF19, M3 e M70 em uma linha celular de mioblastos de rato
[0331] Métodos: um ensaio de luciferase ELK foi realizado em células L6 transfectadas transientemente com FGFR4 de rato, b- Klotho, e construções repórter contendo luciferase 5xUAS e domínio de ligação GAL4-DNA (DBD) fundido com ELK1. Neste sistema, a atividade da luciferase é regulada pela quinase regulada por sinal extracelular fosforilada endógena (ERK). As células foram incubadas com ligantes durante 6 horas antes de lisadas para as medições da atividade da luciferase.
[0332] Um ensaio de ativação de receptor com base em célula foi usado para avaliar a capacidade de FGFR4 de rato para mediar a sinalização dependente do ligante na presença de β-Klotho. Para este fim, uma linha celular de mioblastos L6 de rato, que carece de expressão endógena destas proteínas, foi transfectado com DNAs que codificam FGFR4 e β-Klotho de rato, bem como plasmídeos que contêm um sistema repórter baseado em fator de transcrição quimérico dependente de Elk1.
[0333] Seguindo a transfecção, a resposta da concentração da expressão de luciferase dependente do ligante foi analisada em lisados de células inteiras na presença de substrato de luciferina.
[0334] Resultados: A co-expressão de FGFR4 e β-Klotho em células L6 foi encontrada para potenciar a ativação de vias de sinalização intracelular por M3, M70 e FGF19 (EC50 = 20, 38 e 53 pM, respectivamente (ver Tabela 11 e Fig. 7).Tabela 11: A co-expressão do complexo β-Klotho/FGFR4 de rato em células L6 potencializa a ativação de vias de sinalização intracelular por FGF19, M3 e M70.
EC50 = metade da concentração eficaz máxima; Emax = eficácia máxima. Os dados são expressos como média ± DP
[0335] Estes dados sugerem que a formação de um complexo ternário entre os co-receptores de FGFR4-β-KLOTHO e ligantes cognatos é importante para a ativação potente de sinalização intracelular.
[0336] O presente relatório descritivo está sendo depositado com uma cópia de formulário legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências. O CRF intitulado 13370-007_SEQLIST.txt, que foi criado em 26 de Dezembro de 2013 e possui 241.577 bytes em tamanho, é idêntico à cópia em papel da Listagem de Sequências e é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
Claims (4)
1. Uso de uma sequência de peptídeo quimérico caracterizado por ser para produzir um medicamento para tratar um distúrbio associado ou relacionado ao ácido biliar, em que a sequência de aminoácido do peptídeo quimérico consiste em:RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQR QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPS FEK (M69) (SEQ ID NO:69), ou MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M70) (SEQ ID NO:70) em que o referido distúrbio é colestase, colestase intra- hepática, colestase intra-hepática familiar primária (PFIC), PFIC progressiva, colestase intra-hepática de gravidez (PIC), colestase neonatal, colestase induzida por drogas, colestase extra-hepática, cirrose primária biliar (PBC), colangite esclerosante primária (PSC), compressão de corte biliar a partir de tumor, bloqueio do ducto biliar por pedras na vesícula, má absorção de ácidos biliares e diarreia de ácidos biliares (BAD).
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o terminal amino- ou carbóxi- do referido peptídeo é fundido com uma região Fc de imunoglobulina.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio é PFIC.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido distúrbio é BAD.
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