BR112015011492B1

BR112015011492B1 - RECOMBINANT MICRO-ORGANISM WITH IMPROVED BUTANOL PRODUCTION CAPACITY AND METHOD FOR BUTANOL PRODUCTION THROUGH THE USE OF IT

Info

Publication number: BR112015011492B1
Application number: BR112015011492-0A
Authority: BR
Inventors: Sang-hyun Lee; Moon-Ho Eom
Original assignee: Gs Caltex Corporation
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2022-10-11
Also published as: CA2892129C; CA2892129A1; KR101473532B1; WO2014081084A1; MY170881A; US20150376655A1; BR112015011492A2; US9957529B2; KR20140064469A

Abstract

MICRORGANISMO RECOMBINANTE COM CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE BUTANOL APERFEIÇOADA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE BUTANOL ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um microrganismo recombinante com capacidade de produção de butanol aperfeiçoada, que possui uma via de síntese acetil-CoA e uma via de síntese butiril-CoA, em que uma via que converte acetil-CoA em acetato é inibida e uma via que converte acetil-CoaA em butiril-CoA é promovida. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de butanol utilizando um microrganismo recombinante.RECOMBINANT MICROORGANISM WITH IMPROVED BUTANOL PRODUCTION CAPACITY AND METHOD FOR BUTANOL PRODUCTION THROUGH THE USE OF THE SAME. The present invention relates to a recombinant microorganism with improved butanol production capacity, which has an acetyl-CoA synthesis pathway and a butyryl-CoA synthesis pathway, in which a pathway that converts acetyl-CoA to acetate is inhibited and a pathway that converts acetyl-CoaA to butyryl-CoA is promoted. Furthermore, the present invention relates to a method of producing butanol using a recombinant microorganism.

Description

Campo TécnicoTechnical Field

[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante de capacidade de produção de butanol aperfeiçoada e a um método para produzir butanol utilizando o mesmo.[001] The present invention relates to a recombinant microorganism of improved butanol production capacity and a method for producing butanol using the same.

Antecedentes da TécnicaBackground of the Technique

[002] O butanol é um composto intermediário com uma variada gama de aplicações, tais como, cosméticos, perfumes, hormonas, agentes sanitários, agentes de revestimento industrial, aditivos para tintas, fibras, monómeros plásticos, produtos medicinais, vitaminas, antibióticos, pesticidas e semelhantes e, deste modo, considerados como extremamente úteis (Durre, Biotechnol J„ 2:1525-1534, 2007).[002] Butanol is an intermediate compound with a wide range of applications, such as cosmetics, perfumes, hormones, sanitary agents, industrial coating agents, additives for paints, fibers, plastic monomers, medicinal products, vitamins, antibiotics, pesticides and the like, and thus considered to be extremely useful (Durre, Biotechnol J„ 2:1525-1534, 2007).

[003] Como m método anterior para produzir butanol, foi utilizado até aos anos 80, um método para produzir butanol, acetona e etanol por meio de fermentação de açúcares utilizando as estirpes Clostridium (Weizmann, Patente norte-americana No 1,315,585). Depois dessa data, foi grandemente utilizado um processo oxo para sintetizar butanol a partir de propileno obtido a partir de petróleo. No entanto, este método à base de petróleo para produzir butanol tem desvantagens, considerando que o processo de produção é complexo devido ao emprego de altas pressões e altas temperaturas, sendo uma grande quantidade de resíduos perigosos e dióxido de carbono descarregada a partir do método (Tsuchida et al., Ind. Eng. Chem.Res., 45:8634, 2006). Neste sentido, tem recentemente existido uma crescente necessidade de um método amigo do ambiente para produzir butanol através da fermentação de fontes renováveis utilizando micro-organismos.[003] As a previous method for producing butanol, until the 1980s, a method for producing butanol, acetone, and ethanol by fermenting sugars using Clostridium strains was used (Weizmann, US Patent No. 1,315,585). After that date, an oxo process was widely used to synthesize butanol from propylene obtained from petroleum. However, this petroleum-based method for producing butanol has disadvantages, considering that the production process is complex due to the employment of high pressures and high temperatures, and a large amount of hazardous waste and carbon dioxide is discharged from the method ( Tsuchida et al., Ind. Eng. Chem.Res., 45:8634, 2006 ). In this regard, there has recently been a growing need for an environmentally friendly method to produce butanol through fermentation of renewable sources using microorganisms.

[004] No entanto, por forma a produzir butanol a um nível industrial utilizando micro-organismos, a seletividade de butanol, o rendimento e produtividade (nomeadamente, quantidade produzida de butanol por hora) deverá ser boa. Contudo, micro-organismos recombinantes ou do tipo selvagem utilizados na produção de butanol têm que reunir essas condições.[004] However, in order to produce butanol at an industrial level using microorganisms, the butanol selectivity, yield and productivity (namely, amount of butanol produced per hour) must be good. However, recombinant or wild-type microorganisms used in the production of butanol must meet these conditions.

[005] Especificamente, é sabido que a Clostridium acetobutylicum ATCC 824 do tipo selvagem produz acetona, etanol e butanol em uma proporção em peso de aproximadamente 3:1:6 por meio da fermentação, em que uma pequena quantidade de ácido acético e ácido butírico é igualmente produzida. O rendimento da estirpe de tipo selvagem é aproximadamente 25%, e a concentração final é aproximadamente 10 g/L. Os micro-organismos que têm uma via de biossíntese de acetil-CoA e uma via de biossintese de butiril-CoA, tal como a Clostridium acetobutylicum, são normalmente conhecidos por sintetizar acetona, butanol e etanol por uma via retratada na Fig. 1. Com o recente desenvolvimento da tecnologia de engenharia metabólica, os esforços contínuos têm-se centrado em uma produção mais eficaz de butanol. Em particular, no caso da Clostridium acetobutylicum, estudos relacionados com mecanismos de via metabólica são ativamente executados como o genoma completo do mesmo foi recentemente sequenciado.[005] Specifically, wild-type Clostridium acetobutylicum ATCC 824 is known to produce acetone, ethanol, and butanol in a weight ratio of approximately 3:1:6 through fermentation, in which a small amount of acetic acid and butyric acid is also produced. The yield of the wild-type strain is approximately 25%, and the final concentration is approximately 10 g/L. Microorganisms that have both an acetyl-CoA biosynthesis pathway and a butyryl-CoA biosynthesis pathway, such as Clostridium acetobutylicum, are commonly known to synthesize acetone, butanol, and ethanol via a pathway depicted in Fig. 1. With the recent development of metabolic engineering technology, ongoing efforts have focused on more efficient production of butanol. In particular, in the case of Clostridium acetobutylicum, studies related to metabolic pathway mechanisms are actively performed as its complete genome has been recently sequenced.

[006] Por exemplo, foram registados resultados de testes em que os genes adhE1 (álcool/ aldeído desidrogenase) e genes ctfAB são simultaneamente super-expressados em uma estirpe Clostridium acetobutylicum M5 que perdeu magaplasmídeo com genes relacionados com a produção de butanol (ade, ctfAB, adhE1 (álcool/ aldeído desidrogenase) e adhE2 (álcool/ aldeído desidrogenase)). De acordo com o relatório, foi descoberto que a seletividade de butanol aumentou para 0,78 em uma proporção em peso, mas observaram-se algumas limitações em que a produtividade e rendimento sofreram uma redução bastante significativa devido à inibição do crescimento da estirpe e aumento da produção de ácido acético (Lee, et al„ Biotechnol. J„ 4:1432-1440, 2009; Lee, et al„ WO 2009/082148).[006] For example, test results were recorded in which the adhE1 genes (alcohol/aldehyde dehydrogenase) and ctfAB genes are simultaneously overexpressed in a Clostridium acetobutylicum M5 strain that lost magaplasmid with genes related to butanol production (ade, ctfAB, adhE1 (alcohol/aldehyde dehydrogenase) and adhE2 (alcohol/aldehyde dehydrogenase)). According to the report, it was found that the selectivity of butanol increased to 0.78 in a weight ratio, but some limitations were observed that the productivity and yield were reduced quite significantly due to strain growth inhibition and increased of acetic acid production (Lee, et al Biotechnol. J 4:1432-1440, 2009; Lee, et al WO 2009/082148).

[007] No caso em que um gene pta que converte o acetil-CoA em acetato foi eliminado e no caso em que um gene pta e um gene buk que converte butiril-CoA em butirato foram eliminados e depois um gene aad (álcool/ aldeído desidrogenase) que foi super-expressado, observou-se que a concentração, seletividade e rendimento do butanol aumentaram. Contudo, ambos os casos têm ainda limitações com vista à produtividade e estabilidade de estirpes (LEE et al., WO 2011/037415). Mais ainda, no caso em que o gene ctfB codificador da CoA transferase (CoAT) foi adicionalmente eliminado do mutante livre de pta e buk, a produtividade foi ainda considerada como baixa (LEE et al., WO 2011/037415).[007] In the case where a pta gene that converts acetyl-CoA to acetate was deleted and in the case where a pta gene and a buk gene that converts butyryl-CoA to butyrate were deleted and then an aad gene (alcohol/aldehyde dehydrogenase) that was overexpressed, it was observed that the concentration, selectivity and yield of butanol increased. However, both cases still have limitations regarding productivity and strain stability (LEE et al., WO 2011/037415). Furthermore, in the case where the ctfB gene encoding CoA transferase (CoAT) was additionally deleted from the pta and buk free mutant, the productivity was still considered as low (LEE et al., WO 2011/037415).

[008] Para, além disso, existe um exemplo que regista a produção de 18,6 g/f de butanol como o resultado de fermentação por uma estirpe Clostridium beijerinckii BA101 mutante que sofreu mutação aleatória e utilizando maltodextrina como uma fonte de carbono (Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004). No entanto, a utilização de estirpes recombinantes revelaram baixa produtividade do produto final, butanol, o qual torna a aplicabilidade industrial impossível.[008] Furthermore, there is an example recording the production of 18.6 g/f of butanol as the result of fermentation by a randomly mutated Clostridium beijerinckii BA101 mutant strain using maltodextrin as a carbon source (Ezeji et al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 63:653, 2004). However, the use of recombinant strains revealed low productivity of the final product, butanol, which makes industrial applicability impossible.

[009] Mais ainda, existe um exemplo que regista uma redução na concentração de acetona e aumento na seletividade de butanol ao eliminar o gene ctfAB codificador de CoA transferase ou o gene ade (decarboxilase de ácido acetoacético). No entanto, este exemplo apresenta problemas em que a concentração final de butanol é inferior a 10 g/L e a estirpe não se encontra estável (Jiang et al., Metab. Eng., 11 (4-5):284-291, 2009).[009] Furthermore, there is an example that records a reduction in the concentration of acetone and an increase in the selectivity of butanol by deleting the ctfAB gene encoding CoA transferase or the ade gene (acetoacetic acid decarboxylase). However, this example has problems where the final concentration of butanol is less than 10 g/L and the strain is not stable ( Jiang et al., Metab. Eng., 11(4-5):284-291, 2009).

[010] Para além disso, no caso de super-expressão dos genes ade (decarboxilase de ácido acetoacético) e ctfAB (CoA transferase) na Clostridium acetobutylicum de tipo selvagem, verifica-se que a produtividade de acetona, etanol e butanol é aumentada para 95%, 90%, e 37%, respectivamente, quando comparada à da Clostridium acetobutylicum do tipo selvagem. No entanto, o exemplo apresenta problemas em que a seletividade de butanol e rendimento são baixos (Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993).[010] Furthermore, in the case of overexpression of the genes ade (acetoacetic acid decarboxylase) and ctfAB (CoA transferase) in wild-type Clostridium acetobutylicum, it is found that the productivity of acetone, ethanol and butanol is increased to 95%, 90%, and 37%, respectively, when compared to wild-type Clostridium acetobutylicum. However, the example has problems where the butanol selectivity and yield are low ( Mermelstein et al., Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993 ).

[011] No curso da investigação mais séria dos autores da invenção em encontrar um micro-organismo com uma seletividade excelente de butanol, rendimento e produtividade, descobriu-se que um micro-organismo recombinante com inibição da atividade fosfotransacetilase e butirato quinase, atividade da CoA transferase e aldeído/álcool desidrogenase aumentada e tiolase ou atividade do operão hbd-crt-bcd aumentada entre os micro- organismos com um via biossintética acetil-CoA e uma via biossintética butiril- CoA revela uma seletividade elevada de butanol e rendimento com seletividade baixa de etanol, permitindo assim a produção contínua de biobutanol a uma escala industrial. Com base nesta descoberta, é realizada a presente invenção. Divulgação Problema Técnico[011] In the course of the most serious investigation by the authors of the invention to find a microorganism with an excellent selectivity of butanol, yield and productivity, it was discovered that a recombinant microorganism with inhibition of phosphotransacetylase and butyrate kinase activity, activity of Increased CoA transferase and aldehyde/alcohol dehydrogenase and thiolase or increased hbd-crt-bcd operon activity among microorganisms with an acetyl-CoA biosynthetic pathway and a butyryl-CoA biosynthetic pathway reveals a high butanol selectivity and yield with low selectivity of ethanol, thus allowing the continuous production of biobutanol on an industrial scale. Based on this discovery, the present invention is made. Disclosure Technical Problem

[012] É objeto da presente invenção apresentar um micro-organismo recombinante com seletividade alta de butanol e rendimento com seletividade baixa de etanol, permitindo, deste modo, a produção contínua de biobutanol a uma escala industrial.[012] It is the object of the present invention to present a recombinant microorganism with high selectivity for butanol and yield with low selectivity for ethanol, thus allowing the continuous production of biobutanol on an industrial scale.

Solução TécnicaTechnical Solution

[013] De acordo com um aspecto da presente invenção, é apresentado um micro-organismo recombinante com capacidade de produção de butanol aperfeiçoada que tem uma via de biossíntese de acetil-CoA e uma via de biossíntese de butiril-CoA, em que uma via que converte o acetil-CoA em acetato é inibida e uma via que converte acetil-CoA em butiril-CoA é promovida.[013] According to one aspect of the present invention, there is provided a recombinant microorganism with improved butanol production capability that has an acetyl-CoA biosynthesis pathway and a butyryl-CoA biosynthesis pathway, wherein one pathway pathway that converts acetyl-CoA to acetate is inhibited, and a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA is promoted.

[014] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é apresentado um método para produzir butanol incluindo: a cultura do micro-organismo recombinante de acordo com a presente invenção e a recuperação de butanol da solução de cultura.[014] According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing butanol including: culturing the recombinant microorganism according to the present invention and recovering butanol from the culture solution.

Efeitos VantajososAdvantageous Effects

[015] O micro-organismo recombinante, de acordo com a presente invenção, apresenta um rendimento ABE alto (acetona, butanol e etanol), produtividade de butanol e seletividade de butanol com seletividade baixa de etanol. Por conseguinte, o micro-organismo recombinante, de acordo com a presente invenção, tem capacidade de produzir continuamente biobutanol a uma escala industrial.[015] The recombinant microorganism, according to the present invention, has a high ABE yield (acetone, butanol and ethanol), butanol productivity and butanol selectivity with low ethanol selectivity. Therefore, the recombinant microorganism according to the present invention is capable of continuously producing biobutanol on an industrial scale.

Descrição das FigurasDescription of Figures

[016] A fig. 1 apresenta vias de síntese de acetona, butanol e etanol em um micro-organismo com uma via de biossíntese de acetil-CoA e uma via de biossíntese de butiril-CoA.[016] Fig. 1 shows acetone, butanol, and ethanol synthesis pathways in a microorganism with an acetyl-CoA biosynthesis pathway and a butyryl-CoA biosynthesis pathway.

[017] A fig. 2 apresenta um exemplo de um micro-organismo recombinante de acordo com a presente invenção.[017] Fig. 2 shows an example of a recombinant microorganism according to the present invention.

[018] A fig. 3 apresenta um vector pGS1-MCS.[018] Fig. 3 shows a pGS1-MCS vector.

[019] A fig. 4 apresenta um vector pGS1-atoB.[019] Fig. 4 shows a pGS1-atoB vector.

[020] A fig. 5 apresenta uma sequência base de SEQ ID NO: 4.[020] Fig. 5 shows a base sequence of SEQ ID NO: 4.

[021] A fig. 6 apresenta um vector pGS1-HCB.[021] Fig. 6 shows a pGS1-HCB vector.

[022] A fig. 7 apresenta um vector pGS1 -AdhE1.[022] Fig. 7 shows a pGS1 -AdhE1 vector.

[023] A fig. 8 apresenta um vector pGS1-E1AB.[023] Fig. 8 shows a pGS1-E1AB vector.

[024] A fig. 9 apresenta um vector pGS1-E1 AB-atoB.[024] Fig. 9 shows a pGS1-E1 AB-atoB vector.

[025] A fig. 10 apresenta um vector pGS1-E1AB-HCB.[025] Fig. 10 shows a pGS1-E1AB-HCB vector.

Melhor ModoBest Mode

[026] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante com capacidade de produção de butanol aperfeiçoada que tem uma via biossintética de acetil-CoA e uma via biossintética de butiril-CoA, em que uma via que converte o acetil-CoA em acetato é inibida e uma via que converte acetil-CoA em butiril-CoA é promovida.[026] The present invention relates to a recombinant microorganism with improved butanol production capacity that has an acetyl-CoA biosynthetic pathway and a butyryl-CoA biosynthetic pathway, in which a pathway that converts acetyl-CoA in acetate is inhibited and a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA is promoted.

[027] Mais ainda, a presente invenção refere-se a um método para produzir butanol incluindo: a cultura do micro-organismo recombinante de acordo com a presente invenção e a recuperação de butanol da solução de cultura.[027] Furthermore, the present invention relates to a method for producing butanol including: culturing the recombinant microorganism according to the present invention and recovering butanol from the culture solution.

[028] Será agora descrita em detalhe a presente invenção.[028] The present invention will now be described in detail.

[029] O micro-organismo recombinante, de acordo com a presente invenção, é um micro-organismo recombinante com capacidade de produção de butanol aperfeiçoada que tem uma via biossintética de acetil-CoA e uma via biossintética de butiril-CoA, em que uma via que converte o acetil-CoA em acetato é inibida e uma via que converte acetil-CoA em butiril-CoA é promovida.[029] The recombinant microorganism according to the present invention is a recombinant microorganism with improved butanol production capacity that has an acetyl-CoA biosynthetic pathway and a butyryl-CoA biosynthetic pathway, in which a pathway that converts acetyl-CoA to acetate is inhibited and a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA is promoted.

[030] O micro-organismo recombinante pode promover ou inibir outras vias. Por exemplo, o micro-organismo recombinante pode promover uma ou mais vias selecionadas de uma via que converte o acetil-CoA em acetoacetil- CoA, uma via que converte acetoacetil-CoA em butiril-CoA, uma via que converte acetato em acetil-CoA, uma via que converte butirato em butiril-CoA e uma via que converte butiril-CoA em butanol. Mais ainda, o micro-organismo recombinante pode inibir uma via que converte butiril-CoA para butirato.[030] The recombinant microorganism can promote or inhibit other pathways. For example, the recombinant microorganism can promote one or more pathways selected from a pathway that converts acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA, a pathway that converts acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA, a pathway that converts acetate to acetyl-CoA , a pathway that converts butyrate to butyryl-CoA, and a pathway that converts butyryl-CoA to butanol. Furthermore, the recombinant microorganism can inhibit a pathway that converts butyryl-CoA to butyrate.

[031] Preferencialmente, tal como apresentado na Fig. 2, o microorganismo recombinante é um micro-organismo recombinante que tem uma via biossintética de acetil-CoA e uma via biossintética de butiril-CoA, em que a via que converte acetil-CoA em acetato e a via que converte butiril-CoA em butirato são inibidas e uma via que converte acetil-CoA em butiril-CoA, uma via que converte acetato em acetil-CoA, uma via que converte butirato em butiril-CoA e uma via que converte butiril-CoA em butanol são promovidas.[031] Preferably, as shown in Fig. 2, the recombinant microorganism is a recombinant microorganism that has an acetyl-CoA biosynthetic pathway and a butyryl-CoA biosynthetic pathway, wherein the pathway that converts acetyl-CoA to acetate and the pathway that converts butyryl-CoA to butyrate are inhibited and a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA, a pathway that converts acetate to acetyl-CoA, a pathway that converts butyrate to butyryl-CoA, and a pathway that converts butyryl-CoA to butanol are all promoted.

[032] Em uma realização, o micro-organismo recombinante é um microorganismo recombinante com uma via biossintética de acetil-CoA e uma via biossintética de butiril-CoA, em que as atividade de fosfotransacetilase e de butirato quinase são inibidas, as atividades de CoA transferase e aldeído/álcool desidrogenase são aumentadas, e a atividade de tiolase ou do operão hbd-crt- bcd é aumentada.[032] In one embodiment, the recombinant microorganism is a recombinant microorganism with an acetyl-CoA biosynthetic pathway and a butyryl-CoA biosynthetic pathway, in which phosphotransacetylase and butyrate kinase activities are inhibited, CoA activities transferase and aldehyde/alcohol dehydrogenase are increased, and the activity of thiolase or the hbd-crt-bcd operon is increased.

Via biossintética de acetil-CoAAcetyl-CoA biosynthetic pathway

[033] Aqui, a via biossintética de acetil-CoA refere-se a uma via em que o acetil-CoA é sintetizado a partir de um produto metabólico específico em um micro-organismo. A via biossintética de acetil-CoA pode ser uma via em que o acetil-CoA é sintetizado a partir de piruvato ou uma via em que o acetil-CoA é sintetizado a partir de acetato e semelhantes. A via na qual o acetil-CoA é sintetizado a partir de acetato pode ser regulada por CoA transferase.[033] Here, the acetyl-CoA biosynthetic pathway refers to a pathway in which acetyl-CoA is synthesized from a specific metabolic product in a microorganism. The acetyl-CoA biosynthetic pathway can be a pathway in which acetyl-CoA is synthesized from pyruvate or a pathway in which acetyl-CoA is synthesized from acetate and the like. The pathway in which acetyl-CoA is synthesized from acetate can be regulated by CoA transferase.

Via biossintética de butiril-CoAButyryl-CoA biosynthetic pathway

[034] Aqui, a via biossintética de butiril-CoA refere-se a uma via em que o butiril-CoA é sintetizado a partir de um produto metabólico específico em um micro-organismo. A via biossintética de butiril-CoA pode ser uma via em que o butiril-CoA é sintetizado a partir de acetil-CoA, uma via em que o butiril-CoA é sintetizado a partir de acetoacetil-CoA ou uma via em que o butiril-CoA é sintetizado a partir de butirato e semelhantes. A via na qual o butiril-CoA é sintetizado a partir de butirato pode ser regulada por CoA transferase.[034] Here, the butyryl-CoA biosynthetic pathway refers to a pathway in which butyryl-CoA is synthesized from a specific metabolic product in a microorganism. The butyryl-CoA biosynthetic pathway can be a pathway in which butyryl-CoA is synthesized from acetyl-CoA, a pathway in which butyryl-CoA is synthesized from acetoacetyl-CoA, or a pathway in which butyryl-CoA is synthesized from acetyl-CoA. CoA is synthesized from butyrate and the like. The pathway in which butyryl-CoA is synthesized from butyrate can be regulated by CoA transferase.

Micro-organismo com via biossintéticaacetil-CoA e via biossintética butiril-CoAMicroorganism with acetyl-CoA biosynthetic pathway and butyryl-CoA biosynthetic pathway

[035] Micro-organismos com a via biossintética de acetil-CoA e a via biossintética de butiril-CoA não são particularmente limitados desde que os micro-organismos possuam essas vias biossintéticas. Mais ainda, o microorganismo de acordo com a presente invenção pode ser um micro-organismo do tipo selvagem com a via biossintética de acetil-CoA e a via biossintética butiril-CoA ou um micro-organismo recombinante com via biossintética de acetil-CoA e a via biossintética butiril-CoA por meio de recombinação genética. Preferencialmente, o micro-organismo de acordo com a presente invenção é Clostridium sem que tal constitua qualquer limitação.[035] Microorganisms with the acetyl-CoA biosynthetic pathway and the butyryl-CoA biosynthetic pathway are not particularly limited as long as the microorganisms possess these biosynthetic pathways. Furthermore, the microorganism according to the present invention can be a wild-type microorganism with the acetyl-CoA biosynthetic pathway and the butyryl-CoA biosynthetic pathway or a recombinant microorganism with the acetyl-CoA biosynthetic pathway and the butyryl-CoA biosynthetic pathway through genetic recombination. Preferably, the microorganism according to the present invention is Clostridium without this constituting any limitation.

Inibição da via que converte acetil-CoA para acetatoInhibition of the pathway that converts acetyl-CoA to acetate

[036] O acetil-CoA biossintetizado pode ser convertido para acetato por meio de acetilfosfato. A via pode ser inibida ao se regular a fase de conversão do acetil-CoA em acetil-fosfato ou a fase de conversão de acetil-fosfato em acetato. Estas fases podem ser inibidas por métodos conhecidos tais como regulação da expressão de enzimas que regulam cada fase ou inibição da atividade da enzima.[036] The biosynthesized acetyl-CoA can be converted to acetate by means of acetylphosphate. The pathway can be inhibited by regulating either the acetyl-CoA to acetyl phosphate conversion step or the acetyl phosphate to acetate conversion step. These phases can be inhibited by known methods such as regulating the expression of enzymes that regulate each phase or inhibiting enzyme activity.

[037] Por exemplo, fosfotransacetilase regula a conversão de acetil-CoA para acetil-fosfato. A via que converte o acetil-CoA em acetato pode ser inibida ao inibir a fosfotransacetilase. A inibição de fosfotransacetilase pode ser realizada por inibição da expressão e atividade da enzima de fosfotransacetilase. Por exemplo, os especialistas na técnica podem inibir fosfotransacetilase ao selecionar um método apropriado, tal como eliminar um gene pta codificador de fosfotransacetilase, provocando mutações no gene pta (mutações tais como inibição da expressão de gene normal de genes através da mudança, substituição ou eliminação de uma parte da sequência base ou introduzindo uma parte da sequência base), regulando a expressão do gene no curso da transcrição ou procedimentos de translação e semelhantes.[037] For example, phosphotransacetylase regulates the conversion of acetyl-CoA to acetyl-phosphate. The pathway that converts acetyl-CoA to acetate can be inhibited by inhibiting phosphotransacetylase. Phosphotransacetylase inhibition can be accomplished by inhibiting the expression and activity of the phosphotransacetylase enzyme. For example, those skilled in the art can inhibit phosphotransacetylase by selecting an appropriate method, such as deleting a phosphotransacetylase-encoding pta gene, causing mutations in the pta gene (mutations such as inhibiting normal gene expression of genes by changing, replacing or deleting of a part of the base sequence or introducing a part of the base sequence), regulating gene expression in the course of transcription or translational procedures and the like.

[038] Mais ainda, acetato quinase (ack) regula a conversão de acetilfosfato em acetato. A via que converte o acetil-CoA em acetato pode ser inibida ao inibir o acetato quinase. A inibição de acetato quinase pode ser realizada por inibição da expressão e atividade da enzima de acetato quinase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem inibir acetato quinase ao selecionar um método apropriado, tal como eliminar um gene ack codificador de acetato quinase, provocando mutações no gene ack (mutações tais como inibição da expressão de gene normal de genes através da mudança, substituição ou eliminação de uma parte da sequência base ou introduzindo uma parte da sequência base), regulando a expressão do gene no curso da transcrição ou procedimentos de translação e semelhantes.[038] Furthermore, acetate kinase (ack) regulates the conversion of acetylphosphate to acetate. The pathway that converts acetyl-CoA to acetate can be inhibited by inhibiting acetate kinase. Inhibition of acetate kinase can be carried out by inhibiting the expression and activity of the acetate kinase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can inhibit acetate kinase by selecting an appropriate method, such as deleting an acetate kinase-encoding ack gene, causing mutations in the ack gene (mutations such as inhibiting normal gene expression of genes through change, substitution or deleting a part of the base sequence or introducing a part of the base sequence), regulating gene expression in the course of transcription or translation procedures and the like.

Inibição da via que converte butiril-CoA em butiratoInhibition of the pathway that converts butyryl-CoA to butyrate

[039] O butiril-CoA biossintetizado pode ser convertido em butirato por meio de butirilfosfato. A via pode ser inibida ao se regular a fase de conversão do butiril-CoA em butiril-fosfato ou a fase de conversão de butiril-fosfato em butirato. Estas fases podem ser inibidas por métodos conhecidos tais como regulação da expressão de enzimas que regulam cada fase ou inibição da atividade da enzima.[039] The biosynthesized butyryl-CoA can be converted into butyrate by means of butyrylphosphate. The pathway can be inhibited by regulating either the butyryl-CoA to butyryl-phosphate conversion step or the butyryl-phosphate to butyrate conversion step. These phases can be inhibited by known methods such as regulating the expression of enzymes that regulate each phase or inhibiting enzyme activity.

[040] Por exemplo, butirato quinase regula a conversão de butirilfosfato em butirato. A via que converte o butiril-CoA em butirato pode ser inibida ao inibir o butirato quinase. A inibição de butirato quinase pode ser realizada por inibição da expressão e atividade da enzima de butirato quinase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem inibir butirato quinase ao selecionar um método apropriado, tal como eliminar um gene buk codificador de butirato quinase, provocando mutações no gene buk (mutações tais como inibição da expressão de gene normal de genes através da mudança, substituição ou eliminação de uma parte da sequência base ou introduzindo uma parte da sequência base), regulando a expressão do gene no curso da transcrição ou procedimentos de translação e semelhantes.[040] For example, butyrate kinase regulates the conversion of butyrylphosphate to butyrate. The pathway that converts butyryl-CoA to butyrate can be inhibited by inhibiting butyrate kinase. Butyrate kinase inhibition can be accomplished by inhibiting the expression and activity of the butyrate kinase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can inhibit butyrate kinase by selecting an appropriate method, such as deleting a buk gene encoding butyrate kinase, causing mutations in the buk gene (mutations such as inhibiting normal gene expression of genes through change, substitution or deleting a part of the base sequence or introducing a part of the base sequence), regulating gene expression in the course of transcription or translation procedures and the like.

[041] Para além disso, fosfotransbutilase regula a conversão de butiril-CoA para butiril-fosfato. A via que converte o acetil-CoA em acetato pode ser inibida ao inibir a fosfotransbutilase. A inibição de fosfotransbutilase pode ser realizada por inibição da expressão e atividade da enzima de fosfotransbutilase. Por exemplo, os especialistas na técnica podem inibir acetato quinase ao selecionar um método apropriado, tal como eliminar um gene ptb codificador de fosfotransbutilase, provocando mutações no gene ptb (mutações tais como inibição da expressão de gene normal de genes através da mudança, substituição ou eliminação de uma parte da sequência base ou introduzindo uma parte da sequência base), regulando a expressão do gene no curso da transcrição ou procedimentos de translação e semelhantes.[041] In addition, phosphotransbutylase regulates the conversion of butyryl-CoA to butyryl-phosphate. The pathway that converts acetyl-CoA to acetate can be inhibited by inhibiting phosphotransbutylase. Phosphotransbutylase inhibition can be accomplished by inhibiting the expression and activity of the phosphotransbutylase enzyme. For example, those skilled in the art can inhibit acetate kinase by selecting an appropriate method, such as deleting a ptb gene encoding phosphotransbutylase, causing mutations in the ptb gene (mutations such as inhibiting normal gene expression of genes by changing, replacing or deleting a part of the base sequence or introducing a part of the base sequence), regulating gene expression in the course of transcription or translational procedures and the like.

Aceleração da via que converte butirato para butiril-CoAAcceleration of the pathway that converts butyrate to butyryl-CoA

[042] CoA transferase regula a conversão de butirato para butiril-CoA. A via que converte o butirato para butiril-CoA pode ser acelerada ao aumentar a atividade de CoA transferase. Aumentar a atividade de CoA transferase pode ser realizada por aumento da expressão e atividade da enzima de CoA transferase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem aumentar a atividade da CoA transferase ao selecionar um método apropriado, tal como, introdução, ampliação, reorganização do gene cftA ou ctfB (doravante designado como "ctfAB") codificador da CoA transferase ou regulação da expressão do gene no curso da transcrição ou translação e semelhantes.[042] CoA transferase regulates the conversion of butyrate to butyryl-CoA. The pathway that converts butyrate to butyryl-CoA can be accelerated by increasing CoA transferase activity. Increasing CoA transferase activity can be accomplished by increasing the expression and activity of the CoA transferase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can increase CoA transferase activity by selecting an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the cftA or ctfB (hereinafter referred to as "ctfAB") gene encoding the CoA transferase or regulating the expression of the gene in the course of transcription or translation and the like.

Aceleração da via que converte acetato para acetato-CoAAcceleration of the pathway that converts acetate to acetate-CoA

[043] CoA transferase regula a conversão de acetato para acetil-CoA. A via que converte o acetato para acetil-CoA pode ser acelerada ao aumentar a atividade de CoA transferase. Aumentar a atividade de CoA transferase pode ser realizada por aumento da expressão e atividade da enzima de CoA transferase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem aumentar a atividade da CoA transferase ao selecionar um método apropriado, tal como, introdução, ampliação, reorganização do gene cftAB codificador da CoA transferase ou regulação da expressão do gene no curso da transcrição ou translação e semelhantes.[043] CoA transferase regulates the conversion of acetate to acetyl-CoA. The pathway that converts acetate to acetyl-CoA can be accelerated by increasing CoA transferase activity. Increasing CoA transferase activity can be accomplished by increasing the expression and activity of the CoA transferase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can increase CoA transferase activity by selecting an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the cftAB gene encoding CoA transferase, or regulating gene expression in the course of transcription or translation, and the like.

[044] CoA transferase regula igualmente a via que converte acetoacetil- CoA para acetoacetato. Por conseguinte, no caso em que a atividade da CoA transferase é aumentada, a via que converte acetoacetil-CoA para acetona via acetoacetato pode ser igualmente afetada. No entanto, o micro-organismo recombinante, de acordo com a presente invenção, mostra que outras vias, tais como uma via que converte acetil-CoA para butiril-CoA e semelhantes e enzimas relacionadas com estas vias são reguladas de forma apropriada independentemente do aumento da atividade de CoA transferase. Como resultado, a capacidade de produção de acetona não é aumentada na medida em que o desempenho como uma estirpe produtora de butanol é significativamente inibida.[044] CoA transferase also regulates the pathway that converts acetoacetyl-CoA to acetoacetate. Therefore, in the event that CoA transferase activity is increased, the pathway that converts acetoacetyl-CoA to acetone via acetoacetate may be affected as well. However, the recombinant microorganism according to the present invention shows that other pathways, such as a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA and the like, and enzymes related to these pathways are properly regulated regardless of the increase of CoA transferase activity. As a result, the acetone production capacity is not increased to the extent that the performance as a butanol producing strain is significantly inhibited.

Aceleração da via que converte butiril-CoA para butanolAcceleration of the pathway that converts butyryl-CoA to butanol

[045] O butiril-CoA biossintetizado pode ser convertido para butanol por meio de butanal. A via pode ser acelerada ao se promover a fase de conversão do butiril-CoA em butanal ou a fase de conversão de butanal para butanol. Cada fase pode ser acelerada utilizando um método conhecido, tal como, aumentar a atividade da enzima.[045] The biosynthesized butyryl-CoA can be converted to butanol through butanal. The pathway can be accelerated by promoting the butyryl-CoA to butanal conversion step or the butanal to butanol conversion step. Each phase can be sped up using a known method, such as increasing enzyme activity.

[046] Por exemplo, aldeído/álcool desidrogenase regula a conversão de butiril-CoA para butanal e a conversão de butanal para butanol. A via que converte o butiril-CoA para butanol pode ser acelerada ao se aumentar a atividade de aldeído/álcool desidrogenase. Aumentar a atividade de aldeído/álcool desidrogenase pode ser realizada pelo aumento da expressão e atividade da enzima de aldeído/álcool desidrogenase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem aumentar a atividade da aldeído/álcool desidrogenase ao selecionar um método apropriado, tal como, introdução, ampliação, reorganização do gene adhE codificador da aldeído/álcool desidrogenase ou regulação da expressão do gene no curso da transcrição ou translação e semelhantes.[046] For example, aldehyde/alcohol dehydrogenase regulates the conversion of butyryl-CoA to butanal and the conversion of butanal to butanol. The pathway that converts butyryl-CoA to butanol can be accelerated by increasing aldehyde/alcohol dehydrogenase activity. Increasing aldehyde/alcohol dehydrogenase activity can be accomplished by increasing the expression and activity of the aldehyde/alcohol dehydrogenase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can increase aldehyde/alcohol dehydrogenase activity by selecting an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the adhE gene encoding aldehyde/alcohol dehydrogenase, or regulating gene expression in the course of transcription, or translation and the like.

[047] Aldeído/álcool desidrogenase regula igualmente a via que converte acetil-CoA para etanol. Por conseguinte, no caso em que a atividade da aldeído/álcool desidrogenase é aumentada, a via que converte acetil-CoA para etanol via acetoaldeído pode ser igualmente afetada. No entanto, o microorganismo recombinante, de acordo com a presente invenção, mostra que outras vias, tais como uma via que converte acetil-CoA para butiril-CoA e semelhantes e enzimas relacionadas com estas vias são reguladas de forma apropriada independentemente do aumento da atividade de aldeído/álcool desidrogenase. Como resultado, a capacidade de produção de etanol e seletividade de etanol são reduzidas.[047] Aldehyde/alcohol dehydrogenase also regulates the pathway that converts acetyl-CoA to ethanol. Therefore, in the event that aldehyde/alcohol dehydrogenase activity is increased, the pathway that converts acetyl-CoA to ethanol via acetoaldehyde may be equally affected. However, the recombinant microorganism according to the present invention shows that other pathways, such as a pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA and the like, and enzymes related to these pathways are properly regulated regardless of increased activity. of aldehyde/alcohol dehydrogenase. As a result, ethanol production capacity and ethanol selectivity are reduced.

Aceleração da via que converte acetil-CoA para butiril-CoAAcceleration of the pathway that converts acetyl-CoA to butyryl-CoA

[048] O acetil-CoA biossintetizado pode ser convertido para butiril-CoA por meio de acetoacetil-CoA. A via pode ser acelerada ao se promover a fase de conversão do acetil-CoA em acetoacetil-CoA ou a fase de conversão de acetoacetil-CoA para butiril-CoA. Cada fase pode ser realizada pelo aumento da expressão e atividade de enzimas que regula casa fase.[048] Biosynthesized acetyl-CoA can be converted to butyryl-CoA via acetoacetyl-CoA. The pathway can be accelerated by promoting either the acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA conversion step or the acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA conversion step. Each phase can be accomplished by increasing the expression and activity of enzymes that regulate each phase.

Aceleração da via que converte acetil-CoA para acetoacetil-CoAAcceleration of the pathway that converts acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA

[049] Tiolase regula a conversão de acetil-CoA para acetoacetil-CoA. A via que converte o acetil-CoA para acetoacetil-CoA pode ser acelerada ao aumentar a atividade de tiolase. Aumentar a atividade de tiolase pode ser realizada por aumento da expressão e atividade da enzima de tiolase e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem aumentar a atividade da tiolase ao selecionar um método apropriado, tal como, introdução, ampliação, reorganização do gene atoB codificador da tiolase ou regulação da expressão do gene no curso da transcrição ou translação e semelhantes.[049] Thiolase regulates the conversion of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA. The pathway that converts acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA can be accelerated by increasing thiolase activity. Increasing the activity of thiolase can be accomplished by increasing the expression and activity of the thiolase enzyme and the like. For example, those skilled in the art can increase thiolase activity by selecting an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the thiolase-encoding atoB gene, or regulating gene expression in the course of transcription or translation, and the like.

Aceleração da via que converte acetoacetil-CoA em butiril-CoAAcceleration of the pathway that converts acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA

[050] O operão hbd-crt-bcd regula a conversão de acetoacetil-CoA para butiril-CoA. A via que converte o acetoacetil-CoA para butiril-CoA pode ser acelerada aumentando a atividade do operão hdb-crt-bcd. O aumento da atividade do operão hbd-crt-bcd pode ser realizada aumentando a expressão do gene e atividade da enzima do operão hbd-crt-bcd e semelhantes. Por exemplo, os especialistas na técnica podem aumentar a atividade do operão hbd-crt-bcd ao selecionar um método apropriado, tal como, introdução, ampliação, reorganização do gene do operão hbd-crt-bcd ou regulação da expressão do gene no curso da transcrição ou translação e semelhantes.[050] The hbd-crt-bcd operon regulates the conversion of acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA. The pathway that converts acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA can be accelerated by increasing the activity of the hdb-crt-bcd operon. Increasing the activity of the hbd-crt-bcd operon can be accomplished by increasing the gene expression and enzyme activity of the hbd-crt-bcd operon and the like. For example, those skilled in the art can enhance hbd-crt-bcd operon activity by selecting an appropriate method, such as introducing, amplifying, rearranging the hbd-crt-bcd operon gene, or regulating gene expression over the course of transcription or translation and the like.

Aperfeiçoamento da capacidade de produção de butanolImprovement of butanol production capacity

[051] Aperfeiçoamento da capacidade de produção de butanol refere-se aumento com vista a seletividade de butanol (proporção de butanol entre ABE produzido), produtividade de butanol (quantidade de butanol produzida por hora) e rendimento de produção de ABE (a quantidade de ABE produzido relativamente à quantidade da fonte de carbono consumida na produção) (doravante designada por "rendimento"). Preferencialmente, o aperfeiçoamento da capacidade de produção de butanol significa que a seletividade de butanol se torna 70% ou mais, a produtividade de butanol torna-se 1,0 g/L/h ou mais ou rendimento torna-se 28% ou mais, em uma base de cultura contínua.[051] Improvement of butanol production capacity refers to an increase in butanol selectivity (proportion of butanol between ABE produced), butanol productivity (amount of butanol produced per hour) and ABE production yield (the amount of EBA produced relative to the amount of carbon source consumed in production) (hereinafter referred to as "yield"). Preferably, butanol production capacity improvement means that butanol selectivity becomes 70% or more, butanol productivity becomes 1.0 g/L/h or more, or yield becomes 28% or more, on an ongoing culture basis.

Redução na capacidade de produção de etanolReduction in ethanol production capacity

[052] Por forma a produzir biobutanol de forma persistente e continuamente a uma escala industrial, a concentração de etanol em uma solução de cultura deverá ser inferior a um determinado nível. Concentração alta de etanol pode dar lugar a toxicidade para micro-organismos, a qual torna difícil o cultivo persistente e, deste modo, reduz a eficiência do processo de cultivo. O micro-organismo recombinante, de acordo com a presente invenção, exibe uma capacidade de produção de butanol aperfeiçoada mas uma capacidade de produção de etanol reduzida.[052] In order to persistently and continuously produce biobutanol on an industrial scale, the concentration of ethanol in a culture solution must be below a certain level. High ethanol concentration can give rise to toxicity to microorganisms, which makes persistent cultivation difficult and thus reduces the efficiency of the cultivation process. The recombinant microorganism according to the present invention exhibits improved butanol production capacity but reduced ethanol production capacity.

[053] Redução na capacidade de produção de etanol refere-se a uma redução da proporção de etanol no ABE produzido, nomeadamente redução na seletividade de etanol. Preferencialmente, a redução na capacidade de produção de etanol significa que a seletividade de etanol é 15% ou menos em uma cultura contínua ou base de cultura descontínua. A redução na capacidade de produção de etanol significa que a seletividade de etanol é 20% ou menos em uma base de cultura contínua.[053] Reduction in ethanol production capacity refers to a reduction in the proportion of ethanol in the ABE produced, namely reduction in ethanol selectivity. Preferably, the reduction in ethanol production capacity means that the ethanol selectivity is 15% or less on a continuous culture or batch culture basis. The reduction in ethanol production capacity means that the ethanol selectivity is 20% or less on a continuous culture basis.

Método para produzir butanolMethod to produce butanol

[054] O método para produzir butanol, de acordo com a presente invenção, inclui a cultura do micro-organismo recombinante de acordo com a presente invenção e a recuperação de butanol da solução de cultura.[054] The method for producing butanol according to the present invention includes culturing the recombinant microorganism according to the present invention and recovering butanol from the culture solution.

[055] A fase de cultura pode ser qualquer método de cultura normalmente utilizado no processo de produção de álcoois utilizando micro-organismos, sem que tal constitua qualquer limitação. Por exemplo, o método de cultura de acordo com a presente invenção pode ser cultivo líquido ou cultivo solido, ou cultura em lote, cultura contínua ou cultura descontínua, sem que tal constitua qualquer limitação. Os especialistas na técnica poderiam facilmente selecionar um método apropriado e realizar a presente invenção.[055] The culture phase can be any culture method normally used in the alcohol production process using microorganisms, without this constituting any limitation. For example, the culture method according to the present invention may be liquid culture or solid culture, or batch culture, continuous culture or batch culture, without limitation. Those skilled in the art could easily select an appropriate method and carry out the present invention.

[056] O método para recuperar butanol é qualquer método normalmente empregue na recuperação de bio-álcoois, sendo que tal não constitui qualquer limitação. Por exemplo, a fase de recuperação de butanol, de acordo com a presente invenção, pode ser realizada por membranas de separação, destilação ou processos semelhantes. Mais ainda, as fases de cultivo de microorganismos e recuperação de butanol podem ser realizados simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, butanol pode ser recuperado ao mesmo tempo que se cultivam continuamente micro-organismos.[056] The method for recovering butanol is any method normally employed in the recovery of bio-alcohols, and this does not constitute any limitation. For example, the butanol recovery step according to the present invention can be carried out by separation membranes, distillation or similar processes. Furthermore, the stages of cultivation of microorganisms and recovery of butanol can be carried out simultaneously or sequentially. For example, butanol can be recovered while continuously cultivating microorganisms.

Modo para a InvençãoMode for Invention

[057] Estes e outros aspectos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada das reivindicações que se seguem conjuntamente com as figuras anexas. No entanto, deverá entender-se que a presente invenção não se limita às reivindicações que se reguem e poderá ser incorporada de formas diferentes e que as realizações são facultadas para efeitos de uma divulgação completa e compreensão mais minuciosa da invenção por aqueles que são especialistas na técnica. O âmbito da invenção deve ser definido apenas pelas reivindicações anexas e respectivos equivalentes.[057] These and other aspects, features and advantages of the present invention will become more apparent from the detailed description of the claims that follow together with the attached figures. However, it is to be understood that the present invention is not limited to the claims which govern and may be incorporated in different forms and that the embodiments are provided for the purposes of a full disclosure and a more thorough understanding of the invention by those skilled in the art. technique. The scope of the invention is to be defined only by the appended claims and their equivalents.

MATERIAIS E MÉTODOSMATERIALS AND METHODS

[058] Uma estirpe Clostridium acetobutylicum PJC4BK Δbt//c:MLSr* com gene eliminado é a estirpe descrita no Journal of Microbiology (EM Green et al., 142, pp 2079) em 1996; Clostridium acetobutylicum ATCC824 Δpta e Clostridium acetobutylicum ATCC824 Δpta Δbuk são feitas de acordo com o método apresentado na WO2011/037415.[058] A gene-deleted Clostridium acetobutylicum PJC4BK Δbt//c:MLSr* strain is the strain described in the Journal of Microbiology (EM Green et al., 142, pp 2079) in 1996; Clostridium acetobutylicum ATCC824 Δpta and Clostridium acetobutylicum ATCC824 Δpta Δbuk are made according to the method set forth in WO2011/037415.

[059] Para a avaliação da capacidade de produção de biobutanol da estirpe recombinante C. acetobutylicum foram calculados a seletividade do álcool (proporção de um álcool específico no solvente misturado produzido (ABE: acetona, butanol, etanol)), a produtividade do butanol e rendimento como se segue: - Seletividade do butanol (%): quantidade produzida de butanol (g) / quantidade produzida de ABE (g) x 100 - Seletividade do etanol (%): quantidade produzida de etanol (g) / quantidade produzida de ABE (g) x 100 Produtividade do butanol (g/L/h): quantidade de butanol produzido por unidade de volume por hora (Produtividade do butanol em cultura descontínua e cultura semi- contínua com base na fase exponencial. Em cultura contínua, a produtividade do butanol baseia-se em uma quantidade cumulativa de ABE produzido em fase total). - Rendimento (%): quantidade produzida de ABE (g)/fonte de carbono(g) x 100 - Produtividade ABE (g/L/h): quantidade de ABE produzido por hora por unidade de volume[059] For the evaluation of the biobutanol production capacity of the recombinant strain C. acetobutylicum, the selectivity of the alcohol (proportion of a specific alcohol in the mixed solvent produced (ABE: acetone, butanol, ethanol)), the productivity of butanol and yield as follows: - Butanol selectivity (%): produced amount of butanol (g) / produced amount of EBA (g) x 100 - Ethanol selectivity (%): produced amount of ethanol (g) / produced amount of ABE (g) x 100 Butanol productivity (g/L/h): amount of butanol produced per unit volume per hour (Butanol productivity in batch culture and semi-continuous culture based on exponential phase. In continuous culture, the productivity of butanol is based on a cumulative amount of ABE produced in total phase). - Yield (%): amount of ABE produced (g)/carbon source(g) x 100 - ABE productivity (g/L/h): amount of ABE produced per hour per unit volume

[060] Exemplo Experimental 1 Construção de um plasmídeo recombinante[060] Experimental Example 1 Construction of a recombinant plasmid

Construção de pGS1-atoBConstruction of pGS1-atoB

[061] Em primeiro lugar, riscou-se E.colí W3110 em meio LB sólido, seguido de cultura aeróbica durante 24 horas. Cultivou-se uma colónia selecionada do meio sólido riscado em 3 ml de um meio de cultura líquido durante 18 horas, seguido de centrifugação da solução de cultura para se obter as células. As células foram lavadas com 10 ml de tampão Tris, seguido de purificação com o Conjunto de Purificação de ADN Genômico Wizard (fabricado pela Promega Corp., EUA) para isolar o cromossoma da estirpe.[061] First, E. coli W3110 was streaked onto solid LB medium, followed by aerobic culture for 24 hours. A selected colony from the streaked solid medium was grown in 3 ml of liquid culture medium for 18 hours, followed by centrifugation of the culture solution to obtain the cells. The cells were washed with 10 ml of Tris buffer, followed by purification with the Wizard Genomic DNA Purification Kit (manufactured by Promega Corp., USA) to isolate the strain chromosome.

[062] O gene atoB (SEQ ID NO: 1) foi amplificado com os iniciadores atoB-UP-Pstl (SEQ ID NO: 2) e atoB-DN-Xhol (SEQ ID NO: 3) e empregando o cromossoma isolado como um modelo (Quadro 1). 100 μl de mistura PCR inclui 250 μM de dNTP, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCI2, 10 μl de 10 x de tampão, 100 ng de modelo ADN e 1 unidade de pfu polimerase. Em PCR, a reação foi repetida 25 ciclos, que consistiam em desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, renaturação a 50 °C durante 1 minuto e depois polimerização a 72 °C durante 1 minuto.[062] The atoB gene (SEQ ID NO: 1) was amplified with primers atoB-UP-Pstl (SEQ ID NO: 2) and atoB-DN-Xhol (SEQ ID NO: 3) and using the isolated chromosome as a model (Chart 1). 100 µl of PCR mix includes 250 µM dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM MgCl2, 10 µl of 10x buffer, 100 ng of template DNA and 1 unit of pfu polymerase. In PCR, the reaction was repeated 25 cycles, which consisted of initial denaturation at 95°C for 5 minutes, followed by denaturation at 95°C for 1 minute, renaturation at 50°C for 1 minute, and then polymerization at 72°C for 1 minute. 1 minute.

[063] O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e depois digerido com enzimas de restrição Pstl e Xhol para clivar o fragmento de ADN. O vector pGS1-MCS (Fig. 3) foi digerido com as mesmas enzimas de restrição e o fragmento de ADN foi ligado para construir pGS1-atoB (Fig. 4). QUADRO 1

[063] The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and then digested with Pstl and Xhol restriction enzymes to cleave the DNA fragment. The pGS1-MCS vector (Fig. 3) was digested with the same restriction enzymes and the DNA fragment was ligated to construct pGS1-atoB (Fig. 4). TABLE 1

Construção de pGS1-HCBConstruction of pGS1-HCB

[064] Em primeiro lugar, riscou-se Clostridium acetobutylicum ATCC 824 em meio RCM sólido, seguido de cultura aeróbica durante 48 horas. Cultivou- se uma colónia selecionada do meio sólido riscado em 3 ml de um meio de cultura RCM líquido durante 18 horas, seguido de centrifugação da solução de cultura para se obter as células. As células foram lavadas com 10 ml de tampão Tris, seguido de purificação com o Conjunto de Purificação de ADN Genômico Wizard (fabricado pela Promega Corp., EUA) para isolar o cromossoma da estirpe.[064] First, Clostridium acetobutylicum ATCC 824 was streaked on solid RCM medium, followed by aerobic culture for 48 hours. A selected colony from the streaked solid medium was grown in 3 ml of liquid RCM culture medium for 18 hours, followed by centrifugation of the culture solution to obtain the cells. The cells were washed with 10 ml of Tris buffer, followed by purification with the Wizard Genomic DNA Purification Kit (manufactured by Promega Corp., USA) to isolate the strain chromosome.

[065] O operão hbd-crt-bcd (SEQ ID NO: 4, Fig. 5) de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi amplificado utilizando os iniciadores HCB-UP-Pstl (SEQ ID NO: 5) e HCB-DN-Xhol (SEQ ID NO: 6) (Quadro 2).[065] The hbd-crt-bcd operon (SEQ ID NO: 4, Fig. 5) of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 was amplified using primers HCB-UP-Pstl (SEQ ID NO: 5) and HCB-DN-Xhol ( SEQ ID NO: 6) (Table 2).

[066] 100 μl de mistura PCR inclui 250 μM de dNTP, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCI2, 10 μl de 10 x de tampão, 100 ng de modelo ADN e 5 unidades de pfu polimerase. Em PCR, a reação foi repetida 30 ciclos, que consistiam em desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, renaturação a 50 °C durante 1 minuto e depois polimerização a 72 °C durante 4 minutos.[066] 100 µl of PCR mix includes 250 µM of dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM of MgCl2, 10 µl of 10x buffer, 100 ng of template DNA and 5 units of pfu polymerase. In PCR, the reaction was repeated 30 cycles, which consisted of initial denaturation at 95 °C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 °C for 1 minute, renaturation at 50 °C for 1 minute, and then polymerization at 72 °C for 1 minute. 4 minutes.

[067] O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e digerido com as enzimas de restrição Pstl e Xhol para clivar o fragmento de ADN que foi depois ligado a um vector pGS1-MCS para construir pGS1-HCB (Fig. 6).QUADRO 2

[067] The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and digested with the restriction enzymes Pstl and Xhol to cleave the DNA fragment which was then ligated into a pGS1-MCS vector to construct pGS1-HCB (Fig. 6) .TABLE 2

Construção de pGS1-E1ABConstruction of pGS1-E1AB

[068] Riscou-se Clostridium acetobutylicum ATCC 824 em meio RCM sólido, seguido de cultura aeróbica durante 24 horas. Cultivou-se uma colónia selecionada do meio sólido riscado em 3 ml de um meio de cultura líquido durante 18 horas, seguido de centrifugação da solução de cultura para se obter as células. As células foram lavadas com 10 ml de tampão Tris, seguido de purificação com o Conjunto de Purificação de ADN Genômico Wizard (fabricado pela Promega Corp., EUA) para isolar o cromossoma da estirpe.[068] Clostridium acetobutylicum ATCC 824 was scratched in solid RCM medium, followed by aerobic culture for 24 hours. A selected colony from the streaked solid medium was grown in 3 ml of liquid culture medium for 18 hours, followed by centrifugation of the culture solution to obtain the cells. The cells were washed with 10 ml of Tris buffer, followed by purification with the Wizard Genomic DNA Purification Kit (manufactured by Promega Corp., USA) to isolate the strain chromosome.

[069] O gene adhE1 (SEQ ID NO: 7) foi amplificado com os iniciadores AdhE1-UP-Pstl (SEQ ID NO: 8) e AdhE1-DN-Xhol (SEQ ID NO: 9) e empregando o cromossoma isolado como um modelo (Quadro 3). 100 μl de mistura PCR inclui 250 μM de dNTP, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCl2, 10 μl de 10 x de tampão, 100 ng de modelo ADN e 1 unidade de pfu polimerase. Em PCR, a reação foi repetida 30 ciclos, que consistiam em desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, renaturação a 50 °C durante 1 minuto e depois polimerização a 72 °C durante 2 minuto. O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e digerido com as enzimas de restrição Pstl e Xhol para clivar o fragmento de ADN. O vector pGS1-MCS foi digerido com as mesmas enzimas de restrição e o fragmento de ADN foi ligado para construir pGS1- AdhE1 (Fig. 7). QUADRO 3

[069] The adhE1 gene (SEQ ID NO: 7) was amplified with primers AdhE1-UP-Pstl (SEQ ID NO: 8) and AdhE1-DN-Xhol (SEQ ID NO: 9) and using the isolated chromosome as a model (Chart 3). 100 µl of PCR mix includes 250 µM dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM MgCl2, 10 µl of 10x buffer, 100 ng of template DNA and 1 unit of pfu polymerase. In PCR, the reaction was repeated 30 cycles, which consisted of initial denaturation at 95 °C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 °C for 1 minute, renaturation at 50 °C for 1 minute, and then polymerization at 72 °C for 1 minute. 2 minute. The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and digested with PstI and XhoI restriction enzymes to cleave the DNA fragment. The pGS1-MCS vector was digested with the same restriction enzymes and the DNA fragment was ligated to construct pGS1-AdhE1 (Fig. 7). TABLE 3

[070] Foi construído pGS1-E1AB com plasmídeos recombinantes construídos previamente. Em primeiro lugar, o gene ctfAB (SEQ ID NO: 10) foi amplificado com os iniciadores CtfAB-UP-Xhol (SEQ ID NO: 11) e E1AB-DN- Sall (SEQ ID NO: 12) e empregando o cromossoma isolado de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 como um modelo (Quadro 4).[070] pGS1-E1AB was constructed with previously constructed recombinant plasmids. First, the ctfAB gene (SEQ ID NO: 10) was amplified with primers CtfAB-UP-Xhol (SEQ ID NO: 11) and E1AB-DN-Sall (SEQ ID NO: 12) and using the isolated chromosome from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 as a model (Table 4).

[071] O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e digerido com as enzimas de restrição Pstl e Xhol para clivar o fragmento de ADN. Um vector pGS1-AdhE1 foi digerido com as mesmas enzimas de restrição e o fragmento de ADN foi ligado para construir pGS1-E1AB (Fig. 8).QUADRO 4

[071] The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and digested with restriction enzymes Pstl and Xhol to cleave the DNA fragment. A pGS1-AdhE1 vector was digested with the same restriction enzymes and the DNA fragment was ligated to construct pGS1-E1AB (Fig. 8).TABLE 4

Construção de pGS1-E1 AB-atoBConstruction of pGS1-E1 AB-atoB

[072] O pGS1-E1AB-atoB foi construído com os plasmideos recombinantes previamente construídos pGS1-atoB e pGS1-E1AB.[072] The pGS1-E1AB-atoB was constructed with previously constructed recombinant plasmids pGS1-atoB and pGS1-E1AB.

[073] Em primeiro lugar, o gene atoB (SEQ ID NO: 1) e as regiões promotora e terminadora do plasmideo foram amplificadas utilizando iniciadores pThl-UP-Sall (SEQ ID NO: 13) e pGS-R4 (SEQ ID NO: 14) e empregando o pGS1-atoB construído como um modelo (Quadro 5). 100 μl de mistura PCR inclui 250 μM de dNTP, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCh, 10 μl de 10 x de tampão, 100 ng de modelo ADN e 1 unidade de pfu polimerase. Em PCR, a reação foi repetida 30 ciclos, que consistiam em desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, renaturação a 50 °C durante 1 minuto e depois polimerização a 72 °C durante 4 minutos.[073] First, the atoB gene (SEQ ID NO: 1) and the promoter and terminator regions of the plasmid were amplified using primers pThl-UP-Sall (SEQ ID NO: 13) and pGS-R4 (SEQ ID NO: 14) and using the constructed pGS1-atoB as a template (Table 5). 100 µl of PCR mix includes 250 µM dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM MgCh, 10 µl of 10x buffer, 100 ng of template DNA and 1 unit of pfu polymerase. In PCR, the reaction was repeated 30 cycles, which consisted of initial denaturation at 95 °C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 °C for 1 minute, renaturation at 50 °C for 1 minute, and then polymerization at 72 °C for 1 minute. 4 minutes.

[074] O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e foi digerido com enzimas de restrição Sail e Xmal para clivar um fragmento de ADN. O vector pGS1-E1AB foi digerido com as mesmas enzimas de restrição e o fragmento de ADN foi ligado para construir pGS1-E1AB-atoB (Fig. 9). QUADRO 5

[074] The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and was digested with restriction enzymes Sail and Xmal to cleave a DNA fragment. The pGS1-E1AB vector was digested with the same restriction enzymes and the DNA fragment was ligated to construct pGS1-E1AB-atoB (Fig. 9). TABLE 5

Construção de pGS1-E1AB-HCBConstruction of pGS1-E1AB-HCB

[075] O pGS1-E1AB-HCB foi construído com os plasmídeos recombinantes previamente construídos pGS1-HCB e pGS1-E1AB.[075] The pGS1-E1AB-HCB was constructed with the previously constructed recombinant plasmids pGS1-HCB and pGS1-E1AB.

[076] Um operão codificador do gene hbd-crt-bcd (SEQ ID NO: 4) e as regiões promotora e terminadora foram amplificadas utilizando iniciadores pThl- UP-Sall (SEQ ID NO: 13) e pGS-R4 (SEQ ID NO: 14) e utilizando o pGS1-HCB construído acima como modelo. 100 μl de mistura PCR inclui 250 μM de dNTP, 20 pmol de cada iniciador, 1,5 mM de MgCI2, 10 μl de 10 x de tampão, 100 ng de modelo ADN e 5 unidades de pfu polimerase. Em PCR, a reação foi repetida 30 ciclos, que consistiam em desnaturação inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de desnaturação a 95 °C durante 1 minuto, renaturação a 50 °C durante 1 minuto e depois polimerização a 72 °C durante 1 minuto.[076] An operon encoding the hbd-crt-bcd gene (SEQ ID NO: 4) and the promoter and terminator regions were amplified using primers pThl-UP-Sall (SEQ ID NO: 13) and pGS-R4 (SEQ ID NO : 14) and using the pGS1-HCB constructed above as a template. 100 µl of PCR mix includes 250 µM dNTP, 20 pmol of each primer, 1.5 mM MgCl2, 10 µl of 10x buffer, 100 ng of template DNA and 5 units of pfu polymerase. In PCR, the reaction was repeated 30 cycles, which consisted of initial denaturation at 95 °C for 5 minutes, followed by denaturation at 95 °C for 1 minute, renaturation at 50 °C for 1 minute, and then polymerization at 72 °C for 1 minute. 1 minute.

[077] O gene amplificado foi purificado em gel de agarose 1% e foi digerido com enzimas de restrição Sail e Xmal para clivar um fragmento de ADN. O vector pGS1-E1AB foi digerido com as mesmas enzimas de restrição, o fragmento de ADN foi ligado para construir pGS1-E1AB-HCB (Fig. 10).[077] The amplified gene was purified on a 1% agarose gel and was digested with restriction enzymes Sail and Xmal to cleave a DNA fragment. The pGS1-E1AB vector was digested with the same restriction enzymes, the DNA fragment was ligated to construct pGS1-E1AB-HCB (Fig. 10).

[078] Exemplo Experimental 2 Construção de micro-organismo recombinante[078] Experimental Example 2 Construction of recombinant microorganism

[079] Os plasmídeos recombinantes elaborados no Exemplo Experimental 1 foram introduzidos nas estirpes com gene eliminado discriminadas no quadro 6 para construir micro-organismos recombinantes.QUADRO 6

[079] The recombinant plasmids prepared in Experimental Example 1 were introduced into the gene-deleted strains listed in Table 6 to construct recombinant microorganisms.TABLE 6

[080] Cada estirpe Clostridium com gene eliminado foi cultivada em 60 ml de líquido CGM {Clostridium Growth Media - Meio de Crescimento Clostridium) (0,75 g/L de K2HPO4, 0,75 g/L de KH2PO4, 0,7 g/L, de MgSO4-7H2O, 0,017 g/L de MnSO4-5H2O, 0,01 g/L de FeSO4 -7H2O, 2 g/L de (NH4) 2SO4, 1 g/L de NaCI, 2 g/L de asparagina, 0,004 g/L de ácido p-aminobenzóico, 5 g/L de extrato de levedura, 4,08 g/L de CH3COONa-3H2O e 80 g/L de glicose) em condições anaeróbicas até o QD600 chegar a 0,5. A solução de cultura foi mantida em gelo durante 10 minutos, seguido de centrifugação da solução de cultura a 7000 g a 4 °C durante 10 minutos. Os aglomerados de células foram lavados com uma solução tampão de eletroporação por três vezes e suspensos em 2 ml da mesma solução tampão para produzir células para transformação. Adicionaram-se 0,5~2,0 μg de plasmídeos a 500 μl das células preparadas para transformação, para executar a eletroporação (cuvete de 4 mm, 2,5kV, °°Q, 25 uF) em Gene Pulser II, produzido pela Bio-Rad Corporation. Em seguida, as células foram cultivadas em condições anaeróbicas, em um meio com antibióticos para obter as estirpes transformadas (Quadro 7).[080] Each gene-deleted Clostridium strain was grown in 60 ml of CGM liquid (Clostridium Growth Media) (0.75 g/L K2HPO4, 0.75 g/L KH2PO4, 0.7 g /L of MgSO4-7H2O, 0.017 g/L of MnSO4-5H2O, 0.01 g/L of FeSO4 -7H2O, 2 g/L of (NH4)2SO4, 1 g/L of NaCl, 2 g/L of asparagine, 0.004 g/L of p-aminobenzoic acid, 5 g/L of yeast extract, 4.08 g/L of CH3COONa-3H2O and 80 g/L of glucose) under anaerobic conditions until the QD600 reaches 0.5 . The culture solution was kept on ice for 10 minutes, followed by centrifugation of the culture solution at 7000g at 4°C for 10 minutes. Cell pellets were washed with an electroporation buffer solution three times and suspended in 2 ml of the same buffer solution to produce cells for transformation. 0.5~2.0 μg of plasmids were added to 500 μl of cells prepared for transformation, to perform electroporation (4 mm cuvette, 2.5kV, °°Q, 25 uF) in Gene Pulser II, produced by Bio-Rad Corporation. Then, the cells were cultivated under anaerobic conditions, in a medium with antibiotics to obtain the transformed strains (Table 7).

[081] Os plasmídeos utilizados para a transformação foram todos metilados em estirpe E.coli TOP10 transformada com um vector pAN1 antes da eletroporação, de forma que os plasmídeos não puderam ser afetados pelo sistema de restrição das estirpes Clostridium.QUADRO 7

[081] The plasmids used for transformation were all methylated in E.coli strain TOP10 transformed with a pAN1 vector before electroporation, so that the plasmids could not be affected by the restriction system of Clostridium strains.TABLE 7

[082] MLSr, resistência a macrólidos lincosamida si[082] MLSr, resistance to macrolides lincosamide si

[083] Exemplo Experimental 3 Produção de reptogramina B biobutanol por cultura descontínua[083] Experimental Example 3 Production of reptogramin B biobutanol by batch culture

[084] Testou-se a capacidade de produção de butanol dependente dos micro-organismos recombinantes ao longo da cultura descontínua. As estirpes de Clostridium (n° 1 e n° 18), construídas no Exemplo Experimental 2 foram riscadas em meio CGM sólido, seguido de cultura anaeróbica a 37 °C de um dia para outro. Cada uma das colónias cultivadas foi inoculada em um tubo descartável de 50 ml (fabricado pela Falcon, EUA), contendo 40 ml de CCM, seguido de repouso a 37 °C e depois de cultura anaeróbica até OD600 se tornar 1. Os micro-organismos cultivados foram inoculados novamente em um meio CGM liquido contendo 400 ml de glicose a 6%, seguido de repouso a 37 °C e depois de cultura anaeróbica até o OD600 se tornar 1. Os micro- organismos resultantes foram inoculados em um fermentador contendo 1,6 L de meio CGM líquido, ao qual se adicionou glicose a 8%, iniciando-se assim a cultura. O pH foi mantido a 5,90 com hidróxido de amónio (NH4OH) durante a cultura anaeróbica, tendo-se mantido as condições anaeróbicas através da purga de azoto a uma velocidade de 20 ml/min. A concentração do butanol produzido e de solvente misturado foi analisada a cada três horas após a cultura. A análise do butanol e solvente misturado foi executada por cromatografia gasosa (Agilent, EUA). As condições de análise encontram-se resumidas no quadro 8. A solução de cultura foi centrifugada para produzir um sobrenadante, o qual foi depois submetido a uma HPLC e a um analisador de açúcares para determinar a concentração de açúcares e ácidos orgânicos. Em HPLC, foi utilizada água contendo ácido sulfúrico a 0,01 N como fase móvel e um caudal de 0,6 ml/min. Foram empregues as colunas Aminex87H e Aminex87P (Bio-Rad, EUA). Os açúcares e ácidos orgânicos foram analisados com um detector do IR (índice refletivo). Como grupo de controle foi utilizado C. acetobutylicum ATCC 824 de tipo selvagem (C1).QUADRO 8

[084] The ability to produce butanol dependent on recombinant microorganisms was tested throughout batch culture. Clostridium strains (#1 and #18) constructed in Experimental Example 2 were streaked onto solid CGM medium, followed by anaerobic culture at 37°C overnight. Each of the cultivated colonies was inoculated into a 50 ml disposable tube (manufactured by Falcon, USA) containing 40 ml of CCM, followed by standing at 37 °C and then anaerobic culture until the OD600 became 1. Cultured organisms were re-inoculated in a liquid CGM medium containing 400 ml of 6% glucose, followed by standing at 37 °C and then anaerobic culture until the OD600 became 1. The resulting microorganisms were inoculated in a fermenter containing 1, 6 L of liquid CGM medium, to which 8% glucose was added, thus initiating the culture. The pH was maintained at 5.90 with ammonium hydroxide (NH 4 OH) during the anaerobic culture, maintaining anaerobic conditions by purging nitrogen at a rate of 20 ml/min. The concentration of produced butanol and mixed solvent was analyzed every three hours after culture. Analysis of butanol and mixed solvent was performed by gas chromatography (Agilent, USA). The conditions of analysis are summarized in Table 8. The culture solution was centrifuged to produce a supernatant, which was then subjected to HPLC and a sugar analyzer to determine the concentration of sugars and organic acids. In HPLC, water containing 0.01 N sulfuric acid was used as mobile phase and a flow rate of 0.6 ml/min. Aminex87H and Aminex87P columns (Bio-Rad, USA) were employed. Sugars and organic acids were analyzed with an IR (reflective index) detector. As a control group, wild-type C. acetobutylicum ATCC 824 (C1) was used.TABLE 8

[085] Por comparação das estirpes n°1~n°3, confirmou-se que a seletividade do etanol foi consideravelmente reduzida de 17% para 7% quando o operão HCB e o gene atoB foram sobre-expressos na estirpe PJC4BK com gene buk eliminado. Dado que o etanol é tóxico para micro-organismos, é muito importante manter a concentração de etanol baixa quando o butanol é produzido através de fermentação contínua. No entanto, no caso das estirpes n° 2 e n° 3, embora a seletividade do etanol seja menor, existem problemas com o baixo nível de produtividade e rendimento do butanol.[085] By comparing strains n°1~n°3, it was confirmed that ethanol selectivity was considerably reduced from 17% to 7% when the HCB operon and atoB gene were overexpressed in the PJC4BK strain with buk gene deleted. Since ethanol is toxic to microorganisms, it is very important to keep the ethanol concentration low when butanol is produced through continuous fermentation. However, in the case of strains n° 2 and n° 3, although the ethanol selectivity is lower, there are problems with the low level of productivity and yield of butanol.

[086] Por outro lado, a comparação da estirpe n° 1 com a estirpe n° 4 confirmou que a produtividade do butanol foi aumentada quando adhE1 e ctfAB foram sobre-expressos em simultâneo na estirpe PJC4BK. Assim, os autores da presente invenção procuraram incrementar a produtividade do butanol e manter baixa a seletividade do etanol através da sobre-expressão do gene atoB ou do operão HCB na estirpe n° 4. Assim, a comparação das estirpes n° 2 e n° 3 com as estirpes n° 5 e n° 6, respectivamente, confirmou que a produtividade do butanol foi aumentada em 41% e 17%, respectivamente. No entanto, no caso das estirpes n° 5 e n° 6, confirmou-se que a seletividade do etanol aumentou ligeiramente de 7% para 16% e 13%, respectivamente.[086] On the other hand, comparison of strain #1 with strain #4 confirmed that butanol productivity was increased when adhE1 and ctfAB were simultaneously overexpressed in strain PJC4BK. Thus, the authors of the present invention sought to increase butanol productivity and maintain low ethanol selectivity through overexpression of the atoB gene or the HCB operon in strain No. 4. Thus, the comparison of strains No. 2 and No. 3 with strains n° 5 and n° 6, respectively, confirmed that the productivity of butanol was increased by 41% and 17%, respectively. However, in the case of strains n° 5 and n° 6, it was confirmed that the ethanol selectivity increased slightly from 7% to 16% and 13%, respectively.

[087] Pelo contrário, estirpes com gene pta eliminado (n°7~n° 12) exibiam geralmente um baixo rendimento e especificamente uma baixa seletividade de etanol. A partir deste resultado ficou determinado que a eliminação do gene pta diminuiu a seletividade do etanol. Assim, os autores da presente invenção estimaram que uma eliminação adicional do gene pta nas estirpes n°5 e n° 6 reduziria a seletividade do etanol, mantendo elevada a produtividade do butanol. Com base nesta estimativa, foi medido o desempenho das estirpes n° 17 e n° 18. No caso da estirpe n° 17, confirmoui.se que a seletividade do etanol diminuiu 50% e a produtividade, seletividade e rendimento ABE do butanol aumentou em 7%, 21% e 15% respectivamente, em comparação com a estirpe n° 5. Por outro lado, no caso da estirpe n° 18, confirmou.se que a seletividade do etanol diminuiu em 7%, a seletividade do butanol também diminuiu em cerca de 4% e a produtividade do butanol e rendimento aumentaram em 11%, 10% respectivamente, em comparação com a estirpe n° 6.[087] In contrast, pta gene-deleted strains (#7~#12) generally exhibited low yield and specifically low ethanol selectivity. From this result it was determined that deletion of the pta gene decreased ethanol selectivity. Thus, the authors of the present invention estimated that an additional deletion of the pta gene in strains n°5 and n°6 would reduce the selectivity of ethanol, keeping the productivity of butanol high. Based on this estimate, the performance of strains n° 17 and n° 18 was measured. In the case of strain n° 17, it was confirmed that the selectivity of ethanol decreased by 50% and the productivity, selectivity and ABE yield of butanol increased by 7 %, 21% and 15% respectively, compared to strain n° 5. On the other hand, in the case of strain n° 18, it was confirmed that the ethanol selectivity decreased by 7%, the butanol selectivity also decreased by about 4% and butanol productivity and yield increased by 11%, 10% respectively compared to strain #6.

[088] Em resumo, foi possível confirmar que a produtividade e rendimento de butanol tiveram tendência para aumentar quando adhE e ctfAB foram simultaneamente sobre-expressos em uma estirpe em que foi eliminada a produção de pta e buk relacionada com a produção de ácidos orgânicos. Além disso, foi possível confirmar que, quando atoB ou o operão HCB foram ainda mais sobre-expressos, a seletividade do etanol diminuiu, enquanto a seletividade do butanol aumentou (Quadro 9).QUADRO 9

[088] In summary, it was possible to confirm that the productivity and yield of butanol tended to increase when adhE and ctfAB were simultaneously overexpressed in a strain in which the production of pta and buk related to the production of organic acids was eliminated. Furthermore, it was possible to confirm that when atoB or the HCB operon were further overexpressed, ethanol selectivity decreased, while butanol selectivity increased (Table 9).TABLE 9

[089] Exemplo Experimental 4 Produção de biobutanol por cultura semi- descontínua[089] Experimental Example 4 Production of biobutanol by semi-batch culture

[090] As estirpes recombinantes n° 6, n° 16~n°18 que foram determinadas como tendo excelente seletividade de butanol, produtividade de butanol e rendimento e baixa seletividade de etanol no Exemplo Experimental 3 foram sujeitas a cultura semi-descontínua em um meio de cultura contendo um adsorvente capaz de adsorver seletivamente o butanol.[090] Recombinant strains No. 6, No. 16~No. 18 that were determined to have excellent butanol selectivity, butanol productivity and yield, and low ethanol selectivity in Experimental Example 3 were subjected to fed-batch culture in a culture medium containing an adsorbent capable of selectively adsorbing butanol.

[091] Em primeiro lugar, as estirpes de Clostridium (n° 16 e n° 18), construídas no Exemplo Experimental 2 foram riscadas em meio CGM sólido, seguido de cultura anaeróbica a 37 °C de um dia para outro. Cada uma das colónias cultivadas foi inoculada em um tubo descartável de 50 ml (fabricado pela Falcon, EUA), contendo 40 ml de CCM, seguido de repouso a 37 °C e depois de cultura anaeróbica da colónia até OD600 se tornar 1. O microorganismo cultivado foi novamente inoculado em meio CGM líquido contendo 400 ml de glicose a 6%, seguido de repouso a 37 °C e depois de cultura anaeróbica da colónia até o OD600 se tornar 1. O micro-organismo obtido foi inoculado em um fermentador contendo 1,6 L de CGM líquido, contendo glicose a 8% e 200 g de um adsorvente capaz de adsorver seletivamente butanol e depois foi cultivado. O pH foi mantido a 5,0 com hidróxido de amónio (NH4OH) durante a cultura anaeróbica, em que as condições anaeróbicas foram mantidas por meio de purga do azoto a uma velocidade de 20 ml/min. A concentração do butanol produzido e de solvente misturado foi analisada a cada três horas após a cultura. A fim de manter a concentração de glicose na solução de cultura a10 g/L ou mais, foi utilizada uma solução de 700 g/L de glicose como solução de alimentação.[091] First, Clostridium strains (No. 16 and No. 18) constructed in Experimental Example 2 were streaked onto solid CGM medium, followed by anaerobic culture at 37 °C overnight. Each of the cultivated colonies was inoculated into a 50 ml disposable tube (manufactured by Falcon, USA) containing 40 ml of CCM, followed by standing at 37°C and then anaerobic culture of the colony until the OD600 became 1. The microorganism cultured was again inoculated in liquid CGM medium containing 400 ml of 6% glucose, followed by resting at 37 °C and then anaerobic culture of the colony until the OD600 became 1. The microorganism obtained was inoculated in a fermenter containing 1 .6 L of liquid CGM, containing 8% glucose and 200 g of an adsorbent capable of selectively adsorbing butanol, was then cultured. The pH was maintained at 5.0 with ammonium hydroxide (NH 4 OH) during the anaerobic culture, where anaerobic conditions were maintained by means of a nitrogen purge at a rate of 20 ml/min. The concentration of produced butanol and mixed solvent was analyzed every three hours after culture. In order to keep the glucose concentration in the culture solution at 10 g/L or more, a 700 g/L glucose solution was used as the feed solution.

[092] A fim de produzir butanol através de cultura contínua com elevado rendimento, elevada produtividade e elevada seletividade, é muito importante manter baixa a concentração de etanol de forma que 0 etanol não cause toxicidade às estirpes durante o período de cultura. Como se pode ver dos resultados da cultura semi-contínua, confirmou-se que as estirpes n° 17 e n° 18 mantinham uma seletividade de etanol muito baixa, conservando o elevado rendimento como estirpes produtoras de butanol. Assim, previa-se que estas estirpes fossem adequadas para cultura contínua a longo prazo (quadro 10). QUADRO 10

[092] In order to produce butanol through continuous culture with high yield, high productivity and high selectivity, it is very important to keep the ethanol concentration low so that ethanol does not cause toxicity to the strains during the culture period. As can be seen from the semi-continuous culture results, strains #17 and #18 were confirmed to maintain very low ethanol selectivity, retaining the high yield as butanol producing strains. Thus, these strains were expected to be suitable for long-term continuous culture (Table 10). TABLE 10

[093] Exemplo Experimental 5 Produção de biobutanol pelo método de cultura descontínua[093] Experimental Example 5 Production of biobutanol by the batch culture method

[094] Com base nos resultados do Exemplo Experimental 4, as estirpes recombinantes n° 16, n° 17 e n° 18 foram testadas quanto ao desempenho das estirpes produtoras de butanol através de cultura contínua. Em primeiro lugar foi elaborada uma incubadora para o processo de cultura contínua de acordo com o pedido de patente coreana n°. 10-2012-0038770. Nas extremidades superior e inferior de uma coluna de 3 L foi colocado um filtro com aproximadamente 150 μm de tamanho a fim de prevenir um adsorvente da eluição, seguido da instalação de um agitador e carregamento de 200 g de um adsorvente. Foram preparadas duas colunas. Estas incubadoras foram ligadas por um tubo de silicone, e foram acrescentadas bombas, permitindo assim a circulação de uma solução de cultura entre as colunas. Na admissão e descarga das colunas foram instaladas válvulas de 4 vias de forma que, ao longo da cultura, as colunas possam ser submetidas a dessorção em tempo real mediante passagem de um solvente para eluição quando o adsorvente nas colunas fica saturado com butanol e solvente misto. No caso da primeira coluna ser sujeita a dessorção, a solução de cultura foi feita circular para a segunda coluna de forma que a solução de cultura flua continuamente. A solução de cultura foi feita circular da parte superior para a parte inferior da coluna, mas a direção não é particularmente limitada. Cultivaram-se a estirpe n° 16 (grupo de controle), n° 17 e n° 18 com produtividade de butanol e solvente misturado na incubadora elaborada acima. Em primeiro lugar, inocularam-se 800 ml de micro-organismos que foram cultivados de forma anaeróbica em CGM líquido de um dia para outro em uma incubadora compreendendo 3,2 L de CGM líquido para iniciar a cultura. No presente Exemplo Experimental o microorganismo foi cultivado por fermentação descontínua geral. Depois de iniciar a cultura, a solução de cultura foi feita circular através de colunas com um caudal de 50 ml/min, através de uma bomba, quando a concentração de butanol atingiu 7 g/L~8 g/L. À medida que a solução de cultura passava através das colunas, o adsorvente foi suspenso na solução de cultura para formar uma fase pastosa, que impediu a solução de cultura de formar flocos, passando assim através das colunas. A concentração de butanol foi mantida a 8 g/L ou menos imediatamente antes e depois da passagem da solução de cultura através das colunas.[094] Based on the results of Experimental Example 4, recombinant strains No. 16, No. 17 and No. 18 were tested for the performance of butanol-producing strains through continuous culture. Firstly, an incubator for the continuous culture process was designed according to Korean patent application no. 10-2012-0038770. At the upper and lower ends of a 3 L column a filter approximately 150 µm in size was placed in order to prevent an adsorbent from eluting, followed by the installation of a stirrer and loading of 200 g of an adsorbent. Two columns were prepared. These incubators were connected by a silicone tube, and pumps were added, thus allowing the circulation of a culture solution between the columns. 4-way valves were installed on the inlet and outlet of the columns so that, throughout the culture, the columns can be subjected to desorption in real time by passing a solvent for elution when the adsorbent in the columns becomes saturated with butanol and mixed solvent . In case the first column was subjected to desorption, the culture solution was circulated to the second column so that the culture solution flowed continuously. The culture solution was circulated from the top to the bottom of the column, but the direction is not particularly limited. Strain No. 16 (control group), No. 17 and No. 18 were grown with butanol productivity and mixed solvent in the incubator set up above. First, 800 ml of microorganisms were inoculated and grown anaerobically in liquid CGM overnight in an incubator comprising 3.2 L of liquid CGM to start the culture. In the present Experimental Example the microorganism was cultured by general batch fermentation. After starting the culture, the culture solution was circulated through the columns at a flow rate of 50 ml/min via a pump when the butanol concentration reached 7 g/L~8 g/L. As the culture solution passed through the columns, the adsorbent was suspended in the culture solution to form a slurry phase, which prevented the culture solution from flaking, thus passing through the columns. The butanol concentration was maintained at 8 g/L or less immediately before and after passing the culture solution through the columns.

[095] Em resultado, foi possível confirmar que o rendimento, seletividade e produtividade se encontravam a níveis excelentes, constatou-se um aumento particularmente notável em vista da estabilidade do processo (período de cultura) quando o operão hcb ou a tiolase codificadora de atoB foram sobre- expressos. No entanto, no caso da estirpe recombinante n° 16, na qual o operão HCB e a tiolase não foram sobre-expressas, à medida que o período de cultura foi aumentando o etanol acumulou em uma elevada concentração, a qual deteriorou consideravelmente o desempenho da estirpe, em particular tendo em vista o butanol e produtividade do solvente misturado. Assim, foi impossível cultivar o micro-organismo durante mais de 88 horas.[095] As a result, it was possible to confirm that the yield, selectivity and productivity were at excellent levels, a particularly notable increase was observed in view of the stability of the process (culture period) when the hcb operon or the atoB-encoding thiolase were overexpressed. However, in the case of recombinant strain n° 16, in which the HCB operon and thiolase were not overexpressed, as the culture period increased, ethanol accumulated in a high concentration, which considerably deteriorated the performance of the strain, in particular in view of butanol and productivity of the mixed solvent. Thus, it was impossible to cultivate the microorganism for more than 88 hours.

[096] A comparação da quantidade cumulativa produzida de butanol e o total de solvente misturado para as três estirpes n° 16, n° 17 e n° 18 confirmou que a estirpe n° 16, na qual o operão HCB ou tiolasa não se encontravam sobre-expressos, revelou uma elevada seletividade do etanol de 4, diminuindo assim consideravelmente a produtividade do solvente e seletividade do butanol devido à toxicidade da estirpe. Pelo contrário, no caso das estirpes n° 17 e n° 18, nas quais o operão hcb ou atoB foram sobre-expressos respectivamente, confirmou-se que o butanol e solventes foram produzidos com estabilidade, mantendo sempre a produtividade do solvente durante mais de 100 horas de cultura (quadro 11). Quer dizer que a estabilidade do processo melhorou durante a cultura contínua, melhorando consideravelmente a utilidade e custos operacionais.QUADRO 11

[096] Comparison of the cumulative amount of butanol produced and the total solvent mixed for the three strains No. 16, No. 17 and No. 18 confirmed that strain No. 16, in which the HCB or thiolase operon was not found on -expressed, revealed a high ethanol selectivity of 4, thus considerably decreasing solvent productivity and butanol selectivity due to strain toxicity. On the contrary, in the case of strains n° 17 and n° 18, in which the hcb or atoB operon were overexpressed respectively, it was confirmed that butanol and solvents were produced with stability, always maintaining the solvent productivity for more than 100 hours of culture (Table 11). This means that process stability has improved during continuous culture, considerably improving utility and operating costs.TABLE 11

Aplicabi idade IndustrialIndustrial Applicability

[097] A presente invenção refere-se a um micro-organismo recombinante com capacidade de produção melhorada de butanolque possui uma via de biossíntese de acetil-CoA e uma via de biossíntese de butiril-CoA, em que uma via que converte acetil-CoA em acetato é inibida e uma via que converte acetil- CoaA em butiril-CoA é promovida. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de produção de butanol utilizando micro-organismo recombinante.[097] The present invention relates to a recombinant microorganism with improved butanol production capacity that has an acetyl-CoA biosynthesis pathway and a butyryl-CoA biosynthesis pathway, in which a pathway that converts acetyl-CoA in acetate is inhibited and a pathway that converts acetyl-CoaA to butyryl-CoA is promoted. Furthermore, the present invention relates to a method of producing butanol using a recombinant microorganism.

Claims

1. Microrganismo recombinante, caracterizado por ter uma capacidade de produção de butanol aperfeiçoada e uma capacidade de produção de etanol reduzida em comparação a um microrganismo tipo selvagem em que o microrganismo é Clostridium acetobutyli-cum, em que uma via de conversão de acetil-CoA em acetato é inibida, uma via de conversão de acetil-CoA em butiril-CoA é promovida, e uma via de conversão de butiril-CoA em butirato é inibida, em que a via de conversão de acetil-CoA em acetato é uma via na qual acetil-CoA é convertido em acetato por acetato quinase codificado pelo gene ack ou fosfotransacetilase codificado pelo gene pta, em que a via de conversão de acetil-CoA em butiril-CoA é uma via na qual acetil-CoA é convertido em butitil-CoA por tiolase codificado pelo gene atoB ou operão hbd-crt-bcd, e em que a via de conversão de butiril-CoA em butirato é a via na qual butiril-CoA é convertido em butirato por butirato quinase codificado pelo gene buk.1. Recombinant microorganism, characterized by having an improved butanol production capacity and a reduced ethanol production capacity compared to a wild-type microorganism in which the microorganism is Clostridium acetobutylic-cum, in which an acetyl-CoA conversion pathway to acetate is inhibited, a pathway converting acetyl-CoA to butyryl-CoA is promoted, and a pathway converting butyryl-CoA to butyrate is inhibited, wherein the pathway converting acetyl-CoA to acetate is a pathway in in which acetyl-CoA is converted to acetate by acetate kinase encoded by the ack gene or phosphotransacetylase encoded by the pta gene, wherein the acetyl-CoA to butyryl-CoA conversion pathway is a pathway in which acetyl-CoA is converted to butyl-CoA by thiolase encoded by the atoB gene or hbd-crt-bcd operon, and wherein the pathway of conversion of butyryl-CoA to butyrate is the pathway in which butyryl-CoA is converted to butyrate by butyrate kinase encoded by the buk gene.

2. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a capacidade de produção de butanol ser melhorada em comparação ao microrganismo tipo selvagem.2. Recombinant microorganism according to claim 1, characterized in that the butanol production capacity is improved compared to the wild-type microorganism.

3. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a via de conversão de acetil-CoA em acetato ser inibida através da inibição da fosfotransacetilase.3. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that the pathway of conversion of acetyl-CoA to acetate is inhibited through the inhibition of phosphotransacetylase.

4. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser promovida uma via de conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA aumentando-se a expressão de tiolase ou uma via de conversão acetoacetil-CoA em butiril-CoA ser promovida aumentando-se a expressão de operão hbd-crt-bcd.4. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that a pathway for the conversion of acetyl-CoA to acetoacetyl-CoA is promoted by increasing thiolase expression or a pathway for the conversion of acetoacetyl-CoA to butyryl-CoA is promoted by increasing up the hbd-crt-bcd operon expression.

5. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser promovida a via de conversão de acetil-CoA em butitril-CoA através do aumento da expressão de tiolase ou do operão hbd-crt-bcd.5. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that the pathway for converting acetyl-CoA into butytril-CoA is promoted through increased expression of thiolase or the hbd-crt-bcd operon.

6. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser inibida uma via de conversão de butiril-CoA em butirato inibindo-se butirato quinase.6. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that a pathway of conversion of butyryl-CoA into butyrate is inhibited by inhibiting butyrate kinase.

7. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma via de conversão de acetato em acetil-CoA ou uma via de conversão de butirato em butiril-CoA ser promovida aumentando-se a expressão de CoA transferase codificado pelo gene ctfAB.7. Recombinant microorganism according to claim 1, characterized in that a pathway for converting acetate into acetyl-CoA or a pathway for converting butyrate into butyryl-CoA is promoted by increasing the expression of CoA transferase encoded by the ctfAB gene.

8. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser promovida uma via de conversão de butiril-CoA em butanol aumentando-se a expressão de aldeído/álcool desidrogenase codificado pelo gene adhE.8. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that a pathway of conversion of butyryl-CoA into butanol is promoted by increasing the expression of aldehyde/alcohol dehydrogenase encoded by the adhE gene.

9. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pta, que é um gene codificador da fosfotransacetilase, ser eliminado ou inibido, e pela introdução ou promoção de pelo menos um dos mecanismos selecionados de entre o gene atoB que codifica a tiolase e o operão hbd-crt-bcd.9. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that the pta, which is a phosphotransacetylase coding gene, is eliminated or inhibited, and by the introduction or promotion of at least one of the mechanisms selected from among the atoB gene that encodes the thiolase and the hbd-crt-bcd operon.

10. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a seletividade ao etanol ser igual ou menor que 15% e a seletividade ao butanol ser igual ou superior a 70% em uma base de cultura descontínua.10. Recombinant microorganism according to claim 1, characterized in that the selectivity to ethanol is equal to or less than 15% and the selectivity to butanol is equal to or greater than 70% in a batch culture basis.

11. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a produtividade de butanol ser igual ou superior a 1,0 g/L em uma base de cultura descontínua.11. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that the productivity of butanol is equal to or greater than 1.0 g/L in a batch culture basis.

12. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o rendimento ser igual ou superior a 28%.12. Recombinant microorganism, according to claim 1, characterized in that the yield is equal to or greater than 28%.

13. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a seletividade de etanol ser igual ou menor que 15% em uma base de cultura semicontínua.13. Recombinant microorganism according to claim 1, characterized in that the ethanol selectivity is equal to or less than 15% on a semi-continuous culture basis.

14. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a seletividade ao etanol ser igual ou menor que 20% em uma base de cultura contínua.14. Recombinant microorganism according to claim 1, characterized in that the selectivity to ethanol is equal to or less than 20% on a continuous culture basis.

15. Método de produção de butanol, caracterizado por compreender: cultura do microrganismo recombinante conforme definido na reivindicação 1; e recuperação do butanol a partir da solução de cultura.15. Butanol production method, characterized in that it comprises: culture of the recombinant microorganism as defined in claim 1; and recovering the butanol from the culture solution.

16. Método de produção de butanol caracterizado por compreender: cultura do microrganismo recombinante conforme definido na reivindicação 2; e recuperação do butanol a partir da solução de cultura.16. Butanol production method characterized by comprising: culturing the recombinant microorganism as defined in claim 2; and recovering the butanol from the culture solution.