BR112015007678B1

BR112015007678B1 - Sequência de ácido nucleico de dna complementar isolada, molécula de dna recombinante, vetor, célula hospedeira, uso dos anteriores, e vacina contra infecção por cooperia oncophora

Info

Publication number: BR112015007678B1
Application number: BR112015007678-5A
Authority: BR
Inventors: Peter Geldhof; Jimmy Borloo; Edwin Claerebout; Jozef Vercruysse
Original assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2022-12-13
Also published as: US10105424B2; ES2717441T3; EP2906588B1; AR092939A1; CA2886450C; BR112015007678A2; US20150265687A1; US10946077B2; WO2014056885A1; EP2906588A1; US20180369349A1; CA2886450A1

Abstract

VACINA PARA COOPERIA A presente invenção refere-se a sequências de nucleotídeo codificando antígenos para Cooperia, bem como a moléculas de DNA recombinante contendo tais sequências de nucleotídeo e células expressando essas sequências de nucleotídeo. A invenção refere-se ainda a proteínas de Cooperia, a métodos para produção das proteínas, sequências de nucleotídeos, moléculas de DNA recombinante e hospedeiros. Ainda, a invenção refere-se a vacinas que induzem imunidade protetora contra infecção por nematoides parasíticos tais como espécies do gênero Cooperia e a métodos para preparação de tal vacina.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a sequências de nucleotídeo codificando antígenos de Cooperia, bem como a moléculas de DNA recombinante contendo tais sequências de nucleotídeo e células hospedeiro expressando essas sequências de nucleotídeo. A invenção refere-se ainda a proteínas de Cooperia, a métodos para produção das proteínas, sequências de nucleotídeo, moléculas de DNA recombinante e hospedeiros.

[002] Ainda, a invenção refere-se a vacinas que induzem imunidade protetora contra infecção por nematoides parasíticos tal como espécie do gênero Cooperia e a métodos para preparação de tal vacina.

Antecedentes da Invenção

[003] Nematoides, que são vermes redondos não segmentados com corpos alongados, fusiformes ou em formato de saco cobertos com cutícula, são virtualmente ubíquos em natureza, habitando o solo, água e plantas e estão envolvidos de maneira importante em uma ampla faixa de doenças parasíticas de animais e plantas. Infecções com nematoides gastrintestinais são uma grande restrição no bem- estar e produção de ruminantes (gado, ovelha, cabras, etc.) em todo o mundo. Infecções com esses parasitas pode levar à doença severa (diarreia ou anemia são sintomas típicos). Dentre os efeitos economicamente importantes na pecuária são redução em produção de leite, carne e lã, ganho de peso e morte ocasional.

[004] Parasitas tricostrongilídeos importantes em gado (bovino) são Cooperia oncophora, C. punctata, C. pectinata, C. curticei e Ostertagia ostertagi. Em ruminantes pequenos, por exemplo, ovelha e cabras, infecções com Haemonchus contortus e Teladorsagia circumcincta são as mais importantes. Embora sendo considerado um patógeno brando, o helminto Cooperia oncophora é um dos nematoides parasíticos intestinais mais comuns em gado em regiões de clima temperado em todo o mundo (1) e desta maneira carrega uma pegada econômica substancial uma vez que ele tem uma grande participação em perdas de produção (2, 3). Um estudo recente demonstrou que infecções por helmintos aumentaram os custos de produção de carne nos Estados Unidos em quase $190 por cabeça de acordo com os preços de mercado em 2005 (4). Análogo ao uso de antibióticos em humanos, anti-helmínticos têm sido há muito tempo o método de escolha para tratar e prevenir infecções por parasita de uma maneira razoavelmente eficiente e de baixo custo. Para uso em gado, três classes principais de anti-helmínticos estão atualmente disponíveis, isto é, imidazotiazóis, benzimidazóis e lactonas macrocíclicas, as últimas sendo as mais frequentemente usadas em tratamentos de Cooperia oncophora. No entanto, o declínio deste mérito tem gradualmente ficado aparente durante a última década uma vez que vários relatos de desenvolvimento de resistência a anti- helmíntico surgiram em todo o mundo (5-9). Ainda, há uma preocupação com relação a resíduos de fármaco na carne e no ambiente. Meios mais eficazes de controle de infecções helmínticas são então extremamente necessários, um dos quais pode envolver o desenvolvimento e a administração de vacinas profiláticas.

[005] Uma vez que as questões que cercam resistência a anti- helmínticos são observadas para um grande número de helmintos, vários grupos de pesquisa investiram no desenvolvimento de vacinas recombinantes para, por exemplo, espécies Ancylostoma caninum (10), Onchorcerca volvulus (11-14), Ascaris suum (15-17), Haemonchus contortus (18, 19), Necator americanus (20) e várias Taenia (21-23), Echinococcus (21, 22), Fasciola (24) e Schistosoma (25-230). No entanto, a eficácia dessas vacinas, medida como redução de contagens de ovos e/ou carga de verme (revisto em (59)), foi verificada variar drasticamente e então não previsível.

[006] Atualmente, nenhuma vacina para Cooperia oncophora existe. Vários grupos de pesquisa focaram nas proteínas de baixo peso molecular (12-16 kDa) como potenciais candidatos à vacina, no entanto, sem sucesso (60-61; WO98/01550).

Sumário da Invenção

[007] Um objetivo da presente invenção é prover vacinas para combate de infecções por nematoide gastrointestinal em gado e infecções por Cooperia mais específicas em gado (bovino).

[008] Outro objetivo da presente invenção é prover polinucleotídeos e proteínas (ou polipeptídeos) úteis para a preparação de tais vacinas.

[009] Um aspecto da invenção refere-se a uma proteína de Cooperia oncophora isolada ou um fragmento imunogênico da dita proteína, caracterizado pelo fato da dita proteína compreender ou consistir essencialmente em uma sequência de aminoácido que tem uma identidade de sequência de pelo menos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, com a sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 1.

[0010] Também incluída na presente invenção está uma sequência de ácido nucleico isolada codificando a dita proteína ou fragmento imunogênico, em particular uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, de identidade com a sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO:2.

[0011] Uma modalidade adicional refere-se a uma molécula de DNA recombinante compreendendo a sequência de ácido nucleico aqui descrita, em particular incluindo ainda um promotor funcionalmente ligado.

[0012] Uma modalidade adicional refere-se a um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico aqui descrita ou molécula de DNA recombinante, o dito vetor em particular sendo um plasmídeo, um bacteriófago, cosmídeo, vírus ou minicromossomo.

[0013] A invenção revela ainda uma célula hospedeira compreendendo a sequência de ácido nucleico aqui descrito, molécula de DNA recombinante ou vetor, a dita célula hospedeira em particular sendo uma célula animal, célula bacteriana, célula de levedura, célula de inseto ou célula de planta.

[0014] Outro aspecto da presente invenção refere-se à proteína ou fragmento imunogênico, ácido nucleico, à molécula de DNA recombinante, ao vetor ou à célula hospedeira, conforme aqui descrito, para uso como um remédio, mais específico para uso na prevenção ou tratamento de uma infecção por Cooperia oncophora. Também o uso da proteína ou fragmento imunogênico, do ácido nucleico, da molécula de DNA recombinante, do vetor ou da célula hospedeiro, conforme aqui descrito, para a fabricação de uma vacina contra infecção por Cooperia oncophora é parte da presente invenção.

[0015] Uma modalidade adicional refere-se a uma vacina contra infecção por Cooperia oncophora, caracterizada pelo fato da dita vacina compreender ou consistir essencialmente em pelo menos uma proteína ou ácido nucleico descrito aqui (incluindo suas combinações), ou um fragmento de qualquer um deles, e um veículo ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, a dita vacina compreendendo opcionalmente um adjuvante.

[0016] A invenção refere-se ainda a um método de vacinação de um animal contra infecção por um nematoide parasítico, o dito método compreendendo a etapa de administrar uma proteína(s) secretada associada com ativação (ASP) (Activation-Associated Secreted Protein) purificada ou recombinante do dito nematoide Cooperia oncophora ao dito animal a fim de criar uma resposta imune no dito animal. Breve Descrição dos Desenhos

[0017] Figura 1. A-C: Sequências de nucleotídeo codificando e sequências de aminoácido de proteínas secretadas associadas com ativação de domínio duplo de C. oncophora; D: Sequências de nucleotídeo codificando e sequências de aminoácido de proteínas secretadas associadas com ativação de domínio duplo de C. oncophora incluindo terminais C e N.

[0018] Figura 2. Resultado de EPG média pós-infecção. Ovos de C. oncophora por grama de fezes foram registrados como uma função de tempo, começando 21 dias após a primeira infecção, para os grupos vacinados com adjuvante (controle) e a fração de excretoma/secretoma (ES) (Excretone/Secretone) de Alto Peso Molecular (HMW) (High Molecular Weight).

[0019] Figura 3. Respostas de imunoglobulina do soro G1 e G2 contra antígenos de C. oncophora. Os níveis de IgG1 (barras brancas) e IgG2 (barras cinzas) no soro contra antígenos de C. oncophora, presentes na fração de ES HMW, são providos como leituras de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Diferenças estatisticamente significantes comparadas com o grupo controle são indicadas por um asterisco (*) (P<0,01).

[0020] Figura 4. Leitura de EPG média pós-infecção no teste de campo. Ovos de C. oncophora por grama de fezes foram registrados para os grupos vacinados com adjuvante e fração de ES de Alto Peso Molecular (HMW). Descrição Detalhada da Invenção

[0021] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de vacinas profiláticas baseadas na identificação proteômica, caracterização e avaliação imunológica de antígenos de helminto no excretoma/secretoma (ES) que são o alvo de uma resposta imune protetora no hospedeiro. Em essência, a fração ES é secretada a partir do verme através de aberturas orais e/ou sua superfície externa e consiste basicamente em um grupo de proteínas e outros compostos cruciais em sobrevivência e propagação de helminto, infecção de hospedeiro e evasão de respostas imunológicas de hospedeiro (31, 32).

[0022] A invenção provê polinucleotídeos isolados codificando proteínas excretoras/secretoras (ES) de Cooperia oncophora de estágio adulto (C. oncophora) tendo um peso molecular aproximado de 70 kD conforme estimado por SDS-PAGE, e identificadas como proteínas secretadas associadas com ativação de domínio duplo (ASPs) (Activation-Associated Secreted Proteins); incluindo análogos, homólogos, derivados, suas partes ou combinações; proteínas que são capazes de conferir imunidade protetora em um hospedeiro contra infecção por um nematoide parasítico.

[0023] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico isolada (também referida como polinucleotídeo) compreendendo ou consistindo essencialmente em uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína secretada associada à ativação de domínio duplo de C. oncophora (ASP) ou uma parte da dita sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico da dita proteína. Em particular, a sequência de ácido nucleico ou dita parte da mesma é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico do gene de ASP de C. oncophora conforme mostrado na SEQ ID NO: 2. Ainda mais particularmente, a sequência de ácido nucleico da presente invenção compreende ainda nos terminais N e C, respectivamente, uma ou ambas as sequências CTTTGCTCGCTTGATAATGGAATGACA (SEQ ID NO: 12) e GATGAAGATTGTAAGTGCAGCTCCTGCAGATGCAGCACACAATTATC CATGTGTATCAACCCTAAC (SEQ ID NO: 13). Exemplos dos ditos ácidos nucleicos são representados pelas SEQ ID NOs: 19, 20 e 21. Em uma modalidade particular, a sequência de ácido nucleico da invenção, ou uma parte da mesma, é pelo menos 85% idêntica à sequência de ácido nucleico do gene de ASP de C. oncophora conforme mostrado na SEQ ID NO: 19.

[0024] Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção codificando a proteína C. oncophora, ou uma parte desta sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento imunogênico desta proteína, é pelo menos 90%, preferivelmente 93%, mais preferivelmente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou ainda 100% idêntico à sequência de ácido nucleico do gene de ASP de C. oncophora conforme mostrado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 19. Os ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade com a sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 2 são representados por SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6. Ácidos nucleicos tendo pelo menos 98% de identidade com a sequência de ácido nucleico conforme mostrado na SEQ ID NO: 19 são representados pela SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21.

[0025] Em uma modalidade adicional a presente invenção refere- se a uma proteína de C. oncophora isolada e um fragmento imunogênico da mesma, onde a sequência de aminoácido da proteína ou fragmento imunogênico é pelo menos 90%, preferivelmente 93%, mais preferivelmente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% idêntica à sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO:1. Proteínas tendo pelo menos 98% de identidade com a sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 são representadas pelas SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5. A invenção inclui também uma proteína isolada compreendendo ou consistindo essencialmente na sequência de aminoácido identificada acima e um terminal N e/ou terminal C adicional preferivelmente caracterizado pelos aminoácidos LCSLDNGMT (SEQ ID NO: 14) e DEDCKCSSCRCSTQLSMCINPN (SEQ ID NO: 15), respectivamente. Exemplos das ditas proteínas são representados pelas SEQ ID NOs: 16, 17 e 18. Desta maneira, em uma modalidade específica a presente invenção refere-se a uma proteína de C. oncophora isolada e um fragmento imunogênico da mesma, onde a sequência de aminoácido da proteína ou fragmento imunogênico é pelo menos 90%, preferivelmente 93%, mais preferivelmente 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até mesmo 100% idêntica à sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 16, bem como um ácido nucleico codificando a dita proteína, em particular conforme representado pela SEQ ID NO: 19.

[0026] A identidade percentual das sequências de ácido nucleico e de polipeptídeo pode ser calculada usando algoritmos comercialmente disponíveis, que comparam uma sequência de referência com uma sequência de investigação. Os programas que seguem (providos pelo National Center for Biotechnology Information) podem ser usados para determinar homologias/identidades: BLAST, BLAST gapped, BLASTN e PSI BLAST, que podem ser usados como parâmetros de falha.

[0027] O termo “isolado” é usado para indicar que uma célula, peptídeo ou ácido nucleico é separado de seu ambiente nativo. Peptídeos e ácidos nucleicos isolados podem ser substancialmente puros, isto é, essencialmente livres de outras substâncias com as quais eles podem ser ligados na natureza.

[0028] O termo “fragmento” conforme aqui usado se refere a sequências de aminoácido parciais (e sequências de ácido nucleico codificando as mesmas) tendo pelo menos uma propriedade imunológica ou imunogênica em comum com a molécula nativa. Tais fragmentos incluirão pelo menos um epítopo (ou determinante antigênico) da molécula nativa. Normalmente, eles terão um comprimento de pelo menos 8 aminoácidos, preferivelmente pelo menos 15 ou 20 aminoácidos.

[0029] Uma vez que a presente invenção revela sequências de ácido nucleico codificando proteínas de C. oncophora novas, é agora pela primeira vez possível obter essas proteínas em quantidades suficientes. Isso pode, por exemplo, ser feito usando sistemas de expressão para expressar ou todo ou partes dos genes codificando as proteínas ou fragmentos imunogênicos das mesmas de acordo com a invenção.

[0030] Desta maneira, em uma modalidade adicional, a invenção refere-se a fragmentos de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção. Um fragmento de DNA é uma extensão de nucleotídeos que funciona como um veículo para uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção. Tais fragmentos de DNA podem ser, por exemplo, plasmídeos, nos quais uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção é clonada. Tais fragmentos de DNA são, por exemplo, úteis para aumento da quantidade de DNA para uso como um primer e para expressão de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção, conforme descrito abaixo.

[0031] De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção a proteína ASP é produzida pela expressão de um polinucleotídeo conforme aqui descrito. Vetores adequados para expressão de proteínas são plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeo, vírus, minicromossomos ou vetores de integração estável; os últimos em particular para células de planta ou animal. Em geral esses vetores têm a propriedade de replicação autônoma, exceto pelos vetores de integração estável que se inserem no material genômico da célula hospedeiro e replicam com o material genético do hospedeiro. Células hospedeiras adequadas para a expressão de proteínas podem ser ou procarióticas ou eucarióticas, tais como, mas não limitado a, bactérias tais como Escherichia coli, leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, micoplasma, alga, células de planta tal como Arabidopsis thaliana, células de vertebrado ou células de baculovírus/inseto; as células de planta ou animais podem ser cultivadas in vitro ou podem fazer parte de uma planta ou animal intacto, respectivamente. O polinucleotídeo recombinante pode conter como uma inserção um polinucleotídeo completo codificando a ASP ou um fragmento do mesmo. Sistemas de expressão bacterianos, de levedura, fúngicos, de inseto, planta e vertebrados são sistemas usados com muita frequência. Tais sistemas são bem conhecidos na técnica e geralmente disponíveis. Vetores podem ser também usados como um meio de transporte da sequência de ácido nucleico para uma célula-alvo. Com relação a isso, vírus frequentemente usados como vetores são vírus Vaccinia (62), Herpesvirus (EP0473210), Adenovírus e Retrovírus (69). Um exemplo particular no contexto da presente invenção é um vetor bacteriano. Aqui bactérias capazes de colonizar ruminantes são transformadas a fim de permitir que elas expressem a ASP de tal maneira que levará a uma resposta imunogênica contra o parasita. Em particular elicitar uma resposta imune local forte na superfície mucosal do trato gastrintestinal onde esses parasitas geralmente residem. Bactérias adequadas para este propósito são bactérias Salmonella e Lactobacillus.

[0032] Uma necessidade essencial para a expressão da sequência de ácido nucleico é um promotor adequado funcionalmente ligado à sequência de ácido nucleico, de maneira que a sequência de ácido nucleico esteja sob o controle do promotor. É óbvio àqueles versados na técnica que a escolha de um promotor se estende a qualquer promotor eucariótico, procariótico ou viral capaz de direcionar a transcrição de genes em células usadas como células hospedeiras para expressão de proteína. Desta maneira, uma modalidade particular se refere a uma molécula de DNA recombinante compreendendo um fragmento de DNA e/ou uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção onde a sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção é posta sob o controle de um promotor funcionalmente ligado. Isso pode ser obtido por meio de, por exemplo, técnicas de biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook & Russel: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Promotores funcionalmente ligados são promotores que são capazes de controlar a transcrição das sequências de ácido nucleico às quais eles estão ligados. Tal promotor pode ser um promotor nativo do gene de ASP ou outro promotor de Cooperia oncophora, contanto que o promotor seja funcional nas células usadas para expressão. Ele pode ser também um promotor heterólogo. Quando as células hospedeiras são bactérias, sequências de controle de expressão úteis, que podem ser usadas, incluem o promotor e operador Trp (63); o promotor e operador lac (64); o promotor da proteína de membrana externa (65); os promotores e operadores lambda de bacteriófago (66); o promotor e operador de [alfa]-amilase (B. subtilis), sequências de terminação e sequências de potencialização e controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira selecionada. Quando as células hospedeiro são leveduras, sequências de controle de expressão úteis, que podem ser usadas, incluem o promotor AOX. Quando as células hospedeiras são plantas, sequências de controle de expressão úteis, que podem ser usadas, incluem promotor da faseolina (67).

[0033] Desta maneira, a presente invenção refere-se a um vetor ou célula hospedeira compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de acordo com a invenção, e uma molécula de DNA recombinante compreendendo tal sequência de ácido nucleico sob o controle de um promotor funcionalmente ligado. Esta forma refere-se também a uma célula hospedeira contendo um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína de C. oncophora ou um fragmento imunogênico da mesma de acordo com a invenção.

[0034] A invenção refere-se ainda a um processo para transformação de um hospedeiro para prover um hospedeiro transformado, processo que compreende provisão de um hospedeiro, tornar o hospedeiro competente para transformação e introdução no hospedeiro de uma molécula de DNA recombinante conforme aqui descrito. A invenção compreende também o produto de expressão do dito hospedeiro transformado. Preferivelmente, o produto de expressão está em uma forma purificada.

[0035] Em outro aspecto, a presente invenção provê um método de proteção de um hospedeiro contra infecção por um nematoide parasítico, método que compreende administrar ao hospedeiro pelo menos uma proteína, ácido nucleico ou vetor conforme aqui descrito.

[0036] Uma modalidade particular provê uma composição ou uma vacina para criação de uma resposta imune em um indivíduo. As vacinas podem ser usadas terapeuticamente ou profilaticamente, isto é, para prevenir infecção parasítica, em particular infecção com espécie do gênero Cooperia, mais particularmente Cooperia oncophora. Em casos específicos, a vacina provida pela presente invenção pode ser usada em um método para prevenir ou reduzir infecção ou colonização de um hospedeiro por um parasita nematoide.

[0037] Em particular, os ácidos nucleicos, proteínas ou vetores conforme aqui descrito são usados para fabricar uma composição ou uma vacina, que tipicamente inclui um veículo, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e opcionalmente um adjuvante. É então um objetivo da presente invenção prover uma composição farmacêutica ou uma vacina contra C. oncophora compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em:

[0038] - uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma sequência de ácido nucleico, proteína, vetor ou célula hospedeiro de acordo com a invenção;

[0039] - um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, e

[0040] - opcionalmente um adjuvante.

[0041] Os veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis particulares empregados são veículos ou diluentes “veterinariamente aceitáveis” e são convencionais na técnica. Esses incluem qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes de estabilização, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, agentes de retardo de absorção e similar. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e similar. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Estabilizadores incluem, por exemplo, albumina.

[0042] Adjuvantes são conhecidos por agir de várias maneiras diferentes para aumentar a resposta imune. Em geral, adjuvantes imunomoduladores causam uma suprarregulagem geral de certas citocinas e uma sub-regulagem concomitante de outras levando a uma resposta Th1 celular e/ou Th2 humoral. Como usado na presente invenção, “adjuvantes” incluem, mas não estão limitados a, Quil A, ISCOM, ISOCMATRIX, o sistema de adjuvante RIBI (Ribi Inc.), alume, hidroxigel de alumínio, Colesterol, emulsões óleo-em-água, emulsões água-em-óleo tais como, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero em bloco (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville, CA), adjuvante AMPHIGENO, saponina, saponina em combinação com um esterol (vide, por exemplo, US20050220814), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), MPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) ou outras frações saponina, polímeros tais como dietilaminoetila (DEAE)- dextrano, polietileno glicol e ácido poliacrílico (por exemplo, CARBOPOL®), hidroacetato de N-(2-Desóxi-2-L-leucilamino-b-D- glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida (também conhecido pelo nome comercial Bay R1005®), lipídeo A de monofosforila, adjuvante de lipídeo-amina Avridina, enterotoxina lábil ao calor de E. coli (recombinante ou outra), toxina do cólera, dipeptídeo muramila ou imunomoduladores tais como citocinas e agonistas de TLR, oligonucleotídeos contendo citosina-fosfato-guanosina (CpG) e combinações desses adjuvantes. Um adjuvante preferido é uma saponina ou o adjuvante pode incluir uma saponina, tal como Quil A. Em algumas modalidades, o adjuvante é um composto adjuvante que pode compreender uma saponina, e opcionalmente um esterol, pelo menos um de um polímero poliacrílico, uma amina quaternária (por exemplo, DDA ou avridina), um estimulante de Th2 tal como N-(2- Desóxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N- octadecildodecanoilamida e/ou oligonucleotídeo imunoestimulador.

[0043] Os compostos adjuvantes descritos acima podem estar presentes na forma de uma emulsão óleo-em-água, onde gotículas de óleo são dispersas em uma fase aquosa contínua. Em outros aspectos, o adjuvante pode ser um baseado em óleo, isto é, ele pode conter uma fase de óleo contínua e gotículas de fase aquosa interespaçadas nela. Adjuvantes de emulsão podem ser preferivelmente microfluidizados para obter um tamanho menor (submícron) e uma uniformidade maior entre as partículas de emulsão, desta maneira resultando em uma estabilidade de emulsão e pode ainda aumentar o efeito de adjuvante de tal emulsão microfluidizada. A Patente U.S. No. 5.961.970 ensina ainda outra emulsão óleo-em-água de submícron a ser usada como um adjuvante de vacina. Na dita emulsão, o componente hidrofóbico é selecionado do grupo consistindo em um óleo de triglicerídeo de cadeia média, um óleo vegetal e uma mistura dos mesmos. O tensoativo incluído nesta emulsão pode ser um tensoativo biologicamente compatível natural tal como fosfolipídeo (por exemplo, lecitina) ou um tensoativo não natural farmaceuticamente aceitável tal como TWEEN-80. A Patente U.S. N. 5.084.269 ensina que uma formulação adjuvante contendo lecitina em combinação com óleo mineral causa uma diminuição em irritação dentro do animal hospedeiro e simultaneamente induz imunidade sistêmica aumentada. A formulação adjuvante resultante da Patente U.S. No. 5.084.269 é comercialmente usada em vacinas veterinárias sob o nome comercial AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® é formada de micelas-gotículas de óleo circundadas por lecitina.

[0044] Desta maneira, em modalidades diferentes, a presente invenção provê uma composição compreendendo um componente antígeno e um componente adjuvante. O componente antígeno pode compreender uma subfração de ES HMW, uma sequência de aminoácido pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97%, ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 16 ou uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90% (por exemplo, pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou 100%) idêntica à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 19 ou qualquer combinação das mesmas. O componente adjuvante pode conter uma saponina (tal como, por exemplo, Quil A), e opcionalmente um esterol (tal como, por exemplo, lanosterol, ergosterol ou colesterol), pelo menos uma de uma amina quaternária (tal como, por exemplo, DDA Ou avridina), um polímero poliacrílico, o glicolipídeo (por exemplo, BayR1005® e/ou um oligonucleotídeo imunoestimulador. Adicionalmente ou alternativamente, o componente adjuvante pode conter uma emulsão óleo-em-água. Em ainda outras modalidades, a emulsão água-em-óleo pode conter um oligonucleotídeo imunoestimulador e DEAE dextrano. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser prontamente determinadas pelo versado na técnica.

[0045] Preferivelmente, a composição conforme aqui descrita é uma composição imunogênica. Por “imunogênica” quer dizer a capacidade de provocar uma resposta imune em um indivíduo contra o patógeno. A presente invenção provê então composições para uso na elicitação de uma resposta imune que pode ser utilizada como uma vacina contra C. oncophora. A resposta imune pode ser uma resposta imune celular mediada principalmente por células NK, células T citotóxicas ou uma resposta imune humoral mediada principalmente por células T auxiliares, que por sua vez ativam células B levando à produção de anticorpo. Mais específico, por “elicitação ou indução de uma resposta imune” quer dizer que um antígeno estimula síntese de anticorpos IgG específicos e/ou proliferação celular conforme medido através de, por exemplo, incorporação de timidina 3H de células NK, células T e células B. Administração da vacina da invenção elicita uma resposta imune que resulta em uma redução em contagem de ovo fecal cumulativo médio de pelo menos cerca de 60% em um animal em relação a um animal controle não vacinado (por exemplo, adjuvante sozinho). Preferivelmente, o nível da diminuição é cerca de 70%, mais preferivelmente cerca de 80% e, sobretudo, preferivelmente cerca de 90% ou mais. Desta maneira, a resposta imune confere algum efeito benéfico, protetor, ao indivíduo contra uma provocação subsequente com o agente infeccioso. Mais preferivelmente, a resposta imune previne o início de ou melhora pelo menos um sintoma de uma doença associada com o agente infeccioso, ou reduz a severidade de pelo menos um sintoma de uma doença associada com o agente infeccioso quando de provocação subsequente. Sintomas associados com infecções por C. oncophora tipicamente incluem, mas não estão limitados a, diarreia e falha no crescimento (ill thrift).

[0046] Por “indivíduo” ou “hospedeiro” quer dizer qualquer animal que seja suscetível a C. oncophora, tal como gado. O termo “gado” se refere a animais bovinos incluindo, mas não limitado a, bezerros, bois, vacas e vitelos.

[0047] Na prática dos presentes métodos, uma vacina ou composição da presente invenção é administrada preferivelmente através de via intramuscular ou subcutânea, embora outras vias de administração possam ser usadas também, tal como, por exemplo, através de administração via oral, intranasal (por exemplo, aerossol ou outra administração sem agulha), nodo intralinfo, intradermal, intraperitoneal, retal ou vaginal, ou por uma combinação de vias. A formulação da composição ou da vacina pode ser feita de várias formas dependendo da via de administração. Por exemplo, as composições podem ser feitas na forma de soluções ou dispersões aquosas estéreis adequadas para uso injetável, ou feitas em formas liofilizadas usando técnicas de secagem por congelamento. Composições imunogênicas liofilizadas são tipicamente mantidas em cerca de 4° C e podem ser reconstituídas em uma solução de estabilização, por exemplo, solução salina ou HEPES, com ou sem adjuvante.

[0048] Regimes de reforço podem ser requeridos e o regime de dosagem pode ser ajustado para prover imunização ótima. Protocolos de imunização podem ser otimizados usando procedimentos bem conhecidos na técnica. Uma dose única pode ser administrada a animais ou, alternativamente, duas, três ou mais inoculações podem ocorrer com intervalos de duas a dez semanas. Dependendo da idade do animal, a composição imunogênica ou de vacina pode ser readministrada. Por exemplo, a presente invenção compreende a vacinação de vitelos saudáveis (3-12 semanas de vida) 6 e/ou 3 semanas antes de sua primeira sessão de pastejo e revacinação no início da primeira sessão de pastejo.

[0049] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade suficiente para elicitar uma resposta imune no animal ao qual ela é administrada. A resposta imune pode compreender, sem limitação, indução de imunidade celular e/ou humoral. A quantidade de uma vacina que é terapeuticamente eficaz pode variar dependendo da condição do gado e/ou do grau de infecção, e pode ser determinada por um veterinário. O grau e a natureza das respostas imunes induzidas no gado podem ser avaliados usando uma variedade de técnicas. Por exemplo, soro pode ser coletado dos animais inoculados e testado quanto à presença de anticorpos específicos para C. oncophora.

[0050] Em adição aos aspectos da invenção descritos acima e incluindo as descrições dadas de todas as modificações e meios de produção e administração, uma composição ou vacina pode ser provida com as proteínas de ASP de C. oncophora ou polinucleotídeos conforme aqui descrito como polipeptídeos ou polinucleotídeos únicos ou usados em combinação.

[0051] Desta maneira, em algumas modalidades, o método, uso, composição ou vacina da presente invenção pode ser baseado em duas ou mais proteínas ASP conforme aqui descrito, ou fragmentos das mesmas. Em uma modalidade específica, pelo menos duas, três ou mais proteínas de ASP, ou ácidos nucleicos codificando as ditas proteínas, ou seus fragmentos, são usados em uma composição ou vacina única. Desta maneira, em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição ou vacina baseada em, compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em pelo menos duas proteínas ASP tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido conforme representado pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 16; ou pelo menos dois ácidos nucleicos de ASP tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência de nucleotídeo conforme representado pela SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 19; ou seus fragmentos. Em uma modalidade específica, a composição ou vacina compreende duas ou três das proteínas selecionadas do grupo consistindo em sequência de aminoácido conforme representado pelas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 16, 17 e 18; ou dois ou três dos ácidos nucleicos codificando essas proteínas, ou conforme representado por respectivamente SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 19, 20 e 21. Exemplos de combinações de proteína de Específicas são: SEQ ID NOs: 1 e 3; SEQ ID NOs: 1 e 5; SEQ ID NOs: 3 e 5; e SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; ou os ácidos nucleicos codificando essas proteínas e conforme aqui provido.

[0052] A invenção será melhor compreendida com referência aos Detalhes Experimentais que seguem, mas aqueles versados na técnica compreenderão prontamente que esses são apenas ilustrativos da invenção conforme aqui descrito mais integralmente nas reivindicações que seguem. Modalidades e exemplos particulares não pretendem de modo algum limitar o escopo da invenção conforme reivindicado. Ainda, em todo o presente pedido, várias publicações são mencionadas. O relatório dessas publicações é aqui incorporado a título de referência ao presente pedido para descrever mais integralmente o estado da técnica à qual a presente invenção pertence.

Exemplos 1. Procedimentos Experimentais 1.1. Preparação de Produtos Excretores e Secretores de Cooperia oncophora Adulta

[0053] Os vitelos foram infectados com 100.000 larvas infecciosas de uma linhagem de Cooperia oncophora da casa. Cooperia oncophora de estágio adulto foram coletadas do intestino delgado 21 dias p.i. Os vermes foram subsequentemente postos em um aparelho Baermann modificado que foi cheio com água fisiológica 37° C. Os vermes migrando para o fundo do funil foram então coletados e lavados por um mínimo de cinco vezes em água fisiológica a 37° C. Em uma etapa seguinte, os helmintos foram transferidos e culturados por três dias consecutivos em meio RPMI (Gibco®, Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) a 37° C. O meio foi revigorado em uma base diária e armazenado a -80° C. Depois desse período de cultura de três dias, todo o meio armazenado a -80° C, contendo a fração de proteína de ES, foi passado por um filtro de 0,22 μm e simultaneamente concentrado e dialisado para PBS a 4° C usando uma unidade de ultrafiltragem Amicon e discos de ultrafiltragem Ultracel Regenerated Cellulose (ambos da Millipore; Billerica, MS, USA). A concentração de proteína da amostra de ES obtida foi determinada usando o BCA® Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

1.2. Cromatografia de Exclusão de Tamanho

[0054] Fracionamento cromatográfico de exclusão de tamanho (SEC) (Size Exclusion Chromatographic) de material de ES total de Cooperia oncophora foi realizado usando uma coluna Superdex 200 16/70 autorrevestida (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Suécia). Volumes máximos de 0,5 mL de uma solução de proteína de ES concentração (correspondendo a 300 μg de proteína de ES) foram injetados e eluídos em PBS em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. A eluição da proteína foi monitorada por medições de absorbância a 280, 254 e 214 nm e quando adequado frações de 1,0 mL foram coletadas (ÃKTA Explorer, GE Healthcare BioSciences AB; Uppsala, Suécia). Etapas de equilíbrio e lavagem de coluna de PBS de pelo menos dois volumes de coluna foram realizadas antes e após cada experimento, respectivamente. Para obter quantidade de proteínas adequada, rodadas múltiplas deste procedimento foram realizadas.

1.3. Eletroforese Uni- e Bidimensional e Digestão Tríptica de Proteínas de ES

[0055] Eletroforese unidimensional desnaturante (SDS-PAGE) foi realizada de acordo com Laemmli (34), incluindo e omitindo β- mercaptoetanol em SDS-PAGE de redução e não redução, respectivamente. Eletroforese em gel unidimensional nativa foi realizada com as amostras dissolvidas em Tris 60 mM, pH 6,8, azul de bromofenol 0,1% e tampão de amostra de glicerol 20% com condições de atividade de eletroforese como segue: géis de separação e empilhamento consistiam em Tris-HCl pH 8,5 e Tris-H3PO4, pH 9,6, respectivamente, com quantidades apropriadas de acrilamida- bisacrilamida adicionadas, enquanto o tampão de atividade era um tampão de Tris-Glicina em pH 8,9 e a tensão foi ajustada em 90 V.

[0056] Eletroforese em gel bidimensional foi realizada como segue. A proteína foi precipitada adicionando cinco volumes de acetona gelada a um volume de proteína de ES. Isso foi rapidamente vortexado e incubado a -20° C por uma hora, após o que o pélete de proteína foi recuperado através de centrifugação a 5.000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e o pélete deixado secar ao ar, após o que ele foi ressolubilizado em ureia 8M, tioureia 2M, CHAPS 2% p/p, DTT 20 mM, anfolitos veículos 0,2% v/v (pH 3-10; GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Suécia). Isso foi deixado em temperatura ambiente por uma hora, seguido por centrifugação a 8.000 rpm por cinco minutos para remover qualquer proteína insolúvel ainda presente. O sobrenadante restante, correspondendo a aproximadamente 150 μg de proteína de ES, foi aplicado a tiras Immobiline® DryStrip IEF, pH 3-10, 7 cm (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Suécia). Coberto com óleo mineral, isso foi deixado de um dia para o outro em temperatura ambiente para reidratação da tira e absorção da amostra de proteína. Foco isoelétrico foi realizado em temperatura ambiente usando um instrumento de foco isoelétrico Ettan IPGphor3 (GE Healthcare Bio-sciences AB; Uppsala; Suécia) com um período de foco de três horas inicial a 300 V, seguido por um gradiente linear de cinco horas de 300 a 3500 V e uma extensão de tempo de 18 h final a 3500 V, fornecendo uma carga de tensão total de aproximadamente 73 kVh. As proteínas dissolvidas nas tiras de primeira dimensão foram reduzidas e alquiladas antes da segunda eletroforese dimensional através de incubação das tiras por 15 minutos em temperatura ambiente em uma solução de Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, ureia 6 M, glicerol 30% v/v, SDS 2% p/v, DTT 2% p/v seguido por mais 15 minutos em uma solução idêntica contendo iodoacetamida 2,5% p/v ao invés do DTT. A segunda eletroforese dimensional (SDS-PAGE), com a tira IEF incrustrada no gel de empilhamento, foi realizada conforme descrito para ‘eleteroforese em gel unidimensional’.

[0057] SimplyBlue® SafeStain (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) foi usado para visualizar as proteínas de acordo com as instruções do fabricante. O tamanho de poro dos géis, provido como uma porcentagem de concentração de monômero de acrilamida- bisacrilamida total, é 13,5%.

[0058] Antes da digestão tríptica, faixas e/ou pontos de proteína de interesse foram excisados do gel, lavados duas vezes por 20 minutos a 30° C usando uma mistura de acetonitrila (ACN) 50% - bicarbonato de amônio 200 mM e então secos ao ar. Tripsina de grau de sequenciamento (Promega; Madison, WI, USA) foi adicionada a uma quantidade final de 0,1 μg e a mistura de tripsina-fatia de gel foi então mantida em gelo por 45 minutos, após o que bicarbonato de amônio 50 mM foi adicionado até que as fatias de gel fossem completamente submersas. A digestão foi realizada através de incubação de um dia para o outro a 37° C. Os peptídeos foram extraídos adicionando ACN 60%-ácido fórmico 0,1% duas vezes aos pontos de gel. O tampão de extração foi evaporado em um aparelho Speedvac com os peptídeos restantes sendo redissolvidos em 8 μL de ácido fórmico 0,1%.

1.4. Análise Espectrométrica de Massa

[0059] Peptídeos trípticos foram salpicados em uma placa alvo de ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz de aço inoxidável (MALDI) (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) e cobertos com matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (7 mg/mL em ACN 50%, ácido trifluoracético 0,1%, citrato de amônio 1 mM) em uma razão 1:1. Antes de cada conjunto de análises, calibragem do instrumento foi realizada usando Cal Mix (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Identificação de proteína foi obtida medindo a PMF em um sistema de espectrometria de massa de tempo de voo em tandem MALDI (MALDI-TOF/TOF MS) (analisador proteômico modelo 4800; Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) em modo MS de íon positivo. MS/MS foi realizada para verificar as sequências de certos peptídeos.

1.5. Identificação de Proteína

[0060] Para análise de impressão digital de massa de peptídeo, os espectros obtidos foram pesquisados contra o banco de dados de transcriptoma baseado em EST de Cooperia oncophora (33) consistindo em 31.774 sequências de aminoácido, suplementado com deposição NCBI existentes para C. oncophora, usando a plataforma de software GPS Explorer® V2 (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA) que faz uso da máquina de pesquisa Mascot (Matrix Science Inc.; Boston, MAS, USA). Os espectros foram pesquisados usando uma massa de peptídeo de 200 ppm e uma tolerância MS/MS de 0,8 Da, com carbamidometilação (Cys) e metionina-oxidação como parâmetros de modificação de variável e com uma tolerância máxima de dois eventos de clivagem faltantes durante digestão com tripsina da proteína.

1.6. Análise de Sequência

[0061] Seguindo sua identificação MS, as sequências de aminoácido de comprimento não integral foram submetidas a algoritmos de pesquisa NemaBLAST (33), fornecendo várias sequências de aminoácido vizinhas e/ou de sobreposição. Essas foram subsequentemente alinhadas usando o software MegAlign (DNASTAR, Inc.; Madison, empregando o algoritmo de alinhamento ClustalW, na maioria dos casos levando a um aumento significante em cobertura de sequência e principalmente provendo sequências de aminoácido de comprimento integral das proteínas identificadas. Essas sequências foram então submetidas à análise BLASTP (35) empregando um banco de dados de sequência de proteína não redundante para fornecer uma identificação com base em identidade de sequência.

[0062] A sequência de comprimento integral de ASP de domínio duplo foi determinada como segue: dois primers degenerados (avançado, ATGYAACAGKAYTGGGTGAGG (SEQ ID NO: 7) e reverso, ATACACATGGAYAAYTGTGTGCT (SEQ ID NO: 8), com Y e K representando T/C e G/T, respectivamente) foram projetados com base em regiões conservadas na sequência de ASP de domínio duplo putativo. Reação em cadeia da polimerase (PCR) usando a enzima GoTaq® (Promega; Madison, WI, USA) foi realizada misturando 1 μL de cDNA de Cooperia oncophora de estágio adulto com 1 μM de ambos os primers avançado e reverso e uma unidade de GoTaq® em tampão de reação contendo 0,2 nM de cada dNTP e MgCl2 1,2 mM. Experimentos de PCR foram realizados em um Mastercycle® Ep instrument (Eppendorf; Hauppauge, NY, USA) onde dois minutos em uma temperatura de desnaturação de 95° C foram seguidos por 35 ciclos de desnaturação (30 segundos a 95° C), anelamento (30 segundos a 58° C) e alongamento (síntese de DNA por 90 segundos a 72° C). Em seguida, uma etapa de alongamento final a 72° C por cinco minutos foi incluída, após o que as misturas de PCR foram mantidas a 10° C. Os produtos de PCR obtidos foram subsequentemente ligados em pGEM®-T Easy (Promega; Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante, após o que células competentes DH5α (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) foram transformadas com esses construtos conforme descrito pelo fabricante e plaqueadas em meio contendo X-gal (5-bromo-4-cloro-indol-β-D-galactopiranosideo). Cinquenta e três colônias brancas foram pegas e analisadas misturando 15 μL de suspensão de clone (em água) com quantidades idênticas dos reagentes mencionados acima. Condições de PCR foram também duplicadas do acima, sendo que apenas 32 ciclos de desnaturação, anelamento e alongamento foram realizados. Os fragmentos de PCR obtidos foram sequenciados (na Genetic Service Unit, Ghent University Hospital), seguido por correspondência dos dados obtidos com os espectros de MS e MS/MS anteriormente registrados.

1.7. Caracterização de Proteína In Silico

[0063] Seguindo a avaliação de sequência de aminoácido de comprimento integral das proteínas identificadas, valores de peso molecular e ponto isoelétrico foram determinados usando as ferramentas de cálculo ExPASy correspondentes (SIB Bioinformatics Resource Portal), enquanto sequências de sinal N-terminais foram previstas usando SignalP 3.0 (The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark) (36) ou, quando ausentes, proteínas secretoras não clássicas foram avaliadas usando SecretomeP 2.0 (37). Com relação a previsões de SignalP 3.0, as identificações foram consideradas positivas quando ambos os algoritmos de rede neural e modelo oculto de Markov ofereceram estimativas corroborativas. Proteínas secretadas não clássicas foram previstas fornecer uma classificação de rede neural excedendo o limiar normal de 0,5, mas não contêm um peptídeo de sinal.

1.8. Liberação, Purificação e derivatização de porções N- e O- glicano

[0064] Material de ES total bem como frações de ES obtidas através de cromatografia de exclusão de tamanho separadas, isto é, HMW, MMW e LMW, foram submetidos a tratamento serial com PNGase F e PNGase A para obter N-glicanos liberados. Para esta finalidade, proteínas liofilizadas foram redissolvidas em PBS com SDS 1,3% e β-mercaptoetanol 0,1% e incubadas a 95° C por 10 minutos, seguido pela adição de NP-40 1,3%. As amostras foram então incubadas com Sepharose acoplada à tripsina por 16 horas a 37° C enquanto agitando. As contas foram giradas, o sobrenadante transferido para um tubo fresco e PNGase F adicionado, seguido por incubação por 24 horas a 37° C enquanto agitando. A mistura foi então aplicada a um cartucho RP C18 (500 mg; JT Baker, Philipsburg, NJ, USA) e as frações de fluxo e lavagem (2 mL de acetonitrila 10% (ACN) e 4 ml de água, respectivamente, foram subsequentemente aplicados a cartuchos de carbono (150 mg de Carbograph; Grace, Deerfield, IL, USA). Após uma lavagem com 6 mL de água, os glicanos foram eluídos com 3 mL de ACN 25% e 3 mL de ACN 50% contendo TFA 0,1%. Os (glico)-peptídeos que permaneceram no cartucho RP C18 foram eluídos aplicando 5 mL de ACN 30%/TFA 0,1% e 5 mL de ACN 60%/TFA 0,1% e esses eluatos combinados foram subsequentemente secos a vácuo. Os (glico)-peptídeos foram dissolvidos em acetato de sódio (NaAc) pH 4,5 e, após adição de PNGase A (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), incubação por 24 horas a 37° C. A mistura foi aplicada a um cartucho RP C18 e um cartucho de carbono conforme acima mostrado. Os N-glicanos liberados por PNGase F e PNGase A purificados nos eluatos de cartucho de carbono foram cada um submetidos à marcação com ácido 2-aminobenzoico (2-AA) conforme anteriormente descrito (38). Para limpeza, porções glicano marcadas foram carregadas em Biogel P-10 (BioRad, Veenendaal, Países Baixos) em ACN 75% e após lavagem com ACN 80% eluídas com água. Em paralelo, para obter O-glicano alditóis, amostras de ES foram tratadas com NaOH 0,1 M/NaBH4 1 M a 40° C por 24 h. As amostras foram então neutralizadas em gelo usando ácido acético 4M e ácido bórico foi removido através de evaporação repetida e adição de ácido acético 1% em MeOH.

[0065] O-glicanos liberados foram purificados usando cartuchos C18 e de carbono conforme acima descrito. Para permetilação, O- glicanos secos foram dissolvidos em DMSO, após o que NaOH (ponta da espátula com pó) foi adicionado e a amostra foi deixada em temperatura ambiente por 10 minutos enquanto agitando regularmente. Então 100 μL de iodometano foram adicionados, seguido por 10 minutos de agitação regular e subsequentemente a adição de 400 μL de diclorometano e 500 μL de água. Agitação por inversão, remoção da camada aquosa e adição de água fresca foram repetidas cinco vezes antes da camada orgânica restante ser seca sob fluxo de nitrogênio.

1.9. Análise de Glicano de Excretoma/Secretoma através de Espectrometria de Massa

[0066] Empregando as sequências de aminoácido montadas das proteínas identificadas, análises de glicano N-ligados in silico foram realizadas usando NetNGlyc 1.0 Server (Technical University of Denmark). Análises de glicano experimentais foram realizadas como segue: grupos de N-glicano marcado com 2-AA e O-glicano permetilado foram analisados com um espectrômetro de massa Ultraflex II MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) operando no modo de reflectron íon-negativo (N-Glicanos) ou íon- positivo (O-glicano) usando DHB (Bruker Daltonics) como uma matriz. Uma amostra de N-glicanos MMW foi incubada com α-manosidase de Jack bean (Sigma) em NaAc pH 4,5 por 16 h a 37° C e analisada através de MALDI-TOF MS após aplicação a Zip-Tip C18 e eluição direta na placa alvo com uma solução de 20 mg/mL de DHB em ACN 30%. Para análise de glicopeptídeo, uma amostra da mistura de glicopeptídeo/peptídeo tríptico extraída da fatia de gel foi aplicada a uma coluna de fase reversa (PepMap, 3 μm, 75 μm.100 mm; Dionex/LC Packings, Amsterdam, Países Baixos) usando um sistema Ultimate 3000 nano-LC (Dionex/LX Packings). A coluna foi equilibrada em temperatura ambiente com eluente A (ácido fórmico 0,1% em água) em uma taxa de fluxo de 200 nL/min. Após injeção da amostra, condições de eluição foram mudadas para solvente B 10% (acetonitrila 95%, ácido fórmico 0,1%) seguido por um gradiente para B 60% em 45 min e eluição isocrática subsequente com uma duração de 10 minutos. A coluna de LC foi acoplada a um ESI-ion-trap-MS Esquire HCT-Ultra (Bruker-Daltonics, Bremen, Alemanha) equipado com uma fonte de nanopulverização on line operando no modo de íon-positivo. Para eletropulrização (1100-1250 V), emissores de LC/MS de aço inoxidável eletropolidos (150 μm DE, 30 μm DI) deProxeon A/S (Odense, Dinamarca) foram usados. O solvente foi evaporado a 175° C empregando uma corrente de nitrogênio de 7 L/min. Íons de m/z 500 a m/z 1800 foram registrados no modo MS. Quando operada no modo MS/MS auto, registrando íons de m/z 140 a 2200, cada varredura de MS foi seguida pela aquisição de espectros de MS/MS de até três dos íons mais abundantes no espectro de MS.

1.10. Teste de Vacinação

[0067] Quatorze vitelos machos MontBéliard, de 7 meses de idade no início do experimento, foram aleatorizados em dois grupos de sete animais. Alojamento dos animais, alimentação, imunizações com a fração de HMW, infecções desafiadoras, contagens de ovos fecais e avaliações de comprimento de verme foram realizadas conforme descrito anteriormente (39), exceto que neste estudo os animais foram imunizados com 30 μg de proteína e 750 μg de adjuvante em cada imunização. Os animais sofreram sangria antes do início do teste e uma semana após as segunda e terceira imunizações. Todas as técnicas parasitológicas foram realizadas de maneira cega, que é sem conhecimento do grupo de tratamento ao qual o animal pertencia.

1.11. Respostas de Anticorpo

[0068] Um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) foi empregado para determinar níveis de IgG1 e IgG2 na imunoglobulina do soro contra C. oncophora. As frações de ES de adulto HMW foram separadamente revestidas (1 μg/mL) em uma placa de ELISA de 96 cavidades em tampão de carbonato (0,025 M, pH 9,6), então bloqueadas em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Tween 80 0,2% e albumina de soro bovino (BSA) 2% (Bovine Serum Albumine), seguido por incubação com soro de qualquer grupo controle (adjuvante apenas) ou o grupo imunizado correspondente (antígeno com adjuvante) (séries de diluição serial de 1/200 em PBS com Tween 80 0,2% e BSA 2%). IgG1 e IgG2 antibovinas de ovelha acopladas à peroxidase de rábano silvestre (HRP; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, USA) foram usadas como conjugados (todos diluídos 1:200 em PBS com Tween 80 0,2% e BSA 2%), com ABTS como o substrato. A densidade óptica foi medida a 405 nm com o sinal de 492 nm servindo como uma amostra vazia (blank).

1.12. Análises Estatísticas

[0069] Os dados são apresentados como médias aritméticas. A significância de diferenças entre grupos vacinados e o grupo controle adjuvante foi avaliada em pares usando um teste U Mann-Whitney de uma variável. Diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significantes contanto que o valor P correspondente fosse menor do que 0,05.

1.13. Expressão em Pichia pastoris

[0070] A sequências de codificação de proteína são amplificadas por PCR de cDNA de C. oncophora e subsequentemente inseridas como um fragmento XhoI-NotI no vetor de expressão de Pichia pPIC9 (Invitrogen Ltd., Paisley, RU). Os plasmídeos de expressão resultantes, pPIC9-OoASP1, são usados para transformar uma linhagem GnM5 de Pichia pastoris (68) através de eletroporação. Clones individuais crescendo em placas mínimas são isolados e testados quanto à secreção das proteínas recombinantes através de SDS-PAGE seguido por tingimento com Coomassie Brilliant Blue e immunoblotting. A glicoforma das proteínas secretadas é avaliada usando traçado de perfil de glicano DSA-FACE (68). Clones individuais são subsequentemente selecionados em placas YPD contendo nourseotricina e testados quanto à secreção de proteína recombinante e usados para inocular uma cultura de frasco de agitação com meio BMGY. Depois de 48 horas de crescimento a 28° C, as células são peletizadas através de centrifugação por 5 minutos a 1.519 x g após o que as células são ressuspensas em BMMY e cultivadas adicionalmente a 28° C. A cada 12 horas metanol extra (0,5%) é adicionado à cultura e após 48 horas de indução as células são finalmente peletizadas. O meio celular é coletado e filtrado em uma membrana de 0,2 μm. Quando da adição de sulfato de amônio para saturação de 50% a 4° C, os recombinantes são precipitados e concentrados em uma fração de pelete através de centrifugação a 18.000 x g por 15 minutos. Este pélete é dissolvido em tampão de acetato de sódio 40 mM (pH 4,4) e o sulfato de amônio restante removido através de filtragem em gel usando uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Suécia). Esta fração é então aplicada a uma coluna SP-Sepharose (GE Healthcare BioSciences AB; Uppsala, Suécia) equilibrada em tampão de acetato de sódio 40 mM (pH 4,4) e os recombinantes ligados eluídos empregando um gradiente para cloreto de sódio 1 M (NaCl) no mesmo tampão. Frações contendo a proteína recombinante são agrupadas, dialisadas para Tris-HCl 25 mM (pH 7,5) e carregadas em uma coluna MonoQ (GE Healthcare Biosciences AB; Uppsala, Suécia). Os recombinantes são eluídos desta coluna usando um gradiente para NaCl 1 M no mesmo tampão. Frações contendo ASPs recombinantes são agrupadas e tampão trocado para PBS através de filtragem em gel em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Suécia).

1.14. Teste de Campo

[0071] O teste consiste em dois grupos de 12 vitelos Holstein- Friesian cada um. Vinte e quatro vitelos que nunca tiveram helmintos, 7 a 9 meses de vida, foram aleatoriamente divididos em doze pares. Cada par foi aleatoriamente designado para um grupo de tratamento (controle ou vacinado). Imunizações com a fração HMW e contagens de ovos fecais foram realizadas conforme descrito no teste de vacinação. Um grupo foi vacinado três vezes com intervalo de três semanas com a vacina HMW/Asp de C. oncophora em combinação com QuilA enquanto o outro foi injetado três vezes com QuilA apenas. Após a última vacinação, todos os animais foram postos em um pasto que era naturalmente contaminado com larvas infecciosas de Cooperia oncophora e que era dividido em 12 lotes idênticos. Dois animais pertencentes ao mesmo grupo (controle ou vacinado) foram aleatoriamente designados a um lote, então 6 lotes para os animais controle e 6 lotes para os animais vacinados. Amostras fecais dos animais foram coletadas semanalmente para determinar a produção de ovo de C. oncophora.

2. Resultados 2.1. Excretoma/Secretoma de Cooperia oncophora de Estágio Adulto

[0072] Por razões de obtenção de resolução em gel adequada e separação de proteína completa por um lado, sem comprometer a sensibilidade, mais especificamente detecção de proteínas de pouca abundância, por outro lado, a requerente procurou aplicar duas técnicas complementares. Na primeira, por exemplo, separação eletroforética em gel bidimensional (2D-GE) da fração de proteína de ES de Cooperia oncophora de estágio adulto revelou vinte e cinco pontos de proteína claramente visíveis, agrupados em três grupos chamados HMW, MMW e LMW representando os grupos de proteína de pesos moleculares alto, médio e baixo aos quais eles pertencem respectivamente. Todos os pontos foram excisados e submetidos à identificação direcionada por espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI-MS), resultando na anotação bem-sucedida de vinte e dois pontos (razão de sucesso de 88%). Conforme sumarizado na Tabela 1 (e Tabela S1), mais de 90% da fração de HMW consistiam em uma proteína tipo proteína secretada associada à ativação de domínio duplo (ASP), exibindo alguma heterogeneidade em termos de valores de ponto isoelétrico (pl). Como para o teor de proteína, os grupos de proteína MMW e LMW parecem conter uma faixa mais ampla de proteínas. Mais particularmente, a fração MMW foi verificada contar três proteínas distintas, isto é, inexina, tiorredoxina peroxidase e uma proteína secretada associada com ativação (ASP), aqui em uma conformação de domínio único (40). O grupo de proteína LMW, por outro lado, apesar de exibir um grande número de pontos de proteína, na realidade compreende duas proteínas com funções ainda desconhecidas e três antígenos/proteínas ES de peso molecular baixo anteriormente documentados, conhecidos como antígeno de ES de 14 kDa, antígeno 1 de ES e antígeno 2 de ES (Tabela 1). Dado o alto grau de complexidade em termos de número e distribuição de ponto 2D-GE, os últimos são esperados carregar variação e/ou modificações químicas de sequência de aminoácido extensas, desta maneira fornecendo um número considerável de isoformas de proteína ambos em termos de massa molecular e valores pI.

[0073] Em paralelo à análise eletroforética 2D a requerente escolheu fracionar o proteoma de ES de C. oncophora adulto através de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (Size Exclusion Chromatography) principalmente por duas razões: i) através da aplicação de tal fluxo de trabalho preparativo, quantidades suficientes de todas as três frações (HMW, MMW e LMW) foram obtidas e ii) através de análise eletroforética em gel unidimensional (1D-GE) das frações obtidas de SEC proteínas de pouca abundância, que podem ter sido não detectáveis ou mascaradas em 2D-GE, devem ser tornar mais visíveis e podem então expandir o conjunto de dados obtido. Na verdade, enquanto no geral uma distribuição de proteína similar foi notada quando da comparação das duas metodologias, fracionamento de SEC seguido por análise 1D-GE realmente revelou a presença de várias proteínas de ES adicionais. Conforme sumarizado na Tabela 1 (e Tabela S2), identificação espectrométrica de massa das faixas de proteína demonstrou que, além da ASP de domínio duplo, a porção HMW mantém ainda quantidades muito baixas da ‘proteína hipotética’, que foi curiosamente observada apenas sob condições de redução. Similarmente, a abordagem cromatográfica de exclusão de tamanho não mascarou duas proteínas adicionais no grupo de proteína MMW, particularmente aldose redutase e a proteína 2 específica de estágio parasítico, a última sem nenhuma informação funcional atualmente disponível. Em contraste com frações HMW e MMW, o grupo de peso molecular baixo não foi revelado conter quaisquer proteínas adicionais àquelas reveladas quando da análise de 2D-PAGE.

[0074] Notadamente, ambas as ASPs de domínio único e duplo foram observadas migrar como dupletos quando da separação eletroforética em gel unidimensional das frações HMW e MMW, respectivamente (dados não mostrados). Tabela 1 Anotação direcionada por MS do excretoma/secretoma de Cooperia de estágio adulto As partes superior, média e inferior da tabela refletem as frações de ES HMW, MMW e LMW, respectivamente.

a Baseado em pesquisa BLASTP b Previsão de secreção de proteína usando as sequências de proteína de comprimento integral conforme determinado neste estudo ou quando disponível no GenBank (indicado com um asterisco). SP: Presença de um peptídeo de sinal conforme determinado por SignalP3.0; NC: Proteína secretora não clássica conforme determinado por SecretomeP 2.0; N: Não secretado c A presença de possíveis sítios de N-glicosilação conforme determinado por análise NetNGlyc 1.0 usando as sequências de proteína de comprimento integral conforme determinado neste estudo (Y: sim; N: Não) (número de sítios de consenso encontrados na sequência de aminoácido é dado entre parênteses) d Valores Mr e pI foram determinados usando a ferramenta de cálculo de peso molecular e ponto isoelétrico ExPASy. Valores correspondendo a proteínas de comprimento integral são providos. Clivagem de peptídeo de sinal possível não foi levada em consideração. Tabela S1. Anotação direcionada por MS do proteoma de ES de Cooperia oncophora, conforme revelado através de 2D-PAGE.

Tabela S2. Identificação MS de faixas de proteina encontradas nas três frações de SEC

.2. Complexos de Multiproteína no Proteoma de ES Adulto

[0075] Enquanto as condições de redução aplicadas em 2D-GE dificultaram sua observação, intrigantemente, quando comparando perfis de migração de 1D-GE de redução com não redução, traços de espécies oligoméricas baseadas em ponte dissulfeto foram mostrados estar presentes na fração de proteína HMW. Esta constatação foi corroborada sob análise eletroforética em gel nativa unidimensional. Uma vez que quaisquer peptídeos que não aqueles se originando de ASP de domínio duplo foram notados sob análise MALDI-MS (Tabela S2) e eletroforese em gel de poliacrilamida de porcentagem menor desta espécie oligomérica demonstrou seu peso molecular de aproximadamente 140 kDa, a requerente conclui uma conformação de ASP de domínio duplo homodimérica para esta população de proteína de baixa abundância.

2.3. Vacinação de Vitelos com Subfração de ES de HMW

[0076] Quando da condução do teste de vacinação foi registrada a média dependente do tempo de evolução de contagem de ovos por grama de fezes (EPG) (Egg-Count per Grama) para o grupo HMW, conforme mostrado na Figura 2. Quando comparado com o grupo controle, as contagens de ovos para o grupo vacinado com HMW foram drasticamente menores (P < 0,01) durante todo o experimento, fornecendo níveis de redução de EPG tão altos quanto 91% (Tabela 2). Enquanto carga de verme pós-necropsia foi verificada não diferir significantemente entre os grupos controle e HMW, o grupo HMW realmente mostrou porcentagens significantemente maiores de larvas L4 inibidas (29,4%) (Tabela 2). Finalmente, o comprimento de verme adulto fêmea e macho foi avaliado, com aqueles encontrados nos animais tratados com HMW medidos como consideravelmente menores quando comparado com o grupo controle (P < 0,05; Tabela 2).

[0077] A Figura 4 mostra as contagens de ovo de C. oncophora cumulativas para o teste de campo após um período de 5 meses no pasto e novamente demonstra que as contagens de ovo para o grupo vacinado com HMW são significantemente menores (redução de 70%) comparado com o grupo controle. Dados individuais para o teste de campo são como segue: Controles Vacinados 1519 5673 11246 3278 9011 138 13167 7311 10533 3022 7505 1776 Tabela 2 Visão geral de parâmetros parasitológicos obtidos durante e após o teste de vacinação n, número de animais; EPG, contagens de ovos cumulativas médias; % L4, porcentagem de vermes L4 observados em contagem de verme pós-necropsia. Todos os valores representam médias aritméticas (+ faixa experimentalmente observada).

* P < 0,05, ** P < 0,01; F, fêmea; M, macho.

2.4. Respostas Imunes

[0078] Quando comparado com o grupo controle, a subfração de ES de HMW foi verificada causar níveis significantemente maiores de níveis de IgG1 específicos de Cooperia em soro de animais correspondentemente imunizados (P < 0,01) (Figura 3). Ainda, embora níveis de IgG2 fossem consistentemente muito menores (aprox. 15 vezes) quando comparado com intensidades de IgG1, a fração de HMW foi não obstante mostrada carregar quantidades significantemente maiores de IgG2 (P < 0,01), com relação ao grupo controle.

2.5. Determinação e Caracterização In silico de Sequências de Aminoácido de Comprimento Integral

[0079] Embora o genoma de Cooperia oncophora completo não tenha sido ainda totalmente desvendado, o banco de dados do transcriptoma de C. oncophora recentemente obtido (33) ofereceu um alternativa mais do que adequada uma vez que, após tê-lo empregado em identificação de proteína direcionada por MS, a requerente foi capaz de estender essas sequências contig/isotig obtidas ao alinhá-las com as de sobreposição, continuando até que os códons de início e parada fossem atingidos. Esta abordagem provou ser bem-sucedida para nove das eventualmente doze proteínas diferentes presentes no excretoma/secretoma de C. oncophora adulto (Tabela 1). Para duas proteínas, mais especificamente a proteína hipotética de HMW (isotig27828; homologia mais alta com a proteína hipotética de Caenorhabditis remanei; número de acesso GenBank XP_003114672) e inexina (isotig12080; homologia mais alta com a inexina de C. remanei; número de acesso GenBank XP_003096841.1), a requerente foi incapaz de estender suas sequências até comprimento integral e, com base em homologia em outras espécies, elas são esperadas não ter os aminoácidos 733 e 160 nos terminais N, respectivamente. Por fim, enquanto análises espectrométricas de massa inicialmente identificaram apenas peptídeos do domínio C-terminal da ASP de domínio duplo, ao aplicar técnicas de PCR a requerente foi capaz de revelar sua sequência até comprimento quasi integral, isto é, com base em seu homólogo de Cooperia punctada (AAK35199.1), além de um peptídeo de sinal de 21 resíduos. Os terminais N e C da ASP de domínio duplo identificada consistem nos aminoácidos LCSLDNGMT (SEQ ID NO: 14) e DEDCKCSSCRCSTQLSMCINPN (SEQ ID NO: 15), respectivamente.

[0080] Como uma caracterização in silico bruta inicial, previsão de sequência de sinal direcionada por software, combinada com pesquisas de sítio de consenso de glicosilação N-ligado, revelou apenas as ASPs de domínio duplo e único e os antígenos de ES de LMW como potencialmente carregando porções açúcar (Tabela 1). Análise in silico adicional das sequências de comprimento integral obtidas forneceu valores de peso molecular correspondendo bem àqueles observadas em gel.

2.6. Análise de Glicano do Proteoma de ES de Cooperia oncophora

[0081] Glicosilação de ES total foi estudada através de análise MS MALDI-TOF quando da liberação das porções glicano N- e O-ligadas. Enquanto um conjunto claro de glicanos liberados por PNGase F foi detectado, quaisquer sinais puderam ser detectados na liberação específica de PNGase A (dados não mostrados), desta maneira indicando que quaisquer quantidades significantes de N-glicanos com modificações de fucose 1-3 ligadas da N-acetilglicosamina ligada à asparagina (GlcNAc) estão presentes no excretoma/secretoma de C. oncophora adulto. Com relação à preparação de O-glicano, apenas pequenos sinais foram detectados (dados não mostrados). Para obter mais informação sobre a presença de porções glicano em proteínas específicas na fração de ES de C. oncophora, os N- e O-glicanos, liberados dos grupos de proteína LMW, MMW e HMW foram analisados através de espectrometria de massa MALTI-de tempo de voo (TOF). Enquanto quaisquer quantidades significantes de N- glicanos puderam ser detectadas nas frações LMW e HMW, os sinais de N-glicano principais observados no grupo de ES total foram também verificados estar presentes no espectro de N-glicano MMW. Por outro lado, níveis marginais de sinais de O-glicano foram detectados na fração de HMW exclusivamente. No entanto, esses sinais não puderam ser designados a estruturas O-glicano comuns (nem mesmo putativas) e então não foram investigados adicionalmente.

[0082] Usando a massa monoisotópica de cada um dos picos de N-glicano observados, composições de monossacarídeo foram atribuídas e estruturas putativas deduzidas. Sinais maiores detectados no espectro de N-glicanos de MMW que também apareceram no espectro de N-glicano de ES total foram derivados de porções glicano com as composições F1H3N2, H5N2, H6N2 e H7N2 em valores m/z de 1176,4, 1354,4, 1516,5 e 1678,5 [M-H]-, respectivamente (F, fucose, Fuc; H, hexose, Hex; N, N-acetilexosamina, HexNAc). Essas composições são indicativas para um glicano fucosilado no núcleo, paucimanosídico, (F1H3N2) e uma série de glicanos de oligomanose Man5-7GlcNAc2 (Man, manose). Para confirmar essas designações uma amostra dos N-glicanos de MMW foi incubada com α- manosidase, levando a um espectro contendo sinais detectáveis apenas em m/z 706,3 e 852,3 para H1N2 (Man1GlcNAc2) e F1H1N2 (Fuc1Man1GlcNAc2), desta maneira confirmando a presença das extensões de manose na amostra não tratada.

[0083] Impelida pela presença de um sítio de N-glicosilação putativo na ASP de domínio único no grupo de proteína MMW (Tabela I), a requerente submeteu os glicopeptídeos trípticos derivados da fatia de gel de domínio único correspondente à análise MS/MS de cromatografia nano-líquida (LC) (Liquid Chromatography). Os dados obtidos foram interrogados quanto à presença de peptídeos glicosilados através da pesquisa por espectros MS/MS contendo os íons de fragmento de glicano comuns H1N1 (m/z 366,1 [M+H]+) e H2N1 (m/z 528,2 [M+H]+). Interessantemente, uma série de íons parentais foi detectada, que poderiam ser designados às glicoformas H5N2, H6N2 e H7N2 do peptídeo tríptico de ASP de domínio único (WNCTLEAK (1021,5[M+H]+), com cisteína como derivado carbamidometila) com base em: i) massa geral do glicopeptídeos e ii) espectros de fragmento de dissociação induzida por colisão mostrando os padrões de fragmentação das ligações glicosídicas em cada glicoforma de peptídeo. Uma visão geral de porções de glicopeptídeo detectadas e fragmentadas derivadas da mesma fatia de gel é provida na Tabela S3. A partir de m/z 1201,1 [M+2H]2+ do íon parental uma série clara de íons de fragmento de [M+H]2+ indicou a perda de seis resíduos hexose e uma N-acetilexosamina (HexNAc), deixando o íon de fragmento de peptídeo correspondente com um resíduo de N-acetil- glicosamina único (GlcNAc) ligado ao resíduo asparagina em m/z 612,8. Espectros similares (mas menos intensos) foram obtidos para as glicoforma H5N2 e H7N2 do mesmo peptídeo, indicando que os N- glicanos Man5-7GlcNAc2 liberados das proteínas MMW estão presentes em um sítio de glicosilação único da ASP de domínio único.

[0084] Variantes de glicopeptídeo detectadas na digestão tríptica da ASP de domínio único, analisadas por MS/MS. Glicoformas diferentes de acordo com o perfil de N-glicano de ES de MMW foram detectadas, com as glicoforma H5N2 e H6N2 dando origem às intensidades de íon mais altas.

3. Discussão

[0085] Combinação das identificações obtidas por MALDI-MS de fracionamento cromatográfico eletroforético de gel bidimensional e de exclusão de tamanho do excretoma/secretoma de Cooperia oncophora de estágio adulto forneceu doze proteínas diferentes distribuídas em três grupos de peso molecular distinto (Tabela 1). Embora um total de doze proteínas possa parecer modesto comparado com as frações de ES de outros helmintos tais como Ascarius suum (41), Schistosoma japonicum (42) e Haemonchus contortus (43), frequentemente revelando até cem ou mais proteínas diferentes em seu excretoma/secretoma, tais diferenças quantitativas podem surgir de uma combinação de: i) A interface hospedeiro-verme diferindo substancialmente entre parasitas e então apresentando desafios específicos durante a infecção e ii) excretoma/secretoma de alguns helmintos já tendo sido desenvolvido mais, com proteínas potencialmente redundantes eliminadas e/ou proteínas de alta atividade cruciais tendo sido enriquecidas. Não obstante, embora várias proteínas com funções desconhecidas tenham sido identificadas, o excretoma/secretoma de C. oncophora também carrega um conjunto de proteínas que foram anteriormente notadas em outros nematoides/helmintos e cujas funções foram (parcialmente) elucidadas. Dentre aquelas onde se encontra aldose redutase e tiorredoxina peroxidase, duas proteínas conhecidas como estando envolvidas em mecanismos de desintoxicação, a primeira convertendo o metilglioxal mutagênico e tóxico, um subproduto de glicose, em acetol (44) e a última agindo como um antioxidante que elimina espécies oxigênio reativas geradas durante metabolismo de oxigênio, processos oxidativos e respostas imunes de hospedeiro (45). Outra proteína documentada que foi identificada da fração de ES de C. oncophora adulto é inexina (Pfam: PF00876), um invertebrado equivalente à família conexina de moléculas. Essas proteínas de junção de lacuna que, quando da oligomerização, formam canais intercelulares através dos quais íons e moléculas pequenas podem passar, desta maneira permitindo comunicação intercelular (46).

[0086] Além das duas moléculas ainda não anotadas (isotig32303 e isotig10739), a requerente ainda revelou o grupo de ponto de peso molecular baixo (LMW) como essencialmente consistindo em três proteínas diferentes, isto é, proteína de ES de 14 kDa, proteína de antígeno 1 de ES antígeno 2 de ES. Surpreendentemente, embora funcionalmente ainda pobremente caracterizado, este conjunto de proteínas viu anteriormente seus equivalentes de Cooperia punctata sugeridos como candidatos potenciais à vacina (47), no entanto, quaisquer relatos de um resultado bem-sucedido foram publicados. O motivo dessas proteínas exibe tal diversidade extensiva, conforme visto em seu perfil de ponto de 2D-GE, permanece elusivo, mas foi tomado como hipótese que isso pode criar diversidade antigênica e/ou um conjunto de proteínas redundantes que podem ser eliminadas através da resposta imune do hospedeiro sem efeitos prejudiciais sérios sobre viabilidade do parasita (47).

[0087] Interessantemente, ambas as frações de HMW e MMW foram verificadas ter um tipo de proteína em comum, isto é, elas trnasportam, cada uma, uma proteína secretada associada com ativação (ASP). Tais proteínas constituem um subgrupo específico de Strongylida da superfamília de proteína CAP (também chamada proteínas de glicoproteína de célula de esperma/Tpx-1/Ag5/PR-1/Sc7 (SCP/TAPS); Pfam PF00188), que exibe uma diversidade extrema ambos em ocorrência, compreendendo procariontes e eucariontes, e função, tendo sido mostrada estar envolvida em processos tão diversos quanto reprodução, câncer e regulação imune (48). Até agora, no entanto, a função biológica verdadeira de ASPs permanece ainda enigmática, apesar de esforços substanciais tendo sido recentemente feitos (49-54), e embora pesquisa neste campo particular ainda esteja em sua infância, algumas ASPs foram testadas em testes de vacinação, ambas em suas formas nativa e recombinante (55-58). Ainda, ASPs foram encontradas em três configurações: i) como ASPs de domínio duplo, composta de dois domínios CAP relacionados, mas distintos, ii) como ASPs de domínio único tipo C e iii) como ASPs de domínio único tipo N, a segunda e a última carregando a maior homologia com os terminais C e N das ASPs de domínio duplo, respectivamente (51). O estudo da requerente do excretoma/secretoma de C. oncophora adulto forneceu uma ASP de domínio duplo como parte do grupo de HMW e uma ASP de domínio único, pertencente ao grupo MMW (Tabela 1). Enquanto a ASP de domínio duplo foi prevista carregar uma sequência de sinal e carregar dois sítios aceitadores de consenso para glicosilação N-ligada, ela foi revelada não carregar nenhuma de tais porções. Ainda, quando da análise 2D-GE, uma sucessão de quatro pontos distintos foi observada, todos correspondiam a esta ASP de domínio duplo, refletindo um nível de diversidade de sequência, como é adicionalmente revelado aqui. Enquanto sem ser notado quando da análise 2D-GE, o padrão de migração de gel unidimensional para a ASP de domínio duplo mostrou um dupleto sob ambas as condições de redução e não redução. Uma vez que ela não carrega quaisquer porções açúcar, esta observação pode ser atribuída a processamento parcial do peptídeo de sinal. Talvez a observação mais surpreendente com relação a esta ASP de domínio duplo tenha sido uma pequena porção dela migrando como um dímero, exclusivamente quando de eletroforese em gel de não redução, desta maneira implicando nela ser baseada em ponte dissulfeto. Enquanto ASPs de domínio único são conhecidas dimerizar em solução (49), essas são as primeiras indicações de uma ASP de domínio duplo imitando este comportamento.

[0088] Em contraste com sua contraparte de domínio duplo, a ASP de domínio único, conforme encontrado no grupo de proteína MMW, não exibiu quaisquer sinais de diversidade de sequência ou oligomerização detectáveis. Interessantemente, previsões in silico corroborativas em termos de sequência de sinal e sítios de consenso de N-glicosilação, a ASP de domínio único foi na verdade mostrada carregar uma porção glicano N-ligada em Asn93. Embora seu impacto geral sobre estrutura de proteína e imunogenicidade deva ainda ser conclusivamente determinado, a estrutura do grupo glicano foi verificada lembrar aquela da ASP de domínio único de Ostertagia ostertagi (53), cuja estrutura de cristal foi recentemente determinada e sugere um papel estrutural modal para a porção glicano. Análogo à ASP de domínio duplo, quando da análise eletroforética de gel unidimensional da ASP de domínio único, um dupleto de faixas foi observado com a faixa de peso molecular menor muito menos abundante quando comparado com a situação de ASP de domínio duplo onde ambas as faixas do dupleto eram quase igualmente intensas. Possivelmente, a faixa de ASP de domínio único menor representa a proteína destituída de sua porção glicano ligada a Asn93.

[0089] O teste de vacinação da requerente mostrou que a fração de proteína HMW, consistindo essencialmente na ASP de domínio duplo, é particularmente útil para desenvolvimento de vacina, com níveis de redução de EPG ultrapassando 90%, drasticamente inibiu larvas L4 e realizou diminuições substanciais em comprimento de verme quando comparado com o grupo controle (Tabela 2). Além disso, em soro de vitelos imunizados os níveis de IgG1 são elevados quando da sua administração, com também uma resposta de IgG2 marginal (Figura 3). Finalmente, vacinação com a fração de HMW conferiu proteção contra uma infecção natural com Cooperia oncophora em um teste de campo.

[0090] Concluindo, a ASP de domínio duplo fornece níveis de proteção substanciais e exibe baixa complexidade em termos de modificações pós-traducionais, desta maneira facilitando seu processo de extrapolação recombinante. Conforme acima mencionado, a fração de HMW eficaz empregada no teste de vacina consistia principalmente na ASP de domínio duplo e é um componente de vacina para Cooperia oncophora preferido. Referências 1. Kloosterman, A., Albers, G. A., and van den Brink, R. (1984) Negative interactions between Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora in calves. Vet Parasitol 15, 135-150. 2. Coles, G. C., and Klei, T. R. (1995) Animal parasites, politics and agricultural research. Parasitol Today 11, 276-278. 3. Michel, J. F. (1976) The epidemiology and control of some nematode infections in grazing animals. Adv Parasitol 14, 355397. 4. Lawrence, J. D. a. I., M.A. (2007) Economic analysis of pharmaceutical technologies in modern beef production. NCCC-134 meeting on Applied Commodity Price Analysis, Forecasting and Market Risk Management, April 16-17, 2007, Chicago. 5. Anziani, O. S., Suarez, V., Guglielmone, A. A., Warnke, O., Grande, H., and Coles, G. C. (2004) Resistance to benzimidazole and macrocyclic lactone anthelmintics in cattle nematodes in Argentina. Vet Parasitol 122, 303-306. 6. Condi, G. K., Soutello, R. G., and Amarante, A. F. (2009) Moxidectin-resistant nematodes in cattle in Brazil. Vet Parasitol 161, 213-217. 7. Demeler, J., Van Zeveren, A. M., Kleinschmidt, N., Vercruysse, J., Hoglund, J., Koopmann, R., Cabaret, J., Claerebout, E., Areskog, M., and von Samson-Himmelstjerna, G. (2009) Monitoring the efficacy of ivermectin and albendazole against gastro intestinal nematodes of cattle in Northern Europe. Vet Parasitol 160, 109-115. 8. El-Abdellati, A., Geldhof, P., Claerebout, E., Vercruysse, J., and Charlier, J. (2010) Monitoring macrocyclic lactone resistance in Cooperia oncophora on a Belgian cattle farm during four consecutive years. Vet Parasitol 171, 167-171. 9. Waghorn, T. S., Leathwick, D. M., Rhodes, A. P., Jackson, R., Pomroy, W. E., West, D. M., and Moffat, J. R. (2006) Prevalence of anthelmintic resistance on 62 beef cattle farms in the North Island of New Zealand. N Z Vet J 54, 278-282. 10. Bungiro, R., and Cappello, M. (2004) Hookworm infection: new developments and prospects for control. Curr Opin Infect Dis 17, 421-426. 11. Abraham, D., Leon, O., Leon, S., and Lustigman, S. (2001) Development of a recombinant antigen vaccine against infection with the filarial worm Onchocerca volvulus. Infect Immun 69, 262-270. 12. MacDonald, A. J., Tawe, W., Leon, O., Cao, L., Liu, J., Oksov, Y., Abraham, D., and Lustigman, S. (2004) Ov-ASP-1, the Onchocerca volvulus homologue of the activation associated secreted protein family is immunostimulatory and can induce protective anti- larval immunity. Parasite Immunol 26, 53-62. 13. Taylor, M. J., Jenkins, R. E., and Bianco, A. E. (1996) Protective immunity induced by vaccination with Onchocerca volvulus tropomyosin in rodents. Parasite Immunol 18, 219-225. 14. Wu, Y., Egerton, G., Pappin, D. J., Harrison, R. A., Wilkinson, M. C., Underwood, A., and Bianco, A. E. (2004) The Secreted Larval Acidic Proteins (SLAPs) of Onchocerca spp. are encoded by orthologues of the alt gene family of Brugia malayi and have host protective potential. Mol Biochem Parasitol 134, 213-224. 15. Islam, M. K., Miyoshi, T., and Tsuji, N. (2005) Vaccination with recombinant Ascaris suum 24-kilodalton antigen induces a Th1/Th2-mixed type immune response and confers high levels of protection against challenged Ascaris suum lung-stage infection in BALB/c mice. Int J Parasitol 35, 1023-1030. 16. Tsuji, N., Suzuki, K., Kasuga-Aoki, H., Isobe, T., Arakawa, T., and Matsumoto, Y. (2003) Mice intranasally immunized with a recombinant 16-kilodalton antigen from roundworm Ascaris parasites are protected against larval migration of Ascaris suum. Infect Immun 71, 5314-5323. 17. Tsuji, N., Suzuki, K., Kasuga-Aoki, H., Matsumoto, Y., Arakawa, T., Ishiwata, K., and Isobe, T. (2001) Intranasal immunization with recombinant Ascaris suum 14-kilodalton antigen coupled with cholera toxin B subunit induces protective immunity to A. suum infection in mice. Infect Immun 69, 7285-7292. 18. Redmond, D. L., and Knox, D. P. (2004) Protection studies in sheep using affinity-purified and recombinant cysteine proteinases of adult Haemonchus contortus. Vaccine 22, 4252-4261. 19. Redmond, D. L., and Knox, D. P. (2006) Further protection studies using recombinant forms of Haemonchus contortus cysteine proteinases. Parasite Immunol 28, 213-219. 20. Winter, J. A., Davies, O. R., Brown, A. P., Garnett, M. C., Stolnik, S., and Pritchard, D. I. (2005) The assessment of hookworm calreticulin as a potential vaccine for necatoriasis. Parasite Immunol 27, 139-146. 21. Lightowlers, M. W. (2006) Vaccines against cysticercosis and hydatidosis: foundations in taeniid cestode immunology. Parasitol Int 55 Suppl, S39-43. 22. Lightowlers, M. W., Gauci, C. G., Chow, C., Drew, D. R., Gauci, S. M., Heath, D. D., Jackson, D. C., Dadley-Moore, D. L., and Read, A. J. (2003) Molecular and genetic characterisation of the host-protective oncosphere antigens of taeniid cestode parasites. Int J Parasitol 33, 1207-1217. 23. Plancarte, A., Flisser, A., Gauci, C. G., and Lightowlers, M. W. (1999) Vaccination against Taenia solium cysticercosis in pigs using native and recombinant oncosphere antigens. Int J Parasitol 29, 643-647. 24. Hillyer, G. V. (2005) Fasciola antigens as vaccines against fascioliasis and schistosomiasis. J Helminthol 79, 241-247. 25. Abane, J. L., Oleaga, A., Ramajo, V., Casanueva, P., Arellano, J. L., Hillyer, G. V., and Muro, A. (2000) Vaccination of mice against schistosoma bovis with a recombinant fatty acid binding protein from Fasciola hepatica. Vet Parasitol 91, 33-42. 26. Boulanger, D., Schneider, D., Chippaux, J. P., Sellin, B., and Capron, A. (1999) Schistosoma bovis: vaccine effects of a recombinant homologous glutathione S-transferase in sheep. Int J Parasitol 29, 415-418. 27. Boulanger, D., Trottein, F., Mauny, F., Bremond, P., Couret, D., Pierce, R. J., Kadri, S., Godin, C., Sellin, E., Lecocq, J. P., and et al. (1994) Vaccination of goats against the trematode Schistosoma bovis with a recombinant homologous schistosome- derived glutathione S-transferase. Parasite Immunol 16, 399-406. 28. Loukas, A., Tran, M., and Pearson, M. S. (2007) Schistosome membrane proteins as vaccines. Int J Parasitol 37, 257263. 29. Pacifico, L. G., Fonseca, C. T., Chiari, L., and Oliveira, S. C. (2006) Immunization with Schistosoma mansoni 22.6 kDa antigen induces partial protection against experimental infection in a recombinant protein form but not as DNA vaccine. Immunobiology 211, 97-104. 30. Tran, M. H., Pearson, M. S., Bethony, J. M., Smyth, D. J., Jones, M. K., Duke, M., Don, T. A., McManus, D. P., Correa- Oliveira, R., and Loukas, A. (2006) Tetraspanins on the surface of Schistosoma mansoni are protective antigens against schistosomiasis. Nat Med 12, 835-840. 31. Elliott, D. E., Summers, R. W., and Weinstock, J. V. (2007) Helminths as governors of immune-mediated inflammation. Int J Parasitol 37, 457-464. 32. Haffner, A., Guilavogui, A. Z., Tischendorf, F. W., and Brattig, N. W. (1998) Onchocerca volvulus: microfilariae secrete elastinolytic and males nonelastinolytic matrix-degrading serine and metalloproteases. Exp Parasitol 90, 26-33. 33. Martin, J., Abubucker, S., Heizer, E., Taylor, C. M., and Mitreva, M. (2012) Nematode.net update 2011: addition of data sets and tools featuring next-generation sequencing data. Nucleic Acids Res 40, D720-728. 34. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680685. 35. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., and Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410. 36. Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G., and Brunak, S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340, 783-795. 37. Bendtsen, J. D., Jensen, L. J., Blom, N., Von Heijne, G., and Brunak, S. (2004) Feature-based prediction of non-classical and leaderless protein secretion. Protein Eng Des Sel 17, 349-356. 38. Ruhaak, L. R., Steenvoorden, E., Koeleman, C. A., Deelder, A. M., and Wuhrer, M. (2010) 2-picoline-borane: a non-toxic reducing agent for oligosaccharide labeling by reductive amination. Proteomics 10, 2330-2336. 39. Geldhof, P., Claerebout, E., Knox, D., Vercauteren, I., Looszova, A., and Vercruysse, J. (2002) Vaccination of calves against Ostertagia ostertagi with cysteine proteinase enriched protein fractions. Parasite Immunol 24, 263-270. 40. Yatsuda, A. P., Eysker, M., Vieira-Bressan, M. C., and De Vries, E. (2002) A family of activation associated secreted protein (ASP) homologues of Cooperia punctata. Res Vet Sci 73, 297-306. 41. Islam, M. K., Miyoshi, T., Yokomizo, Y., and Tsuji, N. (2004) The proteome expression patterns in adult Ascaris suum under exposure to aerobic/anaerobic environments analyzed by twodimensional electrophoresis. Parasitol Res 93, 96-101. 42. Liu, F., Cui, S. J., Hu, W., Feng, Z., Wang, Z. Q., and Han, Z. G. (2009) Excretory/secretory proteome of the adult developmental stage of human blood fluke, Schistosoma japonicum. Mol Cell Proteomics 8, 1236-1251. 43. Yatsuda, A. P., Krijgsveld, J., Cornelissen, A. W., Heck, A. J., and de Vries, E. (2003) Comprehensive analysis of the secreted proteins of the parasite Haemonchus contortus reveals extensive sequence variation and differential immune recognition. J Biol Chem 278, 16941-16951. 44. Rath, J., Gowri, V. S., Chauhan, S. C., Padmanabhan, P. K., Srinivasan, N., and Madhubala, R. (2009) A glutathione-specific aldose reductase of Leishmania donovani and its potential implications for methylglyoxal detoxification pathway. Gene 429, 1-9. 45. Lu, W., Egerton, G. L., Bianco, A. E., and Williams, S. A. (1998) Thioredoxin peroxidase from Onchocerca volvulus: a major hydrogen peroxide detoxifying enzyme in filarial parasites. Mol Biochem Parasitol 91, 221-235. 46. Phelan, P., Bacon, J. P., Davies, J. A., Stebbings, L. A., Todman, M. G., Avery, L., Baines, R. A., Barnes, T. M., Ford, C., Hekimi, S., Lee, R., Shaw, J. E., Starich, T. A., Curtin, K. D., Sun, Y. A., and Wyman, R. J. (1998) Innexins: a family of invertebrate gapjunction proteins. Trends Genet 14, 348-349. 47. Yatsuda, A. P., De Vries, E., Vieira Bressan, M. C., and Eysker, M. (2001) A Cooperia punctata gene family encoding 14 kDa excretory-secretory antigens conserved for trichostrongyloid nematodes. Parasitology 123, 631-639. 48. Gibbs, G. M., Roelants, K., and O'Bryan, M. K. (2008) The CAP superfamily: cysteine-rich secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 proteins--roles in reproduction, cancer, and immune defense. Endocr Rev 29, 865-897. 49. Asojo, O. A. (2011) Structure of a two-CAP-domain protein from the human hookworm parasite Necator americanus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 455-462. 50. Asojo, O. A., Goud, G., Dhar, K., Loukas, A., Zhan, B., Deumic, V., Liu, S., Borgstahl, G. E., and Hotez, P. J. (2005) X-ray structure of Na-ASP-2, a pathogenesis-related-1 protein from the nematode parasite, Necator americanus, and a vaccine antigen for human hookworm infection. J Mol Biol 346, 801-814. 51. Geldhof, P., Vercauteren, I., Gevaert, K., Staes, A., Knox, D. P., Vandekerckhove, J., Vercruysse, J., and Claerebout, E. (2003) Activation-associated secreted proteins are the most abundant antigens in a host protective fraction from Ostertagia ostertagi. Mol Biochem Parasitol 128, 111-114. 52. Hawdon, J. M., Jones, B. F., Hoffman, D. R., and Hotez, P. J. (1996) Cloning and characterization of Ancylostoma- secreted protein. A novel protein associated with the transition to parasitism by infective hookworm larvae. J Biol Chem 271, 6672-6678. 53. Meyvis, Y., Callewaert, N., Gevaert, K., Timmerman, E., Van Durme, J., Schymkowitz, J., Rousseau, F., Vercruysse, J., Claerebout, E., and Geldhof, P. (2008) Hybrid N-glycans on the host protective activation-associated secreted proteins of Ostertagia ostertagi and their importance in immunogenicity. Mol Biochem Parasitol 161, 67-71. 54. Osman, A., Wang, C. K., Winter, A., Loukas, A., Tribolet, L., Gasser, R. B., and Hofmann, A. (2011) Hookworm SCP/TAPS protein structure-A key to understanding host-parasite interactions and developing new interventions. Biotechnol Adv. 55. Geldhof, P., Meyvis, Y., Vercruysse, J., and Claerebout, E. (2008) Vaccine testing of a recombinant activation- associated secreted protein (ASP1) from Ostertagia ostertagi. Parasite Immunol 30, 57-60. 56. Goud, G. N., Zhan, B., Ghosh, K., Loukas, A., Hawdon, J., Dobardzic, A., Deumic, V., Liu, S., Dobardzic, R., Zook, B. C., Jin, Q., Liu, Y., Hoffman, L., Chung-Debose, S., Patel, R., Mendez, S., and Hotez, P. J. (2004) Cloning, yeast expression, isolation, and vaccine testing of recombinant Ancylostoma-secreted protein (ASP)-1 and ASP-2 from Ancylostoma ceylanicum. J Infect Dis 189, 919-929. 57. Mendez, S., Zhan, B., Goud, G., Ghosh, K., Dobardzic, A., Wu, W., Liu, S., Deumic, V., Dobardzic, R., Liu, Y., Bethony, J., and Hotez, P. J. (2005) Effect of combining the larval antigens Ancylostoma secreted protein 2 (ASP-2) and metalloprotease 1 (MTP-1) in protecting hamsters against hookworm infection and disease caused by Ancylostoma ceylanicum. Vaccine 23, 3123-3130. 58. Meyvis, Y., Geldhof, P., Gevaert, K., Timmerman, E., Vercruysse, J., and Claerebout, E. (2007) Vaccination against Ostertagia ostertagi with subfractions of the protective ES-thiol fraction. Vet Parasitol 149, 239-245. 59. Geldhof, P., De Maere, V., Vercruysse, J., Claerebout, E. Recombinant expression systems: the obstacle to helminth vaccines? Trends in Parasitology 2007 23:527-532 60. J Clin Microbiol. 1997 Jul;35(7):1728-33. Use of cloned excretory/secretory low-molecular-weight proteins of Cooperia oncophora in a serological assay. Poot J, Kooyman FN, Dop PY, Schallig HD, Eysker M, Cornelissen AW. 61. Int J Parasitol. 2003 Nov;33(13):1503-14. T-cell mediated immune responses in calves primary-infected or re-infected with Cooperia oncophora: similar effector cells but different timing. Kanobana K, Koets A, Bakker N, Ploeger HW, Vervelde L. 62. Panicali et al; PNAS USA 79, 4927 (1982). 63. Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057 (1980). 64. Chang, et al., Nature, 275, 615 (1978). 65. Nakamura, K. and Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775 (1982). 66. Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688 (1983). 67. Nat Biotechnol. 2002 Dec;20(12):1265-8. Epub 2002 Nov 4. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences. De Jaeger G, Scheffer S, Jacobs A, Zambre M, Zobell O, Goossens A, Depicker A, Angenon G. 68. Jacobs et al., Nature protocols 2009 4:58-70. 69. Valerio, D. et al.; in Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. and Pluznik, D. H. (Eds.), Experimental Haematology today-1988. Springer Verlag, New York: pp. 92-99 (1989).

Claims

1. Sequência de ácido nucleico de DNA complementar (cDNA) isolada, caracterizada pelo fato de que tem a sequência de ácido nucleico conforme mostrada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou suas sequências de nucleotídeos degeneradas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

2. Sequência de ácido nucleico de DNA complementar (cDNA) isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem uma sequência de ácido nucleico conforme mostrada na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21, ou suas sequências de nucleotídeos degeneradas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

3. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de cDNA, como definida na reivindicação 1 ou 2, e um promotor funcionalmente ligado.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de cDNA, como definida na reivindicação 1, ou uma molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 3.

5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é um plasmídeo, bacteriófago, cosmídeo, vírus ou minicromossomo.

6. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de cDNA, como definida na reivindicação 1, uma molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 3, ou um vetor, como definido na reivindicação 4 ou 5, em que a referida célula hospedeira é uma célula bacteriana ou célula de levedura.

7. Ácido nucleico de cDNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção ou redução de uma infecção por Cooperia oncophora e/ou redução ou alívio de um ou mais sintomas de uma infecção por Cooperia oncophora.

8. Molécula de DNA recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção ou redução de uma infecção por Cooperia oncophora e/ou redução ou alívio de um ou mais sintomas de uma infecção por Cooperia oncophora.

9. Vetor, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é para uso na prevenção ou redução de uma infecção por Cooperia oncophora e/ou redução ou alívio de um ou mais sintomas de uma infecção por Cooperia oncophora.

10. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção ou redução de uma infecção por Cooperia oncophora e/ou redução ou alívio de um ou mais sintomas de uma infecção por Cooperia oncophora.

11. Uso do ácido nucleico, como definido na reivindicação 1 ou 2, da molécula de DNA recombinante, como definida na reivindicação 3, do vetor, como definido na reivindicação 4 ou 5, ou da célula hospedeira, como definida na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina contra infecção por Cooperia oncophora.

12. Vacina contra infecção por Cooperia oncophora, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um ácido nucleico de cDNA, como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

14. Vacina, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o referido adjuvante é selecionado dentre o grupo que consiste em Quil A, ISCOM, ISCOMATRIX, o sistema adjuvante RIBI, alúmen, gel de hidróxido de alumínio, colesterol, emulsão óleo em água, emulsão água em óleo, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, copolímero em bloco, SAF-M, adjuvante AMPHIGENO, saponina, saponina em combinação com um esterol, QS-21, GPI-0100, frações de saponina, dietilaminoetil (DEAE)-dextrano, polietileno glicol, ácido poliacrílico, hidroacetato de N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)- Noctadecildodecanoilamida, monofosforil lipídio A, adjuvante avridina lipídica-amina, enterotoxina termolábil de E. coli, toxina da cólera, dipeptídeo muramil e um imunomodulador.