BR112015006181B1 - sistema de citômetro de fluxo - Google Patents

Abstract

SISTEMA DE CITÔMETRO DE FLUXO E PONTA DE BOCAL A presente invenção se refere a uma ponta de bocal formada a partir de um corpo cilíndrico definindo um eixo longitudinal e um corpo troncocônico adjacente ao corpo cilíndrico sobre o eixo longitudinal. O corpo cilíndrico pode estar em comunicação fluida com o corpo troncocônico. O corpo troncocônico pode terminar em uma superfície plana com um orifício de saída do bocal, que é transversal ao eixo longitudinal. Pode haver um recorte na extremidade do corpo troncocônico e na superfície plana. O sistema de citômetro de fluxo também pode incluir uma fonte de radiação eletromagnética, para a produção de um feixe incidente sobre a corrente de fluido e as partículas e um detector para detectar a luz emitida ou refletida a partir das partículas dentro da corrente de fluido, em resposta ao feixe.

Description

[001] Este Pedido de Tratado de Cooperação de Patentes Internacional reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/842.310, depositado em 2 de julho de 2013, e do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/703.102, depositado em 19 de setembro de 2012 e do Pedido de Tratado de Cooperação de Patentes Internacional PCT/US2013/031787 depositado em 14 de março de 2013 em que todo o conteúdo dos quais está incorporado neste documento por referência.

Campo da invenção

[002] A presente invenção se refere genericamente ao campo da citometria de fluxo e mais particularmente se refere a melhoria das pontas dos bocais de sistemas de citômetro de fluxo permitindo a detecção mais próxima de um orifício de saída do bocal.

Antecedentes

[003] Os citômetros de fluxo são conhecidos para analisar e ordenar partículas e são particularmente adequados para medir as propriedades físicas e químicas de materiais biológicos, tais como células. Durante o funcionamento, um citômetro de fluxo produz uma corrente de fluido que encerra um fluido de amostra contendo partículas de interesse. Essas partículas podem ser inspecionadas individualmente na corrente de fluido através de uma variedade de sistemas de sensores ou dispositivos de detecção para classificação.

[004] Os citômetros de fluxo adaptados para ordenação fornecem adicionalmente um mecanismo para isolar as subpopulações de partículas com base nas suas propriedades medidas ou determinadas. Os citômetros de fluxo de jato em ar atingem esta separação através da criação e isolamento de gotículas carregadas contendo partículas de interesse. As gotículas contendo partículas podem ser formadas a partir da corrente de fluido e carregadas com base em uma decisão de ordenação e, à medida que passam através de um campo elétrico produzido por meio de placas de deflexão, o seu caminho é redirecionado para uma das várias trajetórias predeterminadas para recolha. A formação dessas gotículas pode ser alcançada em um bocal de citômetro de fluxo.

[005] Em adição à função de formação de gotículas, alguns bocais de citômetro de fluxo incluem uma geometria interior que influencia as partículas no sentido de uma orientação uniforme. A função de orientação permite a análise e ordenação de células com propriedades esféricas. Como um exemplo, as velocidades a que os espermatozoides podem ser ordenados em populações enriquecidas por gênero foram aumentadas, em parte, devido ao desenvolvimento de um bocal de orientação, que apresenta uma porção maior de espermatozoides para os detectores com uma orientação relativamente uniforme.

Sumário da invenção

[006] Certas modalidades da invenção reivindicada estão resumidas em baixo. Estas modalidades não se destinam a limitar o escopo da invenção reivindicada, mas ao invés servir como breves descrições de possíveis formas da invenção. A invenção pode englobar uma variedade de formas que diferem desses sumários.

[007] Uma modalidade se destina a um sistema de citômetro de fluxo que tem um conjunto de bocal para a produção de uma corrente de fluido com partículas. O conjunto de bocal pode ter uma ponta de bocal formada a partir de um corpo cilíndrico definindo um eixo longitudinal e um corpo troncocônico adjacente ao corpo cilíndrico sobre o eixo longitudinal. O corpo cilíndrico pode estar em comunicação fluida com o corpo troncocônico. O corpo troncocônico pode terminar em uma superfície plana com um orifício de saída do bocal, que é transversal ao eixo longitudinal. Pode haver um recorte na extremidade do corpo troncocônico e na superfície plana. O sistema de citômetro de fluxo também pode incluir uma fonte de radiação eletromagnética, para a produção de um feixe incidente sobre a corrente de fluido e as partículas e um detector para detectar a luz emitida ou refletida a partir das partículas dentro da corrente de fluido, em resposta ao feixe.

[008] Outra modalidade se relaciona com uma ponta de bocal possuindo um corpo cilíndrico definindo um eixo longitudinal. Um corpo troncocônico pode ser contíguo, e estar em comunicação fluida com o corpo cilíndrico sobre o eixo longitudinal. O corpo troncocônico pode terminar em uma superfície plana possuindo um orifício de saída do bocal transversal ao eixo longitudinal. Pode haver um recorte na extremidade do corpo troncocônico e na superfície plana. Breve descrição das figuras

[009] A FIG. 1 ilustra um diagrama em esquema de um citômetro de fluxo.

[010] A FIG. 2 ilustra um citômetro de fluxo operando fora de uma posição vertical ideal em uma corrente de fluido.

[011] A FIG. 3 ilustra um gráfico de duas variáveis obtido a partir dos espermatozoides de ordenação sexual do citômetro de fluxo na configuração da FIG. 2.

[012] A FIG. 4 ilustra um citômetro de fluxo operacional com uma localização de interrogação mais próxima de uma localização ideal, mas com alguma oclusão das emissões resultantes.

[013] A FIG. 5 ilustra um gráfico de duas variáveis obtido a partir dos espermatozoides de ordenação sexual do citômetro de fluxo na configuração da FIG. 4.

[014] A FIG. 6 ilustra um citômetro de fluxo operacional com uma localização de interrogação próxima da localização ideal, mas com mais luz de oclusão refletida a partir no bocal até ao orifício de fixação.

[015] A FIG. 7 ilustra um gráfico de duas variáveis obtido a partir dos espermatozoides de ordenação sexual do citômetro de fluxo na configuração da FIG. 6.

[016] A FIG. 8 ilustra uma modalidade de um sistema de citômetro de fluxo possuindo um bocal chanfrado permitindo que a localização de interrogação esteja localizada perto de uma localização ideal sem oclusão.

[017] A FIG. 9 ilustra um gráfico de duas variáveis obtido a partir dos espermatozoides de ordenação sexual do citômetro de fluxo na configuração da FIG. 8.

[018] A FIG. 10 ilustra uma porção de um citômetro de fluxo operacional com uma localização de interrogação a uma distância particular a partir de uma ponta de bocal.

[019] A FIG. 11 ilustra uma porção de um citômetro de fluxo operacional com uma localização de interrogação a uma distância particular a partir de uma ponta de bocal.

[020] A FIG. 12 ilustra uma porção de um citômetro de fluxo operacional com uma localização de interrogação a uma distância particular a partir de uma ponta de bocal chanfrada.

[021] A FIG. 13 ilustra uma vista ampliada da extremidade da ponta de bocal ilustrada na FIG. 10.

[022] A FIG. 14 ilustra uma vista ampliada da extremidade da ponta de bocal ilustrada na FIG. 11.

[023] A FIG. 15 ilustra uma vista ampliada da extremidade da ponta de bocal ilustrada na FIG. 12.

[024] A FIG. 16 ilustra uma vista ampliada da extremidade de uma outra modalidade de uma ponta de bocal.

[025] A FIG. 17 ilustra uma vista ampliada da extremidade de uma outra modalidade de uma ponta de bocal.

[026] A FIG. 18 ilustra uma vista ampliada da extremidade de uma outra modalidade de uma ponta de bocal.

[027] A FIG. 19 ilustra uma modalidade de uma ponta de bocal.

[028] A FIG. 20 ilustra uma modalidade de um conjunto de bocal.

[029] A FIG. 21 ilustra uma modalidade de um conjunto de bocal.

[030] Embora a presente invenção possa ser realizada com várias modificações e formas alternativas, modalidades específicas são ilustradas nas figuras e descritas neste documento por meio de exemplos ilustrativos. Deve ser entendido que as figuras e descrições detalhadas não se destinam a limitar o escopo da invenção à forma divulgada particular, mas que todas as modificações, alternativas, e equivalentes abrangidos pelo espírito e escopo das reivindicações se destinam a estar englobados.

Modos de realização da invenção

[031] No campo da citometria de fluxo, as partículas de interesse incluem, geralmente, uma grande variedade de células. Cada tipo de célula apresenta várias restrições e limitações relacionadas com os parâmetros operacionais de um instrumento de citômetro de fluxo, particularmente quando o instrumento está configurado para ordenação. Por exemplo, células grandes requerem um maior orifício de saída do bocal, enquanto células mais pequenas, muitas vezes requerem um menor orifício de saída do bocal. Outras células menores podem ser frágeis e podem exigir um maior orifício de saída do bocal que diminui a velocidade da célula e forma gotículas maiores. Outros parâmetros operacionais, tais como a pressão da amostra e a velocidade de formação de gotículas, podem depender da concentração de células que sofreram processamento em combinação com o tamanho das células. No caso da ordenação, as taxas de ordenação e purezas desejadas podem ditar limitações adicionais sobre os parâmetros de funcionamento. Além do tamanho das células, as formas das células podem ditar a geometria interior do bocal necessária para o sistema de citômetro de fluxo com jato em ar.

[032] Uma ponta de bocal padrão pode ser configurada para produzir um fluxo laminar coaxial de dois fluidos através de uma geometria circular afunilada não modificada. A corrente de fluido resultante compreende um fluxo núcleo cilíndrico rodeado por um fluxo exterior coaxial. Essa corrente de fluido é bem adequada para células redondas ou semi-redondas. Essa ponta de bocal não modificada injeta células em um núcleo de forma cilíndrica com pressão igual aplicada ao núcleo para centrar as células no interior do núcleo. A geometria não modificada confere pressão igual de todos os lados, instando as células em um fluxo único laminar. Como são redondas, ou semi-redondas, as células apresentam um elevado grau de simetria que não requerem a orientação e podem ser analisadas corretamente, independentemente da sua rotação em relação tanto a detectores de laser como de interrogação. Por esta razão, a localização física ao longo da corrente de fluido na qual é efetuada a interrogação do laser em relação à saída da ponta de bocal não é geralmente um fator crítico.

[033] No entanto, um certo subconjunto de operações do citômetro de fluxo exige bocais modificados que tendem a apresentar partículas em uma orientação uniforme. Bocais modificados podem produzir um núcleo em forma de faixa, fornecendo uma pressão relativamente elevada, num plano e uma pressão relativamente baixa, num plano transversal. Esta geometria é particularmente adequada para células planas de viés ou em forma de pá para uma orientação uniforme. Exemplos não limitativos de geometrias de bocais de orientação modificados são descritos nas Patentes do E.U.A. 6.357.307, 6.604.435, 6.782.768, e 6.263.745, em que todo o conteúdo das quais está incorporado neste documento por referência. Como um exemplo, a ordenação dos espermatozoides requer diferenciação de diferenças muito pequenas de um corante de DNA seletivo. Devido à forma esférica das células dos espermatozoides, essas diferenças só podem ser determinadas com precisão em células que estão uniformemente orientadas de frente para a fonte de excitação para iluminação total e de emissões provenientes das células em relação a um detector.

[034] Adicionalmente aos vários fatores descritos acima, vários aspectos do citômetro de fluxo devem ser calibrados para diferenciar espermatozoides carregando cromossomo X de espermatozoides carregando cromossomo Y. Uma característica que deve ser determinada é o posicionamento vertical da localização de interrogação, ou o ponto de feixe, na corrente de fluido. Uma localização ideal na corrente de fluido geralmente coincide com a localização na qual a maior percentagem de espermatozoides apresenta a orientação desejada e a seção mais estreita do fluxo núcleo. Essa localização ideal pode ser empiricamente determinada enquanto os espermatozoides são analisados numa calibração executada antes da ordenação.

[035] Em muitos bocais, as localizações de interrogação mais próximas do orifício de saída do bocal demonstram cada vez mais um melhor desempenho. Seja porque os espermatozoides são células vivas que tendem a tornar-se não-orientadas, ou porque os espermatozoides se tornam sobre-orientados enquanto continuam a descer a corrente de fluido, parece que as medições são muitas vezes mais precisas quando a localização de interrogação se aproxima da ponta de bocal. No entanto, como o local de interrogação se aproxima das atuais pontas dos bocais de orientação, são introduzidos artefatos que diminuem o desempenho do sistema. Em particular, as emissões de luz refletida para fora da superfície de fundo das atuais pontas criam artefatos no sinal de detecção. Na maioria dos casos, esses tipos de artefatos diminuem o desempenho do sistema, resultando em uma imagem distorcida e na diminuição global nas intensidades dos sinais detectados. Na ausência desses artefatos, o posicionamento vertical da zona de interrogação mais próxima de uma ponta de bocal pode ser possível e resultar em melhor resolução, bem como em maiores velocidades de ordenação, com perdas mínimas na qualidade do sinal.

[036] Em contraste com os bocais de orientação, as células redondas ou semi-redondas típicas podem ser alinhadas dentro de bocais padrão em uma maior escala de posições verticais, sem diminuir a qualidade do sinal. Dito de outra forma, as células redondas podem ser interrogadas com igual eficácia ao longo de uma escala vertical relativamente grande na corrente de fluido, em comparação com células que necessitam de orientação.

[037] No que se refere à FIG. 1, é ilustrado um sistema de citômetro de fluxo (10), que pode incorporar uma ponta de bocal modificada (46) de acordo com modalidades descritas neste documento. Apesar de o sistema de citômetro de fluxo (10) ser representado como um citômetro de fluxo de jato em ar com componentes de ordenação, deve ser entendido que as pontas de bocais descritas neste documento podem ser incorporadas em outros instrumentos analíticos que podem não executar funções de ordenação. O sistema de citômetro de fluxo (10) inclui uma fonte de células (12) para a produção de uma corrente de fluido contendo partículas de interesse. O fluxo de amostra é depositado dentro de um conjunto de bocal (14) e introduzido em, ou fluído para, uma corrente de fluido (16) de fluido de revestimento (18). O fluido de revestimento (18) pode ser fornecido por uma fonte de fluido de revestimento (20) de modo que a fonte de células (12) forneça as partículas ao fluido de revestimento (18) que são concorrentemente alimentados através do conjunto de bocal (14). O fluido de revestimento (18) pode ser fornecido a uma taxa de fluido de revestimento que é determinada por uma pressão de revestimento aplicada na fonte de fluido de revestimento (20). Deste modo, o fluido de revestimento (18) forma uma corrente de fluido (16) rodeando coaxialmente a amostra tendo partículas que saem do conjunto de bocal (14) através da ponta de bocal (46) no orifício de saída do bocal (44). Um oscilador (24) pode ser controlado com precisão com um controle do oscilador (26), de forma a produzir ondas de pressão dentro do conjunto de bocal (14) e as ondas de pressão podem ser transmitidas para os fluidos que saem do conjunto de bocal (14) no orifício de saída do bocal (44). Em resposta às ondas de pressão, a corrente de fluido (16) saindo do orifício de saída do bocal (44) forma eventualmente gotículas regulares (28) a intervalos precisos. A frequência, e em alguma medida a forma das gotículas formadas, pode ser controlada por uma frequência de unidade de queda e amplitude de unidade de queda fornecidas ao oscilador (24) ou ao controlador do oscilador (26).

[038] Cada gotícula, assim formada, retém o fluido de revestimento e a amostra que formou previamente uma porção da corrente de fluido (16). Uma vez que as células fornecidas a partir da fonte de células (20) estão envolvidas pela corrente de fluido (16) ou ambiente de fluido de revestimento, as gotículas (28) contêm idealmente células individualmente isoladas. No entanto, a concentração da amostra, a pressão da amostra, e outros parâmetros do instrumento ditam a frequência com a qual múltiplas células ocuparão regularmente uma única gotícula, bem como as percentagens de gotículas contendo espermatozoides.

[039] O citômetro de fluxo (10) atua para ordenar gotículas com base nas características das células que se prevê estarem contidas dentro das gotículas. Isto pode ser alcançado através de um sistema sensor de células (30) em comunicação com um analisador (36). O sistema sensor de células (30) inclui pelo menos um sensor, ou detector (32) responsivo às células contidas dentro da corrente de fluido (16). O sistema sensor de células (30) proporciona dados ao analisador (36), que podem causar uma ação dependendo da presença relativa ou ausência relativa de uma característica das células na corrente de fluido (16). Certas características, tais como o conteúdo de DNA relativo das células e espermatozoides, podem ser detectadas através de excitação com uma fonte de radiação eletromagnética (34), tal como um laser gerando um feixe de irradiação ao qual as células são responsivas. Como um exemplo não limitativo, as células podem ser células de espermatozoides corados com Hoechst 33342, e a fonte de radiação eletromagnética (34) pode ser um laser operado no comprimento de onda de UV, tal como a cerca de 355 nm. Um exemplo desse laser pode ser um Vanguard 350 (disponível pela Spectra-Physics), que opera a 350 mW. Várias óticas podem ser usadas para moldar o perfil de feixe do laser, dividir o feixe em mais do que uma corrente, ou reduzir a potência do feixe em uma corrente. Exemplos não limitativos de tais óticas podem ser encontrados nos documentos WO/2004/104178 e WO/2001/85913, sendo cada um incorporado neste documento por referência.

[040] No caso dos espermatozoides, a presença de um cromossomo X ou cromossomo Y, pode ser determinada a partir da fluorescência produzida em resposta à fonte de radiação eletromagnética (34). Em particular, as configurações do sistema sensor de células (30) podem estar em comunicação com um analisador para proporcionarem uma variedade de informação de fluorescência, tal como a fluorescência direta de um evento, a fluorescência lateral de um evento, ou a quantidade de dispersão associada a um evento. O analisador (36) pode incluir instruções escritas para análise dos sinais produzidos por um ou mais sensores (32) no sistema sensor de células (30). O corante fluorescente seletivo quanto a DNA se liga estequiometricamente ao DNA dos espermatozoides. Porque os espermatozoides portadores de cromossomo X contêm mais DNA do que os espermatozoides portadores de cromossomo Y, os espermatozoides portadores de cromossomo X se conseguem ligar a uma maior quantidade de corante fluorescente seletivo quanto a DNA do que os espermatozoides portadores de cromossomo Y. Assim, por medição da fluorescência emitida pelo corante ligado após excitação é possível diferenciar entre espermatozoides transportando X e espermatozoides transportando Y. As distinções, tais como espermatozoides que são viáveis ou não viáveis, podem ser diferenciadas adicionalmente a espermatozoides orientados e não orientados pelo analisador (36) de acordo com regiões de entrada incorporando lógica de ordenação.

[041] De modo a se alcançar a separação e isolamento com base em características de espermatozoides corados, a luz emitida pode ser detectada pelo sensor (32) e a informação alimentada a um analisador (36) acoplada a um carregador de gotículas que carrega diferencialmente cada gotícula (28) com base nas características dos espermatozoides corados contidos dentro dessa gotícula (28). Deste modo, o analisador (36) atua para permitir que as placas de deflexão eletrostática (38) desviem gotículas (28) com base em se elas contêm ou não a partícula ou célula apropriada.

[042] Como um resultado, o citômetro de fluxo (10) atua para separar espermatozoides corados fazendo com que as gotículas (28) contendo espermatozoides sejam direcionadas para um ou mais contentores de recolha (40). Por exemplo, quando o analisador diferencia espermatozoides com base em uma característica dos espermatozoides, as gotículas arrastando espermatozoides portadores de cromossomo X podem ser positivamente carregadas e assim defletirem em uma direção, enquanto as gotículas arrastando espermatozoides portadores de cromossomo Y podem ser negativamente carregadas e assim defletirem para o outro lado, e a corrente de desperdício (isto é, gotículas que não arrastam uma partícula ou célula ou arrastam células indesejadas ou que não podem ser orientadas) pode ser deixada não carregada e assim é coletada em uma corrente não defletida em um tubo de sucção ou similar. Alternativamente, um dos espermatozoides portadores de cromossomo X ou dos espermatozoides portadores de cromossomo Y pode ser coletado, enquanto o outro é descartado com o desperdício.

[043] Um controlador (42) pode formar uma porção do analisador (36) ou pode ser um componente externo ao analisador (36). O controlador (42) ilustrado também pode representar uma coleção de controladores individuais. O controlador (42) pode receber sinais ou instruções do analisador (36) e em resposta pode modificar um ou mais parâmetros do instrumento, tais como o caudal da amostra, a pressão da amostra, o caudal de revestimento, a pressão de revestimento, a frequência da unidade de queda, ou a amplitude da unidade de queda e similares. O controlador (42) pode também proporcionar uma interface para entradas do operador para ajustar manualmente o caudal da amostra, a pressão da amostra, o caudal de revestimento, a pressão de revestimento, a frequência da unidade de queda, ou a amplitude da unidade de queda e similares. O analisador (36) pode incluir instruções escritas para modificação dos parâmetros do instrumento em resposta a parâmetros de separação medidos, ou as modificações a parâmetros do instrumento podem ser manualmente realizadas por um operador ajustando várias definições. As modificações aos parâmetros do instrumento podem ser levadas a cabo no analisador (36) tal como por mudança da lógica de separação, lógica de abortação, regiões de separação, ou regiões de filtro e outros parâmetros específicos para fazer decisões de separação no analisador. Modificações adicionais aos parâmetros do instrumento podem ser efetuadas por um controlador (42), que pode controlar vários componentes externos ao analisador, tal como para controle da pressão da amostra, do caudal da amostra, da pressão de revestimento, do caudal de revestimento, da frequência da unidade de queda, e da amplitude da unidade de queda.

[044] A FIG. 2 ilustra uma porção de um sistema de citômetro de fluxo (10) incluindo uma ponta de bocal de orientação não modificada (45) possuindo um orifício de saída do bocal (44) em uma superfície de fundo plana (62). É ilustrada uma fonte de radiação eletromagnética (34) produzindo um feixe de laser (54) na escala de comprimento de onda de 355 nm, que é focada numa localização de interrogação (60) sobre a corrente de fluido (16) uma certa distância abaixo da ponta de bocal (45). A localização de interrogação (60) pode ser vista em uma localização vertical abaixo de uma faixa ideal de localizações indicadas (64). As emissões (68), ou radiação eletromagnética, que são emitidas a partir de, ou refletidas a partir de, células interrogadas na localização de interrogação (60), são ilustradas na forma de raios divergentes que são recolhidos em uma lente objetiva (50) e focada através de um orifício de fixação (52) numa tira do orifício de fixação para um filtro óptico (58) e um sensor, que pode ser um detector (32), tal como um tubo fotomultiplicador (PMT). Arranjos de detectores também podem ser empregues em modos conhecidos. Por exemplo, no campo da separação dos espermatozoides, os detectores de fluorescência ortogonais podem ser colocados nas localizações dianteiras e laterais.

[045] A FIG. 3 ilustra um gráfico de duas variáveis que representa a informação produzida a partir do sistema de citômetro de fluxo (10) parcialmente ilustrada na FIG. 2. O gráfico de duas variáveis pode ser gerado através da manipulação de sinais produzidos por um ou mais detectores que detectam as emissões de fluorescência a partir das células na corrente de fluido. O gráfico de duas variáveis ilustrado é gerado durante o processo de ordenação de sexo dos espermatozoides e representa uma altura de pico em um eixo e uma área integrada no outro eixo detectada a partir de uma população de espermatozoides corados. Dentro do gráfico de duas variáveis, podem ser vistas duas sub-populações emergentes. Enquanto existe alguma sobreposição, essas populações podem ser fechadas e orientadas em uma ou mais populações. Na operação de ordenação dos espermatozoides, R2 representa uma região de entrada que inclui espermatozoides a serem ordenados como espermatozoides portadores de cromossomos X vivos. No entanto, a resolução e a intensidade do sinal observadas na FIG. 3, podem ser sub-óptimas e podem requerer que o sistema do citômetro de fluxo seja executado em velocidades mais baixas, a fim de atingir um grau de pureza desejado e/ou um rendimento desejado.

[046] A FIG. 4 ilustra o mesmo sistema de citômetro de fluxo (10) que a FIG. 2, exceto que o feixe de laser (54) foi deslocado dentro da gama ideal de localizações (64) (que pode também ser referida como a gama ideal de posições verticais). Para fins ilustrativos esta gama ideal de localizações (64) coincide com a localização na qual começa a oclusão de algumas das emissões (68). Para além das emissões (68), uma emissão secundária representativa (70) é ilustrada sendo refletida a partir da superfície plana (62) da ponta de bocal não modificada (45) e através da lente objetiva (50). A FIG. 5 ilustra um gráfico de duas variáveis representativo de sinais produzidos pela configuração ilustrada na FIG. 4. Apesar de não facilmente perceptível a partir do gráfico de duas variáveis, as intensidades de pico globais podem ser menores para ambas as populações de espermatozoides devido à oclusão. Além disso, por causa da natureza divergente da luz fluorescente, uma fracção da luz refletida pode estar entrando no orifício de pino, resultando em ruído e/ou distorção.

[047] Com referência agora à FIG. 6, enquanto a localização de interrogação (60) é movida para mais próximo da ponta de bocal não modificada (45). A redução adicional nesta distância entre a localização de interrogação (60) e a ponta de bocal (45) resulta em um aumento tanto da oclusão das emissões (68) como da quantidade de emissões secundárias (70) a serem refletidas para fora da parte de fundo plana (62) da ponta de bocal (45). No campo da ordenação de espermatozoides tem sido observado que a uma certa distância a geometria da lente objetiva e a ponta de bocal podem realmente colocar as emissões secundárias diretamente no orifício de fixação (52) num tempo ligeiramente diferente provocando distorção. A FIG. 7 ilustra um gráfico de duas variáveis, como a FIG. 5, mas com um elevado grau de distorção. Cada uma das populações típicas de espermatozoides portadoras de cromossomo X e Y se assemelha, ela própria, a duas populações, deixando um aspecto de quatro populações. Duas populações adicionais podem resultar em certos instrumentos de citômetro de fluxo a partir dessas emissões secundárias que atingem o detector depois de um ligeiro atraso.

[048] A FIG. 8 ilustra uma configuração com uma ponta de bocal modificada (46) possuindo uma superfície plana de área reduzida (62') e um recorte (88) na forma de um chanfro (90). Essas características abordam um problema anteriormente não reconhecido por eliminação de uma porção da superfície plana responsável para a oclusão de emissões (68) e pela reflexão das emissões secundárias (70). A ponta de bocal modificada (46) pode ser caracterizada como chanfrada (90), mas outros métodos de corte da superfície plana (62) também são contemplados. A FIG. 8 ilustra a localização de interrogação (60) a ser colocada sobre ou próxima da localização ideal e na mesma localização, como ilustrado na FIG. 6, com reflexões mínimas de emissões secundárias (70) devido à geometria da superfície de fundo (62'). As emissões secundárias (70), que se refletem já não terão disponível a antiga via geométrica para o orifício de fixação (52). Em vez disso, uma maior parte da luz emitida (68) a partir da localização de interrogação (60) é diretamente captada pela lente objetiva (50).

[049] Tal como ilustrado na FIG. 9, o gráfico de duas variáveis resultante ilustra duas populações distintas de espermatozoides. Como tal, a ponta de bocal modificada permite o funcionamento normal do citômetro de fluxo ao longo de uma gama aumentada de posições para o ponto de feixe, incluindo uma gama mais próxima da ponta de bocal que proporciona um desempenho melhorado.

[050] Tal como utilizado neste documento, o termo “troncocônico” pode ser entendido como descrevendo a forma geral de um cone truncado, mas se destina a incluir pequenas variações a partir da definição matemática rigorosa e pode incluir chanfros, filetes, ou outras curvaturas ou porções arredondadas, particularmente em, ou próximo, de quaisquer extremidades.

[051] O termo “corpo troncocônico” pode ser entendido como descrevendo um corpo possuindo a forma geral de um cone truncado, mas se destina a incluir pequenas variações a partir da definição matemática rigorosa dessa forma e pode incluir variações tais como chanfros, filetes, ou outras curvaturas ou porções arredondadas, particularmente em, ou próximo, de quaisquer extremidades.

[052] O termo “corpo cilíndrico” pode ser entendido como descrevendo um corpo possuindo a forma geral de um cilindro, mas se destina a incluir pequenas variações a partir da definição matemática rigorosa dessa forma e pode incluir variações tais como entalhes, ranhuras, flanges, extremidades arredondadas, chanfros e outras alterações.

[053] Tal como utilizado neste documento, o termo "recorte" deve ser entendido como se referindo à superfície de um objeto possuindo a aparência do material adjacente que foi cortado, ou raspado, ou de outro modo removido nessa superfície. No entanto, essa superfície pode ser formada por qualquer número de técnicas e não é necessária a remoção física do material. Por exemplo, uma peça pode ser formada por moldagem por injeção ou com uma impressora 3-D e pode ter qualquer superfície, tendo a aparência de um chanfro, filete ou outra ranhura e esta superfície pode ser considerada um “recorte”, tal como utilizado neste documento.

[054] Voltando agora para as FIGs. 10-12 um feixe de laser (54) é ilustrado em combinação com três pontas de bocais diferentes à mesma distância. A FIG. 10 ilustra uma ponta de bocal não modificada (45) possuindo uma superfície de fundo plana. A FIG. 11 ilustra outra ponta de bocal não modificada (45) possuindo uma superfície de fundo plana, mas que tem uma transição arredondada para a superfície de fundo plana. Cada ponta de bocal produz uma corrente de fluido que é inspecionada em uma zona de interrogação na mesma localização. A emissão (68) resulta de uma célula, ou uma célula corada, sendo interrogada com radiação eletromagnética na zona de interrogação. As emissões (68) estão ilustradas como um cone de emissões representativo tendo um ângulo de θ. O ângulo do cone de emissão pode ser de cerca de 30 graus em cada direção.

[055] Na FIG. 10 a ponta de bocal não modificada (45) é ilustrada tendo uma superfície plana (62) relativamente grande. À distância ilustrada, as emissões (68) a partir de partículas na corrente de fluido (16) são refletidas da superfície plana (62) da ponta de bocal (45). Do mesmo modo, na FIG. 11, uma ponta de bocal não modificada (45) tem características mais curvas, mas ainda tem uma superfície plana (62) relativamente grande que reflete as emissões secundárias (70) a partir de partículas na corrente de fluido (16). O término das pontas de bocais arredondadas existentes possuindo geometrias internas para orientar células ainda é uma superfície plana. Mesmo nessas pontas arredondadas, a superfície de fundo plana ocupa área suficiente para distorcer as medições efetuadas em uma estreita proximidade com a ponta de bocal não modificada (45).

[056] De acordo com certas modalidades melhoradas de pontas de bocais, a FIG. 12 ilustra uma ponta de bocal modificada (46) tendo um corpo cilíndrico (80) definindo um eixo longitudinal. Um corpo troncocônico (84) é adjacente ao corpo cilíndrico (80) ao longo do eixo longitudinal e em comunicação fluida com o corpo cilíndrico. Um recorte (88) na ponta do corpo troncocônico (84) tem a forma de um chanfro (90), deixando uma superfície plana com uma área mínima. A superfície plana (62) pode ter uma área reduzida, em comparação com bocais anteriores, particularmente com o bocal anterior com geometrias orientadoras. Esta geometria modificada acomoda a totalidade dos cones de emissões (68) sem oclusão e sem produzir uma emissão secundária (70), permitindo que as medições sejam efetuadas mais próximo da ponta de bocal modificada (46) do que das pontas do bocal não modificadas (45) das FIGs 10 e 11.

[057] A FIG. 13 ilustra uma vista extremamente próxima da superfície plana (62) na parte de fundo da ponta de bocal não modificada (45) vista na FIG. 10. Uma região exterior (94) representa a área sobre a superfície plana responsável pela oclusão de emissões e refletindo as emissões secundárias a uma distância particular do bocal. Considerando que, a região do centro (92) representa a área da superfície de fundo que não oclui as emissões ou reflete as emissões secundárias a uma distância particular do bocal. Em algumas modalidades de uma ponta de bocal modificada (46), a ponta de bocal modificada (46) pode ser fornecida com uma área de superfície plana reduzida (62') tendo a mesma área de superfície que a região do centro (92) ilustrada.

[058] Do mesmo modo, a FIG. 14 ilustra a parte mais de fundo de uma ponta de bocal arredondada não modificada (45), tal como observado na FIG. 11. A região exterior correspondente (94), inclui menor área do que na FIG. 13, mas uma porção significativa da superfície plana (62) é ainda problemática quando se tenta interrogar uma corrente de fluido em uma posição próxima da ponta de bocal.

[059] A FIG. 15 ilustra o fim de uma ponta de bocal não modificada (46), tal como observado na FIG. 12, que pode ser caracterizada como a extremidade distal de um corpo troncocônico (84). O corpo troncocônico (84) pode ser considerado como um único corpo troncocônico (84) possuindo uma ponta chanfrada (90), ou pode ser considerado um primeiro corpo troncocônico possuindo um primeiro ângulo de afunilamento adjacente e contínuo com um segundo corpo troncocônico possuindo um segundo ângulo de afunilamento. O segundo ângulo pode ter um afunilamento mais agressivo para reduzir o tamanho da superfície de fundo plana, possuindo o orifício de saída do bocal (44).

[060] A FIG. 16 ilustra uma modalidade alternativa de uma ponta de bocal modificada (46), onde um recorte (88) se assemelha a uma ponta arredondada, que termina na superfície de fundo plana, com uma área reduzida (62'). Esse entalhe (88) ilustrado também pode ser caracterizado como um filete côncavo (124) que termina numa superfície de fundo tendo uma área reduzida (62').

[061] A FIG. 17 ilustra uma modalidade alternativa de uma ponta de bocal modificada (46), onde um recorte (88) tem a forma de um filete côncavo (126). O filete côncavo (126) termina numa zona reduzida (62') proporcionando benefícios semelhantes conferidos pelas geometrias modificados ilustradas nas FIGs. 12 e 15.

[062] A FIG. 18 ilustra uma modalidade alternativa em que o recorte tem a forma de uma ranhura perpendicular (128), resultando no aparecimento de um segundo corpo cilíndrico em comunicação com o corpo troncocônico (84). Alternativamente, o segundo corpo cilíndrico pode ter uma base mais larga do que a área reduzida (62') da superfície de fundo plana, que pode ser caracterizada como um segundo corpo troncocônico, mas não um chanfro como na FIG. 15.

[063] A FIG 19 ilustra uma vista em perspectiva e uma vista secional de uma ponta de bocal modificada (46) possuindo uma porção de corte (88) na forma de um chanfro (90) e uma superfície interior configurada para orientar as partículas. A porção de corte ilustrada (88) está na forma de um chanfro (90), mas outras porções de cortes, tais como as ilustradas nas FIGs. 16-18 são esperados como proporcionando benefícios semelhantes. A superfície exterior da ponta de bocal (46) pode ser caracterizada como um corpo cilíndrico (80) adjacente a, e em comunicação fluida com, um corpo troncocônico (84) ao longo de um eixo longitudinal (82). Adicionalmente, podem existir entalhes (120) ou ranhuras formados na superfície exterior do corpo cilíndrico (80) para a finalidade de fixar a ponta de bocal (46) com um conjunto de bocal e/ou para o alinhamento da ponta de bocal (46) de orientação dentro de um conjunto de bocal. A porção de fundo da superfície exterior ilustrada pode ser caracterizada como um corpo troncocônico (84) que termina num chanfro (90), ou pode ser caracterizada como uma porção proximal do corpo troncocônico que tem um primeiro ângulo de afunilamento adjacente a uma porção distal do corpo troncocônico que tem um segundo ângulo de afunilamento; estando o segundo ângulo de afunilamento mais inclinado do que o primeiro ângulo de afunilamento.

[064] Referindo-se para o interior da ponta de bocal de orientação (46) é formada uma boca geralmente circular (102) para uma cavidade da ponta de bocal ao longo do eixo longitudinal (82). A superfície interior da ponta de bocal (46) pode fazer a transição a partir de um perfil circular, ou quase circular, para um perfil elipticamente crescente ao longo de uma região elipticamente crescente (100). A proporção do eixo maior para o eixo menor, pode aumentar até uma demarcação elíptica (104), após o que o perfil elíptico da superfície interior pode fazer a transição de novo para um perfil circular ao longo do eixo longitudinal (82) em uma região elipticamente decrescente (106). A região elipticamente decrescente (106) pode terminar em uma demarcação circular (108), seguida ao longo do eixo longitudinal (82) por uma região cônica (110). A região cônica (110) pode terminar numa segunda demarcação circular (112) que começa uma zona cilíndrica (114) que termina no orifício de saída do bocal (44).

[065] Uma visão mais próxima do terminal da ponta de bocal (46) ilustra o interior da região cônica (110) adicionalmente à zona cilíndrica (114) no interior da ponta de bocal (46), bem como, o recorte (88) na forma de um chanfro (90). O orifício de saída do bocal (44) também pode ser visto nesta vista formada na superfície de fundo plana (62') que é transversal ao eixo longitudinal (82).

[066] Uma modalidade se refere a incorporação da ponta de bocal chanfrado em um conjunto de bocal alternativo. Um exemplo de um conjunto de bocal alternativo descrito neste documento pode incluir um tubo de injeção linear, que está colocado com uma porção do conjunto de bocal. Ao reduzir o comprimento total do tubo de injeção, se torna mais fácil controlar o comprimento e a posição radial da saída de injeção. Tubos de injeção anteriores frequentemente incluíam tubos de injeção metálicos que eram dobrados dentro do conjunto de bocal ou que eram endireitados a partir de um material enrolado, ou curvo. Se introduzidas numa etapa de pré-fabricação de enrolamento ou imediatamente antes da ativação em um bocal de citômetro de fluxo, tais curvaturas resultam em dobras ou irregularidades no interior do tubo de injeção e podem ainda criar a incerteza da posição do eixo central do tubo de injeção em relação ao eixo de fluxo desejado dentro de um bocal. Estas dobras e irregularidades podem inibir a corrente de fluido laminar ou podem redirecionar o fluxo da amostra, o que pode ter um impacto negativo sobre as características de desempenho do conjunto de bocal; particularmente se são desejadas características de orientação. Num outro aspecto, o tubo de injeção moldado descrito neste documento pode apresentar uma superfície contínua ou nivelada em qualquer ponto de ligação.

[067] Vários conjuntos de bocal anteriores incluíram muitas vezes conectores que apresentavam volumes mortos no caminho do fluxo. Estes volumes mortos podem se tornar bolsas de estagnação de fluido que podem albergar bactérias prejudiciais para a amostra e podem ser difíceis de limpar. Por injeção de moldagem por sobreposição de um tubo de injeção para dentro do conjunto de bocal, podem ser conseguidos um comprimento e uma posição repetíveis, proporcionando assim um meio fiável de fabrico de conjuntos de bocais com características de desempenho, reprodutíveis precisas. Além disso, a moldagem por sobreposição pode proporcionar um meio para reduzir ou eliminar os espaços mortos em várias conexões. Os elementos adicionais podem ser moldados por sobreposição, ou moldados por injeção, com várias porções do conjunto de bocal para reduzir o número de espaços mortos potenciais, bem como o número de ligações com potencial para fugas.

[068] Voltando agora à FIG. 20, é ilustrado um sistema de citômetro de fluxo que incorpora um exemplo de um conjunto de bocal (210). O conjunto de bocal (210) pode ser incorporado na cabeça de ordenação de qualquer número de ordenadores de gotículas comercialmente disponíveis, tais como citômetros de fluxo de jato em ar. O conjunto de bocal (210) pode incluir um compartimento de bocal (212), o qual encerra uma cavidade do bocal (214). O compartimento de bocal (212) pode ser construído a partir de uma única peça de compartimento moldada, ou pode ser montado a partir de um conjunto de peças de compartimento de bocal (244), tais como duas, três, quatro ou mais peças de compartimento de bocal. A FIG. 20 ilustra um conjunto de bocal (210), que inclui duas peças de compartimento de bocal (244a), (244b), sob a forma de uma tampa do bocal (228) presa a uma base de bocal (230).

[069] O sistema de citômetro de fluxo pode incluir uma fonte de revestimento (326) fluidamente ligada ao conjunto de bocal (210) para fornecer fluido de revestimento (328) ao conjunto de bocal (210). Uma fonte de amostra (320) pode também ser acoplada ao conjunto de bocal (210) para fornecer fluido de amostra (322) ao conjunto de bocal (210). O fluido de amostra (322) e o fluido de revestimento (328) pode ser introduzido em uma cavidade do bocal (214), sob pressão e, em seguida, passada através de uma ponta de bocal (242) que tem um orifício de saída de bocal (226) para formar um corrente de fluido (236) ao longo de um trajeto de escoamento tendo um eixo de fluxo (294). O interior do conjunto de bocal (210) pode ser configurado para produzir um corrente de fluido (236) a partir do orifício de saída do bocal (226) sob a forma de um fluxo coaxial tendo o fluxo núcleo interior do fluido de amostra (322) rodeado por um fluxo exterior do fluido de revestimento (328).

[070] Um elemento oscilante (252), tal como um cristal piezoeléctrico, pode ser localizado dentro do conjunto de bocal (210) para perturbar a corrente de fluido (236) em gotículas (260) a alguma distância abaixo do orifício de saída do bocal (226). Elementos oscilantes anteriores foram localizados ou por cima da cavidade do bocal, ou dentro da cavidade do bocal, na parte superior da cavidade. Um aspecto do conjunto atual de bocal (210) se refere a um elemento oscilante (252), que está posicionado para envolver uma porção da cavidade do bocal (214) e reduz a distância entre o elemento de oscilação (252) e o orifício de saída do bocal (226). O elemento de oscilação (252) pode ter uma forma em anel ou toroidal com um diâmetro exterior e um diâmetro interior e pode estar em comunicação com um controlador (258). O controlador (258) pode produzir um sinal de ativação, como entre cerca de 10 kHz e 120 kHz para perturbar a corrente de fluido (236) entre cerca de 20.000 gotículas por segundo e 120.000 gotículas por segundo. A frequência e a amplitude do sinal de ativação podem ser manipuladas e/ou ajustadas por um usuário através de uma interface gráfica de usuário ou através de hardware. Como exemplo, o elemento oscilante (252) pode estar localizado a cerca de meio caminho para baixo do conjunto de bocal (210) que envolve a cavidade do bocal (214). Esta localização pode estar dentro do compartimento do bocal (212), ou externa ao compartimento do bocal (212), mas mecanicamente acoplada ao compartimento. Independentemente da localização interna ou externa, se pensa que um tal posicionamento axial do elemento oscilante (252) produz gotículas mais eficientemente. Nessa configuração as vibrações mecânicas são transferidas através do conjunto de bocal (210) e através do fluido de revestimento (328), em uma forma de tipo alto-falante para produzir uma característica pulsante na corrente de fluido (236). Essa característica pulsante eventualmente interrompe a corrente de fluido (236) em gotículas (260) a alguma distância abaixo do orifício de saída do bocal (226). Independente de outras características da invenção descritas neste documento, este pedido contempla o benefício de alterar a colocação de um elemento oscilante (252) dentro ou acoplado a qualquer bocal para aumentar a eficiência na produção de gotículas.

[071] Um pino de carga (262) pode ser montado com o conjunto de bocal (210). O pino de carga (262) pode ser construído a partir de qualquer material eletricamente condutor e proporciona uma ligação elétrica entre um elemento de carga (252) e o fluido de revestimento (328) contido na cavidade do bocal (214). Através do pino de carga (262) pode ser transmitida uma carga para a totalidade da corrente de fluido (236), incluindo uma formação de gotículas imediatamente antes de romper a partir da corrente de fluido (236). Um analisador (378) ou outro dispositivo de processamento pode determinar as características físicas ou químicas das partículas na amostra e pode classificar as partículas em uma ou mais subpopulações. Com base em todas as instruções respeitantes à subpopulação em que uma partícula é classificada e outros parâmetros de ordenação, incluindo uma defasagem calibrada das gotas, o analisador (378) irá instruir um circuito de carga (254) para carregar a corrente de fluido (236) através do carregamento do pino de carga (262) imediatamente antes da formação de uma gotícula na qual é esperada essa partícula. Deste modo, as gotículas (260) podem ser fornecidas com uma carga específica, incluindo sem carga, com base nas características das partículas nelas contidas.

[072] O conjunto de bocal (210) pode incluir um assentamento do bocal (302) para o acoplamento na posição no sistema de citômetro de fluxo. Considerando que bocais anteriores podem ter sido fixados a estágios ajustáveis com elementos de fixação (como parafusos, porcas, etc.), o conjunto de bocal (210) pode incluir um assentamento do bocal (302) construído sem elementos de fixação. Como um exemplo, o assentamento do bocal (302) pode ser acoplado a um citômetro de fluxo sem a ajuda de elementos de fixação.

[073] Uma fonte de excitação (330), tal como uma fonte de radiação eletromagnética pode ser dirigida para uma região conhecida como uma zona de inspeção (332) na corrente de fluido (236). As partículas dentro da corrente de fluido podem refletir e/ou emitir radiação eletromagnética em resposta a esta excitação, e esta radiação eletromagnética emitida e refletida pode ser detectada por um ou mais detectores (334). Esses detectores (334) podem produzir sinais representativos da radiação eletromagnética emitida ou refletida (336), e esses sinais podem ser processados por um analisador ou por um sistema de detecção para obter um número de propriedades químicas e físicas. O analisador (378) pode, então, fornecer instruções ao circuito de carga (254), a fim de efetuar a ação de ordenação adequada.

[074] A FIG. 21 ilustra uma vista explodida do conjunto de bocal (210). A vista explodida ilustra um primeiro elemento de fixação (284a) e um segundo elemento de fixação (284b) para fixar uma primeira peça de bocal (244a), sob a forma de uma tampa de bocal (228), e uma segunda peça de bocal (244b), sob a forma de uma base de bocal (230), a um assentamento de bocal (302). O conjunto de bocal (210) pode, no entanto, ser construído com qualquer número de elementos de fixação (284) e peças de bocal (244). Na modalidade ilustrada, o assentamento de bocal (302) inclui uma primeira porção rosqueada (282a) para receber o primeiro elemento de fixação (284a) e uma segunda porção rosqueada (282b) para receber o segundo elemento de fixação (284b). Em outras modalidades os elementos de fixação podem ser combinados com e/ou omitidos em benefício de adesivos, ou outros meios de acoplamento, tais como imãs ou meios mecânicos, incluindo molas.

[075] A tampa de bocal (228) pode incluir uma entrada de amostra (216), a qual está em comunicação fluida com uma haste de injeção (232) e com um tubo de injeção (218) para formar um caminho de corrente de fluido. A haste de injeção (232) pode ser formada integralmente com a tampa do bocal (228), ou pode ser formada como uma peça de bocal separada. O tubo de injeção (218) pode ser moldado por sobreposição, ou moldado por inserção, com a tampa do bocal (228), de uma maneira que proporciona comunicação de fluido entre a entrada da amostra (216) e o tubo de injeção (218). Esta técnica pode proporcionar um tubo de injeção muito curto e precisamente localizado (218). Numa modalidade um dispositivo pode ser acoplado à haste (232), o que proporciona uma superfície com uma posição axial ajustável. Como um exemplo, o tubo de injeção (218) pode ser moldado por sobreposição sobre um tal elemento, o qual é então acoplado mecanicamente com a haste de injeção (232). Em uma modalidade, o tubo de injeção (218) é formado a partir de um material rígido liso para assegurar as propriedades desejadas do fluxo do fluido. Em uma modalidade alternativa, o tubo de injeção é formado a partir de um material mais flexível, que pode ser manipulado depois de o tubo de injeção estar formado ou moldado. Por exemplo, o tubo de injeção pode ser manipulado para alterar a geometria inicial de um percurso de fluido formado através do mesmo com o propósito de estimular um fluxo de núcleo de fita. Como exemplo não limitativo, as modificações da geometria podem ser incorporadas por gravura a laser em certas porções ou por um passo de fabrico de aperto do tubo de injeção, enquanto flexível, e não no estado perfeitamente elástico. Outras técnicas de fabrico também podem ser incorporadas para moldar a saída do tubo de injeção, de tal modo que um eixo é maior do que um segundo eixo. Como exemplo ilustrativo podem ser empregues outras técnicas de fabrico resultando em uma saída do tubo de injeção de forma elíptica ou retangular.

[076] A segunda peça do bocal (244b), sob a forma de uma base do bocal (230), pode ser dimensionada para o acoplamento com a tampa do bocal (228). Um elemento oscilante (252) pode ser inserido por moldagem com a base do bocal (230), ou pode ser encapsulado dentro de uma cavidade na base do bocal (230). Em uma modalidade a base do bocal (230) está dimensionada para receber uma ponta de bocal (242). Por exemplo, a base de bocal (230) pode incluir dimensões interiores para o acoplamento com a ponta de bocal (242), enquanto o exterior da base do bocal pode ser rosqueado para receber uma porca de fixação (292) que segura a ponta de bocal (242) no seu lugar. Numa outra modalidade, a ponta de bocal (242) pode ser inserida moldada com a base do bocal (230), e em ainda uma outra modalidade a ponta de bocal pode ser moldada como uma porção da base do bocal (230).

[077] O assentamento do bocal (302) pode assumir a forma de uma braçadeira do bocal (278), a qual recebe o primeiro elemento de fixação (284a) e o segundo elemento de fixação (284b) de um modo que prende a tampa do bocal (228) à base do bocal (230). O assentamento do bocal (302) pode ser dimensionado para acoplamento sem elemento de fixação ao receptor (350). Como um exemplo, o assentamento do bocal (302) pode compreender um material metálico acoplado a um receptor (350) que tem propriedades magnéticas. Um material magnético pode estar localizado em qualquer um dos, ou em ambos, o assentamento do bocal (302) e o receptor (350). Em uma modalidade semelhante, um ou ambos os componentes podem ser construídos de modo a incluir eletromagnetos, ou materiais que demonstram propriedades magnéticas em resposta à corrente elétrica. Nesta configuração, um conjunto de bocal (210) pode ser simplesmente deixado no lugar e mantido por ação da gravidade e pelo acoplamento dos componentes magnéticos. Esses bocais são rápida e facilmente intercambiáveis. Em muitos ambientes o tempo de inativação do citômetro de fluxo resulta em tempo de produção perdido e os assentamentos do bocal (302), como descritos neste documento, fornecem um método extremamente eficiente de substituição de bocais e podem melhorar a produtividade de um dado sistema de citômetro de fluxo. O assentamento do bocal (302) e o receptor (350) podem ser construídos de uma variedade de outras configurações para o acoplamento do bocal a um citômetro de fluxo de uma forma sem elementos de ligação. Em uma modalidade o assentamento do bocal (302), ou o receptor (350), pode incluir molas para segurar as duas peças em um acoplamento livre de elemento de fixação. Por exemplo, uma esfera acionada por mola em um componente pode ser concebida para travar o outro componente no encaixe. O assentamento do bocal (302) também pode ser fisicamente dimensionado para uma configuração de interbloqueio com um assentamento em um passo ajustável na cabeça do citômetro de fluxo. Em uma modalidade dessas, o assentamento do bocal (302) pode ser assim dimensionado para ser recebida por um passo ajustável. Uma vez no lugar, o assentamento do bocal (302) pode ser fixado por rotação de forma a conseguir um conjunto de interbloqueio, ou por outros meios mecânicos, tais como meios mecânicos conferidos na fase ajustável.

[078] O assentamento do bocal (302) pode incluir um elemento de alinhamento (354) na forma de uma saliência que se estende geralmente passado um limite restante da superfície de fundo do assentamento do bocal (302). O receptor (350) pode incluir um entalhe de alinhamento (352). O elemento de alinhamento (354) e o entalhe de alinhamento (352) podem ser dimensionados de modo a favorecer o acoplamento na orientação especificada. Em outras modalidades, pode haver uma pluralidade de entalhes de alinhamento (352) para potencialmente prenderem um único elemento de alinhamento (354). Nesta configuração, o conjunto de bocal (210) pode assentar em uma de entre uma pluralidade de orientações pré- definidas em relação ao sistema de citômetro de fluxo. Em outra modalidade, o receptor (350) é ajustável e pode ser fixado numa pluralidade de posições para modificar a orientação fornecida pelo alinhamento do elemento de alinhamento (354) e do entalhe de alinhamento (352). Em uma modalidade, uma esfera acionada por uma mola pode servir tanto como um meio para engatar o assentamento do bocal (302) com o receptor (305) como o elemento de alinhamento (354) para alinhar os dois componentes. Embora os componentes adicionais do citômetro de fluxo não tenham sido ilustrados, deve se entender que o receptor (350) pode ser firmemente ligado a um passo, tal como um passo que é ajustável em duas ou três dimensões, para fins de alinhamento.

[079] O elemento de alinhamento (354) e o entalhe de alinhamento (352), além de fornecerem uma orientação especificada, podem conferir uma localização precisa do bocal permitindo a rápida substituição de um conjunto de bocal e minimizando a necessidade de realinhar o citômetro de fluxo. Em combinação com o acoplamento magnético, esta configuração pode eliminar as forças que tendem a trazer o bocal para fora do alinhamento com os detectores, ou fontes de radiação eletromagnética. Especificamente, pode ser aplicado torque ao passo ajustável no qual o bocal fica quando os elementos de fixação são fixados no lugar pela força descendente que um operador aplica aos próprios elementos de fixação.

[080] Ranhuras, entalhes e outras superfícies e geometrias correspondentes também pode ser utilizados, sozinhos ou em combinação com acoplamento magnético, para fornecer configurações adicionais que permitem a correspondência de forma rápida e precisa com uma orientação e/ou localização preferida. Numa outra modalidade, podem ser aplicadas ajudas visuais sob a forma de marcas ou entalhes ao bocal para facilitar a rápida e fácil substituição dos bocais.

[081] Como pode ser entendido pelo exposto acima, várias características do conjunto de bocal podem ser incorporadas num citômetro de fluxo, bem como num método para o fabrico de um citômetro de fluxo. Aqueles entendidos na técnica reconhecerão que a invenção acima descrita inclui muitos aspetos inventivos, que podem ser conferidos em qualquer combinação e inclui pelo menos o seguinte: A1. Um sistema de citômetro de fluxo compreendendo: um conjunto de bocal para a produção de uma corrente de fluido com partículas, em que o conjunto de bocal compreende uma ponta de bocal formada a partir de um corpo cilíndrico definindo um eixo longitudinal e um corpo troncocônico adjacente ao corpo cilíndrico sobre o eixo longitudinal, que se encontra em comunicação fluida com o corpo cilíndrico, em que o corpo troncocônico termina numa superfície plana transversal ao eixo longitudinal, que tem um orifício de saída do bocal, e em que o corpo troncocônico compreende ainda um recorte na extremidade da superfície plana e do corpo troncocônico; uma fonte de radiação eletromagnética, para produção de um feixe incidente sobre a corrente de fluido e as partículas; e um detector para detectar a luz emitida ou refletida a partir das partículas dentro da corrente de fluido, em resposta ao feixe. A2. O citômetro de fluxo da reivindicação A1, em que a ponta de bocal chanfrada compreende uma superfície interior e uma superfície exterior. A3. O citômetro de fluxo da reivindicação A2, em que a ponta de bocal compreende uma ponta de bocal de orientação. A4. O citômetro de fluxo da reivindicação A3, em que a superfície interior da ponta de bocal compreende uma geometria de orientação. A5. O citômetro de fluxo de acordo com a reivindicação A4, em que a superfície interior da ponta de bocal transita de uma seção transversal circular para uma seção transversal elíptica, e de seguida, para um orifício de saída circular. A6. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende um chanfro. A7. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações A1-A6, em que o recorte compreende um filete convexo. A8. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações A1-A6, em que o recorte compreende um filete côncavo. A9. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende uma ranhura. A10. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendo ainda uma porção proximal do corpo troncocônico e uma porção distal do corpo troncocônico, em que a porção proximal do corpo troncocônico tem um primeiro ângulo de afunilamento e em que a porção distal do corpo troncocônico tem um segundo ângulo de afunilamento, e em que o segundo ângulo de afunilamento é maior do que o primeiro ângulo de afunilamento. A11. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um entalhe formado no corpo cilíndrico para o posicionamento da ponta de bocal dentro de um conjunto de bocal de um citômetro de fluxo. A12. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende um chanfro, e em que o ângulo do chanfro é cerca do mesmo que um ângulo vertical esperado de emissões produzidas por partículas na corrente de fluido, em resposta ao feixe. A13. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação A12, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada está entre 15 e 60 graus. A14. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação A13, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada é de cerca de 30 graus. A15. O citômetro de fluxo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o conjunto de bocal compreende ainda: um conjunto de bocal; uma entrada de amostra em comunicação fluida com um tubo de injeção possuindo uma saída de amostra, o tubo de injeção estando montado com o conjunto de bocal e estendendo-se ao longo do interior do conjunto de bocal; uma ou mais entradas de revestimento em comunicação fluida com o conjunto de bocal; e em que o orifício de saída do bocal está localizado a jusante da saída de amostra. A16. O citômetro de fluxo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o feixe produziu a fonte de radiação eletromagnética está focado na corrente de fluido a 300 micrômetros do orifício de saída. A17. O citômetro de fluxo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um mecanismo de orientação. A18. O citômetro de fluxo de acordo com a reivindicação A19, em que o mecanismo de ordenação compreende um oscilador em comunicação com a corrente de fluido para produção de gotículas, um pino de carga em comunicação com a corrente de fluido para o carregamento de gotículas enquanto se formam e placas de deflexão para desviar as gotículas carregadas. 81. Uma ponta de bocal compreendendo: um corpo cilíndrico definindo um eixo longitudinal; e um corpo troncocônico adjacente ao corpo cilíndrico sobre o eixo longitudinal, e em comunicação fluida com o corpo cilíndrico, em que o corpo troncocônico termina numa superfície plana transversal ao eixo longitudinal, que tem um orifício de saída do bocal, e em que o corpo troncocônico compreende ainda um recorte na extremidade da superfície plana e do corpo troncocônico. 82. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação B1, em que o recorte compreende um chanfro. 83. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação B1, em que o recorte compreende um filete convexo. 84. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação B1, em que o recorte compreende um filete côncavo. 85. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende uma ranhura. 86. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendo ainda uma porção proximal do corpo troncocônico a partir de uma porção distal do corpo troncocônico, em que a porção proximal do corpo troncocônico tem um primeiro ângulo de afunilamento e em que a porção distal do corpo troncocônico tem um segundo ângulo de afunilamento, e em que o segundo ângulo de afunilamento é maior do que o primeiro ângulo de afunilamento. 87. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o corpo da ponta de bocal compreende uma superfície interior e uma superfície exterior. 88. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação B9, em que a ponta de bocal compreende uma ponta de bocal de orientação. 89. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação B10, em que a superfície interior da ponta de bocal compreende uma geometria de orientação. 810. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a superfície interior da ponta de bocal chanfrada transita de uma seção transversal circular para uma seção transversal elíptica, e de seguida, para um orifício de saída circular. 811. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um entalhe formado no corpo cilíndrico para o posicionamento da ponta de bocal dentro de um conjunto de bocal de um citômetro de fluxo. 812. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende um chanfro, e em que o ângulo do chanfro é cerca do mesmo que o ângulo vertical esperado de emissões produzidas por partículas na corrente de fluido, em resposta ao feixe. 813. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada está entre 15 e 60 graus. 814. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada é de cerca de 30 graus. C1. Uma ponta de bocal para um citômetro de fluxo possuindo uma superfície de fundo plana com um orifício de saída do bocal e extremidade chanfrada na superfície de fundo plana. C2. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda uma porção proximal do corpo troncocônico e porção distal do corpo troncocônico, em que a porção proximal do corpo troncocônico tem um primeiro ângulo de afunilamento e em que a porção distal do corpo troncocônico tem um segundo ângulo de afunilamento, e em que o segundo ângulo de afunilamento é maior do que o primeiro ângulo de afunilamento. C3. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o corpo da ponta de bocal compreende uma superfície interior e uma superfície exterior. C4. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação C5, em que a ponta de bocal compreende uma ponta de bocal de orientação. C5. A ponta de bocal de acordo com a reivindicação C6, em que a superfície interior da ponta de bocal compreende uma geometria de orientação. C6. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a superfície interior da ponta de bocal chanfrada transita de uma seção transversal circular para uma seção transversal elíptica, e de seguida, para um orifício de saída circular. C7. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um entalhe formado no corpo cilíndrico para o posicionamento da ponta de bocal dentro de um conjunto de bocal de um citômetro de fluxo. C8. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o recorte compreende um chanfro, e em que o ângulo do chanfro é cerca do mesmo que o ângulo vertical esperado de emissões produzidas por partículas na corrente de fluido, em resposta ao feixe. C9. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada está entre 15 e 60 graus. C10. A ponta de bocal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada é de cerca de 30 graus. C11. Um sistema de citômetro de fluxo possuindo uma ponta de bocal, tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações anteriores.

[082] Conforme pode ser entendido a partir do precedente, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados de uma variedade de maneiras. Como tal, as modalidades ou elementos particulares da invenção divulgados pela descrição ou mostrados nas figuras ou nas tabelas acompanhando este pedido não se destinam a ser limitantes, mas ao invés exemplares das numerosas e variadas modalidades genericamente englobadas pela invenção ou equivalentes englobados em relação a qualquer seu elemento particular. Adicionalmente, a descrição específica de uma única modalidade ou elemento da invenção pode não descrever explicitamente todas as modalidades ou elementos possíveis; muitas alternativas são implicitamente divulgadas pela descrição e figuras.

[083] Adicionalmente, quanto a cada termo usado, deve ser entendido que a menos que a sua utilização neste pedido seja inconsistente com essa interpretação, definições de dicionário comuns devem ser entendidas como incluídas na descrição para cada termo, como contido no Random House Webster’s Unabridged Dictionary, segunda edição, sendo cada definição incorporada neste documento por referência.

[084] Além disso, para o propósito da presente invenção, o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais daquelas entidades; por exemplo, “um bocal” se refere a um ou mais dos bocais. Como tal, os termos “um” ou “uma”, “um(a) ou mais” e “pelo menos um(a)” podem ser usados indistintamente neste documento.

[085] As reivindicações estabelecidas neste relatório, se existirem, são incorporadas neste documento por referência como parte dessa descrição da invenção, e o requerente expressamente reserva o direito de usar todo ou uma porção de tal conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma ou todas as reivindicações ou qualquer elemento ou componente das mesmas, e o requerente reserva expressamente de modo adicional o direito para mover qualquer porção ou a totalidade do conteúdo incorporado dessas reivindicações ou qualquer elemento ou componente das mesmas a partir da descrição para as reivindicações ou vice-versa conforme necessário para definir a matéria para a qual proteção é solicitada por este pedido ou por qualquer pedido subsequente ou continuação, divisão, ou pedido de continuação em parte do mesmo, ou para obter qualquer benefício, redução em taxas nos termos, ou para respeitar as leis, regras, ou regulamentos de patentes de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado a título de referência deve sobreviver durante toda a pendência deste pedido, incluindo qualquer subsequente continuação, divisão, ou pedido de continuação em parte do mesmo ou qualquer reedição ou extensão no mesmo.

[086] As reivindicações estabelecidas neste relatório, se existirem, são adicionalmente destinadas a descrever os marcos e ligações de um número limitado de modalidades preferidas da invenção e não para serem compreendidas como a modalidade mais ampla da invenção ou uma listagem completa de modalidades da invenção que podem ser reivindicadas. O requerente não renuncia a qualquer direito de desenvolver reivindicações adicionais com base sob a descrição acima apresentada como uma parte de qualquer continuação, divisão ou continuação em parte ou aplicação similar.

Claims (6)

1. Sistema de citômetro de fluxo (10) caracterizado por compreender: um conjunto de bocal (14; 210) para a produção de uma corrente de fluido (16; 236) com partículas, o conjunto de bocal (14; 210) compreendendo uma ponta de bocal de orientação (45; 46) formado a partir de: i) um corpo cilíndrico (80) definindo um eixo longitudinal (82); ii) um corpo troncocônico (84) adjacente ao corpo cilíndrico (80) sobre o eixo longitudinal (82), e em comunicação fluida com o corpo cilíndrico (80), em que o corpo troncocônico (84) termina em uma superfície plana (62) transversal ao eixo longitudinal (82), que tem um orifício de saída do bocal (44; 226), e em que o corpo troncocônico (84) compreende adicionalmente um chanfro (90) na extremidade da superfície plana (62) e do corpo troncocônico (84), o corpo troncocônico (84) compreendendo adicionalmente uma superfície exterior tendo uma porção proximal e uma porção distal, em que a porção proximal do corpo troncocônico (84) tem um primeiro ângulo de afunilamento, e em que a porção distal do corpo troncocônico (84) tem um segundo ângulo de afunilamento, e em que o segundo ângulo de afunilamento é maior do que o primeiro ângulo de afunilamento; e iii) uma superfície interior tendo uma geometria de orientação; um feixe de laser (54) para produção de um feixe incidente sobre a corrente de fluido (16; 236) e as partículas, em que o feixe de laser (54) é colocado a uma distância a partir do orifício de saída (44; 226) que normalmente resultaria na oclusão de sinal fluorescente gerado na interseção do feixe e a corrente de fluido (16; 236); e um detector (32; 334) para detectar a luz emitida ou refletida a partir das partículas dentro da corrente de fluido (16; 236) em resposta ao feixe sem oclusão.

2. Sistema de citômetro de fluxo (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a superfície interior da ponta de bocal transitar de uma seção transversal circular para uma seção transversal elíptica, e em seguida, para um orifício de saída circular.

3. Sistema de citômetro de fluxo (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente um entalhe (88; 120) formado no corpo cilíndrico (80) para o posicionamento da ponta de bocal dentro de um conjunto de bocal (14; 210) de um citômetro de fluxo.

4. Sistema de citômetro de fluxo (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ângulo do chanfro ser cerca do mesmo que o ângulo vertical esperado de emissões produzidas por partículas na corrente de fluido (16; 236), em resposta ao feixe.

5. Sistema de citômetro de fluxo (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada estar entre 15 e 60 graus.

6. Sistema de citômetro de fluxo (10) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ângulo do chanfro na ponta de bocal chanfrada ser de cerca de 30 graus.

Images