BR112015005750B1 - Usos de uma proteína isolada - Google Patents
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Abstract
PROTEÍNAS, USOS DA PROTEÍNA, KIT, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E REAGENTE DIAGNÓSTICO. A invenção refere-se a um novo grupo de inibidores básicos da protease do veneno de cobra que têm atividade antagonista do receptor de vasopressina-2, que podem ser usados em terapia, diagnóstico, formação de imagens médicas, triagem de drogas e pesquisa.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um novo grupo de inibidores básicos da protease do veneno de cobra que têm atividade antagonista do receptor de vasopressina-2, que podem ser usados em terapia, diagnóstico, formação de imagens médicas, triagem de drogas e pesquisa.
[002] Receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de proteínas integrais de membrana. Mais de 800 GPCRs foram identificados, cujos genes subjacentes representam 2 a 3% das sequências codificadoras no genoma humano. Eles participam da regulação da maioria das funções fisiológicas e são os alvos de aproximadamente 30% das drogas atualmente comercializadas. Entre os GPCRs, o subtipo de receptor V2 da arginina-vasopressina (também conhecido como vasopressina-2, vasopressina 2, vasopressina tipo 2 ou receptor V2 e formas abreviadas, AVPR2 ou V2R) é considerado um protótipo de receptores acoplados à via de sinalização adenosina monofosfato cíclica intracelular (cAMP). Ele representa um modelo fundamental e terapêutico.
[003] A arginina-vasopressina (AVP), também conhecida como hormônio antidiurético, é um peptídeo cíclico com 9 aminoácidos produzido no hipotálamo. Ele exerce sua ação através de 3 subtipos de receptores distintos: vasopressina 1a (V1aR), vasopressina 1b (V1br) e vasopressina 2 (V2R). As ações de V1aR e V1br são mediadas através de sua interação com Gq da proteína G que leva a um aumento na concentração intracelular de cálcio. O V1aR é expresso principalmente no fígado, células musculares lisas (vasoconstrição), plaquetas, cérebro, retina e órgãos reprodutivos, enquanto que V1bR é expresso principalmente na glândula pituitária anterior onde o seu estímulo controla o eixo corticotrópico em resposta ao estresse. V1br também é expresso no pâncreas e glândulas adrenais onde ele regula a secreção de glucagon, insulina e catecolaminas. O V2R está localizado no ducto coletor renal onde está acoplado às proteínas Gs. Gs ativa a adenilato ciclase que, por sua vez, leva a uma produção aumentada de AMP cíclico. cAMP ativa a proteína quinase A, que fosforila e ativa os canais de água denominados aquaporinas, responsáveis pela reabsorção de água nos rins. O V2R também é expresso no ouvido interno onde regula sua pressão osmótica.
[004] V2R participa na regulação das principais funções fisiológicas e é um alvo para o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas para tratar diversas patologias. Antagonistas não peptídicos de V2R, chamados de vaptans, têm sido desenvolvidos e testados em numerosos ensaios clínicos, mas a maioria deles não foi aprovada pelas autoridades de autorização de drogas por causa de sua hepatotoxicidade. Atualmente, apenas Tolvaptan (OPC-41061) e Conivaptan (YM-087) foram aprovados pelo FDA e/ou EMEA.
[005] A secreção em excesso de AVP é um fator etiológico chave para doenças como hiponatremia e explica porque o uso de antagonistas de V2R é tão eficiente em condições patológicas caracterizadas por hiponatremia euvolêmica ou hipervolêmica, como SIADH (Síndrome da Secreção de Hormônio Anti-Diurético Inapropriada), cirrose hepática e insuficiência cardíaca congestiva (CHF; Ghali et al., Cardiology, 2008, 111, 147-157). A SIADH é causada pela hipersecreção de AVP, o que leva a uma excessiva retenção de água e, consequentemente, a uma diminuição na concentração de Na+ e edema no pulmão e sistema nervoso central. Por seu efeito diurético, os antagonistas de V2R aumentam ou normalizam os níveis séricos de Na+. Tolvaptan (OPC-41061) e Conivaptan (YM-087) foram aprovados pelo FDA e/ou EMEA em pacientes diagnosticados com hiponatremia euvolêmica ou hipervolêmica, SIADH, insuficiência cardíaca congestiva e cirrose (Arai et al., Curr Opin Pharmacol., 2007, 7, 124-129; Manning et al., Prog. Brain Res., 2008, 170, 473-412). Os antagonistas de V2R podem ser potencialmente benéficos em outras condições patológicas caracterizadas por hiponatremia euvolêmica ou hipervolêmica, como edema cerebral (Walcott et al., Neurotherapeutics, 2012, 9, 65-72).
[006] A NSIAD é devido às mutações em V2R, como R137C e R137L que são responsáveis por uma atividade constitutiva do receptor. Os pacientes apresentam hiponatremia e uma alta osmolalidade urinária apesar dos baixos níveis séricos de vasopressina. Os antagonistas de V2R, Satavaptan e Tolvaptan, tanto em culturas celulares (Tenenbaum et al., PLoS One, 2009, 4, e8333) como em pacientes com NSIAD (Decaux et al., JASN, 2007, 18, 606-612) são incapazes de inibir essa atividade constitutiva.
[007] Essa doença é associada com mutações inativadoras do V2R. Os receptores deficientes são sequestrados dentro das células e não podem ser alcançados por AVP circulantes. Isso leva à poliúria com desidratação severa, particularmente em crianças. Os antagonistas de V2R (vaptans) se comportam como chaperonas fármaco, eles são capazes de penetrar na célula e podem resgatar os receptores mutantes (Morello et al., J. Clin. Investigation, 2000, 105, 887-895). Em alguns casos, isso permite ao receptor ser estimulado por AVP a fim de restaurar o efeito antidiurético (Bernier et al., J. Am. Soc. Nephrol., 2006, 17, 232-243; Robben et al., Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 2007, 292, 253-260). Os vaptans foram testados em ensaios clínicos, mas a maioria deles não foi aprovada pelo FDA por causa de sua hepatotoxicidade (Manning et al., Prog. Brain Res., 2008, 170, 473-512). Atualmente, somente Tolvaptan foi aprovado pelo FDA.
[008] A doença renal policística é caracterizada pelo aparecimento de cistos numerosos que, em última análise, levam ao estágio final de insuficiência renal na maioria dos pacientes. Pacientes com mutação nos genes PKD1 e PKD2 são incapazes de concentrar urina, apesar de terem uma alta concentração de vasopressina no sangue. Os tratamentos disponíveis presentes para esta patologia são diálise ou transplante. Foi demonstrado que os antagonistas de V2R diminuem o curso da doença em diferentes modelos animais de doença renal policística recessiva e dominante que inclui o modelo murino CD1pcy/pcy(Gattone et al., Nature Medicine, 2003, 9, 1323-1326; Torres, V.E., Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 2008, 3, 1212-1218; Wang et al., J. Am. Soc. Nephr., 2008, 19, 102-108). O camundongo CD1pcy/pcy é um modelo para doença renal cística recessiva autossômica que é causada por uma mutação missense no gene NPHP3, que codifica nefrocistina-3, uma proteína envolvida no desenvolvimento e função tubular renal. Essa mutação leva à formação de cistos renais e estágio final de insuficiência renal. Além disso, os ensaios clínicos de Fase III em pacientes com doença renal policística dominante autossômica mostraram que Tolvaptan administrado para pacientes durante 3 anos diminuiu a proliferação de células epiteliais que margeiam os cistadenomas (Higashihara et al., Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 2011, 6, 24992507).
[009] Por interação com arrestina, a estimulação de V2R leva à ativação das vias de sinalização que envolvem cAMP e MAP quinase, dessa forma, favorecendo a resposta proliferativa. Por exemplo, a injeção de AVP no rato induz a proliferação de células epiteliais renais tubulares que podem ser inibidas por antagonistas de V2R (Alonso et al., Endocrinology, 2009, 150, 239250). Além disso, diuréticos como antagonistas de V2R foram capazes de inibir a proliferação de células de câncer renal (Bolignano et al., Urol. Oncol., 2010, 28, 642-647) e de células de câncer pulmonar (Pequeux et al., Endocr. Relat. Cancer, 2004, 11, 871-885. Esses resultados indicam que os antagonistas de V2R são bons candidatos terapêuticos contra diferentes tipos de câncer.
[0010] O fator de Von Willebrand (VWF) está envolvido na hemostasia primária. Foi demonstrado que AVP e também o agonista específico de V2R, dDAVP (minirin®), aumentam os níveis de VWF e fator VIII através de sua interação com V2R (Kaufmann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106, 107-116). Um excesso na coagulação pode levar à trombose (coágulos), que pode ser curada pelo uso de antagonistas de V2R, dessa forma, limitando a secreção de fatores de coagulação.
[0011] Na França, a incidência da doença de Ménière é estimada como sendo de 1/13.300. Sua patogênese é amplamente desconhecida. O inchaço endolinfático é considerado um sinal patognomônico. Este pode resultar tanto da hipersecreção endolinfática ou da reabsorção ineficiente. A patologia Ménière do ouvido interno parece ser a origem para sintomas como vertigem, náuseas, zumbido e perda da audição. Acredita-se que a pressão aumentada na cóclea compromete a capacidade das células ciliares para detectar corretamente as ondas sonoras ou movimentos (Kitahara et al., J. Neuroendocrinol., 2008, 20, 1295-1300). Atualmente, o tratamento com acetazolamida (diamox) é usado, o que inibe a anidrase carbônica e age como diurético hipocaliêmico. Por redução da pressão osmótica dentro do ouvido interno, V2R pode ser usado para tratamento da doença de Ménière.
[0012] Embora vaptans tenham provado claramente o efeito terapêutico dos antagonistas V2R em várias patologias, seu uso terapêutico é limitado por alguns grandes inconvenientes: - Vaptans são hepatotóxicos devido a seu efeito inibidor no citocromo CYP3A4. Por essa razão, seu uso necessita de um firme monitoramento dos pacientes e sua administração em longo prazo é limitada. Alguns deles são injetados somente intravenosamente, o que restringe seu uso a pacientes hospitalizados. - Vaptans tem alguma seletividade somente para V2R com índice de seletividade V2/V1a que varia de 112 (Satavaptan) a 0,15 (Conivaptan). - Vaptans são agonistas para ativação da MAP quinase. Portanto, são incapazes de bloquear completamente as vias de sinalização específicas associadas a V2R. - Vaptans são pouco solúveis em tampões fisiológicos e tem biodisponibilidade limitada (Bernier et al., JASN, 2006, 17, 591-).
[0013] Portanto, há uma necessidade de novos antagonistas de V2R com propriedades aprimoradas para uso terapêutico, particularmente com seletividade para V2R aumentada e toxicidade reduzida, em comparação aos antagonistas de V2R não peptídicos disponíveis atualmente.
[0014] Domínios Kunitz são os domínios ativos dos inibidores de protease tipo Kunitz. Eles são relativamente pequenos com um comprimento de cerca de 50 a 60 aminoácidos e uma estrutura que é um dobramento alfa e beta rico em dissulfetos. A maioria das sequências que têm esse domínio pertencem à família de inibidores de tripsina pancreática bovina/kunitz que inclui inibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI ou inibidor de protease básica) e inúmeros outros membros como inibidores de protease básica de veneno de cobra como dendro toxinas, inibidores de inter-alfa-tripsina de mamíferos, tripstatina, um domínio encontrado em uma forma de splicing alternativo da proteína amilóide de Alzheimer, domínios no C-terminal de cadeias alfa-1 e alfa-3 de colágenos tipo VI e tipo VII, precursor de inibidor da via do fator tecidual e inibidor de protease STI Kunitz contido em sementes de leguminosas.
[0015] As dendro toxinas são um grupo de neurotoxinas isoladas do veneno de mamba negra (Dendroaspis polyepis polyepis) e de mamba verde oriental (Dendroaspis angusticeps) que são bloqueadores seletivos de subtipos particulares de canais de potássio dependentes de voltagem nos neurônios que, através disso, melhoram a liberação de acetilcolina nas junções neuromusculares. Devido à sua alta potência e seletividade para canais de potássio, as dendro toxinas representam agentes farmacológicos úteis para estudar a estrutura e a função dessas proteínas de canal iônico e para tratar doenças humanas (documento WO 2007/019267). As dendro toxinas são proteínas pequenas que consistem em uma cadeia peptídica simples de menos de 100 aminoácidos, geralmente cerca de 57 a 60 aminoácidos, que se dobram na estrutura Kunitz, por exemplo, um dobramento alfa e beta rico em dissulfetos composto de 3 pontes dissulfeto com a conectividade 1-6, 2-4, 3-5 e arranjado para formar uma folha beta antiparalela de 2 fitas torcidas por uma alfa hélice (Berndt et al., J. Mol. Biol., 1993, 234, 735-750).
[0016] Os inventores isolaram uma nova toxina da cobra mamba verde e demonstraram que essa toxina, chamada U-Da2a, que é um membro dos inibidores de protease básica de veneno de cobra da família de inibidores de tripsina pancreática bovina/kunitz, é um antagonista de V2R competitivo e seletivo. Também descobriram que o motivo do aminoácido nas posições 15 a 18 da sequência U-Da2a é essencial para a atividade antagonista competitiva de U-Da2a para V2R e que outro inibidor de protease básica de veneno de cobra que tem o motivo similar nesta posição também era antagonista de V2R, enquanto o inibidor de protease básica de veneno de cobra que não tem este motivo não é antagonista de V2R. Este resultado permite definir um novo grupo de inibidor de protease básica de veneno de cobra que tem atividade antagonista V2R, o que inclui dendro toxinas novas e conhecidas que tem esse motivo de aminoácido específico.
[0017] Como peptídeo antagonista de V2R, as proteínas desse grupo de inibidor de protease básica de veneno de cobra podem ser usadas para várias aplicações que incluem terapia, diagnóstico, predição de resposta ao tratamento, formação de imagens médicas, triagem de droga e pesquisa. Em específico, essas proteínas fornecem bons candidatos terapêuticos para o tratamento de patologias que envolvem a via de V2R como hiponatremia e doença renal policística.
[0018] Um aspecto da invenção refere-se a uma proteína isolada, que compreende uma sequência de aminoácidos (I) que é pelo menos 50% idêntica aos resíduos 1 a 57 de SEQ ID NO: 1, e que compreende: (i) um motivo X1X2X3X4 nas posições 15 a 18 de SEQ ID NO: 1, em que X1 é uma asparagina (N), X2 é uma glicina (G), X3 e X4 são aminoácidos hidrofóbicos ou X1 é uma metionina (M), X2 e X3 são fenilalaninas (F) e X4 é uma isoleucina (I), e (ii) uma a três pontes dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína, para uso como antagonista do receptor de vasopressina-2 (V2R) no tratamento de doenças que envolvem a via de V2R.
[0019] Na descrição a seguir, o padrão de código de aminoácido de uma letra é usado. Aminoácidos hidrofóbicos referem-se a M, W, F, A, V, L, I, Y e P.
[0020] A proteína para os diferentes usos de acordo com a invenção, que pode ser natural, recombinante ou sintética, compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos (I). A sequência (I) é uma toxina farmacologicamente ativa que tem atividade antagonista de V2R competitiva, chamada proteína, peptídeo ou toxina. A proteína para os diferentes usos de acordo com a invenção tem a estrutura tipo Kunitz típica de dendro toxinas, que é uma folha beta antiparalela de duas fitas torcidas seguida por uma alfa- hélice, e compreende de uma a três pontes dissulfeto para estabilizar a proteína e contribuir para sua conformação estrutural.
[0021] Essas propriedades podem ser facilmente verificadas por técnicas conhecidas pelos técnicos no assunto, como aquelas descritas nos Exemplos do presente pedido.
[0022] A invenção engloba o uso de uma proteína que compreende ou consiste em aminoácidos naturais (aminoácidos em uma configuração L e/ou D codificados por 20 genes) ligados através de uma ligação peptídica, bem como peptídeos miméticos dessa proteína onde as ligações de aminoácidos e/ou peptídeos foram substituídas por análogos funcionais. Esses análogos funcionais incluem todos os aminoácidos conhecidos, exceto os ditos aminoácidos codificados pelos 20 genes. Uma lista não limitante de aminoácidos não codificados é fornecida na Tabela 1A da patente US 2008/0234183 que é incorporada no presente pedido como referência. A invenção também compreende proteínas modificadas derivadas das proteínas acima por introdução de qualquer modificação em um ou mais resíduos de aminoácidos, ligações peptídicas, extremidades N- e/ou C-terminal da proteína, desde que a atividade antagonista de V2R seja mantida na proteína modificada. Essas modificações que são introduzidas na proteína por métodos convencionais conhecidos pelos técnicos no assunto, incluem, de uma maneira não limitante: a substituição de um aminoácido natural por um aminoácido não proteinogênico (aminoácido D ou aminoácido análogo); a modificação da ligação peptídica, em específico com uma ligação do tipo retro ou retroinverso, ou uma ligação diferente da ligação peptídica; a ciclização, e a adição de um grupo químico à cadeia lateral ou às extremidades da proteína, em específico para acoplamento de um agente de interesse à proteína da invenção. Essas modificações podem ser usadas para marcar a proteína, e para aumentar sua afinidade para V2R, sua biodisponibilidade e/ou sua estabilidade.
[0023] A identidade da sequência de aminoácido percentual é definida como o percentual de resíduos de aminoácido em uma Sequência Comparada que é idêntica à Sequência de Referência SEQ ID NO: 1 após alinhamento das sequências e introdução de gaps se necessário, para atingir a máxima identidade de sequência. A identidade percentual é então determinada de acordo com a seguinte fórmula: Identidade percentual = 100 x [1- (C/R)],
[0024] em que C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência SEQ ID NO: 1 e a Sequência Comparada ao longo de todo o comprimento de SEQ ID NO: 1 (isto é, posições 1 a 57 da SEQ ID NO: 1), em que (i) cada aminoácido na Sequência de Referência que não tem um aminoácido alinhado correspondente na Sequência Comparada, (ii) cada gap na Sequência de Referência, e (iii) cada aminoácido alinhado na Sequência de Referência que é diferente de um aminoácido na Sequência Comparada constitui uma diferença; e R é o número de aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento de alinhamento com a Sequência Comparada, com qualquer gap criado na Sequência de Referência sendo também contado como um aminoácido.
[0025] Alinhamento para propósito de determinar a identidade de sequência de aminoácidos percentual pode ser obtido de várias maneiras conhecidas por um técnico no assunto, por exemplo, com o uso do programa de computação disponível publicamente, como BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Com o uso desse programa de computação, os parâmetros padrão, por exemplo, para penalidade de gap e penalidade de extensão, são preferencialmente usados. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão o comprimento de palavra (W) de 3 e uma expectativa (E) de 10.
[0026] Por exemplo, o alinhamento de Blackelin-3 (SEQ ID NO: 5; 83 aminoácidos) com U-Da2a (SEQ ID NO: 1) presente na figura 1B mostra que ao longo do comprimento de alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada, por exemplo, todo o comprimento da SEQ ID NO: 1 (posições 1 a 57 da SEQ ID NO: 1), não há gap na Sequência de Referência, não há gap na Sequência Comparada e 23 aminoácidos na Sequência de Referência que são diferentes da sequência de aminoácidos alinhada na Sequência Comparada. Portanto, C = 23 e R = 57. A identidade percentual = 100 x [1- (23/57)]. Blackelin-3 compreende uma sequência de aminoácidos que é 60% idêntica às posições 1 a 57 da SEQ ID NO: 1.
[0027] Em uma realização preferencial, a proteína compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos (I) que é pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica aos resíduos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a sequência (I) é pelo menos 60% idêntica aos resíduos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1. Mais preferencialmente, ela é pelo menos 65% idêntica aos resíduos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1.
[0028] Em outra realização preferencial, a sequência (I) compreende um motivo X1X2X3X4 selecionado a partir do grupo que consiste em NGFF e NGLF.
[0029] Em outra realização preferencial, a sequência (I) tem mais de 100 aminoácidos, mais preferencialmente cerca de 60 aminoácidos, e é selecionada a partir do grupo que consiste em SED ID NO: 1 e uma sequência que difere da SEQ ID NO: 1 por deleções dispersas e/ou inserções de um a cinco aminoácidos na SEQ ID NO: 1, e/ou substituições e/ou deleções terminais de 1 a 30, preferencialmente 1 a 15, 1 a 10 ou 1 a 5 aminoácidos.
[0030] As deleções e/ou inserções são escolhidas de forma vantajosa a partir de: (i) deleções/inserções dispersas de um a cinco aminoácidos únicos na SEQ ID NO: 1, e (ii) deleções terminais de 1 a 5 aminoácidos em uma ou ambas as extremidades da SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, as deleções terminais são escolhidas de uma deleção N- terminal de 1, 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de 1 ou 2 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[0031] As substituições na SEQ ID NO: 1 são escolhidas de forma vantajosa de 1 a 10, preferencialmente 1 a 5 substituições conservativas, isto é, substituição de um aminoácido por outro que tem propriedades químicas ou físicas similares (tamanho, carga ou polaridade), que geralmente não modifica as propriedades funcionais da proteína. Mais preferencialmente, as chamadas substituições conservativas são escolhidas em um dos 5 grupos seguintes: Grupo 1 - resíduos alifáticos pequeno, não polares ou ligeiramente polares (A, S, T, P, G); Grupo 2 - resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas (D, N, E, Q); Grupo 3 - resíduos polares, carregados positivamente (H, R, K); Grupo 4 - resíduos alifáticos grandes, não polares (M, L, I, V, C); e Grupo 5 - resíduos grandes, aromáticos (F, Y, W).
[0032] Os resíduos de cisteína nas posições 5 e 55, 14 e 38 e/ou 30 e 51 da SEQ ID NO: 1 são não mutados de forma vantajosa.
[0033] Preferencialmente, a proteína compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 5, uma variante de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 3 que compreende uma deleção N-terminal de 1, 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de 1 ou 2 resíduos de aminoácidos, e uma variante de SEQ ID NO: 5 ou 6 que compreende uma deleção N-terminal de um a trinta resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de um ou dois resíduos de aminoácidos. Exemplos dessas proteínas preferenciais são SEQ ID NO: 11 a 13.
[0034] Em outra realização, a sequência (I) compreende uma a três (uma, duas ou três), preferencialmente três, pontes dissulfeto escolhidas a partir de pontes dissulfeto entre C1 e C6, C2 e C4, C3 e C5, em que cada um de C1 a C6 é um resíduo de cisteína, numerado respectivamente a partir do N- terminal ao C-terminal da dita sequência (I). Exemplos dessas proteínas são SEQ ID NO: 1 e 16, que compreendem três e duas ligações dissulfeto, respectivamente. Preferencialmente, C1 está nas posições 1 a 31, mais preferencialmente 1 a 15, 1 a 10 ou 1 a 5 (1, 2, 3, 4 ou 5) da dita sequência (I) e está separada de C6 por 50 ± 2 aminoácidos; C2 e C4, C3 e C5 estão separados por 25 ± 2 e 20 ± 2 aminoácidos, respectivamente. Mais preferencialmente, C1 a C6 estão nas posições 5, 14, 30, 38, 51 e 55, respectivamente da SEQ ID NO: 1. Além disso, C1 e/ou C6 são, de forma vantajosa, o primeiro e o último resíduo, respectivamente, da dita proteína.
[0035] Em outra realização preferencial, a proteína é uma proteína modificada desprovida de quatro resíduos N-terminais e dois C- terminais da SEQ ID NO: 1, em que a função NH2 de C1 é bloqueada quimicamente, por exemplo, por acetilação, e a função COOH de C6 é também bloqueada quimicamente, por exemplo, por amidação. O peptídeo é um peptídeo cíclico, conhecido por ser muito mais resistente a exoproteases.
[0036] Em outra realização preferencial, a proteína é uma proteína modificada em que um ou mais resíduos de aminoácidos marcados por endoproteases são substituídos por sua forma D não natural correspondente. Por exemplo, um ou mais resíduos de arginina e/ou lisina que são alvos para tripsina podem ser substituídos por sua forma não natural correspondente.
[0037] Em outra realização preferencial, a proteína é uma proteína modificada, em que uma ou mais pontes dissulfeto são substituídas por ligações não naturais. Preferencialmente, a dita ligação não natural é resistente à redução, como, por exemplo, um ligante tiazolidina. Esses ligantes aumentam a resistência da proteína da invenção por redução de agentes presentes nos fluidos biológicos.
[0038] Em outra realização preferencial, a proteína é uma proteína de fusão ou quimérica, que compreende uma sequência (II) fusionada a uma extremidade da sequência (I) e, opcionalmente, outra sequência (III) fusionada a outra extremidade da dita sequência (I). O comprimento da proteína não é crítico à invenção, desde que a atividade antagonista de VR2 seja mantida. As sequências (II) e (III) compreendem um ou mais de outros componentes da proteína/peptídeo, incluindo aqueles que permitem a purificação, detecção, imobilização, e/ou direcionamento celular da proteína da invenção, e/ou que aumentam a afinidade a V2R, a biodisponibilidade, a produção em sistemas de expressão e/ou estabilidade da dita proteína. Esses componentes podem ser selecionados a partir de: (i) um componente de marcação, como uma proteína fluorescente (GFP e suas derivadas, BFP e YFP), (ii) um componente repórter, como uma enzima marcadora (luciferase, fosfatase alcalina, glutationa-S-transferase (GST), β-galactosidase), (ii) um componente de ligação como um epítopo marcador (polyHis6, FLAG, HA, myc.), um domínio de ligação de DNA, um domínio de ligação de hormônio, um marcador polilisina para imobilização em um suporte, (iii) um componente estabilizador como ZZ, DsBa e DsBb, e (iv) um componente de direcionamento para endereçar a proteína quimérica a um tipo celular específico ou compartimento celular. Além disso, as sequências (II) e/ou (III), de forma vantajosa, compreendem um ligante que é longo o suficiente para evitar interações inibitórias entre a sequência (I) e as sequências (II) e/ou (III). O ligante também pode compreender um sítio de reconhecimento para uma protease, por exemplo, para remoção de marcadores de afinidade e componentes estabilizadores da proteína quimérica purificada, de acordo com a presente invenção.
[0039] Em outra realização preferencial, a proteína é acoplada a um agente que aumenta sua biodisponibilidade e, em específico, reduz sua eliminação urinária como, por exemplo, polietilenoglicol.
[0040] A invenção engloba o uso de um polinucleotídeo que codifica a proteína sob a forma capaz de ser expressa, ou um vetor recombinante que compreende o dito polinucleotídeo. O polinucleotídeo que codifica a proteína sob a forma capaz de ser expressa refere-se a uma molécula de ácido nucleico que, mediante expressão em uma célula ou um sistema livre de célula, resulta em uma proteína funcional.
[0041] De acordo com a invenção, a proteína, polinucleotídeo e/ou vetor podem ser incluídos em uma composição farmacêutica, que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0042] A composição farmacêutica é formulada para administração por uma série de rotas, que inclui, mas não se limita à oral, parenteral e local. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são aqueles convencionalmente usados.
[0043] Além disso, a proteína pode ser modificada, de forma vantajosa, por meios bem conhecidos pelos técnicos no assunto, a fim de alterar suas propriedades fisiológicas, e em específico a fim de aprimorar seu tempo de meia-vida no organismo (glicosilação: HAUBNER R. et al., J. Nucl. Med., 2001, 42, 326-36; conjugação com PEG: KIM TH. et al., Biomaterials, 2002, 23, 2311-7), sua solubilidade (hibridização com albumina: KOEHLER MF. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002, 12, 2883-6), sua resistência a proteases (aminoácidos não naturais (conformação D, por exemplo)), e/ou sua absorção intestinal (Lien et al., TIB, 2003, 21, 556).
[0044] A composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína/polinucleotídeo/vetor, por exemplo, suficiente para mostrar benefício ao indivíduo para o qual foi administrada. A dose farmaceuticamente efetiva depende da composição usada, da rota de administração, do tipo de mamífero (humano ou animal) sendo tratado, das características físicas do mamífero específico em consideração, medicação concorrente e outros fatores, que os técnicos nos assuntos médicos reconhecerão.
[0045] A invenção também fornece um método para tratar um paciente com necessidade de tratamento de uma patologia que envolve a via de V2R, que compreende: administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva da proteína, polinucleotídeo e/ou vetor ao paciente.
[0046] Patologias que envolvem a via de V2R incluem, sem limitações: (i) condições patológicas caracterizadas por hiponatremia euvolêmica ou hipovolêmica, como insuficiência cardíaca congestiva (CHF), cirrose, Síndrome da Secreção do Hormônio Antidiurético Inapropriada (SIADH) e edema cerebral, (ii) Síndrome Nefrogênica da Antidiurese Inapropriada (NSIAD), (iii) Diabetes Insipidus Congênita Nefrogênica (cNDI), (iv) Doença renal policística, (v) cânceres, que incluem câncer renal e pulmonar, (vi) trombose, e (vii) doença de Ménière.
[0047] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso da proteína como reagente de diagnóstico ou de imagem que pode ser aplicado na formação de imagens ópticas, formação de imagens de ressonância magnética (MRI) e tomografia de emissão de pósitrons (PET) para detecção de V2R in situ (in vitro ou in vivo) sob condições fisiológicas ou patológicas, ou em resposta a um estímulo endógeno ou exógeno, para propósitos de diagnóstico ou de pesquisa. A proteína também é usada como uma ferramenta de triagem da droga, para triagem de ligantes V2R, que inclui agonistas e antagonistas de V2R.
[0048] Em uma realização preferencial, a proteína é acoplada a um agente marcador que produz um sinal detectável e/ou quantificável, em específico um agente radioativo, magnético ou luminescente (radioluminescente, quimioluminescente, bioluminescente, fluorescente ou fosforescente). A proteína marcada pode ser marcada diretamente ou indiretamente, através de ligações covalentes ou não covalentes, com o uso de técnicas de conjugação padrão que são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Exemplos de agentes marcadores incluem isótopos radioativos como Tecnécio-99 (99Tc), Fluorina 18 (18F), Trítio (3H) e Iodina (125I); agentes luminescentes como AlexaFluor, FITC e cianina 3; agentes de contraste paramagnéticos como componentes gadolínio, e agentes de contraste superparamagnéticos como nanopartículas de óxido de ferro.
[0049] Em uma realização mais preferencial, a proteína marcada é ligada covalentemente a um agente radioativo ou fluorescente.
[0050] O acoplamento covalente do agente marcador à proteína, por exemplo, um agente fluorescente ou radioativo, pode ser conseguido por: (i) incorporação do agente marcador na extremidade N- ou C-terminal da proteína durante a síntese química da proteína, ou (ii) incorporação de um grupo reativo (componente cisteína, biotinina, azida livre) em uma proteína recombinante ou sintética, e então usando o grupo para ligar o agente de marcação covalentemente.
[0051] Preferencialmente, o agente de marcação é ligado covalentemente ao N- ou C-terminal da proteína devido às extremidades da proteína não estarem envolvidas na sua ligação a V2R.
[0052] Um assunto da presente invenção é também o uso da proteína, in vitro, para diagnosticar uma patologia que envolve um aumento ou diminuição no nível de expressão de V2R.
[0053] Outro assunto da presente invenção é a proteína para uso, in vivo, para diagnosticar uma patologia que envolve um aumento ou diminuição no nível de expressão de V2R.
[0054] Para aplicações diagnósticas, a proteína marcada é usada para visualizar a expressão de V2R, in situ, em um tecido de um paciente, e avaliar seu nível de expressão em comparação ao mesmo tipo de tecido de um indivíduo saudável. A superexpressão de V2R é indicativa de uma condição patológica como câncer, enquanto a subexpressão de V2R é indicativa de uma condição patológica como Diabetes Insipidus Congênita Nefrogênica (cNDI). Uma vez que o diagnóstico tenha sido estabelecido, é possível decidir sobre um tratamento efetivo para o paciente diagnosticado, que inclui o uso de antagonistas de V2R, por exemplo, para tratar câncer ou cNDI.
[0055] Um assunto da presente invenção é também o uso da proteína como uma ferramenta de pesquisa para estudar V2R.
[0056] Outro assunto da presente invenção é um método para detectar V2R, in vitro e in vivo, que compreende pelo menos as etapas de: - trazer as células para serem analisadas em contato com a proteína marcada, e - detectar as células marcadas.
[0057] A marcação das células é, em específico, marcação fluorescente ou marcação magnética, detectável por qualquer técnica conhecida pelos técnicos no assunto (microscopia fluorescente, citometria de fluxo, formação de imagens por ressonância magnética).
[0058] A detecção dos receptores, in vivo, no corpo de um mamífero (formação de imagem celular), em específico em tempo real, compreende uma etapa anterior da administração do dito peptídeo ao dito mamífero (injeção parenteral, administração oral).
[0059] Outro assunto da presente invenção é o uso da proteína para triagem de ligantes de V2R.
[0060] Um assunto da presente invenção é também um método para triagem de ligantes de V2R, que compreende: - incubar V2R com uma molécula de teste e a proteína marcada, e - medir o sinal obtido na presença e na ausência da molécula teste, em que um sinal menor na presença da molécula em comparação ao controle sem molécula de teste indica que a molécula de teste é um ligante de V2R.
[0061] O efeito agonista, antagonista dos ligantes identificados em V2R é então testado nas células que expressam V2R com o uso de ensaios farmacológicos que são bem conhecidos na técnica, como aqueles divulgados nos Exemplos do presente pedido.
[0062] Outro assunto da presente invenção é o uso da proteína como um agente de cristalização para produção de cristais de V2R. Cristais de V2R são então analisados por difração de raios-X para determinar a estrutura tridimensional de V2R.
[0063] Outro aspecto da invenção é uma proteína isolada que compreende uma sequência de aminoácidos (I) que é pelo menos 70% idêntica aos resíduos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1 e compreende: (i) um motivo X1X2X3X4 nas posições 15 a 18 de SEQ ID NO: 1, em que X1 é uma asparagina (N), X2 é uma glicina (G), X3 e X4 são aminoácidos hidrofóbicos, e (ii) pelo menos uma ligação dissulfeto entre dois resíduos de cisteína, e em que a dita proteína tem atividade antagonista de V2R.
[0064] A proteína da invenção compreende a proteína da SEQ ID NO: 1, chamada U-Da2a, proteína U-Da2a, peptídeo U-Da2a ou toxina U- Da2a.
[0065] A proteína da invenção pertence a um subgrupo do grupo de proteínas que é usado na presente invenção. Portanto, a proteína da invenção tem o dobramento Kunitz característico do inibidor de protease básica de veneno de cobra e atividade antagonista de V2R. A proteína da invenção é uma proteína natural, recombinante ou sintética que pode ser modificada, quimérica e/ou marcada, conforme explicado antes para as proteínas usadas na presente invenção.
[0066] A proteína da presente invenção possui as seguintes características vantajosas além das conhecidas dos antagonistas de V2R não peptídicos: - é um ligante altamente seletivo de V2R com seletividade absoluta para V2R contra outros 150 GPCRs e 8 canais iônicos cardíacos. Por exemplo, U-Da2a tem um índice de seletividade V2R/V1a que é superior a 10.000. Uma alta afinidade e forte seletividade combinadas podem permitir reduzir as doses terapêuticas e consequentemente os efeitos colaterais secundários. - ela tem afinidades nanomolares para V2R. - ela é o primeiro antagonista seletivo e competitivo que é capaz de bloquear as três maiores vias de sinalização de V2R, por exemplo, accúmulo de cAMP, recrutamento de arrestina e fosforilação de MAP quinase, e como tal pode levar a uma nova classe de terapêuticos, - ela é capaz de atingir o alvo V2R in vivo e produzir um forte efeito diurético sem qualquer toxicidade com o uso de dose de saturação diária durante pelo menos 90 dias. - Como um peptídeo, mostra propriedades adicionais interessantes: sem toxicidade a partir dos produtos de degradação do peptídeo, uma solubilidade perfeita em água, não deve cruzar a barreira hematoencefálica e, então, não deve afetar a função dos receptores no sistema nervoso central, e é uma estrutura química líder para a geração de ferramentas diagnósticas.
[0067] Em uma realização preferencial, a proteína da invenção compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos (I) que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica aos resíduos 1 a 57 da SEQ ID NO: 1.
[0068] Em outra realização preferencial, a sequência (I) tem mais de 75 aminoácidos, mais preferencialmente cerca de 60 aminoácidos, e é selecionada a partir do grupo que consiste em SED ID NO: 1 e uma sequência que difere da SEQ ID NO: 1 por deleção, inserção, e/ou substituição de 1 a 15, preferencialmente 1 a 10, mais preferencialmente 1 a 5 aminoácidos.
[0069] As deleções e/ou inserções são escolhidas de forma vantajosa a partir de: (i) deleções/inserções dispersas de um a cinco aminoácidos únicos na SEQ ID NO: 1, e (ii) deleções terminais de 1 a 5 aminoácidos em uma ou ambas as extremidades da SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, as deleções terminais são escolhidas de uma deleção N- terminal de 1, 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de 1 ou 2 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[0070] As substituições na SEQ ID NO: 1 são escolhidas de forma vantajosa de 1 a 10, preferencialmente 1 a 5 substituições conservativas. Os resíduos de cisteína nas posições 5 e 55, 14 e 38 e/ou 30 e 51 da SEQ ID NO: 1 são não mutados de forma vantajosa.
[0071] Preferencialmente, a proteína da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma variante da SEQ ID NO: 5 ou 1 que compreende uma deleção N-terminal de 1, 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de 1 ou 2 resíduos de aminoácidos. Exemplos dessas proteínas preferenciais são SEQ ID NO: 11 a 13.
[0072] Em outra realização, a sequência (I) compreende uma a três (uma, duas ou três), preferencialmente três, pontes dissulfeto escolhidas a partir de pontes dissulfeto entre C1 e C6, C2 e C4, C3 e C5, em que cada um de C1 a C6 é um resíduo de cisteína, numerado respectivamente a partir do N- terminal ao C-terminal da dita sequência (I). Exemplos dessas proteínas são SEQ ID NO: 1 e 16, que compreendem três e duas ligações dissulfeto, respectivamente. Preferencialmente, C1 está nas posições 1 a 5 (1, 2, 3, 4 ou 5) da dita sequência (I) e está separado de C6 por 50 ± 2 aminoácidos; C2 e C4, C3 e C5 estão separados por 25 ± 2 e 20 ± 2 aminoácidos, respectivamente. Mais preferencialmente, C1 a C6 estão nas posições 5, 14, 30, 38, 51 e 55, respectivamente da SEQ ID NO: 1. Além disso, C1 e/ou C6 são, de forma vantajosa, o primeiro e o último resíduo, respectivamente, da dita proteína.
[0073] Outro assunto da invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína da invenção. O polinucleotídeo sintético ou recombinante pode ser DNA, RNA ou combinação dos mesmos, tanto fita simples e/ou dupla. Preferencialmente, o polinucleotídeo compreende uma sequência codificadora que é otimizada para o hospedeiro no qual a proteína é expressa.
[0074] Outro aspecto da invenção refere-se a um vetor recombinante que compreende o dito polinucleotídeo. Preferencialmente, o dito vetor recombinante é um vetor de expressão capaz de expressar o dito polinucleotídeo quando transfectado ou transformado em uma célula hospedeira, como uma célula de mamífero, bacteriana ou fúngica. O polinucleotídeo é inserido no vetor de expressão na orientação adequada e quadro de leitura correto para expressão. Preferencialmente, o polinucleotídeo é ligado de forma funcional a pelo menos uma sequência reguladora transcricional e, opcionalmente, a pelo menos uma sequência reguladora da tradução. Os vetores recombinantes incluem vetores usuais usados na elaboração genética e terapia gênica que incluem, por exemplo, vetores plasmidiais e virais.
[0075] Um aspecto adicional da invenção fornece uma célula hospedeira transformada com o dito polinucleotídeo ou vetor recombinante.
[0076] O polinucleotídeo, vetor, célula da invenção são úteis para a produção da proteína da invenção com o uso de técnicas de DNA recombinante bem conhecidas.
[0077] Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica, que compreende pelo menos uma proteína, polinucleotídeo e/ou vetor da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma proteína, polinucleotídeo e/ou vetor da invenção como um medicamento.
[0078] Outro aspecto da invenção refere-se a um reagente de diagnóstico que compreende uma proteína da invenção, preferencialmente uma proteína marcada.
[0079] A invenção fornece também um kit , que compreende: (a) um recipiente que contém um ou mais dentre: uma proteína, polinucleotídeo, vetor recombinante, célula hospedeira modificada, composição farmacêutica, reagente de diagnóstico ou de formação de imagens da invenção, sob a forma de solução ou liofilizado; (b) opcionalmente, um segundo recipiente que contém uma solução diluente ou reconstituinte para a formulação liofilizada; (c) opcionalmente, um terceiro recipiente que contém um receptor V2R isolado ou célula hospedeira capaz de expressar V2R sob forma de solução ou liofilizada e, opcionalmente, instruções para o uso das soluções e/ou a reconstituição e/ou uso das formulações liofilizadas.
[0080] O V2R de acordo com a invenção é de qualquer mamífero. Preferencialmente, é V2R humano.
[0081] O polinucleotídeo, de acordo com a invenção, é preparado por métodos convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, é produzido por amplificação de uma sequência de ácido nucleico por PCR ou RT-PCR, por triagem de bibliotecas de DNA genômico por hibridização com uma sonda homóloga, ou então por síntese química total ou parcial. Os vetores recombinantes são construídos e introduzidos nas células hospedeiras por técnicas de DNA recombinante convencional ou de elaboração genética, que são conhecidas na técnica.
[0082] A proteína é preparada por técnicas convencionais conhecidas pelos técnicos no assunto, em específico, por síntese em fase sólida ou fase líquida ou por expressão de DNA recombinante em um sistema celular adequado (eucarionte ou procarionte). Mais especificamente, a proteína e seus derivados podem ser sintetizados em fase sólida, de acordo com a técnica Fmoc, originalmente descrita por Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-), e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa; a proteína e seus derivados também podem ser produzidas a partir dos cDNAs correspondentes, obtidos por qualquer meio conhecido pelos técnicos no assunto, o cDNA é clonado em vetor de expressão eucarionte ou procarionte e a proteína produzida nas células modificadas com o vetor recombinante é purificada por qualquer meio adequado, em específico por cromatografia de afinidade.
[0083] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais que estão dentro da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura.
[0084] Em adição aos arranjos acima, a invenção também compreende outros arranjos, que surgirão a partir da descrição que se segue, os quais se referem a realizações exemplares do assunto da presente invenção, com referência aos desenhos anexos em que: - A Figura 1 representa o alinhamento da sequência de U-Da2a com outras toxinas conhecidas. A. Dendrotoxina-B (Dtx-B Ala 27 ou Dtx-B-A27; SWISSPROT P00983.1; SEQ ID NO: 2); Dendrotoxina-E His55 (DTx-E-H55; SWISSPROT P00984.1; SEQ ID NO: 6); Mulgin-1 (GenBank AAT45400.1; SEQ ID NO: 4); Blackelin-3 (GenBank ABV64393; SEQ ID NO: 5); Dendrotoxina-K (Dtx-K; SWISSPROT P00981.2; SEQ ID NO: 8); Alfa-Dendrotoxina (Alfa-Dtx; SWISSPROT P00980.1; SEQ ID NO: 9); Inibidor de Tripsina Pancreática Bovina (BPTI; SWISSPROT P00974.2; SEQ ID NO: 10). A identidade percentual está indicada na direita. B. Alinhamento de U-Da2a com Blackelin-3 que ilustra a determinação da identidade percentual. - A Figura 2 ilustra a inibição de ligação de 3H-AVP por U-Da2a em diferentes subtipos de receptores de vasopressina expressos em células eucariontes. (O) V1aR. (O) V1bR. (■) V2R. - A Figura 3 ilustra os efeitos tóxicos de U-Da2a na produção de cAMP induzida por AVP em células CHO que expressam estavelmente V2R humano. A. Curvas de dose-resposta induzida por AVP em V2R na ausência (•) ou na presença de concentrações crescentes de U-Da2a 20 nM (), 60 nM (), 150 nM (), 300 nM () e 500 nM (). 20 nM (■), 60 nM (A), 150 nM (O),300 nM (□) e 500 nM (♦). B. Representação Schild dos efeitos da toxina U-Da2a na produção de cAMP induzida por concentrações crescentes de AVP em V2R. Estes dados cumulativos foram obtidos a partir de 3 experimentos independentes. - A Figura 4 ilustra o efeito de U-Da2a na mobilização de β- arrestina-1-YFP induzida pela ação de AVP no receptor V2R-Rluc nas células tsA. A. Curva de dose-resposta de AVP em V2R na ausência (•) ou na presença de concentrações crescentes de U-Da2a: 100 nM (A); 500 nM (■); 1 μM (▼); 5 μM (O) e 10 μM (Δ). B. Representação Schild dos efeitos da toxina U-Da2a na mobilização de β-arrestin-1-YFP para o receptor V2-Rluc induzida por concentrações crescentes de AVP. Estes dados cumulativos foram obtidos a partir de 3 experimentos independentes. - A Figura 5 ilustra o efeito de UDa-2a na fosforilação de MAP quinase induzida por ação de AVP em V2R nas células tsA. A. Curvas de dose- resposta de AVP em V2R na ausência (•) ou na presença de concentrações crescentes de U-Da2a: 0,6 μM (■), 1 μM (A), 3 μM (♦), 6 μM (O), 10 μM ((□), 30 μM (Δ) e 60 μM (O). Representação Schild dos efeitos da toxina U-Da2a na fosforilação de MAP quinase induzida por concentrações crescentes de AVP para o receptor V2R. Estes dados cumulativos foram obtidos a partir de 3 experimentos independentes. - A Figura 6 ilustra o efeito diurético da toxina U-Da2a em camundongos CD1pcy/pcy. U-Da2a foi injetada subcutaneamente e intraperitonealmente ao camundongo CD1pcy/pcy em uma dose única de 1 μmol/kg. Após a injeção, a urina foi coletada por 24 horas em gaiolas metabólicas e o volume da urina foi determinado. Volume da urina no estado basal (caixa vazia) e após a injeção de U-Da2a (caixa preta). - A Figura 7 ilustra o efeito da osmolaridade da toxina U-Da2a em camundongos CD1pcy/pcy. U-Da2a foi injetada subcutaneamente e intraperitonealmente ao camundongo CD1pcy/pcy em uma dose única de 1 μmol/kg. Após a injeção, a urina foi coletada por 24 horas em gaiolas metabólicas e a osmolaridade da urina foi medida. Estado basal (caixa vazia). U-Da2a (caixa preta). - A Figura 8 ilustra o efeito diurético de doses crescentes da toxina U-Da2a por administração intraperitoneal em camundongos CD1pcy/pcy. U- Da2a foi injetada intraperitonealmente em camundongos CD1pcy/pcy em doses de 0,01 (caixa vazia), 0,1 (caixa cinza) e 1 (caixa preta) μmol/kg nos dias 1, 3 e 5. A urina foi coletada por 24 horas após a injeção, em gaiolas metabólicas e o volume da urina foi determinado. - A Figure 9 ilustra o efeito da osmolaridade de doses crescentes da toxina U-Da2a por administração intraperitoneal em camundongospcy/pcy. U-Da2a foi injetada intraperitonealmente em camundongos CD1 pcy/pcy em doses de 0,01 (caixa vazia), 0,1 (caixa cinza) e 1 (caixa preta) μmol/kg nos dias 1, 3 e 5. A urina foi coletada por 24 horas após a injeção, em gaiolas metabólicas e o volume da urina foi determinado. - A Figura 10 ilustra o efeito diurético de U-Da2a em camundongos CD1pcy/pcy após injeções i.p. diárias de U-Da2a a 0,1 μmol/kg por até 99 dias. Nos dias 0 (caixa vazia), 30 (caixa cinza claro), 70 (caixa cinza escuro) e 99 (caixa preta), a urina foi coletada por 24 horas em gaiolas metabólicas e o volume da urina foi determinado. - A Figure 11 ilustra o efeito da osmolaridade de U-Da2a em camundongos CD1pcy/pcy após injeções i.p. diárias de U-Da2a a 0,1 μmol/kg por até 99 dias. Nos dias 0 (caixa vazia), 30 (caixa cinza claro), 70 (caixa cinza escuro) e 99 (caixa preta), a urina foi coletada por 24 horas em gaiolas metabólicas e a osmolaridade da urina foi determinada. - A Figure 12 ilustra o efeito U-Da2a no peso do rim em camundongos CD1pcy/pcy após 99 dias de injeções de toxina diária a 0,1 μmol/kg i.p. por representação das razões peso do rim/peso do corpo, peso do rim/peso do coração e peso do coração/peso corporal. Os camundongos foram fixados por perfusão com paraformaldeído 4% / 1x salina tamponada com fosfato, os rins e corações foram retirados e pesados. Estado basal (caixa vazia). U-Da2a (caixa preta). - A Figure 13 ilustra o efeito U-Da2a no número de cistos em camundongos CD1pcy/pcy após 99 dias de injeções de toxina diária a 0,1 μmol/kg i.p. Os camundongos foram fixados por perfusão com paraformaldeído 4%/1x salina tamponada com fosfato, os rins foram removidos e embebidos em parafina. A. Seções transversais do rim foram coradas com hematoxilina e eosina. B. O número de cistos foi determinado com o uso do programa ImageJ e relacionados ao tamanho da seção, chegando assim ao número relativo de cistos. U-Da2a (caixa cinza). Controle (0,9% NaCl; caixa preta). - A Figura 14 ilustra a inibição da ligação de 3H-AVP por U-Da2a e variantes U-Da2a no subtipo receptor V2 (V2R) de vasopressina expresso em células eucariontes. (•) AVP. (A) U-Da2a WT. (□) U-Da2a-delta4-Nter. (♦) U- Da2a-delta2-Nter-delta2-Cter. (▼) U-Da2a-S3K. (O) U-Da2a-N15K, G16A. - A Figura 15 ilustra a inibição da ligação de 3H-AVP por U- Da2a, Dtx-B-A27S, Dtx-K, DTx-E-R55 no subtipo do receptor V2 (V2R) de vasopressina expresso em células eucariontes. - A Figura 16 ilustra a inibição da ligação de 3H-AVP em V2R por U-Da2a WT (círculo vazio) e U-Da2a C14S,C38S (círculo preenchido). Ki U- Da2a WT = 1,03 nM. Ki U-Da2a C14S,C38S = 6200 nM
[0085] Um grama de veneno de Dendroaspis angusticep (Latoxan, França) foi separado em 13 frações por troca iônica (2 x 15 cm) na Fonte 15S com o uso de um minute t de NaCl de multietapas a 2 mL por minute em um purificador Akta (Pfizer, Canadá). A fração F foi ainda purificada por cromatografia de fase reversa (Waters 600) minute coluna minute tril (C18, 15 μm, 20 cm, Vydac, França, 20 mL por minute), com o uso de um minute t linear a partir de minute trile a 0 para 100% e ácido trifluoroacético 0,1% em 100 minutos. A fração D foi finalmente purificada minute coluna C18 Vydac (4.6 mm, 5 μm, 15 cm 1 mL por minute) com o uso de um minute t de minute trile 0,5% por minute.
[0086] O sequenciamento N-terminal de U-Da2a (200 pmol carregado sobre um filtro revestido com Biobrene) foi realizado com o uso da química de Edman em um sequenciador automático Procise Model 492 da Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA).
[0087] 15 μg de U-Da2a purificada foram reduzidos com 2 μL de tris (carboxietil) fosfina 100 mM (Sigma-Aldrich, St Louis, EUA) para remover as ligações dissulfeto. Após 1 hora a 50°C, a mistura foi purificada em Micro coluna Zip-Tip C18 (Millipore, Billarica, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A eluição da toxina reduzida foi realizada com 5μL de acetonitrila/ácido fórmico (ACN/FA) a 0,2% (50/50, v/v). 1,5-diaminonaftaleno (Acros, Geel, Bélgica) saturado em acetonitrila/ácido fórmico 0,1% 50/50 (v/v) foi usado como matriz para experimentos de decaimento na fonte. 1 μL da solução de toxina e 1 μL da matriz foram misturados em conjunto e manchados sobre uma placa de MALDI. A fragmentação do Decaimento na fonte (ISD) foi registrada com um espectrômetro de massa ULTRAFLEX II MALDI-TOF/TOF (BRUKER DALTONICS, Bremen, Alemanha) equipado com um laser Nd-YAG Smartbeam (MLN 202, LTB). Os espectros foram adquiridos entre m/z 900 e 6500 com uma potência de laser fixada em 55%.
[0088] 300 ng de toxina purificada foram dissolvidos em 5 μL de NH4HCO3 50 mM (pH 8). 2 μL de ditiotreitol 250 mM (DTT) foram então adicionados para reduzir todas as ligações dissulfeto (30 minutos a 56°C). Os grupos sulfidrilo foram então alquilados com 2,2 μL de iodoacetamida 500 mM (IAA) durante uma hora, no escuro, à temperatura ambiente. Tanto DTT como IAA foram primeiramente preparados em NH4HCO3 50 mM. 10 ng de tripsina bovina (razão 1/30) foram finalmente adicionados para digerir U-Da2a, durante 4 horas a 37°C. Os peptídeos resultantes foram dessalinizados com uma Micro coluna a Zip-Tip C18 e eluídos com 10μL de ACN/FA 0,2% (50/50, v/v). 1μL desta amostra foi colocado na placa de MALDI e misturado com 1μL de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (2,5- DHB) usado como matriz. A análise dos peptídeos foi feita com o espectrômetro ULTRAFLEX II (consulte acima). A impressão digital de Massa Peptídica foi registrada a partir de 500 m/z para 3600. Experimentos de espectrometria de massa em tandem foram realizados com o uso de tecnologia LIFT-TOF/TOF (Detlev et al., Suckau, Anal. Bioanal. Chem., 2003, 376, 952-965).
[0089] Todos os dados foram adquiridos graças a Flex Control 3.0. Os espectros resultantes foram analisados com Biotools 3.2 e Sequence Editor 3.2. Os três programas de computação são da BRUKER DALTONICS.
[0090] U-Da2a foi sintetizada em um sintetizador de peptídeos APPLIED BIOSYSTEMS 433A (Foster City, CA, EUA), purificada e dobrada de acordo com o método descrito para a toxina muscarínica MT1 (Mourier et al., Mol Pharmacol, 2003, 63, 26-35). Resumidamente, isto envolveu síntese em fase sólida com o uso de estratégia de Fmoc, clivagem do peptídeo e purificação sobre uma coluna de fase reversa. O peptídeo linear foi então dobrado por 24 horas na presença de glicerol (25%) e de glutationa (1 mM) oxidada e reduzido em tampão Tris a pH 8.
[0091] A presença de uma toxina capaz de se ligar a V2R foi detectada por triagem do veneno extraído da cobra Dendroaspis angusticeps. Uma vez purificada, essa toxina foi sequenciada por dois procedimentos complementares, degradação de Edman e fragmentação de massa e bioquimicamente caracterizada.
[0092] A toxina, denominada U-Da2a, é um peptídeo de 57 aminoácidos: RPSFCNLPVKPGPCNGFFSAFYYSQKTNKCHSFTYGGCKGNANRFSTIEK CRRTCVG (SEQ ID NO: 1) com 3 ligações dissulfeto (Cys1-Cys6, Cys2- Cys4 e Cys3-Cys5) pertencentes à família estrutural Kunitz. As sequências mais próximas correspondem a outras toxinas de cobra, como as dendro toxinas E, B e K, Mulgina-1 e Blakelina-3 (Figura 1). Essas dendro toxinas têm a propriedade de bloquear os canais de potássio dependentes de voltagem.
[0093] A síntese de peptídeos em fase sólida permite a síntese de grandes quantidades de U-Da2a em qualidade GMP. O peptídeo sintético foi então processado a fim de formar pontes dissulfeto. Esse composto sintético, que tem as mesmas propriedades farmacológicas como o produto natural, foi usado em todas os experimentos seguintes.
[0094] As membranas de células que expressam receptores de vasopressina foram adquiridas junto à PERKINELMER (Courtaboeuf, França). Os experimentos de ligação foram realizados com 3H-AVP (PERKINELMER, Courtaboeuf, França) em placas de 96 poços. As misturas de reação continham Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM e BSA 1 g/L em um volume final de 100 μL. As placas foram incubadas por 3 horas à temperatura ambiente. As reações de ligação foram interrompidas por filtração através de um filtro GF/C pré-embebido em polietileno imina 0,5% em um coletor de células (PERKINELMER, Courtaboeuf, França) e as placas foram secas. Ultimagold O (25 μL; PERKINELMER) foi adicionado a cada poço e as amostras foram contadas com o uso de um contador TopCount (PERKINELMER, Courtaboeuf, França) (rendimento de contagem de 55%). As ligações não específicas foram medidas na presença de 1 μM de AVP. A curva da ação de inibição de massas de um local foi ajustada aos dados de inibição de ligação com o uso de Kaleidagraph (SYNERGY SOFTWARE, Reading, PA, EUA). Os valores IC50 foram convertidos em Ki para experimentos de competição com o uso de equação de Cheng-Prusoff (Cheng et al., Biochem. Pharmacol., 1973, 22, 3099-3108).
[0095] Os ensaios de FLIPR foram conduzidos para perfil de U- Da2a para atividades agonistas e antagonistas sobre diferentes receptores acoplados a proteínas-G (GPCRs).
[0096] Os valores de ativação percentual e valores de inibição percentual foram determinados em cada GPCR. Os valores de ativação percentual foram determinados após a adição inicial de 1 μM de U-Da2a. Além disso, U-Da2a foi incubada a 25°C por 2 minutos antes da determinação da porcentagem de inibição. Os valores de inibição percentual foram determinados após a adição de um agonista de referência a uma concentração estimada de EC80. Todos os poços foram preparados com o uso de tampão de ensaio EMD Millipore’s GPCRProfiler®. O tampão de ensaio GPCRProfiler® foi uma solução Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) modificada, em que HBSS foi suplementado para conter HEPES 20 mM e Probenecide 2,5 mM a pH 7,4. O ensaio de agonista foi realizado em um instrumento FLIPRTETRA, em que U- Da2a, os veículos de controles e Emax do agonista de referência foram adicionados à placa de ensaio após um valor de referência de fluorescência ser estabelecido. O ensaio de agonista tinha um total de 180 segundos e foi usado para avaliar a capacidade de cada composto para ativar cada um dos GPCR avaliados. O ensaio de antagonista foi realizado com o uso de valores anteriormente determinados de potência EC80, todos os poços com compostos de amostras pré-incubados (2 minutos) foram desafiados com concentração EC80 do agonista de referência após o estabelecimento de um valor de referência de fluorescência. O ensaio do antagonista foi conduzido com o uso da mesma placa de ensaio e mesmo aparelho que foram usados for para o ensaio de agonista. Todos os dados da placa de ensaio foram submetidos a correções iniciais adequadas. Após a aplicação das correções de base, os valores máximos de fluorescência foram exportados e os dados processados para calcular a ativação percentual (em relação aos valores de Emax do agonista de referência e do veículo de controle), percentual de inibição (em relação aos valores de EC80 e do veículo de controle), e os valores estatísticos adicionais (isto é, Z’, variação dos valores percentuais entre os valores de dados replicados) para avaliar a qualidade de cada placa. Quando os dados da placa de ensaio eram rejeitados, experimentos adicionais foram realizados.
[0097] Ensaios eletrofisiológicos para testar U-Da2a quanto às atividades em canais iônicos cardíacos (Nav1.5, Cav1.2, Kv4.3/KChIP2, Kv1.5, KCNQ1/mink, Kir2.1, hERG, HCN4) foram realizados com as plataformas eletrofisiológicas IonWorks Quattro e IonWorks HT (MOLECULAR DEVICES), de acordo com as instruções do fabricante. A U-Da2a foi preparada em água à concentração de 300 μM. A solução de estoque foi transferida para uma placa principal e para placas de ensaio em que 2 μL de solução por poço foram colocadas. No dia do ensaio, 198 μL de solução externa contendo a concentração apropriada de DMSO foram adicionados e misturados completamente. Isso forneceu uma diluição de 1:100. Uma diluição adicional 1:3 ocorreu com a adição de células na IonWorks, dando uma diluição de a 1:300 no total. Em cada placa de ensaio, pelo menos oito poços foram reservados para o veículo de controle (DMSO 0,3%) e pelo menos oito poços para cada controle positivo específico para a linhagem de células testada. Os controles positivos foram testados a um bloqueio máximo e uma concentração aproximada de IC50. Os compostos usados para controles positivos: Nav1.5 100 μM e Lidocaína 5 mM, Kv4.3/KChIP2 20 μM e Quinidina 500 μM, Cav1.2 1μM e Nitrendipina 100 μM, Kv1.5 300 μM e 4-AP 10 mM, KCNQ1/minK 10 μM e Cromanol 293B 100 μM, hERG 0,1 μM e Cisaprida 1 μM, HCN4 50 μM e Césio 3 mM, Kir2.1 20 μM e Bário 500 μM.
[0098] Testes de ligação foram realizados em equilíbrio nos três subtipos de receptores de vasopressina com o uso de ligante marcado com rádio 3H-AVP. U-Da2a tem uma afinidade entre 2 e 5 nM para o V2R, mesmo a uma concentração de 1 μM, a toxina não inibiu a ligação de 3H-AVP ao V1aR e ao V1bR (Figura 2).
[0099] Ensaios de FLIPR foram conduzidos para o perfil de U- Da2a para atividades agonistas e antagonistas em 157 GPCRs: M1, M2, M3, M4, M5, A1, A2B, A3, alpha1A, alpha1B, alpha1D (D2-79), alpha2A, beta 1, beta 2, beta 3, C3aR, C5aR, AT1, APJ, BB1, BB2, BB3, bradicinina B2, CGPR1, CaS, CB1, CB2, ChemR23, CCR1, CCR10, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5 macaco Rhesus, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, XCR1 /GPR5, CCK1, CCK2, CRF1, CRF2, D1, D2L, D4, D5, ETA, ETB, GPR41, GPR43, GABAB1b, GAL1, GAL2, receptor de grelina, GIP, GLP-1, GLP-2, glucagon, receptor de secretina, mGlu1, mGlu2, TSH, GnRH, H1, H2, H3, GPR99, GPR54, BLT1, CysLT1, CysLT2, LPA1, LPA3, LPA5 /GPR92, S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, S1P5, MrgD, MRGX1, MRGX2, MCHR1, MCHR2, MC2, MC4, MC5, receptor de motilina, NMU1, NMU2, NPBW1 /GPR7, Y2, Y4, NTR1, FPR1, FPRL1, GPR109A, Delta, Kappa, Mu, NOP/ORL1, OX1, OX2, GPR39, OT, GPR103/QRFP, P2RY1, P2RY2, P2RY4, P2RY11, P2RY12, PAF, PK1, PK2, PRP, DP, EP1, EP2, EP3, EP4, FP, IP1, TP, PARs ativados por tripsina, PARs ativados por trombina, PTH1, PTH2,5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5- HT4B, 5-HT6, SST2, SST3, SST4, SST5, GPR68/OGR1, SUCNR1 / GPR91 , NK1, NK2, NK3, TRH, GPR14, V1A, V1B, V2, isoforma longa de PAC1, VPAC1 e VPAC2. A atividade de U-Da2a foi detectada somente em V2R, antagonizado por 69%, demonstrando, dessa forma, a seletividade de U-Da2a para o receptor V2R.
[00100] Ensaios eletrofisiológicos foram realizados para testar U- Da2a para atividades em canais iônicos cardíacos Nav1.5, Cav1.2,Kv4.3/KChIP2, Kv1.5, KCNQ1/mink, Kir2.1, hERG e HCN4. U-Da2a parece não exibir inibição significante de qualquer um dos canais de íons a uma concentração de 1 μM. Esses resultados demonstram que U-Da2a tem uma atividade única em V2R, que é diferente e inesperada da atividade conhecida de dendro toxinas nos canais iônicos cardíacos.
[00101] As células CHO estavelmente transfectadas, que expressam o V2R humano (Cotte et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 29462-68 ; Phalipou et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 23316-23327), foram plaqueadas em 96 poços. Após 24 horas as células foram estimuladas por 24 horas em concentrações crescentes de AVP em um volume de 50 μL de meio de incubação contendo DMEM, BSA 5% e RO 201724 0,1 mM (CALBIOCHEM n° 557502; MERCK-MILLIPORE), um inibidor seletivo de fosfodiesterase cAMP- específico, na ausência (condição controle) ou na presença de concentrações crescentes de U-Da2a (condições inibidoras). A medição de cAMP foi realizada com o uso da tecnologia Homogeneous Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer (HTRF®) desenvolvido por CISBIOINTERNATIONAL com o uso do kit cAMP Dynamic 2 (CISBIOINTERNATIONAL). Após 30 minutos de estimulação a 37°C, as células foram lisadas pela adição de 50 μL de tampão de lise ao meio de incubação. O tampão de lise continha cAMP marcado com um fluoróforo aceitante (cAMP-d2) emitido a 665 nm. Em seguida 50 μL de tampão de lise contendo um anticorpo anti-cAMP marcado com um fluoróforo doador (Anti-cAMP Europium Kryptate= AC-K) emitido a 620 nm foram adicionados. Na ausência de cAMP endógeno, a razão FRET 665/620 é máxima entre cAMP-d2 e AC-K. Assim que o cAMP endógeno é produzido por células após estimulação, ele compete com cAMP- d2 e a razão 665/620 diminuem. A concentração de cAMP endógeno é determinada por comparação entre a razão experimental 665/620 e uma curva padrão estabelecida com concentrações conhecidas de cAMP. Essas medições são realizadas em um leitor HTRF® baseado em laser Rubystar com o programa de computação Rubystar (BMG LABTECH).
[00102] 2,5 x 106 células tsA, uma linhagem celular de rim humano transformada (HEK293), que expressa estavelmente um antígeno T SV40 sensível a temperatura (ECACC), temporariamente transfectadas com 150 ng de plasmídeo de expressão pRK5 para hV2Rluc (PHARMINGEN n° 556104, BD BIOSCIENCE; Terrillon et al., Mol.Endocrinol., 2003, 17, 677-691) e com 1 μg de um plasmídeo de expressão para β-arrestina-1-YFP (β-arrestina clonada em pEYFP-N1 (CLONTECH); Scott et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 3552-3559) foram semeadas em placas de 6 poços. Após 48 horas da transfecção, as células foram lavadas com tampão de KREBS contendo NaCl 146 mM, KCl 4,2 mM, MgCl2 0,5 mM, CaCl21 mM, HEPES 10 mM pH 7,4, 1 mg/mL de glicose e ressuspensas em 1 mL de desse tampão. As medidas da Transferência de Energia por Ressonância Bioluminescente (BRET™) entre a V2-Rluc e a β- arrestina-1-YFP foram realizadas em placas de 96 poços com um volume final de 50 μL, contendo 30 μL de suspensão de células (75,000 células), 10 μL de tampão de KREBS (condição controle) ou a mistura dos ligantes contendo tanto concentrações crescentes de vasopressina (condição controle estimulada) como na presença de concentrações crescentes da toxina (condição estimulada com inibidor). 10 μL de coelenterazina h (Renilla luciferin; MOLECULAR PROBES C-6780, INVITROGEN, LIFE TECHNOLOGIES), o substrato da luciferase, foram então adicionados à mistura que foi incubada a 37°C antes das medições BRET serem realizadas em luminômetro de micro placa (Mithras LB940 BERTHOLD TECHNOLOGIES) com o uso do programa de computação MikroWin 2000 (MIKROTEK LABORSYSTEME, GmbH).
[00103] 10x106 células tsA, uma linhagem celular de rim humano transformada (HEK293), que expressa estavelmente um antígeno T SV40 sensível a temperatura (ECACC), temporariamente transfectadas com 500 ng de pRK5 plasmídeo de expressão para V2R humano (PHARMINGEN n°556104, BD BIOSCIENCE; Terrillon et al., Mol. Endocrinol., 2003, 17, 677-691) foramplaqueadas em placas de 96 poços revestidas de poliornitina com 75.000 células por poço com meio DMEM contendo 10% de soro. Oito horas e vinte e quatro horas mais tarde, as células foram privadas de meio livre de soro e estimuladas por mais 27 horas. As células transfectadas foram incubadas por 10 minutos a 37°C com DMEM (condição controle) ou com doses crescentes de AVP (condição estimulada) ou com uma mistura de AVP e toxina (condição estimulada com inibidor). Em seguida, o meio foi substituído com 50 μL de tampão de lise a partir do kit Cellul’ERK (CISBIO INTERNATIONAL) e as células foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. Em uma placa de 384 poços, para 16 μL de células lisadas, primeiro 2 μL de anticorpo contra ERK fosforilada marcado com fluoróforo aceitante (AC-ERK-P-d2 emitido a 665 nm) e, em seguida 2, μL de anticorpo contra ERK total marcado com fluoróforo doador (AC-ERK-K emitido a 620 nm) foram adicionados. Quando ocorre fosforilação de ERK, o aceitante, em estreita proximidade do doador, é capaz de emitir 665 nm, produzindo o sinal FRET. O aumento na razão 665/620 corresponde ao aumento da fosforilação em MAP quinase. Duas horas mais tarde, RT-FRET foi medido em um leitor HTRF® Rubystar baseado em laser com programa de computação Rubystar (BMG LABTECH).
[00104] A caracterização in vitro dos efeitos farmacológicos de U- Da2a demonstra que a U-Da2a é capaz de inibir a produção de cAMP induzida por ativação de V2R de maneira competitiva com um coeficiente de Shild de -0,91 ± 0,02, um Kinact de 12,0 ± 0,4 nM e um PA2 de 7,92 ± 0,02 (Figuras 3A e 3B). U-Da2a também é capaz de inibir a mobilização da β-arrestina-1-YFP no receptor hV2-Rluc de modo competitivo com um coeficiente de Shild de -0,9 ± 0,2 e a Kinact de 110 ± 50 nM e a PA2 de 7, ± 0,2 (Figuras 4A e 4B). Finalmente, U-Da2a também é capaz de inibir fosforilação de MAP quinase, seguindo a estimulação de AVP do V2R de modo competitivo com um coeficiente de Shild de 0,9 ± 0,2 e a Kinact de 210 ± 80 nM e a PA2 de 6,9 ± 0,2 (Figuras 5A e 5B). Estes ensaios celulares funcionais demonstraram as propriedades antagonista competitivas de U-Da2a para as três principais vias de sinalização da V2R, isto é, a acumulação de cAMP, recrutamento de arrestina e fosforilação de MAP quinase.
[00105] A toxina foi dissolvida em NaCl 0,9% a uma concentração de 1 mg/mL. Camundongos CD1pcy/pcy adultos (Takahashi et al., J. Urol., 1986, 135, 1280-1283, e J. Am. Nephrol., 1991, 1, 980-989 e Olbrich et al., Nature Genetics, 2003, 34, 455-459) e camundongos C57BL/6 adultos foram injetados por via intraperitoneal e por via subcutânea com a toxina em doses de 1, 0,1 e 0,01 μmol da toxina por quilo de peso corporal. Um, três e cinco dias após a primeira injeção, os camundongos foram mantidos por 24 horas em gaiolas metabólicas. A urina coletada foi centrifugada por 30 minutes a 14.000 rpm. A osmolaridade da urina (mOs/kg) foi determinada com um osmômetro de Knauer, o volume urinário (μL) foi medido com uma pipeta.
[00106] A toxina foi dissolvida em NaCl 0,9% a uma concentração de 1 mg/mL e administrada por via intraperitoneal em camundongos CD1pcy/pcy adultos em uma dose de 0,1 μmol/kg/dia. Nos dias 0, 30, 70 e 99, a urina foi coletada por 24 horas em gaiolas metabólicas e o volume urinário e osmolaridade da urina foram determinados.
[00107] O efeito da toxina in vivo foi testado na linhagem de camundongos CD1 pcy/pcy, um modelo animal de doença renal policística, em que antagonistas V2R foram previ anteriormente mostrados por inibir a formação de cistos. Uma vez que U-Da2a é um antagonista de V2R específico, seletivo e biodisponível, que inibi as três vias de sinalização de V2R, essa toxina representa uma droga terapêutica valiosa contra a doença renal policística.
[00108] Em um primeiro conjunto de experimentos, a toxina foi administrada por via intraperitoneal e por via subcutânea em camundongos CD1 pcy/ pcy, em dose única de 0,1 μmol/kg. O volume urinário para os camundongos CD1 pcy/pcy no estado basal é muito baixa com uma alta osmolaridade. Ao contrário, i.p ou s.c. Ao contrário, a injeção por via intraperitoneal ou por via subcutânea de U-Da2a a 1 μmol/kg leva a um forte aumento no volume urinário devido ao efeito antagonista da toxina em V2R, levando a um efeito diurético (Figura 6). O efeito diurético foi correlacionado com uma forte diminuição da osmolaridade (Figura 7), isto é, uma diminuição da concentração de sal, devido ao aumento do volume de urina. Esses resultados demonstram que a U-Da2a é capaz de alcançar o seu alvo in vivo, o V2R tanto por via subcutânea como por via intraperitoneal. Por razões técnicas, a via intraperitoneal melhor tolerada foi usada nos testes seguintes.
[00109] Em um segundo conjunto de experimentos, a toxina foi administrada por via intraperitoneal em camundongos CD1 pcy/pcy, a doses de 1, 0,1 e 0,01 μmol toxina/kg de peso corporal. Um efeito diurético dependente da dose, e uma diminuição da osmolaridade urinária foram observados após a injeção da toxina (Figuras 8 e 9, respectivamente). Uma dose de 0.1 μmol/kg é para se observar o efeito máximo da toxina.
[00110] Em um terceiro conjunto de experimentos, a toxina foi administrada a uma dose de 0,1 μmol/kg/dia por 99 dias. O volume e osmolaridade urinário foram determinados nos dias 0, 30, 70 e 99 (Figuras 10 e 11, respectivamente). Nenhum efeito tóxico foi detectável após injeções diárias de longo prazo da toxina (99 dias).
[00111] A toxina foi dissolvida em NaCl 0,9% a uma concentração de 1 mg/mL. Camundongos CD1 pcy/pcy com 10 semanas de vida foram injetados por via intraperitoneal com a toxina a uma dose de 0,1 μmol de toxina/ kg de peso corporal /dia por 99 dias. Em seguida, os camundongos foram fixados por perfusão com paraformaldeído a 4% / solução salina tamponada 1x, os rins e os corações foram removidos e pesados. Em seguida, a razão entre o peso dos rins ou o peso do coração/peso corporal e peso dos rins/peso do coração foram calculadas para avaliar o efeito de toxina na formação de cistos. Os rins foram incorporados em parafina. Secções transversais dos rins foram coradas com hematoxilina e eosina. O número de cistos foi determinado com o uso do programa ImageJ e relacionada com o tamanho da secção, obtendo assim um número relativo de cistos.
[00112] A administração de U-Da2a a uma dose de 0,1 μmol/kg reduz o peso do rim em camundongos CD1 pcy/pcy (Figura 12). Além disso, a análise histológica de rim demonstra que o tratamento com U- Da2a reduz significativamente o número de cistos (Figura 13).
[00113] As proteínas foram preparadas com o uso dos protocolos descritos para U-D2a no Exemplo 1 e os ensaios de ligação de V2R foram realizados conforme descrito no Exemplo 2.
[00114] Os ensaios de competição de ligação foram realizados com as seguintes variantes de U-Da2a e dendro toxinas conhecidas. - uma variante de U-Da2a contendo uma deleção N-terminal de 4 resíduos de aminoácidos (U-Da2a-delta4 N-ter, SEQ ID NO: 11), - uma variante de U-Da2a contendo uma deleção N-terminal de 2 resíduos de aminoácidos e uma deleção C-terminal de 2 resíduos de aminoácidos (U-Da2a-delta2 N-ter/delta2 C-ter, SEQ ID NO: 12) - uma variante de U-Da2a contendo a substituição S3K (U- Da2a-S3K, SEQ ID NO: 15), - uma variante de U-Da2a contendo substituições N15K/G16A (U-Da2a- N15K, G16A, SEQ ID NO: 14), - Dtx-B A27S (SEQ ID NO: 3) - Dtx-K (SEQ ID NO: 8), - DtxE R55 (SEQ ID NO: 7), e - uma variante de U-Da2a contendo as substituições C14S e C38S (SEQ ID NO: 16).
[00115] Os resultados demonstram que as regiões N-terminal e C-terminal de U-Da2a não são necessárias para a ligação de V2R e bloqueio de sua atividade por inibição da ligação de seus ligantes naturais AVP, uma vez que as variantes de U-Da2a contendo deleções ou substituições em N- e/ou C-terminal na região N-terminal, exibem afinidade similar sobre V2R do que U-Da2a (Figura 14 e Tabela I).
[00116] Ao contrário, os resíduos N15 e G16 que estão em posições homólogas aquelas do sítio ativo do inibidor de tripsina pancreática básica, (BPTI) mas correspondem a diferentes aminoácidos (N15, G16 for U- Da2a versus K15 e A16 in BPTI) são essenciais para a ligação de V2R e inibição de sua atividade, uma vez que a variante U-Da2a com os resíduos NG nas posições 15 e 16 substituídos pelos resíduos K e A exibem afinidade 1000 vezes menor para V2R (Figura 14 e Tabela I).TABELA I AFINIDADE DE LIGAÇÃO DOS LIGANTES PARA V2R
[00117] Esses resultados foram confirmados por ensaios de ligação com dendro toxinas contendo diferentes resíduos nas posições 15 e 16, mostrando que DTx-E-R55 que possuem K e A nas posições 15 e 16, como BPTI, não é capaz de bloquear V2R, mesmo em concentrações 100 vezes maiores às requeridas para se obter uma inibição a 80% com U-D2a (Figura 15). De maneira similar, não foi obtida inibição de V2R com DTx-K que tem K e R nas posições 15 e 16. Ao contrário, Dtx-B A27S que tem M e F nas posições 15 e 16 têm capacidades inibitórias V2R de similares àquelas de U-D2a (Figura 15).
[00118] Esses resultados indicam que U-Da2a farmacóforo está em uma posição homóloga à do sítio ativo de BPTI, na alça localizada na parte da toxina oposta àquela definida pelas regiões N e C-terminais. A atividade antagonista de V2R necessita de NG ou MF nas posições 15 e 16.
[00119] A importância das pontes dissulfeto na atividade de U-Da2a foi testada com a variante U-Da2a C14S, C38S, desprovida da segunda ligação dissulfeto (entre C2 e C4). Essa ligação dissulfeto foi removida independente da existência da toxina com um único dobramento Kunitz que possui apenas 2 ligações dissulfeto, o Conkunitzin-S1 (número de acesso UniProtKB/Swiss-Prot P0C1X2; SEQ ID NO: 17). Essa toxina é desprovida da 2a ponte, mas adota o dobramento Kunitz clássico 3(10)-beta-beta-alfa e exibe uma atividade no canal de potássio (Buczek et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 2006, 62, 980-90).
[00120] Os ensaios de ligação em V2R mostram que a Ki de tipo selvagem de U-Da2a é igual a 1,03 nM, enquanto que os da variante C14S,C38S são iguais a 6200 nM (Figura 16). Os resultados mostram que a atividade antagonista de V2R da proteína da invenção é aprimorada quando três ligações dissulfeto (entre C1 e C6, C2 e C4 e C3 e C5) estão presentes na proteína.
Claims (6)
1. USO DE UMA PROTEÍNA ISOLADA compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, 4 ou 5, uma variante de qualquer uma de SEQ ID NO: 1 compreendendo uma deleção N-terminal de um a quatro resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de um ou dois resíduos de aminoácidos, e uma variante de SEQ ID NO: 5 compreendendo uma deleção N-terminal de um a trinta resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção C-terminal de um ou dois resíduos de aminoácidos, caracterizado por ser para a fabricação de um kit ou reagente para diagnóstico de uma patologia que envolve um aumento ou diminuição no nível de expressão de V2R.
2. USO DA PROTEÍNA ISOLADA, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para diagnóstico in vitro de uma patologia que envolve um aumento ou diminuição no nível de expressão de V2R.
3. USO DA PROTEÍNA ISOLADA, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para a triagem de ligantes de V2R.
4. USO DA PROTEÍNA ISOLADA, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser como um agente de cristalização para produzir cristais de V2R.
5. USO DA PROTEÍNA ISOLADA, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em hiponatremia euvolêmica ou hipovolêmica, síndrome nefrogênica de antidiurese inadequada, diabetes insipidus nefrogênica congênita, doença renal policística, cânceres, trombose e doença de Ménière.
6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida proteína compreender ou consistir em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 11, 12 e 13.
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