BR112015005091B1 - uso de um polinucleotídeo antissenso isolado - Google Patents

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Abstract

?polinucleotídeo antissenso isolado, composição farmacêutica, métodos para induzir salto de éxon de um rna, para melhorar distrofia muscular, para inibir a progressão de patologia distrófica, e para melhorar função muscular, e, kit? polinucleotídeos antissenso e seu uso em composições farmacêuticas para induzir salto de éxon em éxons de alvo do gene gama sarcoglicano são fornecidos juntamente com métodos para evitar ou tratar doenças distróficas, tal como distrofia muscular do cíngulo dos membros. um aspecto da divulgação proporciona um polinucleotídeo antissenso em que o polinucleotídeo especificamente hibridiza a uma região alvo de éxon de um rna gama sarcoglicano, em que o éxon é selecionado do grupo consistindo em éxon 4 (seq id no: 1), éxon 5 (seq id no: 2), éxon 6 (seq id no: 3); éxon 7 ((seq id no: 4); e uma combinação dos mesmos. em algumas modalidades, o polinucleotídeo antissenso não pode formar um substrato rnase h e em modalidades adicionais o polinucleotídeo antissenso compreende uma espinha dorsal de polinucleotídeo modificada.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 USC § 119 (e) do Pedido de Patente Provisório US 61/697.766, depositado em 06 de setembro de 2012, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO DE INTERESSE PÚBLICO
[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob Número de concessão HL061322 e U54AR052646 concedido pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a polinucleotídeos antissenso e a sua utilização em composições farmacêuticas para induzir salto de éxon nos éxons direcionados do gene gama sarcoglicano (SGCG), úteis no tratamento de várias formas de distrofia muscular.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] A distrofia muscular (MD) é um grupo de mais de 30 doenças genéticas caracterizadas por fraqueza muscular esquelética e degeneração. A distrofia muscular de cíngulo dos membros (LGMD) é uma classe autossômica de MD. Os músculos mais afetados em LGMD são aquelas dos membros, incluindo braços e pernas, assim como os músculos do tronco que afetam a postura e respiração. Pacientes com DM nascem com a função muscular normal, mas desenvolvem insuficiência cardíaca e problemas respiratórios, devido à perda de massa e resistência do músculo cardíaco e respiratório. A distrofia muscular de cíngulo dos membros tipo 2C (LGMD2C) é causada por mutações no gene Y-sarcoglicano (Sgcg) [Noguchi et al., Science 270: 819-822 (1995); McNally et al., Am J Hum Genet 59: 1040-1047 (1996); Lasa et al., Eur J Hum Genet 6: 396-399 (1998)]. Ysarcoglicano é uma proteína associada a distrofina [Allikian et al., Traffic 8: 177-183 (2007)]. Distrofina é uma proteína citoplasmática grande em forma de haste encontrada ao longo da superfície interna da membrana plasmática das células de músculo. A distrofina está codificada pelo gene DMD, que é o maior gene conhecido até agora, que mede 2,4 MB no cromossoma X [Hoffman, et al., Biotechnology 24: 457-466 (1992)]. Mutações no gene DMD são as causas mais comuns de distrofia muscular, afetando 1 a cada 3500 meninos recém-nascidos no mundo [Moser, Hum Genet 66: 17-40 (1984)].
[005] O complexo de distrofina se localiza na membrana muscular, conhecida como o sarcolema, e se conecta feixes de actina intracelulares para a matriz extracelular. O complexo distrofina desempenha um papel crítico na estabilização do sarcolema durante a contração muscular. A mutação ou perda de distrofina ou o sarcoglicano associado leva a desestabilização do sarcolema e eventos subsequentes, como a lesão da célula muscular, necrose das células musculares e a deposição de tecido fibrótico ou adiposo.
[006] Os camundongos e os seres humanos têm um complexo distrofina altamente conservado. O modelo de camundongos nulo Sgcg (Sgcg- /-) foi o primeiro modelo estabelecido LGMD por exclusão de éxon 2 de Sgcg, resultando em um alelo nulo [Hack et al., J Cell Biol 142: 1279-1287 (1998)]. Camundongos mutantes em Y-sarcoglicano desenvolvem a patologia da doença progressiva que se assemelha à de pacientes LGMD2C. Camundongos Sgcg-/--/- nascem nas proporções mendelianas esperadas. Por 20 semanas de idade, no entanto, a metade de camundongos Sgcg-/- morrem e os camundongos sobreviventes pesam significativamente menos do que ninhada do tipo-selvagem. Mudanças distróficas de músculo esquelético, como a ampla variação no tamanho das fibras, infiltração de células imunológicas e fibrose e deposição de tecido adiposo são evidentes por 3 semanas de idade, mas tornam-se proeminentes em torno de 8 semanas de idade. Consistente com o padrão de progressão da doença em pacientes, cardiomiopatia em Sgcg- /-também desenvolve em fase posterior. Em 20 semanas de idade, corações Sgcg-/- exibem notável fibrose e função cardíaca reduzida.
[007] O rompimento do complexo distrofina torna a membrana muscular mais frágil e mais suscetível a rompimentos de membrana quando sujeitas à força de cisalhamento durante a contração. Como resultado destes rompimentos, distrofina ou músculos esqueléticos nulos em sarcoglicano, mostram um aumento da permeabilidade que permite que as enzimas solúveis, como a creatina quinase saiam a partir das proteínas celulares e de sangue como albumina ou íons conforme o cálcio entra na célula. Inicialmente, o mecanismo de reparação da membrana, incluindo as proteínas da família disferlina, é ativado para voltar a selar a membrana danificada [Bansal Nature 423: 168-172 (2003); Doherty et al., Development 132: 55655575 (2005)]. No entanto, este esbatimento da fronteira do ambiente celular e aumento do teor de cálcio citoplasmático estão associados com uma série de eventos celulares nocivos, como o aumento das espécies reativas de oxigênio, a ativação da cascata de protease, e eventualmente conduz à morte celular por necrose [Goldstein et al., J Gen Physiol 136: 29-34 (2010)].
[008] A perda de fibras musculares também ativa as células-tronco musculares, chamadas de células satélites. As células-satélites se dividem e tentam reparar as fibras musculares lesadas. Como mioblastos apenas têm limitado potencial de se dividir, a tendência de degeneração gradualmente supera os esforços de regeneração, resultando em perda de massa muscular irreversível. A perda de massa muscular é acompanhada por substituição de tecido conjuntivo e adiposo. Como seres humanos, camundongos mutantes também desenvolvem cardiomiopatia como resultado da perda de cardiomiócitos e deposição de tecido fibrótico. Corações com cardiomiopatia falham em bombear adequadamente, o que resulta em uma falha na liberação de oxigênio e nutrientes ao tecido.
[009] Drosophila tem um complexo distrofina simplificado que mostra conservação de mamíferos. Drosophila Y/δ-sarcoglicano (Sgcd) é igualmente semelhante ao Y-sarcoglicano de mamífero e δ-sarcoglicano. Trabalhos anteriores resultaram na geração de um modelo de mosca de distrofia muscular, induzindo uma grande deleção no locus Sgcdatravés de excisão imprecisa de elemento P[Allikian et al., Hum Mol Genet 16: 29332943 (2007)]. A linhagem Sgcd840 foi selecionada e posteriormente caracterizada, porque tinha uma deleção definida que elimina a expressão do gene único Y/δ-sarcoglicano. Semelhante à natureza progressiva da MD em mamíferos, moscas mutantes Sgcdsão normais quando emergem como adultos, mas desenvolvem anomalias no coração e músculo esquelético ao longo do tempo. Ao contrário do coração de quatro câmaras em mamíferos, moscas têm um tubo cardíaco simples para promover a circulação do sangue. Em comparação com moscas do tipo selvagem, tubos cardíacos em moscas mutantes Sgcdsão ampliados e com defeito na contração. Fraqueza nos músculos esqueléticos se manifesta na capacidade de subida prejudicada das moscas mutantes. O exame histológico do músculo do voo em moscas mutantes também revelou fibra muscular descolada do exoesqueleto, que é só raramente visto em moscas do tipo selvagem.
[0010] As causas mais comuns de distrofia muscular são mutações no gene da distrofina. Diferentes mutações em distrofina conduzem a diferentes gravidades. Por exemplo, uma mutação que altera a região de leitura, como a deleção do éxon 43 ao éxon 48 [Doriguzzi et al., Eur Neurol 33: 454-460 (1993)], leva a uma doença muito mais grave do que uma com uma deleção maior abrangendo o éxon 13 a 48 [Passos-Bueno et al., Hum Mol Genet 3: 919-922 (1994)]. O desvio de região no primeiro caso, resulta em perda do C- terminal da distrofina, que é responsável pela localização normal dos sarcoglicanos e outras proteínas associadas a distrofina. Além disso, o nível de proteína distrofina é também grandemente reduzido, devido possivelmente à deterioração mediada por mutações nonsense ou dobramento de proteínas indevida e subsequente degradação. Neste último caso, a grande eliminação reduz o número de repetições de espectrina na região média da proteína, enquanto se mantém a extremidade C-terminal crucial e N-terminal intactas. Isto sugere que a proteína truncada internamente pode ser parcialmente funcional. Estas mutações mais leves são conhecidas como as formas de distrofia muscular de Becker (BMD).
[0011] A maioria dos genes eucarióticos é feita de éxons codificadores de proteínas e íntrons não codificadores. Splicing é necessário para conectar éxons para formar mRNA maduro. Para atingir um padrão de junção adequado, o reconhecimento de sítios de doador de junção, aceitador de junção e junção exônico (ESE) pelas máquinas de junção são obrigatórios. Bloqueio de sítios de junção essenciais por polinucleotídeos antissenso (AONs) induz a exclusão de certos éxons do mRNA maduro [Aartsma-Rus et al., RNA 13: 1609-1624 (2007)]. Este caso é referido como o salto de éxon.
[0012] Ensaios clínicos de Fase I e Fase II de salto de éxon terapêutico foram realizados, comprovando a segurança da administração de AON e eficiência da restauração de distrofina [Bertoni, Front Biosci 13: 517527 (2008); Cirak et al., Lancet 378: 595-605 (2011)]. No ensaio de fase II, 19 pacientes com idades entre 5-15 participaram do estudo. Eles foram divididos em vários grupos que receberam doses escaladas de AVI-4568 (a droga AON), através de infusão intravenosa por semana, durante 12 semanas. Nenhum efeito adverso relacionado com a droga grave foi observado. Salto de éxon direcionado foi observado em todos os pacientes e nova produção de distrofina foi detectada de uma forma dependente da dose. Os três pacientes com maior resposta à droga tiveram 15%, 21% e 55% de fibras positivas de distrofina. Consistente com a reprodução de distrofina funcional, proteínas associadas com distrofina também foram encontradas restaurada na membrana plasmática das células musculares.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0013] A divulgação é dirigida a um ou mais polinucleotídeos antissenso e a sua utilização em composições farmacêuticas em uma estratégia para induzir salto de éxon no gene gama sarcoglicano em pacientes que sofrem de distrofia muscular de cíngulo dos membros 2C (ou seja, LGMD2C) ou em pacientes em risco de uma tal doença. A divulgação também fornece métodos de prevenção ou tratamento de distrofia muscular, por exemplo, LGMD2C, por salto de éxon no gene gama sarcoglicano utilizando polinucleotídeos antissenso.
[0014] Um aspecto da invenção proporciona um polinucleotídeo antissenso isolado em que o polinucleotídeo hibridiza especificamente com uma região alvo de éxon de RNA de gama sarcoglicano, em que o éxon é selecionado a partir do grupo consistindo no éxon 4 (SEQ ID NO: 1), éxon 5 (SEQ ID NO: 2), o éxon 6 (SEQ ID NO: 3), o éxon 7 (SEQ ID NO: 4) e uma combinação destes. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo antissenso não pode formar um substrato de RNase H, e em outras modalidades o polinucleotídeo antissenso compreende uma espinha dorsal de polinucleotídeos modificada. Em algumas modalidades, a espinha dorsal modificada é um 2'-O-metil-oligorribonucleotídeo. Tabela 1. Sequências de éxons de gama sarcoglicano.
Figure img0001
Figure img0002
[0015] O sublinhado indica a região de codificação de éxon. Polinucleotídeos antissenso são contemplados como sendo sequências que têm como alvo um éxon ou de uma fronteira íntron-éxon.
[0016] De acordo com outras modalidades, a divulgação contempla que a espinha dorsal de polinucleotídeos modificada compreende uma porção modificada substituída por pelo menos um açúcar de pelo menos um dos polinucleotídeos. Em uma modalidade específica, a porção modificada é um morfolino.
[0017] É adicionalmente contemplado pela divulgação de que, em algumas modalidades, a espinha dorsal de polinucleotídeos modificada do polinucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleotídica modificada, e em algumas modalidades da ligação internucleotídica modificada compreende um fosfato modificado. O fosfato modificado, em várias modalidades, é selecionado a partir do grupo que consiste em um fosfonato de metil, um fosforotioato metil, um fosforomorfolidato, um fosforopiperazidato e um fosforoamidato.
[0018] A invenção também proporciona modalidades em que o polinucleotídeo compreende um ácido nucleico peptídico.
[0019] Em ainda outras modalidades, está contemplado que o polinucleotídeo é ligado quimicamente a um ou mais conjugados que aumentam a atividade, a distribuição celular, ou a captação celular do polinucleotídeo antissenso. Em modalidades relacionadas, o conjugado é um peptídeo que aumenta a absorção celular, e em outras modalidades o peptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um sinal de localização nuclear (NLS), proteína HIV-1 TAT, um peptídeo que compreende um domínio de ligação a integrina, um oligolisina, uma proteína de fibra de adenovírus e um peptídeo que compreende um domínio de endocitose mediada por receptores (RME).
[0020] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é ligado quimicamente a uma molécula de polietileno glicol.
[0021] Em outro aspecto da divulgação, uma composição farmacêutica é proporcionada compreendendo o polinucleotídeo antissenso, como aqui descrito e um tampão de fosfato fisiologicamente compatível. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um polinucleotídeo antissenso adicional, em que o polinucleotídeo adicional hibridiza especificamente com um éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano.
[0022] Outro aspecto da invenção proporciona um método de indução de salto de éxon de um RNA de gama sarcoglicano, compreendendo a liberação a uma célula de uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz do polinucleotídeo antissenso ou uma composição da presente divulgação, desse modo induzindo salto de éxon de RNA de gama sarcoglicano.
[0023] Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular humana e em outras modalidades a célula muscular humana está em um paciente. O paciente, em várias modalidades, é um paciente que tem distrofia muscular. Em outras modalidades, a distrofia muscular é a distrofia muscular de cíngulo dos membros tipo 2C (LGMD2C).
[0024] Em ainda outro aspecto da divulgação, um método de melhoramento da distrofia muscular de cíngulo dos membros de tipo 2C (LGMD2C) em um paciente com necessidade da mesma é fornecido, que compreende a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da presente divulgação, desse modo melhorando LGMD2C.
[0025] A invenção também proporciona um método de inibição da progressão da patologia distrófica associada com LGMD2C em um paciente com necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da presente divulgação, inibindo assim a progressão da patologia distrófica.
[0026] Em alguns aspectos, a invenção proporciona um método de melhorar a função muscular de um paciente que sofre de distrofia muscular de cíngulo dos membros tipo 2C (LGMD2C) compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição da presente divulgação, assim melhorando a função muscular. Em algumas modalidades, a melhoria é uma melhoria do músculo cardíaco, e em outras modalidades a melhoria da função muscular é uma melhora da força muscular. Em outras modalidades, a melhoria da força muscular é uma melhora da força muscular respiratória, e em modalidades adicionais da melhoria da função muscular é uma melhoria na estabilidade motora. Em qualquer uma das modalidades da divulgação, a melhora da força muscular respiratória é medida como redução de eventos de dessaturação noturna ou melhora em teste de função pulmonar. Em qualquer uma das modalidades da invenção, a melhoria dos resultados de estabilidade motora em um tempo melhorado para ficar de pé ou subir escadas em relação ao tempo medido anteriormente para ficar de pé ou subir escadas.
[0027] A melhoria na estabilidade motora, em algumas modalidades, resulta em uma melhoria de teste de seis minutos de caminhada pelo paciente em relação a um teste de caminhada de seis minutos anteriormente medido por esse paciente. Melhorias adicionais contempladas pela divulgação são avaliadas através de uma melhor histopatologia ou melhoria dos dados de imagem não invasiva como a redução da infiltração fibrogordurosa e evidência reduzida de cicatrizes. Melhoria do músculo cardíaco como documentado por melhora da função ventricular esquerda e direita, diâmetros reduzidos do ventrículo esquerdo e direito e evidência reduzida de dano cardíaco também está contemplada.
[0028] Outro aspecto da divulgação é desenhado para um kit que compreende polinucleotídeos antissenso como descrito aqui, opcionalmente, em um recipiente, e um folheto informativo, rótulo da embalagem, instruções ou outras rotulagens. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda um polinucleotídeo adicional, em que o polinucleotídeo adicional hibridiza especificamente com um éxon de um RNA de gama sarcoglicano.
[0029] Aspectos e modalidades adicionais da presente descrição são descritos nos parágrafos a seguir enumerados. 1. Um polinucleotídeo isolado que codifica para uma proteína mini-gama sarcoglicano que compreende uma eliminação de um éxon selecionado a partir do grupo consistindo no éxon 4 (SEQ ID NO: 1), éxon 5 (SEQ ID NO: 2), éxon 6 ( SEQ ID NO: 3), éxon 7 (SEQ ID NO: 4) e uma combinação destes. 2. Uma composição compreendendo um vetor viral que compreende o polinucleotídeo de acordo com o parágrafo 1. 3. A composição do parágrafo 2, em que o vetor viral é selecionado a partir do grupo consistindo de um herpesvírus e um adenovírus. 4. A composição do parágrafo 2 ou parágrafo 3, em que o vetor viral é vírus-9 adeno-associado (AAV-9). 5. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-4, em que a deleção compreende éxon 5. 6. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-4, em que a deleção compreende o éxon 4, éxon 5, éxon 6 e o éxon 7. 7. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-4, em que a supressão consiste de éxon 5. 8. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-4, em que a deleção consiste em éxon 4, éxon 5, éxon 6 e o éxon 7. 9. Um polipeptídeo mini-gama sarcoglicano isolado, em que a gama sarcoglicano compreende pelo menos uma deleção em um éxon selecionado a partir do grupo consistindo no éxon 4, éxon 5, éxon 6 e o éxon 7. 10. O polipeptídeo mini-gama sarcoglicano do parágrafo 9 que compreende uma sequência como estabelecida na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. 11. Um polipeptídeo isolado que é pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à do polipeptídeo mini-gama sarcoglicano do parágrafo 9 ou parágrafo 10. 12. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídeo mini-gama sarcoglicano de qualquer um dos parágrafos 9-11 e um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 13. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 12, que compreende ainda um agente terapêutico adicional. 14. A composição do parágrafo 13, em que o agente terapêutico adicional é selecionado de entre o grupo consistindo de um esteroide glicocorticoide, um inibidor da enzima conversora da angiotensina, um bloqueador do receptor beta adrenérgico, um agente anti-fibrótico e uma combinação destes. 15. A composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 12-14, que compreende ainda um veículo, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 16. Uma célula hospedeira que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 1 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2-8. 17. Um método de expressão de uma proteína de mini-sarcoglicano em uma célula, compreendendo o método contatar a célula com o polinucleotídeo isolado do parágrafo 1 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 13, sob condições que resultam na expressão da proteína mini-sarcoglicano na célula. 18. O método do parágrafo 17, em que o contato ocorre in vivo. 19. O método do parágrafo 17 ou o ponto 18, em que a célula é uma célula muscular. 20. O método de qualquer um dos parágrafos 17-19, em que a célula é uma célula de mamífero. 21. O método do parágrafo 20, em que a célula de mamífero é uma célula humana. 22. O método do parágrafo 21, em que o ser humano compreendendo a célula humana tem distrofia muscular. 23. O método do parágrafo 22, em que a distrofia muscular é Distrofia Muscular de cíngulo dos membros tipo 2C (LGMD2C). 24. O método do parágrafo 17, em que o contato ocorre in vitro. 25. O método do parágrafo 24, em que a célula é uma célula muscular. 26. O método de qualquer um dos parágrafos 17 ou 24-25, em que a célula é uma célula de mamífero. 27. O método do parágrafo 26, em que a célula de mamífero é uma célula humana. 28. O método do parágrafo 27, em que o ser humano compreendendo a célula humana tem distrofia muscular. 29. Um método de melhorar a distrofia muscular do cíngulo de membro tipo 2C (LGMD2C) em um paciente com necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo do parágrafo 1 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 12-15, melhorando assim LGMD2C. 30. Um método de inibição da progressão da patologia distrófica associada com LGMD2C em um paciente com necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo do parágrafo 1 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2 -8 ou 12-15, inibindo assim a progressão da patologia distrófica. 31. Um método para melhorar a função muscular de um paciente que sofre de distrofia muscular do cíngulo do membro tipo 2C (LGMD2C) compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do polinucleotídeo do parágrafo 1 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 12-15, melhorando assim a função muscular. 32. O método do parágrafo 31, em que a melhoria é uma melhoria do músculo cardíaco. 33. O método do parágrafo 31 ou parágrafo 32, em que a melhora da função muscular é uma melhora na força muscular. 34. O método do parágrafo 33, em que a melhora da força muscular é uma melhora na força muscular respiratória. 35. O método do parágrafo 29 ou parágrafo 30, em que a melhora da função muscular é uma melhoria na estabilidade motora. 36. O método do parágrafo 35, em que a melhoria dos resultados de estabilidade motora em um teste de caminhada de seis minutos melhorado pelo paciente em relação a um teste de caminhada de seis minutos previamente medido para esse paciente. 37. Um kit que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 1, o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 9-11 ou a composição de qualquer um dos parágrafos 2-8 ou 12, opcionalmente num recipiente, e um folheto informativo, o rótulo da embalagem, instruções ou outras rotulagens. 38. O kit do parágrafo 37, que compreende ainda um agente terapêutico adicional. 39. O kit do parágrafo 38, em que o agente terapêutico adicional é selecionado de entre o grupo consistindo de um esteroide glicocorticoide, um inibidor da enzima conversora da angiotensina, um bloqueador do receptor beta adrenérgico, um agente anti-fibrótico e uma combinação destes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] Figura 1 mostra a região de leitura do gene Sgcgmamífero antes (A) e depois (C) do salto do éxon 4-7. A deleção de uma timina no éxon 6 rompe a região de leitura e é a mutação LGMD2C mais comum. (B). Saltar éxon 4-7 restaura a região de leitura. Os éxons que se seguem éxon "E8" e aqueles que são rotulados "E1" representam regiões não traduzidas.
[0031] Figura 2 mostra a estrutura completa de Y-sarcoglicano (esquerda) e o Y-sarcoglicano internamente truncado após éxon 4-7 ser saltado (direita). Os aminoácidos conservados são mostrados.
[0032] Figura 3 mostra mapas vetoriais de construtos de mini-Sgcg em moscas transgênicas (A) e camundongos transgênicos (B). UAS é a sequência potencializadora especificamente reconhecido por Gal4. O promotor desmina (Des) é músculo específico. Dados preliminares mostraram que mini-Sgcg é produzido em moscas transgênicas UAS-mini-Sgcg e em células musculares Des-mini-Sgcg transfectadas em cultura. Note-se que mini-Sgcg produzida a partir de ambos os transgenes é marcado com o tag de epítopo Xpress.
[0033] Figura 4 mostra que o tubo cardíaco de Drosophila é uma estrutura com paredes finas que corre ao longo do dorso da mosca adulta (A). B mostra uma imagem EM do tubo de coração (h e setas). A e B são de Curtis, Morphology 240: 225 (1999). C mostra a coloração da membrana localizada do transgene mini-Sgcg que expressammini-Sgcg em moscas Sgcg840 moscas no tubo de coração usando um Tinman GAL4.
[0034] Figura 5 mostra que Sgcg e mini-Sgcg de comprimento completo são expressos e se localizam corretamente a membrana plasmática de células de músculo esquelético de voo transgênicas. As células musculares são alinhadas paralelamente umas às outras.
[0035] Figura 6 mostra melhora da função cardíaca em mini-Sgcg moscas resgatadas Sgcd840. Mostrado à esquerda é a dimensão sistólica terminal (ESD). Moscas Sgcd840 têm ESD aumentado, indicando dilatação de tubo cardíaco. Este alargamento é resgatado quando a proteína mini-Sgcgé introduzida em moscas Sgcd840 via transgenia.
[0036] Figura 7 mostra o constructo para a produção de mini-Sgcg em camundongos. Um camundongo fundador transgênico positivo (#23, chamado "MJ") é indicado.
[0037] Figura 8 mostra que a proteína mini-Sgcgé produzida em miotubos cultivados quando transfectados com o vetor Des-mini-Sgcg e se localiza na membrana muscular.
[0038] Figura 9 representa o resgate da capacidade de andar em moscas nulas Sgcd usando mini-Sgcg. No painel da esquerda, o eixo Y é o número de quebras de feixe por hora, e o eixo X é hora onde meia-noite é designada como 0. No painel da direita, o eixo dos Y é o número total de quebras do feixe a partir da meia-noite até 8 AM.
[0039] Figura 10 mostra que a expressão de mini-Sgcg em moscas Sgcd840 melhorou significativamente a atividade noturna.
[0040] Figura 11 mostra que a proteína mini-Sgcg pode ser produzida de forma estável em músculo esquelético de mamíferos (esquelético) e coração (coração).
[0041] Figura 12 mostra a expressão de mini-Sgcg em duas linhagens transgênicas diferentes. O painel superior mostra a expressão de três concentrações diferentes de linhagem transgênica 50 ou linhagem transgênica 84.
[0042] Figura 13 mostra que a proteína mini-Sgcg se localiza na membrana plasmática de músculo esquelético, quando expressa em camundongos normais de tipo selvagem (Tg+). Este mesmo sinal não foi detectado em músculo transgênico negativo (Tg-) demonstrando que este sinal deriva do transgene.
[0043] Figura 14 mostra que a expressão da proteína endógena completa Y-sarcoglicano (Sgcg) é diminuída na membrana plasmática quando mini-Sgcgestá presente (Tg+(painel da esquerda) em comparação quando mini-Sgcgestá ausente (Tg-(painel da direita)).
[0044] Figura 15 ilustra um modelo para a montagem de sarcoglicano.
[0045] Figura 16 mostra que mini-Sgcg é enriquecido na fração microssomal pesada do músculo.
[0046] Figura 17 mostra duas linhagens de células humanas com mutações SGCG que foram infectadas com retrovírus que expressam telomerase e MyoD. A linha superior é de uma paciente LGMD 2C cuja doença resulta de uma mutação de exclusão de éxon 7 em SGCG. A linha inferior é de um paciente LGMD 2C que é eliminado por éxon 6 de SGCG.
[0047] Figura 18 representa as linhagens celulares de LGMD 2C diferenciadas na linhagem muscular (6 dias de diferenciação). A linha superior é de uma paciente LGMD 2C cuja doença resulta de uma mutação de exclusão éxon 6 em SGCG, e a linha inferior é de um paciente LGMD 2C que é eliminado para éxon 7 de SGCG. MyoD, um marcador de músculo, é expresso a partir do retrovírus (painel do meio) e desmina, um marcador de músculo, é induzida a partir MyoD (painel da direita), indicando que estas células são viáveis para modelos de doença muscular. O painel do lado esquerdo (Hoechst) mostra núcleos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0048] As mutações no gene que codifica Y-sarcoglicano, Sgcg,levam a distrofia muscular, uma doença com degeneração muscular, falha de regeneração e fraqueza muscular. Uma estratégia aqui examinada para o tratamento de formas genéticas de distrofia muscular é o salto de éxon. Exclusão de certos éxons a partir de transcritos finais, ou salto de éxon, pode ser conseguida através do bloqueio de sítios de junção essenciais utilizando um ou mais polinucleotídeos antissenso (AONs). Ao induzir a junção em torno éxons portadores da mutação, uma proteína internamente suprimida, mas potencialmente funcional é produzida.y-sarcoglicano é uma proteína associada à membrana que é parte do complexo da proteína distrofina, um complexo que estabiliza a membrana muscular durante a contração muscular. O gene Sgcg é composto por oito éxons. A mutação mais frequente em Sgcg é a deleção de timidina 525 no éxon 6 (525ΔT), fazendo com que a produção de 19 ácidos aminados missense e um códon de parada prematura. Saltar éxons 4-7 restaura a região de leitura de proteína apropriada, resultando em uma proteína Y-sarcoglicano truncada internamente. Esta forma truncada de y- sarcoglicano reduz a proteína de comprimento completo a partir de 291 aminoácidos a 157 aminoácidos e retém a região intracelular, domínio transmembranar e o motivo fundamental rico em cisteína na terminação carboxi.
[0049] O gene Y-sarcoglicano é conservado entre o ser humano, camundongo e Drosophila, e ambos modelos de mosca e camundongos de mutações no gene Y-sarcoglicano foram gerados anteriormente. A sequência de aminoácidos de gama sarcoglicano humana é apresentada na SEQ ID NO: 5, enquanto que a sequência de aminoácidos de gama sarcoglicano de camundongo é apresentada na SEQ ID NO: 6. A Y-sarcoglicano murino ou humano truncado resultante de salto de éxon 4-7 foi denominado "mini- Sgcg." A sequência de aminoácidos de humano mini-Sgcg resultante de salto de éxon 4-7 é apresentada em SEQ ID NO: 7, enquanto que a sequência de aminoácidos de mini-Sgcg de camundongo resultante de salto de éxons 4-7 é apresentada em SEQ ID NO: 8. A divulgação também contempla, em várias modalidades, os polipeptídeos mini-Sgcg de humanos ou de camundongo, em que um ou mais dos éxons 4, éxon 5, éxon 6 e o éxon 7 são eliminados em qualquer combinação. Assim, os polipeptídeos mini-Sgcg são contempladas em que o éxon 4-7 são variadamente suprimidos, incluindo, entre outros, limitando às combinações em que: (i) o éxon 4 e o éxon 5 são excluídos; (ii) éxon 5 e éxon 6 é excluído; (iii) éxon 4 e éxon 6 é excluído; (iv) éxon 4 e éxon 7 são excluídos; (v) éxon 5 e éxon 7 são excluídos; (vi) éxon 6 e éxon 7 são excluídos; (vii) éxon 4, e éxon 5 éxon 6 são excluídos; (viii) éxon 5, éxon 6 e éxon 7 são excluídos; (ix) éxon 4, éxon 6 e éxon 7 são excluídos; (x) éxon 4 é excluído; (xi) éxon 5 é excluído; (xii) éxon 6 é excluído; ou (xiii) éxon 7 é excluído. A divulgação contempla também polinucleotídeos que codificam cada um dos anteriores polipeptídeos mini-Sgcg correspondente.
[0050] Em alguns aspectos, a invenção proporciona um polipeptídeo mini-gama sarcoglicano isolado, em que a gama sarcoglicano compreende pelo menos uma deleção em um éxon selecionado a partir do grupo consistindo no éxon 4, éxon 5, éxon 6 e o éxon 7. Em algumas modalidades, o polipeptídeo mini-gama sarcoglicano da invenção compreende uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
[0051] De acordo com aspectos adicionais, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que é pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a um polipeptídeo mini-gama sarcoglicano da divulgação. Em aspectos adicionais, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que é cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% idêntica a um polipeptídeo mini-gama sarcoglicano da divulgação. Em ainda outros aspectos, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado que é pelo menos 90% a cerca de 100%, ou, pelo menos, 95% a cerca de 100%, ou pelo menos cerca de 95% a cerca de 99% idêntica a um polipeptídeo minigama sarcoglicano da divulgação.
[0052] Os dados aqui apresentados demonstram que a proteína de mini-Sgcgé produzida em Drosophilatransgênica, onde normalmente se localiza na membrana plasmática. As estruturas de todo o comprimento de y- sarcoglicano e a proteína truncada após o salto de éxon são mostradas nas Figuras 1 e 2, respectivamente.
[0053] A invenção proporciona, assim, um ou mais polinucleotídeos isolados antissenso, em que o um ou mais polinucleotídeos hibridizam especificamente com uma região alvo éxon de um RNA de gama sarcoglicano, em que o éxon é selecionado a partir do grupo consistindo no éxon 4 (SEQ ID NO: 1), éxon 5 (SEQ ID NO: 2), éxon 6 (SEQ ID NO: 3), éxon 7 (SEQ ID NO: 4) e uma combinação destes.
[0054] Como aqui utilizado, “hibridização” significa uma interação entre duas ou três fitas de ácidos nucleicos por pontes de hidrogênio, em conformidade com as regras de complementaridade de DNA de Watson- Crick, ligação Hoogstein, ou outra ligação específica de sequência conhecida na técnica. A hibridização pode ser realizada sob condições de rigor diferentes conhecidos na técnica. “Especificamente hibridizar”, como aqui utilizado, é a hibridização que permite um duplex estabilizado entre cadeias polinucleotídicas que são complementares ou substancialmente complementares. Por exemplo, uma cadeia polinucleotídica tendo 21 unidades de nucleotídeos pode parear com base com outro polinucleotídeo de 21 unidades de nucleotídeos, no entanto, apenas 19 bases em cada fita são complementares ou substancialmente complementares, de tal modo que a “duplex” tem 19 pares de bases. As restantes bases podem, por exemplo, existir como saliências 5’ e/ou 3’. Além disso, dentro do duplex, 100% de complementaridade não é necessária; complementaridade substancial é permitida dentro de um duplex. Complementaridade substancial refere-se a 75% ou uma maior complementaridade. Por exemplo, um pareamento incorreto em um duplex que consiste em 19 pares de bases resulta em 94,7% de complementaridade, tornando o duplex substancialmente complementar.
[0055] Note-se aqui que, como utilizado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o” incluem referência plural a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[0056] Note-se também que o termo “cerca de” como aqui utilizado, significa aproximadamente.
Desenho de polinucleotídeos/polinucleotídeo antissenso
[0057] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um polinucleotídeo antissenso capaz de se ligar a um alvo selecionado para induzir o salto de éxon. Para induzir o salto de éxon em éxons do transcrito do gene gama sarcoglicano, o polinucleotídeo antissenso é selecionado com base nas sequências de éxon indicadas nas Tabelas 1 e 2. A invenção também proporciona uma combinação ou “coquetel” de dois ou mais polinucleotídeos antissenso capazes de se ligarem um alvo ou alvos selecionados para induzir o salto de éxon. O salto de éxon contemplado aqui induz exclusão de éxons 4, 5, 6 e/ou 7, de modo a gerar uma proteína gama sarcoglicano in-frame internamente truncada. Excluir éxons 4, 5, 6 e 7 resulta na geração de uma proteína truncada internamente faltando 135 aminoácidos, enquanto excluir éxon 5 resulta em uma proteína internamente excluída, inframe sem 40 aminoácidos. As proteínas truncadas internamente, denominados mini-Sgcg, retém a capacidade de interagir com a distrofina e suas proteínas associadas e estabilizar as células musculares cardíaca e esquelética.
[0058] Dentro do contexto da revelação, sítios alvos preferidos são aqueles envolvidos na junção do mRNA (isto é, sítios de junção doadores, sítios aceitadores de junção ou elementos de junção potencializadores exônicos). Pontos de ramificação de junção e sequências de reconhecimento de éxon ou potencializadores de junção também são sítios alvo potencial para modulação do junção de mRNA.
[0059] Assim, em várias modalidades, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze ou mais polinucleotídeos antissenso são utilizados para induzir o salto de éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano. A escolha do número de polinucleotídeos antissenso pode ser determinada empiricamente por um especialista na técnica. A pessoa especialista pode testar individualmente a capacidade relativa de composições compreendendo um, dois, três, quatro ou mais polinucleotídeos antissenso para produzir um produto de proteína de interesse in vitro. Em resumo, e em uma modalidade específica, uma composição compreendendo um polinucleotídeo antissenso que é concebido para hibridizar especificamente(ou seja, bloquear) um sítio aceitador de junção no éxon 4 de um ácido nucleico gama sarcoglicano é adicionado a uma cultura de fibroblastos obtidos a partir de um paciente contendo uma mutação na gama sarcoglicano. Em seguida, os fibroblastos são induzidos a adotar uma linhagem miogênica via expressão de MyoD forçada (ver Exemplo 2 para detalhes), e os miotubos resultantes são testados para a expressão de uma proteína de superfície de mini-Sgcgatravés de, por exemplo e sem limitação, um experimento de imunofluorescência. Uma análise mais aprofundada de imunofluorescência dos miotubos pode ser conduzida para identificar se sarcoglicano adicionais (ou seja, α-, β- e δ-sarcoglicano) são co-localizados com mini-Sgcg em miotubos. Tal co-localização dos membros do complexo sarcoglicano associado com membranas musculares indica que o mini-Sgcg que é produzido após a administração da composição que compreende um polinucleotídeo antissenso é capaz de induzir eficazmente salto de éxon do ácido nucleico gama sarcoglicano para resultar em uma proteína truncada que manteve a sua capacidade de se associar com os outros membros do complexo sarcoglicano, bem como incorporar em uma membrana muscular. Experimentos semelhantes podem ser realizados com composições que compreendem individualmente dois, três, quatro, cinco ou mais polinucleotídeos antissenso, cada um desenhado para hibridizar especificamente com um éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano.
[0060] Para identificar e selecionar os polinucleotídeos antissenso adequados para utilização na modulação de salto de éxon, uma sequência de ácido nucleico, cuja função é a de ser modulado deve primeiro ser identificada. Isto pode ser, por exemplo, um gene (ou mRNA transcrito do gene) cuja expressão está associada com um distúrbio particular ou estado de doença, ou uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso. Dentro do contexto da revelação, sítios de alvos adequados são aqueles envolvidos na junção do mRNA (por exemplo, sítios de junção doadores, sítios aceitadores de junção, ou elementos de junção potencializadoras exônicos). Pontos de ramificação de junção e sequências de reconhecimento de éxon ou potencializadores de junção também são sítios alvo potenciais para modulação do junção de mRNA contemplado pela divulgação. Tabela 2. Tabela de coordenadas de éxon baseada em UCSC Human Genome Build 19.
Figure img0003
Éxons Sgcg por UCSC hg19 , transcritoNM_000231 * -50 do éxon de início devido à região rica em T
[0061] Os especialistas na técnica podem facilmente desenhar polinucleotídeos antissenso de acordo com a presente divulgação. Por exemplo, os ensinamentos gerais na técnica incluem, entre outros, Aartsma- Rus et al., Methods Mol Biol. 867: 117-29 (2012); Aartsma-Rus et al., Methods Mol Biol. 867: 97-116 (2012); van Roon-Mom et al., Methods Mol Biol. 867: 79-96 (2012), cada um dos quais é aqui incorporado por referência. As diretrizes gerais também incluem a tentativa de evitar 3 nucleotídeos consecutivos G ou C, a escolha de comprimentos e sequências que favorecem a auto estrutura (hairpinning serão evitados), e evitando aquelas sequências susceptíveis de formar dímeros de iniciadores. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo antissenso da divulgação é um que é concebido para hibridizar especificamente com um éxon ou de uma fronteira de íntron-éxon, de tal modo que o polinucleotídeo antissenso hibridiza especificamente com uma sequência que é completamente dentro de um éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano, ou cerca de um nucleotídeo do polinucleotídeos antissenso se estende em dito limite de íntron-éxon quando o polinucleotídeo antissenso é hibridizado especificamente com o ácido nucleico gama sarcoglicano. Em algumas modalidades em que o polinucleotídeo antissenso hibridiza especificamente com uma sequência que é completamente dentro de um éxon, está contemplado que um terminal do polinucleotídeo antissenso é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos de um terminal do éxon. O limite íntron-éxon de cada um dos éxons 4, 5, 6, e 7, é mostrado na Tabela 1. De acordo com outras modalidades, um polinucleotídeo antissenso da divulgação é um que é concebido para hibridizar especificamente com um limite íntron-éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano, de tal forma que cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotídeos do antissenso polinucleotídeo se estende de dita fronteira intron-éxon. Entende-se que um nucleotídeo pode “se estender do limite intron-éxon” em ambos os lados do éxon ou lado do íntron. Assim, um polinucleotídeo antissenso que especificamente e, predominantemente, hibridiza a sequência intrônica e hibridiza com apenas um nucleotídeo de um éxon adjacente poderia “estender o limite éxon-íntron” em um nucleotídeo. Da mesma forma, um polinucleotídeo antissenso que hibridiza especificamente com a sequência exônica e apenas hibridiza com um nucleotídeo de um íntron adjacente poderia “estender o limite éxon-íntron” em um nucleotídeo. Em qualquer das modalidades acima mencionadas, o polinucleotídeo antissenso é pelo menos cerca de 10 nucleotídeos e a cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos de comprimento. Comprimentos de polinucleotídeos antissenso contemplados pela invenção são discutidos com mais detalhes abaixo.
[0062] Em alguns aspectos, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um polinucleotídeo antissenso para induzir o salto de éxon de um ácido nucleico gama sarcoglicano, de tal forma que uma proteína “mini-Sgcg“ é produzida que tem a capacidade de (a), associar de forma eficaz com outros membros do complexo sarcoglicano (ou seja, α-, β- e δ δsarcoglicano) e (b) incorporar corretamente em uma membrana muscular. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos resultam na restauração de um sarcoglicano a uma superfície da membrana muscular, de modo a que cerca de 1% da proteína gama sarcoglicano é restaurada em relação à quantidade de proteína gama sarcoglicano a uma membrana muscular na ausência de administração da composição farmacêutica. Em outras modalidades, os métodos aqui descritos resultarão na recuperação de uma proteína sarcoglicano na superfície da membrana muscular, de tal modo que cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, de cerca de 7 vezes, a cerca de 8 vezes, cerca de 9 vezes, cerca de 10 vezes ou mais da proteína gama sarcoglicano é restaurada em relação à quantidade de proteína na gama sarcoglicano da membrana muscular, na ausência de administração da composição farmacêutica. Essa restauração da proteína gama sarcoglicano na membrana do músculo pode ser determinada por um especialista na técnica, por exemplo, e sem limitação, a obtenção de uma biopsia muscular do paciente e realizando imunofluorescência com um anticorpo que tem afinidade de ligação específica para proteína mini-Sgcg.
Polinucleotídeos
[0063] Produtos, utilizações e métodos da presente descrição compreendem um ou mais polinucleotídeos. Como aqui utilizado, um “polinucleotídeo” é um oligômero composto de nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser composto de DNA, RNA formas modificadas do mesmo, ou uma combinação dos mesmos.
[0064] O termo “nucleotídeo” ou o seu plural, como aqui utilizado é intercambiável com formas modificadas e de outro modo como aqui discutido conhecidos na técnica. Em certos casos, a técnica utiliza a expressão “nucleobase” que abrange os nucleotídeos que ocorrem naturalmente, bem como alterações de nucleotídeos que podem ser polimerizados. Assim, nucleotídeo ou nucleobase significa nucleobase que ocorre naturalmente adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) e uracila (U), bem como nucleobases que não ocorrem naturalmente, como xantina, diaminopurina, 8- oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-desazaguanina, N4, N4- etanocitosina, N’,N'-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina (mC), 5-(C3— C6)-alquinil-citosina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, pseudoisocitosina, iazolopiridina, 2-hidroxi-5-metil-4-tr-,iazolupiridina, isocitocina, isoguanina, inosina e as nucleobases de “ocorrência não natural” descritas em Benner et al., Patente US 5.432.272 e Susan M. Freier e Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443. O termo “nucleobase” também inclui não só os heterociclos de purina e pirimidina conhecidos, mas também análogos heterocíclicos e seus tautômeros. Além disso, nucleobases que ocorrem naturalmente e não naturalmente incluem os revelados na Patente US 3.687.808 (Merigan, et al.), no Capítulo 15 por Sanghvi, em Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke e B. Lebleu, CRC Press, 1993, in Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722 (ver especialmente as páginas 622 e 623, e en Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Em vários aspectos, polinucleotídeos também incluem uma ou mais “bases” ou “bases nucleosídicas” ou “unidades de base”, que incluem compostos como os compostos heterocíclicos que podem servir como nucleobases, incluindo certas “bases universais” que não são bases de nucleosídeos no sentido mais clássico, mas servem como bases nucleosídicas. Bases universais incluem 3-nitropirrol, indois opcionalmente substituídos (por exemplo,, 5-nitroindol), e hipoxantina opcionalmente substituída. Outras bases universais desejáveis incluem derivados de pirrol, e diazol ou triazol, incluindo aquelas bases universais conhecidas na técnica.
[0065] Os polinucleotídeos podem também incluir nucleobases modificadas. Uma “base modificada” é entendida na técnica sendo uma que pode emparelhar com uma base natural (por exemplo, adenina, guanina, citosina, uracila, e/ou timina) e/ou pode emparelhar com uma base que não ocorre naturalmente. Exemplos de bases modificadas são descritas em EP 1 072 679 e WO 97/12896, as revelações das quais são aqui incorporada por referência. As nucleobases modificadas incluem, entre outras, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6- metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinil uracila e citosina e outros derivados alquinil de bases de pirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil e outras adeninas e guaninas 8-substituídos, 5-halo particularmente 5-bromo, 5- trifluorometil e outros 5- uracilas e citosinas substituídas, 7-metilguanina e 7- metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3-desaza-adenina. Outras bases modificadas incluem pirimidinas tricíclicas como fenoxazina citidina (1H-pirimido [5, 4-b] [1, 4] benzoxazin-2 (3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido [5, 4-b] [l, 4] benzotiazin-2 (3H)-ona), G-clamps como uma fenoxazina citidina substituída (por exemplo, 9- (2-aminoetoxi)-H- pirimido [5,4-b] [1, 4] benzox-azin-2 (3H)-ona), carbazol citidina (2H- pirimido [4,5-b] indol-2-ona), citidina piridoindol (H-pirido [3’, 2’: 4,5] pirrolo [2,3-d ] pirimidin-2-ona). Bases modificadas podem também incluir aquelas em que a base de purina ou de pirimidina é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2- aminopiridina e 2-piridona. As nucleobases adicionais incluem as reveladas na Pat. U.S. No. 3,687,808, aquelas reveladas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas reveladas por Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613, e aquelas reveladas por Sanghvi, Y. S., capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algumas destas bases são úteis para aumentar a afinidade de ligação do polinucleotídeo e incluem 5-pirimidinas substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e O-6 purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina. Substituições 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2°C e são, em certos aspectos, combinado com modificações de açúcar com 2’-O-metoxietil. Ver, Patentes US 3.687.808 Patentes US 4.845.205.; 5.130.302; 5.134,066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.750.692 e 5.681.941, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência.
[0066] Os polinucleotídeos modificadas são contemplados para utilização em que ambos um ou mais açúcares e/ou uma ou mais ligação internucleotídica das unidades de nucleotídeos do polinucleotídeo é substituída com açúcares de “ocorrência não natural” (ou seja, com exceção de ribose ou desoxirribose) ou ligações internucleotídicas, respectivamente. Em um aspecto, esta modalidade contempla um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, o esqueleto de açúcar de um polinucleotídeo é substituído com um esqueleto contendo amida (por exemplo, ligações peptídicas entre unidades N- (2-aminoetil)-glicina). Ver, por exemplo, Patentes US 5.539.082.; 5.714.331; e 5.719.262, e Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência.
[0067] Os polinucleotídeos modificados podem também conter um ou mais grupos de açúcares substituídos. Em um aspecto, uma modificação do açúcar inclui ácidos nucleicos bloqueados (LNA) nos quais o grupo 2’- hidroxil está ligado à extremidade 3’ ou 4’ do átomo de carbono do anel de açúcar, formando assim um grupo açúcar bicíclico. A ligação é em alguns aspectos um grupo metileno (—CH2—)n em ponte do átomo de oxigênio 2’ e o átomos de carbono 4’, em que n é 1 ou 2. Os LNA e a sua preparação estão descritos em WO 98/39352 e WO 99/14226, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.
[0068] Para evitar a degradação do pré-mRNA durante a formação do duplex com os polinucleotídeos antissenso, os polinucleotídeos antissenso utilizados no método podem ser adaptados para minimizar ou evitar a clivagem endógena por RNase H. Esta propriedade é vantajosa porque o tratamento do RNA com os polinucleotídeos não metilados intracelularmente ou em extratos brutos que contêm a RNase H leva a degradação do pré- mRNA: dúplex de polinucleotídeos antissenso. Qualquer forma de polinucleotídeo antissenso modificado que é resistente a tal degradação, ou não induz tal degradação, está contemplado pela divulgação. Exemplos de moléculas antissenso não limitativas que, quando duplexadas com RNA, não são clivadas pela RNAase H celular são polinucleotídeos que compreendem derivados de nucleotídeos 2’-O-metil. 2’-O-metil-oligorribonucleotídeos são muito estáveis em um ambiente celular e em tecidos animais, e as suas fitas duplas de RNA com têm valores Tm mais elevados do que os seus homólogos ribo ou deoxirribo.
[0069] Os polinucleotídeos antissenso que não ativam a RNase H podem ser feitos em conformidade com técnicas conhecidas (ver, por exemplo e sem limitação, Patente US 5.149.797). Tais polinucleotídeos antissenso, que podem ser sequências de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, simplesmente contêm qualquer modificação estrutural que estericamente dificulta ou impede a ligação da RNase H a uma molécula duplex contendo o polinucleotídeo como um membro da mesma, que a modificação estrutural não prejudica substancialmente ou interrompe a formação de duplex. Porque as porções do polinucleotídeo envolvidos na formação de fitas duplas são substancialmente diferentes daquelas porções envolvidas na RNase H de ligação da mesma, numerosas moléculas antissenso que não ativam a RNase H estão disponíveis. (A ativação é utilizada neste sentido referir-se a degradação de RNase H, como resultado de um substrato não sendo susceptível a tal degradação ou tal substrato não para induzir a degradação.) Por exemplo, tais moléculas antissenso podem ser polinucleotídeos, em que pelo menos um, ou todos os resíduos de fosfatos em ligação internucleotídica em ponte, como metil fosfonatos, metil fosforotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos e/ou fosforamidatos. Por exemplo, cada um dos resíduos de fosfato internucleotídeos em ponte pode ser modificado conforme descrito. Em outro exemplo não limitativo, tais polinucleotídeos antissenso são polinucleotídeos em que pelo menos um, ou todos, os nucleotídeos contêm um carbono 2’ ligado a um radical alquil inferior (por exemplo, C1-C4, linear ou ramificado, saturado ou insaturado, como metil, etil, etenil, propil, 1-propenil, 2-propenil e isopropil). Por exemplo, cada um dos nucleotídeos pode ser modificado conforme descrito.
[0070] Os métodos para preparar polinucleotídeos de uma sequência predeterminada são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2aed. 1989) and F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991). São preferidos os métodos de síntese em fase sólida para ambos polirribonucleotídeos e polidesoxirribonucleotídeos (os métodos bem conhecidos de síntese de DNA são também úteis para a síntese de RNA). Polirribonucleotídeos podem também ser preparados enzimaticamente. Nucleobases que não ocorrem naturalmente podem ser incorporadas no polinucleotídeo, bem como. Ver, por exemplo, Patente US 7,223,833; Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:7475 (2005); and Zimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002).
[0071] Os polinucleotídeos aqui contemplados variam entre cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é entre pelo menos 5 nucleotídeos, e pelo menos 20 nucleotídeos, entre pelo menos 5 nucleotídeos, e pelo menos 30 nucleotídeos ou pelo menos entre 5 e nucleotídeos, pelo menos, 50 nucleotídeos.
[0072] De acordo com outras modalidades, um polinucleotídeo contemplado pela divulgação é cerca de 5 a cerca de 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 90 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 80 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 45 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 15 nucleotídeos de comprimento, cerca de 5 a cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e todos os polinucleotídeos de comprimento intermediário dos tamanhos especificamente revelados na medida em que o polinucleotídeo é capaz de atingir o resultado desejado. Assim, polinucleotídeos de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou mais nucleotídeos de comprimento são contemplados.
[0073] Os polinucleotídeos da revelação são cerca de 40% de GC a cerca de 60% de GC, com um Tm de cerca de 48°C ou superior.
[0074] Uma outra modificação dos polinucleotídeos da invenção envolve a ligação química do polinucleotídeo para uma ou mais porções ou conjugados que aumentam a atividade, a distribuição celular ou a captação celular do polinucleotídeo. Tais grupos incluem, entre outros, radicais lipídicos, como uma unidade de colesterol, ácido eólico, um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos dodecandiol ou undecil, um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil- rac-glicerol ou de trietilamônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol, ou ácido acético adamantano, uma porção de palmitil, ou um octadecilamina ou porção hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
Agentes Terapêuticos
[0075] Os compostos da invenção podem também ser utilizados como um profilático ou terapêutico, que pode ser utilizado para efeitos de tratamento de uma doença genética.
[0076] Em uma modalidade a invenção proporciona polinucleotídeos antissenso que se liga a um alvo selecionado no pré-mRNA gama sarcoglicano para induzir salto de éxon eficiente e consistente aqui descrito em uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz misturada com um transportador farmaceuticamente aceitável, diluente, ou excipiente.
[0077] Um transportador farmaceuticamente aceitável refere-se, geralmente, a materiais que são adequados para administração a um sujeito em que o transportador não é biologicamente prejudicial, ou de outra forma, provoca efeitos indesejáveis. Tais transportadores são tipicamente componentes inertes de um medicamento. Normalmente, um transportador é administrado a um indivíduo juntamente com um ingrediente ativo sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de um modo prejudicial com qualquer dos outros componentes de uma composição farmacêutica na qual está contido. Transportadores farmacêuticos adequados são descritos Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., (1990), aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0078] De uma forma mais específica da divulgação, são fornecidas composições de produtos farmacêuticos compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes de um polinucleotídeo antissenso em conjunto com diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições incluem diluentes de vários teores de tampão (por exemplo, fosfato, Tris-HCl, acetato), pH e força iónica e outros aditivos como detergentes e agentes solubilizantes (por exemplo, Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (por exemplo, Thimersol, álcool benzílico) e substâncias espessantes (por exemplo, lactose, manitol). O material pode ser incorporado em preparações de partículas de compostos poliméricos, como, por exemplo, e sem limitação, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico, ou em lipossomas. Ácido hialurônico pode também ser utilizado. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo das composições descritas. As composições podem ser preparadas na forma líquida, ou podem estar na forma de pó seco, como a forma liofilizada.
[0079] Será apreciado que as composições farmacêuticas proporcionadas de acordo com a divulgação podem ser administradas por quaisquer meios conhecidos na técnica. De preferência, as composições farmacêuticas para administração são administradas por injeção, por via oral, ou por o pulmonar, ou via nasal. Os polinucleotídeos antissenso são, em várias modalidades, liberados por administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.
[0080] As moléculas antissenso da invenção abrangem todos os sais, ésteres, ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um ser humano, é capaz de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabólito ou resíduo biologicamente ativo. Assim, por exemplo, a divulgação é também desenhada para pró-drogas e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção, sais farmaceuticamente aceitáveis de tais pró-drogas, e outros bioequivalentes.
[0081] O termo “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere-se aos sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção: ou seja, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto parental e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis dos mesmos.
[0082] Para polinucleotídeos, os exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, (a) sais formados com cátions como sódio, potássio, amônio, magnésio, cálcio, poliaminas como espermina e espermidina; (b) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico; (c) sais formados com ácidos orgânicos como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenodissulfônico, ácido poligalacturônico; e (d) sais formados a partir de ânions elementares como cloro, bromo, e iodo. As composições farmacêuticas da divulgação podem ser administradas de várias maneiras, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico desejado e é sobre a área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e a membranas mucosas, incluindo retal), pulmonar, por exemplo, por inalação de pós ou aerossóis, (incluindo por nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), por via oral ou parenteral. A administração parenteral inclui a administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou injeção intramuscular ou infusão; ou administração intracraniana, por exemplo, intratecal ou intraventricular. Os polinucleotídeos com pelo menos uma modificação de 2’-O-metoxietil parecem ser particularmente úteis para a administração oral.
[0083] As formulações farmacêuticas da presente descrição, que podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação os ingredientes ativos com os veículos farmacêuticos ou excipientes. Em geral, as formulações são preparadas trazendo uniformemente em associação os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto.
[0084] A terapia de combinação com um agente terapêutico adicional é também contemplada pela divulgação. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser administrados concomitantemente com uma composição da presente invenção incluem, entre outros, um esteroide glicocorticoide (por exemplo, e sem limitação, prednisona e deflazacort), um inibidor da enzima conversora da angiotensina, um bloqueador do receptor beta adrenérgico, um agente anti-fibrótico e uma combinação destes.
Terapia gênica
[0085] Em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos de expressão de um mini-gama sarcoglicano em uma célula. Em qualquer um dos aspectos ou modalidades da invenção, a célula é uma célula de mamífero. Em qualquer um dos aspectos ou modalidades da invenção, a célula está em um ser humano e o humano tem necessidade do mini-gama sarcoglicano. Assim, em alguns aspectos, a invenção proporciona métodos de terapia genética para a expressão de um mini-gama sarcoglicano em uma célula.
[0086] Em algumas modalidades, um vetor (por exemplo, um vetor de expressão) que inclui um polinucleotídeo da invenção para a expressão direta do polinucleotídeo em uma célula hospedeira adequada. Tais vetores são úteis, por exemplo, para a amplificação dos polinucleotídeos em células hospedeiras para criar quantidades úteis do mesmo, e para a expressão de proteínas utilizando técnicas recombinantes. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão em que um polinucleotídeo da invenção está operativamente ligado a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de controle da expressão. Construções de expressão recombinantes se replicam autonomamente, como plasmídeos e vetores de DNA viral que incorporam os polinucleotídeos da invenção são especificamente contemplados. As sequências de DNA de controle de expressão incluem promotores, estimuladores, e operadores, e são geralmente selecionados com base nos sistemas de expressão em que o constructo de expressão devem ser utilizados. Em algumas modalidades, as sequências promotoras e estimuladoras são selecionadas quanto à sua capacidade para aumentar a expressão do gene, enquanto que as sequências de operação podem ser selecionadas para a capacidade de regular a expressão do gene. As construções de expressão da invenção podem também incluir sequências que codificam para um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a identificação de células hospedeiras que compreendem o constructo. As construções de expressão podem também incluir sequências que facilitam a, e de preferência, promovem a recombinação homóloga em uma célula hospedeira. As construções de expressão da divulgação também incluir, em várias modalidades, as sequências necessárias para a replicação em uma célula hospedeira.
[0087] Exemplos de sequências de controle da expressão incluem sequências/potencializador do promotor, por exemplo, promotor/potencializador de citomegalovírus [Lehner et al., J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502, 1991; Boshart et al., Cell, 41: 521-530, (1985)]; promotor do Vírus do sarcoma Rous [Davis et al., Hum. Gene Ther., 4: 151, (1993)]; e promotor de vírus símio 40, para a expressão em uma célula de mamífero alvo, sendo o promotor operativamente ligado à montante (ou seja, 5’) da sequência de codificação de polipeptídeo (as divulgações das referências citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade e em particular com relação à discussão de sequências de controle de expressão). Em outra variação, o promotor é um promotor específico de músculo. Os polinucleotídeos da invenção podem também incluir, opcionalmente, uma sequência de poliadenilação adequada (por exemplo, SV40 ou sequência de poliadenilação de gene de hormônio de crescimento humano), operacionalmente ligada à jusante (isto é, 3') da sequência de codificação de polipeptídeo.
[0088] Se desejado, um polinucleotídeo da divulgação também compreende, opcionalmente, uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo sinal secretor fundido na estrutura com a sequência polipeptídica. O peptídeo sinal secretor dirige a secreção do polipeptídeo da invenção pelas células que expressam o polinucleotídeo e é clivado pelas células a partir do polipeptídeo segregado. O polinucleotídeo pode ainda compreender, opcionalmente, sequências cuja única função pretendida é facilitar a produção em grande escala do vetor, por exemplo, em bactérias, como uma origem de replicação bacteriana e uma sequência codificando um marcador selecionável. No entanto, se o vetor é administrado a um animal, tais sequências estranhas são, de preferência, pelo menos, parcialmente clivadas. Pode-se produzir e administrar polinucleotídeos para a terapia genética usando procedimentos que foram descritos na literatura para outros transgenes. Ver, por exemplo, Isner et al., Circulation, 91: 2687-2692, 1995; Isner et al., Human Gene Therapy, 7: 989-1011, 1996; Wang et al., Mol Ther. 20(8):1501-7 (2012); e Zhang et al., Hum Mol Genet. 22(18): 3720-9 (2013); cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[0089] Em algumas modalidades, um transgene “nu” que codifica para um mini-gama sarcoglicano aqui descrito (ou seja, um transgene sem um vetor viral, lipossômico ou outro vetor para facilitar a transfecção) é empregado.
[0090] Os vetores são também úteis para os regimes de tratamento de “terapia gênica”, em que, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica para um mini-gama sarcoglicano é introduzido em um sujeito que sofre de ou em risco de sofrer de uma distrofia muscular de uma forma que faz com que as células no sujeito expressem o mini-gama sarcoglicano in vivo. Qualquer vetor apropriado pode ser usado para introduzir um polinucleotídeo que codifica um mini-gama sarcoglicano no hospedeiro. Exemplos de vetores que foram descritos na literatura incluem os vetores retrovirais de replicação deficientes, incluindo, entre outros, vetores lentivírus [Kim et al., J. Virol., 72(1): 811-816, (1998); Kingsman & Johnson, Scrip Magazine, October, 1998, pp. 43-46]; vetores parvovirais, como vetores virais adeno-associados (AAV) [Patentes US 5.474.935l; 5.139.941; 5.622.856; 5.658.776; 5.773.289; 5.789.390; 5.834.441; 5.863.541; 5.851.521; 5.252.479; Gnatenko et al., J. Invest. Med., 45: 87-98, (1997)]; vetores adenovirais (AV) [Patentes US 5.792.453; 5.824.544; 5.707.618; 5.693.509; 5.670.488; 5.585.362; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584, (1992); Stratford Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626-630, (1992); e Rosenfeld et al., Cell, 68: 143155, (1992)]; um quimérico viral adeno-associado adenoviral [Patentes US 5.856.152] ou um vetor viral vaccinia ou um herpesviral [patentes US 5.879.934; 5.849.571; 5.830.727; 5.661.033; 5.328.688]; transferência de gene mediada Lipofectina (BRL); vetores lipossomais [Patentes US 5.631.237]; e combinações dos mesmos. Além disso, contemplado pela divulgação para a introdução de um polinucleotídeo que codifica para um mini-gama sarcoglicano em um sujeito é um vetor plasmídico [ver, por exemplo, Dean, Am J Physiol Cell Physiol. 289(2): C233-45 (2005); Kaufman et al., Gene Ther. 17(9): 1098-104 (2010); Magnusson et al., J Gene Med. 13(7-8): 382-91 (2011)]. Por exemplo e sem limitação, qualquer vetor de plasmídeo derivado de pBR- ou de pUC é contemplado. Todos os documentos anteriores são aqui incorporados por referência na sua totalidade e em particular no que diz respeito à sua discussão de vetores de expressão. Qualquer um destes vetores de expressão pode ser preparado utilizando técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994). Opcionalmente, o vetor viral é gerado deficiente em replicação por, por exemplo, exclusão ou rompimento genes selecionados necessários para a replicação viral.
[0091] Outros mecanismos de liberação não virais contemplados incluem precipitação com fosfato de cálcio [Graham e Van Der Eb, Virology, 52: 456-467, 1973; Chen e Okayama, Mol. Cell Biol., 7: 2745-2752, (1987); Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10: 689-695, (1990)], DEAE-dextrano [Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190, (1985)], eletroporação [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718, (1986); Potter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81: 7161-7165, (1984)], microinjeção direta [Harland e Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-1099, (1985)], lipossomas carreagados em DNA [Nicolau e Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190, (1982); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352, (1979); Felgner, Sci Am., 276(6): 102-6, (1997); Felgner, Hum Gene Ther., 7(15): 1791-3, (1996)], sonicação celular [Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8463-8467, (1987)], bombardeamento de gene usando microprojéteis de alta velocidade [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, (1990)], e transfecção mediada por receptor [Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, (1987); Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892, (1988); Wu and Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12: 159-167, (1993)].
[0092] O vetor de expressão (ou o mini-gama sarcoglicano aqui discutido) pode ser aprisionado em um lipossoma.
[0093] Em algumas modalidades, a transferência de expressão de constructo de DNA nu em células é conseguida usando bombardeamento de partículas, que depende da capacidade de acelerar microprojéteis revestidos de DNA a uma velocidade elevada permitindo que estes perfurem membranas celulares e entrem em células sem as matar [Klein et al., Nature, 327: 70-73, (1987)]. Vários dispositivos para acelerar partículas pequenas têm sido desenvolvidos. Um desses dispositivos depende de uma descarga de alta voltagem para gerar uma corrente eléctrica, que por sua vez proporciona a força motriz [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87: 9568-9572, (1990)]. Os microprojéteis utilizados consistiram em substâncias biologicamente inertes, como esferas de tungstênio ou ouro.
[0094] Em modalidades que empregam um vetor viral, os polinucleotídeos preferidos incluem ainda um promotor adequado e uma sequência de poliadenilação, como descrito acima. Além disso, será prontamente aparente que, nestas modalidades, o polinucleotídeo compreende ainda sequências polinucleotídicas de vetor (por exemplo, sequências polinucleotídicas adenovirais) operacionalmente ligadas à sequência que codifica um polipeptídeo da revelação.
[0095] A invenção proporciona ainda uma célula que compreende o polinucleotídeo ou o vetor, por exemplo, a célula é transformada ou transfectada com um polinucleotídeo que codifica para um mini-gama sarcoglicano da divulgação ou a célula é transformada ou transfectada com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica para o mini-gama sarcoglicano.
[0096] Os polinucleotídeos da divulgação podem ser introduzidos na célula hospedeira como parte de um plasmídeo circular, ou como DNA linear que compreende uma região de codificação de proteína isolado ou um vetor viral. Métodos para introdução de DNA na célula hospedeira, que são bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica, incluem transformação, transfecção, eletroporação, injeção nuclear ou fusão com veículos como lipossomas, micelas, as células fantasma, e protoplastos. Como indicado acima, essas células hospedeiras são úteis para amplificação dos polinucleotídeos e também para expressar os polipeptídeos da invenção codificados pelo polinucleotídeo. A célula hospedeira pode ser isolada e/ou purificada. A célula hospedeira também pode ser uma célula transformada in vivo para causar a expressão transitória ou permanente do polipeptídeo in vivo. A célula hospedeira pode também ser uma célula isolada transformada ex vivo e pós-transformação introduzida, por exemplo, para produzir o polipeptídeo in vivo para fins terapêuticos.
Kits
[0097] A invenção também proporciona kits para o tratamento de um paciente com uma doença genética, como LGMD2C. Em um aspecto, o kit compreende um polinucleotídeo antissenso, como aqui revelado, opcionalmente em um recipiente, e um folheto informativo, o rótulo da embalagem, ou outras instruções de rotulagem.
[0098] Em outra modalidade, um kit é fornecido que compreende um polinucleotídeo adicional, em que o polinucleotídeo adicional hibridiza especificamente com um éxon de um RNA de gama sarcoglicano.
[0099] Os especialistas na técnica apreciarão que as aplicações do método acima tem ampla aplicação para a identificação de moléculas antissenso adequadas para utilização no tratamento de muitas outras doenças.
EXEMPLOS Exemplo 1 Eficiência de resgate de Y-sarcoglicano de mamíferos de comprimento completo e mini-Sgcg em moscas nulas de sarcoglicano.
[00100] Os sarcoglicano são conservados entre Drosophila e mamíferos.Moscas nulas em Y-sarcoglicano desenvolvem sintomas semelhantes aos mamíferos. Moscas transgênicas que expressam Y- sarcoglicano murino de comprimento completo e mini-Sgcg, foram geradas e verificou-se que as proteínas de mini-Sgcg se localiza corretamente na membrana plasmática de células musculares da mosca.
[00101] Mocas nulas em Y/δ-sarcoglicano (Sgcd840) foram previamente geradas e caracterizadas[Allikian et al., Hum Mol Genet 16: 2933-2943 (2007)]. Utilizando PCR e Southern blot, demonstrou-se que os éxons 1 a 3 e éxon parcial 4 dos 6 éxons no gene de Drosophila Sgcd é eliminado em moscas Sgcd840.
[00102] Para determinar se mini-Sgcg retém a função da proteína de comprimento completo, o sistema UAS-GAL4 foi utilizado [Brand et al., Development. 118: 401-15 (1993)] para expressar duas construções diferentes de sarcoglicano. GAL4 é um fator de transcrição que reconhece uma sequência potencializadora específica chamado UAS.
[00103] O primeiro constructo expressa a sequência codificadora completa do gene Sgcg de murino do éxon 2 a éxon 8, referida como UAS- Sgcg. O segundo constructo compreende a sequência de um marcador de epítopo Xpress e éxon 2, éxon 3 e o éxon 8 do gene Sgcg murino apenas, referido como UAS-mini-Sgcg (Figura 1). O constructo mais curta retém a sequência codificadora de um domínio, domínio intracelular intacto transmembranar e parte do domínio extracelular incluindo o terminal carboxi essencial (Figura 2). Uma comparação entre as construções utilizadas em Drosophila e camundongo está ilustrada na Figura 3. Uma linhagem transgênica UAS-Sgcg e uma UAS-mini-Sgcg foram geradas em fundos genéticos correspondentes. Um estoque Mef2-GAL4 foi também obtido. Mef2 é um direcionador específico do músculo que promove a expressão GAL4 em ambos tecido muscular do coração e esquelético. Moscas que transportam ambos Mef2-GAL4 e UAS-Sgcg ou UAS-mini-Sgcg produzem proteína Sgcg ou mini-Sgcg especificamente no tubo cardíaco e no tecido muscular. Para expressar mini-Sgcg e de comprimento completo em moscas mutantes, Sgcd840, Mef2-GAL4 de fêmeas virgens foram cruzados a UAS- Sgcg/+ ou UAS-mini-Sgcg/+ de moscas machos. Uma vez que o gene Sgcd está localizado no cromossomo X, toda a descendência masculina de cada cruzamento foi nula para Sgcd, com metade transportando ambos GAL4 e transgenes UAS. A outra metade serviu como um controle negativo interno. Esta comparação minimiza os efeitos do ambiente e fundos genéticos nos ensaios de comportamento. Moscas do tipo selvagem com a mesma faixa etária e fundo genético serviram como o controle positivo.
[00104] Os dados demonstraram que mini-Sgcg tem localização distinta membrana plasmática Sgcd840 tubos cardíacos de mosca (Figure 4) e no músculo corporal (Figura 5). Este padrão é semelhante a Sgcg de comprimento completo (Figura 5). Estudos no músculo humanos, camundongos, e sistemas de expressão de células sugerem que a montagem de complexo sarcoglicano é necessária para reciprocidade de Y-sarcoglicano para a membrana plasmática [Allikian et al., Traffic 8: 177-83 (2007); Chen et al., Exp Cell Res. 312: 1610-25 (2006); Crosbie et al., Hum Mol Genet. 9:2019-27 (2000)]. Assim, a localização subcelular correta de ambas as proteínas implica a interação com subunidades de sarcoglicano de mosca, com destaque para a conservação entre Y-sarcoglicano de murino e de mosca. Mais importante, os resultados indicaram que a proteína mini-Sgcg retém a função de interagir com outros componentes do complexo distrofina.
[00105] Estrutura muscular esquelética e função em moscas transgenicamente resgatados.
[00106] Os pacientes com LGMD2C apresentam histologia muscular distinta dos indivíduos saudáveis, incluindo a perda de fibras musculares maduras, deposição anormal de fibrose ou tecido adiposo e infiltração de células imunes [Dubowitz, Muscle disorders in childhood. Saunders, Philadelphia. xiii, 282 (1978)]. Moscas Sgcd840 mostram aumento de descolamento do músculo de voo do exoesqueleto, e este achado é mais proeminente se moscas são deixadas exercer [Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Para incentivar o uso do músculo, as moscas são mantidas em uma caixa de 20x20x20 cm, em vez de frascos padrão para que possam voar à vontade. Moscas são envelhecidas até 28 dias antes da coleta para exame histológico. Especificamente, os tórax são coletados, seccionados e manchados com hematoxilina e eosina (H & E), usando o protocolo de fixação Carnoy. A frequência de fratura muscular do voo entre moscas mutantes, moscas resgatadas e moscas do tipo selvagem são então comparadas.
[00107] Semelhante a pacientes humanos, moscas Sgcd840 desenvolvem a capacidade locomotiva prejudicada ao longo do tempo [Allikian et al., Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007)]. Defeitos de motilidade são medidos utilizando um ensaio de geotaxia negativa. Diferente da maioria dos aparelhos para medição de volume, um aparelho mais “individualizado” foi projetado que pode fornecer a medição da capacidade de andar de uma mosca individual tão preciso quanto 0,5 centímetro [Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. O aparelho é composto por 16 tubos de plástico verticais, que são 13 centímetros de comprimento, com réguas de cada lado. Resumidamente, uma mosca individual é colocada em cada tubo após anestesia, deixada recuperar durante 30 minutos e, em seguida, testada. Para a caminhada de teste, as moscas são, então, batidas para o fundo e deixas subir para 5 segundos. A distância que cada mosca viaja no final dos 5 segundos é marcada. Seis ensaios com um intervalo de 1 minuto são executados. A análise de variância (ANOVA) com um teste de Tukey pós é empregado para análise de dados em software PRISM.
Avaliar resgate da função cardíaca usando tomografia de coerência óptica (OCT)
[00108] Os pacientes com distrofia muscular desenvolvem cardiomiopatia dilatada, devido ao comprometimento da contratilidade de células musculares cardíacas. Moscas Sgcd840também mostram disfunção cardíaca à medida que envelhecem, indicado pelo tubo de coração aumentado e fração reduzida encurtada [Allikian et al., Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007); Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. A função cardíaca de moscas é examinada por OCT [Wolf et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 1394-9 (2006)]. OCT serve como a contrapartida da mosca ao ecocardiograma (ECHO) usado com mamíferos. A principal diferença entre OCT e ECHO é que as medidas OCT retrodifundem luz em vez de som. OCT determina o diâmetro sistólico final (ESD), diâmetro diastólico final (EDD), fração de encurtamento (FS) e frequência cardíaca. Vinte a quarenta moscas de cada genótipo foram testadas a 7-10 dias de idade. Os dados mostraram que a expressão mini-Sgcg reduziram a dilatação do tubo cardíaco anormal em moscas Sgcd840 (Figura 6), indicando que mini-Sgcg era funcional. Moscas serão avaliadas em idades mais avançadas, quando a cardiomiopatia é mais prevalente. Mais importante, os resultados serão comparados com moscas transgênicas que expressam Y-sarcoglicano murino de comprimento completo para determinar se o grau de correção é semelhante entre o mini- Sgcg e o Sgcg de comprimento completo.
[00109] Espera-se que a expressão de mini-Sgcg ou Sgcg de comprimento completo levará ao resgate da progressão da doença em moscas mutantes. Especificamente, espera-se menos rompimento do músculo, melhoria da capacidade de andar e a função do coração restaurada serão observados em moscas mutantes com mini-Sgcg ou Sgcg. É possível que os procedimentos de preparação do tecido muscular possam interferir com a identificação de rompimentos musculares. A lesão muscular induz sinalizaçãoTGFe em torno dos sítios de lesões, que podem ser visualizados através da atividade dad-lacZ repórter [Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. O constructo dad-lacZ repórter é esperada para fornecer uma melhor visualização do rompimento do músculo [Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20: 894-904 (2011)]. Se o ensaio de caminhar não é sensível o suficiente para detectar as melhorias introduzidas por expressão de mini-Sgcg, um ensaio de mobilidade alternativo que permite a análise de um maior número de moscas de uma vez será realizado [Shcherbata et al., EMBO J 26: 481-93 (2007)]. Moscas mutantes têm reduzido tempo de vida [Allikian et al., Hum Mol Genet 16: 2933-43 (2007)]. Assim, o tempo de vida de moscas resgatadas com mini-Sgcg é determinado, proporcionando evidência adicional dos benefícios da expressão de mini-Sgcg, e o aumento do tempo de vida será quantificado. Os dados mostram que a expressão de mini-Sgcg melhorou significativamente a função cardíaca em moscasSgcd840, que conduz à expectativa de que mini-Sgcg ou Sgcg de comprimento completo irá produzir efeitos benéficos na prevenção ou tratamento da doença distrófica como LGMD (por exemplo, LGMD2C). Como comparação, as moscas que expressam Drosophila Sgcd também foram geradas para fins de comparação.
Exemplo 2 Mini-Sgcg pode substituirSgcg de comprimento completo no modelo de camundongo mutante de Y-sarcoglicano
[00110] Ao caracterizar a correção do fenótipo mutante, em um modelo estabelecido de camundongo, uma previsão mais exata do efeito da substituição de Y-sarcoglicano de comprimento completo com o Y- sarcoglicano truncado em pacientes humanos pode ser determinada.
Camundongos transgênicos expressando mini-Sgcg no músculo utilizando o promotor da desmina humana com a sequência de codificação de mini-Sgcg
[00111] Para testar a função de mini-Sgcg em camundongos, camundongos transgênicos que expressam mini-Sgcg murino foram gerados utilizando o promotor da desmina, que expressa em ambas as células musculares e cardíacas [Pacak et al., Genet Vaccines Ther 6: 13 (2008)]. Y- sarcoglicano é necessário para o funcionamento adequado de ambos coração e músculo esquelético [Zhu et al., FASEB J 16: 1096-1098 (2002)]. Para avaliar a eficiência de resgate de subdomínios de Y-sarcoglicano em ambos os tecidos musculares, o promotor humano da desmina é usado. A desmina é um filamento intermediário que é expresso em todo o tecido muscular, incluindo músculo de coração e esquelético [Su et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 6062-6067 (2004)]. Além de ser específico de tecido, o gene da desmina também torna-se ativado durante diferenciação muscular em torno do mesmo tempo que os sarcoglicano [Li et al., J Cell Biol 124: 827-841 (1994); Noguchi et al., Eur J Biochem 267: 640-648 (2000)]. Nível de expressão desmina permanece baixo em mioblastos em divisão e atinge um nível persistentemente elevado em miofibras terminalmente diferenciadas. Sequências mínimas da região reguladora do gene da desmina humano foram clonadas e demonstraram promover a expressão do gene alvo em nível alto especificamente em ambos músculo do coração e esquelético [Pacak et al., Genet Vaccines Ther 6: 13 (2008)].
[00112] Usando um constructo CMV-mini-Sgcg em um vetor pcDNA™ 3.0 (Invitrogen), o promotor de CMV foi substituído pelo promotor de desmina. Um tag de epítopo Xpress foi inserido na extremidade N-terminal de mini-Sgcg. O constructo de desmina-mini-Sgcg purificada (ver Figura 3B) foi injetada, e um dos fundadores machos transgene-positivo (Figura 7) foi gerado. O fundador do sexo masculino está sendo criado para camundongosSgcg-/-. Injeções de transgene continuaram e cinco linhagens de fundadoras adicionais foram geradas. Para testar a função do promotor da desmina, células C2C12 (uma linhagem de células cultivadas do músculo) foram transfectadas com o constructo de desmina-mini-Sgcg, e verificou-se que mini-Sgcg foi produzido em miotubos diferenciadas (Figura 8).
Nível de expressão e localização subcelular de mini-Sgcg usando o marcador de epítopo
[00113] A sobre- expressão de Y—sarcoglicano demonstrou provocar a distrofia muscular grave em camundongos de tipo selvagem quando os níveis de expressão são cerca de 20 vezes em relação aos níveis normais [Zhu et al., FASEB J 16: 1096-8 (2002)]. Este resultado deveu-se provavelmente à formação de agregados citoplasmáticos de proteínas anormais que interferem com a montagem do complexo sarcoglicano e da membrana alvo. O número de cópias da linhagem transgene única gerada atualmente parece baixo, de modo que os problemas resultantes da superexpressão não são antecipados. Músculo de camundongos transgênicos desmina-mini-Sgcg são examinados para a localização da membrana normal usando o marcador Xpress. Os experimentos foram conduzidos com esta mesmo constructo em células C2C12, uma linhagem de células de músculo. Nestas células, mini-Sgcg mostrou localização semelhante à proteína endógena Y-sarcoglicano.
[00114] Para determinar ainda mais o nível de produção de mini-Sgcg, ambos tecido muscular de coração e esquelético de várias linhagens transgênicas são coletados e tratados para experimentos immunoblotting. O marcador de epítopo Xpress permite que proteína mini-Sgcg seja facilmente detectada no imunoblotting, através da utilização de um anticorpo contra Xpress. Y-sarcoglicano de comprimento completo é detectada através de anticorpo NCL-g-sarc (Novocastra). Uma vez que este anticorpo monoclonal é dirigido contra um peptídeo de 12 aminoácidos dentro do éxon 6, apenas proteína de comprimento completo mas não mini-Sgcg será detectada. Os anticorpos policlonais foram também gerados irão reconhecer ambos mini- Sgcg e de comprimento completo. Após geração de linhagens transgênicas adicionais, uma linhagem que é escolhida mostra um nível de expressão perto do tipo selvagem.
Resgate de Y-sarcoglicano mutantes por cruzamento com o transgene em camundongos Sgcg-/-
[00115] Para determinar se mini-Sgcg pode substituir Sgcg de comprimento completo em mamíferos, mini-Sgcg camundongos Tg+(positivo transgene) são criados para camundongos Sgcg-/- para determinar se disfunção de músculo do coração em Sgcg-/- pode ser resgatado. Para impedir a dispersão fenotípica, camundongos Sgcg-/- são mantidos como heterozigotos para reduzir a seleção de modificadores desenvolvidos espontaneamente. Para introduzir o transgene mini-Sgcg em camundongos Sgcg-/- , Sgcg-/+ são criados para camundongos mini-Sgcg Tg+. Os machos Tg+Sgcg-/+ F1 são criados para fêmeas. Em F2, camundongos Tg+Sgcg-/- são produzidos. Entre os companheiros de ninhada, os camundongos tipo selvagem Tg+são usados como controles positivos enquanto camundongos Tg-Sgcg-/- são usados como controles negativos. Para medir se mini-Sgcg pode melhoerar a função muscular comprometida em camundongos Sgcg-/-, os seguintes aspectos são comparados entreo coortes: localização subcelular de proteínas sarcoglicano, interação direta entre mini-Sgcg e outros carcoglicanos, permeabilidade de membrana plasmática de células musculares, deposição de tecido fibrótico (fibrose) e função de músculo esquelético e função cardíaca. Histopatologia é avaliada a partir de camundongo transgene-resgatados para comparar a camundongos Sgcg-/- e tipo selvagem. Os músculos são avaliados para a variação no tamanho da fibra, nucleação central e substituição por fibrose e gordura. Camundongos Sgcg-/- e transgênicos são todos no fundo C57Bl6/J.
Localização subcelular
[00116] Em células do coração e musculares sem Y-sarcoglicano, α-, β- , e δ- sarcoglicanos são também grandemente reduzidos da membrana muscular, enquanto os níveis de mRNA permanecem normais, indicando que a presença de Y-sarcoglicano é necessária para a estabilidade de localização da membrana de outros sarcoglicanos no complexo [Hack et al., J Cell Sci. 113(14): 2535-44 (2000)]. Para testar se a proteína mini-Sgcg pode restaurar a localização adequada dos outros sarcoglicanos na ausência de Y-sarcoglicano de comprimento completo, secções de tecido músculo congelado de animais Tg+Sgcg-/- são avaliadas e microscopia de imunofluorescência é realizada usando anticorpos contra α-, β-, e δ-sarcoglicano, respectivamente. Todos os anticorpos estão disponíveis comercialmente ou são aqueles que foram gerados previamente.
Interação
[00117] Nas células musculares do tipo selvagem, α-, β-, Y- e δ- sarcoglicanos formam um complexo justo que se localiza na membrana plasmática, Y-sarcoglicano pode ser co-imunoprecipitado (co-IP) com β- sarcoglicano a partir de tecido muscular [Hack et al., J Cell Sci. 113(14): 2535-44 (2000)]. Para examinar se mini-Sgcg também pode interagir com β- sarcoglicano, co-IP é realizada em preparações de proteínas coletadas de camundongos Tg+Sgcg-/-. O músculo é fracionado para isolar as membranas a partir dos componentes miofibrilares. Estas preparações microssomais são realizadas no músculo inteiro e apenas a fração microssomal é utilizada na coIP.
Permeabilidade da membrana
[00118] Em animaisSgcg-/-, a membrana plasmática de músculo é enfraquecida e torna-se mais permeável para grandes moléculas de proteínas. Corante Evans Blue (EBD) é uma pequena molécula de corante que se liga fortemente à albumina e mede a permeabilidade do sarcolema [Matsuda et al., J Biochem 118: 959-64 (1995)]. Os camundongos são injetados com EBD e sacrificados 40 horas após a injeção. EBD é medido por incubação de tecidos em 1 mililitro de formamida a 55°C durante 2,5 horas e a determinação da absorbância da eluição resultante a 620 nm. O nível de creatina quinase (CK) sérica também é medido usando o kit EnzyChrom™ Creatine Kinase Assay (BioAssay Systems).
Fibrose
[00119] O colágeno é o componente principal do tecido fibroso excessivo. Para quantificar a deposição de colágeno, ensaios de hidroxiprolina (HOP) são realizados para quantificar o conteúdo de colágeno. A hidroxiprolina é um aminoácido modificado que compreende uma porção maior de colágeno. Tecidos musculares do coração são coletados e ensaios HOP são realizados de acordo com os métodos descritos [Heydemann et al., Neuromuscul Disord 15: 601-9 (2005)], aqui incorporados por referência. Função cardíaca
[00120] A disfunção cardíaca é a principal causa direta de incapacidade e morte em pacientes com distrofia muscular. Camundongos sem y- sarcoglicanos também desenvolvem cardiomiopatia dilatada. Para investigar a função do coração, o ecocardiograma (ECHO) é realizado para medir a dimensão diastólica final (EDD), dimensão sistólica final (ESD) e fração de encurtamento (FS).
Análise de camundongos
[00121] Os camundongos são analisados em 12 e 24 semanas de idade, uma vez que nestes momentos apresentam ambas doença muscular e cardíaca. Os números usados irão refletir os estudos fisiológicos sendo conduzidos e tipicamente requerem coortes de entre 5 e 10 para mostrar a significância (teste t). Animais adicionais também são utilizados para proporcionar uma fonte de tecido para microscopia e Western blotting.
Figure img0004
[00122] Os camundongos estão sendo usados porque eles fornecem um bom modelo de doença de músculo e cardíaca que reflete o que é visto em humanos com mutações genéticas semelhantes. Mais de 500 camundongos deste genótipo (Sgcg) foram examinados e foram estabelecidos métodos quantitativos de fenotipagem [Heydemann et al., Neuromuscul Disord 15(910): 601-9 (2005); Heydemann et al., J. Clin. Invest 119(12): 3703-12 (2009); Swaggart et al., Physiol Genomics 43(1): 24-31 (2011)]. Dada a diferença de fenótipo esperado a partir dos estudos em Drosophila, prevê-se que as coortes de 5-10 camundongos serão suficientes.
Resultados esperados
[00123] Várias linhagens de camundongos albergando transgenes des- mini-Sgcg que expressam proteínas mini-Sgcg em diferentes níveis no tecido muscular são esperadas, com algumas linhagens em níveis de Y-sarcoglicano quase endógenos. Espera-se que mini-Sgcg seja indetectável em outros tecidos. Espera-se também que a proteína mini-Sgcg seja enriquecida na membrana plasmática em camundongos do tipo selvagem. É possível que alguma coloração citoplasmática ou perinuclear de mini-Sgcg é observada, pois a presença de Sgcg de comprimento completo pode competir com mini- Sgcg> para inclusão no complexo sarcoglicano. Mais coloração da membrana plasmática distinta de mini-Sgcg em Sgcg-/- é esperada. Um padrão semelhante de expressão foi observado em estudos em Drosophila. Em músculo Tg+Sgcg-/-, espera-se que a expressão de mini-Sgcg restaurará a localização da membrana de outros sarcoglicano. Mini-Sgcg Mini-Sgcg também é esperado para estar presente entre as proteínas associadas com, e puxada para baixo por, β sarcoglican. Melhoria da histopatologia, redução na captação de EBD, diminuição do nível de CK, menos HOP e melhora da função cardíaca são esperados em Tg+Sgcg-/- comparado a ninhada Tg-Sgcg-/- sem o transgene. Estes todos representariam uma melhoria em doenças do músculo e coração, estabelecendo que mini-Sgcg resgata a mutação Sgcg, como esperado.
[00124] Com base nos estudos de Drosophila aqui descritos, mini-Sgcg deverá ter muitas das funções de Sgcg. Os camundongos transgênicos também permitirão a investigação da interação com outros componentes importantes do complexo distrofina, como distrofina, sarcospano e as interações com outros componentes transmembranares.
[00125] Para o salto de éxon, fibroblastos foram obtidas de pacientes LGMD2C humanos. Uma abordagem expressão forçada MyoD, descrita abaixo, é utilizada para induzir essas células em uma linhagem miogênica [Kimura et al., Hum Mol Genet 17: 2507-17 (2008)]. Essas células irão proporcionar um ambiente baseado em células nas quais testar salto de éxonSgcg.
Exemplo 3 Salto de éxon em cultura de músculo derivada de doentes humanos
[00126] A justificativa para os experimentos descritos abaixo é que o salto de éxon requer otimização de polinucleotídeos antissenso e prova de função in vitro.
Usar transformação MyoD para induzir fibroblastos humanos primários para se tornarem mioblastos
[00127] Os fibroblastos isolados a partir de dois pacientes LGMD2C que transportam uma deleção do éxon 6 no gene Sgcg foram obtidos. MyoD é um regulador mestre do programa de diferenciação muscular. A expressão forçada de MyoD em fibroblastos pode converter os fibroblastos para uma linhagem muscular [Lattanzi et al., J Clin Invest 101: 2119-2128 (1998)].
[00128] MyoD é um iniciador chave do programa de diferenciação do músculo esquelético [Weintraub et al., Science 251: 761-766 (1991)]. MyoD é responsável por ativar outros reguladores musculares essenciais, como fator- 2 estimulador de miócitos (MEF2) e miogenina. Tem sido demonstrado que a expressão forçada de MyoD em fibroblastos é capaz de converter os fibroblastos para mioblastos ambos in vitro e in vivo [Kimura et al., Hum Mol Genet 17: 2507-2517 (2008)]. Portanto, a introdução de MyoD em fibroblastos é suficiente para converter um fibroblasto até uma linhagem de mioblastos. Uma vez estabelecido, os mioblastos, nas condições adequadas podem ser induzidos para diferenciar ainda mais em miotubos. Este processo é aplicado para fibroblastos humanos e “fibroblastos forçados por MyoD” são úteis para o diagnóstico da doença do músculo humano. Mioblastos derivados de pacientes humanos que ostentam a mutação Y-sarcoglicano aqui descrita são necessários a fim de testar a eficiência de salto de éxon induzida por diferentes AONs potenciais. Utilização de fibroblastos dérmicos a partir de pacientes LGMD2C evita a necessidade de biópsias musculares dolorosas necessárias para obter mioblastos.
[00129] Kimura et al. fizeram um constructo de MyoD induzível por tamoxifeno e inseriram o gene MyoD em genomas de fibroblastos via vetor lentivírus. Eles encontraram que os fibroblastos transfectados foram capazes de formar miotubos ambos in vivo e in vitro após a administração de tamoxifeno. O vetor MyoD é utilizado para transfectar os fibroblastos obtidos a partir dos pacientes LGMD2C. Os fibroblastos transfectados são expandidos sem indução de tamoxifeno e congelados em pequenas alíquotas para uso futuro. Fibroblastos forçados por MyoD tratados com os polinucleotídeos antissenso induzem o salto de éxon dos éxons 4-7 de Sgcg
[00130] Para direcionar éxons específicos, polinucleotídeos antissenso (AONs) são projetados para bloquear o doador junção, aceitador junção ou sítios exônicos potencializadores de junção (ESE). Sítios doadores e aceitadores de junção se localizam nos limites éxon-íntron e têm sequências altamente conservadas. Com base na sequência de nucleotídeos e estrutura secundária de transcrições de RNA, os sítios ESE estão previstos em alta precisão por software como ESEfinder, que prevê sítios de ligação para as quatro proteínas mais abundantes ricas em serina/arginina envolvidas na regulação do junção (proteínas SR). Uma série de AONs foi concebida com base na previsão de programas de software disponíveis. A eficiência e especificidade dos diferentes AONs em miotubos convertidos a partir de fibroblastos do paciente é então examinada, seguindo um protocolo que foi usado para testar a eficácia no salto de éxon em miotubos humanos primários [Aartsma-Rus et al., Hum Mol Genet 12: 907-914 (2003)]. Especificamente, os fibroblastos são tratados com tamoxifeno durante 24 horas para induzir a expressão de MyoD antes de trocar os fibroblastos para meio de diferenciação para a indução de formação de miotubos. Após 7-14 dias de privação de soro, os miotubos são transfectadas com AON usando polietilenimina (PEI) durante 3 horas em meio com baixo teor de soro. Ao fim de 24 horas após a transfecção, o RNA total é extraído a partir das culturas de miotubos. A razão entre o transcrito de RNAm mais curto composto por apenas éxon 1,2,3 e 8 para os transcritos de comprimento completo é quantificada através da realização da reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT- PCR). O produto de PCR é fracionado em um gel de agarose e a proporção de produtos longos/curtos é calculada utilizando o software Photoshop. Os AONs com mais alta eficiência de salto de éxon são selecionados. Uso de microscopia de imunofluorescência (IF) para testar se o carboxi- terminal de Y-sarcoglicano está presente após o tratamento antissenso, e se outros sarcoglicano são estabilizados usando esta abordagem
[00131] As mutações por desvio de região no gene Sgcg em pacientes resultam em uma proteína prematuramente terminada sem um C-terminal. Estudos anteriores também demonstraram que o produto de proteína do gene Sgcg com uma mutação 525ΔT não foi detectado por um anticorpo policlonal de coelho criado contra a proteína Sgcg de comprimento completo [McNally et al., Am J Hum Genet 59: 1040-1047 (1996)]. Este resultado sugeriu que o gene mutante Sgcg não foi capaz de produzir um produto de proteína estável. Isto também é provável que seja o caso nos pacientes LGMD2C dos quais foram obtidos os fibroblastos.
[00132] Restauração dos resultados de região de leitura na tradução de uma proteína truncada internamente com um C-terminal normal. Para visualizar a produção de proteína induzida por AON, microscopia IF foi realizada usando o anticorpo policlonal contra a proteína Y-sarcoglicano de comprimento completo em miotubos com e sem tratamento com AON. Ao utilizar IF, também pode ser determinado se a proteína menor Y-sarcoglicano se localiza na membrana. IF também é realizado para detectar outros sarcoglicano(por exemplo, α-, β- e δ-sarcoglicano) e avaliar se eles foram restaurados para a membrana em camundongos Tg+Sgcg-/-.
Resultados esperados
[00133] Espera-se que os fibroblastos sejam convertidos em células de mioblastos semelhantes que são capazes de formar miotubos após administração de tamoxifeno. Alternativamente, mioblastos são obtidos a partir de pacientes humanos. Espera-se que vários tratamentos de AON converterão uma fração substancial de transcrito Sgcg de comprimento completo à proteína truncada internamenteo menor. Espera-se que nenhuma coloração de Sgcg seja detectada pelo anticorpo policlonal em miotubos do paciente sem tratamento com AON, enquanto a proteína Y-sarcoglicano truncada internamente está prevista para ser localizada na membrana de uma percentagem substancial de miotubos tratados. Além disso, espera-se que outros componentes do complexo distrofina sejam restaurados na membrana plasmática dos miotubos que mostram a coloração de membrana Y- sarcoglicano positiva. No caso em que o anticorpo policlonal é capaz de detectar produto residual do gene 525ΔT Sgcg, um anticorpo contra o C- terminal da proteína Y-sarcoglicano é levantada para detectar especificamente a proteína Y-sarcoglicano truncada.
Exemplo 4 Comportamento de caminhada em moscas nulas Sgcd
[00134] Este experimento foi concebido para testar se a perda de Sgcd em Drosophila afeta negativamente a sua atividade de caminhada.
[00135] Um monitor concebido para testar a atividade de caminhada (Trikinetics, Waltham, MA) foi utilizado para gravar o movimento, medido como quebras de feixes infravermelhos, ao longo de um período de 24 horas em Drosophila individuais. Normalmente Drosophila exibem um pico acentuado na atividade ao amanhecer e entardecer, independentemente do genótipo. Os dados são mostrados na Figura 9. Para avaliar a atividade basal, os dados foram analisados a partir da meia-noite até 8 AM, encaixotados como a região de interesse no painel da esquerda da Figura 9. Moscas tipo selvagem têm significativamente mais atividade, medida como quebras de feixes infravermelhos, do que moscas Sgcd840 que carecem de Y-sarcoglicano e servem de modelo para a distrofia muscular de cíngulo dos membros tipo 2C. Este declínio da atividade reflete o que é visto em pacientes com distrofia muscular que mostram deambulação reduzida devido à fraqueza muscular.
Expressão de mini-Sgcg em moscas Sgcd840 melhorou significativamente atividade noturna
[00136] A Figura 10 mostra que a expressão de mini-Sgcg em moscas Sgcd840 melhorou significativamente a atividade noturna de Drosophila mutante, medida como quebras de feixes infravermelhos (comparar Sgcd840 vs Scgd840, mini-Sgcg no painel da esquerda). Estes dados indicam que mini- Sgcg pode funcionar no lugar de Y/δ-sarcoglicano de comprimento completo que é eliminado em moscas Sgcd840. O painel do lado direito mostra que a atividade noturna foi igualmente resgatada por Sgcg, que é a proteína de Y- sarcoglicano de comprimento completo de camundongo, e mini-Sgcg (Sgcg840,Sgcg comparado a Sgcd840, mini-Sgcg). Estes dados indicam que mini-Sgcg é tão funcional quanto Sgcg de comprimento completo para restaurar a atividade de caminhada.
Exemplo 5 Proteína mini-Sgcgé produzida de forma estável em músculo esquelético e de coração de mamíferos
[00137] Um transgene, utilizando o promotor da desmina para conduzir a expressão de Mini-Sgcg foi introduzido em camundongos normais de tipo selvagem (Tg+). Os dados são apresentados na Figura 11. Isolamento de músculo esquelético (quadríceps) e imunoblotting foi realizado como descrito em Hack et al. [J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. Proteína mini-Sgcgé robustamente detectada no músculo esquelético e cardíaco no peso molecular esperado de 18 kDa (Figura 11, setas). Não é detectada em outros tipos de células como fígado, baço e rim. Este padrão de expressão reflete o promotor da desmina, que dirige a expressão apenas no coração e músculo. Mini-Sgcg não é detectado em camundongos tipo selvagem, não transgênicos (Tg-) (ver Figura 11). O epítopo Xpress (invitrogen) foi colocado no Mini-Sgcg, e um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade criado para o epítopo Xpress foi utilizado a uma diluição de 1: 1000 para detectar a expressão do transgene. Estes dados demonstram que a proteína mini-Sgcgé estável no músculo e coração de mamíferos, e além disso, que a proteína é capaz de se translocar corretamente à membrana muscular.
Caracterização de camundongos transgênicos
[00138] Duas linhagens transgênicas diferentes foram estabelecidas expressando mini-Sgcg. Os animais transgênicos foram criados utilizando protocolos padrão. Como representado na Figura 12, linhagem 50 expressa em níveis mais elevados do que a linhagem 84. O painel superior da Figura 12 mostra a expressão de três concentrações diferentes de linhagem 50 ou linhagem 84. Estes dados demonstram que mini-Sgcgé uma proteína estável em músculo esquelético e músculo cardíaco. Um anticorpo para a proteína Y- sarcoglicano endógena foi usado para demonstrar a expressão da proteína Sgcg (comprimento completo) nestas mesmas amostras. Um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade anti-Xpress foi gerado em Pocono Rabbit Farms. Foi utilizado a uma diluição de 1: 1000 para detectar a imunoblotting mini-Sgcg(Figura 12, painéis superiores). O anticorpo para y- sarcoglicano foi previamente descrito [McNally et al., Hum Mol Genet. 5: 1841-7 (1996)] e foi utilizado para detectar Y-sarcoglicano endógeno a 1: 1000.
Proteína mini-Sgcg se localiza na membrana plasmática de músculo esquelético
[00139] A Figura 13 mostra que a proteína mini-Sgcg se localiza na membrana plasmática de músculo esquelético, quando expressa em camundongos normais de tipo selvagem (Tg+). Um anticorpo anti-Xpress foi usado para detectar a expressão da periferia de cada fibra muscular consistente com a localização na membrana plasmática, ou sarcolema, do músculo esquelético. Este padrão intracelular é idêntico à proteína Y- sarcoglicano normal (Sgcg), e indica que mini-Sgcg se transloca adequadamente. Este mesmo sinal não foi detectado em músculo transgênico negativo (Tg-) (Figura 13, painel da direita) demonstrando que este sinal deriva do transgene. A imunocoloração foi realizada como descrito em Hack et al. [J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. O anticorpo policlonal purificado por afinidade para o epítopo Xpress foi utilizado a 1: 200.
Expressão da proteína Y-sarcoglicano endógena de comprimento completo é diminuída na membrana plasmática quando mini-Sgcg está presente
[00140] A Figura 14 mostra os resultados de um experimento concebido para testar se a proteína mini-Sgcg pode competir com a proteína Y- sarcoglicano endógena in vivo. Note que a intensidade do sinal para o Sgcg de comprimento completo é reduzida no painel da esquerda da Figura 14, em comparação com o painel da direita. Estes dados demonstram que mini-Sgcg compete com Sgcg normal endógena e, portanto, mini-Sgcg pode substituir Sgcg de comprimento completo. A imunocoloração foi realizada como descrito em Hack et al. [J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. O anticorpo anti—Y— sarcoglicano- policlonal foi utilizado a 1: 200.
[00141] A Figura 15 ilustra um modelo para a montagem de sarcoglicano. Literatura descreve a montagem do complexo sarcoglicano [Chan et al., J Cell Biol. 143: 2033—44 (1998); Chen et al., Exp Cell Res. 312: 1610—25 (2006); Hack et al., J Cell Sci. 113: 2535—44 (2000)]. No músculo de mamífero, onde existem quatro subunidades de sarcoglicano, α—, β—, Y—, e δ— sarcoglicano, as subunidades β—sarcoglicano e δ—sarcoglicano se montam primeiro como uma unidade no retículo endoplasmático (ER)/complexo de Golgi. Esta etapa é seguida pela adição de um α—sarcoglicano e Y— sarcoglicano. A montagem do complexo de sarcoglicano é necessária, mas não suficiente para a translocação para a membrana plasmática [Chen et al., Exp Cell Res. 312: 1610—25 (2006)]. Mutações em subunidades de sarcoglicano rompem a tradução normal do complexo sarcoglicano do ER/Golgi para a membrana plasmática. Translocação para a membrana plasmática requer uma interação com a distrofina e está associada com a estabilização da membrana plasmática. Complexos de sarcoglicano contendo Y—sarcoglicano (Y) ou Mini—Sgcg (mY) se translocam com sucesso para a membrana plasmática. Em músculo de Drosophila, em que há apenas uma única subunidade Y/δ—sarcoglicano, mini—Sgcg de mamífero pode resgatar a perda da fração única de Y/δ—sarcoglicano e resgatar o defeito da função do coração e muscular (como mostrado aqui).
Mini-Sgcg enriquece na fração microssomal pesada de músculo
[00142] O músculo pode ser fraccionado em uma fração citoplasmática (C) e uma de membrana. A fração de membrana pode ser ainda subdividida em microssomas leve (L) e (H). O complexo de sarcoglicano é normalmente encontrado no complexo microssomal pesado contendo membrana plasmática. Músculo dos camundongos que expressam mini—Sgcg (T+) foi fracionado para separar o citoplasma das frações microssomais leve e pesada. A fração microssomal pesada contém as frações ER, de Golgi e da membrana plasmática. Nas duas linhagens transgênicas diferentes (84 e 50), mini-Sgcg enriquece na fração microssomal pesada (Figura 16). Isto demonstra que mini-Sgcgé encontrada na fração intracelular apropriada. O método para o isolamento de microssomas foi como previamente descrito [Ohlendieck et al., J Cell Biol. 112: 135-48 (1991)] com modificação descrita em [Duclos et al., J Cell Biol. 142: 1461-71 (1998); Hack et al., J Cell Sci. 113: 2535-44 (2000)]. O anticorpo utilizado nos painéis superiores da Figura 16 é o epítopo purificado por afinidade anti- Xpress. O anticorpo utilizado no painel inferior da Figura 16 foi um anticorpo policlonal de coelho anti-Y-sarcoglicano [McNally et al., Hum Mol Genet. 5: 1841-7 (1996)]. Os anticorpos foram utilizados a 1: 500. Todos os anticorpos secundários foram a partir Jackson Immunochemicals (anti-HRP de coelho, de cabra) usados a 1: 1000.
Criação de linhagens de células humanas com mutações SGCG
[00143] Foram estabelecidas duas linhagens de células humanas com mutações SGCG para fins de teste de salto de éxon para a produção de mini- Sgcg. Estas linhagens são derivadas a partir de fibroblastos dérmicos humanos isolados a partir de pacientes com mutações no gene SGCG primário. A linhagem de cima da Figura 17 mostra células de um paciente de LGMD 2C cuja doença resulta de uma mutação na exclusão de éxon 7 em SGCG. A linhagem inferior da Figura 17 mostra células de um paciente LGMD 2C que é excluído para éxon 6 de SGCG. Estas linhagens celulares foram infectadas com retrovírus que expressam telomerase e MyoD. A infecção com o vírus da telomerase fornece uma linhagem celular imortalizada, e a infecção com o vírus MyoD proporciona um meio de indução da diferenciação muscular regulado uma vez que a posição nuclear da MyoD está sob o controle de tamoxifeno [Kimura et al., Hum Mol Genet. 17: 2507-17 (2008); Kendall et al., Sci Transl Med. 4: 164ra160 (2012)]. Esta combinação cria linhagens de células que são imortalizadas com telomerase, que proporciona um suprimento pronto de células. O controle regulável da expressão nuclear de MyoD fornece um mecanismo pelo qual a conversão do músculo pode ser induzida à vontade. Estas linhagens de células servem como modelos celulares de LGMD 2C, e fornecem o formato em que a expressão induzida de mini-Sgcg pode ser testada em um contexto de células humanas. Com a adição do tamoxifeno, MyoD se localiza no núcleo e as células sofrem diferenciação em miotubos alongados (Figura 17, painel do meio e da direita).
Linhagens celulares de LGMD 2C diferenciadas na linhagem muscular
[00144] A Figura 18 mostra que as linhagens de células de LGMD 2C se diferenciaram na linhagem muscular após 6 dias de diferenciação. Com a adição de tamoxifeno, linhagens celulares de LGMD 2C sofrem alterações morfológicas tornando-se alongadas e expressando marcadores miogênicos e demonstrando diferenciação na linhagem muscular. MyoD, um marcador de músculo, é expresso a partir do retrovírus (Figura 18, painel do meio) e desmina, um marcador de músculo, é induzida a partir MyoD (Figura 18, painel da direita), indicando que estas células são viáveis para modelos de doença muscular. O painel do lado esquerdo da Figura 18 (Hoechst) mostra núcleos. Os métodos para a cultura de células são descritos em Kendall et al. [Sci Transl Med. 4: 164ra160 (2012)]. Anticorpos anti-desmina e anti-MyoD foram de ThermoFisher (PA5-17182 e MA1-41017, respectivamente). Anticorpos secundários foram de Molecular Probes/Invitrogen (anti-Cy3 de camundongo, de cabra; anti-Alexa488 de camundongo, de cabra, respectivamente).

Claims (17)

1. Uso de um polinucleotídeo antissenso isolado que é especificamente complementar a uma região alvo de éxon de um RNA gama sarcoglicano, em que o éxon é selecionado do grupo consistindo em éxon 4 (SEQ ID NO: 1), éxon 5 (SEQ ID NO: 2), éxon 6 (SEQ ID NO: 3), éxon 7 (SEQ ID NO: 4) e uma combinação dos mesmos, caracterizadopelo fato de ser na manufatura de um medicamento para tratar Distrofia Muscular do Cíngulo dos Membros tipo 2C (LGMD2C).
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o medicamento é preparado para induzir o salto do éxon 4 (SEQ ID NO: 1), éxon 5 (SEQ ID NO: 2), éxon 6 (SEQ ID NO: 3), e éxon 7 (SEQ ID NO: 4) do RNA gama sarcoglicano.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende adicionalmente distribuição de um polinucleotídeo antissenso adicional à célula, em que o polinucleotídeo antissenso adicional é especificamente complementar a um éxon do RNA gama sarcoglicano.
4. Uso de um polinucleotídeo antissenso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o medicamento distribui a uma célula muscular humana o polinucleotídeo antissenso que é especificamente complementar a uma região alvo de éxon de um RNA gama sarcoglicano para formar um duplex, em que o polinucleotídeo antissenso é 100% complementar a uma região alvo de éxon dentro do duplex.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o medicamento compreende adicionalmente um polinucleotídeo antissenso adicional que é especificamente complementar a um éxon do RNA gama sarcoglicano preparado para distribuição à célula.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o polinucleotídeo antissenso compreende uma espinha dorsal de polinucleotídeo modificada.
7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que a espinha dorsal de polinucleotídeo modificada compreende uma porção modificada substituída pelo açúcar de pelo menos um dos polinucleotídeos.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que a porção modificada é um Morfolino.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que a espinha dorsal de polinucleotídeo modificada compreende ligação internucleotídeo modificada.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que a ligação internucleotídeo modificada compreende um fosfato modificado.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o fosfato modificado é selecionado do grupo consistindo em um metil fosfonato, um metil fosforotioato, um fosforomorfolidato, um fosforopiperazidato e um fosforoamidato.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o polinucleotídeo antissenso é um 2'-O-metil-oligorribonucleotídeo.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o polinucleotídeo antissenso compreende um ácido nucleico peptídico.
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o polinucleotídeo antissenso é quimicamente ligado a um ou mais conjugados
15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o polinucleotídeo antissenso é quimicamente ligado a uma molécula de polietileno glicol.
16. Uso de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o conjugado é um peptídeo.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado de modo que o peptídeo é selecionado do grupo consistindo em um sinal de localização nuclear (NLS), proteína TAT HIV-1, um peptídeo compreendendo um domínio de ligação a integrina, oligolisina, proteína de fibra de adenovírus e um peptídeo compreendendo um domínio de endocitose mediada por receptor (RME).
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