BR112015000800B1

BR112015000800B1 - Método para a redução da viscosidade de um anticorpo, anticorpos biespecíficos, composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, método para preparação de um anticorpo biespecífico e anticorpos biespecíficos bivalentes

Info

Publication number: BR112015000800B1
Application number: BR112015000800-3A
Authority: BR
Inventors: Harald Duerr; Frank Herting; Christian Klein; Joerg Regula; Matthias Rueth; Kay-Gunnar Stubenrauch
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2024-03-19

Abstract

ANTICORPOS ANTI-VEGF / ANTI-ANG-2 BIESPECÍFICOS E SEU USO NO TRATAMENTO DE ENFERMIDADES VASCULARES OCULARES Refere-se a presente invenção a um anticorpo biespecífico contra fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-A) e contra angiopoietina-2 humana (ANG-2) da subclasse IgG1 ou IgG4 humana com mutações I253A, H310A, e H435A, métodos para a sua produção, composições farmacêuticas que contêm os ditos anticorpos, e usos das mesmas.

Description

[0001] Refere-se a presente invenção a um método para a redução da viscosidade de um anticorpo (que inclui um anticorpo biespecífico) da subclasse IgG1 humana ou de IgG4 humana, para anticorpos biespecíficos contra o fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-A) e contra angiopoietina-2 humana (ANG-2), métodos para a sua produção, composições farmacêuticas que contêm os referidos anticorpos, e as suas utilizações.

Antecedentes da Invenção

[0002] A angiogênese está envolvida na patogênese de uma variedade de distúrbios que incluem tumores sólidos, síndromes neovasculares intra-ocultares, tais como retinopatias proliferantes ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD), artrite reumatóide, e psoríase (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; and Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology de ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710).

[0003] O Ranibizumab (nome comercial Lucentis®) é um fragmento de anticorpo monoclonal derivado do mesmo anticorpo-mãe de murídeo que o bevacizumab (Avastin). Não obstante, foi maturado por afinidade para proporcionar ligação mais forte para o VEGF-A (WO 98/45331). É sabido que o bloqueio de VEGF-A pode estar relacionado com determinadas toxicidades sistêmicas, por essa razão ao ranibizumab está faltando uma parte Fc para reduzir a porção de vida no soro e Consequentemente toxicidades sistêmicas. É um agente anti-angiogênico que foi aprovado para o tratamento do tipo "úmido" da degeneração macular relacionada com a idade (ARMD), uma forma comum de perda de visão relacionada com a idade.

[0004] Ensaios de angiogénese da córnea demonstraram que tanto a ANG-1 quanto a ANG-2 tinham efeitos similares, agindo sinergicamente com a VEGF para promover o crescimento de novos vasos sanguíneos. Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. A possibilidade de que houve uma resposta endotelial dependente de dose foi levantada pela observação de que in vitro sob alta concentração, a ANG-2 também pode ser pró-angiogênica (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52). Sob alta concentração, a ANG-2 atua como um fator de sobrevivência de apoptose para as células endoteliais durante a apoptose privação de soro através da desativação de Tie2 por intermédio de Kinase PI-3 e caminho de Akt (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52).

[0005] A WO 2010/040508 A9 e a WO 2011/117329 referem-se a anticorpos anti-VEGF/anti-ANG-2 biespecíficos. A WO 2008/132568 refere-se a proteínas de fusão de ligação a fatores de crescimento. A WO 2009/136352 refere-se a compostos anti-angiogênicos. A WO 2009/080253 e a WO 2011/117330 referem-se a formatos de anticorpos bivalentes biespecíficos. A WO 2010/069532 refere-se a anticorpos Ang2.

[0006] As enfermidades vasculares oculares, tais como degeneração macular relacionada com a idade (ARMD) e retinopatia diabética (DR), são devidas a coróide anormal ou a neovascularização da retina, respectivamente. Eles são as principais causas de perda visual em países industrializados. Uma vez que a retina consiste de camadas bem definidas de elementos neuronais, gliais e vasculares, perturbações relativamente pequenas tais como aquelas observadas na proliferação vascular ou edema podem conduzir à perda significativa da função visual. Degenerações retinianas hereditárias, tais como Retinitis Pigmentosa (RP), também estão associadas com as anormalidades vasculares, tais como estreitamento arteriolar e atrofia vascular. Elas afetam tantos quantos 1 em 3500 indivíduos e são caracterizadas por cegueira noturna progressiva, perda do campo visual, atrofia do nervo óptico, atenuação arteriolar, e perda central de visão muitas vezes progredindo para a cegueira completa.

[0007] As retinopatias isquêmicas são caracterizadas por perda ou disfunção da vasculatura retiniana que resulta em uma redução do fluxo sanguíneo e hipóxia. A retina responde à hipóxia pela geração de sinais para fazer crescer novos vasos sanguíneos, mas estes novos vasos são usualmente frágeis e desorganizados. É o crescimento destes novos vasos anormais que cria a maior parte da ameaça para a visão uma vez que eles podem vazar, provocar hemorragia ou levar a cicatrizes que podem terminar em descolamento de retina. Os tratamentos atuais para as retinopatias isquêmicas procuram suspender o crescimento dos vasos patológicos, mas não abordam a isquemia subjacente que impulsiona seu crescimento. Além disso, o tratamento padrão para a retinopatia diabética, uma retinopatia isquêmica que afeta milhões, envolve a destruição de uma parte da retina com um laser em uma tentativa de parar o crescimento de novos vasos e preservar a visão central. Estratégias têm sido utilizados para bloquear a função do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um promotor principal do crescimento de vasos. No curto prazo, a terapia anti-VEGF pode aperfeiçoar a visão, mas não aborda a isquemia subjacente e, com efeito, pode exacerbar esta condição uma vez que ela inibe o crescimento de todos os vasos, incluindo colaterais benéficos. Há também a preocupação séria da exposição sistêmica desses fármacos em pacientes idosos e / ou diabéticos, onde o crescimento de novos vasos pode ser exigido em cérebros isquêmicos, corações ou membros.

[0008] Tipicamente, para enfermidades oculares por meio de aplicação intravítrea fragmentos de anticorpos menores tais como Fab ou Fab (2) são muitas vezes usados uma vez que eles são dotados de uma semivida de baixo soro e o risco de toxicidades sistêmicas é mais baixo. Não obstante, estes fragmentos menores tipicamente também são dotados de semividas intravítreas inferiores (por exemplo, devido à difusão mais rápida no soro) e têm que ser dosados tipicamente mais frequentemente.

[0009] Kim et al, Molecular Vision, 15 (2009) 2803-2812 refere-se a anticorpos de comprimento pleno administrados de forma intravítrea no olho, em que um IgG com ligação de FcRn foi eliminada no sangue em camundongos de tipo comum, enquanto que um IgY sem nenhuma ligação de FcRn não foi eliminado dentro do sistema sanguíneo. Além disso o IgG com ligação de FcRn não foi eliminado dentro do sistema sanguíneo em camundongos derrubados por FcRn.

[0010] Existe uma necessidade na técnica para melhores meios para tratar e prevenir várias enfermidades vasculares oculares tais como retinopatias isquêmicas.

Sumário da invenção

[0011] Um aspecto da invenção é compreendido pelo método para a redução da viscosidade de um anticorpo em que o anticorpo compreende uma região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humano ou IgG4 humano (derivado de origem humana e) em que o método compreende a modificação da região de cadeia pesada constante de anticorpo da subclasse de IgG1 humano ou IgG4 humano com as mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0012] De acordo com uma concretização da invenção o dito método é caracterizado pelo fato de que o anticorpo é compreendido por um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, em que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO:3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO:5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO:6; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno de uma forma específica se liga a ANG-2 compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região de CDR2H de, SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma CDR1L região de SEQ ID NO: 14, e em que iii) o anticorpo biespecífico compreende uma região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humana ou IgG4 humana (derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, and H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0013] De acordo com uma concretização da invenção esse método é caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo biespecífico descrito anteriormente compreende a região de cadeia pesada constante de subclasse IgG1 humana (derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o EU Index de Kabat) e que compreende além disso as mutações L234A , L235A e P329G (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0014] Uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo obtido por meio desse método.

[0015] Uma concretização da invenção é compreendida pelo uso das mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o EU Index de Kabat) para a redução da viscosidade de um anticorpo em que o anticorpo compreende a região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humana ou IgG4 humana (derivados de origem humana).

[0016] De acordo com uma concretização da invenção o dito uso é caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, em que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO:3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO:5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO:6; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno ligando-se especificamente to ANG-2 compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 14, e em que iii) o anticorpo biespecífico compreende a região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humana ou IgG4 humana (derivados de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, and H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0017] De acordo com uma concretização da invenção o dito uso específico é caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico compreende a região de cadeia pesada constante de subclasse IgG1 humana ( derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat) e que compreende além disso as mutações L234A , L235A e P329G (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0018] A invenção refere-se ainda a um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, em que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO:3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO:5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO:6; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno especificamente que se liga a ANG-2 compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 14, and em que iii) o anticorpo biespecífico compreende uma região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humana ou IgG4 humana (derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0019] De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico é caracterizado pelo fato de que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende como domínio VH variável de cadeia pesada uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e como domínio VL variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente a ANG-2 compreende como domínio VH variável de cadeia pesada uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15, e como domínio VL variável de cadeia leve uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[0020] De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico é caracterizado pelo fato de que a região de cadeia pesada constante sob iii) é da subclasse IgG1 humana. De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico de subclasse IgG1 é caracterizado pelo fato de que a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG1 compreende ainda as mutações L234A , L235A e P329G (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

[0021] De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico é caracterizado pelo fato de que a região de cadeia pesada constante sob iii) é da subclasse IgG4 humana. De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico da subclasse IgG4 é caracterizado pelo fato de que a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4 compreende além disso as mutações S228P e L235E (numeração de acordo com o EU Index de Kabat). De acordo com uma concretização o dito anticorpo biespecífico da subclasse IgG4 é caracterizado pelo fato de que a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4 compreende além disso as mutações S228P , L235E e P329G (numeração de acordo com o EU Index de Kabat).

[0022] Ainda outros aspectos da invenção são uma composição farmacêutica que compreende o referido anticorpo biespecífico, destinando-se a dita composição farmacêutica ao uso no tratamento de enfermidades vasculares oculares, o uso do referido anticorpo biespecífico para a manufatura de um medicamento para o tratamento de enfermidades vasculares oculares, um método de tratamento de paciente que sofre de enfermidades vasculares oculares por meio da administração do referido anticorpo biespecífico a um paciente com necessidade de tal tratamento. De acordo com uma concretização o anticorpo biespecífico ou a composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo biespecífico é administrada por intermédio de aplicação intravítrea.

[0023] Outro aspecto da invenção é compreendido por uma molécula de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada e / ou leve de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[0024] A invenção proporciona além disso vetores de expressão que contêm o dito ácido nucléico de acordo com a invenção capaz de expressar o dito ácido nucléico em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, e células hospedeiras que contêm esses vetores para a produção recombinante de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[0025] A invenção compreende além disso uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica que compreende um vetor de acordo com a invenção.

[0026] A invenção compreende além disso um método para a produção de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, caracterizado por expressar um ácido nucléico de acordo com a invenção em a célula hospedeira procariótica ou eucariótica e recuperar o dito anticorpo biespecífico a partir da dita célula ou do sobrenadante de cultura de células. Uma concretização é compreendida por um método para a preparação de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção que compreende as etapas de a) transformar uma célula hospedeira com vetores que compreende a molécula de ácido nucléicos que codifica o dito anticorpo; b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a síntese da dita molécula de anticorpo; e c) recuperar a dita molécula de anticorpo a partir da dita cultura.

[0027] A invenção compreende além disso o anticorpo obtido por meio desse método para a produção de um anticorpo biespecífico.

[0028] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente a VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado por compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, de SEQ ID NO: 22, de SEQ ID NO: 23, e de SEQ ID NO: 24.

[0029] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, de SEQ ID NO: 26, de SEQ ID NO: 27, e de SEQ ID NO: 28.

[0030] Os anticorpos de acordo com a invenção são dotados de propriedades altamente valiosas devidas às suas modificações específicas na parte Fc / região constante causando um benefício para um paciente que sofre de enfermidades vasculares oculares. Eles exibem alta estabilidade no ambiente intravítreo e difusão lenta a partir do olho (comparados com fragmentos de anticorpo menores sem a região de cadeia pesada constante), onde a enfermidade real está localizada e tratada (assim o programa de tratamento pode, potencialmente, ser melhorado em comparação com anticorpos tais como não IgG como, por exemplo, fragmentos Fab e (Fab)2). Surpreendentemente, comparada com anticorpos de IgG não modificados a semivida no olho depois da aplicação intravítrea dos anticorpos com as mutações I253A, H310A, e H435A na região constante (com não mais ligação de FcRn) foi semelhante (apenas levemente reduzida) (Tabelas 17a e 18a e Figuras 7D e 7E), enquanto que a difusão a partir do olho para dentro do soro sanguíneo foi similar (Tabela 15 e Figura 7B). Isto é altamente valioso como é desejado para o tratamento de enfermidades vasculares oculares relacionadas com ANG2 e / ou VEGF para eliminar VEGF sob Ang2 a partir do olho (por exemplo, por meio do transporte para dentro do soro sanguíneo como complexo de anticorpos anti-ANG2/ANG2 ou complexo de anticorpos anti-VEGF/VEGF). Os anticorpos de acordo com a invenção são limpas, por outro lado muito rapidamente a partir do soro quando comparados aos anticorpos de IgG não modificados (o que é altamente desejado para reduzir os potenciais efeitos colaterais decorrentes da exposição sistêmica).

[0031] Surpreendentemente eles também exibem viscosidade mais baixa (vide Figura 2) (comparados com as versões sem as mutações I253A, H310A, e H435A na região constante) e são por essa razão especialmente úteis para aplicação intravítrea através de finas agulhas durante o tratamento das enfermidades oculares (para essa aplicação normalmente são usadas agulhas finas e alta viscosidade faz com que uma aplicação adequada seja bastante difícil). A viscosidade mais baixa também permite formulações de concentração mais elevada.

[0032] Também surpreendentemente os anticorpos de acordo com a invenção exibem tendência de agregação mais baixa (Figura 4) durante o armazenamento comparados às versões sem as mutações I253A, H310A, e H435A na parte Fc) que é da maior importância para aplicação intravítrea aos olhos (uma vez que uma agregação nos olhos pode conduzir a complicações durante esse tratamento). Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção mostram boa eficácia na inibição das enfermidades vasculares.

[0033] De acordo com determinadas concretizações, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção devido às suas modificações específicas na região constante (por exemplo, P329G LALA) mostram propriedades valiosas tais como nenhuma ligação aos receptores de Fcgama o que reduz o risco de efeitos colaterais como trombose e / ou morte celular indesejável (devido a, por exemplo, ADCC) Descrição das Figuras Figura 1 Esquema do conceito e vantagens de anticorpos <VEGF-ANG-2> IgG1 ou IgG4 com mutações de AAA (mutações I253A, H310A, e H435A -numeração de acordo com o EU Index de Kabat). Figura 2 Medição de viscosidade com base em DLS de pequena escala Viscosidade extrapolada sob 150 mg/ml em 200 mM Arginina/Succinato, pH 5,5 (comparação de anticorpos <VEGF-ANG-2> de acordo com a invenção VEGFang2-0016 (com mutações de AAA) com uma referência VEGFang2-0015 (sem essas mutações de AAA). Figura 3 Agregação de DLS dependente de temperatura (incluindo temperatura de início de agregação de DLS) em 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6,0 5 (comparação de anticorpos <VEGF-ANG-2> de acordo com a invenção VEGFang2-0016 (com mutações de AAA) com uma referência VEGFang2-0015 (sem essas mutações de AAA). Figura 4 Armazenamento de 7 dias sob 40°C sob 100 mg/ml (diminuição de Principal e Alto Peso Molecular /HMW) aumento) (comparação de anticorpos <VEGF-ANG-2> de acordo com a invenção VEGFang2-0016 (com mutações de AAA) que mostraram uma agregação mais baixa com um VEGFang2-0015 de referência (sem essas mutações de AAA)). Figura 5A Afinidade estado estacionário de FcRn de VEGFang2-0015 (sem mutações de AAA): sobreposição de sensogramas de Biacore sob diferentes concentrações mostra uma ligação dependente de concentração de VEGFang2-0015 (sem mutações de AAA) para FcRn . Figura 5B Afinidade estado estacionário de FcRn de A: VEGFang2-0015 (sem mutações de AAA): a curva de resposta de ligação dependente de concentração de VEGFang2-0015 (sem mutações de AAA) mostra ligação ao FcRn. Figura 5C Afinidade estado estacionário de FcRn de VEGFang2-0016 (com mutações de AAA): sobreposição de sensogramas de Biacore sob diferentes concentrações mostra nenhuma ligação ao FcRn sob todas as concentrações. Figura 5D Afinidade estado estacionário de FcRn de VEGFang2-0016 (com mutações de AAA): a curva de resposta de ligação dependente de concentração de VEGFang2-0016 (com mutações de AAA) mostra nenhuma ligação ao FcRn . Figura 5E Afinidade estado estacionário de FcRn de VEGFang2-0016 (com mutações de AAA): a curva de resposta de ligação dependente de concentração de VEGFang2-0016 (com mutações de AAA) mostra nenhuma ligação ao FcRn (faixa de resposta desde-0,6 até 0,2 RU/ a escala de concentração varia desde 0 até 0,35 M). Figura 6 Interação FcgammaRIIIa de medições de VEGFang2-0015 sem mutações de AAA e VEGFang2-0016 com mutações de AAA (as duas são compreendidas por subclasse de IgG1 com mutações P329G LALA; como controles foram utilizados um Anti-Dig de subclasse de IgG1 e um anticorpo baseado em IgG4). Figura 7A Princípio de Ensaio Pk-ELISA Esquemático para determinação de concentrações de anticorpos <VEGF/Ang2> biespecíficos em soro e lisados de olho integrais. Figura 7B Concentração de soro depois de aplicação intravenosa: Comparação de compostos - VEGFang2-0015 sem mutações de AAA e VEGFang2-0016 com mutações de AAA. Figura 7C Concentração de soro depois de aplicação intravítrea: Comparação de compostos - VEGFang2-0015 sem mutações de AAA e VEGFang2-0016 com mutações de AAA. Figura 7D Concentração de lisados de olho de VEGFang2-0016 (com mutação AAA) no olho direito e olho esquerdo (depois de aplicação intravítrea somente no olho direito em comparação com a aplicação intravenosa): Concentrações significativas puderam ser detectadas apenas no olho direito depois de aplicação intravítrea. Depois de aplicação intravenosa nenhuma concentração em lisados do olho pôde ser detectada devido à baixa semi-vida do soro de VEGFang2-0016 (com mutação AAA). Figura 7E Concentração de lisados de olho de VEGFang2-0015 (sem mutação AAA) no olho direito e esquerdo (depois de aplicação intravítrea somente dentro do olho direito No olho direito (e em uma certa extensão no olho esquerdo) depois de aplicação intravítrea foi possível detectarem-se concentrações de VEGFang2-0015. Isto indica a difusão a partir do olho direito para o soro e a partir daí para o olho esquerdo, o que pode ser explicado por meio da longa semi-vida de VEGFang2-0015 (sem mutação AAA). Depois da aplicação intravenosa também foi possível detectar concentrações significativas nos lisados do olho nos dois olhos devido à difusão do soro nos olhos Tabela VEGFang2-0015 (sem mutação AAA).

Descrição Detalhada da invenção

[0033] De acordo com uma concretização da invenção o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é bivalente.

[0034] De acordo com um aspecto da invenção esse anticorpo bivalente, biespecífico de acordo com a invenção é caracterizado por compreender: a) a cadeia pesada e a cadeia leve de um primeiro anticorpo de comprimento pleno que especificamente se liga ao VEGF; b) a cadeia pesada modificada e a cadeia leve modificada de um segundo anticorpo de comprimento pleno que especificamente se liga ao ANG-2, em que os domínios constantes CL e CH1 são substituídos um pelo outro.

[0035] Este formato de anticorpo bivalente, biespecífico, para o anticorpo biespecífico que se liga especificamente ao fator de crescimento endotelial humano (VEGF) e angiopoietina-2 humana (ANG-2) encontra-se descrito na WO 2009/080253 (que inclui domínios de CH3 de Botões em Furos modificados). Os anticorpos baseados neste formato de anticorpo bivalente, biespecífico, são chamados de CrossMabs.

[0036] De acordo com uma concretização esse anticorpo bivalente, biespecífico, é caracterizado por compreender: a) como cadeia pesada do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, e como cadeia leve do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, e b) como cadeia pesada modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, e como cadeia leve modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

[0037] De acordo com uma concretização anticorpo bivalente, biespecífico é caracterizado por compreender a) como cadeia pesada do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, e como cadeia leve do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e b) como cadeia pesada modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e como cadeia leve modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0038] De acordo com uma concretização esse anticorpo bivalente, biespecífico, é caracterizado por compreender a) como cadeia pesada do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, e como cadeia leve do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e b) como cadeia pesada modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e como cadeia leve modificada do segundo anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[0039] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 25, da SEQ ID NO: 26, da SEQ ID NO: 27, e da SEQ ID NO: 28.

[0040] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, da SEQ ID NO: 22, da SEQ ID NO: 23, e da SEQ ID NO: 24.

[0041] Po r essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, da SEQ ID NO: 30, da SEQ ID NO: 31, e da SEQ ID NO: 32.

[0042] De acordo com outro aspecto da invenção, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é caracterizado por compreender a) a cadeia pesada e a cadeia leve de um primeiro anticorpo de comprimento pleno que especificamente se liga ao VEGF; b) a cadeia pesada e a cadeia leve de um segundo a secundo anticorpo de comprimento pleno que especificamente se liga ao ANG-2, em que o término N da cadeia pesada é conectado ao término C da cadeia leve por meio de um ligante peptídico.

[0043] Este formato de anticorpo bivalente, biespecífico, para este anticorpo biespecífico que se liga especificamente ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF) e angiopoietina-2 humana (ANG-2) encontra-se descrito na WO 2011/117330 que inclui domínios de CH3 de Knobs-into-Holes modificados. Os anticorpos baseados neste formato de anticorpo bivalente, biespecífico, são chamados de OAscFabs.

[0044] De acordo com uma concretização esse anticorpo bivalente, biespecífico, é caracterizado por compreender: a) como cadeia pesada do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33, e como cadeia leve do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35, e b) como cadeia pesada do segundo anticorpo de comprimento pleno conectada a uma cadeia leve do segundo anticorpo de comprimento pleno por meio de um ligante de peptídeo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34.

[0045] De acordo com uma tal concretização o anticorpo bivalente, biespecífico é caracterizado por compreender a) como cadeia pesada do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e como cadeia leve do primeiro anticorpo de comprimento pleno a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, e b) como cadeia pesada do segundo anticorpo de comprimento pleno conectado a uma cadeia leve do segundo anticorpo de comprimento pleno por meio de um ligante de peptídeo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.

[0046] De acordo com uma concretização o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) and o domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) da cadeia pesada e leve do segundo anticorpo de comprimento pleno são estabilizadas por dissulfureto pela introdução de uma ligação de dissulfureto entre as seguintes posições: posição de domínio variável de cadeia pesada 44 para a posição de domínio variável de cadeia leve 100 (numeração sempre de acordo com o Index EU de Kabat) Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)). Essa maior estabilização de dissulfureto é alcançada pela introdução da ligação de dissulfureto entre os domínios variáveis VH e VL da cadeia pesada e leve do segundo anticorpo de comprimento pleno. As técnicas usadas introduzir pontes de dissulfureto não naturais para fins de estabilização encontram-se descritas, por exemplo, na WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393; or Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721.

[0047] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 33, da SEQ ID NO: 34, e da SEQ ID NO: 35.

[0048] Po r essa razão, uma concretização da invenção é compreendida por um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, da SEQ ID NO: 37, e da SEQ ID NO: 38.

[0049] Na concretização, os domínios CH3 do anticorpo bivalente, biespecífico, de acordo com a invenção são alterados por meio da tecnologia de “botão em buracos” que se encontra descrita de forma detalhada com vários exemplos, por exemplo, na WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; and Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. Neste método as superficies de interação nos dois domínios de CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerisação das duas cadeias pesadas que contêm estes dois domínios de CH3. Cada um dos dois domínios de CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser o “botão”, enquanto que o outro é o “furo”. A introdução de uma ponte de dissulfureto estabiliza os heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e aumenta o rendimento.

[0050] De acordo com um aspecto preferido da invenção todos os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são caracterizados pelo fato de que o domínio de CH3 de uma cadeia pesada e o domínio de CH3 da outra cadeia pesada encontram-se em uma interface que compreende uma interface original entre os domínios do anticorpo CH3; em que a dita interface é alterada para promover a formação do anticorpo biespecífico, em que a alteração é caracterizada pelo fato de que: a) o domínio de CH3 de uma cadeia pesada é alterado, de maneira que dentro da interface original o domínio de CH3 de uma cadeia pesada que atende a interface original do domínio de CH3 da outra cadeia pesada dentro do anticorpo biespecífico, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral maior, gerando desse modo uma protuberância dentro da interface do domínio de CH3 de uma cadeia pesada que é posicionável em uma cavidade dentro da interface do domínio de CH3 da outra cadeia pesada e b) o domínio de CH3 da outra cadeia pesada é alterado, de forma tal que dentro da interface original do segundo domínio de CH3 que ayende a interface original do primeiro domínio de CH3 dentro do anticorpo biespecífico um resíduo de aminoácido é substituídos por um resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral menor, gerando desse modo uma cavidade dentro da interface do segundo domínio de CH3 dentro da qual é suscetível de ser posicionada uma protuberância dentro da interface do primeiro domínio de CH3.

[0051] Deste modo, o anticorpo de acordo com invenção é caracterizado de preferência pelo fato de que o domínio de CH3 da cadeia pesada do anticorpo de comprimento pleno de a) e o domínio de CH3 de uma cadeia pesada do anticorpo de comprimento pleno de b) cada se encontram em uma interface que compreende uma alteração na interface original entre os domínieos de CH3 do anticorpo; em que i) no domínio de CH3 de uma cadeia pesada um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral maior, gerando desse modo uma protuberância durante um período da interface do domínio de CH3 de uma cadeia pesada que é suscetível de ser posivionada em uma cavidade dentro da interface do domínio de CH3 da outra cadeia pesada e em que ii) no domínio de CH3 da outra cadeia pesada um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral menor, gerando desse modo uma cavidade dentro da interface do segundo domínio de CH3 dentro da qual é suscetível de ser posicionada uma protuberência dentro da interface do primeiro domínio de CH3.

[0052] De preferência, o dito resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral maior é selecionado a partir do grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofan (W).

[0053] De preferência, o dito resíduo de aminoácido que é dotado de um volume de cadeia lateral menor é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

[0054] De acordo com um aspecto da invenção os dois domínios de CH3 são ainda alterados pela introdução de cisteína (C) como aminoácido nas correspondentes posições de cada domínio de CH3 de maneira tal que pode ser formada uma ponte de dissulfureto entre os dois domínios de CH3.

[0055] De acordo com uma concretização, o anticorpo biespecífico compreende uma mutação T366W no domínio de CH3 da “cadeia de botões” e T366S, L368A, Y407V mutações no domínio de CH3 da “cadeia de furos”. Também pode ser usada uma ponte de dissulfureto intercadeias adicional entre os domínios de CH3 (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), por exemplo, pela introdução de uma mutação Y349C dentro do domínio de CH3 da “cadeia de botões” e uma mutação E356C ou uma mutação S354C dentro d o domínio de CH3 da “cadeia de furos”.

[0056] De acordo com outra concretização, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção compreende mutações Y349C, T366W mutações em um dos dois domínios de CH3 e mutações E356C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios de CH3. De acordo com outra concretização preferida o anticorpo biespecífico compreende as mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios de CH3 e mutações S354C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios de CH3 (a mutação Y349C adicional em um domínio de CH3 e a mutação E356C ou S354C adicional no outro domínio de CH3 formando uma ponte de dissulfureto intercadeias) (a numeração é sempre de acordo com o Index EU de Kabat) (Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)). Mas também outras tecnologias de botões em furos tais como se encontram descritas pela EP 1 870 459 A1, podem ser usadas alternativamente ou adicionalmente. Deste modo, outro exemplo para o anticorpo biespecífico é compreendido por mutações R409D; K370E no domínio de CH3 da “cadeia de botões” e mutações D399K; E357K no domínio de CH3 da “cadeia de furos” (a numeração é sempre de acordo com o Index EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)).

[0057] De acordo com outra concretização o anticorpo biespecífico compreende uma mutação T366W no domínio de CH3 da “cadeia de botões” e mutações T366S, L368A, Y407V no domínio de CH3 da “cadeia de furos” e adicionalmente mutações R409D; K370E no domínio de CH3 da “cadeia de botões” e mutações D399K; E357K no domínio de CH3 da “cadeia de furos”.

[0058] De acordo com outra concretização o anticorpo biespecífico compreende mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios de CH3 e mutações S354C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios de CH3 ou o dito anticorpo biespecífico, trivalente, compreende mutações Y349C, T366W em um dos dois domínios de CH3 e mutações S354C, T366S, L368A, Y407V no outro dos dois domínios de CH3 e adicionalmente mutações R409D; K370E no domínio de CH3 da “cadeia de botões” e mutações D399K; E357K no domínio de CH3 da “cadeia de furos”.

[0059] De acordo com uma concretização da invenção o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é caracterizado por ser dotado de uma ou mais das seguintes propriedades (determinadas em ensaios tais como se encontram descritos no Exemplo 6 : - exibe uma concentração de soro mais baixa em comparação com o correspondente anticorpo biespecífico sem as mutações descritas em iii) (96 horas depois da aplicação intravítrea em camundongos, que são compreendidos por camundongos deficientes em FcRn, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano); - exibe uma concentração similar (fator 0,8 até 1,2) em lisados de olho direito integrais comparados com anticorpo biespecífico correspondente sem as mutações descritas em iii) (em camundongos, que são camundongos deficientes em FcRn, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano, 96 horas depois da aplicação intravítrea no olho direito).

[0060] De acordo com uma concretização o anticorpo bivalente, biespecífico é caracterizado por compreender um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno compreende como domínio variável de cadeia pesada (VH) a SEQ ID NO: 7, e como domínio variável de cadeia leve (VL) a SEQ ID NO: 8; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno compreende como domínio variável de cadeia pesada (VH) a SEQ ID NO: 15, e como domínio variável de cadeia leve (VL) a SEQ ID NO: 16; e iii) o anticorpo biespecífico compreende a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG1 ou IgG4 (derivada da origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat) e tendo uma ou mais das seguintes propriedades (determinadas em ensaios tais como descritos no Exemplo 6 - mostra uma concentração de soro menor comparada com o correspondente anticorpo biespecífico sem as mutações descritas em iii) (96 horas depois da aplicação intravítrea em camundongos, que são deficientes em FcRn de camundongo, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano); - mostra uma concentração similar (fator 0,8 até 1,2) nos lisados de olho direito integrais em comparação com o correspondente anticorpo biespecífico sem as mutações descritas em iii) (em camundongos, que são camundongos deficientes em FcRn, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano, 96 horas depois da aplicação intravítrea no olho direito).

[0062] De acordo com uma concretização o anticorpo biespecífico é caracterizado por compreender um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno compreende como domínio variável de cadeia pesada (VH) a SEQ ID NO: 7 com 1, 2 ou 3 substituições de resíduos de aminoácidos, e como domínio variável de cadeia leve (VL) a SEQ ID NO: 8 com 1, 2 ou 3 substituições de resíduo de aminoácido; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno compreende como domínio variável de cadeia pesada (VH) a SEQ ID NO: 15 com 1, 2 ou 3 substituições de resíduos de aminoácidos, e como domínio variável de cadeia leve (VL) a SEQ ID NO: com 1, 2 ou 3 substituições de resíduos de aminoácidos; e iii) o anticorpo biespecífico compreende uma região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 ou IgG4 (derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat) e tendo uma ou mais das seguintes propriedades (determinadas em ensaios tais como descritos no Exemplo 6 - mostra uma concentração de soro mais baixa comparada com o correspondente anticorpo biespecífico sem as mutações descritas em iii) (96 horas depois da aplicação intravítrea em camundongos, que são deficientes em FcRn de camundongo, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano); - mostra uma concentração similar (fator 0,8 até 1,2) nos lisados de olho direito integrais em comparação com o correspondente anticorpo biespecífico sem as mutações descritas em iii) (em camundongos, que são camundongos deficientes em FcRn, mas transgênicos hemizigóticos para FcRn humano, 96 horas depois da aplicação intravítrea no olho direito).

[0062] Da forma que é utilizado neste contexto, "anticorpo" refere-se a uma proteína de ligação que compreende locais de ligação de antígenos. Os termos “local de ligação” ou “local de ligação de antígeno” da forma que é utilizado neste contexto, significa a(s) região(s) de uma molécula de anticorpo à qual um ligante se liga realmente. O termo “local de ligação de antígeno” compreende um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) (par de VH / VL).).

[0063] Especificidade de anticorpo refere-se ao reconhecimento seletivo do anticorpo para um epítope particular de um antígeno. Anticorpos naturais, por exemplo, são monospecíficos.

[0064] “Anti corpos biespecíficos” de acordo com a invenção são anticorpos que são dotados de duas especificidades de ligação de antígenos diferentes. Os anticorpos da presente invenção são específicos para dois antígenos diferentes, VEGF como primeiro antígeno e ANG-2 como segundo antígeno.

[0065] O termo anticorpo “monoespecífico” da forma que é utilizado neste contexto, significa um anticorpo que é dotado de um ou mais locais de ligação cada um dos quais se liga ao mesmo epitopo do mesmo antígeno.

[0066] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “valente” dentro do presente pedido significa a presença de um número especificado de locais de ligação em uma molécula de anticorpo. Dessa forma, os termos “bivalente”, “tetravalente”, e “hexavalente” significam a presença de dois locais de ligação, quatro locais de ligação, e seis locais de ligação, respectivamente, em uma molécula de anticorpo. Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são de preferência “bivalentes”.

[0067] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “VEGF” refere-se ao fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF / VEGF-A,) o fator de crescimento celular endotelial vascular humano de 165-aminoácidos (27191 aminoácidos da sequência precursora de VEGF165 humano: SEQ ID NO: 17; os aminoácidos 1-26 representam o péptido de sinal), e isoformas de fator de crescimento de células endoteliais 121, 189, e 206 vasculares relacionadas, conforme descritas por Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 ( 1991) 1806 -1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 and Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24; em conjunto com as formas alélicas e processadas que se apresentam naturalmente desses fatores de crescimento. O VEGF está envolvido na regulagem da angiogênese normal e anormal e neovascularização associada com tumores e distúrbios intraoculares (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; and Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). O VEGF é uma glicoproteína homodimérica que foi isolada a partir de várias fontes e inclui diversas isoformas. O VEGF mostra atividade mitogênica altamente específica para as células endoteliais.

[0068] Da forma que é utilizado neste contexto o termo “ANG-2” refere-se à angiopoietina-2 humana (ANG-2) (alternativamente abreviada com ANGPT2 ou ANG2) (SEQ ID NO: 18) que se encontra descrita, por exemplo, em Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 and Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91. As angiopoietinas-1 (SEQ ID NO: 19) e -2 foram descobertas como ligantes para os Ties, uma família de quinases de tirosina que é expressa seletivamente dentro do endotélio vascular (Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48). Existem atualmente quatro membros definitivos da família das angiopoietinas. A angiopoietina-3 e -4 (Ang-3 e Ang-4) podem representar contrapartes ou homólogos amplamente divergentes do mesmo local do gene no camundogo e no gomem (Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28). A ANG-1 e ANG-2 foram originalmente identificadas em experiências de cultura de tecidos como agonistas e antagonistas, respectivamente (vide, para ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; e para ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Todas as angiopoietinas conhecidas ligam-se principalmente ao Tie2 (SEQ ID NO: 20), e as duas Ang-1 e -2 ligam-se ao Tie2 com uma afinidade de 3 nM (Kd) (Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60).

[0069] Um local de ligação ao antígeno do anticorpo biespecífico da invenção contém seis regiões de determinação complementar (CDRs) que contribuem em graus variáveis para a afinidade do local de ligação para o antígeno. Existem três domínios variáveis de cadeia pesada CDRs (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e três domínios variáveis de cadeia leve CDRs (CDRL1, CDRL2 e CDRL3). A extensão do CDR e regiões estruturais (FRs) é determinada por comparação com uma base de dados compilada das sequências de aminoácidos em que essas regiões foram definidas de acordo com a variabilidade astre as sequências.

[0070] Os anticorpos da invenção compreendem regiões constantes de imunoglobulina derivadas de origem humana de uma ou mais classes de imunoglobulina, em que essas classes de imunoglobulina incluem as classes IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE e, no caso de IgG e IgA, suas subclasses, especialmente IgG1 and IgG4..

[0071] Da forma que são utilizados neste contexto, os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal” referem-se a uma preparação das moleculas de anticorpo de uma composição única de aminoácido.

[0072] O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo que compreende uma região variável, ou seja, região de ligação, a partir de uma fonte ou espécie e pelo menos uma parte de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, usualmente preparada por meio de técnicas de DNA recombinantes. São preferidos os anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável de murídeo e uma região constante humana. Outras formas preferidas de "anticorpos quiméricos" abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi modificada ou alterada a partir daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente com relação à ligação de C1q e / ou ligação de receptor de Fc (FcR). Esses anticorpos quiméricos também são referidos como "anticorpos de classe comutada". Os anticorpos quiméricos são o produto de genes de imunoglobulina expressos que compreendem segmentos de DNA que codificam segmentos de regiões de imunoglobulina variáveis e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina. Métodos para produzir anticorpos quiméricos que envolvem técnicas de trensfecção de DNA e de genes recombinantes convencionais são amplamente conhecidas no campo da técnica. Vide, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238 e US 5.204.244.

[0073] O termo "anticorpo humanizado" refere-se aos anticorpos em que a estrutura ou "regiões de determinação de complementaridade" (CDR) foram modificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especificodade diferente em comparação com aquela da imunoglonulina de origem. De acordo com uma concretização preferida, uma CDR de murídeo é enxertada dentro da região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o " anticorpo humanizado". Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268270. CDRs particularmente preferidas correspondem àquelas que representam sequências que reconhecem os antígenos indicados anteriormente para os anticorpos quiméricos. Outras formas de "anticorpos humanizados" abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi modificada ou alterada adicionalmente a partir daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação de C1q e / ou ligação de receptor de Fc (FcR).

[0074] O termo "anticorpo humano", da forma que é utilizado neste contexto, destina-se a incluir anticorpos que são dotados de regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha de germes humanos. Os anticorpos humanos são amplamente conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, quando da imunização, de produzir um repertório pleno ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A transferência da matriz de genes de imunoglobulina da linha de germs humanos nesses camundongos mutantes de linha de germes resultará na produção de anticorpos humanos na esrimulação de antígenos (vide, por exemplo, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581597). As técnicas de Cole, A., et al. and Boerner, P., et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole, A., et al., Monoclonal Anticorpos and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 8695). Tal como já foi mencionado para os anticorpos quiméricos e humanizados de acordo com a invenção o termo “anticorpo humano” da forma que é utilizado neste contexto também compreende os anticorpos que são modificados na região constante para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente com relação a ligação de C1q e / ou ligação de FcR, por exemplo, por meio de “comutação de classe” ou seja, mudança ou mutação de partes Fc (por exemplo, a partir de IgG1 até IgG4 e / ou mutação de IgG1/IgG4).

[0075] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo " anticorpo recombinante", destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira tais como uma célula NS0 ou CHO ou a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana ou anticorpos que são expressos utilizando-se um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Esses anticorpos recombinantes são dotados de regiões variáveis e constantes em uma forma reordenada. Os anticorpos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, muito embora derivadas de sequências VH e VL de linhas de germes humanas e relacionadas com as mesmas, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhas de germes de anticorpos humanos in vivo.

[0076] O "domínio variável" (domínio variável de uma cadeia leve (VL), domínio variável de uma cadeia pesada (VH) da forma que é utilizado neste contexto significa cada uma do par de cadeias leve e pesada que se acha envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. O domínio das cadeias leve e pesada humanas variáveis é dotado da mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estruturas (FR) cujas sequências são amplamente conservadas, conectadas por meio de três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação de condição complementar, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de folha β-e as CDRs podem formar laços que conectam a estrutura de folha β. As CDR em cada cadeia são mantidas na sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam em conjunto com as CDR provenientes da outra cadeia o local de ligação de antígeno. As regiões de CDR3 de cadeia leve e pesada de anticorpo desempenham uma função particularmente importante na binding especificidade /afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e por essa razão proporcionam outro objetivo da invenção.

[0077] Os termos "região hipervariável" ou "parte de ligação de antígeno de um anticorpo" quando usados neste contexto referem-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos provenientes das regiões de determinação "complementares" ou "CDRs". Regiões de "estrutura" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável tais como definidos anteriormente neste contexto. Por essa razão, as cadeias leve e pesada de um anticorpo compreendem términos desde N- até C- dos domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. CDRs em cada cadeia são separados por esses aminoácidos de estrutura, CDR3 de uma cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação de antígenos. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991).

[0078] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “ligação” ou “especificamente ligação” refere-se à ligação do anticorpo a um epítope do antígeno (seja VEGF humano ou ANG-2 humano) em um ensaio in vitro, de preferência em um ensaio de ressonância plasmônica (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden, com antígeno do tipo natural purificado. A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante de taxa para a associação do anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno), kD (constante de dissociação), e KD (kD/ka). De acordo com uma concretização ligação ou especificamente ligação significa uma afinidade de ligação (KD) de 10-8 mol/l ou memos, de acordo com uma concretização 10-9 M até 10-13 mol/l.

[0079] O termo "epitope" inclui qualquer determinante de polipeptídeo capaz de ligação específica a um anticorpo. De acordo com determinadas concretizações, a determinante de epítope inclui agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforila, ou sulfonila, e, de acordo com determinadas concretizações, pode ser dotada de características estruturais tridimensionais específicas, e ou características de carga específicas. Um epitope é uma região de um antígeno que está ligada por um anticorpo.

[0080] De acordo com determinadas concretizações, diz-se que um anticorpo liga-se especificamente a um antígeno quando ele preferencialmente reconhece o seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e / ou macromoleculas.

[0081] O termo “anticorpo de comprimento pleno” significa um anticorpo que consiste de “duas cadeias pesadas de anticorpo de comprimento pleno” e duas “cadeias leves de anticorpo de comprimento pleno”. Uma “cadeia pesada de anticorpo de comprimento pleno” é um polipeptídeo que consiste na direção do terminal N para o terminal C-de um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH), um domínio 1 constante de cadeia pesada de anticorpo 1 (CH1), uma região de articulação de anticorpo (HR), um domínio 2 constante de cadeia pesada de anticorpo (CH2), e um domínio 3 constante de cadeia pesada de anticorpo (CH3), abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3; e opcionalmente um domínio 4 constante de cadeia pesada de anticorpo (CH4) no caso de um anticorpo da subclasse IgE. De preferência, a “cadeia pesada de anticorpo de comprimento pleno” é um polipeptídeo que consiste na direção do terminal N para o terminal C de VH, CH1, HR, CH2 e CH3. Uma “cadeia leve de anticorpo de comprimento pleno” é um polipeptídeo que consiste na direção do terminal N para o terminal C de um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), e um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL), abreviado como VL-CL. O domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) pode ser K (kapa) ou À (lambda) . As duas cadeias de anticorpo de comprimento pleno são ligadas em conjunto por meio de ligação de dissulfuretos inter-polipeptídeo entre o domínio CL e o domínio CH1 e entre as regiões de articulação de the full length anticorpo cadeia pesadas. Exemplos típicos de anticorpos de comprimento pleno são os anticorpos naturaos tais como IgG (por exemplo, IgG 1 e IgG2), IgM, IgA, IgD, e IgE. Os anticorpos de comprimento pleno de acordo com a invenção podem ser a partir de uma única espécie, por exemplo, humana, ou eles podem ser anticorpos quimerizados ou humanizados. Os anticorpos de comprimento pleno de acordo com a invenção compreendem dois locais de ligação de antígenos cada um deles formado por um par de VH e VL, os quais ligam-se os dois especificamente ao mesmo antigeno. O término C da cadeia pesada ou leve do dito anticorpo de comprimento pleno significa o último aminoácido no término C da dita cadeia pesada ou leve. O término N da cadeia pesada ou leve do dito anticorpo de comprimento pleno significa o último aminoácido no término N da dita cadeia peada ou leve.

[0082] Da forma que é utilizado dentro da invenção, o termo “peptídeo de ligação” significa um peptídeo com sequências de aminoácidos, que é de preferência de origem sintética. Estes peptídeos de acordo com a invenção são usados para conectar o término C de uma cadeia leve ao término N da cadeia pesada do segundo anticorpo de comprimento pleno (que especificamente se liga ao segundo antígeno) por meio de via a peptide linker. O ligante de peptídeo dentro da segunda cadeia pesada e leve de anticorpo de comprimento pleno é um peptídeo com uma sequência de aminoácidos com um comprimento de pelo menos 30 aminoácidos, de preferência com um comprimento de 32 até 50 aminoácidos. De acordo com uma concretização o ligante de peptídeo é um peptídeo com uma sequência de aminoácidos com um comprimento de 32 até 40 aminoácidos. De acordo com uma concretização o dito ligante é (GxS)n com G = glicina, S = serina, (x =3, n= 8, 9 ou 10 e m= 0, 1, 2 ou 3) ou (x = 4 e n= 6, 7 ou 8 e m= 0, 1, 2 ou 3), de preferência com x = 4, n= 6 ou 7 e m= 0, 1, 2 ou 3, com maior preferência com x = 4, n= 7 e m= 2. De acordo com uma concretização o dito ligante é (G4S)6G2.

[0083] O termo “região constante” da forma que é usado neste contexto, dentro do pedido atual, significa a soma dos domínios de um anticorpo que não seja a região variável. A região constante não está envolvida diretamente na ligação de um antígeno, mas exibe várias funções de execução. Na dependência da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e algumas destas podem ser ainda divididas em subclasses, tais como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamadas α, δ, ε, y e μ, respectivamente. As regiões constantes de cadeia leve que podem ser encontradas em todas as cinco classes de anticorpos são chamadas K (kapa) e X (lambda).

[0084] Os termos “região constante derivada de origem humana” ou “região constante humana” tais como são usadas no presente pedido significan a região de cadeia pesada constante de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 e / ou uma região kapa ou lambda de cadeia leve constante. Essas regiões constantes são amplamente conhecidas no estado da técnica e, por exemplo, descritas por Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) (vide, também, por exemplo, Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788). Dentro do pedido para a numeração das posições e mutações o sistema de numeração EU (Index EU) de acordo com Kabat, E.A., et al., Sequences de Proteins de Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) é usado e referenciado como “numeração de acordo com o Index EU de Kabat”.

[0085] De acordo com uma concretização os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são dotados de uma região constante de subclasse de IgG1 humana (derivada da subclasse de IgG1 humana).

[0086] De acordo com uma concretização os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são dotados de uma região constante de subclasse de IgG4 humano (derivado da subclasse de IgG1 humana).

[0087] De acordo com uma concretização o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é da subclasse de IgG1 humana com mutações L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) e P329G (Pro329Gly). Esse anticorpo é dotado de uma ligação de FcR reduzida (especialmente eles não mais mostram qualquer ligação ao FcRgammaI, FcRgamaII e FcRgamaIII). Isto é especialmente útil para reduzir potenciais efeitos colaterais tais como, por exemplo, trombose (Meyer, T., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81). De acordo com uma concretização o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é da subclasse IgG4 humana com mutações S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) e P329G (Pro329Gly). Esses anticorpos mostram ligação de FcR reduzida tal como indicado anteriormente. Muito embora a mutação Pro329Ala já descrita remova apenas dois terços da interação sanduíche de FcgamaRIIIa, a Pro329Gly nos anticorpos de acordo com a invenção transmitem plenamente a ligação da parte Fc ao FcgamaRIII. Isto é especialmente útil uma vez que a ligação ao FcgammaRIII está envolvida na ADCC (toxicidade celular dependente de anticorpo) que conduz à morte celular, o que pode ser de utilidade no tratamento de doenças cancerosas, mas que pode causar sérios efeitos colaterais no tratamento baseado em anticorpos de outras enfermidades vasculares ou imunológicas. Desta forma, os anticorpos de acordo com a invenção da subclasse IgG1 com mutações L234A, L235A e P329G e subclasse IgG4 com mutações S228P, L235E e P329G são especialmente úteis, uma vez que eles dois não mostram nenhuma ligação mais aos FcRgamaI, FcRgamaII e FcRgamaIII.

[0088] Da forma que é utilizado neste contexto o termo “com (as) mutações AAA” refere-se às mutações I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala), e H435A (His435Ala) na região de cadeia pesada constante de IgG1 ou IgG4, em que a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat.

[0089] Da forma que é utilizado neste contexto o termo “com (as) mutações P329G LALA” refere-se às mutações L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) e P329G (Pro329Gly) na região de cadeia pesada constante da subclasse IgG1, em que a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat. Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “com (as) mutações SPLE” refere-se ao S228P (Ser228Pro) e L235E (Leu235Glu) a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4, em que a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat. Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “com (as) mutações SPLE e P239G” refere-se ao S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) e P329G (Pro329Gly) a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4, em que a numeração é de acordo com o Index EU de Kabat.

[0090] O anticorpo de acordo com a invenção é produzidos por meios recombinantes. Deste modo, um aspectio da presente invenção é compreendido por um ácido nucléico que codifica o anticorpo de acordo com a invenção e outro aspecto é compreendido por uma célula que compreende o dito ácido nucléico que codifica um anticorpo de acordo com a invenção. Métodos para produção recombinante são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreenden a expressão de proteína em células procarióticas e eucarióticas com isolamento subsequente do anticorpo e de forma usual purificação para uma pureza farmaceuticamente aceita. Para a expressão dos anticorpos na forma de como mencionado anteriormente em uma célula hospedeira, ácidos nucléicos que codificam as respectivas cadeias leve e pesada são inseridos dentro dos vetores de expressão por meio de métodos padrão. A espressão é realizada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas tais como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levedura, ou células E.coli, e o anticorpo é recuperado a partir das células (subrenadante ou células depois da lise). Métodos gerais para a produção recombinante de anticorpos são amplamente conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, nos artigos de revista de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

[0091] Por essa razão, uma concretização da invenção é compreendido por um método para a preparação de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, que compreende as etapas de a) transformar a célula hospedeira com vetores que compreendem moléculas de ácido nucléico que codificam o dito anticorpo; b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a síntese da dita molécula de anticorpo; e c) recuperar a dita molécula de anticorpo a partir da dita cultura.

[0092] De acordo com uma concretização a etapa de recuperação sob c) inclui o uso de um reagente de captura específico de domínio constante de cadeia leve (que, por exemplo, é específico para a cadeia leva constante kapa ou lambda, na dependência de se é usada uma cadeia leve kapa ou lambda no anticorpo biespecífico de acordo com a invenção). De acordo com uma concretização este reagente de captura específico de cadeia leva é usado em uma modalidade de ligação e eluição). Exemplos desses reagentes de captura específicos de domínio constante de cadeia leve são, por exemplo, KappaSelect™ e LambdaFabSelectTM a partir da GE Healthcare/BAC, que são baseados em uma matriz de base de agarose altamente rígida que permite altas taxas de fluxo e baixa contrapressão em grande escala. Eles caracterizam um ligante que se liga à região constante da cadeia leve kapa ou lambda, respectivamente (ou seja, fragmentos aos quais falta a região constante de uma cadeia leve não serão ligados; Figura 1). Por essa razão, os dois são capazes de ligação a outras moléculas alvo que contêm a região constante de uma cadeia leve, por exemplo, IgG, IgA e IgM. Os ligantes são presos à matriz por meio de um braço espaçador hidrofílico longo para torná-lo facilmente disponível para a ligação à molécula alvo. Eles são baseados em um fragmento de anticorpo de cadeia única que é selecionado para Ig kapa ou lambda humano.

[0093] Os anticorpos específicos são adequadamente separados a partir do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. O DNA e RNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como uma fonte desse DNA e RNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser inserido dentro dos vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como as células HEK 293, células CHO, ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína de imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

[0094] Variantes de sequências de aminoácidos (ou mutantes) do anticorpo biespecífico são preparadas pela introdução de alterações de nucleotídeos apropriadas dentro do DNA de anticorpo, ou por meio da síntese de nucleotídeos. Essas modificações podem ser realizadas, não obstante,, somente em uma faixa muito limitada. Por exemplo, as modificações não alteram as características de anticorpo mencionadas anteriormente tais como a subclasse IgG e ligação de antígeno, mas podem aperfeiçoar o rendimento da produção recombinante, estabilidade de proteinas ou facilitar a purificação.

[0095] Da forma que é utilizado no presente pedido, o termo “célula hospedeira” significa qualquer espécie de sistema celular que pode ser engendrado para gerar os anticorpos de acordo com a presente invenção. De acordo com uma concretização células HEK293 e células CHO são usadas como as célula hospedeiras. Da forma que é utilizado neste contexto, as expressões “célula”, “linha de células” e “cultura de células” são usadas indistintamente e todas essas designações incluem a descendência. Deste modo, as palavras “transformantes” e “células transformadas” incluem a célula em apreço principal e culturas derivadas da mesma sem levar em conta o número de transferências. Deve ser igualmente compreendido que toda a descendência pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou involuntárias. Estão incluídas progênies variantes que têm a mesma função ou atividade biológica tal como rastreadas na célula originalmente transformada.

[0096] A expressão em células NS0 encontra-se descrita, por exemplo, por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transitória encontra-se descrita, por exemplo, por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis encontra-se descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; e Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 7787. Um sistema de expressão transitória preferido (HEK 293) encontra-se descrito por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 e by Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191199.

[0097] As sequências de controle que são adequadas para procariotes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador, e um local de ligação de ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, melhoradores e sinais de poliadenilação.

[0098] Um ácido nucléico é “ligado operacionalmente” quando ele é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucléico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequencia ou líder de secreção é ligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se ele for posicionado de forma tal a facilitar a tradução. De uma maneira geral, “ligado operacionalmente” significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em enquadramento de leitura. Não obstante, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Se esses locais não existirem, os adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[0099] A purificação de anticorpos é realizada a fim de eliminar componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos celulares ou proteínas, por meio de técnicas padrão, que incluem tratamento alcalino / SDS, bandagem de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose, e outras amplamente conhecidas no campo da técnica. Vide Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Diferentes métodos são amplamente estabelecidos e e de utilização generalizada para a purificação de proteínas, tais como cromatografia de afinidade com proteínas microbianas (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou proteína G), cromatografia de permuta iónica (por exemplo, permute de cátions (resinas de carboximetila), permuta de ânions (resinas amino etílicas) e permuta de modalidade mista), adsorção tiofílica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol e outros ligantes de SH), interação hidrofóbica ou cromatografia de adsorção aromática (por exemplo, com fenil sefarose, resinas aza- arenofílicas, ou ácido m-aminofenilborônico), metal chelate cromatografia de afinidade de quelato de metal (por exemplo, com Ni(II)-e material de afinidade de Cu (II)), cromatografia de exclusão de dimensão, e métodos electroforéticos (tais como eletroforese de gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

[00100] Os anticorpos bivalentes, biespecíficos, de acordo com a invenção exibem benefícios para pacientes humanos com necessidade de uma terapia visando VEGF e ANG-2.

[00101] O biespecífico bivalente contra o VEGF humano e Ang-2 humano de acordo com a presente invenção pode ter um perfil de eficácia / segurança valioso e pode proporcionar benefícios para um paciente com necessidade de uma terapia anti-VEGF e anti-ANG-2.

[00102] Um aspecto da invenção é compreendido por uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com a invenção. Outro aspecto da invenção é compreendido pelo uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a manufatura de uma composição farmacêutica. Outro aspecto da invenção é compreendido por um método para a manufatura de uma composição farmacêutica que que compreende um anticorpo de acordo com a invenção. De acordo com outro aspecto, a present invention proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um anticorpo de acordo com a presente invenção, formulada em conjunto com um carreador farmacêutico.

[00103] Da forma que é utilizado neste contexto, “carreador farmacêutico” inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes istônicos e de retardamento de absorção, e assemelhados que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o carreador é adequado para a administração ao paciente por meio de uma rota local. Por exemplo, o anticorpo ou sua composição pode ser administrada ao paciente por meio de aplicação intraocular, por exemplo, por meio de injeção intraocular, tal como injeção intravítrea. Esta pode ser realizada de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; and Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

[00104] A composição da presente invenção pode ser administrada por meio de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pela pessoa versada na técnica, o caminho e / ou modalidade de administração serão variáveis de acordo com os resultados desejados. Para se administrar um composto da invenção por meio de algumas vias de administração, poderá ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir a sua desativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um paciente em um carreador apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. Os carreadores farmacêuticos incluem soluções ou disperses aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injetáveis. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

[00105] Muit as modalidades possíveis de distribuição podem ser usadas, incluindo, sendo que não se fica limitado às mesmas aplicação intraocular ou aplicação tópica. De acordo com uma concretização a aplicação é intraocular e inclui, sendo que não se fica limitado às mesmas, injeção subconjuntival, injeção intracanieral, injeção dentro da câmara anterior por meio do limbo temporal into the anterior chamber através do limbo temporal, injeção intra-estromal, injeção intracorneana, injeção subretinal, injeção de humor aquosa, injeção subtenoniana ou dispositivo de distribuição sustentada, injeção intravítrea (por exemplo, injeção vitreal frontal, média ou traseira). De acordo com uma concretização a aplicação é tópica e inclui, sendo que não se fica limitado às mesmas gotas para os olhos para a córnea.

[00106] De acordo com uma concretização o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrada por meio de aplicação intravítrea, por exemplo, por meio de injeção intravítrea. Isto pode ser realizado de acordo com procedimentos padrão que são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis- Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; and Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

[00107] De acordo com algumas concretizações, kits terapêuticos da invenção podem conter uma ou mais doses de um anticorpo biespecífico presente em uma composição farmacêutica descrita neste contexto, um dispositivo adequado para injeção intravitrea da composição farmacêutica, e uma instrução detalhando assuntos e protocolos adequados para a realização da injeção. Nestas concretizações, as composições são administradas tipicamente ao paciente com necessidade do tratamento por meio de injeção intravítrea. Isto pode ser realizado De acordo com procedimentos padrão que são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; and Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

[00108] As composições também podem conter adjuvantes tais como preservativos, agentes de umedecimento, agentes emulsionadores e agentes de dispersão. A preservação quanto à presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por meio de procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e assemelhados. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e assemelhados dentro das composições. Além disso, absorção prolongada da forma farmaceuticamente injetável poderá ser proporcionada por meio da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monostearato de alumínio e gelatina.

[00109] Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada, e / ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por meio de métodos convencionais que são conhecidos das pessoas versadas na técnica.

[00110] Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de maneira a obter-se uma quantidade do ingrediente ativo que é efetiva para se conseguir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modaludade de administração em particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado será dependente de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção que são empregadas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto específico que está sendo empregado, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e / ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, da idade, sexo, peso, condição, estado de saúde geral e histórico médico anterior do paciente que está sendo tratado, e de fatores assemelhados amplamente conhecidos no estado da técnica.

[00111] A composição deve ser estéril e fluida na extensão em que a composição é suscetível de aplicação por meio de seringa. Além de água, o carreador de preferência é compreendido por uma solução salina tamponada isotônica.

[00112] A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, por meio do uso de revestimento tal como lecitina, pela manutenção da dimensão de partícula requerida no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensioativos. Em muitos casos é preferível incluirem-se agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição.

[00113] A composição pode compreender uma formulação de depósito oftálmica que compreende um agente ativo para administração subconjuntiva. A formulação de depósito oftálmica compreende micropartículas de agente ativo essencialmente puro, por exemplo, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção. As micropartículas que compreendem o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção podem ser incorporadas em um polímero biocompatível farmaceuticamente aceitável ou um agente encapsulante lipídico. As dormulações de depósito podem ser adaptadas para liberar todo ou parcialmente todo o material ativo durante um período de tempo prolongado. O polímero ou matriz de lípides, se presente, pode ser adaptado para se degrader suficientemente para ser transportado a partir do local de administração depois da liberação de todo ou substancialmente todo o agente ativo. A formulação de depósito pode ser uma formulação líquida, que compreende um polímero farmaceuticamente aceitável e um agente ativo dissolvido ou disperso. Quando da injeção, o polímero forma um depósito no local das injeções, por exemplo, por gelificação ou precipitação.

[00114] Out ro aspecto da invenção é compreendido pelo anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para o uso no tratamento de enfermidades vasculares oculares.

[00115] Uma concretização da invenção é compreendida pelo anticorpo biespecífico de acordo com a invenção para o uso no tratamento de enfermidades vasculares oculares.

[00116] Out ro aspecto da invenção é compreendido pela dita composição farmacêutica para o uso no tratamento de enfermidades vasculares oculares.

[00117] Out ro aspecto da invenção é compreendido pelo uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a manufatura de um medicamento para o tratamento de uma enfermidade vascular ocular.

[00118] Out ro aspecto da invenção é compreendido pelo método de tratamento de pacientes que sofrem de enfermidades vasculares oculares pela administração de um anticorpo de acordo com a invenção a um paciente com necessidade desse tratamento.

[00119] Os termos “enfermidade vascular ocular” e “doença ocular vascular” são usados de forma intercambiável neste contexto e incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos síndromes neovasculares intraoculares, tais como retinopatia diabética, edema macular diabético, retinopatia de prematuridade, glaucoma neovascular, oclusões das veias da retina, oclusões da veia central da retina, degeneração macular, degeneração macular relacionada com a idade, retinite pigmentosa, proliferação angiomatosa retinal, telangectasia macular, retinopatia isquêmica, neovascularização da iris, neovascularização intraocular, neovascularização da córnea, neovascularização da retina, neovascularização coroidal, e degeneração da retina. (Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology de ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710). Da forma que é utilizado neste contexto, distúrbio vascular ocular refere-se a quaisquer condições patológicas caracterizadas por proliferação alterada ou desregulada e invasão de novos vasos sanguíneos dentro das estruturas dos tecidos oculares, tais como a retina ou córnea. De acordo com uma concretização a enfermidade vascular ocular é selecionada a partir do grupo que consiste de: degeneração macular úmida relacionada com a idade (AMD úmida), degeneração macular seca relacionada com a idade (AMD seca), edema macular diabético (DME), edema macular cistóide (CME), retinopatia diabética não-proliferante (NPDR), retinopatia diabética proliferante (PDR), edema macular cistóide, vasculite (por exemplo, oclusão da veia retinal central), papilo edema, retinite, conjuntivite, uveíte, coroidite, coroidite multifocal, histoplasmose ocular, blefarite, olho seco (doença de Sjogren) e outras enfermidades oftálmicas em que a enfermidade ou doença ocular está associada com neovascularização ocular, derrame vascular, e / ou edema retinal. Deste modo, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são de utilidade na prevenção e tratamento de AMD úmida, AMD seca, CME, DME, NPDR, PDR, blefarite, olho seco e uveíte, também de preferência AMD úmida, AMD seca, blefarite, e olho seco, também de preferência CME, DME, NPDR e PDR, também de preferência blefarite, e olho seco, em particular AMD únida e AMD seca, e também com particularidade AMD úmida. De acordo com algumas concretizações, a enfermidade ocular é selecionada a partir do grupo que consiste de degenração macular úmida relacionada com a idade (AMD úmida), edema macular, oclusões da veia da retina, retinopatia da prematuridade, e retinopatia diabética.

[00120] Out ras enfermidades associadas com neovascularização corneana incluem, sendo que não se fica limitado às mesmas, ceratoconjuntivite epidêmica, deficiência de Vitamina A, utilização excessiva de lentes de contato, ceratite atópica, ceratite límbica superior, ceratite seca do pterígio, sjogrens, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por micobactérias, degeneração lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecções 'por Herpes simplex, infecções por Herpes zoster, infecções por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, queratólise marginal, artrite reumatóide, lúpus sistêmico, poliarterite, trauma, sarcoidose de Wegeners, esclerite, doença de Steven Johnson, ceratotomia radial perifigóide, e rejeição de enxerto da córnea.

[00121] Enfermidades associadas com neovascularização de retina / coróide incluem, sendo que não se fica limitado às mesmas, retinopatia diabética, degeneração macular, anemia falciforme, sarcoidose, sifilis, pseudoxantoma elástico, doença de Paget, oclusão das veias, oclusão das artérias, doença obstrutiva da carótida, uveite / vitrite crônica, infecções micobacterianas, doença de Lyme, eritematose de lúpus sist}emica, retinopatia de prematuridade, retinite pigmentosa, edema da retina (que inclui edema macular), doença de Eales, doença de Bechet, infecções causadoras de uma retinite ou coroidite, histoplasmose ocular presumida, doença de Best, miopia, poços ópticos, doença de Stargart, planitis pars, descolamento de retina crônico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós- laser. Outras enfermidades incluem, sendo que não se fica limitado às mesmas, enfermidades associadas com rubeose (neovascularização do ângulo) e enfermidades causadas pela proliferação anormal de tecido fibrovascular ou fibrosos que inclui todas as formas de vitreo retinopatia proliferante.

[00122] A retinopatia de prematuridade (ROP) é uma enfermidade ocular que afeta bebês nascidos prematuramente. Imagina-se ser causada por crescimento desordenado de vasos sanguíneos da retina que pode resultar em em cicatrizes e descolamento de retina. A ROP pode ser leve e pode resolver-se espontaneamente, mas pode conduzir à cegueira nos casos graves. Dessa forma, todos os bebês prematuros estão em risco de ROP, e peso muito baixo ao nascer é um fator de risco adicional. Tanto a toxicidade do oxigênio quanto a hipóxia relativa pode contribuir para o desenvolvimento da ROP.

[00123] A degeneração macular é uma condição médica predominantemente encontrada em adultos idosos em que o centro do revestimento interno do olho, conhecido como área da mácula da retina, sofre afinamento, atrofia e, em alguns casos, sangramento. Isto pode resultar na perda de visão central, que implica uma incapacidade para ver detalhes finos, para ler, ou para reconhecer rostos. De acordo com a American Academy de Ophthalmology, é a principal causa de perda da visão central (cegueira) nos Estados Unidos atualmente para aqueles com a idade superior a cinquenta anos. Muito embora algumas distrofias maculares que afetam os indivíduos mais jovens sejam por vezes referidas como degeneração macular, o termo de uma maneira geral refere-se à degenração macular relacionada com a idade (AMD ou ARMD).

[00124] A degenração macular relacionada com a idade começa com depósitos amarelos característicos na mácula (área central da retina que proporciona a visão central detalhada, chamada fóvea) chamados drusas entre o epitélio pigmentar da retina e a coróide subjacente. A maior parte das pessoas com estas mudanças precoces (referidas como maculopatia relacionada com a idade) são dotadas de boa visão. As pessoas com drusas podem vir a desenvolver AMD avançado. O risco é conxideravelmente mais alto quando as drusas são maiores e numerosas e associadas com perturbação na camada de células pigmentadas sob a mácula. As drusas grandes e macias estão relacionadas com depósitos de colesterol elevados e podem responder aos agentes de diminuição de colesterol (hipolipemiantes) ou Procedimento de Rheo.

[00125] A AMD avançada, que é responsável por perda da visão profunda, tem duas formas: seca e úmida. A atrofia geográfica central, a forma seca da AMD avançada, resulta da atrofia para a camada epitelial de pigmento da retina abaixo da retina, que provoca a perda de visão através da perda de fotoreceptores (hastes e cones) na parte central do olho. Muito embora nenhum tratamento esteja disponível para esta condição, suplementos vitamínicos com altas doses de antioxidantes, luteina e zeaxantina, demonstraram pelo National Eye Institute e outros retardar a progressão da degeneração macular seca e em alguns pacientes, melhorar a acuidade visual.

[00126] A retinite pigmentosa (RP) é um grupo de condições oculares genéticas. Na progressão dos sintomas para a RP, a cegueira noturna geralmente precede a visão de túnel por anos ou mesmo décadas. Muitas pessoas com RP não se tornam legalmente cego até os seus 40 ou 50 anos e retêm alguma visão toda a sua vida. Outras ficam completamente cegas a partir da RP, em alguns casos, já em infância. A progressão da RP é diferente em cada caso. A RP é um tipo de distrofia retinal hereditária, um grupo de distúrbios hereditários em que anormalidades dos fotorreceptores (hastes e cones) ou o epitélio pigmentar de retina (RPE) da retina conduzem a uma perda progressiva da visão. Os indivíduos afetados primeiro experimentam adaptação defeituosa ao escuro ou nictalopia (cegueira noturna), seguida por redução do campo visual periférico (conhecida como visão de túnel) e, algumas vezes, perda da visão central mais tarde no decorrer da enfermidade.

[00127] O edema macular ocorre quando depósitos de fluido e proteína são coletados na ou sob a mácula do olho, uma área central amarela da retina, fazendo-a engrossar e inchar. A inchação pode distorcer a visão central da pessoa, uma vez que a mácula está próxima do centro da retina, na parte de trás do globo ocular. Esta área possui cones hermeticamente embalados que fornecem nítida visão central, límpida para permitir que uma pessoa veja forma, cor, e detalhes que ficam diretamente na linha de visão. O edema macular cistóide é um tipo de edema macular que inclui a formação de cistos.

[00128] Terapias de Combinação: De acordo com determinadas concretizações o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrado isoladamente (sem um agente terapêutico adicional) para o tratamento de uma ou mais enfermidades vasculares oculares descritas neste contexto.

[00129] De acordo com outras concretizações o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrado em combinação com um ou mais agentes ou métodos terapêuticos adicionais para o tratamento de uma ou mais enfermidades vasculares oculares descritas neste contexto.

[00130] De acordo com outras concretizações, o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é formulada em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais e administrada para o tratamento de uma ou mais enfermidades vasculares oculares descritas neste contexto.

[00131] De acordo com determinadas concretizações, os tratamentos de combinação proporcionados neste contexto incluem a administração do anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção que é administrado sucessivamente com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para o tratamento de uma ou mais enfermidades vasculares oculares descritas neste contexto.

[00132] Os agentes terapêuticos adicionais incluem, sendo que não se fica limitado aos mesmos, Tryptophanyl-tRNA sintetase (TrpRS), EyeOOl (Anti-VEGF Pegylated Aptamer), esqualamina, RETAANE(TM) (acetato de anecortave para suspensão de depósito; Alcon, Inc.), Combretastatin A4 Prodrug (CA4P), MACUGEN(TM), MIFEPREX(TM) (mifepristona-ru486), acetonida subtenoniana triancinolona, acetonida triamcinolona cristaina intravítrea, Prinomastat (AG3340- inhibitor sintético de metaloproteinase de matriz, Pfizer), acetonida de fluocinolona (incluindo implante intraocular de fluocinolona, Bausch & Lomb/Control Delivery Systems), inibidores de VEGFR (Sugen), VEGF-Trap (Regeneron/Aventis), Inibidores da tirosina quinase do receptor de VEGF tais como 4-(4-bromo- 2-fluoroanilino)-6- metoxi-7-(l-metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474), 4-(4-fIuoro-2-metilindol-5- iloxi)-6-metoxi-7-(3- pyrrolidin- 1 -ilpropoxi)quinazolina (AZD2171), vatalanib (PTK787) e SU1 1248 (sunitinib), linomida, e inibidores de integrina de função v.beta.3 e angiostatina.

[00133] Outras terapias farmacêuticas que podem ser usadas em combinação com o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção é administrado, incluem, sendo que não se fica limitado às mesmas, VISUDYNE(TM) com o uso de um laser não térmico, PKC 412, Endovion (NeuroSearch A/S), fatores neurotróficos, que incluem a título de exemplo Glial Derived Neurotrophic Factor e Ciliary Neurotrophic Factor, diatazem, dorzolamida, Phototrop, 9-cis-retinal, medicação ocular (incluindo Echo Therapy) que inclui iodeto de fosfolina ou ecotiofato ou inibidores de anidrase carbônica, AE-941 (AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (Sima Therapeutics, Inc.), pegaptanib (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), neurotrofinas (incluindo, apenas a título de exemplo, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), antagonistas de integrina (incluindo aqueles provenientes da Jerini AG e Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), talidomida (tal como usada, por exemplo,pela EntreMed, Inc.), cardiotrofina-1 (Genentech), 2-metoxiestradiol (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), tetratiomolibdato (University de Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), composto de microalgas (Aquasearch/ Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group pic), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF- beta 2 (Genzyme/Celtrix), inibidores de tirosina-cinase (Allergan, SUGEN, Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), neuroprotetores ganglionares da retina celular (Cogent Neurosciences), derivados de N- nitropirazol (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), ciclosporin A, Timited retinal translocation", terapia fotodinâmica, (incluindo, somente a título de exemplo, PDT- alvejado receptor, Bristol-Myers Squibb, Co.; porfímero de sódio para injeção com PDT; verteporfin, QLT Inc.; rostaporfin com PDT, Miravent Medical Technologies; talaporfin de sódio com PDT, Nippon Petroleum; motexafin lutetium, Pharmacyclics, Inc.), oligonucleotídeos anti- sentido (incluindo, a título de exemplo, produtos testados pela Novagali Pharma SA e ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), fotocoagulação com laser, aplicação de laser em drusas, cirurgia do buraco macular, cirurgia de translocação macular, telescópios em miniatura implantáveis, Angiografia Phi-Motion (também conhecida como Terapia de Micro-Laser e Tratamento de Vessel Feeder), terapia de feixe de Proton, terapia de microestimulação, descolamento de retina e vítreo cirurgia, curvatura esclerótica, cirurgia submacular, termoterapia transpupilar, terapia de Photosystem I, uso de interferência de RNA (RNAi), reoferese extracorpórea (também conhecida como filtração diferencial de membrana e Reoterapia), implante de microplaqueta, terapia com células estaminais, terapia de substituição de genes, terapia do gene de ribozima (incluindo terapia de genes para elemento de resposta de hipoxia, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; PDEF gene therapy, GenVec), transplante de células fotorreceptoras / retinais (incluindo células epiteliais da retina transplantáveis, Diacrin, Inc.; retinal cell transplant, Cell Genesys, Inc.), e acupuntura.

[00134] Qualquer agente anti-angiogênico pode ser usado em combinação com o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção, incluindo, sendo que não se fica limitado aos mesmos, aqueles listados por Carmeliet and Jain, 2000, Nature 407:249-257. De acordo com determinadas concretizações, o agente anti-angiogênico é compreendido por outro antagonista de VEGF ou um antagonista ao receptor de VEGF, tais como variantes de VEGF, fragmentos receptores de VEGF solúvel, aptâmeros capazes de bloquearem VEGF ou VEGFR, anticorpos de neutralização de- VEGFR, inibidores de baixo peso molecular de tirosina-quinases de VEGFR e quaisquer combinações dos mesmos e estes incluem aptâmeros anti- VEGF (por exemplo, Pegaptanib), receptores de engodo recombinantes solúveis (por exemplo, VEGF Trap). De acordo com determinadas concretizações, o agente anti-angiogênico inclui corticosteróides, esteróides angioestáticos, acetato de anecortave, angiostatina, endostatina, expressão decrescente de RNA's de pequena interferência de ligante de VEGFR ou VEGF, pós-VEGFR bloqueio com inibidores de tirosina-quinase, inibidores de MMP, IGFBP3, bloqueadores de SDF-1, PEDF, gama-secretase, ligante 4 semelhante a Delta, antagonistas de integrina, bloqueio alfa HIF-1, bloqueio CK2 quinase de proteína, e inibição de células- tronco (ou seja, células progenitoras endoteliais) direcionados para o local da neovascularização utilizando- se caderina vascular endotelial (CD-144) e anticorpos de fator derivado do estroma (SDF)-I. Também podem ser usados inibidores de RTK de pequenas moléculas visando os receptores de VEGF incluindo PTK787. Também pode ser utilizados agentes que têm atividade contra neovascularização que não são necessariamente compostos anti-VEGF e incluem fármacos anti-inflamatórios, inibidores de-Tor, rapamicina, everolismus, temsirolismus, ciclospone, agentes anti-TNF, agentes anti-complemento, e agentes anti inflamatórios não esteróides. Também podem ser usados os agentes que são neuroprotetores e podem potencialmente reduzir a progressão da degeneração macular seca, tais como a classe de fármacos chamados de 'neuroesteróides. Estes incluem fármacos tais como deidroepiandrosterona(DHEA) (nomes de marcas: Prastera(R) e Fidelin(R)), sulfato de deidroepiandrosterona, e sulfato de pregnenolona. Poderá ser usado qualquer agente terapèutico de AMD (degeneração macular relacionada com a idade) em combinação com o anticorpo biespecífico ou composição farmacêutica de acordo com a invenção, incluindo, sendo que não se fica limitado aos mesmos, verteporfin em combinação com PDT, pegaptanib sódico, zinco, ou um antioxidante(s), isoladamente ou em qualquer combinação.

[00135] Os termos "indivíduo” "paciente" são usados indistintamente e referem-se a mamíferos tais como pacientes humanos e primatas não humanos, da mesma forma que animais experimentais tais como coelhos, ratos, e camundongos, e outros animais. Os animais incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como cachorros, gatos, ovelhas, vacas, porcos, coelhos, galinhas, e assim por diante. Indivíduos preferidos para a prática dos métodos da presente invenção são seres humanos. Indivíduos com necessidade de tratamento incluem pacientes que já sofrem de uma enfermidade ou distúrbio vascular ocular bem como aqueles propensos a desenvolverem o distúrbio.

[00136] Da forma que são utilizadas neste contexto, as expressões "célula", "linha de células", e "cultura de células" são usadas indistintamente e todas essas designações incluem progenitura. Deste modo, as palavras "transformantes " e " células transformadas " incluem a célula objeto principal e culturas derivadas da mesma sem levar em conta o número de transferências. Fica igualmente compreendido que todas a progenitura pode não ser precisamente idêntica no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou acidentais. Progenitura variante que é dotada da mesma função ou atividade biológica tal como pesquisada na célula originalmente transformada está incluída. Onde designações distintas são pretendidas, será claro a partir do contexto.

[00137] Da forma que é utilizado neste contexto, o termo “transformação” refers to process de transfer de a vectors/nucleic acid into a célula hospedeira. Se as células sem barreiras parede celular formidável são usadas como Celulas Hospedeiras, a transfecção é realizada, por exemplo, pelo método de precipitação de fosfato de cálcio tal como se encontra descrito por Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 546-467. Não obstante,, outros métodos para introduzir DNA dentro das células tais como por injeção nuclear ou por fusão de protoplastos também poderão ser usados. Se forem utilizadas células procarióticas ou células que contêm construções de paredes de células substanciais, por exemplo, um método de transfecção é compreendido por tratamento de cálcio utilizando-se cloreto de cálcio tal como descrito por Cohen, S.N., et al., PNAS. 69 (1972) 2110-2114.

[00138] Da forma que é utilizado neste contexto, "expressão" refere-se ao processo por meio do qual um ácido nucléico é transcrito em mRNA e / ou ao processo por meio do qual o mRNA transcrito (também referido como transcrição) está sendo subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas. Os transcritos e os polipeptídeos codificados são referidos coletivamente como o produto de gene. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão em uma célula eucariótica pode incluir emendas do mRNA.

[00139] Um "vetor" é uma molécula de ácido nucléico, em particular auto-replicante, que transfere uma molécula inserida de ácido nucléico dentro e / ou entre células hospedeiras. O termo inclui vetores que funcionam principalmente para a inserção de DNA ou RNA dentro de uma célula (por exemplo, integração cromossômica), replicação de vetores que funcionam principalmente para a replicação de DNA ou RNA, e vetores de expressão que funcionam para a transcrição e / ou tradução do DNA ou RNA. Igualmente incluídos estão os vetores que proporcionam mais do que uma das funções tais como descritas.

[00140] Um "vetor de expressão" é um polinucleotídeo que, quando introduzido dentro de uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em um polipeptídeo. Um “sistema de expressão" usualmente refere-se a uma célula hospedeira adequada compreendida de um vetor de expressão que pode funcionar para produzir um produto de expressão pretendido.

[00141] Os exemplos, listagem de sequências e figuras seguintes são proporcionados para auxiliar na compreensão da presente invenção, cujo escopo real se encontra estabelecido nas reivindicações em anexo. Compreende-se que modificações podem ser realizadas nos procedimentos expostos sem com isso escapar do espírito da invenção. Descrição da Listagem de Sequências (Sequências de aminoácidos)

[00142] A seguir, encontram-se listadas concretizações da Invenção: 1. Um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, em que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO:3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO:5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO:6; e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno especificamente que se liga a ANG-2 compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região CDR2H de, SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 14, e em que iii) o anticorpo biespecífico compreende uma região de cadeia pesada constante de subclasse de IgG1 humana ou IgG4 humana (derivada de origem humana e) que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A (numeração de acordo com o Index EU de Kabat) 2. O anticorpo biespecífico de acordo com a concretização 1, em que i) o dito primeiro local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF compreende como domínio variável de cadeia pesada VH uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e como domínio variável de cadeia leve VL uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e ii) o dito segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente a ANG-2 compreende como domínio variável de cadeia pesada VH uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e como domínio variável de cadeia leve VL uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 3. O anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações 1 até 2, em que a região de cadeia pesada constante sob iii) é da subclasse IgG1 4. O anticorpo biespecífico de acordo com a concretização 3, em que a região de cadeia pesada constante de subclasse IgG1 compreende além disso as mutações L234A , L235A e P329G (numeração de acordo com o Index EU de Kabat) 5. O anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações 1 até 2, em que a região de cadeia pesada constante sob iii) é da subclasse IgG4 6. O anticorpo biespecífico de acordo com a concretização 5, em que a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4 compreende, além disso, as mutações S228P e L235E (numeração de acordo com o Index EU de Kabat) 7. O anticorpo biespecífico de acordo com a concretização 5, em que a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4 compreende além disso as mutações S228P , L235E e P329G (numeração de acordo com o Index EU de Kabat) 8. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das concretizações 1 até 7. 9. O anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações 1 até 7 para o uso no tratamento de enfermidades vasculares oculares. 10. Uso do anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações 1 até 7 para a manufatura de um medicamento para o tratamento de enfermidades vasculares oculares. 11. O anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações 9 ou 10, em que o anticorpo é administrado por meio de aplicação intravítrea. 12. Um método de tratamento de paciente que sofre de enfermidades vasculares oculares pela administração de um anticorpo de acordo com qualquer uma das concretizações1 até 7 a um paciente com necessidade desse tratamento. 13. Um ácido nucléico que codifica um anticorpo biespecífico de acordo com qualquer uma das concretizações1 até 7. 14. Vetor de expressão que contém o dito ácido nucléico de acordo com a concretização 13 capaz de expressar o dito ácido nucléico em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. 15. A célula hospedeira procariótica ou eucariótica que compreende um vetor de acordo com a concretização 14. 16. Um método para a preparação de um anticorpo biespecífico de acordo com as concretizações 1 até 7 que compreende as etapas de a) transformar a célula hospedeira com vetores que compreende a molécula de ácido nucléicos que codifica o dito anticorpo; b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a síntese da dita molécula de anticorpo; e c) recuperar a dita molécula de anticorpo a partir da dita cultura. 17. Um anticorpo biespecífico obtido por meio do método da concretização 16. 18. Um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, de SEQ ID NO: 26, de SEQ ID NO: 27, and de SEQ ID NO: 28. 19. Um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, de SEQ ID NO: 22., de SEQ ID NO: 23., and de SEQ ID NO: 24. 20. Um anticorpo bivalente, biespecífico, que compreende um primeiro local de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo local de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, de SEQ ID NO: 30, de SEQ ID NO: 31, and de SEQ ID NO: 32. Procedimentos Experimentais Tabela 1: Anticorpos biespecificos e suas sequências respectivas

[00143] Po r favor, observe-se que o termo “com (as) mutações de AAA” da forma que é utilizado neste contexto refere-se às mutações I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala), e H435A (His435Ala) na região da cadeia pesada constante de IgG1 ou IgG4 (numeração de acordo com o Index EU de Kabat), o termo “com (as) mutações de P329G LALA” da forma que é utilizado neste contexto refere-se às mutações de L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) e P329G (Pro329Gly) na região de cadeia pesada constante de da subclasse IgG1 (numeração de acordo com o Index EU de Kabat), e o termo “com (as) mutações de SPLE” da forma que é utilizado neste contexto refere-se à S228P (Ser228Pro) e L235E (Leu235Glu) a região de cadeia pesada constante da subclasse IgG4 (numeração de acordo com o Index EU de Kabat).

Exemplos

[00144] Materiais e métodos gerais

[00145] A informação geral referente às sequências de nucleotídeos de cadeias pesada e leve de imunoglobulina humana é encontrada em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminoácidos de cadeias de anticorpos são numeradas e referidas de acordo com a numeração EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

[00146] Técnicas de DNA recombinante

[00147] Métodos convencionais foram usadas para manipular DNA como descrito em Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do favricante.

[00148] Síntese de genes

[00149] Os segmentos de genes d4sejados foram ordenados de acordo com especificações dadas em Geneart (Regensburg, Germany).

[00150] Determinação da sequência de DNA

[00151] As sequências de DNA foram determinadas por meio de seqüenciamento de cadeia dupla realizada em MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) or Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany).

[00152] Análise do DNA e sequência proteica e gerenciamento de dados de sequência

[00153] Utili zou-se o pacote de software GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versão 10.2 e Infomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0 para a criação de sequências, mapeamento, analise, anotação e ilustração.

[00154] Vetores de expressão

[00155] P ara a expressão dos anticorpos descritos, foram aplicadas variantes de plasmídios de expressão para a expressão transitória (por exemplo, em HEK293-F) de células baseadas seja em uma organização de cDNA com ou sem um promotor CMV-Intron A ou em uma organização genômica com um promotor de CMV.

[00156] Além do cassete de expressão de anticorpos os vetores continham: - uma origem de replicação que permite a replicação deste plasmídeo em E. coli, - um gene β-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli., e - O gene da reductase de di-hidrofolato proveniente de Mus musculus como um marcador capaz de ser selecionado em células eucarióticas. - A unidade de transcrição do gene de anticorpo era composto dos seguintes elementos: - local(s) de restrição único na extremidade 5’, - o intensificador e promotor inicial imediato proveniente do citomegalovirus humano, - seguido pela sequência Intron A no caso da organização de cDNA, - uma região 5’-não traduzida de um gene de anticorpo humano, - uma sequência de sinais de cadeia pesada de imunoglobulina, - a cadeia de anticorpos humanos (tipo comum ou com troca de domínio) seja como cDNA ou como organização genêmica com a organização exon-intron de imunoglobulina, - uma região 3’ não traduzida com uma sequência de sinais de poliadenilação, e - local(s) de restrição unico(s) na extremidade 3’.

[00157] Os genes de fusão que compreendem as cadeias de anticorpos tais como descritas adiante foram gerados por meio de PCR e / ou síntese de genes e montados por meio de métodos e técnicas recombinantes conhecidos por conexão de acordo com segmentos de ácido nucléico, por exemplo, utilizando-se locais de restrição únicos nos respectivos vetores. As sequências de ácido nucléico subclonadas foram verificadas por meio de sequenciamento de DNA. Para as transfecções transitórias foram preparadas quantidades maiores dos plasmídeos por meio de preparação de plasmídeos a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

[00158] Técnicas de cultura de células

[00159] Utilizaram-se técnicas de cultura celular padrão tais como se encontram descritas em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

[00160] Os anticorpos bispecificos foram expressos por meio de co-transfecção transitória dos respectivos plesmídeos de expressão em células HEK29-F capazes de crescer em suspensão tal como descrito adiante.

Exemplo 1

[00161] Expressão e Purificação

[00162] Transfecções transitórias no sistema de HEK293-F

[00163] Os anticorpos bispecificos foram gerados por meio de transfecção transitória com os respectivos plasmídeos (por exemplo, codificando a cadeia pesada e a cadeia pesada modificada, bem como a correspondente cadeia leve e modificada) utilizando-se o sistema HEK293-F (Invitrogen) de acordo com a instrução do fabricante. Sucintamente, células de HEK293-F (Invitrogen) que cresceram em suspensão seja em um balãi de vidro de agitação ou no fermentador submetido a agitação em meio de expressão FreeStyle™ 293 isento de soro (Invitrogen) foram transfectadas com uma mistura dos quatro plasmídeos de expressão e 293fectin™ ou fectin (Invitrogen). Para balai de vidro sob agitação de 2 L (Corning) células de HEK293-F foram semeadas sob uma densidade de 1.0E*6 células/ml em 600 ml e incubadas sob 120 rpm, 8% CO2. No dia seguinte as células foram transfectadas sob uma densidade de células de cerca de 1.5E*6 células/ml com cerca de 42 ml mix de A) 20 ml Opti-MEM (Invitrogen) com 600 μg de DNA de plasmídeo total (1 μg/ml) codificando a cadeia pesada ou pesada modificada, respectivamente e a correspondente cadeia leve em uma relação equimolar e B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 ml 293 fectina ou fectina (2 μl/ml). De acordo com o consumo de glicose solução de glicose foi adicionada durante a realização da fermentação. O sobrenadante que continha o anticorpo secretado foi colhido depois de 5-10 dias e os anticorpos foram seja diretamente purificados a partir do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.

[00164] Purificação

[00165] Os anticorpos biespecíficos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de células por cromatografia de afinidade utilizando-se MabSelectSure- SepharoseTM (para mutantes não_AAA) (GE Healthcare, Sweden) ou kappaSelect-Agarose (para mutantes AAA) (GE Healthcare, Sweden), cromatografia de interação hidrofóbica utilizando- se butil-Sepharose (GE Healthcare, Sweden) e cromatografia de exclusão por dimensão Superdex 200 (GE Healthcare, Sweden).

[00166] Sucintamente, sobrenadantes de culturas de células filtradas estéreis foram captados em uma resina MabSelect SuRe equilibrada com tampão PBS (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl, pH 7,4), lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com 25 mM de citrato de sódio sob pH 3,0. Os mutantes de AAA foram captados em uma resina kappaSelect equilibrada com 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,2, lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com 25 mM de citrato de sódio pH 2,9. As fracções de proteína eluidas foram agrupadas e neutralizadas com 2M Tris, pH 9,0. Os grupos de anticorpos foram preparados para cromatografia de interação hidrofóbica por meio de adição de 1,6 M solução de sulfato de amônio para uma concentração final de 0,8 M sulfato de amônio e o pH ajustado para pH 5,0 utilizando-se ácido acético. Depois de equilibrio da resina de butil-Sepharose com 35 mM de acetato de sódio, aplicaram-se 0,8 M de sulfato de amônio, pH 5,0, os anticorpos foram aplicados à resina, lavados com tampão de equilíbrio e eluídos com um gradiente linear para 35 mM acetato de sódio, pH 5,0. As frações que continham anticorpos biespecíficos foram agrupadas e ainda purificadas por meio de cromatografia de exclusão por dimensão utilizando-se uma coluna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0. As frações que continham anticorpos biespecíficos foram agrupadas, concentradas para a concentração requerida utilizando-se dispositivos de ultra filtração Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., France) e armazenadas sob -80°C. Tabela 2: Rendimentos de anticorpos <VEGF-ANG-2> biespecíficos

[00167] Pure za e integridade de anticorpos foram analisadas depois de cada etapa de purificação por meio de CE-SDS utilizando-se tecnologia micro fluídica Labchip (Caliper Life Science, USA). Prepararam-se 5 μl de solução protéica para análise de CE-SDS utilizando-se o kit HT Protein Express Reagent Kit de acordo com as instruções do fabricante e analisaram-se no sistema LabChip GXII utilizando-se uma microplaqueta de expressão de proteínas de HT (HT Protein Express Chip). Os dados foram analisados utilizando-se Software LabChip GX. Tabela 3: Remoção dos produtos colaterais típicos por meio de diferentes etapas de purificação seqüencial determinadas por meio de CE-SDS.

[00168] O conteúdo de agregados de amostras de anticorpos foi analisado por meio de SEC de alto desempenho utilizando-se uma coluna de exclusão por dimensão analítica Superdex 200 (GE Healthcare, Sweden) em 2xPBS (20 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 274 mM NaCl e 5,4 mM KCl, pH 7,4) tampão de operação sob 25°C. Injetaram-se 25 μg de proteína na coluna sob uma taxa de fluxo de 0,75 ml/min. e eluída isocrática durante 50 minutos.

[00169] De forma análoga os anticorpos específicos <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0012 e VEGFang2-0201 foram preparados e purificados com os seguintes rendimentos:

[00170] Também, os anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG4 com mutações de AAA e com mutações de SPLE (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 com mutações de AAA (SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35)and <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 com mutações de AAA e com mutações de SPLE (SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38) podem ser preparados e purificado analogamente analogously.

Exemplo 2

[00171] Analítica & Evolutividade

[00172] Medição de viscosidade à base de DLS em pequena escala.

[00173] A medição de viscosidade foi realizada essencialmente como descrita em (He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-3). Sucintamente, amostras são concentradas para várias concentrações de proteínas em 200 mM de succinato de arginina, pH 5,5, before de glóbulos de látex de poliestireno (300 nm de diâmetro) e Polysorbate 20 (0.02% v/v) serem adicionados. Amostras são transferidas para uma placa de 384 cavidades óptica por centrifugação através de uma placa de filtro de 0,4 μm e coberta com óleo de parafina. O diâmetro aparente dos glóbulos de látex é determinado por meio de dispersão dinâmica da luz sob 25°C. A viscosidade da solução pode ser calculada como n = n0(rh/rh,0) (n: viscosidade; n0: viscosidade da água; rh: raio hidrodinâmico aparente dos glóbulos de látex; rh,0: raio hidrodinâmico dos glóbulos de látex na água.

[00174] P ara permitir a comparação de várias amostras sob a mesma concentração, dados de concentração- viscosidade foram ajustados à equação de Mooney (Equação 1) (Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta 1997) e os dados interpolados correspondentemente. (S: parâmetro de interação hidrodinâmica da proteína; K: fator de auto-aglomeração; Φ: fração de volume da proteína dissolvida)

[00175] Os resultados estão ilustrados na Figura 2: VEGFang2-0016 com mutações de AAA na parte Fc mostra uma viscosidade mais baixa em todas as temperaturas medidas comparadas com VEGFang2-0015 sem as mutações de the AAA na parte Fc.

[00176] Temperatura de início de agregação de DLS

[00177] Amostras são preparadas sob uma concentração de 1 mg/ml em 20 mM de Histidina / cloreto de Histidina, 140 mM NaCl, pH 6,0, transferidas para uma placa óptica de 384 cavidades por meio de centrifugação através de uma placa de filtro de 0,4 μm e coberta com óleo de parafina. O raio hidrodinâmico é medido repetidamente por meio de dispersão dinâmica de luz ao mesmo tempo que as amostras são aquecida com uma taxa de 0,05°C/min. a partir de 25°C até 80°C. A temperatura de iniciação de agregação é definida como a temperatura sob a qual o raio hidrodinâmico começa a aumentar. Os resultados estão ilustrados na Figura 3. Na Figura 3 está ilustrada a agregação de VEGFang2-0015 sem as mutações de AAA contra VEGFang2-0016 com mutações de AAA na parte de Fc. VEGFang2-0016 mostrou uma temperatura de início de agregação de 61°C enquanto que VEGFang2-0015 sem as mutações de AAA mostrou uma temperatura de início de 60°C.

[00178] Curso temporal de DLS

[00179] As amostras são preparadas sob uma concentração de 1 mg/ml em 20 mM Histidina/ cloreto de Histidina, 140 mM NaCl, pH 6,0, transferidas para uma placa óptica de 384-cavidades por meio de centrifugação através de uma placa de filtro de 0,4 μm e cobertas com óleo de parafina. O raio hidrodinâmica é medido repetidas vezes por meio de dispersão dinâmica de luz enquanto as amostras são mantidas sob uma temperatura constante de 50°C durante até 145 horas. Nesta experiência as tendências de agregação da proteína nativa, desdobrada, sob temperatura elevada conduziria a um aumento do diâmetro médio das partículas ao longo do tempo. Este método baseado em DLS-é muito sensível para agregados porque estes contribuem mais do que proporcionalmente para a intensidade da luz dispersa. Mesmo depois de 145 horas sob 50°C (uma temperatura próxima da temperatura de início da agregação, vide retro), um aumento de diâmetro médio de partícula de apenas menos do que 0,5 nm foi encontrado tanto para VEGFang2-0015 quanto para VEGFang2-0016.

[00180] Armazenamento de 7 dias a 40°C sob 100 mg/ml (aumento de HMW)

[00181] As amostras são concentradas para uma concentração final de 100 mg/ml em 200 mM de succinato de arginina, pH 5,5, esterilizadas por filtração e armazenadas em repouso a 40°C durante 7 dias. Antes e depois do armazenamento, o conteúdo das expécies de alto e baixo peso molecular (HMWs and LMWs, respectivamente) é determinado por meio de cromatogafia de exclusão por dimensão. A diferença de conteúdo em HMW e LMW entre a amostra armazenada e uma amostra medida imediatamente depois da preparação é reportada como “aumento de HMW” e “aumento de LMW i”, respectivamente. Os resultados estão ilustrados na Tabela 4 e na Figura 4, que mostra que VEGFang2-0015 (sem mutação AAA ) apresenta uma redução mais alta do pico principal e um aumento de HMW mais alto comparado com VEGF Ang2-0016 (com mutação de AAA). Surpreendentemente VEGF Ang2-0016 (com mutaçãi de AAA) mostrou uma tendência de agregação mais baixa comparada comVEGFang2-0015 (sem mutação de AAA). Tabela 4: Delta Main-, Picos de HMW e LMW depois de 7d a 40°C

[00182] A análise funcional de anticorpos biespecíficos anti-VEGF e anti-Ang2 foi avaliada por meio de Surface Plasmon Resonance (SPR) utilizando-se um instrumento BIAcore® T100 ou T200 (GE Healthcare) sob 25°C. O sistema BIAcore® é amplamente estabelecido para o estudo de interações de moléculas. A tecnoloia de SPR-é baseada na medição do índice de refração junto à superfície de uma microplaqueta biossensora revestida de ouro. Alterações no índice de refração indicam alterações de massa na superfície causadas pela interação do ligante imobilizado com analito injetado na solução. A massa aumenta se moléculas se ligam a ligantes imobilizados na superfície, e vice versa, a massa diminui no caso de dissociação do analito a partir do ligante imobilizado (refletindo dissociação complexa). A SPR permite uma monitoração continua em tempo real da ligação de ligante / analito e deste modo a determinação da constante de taxa de associação (ka), a constante da taxa de dissociação (kd), e da constante de equilíbrio (KD).

Exemplo 3

[00183] Ligação a VEGF, Ang2, FcgammaR e FcRn

[00184] Afinidade cinética de isoformas de VEGF incluindo avaliação de reatividade cruzada das espécies

[00185] Cerca de 12000 unidades de ressonância (RU) deo sistema de captura (10 μg/ml de F(ab)‘2 anti- humano de cabra; Código de ordem: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) foram acopladas em uma microplaqueta CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) sob pH 5,0 mediante utilização de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e tampão do sistema foi PBS-T (10 mM de salina tamponada com fosfato incluindo 0,05% de Tween20) pH 7,4. A célula de fluxo foi ajustada a 25°C - e o bloco de amostra ajustado a 12°C - e preparado com tampão de circulação duas vezes. O anticorpo biespecífico foi captado por meio de injeção de uma solução de 50 nM durante 30 segundos sob um fluxo de 5 μl/min. A associação foi medida por meio de injeção de hVEGF121 humano, mVEGF120 de camundongo ou rato rVEGF164 em várias concentrações em solução durante 300 segundos sob um fluxo de 30 μl/min. começando com 300 nM em diluições 1:3. A fase de dissociação foi monitorada durante até 1200 segundos e desencadeada pela comutação a partir da solução de amostra para o tampão de circulação. A superfície foi regenerada por meio de lavagem durante 60 segundos com uma solução de pH 2,1 de Glicina sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Diferenças de índice de refração em massa foram corrigidas pela subtração da resposta obtida a partir de uma superfície F(ab’)2 anti-humana de cabra. Injeções simuladas (placebo) também são subtraídas (= referência dupla). Para o cálculo de KD aparente e outros parâmetros cinéticos utilizou-se o modelo Langmuir 1:1. Os resultados estão ilustrados na Tabela 5.

[00186] Afinidade da solução Ang2 incluindo a avaliação de reactividade cruzada de espécies

[00187] A afinidade de solução mede a afinidade de uma interação pela determinação da concentração de participantes de interação livres em uma mistura em equilíbrio. O ensaio de afinidade de soluções envolve a mistura de um anticorpo biespecífico <VEGF-ANG-2>, mantido sob uma concentração constante, com um ligante (= Ang2) sob concentrações variáveis. Unidades de ressonância máxima possível (por exemplo, 17000 unidades de ressonância (RU)) de um anticorpo foram imobilizadas na superfície da microplaqueta CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) sob pH 5,0 utilizando-se um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e tampão de sistema foi HBS-P, pH 7,4. A célula de fluxo foi ajustada para 25°C e o bloco de amostras para 12°C e preparado com tampão de circulação duas vezes. Para gerar uma curva de calibragem concentrações crescentes de Ang2 foram injetadas dentro de uma célula de fluxo BIAcore que continha o anticorpo biespecífico VEGF-ANG-2> imobilizado. A quantidade de Ang2 de ligação foi determinada na forma de unidades de ressonância (RU) e plotada contra a concentração. Soluções de cada ligante (11 concentrações a partir de 0 até 200 nM para o anticorpo biespecífico VEGF-ANG-2>) foram incubadas com 10 nM de Ang2 e deixou-se que alcançassem o equilíbrio sob temperatura ambiente. Concentrações de Ang2 livre foram determinadas a partir da curva de calibragem gerada antes e depois da medição da resposta de soluções com quantidades conhecidas de Ang2. Um ajuste de 4 parâmetros foi estabelecido com XLfit4 (Software IDBS) utilizando-se Model 201 que utilizava concentração de Ang2 livre como eixo y e usava concentração de anticorpo para inibição como eixo x. A afinidade foi calculada por determinação do ponto de inflexão desta curva. A superfície foi regenerada por um tempo de lavagem de 30 s com uma solução a 0,85% de H3PO4 sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. As diferenças de índice de refração de massa foram corrigidas substraindo-se a resposta obtida a partir de uma superfície acoplada em branco. Os resultados estão ilustrados na Tabela 6.

[00188] Afinidade do estado estacionário de FcRn

[00189] Para a medição de FcRn foi utilizada uma afinidade de estado estacionário para comparar anticorpos bispecificos uns contra os outros. Diluiu-se FcRn humano em tampão de acoplamento (10 μg/ml, Acetato Na, pH 5,0) e imobilizado em uma microplaqueta C1-(GE Healthcare BR-1005-35) por meio de procedimento de imobilização direcionado utilizando-se um BIAcore wizard para uma resposta final de 200 RU. A Célula de fluxo foi ajustada para 25°C e o bloco de amostra para 12°C e preparado com tampão de circulação duas vezes. A amostra e tampão de sistema foi o PBS-T (10 mM solução salina tamponada com fosfato incluindo 0,05% Tween20) pH 6,0. Para avaliar diferentes concentrações de IgG para cada anticorpo, preparou-se uma concentração de 62,5 nM, 125 nM e 250 nM, 500 nM. A taxa de fluxo foi ajustada para 30 μl/min. e as diferentes amostras foram injetadas consecutivamente sobre a superfíciede microplaqueta escolhendo tempo de associação de 180 segundos. A superfície foi regenerada por meio de PBS-T pH 8 injetado durante 60 s sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. As diferenças de índice de refração de massa foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida a partir de uma superfície em branco. As injeções de tampão também são subtraídas (= dupla referência). Para se calcular a afinidade de condição estável utilizou-se o método a partir do software Bia-Evaluation. Sucintamente, os valores de RU (RU máximo) foram plotados contra as concentrações analisadas, proporcionando uma curva de resposta de dose. Com base num ajuste 2-paramétrico, a assimptota superior é calculada, permitindo a determinação da metade do valor de RU máximo e, deste modo, a afinidade. Os resultados estão ilustrados na Figura 5 e na Tabela 7. De uma forma análoga a afinidade de FcRn para “cyno”, camundongo e coelho pode ser determinada.

[00190] Medição de FcgammaRIIIa

[00191] Para a medição de FcgammaRIIIa utilizou-se um ensaio de ligação direta. Em torno de 3000 unidades de ressonância (RU) do sistema de captação (1 μg/ml Penta-His; Quiagen) foram acopladas em uma microplaqueta de CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) sob pH 5,0 mediante utilização de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e tampão de sistema foi HBS-P+ pH 7,4. A célula de fluxo foi ajustada para 25°C - e o bloco de amostras para 12°C - e preparada com tampão de circulação duas vezes. O receptor His de FcgammaRIIIa foi captado pela injeção de uma solução de 100 nM durante 60 s sob um fluxo de 5 μl/min. A ligação foi medida pela injecão de 100 nM de anticorpo biespecífico ou anticorpos de controle monospecificos (anti-Dig para a subclasse IgG1 e um anticorpo de subclasse IgG4) durante 180 s sob um fluxo de 30 μl/min. A superfície foi regenerada por lavagem de 120 s com solução de Glicina pH 2,5 sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Uma vez que a ligação de FcgammaRIIIa difere do modelo Langmuir 1:1, com este ensaio foi determinada somente a ligação / não ligação. De uma maneira assemelhada poderá ser determinada a FcgammaRIa, e a ligação de FcgammaRIIa. Os resultados encontram-se ilustrados na Figura 6, onde se segue que por instrução das mutações P329G LALA nenhuma ligação mais para FcgammaRIIIa poderá ser detectada.

[00192] Avaliação da ligação de i VEGF- e Ang2 independente aos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

[00193] Em torno de 3500 unidades de ressonância (RU) do sistema de captação (10 μg/ml de IgG anti humano de cabra; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden) foram acopladas em uma micropçaqueta CM4 (GE Healthcare BR-1005-34) sob pH 5,0 mediante utilização de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e tampão de sistema foi PBS-T (10 mM de solução salina tamponada por fosfato incluindo 0,05% de Tween20 ) pH 7,4. A temperatura da célula de fluxo foi ajustada para 25°C e do bloco de amostras para 12°C. Antes da captação, a célula de fluxo foi preparada com tampão de circulação duas vezes.

[00194] O anticorpo biespecífico foi captado por meio de injeção de uma solução de 10 nM durante 60 s sob um fluxo de 5 μl/min. A ligação Independente de cada ligante ao anticorpo biespecífico foi analisada pela determinação da capacidade de ligação ativa para cada ligante, seja adicionado sucessivamente ou simultaneamente (fluxo de 30 μl/min.): 1. Injeção de VEGF humano com uma concentração de 200 nM durante 180 s (identifica a ligação única do antígeno). 2. Injeção de Ang2 humano com uma concentração de 100 nM durante 180 s (identifica a ligação única do antígeno). 3. Injeção de VEGF humano com uma concentração de 200 nM durante 180 s seguida por uma injeção adicional de Ang2 humano com uma concentração de 100 nM durante 180 s (identifica a ligação de Ang2 na presença de VEGF). 4. Injeção de Ang2 humano com um a concentração de 100 nM durante 180 s seguida por uma injeção adicional de VEGF humano com uma concentração de 200 nM (identifica a ligação de VEGF na presença de Ang2). 5. Co-Injeção de VEGF humano com uma concentração de 200 nM e de Ang2 humano com uma concentração de 100 nM durante 180 s (identifica a ligação de VEGF e de Ang2 ao mesmo tempo).

[00195] A superfície foi regenerada por meio de lavagem de 60 s com uma solução 3m MgCl2 sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. As diferenças de índice de refração de massa foram corrigidas subtraindo-se a resposta obtida a partir da superfície de IgG anti-humana de cabra.

[00196] O anticorpo biespecífico é capaz de ligar-se aos dois antígenos mútuos independentemente de se o sinal final resultante das abordagens 3, 4 & 5 iguala ou é semelhante à soma dos sinais finais individuais das abordagens 1 e 2. Os resultados estão ilustrados na Tabela 9, onde os dois anticorpos VEGFang2-0016, VEGFang2-0012 estão ilustrados como sendo capazes de ligação mútia independentemente ao VEGF e ANG2

[00197] Avaliação da ligação simultânea de VEGF- e de Ang2-aos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

[00198] Primeiro, em torno de 1600 unidades de ressonância (RU) de VEGF (20μg/ml) foram acopladas em uma microplaqueta CM4 (GE Healthcare BR-1005-34) sob pH 5,0 pela utilização de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare. A amostra e yampão do sistema foi PBS- T (10 mM de solução salina tamponada por fosfato incluindo 0,05% de Tween 20) pH 7,4. A célula de fluxo foi ajustada para 25°C e o bloco de amostra para 12°C e preparada com tampão de circulação duas vezes. Segundo, 50nM de solução do anticorpo biespecífico foram injetados durante 180 s sob um fluxo de 30 μl/min. Terceiro, hAng-2 foi injetado durante 180 s sob um fluxo de 30 μl/min. A resposta da ligação de hAng-2 depende da quantidade da ligação do anticorpo biespecífico ao VEGF e mostra ligação simultânea. A superfície foi regenerada por meio de lavagem durante 60 s com uma solução de H3PO4 0,85% sob uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Ligação simultânea é ilustrada por um sinal de ligação específico adicional de hAng2 aos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> de ligação de VEGF anterior. Para os dois anticorpos biespecíficos VEGFang2-0015 e VEGFang2-0016 poderá ser detectada uma ligação de VEGF- e Ang2- simultânea aos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> (dados não ilustrados). Tabela 5: Resultados: Afinidades cinéticas às isoformas VEGF a partir de diferentes espécies Tabela 6: Resultados: Afinidades de soluções para Ang2 Tabela 7: Resultados: Afinidade ao FcRn de anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> Tabela 8: Resultados de Lihação ao FcgammaRI – IIIa Tabela 9: Resultados: Ligação ondependente de VEGF- e Ang2 aos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Exemplo 4

[00199] Espectrometria de massa

[00200] Est a seção descreve a caracterização de anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> com ênfase na montagem correta. As estruturas principais esperadas foram confirmadas por meio de espectrometria de massa de ionização de eletrospray (ESI-MS) dos anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>. desglicosilados e intactos ou IdeS-digeridos (IgG- enzima de degradação de S. pyogenes). A digestão IdeS-foi realizada com 100 μg de anticorpo purificado incubado com 2 μg de protease de IdeS (Roche) em 100 mmol/L NaH2PO4 / Na2HPO4, pH 7,1 sob 37°C durante 5 h. Subsequentemente, os anticorpos foram desglicosilados com N-Glycosidase F, Neuraminidase e O-glycosidase (Roche) em 100 mmol/L de NaH2PO4 / Na2HPO4, pH 7,1 sob 37°C durante até 16 h sob uma concentração de proteínas de 1 mg/ml e subsequentemente dessalinizados por meio de HPLC em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa total foi determinada por intermédio de ESI-MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado com uma fonte TriVersa NanoMate (Advion).

[00201] As massas obtidas para as moléculas IdeS-digeridas, deglicosiladas (Tabela 10), ou intactas, desglcosladas (Tabela 11) correspondem às massas previstas deduzidas a partir das sequências de aminoácidos para os anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> consistindo de duas cadeias leves diferentes LCAng2 e LCLucentis, e duas cadeias pesadas diferentes HCAng2 and HCLucentis. Tabela 10: Massas dos anticorpos biespecíficos <VEGF/ANG2> desglicosilados e IdeS-digeridos VEGFang2-0201 (sem mutação de AAA) e VEGFang2-0012 (com mutação de AAA) Tabela 11: Massas dos anticorpos desglicosilados <VEGF/ANG2> VEGFang2-0016 (com mutação de AAA) e VEGFang2- 0015 (sem mutação de AAA)

Exemplo 5

[00202] Cromatografia de Fc-Rn

[00203] Acoplamento à estreptavidina sefarose:

[00204] Um grama de estreptavidina sefarose (GE Healthcare) foi adicionado ao receptor biotinilado e dialisado e incubado durante duas horas com agitação. O receptor de sefarose derivatizada foi levado a preencher uma coluna de 1 ml XK (GE Healthcare).

[00205] Cromatografia utilizando-se a coluna de afinidade de FcRn: Condições: Dimensões da coluna: 50 mm x 5 mm Altura do leito: 5 cm Carga: amostra de 50 μg Tampão de equilíbrio: 20 mM MES, com 150 mM NaCl, ajustado pata pH 5,5 Tampão de eluição: 20 mM Tris/HCl, com 150 mM NaCl, ajustado para pH 8,8 eluição: tampão de equilíbrio 7,5 CV, em 30 CV até 100 % tampão de eluição, tampão de eluição 10 CV

[00206] Cromatografia de coluna de afinidade de Hu FcRn

[00207] Na Tabela seguinte estão expostos tempos de retenção de anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> nas colunas de afinidade que compreendem FcRn humano. Os dados foram obtidos utilizando-se as condições expostas retro. Na Tabela seguinte estão expostos os tempos de retenção de anticorpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> em FcRn humano. Tabela 12: Resultados: tempos de retenção anticorpos biespecíficos de <VEGF-ANG-2>

Exemplo 6

[00208] Propriedades Farmacocinéticas ( PK )

[00209] Dados de PK com Fc-Rn de camundongos transgênicos para FcRn humano

[00210] Fase em vida

[00211] O estudo incluiu camundongos C57BL/6J fêmea (antecedentes); camundongo deficiente de FcRn, mas transgênico hemizigoto para FcRn humano (huFcRn, linha 276 -/tg)

Parte 1

[00212] Todos os camundongos foram injetados uma vez intravitrealmente no olho direito com 2 μl/animal da solução apropriada (ou seja, 21 μg composto /animal (VEGFAng2-0015 (sem mutação de AAA ) ou 23,6 μg composto /animal (VEGFAng2-0016 (com mutação de AAA).

[00213] Os canundongos foram atribuídos a dois grupos com 6 animais cada um. Amostras de sangue foram coletadas a partir do grupo 1 em 2, 24 e 96 horas e a partir do grupo 2 em 7, 48 e 168 horas depois da dosagem.

[00214] Injeção dentro do vítreo do olho direito do camundongo foi realizada pelo uso do sistema NanoFil Microsyringe para injeção de nanolitro a partir da World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germany. Os camundongos foram anestesiados com 2,5% de Isoflurane e para visualização do olho do camundongo utilizou-se um microscópio Leica MZFL 3 com uma ampliação de 40 vezes e um anel de iluminação com uma Leica KL 2500 LCD iluminando. Subsequentemente, injetaram-se 2 μl do composto utilizando- se uma agulha de tamanho 35.

[00215] Coletou-se sangue por meio do plexo venoso retrobulbar do olho contralateral a partir de cada animal para a determinação dos níveis de composto no soro.

[00216] Amostras de soro de pelo menos 50 μl foram obtidas a partir do sangue depois de 1 hora sob RT por meio de centrifugação (9300xg) sob 4°C durante 3 min. As amostras de soro foram congeladas diretamente após a centrifugação e armazenadas congeladas sob-80°C até serem analisadas. Os olhos tratados dos animais do grupo 1 foram isolados 96 horas depois do tratamento e dos animals do grupo 2 168 horas depois do tratamento. Aa amostras foram armazenadas congeladas sob -80°C até serem analisadas.

Part 2

[00217] Todos os camungos foram injetados uma vez de forma intravenosa por meio da veia caudal com 200 μl/animal da solução apropriada (ou seja, 21 μg de composto /animal (VEGFAng2-0015 (sem mutação de AAA) ou 23,6 μg de composto /animal (VEGFAng2-0016 (com mutação de AAA).

[00218] Os camundongos foram distribuídos em 2 grupos com 5 animais cada grupo. Amostras de sangue são coletadas a partir do grupo 1 em 1, 24 e 96 horas e a partir do grupo 2 em 7, 48 e 168 horas depois da dosagem. O sangue foi coletado por meio do plexo venoso retrobulbar a partir de cada animal para a determinação dos níveis de composto no soro.

[00219] Amostras de soro de pelo menos 50 μl foram obtidas a partir do sangue depois de 1 horas sob RT por meio de centrifugação (9300xg) sob 4°C durante 3 min. As amostras de soro foram congeladas diretamente depois da centrifugação e armazenadas congeladas sob -80°C até serem analisadas.

[00220] Preparação de lisados de olho integrais (camundongos)

[00221] Os lisados oculares foram ganhos pela desintegração físico-química de todo o olho a partir de animais de laboratório. Para ruptura mecânica, cada olho foi transferido para um frasco de 1,5-ml com fundo cônico. Depois de congelamento e descongelamento, os olhos foram lavados com 1 ml de tampão de lavagem de células uma vez (Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, Cat. No. 171-304011). Na etapa seguinte, 500 μl de tampão de lise celular recém preparado foram adicionados e os olhos foram triturados utilizando-se um pilão de moagem de 1,5 ml de tecido (Kimble Chase, 1.5ml pestle, Art. No. 749521-1500). A mistura foi então congelada e descongelada cinco vezes e moída novamente. Para separar o lisado do tecido remanescente as amostras foram centrifugadas durante 4 min. sob 4500 g. Depois da centrifugação o sobrenadante foi coletado e armazenado sob -20°C até nova análise no ELISA de quantificação.

[00222] Análise

[00223] As concentrações dos anticorpos <VEGF/ANG2> em soro de camundongos e lisados de olho foram determinadas com um ensaio de imunossolventes ligados por enzimas (enzyme linked immunosorbent assay) (ELISA)

[00224] P ara a quantificação de anticorpos <VEGF/ANG2> em amostras de soro de camundongo e lisados do olho, realizou-se um imunoensaio de sanduíche série de fase sólida padrão com anticorpos monoclonais biotinilados e digoxigenados usados na captação e detecção de anticorpos. Para verificar a integridade da bispecificidade do analito o anticorpo de captação biotinilado reconhece o local de ligação anti-VEGF enquanto que o anticorpo de detecção digoxigenado será ligado ao local de ligação anti-Ang2 do analito. O complexo imune ligado de anticorpo de captação, analito e anticorpo de detecção na fase sólida da placa de microtitulação revestida de estreptavidina (SA-MTP) é então detectado com uma peroxidase de rábano acoplada a um anticorpo de anti-digoxigenina. Depois de lavagem do material não ligado a partir da SA-MTP e adição do substrato de ABTS, o sinal obtido é proporcional à quantidade de analito ligado à fase sólida da SA-MTP. A quantificação é então realizada pela conversão dos sinais medidos das amostras em concentrações referentes a calibradores analisados em paralelo.

[00225] Em uma primeira etapa a SA-MTP foi revestida com 100 μl/cavidade de solução de anticorpo de captação biotinilado (mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)) com uma concentração de 1μg/ml durante uma hora sob 500 rpm em um agitador de MTP. Nesse meio tempo calibradores, amostras de QC-e outras amostras foram preparadas. Os calibradores e amostras de QC- são diluídas para 2% matriz de soro; as amostras foram diluídas até os sinais estarem dentro da faixa linear dos calibradores.

[00226] Depois do revestimento da SA-MTP com anticorpo de captação, a placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem e 300 μl/cavidade. Subsequentemente 100μl/cavidade dos calibradores, amostras de QC-e amostras foram pipetados na SA-MTP e incubados novamente durante uma hora sob 500 rpm. O analito foi agora ligado com seu local de ligação anti-VEGF por meio do anticorpo de captação à fase sólida da SA-MTP. Depois da incubação e remoção do analito não ligado por lavagem da placa 100 μl / cavidade do primeiro anticorpo de detecção (mAb<Id-<Ang2>>M-2.6.81- IgG-Dig(XOSu)) com uma concentração de 250ng/ml foram adicionados à SA-MTP. Novamente, a placa foi incubada durante uma hora sob 500 rpm em um agitador. Depois de lavagem, 100 μl /cavidade do segundo anticorpo de detecção (pAb<Digoxigenin>S-Fab-POD (poly)) sob uma concentração de 50 mU/ml foram adicionados às cavidades da SA-MTP e a placa foi incubada novamente durante uma hora sob 500 rpm. Depois de uma etapa de lavagem final para remover o excesso de anticorpo de detecção, adicionaram-se 100 μl /cavidade de substrato (ABTS). O conjugado de anticorpo-enzima catalisa a reação de cor do substrato ABTS®. O sinal foi então medido por meio de uma leitora de ELISA sob comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm ([405/490] nm)).

[00227] Avaliação Farmacocinética

[00228] Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados por meio de análise compartimental, utilizando- se o programa de avaliação farmacocinética WinNonlinTM (Pharsight), versão 5.2.1.

[00229] Resultados: A) Concentrações de soro

[00230] Os resultados para as concentrações de soro estão ilustradas nas Tables 13 até 16 e Figuras 7B até 7C Tabela 13: VEGFAng2-0015 (sem mutação de AAA ): Comparação de concentrações de soro depois de aplicação intravítrea e intravenosa Tabela 14: VEGFAng2-0016 (com mutação de AAA): Comparação de concentrações de soro depois de aplicação intravítrea e intravenosa Tabela 15: VEGFang2-0015 ( sem mutação de AAA) e VEGFang2- 0016 ( com mutação de AAA) : Comparação de concentrações de soro depois de aplicação intravítrea) Tabela 16: VEGFang2-0015 (sem mutação de AAA) e VEGFang2- 0016 (com mutação de AAA) : Comparação de concentrações de soro depois de aplicação intravenosa

[00231] Resultados: B) Concentrações em lisados do olho dos olhos esquerdo e direito

[00232] Os resultados para concentrações em lisados do olho estão ilustrados nas Tabelas 17 a 18 e Figuras 7D a 7E Tabela 17a: Concentrações de VEGFang2-0015 (sem mutação de AAA) nos lisados do olho depois de aplicação intravítrea no olho direito Tabela 17b: Concentrações de VEGFang2-0015 (sem mutação de AAA) em lisados de olho depois de aplicação intravenosa Tabela 18a: Concentrações de VEGFang2-0016 ( com mutação de AAA) em lisados do olho depois de aplicação intravítrea no olho direito Tabela 18b: Concentrações de VEGFang2-0016 ( com mutação de AAA) em lisados do olho depois de aplicação intravenosa

[00233] Sumário dos Resultados:

[00234] Depois de aplicação intravítrea o anticorpo biespecífico <VEGF/ANG2> de acordo com a invenção VEGFang2-0016 (com mutação de AAA) mostra concentrações similares (depois de 96 e 168 horas) nos lisados do olho em comparação com o anticorpo biespecífico <VEGF/ANG2> sem mutação de AAA VEGFang2-0015.

[00235] Também depois de aplicação intravítrea o anticorpo biespecífico <VEGF/ANG2> de acordo com a invenção VEGFang2-0016 (com mutação de AAA) mostra além disso uma depuração mais rápida e meia vida mais curta no soro em comparação com o anticorpo biespecífico <VEGF/ANG2> sem mutação de AAA VEGFang2-0015.

Exemplo 7 Ensaio de angiogênese de microbolsa da córnea de camundongo

[00236] P ara testar o efeito anti-angiogênico do anticorpo biespecífico <VEGF/ANG2> com o respectivo anti-VEGF VH e VL da SEQ ID NO: 7 e 8 e o anti-ANG2 VH e VL da SEQ ID NO: 15 e 16 na angiogênes induzida por VEGF- in vivo, os inventores realizaram o ensaio de angiogênese de córnea de camundongo. Neste ensaio um disco de Nylaflo embebido de VEGF é implantado dentro de uma bolsa da córnea avascular a uma distância fixa dos vasos do limbo. Os vasos crescem imediatamente na córnea para o desenvolvimento do gradiente de VEGF. Obtiveram-se camundongos Balb/c fêmeas de 8 até 10 semanas de idade a partir da Charles River, Sulzfeld, Germany. O protocolo é modificado de acordo com o método descrito por Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550. Sucintamente, microbolsas com uma largura de cerca de 500 μm são preparadas sob um microscópio a aproximadamente 1 mm do limgo até o topo da córnea utilizando-se uma lâmina cirúrgica e pinças afiadas no camundongo anestesiado. O disco (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan) com um diâmetro de 0,6 mm é implantado e a superfície da área de implante foi alisada. Os discos são incubados o correspondente fator de crescimento ou no veículo durante pelo menos 30 min. Depois de 3, 5 e 7 dias (ou alternativamente apenas depois de 3, 5 ou 7 dias), os olhos foram fotografados e a resposta vascular é medida. O ensaio é quantificado pelo cálculo da percentagem da área de novos vasos por área total da córnea.

[00237] Os discos são carregados com 300 ng VEGF ou com PBS como um controle e implantados durante 7 dias. O crescimento dos vasos do limbo para o disco é monitorado ao longo do tempo no dia 3, 5 e / ou 7. Um dia antes da implantação do disco os anticorpos são administrados de forma intravenosa sob uma dose de 10 mg/kg (devido à aplicação intravenosa de soro estável VEGFang2- 0015 (sem mutação de AAA) que apenas difere de VEGFang2- 0016 pela mutação de AAA e tem o mesma anti-VEGF e anti- ANG2 VHs e VLs para mediar a eficácia, é utilizado como substituto) para testar o efeito anti-angiogênico na angiogênese induzida por VEGF- in vivo. Os animais no grupo de controle receberam veículo. O volume de aplicação é de 10 ml/kg.

Claims

1 - Método para a redução da viscosidade de um anticorpo que compreende uma região constante de cadeia pesada de subclasse IgG1 humano, o método caracterizado por compreender: a modificação da região constante de cadeia pesada do anticorpo de subclasse IgG1 humano com as mutações I253A, H310A e H435A, numeradas de acordo com o Índice EU de Kabat; e em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que especificamente se liga ao VEGF humano e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, em que: i) o referido primeiro sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente ao VEGF, compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 6; e ii) o referido segundo sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente ao ANG-2, compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 14.

2 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico é adicionalmente modificado com as mutações L234A, L235A e P329G, numeradas de acordo com o Índice EU de Kabat.

3 - Anticorpo biespecífico, que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado pelo fato de que: i) o referido primeiro sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente ao VEGF, compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1H de SEQ ID NO:3, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2L de SEQ ID NO:5, e uma região CDR1L de SEQ ID NO:6; e ii) o referido segundo sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente ao ANG-2, compreende no domínio variável de cadeia pesada uma região CDR3H de SEQ ID NO: 9, uma região CDR2H de SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1H de SEQ ID NO: 11, e no domínio variável de cadeia leve uma região CDR3L de SEQ ID NO: 12, uma região CDR2L de SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1L de SEQ ID NO: 14, e em que iii) o anticorpo biespecífico compreende uma região constante de cadeia pesada de subclasse IgG1 humano que compreende as mutações I253A, H310A, e H435A, numeradasde acordo com o Índice EU de Kabat.

4 - Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que: i) o referido primeiro sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente ao VEGF, compreende como domínio variável de cadeia pesada VH uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e como domínio variável de cadeia leve VL uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e ii) o referido segundo sítio de ligação de antígeno, que se liga especificamente a ANG-2, compreende como domínio variável de cadeia pesada VH uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e como domínio variável de cadeia leve VL uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

5 - Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada de subclasse IgG1 compreende adicionalmente as mutações L234A, L235A e P329G, numeradas de acordo com o Índice EU de Kabat.

6 - Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por ser para uso no tratamento de doenças vasculares oculares.

7 - Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por meio de aplicação intravítrea.

8 - Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5.

9 - Método para a preparação de um anticorpo biespecífico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por compreender as etapas de: a) transformar uma célula hospedeira com vetores compreendendo moléculas de ácidos nucléicos que codificam o referido anticorpo; b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitam a síntese da referida molécula de anticorpo; e c) recuperar a referida molécula de anticorpo a partir da referida cultura.

10 - Anticorpo bivalente e biespecífico, que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado por compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, de SEQ ID NO: 26, de SEQ ID NO: 27, e de SEQ ID NO: 28.

11 - Anticorpo bivalente e biespecífico, que compreende um primeiro sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao VEGF humano e um segundo sítio de ligação de antígeno que se liga especificamente ao ANG-2 humano, caracterizado por compreender as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, de SEQ ID NO: 22, de SEQ ID NO: 23, e de SEQ ID NO: 24.

12 - Anticorpo bivalente e biespecífico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por ser para uso no tratamento de doenças vasculares oculares.

13 - Anticorpo bivalente e biespecífico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado por meio de aplicação intravítrea.