BR112014030009B1 - Método para a produção de um produto alimentar compreendendo galacto- oligossacarídeos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEOS QUE TÊM ATIVIDADE DE TRANSGALACTOSILAÇÃO. A presente invenção refere-se a polipeptídeos, especificamente polipeptídeos que têm atividade de transgalactosilação e ácidos nucleicos que codificam estes, e seus usos, por exemplo, em produtos lácteos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a polipeptídeos, especifica mente polipeptídeos que têm atividade de transgalactosilação e ácidos nucleicos que codificam estes, e seus usos, por exemplo, no produto lácteo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Galacto-oligossacarídeos (GOS) são carboidratos que não são digeríveis em seres humanos e animais, compreendendo duas ou mais moléculas de galactose, tipicamente até nove, ligados por ligações glicosídicas. GOS’s também podem incluir uma ou mais moléculas de glicose. Um dos efeitos benéficos do GOS’s é sua capacidade de atuação como compostos prebióticos estimulando seletivamente a proliferação de micro-organismos relativos ao cólon benéficos, como bactérias para fornecer benefícios fisiológicos ao consumidor. Os efeitos de saúde estabelecidos resultaram em um interesse crescente em GOS’s como ingredientes alimentícios de vários tipos de alimentos.

[003] A enzima β-galactosidase (EC 3.2.1.23) normalmente hidro- lisa lactose aos monossacarídeos D-glicose e D-galactose. Na reação enzimática normal de β-galactosidases, a enzima hidrolisa lactose e transientemente se liga ao monossacarídeo galactose em um complexo galactose-enzima que transfere a galactose para o grupo hidroxila da água, resultando na liberação de D-galactose e D-glicose. Entretanto, em altas concentrações de lactose, algumas β-galactosidases são capazes de transferir a galactose para os grupos hidroxilas de D- galactose ou D-glicose em um processo chamado transgalactosilação, pelo qual os galacto-oligossacarídeos são produzidos. Também em altas concentrações de lactose, algumas β-galactosidases são capa- zes de transferir a galactose para os grupos hidroxilas da lactose ou oligossacarídeos de ordem superior.

[004] O gênero Bifidobacterium é um dos tipos mais comumente usados de culturas de bactérias na indústria do leite para fermentar uma variedade de produtos lácteos. A ingestão de produtos contendo Bifidobacterium, além disso, tem um efeito promotor da saúde. Este efeito não é somente alcançado por um pH reduzido dos conteúdos intestinais, mas também pela capacidade de Bifidobacterium de repovoar a flora intestinal em indivíduos que perturbaram sua flora intestinal, por exemplo, pela ingestão de antibióticos. Bifidobacterium, além disso, tem o potencial de superar competitivamente micro-organismos intestinais potencialmente perigosos.

[005] Galacto-oligossacarídeos são conhecidos por aumentar o crescimento de Bifidobacterium. Este efeito é provavelmente alcançado pela capacidade única de Bifidobacterium de explorar galacto- oligossacarídeos como uma fonte de carbono. Pensa-se, além disso, que o suplemento dietético de galacto-oligossacarídeos tem diversos efeitos de proteção para doenças de longo prazo. Por exemplo, foi mostrado que a ingestão de galacto-oligossacarídeos é altamente protetora contra o desenvolvimento do câncer colorretal em ratos. Por isso, há um grande interesse no desenvolvimento de métodos baratos e eficientes para produzir galacto-oligossacarídeos para o uso na indústria para melhorar suplementos dietéticos e produtos lácteos.

[006] Uma lactase extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215 truncada com aproximadamente 580 aminoácidos (BIF3- d3) foi descrita como uma enzima de transgalactosilação em uma solução contendo lactose solubilizada em água (Jorgensen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 647-652). O WO 01/90317 também descreve uma variante de truncamento (OLGA347) como sendo uma enzima de transgalactosilação e no WO 2012/010597 OLGA347 foi mostrado transferir uma porção de galactose para D-fucose, N-acetil- galactosamina e xilose.

[007] No WO 2009/071539, um fragmento diferentemente trunca do comparado com BIF3-d3 é descrito como resultando em hidrólise eficiente e produção muito baixa de GOS quando testado no leite.

[008] As enzimas lactase de Bifidobacterium bifidum descritas acima têm a desvantagem de requerer altas concentrações de lactose tais como acima de 10% (p/p) a fim de produzir GOS ou elevado excesso de outra molécula aceptora para gerar hetero-oligossacarídeos. Além disso, uma molécula foi descrita tendo consideravelmente atividade de beta-galactosilase (hidrolase).

[009] Ainda há uma necessidade de desenvolver enzimas que são eficientes durante a produção de GOS em aplicações com níveis de substrato de baixo teor de lactose tal como no leite.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[010] É um objetivo das modalidades da invenção fornecer um polipeptídeo que tem uma proporção útil de transgalactosilação para atividade de hidrólise e, dessa forma, seja um produtor eficiente de GOS quando incubado com lactose mesmo em níveis baixos de lactose tais como em um produto baseado em leite. É um objetivo adicional das modalidades da invenção fornecer um método para produção de galacto-oligossacarídeos (GOS) in situ em produtos lácteos. É um objetivo adicional das modalidades da invenção fornecer um método para desenvolver um método mais barato e mais eficiente para produção de galacto-oligossacarídeos (GOS) para o uso na indústria. É objetivo adicional das modalidades da invenção fornecer polipeptídeos que são estáveis contra o truncamento adicional tal como pela degradação pro- teolítica quando produzidos em um organismo adequado como Bacillus subtilis, por exemplo, cepa de Bacillus subtilis BG3594. É ainda um objetivo adicional das modalidades da invenção fornecer polipeptí- deos que são estáveis contra o truncamento adicional durante o arma-zenamento após formulação final.

[011] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que os polipeptídeos descritos neste pedido são produtores eficientes de galacto-oligossacarídeos, por exemplo, in situ quando incubados em uma composição contendo lactose como leite, em que têm uma conversão eficiente de lactose em GOS resultando em uma quantidade mais baixa de lactose livre. A presença de galacto-oligossacarídeos em produtos lácteos ou outros produtos comestíveis tem a vantagem de aumentar o crescimento de cepas microbianas benéficas (probióti- cos) como promotores de saúde de Bifdobacterium sp. no próprio produto e/ou no ser humano ou animal que consome o produto.

[012] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem atividade de transgalactosilação, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, e em que o dito polipeptídeo, sendo um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica o dito polipeptídeo, é o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nucleicos que exibe a atividade de transgalactosilação.

[013] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem atividade de transgalactosilação selecionado a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5; ou ii) a fita complementar de i), e. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com-preendendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo menos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e f. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[014] Em outro aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem atividade de transgalactosilação selecionado a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5; ou ii) a fita complementar de i), d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com-preendendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo menos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e e. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[015] Em um aspecto, é descrito neste pedido o polipeptídeo que é um fragmento C-terminal truncado da SEQ ID NO:22 tendo atividade de transgalactosilação e que é estável contra o truncamento adicional tal como pela degradação proteolítica quando produzido em um organismo adequado tal como Bacillus subtilis, por exemplo, cepa de Bacillus subtilis BG3594 e/ou que é estável contra truncamento adicional durante o armazenamento após formulação final.

[016] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos.

[017] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, é fornecido.

[018] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos.

[019] Em um aspecto, é descrito neste pedido um ácido nucleico capaz de codificar um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[020] Em um aspecto, é descrito neste pedido um vetor de ex pressão e/ou um plasmídeo compreendendo um nucleico como descrito neste pedido, ou capaz de expressar um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[021] Em um aspecto, é descrito neste pedido uma célula capaz de expressar um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[022] Em um aspecto, é descrito neste pedido um método de ex pressar um polipeptídeo, o método compreendendo obtenção de uma célula como descrito neste pedido e expressão do polipeptídeo a partir da célula, e opcionalmente purificação do polipeptídeo.

[023] Em um aspecto, é descrito neste pedido uma composição compreendendo um polipeptídeo como descrito neste pedido, prefe-rencialmente uma composição alimentícia, mais preferencialmente um produto lácteo.

[024] Em um aspecto, é descrito neste pedido um método para produção de um produto alimentício como um produto lácteo pelo tra-tamento de um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[025] Em um aspecto, é descrito neste pedido um galacto- oligossacarídeo ou composição deste obtido pelo tratamento de um substrato compreendendo lactose com um polipeptídeo como descrito neste pedido.

LEGENDAS PARA AS FIGURAS

[026] A figura 1 mostra um mapa de plasmídeo para a variante BIF_1326 para expressão recombinante em Bacillus subtilis.

[027] A figura 2 mostra SDS-PAGE mostrando variantes de trun camento purificadas usando a coluna HyperQ eluída com um gradiente de NaCI.

[028] A figura 3 mostra a proporção da atividade de transgalacto- silação. A proporção é calculada como a proporção entre Abs420 com o aceptor presente dividido por Abs420 sem o aceptor presente vezes 100. As variantes no índice 100 ou abaixo são variantes puramente hidrolíticas, ao passo que o nível acima reflete a atividade de transga- lactosilação relativa.

[029] A figura 4 mostra a eficácia de geração de Galacto- oligossacarídeos (GOS) de variantes selecionadas em uma matriz de iogurte a 30°C por 3 horas. Neste exemplo, GOS são os oligossacarí- deos de quantidade acumulativa em DP3 e acima.

[030] A figura 5 mostra o gel de SDS-PAGE mostrando as varian tes diferentes da tabela 2 expressas e os fragmentos de degradação detectados. O painel inferior mostra a ampliação e a identificação de bandas de degradação. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A SEQ ID NO: 1 (também denominada (BIF_917) neste pedido) é um fragmento de 887 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 2 (também denominada (BIF_995) neste pedido) é um fragmento de 965 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 3 (também denominada (BIF_1068) neste pedido) é um fragmento de 1.038 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 4 (também denominada (BIF_1172) neste pedido) é um fragmento de 1142 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 5 (também denominada (BIF_1241) neste pedido) é um fragmento de 1211 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 6 (também denominada (BIF_1326) neste pedido) é um fragmento de 1296 aminoácidos truncado da SEQ ID NO: 22. A SEQ ID NO: 7 é o núcleo catalítico da glicosídeo hidrolase de Bifido-bacterium bifidum. A SEQ ID NO: 8 é uma sequência nucleotídica que codifica uma lactase extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215. A SEQ ID NO: 9 é a sequência nucleotídica que codifica BIF_917. A SEQ ID NO: 10 é a sequência nucleotídica que codifica BIF_995. A SEQ ID NO: 11 é a sequência nucleotídica que codifica BIF 1068. A SEQ ID NO: 12 é a sequência nucleotídica que codifica BIF_1172. A SEQ ID NO: 13 é a sequência nucleotídica que codifica BIF_1241. A SEQ ID NO: 14 é a sequência nucleotídica que codifica BIF_1326. A SEQ ID NO: 15 é o iniciador de sentido direto para geração das variantes de BIF acima. A SEQ ID NO: 16 é o iniciador de sentido reverso de BIF917. A SEQ ID NO: 17 é o iniciador de sentido reverso de BIF995. A SEQ ID NO: 18 é o iniciador de sentido reverso de BIF1068. A SEQ ID NO: 19 é o iniciador de sentido reverso de BIF1241. A SEQ ID NO: 20 é o iniciador de sentido reverso de BIF1326. A SEQ ID NO: 21 é o iniciador de sentido reverso de BIF1478. A SEQ ID NO: 22 é a lactase extracelular de Bifidobacterium bifidum DSM20215. A SEQ ID NO: 23 é a sequência-sinal de lactase extracelular de Bifi-dobacterium bifidum DSM20215.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[031] Conforme esta descrição detalhada, as seguintes abreviatu ras e definições aplicam-se. Deve ser observado que como usado neste pedido, as formas singulares “a”, “o”, “um” e “uma” incluem os referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa forma, por exemplo, a referência a “um polipeptídeo” inclui uma pluralidade de tais polipeptídeos, e a referência à “formulação” inclui referência a uma ou mais formulações e equivalentes destas conhecidas pelos especialistas na técnica, e similares.

[032] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por um especialista ordinário na técnica. Os seguintes termos são fornecidos abaixo.

[033] “Transgalactosilase” significa uma enzima que, entre outras coisas, é capaz de transferir galactose para os grupos hidroxilas da D- galactose ou D-glicose pelos quais os galacto-oligossacarídeos são produzidos. Em um aspecto, uma transgalactosilase é identificada pela reação da enzima na lactose na qual a quantidade da galactose gerada é menos do que a quantidade de glicose gerada a qualquer dado momento.

[034] No presente contexto, o termo “atividade de transga- lactosilação” significa a transferência de uma porção de galactose para uma molécula além de água. A atividade pode ser medida como [glicose] - [galactose] gerada a qualquer dado momento durante a reação ou pela quantificação direta do GOS gerado a qualquer dado momento durante a reação. Esta medida pode ser realizada de vários modos tal como por um método de HPLC como mostrado nos exemplos. Para comparar as medidas da atividade de transgalactosilação, elas foram realizadas em uma concentração de lactose inicial dada, tal como, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% (p/p).

[035] No presente contexto, o termo “atividade de β- galactosidase” significa a capacidade de uma enzima de hidrolisar β- galactosídeos tal como, por exemplo, a lactose em monossacarídeos, glicose e galactose.

[036] No contexto de calcular a atividade de transgalactosilação: atividade de β-galactosidase, a atividade de β-galactosidase é medida como [galactose] gerada a qualquer dado momento durante a reação. Esta medida pode ser realizada de vários modos tal como por um método de HPLC como mostrado nos exemplos.

[037] No presente contexto, o termo “proporção da atividade de transgalactosilação” usando orto-nitrofenol-β-D-galactopiranosideo (ONPG) foi calculado como se segue: a proporção é calculada como a proporção entre Abs420 com o aceptor presente dividido por Abs420 sem aceptor presente vezes 100. A variante no índice 100 ou abaixo são variantes puramente hidrolíticas, ao passo que o nível acima representa a atividade de transgalactosilação relativa.

[038] A proporção da atividade de transgalactosilação = (Abs420+Celobiose/Abs420-Celobiose)*100%, onde Abs420+Celobiose é a ab- sorbância lida em 420 nm usando o método descrito 3 abaixo incluindo celobiose na reação e Abs420-Celobiose é a absorbância lida em 420 nm usando o método descrito 3 abaixo, mas sem celobiose na reação. A equação acima somente é válida para diluições onde a absorbância está entre 0,5 e 1,0.

[039] Em um aspecto, a atividade é medida após 15 min de rea ção, 30 min de reação, 60 min de reação, 90 min de reação, 120 min de reação ou 180 min de reação. Dessa forma, em um aspecto, como um exemplo, a atividade de transgalactosilação relativa é medida 15 minutos após a adição da enzima, tal como 30 minutos após a adição da enzima, tal como 60 minutos após a adição da enzima, tal como 90 minutos após a adição da enzima, tal como 120 minutos após a adição da enzima ou tal como 180 minutos após a adição da enzima.

[040] No presente contexto, o termo “proporção de atividade de transgalactosilação: atividade de β-galactosidase” significa ([Glicose] - [Galactose] / [Galactose]).

[041] No presente contexto, o termo [Glicose] significa a concen tração de glicose em % em peso como medido por HPLC.

[042] No presente contexto, o termo [Galactose] significa a con centração de galactose em % em peso como medido por HPLC.

[043] No presente contexto, o termo “lactose foi transgalac- tosilada” significa que uma molécula de galactose foi covalentemente ligada à molécula de lactose tal como, por exemplo, covalentemente ligada a qualquer um dos grupos hidroxilas livres na molécula de lactose ou como gerado por transgalactosilação interna, por exemplo, formando alolactose.

[044] No presente contexto, a avaliação do desempenho dos po- lipeptídeos descritos neste pedido, na produção de galacto- oligossacarídeos (GOS), foi testada em um “ensaio baseado em leite” (mimético de aplicação de iogurte). Experimentos em batelada com um volume de 100 μl foram realizados em placas de MTP de 96 poços usando uma mistura de iogurte, consistindo de 98,60% (p/v) de leite de baixo teor de gordura pasteurizado fresco (Arla Mini-maelk) e ingrediente de soro de leite Nutrilac YQ-5075 1,4% (p/v) (Arla). Para hidratar completamente o Nutrilac YQ-5075, a mistura foi deixada com agitação por 20 h e posteriormente foi adicionado NaFosfato 20 mM pH 6,5 para assegurar um pH de 6,5. Esta base de iogurte foi usada pura ou com vários suplementos como mais lactose, fucose, maltose, xilose ou sais. 90 μl do iogurte foram misturados com 10 μl de enzima purificada ou fermento bruto, selados com fita e incubados a 43°C por 3 horas. A reação foi parada por 100 μl de Na2CO3 10%. As amostras foram armazenadas a -20°C. A quantificação de galacto-oligossacarídeos (GOS), lactose, glicose e galactose foi realizada por HPLC. A análise de amostras foi realizada em um Dionex ICS 3000. Os parâmetros de IC foram como se segue: fase móvel: NaOH 150 mM, Fluxo: Isocráti- co, 0,25 ml/min, Coluna: Carbopac PA1, temperatura da Coluna: TA, volume de Injeção: 10 μl, detectores: PAD, Integração: Manual, Prepa-ração da amostra: diluição de 100 vezes em água Milli-Q (0,1 ml de amostra + 9,9 ml de água) e filtração por filtros de seringa de 0,45 μm, Quantificação: áreas de pico em porcentagem da área de pico padrão. Um xarope de GOS (Vivanal GOS, Friesland Campina) foi usado como padrão para a quantificação de GOS. Os resultados de tal avaliação são mostrados na Figura 4, e ainda descritos no exemplo 2.

[045] No presente contexto, o termo “polipeptídeo, o qual é con gelado a vácuo” significa que o polipeptídeo foi obtido por congelamento a vácuo de um líquido do polipeptídeo em uma pressão apropriada e durante um período apropriado removendo a água.

[046] No presente contexto, o termo “polipeptídeo, o qual está em solução” refere-se a um polipeptídeo que é solúvel em um solvente sem precipitar da solução. Um solvente com esta finalidade inclui qualquer circundante no qual o polipeptídeo pode ocorrer, como um tampão aquoso ou solução salina, um caldo de fermentação ou citoplasma de um hospedeiro de expressão.

[047] No presente contexto, o termo “estabilizante” significa qual quer estabilizante para estabilizar o polipeptídeo, por exemplo, um po- liol tal como, por exemplo, glicerol ou propilenoglicol, um açúcar ou um álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático). Em um aspecto, o estabilizante é glicerol.

[048] No presente contexto, o termo “substrato de carboidrato” significa um composto orgânico com a fórmula geral Cm(H2O)n, isto é, consistindo somente em carbono, hidrogênio e oxigênio, os dois últimos na proporção 2:1 de átomos como um dissacarídeo.

[049] No presente contexto, o termo “dissacarídeo” são duas uni dades de monossacarídeos ligadas em conjunto por uma ligação covalente conhecida como uma ligação glicosídica formada via uma reação de desidratação, resultando na perda de um átomo de hidrogênio de um monossacarídeo e um grupo hidroxila do outro. A fórmula dos dis- sacarídeos não modificados é C12H22O11. Em um aspecto, o dissacarí- deo é lactulose, trealose, ramnose, maltose, sacarose, lactose, fucose ou celobiose. Em um aspecto adicional, o dissacarídeo é lactose.

[050] O termo “isolado” significa que o polipeptídeo pelo menos é substancialmente isento de pelo menos um outro componente com o qual a sequência está associada naturalmente na natureza e como encontrado na natureza. Em um aspecto, “polipeptídeo isolado”, como usado neste pedido, se refere a um polipeptídeo que é pelo menos 30% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro, e pelo menos 95% puro, como determinado por SDS-PAGE.

[051] O termo “polipeptídeo substancialmente puro” significa, neste pedido, uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10%, preferencialmente no máximo 8%, mais preferencialmente no máximo 6%, mais preferencialmente no máximo 5%, mais preferencialmente no máximo 4%, no máximo 3%, até mais preferencialmente no máximo 2%, ainda mais preferencialmente no máximo 1%, e até mais preferencialmente no máximo 0,5% em peso de outro material polipeptídico com o qual esteja associado nativamente. Por isso, é preferencial que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, preferencialmente pelo menos 94% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferencialmente pelo menos 96% puro, mais preferencialmente pelo menos 96% puro, mais prefe-rencialmente pelo menos 97% puro, mais preferencialmente pelo menos 98% puro, até mais preferencialmente pelo menos 99%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99,5% puro, e até mais preferencialmente 100% puro em peso do material polipeptídico presente total na preparação. Os polipeptídeos descritos neste pedido estão preferencialmente em uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferencial que os polipeptídeos estejam em “forma essencialmente pura”, isto é, que a preparação de polipeptídeo seja essencialmente isenta de outro material polipeptídico com o qual esteja associado nativamente. Isto pode ser realizado, por exemplo, preparando o polipep- tídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos. Neste pedido, o termo “polipeptídeo substancialmente puro” é sinônimo aos termos “polipeptídeo isolado” e “polipeptídeo em forma isolada.”

[052] O termo “purificado” ou “puro” significa que um dado com ponente está presente em um estado de alto nível, por exemplo, pelo menos aproximadamente 51% puro, como pelo menos 51% puro, ou pelo menos aproximadamente 75% puro como pelo menos 75% puro, ou pelo menos aproximadamente 80% puro como pelo menos 80% puro, ou pelo menos aproximadamente 90% puro como pelo menos 90% puro, ou pelo menos aproximadamente 95% puro como pelo menos 95% puro, ou pelo menos aproximadamente 98% puro como pelo menos 98% puro. O componente é desejavelmente o componente ativo predominante presente em uma composição.

[053] O termo “micro-organismo”, em relação à presente inven ção, inclui qualquer “micro-organismo” que pode compreender uma sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção ou uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo tendo as propriedades específicas como definido neste pedido e/ou produtos obtidos deste. No presente contexto, “micro-organismo” pode incluir qualquer bactéria ou fungo que é capaz de fermentar um substrato lácteo.

[054] O termo “célula hospedeira” - em relação à presente inven ção - inclui qualquer célula compreendendo uma sequência nucleotídi- ca que codifica um polipeptídeo tendo as propriedades específicas como definido neste pedido ou um vetor de expressão como descrito acima e que é usado na produção de um polipeptídeo tendo as propriedades específicas como definido neste pedido. Em um aspecto, a produção é a produção recombinante.

[055] O termo “leite”, no contexto da presente invenção, deve ser entendido como a secreção láctea obtida de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos.

[056] No presente contexto, o termo “substrato baseado em leite” significa qualquer material lácteo bruto e/ou processado ou um material derivado dos constituintes do leite. Substratos baseados em leite úteis incluem, mas não são limitados a, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos similares a leite compreendendo lactose, como leite integral ou de baixo teor de gordura, leite desnatado, soro, leite em pó reconstituído, leite condensado, soluções de leite em pó, leite UHT, soro de leite, permeado de soro de leite, soro de leite ácido ou creme. Preferencialmente, o substrato baseado em leite é leite ou uma solução aquosa de leite em pó desnatado. O substrato baseado em leite pode ser mais concentrado do que o leite bruto. Em uma modalidade, o substrato baseado em leite tem uma proporção de proteína para lactose de pelo menos 0,2, preferencialmente pelo menos 0,3, pelo menos 0,4, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6 ou, ainda mais preferencialmente, pelo menos 0,7.

[057] O substrato baseado em leite pode ser homogeneizado e/ou pasteurizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica.

[058] “Homogeneizar”, como usado neste pedido, significa mistu ra intensiva para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Pode ser realizado para romper a gordura do leite em tamanhos menores de forma que não se separe do leite. Isto pode ser realizado forçando o leite em alta pressão através de pequenos orifícios.

[059] “Pasteurização”, como usado neste pedido, significa reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, como micro-organismos, no substrato baseado em leite. Preferencialmente, a pasteurização é alcançada mantendo uma temperatura especificada durante um perío- do específico de tempo. A temperatura especificada é normalmente alcançada por aquecimento. A temperatura e a duração podem ser selecionadas a fim de eliminar ou inativar certas bactérias, como bactérias perigosas, e/ou inativar as enzimas no leite. Uma etapa de resfriamento rápida pode seguir. Um “produto alimentício” ou “composição alimentícia”, no contexto da presente invenção, podem ser quaisquer alimento comestível ou produto alimentício adequados para o consumo por um animal ou ser humano.

[060] Um “produto lácteo”, no contexto da presente invenção, po de ser qualquer produto alimentício em que um dos constituintes principais é baseado em leite. Preferencialmente, o constituinte principal é baseado em leite. Mais preferencialmente, o constituinte principal é um substrato baseado em leite que foi tratado com uma enzima tendo atividade de transgalactosilação.

[061] No presente contexto, “um dos constituintes principais” sig nifica um constituinte tendo uma matéria seca que constitui mais de 20%, preferencialmente mais de 30% ou mais de 40% da matéria seca total do produto lácteo, ao passo que “o constituinte principal” significa um constituinte tendo uma matéria seca que constitui mais de 50%, preferencialmente mais de 60% ou mais de 70% da matéria seca total do produto lácteo.

[062] Um “produto lácteo fermentado”, no presente contexto, de ve ser entendido como qualquer produto lácteo em que qualquer tipo de fermentação é parte do processo de produção. Exemplos de produtos lácteos fermentados são produtos como iogurte, soro, crème frafche, quark e queijo fresco. Outro exemplo de um produto lácteo fermentado é queijo. Um produto lácteo fermentado pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica.

[063] O termo “fermentação” significa conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos por meio da ação de um micro-organismo como uma cultura inicial. Em um aspecto, a fermentação compreende a conversão de lactose a ácido lático.

[064] No presente contexto, “micro-organismo” pode incluir qual quer bactéria ou fungo que é capaz de fermentar um substrato lácteo.

[065] No presente contexto, o termo “domínios de Pfam” significa regiões dentro de uma sequência proteica que são identificadas como Pfam-A ou Pfam-B baseado em múltiplos alinhamentos de sequência e a presença de Motivos de Markov Ocultos (“The Pfam protein families database": R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222.). Como exemplos de domínios Pfam, menção pode ser feita a Glico_hidro2N (PF02837), Gli- co_hidro (PF00703), Glico_hidro 2C (PF02836) e domínio similar à Ig Bacteriana (grupo 4) (PF07532).

[066] Como usado neste pedido, “uma posição que corresponde à posição” significa que um alinhamento como descrito neste pedido é feito entre um polipeptídeo da consulta particular e o polipeptídeo de referência. A posição que corresponde a uma posição específica no polipeptídeo de referência então é identificada como o aminoácido correspondente no alinhamento com identidade de sequência mais alta.

[067] Uma “variante” ou “variantes” referem-se a polipeptídeos ou a ácidos nucleicos. O termo “variante” pode ser usado intercambiavel- mente com o termo “mutante”. As variantes incluem inserções, substi-tuições, transversões, truncamentos e/ou inversões em uma ou mais posições na sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos, respecti-vamente. As frases “polipeptídeo variante”, “variante de polipeptídeo”, “polipeptídeo”, “variante” e “enzima variante” significam um polipeptí- deo/proteína tendo uma sequência de aminoácidos que tem ou compreende uma sequência de aminoácidos selecionada ou é modificada em comparação com a sequência de aminoácidos selecionada, como a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[068] Tal como usado neste pedido, “enzimas de referência,” “se quência de referência,” “polipeptídeo de referência” significa enzimas e polipeptídeos dos quais qualquer um dos polipeptídeos variantes são baseados, por exemplo, a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Um “ácido nu- cleico de referência” significa uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de referência.

[069] Como usado neste pedido, os termos “sequência de refe rência” e “sequência objeto” são usados intercambiavelmente.

[070] Como usado neste pedido, “sequência de consulta” signifi ca uma sequência estranha, que é alinhada com uma sequência de referência a fim de verificar se está incluída no escopo da presente invenção. Consequentemente, tal sequência de consulta, por exemplo, pode ser uma sequência da técnica prévia ou uma sequência de terceiros.

[071] Como usado neste pedido, o termo “sequência” pode se referir a uma sequência polipeptídica ou uma sequência de ácidos nu- cleicos, dependendo do contexto.

[072] Como usado neste pedido, os termos “sequência de poli- peptídeos” e “sequência de aminoácidos” são usados intercambiavel- mente.

[073] A sequência-sinal de uma “variante” pode ser a mesma ou pode diferenciar-se da sequência-sinal de um peptídeo sinal de Bacillus selvagem ou qualquer sequência-sinal que secretará o polipeptí- deo. Uma variante pode ser expressa como uma proteína de fusão que contém um polipeptídeo heterólogo. Por exemplo, a variante pode compreender um peptídeo sinal de outra proteína ou uma sequência projetada para ajudar a identificação ou a purificação da proteína de fusão expressa, como uma sequência de marcador His.

[074] Para descrever várias variantes que são contempladas a serem englobadas pela presente descrição, a seguinte nomenclatura será adotada para facilidade de referência. Onde a substituição inclui um número e uma letra, por exemplo, 592P, então isto refere-se à {posição de acordo com o sistema de numeração/aminoácido substituído}. Consequentemente, por exemplo, a substituição de um aminoácido por prolina na posição 592 é designada como 592P. Onde a substituição inclui uma letra, um número, e uma letra, por exemplo, D592P, então isto refere-se a {aminoácido original/posição de acordo com sistema de numeração/aminoácido substituído }.

[075] Consequentemente, por exemplo, a substituição de alanina por prolina na posição 592 é designada como A592P.

[076] Onde duas ou mais substituições são possíveis em uma posição particular, isto será designado por letras contíguas, que podem ser opcionalmente separadas por barras “/”, por exemplo, G303ED ou G303E/D.

[077] Posição(ões) e substituições são listadas com referência, por exemplo, a qualquer SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Posições equivalentes, por exemplo, em outra sequência podem ser encontradas alinhando esta sequência com a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou com 5 para encontrar um alinhamento com identidade percentual mais alta e depois disso determinar que aminoácido se alinha para corresponder a um aminoácido de uma posição específica da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou de 5. Tal alinhamento e uso de uma sequência como uma primeira referência são simplesmente uma matéria de rotina para um especialista ordinário na técnica.

[078] Como usado neste pedido, o termo “expressão” refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido baseado na sequência de ácidos nucleicos de um gene. O processo inclui tanto a transcrição como a tradução.

[079] Como usado neste pedido, “polipeptídeo” é usado inter- cambiavelmente com os termos “sequência de aminoácidos”, “enzima”, “peptídeo” e/ou “proteína”. Como usado neste pedido, “sequência nucleotídica” ou “sequência de ácidos nucleicos” se referem a uma se-quência de oligonucleotídeos ou sequência de polinucleotídeos e variantes, homólogos, fragmentos e derivados destas. A sequência nucle- otídica pode ser de origem genômica, sintética ou recombinante e pode ser de fita dupla ou de fita simples, se representar a fita sentido ou antissentido. Como usado neste pedido, o termo “sequência de nu- cleotídeos” inclui DNA genômico, cDNA, DNA sintético e RNA.

[080] “Homólogo” significa uma entidade que tem certo grau de identidade ou “homologia” com as sequências de aminoácidos objeto e as sequências nucleotídicas objeto. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos objeto é a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, e a sequência nu- cleotídica objeto preferencialmente é a SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13.

[081] Uma “sequência homóloga” inclui um polinucleotídeo ou um polipeptídeo tendo certa porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%, da identidade de sequência com outra sequência. Identidade percentual significa que, quando alinhadas, a porcentagem de bases ou resíduos de aminoácidos é a mesma ao comparar as duas sequências. As sequências de aminoácidos não são idênticas, onde um aminoácido é substituído, deletado ou adicionado em comparação com a sequência objeto. A identidade de sequência percentual tipicamente é medida com respeito à sequência madura da proteína objeto, isto é, após remoção de uma sequência-sinal, por exemplo, tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos resíduos de sítio ativos que a sequência de aminoácidos objeto. Os homólogos também conservam a atividade enzimática, embora o homólogo possa ter propriedades enzimáticas diferentes do que a selvagem.

[082] Como usado neste pedido, “hibridização” inclui o processo pelo qual uma fita de ácido nucleico se junta com uma fita complementar por meio do pareamento de bases, bem como o processo de amplificação como realizado em tecnologias de reação de polimerase em cadeia (PCR). O ácido nucleico variante pode existir como DNA ou RNA de fita única ou dupla, RNA/DNA heterodúplex ou um copolímero de RNA/DNA. Como usado neste pedido, “copolímero” refere-se a uma fita de ácido nucleico única compreendendo tanto ribonucleotí- deos como desoxirribonucleotídeos. O ácido nucleico variante pode ser otimizado por códon para aumentar mais a expressão.

[083] Como usado neste pedido, um composto “sintético” é pro duzido por síntese química ou enzimática in vitro. Inclui, mas não é limitado a, ácidos nucleicos variantes feitos com o uso ótimo de códon de organismos hospedeiros, como um hospedeiro de célula de levedura ou outros hospedeiros de expressão de escolha.

[084] Como usado neste pedido, “célula transformada” inclui célu las, incluindo tanto células bacterianas como fúngicas, que foram transformadas pelo uso de técnicas de DNA recombinante. A transformação tipicamente ocorre pela inserção de uma ou mais sequências nucleotídicas em uma célula. A sequência nucleotídica inserida pode ser uma sequência nucleotídica heteróloga, isto é, é uma sequência que não é natural para a célula que deve ser transformada, como uma proteína de fusão.

[085] Como usado neste pedido, “operacionalmente ligado” signi fica que os componentes descritos estão em uma relação que os permite funcionar na sua maneira desejada. Por exemplo, uma sequência reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é al-cançada sob condição compatível com as sequências controle.

[086] Como usado neste pedido, o termo “fragmento” é definido neste pedido como um polipeptídeo tendo um ou mais (vários) amino- ácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila em que o fragmento tem atividade.

[087] Em um aspecto, o termo “fragmento” é definido neste pedido como um polipeptídeo tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5; em que o fragmento tem atividade de transgalactosilação.

[088] O termo “similar ao domínio de Ligação à Galactose”, como usado neste pedido, é abreviado e intercambiável com o termo “GBD”.

Grau de identidade

[089] O relacionamento entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências nucleotídicas é descrito pelo parâmetro “identidade”.

[090] Em uma modalidade, o grau de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência é de-terminado pelo 1) alinhamento das duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré- configurada e penalidade de lacuna pré-configurada, 2) pela identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nu- cleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) pela divisão do número de combinações exatas pelo comprimento da sequência de referência.

[091] Em uma modalidade, o grau de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência é de-terminado pelo 1) alinhamento das duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré- configurada e penalidade de lacuna pré-configurada, 2) pela identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nu- cleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) pela divisão do número de combinações exatas pelo comprimento da mais longa das duas sequências.

[092] Em outra modalidade, o grau de identidade de sequência entre a sequência de consulta e a sequência de referência é determinado pelo 1) alinhamento das duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré- configurada e penalidade de lacuna pré-configurada, 2) pela identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nu- cleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) pela divisão do número de combinações exatas pelo “comprimento de alinhamento”, onde o comprimento de alinhamento é o comprimento do alinhamento inteiro, incluindo lacunas e partes salientes das sequências.

[093] As comparações de identidade de sequência podem ser conduzidas visualmente, ou mais normalmente, com a ajuda de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis usam algoritmos de comparação complexos para alinhar duas ou mais sequências que melhor refletem os eventos evolutivos que poderiam ter levado à diferença(s) entre duas ou mais sequências. Por isso, estes algoritmos operam com um sistema de classificação que recompensa o alinhamento de aminoácidos idênticos ou similares e penaliza a inserção de lacunas, extensões de lacuna e alinhamento de aminoácidos não similares. O sistema de classificação dos algoritmos de comparação inclui: i) atribuição de um escore de penalidade cada vez que uma lacuna é inserida (escore de penalidade de lacuna), ii) atribuição de um escore de penalidade cada vez que uma lacuna existente é estendida com uma posição extra (escore de penalidade de extensão), iii) atribuição de altos escores após alinhamento de amino- ácidos idênticos, e iv) atribuição de escores variáveis após alinhamento de aminoácidos não idênticos.

[094] A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalidades de lacuna sejam modificadas. Entretanto, é preferencial usar os valores pré-configurados ao usar tal programa para comparações de sequência.

[095] Os escores dados para o alinhamento de aminoácidos não idênticos são atribuídos de acordo com uma matriz de classificação também chamada uma matriz de substituição. Os escores fornecidos em tais matrizes de substituição estão refletindo o fato de que a probabilidade de um aminoácido ser substituído por outro durante a evolução varia e depende da natureza física/química do aminoácido a ser substituído. Por exemplo, a probabilidade de um aminoácido polar ser substituído por outro aminoácido polar é mais alta em comparação com ser substituído por um aminoácido hidrofóbico. Por isso, a matriz de marcação destinará o escore mais alto para aminoácidos idênticos, escore mais baixo para aminoácidos não idênticos, mas similares, e escore ainda mais baixo para aminoácidos não similares não idênticos. As matrizes de marcação ainda mais frequentemente usadas são as matrizes PAM (Dayhoff et al. (1978), Jones et al. (1992)), as matrizes BLOSUM (Henikoff e Henikoff (1992)) e a matriz Gonnet (Gonnet et al. (1992)).

[096] Programas de computador adequados para executar tal ali nhamento incluem, mas não são limitados a, Vector NTI (Invitrogen Corp.) e os programas ClustalV, ClustalW e ClustalW2 (Higgins DG & Sharp PM (1988), Higgins et al. (1992), Thompson et al. (1994), Larkin et al. (2007). Uma seleção de diferentes instrumentos de alinhamento está disponível no servidor ExPASy Proteomics em www.expasy.org. Outro exemplo de programa que pode realizar o alinhamento de sequência é BLAST (Instrumento de Pesquisa de Alinhamento Local Básico), que está disponível na página web do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia que pode ser atualmente encontrada em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e que foi primeiramente descrito em Al- tschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215; 403-410.

[097] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o programa de alinhamento realiza um programa de alinhamento global, que otimiza o alinhamento ao longo das sequências inteiras. Em uma modalidade preferencial adicional, o programa de alinhamento global é baseado no algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B.; e Wunsch, Christian D. (1970), “A general method applicable to the search for similarities in amino acid sequence of two proteins”, Journal of Molecular Biology 48 (3): 443-53). Exemplos de programas atuais que executam alinhamentos globais usando o algoritmo Needleman- Wunsch são programas EMBOSS Needle (EMBOSS Needle) e EMBOSS Stretcher (EMBOSS Stretcher), que ambos estão disponíveis em http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/.

[098] EMBOSS Needle executa um alinhamento ótimo de se quência global usando o algoritmo de alinhamento Needleman- Wunsch para encontrar o alinhamento ótimo (incluindo lacunas) de duas sequências ao longo de seu comprimento completo.

[099] EMBOSS Stretcher usa uma modificação do algoritmo Ne- edleman-Wunsch que permite sequências maiores serem globalmente alinhadas.

[0100] Em uma modalidade, as sequências são alinhadas por um programa de alinhamento global e a identidade de sequência é calculada identificando o número de combinações exatas identificadas pelo programa dividido pelo “comprimento de alinhamento”, onde o com- primento de alinhamento é o comprimento de alinhamento completo, incluindo lacunas e partes salientes das sequências.

[0101] Em uma modalidade adicional, o programa de alinhamento global usa o algoritmo Needleman-Wunsch e a identidade de sequência é calculada identificando o número de combinações exatas identificadas pelo programa dividido pelo “comprimento de alinhamento”, onde o comprimento de alinhamento é o comprimento de alinhamento completo incluindo lacunas e partes salientes das sequências.

[0102] Ainda em uma modalidade adicional, o programa de ali- nhamento global é selecionado a partir do grupo consistindo de EMBOSS Needle e EMBOSS Stretcher, e a identidade de sequência é calculada identificando o número de combinações exatas identificadas pelo programa dividido pelo “comprimento de alinhamento”, onde o comprimento de alinhamento é o comprimento de alinhamento completo, incluindo lacunas e partes salientes das sequências.

[0103] Uma vez que o programa produziu um alinhamento, é pos- sível calcular a similaridade % e a identidade de sequência %. O programa tipicamente faz isto como parte da comparação de sequência e gera um resultado numérico.

[0104] Em uma modalidade, é preferencial usar o programa Clus- talW para realizar alinhamentos de sequência. Preferencialmente, o alinhamento com ClustalW é realizado com os seguintes parâmetros para o alinhamento aos pares:

[0105] ClustalW2, por exemplo, é colocado à disposição na Inter net pelo Instituto Europeu de Bioinformática na página web EMBL-EBI www.ebi.ac.uk sob ferramentas - análise de sequência - ClustalW2. Atualmente, o endereço exato do instrumento ClustalW2 é www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2.

[0106] Em outra modalidade, é preferencial usar o programa Align X no Vector NTI (Invitrogen) para realizar alinhamentos de sequência. Em uma modalidade, Exp10 pode ter sido usado com as configurações padrão: Penalidade inicial de lacuna: 10 Penalidade de extensão de lacuna: 0,05 Faixa de penalidade de separação de lacuna: 8

[0107] Em outra modalidade, o alinhamento de uma sequência de aminoácidos com ou para outra sequência de aminoácidos é determinada pelo uso da matriz de escore: blosum62mt2 e as configurações de alinhamento de pareamento de VectorNTI Configurações K-tuple 1 Número das melhores diagonais 5 Tamanho da janela 5 Penalidade de lacuna 3 Penalidade de abertura de lacuna 10 Penalidade de extensão de lacuna 0,1

[0108] Em uma modalidade, a porcentagem da identidade de uma sequência de aminoácidos com ou para outra sequência de aminoáci- dos é determinada pelo uso de Blast com um tamanho de palavra de 3 e com BLOSUM 62 como a matriz de substituição Polipeptídeos

[0109] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem uma proporção da atividade de transgalactosilação: atividade de β-galactosidase de pelo menos 0,5, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 2,5, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 em uma concentração de 3% p/p ou acima da concentração de lactose inicial.

[0110] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo, em que o núcleo catalítico do glicosídeo hidrolase tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:7.

[0111] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que contém domínios Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703) e/ou Glico_hidro 2C (PF02836).

[0112] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que contém o domínio similar à Ig Bacteriana (grupo 4) (PF07532).

[0113] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem atividade de transgalactosilação selecionada a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou ii) a fita complementar de i), e. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com-preendendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo me- nos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e f. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0114] Em outro aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem atividade de transgalactosilação selecionada a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5; ou ii) a fita complementar de i), d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com-preendendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo menos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e e. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0115] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à sequência de amino- ácidos madura da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0116] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem identidade de sequência de 90% à sequência de aminoácidos madura da SEQ ID NO: 1.

[0117] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem identidade de sequência de 90% à sequência de aminoácidos madura da SEQ ID NO: 2.

[0118] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem identidade de sequência de 96,5% à sequência de aminoáci- dos madura da SEQ ID NO: 3.

[0119] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem identidade de sequência de 96,5% à sequência de aminoáci- dos madura da SEQ ID NO: 4.

[0120] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem identidade de sequência de 96,5% à sequência de aminoáci- dos madura da SEQ ID NO: 5.

[0121] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0122] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo, que é derivado de Bifidobacterium bifidum.

[0123] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem uma condição favorável de pH de 6,5-7,5.

[0124] Em um aspecto, é descrito neste pedido um polipeptídeo que tem uma condição favorável de temperatura de 30-60 como 42-60 graus Celsius.

[0125] Os polipeptídeos que têm atividade nos carboidratos podem ser classificados usando o sistema de classificação IUBMB baseado na sua especificidade de substrato ou na atribuição de CaZy em uma família glicosídeo hidrolase corrente 125. No banco de dados CaZy, a atribuição é baseada tanto em sequência como em informação estrutural combinada com o conhecimento da estereoquímica dos substratos e produtos.

[0126] São descritos neste pedido polipeptídeos que, quando são um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica o dito polipeptídeo, são o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nucleicos que exibe atividade de transgalactosilação. Isto pode ser avaliado usando as seguintes técnicas conhecidas por um especialista na técnica. As amostras a serem avaliadas são submetidas à SDS-PAGE e visualizadas usando um corante apropriado para a quantificação proteica, tal como, por exemplo, o sistema Bio-Rad Criterion. O gel então é esquadrinhado usando o scanner densiométrico apropriado tal como, por exemplo, que o sistema Bio-Rad Criterion e a imagem resultante é assegurada estar na faixa dinâmica. As faixas que correspondem a qualquer variante/fragmento derivado da SEQ ID NO: 8 são quantificadas e a porcentagem dos polipeptídeos é calculada como: porcentagem de polipeptídeo em questão = polipeptídeo em questão / (soma de todos os polipeptídeos que exibem atividade de transgalactosilação) *100.

[0127] O número total de variantes/fragmentos de polipeptídeos derivados da SEQ ID NO:8 na composição pode ser determinado de-tectando o fragmento derivado da SEQ ID NO:8 por Western blotting usando um anticorpo policlonal por métodos conhecidos por um espe- cialista na técnica.

[0128] O polipeptídeo descrito neste pedido compreende pelo me nos dois domínios funcionais separados contidos dentro da enzima. Primeiramente, o polipeptídeo deve conter um núcleo catalítico de gli- cosídeo hidrolase como descrito a seguir. O núcleo catalítico deve pertencer ao clã GH-A das famílias de glicosídeo hidrolase relacionadas. O clã GH-A é caracterizado clivando ligações glicosídicas através de um mecanismo retentor e possui um domínio catalítico que é baseado em enovelamento TIM barril (Wierenga, 2001, FEBS Letters, 492 (3), p 193-8). O domínio catalítico contém dois resíduos glutâmicos que atuam como doador de prótons e nucleófilo, originando-se das fitas 4 e 7 do domínio barril (Jenkins, 1995, FEBS Letters, 362 (3), p 281-5). A estrutura total do TIM barril é um enovelamento 8 (β/α) consistindo em 8 fitas beta e 8 alfa-hélices. Em um aspecto, o núcleo catalítico do gli- cosídeo hidrolase descrito neste pedido pertence a famílias da glicosí- deo hidrolase GH-2, e -35 que são todas as enzimas TIM-barril que pertencem ao clã GH-A. Em um aspecto adicional, o núcleo catalítico da glicosídeo hidrolase pertence à família GH-2 ou GH-35. Em um aspecto adicional, o núcleo catalítico da glicosídeo hidrolase pertence à família GH-2. Um denominador comum é que estas enzimas são as chamadas enzimas retentoras, para que a estereoquímica do substrato seja conservada no produto (Henrissat, 1997, Curr Opin Struct Biol, 7 (5), 637-44).

[0129] Em um aspecto, os polipeptídeos descritos neste pedido têm atividade sobre ligações de carboidratos que têm a conformação β(1^4). Isto efetivamente coloca as enzimas na classe EC IUBMB 3.2.1.23 de β-galactosidases. Esta atividade pode ser, mas não é confinada a, determinada utilizando substratos sintéticos como para- nitrofenol-e-D-galactopiranosídeo (PNPG), orto—nitrofenol—β—D—galacto— piranosídeo (ONPG) ou β—D—galactopiranosideo com agliconas cromo- gênicas (XGal). Como um modo alternativo de determinar se uma enzima pertence à classe EC 3.2.1.23 de β-galactosidases, deve ser incubada com um substrato como lactose e medir a liberação de glicose por um método como determinação enzimática, HPLC, TLC ou outros métodos conhecidos por especialistas na técnica.

[0130] A fim de predizer as entidades funcionais de polipeptídeos, vários repositórios públicos disponíveis podem ser aplicados tais como, por exemplo, Pfam (Nucl. Acids Res. (2010) 38 (supl 1): D211D222. doi: 10.1093/nar/gkp985) e Interpro (Nucl. Acids Res. (2009) 37 (supl 1): D211-D215. doi: 10.1093/nar/gkn785). Deve ser especificado que ao realizar tal análise, a análise deve ser realizada na sequência completa do polipeptídeo disponível de bancos de dados de repositório públicos.

[0131] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo que contém um ou mais domínios Pfam selecionados a partir de: Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703), Glico_hidro 2C (PF02836) e domínio similar à Ig Bacteriana (grupo 4) (PF07532), é fornecido. Ainda em um aspecto adicional, um polipeptídeo que contém os domínios Pfam Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703), Glico_hidro 2C (PF02836) e domínio similar à Ig Bacteriana (grupo 4) (PF07532), é fornecido. Ainda em um aspecto adicional, um polipeptídeo que contém domínios Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703) e Gli- co_hidro 2C (PF02836) que constituem o domínio catalítico do polipep- tídeo, é fornecido.

[0132] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo como descrito neste pedido e tendo uma proporção de atividade de transgalactosila- ção: atividade de β-galactosidase de pelo menos 1, pelo menos 2,5, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, ou pelo menos 12 como medida em uma concentração de 100 ppm em um ensaio baseado em leite a 37°C e lactose 5% p/p após reação de 15, 30 ou 180 tal como 180 minutos, é fornecido. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo é derivado de Bifidobacterium bifidum.

[0133] Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedi do tem uma atividade de transgalactosilação tal que mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, até 50% da lactose inicial são transgalactosilados como medido em uma concentração de 100 ppm em um ensaio baseado em leite a 37°C e lactose 5% p/p após 15, 30 ou 180 tal como 180 minutos de reação.

[0134] Em um aspecto adicional, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) nes te pedido tem uma atividade de β-galactosidase tal que menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20% da lactose foi hidrolisada como medido em uma concentração de 100 ppm em um ensaio baseado em leite a 37°C e lactose 5% p/p depois 15, 30 ou 180 como 180 minutos de reação.

[0135] Em um aspecto, a atividade de β-galactosidase e/ou ativida de de transgalactosilação são medidas em uma concentração de 100 ppm correspondendo a 2,13 LAU, como especificado no método 4.

[0136] Em um aspecto adicional, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedido tem uma ou mais das seguintes características: a) uma proporção de atividade de transgalactosilação: atividade de β-galactosidase de pelo menos 1, pelo menos 2,5, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11 ou pelo menos 12 como medido em uma concentração de 100 ppm em um ensaio baseado em leite a 37°C e lactose 5% p/p depois 15, 30 ou 180 tal como reação de 180 minutos, e/ou b) tem uma atividade de transgalactosilação tal que mais de 20%, mais de 30%, mais de 40% e até 50% da lactose inicial foi trans- galactosilada como medido em uma concentração de 100 ppm em um ensaio baseado em leite a 37°C e lactose 5% p/p depois 15, 30 ou 180 tal como reação de 180 minutos.

[0137] Em um aspecto, um polipeptídeo compreendendo uma se quência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Em um aspecto adicional, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1 tal como em que a dita identidade de sequência é pelo menos 95%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100%, e em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Em um aspecto adicional, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Ainda em um aspecto adicional, um polipep- tídeo em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1 tal como em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 90%, tal como, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou identidade de sequência de pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 1 é fornecido. Em outro aspecto, um polipeptídeo que tem identidade de sequência de pelo menos 96,5% à SEQ ID NO: 2 tal como em que o dito polipeptí- deo tem pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, os polipeptídeos descritos neste pedido consistem em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 970 resíduos de aminoácidos, tal como no máximo 950 resí- duos de aminoácidos, tal como no máximo 940 resíduos de aminoáci- dos, no máximo 930 resíduos de aminoácidos, no máximo 920 resíduos de aminoácidos, no máximo 910 resíduos de aminoácidos, no máximo 900 resíduos de aminoácidos, no máximo 895 resíduos de aminoácidos ou no máximo 890 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Em um aspecto, um polipeptídeo particular que consiste em 887 ou 965 resíduos de aminoácidos é fornecido. Em um aspecto, um polipep- tídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2 tal como em que a dita identidade de sequência é pelo menos 98%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 99% ou pelo menos 100%, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 970 ou pelo menos 965 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Em um aspecto, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, é fornecido.

[0138] Em um aspecto preferencial adicional, um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, é fornecido. Ainda em um aspecto preferencial, um polipeptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5, especialmente um poli- peptídeo consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 2, é fornecido.

[0139] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3 tal como em que a dita identidade de sequência é pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100%, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resí- duos de aminoácidos, é fornecido.

[0140] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 98,5%, como identidade de sequência de pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% com a SEQ ID NO: 5, é fornecido. Em um aspecto, tal polipeptídeo consiste em no máximo 1.290 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 1280, no máximo 1270, no máximo 1260, no máximo 1250, no máximo 1240, no máximo 1230, no máximo 1220 ou no máximo 1.215 resíduos de ami- noácidos, é fornecido. Em um aspecto preferencial, um polipeptídeo que consiste em 1.211 resíduos de aminoácidos, é fornecido.

[0141] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 96% como pelo menos pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 4, é fornecido. Em um aspecto, um polipeptídeo que consiste de no máximo 1.210 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 1200, no máximo 1190, no máximo 1180, no máximo 1170, no máximo 1160, no máximo 1150 ou no máximo 1.145 resíduos de aminoácidos, como 1.142 resíduos de aminoácidos, é fornecido.

[0142] Em um aspecto adicional, um polipeptídeo em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 96,5% como pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 3, é fornecido. Em um aspecto, um polipeptídeo que consiste de no máximo 1.130 resíduos de aminoáci- dos, tal como, por exemplo, no máximo 1120, no máximo 1110, no máximo 1100, no máximo 1.090, no máximo 1.080, no máximo 1.070, no máximo 1.060, no máximo 1.050, no máximo 1.055 ou no máximo 1.040 resíduos de aminoácidos, é fornecido. Em um aspecto preferencial, um polipeptídeo que consiste em 1.038 resíduos de aminoácidos, é fornecido.

[0143] Em um aspecto adicional, os polipeptídeos descritos neste pedido têm uma proporção da atividade de transgalactosilação acima de 100% tal como acima de 150%, 175% ou 200%.

[0144] As proteínas são geralmente compreendidas de uma ou mais regiões funcionais, comumente denominadas de domínios. A presença de domínios diferentes em combinações variadas em proteínas diferentes dá origem ao repertório diverso das proteínas encontradas na natureza. Um modo de descrever os domínios é pela ajuda do banco de dados Pfam, que é uma grande coleção de famílias de domínio de proteínas, como descrito em “ The Pfam protein families database”: R.D. Finn, J. Mistry, J. Tate, P. Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38:D211-222. Cada família é representada por múltiplos alinhamentos de sequência e modelos de Markov ocultos (HMMs). Em um aspecto adicional, os presentes inventores descobriram que neste pedido o(s) polipeptídeo(s) fornecido(s) contém um ou mais dos domínios Pfam Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703), Glico_hidro 2C (PF02836) e domínio similar à Ig Bacteria- na (grupo 4) (PF07532). Em um aspecto, neste pedido o(s) polipeptí- deo(s) fornecido(s) contém Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703), Glico_hidro 2C (PF02836) e domínio similar à Ig Bacteria- na (grupo 4) (PF07532).

[0145] Em um aspecto, os polipeptídeos têm atividade de transga- lactosilação útil sobre uma faixa de pH de 4-9, tal como 5-8, tal como 5,5-7,5, tal como 6,5-7,5.

[0146] A presente invenção engloba polipeptídeos que têm certo grau de identidade de sequência ou homologia de sequência com a(s) sequência(s) de aminoácidos definida(s) neste pedido ou com um poli- peptídeo que define as propriedades específicas neste pedido. A pre sente invenção engloba, especialmente, peptídeos que têm um grau de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, definidos abaixo, ou homólogos destes.

[0147] Em um aspecto, a sequência de aminoácidos homóloga e/ou a sequência nucleotídica devem fornecer e/ou codificar um poli- peptídeo que conserva a atividade de transgalactosilação funcional e/ou aumenta a atividade de transgalactosilação em comparação com um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0148] No presente contexto, uma sequência homóloga é tomada para incluir uma sequência de aminoácidos que pode ser pelo menos 66%, 70%, 75%, 78%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, idêntica à sequência objeto. Tipicamente, os homólogos compreenderão os mesmos sítios ativos, etc., que a sequência de aminoácidos objeto. Embora a homologia também possa ser considerada, em termos de similaridade (isto é, resíduos de ami- noácidos que têm propriedades/funções químicas similares), no contexto da presente invenção, é preferencial expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

[0149] Dessa forma, a presente invenção também engloba varian tes, homólogos e derivados de qualquer sequência de aminoácidos de uma proteína ou polipeptídeo como definido neste pedido, particularmente aqueles da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 definidos abaixo.

[0150] As sequências, particularmente aquelas de variantes, ho mólogos e derivados da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 definidas abaixo, também podem ter deleções, inserções ou substituições de resíduos de aminoácidos que produzem uma modificação silenciosa e resultam em uma substância funcionalmente equivalente. As substituições de aminoácidos deliberadas podem ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos enquanto a atividade de ligação secundária da substância é conservada. Por exemplo, os aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos cabeça polares não carregados que têm valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

[0151] A presente invenção também engloba a substituição con- servativa (substituição e reposição são ambas usadas neste pedido para significar a troca de um resíduo de aminoácido existente por um resíduo alternativo) que pode ocorrer, isto é, substituição similar por similar tal como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar, etc. A substituição não conservativa também pode ocorrer, isto é, de uma classe de resíduo por outra ou alternativamente implicando a inclusão de aminoácidos não naturais como ornitina (a seguir designada como Z), ácido ornitina diaminobutírico (a seguir designado como B), norleucina ornitina (a seguir designada como O), pirilalanina, tienilala- nina, naftilalanina e fenilglicina.

[0152] As substituições conservativas que podem ser feitas são, por exemplo, dentro dos grupos de aminoácidos básicos (Arginina, Lisina e Histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e aspártico), aminoácidos alifáticos (Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina), aminoá- cidos polares (Glutamina, Asparagina, Serina, Treonina), aminoácidos aromáticos (Fenilalanina, Triptofano e Tirosina), aminoácidos com hi- droxilas (Serina, Treonina), grandes aminoácidos (Fenilalanina e Trip- tofano) e pequenos aminoácidos (Glicina, Alanina).

[0153] Em um aspecto, a sequência polipeptídica usada na pre sente invenção está em uma forma purificada.

[0154] Em um aspecto, o polipeptídeo ou proteína para uso na presente invenção está em uma forma isolada.

[0155] Em um aspecto, o polipeptídeo da presente invenção é re- combinantemente produzido.

[0156] Os polipeptídeos variantes incluem um polipeptídeo que tem uma certa porcentagem, por exemplo, pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, da identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 ou 2.

[0157] Os polipeptídeos variantes incluem um polipeptídeo que tem uma certa porcentagem, por exemplo, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99%, da identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3, 4 ou 5.

[0158] Em um aspecto, os polipeptídeos descritos neste pedido compreendem uma sequência de aminoácidos que tem identidade de sequência de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% à sequência de aminoácidos do polipeptídeo maduro codificado pela sequência nucleotídica que codifica a transgalac- tosilase contida em Bifidobacterium bifidum DSM20215 mostrada neste pedido como a SEQ ID NO: 22. Todas as considerações às limitações que se relacionam com a identidade de sequência e funcionalidade discutidas em termos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 aplicam-se mutatis mutandis à identidade de sequência e funcionalidade destes polipeptídeos e nucleotídeos.

[0159] Em um aspecto, a sequência de aminoácidos objeto é a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, e a sequência nucleotídica objeto prefe-rencialmente é a SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13.

[0160] Em um aspecto, o polipeptídeo é um fragmento tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados do terminal amino e/ou carbo- xila do polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5; em que o fragmento tem a atividade de transgalactosilação.

[0161] Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ou 1.000 resíduos de aminoácidos.

[0162] Em um aspecto adicional, o comprimento do polipeptídeo variante é 500 a 1.300 resíduos de aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento do polipeptídeo variante é 600 a 1.300 aminoá- cidos. Em um aspecto adicional, o comprimento do polipeptídeo variante é 700 a 1.300 aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento do polipeptídeo variante é 800 a 1.300 aminoácidos. Em um aspecto adicional, o comprimento do polipeptídeo variante é 800 a 1.300 aminoácidos. Variantes de polipeptídeos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5

[0163] Em um aspecto, uma variante da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 tendo uma substituição em uma ou mais posições que afeta uma propriedade alterada como transgalactosilação melhorada, em relação às SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, é fornecida. Tais polipeptídeos variantes também são referidos neste documento por conveniência como “polipeptídeo variante”, “variante de polipeptídeo” ou “variante”. Em um aspecto, os polipeptídeos, como definido neste pedido, têm uma atividade de transgalactosilação melhorada quando comparados com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em outro aspecto, os poli- peptídeos, como definido neste pedido, têm uma velocidade de reação melhorada quando comparados com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0164] Em um aspecto, os polipeptídeos e variantes, como defini do neste pedido, exibem atividade enzimática. Em um aspecto, os po- lipeptídeos e os polipeptídeos variantes descritos neste pedido com-preendem a atividade de transgalactosilação.

[0165] Em um aspecto, a proporção de atividade de transgalactosi- lação: atividade de β-galactosidase é pelo menos 0,5, tal como pelo menos 1, tal como pelo menos 1,5, ou tal como pelo menos 2 após 30 min de reação tal como acima de uma concentração da concentração de lactose inicial de 3% p/p.

[0166] Em um aspecto, a proporção de atividade de transgalactosi- lação: atividade de β-galactosidase é pelo menos 2,5, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 11, ou tal como pelo menos 12 após 30 min de reação tal como acima de uma concentração da concentração de lactose inicial de 3% p/p.

[0167] Em um aspecto, os polipeptídeos e as variantes, como de finido neste pedido, são deriváveis de fontes microbianas, em particular, de um fungo filamentoso ou levedura ou de uma bactéria. A enzima pode ser, por exemplo, derivada de uma cepa de Agaricus, por exemplo, A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por exemplo, D. discoi- deum; Kluveromyces, por exemplo, K. fragilis, K. lactis; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, W sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. sub- tilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. Iongum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacte- rium; Citrobacter, por exemplo, C. freundii; Clostridium, por exemplo, C. perfringens; Diplodia, por exemplo, D. gossypina; Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neuros- pora, por exemplo, N. crassa; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Provi- dencia, por exemplo, P. stuartii; Pycnoporus, por exemplo, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, por exemplo, R. torques; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. antibioticus, S. castaneoglo- bisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por exemplo, T. reesei, T. viride; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica.

[0168] Um polipeptídeo isolado e/ou purificado compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo variante, como definido neste pedido, é fornecido. Em uma modalidade, o polipeptídeo variante é uma forma madura do polipeptídeo (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5). Em um aspecto, as variantes incluem um domínio C-terminal.

[0169] Em um aspecto, um polipeptídeo variante como definido neste pedido inclui variantes em que entre um e aproximadamente 25 resíduos de aminoácidos foram adicionados ou deletados com respeito à SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em um aspecto, um polipeptídeo variante como definido neste pedido inclui variantes em que entre um e 25 resíduos de aminoácidos foram substituídos, adicionados ou deletados com respeito à SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em um aspecto, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, em que qualquer quantidade entre um e aproximadamente 25 aminoáci- dos foi substituída. Em um aspecto adicional, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, em que qualquer quantidade entre três e doze aminoácidos foi substituída. Em um aspecto adicional, a variante tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, em que qualquer quantidade entre cinco e nove aminoácidos foi substituída.

[0170] Em um aspecto, pelo menos dois, em outro aspecto pelo menos três, e ainda em outro aspecto, pelo menos cinco aminoácidos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 foram substituídos.

[0171] Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedi do tem a sequência de 1, 2, 3, 4 ou 5. Em um aspecto, o(s) polipeptí- deo(s) descrito(s) neste pedido tem a sequência da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, em que 10, tal como 9, tal como 8, tal como 7, tal como 6, tais 5, tal como 4, tal como tal como 2, como 1 aminoácidos na extremidade de N-terminal são substituídos e/ou deletados.

[0172] As enzimas e as variantes de enzima destas podem ser ca racterizadas pelas suas sequências de ácidos nucleicos e de polipep- tídeos primárias, por modelagem estrutural tridimensional, e/ou pela sua atividade específica. As características adicionais do polipeptídeo ou variantes de polipeptídeo, como definido neste pedido, incluem estabilidade, faixa de pH, estabilidade de oxidação e termoestabilidade, por exemplo. Os níveis de expressão e atividade da enzima podem ser avaliados usando ensaios padrão conhecidos pelo especialista neste campo. Em outro aspecto, as variantes demonstram características de desempenho melhoradas em relação ao polipeptídeo com a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5, como estabilidade melhorada em altas temperaturas, por exemplo, 65-85°C.

[0173] Uma variante de polipeptídeo é fornecida, como definido neste pedido, com uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos aproximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Nucleotídeos

[0174] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptí- deos isolados que têm atividade de transgalactosilação, como afirmado acima, que são codificados por polinucleotídeos que se hibridizam sob condições de estringência muito baixa, preferencialmente condições de estringência baixa, mais preferencialmente condições de es- tringência média, mais preferencialmente condições de estringência média e alta, ainda mais preferencialmente condições de alta estrin- gência e ainda mais preferencialmente condições de estringência muito alta com i) a sequência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5; ii) a sequência cDNA de i) ou iii) a fita complementar de i) ou ii), (J. Sambrook, E.F. Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). Uma subsequência da SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferencialmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subsequência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem a atividade de lactase.

[0175] A sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 ou uma subsequência desta, bem como a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou um fragmento desta, podem ser usadas para desenhar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar o DNA que codifica polipeptídeos que têm atividade de transga- lactosilase de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o genômico ou cDNA do gênero ou espécies de interesse, após procedimentos de Southern blotting padrão, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, preferencialmente pelo menos 25, mais preferencialmente pelo menos 35, e ainda mais preferencialmente pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento.

[0176] É, entretanto, preferencial que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou ainda mais preferencialmente pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Mesmo sondas mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico que têm pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos preferencialmente pelo menos 700 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 800 nucleo- tídeos, ou ainda mais preferencialmente pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Tanto sondas de DNA como de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0177] Uma biblioteca de DNA genômico preparada de outros or ganismos, então, pode ser rastreada para DNA que se hibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo que tem atividade de lactase. DNA genômico ou outro de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacri- lamida ou outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material veículo adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com a SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 ou uma subsequên- cia desta, o material veículo é usado em um Southern blot.

[0178] Para os fins da presente invenção, a hibridização indica que a sequência nucleotídica se hibridiza com uma sonda de ácido nuclei- co marcada, que corresponde à sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13, sua fita complementar ou subsequên- cia desta, sob condições de estringência muito baixa a muito alta. As moléculas às quais a sonda de ácido nucleico se hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando filme de raio X.

[0179] Em outro aspecto preferencial, a sonda de ácido nucleico é a região de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13.

[0180] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS 0,3%, DNA de esperma de salmão 200 g/ml cortado e desnaturado, e formamida 25% para estringências muito baixa e baixa, formami- da 35% para estringências média e média-alta ou formamida 50% para estringências alta e muito alta, após os procedimentos de Southern blotting padrão durante 12 a 24 horas otimamente.

[0181] Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS 0,2% preferencialmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferencialmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferencialmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferencialmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta), até mais preferencialmente pelo menos a 65°C (estringência alta), e ainda mais preferencialmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

[0182] Em uma modalidade particular, a lavagem é conduzida usando SSC 0,2X, SDS 0,2% preferencialmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferencialmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferencialmente pelo menos a 55°C (es- tringência média), mais preferencialmente pelo menos a 60°C (estrin- gência média-alta), até mais preferencialmente pelo menos a 65°C (alta estringência), e ainda mais preferencialmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta). Em outra particular modalidade, a lavagem é conduzida usando SSC 0,1X, SDS 0,2% preferencialmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferencialmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferencialmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferencialmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta), até mais preferencialmente pelo menos a 65°C (estringência alta), e ainda mais preferencialmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

[0183] Para sondas curtas que têm aproximadamente 15 nucleotí- deos a aproximadamente 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização em aproximadamente 5°C a aproximadamente 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em NaCI 0,9 M, Tris-HCI 0,09 M pH 7,6, EDTA 6 mM, NP-40 0,5%, solução de Denhardt 1X, 1 pirofosfato de sódio 1 mM, fosfato monobásico de sódio 1 mM, ATP 0,1 mM, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml após procedimentos de Southern blotting padrão.

[0184] Para sondas curtas que têm aproximadamente 15 nucleotí- deos a aproximadamente 70 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é lavado uma vez em SCC 6X mais SDS 0,1% por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando SSC 6X em 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada.

[0185] Sob condições de hibridização contendo sal, a Tm eficazé a que controla o grau de identidade requerida entre a sonda e o filtro ligado ao DNA para hibridização bem sucedida. A Tm eficaz pode ser determinada usando a fórmula abaixo para determinar o grau de identidade requerida para dois DNAs se hibridizarem sob várias condições de estringência.

[0186] Tm eficaz = 81,5 + 16,6(log M [Na+]) + 0,41(%G+C) - 0,72(formamida %) (Ver www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)

[0187] O conteúdo G+C da SEQ ID NO: 10 é 42% e o conteúdo G+C da SEQ ID NO: 11 é 44%. Para estringência média, formamida é 35% e concentração de Na+ para SSPE 5X é 0,75 M.

[0188] Outra relação relevante é que uma incompatibilidade de 1% de dois DNAs reduz a Tm por 1,4°C. Para determinar o grau de identidade requerida para dois DNAs se hibridizarem sob condições de es- tringência média a 42°C, a seguinte fórmula é usada: Homologia % = 100 - [(Tm Eficaz - Temperatura de Hibridização)/1,4] (Ver www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)

[0189] Os ácidos nucleicos variantes incluem um polinucleotídeo que tem certa porcentagem, por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%, da identidade de sequência com o ácido nu- cleico que codifica a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em um aspecto, um ácido nucleico capaz de codificar um polipeptídeo como descrito neste pedido, é fornecido. Em um aspecto adicional, o ácido nucleico descrito neste pedido tem uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 60%, tal como pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13.

[0190] Em um aspecto, um plasmídeo compreendendo um ácido nucleico como descrito neste pedido, é fornecido. Em um aspecto, um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico como descrito neste pedido, ou capaz de expressar um polipeptídeo como descrito neste pedido, é fornecido.

[0191] Um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico, que codifica qualquer uma das variantes de polipeptídeos como definido neste pedido, é apresentado neste pedido fornecido. Adicionalmente, um ácido nucleico capaz de se hibridizar ao complemento é fornecido. Em outra modalidade, a sequência para o uso nos métodos e composições descritas neste pedido é uma sequência sintética. Inclui, mas não é limitada a, sequências feitas com o uso ótimo de códon para expressão em organismos hospedeiros, como levedura. As variantes de polipeptídeos fornecidas neste pedido podem ser produzidas sinteticamente ou pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedido é(são) o(s) polipep- tídeo(s) recombinante(s). A variante de polipeptídeo expressa como definido neste pedido opcionalmente é isolada antes do uso.

[0192] Em outra modalidade, a variante de polipeptídeo como de finido neste pedido é purificada após a expressão. Os métodos de mo-dificação genética e produção recombinante de variantes de polipeptí- deos são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 7.371.552. 7.166.453; 6.890.572; e 6.667.065; e Pedidos de Patente Publicados U.S. Nos. 2007/0141693; 2007/0072270; 2007/0020731; 2007/0020727; 2006/0073583; 2006/0019347; 2006/0018997; 2006/0008890; 2006/0008888; e 2005/0137111. Os ensinamentos re-levantes destas descrições, incluindo sequências de polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo, iniciadores, vetores, métodos de seleção, células hospedeiras, purificação e reconstituição de variantes de polipeptídeos expressas e caracterização de variantes de polipeptí- deos como definidos neste pedido, incluindo tampões úteis, faixas de pH, concentrações de Ca2+, concentrações de substrato e concentrações de enzimas de ensaios enzimáticos, são neste pedido incorporados por referência.

[0193] Uma sequência de ácidos nucleicos é fornecida que codifi ca a proteína da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma sequência de ácidos nucleicos que tem identidade de sequência de pelo menos apro-ximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com um ácido nucleico que codifica a proteína da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos tem identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 60%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao ácido nucleico da SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13. Vetores

[0194] Em um aspecto, a invenção refere-se a um vetor compre endendo um polinucleotídeo. Em um aspecto, uma célula bacteriana compreende o vetor. Em algumas modalidades, um construto de DNA que compreende um ácido nucleico que codifica uma variante é transferido para uma célula hospedeira em um vetor de expressão compreendendo sequências reguladoras operacionalmente ligadas a uma sequência de codificação. O vetor pode ser qualquer vetor que pode estar integrado em um genoma da célula hospedeira fúngica e replicado quando introduzido na célula hospedeira. O Catálogo FGSC de Cepas, Universidade do Missouri, lista os vetores adequados. Exemplos adicionais de expressão adequada e/ou vetores de integração são fornecidos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); Bennett et al., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego (1991), pp. 396-428; e Patente U.S. No. 5.874.276. Vetores exemplares incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 e pENTR/D, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z e pGEM®4Z. Exemplar para o uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19, que permitem a replicação em E. coli e pE194, por exemplo, que permite a replicação em Bacillus.

[0195] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica uma variante é operacionalmente ligado a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Exemplos não limitantes adequados de promotores incluem promotores cbhl, cbh2, egll, e egl2. Em uma modalidade, o promotor é aquele que é nativo à célula hospedeira. Por exemplo, quando P. saccharophila é o hospedeiro, o promotor é o promotor nativo de P. saccharophila. Um “promotor induzível” é promotor que é ativo de acordo com a regulação ambiental ou de desenvolvimento. Em outra modalidade, o promotor é aquele que é heterólogo à célula hospedeira.

[0196] Em algumas modalidades, a sequência de codificação é operacionalmente ligada a uma sequência de DNA que codifica uma sequência-sinal. Em outro aspecto, um peptídeo sinal representativo é a SEQ ID NO: 27. Um peptídeo sinal representativo é a SEQ ID NO: 9 que é a sequência-sinal nativa do precursor aprE de Bacillus subtilis. Em outras modalidades, o DNA que codifica a sequência-sinal é substituído por uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência- sinal de outros precursores de Bacillus subtilis extracelulares. Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica a sequência-sinal é imediatamente a montante e em estrutura do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. A sequência-sinal pode ser selecionada das mesmas espécies que a célula hospedeira.

[0197] Em modalidades adicionais, uma sequência-sinal e uma sequência do promotor compreendendo um construto de DNA ou vetor a ser introduzido em uma célula hospedeira fúngica são derivadas da mesma fonte. Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de terminação. Em uma modalidade, a sequência de terminação e a sequência do promotor são derivadas da mesma fonte. Em outra modalidade, a sequência de terminação é homóloga à célula hospedeira.

[0198] Em algumas modalidades, um vetor de expressão inclui um marcador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados incluem aqueles que conferem resistência a agentes antimi- crobianos, por exemplo, higromicina ou fleomicina. Marcadores seletivos nutritivos também são adequados e incluem amdS, argB, e pyr4. Em uma modalidade, o marcador seletivo é o gene amdS, que codifica a enzima acetamidase; permite células transformadas crescerem em acetamida como uma fonte de nitrogênio. O uso de um gene amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito em Kelley et al., EMBO J. 4: 475-479 (1985) e Penttila et al., Gene 61: 155-164 (1987).

[0199] Um vetor de expressão adequado compreendendo um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifica uma variante pode ser qualquer vetor que é capaz de replicação autônoma em um organismo de hospedeiro dado ou integração no DNA do hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um plasmídeo. Em algumas modalidades, dois tipos de vetores de expressão para obter a expressão de genes são contemplados. O primeiro vetor de expressão compreende sequências de DNA nas quais o promotor, a região de codificação e o terminador, todos se originam do gene a ser expresso. Em algumas modalidades, o truncamento gênico é obtido deletando sequências de DNA indesejadas para deixar o domínio a ser expresso sob controle das suas próprias sequências reguladoras de transcrição e tradução. O segundo tipo de vetor de expressão é pré-montado e contém as sequências requeridas para transcrição de alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região de codificação de um gene ou parte desta é inserida neste vetor de expressão de propósito geral, tal que esteja sob controle transcricional do promotor do construto de expressão e sequências terminadoras. Em algumas modalidades, os genes ou parte destes são inseridos à jusante do promotor cbhl forte. Hospedeiros/células hospedeiras de expressão

[0200] Em um aspecto adicional, uma célula hospedeira compre endendo, preferencialmente transformada com um plasmídeo como descrito neste pedido ou um vetor de expressão, como descrito neste pedido, é fornecida.

[0201] Em um aspecto adicional, uma célula capaz de expressar um polipeptídeo, como descrito neste pedido, é fornecida.

[0202] Em um aspecto, a célula hospedeira, como descrito neste pedido, ou célula, como descrito neste pedido, é uma célula bacteria- na, fúngica ou de levedura.

[0203] Em um aspecto adicional, a célula hospedeira é seleciona da a partir do grupo consistindo em Ruminococcus, Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, To- rula, Torulopsis e Aspergillus.

[0204] Em um aspecto adicional, a célula hospedeira é seleciona da a partir do grupo consistindo de Ruminococcus hansenii, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum e Lactococcus lactis.

[0205] Em outra modalidade, as células hospedeiras adequadas incluem uma bactéria Gram-positiva selecionada a partir do grupo consistindo em Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagu- lans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans ou S. murinus; ou uma bactéria Gram-negativa, em que a dita bactéria Gram-negativa é Escherichia coli ou uma espécie de Pseudomonas. Em um aspecto, a célula hospedeira é um B. subtilus ou B. lichenifor- mis. Em uma modalidade, a célula hospedeira é B. subtilis, e a proteína expressa é engendrada para compreender uma sequência-sinal de B. subtilis, como apresentado em detalhes adicionais abaixo. Em um aspecto, a célula hospedeira expressa o polinucleotídeo como estabelecido nas reivindicações.

[0206] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é geneti camente engendrada para expressar uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido com uma sequência de aminoácidos que tem identidade de pelo menos aproximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo como definido neste pedido terá uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma sequência de ácidos nucleicos que tem identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com um ácido nucleico que codifica a proteína da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos tem identidade de sequência de pelo menos aproximadamente 60%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 78%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ao ácido nucleico da SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13. Métodos para produção de polipeptídeos

[0207] Em um aspecto adicional, um método de expressão de um polipeptídeo como descrito neste pedido compreende a obtenção de uma célula hospedeira ou uma célula como descrita neste pedido e expressão do polipeptídeo da célula ou célula hospedeira, e opcionalmente purificação do polipeptídeo.

[0208] Uma característica de expressão significa um nível alterado da expressão da variante, quando a variante é produzida em uma célula hospedeira particular. A expressão refere-se geralmente à quantidade da variante ativa que é recuperável de um caldo de fermentação usando técnicas padrão conhecidas nesta técnica ao longo de um dado período de tempo. A expressão pode relacionar-se também à quantidade ou taxa da variante produzida dentro da célula hospedeira ou secretada pela célula hospedeira. A expressão também pode relacionar-se à taxa da tradução do mRNA que codifica o polipeptídeo variante. Transformação, expressão e cultura de células hospedeiras

[0209] A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira inclui técnicas como transformação; eletroporação; microinje- ção nuclear; transdução; transfecção, por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-dextrina; incubação com DNA precipitado com fosfato de cálcio; bombardeio de alta velocidade com microprojé- teis recobertos com DNA; e fusão de protoplastos. As técnicas de transformação gerais são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Ausubel et al. (1987), supra, capítulo 9; Sambrook et al. (2001), supra; e Campbell et al., Curr. Genet. 16: 53-56 (1989). A expressão da proteína heteróloga em Trichoderma é descrita, por exemplo, na patente U.S. No. 6.022.725; Patente U.S. No. 6.268.328; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991); Harkki et al., BioTechnol. 7: 596-603 (1989); EP 244.234; e EP 215.594. Em uma modalidade, os transformantes geneticamente estáveis são construídos com sistemas de vetores pelos quais o ácido nucleico que codifica uma variante está estavelmente integrado em um cromossomo da célula hospedeira. Os transformantes então são purificados por técnicas conhecidas.

[0210] Em um exemplo não limitante, transformantes estáveis inclu indo um marcador amdS são distinguidos de transformantes instáveis pela sua taxa de crescimento mais rápida e a formação de colônias circulares com um traçado uniforme, em vez de irregular em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos, um teste adicional de estabilidade é conduzido cultivando os transformantes em meio não seletivo sólido, por exemplo, um meio sem acetamida, coletando esporos deste meio de cultura e determinando a porcentagem destes esporos que posteriormente germinam e crescem no meio seletivo contendo acetamida. Outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para selecionar transformantes. Identificação de atividade

[0211] Para avaliar a expressão de uma variante em uma célula hospedeira, os ensaios podem medir a proteína expressa, mRNA correspondente ou atividade de β-galactosidase. Por exemplo, ensaios adequados incluem Northern e Southern blotting, RT-PCR (reação de polimerase em cadeia de transcriptase reversa), e hibridização in situ, usando uma sonda hibridizante marcada apropriadamente . Ensaios adequados também incluem a atividade de medida em uma amostra. Ensaios adequados da atividade da variante incluem, mas não são limitados a ensaios baseados em ONPG ou determinação de glicose em misturas de reação tais como, por exemplo, os descritos nos métodos e exemplos neste pedido. Métodos para purificação de polipeptídeos descritos neste pedido

[0212] Em geral, uma variante produzida na cultura de células é secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, re-movendo componentes não desejados do meio de cultura de células. Em alguns casos, uma variante pode ser recuperada de um lisado celular. Em tais casos, a enzima é purificada das células nas quais foi produzida usando técnicas rotineiramente empregadas por aqueles especialistas na técnica. Exemplos incluem, mas não são limitados à, cromatografia de afinidade, métodos cromatográficos de troca iônica, incluindo troca iônica de alta resolução, cromatografia de interação hi- drofóbica, particionamento de duas fases, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica, como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação em sulfato de amônio e filtração em gel usando Sephadex G-75, por exemplo. Dependendo do uso desejado, o(s) polipeptídeo(s) des- crito(s) neste pedido, por exemplo, pode(m) ser congelado(s) a vácuo ou preparado(s) em uma solução. Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedido está(ão) em forma congelada a vácuo. Em outro aspecto, o(s) polipeptídeo(s) descrito(s) neste pedido está(ão) em solução. Composições, aplicação e uso Métodos para imobilização e formulação dos polipeptídeos descritos neste pedido

[0213] As composições de polipeptídeos podem ser preparadas conforme métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de um líquido ou uma composição seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma granular ou microgranular. O polipep- tídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado conforme métodos conhecidos na técnica. Exemplos são dados sob usos preferenciais dos polipeptídeos ou composições de polipeptídeos da invenção.

[0214] Em um aspecto, é descrito neste pedido um método para produção de um produto alimentício tratando um substrato compreendendo lactose com um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[0215] Em um aspecto, é descrito neste pedido um método para produção de um produto lácteo tratando um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo como descrito neste pedido.

[0216] Em um aspecto, o substrato compreendendo lactose é ain da tratado com uma beta-galactosidase hidrolisante.

[0217] A preparação de enzima, tal como na forma de um ingredi ente alimentício preparado de acordo com a presente invenção, pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou modo de administração. A forma sólida pode ser como um pó de enzima seca ou como uma enzima granulada.

[0218] Exemplos de formulações de enzimas secas incluem produ tos secos por pulverização, produtos de granulação no misturador, produtos em camadas tais como grânulos em leito fluidizado, grânulos extrudados ou produtos peletizados agregados, produtos liofilizados.

[0219] A preparação de enzima, tal como na forma de um ingredi- ente alimentício preparado de acordo com a presente invenção, pode estar na forma de uma solução ou como um sólido - dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou modo de administração. A forma sólida pode ser como um pó de enzima seca ou como uma enzima granulada.

[0220] Em um aspecto, uma composição, preferencialmente uma composição alimentícia, mais preferencialmente um produto lácteo compreendendo uma célula ou um polipeptídeo como descrito neste pedido, é fornecida.

[0221] Além disso, é descrito neste pedido uma composição com preendendo pelo menos 5%, tal como, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% p/p de um ou mais polipeptídeos como descrito neste pedido baseado na quantidade total de polipeptí- deos na composição tendo identidade de sequência de pelo menos 70%, por exemplo, tal como 72%, 74%, 74%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90% com a SEQ ID NO: 22. Isto pode ser avaliado usando as seguintes técnicas conhecidas por um especialista na técnica. As amostras a serem avaliadas são submetidas à SDS-PAGE e visualizadas usando um corante apropriado para quantificação proteica, tal como, por exemplo, o sistema Bio-Rad Criterion. O gel então é esquadrinhado usando o scanner densiométrico apropriado tal como, por exemplo, que o sistema Bio-Rad Criterion e a imagem resultante é assegurada estar na faixa dinâmica. As faixas que correspondem a qual-quer variante/fragmento derivada da SEQ ID NO: 8 são quantificadas e a porcentagem dos polipeptídeos é calculada como: porcentagem do polipeptídeo em questão = polipeptídeo em questão / (soma de todos os polipeptídeos que exibem atividade de transgalactosilação) *100. A quantidade total de variantes/fragmentos de polipeptídeos derivados da SEQ ID NO:8 na composição pode ser determinada detectando o fragmento derivado da SEQ ID NO:8 por Western blotting um anticorpo policlonal por métodos conhecidos pelo especialista na técnica.

[0222] Em um aspecto, a composição de acordo com a presente invenção compreende um ou mais polipeptídeos selecionados a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 e 5. Em um aspecto adicional, a composição compreende um ou mais polipeptídeos selecionados a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1, 2 e 3. Ainda em um aspecto adicional, a composição compreende um ou mais polipeptídeos selecionados a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 e 2.

[0223] Em um aspecto, a invenção fornece uma preparação de complexo enzimático compreendendo o complexo enzimático de acordo com a invenção, um veículo para a enzima e opcionalmente um es- tabilizante e/ou um conservante.

[0224] Ainda em um aspecto adicional da invenção, o veículo para a enzima é selecionado a partir do grupo consistindo em glicerol ou água.

[0225] Em um aspecto adicional, a preparação/composição com preende um estabilizante. Em um aspecto, o estabilizante é selecionado a partir do grupo consistindo em sais inorgânicos, polióis, açúcares e combinações destes. Em um aspecto, o estabilizante é um sal inorgânico como cloreto de potássio. Em outro aspecto, o poliol é glicerol, propilenoglicol ou sorbitol. Ainda em outro aspecto, o açúcar é uma pequena molécula de carboidrato, em particular qualquer um de vários de sabor doce como glicose, galactose, frutose e sacarose.

[0226] Ainda em um aspecto adicional, a preparação compreende um conservante. Em um aspecto, o conservante é metilparabeno, pro- pilparabeno, benzoato, sorbato ou outros conservantes aprovados para alimentos ou uma mistura destes.

[0227] O método da invenção pode ser praticado com enzimas imobilizadas, por exemplo, uma lactase imobilizada ou outras enzimas produtoras de galacto-oligossacarídeo. A enzima pode ser imobilizada em qualquer suporte orgânico ou inorgânico. Suportes inorgânicos exemplares incluem alumina, celite, Dowex-1-cloreto, contas e sílica- gel. Suportes orgânicos exemplares incluem DEAE-celulose, hidrogéis de alginato ou contas de alginato ou equivalentes. Em vários aspectos da invenção, a imobilização da lactase pode ser otimizada pela adsor- ção física no suporte inorgânico. As enzimas usadas para praticar a invenção podem ser imobilizadas em meios diferentes, incluindo água, tampão Tris-HCI e solução tamponada com fosfato. A enzima pode ser imobilizada para qualquer tipo de substrato, por exemplo, filtros, fibras, colunas, contas, coloides, géis, hidrogéis, redes e similares.

[0228] Em um aspecto, um método para produção de um produto lácteo tratando um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo como descrito neste pedido, é fornecido. Em um aspecto adicional, um método para produção de um produto lácteo tratando um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo que tem uma atividade de transgalactosilação relativa acima de 60%, tal como acima de 70%, tal como acima de 75% após 15 min de reação, é fornecido. Em um aspecto, a atividade de transga- lactosilação relativa está acima de 3 após 30 min de reação. Em um aspecto adicional, a atividade de transgalactosilação relativa está acima de 6 após 30 min de reação. Ainda em um aspecto adicional, a atividade de transgalactosilação relativa está acima de 12 após 30 min de reação. Em um aspecto, um método é fornecido, em que o tratamento com um polipeptídeo como descrito neste pedido se realiza em uma temperatura ótima para a atividade da enzima. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo é adicionado ao substrato baseado em leite em uma concentração de 0,01-1000 ppm. Ainda em um aspecto adicional, o polipeptídeo é adicionado ao substrato baseado em leite em uma concentração de 1-100 ppm. Em um aspecto adicional, o polipep- tídeo é adicionado ao substrato baseado em leite em uma concentração de 1-10 ppm. Em um aspecto, um método compreendendo ainda fermentação de um substrato como um produto lácteo com um microorganismo, é fornecido. Em um aspecto adicional, o produto lácteo é iogurte. Em um aspecto adicional, o tratamento com o polipeptídeo e o micro-organismo é realizado essencialmente ao mesmo tempo. Em um aspecto, o polipeptídeo e o micro-organismo são adicionados ao substrato baseado em leite essencialmente ao mesmo tempo. Em um aspecto, um produto lácteo compreendendo uma célula ou um polipeptí- deo, como descrito neste pedido, é fornecido. Em um aspecto, o poli- peptídeo como definido neste pedido é adicionado em uma concentração de 01-1000 ppm. Em um aspecto, um produto lácteo compreendendo um polipeptídeo inativado, como definido neste pedido, é fornecido. Em um aspecto, um produto lácteo compreendendo um polipep- tídeo inativado, como definido neste pedido, em uma concentração de 0,01-1000 ppm, é fornecido. Em um aspecto, um produto lácteo compreendendo GOS formado in situ por um polipeptídeo, como definido neste pedido, é fornecido. Em um aspecto, um produto lácteo compreendendo uma célula, como definido neste pedido, é fornecido. Um produto lácteo, como descrito neste pedido, pode ser, por exemplo, leite desnatado, leite de baixo teor de gordura, leite integral, creme, leite UHT, leite que tem um prazo de validade extenso, um produto lácteo fermentado, queijo, iogurte, manteiga, creme lácteo, manteiga, bebida láctea acidificada, creme azedo, bebida baseada em soro de leite, sorvete, leite condensado, doce de leite ou uma bebida láctea saborosa. Um produto lácteo pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica.

[0229] Um produto lácteo pode compreender adicionalmente com ponentes não lácteos, por exemplo, componentes vegetais tais como, por exemplo, óleo vegetal, proteína vegetal e/ou carboidratos vegetais. Os produtos lácteos também podem compreender aditivos adicionais tais como, por exemplo, enzimas, agentes aromatizantes, culturas microbianas como culturas probióticas, sais, adoçantes, açúcares, ácidos, fruta, sucos de frutas ou qualquer outro componente conhecido na técnica como um componente, ou aditivo para um produto lácteo.

[0230] Em uma modalidade da invenção, um ou mais componen tes do leite e/ou as frações de leite contabilizam pelo menos 50% (pe- so/peso), como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80%, pre-ferencialmente pelo menos 90%, do produto lácteo.

[0231] Em uma modalidade da invenção, um ou mais substratos baseados em leite que foram tratados com uma enzima, como definido neste pedido, tendo atividade de transgalactosilação contabilizam pelo menos 50% (peso/peso), tal como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, do produto lácteo.

[0232] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é um produto lácteo que não é enriquecido pela adição de galacto- oligossacarídeos pré-produzidos.

[0233] Em uma modalidade da invenção, o substrato baseado em leite tratado pelo polipeptídeo não é seco antes de ser usado como um ingrediente no produto lácteo.

[0234] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é sorve te. No presente contexto, o sorvete pode ser qualquer tipo de sorvete como sorvete completo, sorvete de baixo teor de gordura ou sorvete baseado em iogurte ou outros produtos lácteos fermentados. O sorvete pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica.

[0235] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é o leite ou leite condensado.

[0236] Em uma modalidade da invenção, o produto lácteo é o leite UHT. O leite UHT, no contexto da presente invenção, é o leite que foi submetido a um procedimento de esterilização que é destinado a eliminar todos os micro-organismos, incluindo os esporos bacterianos. O tratamento UHT (alta temperatura extrema) pode ser, por exemplo, o tratamento térmico durante 30 segundos a 130°C, ou o tratamento térmico durante um segundo a 145°C.

[0237] Em uma modalidade preferencial da invenção, o produto lácteo é o leite ESL. O leite ESL, no presente contexto, é o leite que tem um prazo de validade extenso devido à microfiltração e/ou tratamento térmico e que é capaz de ficar fresco durante pelo menos 15 dias, preferencialmente durante pelo menos 20 dias, na prateleira em 2-5°C.

[0238] Em outra modalidade preferencial da invenção, o produto lácteo é um produto lácteo fermentado, por exemplo, iogurte.

[0239] Os micro-organismos usados para a maioria dos produtos lácteos fermentados são selecionados a partir do grupo de bactérias geralmente referidas como bactérias de ácido lático. Como usado neste pedido, o termo “bactéria de ácido lático” designa uma bactéria gram-positiva, microaerofílica ou anaeróbica, que fermenta açúcares com a produção de ácidos incluindo o ácido lático como o ácido pre-dominantemente produzido, ácido acético e ácido propiônico. As bactérias de ácido lático industrialmente mais úteis são encontradas dentro da ordem “Lactobacillales” que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Adicionalmente, bactérias produtoras de ácido lático que pertencem ao grupo de bactérias anaeróbicas, bifidobacteria, isto é, Bifidobacterium spp. que são frequentemente usadas como culturas alimentícias sozinhas ou em combinação com bactérias de ácido lático, estão geralmente incluídas no grupo de bactérias de ácido lático. As bactérias de ácido lático são normalmente supridas à indús- tria do leite como culturas congeladas ou secas por congelamento para propagação inicial de volume ou a chamada de culturas “Direct Vat Set” (DVS), destinadas à inoculação direta em um vaso ou tonel de fermentação para produção de um produto lácteo fermentado. Tais culturas são referidas em geral “como culturas iniciais” ou “iniciadoras”.

[0240] As cepas de culturas iniciais comumente usadas de bacté rias de ácido lático são geralmente divididas em organismos mesofíli- cos que têm temperaturas de crescimento ótimo em aproximadamente 30°C e organismos termofílicos que têm temperaturas de crescimento ótimo na faixa de aproximadamente 40 a aproximadamente 45°C. Os organismos típicos que pertencem ao grupo mesofílico incluem Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesen- teroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei e Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. As espécies bacterianas de ácido lático termofílicas incluem como exemplos Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus acidophilus. Também as bactérias anaeróbicas que pertencem ao gênero Bifidobacterium incluindo Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis e Bifidobacterium longum são comumente usadas como culturas iniciais lácteas e estão geralmente incluídas no grupo de bactérias de ácido lático. Adicionalmente, as espécies Propionibacteria são usadas como culturas iniciais lácteas, em particular na produção de queijo. Adicionalmente, os organismos que pertencem ao gênero Brevibacterium são comumente usados como culturas iniciais alimentícias.

[0241] Outro grupo de culturas iniciais microbianas são culturas fúngicas, incluindo culturas de levedura e culturas de fungos filamen- tosos, que são particularmente usados na produção de certos tipos de queijo e bebidas. Exemplos de fungos incluem Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccha- romyces kefir e Saccharomyces cerevisiae.

[0242] Em uma modalidade da presente invenção, o micro organismo usado para a fermentação do substrato baseado em leite é Lactobacillus casei ou uma mistura de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

[0243] Os processos de fermentação a serem usados em um mé todo da presente invenção são bem conhecidos e o especialista na técnica saberá como selecionar as condições de processo adequadas, como temperatura, oxigênio, quantidade e características de microorganismos, aditivos tais como, por exemplo, carboidratos, sabores, minerais, enzimas, e tempo de processo. Obviamente, as condições de fermentação são selecionadas para suportar a realização da presente invenção.

[0244] Em consequência da fermentação, o pH do substrato base ado em leite será reduzido. O pH de um produto lácteo fermentado da invenção pode ser, por exemplo, na faixa 3,5-6, tal como na faixa 3,55, preferencialmente na faixa 3,8-4,8.

[0245] Em um aspecto, um método de uso dos polipeptídeos ou uso de um ou mais dos tipos celulares mencionados acima para produzir oligossacarídeos, é fornecido. Os oligossacarídeos compreendem, mas não são limitados a, fruto-oligossacarídeos, galacto- oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, malto-oligossacarídeos, lactossacarose e xilo-oligossacarídeos.

[0246] Em uma modalidade da invenção, os oligossacarídeos são produzidos incubando a célula que expressa o polipeptídeo em um meio compreendendo um substrato de dissacarídeo tal como, por exemplo, lactulose, trealose, ramnose, maltose, sacarose, lactose ou celobiose. A incubação é realizada sob condições onde oligossacarí- deos são produzidos. As células podem ser parte de um produto selecionado a partir do grupo consistindo em iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplementos dietéticos e produtos comestíveis pro- bióticos. Alternativamente, os oligossacarídeos podem ser recuperados e posteriormente adicionados ao produto de interesse antes ou após sua preparação.

[0247] Em um aspecto, o uso de uma célula descrita neste pedido para produzir um produto selecionado a partir do grupo consistindo em iogurte, queijo, produto lácteo fermentado, suplemento dietético e produto comestível probiótico, é fornecido.

[0248] Em um aspecto, os polipeptídeos descritos neste pedido podem ser usados para preparar produtos de queijo e em métodos para produção dos produtos de queijo. Os produtos de queijo podem ser, por exemplo, selecionados a partir do grupo consistindo em queijo cremoso, queijo cottage e queijo processado. Por adição de polipeptí- deos, os queijos podem conter níveis significativamente aumentados de galacto-oligossacarídeos e níveis reduzidos de lactose. Em um aspecto, os níveis de lactose no produto de queijo final podem ser reduzidos em pelo menos aproximadamente 25 por cento, preferencialmente pelo menos aproximadamente 50 por cento, e mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 75 por cento. Os polipeptídeos podem ser usados para reduzir a lactose em produtos de queijo a menos de aproximadamente 1 grama por porção, uma quantidade que pode ser tolerada pela maioria dos indivíduos intolerantes à lactose.

[0249] Os produtos de queijo fornecidos neste pedido são produ tos de queijo nutritivamente aumentados tendo conteúdo aumentado de fibra solúvel, conteúdo calórico reduzido, propriedades organolépti- cas excelentes, textura melhorada e sabor. Ainda, os polipeptídeos descritos neste pedido podem reduzir o índice glicêmico dos produtos de queijo porque GOS são mais lentamente absorvidos do que lactose ou seus produtos de hidrólise. Finalmente, os polipeptídeos podem reduzir o custo da produção de produtos de queijo, particularmente produtos de queijo cremoso, porque GOS surpreendentemente fornece textura melhorada ao produto de queijo cremoso, dessa forma, permitindo o uso reduzido de estabilizantes, ou permitindo o teor de umidade aumentar sem sinerese.

[0250] Em um aspecto adicional, uma composição compreenden do um polipeptídeo como descrito neste pedido e um substrato de car-boidrato, é fornecida. Em um aspecto adicional, o substrato de carboidrato é um dissacarídeo. Em um aspecto adicional, por exemplo, o dissacarídeo é lactulose, trealose, ramnose, maltose, sacarose, lactose ou celobiose. Ainda em um aspecto adicional, o substrato de carboidrato é lactose. A composição é preparada tal que os oligossacarí- deos sejam produzidos. O polipeptídeo como descrito neste pedido pode ser parte de um produto selecionado a partir do grupo consistindo em iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos. Em um aspecto, uma composição compreendendo um polipeptídeo como descrito neste pedido e um estabilizante, são fornecidos. Exemplos de estabilizantes, por exemplo, são um poliol tal como, por exemplo, glicerol ou propilenogli- col, um açúcar ou um álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático).

[0251] Em um aspecto, o uso de um polipeptídeo de transgalacto- silação, como descrito neste pedido, ou uma célula, como descrito neste pedido, para produção de galacto-oligossacarídeos, é fornecido. Em um aspecto, o uso de um polipeptídeo de transgalactosilação, como descrito neste pedido, ou uma célula, como descrito neste pedido, para produção de galacto-oligossacarídeos, para ser parte de um pro- duto selecionado a partir do grupo consistindo em iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos, é fornecido. Em um aspecto, o produto é iogurte, queijo, ou produtos lácteos fermentados. Em um aspecto, o uso de um polipeptídeo de transgalactosilação, como descrito neste pedido, ou uma célula, como descrito neste pedido, para produção de galacto- oligossacarídeos para aumentar o crescimento de Bifidobacterium, é fornecido. Em um aspecto, o uso de um polipeptídeo de transgalactosi- lação, como descrito neste pedido, ou uma célula, como descrita neste pedido, para produção de galacto-oligossacarídeos para aumentar o crescimento de Bifidobacterium em uma fermentação de cultura variada, é fornecido.

[0252] Em um aspecto, um processo para produção de um poli- peptídeo de transgalactosilação, como descrito neste pedido, compre-endendo cultura de uma célula, como descrito neste pedido, em meio de cultura adequado sob condições que permitem a expressão do dito polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo resultante da cultura, é fornecido. Um processo para produção de galacto-oligossacarídeos, compreendendo contato de um polipeptídeo, como descrito neste pedido, ou uma célula, como descrito neste pedido, com uma solução baseada em leite compreendendo lactose, é fornecido.

[0253] A adição de oligossacarídeos pode aumentar o crescimento de Bifidobacterium sozinho ou de Bifidobacterium em uma cultura variada.

[0254] O tratamento de produtos lácteos com enzimas que conver tem lactose em monossacarídeos ou GOS tem várias vantagens. Primeiro, os produtos podem ser consumidos por pessoas com intolerância à lactose, que exibiria de outra maneira sintomas como flatulência e diarreia. Em segundo lugar, os produtos lácteos tratados com lactase terão uma doçura mais alta do que produtos não tratados similares de vido à doçura mais alta percebida da glicose e galactose em comparação com a lactose. Este efeito é particularmente interessante para aplicações como iogurte e sorvete, onde a alta doçura do produto final é desejada e isto permite a uma redução líquida de carboidratos no produto consumido. Em terceiro lugar, na produção do sorvete, um fenômeno denominado arenosidade, muitas vezes é visto, onde as moléculas de lactose se cristalizam devido à solubilidade baixa relativa da lactose. Quando a lactose é convertida em monossacarídeos ou GOS a sensação na boca do sorvete é muito melhorada sobre os produtos não tratados. A presença de uma sensação arenosa devido à cristalização da lactose pode ser eliminada e os custos da matéria-prima podem ser reduzidos pela substituição de leite em pó desnatado por soro de leite em pó. Os efeitos principais do tratamento enzimático foram a doçura aumentada.

[0255] Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) de transgalactosilação como descrito(s) neste pedido pode(m) ser usado(s) em conjunto com outras enzimas, como proteases, como quimosina ou renina, lipases como fosfolipases, amilases, transferases, e lactases. Em um aspecto, o(s) polipeptídeo(s) de transgalactosilação como descrito(s) neste pedido pode(m) ser usado(s) em conjunto com lactase. Isto pode ser especialmente útil quando há um desejo de reduzir a lactose residual após tratamento com o(s) polipeptídeo(s) de transgalactosilação, como descrito(s) neste pedido, especialmente em níveis de lactose baixos. Uma lactase, no contexto da presente invenção, é qualquer glicosídeo hidrolase tendo a capacidade de hidrolisar o dissacarídeo lactose nos monômeros constituintes galactose e glicose. O grupo de lactases compreende, mas não é limitado a, enzimas classificadas na subclasse EC 3.2.1.108. As enzimas destinadas a outras subclasses, tais como, por exemplo, EC 3.2.1.23, também podem ser lactases no contexto da presente invenção. Uma lactase, no contexto da invenção, pode ter outras atividades do que a atividade de hidrólise da lactose, tal como, por exemplo, uma atividade de transgalactosilação. No contexto da invenção, a atividade de hidrólise da lactase pode ser referida como sua atividade de lactase ou sua atividade de beta-galactosidase. As enzimas que têm atividade de lactase a serem usadas em um método da presente invenção podem ser de origem animal, vegetal ou microbiana. As enzimas preferenciais são obtidas de fontes microbianas, em particular, de um fungo filamentoso ou levedura, ou de uma bactéria. A enzima pode ser, por exemplo, derivada de uma cepa de Agaricus, por exemplo, A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por exemplo, A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por exemplo, D. discoi- deum; Kluveromyces, por exemplo, K. fragilis, K. lactis; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo, R. pusillus; Rhizopus, por exemplo, R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo, S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por exemplo, T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo, W. sclerotiorum; Bacillus, por exemplo, B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. sub- tilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por exemplo, B. longum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacte- rium; Citrobacter, por exemplo, C. freundii; Clostridium, por exemplo, C. perfringens; Diplodia, por exemplo, D. gossypina; Enterobacter, por exemplo, E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo, E. herbicola; Escherichia, por exemplo, E. coli; Klebsiella, por exemplo, K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neuros- pora, por exemplo, N. crassa; Proteus, por exemplo, P. vulgaris; Providencia, por exemplo, P. stuartii; Pycnoporus, por exemplo, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, por exemplo, R. torques; Salmonella, por exemplo, S. typhimurium; Serratia, por exemplo, S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo, S. flexneri; Streptomyces, por exemplo, S. antibioticus, S. castaneoglo- bisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por exemplo, T. reesei, T. viride; Yersinia, por exemplo, Y. enterocolitica. Em uma modalidade, a lactase é um componente intracelular de micro-organismos como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces, especialmente K. fragilis e K. lactis e outros fungos como aqueles dos gêneros Candida, Torula e Torulopsis, é uma fonte comum de lactases fúngicas, ao passo que B. coagulans e B circulans são fontes bem conhecidas de lactases bacterianas. Várias preparações de lactase comerciais derivadas destes organismos estão disponíveis como Lactozym. RTM. (disponível em Novozymes, Dinamarca), HA-Lactase (disponível em Chr. Hansen, Dinamarca) e Maxilact. RTM. (disponível em DSM, Holanda), todos de K. lactis. Todas estas lactases são chamadas de lactases neutras por terem uma condição favorável de pH entre pH 6 e pH 8. Quando tais lactases são usadas na produção, por exemplo, de iogurte de baixo teor de lactose, o tratamento enzimático terá de ser feito em uma etapa separada antes que a fermentação ou dosagens de enzima bastante altas tenham que ser usadas, porque sua atividade cai conforme o pH diminui durante a fermentação. Também, estas lactases não são adequadas para a hidrólise de lactose no leite realizada em alta temperatura, que seria em alguns casos benéfica a fim de manter a contagem microbiana baixa e, dessa forma, assegurar a boa qualidade do leite.

[0256] Em uma modalidade, a enzima é uma lactase de uma bac téria, por exemplo, da família Bifidobacteriaceae, tal como do gênero Bifidobacterium como a lactase descrita no WO 2009/071539.

ASPECTOS ADICIONAIS DA INVENÇÃO

[0257] Aspecto 1. Um polipeptídeo que tem atividade de transga- lactosilação, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, e em que o dito polipeptídeo, sendo um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nuclei- cos, que codifica o dito polipeptídeo, é o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nucleicos que exibe atividade de transgalactosilação.

[0258] Aspecto 2. Um polipeptídeo tendo atividade de transgalac- tosilação selecionada a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5; ou ii) a fita complementar de i), e. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo com-preendendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo menos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e f. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5. Aspecto 3. Um polipeptídeo tendo atividade de transgalac- tosilação selecionada a partir do grupo consistindo em: a. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos, b. um polipeptídeo compreendendo uma sequência de ami- noácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos, c. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza pelo menos sob condições de baixa estringência com i) a se-quência de ácidos nucleicos compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, ou 5; ou ii) a fita complementar de i), d. um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compre-endendo uma sequência nucleotídica tendo identidade de pelo menos 70% à sequência nucleotídica que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou a sequência nucleotídica compreendida na SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13 que codifica um polipeptídeo maduro, e e. um polipeptídeo compreendendo uma deleção, inserção e/ou substituição conservativa de um ou mais resíduos de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 ou 5.

[0259] Aspecto 4. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o dito polipeptídeo, sendo um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica o dito polipeptídeo, é o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nu- cleicos que exibe atividade de transgalactosilação.

[0260] Aspecto 5. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes compreendendo uma sequência de aminoáci- dos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos.

[0261] Aspecto 6. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes compreendendo uma sequência de aminoáci- dos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos.

[0262] Aspecto 7. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1, 2 e 4 compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 97% com a SEQ ID NO: 2, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos.

[0263] Aspecto 8. Um polipeptídeo compreendendo uma sequên cia de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 980 resíduos de aminoácidos.

[0264] Aspecto 9. O polipeptídeo de acordo com o aspecto 8, em que o dito polipeptídeo tem atividade de transgalactosilação.

[0265] Aspecto 10. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 8 a 9, em que o dito polipeptídeo, sendo um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica o dito polipeptídeo, é o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nucleicos que exibe atividade de transgalactosilação.

[0266] Aspecto 11. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que a dita identidade de sequência é pelo menos 95%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100%.

[0267] Aspecto 12. Um polipeptídeo em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1.

[0268] Aspecto 13. O polipeptídeo de acordo com o aspecto 12, em que o dito polipeptídeo tem atividade de transgalactosilação.

[0269] Aspecto 14. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 90% tal como, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 1.

[0270] Aspecto 15. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 14, em que o grau de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência é determinado alinhando 1) as duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré-configurada e penalidade de lacuna pré-configurada, 2) identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nucleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) divisão do número de combinações exatas pelo comprimento da sequência de referência.

[0271] Aspecto 16. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 15, em que o grau de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência é determinado alinhando 1) as duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré-configurada e pe nalidade de lacuna pré-configurada, 2) identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nucleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) divisão do número de combinações exatas com a mais longa das duas sequências.

[0272] Aspecto 17. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 16, em que o grau de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência de referência é determinado alinhando 1) as duas sequências por qualquer programa de alinhamento adequado usando a matriz de marcação pré-configurada e penalidade de lacuna pré-configurada, 2) identificação do número de combinações exatas, onde uma combinação exata é onde o programa de alinhamento identificou um aminoácido ou nucleotídeo idêntico em duas sequências alinhadas em uma dada posição no alinhamento e 3) divisão do número de combinações exatas pelo “comprimento de alinhamento”, onde o comprimento de alinhamento é o comprimento do alinhamento inteiro incluindo lacunas e partes salientes das sequências.

[0273] Aspecto 18. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 15 a 17, em que o programa de alinhamento adequado é um programa de alinhamento global.

[0274] Aspecto 19. O polipeptídeo de acordo com o aspecto 18, em que o programa de alinhamento global usa o algoritmo Needle- man-Wunsch.

[0275] Aspecto 20. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 18 e 19, em que o programa de alinhamento global é selecionado a partir do grupo consistindo em EMBOSS Needle e EMBOSS Stretcher.

[0276] Aspecto 21. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que consiste em no máximo 975 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 970 resíduos de ami- noácidos, tal como no máximo 950 resíduos de aminoácidos, tal como no máximo 940 resíduos de aminoácidos, no máximo 930 resíduos de aminoácidos, no máximo 920 resíduos de aminoácidos, no máximo 910 resíduos de aminoácidos, no máximo 900 resíduos de aminoáci- dos, no máximo 895 resíduos de aminoácidos ou no máximo 890 resíduos de aminoácidos.

[0277] Aspecto 22. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que consiste em 887 resíduos de aminoácidos.

[0278] Aspecto 23. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que compreende a SEQ ID NO: 1.

[0279] Aspecto 24. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

[0280] Aspecto 25. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o dito polipeptídeo consiste em 965 resíduos de aminoácidos.

[0281] Aspecto 26. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 23 e 25, em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 96,5% à SEQ ID NO: 2.

[0282] Aspecto 27. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 23 e 25 a 26, em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou de pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 2.

[0283] Aspecto 28. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 23 e 25 a 27, em que o dito polipeptídeo compreende a SEQ ID NO: 2.

[0284] Aspecto 29. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 23 e 25 a 28, em que o dito polipeptídeo consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.

[0285] Aspecto 30. Um polipeptídeo compreendendo uma sequên cia de aminoácidos tendo identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3, em que o dito polipeptídeo consiste em no máximo 1.300 resíduos de aminoácidos.

[0286] Aspecto 31. O polipeptídeo de acordo com o aspecto 30, em que o dito polipeptídeo tem atividade de transgalactosilação.

[0287] Aspecto 32. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 30 a 31, em que o dito polipeptídeo, sendo um produto de expressão em uma cepa de Bacillus subtilis BG3594 de uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica o dito polipeptídeo, é o único produto de expressão de polipeptídeo da dita sequência de ácidos nuclei- cos que exibe atividade de transgalactosilação.

[0288] Aspecto 33. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20 e 30 a 32, em que a dita identidade de sequência é pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100%.

[0289] Aspecto 34. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20 e 30 a 33, que compreende a SEQ ID NO: 3.

[0290] Aspecto 35. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20 e 30 a 34, que consiste na sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 3.

[0291] Aspecto 36. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20 e 30 a 34, que consiste em no máximo 1.290 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 1280, no máximo 1270, no máximo 1260, no máximo 1250, no máximo 1240, no máximo 1230, no máximo 1220 ou no máximo 1.215 resíduos de ami- noácidos.

[0292] Aspecto 37. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36, que consiste em 1.211 resíduos de aminoácidos.

[0293] Aspecto 38. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36 a 37, em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 98,5% com a SEQ ID NO: 5.

[0294] Aspecto 39. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36 a 38, em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 99% ou de pelo menos 99,5% com a SEQ ID NO: 5.

[0295] Aspecto 40. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36 a 39, que compreende a SEQ ID NO: 5.

[0296] Aspecto 41. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36 a 40, que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

[0297] Aspecto 42. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34 e 36 a 40, que consiste em no máximo 1.210 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 1200, no máximo 1190, no máximo 1180, no máximo 1170, no máximo 1160, no máximo 1150 ou no máximo 1.145 resíduos de aminoácidos.

[0298] Aspecto 43. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42, que consiste em 1.142 resíduos de aminoácidos.

[0299] Aspecto 44. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42 a 43, em que o dito po- lipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 96% com a SEQ ID NO: 4.

[0300] Aspecto 45. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42 a 44, em que o dito po- lipeptídeo tem pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou de pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 4.

[0301] Aspecto 46. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42 a 45, que compreende a SEQ ID NO: 4.

[0302] Aspecto 47. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42-46, que consiste na se-quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

[0303] Aspecto 48. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40 e 42 a 46, que consiste em no máximo 1.130 resíduos de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 1120, no máximo 1110, no máximo 1100, no máximo 1.090, no máximo 1.080, no máximo 1.070, no máximo 1.060, no máximo 1.050, no máximo 1.055 ou no máximo 1.040 resíduos de aminoácidos.

[0304] Aspecto 49. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40, 42 a 46 e 48, em que o dito polipeptídeo consiste em 1.038 resíduos de aminoácidos.

[0305] Aspecto 50. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40, 42 a 46 e 48 a 49, em que o dito polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 96,5% com a SEQ ID NO: 3.

[0306] Aspecto 51. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40, 42 a 46 e 48 a 50, em que o dito polipeptídeo tem pelo menos 97%, tal como, por exemplo, identidade de sequência de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a SEQ ID NO: 3.

[0307] Aspecto 52. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40, 42 a 46 e 48 a 51, que com-preende a SEQ ID NO:3.

[0308] Aspecto 53. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, 15 a 20, 30 a 34, 36 a 40, 42 a 46 e 48 a 52, que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

[0309] Aspecto 54. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que a proporção de atividade de transgalac- tosilação:atividade de β-galactosidase é pelo menos 0,5, tal como pelo menos 1, tal como pelo menos 1,5, tal como pelo menos 2 após 30 min de reação tal como acima de uma concentração da concentração de lactose inicial de 3% p/p.

[0310] Aspecto 55. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que a proporção de atividade de transgalac- tosilação:atividade de β-galactosidase é pelo menos 2,5, tal como pelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelo menos 6, tal como pelo menos 7, tal como pelo menos 8, tal como pelo menos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 11, ou tal como pelo menos 12 após 30 min de reação tal como acima de uma concentração da concentração de lactose inicial de 3% p/p.

[0311] Aspecto 56. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 54 a 55, em que a concentração de lactose inicial é 3% p/p.

[0312] Aspecto 57. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que é isolado e/ou purificado.

[0313] Aspecto 58. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que é produzido recombinantemente.

[0314] Aspecto 59. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o dito polipeptídeo tem uma proporção de atividade de transgalactosilação acima de 100%.

[0315] Aspecto 60. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o dito polipeptídeo tem uma proporção de atividade de transgalactosilação acima de 150%, 175% ou 200%.

[0316] Aspecto 61. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, tendo o núcleo catalítico do glicosídeo hidro- lase com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo da SEQ ID NO:7.

[0317] Aspecto 62. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes que contêm domínios Glico_hidro2N (PF02837), Glico_hidro (PF00703) e/ou Glico_hidro 2C (PF02836).

[0318] Aspecto 63. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes que contêm o domínio similar à Ig Bacteriana (grupo 4) (PF07532).

[0319] Aspecto 64. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, que é derivado de Bifidobacterium bifidum.

[0320] Aspecto 65. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes que têm uma condição favorável de pH de 6,57,5.

[0321] Aspecto 66. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes que têm uma condição favorável de temperatura de 30-60 como 42-60 graus Celsius.

[0322] Aspecto 67. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que a porcentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos com ou para outra sequência de aminoáci- dos é determinada pelo uso de Blast com um tamanho de palavra de 3 e com BLOSUM 62 como a matriz de substituição.

[0323] Aspecto 68. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o polipeptídeo é um polipeptídeo re- combinante.

[0324] Aspecto 69. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o polipeptídeo é congelado a vácuo.

[0325] Aspecto 70. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o polipeptídeo está em solução.

[0326] Aspecto 71. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o polipeptídeo é isolado.

[0327] Aspecto 72. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes, em que o polipeptídeo é purificado.

[0328] Aspecto 73. Um ácido nucleico capaz de codificar um poli- peptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos precedentes.

[0329] Aspecto 74. Um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico de acordo com o aspecto 73, ou capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0330] Aspecto 75. Uma célula capaz de expressar um polipeptí- deo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0331] Aspecto 76. Um método de expressão de um polipeptídeo, o método compreendendo obtenção de uma célula de acordo com o aspecto 75 e expressão do polipeptídeo da célula, e opcionalmente purificação do polipeptídeo.

[0332] Aspecto 77. Uma composição compreendendo um polipep- tídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72, preferencialmente uma composição alimentícia, mais preferencialmente um produto lácteo.

[0333] Aspecto 78. A composição de acordo com o aspecto 77 compreendendo pelo menos 5%, tal como, por exemplo, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% p/p de um ou mais polipeptí- deos como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72 baseado na quantidade total de polipeptídeos na composição tendo identidade de sequência de pelo menos 70%, por exemplo, tal como 72%, 74%, 74%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90% com a SEQ ID NO: 22.

[0334] Aspecto 79. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 77 a 78, em que um ou mais polipeptídeos são selecionados a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo consistindo da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 e 5.

[0335] Aspecto 80. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 77 a 79, em que um ou mais polipeptídeos são selecionados a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo consistindo da SEQ ID NO: 1, 2, e 3.

[0336] Aspecto 81. A composição de acordo com qualquer um dos aspectos 77 a 80, em que um ou mais polipeptídeos são um polipeptí- deo consistindo da SEQ ID NO: 1 ou 2.

[0337] Aspecto 82. Um método para produção de um produto ali mentício tratando um substrato compreendendo lactose com um poli- peptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0338] Aspecto 83. O método de acordo com o aspecto 82 para produção de um produto lácteo tratando um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0339] Aspecto 84. O método de acordo com qualquer um dos as pectos 82 a 83 tratando adicionalmente o substrato com uma beta-galactosidase hidrolisante.

[0340] Aspecto 85. Um galacto-oligossacarídeo ou composição deste obtido tratando o substrato compreendendo lactose com um po- lipeptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0341] Aspecto 86. Um ácido nucleico capaz de codificar um poli- peptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0342] Aspecto 87. O ácido nucleico de acordo com o aspecto 86 tendo uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 ou 13.

[0343] Aspecto 88. Um plasmídeo compreendendo um ácido nu- cleico de acordo com qualquer um dos aspectos 86 a 87.

[0344] Aspecto 89. Um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer um dos aspectos 86 a 87, ou capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0345] Aspecto 90. Uma célula hospedeira compreendendo, prefe rencialmente transformada com um plasmídeo de acordo com o aspecto 88 ou um vetor de expressão de acordo com o aspecto 89.

[0346] Aspecto 91. Uma célula capaz de expressar um polipeptí- deo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0347] Aspecto 92. A célula hospedeira de acordo com o aspecto 90, ou a célula de acordo com o aspecto 91, que é uma célula bacteri- ana, de levedura ou fúngica.

[0348] Aspecto 93. A célula de acordo com o aspecto 92, em que a célula é selecionada a partir do grupo consistindo de Ruminococcus, Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconos- toc, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyve- romyces, Candida, Torula, Torulopsis e Aspergillus.

[0349] Aspecto 94. A célula de acordo com o aspecto 93, em que a célula é selecionada a partir do grupo consistindo de Ruminococcus hansenii, Ruminococcus lactaris, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum e Lactococcus lactis.

[0350] Aspecto 95. Um método de expressão de um polipeptídeo, o método compreendendo obtenção de uma célula hospedeira ou uma célula de acordo com qualquer um dos aspectos 91 a 94 e expressão do polipeptídeo da célula ou célula hospedeira, e opcionalmente purificação do polipeptídeo.

[0351] Aspecto 96. Uma composição compreendendo um polipep- tídeo como definido em qualquer um de aspectos 1 a 72 e um estabili- zante.

[0352] Aspecto 97. Uma composição compreendendo um polipep- tídeo como definido em qualquer um de aspectos 1 a 72 e um substrato de carboidrato.

[0353] Aspecto 98. A composição de acordo com o aspecto 97, em que o substrato de carboidrato é um dissacarídeo.

[0354] Aspecto 99. A composição de acordo com o aspecto 98, em que o dissacarídeo é lactose.

[0355] Aspecto 100. Um método para produção de um produto lác teo tratando um substrato baseado em leite compreendendo lactose com um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0356] Aspecto 101. O método de acordo com o aspecto 90, em que o polipeptídeo tem uma proporção de atividade de transgalactosi- lação como definido acima.

[0357] Aspecto 102. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 100 a 101, em que o substrato baseado em leite é iogurte, queijo, ou produtos lácteos fermentados.

[0358] Aspecto 103. O método de acordo com qualquer um dos as pectos 100 a 102, compreendendo ainda fermentação do dito substrato com um micro-organismo capaz de fermentação do dito substrato.

[0359] Aspecto 104. O método de acordo com o aspecto 103, em que o substrato baseado em leite é iogurte.

[0360] Aspecto 105. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 100 a 104, em que o tratamento com o polipeptídeo e o micro-organismo é realizado essencialmente ao mesmo tempo.

[0361] Aspecto 106. O método de acordo com qualquer um dos aspectos 100 a 105, em que o polipeptídeo e o micro-organismo são adicionados ao substrato baseado em leite essencialmente ao mesmo tempo.

[0362] Aspecto 107. O uso de uma célula de qualquer um dos as pectos acima para produção de um produto selecionado a partir do grupo consistindo em iogurte, queijo, produto lácteo fermentado, suplemento dietético e produto comestível probiótico.

[0363] Aspecto 108. Um produto lácteo compreendendo uma célu la de qualquer um dos aspectos acima.

[0364] Aspecto 109. Um produto lácteo compreendendo um poli- peptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0365] Aspecto 110. Um produto lácteo compreendendo um poli- peptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72 em uma concentração de 0,01-1000 ppm.

[0366] Aspecto 111. Um produto lácteo compreendendo um polipep- tídeo inativado como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0367] Aspecto 112. Um produto lácteo compreendendo um poli- peptídeo inativado como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72 em uma concentração de 0,01-1000 ppm.

[0368] Aspecto 113. Um produto lácteo compreendendo GOS for mado in situ por um polipeptídeo como definido em qualquer um dos aspectos 1 a 72.

[0369] Aspecto 114. O uso de um polipeptídeo de transgalactosila- ção de qualquer um dos aspectos 1 a 72 ou uma célula de qualquer um dos aspectos acima, para produção de galacto-oligossacarídeos.

[0370] Aspecto 115. O uso de um polipeptídeo de transgalactosila- ção de qualquer um dos aspectos 1 a 72 ou uma célula de qualquer um dos aspectos acima, para produção de galacto-oligossacarídeos para ser parte de um produto selecionado a partir do grupo consistindo no iogurte, queijo, produtos lácteos fermentados, suplementos dietéticos e produtos comestíveis probióticos.

[0371] Aspecto 116. O uso de um polipeptídeo de transgalactosila- ção de qualquer um dos aspectos 1 a 72 ou uma célula de qualquer um dos aspectos acima, para produção de galacto-oligossacarídeos para aumentar o crescimento de Bifidobacterium.

[0372] Aspecto 117. O uso de um polipeptídeo de transgalactosila- ção de qualquer um dos aspectos 1 a 72 ou uma célula de qualquer um dos aspectos acima, para produção de galacto-oligossacarídeos para aumentar o crescimento de Bifidobacterium em uma fermentação de cultura variada.

[0373] Aspecto 118. Um processo de produção de um polipeptídeo de transgalactosilação de qualquer um dos aspectos 1 a 72, compreen- dendo cultura de uma célula de qualquer um dos aspectos acima em meio de cultura adequado sob condições que permitem a expressão do dito polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo resultante da cultura.

[0374] Aspecto 119. Um processo de produção de galacto- oligossacarídeos, compreendendo contato de um polipeptídeo de qualquer um dos aspectos 1 a 72 ou uma célula de qualquer um dos aspectos acima com uma solução baseada em leite compreendendo lactose.

[0375] Aspecto 120. Um polipeptídeo que é um fragmento trunca do C-terminal da SEQ ID NO:22 tendo atividade de transgalactosilação e que é estável contra truncamento adicional tal como pela degradação proteolítica quando produzido em um organismo adequado como Bacillus subtilis por exemplo, cepa de Bacillus subtilis BG3594 e/ou que é estável contra truncamento adicional durante o armazenamento após a formulação final.

[0376] Aspecto 121. O polipeptídeo de acordo com o aspecto 120 que é como definido ainda em qualquer um dos aspectos 1 a 72. MATERIAIS E MÉTODOS

Método 1 Produção de polipeptídeo

[0377] Os genes sintéticos projetados para codificar o gene com pleto de Bifidobacterium bifidum (1.752 resíduos) com códons otimizados para a expressão em Bacillus subtilis foram adquiridos de GeneART (Regensburg, Alemanha) SEQ ID No. 8

[0378] Os mutantes de truncamento de Bifidobacterium bifidum foram construídos usando a reação de polimerase em cadeia com ini-ciadores de sentido reverso que permitiram amplificação específica da região selecionada a partir do gene sintético. Iniciador de sentido direto: GGGGAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAGTAAG (Spel sublinhado) (SEQ ID NO: 15). Iniciadores de sentido reverso:

[0379] O gene sintético foi clonado no vetor de expressão de Baci- llus subtilis pBNspe usando os sítios de restrição única Spel e PacI (Figura 1) e os plasmídeos isolados foram transformados na cepa de Bacillus subtilis BG3594. Os transformantes foram riscados novamente nas placas LB contendo Neomicina 10 μg/mL como seleção.

[0380] Uma pré-cultura foi organizada em meios LB contendo Ne- omicina 10 μg/mL e cultivada por 7 horas a 37°C e agitação de 180 rpm. 500 μg desta pré-cultura foram usados para inocular 50 mL de meio modificado de Grant contendo Neomicina 10 μg/mL deixados crescer por 68 horas a 33°C e agitação de 180 rpm.

[0381] As células foram lisadas pela adição diretamente a meios de culturas de concentrações finais de Lisozima 1 mg/ml (Sigma-Aldrich) e Benzonase 10 U/ml (Merck) e incubadas por 1 hora a 33°C em 180 RPM. Os lisados foram clarificados pela centrifugação em 10.000 x g durante 20 minutos e posteriormente filtrados de forma estéril. Meios modificados de Grant foram preparados de acordo com as seguintes instruções: PARTE I (Autoclave) Soytone Trazer a PARTE II 10 g 500 mL por litro K2HPO4 1M 3 mL Glicose 75 g Ureia 3,6 g MOPS 10X de Grant 100 mL Trazer a 400 mL por litro

[0382] PARTE I (Soytone 2% p/p) foi preparada, e autoclavada por 25 minutos a 121°C.

[0383] PARTE II foi preparada e misturada com PARTE 1 e o pH foi ajustado ao pH 7,3 com HCI/NaOH.

[0384] O volume foi trazido ao volume completo e esterilizado com filtro PES de 0,22 μm. Tampão MOPS 10 x foi preparado de acordo com as seguintes instruções: 83,72 g 7,17 g 12 g 29,22 g 10 mL Tricina Péletes de KOH NaCI K2SO4 0,276 M MgCI2 0,528 M 10 mL Micronutrientes de Grant 100X

[0385] Trazer a aprox. 900 mL com água e dissolver. Ajustar o pH a 7,4 com KOH, encher até 1 L e filtrar de forma estéril a solução com filtro PES de 0,22 μm. Micronutrientes 100 x foram preparados de acordo com as seguintes instruções: Citrato de sódio.2H2O 1,47 g CaCI2.2H2O 1,47 g FeSO4.7H2O 0,4 g MnSO4. H2O 0,1 g ZnSO4. H2O 0,1 g CuCI2.2H2O 0,05 g CoCI2.6H2O 0,1 g Na2MoO4.2H2O 0,1 g Dissolver e ajustar o volume a 1 L com água. A esterilização foi com filtro PES de 0,22 μm. O armazenamento era a 4°C evitando a luz. Método 2 Purificação e preparações de enzima

[0386] A enzima filtrada isolada foi concentrada usando dispositivo de filtração VivaSpin ultra com um corte de PM de 10 kDa (Vivaspin 20, Sartorius, Lot#12VS2004) e o concentrado foi carregado para uma coluna de dessalinização PD10 (GE Healthcare, Lot# 6284601) e eluí- do em Tris-HCI 20 mM pH 8,6. A cromatografia foi realizada manualmente em um sistema Ãkta FPLC (GE Healthcare). 4 mL da amostra dessalinizada, contendo aproximadamente 20 mg de proteína, foram carregados para uma coluna HyperQ de 2 mL (HyperCel™, agente absorvente Q) equilibrada com Tris-HCI 20 mM pH 8,6 em um fluxo de 1 ml/min. A coluna foi minuciosamente lavada com 30 CV (volumes de coluna) de tampão de lavagem e a β-galactosidase ligada foi eluída com um gradiente longo de 100 CV em Tris-HCI 20 mM pH 8,6 NaCI 250 mM. As impurezas restantes na coluna foram removidas com uma eluição de uma etapa usando Tris-HCI 20 mM pH 8,6 NaCI 500 mM. A proteína no eluído e eluição foi analisada para atividade de β- galactosidase e por SDS-page.

[0387] Os géis de SDS-page foram corridos com gel NuPage® Novex Invitrogen 4-12% Bis-Tris 1,0 mM, 10 poços (Cat# NP0321box), Padrão pré-marcado See-Blue® Plus2 (Cat# LC5925) e Tampão de Corrida NuPAGE® MES SDS (Cat# NP0002) de acordo com o protocolo do fabricante. Os géis foram marcados com Safestain Simply Blue (Invitrogen, Cat# LC6060) (Figura 2). Método 3 Medida da atividade de β-galactosidase

[0388] A atividade enzimática foi medida usando o substrato 2- Nitrofenil-β-D-Galactopiranosideo comercialmente disponível (ONPG) (Sigma N1127). ONPG sem aceptor 100 mM KPO4 pH 6,0 12,3 mM ONPG ONPG suplementado com aceptor 100 mM KPO4 pH 6,0 20 mM Celobiose 12,3 mM ONPG Solução de Parada Na2CO310%

[0389] Séries de diluição de 10 μl da enzima purificada foram adi cionadas em poços de placas de microtítulo contendo 90 μl de tampão ONPG com ou sem aceptor. As amostras foram misturadas e incubadas por 10 min a 37°C, posteriormente 100 μl da Solução de Parada foram adicionados a cada um dos poços para terminar a reação. As medidas de absorbância foram registradas em 420 nm em um leitor de placas Molecular Device SpectraMax controlado pelo pacote de programas Softmax.

[0390] A proporção de atividade de transgalactosilação foi calcula da como se segue Proporção de atividade de transgalactosilação = (Abs420+Celobiose/Abs420-Celobiose) *100, para diluições onde a absorvân- cia estava entre 0,5 e 1.0 (Figura 3).

Método 4 Determinação de atividade de LAU Princípio:

[0391] O princípio deste método de ensaio consiste em que lactase hidrolisa 2-o-nitrofenil-β-D-galactopiranosideo (ONPG) em 2-o-nitrofenol (ONP) e galactose a 37°C. A reação é parada com carbonato de sódio e o ONP liberado é medido em espectrofotômetro ou colorímetro em 420 nm. Reagentes:

[0392] Tampão MES pH 6,4 (MES 100 mM pH 6,4, CaCI2 10 mM): dissolver 19,52 g de hidrato de MES (Pm: 195,2 g/mol, Sigma-aldrich #M8250-250G) e 1,470 g de di-hidrato de CaCI2 (Pm: 147,01g/mol, Sigma-aldrich) em 1000 ml de ddH2O, ajustar o pH a 6,4 por NaOH 10 M. Filtrar a solução por filtro de 0,2 μm e armazenar a 4°C por até 1 mês.

[0393] Substrato de ONPG pH 6,4 (ONPG 12,28 mM, MES 100 mM pH 6,4, CaCI210 mM): dissolver 0,370 g de o-nitrofenil-β-D-galactopi- ranosídeo (ONPG, Pm: 301,55 g/mol, Sigma-aldrich #N1127) em 100 ml de tampão MES pH 6,4 e armazenar no escuro a 4°C por até 7 dias.

[0394] Reagente de parada (Na2CO3 10%): dissolver 20,0 g de Na2CO3 em 200 ml de ddH2O, filtrar a solução por filtro de 0,2 μm e armazenar à TA por até 1 mês. Procedimento:

[0395] A série de diluição da amostra de enzima foi feita no tampão MES pH 6,4 e 10 μl de cada diluição de amostra foram transferidos para os poços de uma placa de microtítulo (formato de 96 poços) contendo 90 μl de substrato de ONPG pH 6,4. As amostras foram misturadas e incubadas por 5 min a 37°C usando Thermomixer (Comfort Thermomixer, Eppendorf) e posteriormente 100 μl de reagente de parada foram adicionados a cada um dos poços para terminar a reação. Um branco foi construído usando tampão MES pH 6,4 em vez da amostra de enzima. O aumento na absorbância em 420 nm foi medido em um leitor ELISA (leitor de placa SpectraMax, Molecular Device) contra o branco. Cálculo de atividade de enzima:

[0396] O coeficiente de extinção molar de 2-o-nitrofenol (Sigma- aldrich #33444-25G) no tampão MES pH 6,4 foi determinado (0,5998 x 10-6 M-1 x cm-1). Uma unidade (U) da atividade de lactase (LAU) foi definida como aquela correspondendo à hidrólise de 1 nmol de ONPG por minuto. Ao usar placas de microtítulo com um volume de reação total de 200 μl (percurso luminoso de 0,52 cm), a atividade lactase por mL da amostra de enzima pode ser calculada usando a seguinte equação:

Cálculo de atividade específica de BIF917 mostrado neste pedido como a SEQ ID NO: 1: Determinação de concentração de BIF917:

[0397] A quantificação da enzima alvo (BIF917) e produtos de truncamento foram determinados usando o sistema Criterion Stain free SDS-page (BioRad). Qualquer Gel pré-moldado kD Stain Free Tris- HCI 4-20%, 18 poços (Comb #345-0418) foi usado com tampão Serva Tris-Glicina/SDS (BioRad cat. #42529). Os géis foram corridos com os seguintes parâmetros: 200 V, 120 mA, 25 W, 50 min BSA (1,43 mg/ml) (Sigma-Aldrich, cat. #500-0007) foi usado como padrão proteico e Imageador Criterion Stain Free (BioRad) foi usado com o programa Image Lab (BioRad) para quantificação usando a intensidade de banda com correlação do conteúdo de triptofano.

[0398] A atividade de LAU específica de BIF917 foi determinada do fermento bruto (concentrado de filtração extrema) de duas fermen-tações independentes (como descrito no método 1) e usando 5 dilui-ções diferentes (ver a tabela 1).

[0399] Foi descoberto que a atividade específica de BIF917 era 21,3 LAU/mg ou 0,0213 LAU/ppm. Tabela 1: Determinação de atividade específica BIF917

EXEMPLOS Exemplo 1 Determinação de atividade de β-galactosidase de variantes de truncamento de BIF

[0400] Oito variantes de truncamento diferentes: BIF_917, BIF_995, BIF_1068, BIF_1172, BIF_1241, BIF1326, BIF_1400 e BIF_1478 foram construídas como descrito usando o método 1 e purificadas como descrito no método 2 (ver a Figura 2).

[0401] A atividade de β-galactosidase foi determinada de todas as variantes de truncamento na presença e na ausência da celobiose usando o método descrito 3 acima.

Resultados

[0402] A proporção de atividade de transgalactosilação ((Abs420+Celobiose/Abs420-Celobiose)*100) foi calculada da atividade de β- galactosidase medida de cada variante e é mostrada na Figura 3. As variantes que têm um comprimento de 1.241 resíduos ou menos mostram uma proporção de atividade de transgalactosilação acima de 100%, indicando que estas variantes são predominantemente transgalactosilantes. As variantes com um comprimento que é maior que 1.241 resíduos mostram uma proporção de atividade de transgalactosilação abaixo de 100%, indicando que estas variantes são predominantemente hidrolíticas. BIF_917 e BIF_995 têm a proporção mais alta da atividade de transga- lactosilação de aproximadamente 250%.

Exemplo 2 GOS gerado em uma matriz de iogurte

[0403] A avaliação de enzimas BIF na produção de GOS foi testa da em um mimético de aplicação de iogurte. Os experimentos em batelada com um volume de 100 μl foram realizados em placas de MTP de 96 poços usando uma mistura de iogurte, consistindo em 98,60% (p/v) de leite de baixo teor de gordura pasteurizado fresco (Mini-maelk, Arla Foods, Dinamarca) e ingrediente de soro de leite 1,4% (p/v) Nutri- lac YQ-5075 (Arla). Para hidratar completamente Nutrilac YQ-5075, a mistura foi deixada com agitação por 20 h e posteriormente foi adicionado NaFosfato 20 mM pH 6,5 para assegurar um pH de 6,5. Esta base láctea foi usada pura e a concentração de lactose foi determinada sendo 5,5% (p/v), correspondendo a 5,3% (p/p) nesta solução. A seguinte correlação é válida no presente exemplo: lactose 1% (p/v) = lactose 9,587% (p/p). 90 μl da base láctea foram misturados com 10 μl das enzimas purificadas, selados com fita e incubados a 43°C por 3 horas. A reação foi parada por 100 μl de Na2CO3 10%. As amostras foram armazenadas a -20°C.

Método de HPLC

[0404] A quantificação de galacto-oligossacarídeos (GOS), lacto- se, glicose e galactose foi realizada por HPLC. A análise de amostras foi realizada em um Dionex ICS 3000. Os parâmetros de IC foram como se segue: fase móvel: NaOH 150 mM, Fluxo: Isocrático, 0,25ml/min, Coluna: Carbopac PA1, temperatura de Coluna: TA, volume de Injeção: 10 μL, detectores: PAD, Integração: Manual, Preparação da amostra: diluição de 100 vezes em água Milli-Q (0,1 ml de amostra + 9,9 ml de água) e filtração através de filtros de seringa de 0,45 μm, Quantificação: áreas de pico em porcentagem de área de pico padrão. Um xarope de GOS (Vivanal GOS, Friesland Campina) foi usado como padrão para a quantificação de GOS. Neste exemplo, o termo “GOS” é definido como galacto-oligossacarídeos com um grau de polimerização (DP) de 3 ou acima.

Resultados

[0405] O montante quantificado de GOS gerado na base láctea por BIF_917, BIF_995 e BIF_1326 é mostrado na Figura 4. Pode ser visto que as variantes mais curtas BIF_917 e BIF_995 têm uma produção significativamente (determinado por um teste T de Student com confiança de 95%) mais alta de GOS aproximadamente 1,2% (p/v) em comparação com BIF 1326 gerando abaixo de 0,1% (p/v).

Exemplo 3 Modelo de degradação de variantes de truncamento

[0406] Uma biblioteca que cobre a região entre BIF1230 e BIF1325 foi ordenada de GeneART (Regensburg, Alemanha) (ver tabela 2). As variantes de truncamento foram produzidas como descrito no método 1. Os peptídeos resultantes foram submetidos à análise de SDS_PAGE e visualizados com Safestain Simply Blue (Invitrogen, Cat# LC6060) (Figura 5).

Resultados

[0407] Surpreendentemente, a maioria das variantes foram proteo- liticamente modificadas no caldo final com quantidades variadas da banda alvo que aparece no fim da fermentação. As variantes geraram três faixas distintas com intensidades variadas que foram verificadas usando espectrometria de massa. As variantes têm o truncamento C- terminal com BIF917 que corresponde aos terminais da SEQ ID NO: 1, BIF995 correspondendo aos terminais da SEQ ID NO: 2 e BIF1068 correspondendo aos terminais da SEQ ID NO: 3.

[0408] As bandas de proteínas cortadas do gel (marcadas com flechas na Figura 5) são digeridas usando três enzimas diferentes, como preparação para a análise de espectrometria de massa. A tripsi- na hidrolisa ligações peptídicas especificamente no lado da carboxila dos resíduos arginina (R) e lisina (K), menos quando uma prolina (P) está no lado da carboxila. Uma quimiotripsina hidrolisa ligações peptí- dicas especificamente no lado da carboxila da tirosina (Y), fenilalanina (F), triptofano (W) e leucina (L), menos quando uma prolina (P) está no lado da carboxila. Glu-C preferencialmente cliva no lado de carboxila de glutamila (E) no tampão de bicarbonato de amônio pH 8, mas também cliva no lado de carboxila de aspartila (D) se a hidrólise for realizada em um tampão de fosfato pH 8.

[0409] A fim de detectar o C-terminal, a proteína de interesse é preparada para a análise usando o nosso procedimento básico para caracterização proteica (A2963), com uma modificação usando 40% de 18O-água no tampão de digestão. A teoria consiste em que a clivagem proteolítica incorporará tanto 18O-água como 16O-água nos peptí- deos resultantes, que consequentemente aparecerão como pares. A proteína C-terminal embora somente aparecerá como um peptídeo único com 16O-água, uma vez que não é clivada, mas somente o “pep- tídeo último” deixado da proteína. Deste modo, o C-terminal é mapeado usando a análise MS/MS. Tabela 2: Variantes

Exemplo 4 GOS gerados enzimaticamente in situ em base láctea e iogurtes

[0410] Neste exemplo, o termo “GOS” é definido como galacto- oligossacarídeos com um grau de polimerização (DP) de 3 ou acima.

[0411] A avaliação da produção de GOS por BIF917 e BIF995 foi testada pela aplicação in situ em diferentes iogurtes tipo balcã. A β- galactosidase foi adicionada à base láctea simultaneamente com a adição das culturas de iogurte específicas, resultando na reação de transgalactosilação que ocorre em conjunto com o processo de fer-mentação do iogurte.

[0412] Experimentos em batelada do iogurte inicial (tipo balcã) foram feitos com 100 mL de base láctea (mistura de iogurte). A base láctea consistiu em 98,60% (p/v) de leite de baixo teor de gordura fresco pasteurizado convencional (não orgânico) (0,5% de gordura de Mini-maelk, Arla Foods Amba, Dinamarca) e ingrediente de soro de leite Nutrilac YQ-5075 1,4% (p/v) (Arla Foods Ingredients, Dinamarca), resultando em uma concentração de lactose de 5,5% (p/v) correspondendo a 5,3% (p/p) (lactose 1% (p/v) = lactose 0,9587% (p/p) nesta solução). Para hidratar completamente Nutrilac YQ-5075, a mistura foi deixada com agitação fraca por 20 horas a 4°C. No ex-perimento inicial, uma cultura congelada a vácuo YO-MIX 485LYO foi usada consistindo em Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus e Streptococcus thermophilus (DuPont Nutrition Biosciences, Dina-marca). Uma diluição inicial da cultura foi feita, adicionando 10 g de YO-MIX 485LYO a 400 mL de leite convencional UHT (não orgânico) (gordura 1,5% Let-maelk, Arla Foods Amba, Dinamarca). 1,43 mL da cultura diluída foram adicionados por litro da base láctea. 100 mL da base láctea foram distribuídos em garrafas de tampa azul de 250 mL e as enzimas foram adicionadas em concentração variada (10, 20 e 40 ppm, correspondendo 0,213, 0,426 e 0,853 LAU como descrito no método 4) constituição de 1% (v/v) da mistura de iogurte final. A fermentação do iogurte foi realizada a 43°C e terminada após 10 h pelo resfriamento rápido no gelo. As fermentações sempre eram executadas em duplicatas e a composição de açú- car/oligossacarídeo do iogurte foi analisada por HPLC no dia seguinte da fermentação (ver o método de HPLC abaixo). As amostras de iogurte fermentadas sempre eram armazenadas a 4°C.

[0413] Os resultados do experimento do iogurte inicial são mostra dos na tabela 3. Pode ser visto que a dose aumentada de BIF917 ou de BIF995 de 10 ppm a 40 ppm leva ao conteúdo aumentado de GOS e quantidade reduzida de DP2 (incluindo lactose) no iogurte final. A diferença no desempenho das duas variantes está dentro da variação da determinação de HPLC e pode ser concluído que têm desempenho similar dentro das dosagens investigadas. Tabela 3. O conteúdo de sacarídeos DP2 (principalmente lactose) e GOS (DP3+) em um iogurte fermentado tratado com dose crescente de BIF917 e BID995. Todos os resultados são calculados como uma média de três medidas independentes.

[0414] O iogurte tipo balcã foi feito com a concentração de lactose inicial mais alta de 7,5% p/v (correspondendo a 7,1% p/p, como lactose 1% p/v = 0,9423% p/p nesta solução) para investigar seu efeito sobre a concentração de GOS alcançada no iogurte final. O seguinte procedimento foi aplicado: 1. Todos os ingredientes em pó (listados na tabela 4) são misturados e a mistura seca é adicionada ao leite / água sob boa agi-tação a 4-5°C, deixando hidratar por 20 horas a 4°C. 2. A base láctea é pré-aquecida a 65°C (P1) 3. A base láctea é homogeneizada a 65°C / 6.000 kPa(200 bar) 4. A base láctea é pasteurizada a 95°C por 6 minutos (P3) 5. A base láctea é resfriada a 5°C (K2) Tabela 4. Lista de ingredientes de iogurte SET em % (p/p)

[0415] A seguir, a base láctea é aquecida a 43°C (K1). A diluição da cultura YO-MIX 495 consistindo em Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus e Streptococcus thermophilus (DuPont Nutrition Biosciences, Dinamarca) foi feita na temperatura de fermentação. 250 mL de base láctea foram distribuídos em garrafas de tampa azul de 500 mL e as enzimas foram adicionadas em constituição de concentração variada 1% (v/v) da mistura do iogurte final. A cultura inicial, a mistura YO-495 é adicionada em uma dosagem de 20 DCU (Unidades de Cultura de Danisco) por 100 litros, onde uma DCU são 100 bilhões de células medidas como unidades de formação de colônia. Para cada teste, três amostras foram feitas. A fermentação foi realizada no pH 4,6 a 43°C e seguida de parada por resfriamento rápido a 5°C. A composição de açúcar/oligossacarídeo do iogurte foi analisada por HPLC no dia seguinte da fermentação (ver o método de HPLC abaixo). As amostras de iogurte fermentadas sempre eram armazenadas a 4°C.

[0416] Os resultados do experimento do iogurte são mostrados na tabela 5. Pode ser visto que a lactose inicial mais alta (7,5% p/v) au-mentou o GOS total gerado no iogurte em comparação com o GOS alcançado com lactose inicial 5,5% (p/v), como mostrado na tabela 3. Uma concentração de GOS final de 2,954% é alcançada com dose de 50 ppm de BIF917 testado, ao passo que GOS 2,662% foi produzido com 25 ppm de BIF917. Na comparação feita, a hidrólise convencional de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis (GODO-YNL2, GODO SHUSEI Co., Ltd., Japão) produziu GOS 0,355% em uma dose de 25 ppm. Uma redução na concentração de lactose de 2,127% foi obser-vada no iogurte branco onde a mesma quantidade de H2O foi adicio-nada em vez de enzima. Tabela 5: Conteúdo de sacarídeos DP2 (principalmente lactose) e GOS (DP3+) em um iogurte fermentado tratado com dose crescente de BIF917 e β-gal de K. lactis.

[0417] Para testar a influência da acidii Ncação na fermen tação de iogurte em desempenho de BIF917, estudos foram feitos com três cul-turas diferentes de YO-mix, todas consistindo em Lactobacillus delbru- eckii subsp bulgaricus e Streptococcus thermophilus (DuPont Nutrition Biosciences, Dinamarca): YO-MIX 495 com um tempo de fermentação reduzido relativo; YO-MIX 495 com um tempo de fermentação rápido relativo e YO-MIX 601 com a última fase prolongada e uma fermenta-ção de acidificação forte. Todas as fermentações foram realizadas a 43°C com a mesma quantidade de BIF917 (25 ppm).

[0418] Além disso, para testar a influência da temperatura em de sempenho de BIF917, fermentação com YO-MIX 495 e 25 ppm de BIF917 foi realizada a 43°C, 45°C e 47°C. O seguinte procedimento foi aplicado para produzir iogurtes tipo balcã com uma concentração de lactose inicial de 7,5% (p/v) (correspondendo a 7,1% p/p, como lactose 1% p/v = 0,9423% p/p nesta solução): 1. Todos os ingredientes em pó (listados na tabela 6) são misturados e a mistura seca é adicionada ao leite / água sob boa agi-tação a 4-5°C, deixando hidratar por 20 horas a 4°C. 2. A base láctea é pré-aquecida a 65°C (P1) 3. A base láctea é homogeneizada q 65°C / 6.000 kPa(200 bar) 4. A base láctea é pasteurizada a 95°C por 6 minutos (P3) 5. A base láctea é resfriada a 5°C (K2) 6. A base láctea é aquecida a 43°C (K1). A diluição das cul-turas YO-MIX 495, 485 e 601 (DuPont Nutrition Biosciences, Dinamar-ca) foi feita na temperatura de fermentação. 7. 100 mL de base láctea foram distribuídos em garrafas de tampa azul de 250 mL e as enzimas foram adicionadas em constituição de concentração variada de 1% (v/v) da mistura do iogurte final 8. A cultura inicial, YO-Mix 495, 485 ou 601 foi adicionada em uma dosagem de 20 DCU (Unidades de Cultura de Danisco) por 100 litros. Para cada teste, três amostras foram feitas. 9. A fermentação foi realizada no pH 4,6 a 43°C (para estu-dos de temperatura a 43°C, 45°C e 47°C respectivamente) e a seguir parada por resfriamento rápido a 5°C 10. A composição de açúcar/oligossacarídeo de iogurte foi analisada por HPLC no dia seguinte da fermentação (ver o método de HPLC abaixo). As amostras de iogurte fermentadas sempre eram ar-mazenadas a 4°C. Tabela 6. Lista de ingredientes de iogurte SET em % (p/p)

[0419] Os resultados do experimento de iogurte são mostrados na tabela 7. Pode ser visto que diferentes culturas YO-mix, tendo perfis de acidificação diferentes, não exercem nenhum efeito significante sobre o rendimento de GOS final. Em média, GOS 3,22% (p/v) é gerado e a concentração de GOS mais alta (3,300%) encontrada no iogurte produzido com a YO-mix 485 está dentro da variação da quantificação. A modificação na temperatura de fermentação de 43°C a 45°C e 47°C não modifica significativamente (usando um teste T de Student com limites de confiança de 95%) a quantidade de GOS produzida em qualquer um dos iogurtes: 3,258% p/v a 43°C, 3,375% p/v a 45°C e 3,236% p/v a 47°C. Dessa forma, pode concluir-se que a ação de BIF917 sob as condições investigadas é robusta para a geração in situ de GOS no iogurte usando várias condições de cultura e temperatura. Tabela 7: Conteúdo de DP2, DP3, DP4, DP5, DP6, glicose e galactose em um iogurte fermentado tratado com BIF917.

Método de HPLC

[0420] Todos os produtos químicos usados foram de grau analíti co. D-(+)-Lactose (min 99%, n° 17814), D-(+)-glicose (min 99,5%, n° G8270-100G, lote# 036K0137), e D-(+)-galactose (min 99%, n° G0750- 25G, lote# 031M0043V) foram obtidas de Sigma (St. Louis, Mo, USA). Xarope Vivinal GOS (Prod. No. 502675 Lote#649566) foi obtido de Friesland Campina Domo (Amersfoort, Holanda) contendo 57% em galacto-oligossacarídeos de matéria seca (DM), 21% em DM lactose anidra, 20% em DM glicose anidra e 0,8% em DM galactose anidra.

Preparação de amostra

[0421] Todos os padrões: lactose, glicose, galactose e GOS foram preparados em água destilada dupla (ddH2O) e filtrados através de filtros de seringa de 0,45 μm. Um conjunto de cada padrão foi prepa-rado variando a concentração de 10 a 200.000 ppm.

[0422] Para avaliar a quantificação do conjunto acima de açúcares em uma matriz de iogurte/leite, os padrões acima foram semeados em uma amostra de iogurte e leite como controles internos. Todas as amostras de iogurte e leite contendo β-galactosidase ativa foram inati- vadas aquecendo a amostra a 95°C por 10 min. Todas as amostras de leite foram preparadas em placas de MTP de 96 poços (Corning, NY, EUA) e diluídas 20 vezes no mínimo e filtradas por filtros de placa de 96 poços de 0,20 μm antes da análise (placa de filtro Corning, mem-brana hidrófila PVDF, NY, EUA). As amostras que contêm mais de 50.000 ppm (5% p/v) de lactose foram aquecidas a 30°C para assegu-rar a solubilização apropriada. Todas as amostras de iogurte foram pesadas e diluídas 10 vezes em ddH2O antes da homogeneização da amostra usando um Ultra Turrax TP18/10 durante alguns minutos (Janke & Kunkel Ika-labortechnik, Bie & Berntsen, Dinamarca). β- galactosidase foi inativada pelo tratamento térmico e as amostras fo-ram ainda diluídas em placas de MTP de 96 poços filtradas através de filtros de placa de 96 poços de 0,20 μm antes da análise (placa de filtro Corning, membrana hidrófila PVDF, NY, EUA). Todas as amostras fo-ram analisadas em placas de MTP de 96 poços seladas com a fita.

Instrumentação

[0423] A quantificação de galacto-oligossacarídeos (GOS), lacto se, glicose e galactose foi realizada por HPLC. A análise de amostras foi realizada em um sistema Dionex Ultimate 3000 HPLC (Thermo Fis-her Scientific) equipado de uma bomba analítica Dual Gradiente DGP- 3600SD, autoamostrador com termostato WPS-3000TSL, forno de co-luna com termostato TCC-3000SD e um detector de índice refrativo RI- 101 (Shodex, JM Science). O programa Chromeleon datasystem (Ver-são 6.80, DU10A Build 2826, 171948) foi usado para aquisição e aná-lise de dados.

Condições cromatográficas

[0424] As amostras foram analisadas por HPLC usando uma colu na de oligossacarídeo RSO, Ag+ 4% reticulada (Phenomenex, Holan-da) equipada de uma coluna de guarda analítica (Carbo-Ag+ neutra, AJ0-4491, Phenomenex, Holanda) a 70°C. A coluna foi eluída com água destilada dupla (filtrada por uma membrana de celulose regene-rada de 0,45 μm e purgada com gás hélio) em uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min.

[0425] O fluxo isocrático de 0,3 ml/min foi mantido durante a análi se com um tempo de execução total de 37 min e o volume de injeção foi ajustado a 10 μl. As amostras foram mantidas a 30°C no comparti-mento de autoamostrador com termostato para assegurar a solubiliza- ção da lactose. O eluente foi monitorado por meio de um detector de índice refrativo e a quantificação foi feita pela área de pico em relação à área de pico padrão dada. Picos com um grau de três ou mais (DP3+) no xarope Vivinal GOS (Friesland Food Domo, Holanda) foram usados como padrão para a quantificação de GOS após declaração de produções sobre o conteúdo GOS no produto. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS >SEQ ID NO: 1 (BIF_917) vedatrsdsttqmsstpevvyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkysqsneaesa ylpggtgwyrksftidrdlagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentivvkvenrlpssrwysgsg iyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpslatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaalgtvttasksiaagasadvt stitaaspklwsiknpnlytvrtevlnggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsmhhdqgslgavanrraierqveil qkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstínrdr napsvlmwslgnemmegisgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwnesntmgdnltanggvvgtnysdga nydkirtthpswaiygsetasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydvvqrdfvagtyvwtgfdylgept pwngtgsgavgswpspknsyfglvdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhilpawnenvvakgsgnnvpvvvytdaakvklyft pkgstekrligeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrlipegstegnasvtttgkaak Ikadadrktitadgkdlsyievdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhdsyqadnrkafsgkvlaivqstkeag eit vta kadg I q sstvki attavpgtstekt >SEQ ID NO: 2 (BIF_995) 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Vedatrsdsttqmsstpevvyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysltqkysqsneaesa ylpggtgwyrksftidrdlagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentivvkvenrlpssrwysgsg iyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpslatqπggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaaigtvttasksiaagasadvt stitaaspklwsiknpnlytvrtevlnggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsmhhdqgslgavanrralerqveil qkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstinrdr napsvimwslgnemmegisgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwπesntmgdnltaπggvvgtnysdga nydkirtthpswaiygsetasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydvvqrdfvagtyvwtgfdylgept pwngtgsgavgswpspknsyfgivdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhllpawnenvvakgsgnnvpwvytdaakvklyft pkgstekrligeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrtipegstegnasvtttgkaak Ikadadrktitadgkdlsyievdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhdsyqadnrkafsgkvlaivqstkeag eitvtakadglqsstvkiattavpgtstektvrsfyysrnyyvktgnkpilpsdvevrysdgtsdrqnvtwdavsddqiakagsfsva gtvagqkisvrvtmideigallnysastpvgtpavlpgsrpavlpdgtvtsanfavhwtkpadtvyntagtvkvpgtatvfgkefkvt atirvq >SEQ ID NO: 4 (BIF_1172) vedatrsdsttqmsstpevvyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkysqsneaesa ylpggtgwyrksftidrdlagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentivvkvenrlpssrwysgsg iyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpsíatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaaigtvttasksiaagasadvt stltaaspklwsiknpnlytvrtevlπggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsrnhhdqgslgavaπrraierqveil qkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstinrdr napsvimwslgnemmeglsgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwnesntmgdnltanggvvgtnysdga nydkirtthpswaiygsetasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydwqrdfvagtyvwtgfdylgept pwngtgsgavgswpspknsyfgivdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhilpawnenwakgsgnnvpvwytdaakvklyft pkgstekiiigeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrlipegstegnasvtttgkaak Ikadadrktitadgkdlsyievdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhdsyqadnrkafsgkvlaivqstkeag 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aaatcgcacaagcgattttgatgcgaactggaaatttatgctgtcagatagcgttcaagcacaagatccggcatttgatgattcagca tggcaacaagttgatctgccgcatgattatagcatcacacagaaatatagccaaagcaatgaagcagaatcagcatatcttccggga ggcacaggctggtatagaaaaagctttacaattgatagagatctggcaggcaaacgcattgcgattaattttgatggcgtctatatga atgcaacagtctggtttaatggcgttaaactgggcacacatccgtatggctattcaccgttttcatttgatctgacaggcaatgcaaaat ttggcggagaaaacacaattgtcgtcaaagttgaaaatagactgccgtcatcaagatggtattcaggcagcggcatttatagagatg ttacactgacagttacagatggcgttcatgttggcaataatggcgtcgcaattaaaacaccgtcactggcaacacaaaatggcggag atgtcacaatgaacctgacaacaaaagtcgcgaatgatacagaagcagcagcgaacattacactgaaacagacagtttttccgaaa ggcggaaaaacggatgcagcaattggcacagttacaacagcatcaaaatcaattgcagcaggcgcatcagcagatgttacaagca caattacagcagcaagcccgaaactgtggtcaattaaaaacccgaacctgtatacagttagaacagaagttctgadcggaggcaa agttctggatacatatgatacagaatatggctttcgctggacaggctttgatgcaacatcaggcttttcactgaatggcgaaaaagtc aaactgaaaggcgttagcatgcatcatgatcaaggctcacttggcgcagttgcaaatagacgcgcaattgaaagacaagtcgaaat 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geração de vari-antes de BIF GGGGTAACTAGTGGAAGATGCAACAAGAAG >SEQ ID NO: 16 iniciador de sentido reverso para BIF917 GCGCTTAATTAATTATGI I I I I ICTGTGCTTGTTC >SEQ ID NO: 17 iniciador de sentido reverso para BIF995 GCGCTTAATTAATTACAGTGCGCCAATTTCATCAATCA >SEQ ID NO: 18 iniciador de sentido reverso para BIF1068 GCGCTTAATTAATTATTGAACTCTAATTGTCGCTG >SEQ ID NO: 19 iniciador de sentido reverso para BIF1241 GCGCTTAATTAATTATGTCGCTGTTTTCAGTTCAAT >SEQ ID NO: 20 iniciador de sentido reverso para BIF1326 GCGCTTAArrAATTAAAATTCTTGTJCTGTGCCCA >SEQ ID NO: 21 iniciador de sentido reverso para BIF1478 GCGCTTAATTAATTATCTCAGTCTAATTTCGCTTGCGC >SEQ ID NO: 22 Bifidobacterium bifidum BIF1750 vedatrsdsttqmsstpewyssavdskqnrtsdfdanwkfmlsdsvqaqdpafddsawqqvdlphdysitqkysqsneaesa ylpggtgwyrksftidrdiagkriainfdgvymnatvwfngvklgthpygyspfsfdltgnakfggentlvvkvenrlpssrwysgsg iyrdvtltvtdgvhvgnngvaiktpslatqnggdvtmnlttkvandteaaanitlkqtvfpkggktdaaigtvttasksiaagasadvt stitaaspklwsiknpnlytvrtevlπggkvldtydteygfrwtgfdatsgfslngekvklkgvsmhhdqgslgavanrraierqveil qkmgvnsirtthnpaakalidvcnekgvlvveevfdmwnrskngntedygkwfgqaiagdnavlggdkdetwakfdltstinrdr napsvimwslgnemmegisgsvsgfpatsaklvawtkaadstrpmtygdnkikanwnesntmgdnltanggvvgtnysdga nydkirtthpswaiygsetasainsrgiynrttggaqssdkqltsydnsavgwgavassawydvvqrdfvagtyvwtgfdylgept pwngtgsgavgswpspknsyfgivdtagfpkdtyyfyqsqwnddvhtlhilpawnenvvakgsgnπvpvvvytdaakvklyft pkgstekrllgeksftkkttaagytyqvyegsdkdstahknmyltwnvpwaegtisaeaydennrlipegstegnasvtttgkaak Ikadadrktltadgkdlsylevdvtdanghivpdaanrvtfdvkgagklvgvdngsspdhdsyqadnrkafsgkvlalvqstkeag eitvtakadglqsstvkiattavpgtstektvrsfyysrnyyvktgnkpilpsdvevrysdgtsdrqnvtwdavsddqiakagsfsva gtvagqkisvrvtmideigallnysastpvgtpavlpgsrpavlpdgtvtsanfavhwtkpadtvyntagtvkvpgtatvfgkefkvt atirvqrsqvtigssvsgnalrttqnipadkqsdtldaikdgsttvdantggganpsawtnwayskaghntaeitfeyateqqlgqiv myffrdsnavrfpdagktkiqisadgknwtdlaatetiaaqessdrvkpytydfapvgatfvkvtvtnadtttpsgvvcaglteielkt 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Claims (11)

1. Método para a produção de um produto alimentar com-preendendo galacto-oligossacarídeos, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de um substrato contendo lactose compre-endendo lactose com um polipeptídeo possuindo atividade de transga- lactosilação, em que o polipeptídeo consiste na sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:2.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato contendo lactose é um substrato à base de leite.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o substrato à base de leite é iogurte, queijo ou um produto lácteo fermentado.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri-zado pelo fato de que o produto alimentar é um produto lácteo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o produto lácteo é sorvete, leite, leite condensado, leite UHT, leite ESL, um produto lácteo fermentado ou iogurte.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o substrato à base de leite que foi tratado com o polipeptídeo representa pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, (peso/peso), do produto lácteo.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma razão de atividade de transgalactosilação acima de 100%, de preferência acima de 150%, 175% ou 200%, calculada como razão entre Abs420 com aceptor presente dividido por Abs420 sem aceitador presente nos tempos 100.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma razão de atividade de transgalactosilação: atividade de beta-galactosidase de pelo menos 1,5, ou pelo menos 2, após 30 reação de minutos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma razão de atividade de transga- lactosilação : atividade de beta-galactosidase de pelo menos 2 ou acima de uma concentração de 3% p/p de concentração inicial de lactose,

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 4 a 9, caracterizada por o produto lácteo ser um produto lácteo que não é enriquecido pela adição de galacto-oligossacarídeos pré-produzidos.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 5 a 9, caracterizado pelo fato de que o substrato à base de leite tratado com polipeptídeo não é seco antes de ser usado como ingredi-ente no produto lácteo.

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