BR112014025233B1

BR112014025233B1 - métodos para processar um produto de milho e para desconstrução de grãos de milho

Info

Publication number: BR112014025233B1
Application number: BR112014025233-5A
Authority: BR
Inventors: Michael R. Ladisch; YoungMi Kim; Richard L. Hendrickson
Original assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 2012-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2021-01-05
Also published as: US10093951B2; US20150024471A1; WO2013155431A1

Abstract

DESMONTAGEM CATALISADA POR ENZIMAS DE GRÃOS DE MILHO Grãos de milho como um todo ou partículas do mesmo são desmontadas enzimaticamente. O método pode produzir uma fração de amido sólido, uma fração de pericarpo sólido, e uma fração líquida. Um produto de sólidos de amido com pu-reza elevada pode ser proporcionado compatível para o uso como uma matéria-prima em outros processos químicos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n° 61/623,365, depositado em 12 de abril de 2012, cuja divulgação completa está incorporada aqui para referência.

ANTECEDENTES

[002] Devido a natureza intensiva de energia e capital das refinarias de pe- tróleo e das emissões de gases de efeito estufa causadas por eles, as biorrefinarias com base nas matérias-primas renováveis estão se tornando mais atrativas. Elas oferecem um potencial para a fabricação sustentável de combustíveis e químicas com emissões de carbono, energia e custo reduzido.

[003] Uma das principais metas das biorrefinarias é produzir energia a partir de matérias-primas domésticas renováveis para substituir o petróleo importado. Es- pera-se que as biorrefinarias de milho, por exemplo, usinas secas, que atualmente produzem etanol e ração animal, busquem portfólios de produtos diversificados já que os subsídios de etanol são eliminados. Incorporando uma variedade de combus- tíveis e químicas em um portfólio de produto de biorrefinaria, espera-se que seja crucial facilitar a expansão da indústria de biorrefinaria, maximizar os lucros e tornar as biorrefinarias viáveis economicamente. As biorrefinarias de milho com portfólios de produtos diversificados oferecem um grande potencial para os produtores de mi- lho e os produtores de açúcar para capturar um valor adicionado, e um retorno maior no investimento, enquanto alcança simultaneamente as metas de energia e econô- micas. Também, dependendo do tipo de produto almejado, isto pode aumentar os energéticos da biorrefinaria de milho de forma que a análise do ciclo de vida possa mostrar que estas biorrefinarias poderiam se encaixar na definição de biocombustí- veis avançados, por exemplo, proporcionando uma redução de 50 % nas emissões de gases de efeito estufa.

[004] Os açúcares tais como glicose podem ser usados como matéria-prima para a produção de hidrogênio renovável, eles também podem ser desidratados pa- ra furfurais ou ácidos levulínicos para possibilitar a produção de gasolina, jato, e die- sel hidrocarbonetos. Várias plataformas químicas importantes que podem ser produ- zias a partir de açúcares incluem furfural, hidroximetilfurfural (HMF), ácido levulínico, e Y-valerolactona, todos os quais podem adicionar um valor significante para as bior- refinarias de milho existentes através da diversificação do produto enquanto reduz o risco e aumenta o rendimento e os lucros a partir do milho.

[005] À luz dos presentes antecedentes, permanece a necessidade por mé- todos alternativos e/ou aperfeiçoados para o processamento de matéria-prima no campo da biorrefinaria.

SUMÁRIO

[006] Em certos aspectos, a presente invenção proporciona métodos para pro- cessar produtos de milho. Os produtos de milho incluem digerir enzimaticamente os grãos de milho como um todo ou essencialmente uma forma toda ou em uma forma particulada (a última aqui algumas vezes referida como “partículas de grão de milho”) em um meio de digestão para formar uma fração de amido de milho sólido, uma fração de pericarpo sólido, e uma fração líquida contendo glicose dissolvida. Os métodos po- dem também incluir separar a fração de amido de milho sólido, a fração de pericarpo sólido e a fração líquida. A etapa ou etapas de separação podem ser realizadas usando uma técnica de separação física tal como filtragem, centrifugação, filtragem por centrifu- gação, colonização, triagem, flutuação, ou qualquer outro método apropriado. As partí- culas de grãos de milho para carregar a etapa de desconstrução enzimática podem ser formada por métodos compatíveis. Este pode ser acompanhado, por exemplo, por cor- te, degerminação, craqueamento, fraturação, moagem, ou quaisquer outros meios compatíveis par formar as partículas de grão de milho. As partículas de grão de mi- lho podem ser formadas em um processo de moagem seco que pode também servir para degerminar o milho. As partículas de grão de milho podem ser formadas com um teor de umidade dos grãos de milho iniciais de menos do que cerca de 30 %. O número de partículas de grão de milho formadas pode variar de cerca de duas a vin- te partículas por grão de milho de material inicial.

[007] Em outros aspectos, a invenção proporciona uma composição enzimá- tica compatível para uma desconstrução enzimática do material de grão de milho. A composição inclui pelo menos uma pectinase, uma celulase, e uma β-glicosidase.

[008] As modalidades adicionais da invenção, assim como as características e as vantagens das mesmas, serão aparentes a partir das descrições aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[009] A figura 1 é um fluxograma em bloco de uma modalidade de um méto- do de processamento de milho.

[010] A figura 2 é um diagrama esquemático de uma modalidade da presente divulgação com um fluxo líquido para afetar uma suave agitação.

[011] A figura 3 é um diagrama esquemático de uma modalidade da presente divulgação como na figura 2 com um fluxo líquido parado para permitir uma coloni- zação da questão particulada tal como o pericarpo e o amido.

[012] A figura 4 mostra o percentual de glucano (celulose e amido) solubili- zado e a porcentagem de solubilização dos sólidos totais dos grãos de milho hidroli- sados por diferentes preparações de enzimas comerciais. 15 % p/v de grão de milho seco (capa da extremidade removida) carregando, 5 % v/v de carregamento de en- zima, pH em cerca de 5,0 de tampão de citrato, 50° C, 1 semana, 200 rpm.

[013] A figura 5 mostra a quantidade de amido liberada durante a descons- trução enzimática dos grãos de milho. O experimento foi realizado usando 30 % p/v de grão de milho com a capa da extremidade removida em uma lama aquosa, Pecti- nase 162L a 2 % v/v, Depol 793L a 0,5 % v/v, e Spezyme CP a 0,5 % v/v, pH em cerca de 5,5 tampão de citrato, 45° C, 2 semanas, 100 rpm.

[014] A figura 6 retrata a hidrólise enzimática ao longo do tempo mostrando a % de grânulos de amido recuperados e a concentração de glicose durante a des- construção enzimática dos grãos de milho rachados. O experimento foi realizado usando 25 % p/v de grãos de milho rachados em uma lama aquosa, 5 % v/v Pecti- nase 162L e 0,5 % Spezyme CP, pH em cerca de 5,5 tampão de citrato, 45° C, 72 horas, 100 rpm.

[015] A figura 7 mostra o balanço do material observado da desconstrução enzimática dos grãos de milho rachados, como descrito no Experimento abaixo. O experimento foi realizado usando 25 % p/v de grãos de milho rachados em uma la- ma aquosa, 5 % v/v Pectinase 162L e 0,5 % Spezyme CP, pH em 5,5 tampão de citrato, 45° C, 72 horas, 100 rpm.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[016] Com o propósito de promover um entendimento dos princípios da in- venção, uma referência será feita agora a certas modalidades e uma linguagem es- pecífica será usada para descrever o mesmo. Será entendido, no entanto, que ne- nhuma limitação do escopo da invenção é aqui pretendida, tais alterações e outras modificações, e tais outras aplicações dos princípios da invenção como descrito aqui sendo complementadas como ocorreria normalmente a um perito na arte à qual a invenção se refere.

[017] Como divulgado acima, certos aspectos da presente divulgação refe- rem-se ao processamento de milho. Os grãos de milho, incluindo os grãos como um todo e/ou as partículas do mesmo, são processados para alcançar uma desconstru- ção enzimática e a separação de partes do componente do grão de milho, que po- dem incluir, por exemplo, separação do amido e das frações de pericarpo, e potenci- almente também as frações de gérmen quando o gérmen está presente.

[018] Os materiais iniciais de grão de milho compatíveis para o uso em pro- cessos da presente divulgação incluem o uso dos grãos de milho de dente amarelo, embora outras variedades de grãos de milho também possam ser usadas. Os grãos como um todo como materiais iniciais podem ser processados de forma que aumen- tem a área de superfície dos grãos de milho disponíveis para enzimas. Este proces- samento pode formar partículas a partir dos grãos de milho por qualquer meio com- patível, que pode incluir, por exemplo, cortar, esmagar, rachar, fraturar ou outras técnicas que podem ser conduzidas como as operações de moagem a seco. Adicio- nalmente ou alternativamente, este processo pode atrapalhar o pericarpo dos grãos, facilitando o acesso de um meio contendo enzima e/ou outra mídia de processo para o interior dos grãos. Ilustrativamente, o pericarpo do grão (material do casco) pode ser rompido pela remoção das capas de extremidade dos grãos de milho iniciais en- quanto, no entanto, deixa os grãos como um todo ou essencialmente os grãos como um todo. Os grãos de milho formados como um todo ou as partículas de grãos de milho a serem submetidas a uma digestão enzimática podem incluir pelo menos um pericarpo anexado e um endosperma a partir dos grãos de milho. O processo para formar tais grãos de milho como um todo ou as partículas de grãos de milho para a digestão pode ser conduzido enquanto os grãos de milho do produto de milho inicial têm um teor de umidade relativamente baixo, por exemplo, menos do que 30 % de umidade por peso, e em certas modalidades na faixa de cerca de 10 % a cerca de 30 % de umidade por peso. Em uma modalidade ilustrativa, a capa da extremidade pode ser removida a partir de tais grão de milho iniciais separando (por exemplo, cortando) a capa de extremidade do pericarpo. Em outra modalidade, os grãos de milho iniciais podem ser rachados. Ainda em outra modalidade, os grãos de milho podem ser submetidos a degerminação, por exemplo, em um aparelho de degermi- nação, a fim de remover o gérmen a partir dos grãos de milho e a partir das partícu- las incluindo o pericarpo e o endosperma. Esta degerminação ou outro pré-processo para proporcionar um grão de milho particulado é desejavelmente conduzido como uma operação de moagem a seco.

[019] As partículas de grãos de milho carregadas para a digestão enzimática de acordo com esta divulgação podem ter o tamanho de partícula relativamente maior. Para estes propósitos, no processamento para partícula, os grãos de milho podem ser racionados em entre, na média, de 2 a 20 partículas de grãos de milho por grão de milho, cada um tendo um peso a partir de cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g. Mais preferencialmente, os grão de milho são fraturados em entre, na média, de 2 a 10 partículas de grãos de milho por grão de milho, cada um tendo um peso a partir de cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g. adicionalmente ou alternativamente, as partícu- las de grãos de milho podem ter uma média de dimensão de partícula máxima na faixa de cerca de 3 mm a cerca de 20 mm. Entende-se que tais processos de forma- ção de partícula também podem produzir algumas partículas finas ou outras meno- res, que podem ser separadas a partir das partículas maiores ou que também po- dem ser carregadas no processo de digestão enzimática. Em alguns aspectos, os grãos de milho iniciais podem ser degerminados antes do fracionamento em partícu- las de grãos de milho a serem digeridas enzimaticamente. Alternativamente, os grãos de milho iniciais podem ser degerminados em conjunto com o fracionamento dos grãos em partículas, e o gérmen pode opcionalmente ser separado antes de carregar o material na digestão enzimática. Será entendido pelos peritos no campo pertinente que a degerminação dos grãos de milho, e a separação do gérmen, po- dem, no entanto, deixar alguns resíduos de gérmen misturados com ou anexados ao grão de milho particulado a ser carregado no processamento enzimático. Em aspec- tos preferidos onde o gérmen é separado de outras partículas de grão a serem sub- metidos a um processamento enzimático, o grau de degerminação será de pelo me- nos cerca de 90 % (isto é, pelo menos cerca de 90 % do gérmen em grãos de milho originais terão sido separados, e assim não mais do que cerca de 10 % do gérmen nos grãos originais serão incluídos nas partículas de grão carregadas a uma diges- tão enzimática). Entretanto, os graus mais elevados e mais baixos de degerminação podem ser usados em outros aspectos da presente invenção.

[020] Como divulgado acima, os processos aqui envolvem uma digestão en- zimática ou uma desmontagem dos materiais de grãos de milho. As enzimas compa- tíveis nos processos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a celu- lase, β-glicosidases, xilanases, β-xilosidases, pectinases, α-amilases, α- arabinofuranosideases, esterases de ácido ferúlico, e estearases de P-coumaril. Uma ou mais enzimas podem ser usadas em qualquer quantidade e qualquer pro- porção compatível para os processos da presente invenção. Por exemplo, as formu- lações comerciais de enzimas podem ser usadas nas modalidades da presente in- venção. As formulações comerciais compatíveis de enzinas para o uso em proces- sos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a Spezime CP, Depol 740L, Depol 692L, Depol 793L, Pectinase 162L, e/ou Pectinase 656L. em uma mo- dalidade, uma ou mais misturas comerciais de enzimas são empregadas para digerir enzimaticamente os grãos de milho ou as partículas de grão de milho. Em um mo- numento, a concentração de pelo menos uma enzima é de pelo menos cerca de 0,5 % v/v. em uma modalidade, uma ou mais enzimas estão presentes e a concentração de entre cerca de 0,2 v/v a cerca de 10 % v/v. em outra modalidade, uma mistura de três soluções enzimática comercialmente disponíveis foram usadas nos processos da presente invenção. Por exemplo, em um exemplo ilustrativo, a Pectinase 162L esteve presente a 2 % (v/v) em um tampão de citrato aquoso em cerca de pH a 5,5 por 2 semanas a 45° C agitando a 100 rpm. As técnicas de triagem conhecidas po- dem ser usadas para determinar a atividade das enzimas candidatas para o uso na digestão enzimática. Por exemplo, com referência a figura 4, mostra-se um gráfico em barras da porcentagem de solubilização do glucano e outros sólidos usando dife- rentes enzimas que foram triadas para um uso potencial nos processos aqui. Será entendido que triagens similares podem ser usadas em conjunto com outras enzi- mas candidatas.

[021] A digestão enzimática pode ser conduzida efetivamente para separar os componentes endosperma (amido) e o pericarpo (casca) dos grãos de milho ou das partículas de grão de milho submetidas a digestão, para formar um amido sólido separado e frações de pericarpo. Durante a digestão enzimática, em algumas moda- lidades, pelo menos uma parte do amido nos grãos ou mas partículas de grãos é hidrolisado para formar a glicose, que pode ser solubilizada no meio de digestão. Assim, se o gérmen a partir dos grãos de milho de material inicial, ou pelo menos uma parte de tal gérmen, está presente na digestão enzimática, a digestão pode efe- tivamente separar o gérmen como um sólido (que pode flutuar no meio de digestão) e/ou como um óleo que é suspenso ou solubilizado no meio de digestão.

[022] Os meios de digestão usados nas modalidades da presente invenção serão tipicamente meios aquosos. Tais meios aquosos podem ser tamponados para um pH desejado ou um pH na faixa da qual as enzimas estão ativas. Por exemplo, o pH do meio de digestão pode ser na faixa de cerca de 5 a cerca de 8, mais tipica- mente na faixa de cerca de 5 a cerca de 7. Em algumas modalidades, um tampão de citrato ou outro tampão pode ser usado para tamponar o meio de digestão a um pH de cerca de 5,5.

[023] O milho para a proporção de água em um meio de digestão aquoso pode ser qualquer proporção compatível par ao uso na digestão enzimática. Em certas for- mas, o milho (grão ou partículas de grão) para proporção de água é de cerca de 1 % p/v a cerca de 30 % p/v (isto é, o peso de milho dividido pelo peso da água com a qual este é combinado equivale a cerca de 0,01 a 0,3), mais preferencialmente cerca de 5 % p/v a cerca de 30 % p/v, e ainda mais preferencialmente cerca de 15 % p/v a cerca de 30 % p/v. Em uma modalidade mais específica, a proporção de milho para água no meio de digestão pode ser de cerca de 25 % p/v a cerca de 30 % p/v.

[024] O meio de digestão enzimática pode ser contatado com os grãos de milho ou com as partículas de grão de milho por qualquer quantidade de tempo compatível para alcançar a digestão desejada ou a desmontagem. Em certos aspec- tos, este tempo de contato pode ser de cerca de uma hora a cerca de duas sema- nas, ou de cerca de uma hora a cerca de dois dias, ou de cerca de uma hora a cerca de um dia. O tempo de contato selecionado pode ser dependente do número de ou- tros fatores incluindo, por exemplo, a temperatura da digestão, a concentração e/ou a atividade da enzima(s) usada, e a extensão da desmontagem dos grãos ou das partículas de grãos desejadas antes de outro processamento. Também, a seleção destas outras condições pode ser dependente uma da outra, e do tempo de contato desejado para a digestão enzimática.

[025] Em relação as temperaturas durante a digestão enzimática, qualquer temperatura apropriada na qual a enzima(s) está ativa pode ser usda. Em algumas modalidades, a temperatura do meio de digestão enzimática durante a digestão está na faixa de cerca de 10° C a cerca de 65° C, ou cerca de 20° C a cerca de 65° C, ou cerca de 30° C a cerca de 65° C. em um aspecto preferido específico, a temperatura do meio de digestão enzimática durante a digestão está na faixa de cerca de 40° C a cerca de 60° C.

[026] A figura 5 proporciona um gráfico em barras resultante de uma execu- ção experimental de uma digestão enzimática ilustrativa sob condições selecionadas de enzimas, temperatura, e tempo de contato. Em particular, é mostrada a porcenta- gem de amido liberada durante o tempo na execução. Nesta execução, os grãos de milho com suas capas de extremidade removidas foram incubados em um meio de digestão aquoso em uma concentração de 30 % p/v. O meio de digestão foi tampo- nado a cerca de pH 5,5 com um tampão de citrato, e contido de 2 % v/v Pectinase 162L, 0,5% Depol 793L, e 0,5% Spezyme CP. O meio foi permitido reagir a 45° C por duas semanas com 100 revoluções por minuto de um misturador mecânico. Após 24 horas apenas uma pequena fração do amido tinha sido liberada. Após 288 horas quase todo o amido dos grãos de milho tinha sido liberado.

[027] A digestão enzimática pode ser conduzia em qualquer reservatório de rea- ção compatível. Os reservatórios compatíveis incluem, mas não estão limitados a reser- vatórios tanques, canos ou reatores tubulares, reatores de tanque agitados continuamen- te, reatores de fluxo tampão, reatores semi-batelada, ou outros reservatórios compatíveis. Durante a digestão enzimática, em um modo de operação, o meio de digestão contendo o material de milho não é agitado. Em outros modos, durante a digestão, o meio de diges- tão contendo o material de milho pode ser agitado. Quaisquer meios compatíveis de agi- tação podem ser empregados. Preferencialmente, entretanto, qualquer agitação usda está em um nível baixo insuficiente para alcançar a desmontagem dos grãos de milho ou das partículas de grão de milho por conta própria, mas suficiente para facilitar o contato da enzima(s) no meio com o material de milho. Fazendo isto, a agitação também pode agitar ou de outra maneira mover os grãos de milho ou as partículas de grão de milho dentro do meio de digestão. Em um reservatório de reação no qual a separação do amido sólido e das frações de pericarpo sólidos (e também potencialmente o gérmen sólido se presente) é alcançado sob condições de sedimentação de gravidade, esta agitação tam- bém pode facilitar a liberação dos materiais sólidos desmontados de sua mistura com um com o outro de forma que o amido sólido possa colonizar para ou em direção ao fundo do reservatório e o pericarpo sólido (e também potencialmente o gérmen sólido) pode flutuar para o topo do reservatório. A agitação, quando usada, pode ser alcançada, por exemplo, com um misturador mecânico tal como uma lâmina de dispersão, um misturador estático, ou um misturador de lamina rotatória. Tal misturador mecânico pode ser alimentado por energia elétrica, hidráulica, pneumática, ou outros meios compatíveis. Em outras modali- dades, o meio de digestão pode ser agitado durante a digestão enzimática por um fluxo de entrada e/ou um fluxo de saída de líquido do meio de digestão, incluindo, por exemplo, fluir o líquido através de uma volta de circulação. Tal volta de circulação pode incluir uma ou mais aberturas no reservatório a partir do qual o líquido circulado é forçado suficiente- mente para agitar o meio de digestão, inclusive das maneiras discutidas acima. Em as- pectos desejados, uma ou mais aberturas nos reservatórios estão a ou próximas ao fun- do do reservatório de reação e o líquido circulado é forçado para cima através dos sólidos no meio de digestão.

[028] A digestão enzimática pode ser conduzida de forma que resulte em um meio digerido contendo uma fração de amido de milho sólido (por exemplo, na forma de grânulos de amido liberados a partir dos grãos ou das partículas de grão), uma fração de pericarpo sólido (fração fibrosa), e uma fração líquida contendo a glicose dissolvida. O líquido do meio de digestão, preferencialmente o líquido aquoso, pode ser de volume suficiente para proporcionar um material estratificado no reservatório de reação no qual uma fração enriquecida com amido de milho sólido está no fundo, uma fração enriquecida com pericarpo sólido reside acima da fração enriquecida de amido de milho sólido, e uma fração líquida com a glicose dissolvida reside acima da fração enriquecida de pericarpo sólido. Quando a agitação é empregada, sob condi- ções apropriadas, tal material estratificado pode formar mesmo enquanto a agitação é aplicada; ou, tal material estratificado pode formar a cessação da agitação. O uso de grãos ou de partículas de grão relativamente maiores, por exemplo, tendo tama- nho como especificado acima, facilita uma separação eficiente do amido de milho sólido e do pericarpo sólido. Os fragmentos de pericarpo sólidos (material de fibra) resultante da digestão enzimática também são maiores e assim são mais rapida- mente separados no meio de digestão líquido a partir do amido, mesmo com ne- nhum ou um baixo nível de agitação como discutido acima. Os fragmentos de peri- carpo sólidos desejáveis têm uma média máxima de dimensão de seção transversa que é maior do que aquela dos grânulos de amido sólido ou outras partículas de amido sólido ou formadas pela digestão enzimática. Quando o gérmen está presente no material de milho carregado para a digestão, o gérmen sólido tipicamente flutuará para o topo do meio de digestão e permanecerá ali até que complete a digestão, a menos que removido antes. Assim, outros fragmentos de grão tais como os fragmen- tos de pericarpo que tem um gérmen anexado podem flutuar para o topo do meio de digestão e permanecer ali até que complete a digestão, a menos que removido antes.

[029] Em certos aspectos, ao completar a digestão enzimática, o produto de amido sólido liberado durante a digestão pode constituir pelo menos cerca de 20 % por peso do amido total original nos grãos de milho ou nas partículas de grão de mi- lho carregadas para a digestão enzimática, por exemplo, em certos modos a partir de cerca de 20 % a cerca de 70 %. Será entendido que estas quantidades são de- pendentes dos materiais iniciais usados e das condições da digestão enzimática, e podem variar destas faixas em outras modalidades. Também, será entendido que em certos modos de operação, o amido sólido liberado pode ser coletado a partir do reservatório de reação, por exemplo, periodicamente, quando é formado, enquanto em outros modos de operação o amido sólido liberado será permitido coletar nos reservatórios do começo ao fim da digestão, para a coleta após completar a digestão.

[030] Ao completar a digestão enzimática, o produto de pericarpo sólido libe- rado durante a digestão pode constituir pelo menos cerca de 20 % por peso do peri- carpo total original nos grãos de milho ou nas partículas de grãos de milho carrega- das para digestão, e em certos aspectos na faixa de cerca de 20 % a 99 % ou es- sencialmente 100 % do teor de pericarpo total original do grão de milho ou das partí- culas de grão de milho carregadas para a digestão enzimática. Em certos modos de operação, o pericarpo liberado pode ser coletado a partir do reservatório de reação, por exemplo, periodicamente, quando é formado, enquanto em outros modos de operação o pericarpo liberado será permitido para coleta no reservatório do início ao fim da digestão, para a coleta após completa a digestão.

[031] Em alguns modos operativos, a digestão enzimática também resultará na formação de uma fração de gérmen de milho sólido. Será entendido que quando um material de milho degerminado é carregado na digestão enzimática, este pode ser apenas uma fração muito menor, enquanto que quando um material de milho não degerminado é carregado para a digestão enzimática, este pode ser uma fração mais significante. Também, as condições de digestão enzimática podem resultar na conversão de algumas ou de todas de algumas frações de gérmen presentes no óleo que podem ser solubilizadas e/ou suspensas no meio de digestão.

[032] Como divulgado acima, a digestão enzimática também pode resultar na presença de glicose dissolvida na solução aquosa resultante de hidrólise de uma parte do componente de amido dos grãos de milho ou das partículas de grão. A este respeito, a glicose no meio de digestão pode incluir a glicose resultante de hidrólise de até cerca de 80 % por peso do teor de amido original total no grão de milho ou nas partículas do grão de milho submetidas a uma digestão enzimática, e em certos aspectos a hidrólise de cerca de 30 % a cerca de 70 % por peso de tal teor de amido original total. Em características alternativas ou adicionais, a concentração de glico- se dissolvida do meio digerido enzimaticamente pode variar de cerca de 1 g/L a cer- ca de 140 g/L.

[033] As frações formadas durante a digestão enzimática podem ser separa- das a partir uma da outra por quaisquer meios compatíveis e em qualquer ordem compatível ou combinação. Por exemplo, em algumas variantes inventivas, uma fra- ção de amido de milho sólido, uma fração de pericarpo, e uma fração líquida con- tendo a glicose dissolvida são separados a partir um do outro. As separações aqui podem ser alcançadas, por exemplo, usando uma colonização de gravidade ou se- dimentação, centrifugação, flutuação, filtragem ou filtragem por centrifugação, ou combinações dos mesmos. A separação pode resultar em uma fração de pericarpo sólido isolado, uma fração líquida isolada contendo glicose dissolvida, e uma fração de amido sólido isolado. Em um modo de operação, um primeiro, produto pericarpo sólido é primeiro separado de um segundo produto incluindo a fração de amido sóli- do e a fração líquida contendo a glicose dissolvida. O segundo produto, em algumas formas, pode ser processado (por exemplo, por centrifugação ou de outra maneira) para separar a fração de amido sólido e a fração líquida contendo a glicose dissolvi- da, que pode ser recuperada separadamente como frações isoladas. Em outras for- mas, o segundo produto pode ser submetido a digestão (por exemplo, com uma en- zima compatível coo identificado aqui) para hidrolisar o amido sólido para uma glico- se adicional, e a solução de glicose resultante pode ser usada em uma outra fermen- tação ou processos de síntese química, incluindo qualquer um daqueles descritos aqui para os produtos de glicose. Estas e outras variações na separação como um todo e o uso de frações a partir da desconstrução enzimática dos materiais de grão de milho serão aparentes a partir das descrições aqui.

[034] Cada uma das frações isoladas pode ser ainda processada. Por exem- plo, a fração de amido sólido pode ser ainda purificada por lavagem (por exemplo, com água ou outro líquido de lavagem) ou outros meios. A fração de amido sólido também pode ser seca antes e/ou depois de qualquer outra purificação da fração por quaisquer meios, incluindo, por exemplo, secagem por ar ou secagem por aqueci- mento. Nos processos preferidos, uma fração de amido sólido isolado é formada que é constituída de pelo menos 80 % por peso de amido, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 85 %, e ainda mais preferencialmente de pelo menos cerca de 90 %. Similarmente, a fração de pericarpo sólido isolada também pode ser ainda purificada por qualquer meio compatível, por exemplo, por lavagem.

[035] Em um aspecto da presente divulgação, a fração de amido sólido iso- lado pode ser enzimaticamente ou de outra maneira convertido para glicose. Qual- quer método para a conversão de amido para glicose pode ser usado. Os métodos compatíveis incluem, mas não estão limitados a métodos de hidrólise ácida ou enzi- mática. Ilustrativamente, uma enzima de amilase pode ser usada para converter a fração de amido isolado em glicose. A glicose produzida a partir de amido pode ser utilizada nos processos abaixo incluindo, mas não estão limitados a fermentação (por exemplo, para a conversão em álcoois tais como etanol), assim como a conver- são em outros químicos tais como, mas não estão limitados a ácido levulínico, hidro- xila metilfurfural, furfural, e Y-valerolactona. Estas conversões podem ser realizadas reagindo a glicose na presença de catalisadores tais como catalisadores ácidos, ca- talisadores básicos, catalisadores sólidos, catalisadores de metal tais como os cata- lisadores de metal de transição incluindo, mas não estão limitados a catalisadores de metal sólido tais como platina, paládio, cobre, catalisadores suportados sólidos, zeo- litos, catalisadores heterogêneos, e catalisadores homogêneos. Esta reação pode formar um produto químico outro que não a glicose.

[036] Similarmente, a glicose dissolvida no líquido do meio de digestão tam- bém pode ser usada nos processos abaixo. Tais processos abaixo incluem, mas não estão limitados a fermentação, por exemplo, para etanol, assim como a conversão em outras químicas tais como, mas não estão limitados a ácido levulínico, hidroxila metilfurfural, furfural, e Y-valerolactona. Estas transformações podem ser realizadas por catalisadores tais como aqueles identificados aqui acima.

[037] Uma fração de pericarpo sólido isolado também pode ser usada nos processos abaixo ou nos produtos. Por exemplo, a fibra da fração de pericarpo sóli- do pode ser usada como uma matéria-prima ou para a produção de tais produtos finais como a goma de fibra de milho e o óleo de fibra de milho.

[038] Em processos nos quais a digestão enzimática rende uma fração de gérmen de milho sólida, quaisquer meios compatíveis para a separação da fração de gérmen de milho a partir de outras frações tais como a fração de amido de milho só- lido, a fração de pericarpo sólido, e/ou um líquido contendo glicose pode ser empre- gado. Estes incluem, por exemplo, colonização, a centrifugação, a flutuação, ou uma filtragem por centrifugação.

[039] Como discutido acima, certos modos de operação da digestão enzimá- tica podem envolver agitação dos teores de reservatórios durante a digestão através circulação de quantidades de líquido do meio de digestão através de uma volta de circulação de uma maneira que agite os sólidos do meio. A figura 2 proporciona um diagrama de um sistema para conduzir um tal processo exemplar. Um reservatório de reação é proporcionado e é preenchido parcialmente com um meio de digestão. Uma volta de circulação és estabelecida incluindo uma triagem ou filtragem para o fluxo de saída de líquido do reservatório (para reter os sólidos de milho no reservató- rio), uma bomba, um trocador de calor, e uma abertura para o fluxo de entrada no fundo do reservatório de reação. A bomba circula o líquido através da volta de circu- lação, e o trocador de calor aquece o líquido na volta para uma temperatura deseja- da, por exemplo, 50° C. como mostrado, o sistema também pode incluir uma fonte de meio líquido contendo enzima(s), e uma bomba para a medição do meio líquido contendo enzima(s) na volta de circulação, por exemplo, no início da digestão enzi- mática e/ou periodicamente ou continuamente durante a digestão enzimática. Será entendido que uma ou mais válvulas podem ser proporcionadas, como desejado, para possibilitar uma interrupção seletiva do fluxo dentro da volta de circulação e/ou a partir da fonte de solução contendo enzima(s) na volta de circulação. A figura 3 mostra o sistema da figura 2 onde o fluxo dentro da volta de circulação foi parado e uma fração de amido de milho sólido, uma fração de pericarpo sólido, e uma fração de líquido contendo glicose dissolvida são formados. Estas frações podem então ser separadas e potencialmente purificadas como discutido aqui.

DIVULGAÇÃO DE CERTAS MODALIDADES EXEMPLARES E USOS DO PRODUTO

[040] Com referência a um aspecto ilustrativo particular, uma nova aborda- gem para a desmontagem, em vez da destruição dos grãos de milho em seus com- ponentes (amido, pericarpo e gérmen) por uma catálise por enzima em temperaturas de 50° C a 60°C (figura 1) é apresentado. As enzimas são formuladas para separar o pericarpo do endosperma enquanto deixa o gérmen flutuar na solução de reação no final do processo. O processo envolve nenhuma moagem mecânica e nenhuma ma- ceração química dos grãos de milho antes da desconstrução enzimática e pode ser facilmente adaptado a um processo de moagem a seco convencional. O fraciona- mento do pericarpo e do gérmen, seguido pela lavagem gerará um fluxo de amido que é subsequentemente hidrolisado para glicose por amilase.

[041] Em outro aspecto das modalidades exemplares divulgadas no momen- to, capturar a glicose concentrada e outros açúcares a partir do milho para o propósi- to de sintetizar os blocos de construção química é divulgada. As químicas intermedi- árias e os polímeros derivados deles são avaliados em mais de $2 trilhões, e podem proporcionar uma fonte química que seja ambos renovável e derivada de colheitas cultivadas nos Estados Unidos, por exemplo, incluindo, mas não limitado ao milho. Enquanto o valor do mercado é maior, a quantidade total de milho que seria consu- mido pela produção de químicas quando comparado ao etanol seria menor e teria pouco impacto na produção de alimento. A fim de alcançar a conversão química, os açúcares substancialmente puros e altamente concentrados são necessários, e os açúcares devem ter um baixo custo a fim de maximizar as margens que são deriva- dos adicionando o valor através de caminhos sintéticos químicos.

[042] As atuais modalidades exemplares divulgadas descrevem um novo processo e contém uma lista não limitante de modalidades incluindo a desconstru- ção direta por enzima dos grãos de milho de forma que um amido sólido precipite os resultados. Os grãos de milho contêm aproximadamente 72 % de amido, cerca de 5- 6 % de hemicelulose, 2,4 % de celulose e açúcares solúveis, lipídios, proteínas e cinzas. Nas modalidades exemplares divulgadas no momento, um método para o fracionamento dos grãos de milho em gérmen intacto, amido, açúcar, e frações de pericarpo é divulgado. O método envolve remover a capa da extremidade, colocar os grãos de milho secos a 12 % de umidade em uma lama com 30 % peso/volume em água, e então adicionar uma mistura de enzimas: uma pectinase, por exemplo, pec- tinase 162 L, uma celulase, por exemplo, Spezyme CP, e uma β-glicosidase, por exemplo, Novozyme 188. O pH natural no qual a mistura é tamponada é cerca de 5,5. A incubação da mistura a 45° C por 2 semanas, sob uma agitação leve, resulta em um fracionamento claro do amido do gérmen e do pericarpo. A separação fácil é então alcançada e o gérmen flutua, e o amido vai para o fundo do reservatório, e o pericarpo também flutua. Relativo as práticas atuais, as entradas mecânicas são mí- nimas e tem uma baixa energia. O pericarpo, sendo intacto, pode ser então ainda processado para etanol celulósico, por exemplo, usando outra tecnologia conhecida por um perito na arte.

[043] A aplicação desta tecnologia poderia ser principalmente na indústria de moagem seca de milho, que está produzindo milho atualmente do etanol. Como as instalações de celulose vem em linha, e o subsídio de milho é reduzido, a quantida- de de etanol que pode ser derivado do milho, de uma maneira econômica, possivel- mente diminuirá nos próximos 5 anos. Neste contexto, tendo um valor adicionado aos produtos derivados do milho nestas instalações seria, na verdade, aumentar as margens e aperfeiçoar o mercado do milho, e ao mesmo tempo, proporcionando um fluxo de receita maior, não aumentaria significantemente, e possivelmente diminuiria, o milho sendo desviado do uso na alimentação e em ração para a produção química e etanol. Os materiais que são obtidos são diretamente compatíveis para a produção nos blocos de construção química para polímeros. Pelo menos uma modalidade da divulgação do momento está relacionada a combinação de condições usando um sistema estático que não requer que o milho seja moído ou reduzido o tamanho. Em outra modalidade, a agitação suave é usada periodicamente ou continuamente. Mantendo a estrutura natural do grão de milho, e usando as enzimas e o processa- mento aquoso em temperaturas de 45° C, o grão pode ser fracionado em componen- tes de valor adicionado, adicionando ali margem para os produtos que poderiam ser derivados do grão de milho.

EXPERIMENTOS

[044] Com o propósito de promover um outro entendimento dos aspectos da presente divulgação e das características e vantagens da mesma, os seguintes Ex- perimentos específicos são proporcionados. Será entendido que este Experimento é ilustrativo, e não limitante, na natureza.

EXEMPLO 1 DIGESTÃO ENZIMÁTICA DOS GRÃOS DE MILHO MATERIAIS E MÉTODOS

[045] Grãos de milho de dente amarelo (12 % de umidade) são usados. As enzimas comerciais Depol 692L, Depol 740L, Depol 793L, Pectinase 162L, Pecti- nase 656L foram compradas da Biocatalysts Ltd (Wales, UK). Spezyme CP foi pro- porcionada pela Dupont (anteriormente Genencor). Todas as outras químicas foram compradas da Sigma-Aldrich.

[046] Medição de Atividade por Enzima. As atividades de celulase e celobi- ase foram medidas por procedimentos da International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Todas as outras atividades enzimáticas foram medidas seguindo os procedimentos abaixo.

[047] Endoglucanase (CMCase): Uma unidade de atividade CMCase é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de glicose por minuto. 1) 200μl de enzima + 1,8ml de 1 % CMC 2) Incubar por 30 min a 50 °C 3) Parar a reação fervendo a 95 °C por 5min 4) A glicose liberada durante a reação foi medida por HPLC.

[048] Xilanase: Uma unidade de atividade xylanase é definida como a quantidade de enzima que produz 1 μmol de xilose por min. 1) Adicionar 100 μl de enzima + 400μl de 1 % (p/p) OSX 2) Incubar por 10 min a 50 °C 3) Parar a reação adicionando 2ml DNS e ferver por 5 min 4) Ler ABS a 540 nm.

[049] B-xilosidase: A hidrólise do substrato pNP é determinada pela liberação de p-nitrofenol e a densidade ótica foi medida a 410 nm. Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de liberação de enzima 1 μmol de p-nitrofenol por min. 1) 100 μl de enzima + 400μl de 10 mM nitrofenil xilopiranosídeo 2) Incubar por 15 min a 50 °C 3) 1 ml de carbonato de sódio gelado 1M foi adicionado para parar a reação 4) Medição de absorbância a 410nm.

[050] Pectinase (poligalacturonase): A atividade da poligalacturonase foi medida determinando a quantidade de ácido galacturônico liberado do ácido poligalacturônico. Uma unidade é definida co- mo a quantidade de liberação de enzima 1 μmol de glicose equivalente por min. 1) 100μl enzima + 100μl de 1% PGA (ácido poligalacturônico) 2) Incubar por 10 min a 50 °C 3) Adicionar 400 μl DNS e ferver os tubos por 5 min 4) Medição de absorbância a 540nm A curva padrão foi determinada usando ácido galacturônico (Sigma).

[051] α-amilase: Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de glicose por min. 1) 400 μl tampão + 1ml de amido solúvel (0,5%, p/p) + 600 μl de enzima dilu- ída 2) Incubar por 30 min a 50 °C 3) Para a reação fervendo por 5 min 4) Medir a glicose concentrada por HPLC

[052] α-arabinofuranosidase: A hidrólise do substrato pNP é determinada pela liberação de p-nitrofenol e a densidade ótica foi medida a 410 nm. Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de liberação de enzima 1 μmol de p-nitrofenol por min. 1) 100 μl de enzima + 400μl de 10 mM p-NP-a-L-arabinofuranosídeo (Sigma) 2) Incubar por 15 min a 50 °C 3) 1 ml de carbonato de sódio gelado 1M foi adicionado para parar a reação 4) Medição de absorbância a 410nm.

[053] Estearase de ácido ferúlico: A atividade FAE foi determinada medindo o ácido ferulico liberado a partir do ferulato de metil (Alfa Aesar). Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido ferulico por min. 1) Adicionar 760μl de tampão ao tubo. 2) Adicionar 20μl de 100mM MeFe (Metil-Felulato) caldo preparado em 50% (v/v) DMSO. 3) Adicionar 20μl de enzima diluída 4) Incubar por 30 min e então adicionar 50μl de 20% ácido fórmico para pa- rar a reação. 5) A concentração de ácido ferulico liberada a partir de MeFe foi medida por HPLC.

[054] Estearase de p-coumaril: O procedimento é o mesmo daquele com FAE. 1) Adicionar 760μl de tampão ao tubo dfe microcentrífuga. 2) Adicionar 20μl de 100mM de caldo de coumarato de metil preparado em 50% (v/v) DMSO. 3) Adicionar 20μl de enzima diluída 4) Incubar por 30 min e então adicionar 50μl de 20% ácido fórmico para pa- rar a reação. 5) A concentração de ácido coumarico liberada a partir do coumarato de me- til (Frinton Laboratories) foi medida por HPLC.

[055] Preparação dos grãos. Os grãos de milho, por exemplo, amarelo #2 dente de milho, tendo um teor de umidade entre cerca de 10 % e cerca de 20 % de umidade foram tanto retirados a capa da extremidade por um escalpelo de laboratório quanto rachados em metades usando um degerminador antes de todos os tratamentos enzimá- ticos. A moagem do degerminador lembrava um degerminador tamanho Beall 00 e é descrito em Kirleis, A. W., e Stroshine, R. L. 1990. Os efeitos de dureza e temperatura do ar de secagem na susceptibilidade à quebra e nas características de moagem a se- co do milho de dente amarelo. Cereal Chem. 67:523-528. Isto foi feito para expor a su- perfície interna às enzimas para agir ali facilitando o processo de desconstrução enzi- mática. O degerminador foi configurado para minimizar a moagem excessiva dos grãos. Em outra modalidade, os grãos de milho são fraturados mecanicamente em partículas tendo uma massa de cerca de 0,02 a cerca de 0,4 g. em uma modalidade, o particio- namento dos grãos de milho desta maneira deu de cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g. em outra modalidade, o fraturamento mecanicamente dos grãos de milho deu de cerca de dois a cerca de dez partículas por grão de milho.

[056] Triagem da enzima. Os grãos de milho com a capa de extremidade re- movida foram misturados em cerca de um tampão de citrato de sódio no pH 5,0 a uma lama com 15% p/v com um volume líquido inicial ficado em 10 mL. As enzimas foram adicionadas a 5 % wt de grão de milho secos. A hidrólise foi realizada em um incubador de agitação a 200 rpm, 50° C, por 1 semana. Todas as hidrólises execu- tadas continham 1 g/L de azido de sódio para prevenir a contaminação microbiana.

[057] Desconstrução enzimática. Os grãos de milho tanto com a capa de ex- tremidade removida quanto rachados por um degerminador foram misturados em cerca de um tampão de citrato de sódio no pH 5,5 em uma lama de 25-30 % p/v. duas formu- lações diferentes de enzimas foram usadas para a hidrólise. Em uma modalidade, a digestão enzimática foi afetada por uma mistura de enzimas que consistiam de Pecti- nase 162L a 2% v/v, Depol 793L a 0,5% v/v, e Spezyme CP a 0,5% v/v e hidrolisada por 24 horas ou 2 semanas. A segunda formulação, usada para obter um balanço de massa completo dos grãos fracionados, incluíam 5 % v/v Pectinase 162L e 0,5% v/v Spezyme CP. A hidrólise executada foi realizada em cerca de um tampão de citrato de sódio no pH 5,5 a 45° C, com uma agitação contínua a 100 rpm. As condições de agita- ção compatíveis incluem agitação contínua, assim como agitação periódica da solução de enzima aquosa. As amostras do curso de tempo foram coletadas em 3 horas, 6 ho- ras, 24 horas, e 72 horas enquanto os experimentos de balanço de massa foram deixa- dos imperturbáveis pelo tempo inteiro de 72 horas de hidrólise.

[058] Em outra modalidade, as enzimas compatíveis para o uso na presente invenção também incluem, mas não estão limitadas a celulases, β-glicosidases, xila- nases, α-arbinofuranosidases, β-xilosidases, α-galactosidases, esterases de feruloil, e estearases de P-coumaroil.

[059] Em outra modalidade, a solução de enzima aquosa é reusada ou reci- clada após a coleção do produto de amido sólido.

[060] Fracionamento. O procedimento de separação para os componentes fracionados do grão de milho rachado hidrolisado para a determinação de balanço de massa é descrito abaixo. A primeira etapa envolve remover a fração de pericarpo da fração superior, gérmen, capa de extremidade, e resíduos de fibra anexada ao gérmen que estavam flutuando na superfície ou apenas abaixo com pinças e uma espátula. Em seguida a lama líquida intermediária remanescente foi passada através de uma tela de 20 fios para coletar a fração de fibra enquanto a maioria do amido e do glúten atravessou com o líquido. A fibra foi pressionada contra a tela para remo- ver o máximo de líquido possível. O líquido foi distribuído em 6 x 50 ml tubos de cen- trífuga e centrifugados a 7000 rpm por 15 minutos. Seguido da centrifugação o líqui- do claro foi reservado e o volume coletado registrado. No fundo dos tubos de centrí- fuga a fração de milho de amido branco poderia ser vista como uma fração inferior. No topo do líquido centrifugado um resíduo amarelo escuro foi separado, que foi re- movido através de uma espátula e colocado em um filtro de papel Whatman #1. O amido foi lavado com um total de 600 ml de água quente DI, 6 x 50 ml tubos de cen- trífuga lavados duas vezes com 50 ml de água quente DI. A água de lavagem foi decantada e o amido foi colocado em um bote para peso e então dentro de um forno a 45 °C. O trabalho então continuou na fração de fibra coletada na tela com 20 fios já que este foi removido e colocado em 2 x 250 ml de Nalgene em garrafas de polipro- pileno de boca mais amplas. A água quente DI foi adicionada, 200 ml, e as garrafas foram sacudidas para desalojar qualquer amido remanescente e partículas de glú- ten. A lama foi então derramada através da tela com 20 fios e o filtrado foi coletado para a recuperação do glúten e do amido residual. Esta etapa de procedimento foi repetida duas vezes e o filtrado foi dividido em até 6 x 50 ml tubos de centrífuga e girado para baixo a 7000 rpm por 15 minutos para obter um amido de milho sólido. O amido foi ressuspenso usando uma pequena quantidade de água DI. O amido foi lavado com água quente DI como na etapa anterior e o milho recuperado é foi adici- onado para aquela ainda no bote de pelo secando a 45 °C.

[061] Em outras modalidades, a separação da fração de pericarpo de milho sólido superior, a fração líquida intermediária, a fração de amido de milho sólido infe- rior é realizada pela filtragem de gravidade. Ainda em outras modalidades, a separa- ção é realizada por uma filtragem por centrífuga. Ainda em outras modalidades, a separação é realizada por centrifugação, colonização e flutuação.

[062] Análise composicional. Cada fração foi testada quando apropriado para monossacarídeos, oligossacarídeos, amido, óleo, e proteína usando os seguintes procedimentos. Uma fração líquida foi analisada para monossacarídeos usando uma cromatografia de coluna analítica BioRad HPX87-H conectada a um sistema Waters e2695 Alliance HPLC. O teor de oligossacarídeo foi medido através de um procedi- mento de hidrólise ácida NREL’s LAP-14. As amostras hidrolisadas foram analisadas na coluna HPLC e o Sistema mencionado acima.

[063] O teor de óleo foi determinado extraindo as amostras com hexano. Pa- ra as amostras líquidas, 25 ml de amostra líquida foi extraída com 2 x 25 ml volumes de n-Hexano usando um funil separatório. Para as amostras sólidas, o teor de óleo foi medido extraindo um grama de amostra seca em rede com 40 fios de sólidos tri- turados com 2 x 7 ml porções de hexano em um tubo de centrífuga de 15 ml. A fase orgânica foi decantada em um bote de peso e permitida evaporar na capa deixando o extrato atrás para ser medido pela diferença.

[064] A proteína no líquido foi medida usando o Pierce BCA Protein Assay Kit, produto #23225, obtido pela Thermo Scientific. A proteína nas amostras sólidas foi me- dida por uma análise de nitrogênio Micro-Kjeldahl para obter o teor de proteína.

[065] O amido foi medido no líquido usando um Megazyme Total Starch As- say Procedure kit, K-TSTA, que segue o método AOAC 996.1 e o método AACC 76.13 com aperfeiçoamentos.

RESULTADOS:

[066] O milho é composto de quatro componentes principais, endosperma (83% db de grãos), gérmen (11%), revestimento de farelo (5,3%) e uma capa de ex- tremidade (0,8%). A composição típica dos grãos de milho de dente amarelo é dada na Tabela 1. O endosperma é aproximadamente 88% de amido incorporado em uma matriz de proteína (8%) e fibra (2%). O revestimento de farelo e a capa de extremi- dade são 80-87% de fibra (celulose, hemicelulose) (www. Bungenorthamerica.com). O revestimento de farelo é composto de pericarpo e uma camada de revestimento de semente. Interfaceando o endosperma e o revestimento de farelo está a camada de célula aleurona. O pericarpo e as camadas aleurona contém fibra (3-4%), fitoeste- róis e ésteres de gordura Singh, V., Moreau, R. A. e Cooke, P. H. 2001. Efeito das práticas de moagem do milho nas células de camada aleurona e seus únicos fitoes- teróis. Cereal Chem. 78:436-441. O arabinoxilano no revestimento de farelo e na camada aleurona é principalmente composto de uma estrutura de xilano que é alta- mente substituída e ligada em cruz pelo ferulato e o diferulato. A hidrólise eficiente do arabinoxilano no revestimento de farelo e na camada de aleurona requer ação de uma mistura complexa de atividades enzimáticas.

[067] Tabela 1. Composição dos grãos de milho adaptados a partir de Gulati M. Kohlmann K., Ladisch. M.R. Hespell R, Bothast R. J. (1996) Avaliação de opções de produção de etanol para os produtos de milho. Bioresource Technol 58(3):253-264.

[068] Para atacar efetivamente e expor o endosperma para a liberar os grâ- nulos de amido dos grãos, as enzimas degradando o pericarpo e a camada aleurona são necessários, que incluem celulase, xilanase, estearase de feruroil, arabinofura- nosidase e proteases. As hidrólises de celulase na endosperma e pericarpo, torna a cadeia de celulose menor nos oligomeros menores e na glicose. Xilanase, estearase de feruroil e p-coumaroil, e arabinofuranosidase hidrolisa os heteroxilanos na cama- da aleurona e no pericarpo do milho. A protease ajuda no processo hidrolisando a proteína matriz no endosperma do milho.

[069] Os trabalhos anteriores têm mostrado que a hidrólise de fibras de grãos de destiladores secos usando 15 FPU de Spezyme CP plus 40 IU Novozyme 188 por g de glucano resultou em 90% de rendimento de glicose dentro de 24 horas. Kim, Y., R. Hendrickson, N.S. Mosier, M. R. Ladisch, B. Bals, V. Balan, B.E. Dale, “Enzyme Hydrolysis and Ethanol Fermentation of Liquid Hot Water and AFEX Pre- treated Distillers’ Grains at High-Solids Loadings,” Bioresource Technology J., 99(12), 5206-5215 (2008). O trabalho mostrou que a fração de pericarpo (fibra) dos grãos de milho é prontamente hidrolisável pela ação da celulose. A adição de hemi- celulase, xilanase, pectinase ou uma mistura destas enzimas ainda facilitará o pro- cesso de descasque.

[070] A tabela 2 dá as atividades medidas de várias enzimas comerciais que medimos. A Spezyme CP contém principalmente atividades de celulase e xilanase. As preparações de Depol 692L, 793L e pectinase são principalmente de atividades de pectinase com uma atividade arabinofuranosidase, estearase de feruloil, e estea- rase de p-coumaroil significante requerida para a quebra do arabinoxilano no peri- carpo do milho. Depol 740L é uma preparação de estearase de feruloil comercial com atividades paralelas mínimas. Estas preparações de enzimas forma escolhidas devido a seu amplo espectro de atividades enzimáticas e suas faixas de pH e tempe- ratura ótimas comuns. Para triar uma formulação de enzima que dê a maior solubili- zação do endosperma do grão de milho, a execução da hidrólise foi conduzida em cerca de um tampão de citrato de sódio no 5,5 em cerca de 45 °C. Após 1 semana de hidrólise a lama foi decantada e o líquido foi analisado pra as concentrações e açúcar (total de glicose solubilizada e glicooligômeros a partir do amido e da celulo- se) e os sólidos remanescentes foram secos em um forno em cerca de 145°C duran- te a noite para determinar o percentual de solubilização. Os experimentos foram de- signados para triar rapidamente as enzimas que contém atividades enzimáticas ba- lanceadas para desconstruir os grãos em seus componentes de composição em vez de obter um fracionamento completo dos grãos. Os resultados da execução de hi- drólise de triagem de enzima são apresentados na figura 4.

[071] Spezyme CP que é principalmente celulase e xilanase sem atividades significantes que podem ser ramos hidrolizados e grupos substituídos de arabinoxi- lano apenas liberou 15% do glucano total e solubilizou 15% da massa seca inicial. No final de 1 semana de hidrólise os grãos com Spezyme CP pareciam ainda intac- tos sem uma desintegração visual significante. Depol 740L que carece de atividades de hidrólise de celulose e xilano, mas com a maior quantidade de atividade de estea- rato de feruloil entre as enzimas testadas resultou em menos do que 10% de gluca- no e a solubilização dos sólidos totais. Um esvaziamento significante visualmente dos grãos foi observado com Depol 692L ou 793L, resultando em 20-25% do amido e celulose inicial sendo liberado a partir dos grãos na solução. A maior desintegra- ção enzimática foi observada com a adição tanto de Pectinase 162L quanto 656L. estas duas enzimas, quando comparadas com outras preparações, continham mais atividades enzimáticas balanceadas para hidrólise de arabinoxilano do pericarpo e da camada aleurona. Também estas enzimas continham atividade amilase que po- deria ter ajudado na solubilização do endosperma dos grãos. Visualmente, ambas pectinase 162L e 656L resultaram cerca de 40-45% de endosperma sendo solubili- zado enquanto deixava o revestimento de farelo intacto. Entretanto, os gérmens fica- ram intactos apenas com pectinase 656L enquanto que todas as outras enzimas so- lubilizaram o gérmen em óleos e ácidos graxos. Embora não medíssemos as ativi- dades lipase, parece que estas preparações de enzima exceto para pectinase 656L contêm também atividades enzimáticas hidrolisadas por gérmen. EXEMPLO 2 BALANÇO DE MATERIAL

[072] Os grãos de milho rachados a 25% wt/vol de lama foram hidrolisados por 72 hrs usando 5% v/v Pectinase 162L e 0,5% Spezyme CP por 72 hrs para obter um balanço de massa completo dos componentes fracionados. O fluxograma do processo como um todo e do balanço do material é dado na figura 7 e resumido nas tabelas 3 e 4. A este respeito, será entendido que as modalidades adicionais aqui, o balanço da massa dos componentes de fração identificados na figura 7 ou nas tabe- las 3 e/ou 4, ou nas discussões abaixo, podem variar a partir dos números particula- res estabelecidos, e ainda pelo menos alguma quantidade de cada um dos componen- tes identificados para cada uma das frações será incluso nas frações respectivas.

[073] Como mostrado, a desconstrução enzimática dos grãos de milho resul- tou em cinco diferentes frações: gérmens e capa de extremidade, pericarpo e alguns amidos residuais, sólidos amarelos que foram recuperados como uma camada de topo após a centrifugação da fração líquida da lama, amido e glicose e glicooligôme- ros na fase líquida. A fração de gérmen e de capa de extremidade foi principalmente fibra a partir da capa de extremidade e do pericarpo anexado ao gérmen assim como o óleo extraível por hexano. A recuperação do óleo na fração de gérmen e capa de extremidade foi apenas mais ou menos de 10% dos lipídios de entrada, sugerindo que a maioria do gérmen é solubilizado em óleos e lipídios que são recuperáveis na fase líquida. O balanço de massa da proteína e do óleo não foi devido a limitação dos procedimentos analíticos aplicados a este estudo. A camada amarela contida após a centrifugação da fração líquida do hidrolisado foi principalmente extrativo de hexano, glucano, e outros componentes. Outra análise está sendo realizada para identificar os componentes no fluxo de lama líquido.

[074] Aproximadamente 30% por peso de um amido inicial foi recuperado como um amido granular após 72 hr. O amido remanescente (60% por peso do inici- al) foi hidrolisado para glicose e glicooligômeros devido a atividades de amilase e glico-amilase encontradas na preparação das enzimas. Aproximadamente todas as fibras iniciais (pericarpo) foram recuperadas. As composições de pericarpo do milho (não processadas) e o pericarpo recuperado a partir da desconstrução enzimática são dados por comparação na tabela 4. Como mostrado na tabela 4, o pericarpo recuperado a partir do processamento enzimático foi similar ao pericarpo inicial. A fração de amido sólido fracionado foi >90% de amido puro como medido pelo ensaio de amido. O tempo de curso da porcentagem de amido recuperado como grânulos de amido e concentração de glicose é dado na figura 6. A recuperação máxima do amido foi alcançada após 24 hr de hidrólise e continuando a hidrólise hidrolisou o amido liberado em glicose. Tanto quanto 55% de grânulos de amido foram recupe- rados. Parece, para maximizar a recuperação dos grânulos de amido, o tempo de hidrólise deve ser reduzido. Entretanto, isto resultaria em mais amido sendo ainda anexado ao pericarpo e reduz a pureza do pericarpo recuperado.

[075] TABELA 3. Sumário do balanço do material de grãos de milho racha- dos antes e depois da desconstrução enzimática.

[076] TABELA 4. Composição do pericarpo de milho antes e depois da des- const rução enzimática.

[077] O uso dos termos "um" e "uma" e "o" “a” “os” “as” e referencias similares no contexto de descrição da invenção, especialmente no contexto das seguintes reivin- dicações, são para serem construídos para cobrir ambos os singulares e os plurais e o plural, a menos que do contrário indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. As recitações de faixas de valores aqui pretendem meramente server como um método de abreviação de referência individualmente a cada valor separado abrangendo a faixa, a menos que do contrário indicado aqui, e cada valor separado é incorporado na espe- cificação como se fosse recitado individualmente aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem compatível a menos que de outra maneira indicado aqui ou de outra maneira claramente contradito pelo contexto. O uso de qual- quer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") proporcio- nado aqui, pretende meramente iluminar melhor a invenção e não colocar uma limitação no escopo da invenção a menos que do contrário reivindicado. Nenhuma linguagem na especificação deve ser construída como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[078] Enquanto a invenção tem sido ilustrada e descrita em detalhes nos de- senhos e na descrição acima mencionada, o mesmo é pra ser considerado como ilustrativo e não restritivo em caráter, sendo entendido que apenas a modalidade preferida tem sido mostrada e descrita e que todas as mudanças e modificações que caibam dentro do espírito da invenção são desejados para serem protegidos. Além disso, todas as referências citadas aqui são indicativas do nível de habilidade na arte e são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims

1. Método para processar um produto de milho, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: digerir enzimaticamente grãos de milho inteiros ou partículas de grãos de mi- lho em um meio de digestão líquido compreendendo enzimas incluindo uma pro- tease e uma celulase, para desta forma separar componentes dos grãos de milho inteiros ou partículas de grãos de milho pela ação do meio de digestão e formar, por ação do meio de digestão, uma fração de amido de milho sólida incluindo grânulos de amido de milho liberados, uma fração de pericarpo sólida, e uma fração líquida contendo glicose dissolvida; e separar a fração de amido de milho sólida da fração de pericarpo sólida e da fração líquida de forma que proporcione uma fração de amido de milho sólida sepa- rada.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende digerir enzimaticamente partículas de grãos de milho, e em que a média por peso de partícula das partículas de grãos de milho é cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende: fraturar mecanicamente grãos de milho tendo um teor de umidade de 30% ou menos para formar as partículas de grãos de milho.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a fraturação mecânica fratura cada grão de milho para formar, em média, duas a vinte partículas de grãos de milho tendo um peso por partícula na faixa de cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a fração de amido de milho sólida separada constitui pelo menos cerca de 20 % do teor de amido de milho total das partículas de grãos de milho.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fração de amido de milho sólida separada é constituída pelo menos por cerca de 80% em peso de amido de milho em uma base de peso seco.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática hidrolisa uma parte do teor de amido de milho total das partículas de grãos de milho para formar glicose.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática solubiliza uma parte de um teor total de gérmen das partículas de grãos de milho na fração líquida.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática também forma uma fração de gérmen de milho sólida, e em que a dita separação da fração de amido de milho sólida também com- preende separar a fração de gérmen sólida da fração de amido de milho sólida.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende tratar a fração de amido de milho sólida separada para formar glicose.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende reagir quimicamente a glicose na presença de um cata- lisador para formar um produto de reação diferente de glicose.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende agitar periodicamente ou continuamente o meio de di- gestão durante a etapa de digestão enzimática.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática é conduzida em um reservatório, e em que a agitação compreende circular líquido da composição líquida aquosa através de uma volta de circulação, a volta de circulação incluindo uma ou mais aberturas no reser- vatório a partir do qual o líquido circulado é forçado suficientemente para agitar os sólidos do meio de digestão.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática é conduzida sob condições em que um meio digerido é formado tendo a fração de amido de milho sólida como uma fração inferi- or, a fração de pericarpo de milho sólida acima da fração de amido de milho sólida, e a fração líquida acima da fração de pericarpo de milho sólida.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende fermentar um meio contendo glicose a partir da fração líquida contendo glicose dissolvida.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática inclui digerir enzimaticamente com uma pec- tinase, a celulase, e uma β-glicosidase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática inclui digerir enzimaticamente com uma en- zima que hidrolisa gérmen de milho.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de grãos de milho ou de partículas de grãos de milho para líquido no meio de digestão é de cerca de 1% a cerca de 30% p/v.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita etapa de digestão enzimática compreende digerir enzimaticamente partículas de grãos de milho degerminadas.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende formar as partículas de grão de milho degerminadas por um processo incluindo a degerminação de um material inicial de grão de milho para fornecer um material de grão de milho degerminado, e fraturar o material de grão de milho degerminado para formar as partículas de grão de milho degermina- das.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática compreende digerir enzimaticamente partícu- las de grão de milho, o método também compreende: fraturar mecanicamente grãos de milho tendo um teor de umidade de 30% ou menos para formar partículas de grão de milho.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a média por peso de partícula das partículas de grão de milho é cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de fraturação mecânica fratura cada grão de milho para formar, em média, duas a vinte partículas de grão de milho tendo um peso por partícula na faixa de cerca de 0,02 g a cerca de 0,4 g.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de digestão enzimática também forma uma fração de gérmen de mi- lho sólida, hidrolisa uma porção de um teor de amido total das partículas de grão de milho para formar glicose, e solubiliza uma porção de um teor de gérmen total das partículas de grão de milho na fração líquida.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende tratar a fração de amido de milho sólida para formar glicose.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende reagir quimicamente a glicose na presença de um cata- lisador para formar um produto de reação diferente de glicose.

27. Método para desconstrução de grãos de milho, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma desconstrução por enzima de grãos de milho em um meio aquoso con- tendo enzimas, a desconstrução ocorre por ação do meio aquoso contendo enzimas nos grãos de milho, de modo a formar, por ação do meio aquoso contendo enzimas nos grãos de milho, um precipitado de amido sólido incluindo grânulos de amido de milho liberados.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a desconstrução por enzima resulta em frações intactas de pericarpo, açúcar, amido e gérmen.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que enzimas para a desconstrução enzimática compreendem uma pectinase, uma celulase, e uma β-glicosidase.

30. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: desconstruir enzimaticamente grãos milho no precipitado de amido, pericar- po, e gérmen.

31. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que enzimas da desconstrução enzimática são formuladas para separar pericarpo de endosperma enquanto deixa gérmen flutuando em uma solução de reação ao fim do processo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende fracionar o pericarpo e gérmen do precipitado de amido e lavar o precipitado de amido para gerar um fluxo de amido.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende hidrolisar o dito fluxo de amido em glicose por uma amilase.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que os grãos de milho são grãos de milho com suas capas da extremidade remo- vidas, ou partículas de grão de milho.