BR112014024291B1 - Método para a produção de forma recombinante de um polímero de heparosan com alto peso molecular, uso do referido polímero para aumento de tecido, polinucleotídeo isolado e composição de material biológico compreendendo o referido polímero - Google Patents

Abstract

POLÍMEROS DE HEPAROSAN COM ALTO PESO MOLECULAR E MÉTODOS DE PRODUÇÃO E DE USO DOS MESMOS. São descritos polímeros de heparosan com alto peso molecular, assim como são os métodos de produção e de utilização dos polímeros de heparosan com alto peso molecular.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS/INCORPORAÇÃO POR DECLARAÇÃO DE REFERÊNCIA

[001]Este pedido de patente reivindica benefício sob 35 USC 119(e) do pedido de patente US provisório No. de Série 61/617.952, depositado em 30 de março de 2012. O conteúdo total do pedido de patente referido acima é incorporado expressamente aqui como referência.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL

[002]N/A

FUNDAMENTO 1 .Campo do(s) Conceito(s) da Invenção

[003]O(s) conceito(s) da invenção divulgado(s) e reivindicado(s) aqui refere(m)-se à metodologia para a produção e aos usos de composições de glicosaminoglicana e mais particularmente, às composições que compreendem um polímero de heparosan isolado de alto peso molecular, bem como aos métodos de produção e usos das mesmas.

2 .Descrição da Arte Relacionada

[004]Os materiais biológicos (livremente definidos como compostos ou construções que são utilizadas para aumentar ou para substituir componentes de tecidos ou partes do corpo naturais) são e continuarão a ser componentes integrais de abordagens de engenharia de tecidos e de medicina regenerativa. Procedimentos complexos que incluem transplantes e terapias com células tronco prometem melhorar a saúde humana, mas suprimentos limitados de órgãos/tecidos de doadores e os diagramas do aprendizado pronunciadas (bem como debates éticos) para abordagens pioneiras são obstáculos. Há uma demanda crescente por mais aplicações de rotina de materiais biológicos, tal como na cirurgia reconstrutiva, nos cosméticos e nos dispositivos médicos. Portanto, há uma necessidade na arte de materiais biológicos novos e aprimorados que possam ser utilizados, por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, para aplicações de preenchimento dérmico e para revestimentos de superfície para dispositivos implantados.

[005]Hialuronana (HA), ácido poli-L-láctico (poli[lactida]), hidroxiapatita de cálcio e produtos à base de colágeno dominam o mercado atual para materiais biológicos utilizados na cirurgia reconstrutiva e procedimentos cosméticos. Entretanto, estes produtos possuem um número de propriedades indesejáveis para as quais os fabricantes e os profissionais de cuidado da saúde estão buscando melhorias. Estas desvantagens incluem, mas não estão limitadas a, tempo de vida limitado, potencial para imunogenicidade e/ou alergenicidade e aparência não natural em procedimentos estéticos. Para melhorar a compatibilidade biológica e a durabilidade de um dispositivo implantado, HA, heparina, albumina do soro bovino, carbono pirolítico ou revestimentos lipídicos são empregados para melhorar a compatibilidade biológica de stents, cateteres e outros dispositivos de materiais implantados. Entretanto, estes produtos frequentemente causam obstrução, entupimento ou formação de coágulo sanguíneo devido à reatividade com o corpo humano. Portanto, há uma necessidade na arte de composições de materiais biológicos novas e aprimoradas que superam as desvantagens e os defeitos da arte anterior.

[006]Há várias aplicações médicas da HA. Por exemplo, a HA tem sido amplamente utilizada como uma substituição viscoelástica para o humor vítreo do olho na cirurgia oftálmica durante o implante de lentes intraoculares em pacientes com cataratas. A injeção de HA diretamente dentro das articulações também é utilizada para aliviar a dor associada à artrite. Géis e filmes quimicamente reticulados também são utilizados para prevenir adesões deletérias após cirurgia abdominal. Outros pesquisadores que utilizam outros métodos demonstraram que os revestimentos de HA adsorvidos também melhoram a compatibilidade biológica de dispositivos médicos tais como cateteres e sensores através da redução da obstrução e da abrasão de tecidos.

[007]O(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s) superam as desvantagens e os defeitos da arte anterior. O(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s) é(são) baseado(s) em um material biológico que compreende heparosan, o precursor biossintético natural da heparina e do sulfato de heparana. Esta composição possui várias características que fornecem melhorias e vantagens em relação aos produtos existentes. Embora a heparosan seja muito similar à HA e à heparina, a molécula possui maior estabilidade dentro do corpo uma vez que não é a forma final natural deste açúcar e, portanto, o corpo não possui enzimas de degradação ou proteínas de ligação que levam à perda de funcionalidade. Esta propriedade também reduz bioobstrução, infiltração, formação de cicatrizes e/ou coagulação. A heparosan é também mais hidrofílica que revestimentos sintéticos tais como plásticos ou carbono. Finalmente, aparte da HA bacteriana, a maioria dos outros materiais biológicos para preenchimento atuais é tipicamente derivada de animais, o que causa preocupação em relação a efeitos colaterais tais como reações alérgicas ou estímulo da granulação e tais efeitos colaterais não serão uma preocupação com a heparosan. Ainda, os polímeros de heparosan que ocorrem naturalmente principais são conhecidos por possuírem certas faixas de tamanho de peso molecular, dependendo da origem do biopolímero de heparosan tal como as vias de biossíntese utilizadas, incluindo os tipos de catalisadores, os hospedeiros e os aparatos de suporte. Como é conhecido na arte, a distribuição de tamanho do biopolímero de heparosan afeta suas propriedades físicas, tais como viscosidade, entrelaçamento de cadeias e solubilidade. No(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s), foi desenvolvido um meio de produzir polímeros de heparosan com peso molecular (PM) extremamente alto que possuem maior viscosidade e podem ser utilizados em concentrações menores (com ou sem reticulação química) que as preparações de heparosan que ocorrem naturalmente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[008]A Figura 1A contém um alinhamento de duas sequências otimizadas para o gene de E. coli (SEQ ID NOS:9 e 10) com o gene da heparosan sintase nativo de Pasteurella multocida (SEQ ID NO:1).

[009]A Figura 1B contém um alinhamento das duas sequências otimizadas para o gene de E. coli (SEQ ID NOS:9 e 10).

[0010]A Figura 1C contém um alinhamento de uma sequência otimizada para o gene de Bacillus (SEQ ID NO:11) com o gene da heparosan sintase nativo de Pasteurella multocida (SEQ ID NO:1).

[0011]A Figura 2 representa uma análise em gel que demonstra a produção de polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto em E. coli K5 com o gene PmHS1 recombinante produzido por plasmídeo de P. multocida Tipo D.

[0012]A Figura 3 representa uma análise em gel que demonstra a produção de polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto em E. coli BL21(DE3) com o gene PmHS1 recombinante produzido por plasmídeo ou um plasmídeo de expressão que produz uma proteína de fusão PmHS1 com a proteína de ligação à maltose (MBP).

[0013]A Figura 4 representa uma análise em gel que demonstra a produção de polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto em E. coli BL21Express Iq transformada com o plasmídeo de expressão que produz a proteína de fusão PmHS1 com a proteína de ligação à maltose (MBP).

[0014]A Figura 5 representa uma análise em gel que demonstra a produção de polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto em E. coli K5- (em que os genes kfiA, kfiB e kfiC foram deletados) com o gene PmHS1 recombinante produzido por plasmídeo ou o plasmídeo de expressão que produz a proteína de fusão PmHS1 com a proteína de ligação à maltose (MBP).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0015]Antes de explicar pelo menos uma modalidade do(s) conceito(s) da invenção em detalhes com a finalidade de exemplos de desenhos, experimentos, resultados e procedimentos de laboratório, deve ser entendido que o(s) conceito(s) da invenção não está(ão) limitado(s) em sua aplicação aos detalhes de construção e da disposição dos componentes apresentados na descrição a seguir ou ilustrados nos desenhos, nos experimento e/ou nos resultados. O(s) conceito(s) da invenção é(são) capaz(es) de outras modalidades ou de ser(em) praticado(s) ou realizado(s) de várias maneiras. Dessa forma, é pretendido que a linguagem utilizada aqui forneça o âmbito e o significado mais amplos possíveis; e é entendido que as modalidades são exemplos - não exaustivas. Ainda, deve ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregadas aqui têm a finalidade de descrição e não devem ser consideradas como limitantes.

[0016]A não ser que seja definido de outra maneira aqui, os termos científicos e técnicos utilizados em associação ao(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção devem ter os significados que são comumente entendidos pelos peritos comuns na arte. Ainda, a não ser que seja exigido de outro modo pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em associação a e técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular e química de proteínas e oligo- ou polinucleotídeos e hibridização descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na arte. As técnicas padronizadas são utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizadas na arte ou como são descritas aqui. As técnicas e os procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na arte e como são descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo de todo o presente relatório descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook e outros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Coligan e outros. Current Protocols in Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994)), que são incorporadas aqui como referência. As nomenclaturas utilizadas em associação a e os procedimentos de laboratório e as técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente utilizados na arte. Técnicas padronizadas são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e fornecimento e tratamento de pacientes.

[0017]Todas as patentes, os pedidos de patentes publicados e as publicações que não são patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de perícia dos peritos na arte à qual este(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção pertence(m). Todas as patentes, os pedidos de patentes publicados e as publicações que não são patentes referidos em qualquer parte deste pedido de patente são expressamente incorporados aqui como referência em sua totalidade até a mesma extensão como se cada patente ou publicação individual estivesse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada como referência.

[0018]Todas as composições e/ou os métodos divulgados e reivindicados aqui podem ser produzidos e realizados sem experimentos desnecessários à luz da presente divulgação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, será evidente para os peritos na arte que variações podem ser aplicadas às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se afastar do conceito, do espírito e do âmbito da invenção. Todos os tais substitutos e modificações similares evidentes aos peritos na arte são considerados como estando dentro do espírito, do âmbito e do conceito do(s) conceito(s) da invenção que são definidos pelas reivindicações em anexo.

[0019]Como são utilizados de acordo com a presente divulgação, os termos a seguir, a não ser que sejam indicados de outra maneira, devem ser entendidos como possuindo os significados a seguir:

[0020]O uso da palavra “um” ou “uma” quando utilizada em associação com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou no relatório descritivo pode significar “um(a)”, mas também é coerente com o significado de “um(a) ou mais”, “pelo menos um(a)” e “um(a) ou mais de um(a)”. O uso do termo “ou” nas reivindicações é utilizado para significar “e/ou” a não ser que seja explicitamente indicado o contrário para se referir a alternativas apenas ou às alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação sustente uma definição que se refere apenas às alternativas e “e/ou”. Ao longo de todo este pedido de patente, o termo “aproximadamente” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para o dispositivo, o método que será empregado para determinar o valor ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo. O uso do termo “pelo menos um” será entendido como incluindo um bem como qualquer quantidade maior que um, incluindo, mas não limitado a, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 etc. O termo “pelo menos um” pode se estender até 100 ou 1000 ou mais, dependendo do termo ao qual está ligado; em adição, as quantidades de 100/1000 não devem ser consideradas limitantes, uma vez que limites mais altos também podem produzir resultados satisfatórios. Em adição, o uso do termo “pelo menos um de X, Y e Z” será entendido como incluindo X apenas, Y apenas e Z apenas, bem como qualquer combinação de X, Y e Z.

[0021]Ao longo de todo o relatório descritivo e as reivindicações, a não ser que o contexto exija o contrário, os termos “substancialmente” e “aproximadamente” serão entendidos como não sendo limitados aos termos específicos qualificados por estes adjetivos/advérbios, mas serão entendidos como indicando que um valor inclui a variação de erro inerente para o dispositivo, o método que é empregado para determinar o valor e/ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo. Assim, os ditos termos possibilitam variações e/ou desvios menos significativos que não resultam em um impacto significativo aqui. Por exemplo, em certos casos o termo “aproximadamente” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para o dispositivo, o método que é empregado para determinar o valor e/ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo. Similarmente, o termo “substancialmente” também pode se referir a 80% ou mais, tal como 85% ou mais ou 90% ou mais ou 95% ou mais ou 99% ou mais e similares.

[0022]Como são utilizadas neste relatório descritivo e na(s) reivindicação(ões), as palavras “compreendendo” (e qualquer forma de compreendendo, tal como “compreendem” e “compreende”), “possuindo” (e qualquer forma de possuindo, tal como “possuem” e “possui”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, tal como “inclui” e “incluem”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo, tal como “contém” e “contêm”) são inclusivas ou ilimitadas e não excluem elementos ou etapas de método não citadas adicionais.

[0023]O termo “ou combinações dos mesmos” como utilizado aqui se refere a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, é pretendido que “A, B, C ou combinações dos mesmos” inclua pelo menos um de: A, B, C, AB, AC, BC ou ABC e se a ordem for importante em um contexto particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com este exemplo, são expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais item ou termo, tal como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB e outros. O perito na arte entenderá que tipicamente não há limite sobre o número de items ou termos em qualquer combinação, a não ser que seja de outra maneira evidente partindo do contexto.

[0024]O termo “que ocorre naturalmente” como utilizado aqui como é aplicado a um objeto refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou de polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada partindo de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo ser humano no laboratório ou que de outra maneira ocorre naturalmente. Similarmente, um polímero de açúcar ou um polissacarídeo com características estruturais intrínsecas (tais como, mas não limitadas a, composição, distribuição do peso molecular (PM) etc.) encontrado em organismos nativos (isto é, não modificado pela mão do ser humano) é denominado como “ocorrendo naturalmente”.

[0025]O termo “paciente” como utilizado aqui inclui indivíduos humanos e veterinários. “Mamífero” para as finalidades de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo o ser humano, animais domésticos e de fazenda, primatas não humanos e qualquer outro animal que possui tecido mamário.

[0026]Os termos “administração” e “administrando”, como utilizados aqui serão entendidos como incluindo todas as rotas de administração conhecidas na arte, incluindo, mas não limitadas a, rotas orais, tópicas, transdermais, parenterais, subcutâneas, intranasais, mucosais, intramusculares, intraperitoneais, intravitreais e intravenosas, incluindo aplicações tanto locais quanto sistêmicas. Em adição, as composições do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção (e/ou os métodos de administração das mesmas) podem ser planejadas para fornecer liberação retardada, controlada ou prolongada utilizando técnicas de formulação que são bem conhecidas na arte.

[0027]O termo “aumento dérmico” no contexto do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção refere-se a qualquer alteração do estado natural da pele de um mamífero e áreas relacionadas devida a ações externas. As áreas que podem ser alteradas através do aumento dérmico incluem, mas não estão limitadas a, epiderme, derme, camada subcutânea, gordura, grupo eretor do pelo, hair shaft, poro sudorífero e glândula sebácea.

[0028]Como utilizado aqui, o termo “heparosan” será entendido como se referindo ao precursor biossintético natural de heparina e sulfato de heparina. O polímero de açúcar heparosan é uma molécula de heparina não epimerizada não sulfatada e também pode ser referido como “N-acetil heparosan”.

[0029]O termo “tecido” como utilizado aqui será entendido como se referindo a um agrupamento de células dentro de um organismo que são similarmente caracterizadas por sua estrutura e função.

[0030]O termo “material biológico” como utilizado aqui será entendido como se referindo a qualquer material que não é fármaco que pode ser utilizado para tratar, melhorar, proteger ou substituir qualquer tecido, órgão ou função em um organismo. O termo “material biológico” refere-se ainda ao material derivado biologicamente que é utilizado por suas propriedades estruturais ao contrário de pelas biológicas, por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, para o uso de colágeno, a proteína encontrada nos tecidos ósseos e conjuntivos, como um ingrediente cosmético ou para o uso de carboidratos modificados com processos biotecnológicos como lubrificantes para aplicações biomédicas ou como agentes de volume na fabricação de alimentos. Um “material biológico” é qualquer material, natural ou produzido pelo ser humano, que compreende toda ou parte de uma estrutura viva ou um dispositivo biomédico que realiza, aumenta, protege ou substitui uma função natural e que é compatível com o corpo.

[0031]Como utilizado aqui, quando o termo “isolado” for utilizado em referência a uma molécula, o termo significa que a molécula foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um organismo vivo não é “isolado”, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado.” Ainda, as moléculas de DNA recombinantes contidas em um vetor são consideradas isoladas para as finalidades do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção. As moléculas de RNA isoladas incluem produtos da replicação de RNA in vivo ou in vitro de moléculas de DNA e de RNA. As moléculas de ácido nucleico isoladas incluem ainda moléculas produzidas de forma sintética. Adicionalmente, moléculas de vetor contidas em células hospedeiras recombinantes também são isoladas. De forma global, isto também se aplica aos carboidratos em geral. Assim, nem todas as moléculas “isoladas” precisam ser “purificadas”.

[0032]Como utilizado aqui, quando o termo “purificado” for utilizado em referência a uma molécula, este significa que a concentração da molécula que será purificada foi aumentada em relação às moléculas associadas com a mesma em seu ambiente natural. As moléculas associadas naturalmente incluem proteínas, ácidos nucleicos, lipídeos e açúcares, mas geralmente não incluem água, tampões e reagentes adicionados para manter a integridade ou facilitar a purificação da molécula que será purificada.

[0033]Como utilizado aqui, o termo “substancialmente purificado” refere-se a um composto que é removido de seu ambiente natural e é pelo menos 60% livre, preferencialmente 75% livre e mais preferencialmente 90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado.

[0034]Como utilizado aqui, “substancialmente puro” significa que uma espécie de objetivo é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar esta é mais abundante que qualquer outra espécie individual na composição) e preferencialmente uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie de objetivo compreende pelo menos aproximadamente 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de aproximadamente 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, tal como mais de aproximadamente 85%, 90%, 95% e 99%. Em uma modalidade, a espécie de objetivo é purificada até a homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição através de métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente de uma única espécie macromolecular.

[0035]Como utilizado aqui, o termo “substrato” será entendido como se referindo a qualquer superfície do qual um revestimento pode ser colocado. Os exemplos de substratos que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem, mas não estão limitados a, sílica, silício, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais e combinações dos mesmos. Quando o substrato for um metal, o metal pode incluir, mas não está limitado a, ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

[0036]Os termos “gel” e “semissólido” são utilizados de forma intercambiável aqui e serão entendidos como incluindo um sistema coloidal, com a semelhança de um sólido, em que um sólido é disperso em um líquido; o composto pode ter um yield stress (limite de escoamento) finito. O termo “gel” refere-se ainda a um material similar à geleia formado através da coagulação de um líquido coloidal. Muitos géis possuem uma matriz fibrosa e interstícios preenchidos com fluido: géis são viscoelásticos ao invés de simplesmente viscosos e podem resistir a algum estresse mecânico sem deformação. Quando pressão for aplicada aos géis ou semissólidos, estes se adaptam ao formato no qual a pressão é aplicada.

[0037]O termo “hidrogel” é utilizado aqui para descrever uma rede de cadeias poliméricas que são insolúveis em água, algumas vezes encontrada na forma de um gel coloidal em que a água é o meio de dispersão. Os hidrogéis são polímeros naturais ou sintéticos muito absorventes e podem conter mais de 99% de água. Os hidrogéis também possuem um grau de flexibilidade muito similar ao do tecido natural, devido ao seu conteúdo significativo de água. Em adição, os peptídeos e/ou as substâncias biologicamente ativas maiores podem estar confinadas em hidrogéis, formando assim uma composição de liberação prolongada.

[0038]Como utilizado aqui, o termo “quantidade eficiente” refere-se a uma quantidade de uma composição de material biológico ou um conjugado ou um derivado da mesma suficiente para exibir um efeito terapêutico ou profilático detectável sem efeitos colaterais adversos desnecessários (tais como toxicidade, irritação e resposta alérgica) proporcionais a uma relação de benefício/risco razoável quando utilizado da maneira do(s) conceito(s) da invenção. A quantidade eficiente para um indivíduo dependerá do tipo de indivíduo, do tamanho e da saúde do indivíduo, da natureza e da gravidade do estado de saúde que será tratado, do método de administração, da duração do tratamento, da natureza da terapia concorrente (se alguma), das formulações específicas empregadas e similares. Assim, não é possível especificar uma quantidade eficiente exata de forma antecipada. Entretanto, a quantidade eficiente para certa situação pode ser determinada por um perito comum na arte utilizando experimento de rotina com base na informação fornecida aqui.

[0039]Como utilizado aqui, o termo “segmento de ácido nucleico” e “segmento de DNA” são utilizados de forma intercambiável e referem-se a uma molécula de DNA que foi isolada livre do DNA genômico total de uma espécie particular. Portanto, um DNA ou um segmento de ácido nucleico “purificado” como utilizado aqui, se refere a um segmento de DNA que contém uma sequência que codifica Heparosan Sintase (HS) e ainda é isolado de ou purificado livre de DNA genômico não relacionado, por exemplo, Pasteurella multocida total. Estão incluídos dentro do termo “segmento de DNA”, segmentos de DNA e fragmentos menores de tais segmentos e também vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fago, vírus e similares.

[0040]O termo “expressão” como utilizado aqui pode incluir qualquer etapa envolvida na produção de heparosan sintases, incluindo, mas não limitada a, transcrição e tradução.

[0041]Os termos “otimizado para o gene” e “otimização gênica” como são utilizados aqui se referem a alterações na sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína para aquelas preferencialmente utilizadas em uma célula hospedeira particular de forma que a proteína codificada seja mais eficientemente expressa na célula hospedeira quando comparada com a sequência de nucleotídeos nativa. A otimização gênica envolve vários aspectos de aprimoramento do uso de códons e da estrutura do RNA mensageiro para melhorar a produção de proteína. É bem sabido na arte que genes provenientes de um organismo, a fonte, nem sempre têm bom desempenho em um organismo receptor. Por exemplo, alguns aminoácidos (AAs) são codificados por vários tRNAs (o código degenerado) e cada organismo possui códon(s) preferido(s) que é(são) utilizado(s) mais frequentemente. Se um códon raro for utilizado em um gene, então o ribossomo tem que parar e esperar para que o tRNA raro seja encontrado antes da tradução da proteína poder se mover para o aminoácido seguinte que deve ser adicionado; se a parada ocorrer durante muito tempo, então o ribossomo pode cair e a proteína não é produzida. Similarmente, se o mRNA tiver uma estrutura secundária que interfere no movimento do ribossomo e assim na tradução, então o ribossomo pode cair do RNA mensageiro, resultando novamente em menos produção de proteína. Através do estudo da sequência de DNA de proteínas naturalmente altamente produzidas no organismo hospedeiro ou receptor desejado, certos códons para AAs são observados. Portanto, o gene de origem pode ser convertido em um produtor mais altamente funcional se os códons raros forem removidos e os códons mais utilizados (em relação ao receptor) são utilizados. A sequência de proteína é a mesma, mas a sequência de DNA pode diferir devido ao código de tRNA degenerado. Uma vez que há muitos aspectos para o processo de tradução, há várias questões de otimização importantes às quais é preciso se dirigir, incluindo, mas não limitadas a, tendência de uso de códons, conteúdo de GC, conteúdo de dinucleotídeos CpG, estrutura secundária do mRNA, sítios de processamento crípticos, sítios de PoliA prematuros, sítios chi internos e sítios de ligação ribossomal, ilhas de CpG negativas, motivos de instabilidade do RNA (ARE), sequências de repetição (repetição direta, repetição inversa e repetição de Dyad), adição de sequências de Kozak e/ou sequências de Shine-Dalgarno para aumentar a eficiência de início da tradução, adição de códons de término para aumentar a eficiência do término da tradução e similares. Portanto, a otimização gênica, como é utilizada aqui, se refere a quaisquer alterações em uma sequência de nucleotídeos produzida para se direcionar a uma ou mais questões de otimização mencionadas anteriormente.

[0042]Um exemplo não limitante de um tipo de otimização gênica utilizado de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção é a otimização de códons. Os termos “otimizado em relação aos códons” e “otimização de códons” referem-se a alterações dos códons do polinucleotídeo que codificam uma proteína naqueles preferencialmente utilizados em um organismo particular de forma que a proteína codificada seja eficientemente expressa no organismo de interesse. Embora o código genético seja degenerado pelo fato de que a maioria dos aminoácidos é representada por vários códons, chamados de códons “sinônimos” ou “idênticos”, é bem sabido que o uso de códons por organismos particulares é não aleatório e com tendência em direção aos tripletos de códons particulares. Esta tendência de uso de códons pode ser mais alta em referência a certo gene, genes de função comum ou de origem ancestral, proteínas altamente expressas versus proteínas com número de cópias baixo e as regiões que codificam proteínas agregadas do genoma de um organismo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam enzimas podem ser otimizados em relação aos códons para a produção ótima partindo do organismo hospedeiro selecionado para expressão.

[0043]“Códons da tendência de uso de códons alta ótima preferida” refere-se de forma intercambiável a códons que são utilizados em maior frequência nas regiões codificadoras de proteína que outros códons que codificam o mesmo aminoácido. Os códons preferidos podem ser determinados em relação ao uso de códons em um único gene, um conjunto de genes de função ou origem comum, genes altamente expressos, a frequência de códons nas regiões codificadoras de proteínas agregadas do organismo como um todo, frequência de códons nas regiões que codificam proteínas agregadas de organismos relacionados ou combinações dos mesmos. Os códons cuja frequência aumenta com o nível de expressão gênica são tipicamente códons ótimos para expressão. Uma variedade de métodos é conhecida para a determinação da frequência de códons (por exemplo, uso de códons, uso de códons sinônimos relativos) e preferência de códons em organismos específicos, incluindo análise multivariada, por exemplo, utilizando análise de cluster ou análise de correspondência e o número eficiente de códons utilizados em um gene (Ver GCG Codon Preference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico e outros., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29). As tabelas de uso de códons estão disponíveis para uma lista crescente de organismos (ver, por exemplo, Wada e outros., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura e outros., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292; Duret, e outros., supra; Henaut e Danchin, “Escherichia coli and Salmonella”, 1996, Neidhardt, e outros. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066), dos quais todos são expressamente incorporados aqui como referência. A fonte de dados para a obtenção do uso de códons pode depender de qualquer sequência de nucleotídeos adequada capaz de codificar uma proteína. Estes conjuntos de dados incluem sequências de ácido nucleico verdadeiramente conhecidas por codificarem proteínas expressas (por exemplo, sequências codificadoras de proteínas completas-CDS), tags de sequência expressos (ESTs) ou regiões codificadoras previstas de sequências genômicas (ver, por exemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281; Tiwari e outros., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270), dos quais todos são incorporados aqui como referência.

[0044]O Dálton (Da) é a unidade internacional da massa molecular baseada em 1/12 da massa de carbono 12. Um quiloDálton (kDa) é 1.000 Da. Um megaDalton (MDa) é 1.000 kDa.

[0045]Se dirigindo agora ao(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, as composições que incluem um polímero de heparosan com alto peso molecular (HMW) isolado são incluídas e descritas em detalhes aqui, junto com os métodos de produção e de utilização das mesmas. Em certas modalidades, a composição é uma composição de material biológico. Em modalidades particulares, o polímero de heparosan isolado é biocompatível com um paciente mamífero e biologicamente inerte nos compartimentos extracelulares do paciente mamífero. O polímero de heparosan substancialmente não é suscetível às hialuronidases de vertebrados (tais como, mas não limitados a, mamíferos) ou às heparanases de vertebrados (tais como, mas não limitados a, mamíferos) e dessa maneira não é substancialmente degradado in vivo nos compartimentos extracelulares do paciente mamífero. Em adição, o polímero de heparosan pode ser recombinantemente produzido como descrito em detalhes aqui utilizando uma combinação de célula hospedeira e biossíntese de sintase, em que as características de ambos estes fatores influenciam no PM produzido pela célula viva.

[0046]O polímero de heparosan isolado divulgado e reivindicado é representado pela estrutura (-GlcUA-beta1,4-GlcNAc-alfa-1,4-)n, em que n é um número inteiro positivo maior que ou igual a aproximadamente 2.000. Os polímeros deste tamanho não foram até agora relatados na literatura específica e na arte anterior. Cada unidade n única tem aproximadamente 400 Da e, portanto, o polímero de heparosan isolado possui um peso molecular (PM) de mais de ou igual a aproximadamente 800 kDa. Em modalidades particulares, n é um número inteiro positivo em uma faixa de desde aproximadamente 2.000 até aproximadamente 17.000 e, portanto, o polímero de heparosan isolado possui um PM em uma faixa de desde aproximadamente 0,8 MDa até aproximadamente 6,8 MDa. Em adição, n pode ser um número inteiro positivo tal como, mas não limitado a, 2.250; 2.500; 2.750; 3.000; 3.250; 3.500; 3.750; 4.000; 4.250; 4.500; 4.750; 5.000; 5.250; 5.500; 5.750; 6.000; 6.250; 6.500; 6.750; 7.000; 7.250; 7.500; 7.750; 8.000; 8.250; 8.500; 8.750; 9.000; 9.250; 9.500; 9.750; 10.000; 10.250; 10.500; 10.750; 11.000; 11.250; 11.500; 11.750; 12.000; 12.250; 12.500; 12.750; 13.000; 13.250; 13.500; 13.750; 14.000; 14.250; 14.500; 14.750; 15.000; 15.250; 15.500; 15.750; 16.000; 16.250; 16.500; 16.750; e 17.000; bem como dentro de uma faixa de qualquer um dos anteriores.

[0047]O polímero de heparosan pode ser linear ou reticulado. As composições do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção podem ser administradas a um paciente através de quaisquer meios conhecidos na arte; por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, as composições podem ser injetáveis e/ou implantáveis. Em adição, as composições podem estar em um estado em gel ou semissólido, uma suspensão de partículas ou as composições podem estar em uma forma líquida.

[0048]Alternativamente, o polímero de heparosan pode ser ligado a um substrato. Quando ligado a um substrato, o polímero de heparosan isolado pode ser de forma covalente (através de uma ligação química) ou de forma não covalente (através de ligações fracas) ligado ao substrato. Qualquer substrato conhecido na arte ou considerado de outra maneira aqui pode ser utilizado, contanto que o substrato seja capaz de ser ligar ao polímero de heparosan e funcionar de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção. Os exemplos de substratos que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem, mas não estão limitados a, sílica, silício, semicondutores, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais e combinações dos mesmos. Os exemplos não limitantes de metais que podem ser utilizados incluem ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

[0049]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção compreende(m) ainda composições de materiais biológicos que compreendem um gel reticulado que inclui um polímero de heparosan isolado e pelo menos um agente de reticulação. O agente de reticulação pode ser qualquer agente de reticulação conhecido ou considerado de outra maneira na arte; os exemplos não limitantes específicos de agentes de reticulação que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem aldeídos, epóxidos, compostos de poliaziridila, glicidil éteres, divinil sulfonas e combinações e derivados dos mesmos. Uma vantagem do(s) conceito(s) da invenção descrito(s) aqui é que concentrações menores deste polímero com PM alto (maior que 1 MDa ou 1.000 kDa) podem ser utilizadas para produzir géis úteis do que se um polímero de PM menor fosse empregado.

[0050]Qualquer uma das composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção pode ser um material biológico de hidratação que protege da desidratação; alternativamente, qualquer uma das composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção pode ser um material biológico lubrificante.

[0051]Outro aspecto do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção está relacionado a kits para a administração in vivo de qualquer uma das composições descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui a um paciente mamífero. O kit também pode incluir instruções para a administração da composição ao paciente mamífero. O kit também pode opcionalmente conter uma ou mais outras composições para uso de acordo com os métodos descritos aqui.

[0052]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção é(são) adicionalmente direcionado(s) a um método de produção de forma recombinante de um polímero de heparosan com alto PM. No método, uma célula hospedeira recombinante que contém uma sequência de nucleotídeos que codifica uma heparosan sintase, a enzima que polimeriza os monossacarídeos de precursores de UDP-açúcar em polissacarídeo de heparosan ou polímero de açúcar, é cultivada sob condições apropriadas para a expressão da heparosan sintase. A heparosan sintase produz o polímero de heparosan com alto PM, que é então isolado.

[0053]O polímero de heparosan com alto PM isolado pode possuir qualquer uma ou todas as características descritas anteriormente aqui e pode subsequentemente ser utilizado como uma composição de material biológico. Assim, o método pode compreender ainda uma ou mais etapas para esta finalidade, tal como, mas não limitada a, reticulação do polímero de heparosan isolado ou ligação (de forma covalente ou de forma não covalente) do polímero de heparosan isolado a qualquer um dos substratos descritos ou considerados de outra maneira aqui.

[0054]Em certas modalidades não limitantes, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de E. coli e a heparosan sintase é uma heparosan sintase de Pasteurella.

[0055]Qualquer heparosan sintase conhecida na arte ou considerada de outra maneira aqui pode ser utilizada de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, contanto que a heparosan sintase seja capaz de produzir um polímero de heparosan com alto PM em um hospedeiro apropriado sob as condições de cultura apropriadas. Os exemplos não limitantes de heparosan sintases que podem ser utilizadas de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção são descritos em maiores detalhes aqui abaixo.

[0056]Qualquer célula hospedeira conhecida na arte ou considerada de outra maneira aqui pode ser utilizada de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, contanto que a célula hospedeira seja capaz de ser tornada recombinante com um gene de heparosan sintase e de produzir um polímero de heparosan com alto PM após a expressão do gene de heparosan sintase sob as condições de cultura apropriadas. Os exemplos não limitantes de células hospedeiras que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção são descritos em maiores detalhes a seguir.

[0057]Em uma modalidade, o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção mostra(m) que as heparosan sintases de Pasteurella (ou catalisador com similaridade de sequência ou motivos chaves) realizarão a operação de biossíntese de heparosan com PM ultra alto em uma célula hospedeira de E. coli com o UDP-açúcar apropriado e a infraestrutura de transporte. As cepas de E. coli disponíveis principais empregadas nos laboratórios bem como a maioria dos isolados do tipo selvagem não são, portanto, úteis sem manipulação adicional. O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção demonstra(m) que um hospedeiro de E. coli K5 (ou cepas que contêm infraestrutura similar) é suscetível à produção do polímero de heparosan com alto PM.

[0058]Em teoria, pelo menos dois modelos simples para o controle do tamanho de um polímero são possíveis: (A) biossíntese controlada pela célula hospedeira ou (B) biossíntese controlada pela sintase. No primeiro modelo, a natureza do aparato de suporte (por exemplo, precursores de UDP-açúcar, transportadores) define a distribuição final de tamanho feita pela célula viva. No último modelo, as propriedades intrínsecas do catalisador de polimerização (por exemplo, taxa de alongamento, capacidade de processamento) controlam a distribuição de tamanho do polímero feita pela célula viva. Um terceiro modelo (C), célula hospedeira/biossíntese de sintase combinatória, é possível quando as características de ambos os fatores influenciam no PM produzido por uma célula viva; este modelo também é o mais complexo, imprevisível e não óbvio de interpretar. Para o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, os modelos A & B são incoerentes com os dados observados; nem o tamanho do produto da célula hospedeira de Escherichia coli K5 (~50-80 kDa) nem o tamanho do produto de heparosan sintase de Pasteurella (~100-300 kDa) é similar à heparosan produzida no(s) conceito(s) da invenção (>800 kDa) e deve ser considerado um resultado imprevisível que não foi relatado na literatura de patentes ou científica até agora.

[0059]Certas modalidades do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem ainda o uso de hospedeiros alternativos com o potencial para produção de glicosaminoglicana, incluindo bactérias das classes tanto Gram- negativas (por exemplo, Pseudomonas etc.) quanto Gram-positivas (por exemplo, Bacilli, Lactoctococci etc.), bem como outros micro-organismos (fungos, archae etc). As exigências básicas de um hospedeiro recombinante para uso na produção de heparosan de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem: (a) a(s) glicosiltransferase(s) que produz(em) heparosan e (b) os precursores de UDP-açúcar UDP-GlcNAc e UDP-GlcUA. Deve ser observado que a última exigência pode ser satisfeita através de genes nativos ou de genes recombinantes introduzidos. Os genes requeridos podem ser localizados de forma epissomal e/ou cromossômica.

[0060]Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende ainda pelo menos um gene que codifica uma enzima para a síntese de um precursor de açúcar heparosan (isto é, UDP-GlcNAc ou UDP-GlcUA). Os exemplos não limitantes de genes que codificam uma enzima para a síntese de um precursor de açúcar heparosan que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem pirofosforilases, transferases, mutases, desidrogenases e epimerases.

[0061]O polímero de heparosan com PM ultra alto (= ou > 1MDa) não é conhecido na natureza e não foi mostrado ou relatado por outros. Como é bem conhecido no campo de polímeros, a distribuição de tamanho afeta suas propriedades físicas (por exemplo, viscosidade, entrelaçamento de cadeias, solubilidade). A heparosan >1 MDa descrita e reivindicada no(s) conceito(s) da invenção é preferida em relação à heparosan que ocorre naturalmente no que se refere ao desempenho na produção de certos materiais biológicos, tais como, mas não limitados a, viscoelásticos e hidrogéis.

[0062]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também está(ão) relacionado(s) aos métodos de aumento de tecido em um paciente mamífero. Em tais métodos, uma quantidade eficiente de qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada ao paciente mamífero. A composição de material biológico pode ser administrada ao paciente através de qualquer método conhecido na arte, incluindo, mas não limitados a, injeção e/ou implante. Quando injetada, a composição de material biológico pode estar em um estado líquido ou uma suspensão de partículas, enquanto quando implantada, a composição de material biológico pode estar em um estado em gel ou semissólido ou pode estar ligada a um substrato.

[0063]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também se refere(m) a métodos de reparo de espaços vazios nos tecidos de mamíferos. No método, qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada dentro dos espaços vazios. Em certas modalidades, a composição de material biológico pode ser injetada e/ou implantada dentro dos espaços vazios.

[0064]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também se refere(m) a métodos de criação de espaços vazios ou vísceras nos tecidos de mamíferos. No método, qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é disposta dentro de um tecido ou uma construção para engenharia de tecido para criar os espaços vazios ou as vísceras. Em certas modalidades, a composição de material biológico pode ser injetada e/ou implantada dentro do tecido/construção para engenharia de tecido para criar os espaços vazios ou as vísceras.

[0065]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também se refere(m) a métodos de cirurgia reparadora ou cirurgia plástica. No método, qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada a um paciente e serve como um material de preenchimento no local no qual é administrada. Em certas modalidades, a composição de material biológico pode ser injetada e/ou implantada no paciente.

[0066]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção refere(m)-se adicionalmente a métodos de aumento dérmico e/ou tratamento de deficiência na pele em um paciente. No método, qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada ao paciente. Em certas modalidades, a composição de material biológico pode ser injetada e/ou implantada no paciente. A composição de material biológico é biocompatível, pode ser expandida, hidrofílica e substancialmente não tóxica e a composição de material biológico se expande após o contato com fluidos fisiológicos no local de administração/injeção/implante.

[0067]O método de aumento dérmico do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção é especialmente adequado para o tratamento de deficiências no contorno da pele, que são frequentemente causadas por várias condições/exposições, incluindo, mas não limitadas a, envelhecimento, exposição ambiental, perda de peso, gravidez, danos, cirurgia, em adição a doenças tais como acne e câncer. Os exemplos não limitantes de deficiências no contorno que podem ser tratadas de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem linhas causadas por franzimento das sobrancelhas, linhas causadas por preocupação, rugas, pé de galinha, linhas de marionete, estrias e cicatrizes internas e externas resultantes de danos, ferimento, picada, cirurgia ou acidente.

[0068]Em adição, o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também se refere(m) a métodos de tratamento médico ou profilático de um paciente mamífero. No método, qualquer uma das composições descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada ao paciente mamífero que necessita de tal tratamento. Em certas modalidades, a composição pode ser injetada e/ou implantada no paciente mamífero.

[0069]Ainda, o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também se refere(m) a métodos de tratamento ou de profilaxia de aumento do tecido em um paciente mamífero. No método, uma composição médica ou profilática que compreende uma composição de gel de polissacarídeo que inclui qualquer uma das composições de materiais biológicos descritas anteriormente aqui ou consideradas de outra maneira aqui é administrada ao paciente mamífero.

[0070]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção é(são) adicionalmente relacionado(s) a um sistema de fornecimento para uma substância que possui atividade biológica ou farmacológica. O sistema que compreende uma gaiola molecular formada de um gel reticulado de heparosan ou um gel reticulado misto de heparosan e pelo menos outro polímero hidrofílico que pode ser copolimerizado com o mesmo. O sistema inclui ainda uma substância que possui atividade biológica ou farmacológica dispersa no mesmo, em que a substância é capaz de ser difundida partindo do mesmo de uma maneira controlada.

[0071]Os materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção podem ser utilizados em quaisquer métodos de utilização de materiais biológicos conhecidos ou considerados de outra maneira na arte. Por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, as composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção podem ser utilizadas em qualquer um dos métodos de utilização de outros materiais biológicos conhecidos que são descritos nas Patentes US Nos. 4.582.865, concedida a Balazs e outros em 15 de abril de 1986; 4.636.524, concedida a Balazs e outros em 13 de janeiro de 1987; 4.713.448, concedida a Balazs e outros em 15 de dezembro de 1987; 5.137.875, concedida a Tsununaga e outros em 11 de agosto de 1992; 5.827.937, concedida a Ang em 27 de outubro de 1998; 6.436.424, concedida a Vogel e outros em 20 de agosto de 2002; 6.685.963, concedida a Taupin e outros em 3 de fevereiro de 2004; e 7.060.287, concedida a Hubbard e outros em 13 de junho de 2006;. O conteúdo inteiro de tais patentes é expressamente incorporado aqui como referência e, portanto, qualquer um dos métodos descritos nas mesmas, quando utilizados com as novas composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s), também se encaixa dentro do âmbito do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção.

[0072]Outros exemplos específicos de usos para as composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem, mas não estão limitados a: (a) um revestimento lubrificante persistente sobre uma superfície, tal como, mas não limitado a, dispositivos cirúrgicos; (b) um hidratante de longa duração; (c) um suplemento viscoelástico para doenças das articulações; e (d) um condutor de sangue não oclusivo não trombótico (tal como, mas não limitado a, um stent ou um vaso artificial etc.). Em adição, qualquer uma das composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção pode ser utilizada na engenharia de tecido para formar um duto ou um lúmen de víscera ou vaso através da utilização das composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção como um formador de espaço tridimensional; neste caso, as células circundantes não se ligarão às composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, tornando assim tais composições de materiais biológicos bem adequadas para esta tecnologia.

[0073]Em adição, o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção inclui(em) ainda métodos de fazer negócios através da produção de qualquer uma das composições descritas ou consideradas de outra maneira aqui através dos métodos descritos anteriormente aqui e da venda e do fornecimento das composições a um cliente ou do fornecimento de tais composições a um paciente.

[0074]Em uma modalidade do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, as composições do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção podem ser produzidas utilizando heparosan sintases recombinantes que são descritas ou de outra maneira conhecidas na arte, incluindo, mas não limitada às heparosan sintases divulgadas nas Patentes U.S. Nos. de patentes anteriores do inventor 7.307.159, publicada em 11 de dezembro de 2007; 7.771.981, publicada em 8 de maio de 2002; e 8.088.604, publicada em 3 de janeiro de 2012; bem como as heparosan sintases divulgadas nos pedidos de patentes publicados do inventor US 2008/0226690, publicado em 18 de setembro de 2008; US 2010/0036001, publicado em 11 de fevereiro de 2010; e US 2012/0108802, publicado em 3 de maio de 2012. O conteúdo total das patentes e dos pedidos de patentes referidos acima e especialmente as listagens de sequências dos mesmos, é expressamente incorporado aqui como referência como se fosse explicitamente divulgado aqui.

[0075]Os exemplos não limitantes de heparosan sintases que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem: uma heparosan sintase recombinante que possui uma sequência de aminoácidos que é apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 68; uma heparosan sintase recombinante codificada pela sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com um complemento da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11 sob condições de hibridização compreendendo hibridização a uma temperatura de 68°C em 5x SSC/5x solução de Denhardt/1,0% de SDS, seguida pela lavagem em 3x SSC a 42°C; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com um complemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que é apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8 sob condições de hibridização compreendendo hibridização a uma temperatura de 68°C em 5x SSC/5x solução de Denhardt/1,0% de SDS, seguida pela lavagem em 3x SSC a 42°C; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com um complemento da sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11 sob condições de hibridização compreendendo hibridização a uma temperatura de 30°C em 5x SSC, 5X reagente de Denhardt, 30% de formamida durante aproximadamente 20 horas seguida pela lavagem duas vezes em 2X SSC,0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 15 min seguida por 0,5X SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 30 minutos; e uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos capaz de se hibridizar com um complemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos que é apresentada em pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8 sob condições de hibridização compreendendo hibridização a uma temperatura de 30°C em 5x SSC, 5X reagente de Denhardt, 30% de formamida durante aproximadamente 20 horas seguida pela lavagem duas vezes em 2X SSC,0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 15 min seguida por 0,5X SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 30 minutos.

[0076]Os exemplos não limitantes adicionais de heparosan sintases que podem ser utilizados de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção incluem: uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 60% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 80% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 85% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6-8; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 60% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11; e uma heparosan sintase recombinante codificada por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 9-11.

[0077]O uso de genes de heparosan sintase truncados para produzir qualquer uma das composições descritas ou consideradas de outra maneira aqui também se encaixa dentro do âmbito do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção. Por exemplo, a remoção dos últimos 50 resíduos ou dos primeiros 77 resíduos de PmHS1 (SEQ ID NOS: 7 e 8, respectivamente) não inativa sua função catalítica (Kane e outros., 2006). Os peritos comuns na arte considerarão que a remoção simples de aminoácido de cada uma das extremidades da sequência da heparosan sintase pode ser realizada. As versões truncadas da sequência simplesmente têm que ser verificadas em relação à atividade com a finalidade de determinar se tal sequência truncada ainda é capaz de produzir heparosan.

[0078]Similarmente, o uso de proteínas de fusão que adicionam outros segmentos de polipeptídeos (a qualquer um dos términos ou internamente) à sequência da heparosan sintase também se encaixa dentro do âmbito do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção. O parceiro da proteína de fusão (tal como, mas não limitado a, proteína de ligação à maltose, tiorredoxina etc.) pode aumentar a estabilidade, aumentar os níveis de expressão na célula e/ou facilitar o processo de purificação, mas a atividade catalítica para a produção do polímero de heparosan intrínseca ao(s) conceito(s) da invenção permanece a mesma.

[0079]A heparosan sintase recombinante utilizada de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção também abrange sequências essencialmente como são apresentadas nas SEQ ID NOS:1-8. O termo “uma sequência essencialmente como é apresentada na SEQ ID NO:X” significa que a sequência substancialmente corresponde a uma porção da SEQ ID NO:X e possui relativamente poucos aminoácidos ou códons que codificam os aminoácidos que não são idênticos a ou um equivalente biologicamente funcional dos aminoácidos ou dos códons que codificam os aminoácidos da SEQ ID NO:X. O termo “equivalente biologicamente funcional” é bem entendido na arte e é adicionalmente definido em detalhes aqui, como um gene que possui uma sequência essencialmente como é apresentada na SEQ ID NO:X e que está associado à capacidade dos procariotos de produzir HA ou um polímero de heparosan in vitro ou in vivo. Nos exemplos anteriores, X refere-se às SEQ ID NOs:1-11 ou a quaisquer sequências adicionais apresentadas aqui, tais como as versões truncadas ou mutadas de pmHS1 que estão geralmente contidas nas SEQ ID NOS:7-8.

[0080]É amplamente reconhecido que um par de enzimas distintas com até mesmo 30, 50 ou 70% de identidade ou similaridade no sítio ativo (de regiões funcionais) das mesmas podem possuir a mesma atividade catalítica. Uma vez que a maior parte da sequência de proteína é uma estrutura para o sítio ativo, não é necessário que todas as regiões das enzimas sejam exatamente as mesmas entre homólogos ou análogos de enzimas funcionais. Em adição, algumas sequências (não catalíticas) extras também podem estar presentes, reduzindo assim os níveis de similaridade total das proteínas. Assim, as regiões funcionais (e não as sequências inteiras) devem ser a base para as comparações de similaridade entre duas enzimas.

[0081]Estas referências e outras incontáveis indicam que um perito comum na arte, fornecida uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos, poderia fazer substituições e alterações na sequência de ácido nucleico/aminoácidos sem alterar sua funcionalidade (exemplos específicos de tais alterações são fornecidos posteriormente aqui e são geralmente apresentados nas SEQ ID NOS:7-8). Ainda, um segmento de ácido nucleico substituído pode ser altamente idêntico e manter sua atividade enzimática em consideração ao seu parental não adulterado e ainda falhar em se hibridizar ao mesmo. Desta maneira, as variações das sequências que se encaixam dentro das limitações funcionais definidas anteriormente foram descritas nos pedidos de patentes incorporados como referência. Dessa maneira, o(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s) não deve(m) ser considerado(s) como sendo exclusivamente limitado(s) ao uso das sequências específicas divulgadas e/ou incorporadas como referência aqui. Ainda, se regiões menores ou motivos de sequência contiverem os resíduos do sítio ativo ou unidades funcionais importantes, esta similaridade é também indicativa de função. O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção pode(m) utilizar segmentos de ácido nucleico que codificam uma HS enzimaticamente ativa proveniente de P. multocida - pmHS1 e/ou PmHS2. Um perito comum na arte considerará que substituições podem ser feitas nos segmentos de ácido nucleico de pmHS1 ou PmHS2 listados nas SEQ ID NOS:1, 3 e 5, respectivamente, sem se desviar do âmbito e das reivindicações do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção. As substituições de aminoácidos funcionalmente equivalentes padronizadas e aceitas são apresentadas na Tabela 1. Em adição, outras enzimas análogas ou homólogas que são funcionalmente equivalentes às sequências de sintase divulgadas também serão consideradas pelos peritos na arte como sendo similarmente úteis nos métodos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção, isto é, um novo método para controlar precisamente a distribuição de tamanho do polímero de heparosan.

[0082]Portanto, o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção inclui(em) ainda o uso de heparosan sintases que possuem sequências de aminoácidos que diferem de pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8 em pelo menos um dos seguintes: a presença de 1-60 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-55 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-50 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-45 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-40 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-35 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-30 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-25 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-20 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-15 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; a presença de 1-10 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8; e a presença de 1-5 adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8.

[0083]Levando em conta a degeneração do código genético bem como substituições conservadas e semi-conservadas, as sequências que possuem entre aproximadamente 40% e aproximadamente 99%; ou mais preferencialmente, entre aproximadamente 60% e aproximadamente 99%; ou mais preferencialmente, entre aproximadamente 70% e aproximadamente 99%; ou mais preferencialmente, entre aproximadamente 80% e aproximadamente 99%; ou ainda mais preferencialmente, entre aproximadamente 90% e aproximadamente 99% de identidade em relação aos nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 9-11 serão sequências que são “essencialmente como apresentadas em pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 9-11. As sequências que são essencialmente as mesmas que aquelas apresentadas em pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 9-11 também podem ser funcionalmente definidas como sequências que são capazes de se hibridizar com um segmento de ácido nucleico contendo o complemento de pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 9-11 sob condições de hibridização estringentes padronizadas, “condições de hibridização moderadamente estringentes”, “condições de hibridização menos estringentes” ou “condições de hibridização de baixa estringência”. As condições de hibridização padronizadas adequadas ou menos estringentes serão bem conhecidas pelos peritos na arte e são claramente apresentadas posteriormente aqui. Em uma modalidade preferida, as condições de hibridização estringentes padronizadas ou as condições de hibridização menos estringentes são utilizadas.

[0084]Os termos “condições de hibridização estringentes padronizadas”, “condições moderadamente estringentes” e condições de hibridização menos estringentes ou “condições de hibridização de baixa estringência” são utilizados aqui, descrevem as condições sob as quais segmentos de ácido nucleico substancialmente complementares formarão pareamento de bases de Watson-Crick padronizado e assim se “hibridizam” um com o outro. É conhecido um número de fatores que determina a especificidade de ligação ou de hibridização, tais como pH; temperatura; concentração de sal; a presença de agentes, tais como formamida e dimetil sulfóxido; o comprimento dos segmentos que se hibridizam; e similares. Há vários protocolos para os experimentos de hibridização padronizados. Dependendo da similaridade relativa do DNA alvo e da sonda ou do DNA de busca, então a hibridização é realizada sob condições estringentes, moderadas ou sob condições de baixa estringência ou menos estringentes.

[0085]A porção de hibridização dos ácidos nucleicos que se hibridizam tem tipicamente pelo menos aproximadamente 14 nucleotídeos de comprimento e preferencialmente entre aproximadamente 14 e aproximadamente 100 nucleotídeos de comprimento. A porção de hibridização do ácido nucleico que se hibridiza é pelo menos aproximadamente 60%, por exemplo, pelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 90%, idêntica a uma porção ou toda uma sequência de ácido nucleico que codifica uma heparina/heparosan sintase ou seu complemento, tal como SEQ ID NO:1, 3, 5, 9, 10 ou 11 ou o complemento da mesma. A hibridização da sonda de oligonucleotídeo com uma amostra de ácido nucleico tipicamente é realizada sob condições de hibridização padronizadas ou estringentes. A estabilidade do duplex ou do híbrido de ácido nucleico é expressa na forma da temperatura de fusão ou Tm, que é a temperatura à qual uma sequência de ácido nucleico de sonda se dissocia de seu DNA alvo. Esta temperatura de fusão é utilizada para definir as condições de estringência necessárias. Se tiverem que ser identificadas sequências que são relacionadas e substancialmente idênticas à sonda, ao invés de idênticas, então é útil primeiro estabelecer a temperatura mais baixa à qual somente a hibridização homóloga ocorre com uma concentração de sal particular (por exemplo, soluções de Citrato Salino Padronizadas (SSC), de EDTA Fosfato de Sódio Salino (SSPE) ou Tampão com Alto Teor de Fosfato (HPB)). Então, assumindo que 1% dos pareamentos errados resulta em um decréscimo de 1°C na Tm, a temperatura da lavagem final na reação de hibridização é reduzida consequentemente (por exemplo, se as sequências que possuem >95% de identidade em relação à sonda estiverem sendo buscadas, a temperatura de lavagem final é diminuída em aproximadamente 5°C). Na prática, a alteração na Tm pode ocorrer entre aproximadamente 0,5°C e aproximadamente 1,5°C por 1% de pareamento errado. Os exemplos de condições de hibridização estringentes padronizadas incluem a hibridização a aproximadamente 68°C em 5x SSC/5x solução de Denhardt/1,0% de SDS, seguida pela lavagem em 0,2x SSC/0,1% de SDS à temperatura ambiente ou a hibridização em 1,8x HPB a aproximadamente 30°C até aproximadamente 45°C seguida pela lavagem a 0,2-0,5xHPB a aproximadamente 45°C. As condições moderadamente estringentes incluem a hibridização como é descrita anteriormente em 5xSSC\5x solução de Denhardt/1% de SDS lavando em 3x SSC a 42°C. Os parâmetros de concentração de sal e temperatura podem ser variados para atingir o nível ótimo de identidade entre a sonda e o ácido nucleico alvo. Diretrizes adicionais em relação a tais condições estão facilmente disponíveis na arte, por exemplo, por Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Press, N.Y.); e Ausubel e outros. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.). Vários exemplos de protocolos de baixa estringência incluem: (A) hibridização em 5x SSC, 5X reagente de Denhardt, 30% de formamida a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 20 horas seguida pela lavagem duas vezes em 2X SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 15 min seguida por 0,5X SSC, 0,1% de SDS a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 30 min (FEMS Microbiology Letters, 2000, vol. 193, p. 99-103); (B) hibridização em 5x SSC a aproximadamente 45°C durante toda a noite seguida pela lavagem com 2X SSC, então por 0,7X SSC a aproximadamente 55°C (J. Viological Methods, 1990, vol. 30, p. 141-150); ou (C) hibridização em 1,8XHPB a aproximadamente 30°C até aproximadamente 45°C; seguida pela lavagem em 1X HPB a 23°C.

[0086]Os segmentos de DNA que podem ser utilizados para produzir as composições do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção abrangem segmentos de DNA que codificam proteínas e peptídeos de HS equivalentes biologicamente funcionais. Tais sequências podem surgir como uma consequência da redundância de códons e da equivalência funcional que são conhecidas por ocorrerem naturalmente dentro das sequências de ácido nucleico e das proteínas codificadas dessa maneira. Alternativamente, as proteínas ou os peptídeos funcionalmente equivalentes podem ser criados através da aplicação da tecnologia do DNA, em que alterações na estrutura da proteína podem ser engenheiradas, com base nas considerações das propriedades dos aminoácidos que serão alterados. As alterações planejadas pelo ser humano podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagênese direcionada ao sítio, por exemplo, para introduzir melhorias na atividade da enzima ou na antigenicidade da proteína HS ou para testar mutantes de HS com a finalidade de examinar a atividade de HS no nível molecular ou para produzir mutantes de HS que possuem atividade enzimática e/ou especificidade ao substrato de açúcar alterada ou nova.

[0087]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção inclui(em) ainda o uso de sequências de nucleotídeos que codificam qualquer uma das heparosan sintases descritas ou consideradas de outra maneira aqui, em que as sequências de nucleotídeos são sequências sintéticas que foram otimizadas para o gene para expressão em uma célula hospedeira particular. Os exemplos não limitantes específicos de sequências de nucleotídeos que codificam heparosan sintase otimizadas para o gene são fornecidos nas SEQ ID NOS:9-11. As SEQ ID NOS:9-10 incluem sequências de nucleotídeos que codificam a heparosan sintase da SEQ ID NO:2 e que foram otimizadas otimizado para o gene para expressão em E. coli. A SEQ ID NO:11 inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica a heparosan sintase da SEQ ID NO:2 e que foi otimizada para o gene para expressão em Bacillus.

[0088]Entretanto, o âmbito do(s) conceito(s) da invenção não está limitado a estas sequências particulares, mas ao invés disso inclui sequências de nucleotídeos otimizadas para o gene que codificam qualquer heparosan sintase descrita ou considerada de outra maneira aqui (tal como, mas não limitada às sequências da heparosan sintase de aminoácidos que são certa porcentagem idênticas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8, bem como sequências de aminoácidos da heparosan sintase que contêm uma ou mais adições, deleções ou substituições quando comparadas a pelo menos uma das SEQ ID NOS:2, 4 e 6-8).

[0089]O uso de sequências otimizadas para o gene é conhecido e utilizado na arte para aumentar a expressão da sequência gênica dentro do hospedeiro heterólogo. Entretanto, um novo produto foi inesperadamente produzido partindo da heparosan sintase expressa em E. coli quando a sequência gênica de Pasteurella foi otimizada para o gene e expressa em E. coli. O(s) conceito(s) da invenção divulga(m) a produção de polímeros de heparosan com peso molecular em mega- Dáltons e esta nova espécie nunca foi relatada antes em quaisquer microorganismos conhecidos. Um perito comum na arte assumiria que a otimização de uma sequência gênica que codifica uma enzima resultaria na expressão aumentada de tal enzima no hospedeiro heterólogo, resultando assim na maior produção do mesmo produto derivado da enzima (isto é, quantidades mais altas do polímero de heparosan do tamanho típico encontrado nos micro-organismos nativos) produzido no hospedeiro nativo. Inesperadamente, a expressão da heparosan sintase de Pasteurella multocida otimizada para o gene em E. coli resultou em uma nova espécie de produto - um polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto. A produção de polímeros de heparosan deste tamanho não foi relatada para qualquer outro micro-organismo. Em adição, os polímeros de heparosan produzidos de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção exibem propriedades superiores e vantajosas comparados com os produtos com peso molecular menor atualmente conhecidos na arte. Estas propriedades fornecem maior utilidade para o polímero de heparosan no campo dos materiais biológicos. Por exemplo, mas não com a finalidade de limitação, os polímeros de heparosan com peso molecular (PM) ultra-alto produzidos de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção exibem maior viscosidade da solução e podem ser utilizados em concentrações menores (com ou sem reticulação química) que as preparações de heparosan que ocorrem naturalmente.

[0090]O(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção inclui(em) ainda sequências de nucleotídeos isoladas, junto com células hospedeiras recombinantes contendo as mesmas, que contêm qualquer uma das sequências otimizadas para o gene da heparosan sintase divulgadas ou consideradas de outra maneira aqui.

[0091]A heparosan, um polímero de açúcar que é o precursor biossintético natural de heparina e sulfato de heparana, possui várias características que indicam que este material exibe maior desempenho em uma variedade de aplicações médicas ou dispositivos médicos. Em comparação à HA e à heparina, dois polímeros muito similares estruturalmente utilizados em muitas aplicações atuais em vários mercados grandes, a heparosan é mais estável no corpo, uma vez que nenhuma enzima que ocorre naturalmente degrada a heparosan e, portanto, as composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção devem ter tempos de vida mais longos comparados com os materiais biológicos utilizados atualmente. Em adição, a heparosan interage com menos proteínas (assim menos obstrução) e células (assim menos infiltração, formação de cicatrizes ou coagulação) quando comparada com os materiais biológicos existentes.

[0092]A cadeia de heparosan não contém grupos sulfato; assim, a enzima de degradação heparanase, as proteínas do sistema anticoagulação do sangue, os receptores de ligação à superfície celular e os fatores de crescimento e as citocinas não irão se ligar especificamente ao polímero. Esta característica leva a um caráter inerte no corpo, fornecendo dessa maneira meia-vida longa no espaço extracelular em adição aos comportamentos celulares de não estimulação ou indução (por exemplo, crescimento, migração, ligação, ativação etc). Entretanto, uma vez na célula, a cadeia de heparosan pode ser degradada por sistemas metabólicos normais tais como as exoglicosidases no lisossomo.

[0093]Em comparação a plásticos sintéticos ou carbono, as características de hidrofilicidade natural (também conhecidas como afinidade com a água) da heparosan também aumentam a compatibilidade do tecido. As proteínas derivadas de animais (por exemplo, colágeno, albumina do soro bovino) e a hidroxiapatita de cálcio frequentemente possuem efeitos colaterais, incluindo, mas não limitados a, ativação de uma resposta alérgica e/ou estimulação da granulação (5). Por outro lado, ainda certas bactérias patogênicas utilizam a heparosan para se esconder no corpo uma vez que este polímero é não imunogênico (8-10). As composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção produzidas partindo de uma fonte não animal também prometem ser livres de agentes adventícios (por exemplo, vírus de vertebrados, príons) que poderiam potencialmente contaminar fontes derivadas de animais ou de seres humanos.

[0094]Certos carboidratos desempenham funções na formação e na manutenção das estruturas de organismos multicelulares em adição a funções mais familiares como nutrientes para energia. As glicosaminoglicanas [GAGs], polissacarídeos lineares longos que consistem em repetições de dissacarídeos que contêm um amino açúcar, são bem conhecidas como sendo essenciais em vertebrados (9, 11-15). As estruturas de GAG possuem muitos grupos negativos e são repletas de grupos hidroxila, portanto, estes açúcares possuem uma alta capacidade de adsorver água e íons. Heparina/heparan (estrutura [β4GlcUA- α4GlcNAc]n), condroitina (estrutura [β4GlcUA-β3GalNAc]n) e hialuronana (HA; estrutura [β4GlcUA-β3GlcNAc]n) são as três GAGs mais predominante em humanos. Dependendo do tecido e do tipo de célula, as GAGs são elementos estruturais, de adesão e/ou de sinalização. Alguns micro-organismos hábeis também produzem revestimentos de polissacarídeos extracelulares, chamados de cápsulas, compostos de cadeias de GAG que servem como fatores de virulência (9, 10). Acredita-se que a cápsula ajude na evasão das defesas do hospedeiro tais como fagocitose e complemento. Uma vez que o polissacarídeo microbiano é idêntico ou muito similar à GAG do hospedeiro, a resposta de anticorpo é muito limitada ou inexistente.

[0095]Em seres humanos, a heparosan existe apenas de forma transitória, servindo como um precursor para os produtos de sulfato de heparana e heparina finais mais altamente modificados. Em contraste, as cepas bacterianas apresentadas aqui produzem heparosan como seu produto final (16). Devido à constituição menos complexa das células bacterianas e à facilidade relativa com a qual seu crescimento e expressão podem ser modulados, a coleta de um polímero partindo de micro- organismos é muito mais fácil, mais possível de ter a quantidade aumentada e menos cara que a extração partindo de tecidos de animais. Em adição, o polímero no(s) conceito(s) da invenção descrito(s) aqui, a saber, a heparosan com PM ultra alto (1 até 6,8 MDa) derivada do sistema recombinante dos presentes inventores não existia anteriormente ou foi relatado na natureza.

[0096]Os preenchimentos dérmicos servem como substituições ou agentes de aumento de tecidos moles (5, 6). A necessidade de um preenchimento dérmico pode surgir de envelhecimento (perda de HA e elastina), trauma (perda de tecido), acne (marcas graves) e/ou atrofia (certas doenças debilitantes incluindo lipoatrofia). Três características importantes que os preenchimentos dérmicos têm que possuir incluem a) capacidade de preenchimento de espaços, b) manutenção da hidratação e c) compatibilidade biológica (5). Atualmente, polissacarídeos, proteínas, plásticos e cerâmicas têm sido utilizados como materiais biológicos nos preenchimentos dérmicos. Em relação à aparência estética e à facilidade de implante, géis injetáveis mais moles possuem atributos melhores; assim, polissacarídeos e proteínas são amplamente utilizados. Em adição aos usos terapêuticos, as aplicações cosméticas estão se tornando mais amplamente difundidas. As alternativas para o tratamento de preenchimento dérmico são o uso de (i) cirurgia plástica (esticamento da pele), (ii) agentes que matam nervos tal como BOTOX® (relaxam os músculos) e (iii) o uso de gordura autóloga. Comparadas com os preenchimentos dérmicos, estas alternativas são mais invasivas e/ou deixam o paciente com uma aparência não natural (5, 6). Para vítimas de trauma, formação de cicatrizes ou doença grave, um objetivo da terapia é fornecer mais autoconfiança e melhor disposição; este efeito não deve ser desconsiderado, uma vez que o estado de espírito de um paciente é importante para a cura de forma geral.

[0097]Uma meta importante da bioengenharia é o planejamento de dispositivos artificiais implantados para reparar ou para monitorar o corpo humano. Polímeros de alta resistência, ligas duráveis e semicondutores versáteis possuem muitas propriedades que tornam estes materiais desejáveis para as tarefas da bioengenharia. Entretanto, o corpo humano possui uma faixa ampla de defesas e respostas que evoluíram para prevenir infecções e para remover matéria estranha que impede a utilização de substâncias modernas produzidas pelo ser humano (17, 18). O aprimoramento da compatibilidade biológica destes materiais eliminará um obstáculo significativo no avanço da bioengenharia.

[0098]Um exemplo importante de uma necessidade médica de revestimentos de superfície aprimorados é observado na doença cardiovascular. Os danos provenientes desta doença são um problema muito prevalecente e caro; o sistema do paciente sofre privação de oxigênio e nutrientes devido ao fraco fluxo sanguíneo. A disponibilidade de enxertos de vasos sanguíneos provenientes de transplantes (autólogos ou doadores) é limitada bem como cara. Portanto, a capacidade de inserir novos vasos artificiais é uma meta, mas esta levará mais tempo até a perfeição devido à engenharia complexa e às necessidades biológicas. Outra intervenção terapêutica mais acessível atual emprega stents, dispositivos artificiais que mantêm aberta a cavidade interna do vaso sanguíneo de um paciente. Como summated por Kordan & Chaikof, “The development of a clinically durable small-diameter vascular graft as well as permanently implantable biosensors and artificial organ systems that interface with blood, including the artificial heart, kidney, liver, and lung, remain limited by surface-induced thrombotic responses” (7). Assim, para melhorar esta tecnologia adicionalmente, são necessários revestimentos de superfície tromborresistentes que inibem: (i) absorção de proteínas e células, (ii) formação de trombina e fibrina e (iii) ativação e agregação de plaquetas.

[0099]Plásticos artificiais (poli[lactida] em SCULPTRA® (Sanofi-Aventis) ou poli[metilmetacrilato] em ARTECOLL® (Artes Medical, Inc., San Diego, CA), cerâmicas (hidroxiapatita de cálcio em RADIESSE® (Bioform Medical, Inc., San Mateo, CA)) ou carbono puro possui utilidade para muitas aplicações terapêuticas (1,5,7,18), mas em muitos aspectos, suas propriedades químicas e físicas não são tão ótimas quanto os polissacarídeos para as metas direcionadas de preenchimentos dérmicos ou revestimentos de superfície. As questões mais críticas são a falta de boa capacidade de manter umidade (devida à fraca interação com a água) e/ou a dureza (levando a uma sensação não natural ou fragilidade). O(s) conceito(s) da invenção reivindicado(s) e divulgado(s) é(são) relacionado(s) ao uso de heparosan para substituir e suplantar polímeros de açúcar úteis que são hidrofílicos (têm afinidade com a água) e podem ser preparados em uma forma mole.

[00100]Em adição à HA e à heparina, outros polissacarídeos tal como dextran ([α6Glc]n), celulose ([β4Glc]n) ou quitosana ([β4GlcN]n) possuem muitas propriedades úteis, mas uma vez que não são naturalmente aniônicos (carregados negativamente), estes polímeros não imitam a matriz extracelular natural ou as superfícies de vasos sanguíneos. Celulose e dextran podem ser quimicamente transformados em polímeros carregados que ajudam a aumentar sua compatibilidade biológica e melhoram suas propriedades fisicoquímicas gerais, mas condições adversas são necessárias levando à variabilidade de batelada para batelada e às questões de qualidade. Por outro lado, as GAGs, os polímeros naturais, possuem cargas negativas intrínsecas.

[00101]A HA e a heparina foram empregadas como revestimentos de material biológico para próteses e stents vasculares (vasos sanguíneos artificiais e suportes), bem como revestimentos sobre lentes intraoculares e próteses de tecidos moles (7, 22). O raciocínio é prevenir a coagulação sanguínea, aumentar a resistência à obstrução e prevenir a adesão pós-cirúrgica (quando os órgãos se grudam de uma maneira indesejável). As composições de materiais biológicos do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção devem ser também adequadas como um revestimento, como descrito em maiores detalhes posteriormente aqui.

[00102]Uma vantagem importante com a heparosan é que esta possui maior estabilidade biológica na matriz extracelular quando comparada com outras GAGs. Como com a maioria dos compostos sintetizados no corpo, novas moléculas são produzidas e após cumprirem com sua finalidade, são quebradas em constituintes menores para reciclagem. A heparina e o sulfato de heparana são eventualmente degradados e reciclados por uma única enzima conhecida como heparanase (23, 24). O desafio experimental de heparosan e N-sulfo-heparosan com heparanase, entretanto, mostra que estes polímeros que não possuem O-sulfatização não são sensíveis à ação da enzima in vitro (25, 26). Estas descobertas demonstram que a heparosan não é fragmentada enzimaticamente no corpo. De forma geral, isto indica que a heparosan é um material biológico muito estável.

EXEMPLOS

[00103]Os Exemplos são fornecidos aqui a seguir. Entretanto, a presente invenção deve ser entendida como não sendo limitada em sua aplicação aos experimentos, aos resultados e aos procedimentos de laboratório específicos. Ao invés disso, os Exemplos são simplesmente fornecidos com uma das várias modalidades e é pretendido que sejam exemplos, não exaustivos.

EXEMPLO 1

[00104]Sequências de pmHS1 otimizadas para o gene para expressão em E. coli e Bacillus. Três sequências otimizadas para o gene que codifica a heparosan sintase de Pasteurella multocida da SEQ ID NO:2 foram obtidas. Duas das sequências (SEQ ID NOS:9 e 10) foram otimizadas para o gene para expressão em E. coli, enquanto a terceira sequência (SEQ ID NO:11) foi otimizada para o gene para expressão em Bacillus.

[00105]A Figura 1A contém um alinhamento das duas sequências otimizadas para o gene de E. coli, SEQ ID NOS:9 e 10, com o gene da heparosan sintase nativo de Pasteurella multocida (SEQ ID NO:1). A Figura 1B contém um alinhamento apenas das duas sequências otimizadas para o gene de E. coli, SEQ ID NOS:9 e 10. A Figura 1C contém um alinhamento da sequência otimizada para o gene de Bacillus (SEQ ID NO:11) com o gene da heparosan sintase nativo de Pasteurella multocida (SEQ ID NO:1).

[00106]A Tabela 2 ilustra a porcentagem de identidade entre as duas sequências otimizadas para o gene das SEQ ID NOS:9-10 e a sequência do gene nativo de Pasteurella multocida (SEQ ID NO:1). Observar que todas as três sequências codificam sequências de aminoácidos que são 100% idênticas à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Como pode ser observado, as duas sequências otimizadas para o gene são aproximadamente 74% idênticas à sequência do gene nativo de Pasteurella. É também observado que as duas sequências otimizadas para o gene são apenas 95% idênticas uma em relação à outra, de forma que há alguma variação obtida do algoritmo que é utilizado para gerar a sequência otimizada. TABELA 2: Porcentagens de Identidade das Sequências Otimizadas para o Gene e do Gene da Heparosan Sintase Nativo

EXEMPLO 2

[00107] Produção de Polissacarídeo de Heparosan com Alto PM. Há dois tipos de micro-organismos que ocorrem naturalmente, (a) certas bactérias Pasteurella multocida (Tipo D) e seus parentes relacionados tais como certas Avibacteria e (b) Escherichia coli K5 e seus parentes relacionados que produzem um revestimento extracelular composto de polímero de heparosan não sulfatado que é facilmente coletado do meio de cultura. Uma característica inesperada e vantajosa foi descoberta para a heparosan recombinante (gene de Pasteurella otimizado para o gene em um hospedeiro de E. coli) em relação tanto à heparosan bacteriana natural quanto à heparina de mamífero; a heparosan produzida de acordo com o(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção possui um peso molecular mais alto de aproximadamente 1 até 6,8 MDa (1.000 até 6.800 kDa); portanto, géis ou líquidos viscoelásticos formados partindo desta heparosan recombinante devem ser mais fáceis de produzir.

[00108]Transformação de pmHSI otimizado para o gene em E. coli: A sequência de nucleotídeos otimizada para o gene pmHS1 sintética (SEQ ID NO:9) foi obtida na GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ) e ligada dentro de um plasmídeo pKK223-3. O plasmídeo contendo o gene pmHS1 foi então transformado em células de E. coli K5 quimicamente competentes.

[00109]Produção e Teste da Heparosan: Células de E. coli K5 expressando o gene pmHS1 otimizado para o gene foram crescidas em meio sintético a 30°C em um fermentador de 14 L durante aproximadamente 40 horas. O meio de cultura gasto (a parte líquida da cultura após as células microbianas terem sido removidas) foi coletado (por centrifugação a 10.000 x g durante 60 minutos) e alíquotas do mesmo foram analisadas por eletroforese em gel de agarose (1X tampão TAE, 0,81,5% de agarose) seguida pela visualização com Stains-All (Lee & Cowman, Anal. Biochem., 1994). O tamanho do polímero de heparosan foi determinado por comparação aos padrões de tamanho de HA monodispersos (HiLadder, Hyalose, LLC).

[00110]O rendimento da heparosan no meio gasto foi verificado através de ensaios de carbazol para o ácido urônico. O ensaio de carbazol é um ensaio químico espectrofotométrico que mede a quantidade de ácido urônico na amostra através da produção de uma coloração rosa; cada outro açúcar na cadeia de heparosan é um ácido glucurônico. O limite de detecção do ensaio de carbazol é de aproximadamente 5 microgramas de polímero.

[00111]A identidade do polímero como heparosan foi testada através da digestão como heparina liase III (Pedobacter); qualquer polissacarídeo similar à heparina será clivado em pequenos fragmentos (oligossacarídeos) que correm na frente do corante em um gel de agarose e não coram bem com Stains-All.

[00112]Várias vantagens do(s) conceito(s) divulgado(s) e reivindicado(s) aqui da invenção são apresentadas nas Tabelas 3 e 4. Tabela 3: Comparação de Heparosan e Materiais Biológicos Cirúrgicos Existentes para Aplicações de Revestimento

Tabela 4: Comparação de Heparosan e Materiais Biológicos Existentes para Aplicações de Revestimento de Superfície

EXEMPLO 3

[00113]Produção de heparosan com peso molecular em mega-Dáltons. Foi realizada a análise em gel de agarose do polímero de heparosan com peso molecular ultra-alto produzido de acordo com o método do Exemplo 2. A análise em gel de agarose (1X TAE, detecção com Stains-All) mostrada na Figura 2 demonstrou que a construção do gene PmHS1 recombinante produzido por plasmídeo partindo de P. multocida Tipo D em E. coli K5 (Ec K5 + pmHS1) produzia um polímero de heparosan com PM muito alto (~1 até ~4,5 MDa; banda marcada com um colchete). Como um controle negativo, a mesma E. coli hospedeira com vetor apenas (Ec K5 + vetor) produzia apenas um polímero de baixo PM (~50 kDa até ~100 kDa; marcado com uma seta). Std = SelectHA MegaLadder/SelectHA HiLadder/Select HA LoLadder (Hyalose LLC) com bandas da parte superior para a parte inferior: 6100, 4570, 3050, 1510, 1090, 966, 572, 495, 310, 214, 110, 27 kDa (kDa = 1.000 Da; MDa = 1.000 kDa). Plasmídeos: Vetor = (pKK223-3); PmHS1 = (pKK223-3/PmHS1).

EXEMPLO 4

[00114]Produção de heparosan com peso molecular em mega-Dáltons em E. coli BL21(DE3). E. coli BL21(DE3) [NEB], uma cepa de E. coli com genética distinta das cepas K5 e K12, foi transformada com pKK223-3/otimizado para o gene PmHS1 (P) ou pMAL-C4e/otimizado para o gene PmHS1 (M), um plasmídeo de expressão que produz uma proteína de fusão de proteína de ligação à maltose (MBP)-PmHS1. As culturas dos transformantes foram induzidas com IPTG e então crescidas durante toda a noite em LB (LB) ou um meio sintético (Syn). O meio de cultura foi então clarificado por centrifugação e o polímero de heparosan foi concentrado por precipitação com etanol. A identidade do polímero de heparosan foi confirmada através da digestão com a heparina liase III (+LYASE). A análise em gel de agarose (1X TAE, detecção com Stains-All) mostrada na Figura 3 demonstrou que a construção do gene PmHS1 recombinante produzido por plasmídeo partindo de P. multocida Tipo D em E. coli BL21(DE3) produzia um polímero de heparosan com PM muito alto (~2 até 6,8 MDa; extensão da banda de alto PM marcada com um colchete). Mega = SelectHA MegaLadder (Hyalose LLC) com bandas da parte superior para a parte inferior: 6100, 4570, 3050, 1510 kDa, Std = SelectHA HiLadder/SelectHA LoLadder (Hyalose LLC) com bandas da parte superior para a parte inferior: 1510, 1090, 966, 572, 495, 310, 214, 110, 27 kDa (kDa = 1.000 Da; MDa = 1.000 kDa).

EXEMPLO 5

[00115] Produção de heparosan com peso molecular em mega-Dáltons em E. coli BL21 Express Iq. E. coli BL21Express Iq (NEB) foi transformada com pMAL- C4e/otimizado para o gene PmHS1, um plasmídeo de expressão que produz uma proteína de fusão de MBP-PmHS1. As culturas dos transformantes foram induzidas com IPTG e então crescidas durante toda a noite em meio sintético. O meio de cultura foi então clarificado por centrifugação e o polímero de heparosan foi concentrado por precipitação com etanol. A identidade do polímero de heparosan foi confirmada através da digestão do polímero (START) com heparina liase III (+LYASE). A análise em gel de agarose (1X TAE, detecção com Stains-All) mostrada na Figura 4 demonstrou que a construção do gene PmHS1 otimizado para o gene recombinante produzido por plasmídeo (que codifica PmHS partindo de P. multocida Tipo D) em E. coli BL21 Express Iq produzia um polímero de heparosan com PM muito alto (~2 até 6,8 MDa; banda marcada com um colchete). Mega = SelectHA MegaLadder (Hyalose LLC) com bandas da parte superior para a parte inferior: 6100, 4570, 3050, 1510 kDa.

EXEMPLO 6

[00116]Efeito da deleção da produção de heparosan em E. coli K5 sobre a produção de heparosan com peso molecular em mega-Dáltons. Os genes kfiA, kfiB e kfiC em E. coli K5 foram deletados e a cepa resultante (K5-) não produz mais a heparosan de 50-80 kDa usualmente produzida por K5. A cepa K5- foi transformada com pKK223-3/otimizado para o gene PmHS1 (P) ou pMAL-C4e/otimizado para o gene PmHS1 (M). As culturas dos transformantes foram induzidas com IPTG e então crescidas durante toda a noite em LB. O meio de cultura foi então clarificado por centrifugação e o polímero de heparosan foi concentrado por precipitação com etanol. A identidade do polímero de heparosan foi confirmada através da digestão com a heparina liase III (+LYASE). A análise em gel de agarose (1X TAE, detecção com Stains-All) mostrada na Figura 5 demonstrou que a construção do gene PmHS1 otimizado para o gene recombinante produzido por plasmídeo partindo de P. multocida Tipo D, expressa em E. coli K5 sem os genes kfiA, kfiB ou kfiC, produzia um polímero de heparosan com PM muito alto (~2 MDa; banda marcada com um colchete). Std = SelectHA MegaLadder/SelectHA HiLadder/SelectHA LoLadder (Hyalose LLC) com bandas da parte superior para a parte inferior: 6100, 4570, 3050, 1510, 1090, 966, 572, 495, 310, 214, 110, 27 kDa (kDa = 1.000 Da; MDa = 1.000 kDa).

[00117]Assim, os genes kfiA, kfiB e kfiC não estão envolvidos na produção de heparosan com PM ultra alto em E. coli K5.

[00118]Embora o(s) conceito(s) anterior(es) da invenção tenha(m) sido descrito(s) em detalhes com a finalidade de ilustração e exemplo para as finalidades de clareza do entendimento, será óbvio para os peritos na arte que certas alterações e modificações podem ser praticadas sem se afastar do espírito e âmbito do(s) mesmo(s), como descrito neste relatório descritivo e como definido nas reivindicações em anexo a seguir.

REFERÊNCIAS

[00119]As referências a seguir, até a extensão que forneçam exemplos de procedimentos ou outros detalhes suplementares aqueles apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui como referência em sua totalidade ainda que apresentadas em particular. 1 .Burg, K. J., Porter, S. e Kellam, J. F. (2000) Biomaterial developments for bone tissue engineering Biomaterials 21, 2347-2359 2 .Luo, Y., Kirker, K. R. e Prestwich, G. D. (2000) Cross-linked hyaluronic acid hydrogel films: new biomaterials for drug delivery J Control Release 69, 169-184 3 .Morra, M. (2005) Engineering of biomaterials surfaces by hyaluronan Biomacromolecules 6, 1205-1223 4 .Olivier, V., Faucheux, N. e Hardouin, P. (2004) Biomaterial challenges and approaches to stem cell use in bone reconstructive surgery Drug Discov Today 9, 803-811 5 .Johl, S. S. e Burgett, R. A. (2006) Dermal filler agents: a practical review Curr Opin Ophthalmol 17, 471-479 6 .Eppley, B. L. e Dadvand, B. 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Claims (40)

1. Método para a produção de forma recombinante de um polímero de heparosan com alto peso molecular CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende as etapas de: cultivar uma célula hospedeira recombinante que contém uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo atividade de heparosan sintase sob condições apropriadas para a expressão da heparosan sintase, em que pelo menos um dentre: (a) o polipeptídeo definido pela sequência de aminoácidos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 2, 4 e 6 a 8; (c) o polipeptídeo é codificado pela sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 9 a 11; e isolar o polímero de heparosan produzido pela heparosan sintase e em que o polímero de heparosan isolado é representado pela estrutura (-GlcUA-beta1,4- GlcNAc-alfa-1,4-)n, em que n é um número inteiro positivo maior que ou igual a 2.000.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero de heparosan isolado é ainda definido como tendo um valor para n em uma faixa de 2.000 até 17.000.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante compreende ainda pelo menos um gene que codifica uma enzima para a síntese de um precursor de açúcar heparosan, em que o pelo menos um gene que codifica uma enzima para a síntese de um precursor de açúcar heparosan é selecionado dentre o grupo que consiste em uma pirofosforilase, uma transferase, uma mutase, uma desidrogenase, e uma epimerase, capaz de produzir UDP-GlcNAc ou UDP-GlcUA.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de reticular o polímero de heparosan isolado.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de ligar de forma covalente e/ou de forma não covalente o polímero de heparosan isolado a pelo menos uma porção de uma superfície de um substrato.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato é selecionado dentre o grupo que consiste em sílica, silício, semicondutores, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais e combinações dos mesmos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção do substrato é um metal selecionado dentre o grupo que consiste em ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula hospedeira recombinante de E. coli.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante tem UDP-açúcar e em que a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo heparosan sintase é uma sequência de nucleotídeos heteróloga que codifica uma heparosan sintase de Pasteurella.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante compreende ainda pelo menos um gene que codifica um precursor de açúcar heparosan selecionado dentre o grupo que consiste em uma pirofosforilase, uma transferase, uma mutase, uma desidrogenase e uma epimerase.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de reticular o polímero de heparosan isolado.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda a etapa de ligar de forma covalente e/ou de forma não covalente o polímero de heparosan isolado a pelo menos uma porção de uma superfície de um substrato.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato é selecionado dentre o grupo que consiste em sílica, silício, semicondutores, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais e combinações dos mesmos.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção do substrato é um metal selecionado dentre o grupo que consiste em ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula hospedeira recombinante de E. coli.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero de heparosan isolado é ainda definido como tendo um valor para n em uma faixa de 2.000 até 17.000.

17. Uso de um polímero de heparosan isolado que é representado pela estrutura (-GlcUA-beta1,4-GlcNAc-alfa-1,4-)n, em que n é um número inteiro positivo maior que ou igual a 2.000 e em que o polímero de heparosan isolado é produzido pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de uma composição de material biológico para aumento de tecido em um paciente mamífero.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico está em um estado de gel, semissólido, líquido e/ou particulado.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico é formulada para implante e/ou injeção no paciente mamífero.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que n é um número inteiro positivo maior que 2.000.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero de heparosan isolado é definido ainda como tendo um valor para n em uma faixa de 2.000 até 17.000.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero de heparosan isolado da composição de material biológico é recombinantemente produzido.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico está em um estado de gel, semissólido, líquido, e/ou particulado.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico compreende ainda um substrato e em que o polímero de heparosan isolado é ligado de forma covalente e/ou de forma não covalente ao substrato.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato é selecionado dentre o grupo que consiste em sílica, silício, semicondutores, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais e combinações dos mesmos.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma porção do substrato é um metal selecionado dentre o grupo que consiste em ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico é formulada para implante no paciente mamífero.

28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de material biológico é formulada para injeção no paciente mamífero.

29. Polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo tendo atividade de heparosan sintase CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo tem a sequência de nucleotídeos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 9 a 11.

30. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do gene foi otimizada para expressão em uma célula hospedeira de E. coli.

31. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do gene foi otimizada para expressão em uma célula hospedeira de E. coli K5.

32. Composição de material biológico CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende: um polímero de heparosan isolado produzido pelo método, como definido na reivindicação 1, em que o polímero de heparosan isolado é representado pela estrutura (-GlcUA-beta1,4-GlcNAc-alfa-1,4-)n, em que n é um número inteiro positivo maior que ou igual a 2.000.

33. Composição de material biológico, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que n está em uma faixa de 2.000 até 17.000.

34. Composição de material biológico, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o polímero de heparosan é linear.

35. Composição de material biológico, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o polímero de heparosan é reticulado.

36. Composição de material biológico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, CARACTERIZADA pelo fato de que é definida ainda como estando em um estado de gel, semissólido e/ou particulado e em que a composição de material biológico é definida ainda como sendo uma composição de material biológico implantável.

37. Composição de material biológico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, CARACTERIZADA pelo fato de que é definida ainda como sendo uma composição de material biológico líquida e em que a composição de material biológico é definida ainda como sendo uma composição de material biológico injetável.

38. Composição de material biológico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um substrato ao qual o polímero de heparosan isolado é ligado de forma covalente e/ou de forma não covalente.

39. Composição de material biológico, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que o substrato é selecionado dentre o grupo que consiste em sílica, silício, semicondutores, vidro, polímeros, nanotubos, nanopartículas, compostos orgânicos, compostos inorgânicos, metais, e combinações dos mesmos.

40. Composição de material biológico, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos uma porção do substrato é um metal selecionado dentre o grupo que consiste em ouro, cobre, aço inoxidável, níquel, alumínio, titânio, ligas termossensíveis e combinações dos mesmos.

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