BR112013028169B1 - Formulação farmacêutica líquida estável compreendendo um anticorpo anti-alfa4ss7 e artigo manufaturado - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA LÍQUIDA ESTÁVEL E SEU USO, USO DE UMA MISTURA DE UM ANTICORPO ANTI-A4B7, UM ANTIOXIDANTE OU QUELANTE E PELO MENOS UM AMINOÁCIDO LIVRE E ARTIGO MANUFATURADO. Formulações de anticorpo são descritas compreendendo uma mistura de um anticorpo anti-alfa4beta7, um antioxidante ou quelante e pelo menos um aminoácido livre. As formulações reveladas podem ter estabilidade melhorada, formação de agregado reduzida ou ambas. A presente invenção ainda fornece um regime de dosagem seguro destas formulações de anticorpo que é fácil de seguir e que resulta em uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-alfa4beta7 in vivo.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade do pedido provisório US 61/544.054, depositado em 6 de outubro de 2011, e pedido provisório US 61/481.522, depositado em 2 de maio de 2011. O conteúdo completo dos pedidos anteriores é incorporado aqui para referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada em formato ASCII via EFS-Web e está incorporado por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 30 de abril de 2012, é nomeada 92596603.txt e é de 16.986 bytes de tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Avanços em biotecnologia têm tornado possível para produzir uma variedade de proteínas para aplicações farmacêuticas usando técnicas de DNA recombinante. Devido ao fato de que proteínas são maiores e mais complexas do que drogas tradicionais orgânicas e inorgânicas (ou seja, que possuem vários grupos funcionais além de estruturas complexas tridimensionais), a formulação de ditas proteínas possui problemas especiais. Para uma proteína permanecer biologicamente ativa, uma formulação deve preservar a integridade conformacional de pelo menos uma sequência central dos aminoácidos da proteína, enquanto ao mesmo tempo protege os vários grupos funcionais da proteína de degradação. As proteínas podem sofrer de uma falta de estabilidade e anticorpos monoclonais e policlonais, em particular, podem ser relativamente instáveis (Ver, por exemplo, Wang et al., J. Pharm Sci. 96:1-26 (2007)). Um grande número de opções de formulação está disponível e nenhuma abordagem ou sistema está disponível para todas as proteínas. Vários fatores a serem considerados foram relatados (Ver, por exemplo, Wang et al.).

[004] Inúmeras características podem afetar a estabilidade de uma proteína. De fato, mesmo no caso de anticorpos purificados, as estruturas de anticorpos podem ser heterogêneas o que ainda complica a formulação de ditos sistemas. Além disso, os excipientes incluídos em formulações de anticorpo preferencialmente minimizam qualquer resposta imune potencial.

[005] No caso de anticorpos, a preservação da integridade conformacional é ainda mais importante. As vias de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (ou seja, qualquer processo que envolve modificação da proteína por formação de ligação ou clivagem resultando em uma entidade química nova) ou instabilidade física (ou seja, alterações na estrutura de ordem superior da proteína). A instabilidade química é manifestada em, por exemplo, deamidação, isomerização, hidrólise, oxidação, fragmentação, eliminação de beta glicano ou troca de dissulfeto. A instabilidade química pode resultar de desnaturação, agregação, precipitação ou adsorção, por exemplo. As quatro vias de degradação de proteína mais comuns são fragmentação de proteína, agregação, deamidação e oxidação. Consequências de instabilidade química ou física de proteína terapêutica incluem uma redução da dose efetiva administrada, segurança reduzida da terapia devido a, por exemplo, irritação ou reatividade imunológica e, mais frequente, fabricação devido à meia-vida curta.

[006] Várias publicações revelaram geralmente vários métodos para tratar doenças intestinais inflamatórias e forneceram esquemas de dosagem para administração de agentes projetados para tratar doença intestinal inflamatória. Por exemplo, WO 96/24673 revela adressinas vasculares de mucosa e tratamento de doenças associadas com recrutamento de leucócitos para o trato gastrointestinal como um resultado de ligação de leucócito às células que expressam MAdCAM. US 2005/0095238 descreve métodos para tratar uma doença associada com infiltração de leucócito de tecido de mucosa e administração a um humano uma quantidade efetiva de uma imunoglobulina humana ou humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno contendo especificidade de ligação para α4β7 integrina. US 2005/0095238 ainda descreve várias doses (por exemplo, 0,15, cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5 ou cerca de 2,0 mg de imunoglobulina ou fragmento por kg de peso corporal) e vários intervalos entre doses (7, 14, 21, 28, ou 30 dias). No entanto, as patentes e publicações acima mencionados não revelam as formulações específicas do anticorpo anti-α4β7 ou as doses específicas e regimes de dose e reivindicados aqui. De modo importante, as patentes acima mencionadas não revelam formulações, doses, e regimes de dose que fornecem os métodos de tratamento (suportado por dados de estudos clínicos) descritos e reivindicados aqui.

[007] As formulações de anticorpo da presente invenção podem ser úteis para inibir ligação ao leucócito às células que expressam MAdCAM e, portanto, auxilia no tratamento de doenças intestinais inflamatórios em pacientes. Há, assim, uma necessidade urgente para descobrir dosagens e esquemas de doses apropriadas destes compostos, e para desenvolver formulações, preferencialmente, formulações subcutâneas, que geram níveis sanguíneos estáveis, terapeuticamente efetivos das formulações de anticorpo por um período de tempo estendido em uma forma estável e conveniente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção se refere à identificação de um antioxidante ou quelante e, pelo menos um aminoácido, como excipientes uteis para formular formulações de anticorpo anti-α4β7 cuja instabilidade os torna susceptíveis a deamidação, oxidação, isomerização e/ou agregação. A formulação melhora a estabilidade, reduz a formação de agregados e retarda a degradação do anticorpo na mesma.

[009] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida compreendendo uma mistura de um anticorpo anti-α4β7, um antioxidante ou quelante e pelo menos um aminoácido livre.

[010] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica líquida estável tem pelo menos cerca de 1,0% formação de agregado após 12 meses em temperatura ambiente. A formulação farmacêutica líquida estável pode ter menos do que cerca de 0,2% formação de agregado após 12 meses em temperatura ambiente.

[011] Em algumas modalidades, o antioxidante ou quelante é citrato. Em algumas modalidades o quelante é EDTA.

[012] Em algumas modalidades, o aminoácido livre da formulação é histidina, alanina, arginina, glicina, ácido glutâmico, ou qualquer combinação dos mesmos. A formulação pode compreender entre cerca de 50 mM a cerca de 175 mM do aminoácido livre. A formulação pode compreender entre cerca de 100 mM e cerca de 175 mM do aminoácido livre. A razão molar de aminoácido livre para razão molar de anticorpo ser pelo menos 250:1.

[013] A formulação pode ainda conter um surfactante. O surfactante pode ser polissorbato 20, polissorbato 80, um poloxâmero, ou qualquer combinação dos mesmos.

[014] Em algumas modalidades, a razão molar do antioxidante ao surfactante é cerca de 3:1 a cerca de 156:1.

[015] A formulação pode ter um pH entre cerca de 6,3 e cerca de 7,0. O pH da formulação pode estar entre cerca de 6,5 e cerca de 6,8. A formulação pode ter um pH entre cerca de 6,1 e cerca de 7,0, ou entre cerca de 6,2 e 6,8.

[016] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica líquida estável contém pelo menos cerca de 60 mg/ml a cerca de 160 mg/ml anticorpo anti-α4β7. A formulação pode conter pelo menos cerca de 160 mg/ml anticorpo anti-α4β7. A formulação pode conter cerca de 150 a cerca de 180 mg/ml anticorpo ou cerca de 165 mg/ml anticorpo.

[017] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida estável compreendendo pelo menos cerca de 60 mg/ml a cerca de 160 mg/ml anticorpo anti-α4β7, um agente tamponante e citrato pelo menos cerca de 10 mM. O agente tamponante pode ser um tampão de histidina.

[018] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida estável compreendendo pelo menos cerca de 60 mg/ml a cerca de 180 mg/ml anticorpo anti-α4β7, um agente tamponante e citrato pelo menos cerca de 5 mM. O agente tamponante pode ser um tampão de histidina.

[019] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida estável compreendendo pelo menos cerca de 160 mg/ml anticorpo anti-α4β7 e citrato pelo menos cerca de 10 mM. A formulação pode ainda conter polissorbato 80.

[020] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida estável compreendendo cerca de 160 mg/ml anticorpo anti-α4β7 e citrato pelo menos cerca de 5 mM. A formulação pode ainda conter polissorbato 80.

[021] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma formulação farmacêutica líquida estável compreendendo uma mistura de anticorpo anti-α4β7, citrato, histidina, arginina e polissorbato 80. A formulação pode estar presente em um recipiente, como um frasco, cartucho, seringa ou autoinjetor.

[022] O anticorpo anti-α4β7 na formulação farmacêutica líquida estável da invenção pode ser vedolizumabe. A formulação da invenção pode ser para administração subcutânea, intravenosa ou intramuscular.

[023] Em alguns aspectos, a formulação pode minimizar imunogenicidade do anticorpo anti-α4β7.

[024] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar doença intestinal inflamatória, compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo a formulação farmacêutica líquida estável descrita aqui. A administração pode ser administração subcutânea. A administração pode ser autoadministração.

[025] Ainda em outro aspecto, a invenção refere-se a um artigo de fabricação, compreendendo um recipiente, uma formulação farmacêutica líquida estável descrita aqui, e instruções para seu uso.

[026] Em um aspecto, a invenção refere-se à um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória, em que o método compreende a etapa de administração a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) doses iniciais, por exemplo, em um regime de tratamento de fase de indução, de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea dia sim dia não por seis doses; (b) seguidas na semana seis por uma sétima e subsequente doses, por exemplo, em um regime de tratamento de fase de manutenção, de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea a cada duas semanas ou a cada quatro semanas conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[027] Em um aspecto, a invenção refere-se à um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória, em que o método compreende a etapa de administração a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem compreendendo uma fase de indução de doses intravenosas e uma fase de manutenção de doses subcutâneas: (a) uma dose intravenosa inicial de 300 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma infusão intravenosa; (b) seguidas por uma segunda dose subsequente intravenosa de 300 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma infusão intravenosa cerca de duas semanas após a dose inicial; (c) seguidas começando na semana seis por uma terceira e subsequente doses de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea a cada semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou a cada quatro semanas conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[028] Em outro aspecto, a invenção se refere a um regime de dosagem para o tratamento terapêutico da doença intestinal inflamatória, em que o regime de dosagem compreende a etapa de: administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrado ao paciente de acordo com um regime de dosagem subcutânea ou intramuscular que mantém uma concentração sérica média no estado de equilíbrio da imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de cerca de 9 a cerca de 13 μg/mL; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[029] Em outro aspecto, a invenção se refere a um regime de dosagem para o tratamento terapêutico da doença intestinal inflamatória, em que o regime de dosagem compreende a etapa de: administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com um regime de dosagem subcutânea ou intramuscular que mantém uma concentração sérica média no estado de equilíbrio de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma de cerca de 35 a cerca de 40 μg/mL; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[030] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória, em que o método compreende a etapa de: administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) uma pluralidade de doses de fase de indução de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma suficiente para atingir uma concentração sérica média significativa de cerca de 20 a cerca de 30 μg/mL de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma por cerca de seis semanas da dosagem inicial; (b) seguidas por uma pluralidade de doses de fase de manutenção de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma conforme necessário para manter uma concentração sérica média no estado de equilíbrio de cerca de 9 a cerca de 13 μg/mL ou cerca de 35 a 40 μg/mL da imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO:11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO:13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO:8, CDR2 SEQ ID NO:9, CDR3 SEQ ID NO:10.

[031] Em alguns aspectos, a formulação, método de tratamento, dose e/ou regime de doses garante probabilidade mínima de que um paciente irá desenvolver anticorpos reativos ao anticorpo anti-α4β7.

[032] O paciente pode ter tido uma ausência de resposta adequada com, perda de resposta a ou foi intolerante ao tratamento com pelo menos um de um imunomodulador, um antagonista de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) ou combinações dos mesmos.

[033] A doença intestinal inflamatória pode ser uma doença de Crohn ou colite ulcerativa. A doença intestinal inflamatória pode ser moderada para colite ulcerativa gravemente ativa.

[034] O regime de dosagem pode resultar em cura de mucosa em pacientes que sofrem de colite ulcerativa moderada a gravemente ativa.

[035] O paciente pode ter recebido tratamento anteriormente com pelo menos um corticosteroide para a doença intestinal inflamatória. O paciente pode concomitantemente receber tratamento com pelo menos um corticosteroide para a doença intestinal inflamatória. O regime de dosagem pode resultar em uma redução, eliminação ou redução e eliminação de uso de corticosteroide pelo paciente.

[036] Em alguns aspectos, a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada em uma forma de dosagem final em uma concentração de entre cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml. A imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma pode ser administrada em uma forma de dosagem final de cerca de 1,2 mg/ml.

[037] Em alguns aspectos, a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno é administrada em uma forma de dosagem final contendo uma quantidade de anticorpo anti-α4β7 entre cerca de 70 a cerca de 250 mg, entre cerca de 90 a cerca de 200 mg, entre cerca de 150 a cerca de 180 mg, ou pelo menos 160 mg.

[038] Em alguns aspectos, o regime de dosagem não altera a razão de CD4 para CD8 no fluido cerebroespinal de pacientes recebendo o dito tratamento.

[039] O paciente pode ser uma pessoa de 65 anos de idade ou mais velho e não requer qualquer ajuste do regime de dose.

[040] Em alguns aspectos o método de tratamento com formulação de anticorpo anti-α4β7, a dose, ou o regime de doses pode minimizar imunogenicidade do anticorpo anti-α4β7.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[041] A FIG. 1 é uma ilustração de uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:1) que codifica a cadeia pesada de uma imunoglobulina anti-α4β7 humanizada, e a sequência de aminoácido deduzida da cadeia pesada (SEQ ID NO:2). A sequência de nucleotídeo contém sítios de clonagem (caixa baixa), sequência de Kozak (caixa alta, nucleotídeos 18-23 de SEQ ID NO:1) e sequência líder (caixa baixa, nucleotídeos 24-86 de SEQ ID NO:1) na extremidade 5' da cadeia pesada. A região de leitura aberta da sequência de nucleotídeo são nucleotídeos 24-1433 de SEQ ID NO:1.

[042] A FIG. 2 é uma ilustração de uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:3) que codifica a cadeia leve de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como vedolizumabe, e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO: 4) da cadeia leve. A sequência de nucleotídeo contém sítios de clonagem (caixa baixa), sequência Kozak (caixa alta, nucleotídeos 18-23 da SEQ ID NO:3) e sequência líder (caixa baixa, nucleotídeos 24-80 da SEQ ID NO:3) na extremidade 5' da cadeia pesada. A região de leitura aberta da sequência de nucleotídeo são nucleotídeos 24-737 da SEQ ID NO:3.

[043] A FIG. 3 é um alinhamento das sequências de aminoácidos de (A) a cadeia leve humanizada madura (aminoácidos 20-238 da SEQ ID NO:4) de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como vedolizumabe e (B) a cadeia leve humanizada madura de uma imunoglobulina humanizada referenciada aqui como LDP-02 (SEQ ID NO:5). (Com relação a LDP-02, ver, WO 98/06248 e Feagan et al., N. Eng. J. Med. 352:2499-2507 (2005)). Feagan et al. descreve um estudo clínico de LDP-02, mas no artigo referem-se a LDP-02 como MLN02.) O alinhamento ilustra que as sequências de aminoácido das cadeias leves de vedolizumabe e LDP-02 diferem em posições 114 e 115 das cadeias leves maduras.

[044] A FIG. 4 é um alinhamento de sequências de aminoácidos de (A) uma região constante de cadeia leve capa humana genérica (SEQ ID NO:6) e (B) uma região constante de cadeia leve capa murina genérica (SEQ ID NO:7). Os resíduos de aminoácido Thr e Val (que estão presentes nas posições 114 e 115 da cadeia leve vedolizumabe madura (aminoácidos 133 e 134 da SEQ ID NO:4)) estão presentes na região constante da cadeia leve capa humana, enquanto que os resíduos de aminoácido Ala e Asp (que estão presentes nas posições 114 e 115 da cadeia leve LDP-02 madura (SEQ ID NO:5)) estão presentes na região constante da cadeia leve capa de camundongo.

[045] A FIG. 5 é um mapa de vetor pLKTOK38D (ainda referenciado como pTOK38MLN02-TV), que codifica a cadeia pesada humanizada e a cadeia leve humanizada de MLN02, e é apropriado para produzir em células CHO. (Ver, publicação de pedido de patente US 2004/0033561 A1 que revela pLKTOK38. pLKTOK38D é uma variante de pLKTOK38 em que os sítios de restrição no mapa flanqueiam a sequência que codifica a região variável de cadeia leve.)

[046] A FIG. 6 mostra a inclinação de formação de agregados SEC (% por dia) como um resultado de alterações à concentração da proteína, pH e razão molar surfactante:proteína. Em uma faixa de pH de 6,0 a 6,5, a formação de agregados foi semelhante para a formulação com a razão molar de polissorbato 80:proteína de 0,7 a 1,5.

[047] A FIG. 7 é um gráfico que mostra que nas proporções molares de polissorbato 80:proteína maiores do que 1,5, a taxa de formação de agregado aumenta conforme aumenta o pH.

[048] A FIG. 8 é um gráfico que mostra o efeito dos excipientes na formação de agregados. Citrato 25mM, citrato 5 mM, EDTA 5 mM, cisteína 25 mM ou cisteína 5 mM foram adicionado às formulações. Todos os três excipientes reduziram a formação de agregados.

[049] A FIG. 9 é um conjunto de gráficos que mostra a redução na formação de agregado com a presença de citrato 25 mM na formulação e uma correlação entre concentração aumentada de proteína e taxa aumentada de formação de agregado.

[050] A FIG. 10 é um gráfico mostrando os resultados da degradação de espécie CEX a 40°C. Os dados mostram a influência de alteração de pH em degradação de CEX.

[051] A FIG. 11 é um gráfico que mostra o efeito de temperatura no pH das formulações. O pH das formulações contendo histidina diminui com a temperatura, enquanto o pH de formulações de citrato não é afetado pela temperatura.

[052] A FIG. 12 é um gráfico que mostra o percentual de isoforma principal CEX por um período de dozes meses. As formulações tendo um pH de 6,0-6,2 mostraram cerca de 1-2% menos isoforma principal do que as formulações tendo um pH de 6,3-6,4.

[053] A FIG. 13 mostra um conjunto de gráficos que demonstra que a viscosidade é afetada principalmente por concentração de proteína e pH. Adições de sacarose, histidina e arginina demonstraram ter um efeito menor na viscosidade da formulação.

[054] A FIG. 14 mostra as sequências de aminoácido de (A) região variável de cadeia leve capa de anticorpo GM607’CL maduro humano e (B) região variável de cadeia pesada de 21/28’CL humana.

[055] A FIG. 15 mostra componentes de um produto de proteína em uma seringa preenchida.

[056] As FIGS. 16A-B mostram o efeito de (A) concentração de proteína e (B) viscosidade da força de injeção de várias seringas testadas.

[057] A FIG. 17 (A) mostra a força de deslizamento inicial em função da concentração de proteína e do tamanho da agulha. A FIG. 17 (B) mostra a força de deslizamento inicial para cada fabricante de seringa e tamanho de agulha.

[058] A FIG. 18 mostra o perfil de absorção de vedolizumabe. O gráfico mostra que concentrações de doses intramusculares e subcutâneas geralmente se sobrepõem. Não há diferenças grossas aparentes nos perfis de absorção destas vias de administração.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[059] A invenção refere-se à uma formulação farmacêutica compreendendo anticorpos anti-α4β7. A formulação farmacêutica pode ser uma mistura compreendendo um antioxidante ou quelante (por exemplo, citrato), anticorpo anti-α4β7 e um aminoácido livre. A formulação farmacêutica pode estar em uma forma sólida ou líquida.

Definições

[060] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que contém um anticorpo anti-α4β7 de tal forma como permite que a atividade biológica seja efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos a um sujeito ao qual a formulação poderia ser administrada.

[061] Uma formulação “estável” é uma na qual o anticorpo nesta substancialmente retém sua estabilidade física e/ou sua estabilidade química e/ou sua atividade biológica no armazenamento. Em um aspecto, a formulação substancialmente retém sua estabilidade física e química, bem como sua atividade biológica no armazenamento. O período de armazenamento é geralmente selecionado com base na vida útil da formulação. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade de proteína estão disponíveis na técnica e são revisadas, por exemplo, em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) e Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado. Por exemplo, a formulação líquida é estável a cerca de 40°C por pelo menos cerca de 3 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ou 6 semanas. Em outro aspecto, a formulação liofilizada é estável em cerca de 40°C por pelo menos cerca de 2-4 semanas, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, ou pelo menos cerca de 18 meses. A formulação líquida e/ou liofilizada em outro aspecto é estável em cerca de 5°C e/ou 25°C por pelo menos cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses, pelo menos cerca de 24 meses, pelo menos cerca de 30 meses, ou pelo menos cerca de 36 meses; e/ou estavam em cerca de - 20°C e/ou -70°C por pelo menos cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses, pelo menos cerca de 24 meses, pelo menos cerca de 30 meses, pelo menos cerca de 36 meses, pelo menos cerca de 42 meses, ou pelo menos cerca de 48 meses. Além disso, a formulação líquida pode, em algumas modalidades, ser estável após congelamento (a, por exemplo, -80°C) e descongelamento, por exemplo, após 1, 2 ou 3 ciclos de congelamento e descongelamento.

[062] A estabilidade de uma formulação líquida pode ser avaliada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de diferentes formas, incluindo avaliação de dímero, multímero e/ou formação de agregado (por exemplo, usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), espectrometria de massa em ionização por desorção a laser em tempo de voo assistida por matriz (MALDI-TOF MS), ultracentrifugação analítica, espalhamento de luz (espectroscopia de correlação de fóton, espalhamento de luz dinâmico (DLS), dispersão de luz estática, dispersão de luz de laser multiângulo (MALLS)), imagem microscópica a base de fluxo, contagem de impedância eletrônica (coulter), obscurecimento de luz em outro sistema de contagem de partículas líquidas, por medição de turbidez, e/ou por inspeção visual); por avaliação de heterogeneidade de carga usando cromatografia de troca catiônica (CEX), focagem isoelétrica (IEF), por exemplo, técnica capilar (cIEF), ou eletroforese de zona capilar; análise de sequência amino-terminal ou carboxi-terminal; análise por espectrometria de massa; análise de SDS-PAGE ou SEC para comparar anticorpo fragmentado, intacto e multimérico (ou seja, dimérico, trimérico, etc.); análise de mapa de peptídeo (por exemplo, tríptico ou LYS-C); avaliação de atividade biológica ou função de ligação ao antígeno; e semelhantes. A estabilidade de uma formulação no estado sólido pode ainda ser avaliada qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de diferentes formas, incluindo testes diretos, como identificação de estrutura cristalina por difração em pó de raios-X (XRPD); avaliando a estrutura do anticorpo no estado sólido usando Espectroscopia em Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR); e medindo as transições térmicas no sólido liofilizado (fusão, transição vítrea, etc.) usando calorimetria por varredura diferencial (DSC) e testes indiretos como medição do teor de umidade por teste de Karl Fisher, por exemplo, para extrapolar a probabilidade de instabilidade química através de hidrólise. A instabilidade pode envolver qualquer um ou mais de: agregação (por exemplo, agregação solúvel não covalente, agregação solúvel covalente (por exemplo, rearranjo/embaralhamento de ligação de dissulfeto), agregação insolúvel), deamidação (por exemplo, deamidação Asn), oxidação (por exemplo, oxidação Met), isomerização (por exemplo, isomerização Asp), corte/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação da região em dobradiça), formação de succinimida, extensão N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, e semelhantes.

[063] Um anticorpo monoclonal “deamidado” é um em que um ou mais resíduos de asparagina ou glutamina do mesmo foi derivado, por exemplo, a um ácido aspártico ou um ácido isoaspártico.

[064] Um anticorpo que é “suscetível a deamidação” é um compreendendo um ou mais resíduos que demonstraram ser tendentes a deamidar.

[065] Um anticorpo que é “suscetível a oxidação” é um anticorpo compreendendo um ou mais resíduos que demonstraram ser tendentes à oxidação.

[066] Um anticorpo que é “suscetível à agregação” é um que demonstrou agregar com outras moléculas de anticorpo, especialmente no congelamento, aquecimento, secagem, reconstituição e/ou agitação.

[067] Um anticorpo que é “suscetível a fragmentação” é um que demonstrou ser clivado em dois ou mais fragmentos, por exemplo, em uma região em dobradiça do mesmo.

[068] Por “reduzir deamidação, oxidação, agregação, ou fragmentação” pretende significar prevenir ou reduzir (por exemplo, a 80%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de) a quantidade de deamidação, agregação, ou fragmentação em relação ao anticorpo monoclonal formulado em um diferente pH ou em um diferente tampão.

[069] Um “agregado”, “agregado SEC”, ou “agregado solúvel” é mais do que um e menos do que ou igual a dez proteínas de anticorpo e/ou fragmentos associados juntos por interações covalentes, iônicas ou hidrofóbicas para formar um corpo proteico maior.

[070] Um “agregado insolúvel” ou “partícula” é maior do que dez proteínas de anticorpo e/ou fragmentos associados por interações covalentes, iônicas ou hidrofóbicas para formar um corpo proteico maior.

[071] Como usado aqui, “atividade biológica” de um anticorpo monoclonal refere-se à capacidade do anticorpo em se ligar ao antígeno e resulta em uma resposta biológica mensurável que pode ser medido in vitro ou in vivo. Dita atividade pode ser antagonista ou agonista.

[072] A molécula de superfície celular, “□ 4D7 integrina,” ou “□ 4Q7,” é um heterodímero de uma cadeia D4 (CD49D, ITGA4) e uma cadeia 7 (ITGB7). Cada cadeia pode formar um heterodímero com uma cadeia de integrina alternativa, para formar, por exemplo, 4 1 ou DEÜ7. Genes humanos CI4 e CI7 (GenBank (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) RefSeq números de acessão NM_000885 e NM_000889, respectivamente) são expressos por linfócitos B e T, particularmente linfócitos de memória CD4+. Típico de muitas integrinas, a^7 pode existir em um estado de repouso ou ativado. Ligantes para a^7 incluem molécula de adesão celular vascular (VCAM), fibronectina e adressina de mucosa (MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1)).

[073] Como usado aqui, uma imunoglobulina humana ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que tem “especificidade de ligação para o complexo α4β7” se liga ao α4β7, mas não ao α4β1 ou αEB7.

[074] Como usado aqui, uma formulação “isotônica” tem substancialmente a mesma pressão osmótica que sangue humano. As formulações isotônicas irão geralmente ter uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. A isotonicidade pode ser medida usando uma pressão de vapor ou osmômetro tipo congelamento, por exemplo.

[075] Como usado aqui, “agente tamponante” refere-se a um tampão que resiste a alterações em pH pela ação de seus componentes ácido-base conjugados. O agente tamponante pode estar presente em uma formulação líquida ou sólida da invenção.Em algumas modalidades, o agente tamponante desta invenção ajusta o pH da formulação a cerca de 5,0 a cerca de 7,5, a cerca de pH 5,5 a cerca de 7,5, a cerca de pH 6,0 a cerca de 7,0, ou a um pH de cerca de 6,3 a cerca de 6,5. Em um aspecto, exemplos de agentes de tamponamento que isolados ou em combinação, irão controlar o pH na faixa de 5,0 a 7,5 incluem acetato, succinato, gluconato, histidina, citrato, fosfato, maleato, cacodilato, ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico (MES), bis(2- hidroxietil)iminotris[hidroximetil]metano (Bis-Tris), ácido N-[2- acetamido]-2-iminodiacético (ADA), glicilglicina e outros tampões de ácidos orgânicos. Em outro aspecto, o agente tamponante aqui é histidina ou citrato.

[076] Um “tampão histidina” é um tampão compreendendo íons de histidina. Exemplos de tampões de histidina incluem soluções de cloreto de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina. O tampão de histidina ou tampão histidina-HCl tem um pH entre cerca de pH 5,5 a cerca de,7.0, entre cerca de pH 6,1 a cerca de 6.9, ou cerca de pH 6,5.

[077] Um “tampão citrato” é um tampão compreendendo íons citrato. Exemplos de tampões de citrato incluem soluções de citrato de sódio, citrato de amônio, citrato de cálcio, e citrato de potássio. O tampão de citrato tem um pH de cerca de 3,0 a 6,2, cerca de pH 5,5 a 6,5, cerca de pH 6,1 a cerca de 6,5, cerca de pH 6,1, cerca de pH 6,2, ou cerca de pH 6,5.

[078] Um “sacarídeo” aqui é um composto que tem uma fórmula geral (CH2O)n e derivados dos mesmos, incluindo monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, álcoois de açúcar, açúcares redutores, açúcares não redutores, e semelhantes. Exemplos de sacarídeos aqui incluem glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, rafinose, manotriose, estaquiose, maltose, lactulose, maltulose, glucitol, maltitol, lactitol, isomaltulose, e semelhantes. Um sacarídeo pode ser um lioprotetor. Em outro aspecto, o sacarídeo aqui é um dissacarídeo não redutor, como sacarose.

[079] Aqui, um “surfactante” refere-se a um agente que reduz a tensão superficial de um líquido. Em um aspecto, o surfactante é um surfactante não iônico. Exemplos de surfactantes aqui incluem polissorbato (polioxietileno sorbitano monolaurato, por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80); TRITON (t-Octilfenoxipolietoxietanol, detergente não iônico, Union Carbide subsidiária de Dow Chemical Co., Midland MI); dodecil sulfato de sódio (SDS); lauril sulfato de sódio; glicosídeo octil de sódio; laurel-, miristil-, linoleil-, ou estearil- sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, ou cetil-betaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-betaina (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-dimetilamina; cocoil metil de sódio, ou oleil-taurato metil dissódico; sorbitano monopalmitato; e a série MONAQUAT (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietil glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), e copolímeros de polixietileno e polixipropilene glicol (por exemplo, Pluronics/Polixamer, PF68 etc); etc. Em outro aspecto, o surfactante aqui é polissorbato 80.

[080] O termo “quelante” refere-se a uma gente que se liga a um átomo através de mais do que uma ligação. Em um aspecto, exemplos de quelantes aqui incluem citrato, ácido etilenodiaminatetracético, ácido etilenoglicoltetracético (EGTA), dimercaprol, ácido dietilenotriaminapentacético, e N,N-bis(carboximetil)glicina. Em outro aspecto, o quelante é citrato ou EDTA.

[081] O termo “antioxidante” se refere a um agente que inibe a oxidação de outras moléculas. Exemplos de antioxidantes aqui incluem citrato, ácido lipoico, ácido úrico, glutationa, tocoferol, caroteno, licopeno, cisteína, compostos fosfonatos, por exemplo, ácido etidrônico, desferoxamina e malato.

[082] O termo “anticorpo” aqui é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre os anticorpos monoclonais completos, imunoglobulinas, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados de pelo menos dois anticorpos de comprimento completo, por exemplo, cada um em um diferente antígeno ou epítopo, e fragmentos de ligação ao antígeno individual, incluindo dAbs, scFv, Fab, F(ab)'2, Fab', incluindo anticorpos humanos e humanizados de espécies não humanas e formas de ligação ao antígeno recombinante como monobodies e diabodies.

[083] Quantidades e razões molares de anticorpo anti-α4β7 para outros excipientes aqui descritos são calculadas assumindo um peso molécula aproximado de cerca de 150.000 daltons para o anticorpo. O peso molecular real do anticorpo pode diferir de 150.000 daltons, dependendo da composição de aminoácido ou modificação pós- tradução, por exemplo, como dependente da linhagem de célula usada para expressar o anticorpo. O peso molecular real do anticorpo pode ser +/- 5% de 150.000 daltons.

[084] O termo “anticorpo humano” inclui um anticorpo que possui uma sequência que é derivada de uma sequência de imunoglobulina germinativa humana, como um anticorpo derivado de camundongos transgênicos contendo genes de imunoglobulina humana (por exemplo, camundongos XENOMOUSE geneticamente modificados (Abgenix, Fremont, CA), HUMAB-MOUSE ®, camundongos transcromossômicos KIRIN TC MOUSE™, KMMOUSE® (MEDAREX, Princeton, NJ)), bibliotecas de phage display humanos, células de Mieloma humanas, ou células B humanas.

[085] O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis variantes que podem surgir durante a produção de anticorpo monoclonal, ditas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” indica a características do anticorpo sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser preparado por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” podem ainda ser isolados de bibliotecas de anticorpo phage usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.

[086] Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo particular ou, enquanto o restante das cadeias é idêntico com ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de ditos anticorpos, contanto que apresentem a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, Ape etc) e sequências de região constante humanas.

[087] “Fragmentos de ligação ao antígeno” de uma imunoglobulina humanizada preparados na formulação da invenção compreende pelo menos as regiões variáveis de cadeias pesadas e/ou leves de um anticorpo anti-α4β7. Por exemplo, um fragmento de ligação ao antígeno de vedolizumabe compreende resíduos de aminoácido 20-131 da sequência de cadeia leve humanizada de SEQ ID NO:4. Exemplos de ditos fragmentos de ligação ao antígeno incluem fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos scFv e F(ab')2 de uma imunoglobulina humanizada conhecida na técnica. Fragmentos de ligação ao antígeno de uma imunoglobulina humanizada da invenção podem ser produzidos por clivagem enzimática ou por técnicas recombinantes. Por exemplo, clivagem por papaína ou pepsina pode ser usada para gerar fragmentos Fab ou F(ab')2, respectivamente. Anticorpos podem ainda ser produzidos em uma variedade de formas truncadas usando genes de anticorpo em que um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um construto recombinante que codifica a cadeia pesada de um fragmento F(ab')2 pode ser desenhado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CHI e região em dobradiça da cadeia pesada. Em um aspecto, fragmentos de ligação ao antígeno inibem a ligação de uma α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, a adressina MAdCAM de mucosa (por exemplo, MAdCAM-1), fibronectina).

[088] A digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um sítio de ligação ao antígeno único, e um fragmento residual “Fc”, cujo nome reflete sua capacidade de prontamente cristalizar. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação e é ainda capaz de reticular com um antígeno.

[089] “Fv” é um fragmento de anticorpo que consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em associação não covalente.

[090] O fragmento Fab ainda contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carbóxi do domínio de cadeia pesada CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região em dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que os resíduos de cisteína dos domínios constantes que têm pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas em dobradiça entre estes. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são ainda conhecidos.

[091] “Fv de cadeia simples” ou fragmentos de anticorpo “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia única de polipeptídeo. Em um aspecto, o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permitem que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[092] O termo “diabodies” se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio de cadeia variável (VH) conectados a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Usando um ligante que é muito pequeno para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parearem com os domínios complementares de outra cadeia e criam dois sítios de ligação ao antígeno. Diabodies são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[093] Um “anticorpo completo” é aquele que compreende uma região variável de ligação ao antígeno bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variantes de sequência de aminoácido das mesmas. Em um aspecto, o anticorpo completo tem uma ou mais funções efetoras.

[094] Um anticorpo de “sequência variante de aminoácido” aqui é um anticorpo com uma sequência de aminoácido que difere do anticorpo da espécie principal. Ordinariamente, variantes de sequência de aminoácido irão possuir pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de homologia com o anticorpo da espécie principal. As variantes de sequência de aminoácido possuem substituições, deleções, e/ou adições em certas posições dentro ou adjacentes à sequência de aminoácido do anticorpo da espécie principal, mas retêm a atividade de ligação ao antígeno. As variações na sequência das regiões constantes do anticorpo irão ter menos efeito na atividade de ligação ao antígeno do que as variações nas regiões variáveis. Nas regiões variáveis, variantes de sequência de aminoácidos serão pelo menos cerca de 90% homólogas, pelo menos cerca de 95% homólogas, pelo menos cerca de 97% homólogas, pelo menos cerca de 98% homólogas, ou pelo menos cerca de 99% homólogas com o anticorpo da espécie principal.

[095] “Homologia” é definido como o percentual de resíduos na variante de sequência de aminoácidos que são idênticos após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para obter a homologia de percentual máximo. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica.

[096] Um “anticorpo monoclonal terapêutico” é um anticorpo usado para terapia de um sujeito humano. Anticorpos monoclonais terapêuticos revelados aqui incluem anticorpos anti-α4β7.

[097] Um anticorpo de “glicosilação variante” aqui é um anticorpo com uma ou mais frações de carboidratos ligadas a este que diferem de uma ou mais frações de carboidratos ligadas a um anticorpo da espécie principal. Exemplos de variantes de glicosilação aqui incluem anticorpo com uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2, ao invés de uma estrutura de oligossacarídeo G0, ligado a uma região Fc do mesmo, anticorpo com uma ou duas frações de carboidratos ligados a uma ou duas cadeias das mesmas, anticorpo sem carboidrato ligado a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, etc, e combinações de alterações de glicosilação.

[098] “Funções efetoras” de anticorpo referem-se àquelas atividades de anticorpo atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), e semelhantes.

[099] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos completos podem ser designados como de diferentes “classes”. Há cinco classes principais de anticorpos completos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e vários destes podem ser ainda divididos em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são chamados α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[100] As “cadeias leves” de anticorpos de qualquer espécie de vertebrados podem ser designadas como uma de dois tipos claramente distintos, chamados capa (K) e lambda (À), baseados nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.

[101] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” e “ADCC” referem-se à uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcYRIII, enquanto que monócitos expressam FcYRI, FcYRII e FcYRIII. Expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizado na tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio ADCC in vitro, como o descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337 podem ser realizados. Células efetoras úteis para ditos ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animai como o revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652656 (1998).

[102] Os termos “receptor Fc” ou “FcR” são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em um aspecto, o FcR é um FcR de sequência nativa humana. Em outro aspecto, o FcR é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FCYRI, FCYRII, e FCYRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas destes receptores. Receptores FCYRII incluem FCYRIIA (um “receptor de ativação”) e FCYRIIB (um “receptor de inibição”), que têm sequências semelhantes de aminoácidos que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em um imunoreceptor tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em um imunoreceptor tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (Ver, revisão em M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:33-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles identificados no futuro, são incluídos pelo termo “FcR” aqui. O termo ainda inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência dos IgGs maternais ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

[103] O termo “região hipervariável” quando usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação ao antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 5056 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma “alça hipervariável” (por exemplo, resíduos 2632 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). “Região estrutural” ou resíduos de “FR” são aqueles cujos resíduos de domínio variável além dos resíduos de região hipervariável são aqui definidos. A região hipervariável ou as CDRs das mesmas podem ser transferidas de uma cadeia de anticorpo a outra ou à outra proteína para conferir especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo resultante (compósito) ou proteína de ligação.

[104] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo do receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo do doador) como camundongo, rato, coelho ou primata não humano contendo a especificidade desejada, afinidade e capacidade. Em alguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do receptor ou no anticorpo do doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças hipervariáveis correspondente àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente ainda irá compreender pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[105] Um anticorpo de “afinidade madura” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis das mesmas que resultam em uma melhora na afinidade do anticorpo ao antígeno, em comparação a um anticorpo parente que não possui aquelas alterações. Em um aspecto, anticorpos de afinidade maduros terão afinidades nanomolar ou ainda picomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por embaralhamento de domínio VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos estruturais é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[106] Um anticorpo “isolado” é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Em certas modalidades, o anticorpo será purificado (1) a mais do que 95% em peso de proteína como determinado pelo método de Lowry, e alternativamente, mais do que 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador em copo giratório, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE em condições redutoras ou não redutoras usando azul de Coomassie ou corante de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro da célula recombinante uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, no entanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[107] “Tratamento” refere-se a ambos tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que já estão doentes bem como aqueles em que a doença ou sua recorrência deve ser prevenida. Assim, o paciente a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticado como tendo a doença ou pode ser predisposto ou suscetível à doença. Os termos “paciente” e “sujeito” são usados de modo intercambiável aqui.

[108] O anticorpo que é formulado é substancialmente puro e desejavelmente substancialmente homogêneo (ou seja, isento de proteínas contaminantes, etc.). Anticorpo “substancialmente puro” significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% anticorpo em peso, baseado em peso total da proteína, alternativamente, pelo menos cerca de 95% ou 97% em peso. Anticorpo “substancialmente homogêneo” significa uma composição compreendendo proteína em que pelo menos cerca de 99% em peso de proteína é anticorpo específico, por exemplo, anticorpo anti-D4D 7, baseado em peso total da proteína.

[109] “Remissão clínica” como usado aqui com referência à sujeitos com colite ulcerativa refere-se a um escore de Mayo completo de 2 ou menos pontos e nenhum subescore do indivíduo maior do que 1 ponto. “Remissão clínica” de doença de Crohn refere-se a um escore CDAI de 150 pontos ou menos.

[110] Uma “resposta clínica” como usado aqui com referência aos sujeitos com colite ulcerativa refere-se a uma redução em escore de Mayo completo de 3 ou mais pontos e 30% do basal, (ou um escore de Mayo parcial de 2 ou mais pontos e 25% ou mais do basal, se o escore de Mayo completo não foi realizado na visita) com uma redução acompanhante no subescore de sangramento retal de 1 ou mais pontos ou escore de sangramento retal absoluto de 1 ou menos pontos. Uma “resposta clínica” como usado aqui com relação aos sujeitos com doença de Crohn refere-se à uma redução de 70 pontos ou mais no escore CDAI do basal (semana 0).

[111] “Cura da mucosa” como usado aqui com relação aos sujeitos com colite ulcerativa refere-se a um subescore endoscópico de 1 ponto ou menos.

[112] Como usado aqui, “falha de tratamento” refere-se a uma piora da doença, uma necessidade para medicações de resgate ou intervenção cirúrgica para tratamento de colite ulcerativa ou doença de Crohn. Uma medicação de resgate é qualquer novo medicamento ou qualquer aumento na dose de um medicamento basal requerida para tratar sintomas novas ou não resolvidos de colite ulcerativa ou doença de Crohn (além de antidiarreicos ou diarreia crônica).

Formulações

[113] Como descrito aqui, foi descoberto que anticorpos anti-α4β7 são mais estáveis quando formulados com um antioxidante ou quelante. Além disso, como descrito aqui, anticorpos anti-α4α7 podem ser formulados para reduzir a formação de agregado (por exemplo, a quantidade de polissorbato 80 na formulação pode ser reduzida). Por exemplo, as formulações que compreendem citrato ou EDTA e anticorpos anti-α4β7 reduzem a taxa de formação de agregado de anticorpo durante o armazenamento. As formulações podem ainda ser armazenadas sem oxigênio para reduzir a formação de agregados. Em uma modalidade, a formulação de uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 2,5% a 25°C após 12 meses. Em uma modalidade, a formulação de uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 2,0% a 25°C após 12 meses. Em uma modalidade, a formulação de uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 1,6% a 25°C após 12 meses. Em uma modalidade, a formulação de uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 1,3% a 25°C após 12 meses. Em uma modalidade, a formulação de uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 1,0% a 25°C após 12 meses. Em outra modalidade, a formulação tem uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 0,5% a 5°C após 12 meses. Em outra modalidade, a formulação tem uma formação de agregado de anticorpo de menos do que cerca de 0,3% a 5°C após 12 meses.

[114] A presente invenção fornece, em um primeiro aspecto, uma formulação estável de anticorpo anti-α4β7. A formulação compreende um anticorpo anti-α4β7 e um antioxidante ou quelante. A formulação ainda compreende um agente tamponante que pode ser um ou mais aminoácidos livres. A formulação pode opcionalmente ainda compreender um surfactante. O anticorpo na formulação pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como um fragmento Fab, Fv, scFv, Fab' ou F(ab')2.

[115] A formação de agregado pode ser reduzida por remoção de oxigênio da formulação. Alternativamente, a formulação pode conter um antioxidante ou quelante. Em um aspecto, antioxidantes e quelantes exemplares que podem ser incluídos na formulação incluem ácido lipoico, ácido úrico, glutationa, tocoferol, caroteno, licopeno, cisteína, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), ácido etilenoglicoltetracético (EGTA), dimercaprol, ácido dietilenotriaminapentacético, e N,N- bis(carboximetil)glicina, compostos fosfonatos, por exemplo, ácido etidrônico, desferoxamina, malato e citrato. Alguns antioxidantes e quelantes podem reduzir a taxa de formação de agregado durante o armazenamento da formulação. Em outro aspecto, o quelante e/ou antioxidante é citrato ou EDTA. Concentrações de quelante exemplares para formulações líquidas estão na faixa de cerca de mais do que 0 mM a cerca de 60 mM, cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, cerca de 10 mM a cerca de 25 mM, e cerca de 20 a cerca de 30 mM. Em outro aspecto, a concentração do quelante é de cerca de 0 mM a cerca de 30 mM. Em uma modalidade, o quelante e/ou antioxidante é citrato, e a concentração de citrato é de cerca de 0 mM a cerca de 15 mM, cerca de 0 mM a cerca de 10 mM, ou cerca de 0 mM a cerca de 5 mM.

[116] A formulação pode conter qualquer aminoácido desejado ou livre, que pode estar na forma L, na forma D ou qualquer mistura desejada destas formas. Em um aspecto, aminoácidos livres que podem ser incluídos na formulação incluem, por exemplo, histidina, alanina, arginina, glicina, ácido glutâmico, serina, lisina, triptofano, valina, cisteína e combinações das mesmas. Alguns aminoácidos podem estabilizar as proteínas contra a degradação durante a fabricação, secagem, liofilização e/ou armazenamento, por exemplo, através de ligações de hidrogênio, pontes salinas, propriedades antioxidantes, ou interações hidrofóbicas ou por exclusão da superfície proteica. Aminoácidos podem agir como modificadores de tonicidade ou podem agir para reduzir a viscosidade da formulação. Em outro aspecto, aminoácidos livres, como histidina e arginina, podem agir como lioprotetores, e não cristalizam quando liofilizados como componentes da formulação. Aminoácidos livres, como ácido glutâmico e histidina, isolados ou em combinação, pode agir como agentes tamponantes em solução aquosa na faixa de pH de 5 a 7,5. Ainda em outro aspecto, a formulação contém histidina, arginina, ou uma combinação de histidina e arginina. Ainda em outro aspecto, concentrações de aminoácido livres para formulações líquidas estão na faixa de cerca de 9 mM a cerca de 0,5 M, por exemplo, de cerca de 10 mM a cerca de 90 mM, cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, cerca de 10 mM a cerca de 40 mM, cerca de 25 mM a cerca de 50 mM, cerca de 15 mM a cerca de 300 mM, cerca de 20 mM a cerca de 200 mM, cerca de 25 mM a cerca de 150 mM, cerca de 50 mM a cerca de 75 mM, cerca de 50 mM a cerca de 120 mM, cerca de 50 a cerca de 150 mM, ou cerca de 50 mM ou cerca de 125 mM.

[117] A formulação pode opcionalmente ainda conter pelo menos um surfactante, por exemplo, para controlar formação de agregado solúvel ou insolúvel. Em um aspecto, o surfactante é um surfactante não iônico. Em outro aspecto, o surfactante é um surfactante iônico. Surfactantes exemplares que podem ser incluídos na formulação incluem, por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80, um poloxâmero (Pluronic®) e combinações dos mesmos. Quando presente, o surfactante é geralmente incluído em uma quantidade que reduz a formação de agregados insolúveis de anticorpo, por exemplo, durante engarrafamento, congelamento, secagem, liofilização e/ou reconstituição, na presença de silicone, frascos envasados, seringas preenchidas, e/ou cartuchos. A concentração do surfactante é geralmente de cerca de 0,0001% a cerca de 1,0%, de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%, por exemplo, cerca de 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,20%, 0,3%, 0,4%, ou 0,5% (p/v). Concentrações maiores de surfactante, por exemplo, polissorbato 80 podem levar à formação de mais agregado SEC. A redução de concentração de polissorbato 80 pode reduzir a formação de agregado SEC no armazenamento. Em um aspecto, a razão molar de surfactante:anticorpo é de cerca de 0,7:1 a cerca de 2,0:1. Em outro aspecto, a razão molar de surfactante:anticorpo é 1,5:1.

[118] Uma modalidade de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 contém uma concentração alta do anticorpo anti-α4β7. Por exemplo, em uma modalidade, as formulações líquidas podem compreender pelo menos cerca de 60 mg/ml, pelo menos cerca de 70 mg/ml, pelo menos cerca de 80 mg/ml, pelo menos cerca de 90 mg/ml, pelo menos cerca de 100 mg/ml, pelo menos cerca de 110 mg/ml, pelo menos cerca de 120 mg/ml, pelo menos cerca de 130 mg/ml, pelo menos cerca de 140 mg/ml, pelo menos cerca de 150 mg/ml, pelo menos cerca de 160 mg/ml, pelo menos cerca de 170 mg/ml, pelo menos cerca de 180 mg/ml, pelo menos cerca de 190 mg/ml, pelo menos cerca de 200 mg/ml, pelo menos cerca de 250 mg/ml, pelo menos cerca de 300 mg/ml, de cerca de 60 mg/ml a cerca de 190 mg/ml, de cerca de 60 mg/ml a cerca de 170 mg/ml anticorpo anti-α4β7, de cerca de 150 mg/ml a cerca de 180 mg/ml, ou cerca de 160 mg/ml ou cerca de 165 mg/ml anticorpo anti-α4β7. Alternativamente, em outro aspecto, as formulações líquidas podem compreender pelo menos cerca de 154 mg/ml, pelo menos cerca de 176 mg/ml.

[119] A formulação pode ser um líquido ou um sólido. As formulações líquidas são soluções ou suspensões aquosas, preparadas em um solvente aquoso apropriado, como água ou uma mistura aquosa/orgânica, como misturas de álcool e água. As formulações líquidas têm um pH entre cerca de 5,5 e cerca de 7,5, entre cerca de 6,0 e 7,3, entre cerca de 6,0 e cerca de 7,0, entre cerca de 6,0 e 6,5, entre cerca de 6,0 e 6,3, entre cerca de 6,3 e 7,1, ou entre cerca de 6,4 e 7,0, ou entre 6,3 e 6,8, como cerca de 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. As formulações líquidas podem ser mantidas em temperatura ambiente, refrigerada (por exemplo, 2-8oC), ou congelada (por exemplo, -20oC ou -70oC) para armazenamento.

[120] Uma formulação sólida pode ser preparada de qualquer modo apropriado e pode estar na forma de uma torta ou pó, por exemplo, com adição de um lioprotetor. Em um aspecto, a formulação sólida é preparada por secagem de uma formulação líquida como descrito aqui, por exemplo, por liofilização ou secagem por spray. Quando a formulação é uma formulação sólida, a formulação pode ter um teor de umidade de não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 4,5%, não mais do que cerca de 4%, não mais do que cerca de 3,5%, não mais do que cerca de 3%, não mais do que cerca de 2,5%, não mais do que cerca de 2%, não mais do que cerca de 1,5%, não mais do que cerca de 1%, ou é substancialmente anidra. Uma formulação sólida pode ser dissolvida, ou seja, reconstituída, em um meio apropriado ou solvente para se tornar um líquido apropriado para administração. Solventes apropriados para reconstituição da formulação sólida incluem água, salina isotônica, tampão, por exemplo, salina tampão fosfato, solução de Ringer (lactato ou dextrose), meio essencial mínimo, soluções de álcool/aquosas, solução de dextrose, etc. A quantidade de solvente pode resultar em uma concentração de proteína terapêutica maior, igual ou inferior à concentração antes da secagem. Em outro aspecto, a concentração de anticorpo anti-α4β7 reconstituída é a mesma concentração que na formulação líquida pré- secagem.

[121] A formulação pode ser estéril, e isto pode ser obtido de acordo com os procedimentos conhecidos aos especialistas para gerar as formulações farmacêuticas apropriadas para administração ao sujeitos humanos, antes, ou após a preparação da formulação. A formulação pode ser esterilizada como um líquido, por exemplo, antes da secagem e/ou após a reconstituição por filtração por poros pequenos, por processamento asséptico ou por exposição à radiação ultravioleta. Tamanhos de poro do filtro podem ser 0,1 Dm ou 0,2 Dm para filtrar micro-organismos ou 10 a 20 nm para filtrar partículas virais. Alternativamente, ou adicionalmente, a formulação seca pode ser esterilizada, por exemplo, por exposição à radiação gama. Em um aspecto, a formulação líquida de anticorpo anti-α4β7 é esterilizada por filtração antes de secagem.

[122] Em um aspecto, a formulação é estável no armazenamento. Vários ensaios de estabilidade são disponíveis ao praticamente especializado para confirmar a estabilidade da formulação. Por exemplo, o anticorpo na formulação líquida pode ser estável no armazenamento em cerca de 25°C por pelo menos cerca de 4 semanas, pelo menos cerca de 2 meses, pelo menos cerca de 3 meses, ou pelo menos cerca de 6 meses, ou pelo menos cerca de 9 meses, ou pelo menos cerca de 12 meses; em cerca de 2-8oC pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 1 ano, pelo menos cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 3 anos ou mais. Alternativamente ou além disso, o anticorpo na formulação pode ser estável no armazenamento em cerca de 15°C por pelo menos cerca de 4 semanas, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 1 ano, ou mais. Alternativamente ou além disso, o anticorpo na formulação pode ser estável no armazenamento em cerca de -20°C ou -70°C por pelo menos cerca de 4 semanas, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 1 ano, pelo menos cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 3 anos, pelo menos cerca de 4 anos ou mais.

[123] A estabilidade pode ser testada por avaliação da estabilidade física, estabilidade química, e/ou atividade biológica do anticorpo na formulação em torno do tempo de formulação bem como após o armazenamento das temperaturas notadas. Estabilidade física e/ou química de uma formulação líquida ou um pó seco reconstituído pode ser avaliado qualitativamente e/ou quantitativamente em uma variedade de formas diferentes (ver, por exemplo, Analytical Techniques for Biopharmaceutical Development, Rodriguez-Diaz et al. eds. Informa Healthcare (2005)), incluindo avaliação de formação de agregado solúvel ou insolúvel (por exemplo, usando cromatografia por exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica, MALDI-TOF MS, espalhamento de luz ((DLS) dinâmico ou MALLS), imagem microscópica baseada em fluxo, ou outro sistema de contagem de partícula líquida, ao medir a turbidez, por centrifugação de gradiente densidade e/ou por inspeção visual); avaliando a heterogeneidade de carga usando cromatografia de troca catiônica (ver ainda Vlasak and Ionescu, Curr. Pharm. Biotechnol. 9:468-481 (2008) e Harris et al. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 752:233-245 (2001)), focagem isoelétrica ou eletroforese por zona capilar; análise de sequência amino-terminal ou carboxi terminal; análise de espectrometria de massa; análise SDS-PAGE para comparar anticorpo fragmentado, intacto e multimérico (ou seja, dimérico, trimérico, etc.); mapa de peptídeo (por exemplo, tríptico ou LYS e semelhantes). A instabilidade pode resultar em agregação, deamidação (por exemplo, Asn deamidação), oxidação (por exemplo, Met oxidação), isomerização (por exemplo, Asp isomerização), desnaturação, corte/hidrólise/fragmentação (por exemplo, fragmentação em região em dobradiça), formação de succinimida, cisteínas não pareadas, extensão de N-terminal, processamento C-terminal, diferenças de glicosilação, etc. Atividade biológica ou função de ligação ao antígeno, por exemplo, ligação do anticorpo anti-α4β7 ao MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) ou inibição de ligação de uma célula que expressa α4β7 integrina ao MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), por exemplo, MAdCAM imobilizada (por exemplo, MAdCAM-1), pode ser avaliada usando várias técnicas disponíveis ao praticante especialista (ver, por exemplo, Soler et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 330:864-875 (2009)). A medição do teor de umidade de uma formulação seca pode indicar como provavelmente uma formulação sofrerá degradação química ou física, com umidade mais alta levando a mais degradação.

[124] Uma formulação estável pode contribuir para uma baixa imunogenicidade de um anticorpo anti-α4β7. Um anticorpo anti-α4β7 imunogênico pode levar a uma resposta d anticorpo humano-anti- humano (HAHA) em sujeitos ou pacientes humanos. Os pacientes que desenvolvem uma resposta HAHA a um anticorpo anti-α4β7 podem ter eventos adversos (por exemplo, reação no local da infusão) no tratamento ou podem eliminar anticorpo anti-α4β7 rapidamente, resultando em uma dose menor do que a planejada pelo tratamento. Um relato (Feagen et al. (2005) N. Engl. J. Med. 352:2499-2507) de estudo precoce de um tratamento com anticorpo anti-α4β7 indicou que anticorpos anti-humanos se desenvolveram pela semana 8 em 44% dos pacientes tratados. O anticorpo neste estudo foi armazenado como um líquido e não continha qualquer polissorbato.

[125] Em algumas modalidades, a formulação pode aumentar a proporção de pacientes negativos para HAHA em pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% dos pacientes em comparação com os resultados HAHA de uma formulação menos estável.

[126] Em algumas modalidades, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem > 50% de isoforma principal carregada, > 55% de isoforma principal carregada, ou 65 a 70% de isoforma principal carregada. Em outros aspectos, uma formulação estável de anticorpo anti-α4β7 tem < 45% de isoformas carregadas ácidas, < 40% de isoformas carregadas ácidas, < 30% de isoformas carregadas ácidas ou 22 a 28% de isoformas ácidas. Ainda em outros aspectos, uma formulação estável de anticorpo anti-α4β7 tem < 25% de isoformas básicas, < 20% de isoformas básicas, < 15% de isoformas básicas, cerca de 5% de isoformas básicas ou cerca de 10% de isoformas básicas. Em um aspecto, uma formulação estável de anticorpo anti- α4β7 tem > 55% de isoforma principal, < 30 % de isoformas ácidas e/ou < 20% de isoformas básicas, por exemplo, como determinado por CEX. Em outro aspecto, uma formulação estável de anticorpo anti-α4β7 tem > 50% de isoforma principal, < 45 % de isoformas ácidas e/ou < 10% de isoformas básicas, por exemplo, como determinado por cIEF.

[127] Em alguns aspectos, uma formulação sólida, seca de anticorpo anti-α4β7 tem <10% teor de umidade, < 5% teor de umidade ou < 2,5% teor de umidade. O tempo requerido para reconstituição é < 60 minutos, < 50 minutos ou < 40 minutos ou < 30 minutos ou < 20 minutos.

[128] Teor monomérico e/ou teor de agregado (por exemplo, como dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros, oligômeros e agregados de ordem maior), ou seja, na formulação líquida, ou na formulação reconstituída, pode ser medido por SEC, ultracentrifugação analítica, espalhamento de luz (DLS ou MALLS), MALDI-TOF MS ou medição em nanoescala, como análise de rastreamento de nanopartícula NTA, NanoSight Ltd, Wiltshire, UK). Resolução, caracterização e quantificação de agregado podem ser obtidas em um número de formas, incluindo aumentar o comprimento da separação em coluna SEC, por exemplo, por uma coluna maior ou por ligação serial de uma segunda ou mais colunas SEC em linha com a coluna SEC analítica inicial, quantificação de SEC complementar de monômeros com dispersão de luz, ou usando NTA.

[129] Em uma modalidade, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem > 90% de anticorpo monomérico, > 95% de anticorpo monomérico, ou 97 a 99% de anticorpo monomérico. Em outra modalidade, a maior parte do material em uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem um raio médio de < 20 nm, < 15 nm, < 10 nm, ou cerca de 5 a cerca de 7 nm. Em um aspecto, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem > 80% de quantidade de cadeia pesada mais leve por análise de proteína. Em um aspecto, há > 90% de cadeia pesada mais leve. Em outro aspecto, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem < 10% de agregado, < 5% de agregado, < 2,5% de agregado, < 1,5% de agregado, < 1,0% de agregado ou < 0,5% de agregado. Em outro aspecto, a formulação estável de anticorpo anti-α4β7 tem > 96% de monômero e/ou < 2,5% de agregado. Ainda em outro aspecto, uma formulação estável de anticorpo anti-α4β7 tem cerca de 99% de monômero e/ou cerca de < 1% de agregado.

[130] Tamanhos de partículas, maiores do que 1 a 2 mícrons, por exemplo, de agregados ou excipiente não dissolvido, ou seja, na formulação líquida, ou na formulação reconstituída podem ser medidos por obscurecimento (por exemplo, sistema de contagem de partícula líquida (HIAC) por Hach Ultra Analytics (Grants Pass, OR)), microscopia, contador coulter, ou digital (por exemplo, baseado em fluxo) sistema baseado em imagem microscópica como imagem microfluídico (MFI) por Brightwell (Ottawa, CA) ou analisador de partícula por imagem FLOWCAM® por Fluid Imaging Technologies (Yarmouth, ME). Em um aspecto, tamanho de partícula em uma preparação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 30 Dm, cerca de 25 Dm, cerca de 10 nm, cerca de 5 μm, cerca de 2 μm ou 1 μm ou menos. A quantidade de partículas deve ser minimizada em formulações de anticorpo. Em um aspecto, uma quantidade de partículas em uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é < 6000 partículas > 10 Dm de diâmetro e/ou < 600 partículas > 25 Dm diâmetro em uma dose (U.S. Pharmacopoeia Chp. 788, método de contagem por obscurecimento; metade daquelas quantidades por método de quantificação microscópica). Em outro aspecto, uma quantidade de partículas em uma dose de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 1000 partículas >10 Dm e cerca de 0-100 partículas >25 Dm (método MFI). Ainda em outro aspecto, uma quantidade de partículas por mililitro, por exemplo, por medição MFI, em uma dose de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 500 a cerca de 2000 de 2-10 Dm partículas por ml, cerca de 50 a cerca de 350 de >10 Dm partículas por ml e cerca de 0 a cerca de 50 de >25 Dm partículas por ml. Ainda em outro aspecto, uma quantidade de partículas em uma dose de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 500 a cerca de 100.000, cerca de 1.000 a cerca de 5.000 ou cerca de 1.500 a cerca de 3.000 de 2-10 μm partículas por ml.

[131] A viscosidade de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 pode ser controlada para administração subcutânea ou intramuscular. A viscosidade pode ser afetada por concentração de proteína e pH. Por exemplo, conforme a concentração de proteína aumenta, a viscosidade pode aumentar. Um aumento em pH pode reduzir a viscosidade da formulação de anticorpo anti-α4β7. Em algumas formulações de proteína, cloreto de sódio é adicionado para reduzir a viscosidade da formulação. Os componentes adicionais que podem afetar a viscosidade de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 são aminoácidos como histidina e arginina.

[132] Uma formulação de anticorpo anti-α4β7 pode ser isotônica (por exemplo, 250-350 mOsm) ou hipertônica (por exemplo, mais do que 350 mOsm, mais do que 450 mOsm, mais do que 550 mOsm ou mais do que 650 mOsm), por exemplo, para administração subcutânea ou intramuscular. Em um aspecto, a formulação de anticorpo anti-α4β7 não é hipotônica, por exemplo, menos do que 250 mOsm. Em outro aspecto, a formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 350 a cerca de 400 mOsm, cerca de 400 a cerca de 450 mOsm ou cerca de 350 a cerca de 450 mOsm.

[133] A instabilidade levando à desnaturação pode ser avaliada por calorimetria de varredura diferencial (DSC). Anticorpos têm duas temperaturas de fusão (Tm) em DSC, por exemplo, Tm1 e Tm2. Certos excipientes podem afetar a estabilidade do anticorpo nativo anti-α4β7. Um achado de uma temperatura de fusão maior quando comparando as formulações pode DSC pode indicar uma formulação mais estável de anticorpo anti-α4β7 com uma Tm maior. Por exemplo, em pH5,7, a Tm de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é menor, e, assim, menos estável do que em pH 6,5. Em um aspecto, Tm1 de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é >60oC. Em outro aspecto, a Tm1 de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 65 oC a cerca de 70oC ou cerca de 69oC. Em um aspecto, Tm2 de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é >80oC. Em outro aspecto, a Tm2 de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 é cerca de 82 oC a cerca de 88oC ou cerca de 86°C.

[134] Em uma modalidade, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem uma afinidade de ligação ou valor EC50 de cerca de 60% a cerca de 140% do anticorpo padrão de referência anti-α4β7. Em um aspecto, um anticorpo anti-α4β7 em uma formulação descrita aqui se liga a α4β7, por exemplo, em uma célula (WO98/06248 ou patente US 7.147.851), em um valor de cerca de 80% a cerca de 120% do padrão de referência. Em outra modalidade, uma formulação de anticorpo anti-α4β7 tem a capacidade de inibir pelo menos 50%, ou pelo menos 60% da ligação de uma célula que expressa α4β7 integrina a MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), por exemplo, a MAdCAM-Ig quimera (ver publicação de pedido de patente US 20070122404, ainda para exemplos de padrão de referência).

[135] Como notado acima, congelamento da formulação é especificamente contemplado aqui. Assim, a formulação pode ser testada para estabilidade no congelamento e descongelamento. Assim, o anticorpo em uma formulação líquida pode ser estável no congelamento e descongelamento da formulação, por exemplo, o anticorpo pode ser estável após um, dois, três, quatro, cinco ou mais ciclos de congelamento/descongelamento.

[136] Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é uma formulação líquida compreendendo pelo menos cerca de 60 mg/ml a cerca de 170 mg/ml anticorpo anti-α4β7, um agente tamponante (por exemplo, histidina), e citrato pelo menos cerca de 5 mM. Em outras modalidades, a formulação é uma formulação líquida compreendendo pelo menos cerca de 60 mg/ml a cerca de 170 mg/ml anticorpo anti- α4β7, um agente tamponante (por exemplo, citrato), aminoácido (por exemplo, arginina) e surfactante (por exemplo, polissorbato 80).

[137] Em outra modalidade, a formulação compreende pelo menos cerca de 140 mg/ml ou cerca de 150 mg/ml a cerca de 170 mg/ml, por exemplo, cerca de 160 mg/ml de um anticorpo anti-α4β7, um agente tamponante (por exemplo, histidina), citrato pelo menos cerca de 5 mM e um aminoácido livre (por exemplo, arginina).

[138] Ainda em outra modalidade, a formulação compreende pelo menos cerca de 160 mg/ml de um anticorpo anti-α4β7, um agente tamponante (por exemplo, histidina), citrato pelo menos cerca de 5 mM, 0,2% polissorbato 80, e um aminoácido livre (por exemplo, arginina). Em uma modalidade, a concentração de tampão na formulação é cerca de 15 a cerca de 75 mM, cerca de 25 a cerca de 65 mM, ou cerca de 50 mM. A concentração de aminoácido livre na formulação é cerca de 50 a cerca de 250 mM, cerca de 75 a cerca de 200 mM, cerca de 100 a cerca de 150 mM ou cerca de 125 mM; a concentração de polissorbato 80 na formulação é cerca de 0,05% a 0,4%, cerca de 0,1% a 0,4%, cerca de 0,1% a 0,3%, cerca de 0,1% a 0,25%, cerca de 0,1% a 0,2%, ou cerca de 0,2%.

[139] Em algumas modalidades, a formulação é uma formulação sólida (por exemplo, uma formulação liofilizada), compreendendo uma mistura de um anticorpo anti-α4β7, citrato, histidina, arginina, polissorbato 80, e um lioprotetor ou um sacarídeo, como um açúcar não redutor. O sacarídeo pode ser incluído na formulação líquida para atingir as concentrações de 0% a 20%, ou cerca de 6% a cerca de 10%.

[140] Em uma modalidade, a formulação é liofilizada e armazenada como uma dose única em um recipiente, por exemplo, frasco, seringa, cartucho, e/ou autoinjetor. O recipiente pode ser armazenado em cerca de 2-8°C ou 25°C até esta ser administrada a um sujeito em necessidade do mesmo. O frasco pode, por exemplo, ser um frasco de 5, 10 ou 20 cm3 (por exemplo, para uma dose de 160 mg/ml). O frasco pode conter pelo menos cerca de 20 mg, pelo menos cerca de 50 mg, pelo menos cerca de 70 mg, pelo menos cerca de 80 mg, pelo menos cerca de 100 mg, pelo menos cerca de 120 mg, pelo menos cerca de 155 mg, pelo menos cerca de 180 mg, pelo menos cerca de 200 mg, pelo menos cerca de 240 mg, pelo menos cerca de 300 mg, pelo menos cerca de 360 mg, pelo menos cerca de 400 mg, pelo menos cerca de 540 mg, ou pelo menos cerca de 900 mg de anticorpo anti- α4β7. Em um aspecto, o recipiente contém cerca de 165 mg de anticorpo anti-α4β7.

[141] Em outra modalidade, a formulação é líquida e armazenada como uma dose única em um ou dois frascos, cartuchos, seringas, ou autoinjetores. O frasco, cartucho, seringa, ou autoinjetor pode ser armazenado em cerca de 2-8°C até seus conteúdos, por exemplo, um anticorpo anti-D4D7, serem administrados a um sujeito em necessidade do mesmo. O frasco pode, por exemplo, ser um frasco de 5, 10 ou 20 cm3 (por exemplo, para uma dose de 160 mg/ml). O frasco pode conter pelo menos cerca de 20 mg, pelo menos cerca de 50 mg, pelo menos cerca de 70 mg, pelo menos cerca de 80 mg, pelo menos cerca de 100 mg, pelo menos cerca de 120 mg, pelo menos cerca de 155 mg, pelo menos cerca de 180 mg, pelo menos cerca de 200 mg, pelo menos cerca de 240 mg, pelo menos cerca de 300 mg, pelo menos cerca de 360 mg, pelo menos cerca de 400 mg, pelo menos cerca de 540 mg, ou pelo menos cerca de 900 mg de anticorpo anti-α4β7. Em um aspecto, o frasco contém cerca de 165 mg de anticorpo anti-α4β7. A seringa ou cartucho pode ser um recipiente de 1 mL ou 2 mL (por exemplo, para uma dose de 160 mg/mL) ou mais do que 2 ml, por exemplo, para uma dose maior (pelo menos 320 mg ou 400 mg ou maior). A seringa ou cartucho podem conter pelo menos cerca de 20 mg, pelo menos cerca de 50 mg, pelo menos cerca de 70 mg, pelo menos cerca de 80 mg, pelo menos cerca de 100 mg, pelo menos cerca de 120 mg, pelo menos cerca de 155 mg, pelo menos cerca de 180 mg, pelo menos cerca de 200 mg, pelo menos cerca de 240 mg, pelo menos cerca de 300 mg, pelo menos cerca de 360 mg, pelo menos cerca de 400 mg, ou pelo menos cerca de 500 mg de anticorpo anti-α4β7.

[142] Um ou mais carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis como os descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Hendrickson, R. Ed. (2005) podem ser incluídos na formulação fornecida contanto que não afetam adversamente as características desejadas da formulação. Carreadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem; agentes de tamponamento adicionais; cossolventes; antioxidantes incluindo citrato e cisteína; agentes quelantes como EDTA; complexos de metais (por exemplo, complexos de proteína Zn); polímeros biodegradáveis como poliésteres; preservativos; lubrificantes de parede de recipiente, por exemplo, silicone, óleo mineral, glicerina, ou TRIBOGLIDE® (Tribo Film Research, Inc.) derivado de perfluoropoliéter, para facilitar a injeção e/ou contraíons formadores de sal como sódio.

Anticorpos α4β7

[143] Anticorpos anti-α4β7 apropriados para uso nas formulações incluem anticorpos de qualquer fonte desejada, como anticorpos completamente humanos, anticorpos murinos, anticorpos de coelho e semelhantes, e quaisquer anticorpos modificados desejados, como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, e semelhantes. Fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um destes tipos de anticorpos, como fragmentos Fab, Fv, scFv, Fab' e F(ab')2, são ainda apropriados para uso nas formulações.

[144] O anticorpo anti-α4β7 pode se ligar a um epítopo na cadeia α4 (por exemplo, MAb 21.6 humanizado (Bendig et al., Patente US 5.840.299)), na cadeia β7 (por exemplo, FIB504 ou um derivado humanizado (por exemplo, Fong et al., patente US 7.528.236)), ou a um epítopo combinatorial formado pela associação de uma cadeia α4 com a cadeia β7. Em um aspecto, o anticorpo se liga a um epítopo combinatorial no complexo α4β7, mas não se liga a um epítopo na cadeia α4 ou a cadeia β7 salvo se as cadeias estão em associação com cada outro. A associação de Q4 integrina com Q7 integrina pode reagir a um epítopo combinatorial, por exemplo, por ligação em ponte nos resíduos de proximidade presentes em ambas as cadeias que juntas compreendem o epítopo ou por exposição conformacionalmente em uma cadeia, por exemplo, a cadeia D4 integrina ou a cadeia D7 integrina, um sítio de ligação ao epítopo que é inacessível à ligação do anticorpo na ausência do parceiro apropriado de integrina ou na ausência de ativação de integrina. Em outro aspecto, o anticorpo anti- α4β7 se liga a ambas cadeia Q4 integrina e a cadeia D7 integrina, e, assim, é específica para o complexo α4β7 integrina. Ditos anticorpos podem se ligar a α4β7 mas não se ligam a α4β1, e/ou não se ligam a □ED7, por exemplo. Em outro aspecto, o anticorpo anti-α4β7 se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo Act-1 (Lazarovits, A. I. et al., J. Immunol., 133(4): 1857-1862 (1984), Schweighoffer et al., J. Immunol., 151(2): 717-729, 1993; Bednarczyk et al., J. Biol. Chem., 269(11): 8348-8354, 1994). Linhagem de célula de hibridoma ACT-1, que produz o anticorpo monoclonal Act-1 murino, foi depositado sob as provisões do Tratado de Budapeste em 22 de agosto de 2001, em nome de Millennium Pharmaceuticals, Inc., 40 Landsdowne Street, Cambridge, Mass. 02139, EUA, no American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., sob N.° de acessão PTA-3663. Em outro aspecto, o anticorpo anti-α4β7 é um anticorpo humano ou uma proteína de ligação a α4β7 usando as CDRs fornecidas na publicação do pedido de patente US 2010/0254975.

[145] Em um aspecto, o anticorpo anti-α4β7 inibe a ligação de α4β7 a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, a adressina de mucosa, por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), fibronectina, e/ou adressina vascular (VCAM)). MAdCAMs de primata (por exemplo, MAdCAM-1) são descritas na publicação PCT WO 96/24673, os ensinamentos completos dos quais são incorporados aqui por esta referência. Em outro aspecto, o anticorpo anti-α4β7 inibe a ligação de α4β7 a MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) e/ou fibronectina sem inibição da ligação de VCAM.

[146] Em um aspecto, os anticorpos anti-α4β7 para uso nas formulações são versões humanizadas do anticorpo de Act-1 de camundongo. Métodos apropriados para preparar anticorpos humanizados são bem conhecidos na técnica. Geralmente, o anticorpo anti-α4β7 humanizado conterá uma cadeia pesada que contém as 3 regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs, CDR1, SEQ ID NO:8, CDR2, SEQ ID NO:9 e CDR3, SEQ ID NO:10) do anticorpo Act-1 de camundongo e regiões estruturais de cadeia pesada humana apropriadas; e ainda contém uma cadeia leve que contém as 3 cadeias leves CDRs (CDR1, SEQ ID NO:11, CDR2, SEQ ID NO:12 e CDR3, SEQ ID NO:13) do anticorpo Act-1 de camundongo e regiões estruturais de cadeia leve humanas apropriadas. O anticorpo Act-1 humanizado pode conter qualquer região estrutural humana apropriada, incluindo região estrutural consenso, com ou sem substituições de aminoácidos. Por exemplo, um ou mais dos aminoácidos estruturais podem ser substituídos com outro aminoácido, como o aminoácido na posição correspondente no anticorpo Act-1 de camundongo. A região constante humana ou porção da mesma, se presente, pode ser derivada das cadeias leves K ou À, e/ou as cadeias pesadas y (por exemplo, y1, y2, y3, y4), μ, α (por exemplo, α1, α2), δ ou ε de anticorpos humanos, incluindo variantes alélicas. Uma região constante particular (por exemplo, IgG1), variante ou partes das mesmas podem ser selecionadas para configurar a função efetora. Por exemplo, uma região constante mutada (variante) pode ser incorporada em uma proteína de fusão para minimizar a ligação aos receptores Fc e/ou capacidade de fixar complemento (ver, por exemplo, Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351, Dec. 22, 1994). Versões humanizadas de anticorpo Act-1 foram descritas em publicações PCT WO98/06248 e WO07/61679, os ensinamentos completos de cada um dos quais são incorporados aqui por esta referência.

[147] Em outro aspecto, os anticorpos humanizados anti-α4β7 para uso na formulação compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo aminoácidos 20 a 140 da SEQ ID NO:2, e uma região variável de cadeia leve compreendendo aminoácidos 20 a 131 da SEQ ID NO:4 ou aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO:5. Se desejado, uma região constante humana apropriada pode estar presente. Por exemplo, o anticorpo humanizado anti-α4β7 pode compreender uma cadeia pesada que compreende aminoácidos 20 a 470 da SEQ ID NO:2 e uma cadeia leve compreendendo aminoácidos 21 a 239 da SEQ ID NO:5. Em outro exemplo, o anticorpo humanizado anti-α4β7 pode compreender uma cadeia pesada que compreende aminoácidos 20 a 470 da SEQ ID NO:2 e uma cadeia leve compreendendo aminoácidos 20 a 238 da SEQ ID NO:4. Figura 4 mostra um alinhamento que compara as cadeias leves genéricas de anticorpos humanos com anticorpos murinos. O alinhamento ilustra que a cadeia leve humanizada de vedolizumabe (por exemplo, Chemical Abstract Service (CAS, American Chemical Society) Número de registro 943609-66-3), com dois resíduos de camundongo trocados para resíduos humanos, é mais humana do que a cadeia leve de LDP-02 (Figura 3). Além disso, LDP-02 tem de algum modo um sítio hidrofóbico, flexível alanina 114 e um hidrofílico (Aspartato 115) que é substituído em vedolizumabe com o resíduo treonina 114 contendo hidroxil ligeiramente hidrofílico e resíduo valina 115 hidrofóbico, potencialmente faceando para dentro.

[148] Outras substituições à sequência de anticorpo podem ser, por exemplo, mutações às regiões estruturais de cadeia pesada e leve, como uma mutação de isoleucina para valina no resíduo 2 da SEQ ID NO:14; uma mutação de metionina para valina no resíduo 4 da SEQ ID NO:14; uma mutação de alanina para glicina no resíduo 24 da SEQ ID NO:15; uma mutação de arginina para lisina no resíduo 38 da SEQ ID NO:15; uma mutação de alanina para arginina no resíduo 40 da SEQ ID NO:15; uma mutação de metionina para isoleucina no resíduo 48 da SEQ ID NO:15; uma mutação de isoleucina para leucina no resíduo 69 da SEQ ID NO:15; uma mutação de arginina para valina no resíduo 71 da SEQ ID NO:15; uma mutação de treonina para isoleucina no resíduo 73 da SEQ ID NO:15; ou qualquer combinação dos mesmos; e substituição das CDRs de cadeia pesada com as CDRs (CDR1, SEQ ID NO:8, CDR2, SEQ ID NO:9 e CDR3, SEQ ID NO:10) do anticorpo Act- 1 de camundongo; e substituição das CDRs de cadeia leve com as CDRs de cadeia leve (CDR1, SEQ ID NO:11, CDR2, SEQ ID NO:12 e CDR3, SEQ ID NO:13) do anticorpo Act-1 de camundongo.

[149] Em algumas modalidades, os anti-α4β7 anticorpos humanizados para uso na formulação compreendem uma região variável de cadeia pesada que tem cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência aos aminoácidos 20 a 140 da SEQ ID NO:2, e uma região variável de cadeia leve que tem cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequência aos aminoácidos 20 a 131 da SEQ ID NO:4 ou aminoácidos 21 a 132 da SEQ ID NO:5. Identidade de sequência de aminoácido pode ser determinada usando um algoritmo de alinhamento de sequência apropriado, como o sistema Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.), usando os parâmetros padrões. Em uma modalidade, o anticorpo anti-α4β7 para uso na formulação é vedolizumabe (CAS, American Chemical Society, Número de registro 943609-66-3).

[150] Outros anticorpos α4β7 podem ainda ser usados nas formulações e esquemas de dosagem descritos aqui. Por exemplo, os anticorpos α4β7 descritos em US 2010/0254975 (Amgen, Inc.), incorporados por referência aqui em sua totalidade, são apropriados para uso nas formulações e métodos para tratar doença intestinal inflamatória em um indivíduo.

[151] O anticorpo anti-α4β7 pode ser produzido por expressão de sequências de ácido nucleico codificando cada cadeia em células vivas, por exemplo, células em cultura. Uma variedade de sistemas de vetor de expressão hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpo da invenção. Os sistemas de expressão em hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas ainda representam as células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressam um anticorpo anti-α4β7 in situ. Estes incluem, entre outros, micro-organismos como bactéria (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectado com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de planta infectada com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus de mosaico de couve-flor, CaMV; vírus de mosaico de tabaco, TMV) ou transformada com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de célula mamífera (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NS0) contendo construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células mamíferas (por exemplo, promotor metalotioneina) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7,5K de vírus vaccínia). Por exemplo, células mamíferas como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor como o principal elemento promotor de gene precoce intermediário de citomegalovírus humano, é um sistema de expressão efetivo para anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

[152] Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de dita uma proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Ditos vetores incluem, entre outros, ao vetor de expressão E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), em que a sequência de codificação de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codificação lac Z de modo que uma proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX podem ainda ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, ditas proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas de células lisadas por adsorção e ligação às esferas de matriz de glutationa-agarose seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou sítios de clivagem de Xa protease de modo que o produto do gene clonado pode ser liberado da fração GST.

[153] Em um sistema de inseto, vírus poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocado sob o controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedrina).

[154] Em células hospedeiras mamíferas, um número de sistemas de expressão a base de vírus pode ser utilizado. Nos casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação de anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controle de transcrição/tradução, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartite. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) irá resultar em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355359 (1984)). Sinais de iniciação específicos podem ainda ser requeridos para tradução eficiente de sequências de codificação de anticorpo inseridas. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além disso, o códon de iniciação deve estar na fase com a região de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução do inserto completo. Estes sinais de controle de tradução exógenos e códons de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto natural quanto sintético. A eficiência da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos melhoradores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).

[155] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processo o produto do gene no modo específico desejado. Ditas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós- tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhagens de células apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para esta finalidade, células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para processamento do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Ditas células hospedeiras mamíferas incluem, entre outras, células de ovário de hamster chinês (CHO), NS0, HeLa, VERY, renais de hamster recém-nascido (BHK), renais de macacos (COS), MDCK, 293, 3T3, WI38, células de carcinoma hepatocelular humanas (por exemplo, Hep G2), linhagens de célula de câncer de mama como, por exemplo, linhagem de célula BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e de glândula mamária normal como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

[156] A máquina de glicosilação de diferentes tipos de células pode produzir anticorpos com diferente composição de glicosilação além de outro tipo de célula, ou sem glicosilação, como com células bacterianas. Em um aspecto, os tipos de célula para a produção do anticorpo anti-α4β7 são células de mamíferos, como células NS0 ou CHO. Em um aspecto, as células mamíferas podem ainda compreender a deleção de uma enzima envolvida no metabolismo celular e o gene exógeno de interesse pode ser operacionalmente ligado a uma enzima de substituição, por exemplo, em um construto ou vetor para introdução nas células, por exemplo, por transformação ou transfecção. O construto ou vetor com o gene exógeno confere às células que hospedam o construto ou vetor uma vantagem de seleção para encorajar a produção do polipeptídeo codificado pelo gene exógeno. Em uma modalidade, células CHO são células DG44 (Chasin and Urlaub (1980) PNAS USA 77:4216), compreendendo a deleção ou inativação do gene di-idrofolato redutase gene. Em outra modalidade, as células CHO são células CHO K1 compreendendo a deleção ou inativação do gene glutamina sintase (ver, por exemplo, patentes US 5.122.464 ou 5.827.739).

Formulações sólidas

[157] As formulações sólidas da invenção são geralmente preparadas por secagem de uma formulação líquida. Qualquer método apropriado de secagem pode ser usado, como liofilização ou secagem por spray. Em um aspecto, um lioprotetor é adicionado à formulação antes da liofilização. A liofilização envolve congelar uma formulação líquida, geralmente no recipiente que será usado para armazenar, transportar e distribuir uma formulação (por exemplo, um frasco, seringa (por exemplo, uma seringa de uma ou duas câmaras), ou cartucho (por exemplo, um cartucho de uma ou duas câmaras) (Ver, por exemplo, Gatlin and Nail em Protein Purification Process Engineering, ed. Roger G. Harrison, Marcel Dekker Inc., 317-367 (1994).) Uma vez que a formulação é congelada, a pressão atmosférica é reduzida e a temperatura é ajustada para permitir a remoção do solvente congelado, por exemplo, através de sublimação. Esta etapa do processo de liofilização é algumas vezes referenciada como uma secagem primária. Se desejado, a temperatura pode então ser elevada para remover qualquer solvente que é ainda ligada à formulação seca por evaporação. Esta etapa do processo de liofilização é algumas vezes referenciada como uma secagem secundária. Quando a formulação atingiu o grau desejado de secagem, o processo de secagem é concluído e os recipientes são vedados. A formulação sólida final é algumas vezes referenciada como uma “formulação liofilizada” ou uma “torta.” O processo de liofilização pode ser realizado usando qualquer equipamento apropriado. O equipamento de liofilização apropriado é disponível de um número de fontes comerciais (por exemplo, SP Scientific, Stone Ridge, NY).

[158] Uma variedade de aparatos apropriados pode ser usada para secar formulações líquidas para produzir uma formulação sólida (por exemplo, liofilizada). Geralmente, as formulações liofilizadas são preparadas pelos especialistas na técnica usando uma câmara vedada que contém prateleiras, em que os frascos da formulação líquida a serem secos são colocados. A temperatura das prateleiras, vem como taxa de resfriamento e aquecimento podem ser controladas, assim como a pressão dentro da câmara. Será entendido que vários parâmetros de processo discutidos aqui se referem aos processos realizados usando este tipo de aparelho. Os especialistas na técnica podem facilmente adaptar os parâmetros descritos aqui a outros tipos de aparelhos de secagem se desejado.

[159] Temperaturas apropriadas e uma quantidade de vácuo para secagem primária e secundária podem ser prontamente determinadas por um especialista na técnica. Em geral, a formulação é congelada em uma temperatura de cerca de -30°C ou menos, como -40°C ou -50°C. A taxa de resfriamento pode afetar a quantidade e tamanhão de cristais de gelo na matriz. A secagem primária é geralmente conduzida em uma temperatura que é cerca de 10°C, cerca de 20°C, cerca de 30°C, cerca de 40°C ou cerca de 50°C mas quente do que a temperatura de congelamento. Em um aspecto, as condições de secagem primárias podem ser ajustadas para manter o anticorpo anti-α4β7 abaixo da temperatura de transição vítrea ou temperatura de colapso da formulação. Acima da temperatura de colapso, a matriz congelada amorfa pode fluir (colapsar), com um resultado que as moléculas de proteína podem não ser circundadas por uma matriz rígida, sólida e as moléculas de proteína podem não ser estáveis na matriz colapsada. Ainda, a formulação pode ser difícil para secar totalmente se ocorrer o colapso. As quantidades maiores resultantes de umidade na formulação podem levar às taxas maiores de degradação de proteína e uma redução na quantidade de tempo que o produto liofilizado pode ser armazenado antes de suas qualidades diminuírem a níveis inaceitáveis. Em um aspecto, a temperatura de prateleira e pressão da câmara são selecionadas para manter a temperatura do produto abaixo da temperatura de colapso durante secagem primária. A temperatura de transição vítrea de uma formulação congelada pode ser medida por métodos conhecidos técnica, por exemplo, por calorimetria de varredura diferencial (DSC). A temperatura de colapso pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia de liofilização, tomografia de coerência óptica. A etapa de secagem pode remover pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou mais do solvente. Em um aspecto, a etapa de secagem primária remove mais do que 80% do solvente da formulação de anticorpo anti-α4β7.

[160] O tamanho do frasco pode ser selecionado com base na área de superfície que será exposto à prateleira e à liofilização durante vácuo. O tempo de secagem é diretamente proporcional à altura da torta, assim, o tamanho do frasco pode ser escolhido com base no que é determinado para ser uma altura de torta variável. Um frasco com um diâmetro grande em relação ao volume pode fornecer uma quantidade alta de contato com a prateleira para eficiente transferência de calor durante o ciclo de liofilização. Uma solução de anticorpo diluída em um alto volume de líquido irá requerer mais tempo para secagem. Um equilíbrio no tamanho do frasco versos volume de formulação precisa ser atingido, porque frascos maiores podem ser mais caros para armazenar e transportar e têm uma maior proporção de espaço aéreo para formulação, e podem expor uma alta proporção da formulação aos efeitos de degradação de umidade durante armazenamento de longo prazo. Para uma dose de 165 mg, o tamanho do frasco da formulação de anticorpo anti-α4β7 pode ser de 3 mL, 5 ml ou 10 ml. Em um aspecto, o tamanho do frasco é de 5 ml para uma solução de 160 mg/ml.

[161] Os princípios para escolha de um tamanho de cartucho ou seringa para liofilização são semelhantes ao do frasco. A profundidade da altura da torta irá ainda aumentar o tempo de secagem conforme a altura aumenta. O diâmetro e tamanho da seringa ou cartucho devem ser equilibrados com o volume da formulação final. Diâmetros maiores podem aumentar a taxa de absorção de umidade na torta liofilizada, assim, aumentando os efeitos de degradação da umidade durante o armazenamento. Para uma dose de 165 mg, o volume da formulação de anticorpo anti-α4β7 pode ser de 1 ml ou 2 mL. Em um aspecto, o tamanho da seringa ou cartucho é mais do que 1 mL para uma solução de 160 mg/mL.

[162] Após a liofilização, o frasco, seringa, ou cartucho podem ser vedados, por exemplo, recravados, em um vácuo. Alternativamente, um gás, por exemplo, ar seco ou nitrogênio, pode ser permitido no recipiente antes da vedação. Onde a oxidação é uma preocupação, o gás permitido na câmara de liofilização pode compreender um gás que retarda ou previne a oxidação do produto liofilizado. Em um aspecto os gases são gases não oxigenados, por exemplo, nitrogênio, ou um gás inerte, por exemplo, hélio, neônio, argônio, criptônio ou xenônio. Em outro aspecto, o gás é nitrogênio ou argônio.

Tratamento com a formulação de anticorpo

[163] Em um aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma doença ou distúrbio em um sujeito compreendendo administrar ao sujeito a formulação de anticorpo anti-α4β7 descrita aqui em uma quantidade efetiva para tratar a doença ou distúrbio, por exemplo, em humanos. O sujeito humano pode ser um adulto (por exemplo, 18 anos de idade ou mais), um adolescente, ou uma criança. O sujeito humano pode ser uma pessoa de 65 anos de idade ou mais. Em contraste aos esquemas de dosagem terapêuticos alternativos, um sujeito humano de 65 anos de idade ou mais não requer qualquer modificação do regime de dosagem descrito aqui, e podem ser administrados à formulação convencional de anticorpo anti-α4β7 descrita aqui.

[164] O sujeito pode ter tido uma falta de uma resposta adequada com, perda de resposta a, ou foi intolerante ao tratamento com um imunomodulador, um antagonista TNF-α, ou combinações dos mesmos. O paciente pode ter recebido tratamento anterior com pelo menos um corticosteroide (por exemplo, prednisona) para a doença intestinal inflamatória. Uma resposta inadequada aos corticosteroides refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de uma história de pelo menos um regime de indução de 4 semanas que incluiu uma dose equivalente a prednisona 30 mg diariamente via oral por 2 semanas ou via intravenosa por 1 semana. Uma perda de resposta aos corticosteroides refere-se às duas tentativas falhas de reduzir os corticosteroides abaixo de uma dose equivalente a prednisona 10 mg diariamente via oral. A intolerância de corticosteroides inclui u histórico de síndrome de Cushing, osteopenia/osteoporose, hiperglicemia, insônia e/ou infecção.

[165] Um imunomodulador pode ser, por exemplo, azatioprina oral, 6-mercaptopurina, ou metotrexato. Uma resposta inadequada a um imunomodulador refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de um histórico de pelo menos um regime de 8 semanas ou azatioprina oral (>1,5 mg/kg), 6-mercaptopurina (>0,75 mg/kg), ou metotrexato (>12,5 mg/semana). A intolerância de um imunomodulador inclui, entre outros, náusea/vômito, dor abdominal, pancreatite, anormalidades LFT, linfopenia, mutação genética de TPMT e/ou infecção.

[166] Um antagonista TNF-α é, por exemplo, um agente que inibe a atividade biológica de TNF-α, e preferencialmente se liga a TNF-α, como um anticorpo monoclonal, por exemplo, REMICADE (infliximabe), HUMIRA (adalimumabe), CIMZIA (certolizumabe pegol), SIMPONI (golimumabe) ou uma proteína de fusão do receptor como ENBREL (etanercepte). Uma resposta inadequada a um antagonista de TNF-α refere-se aos sinais e sintomas de doença persistentemente ativa apesar de um histórico de pelo menos um regime de indução de 4 semanas de infliximabe 5 mg/kg IV, 2 doses pelo menos 2 semanas afastadas; uma dose de 80 mg subcutânea de adalimumabe, seguido por uma dose de 40 mg pelo menos duas semanas afastadas; ou 400 mg via subcutânea de certolizumabe pegol, 2 doses pelo menos 2 semanas afastadas. Uma perda de resposta a um antagonista TNF-α refere-se à recorrência de sintomas durante a dosagem de manutenção após benefício clínico anterior. A intolerância de um antagonista TNF-α inclui, entre outros, a reação relacionada à infusão, desmielinização, insuficiência cardíaca congestiva, e/ou infecção.

[167] Uma perda de manutenção de remissão, como usado aqui para sujeitos com colite ulcerativa, refere-se a um aumento em escore de Mayo de pelo menos 3 pontos e um Escore de Baron Modificado de pelo menos 2.

[168] Em outro aspecto, a presente invenção fornece formulações de anticorpo anti-α4β7 que (1) podem ligar α4β7 integrina in vitro e/ou in vivo; e (2) podem modular uma atividade ou função de uma α4β7 integrina, como (a) função de ligação (por exemplo, a capacidade de α4β7 integrina em se ligar a MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), fibronectina e/ou VCAM-1) e/ou (b) função de infiltração de leucócito, incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos (por exemplo, a capacidade de inibir migração de linfócito ao tecido da mucosa intestinal). Em uma modalidade, um anticorpo na formulação pode ligar uma α4β7 integrina, e pode inibir a ligação de α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), VCAM-1, fibronectina), assim inibindo a infiltração de leucócito de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos). Em outra modalidade, um anticorpo na formulação pode ligar a uma α4β7 integrina, e pode seletivamente inibir a ligação da α4β7 integrina a um ou mais de seus ligantes (por exemplo, MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1), VCAM-1, fibronectina), assim inibindo infiltração de leucócito de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos). Ditas formulações de anticorpo anti-α4β7 podem inibir adesão celular de células contendo uma α4β7 integrina às células endoteliais vasculares em tecidos de mucosa, incluindo tecidos associados ao intestino, órgãos linfoides ou leucócitos (especialmente linfócitos como células T ou B) in vitro e/ou in vivo. Ainda em outra modalidade, a formulação de anticorpo anti-α4β7 da presente invenção pode inibir a interação de α4β7 com MAdCAM (por exemplo, MAdCAM- 1) e/ou fibronectina. Ainda em outra modalidade, a formulação de anticorpo anti-α4β7 da presente invenção pode inibir a interação de α4β7 com MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) e/ou fibronectina seletivamente, por exemplo, sem inibir a infecção de α4β7 com VCAM.

[169] As formulações de anticorpo anti-α4β7 da presente invenção podem ser usadas para modular (por exemplo, inibir (reduzir ou prevenir)) a função de ligação e/ou função de infiltração de leucócito (por exemplo, linfócito, monócito) de α4β7 integrina. Por exemplo, imunoglobulinas humanizadas que inibem a ligação de α4β7 integrina a um ligante (ou seja, um ou mais ligantes) podem ser administradas de acordo com o método no tratamento das doenças associadas com infiltração de leucócito (por exemplo, linfócito, monócito) de tecidos (incluindo recrutamento e/ou acúmulo de leucócitos em tecidos), particularmente de tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1).

[170] Uma quantidade efetiva de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 da presente invenção (ou seja, uma ou mais) é administrada a um indivíduo (por exemplo, um mamífero, como um humano ou outro primata) para tratar dita uma doença. Por exemplo, doenças inflamatórias, incluindo doenças que são associadas com infiltração de leucócito do trato gastrointestinal (incluindo endotélio associado ao intestino), outros tecidos de mucosa, ou tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) (por exemplo, tecidos associados ao intestino, como vênulas da lamina própria do intestino delgado e grosso; e glândula mamária (por exemplo, glândula mamária de lactação)), podem ser tratadas de acordo com o presente método. De modo semelhante, um indivíduo contendo doença associada com infiltração de leucócito de tecidos como um resultado de ligação de leucócitos às células (por exemplo, células endoteliais) que expressam MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) pode ser tratado de acordo com a presente invenção.

[171] Em uma modalidade, doenças que podem ser tratadas dessa forma incluem doença intestinal inflamatória (IBD), como colite ulcerativa, doença de Crohn, ileíte, doença celíaca, espru não tropical, enteropatia associada com artropatia soronegativa, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite eosinofílica, ou pouchite resultando após protocolectomia, e anastomose ileoanal. Em algumas modalidades, a doença intestinal inflamatória é doença de Crohn ou colite ulcerativa. A colite ulcerativa pode ser colite ulcerativa moderada a gravemente ativa. O tratamento pode resultar em cicatrização da mucosa em pacientes que sofrem de colite ulcerativa moderada a gravemente ativa. O tratamento pode ainda resultar em uma redução, eliminação ou redução e eliminação de uso de corticosteroide pelo paciente.

[172] Pancreatite e diabetes mellitus dependente de insulina são outras doenças que podem ser tratadas usando as formulações da invenção. Foi reportado que MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) é expresso por alguns vasos no pâncreas exócrino de camundongos NOD (diabéticos não obesos), bem como de camundongos BALB/c e SJL. A expressão de MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) foi reportadamente induzida em endotélio em ilhotas inflamadas do pâncreas do camundongo NOD, e MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) foi a adressina predominante expressa por endotélio de ilhota de NOD em estágios inicias de insulite (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 25092515 (1993)). O tratamento de camundongos NOD com anticorpos anti- MAdCAM ou anti-07 preveniu o desenvolvimento de diabetes (Yang et al., Diabetes, 46:1542-1547 (1997)). Ainda, o acúmulo de linfócitos que expressam α4β7 dentro das ilhotas foi observado, e MAdCAM-1 foi envolvido na ligação das células de linfoma via α4β7 aos vasos de ilhotas inflamadas (Hanninen, A., et al., J. Clin. Invest., 92: 2509-2515 (1993)) ou ao trato gastrointestinal em linfoma de célula do manto (Geissmann et al., Am. J. Pathol., 153:1701-1705 (1998)).

[173] Exemplos de doenças inflamatórias associadas com tecidos de mucosa que podem ser tratadas usando uma formulação da invenção incluem colecistite, colangite (Adams e Eksteen Nature Reviews 6:244-251 (2006) Grant et al., Hepatology 33:1065-1072 (2001)), por exemplo, colangite esclerosante primária, doença de Behcet, por exemplo, do intestino, ou pericolangite (duto biliar e tecido circundante do fígado), e doença de enxerto versus hospedeiro (por exemplo, no trato gastrointestinal (por exemplo, após um transplante de medula óssea) (Petrovic et al. Blood 103:1542-1547 (2004)). Como observado na doença de Crohn, a inflamação geralmente se estende além da superfície de mucosa, assim, as doenças inflamatórias crônicas, como sarcoidose, gastrite crônica, por exemplo, gastrite autoimune (Katakai et al., Int. Immunol., 14:167-175 (2002)) e outras condições idiopáticas podem ser passiveis de tratamento.

[174] A invenção ainda refere-se a um método para inibir a infiltração de leucócito de tecido de mucosa. A invenção ainda refere-se a um método para tratar câncer (por exemplo, um tumor positivo a α4β7, como linfoma). Outros exemplos de doenças inflamatórias associadas com tecidos de mucosa que podem ser tratados usando uma formulação da invenção incluem mastite (glândula mamária) e síndrome do intestino irritável.

[175] As doenças ou patógenos cujas etiologias exploram a interação de MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1) com α4β7 podem ser tratadas com um anticorpo anti-α4β7 em uma formulação descrita aqui. Exemplos de ditas doenças incluem distúrbios de imunodeficiência, como causados por vírus da imunodeficiência humana (Ver, por exemplo, WO2008140602).

[176] Uma formulação da invenção é administrada em uma quantidade efetiva que inibe a ligação de α4β7 integrina a um ligante do mesmo. Para a terapia, uma quantidade efetiva será suficiente para atingir o efeito terapêutico desejado (incluindo profilático) (como uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir ligação e/ou sinalização mediada por α4β7 integrina, assim inibindo a adesão de leucócito e infiltração e/ou respostas celulares associadas). Uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-α4β7, por exemplo, um título efetivo suficiente para manter saturação, por exemplo, neutralização, de α4β7 integrina, pode induzir resposta clínica ou remissão em doença intestinal inflamatória. Uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-α4β7 pode levar a cicatrização da mucosa em colite ulcerativa ou doença de Crohn. Uma formulação da invenção pode ser administrada em uma dose unitária ou várias doses. A dosagem pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica e pode ser dependente, por exemplo, da idade do indivíduo, sensibilidade, tolerância e bem estar geral. Exemplos de modos de administração incluem vias tópicas como administração nasal ou inalação ou transdérmica, vias enterais, como por um tubo de alimentação ou supositório, e vias parenterais, como administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intra-arterial, intraperitoneal, ou intravítrea. As dosagens apropriadas para anticorpos podem ser de cerca de 0,1 mg/kg peso corporal a cerca de 10,0 mg/kg peso corporal por tratamento, por exemplo, cerca de 2 mg/kg a cerca de 7 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 6 mg/kg, ou cerca de 3,5 a cerca de 5 mg/kg. Em modalidades particulares, a dose administrada é cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg. A dose total pode ser cerca de 22 mg, cerca de 50 mg, cerca de 72 mg, cerca de 125 mg, cerca de 165 mg, ou cerca de 432 mg. A dose total pode ser pelo menos 77 mg, pelo menos 125 mg ou pelo menos 356 mg. Em uma modalidade, a dose total é 165 mg. Em outra modalidade, a dose total é 108 mg. Em outra modalidade, a dose total é 216 mg.

[177] Modelagem e simulações (BERKELEY MADONNA™ software, University of California) usando dados de farmacocinética (PK) de estudos de disponibilidade de anticorpo anti-α4β7 ao longo do tempo após a administração pode avaliar os esquemas de dosagem potenciais para administração subcutânea ou intramuscular. Dados de PK podem ser avaliados para esquemas de indução e de manutenção. Outra abordagem de modelagem é a análise de farmacocinética/farmacodinâmica da população (ferramenta de modelagem de efeitos mistos não lineares NONMEM®, ICON plc, Dublin, Ireland). Ambos níveis de exposição e níveis mínimos podem ser analisados.

[178] Tipicamente, após direcionamento de, por exemplo, α4β7 integrina, a saturação é atingida, a concentração do anticorpo no sangue tem uma relação linear à dose administrada. Um anticorpo anti- α4β7 administrado por via subcutânea ou intramuscular tem cerca de 60% a cerca de 90% da biodisponibilidade de um anticorpo anti-α4β7 administrado por uma via intravenosa. Em um exemplo desta relação, se uma dose IV é assumida para ter uma biodisponibilidade de 100% e uma dose subcutânea demonstra ter uma biodisponibilidade de 69,5%, então, uma dose intravenosa de 300 mg pode ser combinada com uma dose 432 mg por administração subcutânea. Assim, uma dose de 150 mg intravenosa pode ser combinada por uma dose subcutânea de 216 mg a 69,5% em relação a biodisponibilidade. De modo semelhante, se uma dose subcutânea demonstra ter uma biodisponibilidade de 75% e uma dose intramuscular demonstra ter uma biodisponibilidade de 80%, então, para combinar uma dose intravenosa de 300 mg, a dose subcutânea pode ser 400 mg e a dose intramuscular pode ser 375 mg. As tabelas 40-43 nos exemplos ilustram estas relações e fornecem doses úteis e esquemas de dosagem de um anticorpo anti-α4β7.

[179] Em alguns aspectos, o regime de dosagem tem duas fases, uma fase de indução e uma fase de manutenção. Na fase de indução, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado em uma via que rapidamente fornece uma quantidade efetiva do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo apropriado para certos fins, como induzir tolerância imune ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou para induzir uma resposta clínica e amenizar os sintomas da doença intestinal inflamatória. Um paciente pode ser administrado com um tratamento em fase de indução quando primeiro estiver sendo tratado por um anticorpo anti-α4β7, quando estiver sendo tratado após uma ausência longa da terapia, por exemplo, mais do que três meses, mais do que quatro meses, mais do que seis meses, mais do que nove meses, mais do que um ano, mais do que dezoito meses ou mais do que dois anos uma vez que a terapia de anticorpo anti-α4β7 ou durante a fase de manutenção da terapia de anticorpo anti-α4β7 se há um retorno dos sintomas da doença intestinal inflamatória, por exemplo, uma recorrência da remissão da doença. Em algumas modalidades, o regime de fase de indução resulta em uma concentração mínima média maior, por exemplo, a concentração imediatamente antes da dose seguinte, do que a concentração mínima média no estado de equilíbrio mantida durante o regime de manutenção.

[180] Na fase de manutenção, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é administrado de uma forma que continua a resposta obtida por terapia de indução com um nível estável de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma. Um regime de manutenção pode prevenir o retorno dos sintomas ou recorrência da doença intestinal inflamatória. Um regime de manutenção pode fornecer conveniência ao paciente, por exemplo, ser um regime de dosagem simples ou requerer excursões pouco frequentes para o tratamento. Em algumas modalidades, o regime de manutenção pode incluir administração do anticorpo anti-α4β7 ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, por exemplo, em uma formulação descrita aqui, por uma estratégia selecionada do grupo que consiste em dose baixa, administração pouco frequente, autoadministração e uma combinação qualquer dos anteriores.

[181] Em uma modalidade, por exemplo, durante uma fase de indução de terapia, o regime de dosagem fornece uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-α4β7 ou fragmento de ligação ao antígeno em uma formulação descrita aqui para induzir a remissão de uma doença intestinal inflamatória em um paciente humano. Em algumas modalidades, a quantidade efetiva do anticorpo anti-α4β7 é suficiente para atingir cerca de 5 αg/ml a cerca de 60 αg/ml, cerca de 15 αg/ml a cerca de 45 αg/ml, cerca de 20 αg/ml a cerca de 30 αg/ml, ou cerca de 25 αg/ml a cerca de 35 αg/ml concentração sérica mínima média do anticorpo anti-α4β7 pelo fim da fase de indução. A duração da fase de indução pode ser cerca de quatro semanas, cerca de cinco semanas, cerca de seis semanas, cerca de sete semanas, ou cerca de oito semanas de tratamento. Em algumas modalidades, o regime de indução pode utilizar uma estratégia selecionada do grupo que consiste em dose alta, administração frequente, e uma combinação de dose alta e administração frequente do anticorpo anti-α4β7 ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, por exemplo, em uma formulação descrita aqui. O regime de indução pode ser uma vez, ou uma pluralidade de mais do que uma dose, por exemplo, pelo menos duas doses. Durante a fase de indução, uma dose pode ser administrada uma vez por dia, dia sim dia não, duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada dez dias, uma vez a cada duas semanas ou a cada três semanas. Em algumas modalidades, as doses de indução são administradas dentro das primeiras duas semanas de terapia com o anticorpo anti-α4β7. Em uma modalidade, regime de indução pode ser uma vez no início de tratamento (dia 0) e uma vez cerca de duas semanas após o início do tratamento. Em outra modalidade, a duração da fase de indução é de seis semanas. Em outra modalidade, a duração da fase de indução é de seis semanas e uma pluralidade de doses de indução é administrada durante as primeiras duas semanas.

[182] Em algumas modalidades, por exemplo, quando iniciando o tratamento de um paciente com doença intestinal inflamatória grave (por exemplo, em pacientes que falharam na terapia anti-TNF ), a fase de indução precisa ter uma duração maior do que para os pacientes com doença grave ou moderada. Em algumas modalidades, a fase de indução para um paciente com uma doença grave pode ter uma duração de pelo menos 6 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 10 semanas, pelo menos 12 semanas ou pelo menos 14 semanas. Em uma modalidade, um regime de indução para um paciente com uma doença grave pode incluir uma dose na semana 0 (início do tratamento), uma dose na semana 2 e uma dose na semana 6. Em outra modalidade, um regime de indução para um paciente com uma doença grave pode compreender uma dose na semana 0 (início do tratamento), uma dose na semana 2, uma dose na semana 6 e uma dose na semana 10.

[183] Em uma modalidade, por exemplo, durante uma fase de manutenção de terapia, o regime de dosagem mantém uma concentração sérica mínima no estado de equilíbrio média, por exemplo, a concentração platô imediatamente antes da dose seguinte, de cerca de 5 a cerca de 25 μg/mL, cerca de 7 a cerca de 20 μg/mL, cerca de 5 a cerca de 10 μg/mL, cerca de 10 a cerca de 20 μg/mL, cerca de 15 a cerca de 25 μg/mL ou cerca de 9 a cerca de 13 μg/mL of anticorpo anti- α4β7. Em outra modalidade, o regime de dosagem, por exemplo, durante uma fase de manutenção de terapia, mantém uma concentração sérica média no estado de equilíbrio de cerca de 20 a cerca de 30 μg/mL, cerca de 20 a cerca de 55 μg/mL, cerca de 30 a cerca de 45 μg/mL, cerca de 45 a cerca de 55 μg/mL ou cerca de 35 a cerca de 40 μg/mL de anticorpo anti-α4β7. Em outra modalidade, o regime de dosagem, por exemplo, durante uma fase de manutenção de terapia, mantém uma concentração sérica média de longo prazo, por exemplo, exposição (por exemplo, área sob a curva-tempo de concentração) de cerca de 15 a cerca de 40 μg/mL, cerca de 10 a cerca de 50 μg/mL, cerca de 18 a cerca de 26 μg/mL, ou cerca de 22 a cerca de 33 μg/mL de anticorpo anti-α4β7. Ainda em outra modalidade, o regime de dosagem, por exemplo, durante a terapia de manutenção, mantém uma concentração sérica média de longo prazo, por exemplo, exposição (por exemplo, área sob a curva-tempo de concentração) de cerca de 35 a cerca de 90 μg/mL, cerca de 45 a cerca de 75 μg/mL, cerca de 52 a cerca de 60 μg/mL ou cerca de 50 a cerca de 65 μg/mL de anticorpo anti-α4β7.

[184] A forma de dosagem final pode compreender a dose inteira em cerca de 0,5 ml, em cerca de 1 ml, em cerca de 1,5 ml em cerca de 2 ml, em cerca de 2,5 ml, em cerca de 3 ml da formulação de anticorpo.

[185] A forma de dosagem final para administração intravenosa pode estar em uma concentração de entre cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,0 a cerca de 1,1 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,1 mg/ml a cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml a cerca de 1,3 mg/ml, ou cerca de 1,3 mg/ml a cerca de 1,4 mg/ml. A forma de dosagem final pode estar em uma concentração de cerca de 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,1 mg/ml, cerca de 1,2 mg/ml, cerca de 1,3 mg/ml, cerca de 1,4 mg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 1,6 mg/ml, cerca de 1,8 mg/ml ou cerca de 2,0 mg/ml.

[186] A dose pode ser administrada uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 8 semanas ou uma vez a cada 10 semanas. Uma dose maior ou mais frequente, por exemplo, dia sim dia não, uma vez por semana, uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas ou uma vez a cada 4 semanas pode ser útil para induzir a remissão de doença ativa ou para tratar um novo paciente, por exemplo, para induzir tolerância ao anticorpo anti- α4β7. Uma dose uma vez a cada 2 semanas, uma vez a cada 3 semanas, uma vez a cada 4 semanas, uma vez a cada 5 semanas, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada 8 semanas ou uma vez a cada 10 semanas, pode ser útil para terapia preventiva, por exemplo, para manter a remissão de um paciente com doença crônica. Em um aspecto, o regime de tratamento é tratamento no dia 0, cerca de semana 2, cerca de semana 6 e cada 1 ou 2 semanas seguidas. Em outro aspecto, o regime de tratamento para indução é tratamento dia sim dia não por um total de 6 tratamentos.

[187] O regime de dosagem pode ser otimizado para induzir uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente. Em algumas modalidades, o regime de dosagem não altera a razão de CD4 para CD8 no fluido cerebroespinal de pacientes que recebem tratamento.

[188] Em alguns aspectos, uma remissão clínica durável, por exemplo, uma remissão clínica que é sustentada por pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro visitas com um médico cuidador dentro de um período de seis meses ou um ano após início do tratamento, pode ser obtida com um regime de dosagem otimizado.

[189] Em alguns aspectos, uma resposta clínica durável, por exemplo, uma resposta clínica que é sustentada por pelo menos 6 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos um ano, após o início de tratamento, pode ser obtida com um regime de dosagem otimizado.

[190] A formulação pode ser administrada via subcutânea em injeções únicas ou múltiplas. Por exemplo, o volume de uma injeção única pode variar de cerca de 0,5 ml a cerca de 3 ml. Em uma modalidade, o volume de uma injeção única pode ser cerca de 0,6 ml a cerca de 1,1 ml ou cerca de 1 ml a cerca de 3 ml. Em um aspecto, o volume de uma injeção única é cerca de 1 ml. O calibre da agulha usado para administrar a formulação via subcutânea pode ser cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29 ou cerca de 30G.

[191] A formulação pode ser administrada por via intramuscular em injeções únicas ou múltiplas. Por exemplo, o volume de uma injeção única pode variar de cerca de 0,5 ml a cerca de 5 ml. Em uma modalidade, o volume de uma injeção única pode ser cerca de 2 ml a cerca de 5 ml, cerca de 0,6 ml a cerca de 1,1 ml ou cerca de 1 ml a cerca de 3 ml. Em um aspecto, o volume de uma injeção única é cerca de 1 ml, cerca de 2 ml, cerca de 3 ml, cerca de 4 ml, ou cerca de 5 ml. A agulha usada para administrar a formulação via intramuscular pode ser cerca de 5/8”, cerca de 7/8”, cerca de 1”, cerca de 1,25”, cerca de 1,5”, cerca de 2”, ou cerca de 3”. O calibre da agulha pode ser entre 20- 22G para administração intramuscular.

[192] Em um aspecto, a invenção refere-se à um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória, em que o método compreende a etapa de administração a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) doses iniciais de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea dia sim dia não por seis doses; (b) seguidas por uma sétima e subsequentes doses de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea a cada duas semanas ou a cada quatro semanas conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[193] Em um aspecto, a invenção refere-se à um método para tratar um paciente humano que sofre de doença intestinal inflamatória, em que o método compreende a etapa de administração a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com o seguinte regime de dosagem: (a) uma dose intravenosa inicial de 300 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma infusão intravenosa; (b) seguida por uma segunda dose subsequente intravenosa de 300 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma infusão intravenosa cerca de duas semanas após a dose inicial; (c) seguidas começando na semana seis por uma terceira e subsequente doses de 165 mg de uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma como uma injeção subcutânea a cada semana, a cada duas semanas ou a cada três semanas conforme necessário; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[194] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um regime de dosagem para o tratamento terapêutico da doença intestinal inflamatória, em que o regime de dosagem compreende a etapa de: administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com um regime de dosagem subcutânea ou intramuscular que mantém uma concentração mínima sérica no estado de equilíbrio média de cerca de 9 a cerca de 13 μg/mL do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO: 11, CDR2 SEQ ID NO: 12, CDR3 SEQ ID NO: 13; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO: 8, CDR2 SEQ ID NO: 9, CDR3 SEQ ID NO: 10.

[195] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um regime de dosagem para o tratamento terapêutico da doença intestinal inflamatória, em que o regime de dosagem compreende a etapa de: administrar a um paciente que sofre de doença intestinal inflamatória, uma imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma contendo especificidade de ligação para integrina α4β7 humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região de ligação ao antígeno de origem não humana e pelo menos uma parte de um anticorpo de origem humana, em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma é administrada ao paciente de acordo com um regime de dosagem subcutânea ou intramuscular que mantém concentrações mínimas séricas no estado de equilíbrio médias de cerca de 35 a cerca de 40 μg/mL do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma; em que o regime de dosagem induz uma resposta clínica e remissão clínica na doença intestinal inflamatória do paciente; e ainda em que a imunoglobulina humanizada ou fragmento de ligação ao antígeno tem especificidade de ligação para o complexo α4β7, em que a região de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia leve e três regiões determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2, e CDR3) de uma região variável de cadeia pesada da sequência de aminoácido estabelecida aqui abaixo: cadeia leve: CDR1 SEQ ID NO:9, CDR2 SEQ ID NO:10, CDR3 SEQ ID NO:11; cadeia pesada: CDR1 SEQ ID NO:12, CDR2 SEQ ID NO:13, CDR3 SEQ ID NO:14.

[196] Em algumas modalidades, o método de tratamento, dose ou regime de dosagem reduz a probabilidade que um paciente desenvolverá uma resposta HAHA ao anticorpo anti-α4β7. O desenvolvimento de HAHA, por exemplo, como medido por anticorpos reativos ao anticorpo anti-α4β7, pode aumentar a depuração do anticorpo anti-α4β7, por exemplo, reduz a concentração sérica do anticorpo anti-α4β7, por exemplo, reduzir o número de anticorpo anti- α4β7 ligado a α4β7 integrina, assim, tornando o tratamento menos efetivo. Em algumas modalidades, para prevenir HAHA, o paciente pode ser tratado com um regime de indução seguido por um regime de manutenção. Em algumas modalidades, não há quebra entre o regime de indução e o regime de manutenção. Em algumas modalidades, o regime de indução compreende administrar uma pluralidade de doses de anticorpo anti-α4β7 ao paciente. Para prevenir HAHA, o paciente pode ser tratado com uma dose inicial alta, por exemplo, pelo menos 1,5 mg/kg, pelo menos 2 mg/kg, pelo menos 2,5 mg/kg, pelo menos 3 mg/kg, pelo menos 5 mg/kg, pelo menos 8 mg/kg, pelo menos 10 mg/kg ou cerca de 2 a cerca de 6 mg/kg, ou administrações iniciais frequentes, por exemplo, cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez a cada duas semanas ou cerca de a cada três semanas, do dose padrão quando iniciando a terapia com um anticorpo anti-α4β7. Em algumas modalidades, o método de tratamento mantém pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos pacientes como HAHA-negativo. Em outras modalidades, o método de tratamento mantém pacientes como HAHA-negativos por pelo menos 6 semanas, pelo menos 10 semanas pelo menos 15 semanas, pelo menos seis meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, ou pela duração da terapia. Em algumas modalidades, os pacientes, ou pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% de pacientes que desenvolveram HAHA mantêm um título baixo, por exemplo, <125, de anticorpo anti-α4β7. Em uma modalidade, o método de tratamento mantém pelo menos 70% dos pacientes como HAHA-negativos por pelo menos 12 semanas após início da terapia com um anticorpo anti-α4β7.

[197] A formulação pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um humano) isolado ou em conjunto com outro agente. Uma formulação da invenção pode ser administrada antes, junto com ou subsequente à administração do agente adicional. Em uma modalidade, mais do que uma formulação que inibe a ligação de α4β7 integrina ao seu ligante é administrada. Em dita uma modalidade, um agente, por exemplo, um anticorpo monoclonal, como um anti-MAdCAM ou um anticorpo monoclonal anti-VCAM-1 pode ser administrado. Em outra modalidade, o agente adicional inibe a ligação de leucócitos a um ligante endotelial em uma via diferente da via de α4β7. Dito um agente pode inibir a ligação, por exemplo, de linfócitos que expressam receptor 9 de quimiocina (motivo C-C) (CCR9) à quimiocina expressa pelo timo (TECK ou CCL25) ou um agente que previne a ligação de LFA-1 à molécula de adesão intercelular (ICAM). Por exemplo, um anticorpo anti-TECK ou anti-CCR9 ou um inibidor de molécula pequena CCR9, como inibidores revelados na publicação PCT WO03/099773 ou WO04/046092, ou anticorpo anti-ICAM-1 ou um oligonucleotídeo que previne a expressão de ICAM, é administrado além de uma formulação da presente invenção. Ainda em outra modalidade, um ingrediente adicional ativo (por exemplo, um composto anti-inflamatório, como sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, ácido 5-aminosalicílico contendo anti- inflamatórios, outro composto anti-inflamatório não esteroidal, um composto anti-inflamatório esteroidal, ou antibióticos comumente administrados para controle de IBD (por exemplo, ciprofloxacina, metronidazol), ou outro agente biológico (por exemplo, antagonistas de TNF alfa) pode ser administrado em conjunto com uma formulação da presente invenção.

[198] Em uma modalidade, a dose de medicamento coadministrado pode ser reduzida ao longo do tempo durante o período de tratamento por uma formulação compreendendo p anticorpo anti- α4β7. Por exemplo, um paciente sendo tratado com um esteroide (por exemplo, prednisona, prednisolona) no início, ou antes de, tratamento com a formulação de anticorpo anti-α4β7 submeter-se a um regime de doses decrescentes de esteroide começando o mais cedo como 6 semanas de tratamento com a formulação de anticorpo anti-α4β7. A dose de esteroide será reduzida em cerca de 25% dentro de 4-8 semanas do início da redução, em 50 % em cerca de 8-12 semanas e 75% em cerca de 12-16 semanas da redução durante o tratamento com a formulação do anticorpo anti-α4β7. Em um aspecto, em cerca de 1624 semanas de tratamento com a formulação de anticorpo anti-α4β7, dose de esteroide pode ser eliminada. Em outro exemplo, um paciente sendo tratado com um composto anti-inflamatório, como 6- mercaptopurina no início, ou antes, do tratamento com a formulação de anticorpo anti-α4β7 poderia se submeter a um regime de doses reduzidas de composto anti-inflamatório semelhante ao regime de redução para a dosagem de esteroide como notado acima.

[199] Em uma modalidade, o método compreende administrar via subcutânea ou administrar via intramuscular uma quantidade efetiva de uma formulação da invenção a um paciente. Em outra modalidade, a formulação pode ser preparada para autoadministração.

[200] Se a formulação está em um estado sólido, por exemplo, seco, o processo de administração pode compreender uma etapa de conversão de uma formulação a um estado líquido. Em um aspecto, uma formulação seca pode ser reconstituída, por exemplo, por um líquido como descrito acima, para uso em injeção, por exemplo, injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em outro aspecto, uma formulação sólida ou seca pode ser administrada via tópica, por exemplo, em um adesivo, creme, aerossol ou supositório.

[201] A invenção ainda refere-se a um método para tratar uma doença associada com infiltração de leucócito de tecidos que expressam a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1). O método compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 da invenção. Em uma modalidade, a doença é doença do enxerto versus hospedeiro. Em algumas modalidades, a doença é uma doença associada com infiltração de leucócito de tecidos como um resultado de ligação de leucócitos que expressam α4β7 integrina ao endotélio associado ao intestino que expressa a molécula MAdCAM (por exemplo, MAdCAM-1). Em outras modalidades, a doença é gastrite (por exemplo, gastrite eosinofílica ou gastrite autoimune), pancreatite, ou diabetes melitus dependente de insulina. Ainda em outras modalidades, a doença é colecistite, colangite, ou pericolangite.

[202] A invenção ainda refere-se a um método para tratar doença intestinal inflamatória em um paciente. Em uma modalidade, o método compreende administrar via subcutânea ao paciente uma quantidade efetiva de uma formulação de anticorpo anti-α4β7 da invenção. Em algumas modalidades, a doença intestinal inflamatória é colite ulcerativa ou doença de Crohn. Em outras modalidades, a doença intestinal inflamatória é doença celíaca, enteropatia associada com artropatias soronegativas, colite microscópica ou colagenosa, gastroenterite (por exemplo, gastroenterite eosinofílica), ou pouchite.

[203] Em algumas modalidades, tratamento com um anticorpo anti-α4β7 não altera a proporção de linfócitos CD4:CD8. Proporções de CD4:CD8 podem ser medidas em sangue, aspirato de linfonodo, e fluido cerebroespinal (CSF). As proporções de linfócitos CSF CD4+:CD8+ em indivíduos saudáveis são tipicamente mais do que ou iguais a cerca de 1. (Svenningsson et al., J. Neuroimmunol. 1995;63:39-46; Svenningsson et al., Ann Neurol. 1993; 34:155-161). Um imunomodulador pode alterar a proporção de CD4:CD8 a menos do que 1.

Artigos de Fabricação

[204] Em outro aspecto, a invenção é um artigo de fabricação que contém a formulação farmacêutica da presente invenção e fornece instruções para seu uso. O artigo de fabricação compreende um recipiente. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de duas câmaras, um frasco de formulação líquida com ou sem uma agulha, um frasco de formulação sólida com ou sem um frasco de líquido de reconstituição com ou sem uma agulha), seringas (como seringas de duas câmaras, seringas pré- carregadas, um autoinjetor), cartuchos, e tubos de teste. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais como vidro, metal ou plástico. O recipiente mantém a formulação e um rótulo em, ou associado com, o recipiente pode indicar instruções para uso. Em outra modalidade, a formulação pode ser preparada para autoadministração e/ou conter instruções para autoadministração. Em um aspecto, o recipiente mantendo a formulação pode ser um frasco de uso único. Em outro aspecto, o recipiente mantendo a formulação pode ser um frasco de vários usos, que permite administração repetida (por exemplo, de 26 administrações) da formulação, por exemplo, usando mais do que uma parte de uma formulação reconstituída. O artigo de fabricação pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso como notado na seção acima.

[205] Em uma modalidade, o artigo de fabricação é uma seringa com uma agulha. O calibre da agulha pode ser 25 G, 26 G, 27 G, 29 G, 30 G. Uma agulha de parede fina, por exemplo, 19 G ou 23 G, ou maior, pode facilitar a injeção de uma formulação de alta viscosidade. Em um aspecto, o calibre da agulha é 27 G ou mais. O comprimento da agulha pode ser apropriada para administração subcutânea, e pode ser cerca de 1/2 polegada, cerca de 5/8 de polegada ou 1 polegada de comprimento. Em algumas modalidades, a seringa é uma seringa preenchida.

Desenvolvimento de produto de seringa preenchida

[206] Em alguns aspectos, há vários atributos de produto que são desejados para um produto de proteína (por exemplo, um anticorpo anti- α4β7) em uma seringa preenchida (PFS) (por exemplo, para uso na administração de uma formulação para liberação subcutânea ou intramuscular). É ainda útil para equilibrar alguns dos atributos para mitigar os efeitos de competição. Por exemplo, quando um volume de injeção baixo é desejado, uma concentração de alta proteína para a formulação pode ser preferencial. No entanto, no caso de uma concentração de proteína alta, pode haver taxas maiores de formação de impureza (por exemplo, impurezas agregadas que vazam na formulação da seringa) e forças manuais maiores necessárias para operar a seringa. Uma agulha de tamanho pequeno para o conforto do paciente no local da injeção, pode requerer mais forças para operar a seringa. Um entendimento de como a estabilidade e desempenho do produto são afetados por ambos parâmetros de formulação e seringa como concentração da proteína, pH, e diâmetro interno da agulha auxiliam o desenvolvimento de um produto de proteína (por exemplo, um anticorpo anti-α4β7 em uma seringa preenchida).

[207] Em um aspecto, um método para desenvolver um produto de proteína (por exemplo, um anticorpo anti-α4β7) para uso em uma seringa preenchida compreende variados parâmetros de seringa e parâmetros de formulação juntos, por exemplo, em um modo coordenado ou simultaneamente. Isso pode levar a um melhor entendimento da faixa de estabilidade de proteína e desempenho de produto que pode ser esperado de um produto de proteína em uma seringa preenchida do que se cada aspecto é variado separadamente ou em série.

[208] O desenvolvimento de um produto em seringa preenchida (por exemplo, um anticorpo anti-α4β7) refere-se ao entendimento que em algum ponto, há uma formulação líquida em contato com vários componentes da seringa preenchida (Figura 15). Por exemplo, a formulação pode estar em contato com um cilindro de seringa, que pode ser construído de vidro (por exemplo, vidro de borossilicato tipo I) ou plástico (por exemplo, polímero de olefina cíclica (COP), copolímero de olefina cíclica (COC), polipropileno ou politetrafluoroetileno). A formulação pode estar em contato com a seringa, êmbolo e/ou tampa da ponta, que podem ser elastoméricas (por exemplo, dos mesmos materiais ou diferentes (por exemplo, plástico, como polietileno, poliestireno ou polipropileno ou elástico, como borracha (natural, sintética, butil) ou silicone)). A formulação pode estar em contato com um lubrificante que é adicionado a uma superfície interna do cilindro para facilitar o movimento do êmbolo. O lubrificante pode ser, por exemplo, óleo de silicone, óleo mineral ou glicerina. Na modalidade da seringa de agulha delimitada, pode haver uma agulha de liga metálica (por exemplo, agulha de aço inoxidável e adesivo usado para coletar a agulha no lugar). Uma consideração para um produto de proteína em uma seringa preenchida é aquela que a solução de proteína líquida está em contato direto com um ou mais destes componentes da seringa ao longo da vida útil do produto. Ambos os componentes da formulação e da seringa podem ter um impacto na estabilidade do produto.

[209] Os parâmetros de formulação que podem afetar a estabilidade do produto de seringa preenchida incluem concentração de proteína, pH, tipo de tampão, concentração de tampão, força iônica, tipo de estabilizador, e concentração do estabilizador. Exemplos de estabilizadores para formulações de proteína incluem, por exemplo, sais iônicos, polissacarídeos, aminoácidos, antioxidantes, quelantes, e surfactantes como descrito nas seções anteriores.

[210] Os componentes da seringa que podem afetar a estabilidade do produto de seringa preenchida incluem, por exemplo, lubrificante, composição de êmbolo e tampa da ponta, e impurezas. A quantidade de lubrificante (por exemplo, óleo de silicone no cilindro da seringa) pode afetar a estabilidade do produto. A composição de êmbolo e tampa da ponta, que pode afetar a permeabilidade de oxigênio destes componentes e introduz lixiviáveis destes componentes no produto de proteína (por exemplo, a formulação de anticorpo anti-α4β7) pode ainda afetar a estabilidade do produto. Outro parâmetro da que pode afetar a estabilidade do produto inclui o tipo e/ou quantidade de impurezas (por exemplo, metal pesado (por exemplo, tungstênio)) que pode lixiviar na formulação do produto (por exemplo, do cilindro (por exemplo, cilindro de vidro) e/ou agulha (por exemplo, agulha de aço inoxidável)). (ver ainda Ludwig et al. J. Pharm. Sci. 99:1721-1733 (2010); Nashed-Samuel et al., American Pharmaceutical Review Jan/Feb:74-80 (2011); Badkar et al. AAPS PharmSciTech 12:564-572)

[211] Uma seringa preenchida pode ser injetada manualmente ou usada com um dispositivo autoinjetor. O teste funcional da seringa preenchida inclui a medição da força de soltura, a força requerida para iniciar o movimento do êmbolo, e a força de deslizamento, a força necessária para injetar os conteúdos da seringa em uma taxa constante. O desempenho mecânico da seringa preenchida pode ser dependente de várias formulações e parâmetros da seringa como a viscosidade da formulação e a quantidade de lubrificante (por exemplo, óleo de silicone) na seringa.

[212] Vários atributos dos produtos de proteína em seringas preenchidas e fatores de formulação ou da seringa que podem impactar aqueles atributos do produto são mostrados na Tabela 1. Muitos atributos do produto podem ser uma função complexa de vários parâmetros da formulação e da seringa. Por exemplo, a força de deslizamento da seringa é uma função da viscosidade de formulação, embora a viscosidade possa ser dependente de vários fatores de formulação, como concentração da proteína, concentrações de estabilizador, e pH. Tabela 1: Atributos de Produto para Produtos de Proteína em Seringas Preenchidas e a Formulação Potencial e Parâmetros de Seringa que podem Impactar Estes Atributos

[209] Em um aspecto, um surfactante, como polissorbato 20 ou polissorbato 80 pode ser adicionado às formulações de proteína em seringas preenchidas (por exemplo, para prevenir que as moléculas de proteína adsorvam ou desnaturem nas interfaces de líquido/ar e/ou líquido/lubrificante (por exemplo, óleo de silicone)). A adsorção em superfície e desnaturação de moléculas de proteína podem ser um mecanismo para a nucleação de partículas de proteínas visíveis e subvisíveis. A adição de um surfactante à uma seringa preenchida, portanto, pode reduzir a formação de partículas visíveis e subvisíveis em produtos de seringa preenchida. Em uma modalidade, uma pequena quantidade de surfactante pode emulsificar lubrificante (por exemplo, gotículas de óleo de silicone na solução e, assim, a formação de lubrificante subvisível e visível (por exemplo, gotículas de óleo de silicone)) (Ludwig et al., supra). Em outra modalidade, a quantidade de surfactante em uma formulação é minimizada, devido aos efeitos danosos potenciais de grandes quantidades nas formulações de proteína. Impurezas de peróxido em polissorbatos podem levar a uma oxidação de proteína aumentada (Wang and Wang J. Pharm. Sci. 91:2252-2264 (2002)). Grandes quantidades de surfactante podem emulsificar uma quantidade significativa de óleo de silicone a partir das paredes da seringa e leva a um aumento na força de deslizamento funcional sobre a vida útil. Os estudos de desenvolvimento de produto podem ser projetados para avaliar o efeito de níveis variados de surfactante em ambos estabilidade do produto e desempenho da seringa.

[210] As interações complexas entre a formulação e os parâmetros da seringa nos sistemas de proteína/PFS são passíveis de avaliação destes sistemas usando uma abordagem Quality by Design (QbD) ou Design of Experiments (DOE). Estudos podem ser projetados que simultaneamente variem parâmetros de formulação e de seringa para obter um melhor entendimento destes sistemas complexos. Isto resulta em uma abordagem compreensiva ao desenvolvimento de produtos de seringa preenchida. A Tabela 2 mostra um exemplo dos parâmetros de entrada e níveis que podem passar por um desenho de experimento para um produto de seringa preenchida e um exemplo do teste analítico a ser empregado. Dependendo do tipo de desenho experimental que é usado para o estudo QbD, o número de experimentos poderia variar de 9 para um desenho de triagem para 81 para um desenho fatorial completo (todas as possíveis combinações). Quanto maior o número de experimentos, maior o número de interações entre parâmetros de produto que podem ser resolvidos. Software projetado para esta análise, por exemplo, software de descoberta estatística JMP® (Cary, NC), pode ser útil para estudos QbD. Esta análise resulta em um entendimento quantitativo de como os parâmetros de formulação e de seringa interagem para impactar os atributos do produto. Tabela 2: Exemplo de um Desenho Experimental para um Produto de Proteína Líquida em uma Seringa Preenchida

[211] Um exemplo de um modelo preditivo que pode ser obtido a partir do experimento do exemplo mostrado na Tabela 2 é mostrado abaixo, onde Cn são constantes numéricas.

[212] Formação de agregado solúvel ao longo do tempo = C0 + C1 [Concentração de proteína] + C2 [Concentração de proteína]2 + C3 [ pH] + C4 [Concentração de surfactante] + C5 [quantidade de lubrificante]

[213] Vários parâmetros de seringa podem afetar a estabilidade de produto e desempenho, portanto, uma modalidade inclui caracterização de como as tolerâncias permissíveis nos parâmetros da seringa afetam a estabilidade de produto e desempenho. A quantidade de lubrificante (por exemplo, óleo de silicone) no cilindro da seringa pode variar 50100% de seringa para seringa. Esta variação na quantidade pode afetar várias características de produto como mostrado na Tabela 1. O diâmetro interno do cilindro da seringa pode variar de seringa para seringa que afeta as forças de injeção. Para seringas de agulha delimitadas (fixa), o diâmetro interno pode variar de lote para lote ou de fabricante para fabricante, que irão afetar as forças de injeção. Ao usar uma abordagem QbD para avaliar como os parâmetros da seringa afetam o desempenho, modelos preditivos podem ser obtidos que podem ser usados para estimar como as tolerâncias permissíveis nos parâmetros da seringa podem afetar o desempenho do produto. Os modelos preditivos que são obtidos usando uma abordagem QbD podem ser usados para selecionar os parâmetros de formulação e de seringa que atingem os atributos de produto desejados e para prever a estabilidade do produto e desempenho.

[214] A seringa preenchida pode conter uma adição de emulsão de silicone ou tungstênio à formulação de proteína. Quantidades exemplares de silicone que podem estar presentes na seringa preenchida variam de cerca de 0,3 mg a cerca de 0,8 mg. Em um aspecto, a quantidade de silicone que pode estar presente na seringa preenchida é cerca de 0,3 mg, cerca de 0,4 mg, cerca de 0,5 mg, cerca de 0,6 mg, cerca de 0,7 mg, ou cerca de 0,8 mg. Em outro aspecto, a viscosidade da formulação irá variar de 2 a 60 cP, resultando em forças de injeção de 5N a 80N em uma velocidade de 200 mm/min. Ainda em outro aspecto, a viscosidade da formulação irá variar de 4 a 27 cP resultando em forças de injeção de 10 N a 40 N em uma velocidade de 200 mm/min.

[215] A invenção será mais bem entendida por referência aos seguintes exemplos. Não deve, no entanto, ser interpretados como limitando o escopo da invenção. Toda a literatura e citações de patente são incorporadas aqui por referência.

PROOCOLO PARA PREPARO DA FORMULAÇÃO

[216] Uma solução de anticorpo anti-α4β7 é diafiltrado em um sistema de filtração de fluxo tangencial para atingir uma concentração especificada em citrato, histidina, tampão arginina, então agrupado e misturado com uma solução de polissorbato 80 em citrato, histidina, tampão arginina. A solução é armazenada a -70°C em garrafas de 2L ou 5L. A solução é então descongelada e filtrada duas vezes por um filtro 0,2 μm. Aproximadamente 1,0 mL é envasado em uma seringa esterilizada e fechada com um êmbolo esterilizado (rolha). A formulação é armazenada e o produto de droga final é transportado em seringas a 2-8°C.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 FABRICAÇÃO DA FORMULAÇÃO Fatores Concentrações de Excipiente

[217] A formação de agregados na formulação de anticorpo foi testada. Um modelo de agregados SEC foi desenvolvido a partir de dados experimentais que avaliaram a concentração de proteína, pH, e razão molar de surfactante:proteína. Em uma faixa de pH de 6,0 a 6,5, a formação de agregados foi semelhante com o polissorbato 80 à uma razão molar de proteína de 0,7 a 1,5. (Fig 6). Geralmente, em proporções de PS80:proteína mais do que 1,5 a taxa de formação de agregados aumenta com pH crescente. (Fig 7).

[218] Um experimento avaliando a formação de agregados SEC na presença de ar foi realizado. Onze diferentes formulações de composição variantes foram colocadas em frascos de borossilicato e tampadas com rolhas elastoméricas com um espaço aéreo de ar. Um conjunto idêntico de formulações foi criado, e o espaço aéreo de ar foi deslocado com argônio. Estas amostras foram colocadas em estabilidade a 40°C por duas semanas. Todas as amostras com espaço aéreo de ar resultaram em grandes quantidades de agregados ao fim do experimento em comparação à mesma formulação com o espaço aéreo de argônio. Tabela 3

[219] Baseado nestes experimentos, foi hipotetizado que agregados SEC se formam por oxidação ou por formação de ligação dissulfeto. A adição de antioxidantes e/ou quelantes foi explorada. Uma formulação contendo Histidina 40 mM, Arginina 90 mM, e 160 mg/mL de proteína com uma razão molar de polissorbato 80 para proteína de 1,5 em pH 6,6 foi preparada. À formulação, citrato 25 mM, citrato 5 mM, EDTA 5 mM, cisteína 25 mM, ou cisteína 5 mM foram adicionados. Todos os 3 excipientes adicionais reduziram a formação de agregados (Fig 8). A adição de antioxidantes e/ou quelantes foram ranqueados em ordem de desempenho como citrato>EDTA>cisteína. Citrato ou 5 ou 25 mM reduziu a formação de agregados SEC em comparação à formulação de controle.

[220] Um experimento foi realizado para determinar os efeitos de pH, concentração de proteína, concentração de citrato, concentração de histidina e a razão molar de polissorbato 80 para proteína. O pH foi variado de 6,0 a 6,3, a concentração de proteína foi variada de 60 a 160 mg/mL, a concentração de citrato foi variada de 0 a 25 mM, a concentração de histidina foi variada de 25 a 50 mM, e a razão molar de polissorbato 80 para proteína foi variado de 0,7 a 1,5. As formulações foram envasadas em seringas de 1 ml, 27G1/2” (0,55 +/- 0,2 mg silicone). Todas as formulações continham aproximadamente arginina 125 mM.

[221] A estabilidade foi testada a 40°C por duas semanas, usando CEX e SEC. Os resultados (Fig. 9 e Tabela 4) mostram uma redução na formação de agregado com a presença de citrato 25 mM na formulação, enquanto aumentando a concentração de proteína aumentou a taxa de formação de agregado. A quantidade de monômero mostra tendências opostas à formação de agregado a 25°C e 40°C, enquanto a 5°C a quantidade de monômero é essencialmente inalterada por até 24 meses (Tabela 5).

[222] Outro conjunto de formulações explorou a taxa de formação de agregados SEC na presença de 40-63 mM citrato mas sem histidina a 40°C, 25°C, 5°C. A taxa de formação de agregado nestas formulações foi ligeiramente maior do que as formulações com histidina a 40°C. No entanto, a 5°C, a taxa de formação de agregados nas formulações com citrato e sem histidina foram comparáveis às formulações contendo citrato e histidina (Tabela 6). Ainda, a 5°C, a quantidade de monômero é essencialmente inalterada for até 24 meses (Tabela 7). Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 pH

[223] Vários experimentos de pH foram realizados para determinar os efeitos de pH em degradação CEX a 5°C. A formulação de anticorpo vedolizumabe compreendeu 160 mg/ml de anticorpo anti-α4β7, arginina 125 mM, histidina 50 mM, e citrato 25 mM. Vários níveis diferentes de pH, 6,3, 6,5, 6,7 e 6,9 foram testados para estabilidade a 40°C, 25°C e 5°C.

[224] Os modelos CEX a 40°C mostram (FIG. 10) que pH influencia a degradação de CEX na maior parte. O pH das formulações contendo histidina reduz com aumento de temperatura, no entanto, o pH de formulações citrato demonstrou não ser afetado por temperatura (FIG. 11). A formulação de histidina/citrato foi determinada como tendo uma boa estabilidade em um pH de 6,8 a 40°C após 1 semana, 6,3-6,5 a 25°C após 6 meses e 6,3-6,5 a 5°C após 6 meses. Baseado em estudos adicionais, a estabilidade de formulações foi semelhante a 25°C e 5°C para uma faixa de pH de 6,2 a 6,9 (Tabelas 8 e 9). Tabela 8 Tabela 9

EXEMPLO 2 ESTABILIDADE

[225] Quatro diferentes formulações de anticorpo anti-α4β7 foram testadas para estabilidade ao longo do curso de doze meses. As formulações contendo um pH de 6,0-6,2 demonstraram aproximadamente 1-2% menos espécies principais do que as formulações contendo um pH de 6,3-6,4 (FIG. 12). As formulações contendo um pH de 6,3-6,4 mostraram menos do que 1% alteração em espécies básicas ou principais a 5°C.

[226] Dez diferentes formulações anticorpo anti-α4β7 foram testadas para estabilidade por SEC ao longo do curso de doze meses (Tabela 10). As formulações com 60 mg/mL concentração de proteína e contendo citrato 25 mM tiveram uma alteração em agregados de 0,10,2% após 1 ano, enquanto as formulações contendo 160 mg/mL de proteína e citrato 25 mM tiveram um aumento de agregados de 0,2-0,3% por 1 ano. Houve um aumento de 0,4-0,6% de agregados para as formulações contendo 60, 110, ou 160 mg/mL de proteína sem citrato. Tabela 10

EXEMPLO 3 VISCOSIDADE

[227] A força de injeção necessária para administrar a formulação farmacêutica está relacionada à viscosidade da formulação. As formulações com pH variados e concentrações variadas de proteína, arginina, histidina, citrato, sacarose, e polissorbato 80 foram realizadas. A viscosidade destas formulações foi testada. Um modelo estatístico de Ln (viscosidade) foi desenvolvido. O modelo mostrou que a viscosidade é afetada principalmente por concentração de proteína e pH (Fig. 13). Sacarose, histidina e arginina ainda podem ter um efeito menor na viscosidade. Em algumas formulações de proteína, cloreto de sódio é adicionado para reduzir a viscosidade da formulação. Sabe-se, no entanto, que o efeito de cloreto de sódio na viscosidade é dependente de proteína e da formulação.

[228] Cloreto de sódio foi adicionado à formulação contendo 140 mg/ml vedolizumabe, arginina 125 mM, histidina 25 mM, citrato 25 mM, e polissorbato 80 em uma razão molar de 1,5 polissorbato 80 para proteína, e um pH de 6,4. O NaCl não teve qualquer efeito na viscosidade da formulação.

[229] Os efeitos da viscosidade na força de injeção de várias seringas testadas são mostrados nas Figuras 16A e 16B.

EXEMPLO 4 MÉTODOS Cromatografia de troca catiônica (CEX)

[230] Um gradiente de fosfato/cloreto de sódio em uma coluna de troca catiônica fraca é usado em um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho para separar espécies carregadas em formulações de anticorpo anti-D4D7 e determinar a composição de carga das espécies de anticorpo. Isoformas ácidas eluem antes da isoforma principal e isoformas básicas eluem após a isoforma principal.

[231] Os dados de estabilidade para uma formulação de vedolizumabe gerada usando um ensaio CEX indicou que o % de isoforma principal foi acima de 55,0%.

Focagem isoelétrica capilar (cIEF)

[232] cIEF é realizado usando uma coluna completa iCE280 em sistema de detecção cIEF (Convergent Biosciences, Toronto, Ontario). A escolha do anfolito pode ser recomendada pelo fabricante ou pode ser uma combinação de anfolitos comercialmente disponíveis. Uma combinação útil é uma mistura de 3-10 e 5-8 PHARMALYTE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[233] Os dados de estabilidade para uma formulação de vedolizumabe gerada usando um ensaio cIEF indicou que o % de isoforma principal foi cerca de 53%, o % de espécies ácidas foi cerca de 42% e o % de espécies básicas foi cerca de 5%. Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)

[234] SEC é realizada usando uma coluna analítica SEC (Tosoh Bioscience, LLC, King of Prussia, PA). A fase móvel é uma solução de salina tamponada em fosfato e a absorbância é monitorada a 280 nm.

[235] Os dados de estabilidade para uma formulação de vedolizumabe gerada usando um ensaio SEC indicou que o % de monômero foi 99,0%, o % de agregados foi <0,5% e o % de substâncias de baixo peso molecular foi <1,0%. Ens

io SDS-PAGE

[236] SDS-PAGE é realizado usando um Invitrogen (Carlsbad, CA) Tris-Glicina gel, 4-20% para condição redutora e 4-12% para condição não redutora. A formulação de anticorpo reconstituído é diluída em tampão de formulação líquida, em seguida, diluída uma a duas com tampão de amostra Tris-Glicina SDS (Amostra 2X, Invitrogen) com 10% 2-mercaptoetanol (tampão de amostra redutor) ou sem 2- mercaptoetanol (tampão de amostra não redutor). As amostras são brevemente aquecidas e carregadas em comparação com um marcador de alto peso molecular (Invitrogen). Os géis são corados com azul coomassie coloidal (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As bandas de proteína são analisadas por densitometria para identificar o % de cadeia pesada e cadeia leve e % IgG para géis não reduzidos.

Efiácia de ligação

[237] Células HuT78 (células de linfoma de célula T humana, American Type Culture Collection, Manassas, VA) suspensas em 1% BSA em PBS, 0,01% azida sódica são contatadas com diluições seriais de anticorpo de teste primário. Após incubação em gelo, as células são lavadas e tratadas com anticorpo secundário fluorescentemente marcado. Após outra lavagem, as células são fixadas e suspensas em reagente FACS para análise por citometria de fluxo (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ); ver ainda patente US 7.147.851.

Umiade por Karl Fischer

[238] A formulação é titulada com metanol para uma determinação de umidade coulométrica de Karl Fischer.

EXEMPLO 5 Efeitos de Silicone de Produtos em Seringa Preenchida com Formulação de Anticorpo anti-α4β7

[239] Uma formulação subcutânea que consiste em 60-160 mg/mL de proteína anti-α4β7 em um tampão contendo L-Histidina, L-Arginina Cloridrato, Citrato e Polissorbato 80 é usada para estudar os efeitos de silicone na estabilidade de formulações de proteína e atributos de recipiente/fechamento. O estudo é realizado com um envase de 0,5 mL.

[240] Os parâmetros incluindo a concentração de proteína, a razão molar de polissorbato 80 para proteína, e a quantidade de silicone que é pulverizada nos barris de seringa são explorados. A faixa de cada um dos parâmetros de entrada é mostrada na Tabela 11. Tabela 11. Faixas de parâmetro de entrada

[241] Um desenho de experimento é usado para determinar o conjunto de formulações para o estudo. Um número razoável de formulações varia de 6 a 8 formulações. Um exemplo de formulações que são testadas é mostrado na tabela 12. Tabela 12

[242] Alguns controles podem ser adicionados ao conjunto de formulações e testados em alguns poucos pontos de tempo seletivos.

[243] Estas formulações são colocadas em estabilidade em várias temperaturas diferentes (por exemplo, 5°C, 25°C/60%RH, 40°C/75% RH) e puxadas em vários pontos de tempo (por exemplo, 0 semana, 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas, 6 meses, e 12 meses) para testagem. Os controles são testados em 0 semana, 12 semanas, 6 meses e 12 meses.

[244] Os testes que são realizados em cada extração de tempo de estabilidade incluem SEC, CEX, Instron, MFI, e quantificação de Silicone. 1 seringa é testada para Instron, com o material expelido sendo usado para SEC, CEX, medidas de força de injeção e imagem de microfluxo (MFI), e quantificação de silicone.

EXEMPLO 6 Análise de Componentes de Seringa preenchida com formulação de Anticorpo Anti-α4β7

[245] Este estudo explorou como os vários fabricantes de seringa, materiais elastoméricos de êmbolo (rolha), e a quantidade de PS80 na formulação afetou as propriedades mecânicas do sistema e a estabilidade da formulação.

[246] Um desenho de experimento foi criado explorando 3 diferentes fabricantes de seringa, 2 diferentes tipos de material de êmbolo (rolha), e 2 proporções molares diferentes de PS80 para proteína. O resto da formulação foi mantida constante a 170 mg/mL de proteína, arginina 125 mM, histidina 50 mM, citrato 25 mM, e um pH de 6,5. O tamanho da agulha nestas seringas preenchidas foi 27G ^’ ou 29G ^” de parede fina. Os experimentos realizados são detalhados na Tabela 15.

[247] As entradas do desenho experimental para a parte ativa do experimento são mostradas abaixo na Tabela 13, enquanto as constantes são mostradas na Tabela 14. O desenho experimental foi criado utilizando as entradas mostradas na Tabela 13.

[248] A lista de experimentos é mostrada na Tabela 10. Tabela 13. Variáveis DOE e níveis com formulações ativas Tabela 14. Constantes para formulação ativa Tabela 15. Detalhes experimentais

[249] Uma formulação concentrada da formulação anti-α4β7 e concentrada com polissorbato 80 e diluída abaixo de 170 mg/mL. A composição da formulação inicial é mostrada abaixo na Tabela 16. Tabela 16. Detalhes de tampão de formulação de partida

[250] Para a diluição do material à composição de formulação desejada, soluções estoque de PS80 em 25 mM Citrato, histidina 50 mM, arginina 125 mM, pH 6,48 são preparadas. Tabela 17. Detalhes de solução estoque

[251] O regime de diluição para a formulação é detalhado na Tabela 18. Tabela 18. Detalhe de diluição

[252] A manipulação é realizada baseado no regime de diluição e a formulação inicial deve ser pesada, enquanto as outras soluções estoques podem ser pipetadas volumetricamente. As formulações são filtradas. 0,5 mL de formulação é aliquotada no maior número possível de seringas de 1 mL. As seringas são fechadas por máquina de recravação com uma bolha de 2-4 mm. Para cada ponto de tempo, há uma seringa armazenada com agulha pra baixo e uma seringa armazenada lateralmente. As seringas extra são armazenadas com a agulha para baixo.

[253] As seringas são testadas a 5, 25 e 40°C na semana 2 e no mês um. Testes analíticos (aparência, Instron, pH, osmolalidade, densidade, viscosidade, SEC, CEX, e Brightwell) são realizados inicialmente e então novamente em 2 semanas a 25 e 40°C e em 4 semanas a 25°C.

EXEMPLO 7 Análise de fechamentos de recipientes subcutâneos usados em seringas com agulha de 27 G de parede fina preenchidas com formulação de anticorpo anti-α4β7

[254] Este estudo explora como vários modelos de seringa com uma agulha de 27G em espessura de parede e vários fabricantes de êmbolo (rolha) e modelos afetam as propriedades mecânicas e a estabilidade da formulação sobre o tempo.

[255] Este estudo explora como a estabilidade da formulação líquida subcutânea de anti-α4β7 em uma seringa preenchida e as propriedades mecânicas da seringa são afetadas pelo fabricante da seringa e o modelo do êmbolo (rolha) para seringas com uma agulha 27GTW. Os dados gerados destes estudo podem determinar os componentes do recipiente/fechamento para a formulação líquida subcutânea anti-α4β7.

[256] As entradas do desenho experimental são mostradas abaixo na Tabela 19, enquanto as constantes são mostrados na Tabela 20. O desenho experimental foi criado utilizando as entradas mostradas na Tabela 19.

[257] A lista de experimentos a ser realizados é mostrada na Tabela 21. Tabela 19. Variáveis DOE e níveis com formulação ativa Tabela 20. Constantes para formulação ativa Tabela 21. Detalhes experimentais

[258] Uma formulação concentrada da formulação anti-α4β7 é concentrada com polissorbato 80 e diluída abaixo de 160 mg/mL. A composição da formulação inicial é mostrada abaixo na Tabela 22. Tabela 22. Detalhes de tampão de Formulação inicial

[259] Para a diluição do material à composição de formulação desejada, soluções estoque de PS80 em Citrato 25 mM, Histidina 50 mM, Arginina 125 mM, pH 6,3 são preparadas. Tabela 23. Detalhes de solução estoque

[260] O regime de diluição para a formulação é detalhado na Tabela 24. Tabela 24. Detalhe de diluição

[261] A manipulação é realizada baseado no regime de diluição e a formulação inicial deve ser pesada, enquanto as outras soluções estoques podem ser pipetadas volumetricamente. As formulações são filtradas. 0,5 mL de formulação é aliquotada no maior número possível de seringas de 1 mL. As seringas são fechadas por máquina de recravação com uma bolha de 2-4 mm. Para cada ponto de tempo, há uma seringa armazenada com agulha para baixo (posição horizontal).

[262] As seringas são testadas a 5°C, 25°C/60% RH, e 40°C/75% RH por 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses (opcional), 12 meses, 18 meses e 24 meses.

[263] As formulações líquidas são analiticamente testadas (concentração, osmolalidade, pH, Instron, MFI, SEC, e/ou CEX) nos meses 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 (5°C); meses 1, 3, 6, 9, 12, 18, (25°C); meses 1, 3, 6, 9, 12, (40°C); e meses 1, 3, (40°C).

EXEMPLO 8 Análise de formulação subcutânea de Anticorpo anti-α4β7 em Seringas plásticas preenchidas

[264] Este estudo é iniciado para pesquisar o uso de seringas plásticas como o sistema de recipiente/fechamento para uma formulação subcutânea de anticorpo anti-α4β7. A estabilidade de uma formulação subcutânea representativa de anticorpo anti-α4β7 em seringas plásticas preenchidas é estudada. Os dados gerados deste estudo ajuda o critério de aplicabilidade de uso de uma seringa plástica para uma formulação líquida subcutânea de anticorpo anti-α4β7.

[265] As amostras do teste de estabilidade são preparadas como mostrado abaixo. Os testes de estabilidade são conduzidos sob as condições de armazenamento de 40°C/75% RH, 25°C/60% RH, 5°C.

[266] Dois tipos de seringas plásticas e uma seringa de vidro (Controle) na Tabela 25 são testados com uma formulação líquida subcutânea de anticorpo anti-α4β7 mostrados na Tabela 26. Tabela 27 mostra os detalhes de cada conjunto de amostras a ser testado no experimento. Tabela 25. Seringas plásticas Tabela 26. Formulação subcutânea de anticorpo anti-α4β7 (pH 6,5) Tabela 27. Detalhes da amostra

[267] Formulação líquida subcutânea de anti-α4β7 preparada é usada para esta investigação. As formulações são filtradas. A amostragem da solução filtrada para o teste de qualidade como amostra “antes do envase” (Aparência, MFI, DLS). 0,5 mL de formulação são aliquotadas em seringas plásticas de 1 mL. As seringas são fechadas por máquina de recravação à vácuo. As seringas são armazenadas com a agulha pra baixo.

[268] Uma verificação inicial é realizada para medir pH, osmolalidade, densidade, viscosidade, e concentração de proteína. Testes analíticos (aparência, SEC(Agregados, monômero, LMW), CEX(ácido, principal, básico), força de deslizamento, MFI, DLS, e/ou peso) são realizados após 1 semana, a 40°C, 2 semanas, 40°C, 1 mês, 5, 25 e 40°C, 3 meses, 5 e 25°C, 6 meses em 5 e 25°C, 9 meses em 5 e 25°C, e 12 meses em 5 e 25°C.

[269] As amostras são tomadas em 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses a 5°C e 25°C. As amostras são tomadas em 1 semana, 2 semanas e 1 mês a 40°C.

Exemplo 9:

[270] As amostras foram analisadas para aparência, força de injeção, SEC, CEX, e imagem de microfluxo a 5°C e 25°C em vários pontos de tempo que podem ter incluídos 0, 1, 3, 6, e 12 meses. A estabilidade da formulação como medida por SEC e CEX foi semelhante ao que foi discutido nos Exemplos 1 e 2. Para teste de força de injeção, a força de deslizamento foi medida (Tabela 28). Um modelo estatístico determinado que o único fator significativo que afeta a força de deslizamento foi o fabricante de seringa, onde A tinha uma força de deslizamento maior do que B, que foi mais do que C (Figura 17). As alterações na força de deslizamento das seringas por 12 meses a 5°C e 6 meses a 25°C foram menos do que 10 N, mas principalmente menos do que 5 N. Tabela 28

EXEMPLO 10 Análise de componentes de seringa preenchida usados em seringas com agulha de 27 G de parede fina envasadas com formulação anticorpo anti-α4β7

[271] Este estudo explorou como vários fabricantes de seringa com uma agulha de 27G de parede fina e vários fabricantes de êmbolo (rolha) e materiais elastoméricos afetaram as propriedades mecânicas do sistema de seringa preenchida e a estabilidade da formulação sobre o tempo.

[272] Três diferentes fabricantes de seringa e 4 diferentes modelos de êmbolo (rolha) foram testados com agulhas de 27G ^” de parede fina e uma formulação contendo 160 mg/mL de proteína, arginina 125 mM, histidina 50 mM, citrato 25 mM, 0,2% PS80, em um pH de 6,5. Todas as amostras criadas e testadas são mostradas na Tabela 29. Tabela 29. Detalhes experimentais

[273] As amostras foram analisadas para aparência, força de injeção, SEC, CEX, e imagem de micro-fluxo a 5°C e 25°C e 40°C em vários pontos de tempo que podem ter incluídos 0, 1, 3, 6, e 12 meses. A estabilidade da formulação como medido por SEC e CEX foi semelhante ao que foi discutido nos exemplos 1 e 2. Para teste de força de injeção, a soltura e força de deslizamento foram medidos. Os resultados no ponto de tempo inicial são mostrados na Tabela 30. Tabela 30

[274] Um modelo estatístico mostrou que fabricantes de seringa A e C foram semelhantes e tiveram uma força de deslizamento inferior do que o fabricante B, enquanto o êmbolo (rolha) E teve força de deslizamento ligeiramente maior do que o outro êmbolo (rolhas).

[275] Geralmente as forças de soltura iniciais foram semelhantes entre todas as amostras que foram testadas.

[276] Durante 12 meses a 5°C, 25°C, e 40°C, a força de deslizamentos não alterou significativamente. No entanto, a força de soltura para seringas com êmbolo (rolha) F aumentou em 12 meses a 25°C e 40°C.

EXEMPLO 11 Análise de formulação de anticorpo anti-α4β7 em seringas preenchidas

[277] Este estudo determina como os níveis variados de concentração de proteína, concentração de polissorbato 80, concentração citrato, e pH afeta formulações de anticorpo anti-α4β7 em um formato de seringa preenchida.

[278] Parte do desenho experimental é criado em JMP com uma fração fatorial de dois níveis de concentração de proteína (60 a 160 mg/mL), pH (6,0 a 6,3), razão molar de polissorbato 80:proteína (0,723 a 1,5), e concentração de citrato (0 a 25 mM). Estas formulações têm um valor constante de concentração de histidina (50 mM) e Arginina (125 mM) (Formulações 1-8). Variações destas formulações com 25 mM Histidina são adicionadas (Formulações 9-10).

[279] Um conjunto adicional de formulações é desenvolvido para explorar as formulações sem histidina presente e somente citrato agindo como o tampão (Formulações 11-16). Os níveis de entradas para todas as formulações sendo explorados na Tabela 31. As constantes usadas para todas as formulações são mostradas na Tabela 32. Tabela 31. Variáveis DOE e níveis Tabela 32. Constantes Tabela 33 lista as formulações a serem testadas. Tabela 33. Detalhes de formulação

[280] Cada formulação é gerada a partir de uma formulação estoque inicial contendo anticorpo anti-α4β7 e diluída com várias soluções estoque de excipiente. Para atingir os volumes de diluição razoáveis, a solução estoque de anticorpo anti-α4β7 usada é mostrada na Tabela 34. Duas operações TFF diferentes são realizadas para obter as formulações TFF 1 e 2. Uma porção de TFF 1 é usada em uma diálise para obter a formulação rotulada “Diálise”. Tabela 34. Detalhes de tampão de Formulação inicial

[281] Para a diluição do material à composição de formulação desejada, soluções estoque de cada excipiente em água são preparadas nas concentrações especificadas por Tabela 35. Tabela 35. Detalhes de solução de estoque

[282] O regime de diluição para as formulações é detalhado nas Tabelas 36 e 37. Tabela 36. Detalhe de diluição Tabela 37. Detalhe de diluição

[283] A manipulação é realizada baseada no regime de diluição e a formulação inicial é pesada, enquanto as outras soluções estoques são pipetadas volumetricamente. As formulações são filtradas. 0,5 mL de formulação é aliquotada no maior número possível de seringas de 1 mL. As seringas são fechadas por máquina de recravação. As seringas são armazenadas com a agulha pra baixo.

[284] As formulações líquidas são testadas analiticamente (aparência, pH, osmolalidade, densidade, DLS, SEC, CEX, e/ou Brightwell) inicialmente, e em 1 semana, 40°C, 2 semanas, 40°C, 1 mês 25 e 40°C, 2 meses, 5 e 25°C, 3 meses, 5 e 25°C, 6 meses, 5 e 25°C, 9 meses, 5 e 25°C, e 12 meses, 5 e 25°C.

[285] Puxadas de formulação específica de acordo com a Tabela 38 são ainda realizadas. Tabela 38: Tiragens de formulação específica

EXEMPLO 12

[286] Uma formulação contendo 160 mg/mL de proteína, histidina 50 mM, citrato 25 mM, arginina 125 mM em pH 6,5 foi testada para estabilidade em uma seringa de vidro ou duas diferentes seringas plásticas COP. A 5°C e 25°C após 12 meses, a quantidade de agregados e monômero foi comparável entre as seringas plásticas e as de vidro. Tabela 39

Exemplo 13: Biodisponibilidade de Vedolizumabe administrada por injeção subcutânea e intramuscular

[287] Um estudo de fase I da biodisponibilidade de vedolizumabe administrada por injeção subcutânea e intramuscular a sujeitos homens saudáveis foi completado. Um total de 42 homens saudáveis foi incluído no estudo. Os sujeitos foram divididos em três grupos (administração subcutânea, intramuscular, e intravenosa) de 14 sujeitos cada. Os sujeitos foram receberam 180 mg de vedolizumabe em um dia. A dose foi reconstituída a partir de uma formulação liofilizada de 60 mg/ml de anticorpo em histidina 50 mM, arginina 125 mM, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH 6,3. Para os sujeitos intramuscular e subcutâneos, a dose foi dividida em duas injeções de 1,5 ml cada. O sangue foi amostrado para determinar a concentração plasmática de vedolizumabe e a biodisponibilidade de vedolizumabe em cada conjunto de sujeitos foi determinada.

[288] Nenhum evento adverso grave ou infecção significativa, anormalidades clinicamente significativas, listas de verificação RAMP subjetivas/objetivas positivas, nem achados ECG clinicamente significativos foram reportados

[289] Modelagem e simulação PK/PD foi concluída para determinar a dose e esquemas de doses extravasculares que resultam em exposições semelhantes como as doses intravenosas para manter as concentrações séricas desejadas em níveis mínimos.

[290] O perfil de absorção (FIG. 18) mostrou que as concentrações das doses intramusculares e subcutâneas geralmente se sobrepõem. Não há diferenças grossas aparentes nos perfis de absorção destas vias de administração. A biodisponibilidade absoluta de vedolizumabe após injeção SC foi aproximadamente 75% e após injeção IM foi aproximadamente 80%.

Exemplo 14. Modelagem de Regimes de Dose Subcutânea

[291] Modelagem e simulação PK/PD foi concluída para determinar a dose e esquemas de doses extra-vasculares que resultam em exposições semelhantes como as doses intravenosas para manter as concentrações séricas desejadas em níveis mínimos.

[292] Um conjunto de dados combinado final (dados IV, SC e IM) mostrou dois modelos lineares de compartimento parametrizados em termos de depuração (CL) e volume central de distribuição (V2), volume periférico de distribuição (V3), uma taxa constante de absorção dependente da via extravascular (KA) e a biodisponibilidade relativa (comparada à administração intravenosa) das doses extravasculares (F). Termos IIV foram incluídos em CL, V2 e V3 com peso corporal como a única covariante que influencia CL e V3 através de efeito alométrico.

[293] Aceitabilidade e previsibilidade de modelo foi demonstrado através de estimativas de parâmetro de inicialização, verificações preditivas visuais e adequabilidade de ajuste de gráfico. Análise do modelo identificou peso corporal como um preditor para o PK de vedolizumabe com a variabilidade na PK atribuída para entre sujeito e dentro de componentes do sujeito.

[294] Uma vez o modelo foi demonstrado como sendo adequado para simulação, as simulações foram realizadas para avaliar o efeito da via de administração (IV, IM ou SC), e avaliar o efeito da frequência de dosagem (semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 4 semanas, e a cada 8 semanas) nas concentrações mínimas no estado de equilíbrio. Baseado nestes valores e a biodisponibilidade relativa de vedolizumabe após administração IM e SC (F=69,5%), as doses foram selecionadas para obter concentrações mínimas semelhantes como as doses IV.

[295] Simulações modelaram as doses e esquemas para combinar a indução intravenosa e esquemas de manutenção. Os alvos foram ambos exposição (área sob curva de tempo-concentração sérica da droga (AUC)) e concentração mínima da droga. As tabelas 40-43 fornecem resultados de simulações. Tabela 40. Regime de indução combinando uma AUC IV durante semanas 0-6 Tabela 41. Regime de indução combinando uma concentração mínima IV durante semanas 0-6 Tabela 42. Regime de manutenção combinando uma dose de 300 mg IV a cada 4 semanas Tabela 43. Regime de manutenção combinando uma dose de 300 mg IV a cada 8 semanas

Exemplo 15: Estudo de Fase 2a de dose múltipla

[296] Um estudo de fase 2a de dose múltipla pode avaliar a segurança, tolerabilidade e PK do estado de equilíbrio de vedolizumabe após doses múltiplas de vedolizumabe pela via de administração subcutânea e para avaliar a biodisponibilidade relativa do regime subcutâneo comparado com o regime intravenoso. O desenvolvimento de HAHA e HAHA neutralizante e o efeito de PD de doses múltiplas de vedolizumabe após administração subcutânea pode ser avaliado.

[297] Pacientes com colite ulcerativa com um escore parcial de Mayo de 1-12 e pacientes com doença de Crohn contendo um CDAI de mais do que 150 podem ser incluídos no estudo. Coortes podem receber um regime de indução de vedolizumabe (300 mg) administrado IV nas semanas 0 e 2, seguido por um regime de manutenção de qualquer um destes.

[298] Vedolizumabe (300 mg) administrado IV a cada 4 semanas nas semanas 6-22.

[299] Vedolizumabe (300 mg) administrado IV a cada 8 semanas nas semanas 6-22.

[300] Vedolizumabe (108 mg) administrado SC a cada semana nas semanas 6-22.

[301] Vedolizumabe (108 mg) administrado SC a cada 2 semanas nas semanas 6-22.

[302] Vedolizumabe (165 mg) administrado SC a cada 3 semanas nas semanas 6-22.

[303] As amostras podem ser coletadas antes da dosagem no dia 1, e então novamente no dia 1 (12 horas), 2, 3, 5, 8, 15, 29, 43, 127, 127 (12 horas), 128, 129, 131, 134, 141, e 155 para avaliar PK e PD.

Exemplo 16: Experiência clínica de longo prazo com Vedolizumabe para o tratamento de IBD

[304] Um estudo de extensão de segurança aberto de fase 2 foi concluído para avaliar a farmacocinética de longo prazo (PK), farmacodinâmica (PD), segurança, e eficácia de vedolizumabe. Os pacientes tinha idades de 18 a 75 anos, e tinham participado anteriormente em um estudo precoce de PK/PD/segurança em pacientes com colite ulcerativa ou tinham sintomas de IBD por pelo menos 2 meses confirmados por endoscopia e/ou histopatologia e/ou radiologia em 36 meses de triagem.

[305] Todos os pacientes receberam um regime de dosagem intravenosa de ou 2 mg/kg ou 6 mg/kg de vedolizumabe (5 mg/mL de anticorpo, citrato 20 mM/ácido cítrico, cloreto de sódio 125 mM, 0,05% polissorbato 80, pH 6,0 (armazenado em longo prazo -70°C e até 3 meses a -20°C)) nos dias 1, 15 e 43, seguido por uma dose a cada 8 semanas por até um total de 78 semanas. Os pacientes foram aqueles de colite ulcerativa de tratamento naive ou pacientes com doença de Crohn, ou pacientes com colite ulcerativa que tinham participado de estudo clínico anterior.

[306] A eficácia/qualidade de vida (QoL); escore de Mayo parcial (PMS), índice de atividade de doença de Crohn (CDAI), e questionário de doença intestinal inflamatória (IBDQ) foram usados para avaliar os resultados do estudo.

Resultados PK

[307] As concentrações médias de vedolizumabe pré-infusão foram dose proporcional, e permaneceram estáveis e detectáveis ao longo do estudo.

Resultados PD

[308] Receptores (%ACT-1 + [CD4+CD45RO HIGH] e % MADCAM+ [CD4+CD45RO HIGH] foram quase totalmente inibidos ao longo do período do estudo em todos os níveis de dose.

Escore de Mayo parcial

[309] PMS médio basal foi maior para o tratamento de pacientes com colite ulcerativa sem tratamentos (5,4) do que para pacientes colite ulcerativa em prorrogação (2,3). Pelo dia 43, PMS médio mostrou uma redução pronunciada para ambos pacientes com colite ulcerativa sem tratamento e em prorrogação. Pelo dia 155, escores médios dos dois grupos foram semelhantes. PMS médio continuou a reduzir até o dia 267, e nivelou em seguida.

Índice de atividade de doença de Crohn

[310] CDAI médio de pacientes CD reduziu de 294,6 em basal a 237,7 no Dia 43, e continuou a reduzir até o dia 155 (156,1). IBDQ

[311] Pacientes com colite ulcerativa em prorrogação tiveram os escores médios IBDQ maiores em basal. Pelo dia 43, escores IBDQ médios aumentaram em todos os três grupos de doença. Escores IBDQ médios continuaram a aumentar ao longo do tempo em todos os 3 grupos de doença, atingindo um máximo no dia 155 para pacientes com doença de Crohn, e no dia 491 para pacientes com colite sem tratamento e pacientes com colite ulcerativa em prorrogação.

Proteína C reativa

[312] Ambos os pacientes com colite ulcerativa em prorrogação e doença de Crohn mostraram níveis reduzidos médios de CRP ao longo do dia 155 e então nivelaram. Pacientes com colite ulcerativa sem tratamento tiveram um nível CRP médio menor em basal do que pacientes com colite ulcerativa em prorrogação (2,28 v. 7,09). Níveis CRP médios dos pacientes com colite ulcerativa sem tratamento permaneceram relativamente constantes em todos os pontos de tempo avaliados.

Outros resultados de segurança

[313] Nenhuma infecção oportunista sistêmica (incluindo PML) foi reportada durante o estudo. Um paciente teve teste positivo para viremia JC em um único ponto de tempo, embora fosse negativo para JCV em todos os outros pontos de tempo. Três de 72 pacientes (4%) tiveram resultados HAHA positivos (dois destes foram transitoriamente positivos). O estudo não mostrou evidência de toxicidade hepática, linfocitose, ou linfopenia, ou qualquer outra alteração associada à droga.

Conclusões

[314] Vedolizumabe administrado a 2,0 ou 6,0 mg/kg uma vez a cada 8 semanas por até 78 semanas atingiu as saturações do receptor alvo, foi associado com reduções médias duráveis na atividade da doença e melhorou os escores IBDQ, foi geralmente seguro e bem tolerado, e demonstrou imunogenicidade aceitável.

Exemplo 17: Indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa

[315] Um estudo único compreendendo dois estudos randomizados, duplo-cego, multicêntricos desenhados para avaliar a indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa. Características demográficas e basais da doença foram comparáveis através de todos os grupos de tratamento.

[316] O estudo de indução, usando administração intravenosa, comparou placebo contra vedolizumabe, em uma dose de 300 mg reconstituída de uma formulação liofilizada de 60 mg/mL de anticorpo em histidina 50 mM, arginina 125 mM, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH 6,3, com um ponto de avaliação em 6 semanas após 2 doses de vedolizumabe.

[317] O estudo de manutenção, usando a mesma formulação e via de administração como o estudo de indução, comparou placebo contra vedolizumabe dosado a cada quatro semanas, e placebo contra vedolizumabe dosado a cada oito semanas. O ponto de avaliação deste estudo foi em 52 semanas, analisando a população respondente à indução.

[318] Amostras de sangue foram coletadas para medir as concentrações de vedolizumabe durante o estudo. A concentração sérica média de vedolizumabe ao fim da fase de indução foi 20 a 30 μg/mL. As concentrações séricas médias de vedolizimab no estado de equilíbrio após 30 min de infusão IV de administração de dose de 300mg foram entre 9 a 13 μg/mL para o regime de q8wks (regime de 8 semanas) e entre 35 a 40 μg/mL para o regime de q4wks (regime de 4 semanas). Ao fim da infusão, as concentrações plasmáticas medianas de vedolizimab foram de entre 98 e 101 μg/mL para o regime de q8ks e ao redor de 129 e 137 μg/mL para o regime de q4 wks.

[319] Os sumários da resposta dos estudos de indução e manutenção são fornecidos nas tabelas 44-47. Uma proporção significativamente maior de pacientes tratados com vedolizumabe atingiu resposta clínica, remissão, e cura de mucosa em 6 semanas, em comparação com placebo (Tabela 44). 39% da população com intenção de tratar em fase de indução teve falha anti-TNFα anterior. A resposta clínica e taxas de remissão foram maiores em pacientes com vedolizumabe do que com placebo entre ambos aqueles com falha de anti-TNF antes e aqueles sem exposição a anti-TNF antes. Em análises preliminares na semana 6, as taxas de eventos adversos (AEs), AEs graves, e eventos adversos que levam à descontinuação do estudo foram maiores no grupo placebo do que no grupo vedolizumabe. Uma proporção significativamente maior de pacientes com vedolizumabe do que pacientes com placebo atingiram remissão clínica, cura de mucosa, e remissão isenta de corticosteroide em 52 semanas e resposta e remissão durável (Tabela 45). 32% do população do estudo de manutenção teve falha anti-TNFα antes. Remissão clínica e taxas de resposta clínica durável foram maior com vedolizumabe do que com placebo em ambos os pacientes com falha de TNF e sem TNF. Na população de segurança (N=895) por semanas 0-52, as taxas de eventos adversos (AEs), AEs graves, e infecções sérias foram semelhantes entre grupos de vedolizumabe e placebo. Nenhum aumento nas taxas de infecção oportunista ou entérica foi observado no grupo de vedolizumabe. Tabela 44: Resultados de estudo de indução - pontos de avaliações chaves primários e secundários Tabela 45: Resultados de estudo de manutenção - pontos de avaliações chaves primários e secundários Tabela 46: Estudo de indução: Resposta e remissão clínica em 6 Semanas em pacientes com falha de antagonista anti-TNF-α antes e sem exposição a anti-TNF, população ITT Tabela 47: Remissão Clínica e resposta clínica duráveis em 52 Semanas: Pacientes com falha anterior ao antagonista Anti-TNF-α ou sem exposição ao antagonista Anti-TNF-α em população ITT

Exemplo 18: Indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa

[320] Um estudo único compreendendo dois estudos randomizados, duplo-cego, multicêntricos desenhados para avaliar a indução e manutenção de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa. Características demográficas e basais da doença foram comparáveis através de todos os grupos de tratamento.

[320] O estudo de indução, usando administração intravenosa, comparou placebo contra vedolizumabe, em uma dose de 300 mg reconstituída de uma formulação liofilizada de 60 mg/mL de anticorpo em histidina 50 mM, arginina 125 mM, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH 6,3, com um ponto de avaliação em 6 semanas após 2 doses de vedolizumabe.

[321] O estudo de manutenção, usando a mesma formulação e via de administração como o estudo de indução, comparou placebo contra vedolizumabe dosado a cada quatro semanas, e placebo contra vedolizumabe dosado a cada oito semanas. O ponto de avaliação deste estudo foi em 52 semanas, analisando a população respondente à indução.

[322] Surpreendentemente, este estudo mostrou que os grupos Q4 e Q8 semanas gerou resultados muito semelhantes. Sumários das respostas dos estudos de indução e manutenção são fornecidos nas Tabelas 48-51. Uma proporção significativamente maior de pacientes tratados com vedolizumabe atingiu remissão clínica e resposta melhorada, em comparação com placebo (Tabela 48). Taxas melhoradas de remissão e resposta foram maiores em vedolizumabe do que pacientes com placebo entre ambos aqueles com falha anterior a anti-TNF e aqueles sem exposição anterior a anti-TNF. As taxas de eventos adversos (AEs), AEs graves, e infecções graves foram semelhantes entre os grupos vedolizumabe e placebo. Nenhum aumento nas taxas de infecções oportunas ou entéricas foi observado no grupo vedolizumabe. Tabela 48: Resultados de estudo de indução - pontos de avaliações primários e secundários Tabela 49: Resultados de estudo de manutenção - pontos de avaliações chaves primários e secundários Tabela 50: Resposta e remissão clínica melhoradas em 6 Semanas em pacientes com falha de antagonista Anti-TNF-α antes e sem exposição a Anti-TNF, população ITT Tabela 51: Remissão Clínica e resposta melhorada em 52 Semanas: Pacientes com falha anterior ao antagonista Anti-TNF-α ou sem exposição ao antagonista Anti-TNF-α em população ITT

Exemplo 19: Indução de resposta e remissão em pacientes com colite ulcerativa moderadamente a gravemente ativa

[324] Um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo multicêntrico foi concluído para avaliar o efeito de indução de vedolizumabe em doses de 300 mg (reconstituído de uma formulação de 60 mg/mL de anticorpo em histidina 50 mM, arginina 125 mM, 0,06% polissorbato 80, 10% sacarose, em pH6,3 que foi liofilizado), em pacientes com falha de antagonista de TNFα na semana 6 (após 2 doses--0 e 2 semanas) e na semana 10 (após 3 doses). O estudo consistiu de 416 pacientes, 75% dos quais foram falhas em antagonista TNFα, e 25% dos quais foram virgens de TNFα. Demografia e medicação para IBD concomitante foram equilibrados através dos grupos de tratamento. As características basais da doença foram ainda equilibradas através dos grupos de tratamento para doença basal, exceto para atividade de doença basal.

[325] O ponto de avaliação primário desenhado para o estudo foi a semana 6 de remissão (%) em população de falha de antagonista de anti-TNF-α. Os pontos de avaliações chaves secundários que foram avaliados (procedimento de teste sequencial procedure) foram: semana 6 de remissão (%) na população geral, semana 10 de remissão (%) em falha de antagonista anti-TNF-α e população geral (usando procedimento Hochberg), semana 6 e 10 remissão sustentada (%) na falha de antagonista anti-TNF-α e população geral (usando procedimento Hochberg), e semana 6 de resposta melhorada (%) na população com falha de antagonista anti-TNF-α. Tabela 52: CDAI Basal: Tabela 53: resultados de estudo de indução: Pontos de avaliações chaves primários e secundários Tabela 54: Resultados em pacientes virgens de antagonista anti-TNF-α (n=101, 24% do geral) Tabela 55: Resultados do estudo: Remissão clínica nas Semanas 6 e 10, Subgrupo chave - Falhas Tx anteriores, ITT geral

[326] O estudo mostrou que pacientes com falha de antagonista TNF-α requereu 3 doses para indução de remissão. As taxas de remissão em pacientes com falha em antagonista TNF-α aumentou entre semana 6 e semana 10, mas somente para o grupo vedolizumabe (não placebo). Taxas de remissão para pacientes virgens de antagonista TNF-α não aumentaram substancialmente entre semana 6 e 10. Da população de falha antagonista TNF-α com um alto grau de gravidade da doença, 43% nunca responderam a um antagonista TNF- α, e 45% de perda de resposta.

Exemplo 20: Estabilidade

[327] Várias diferentes formulações de anticorpo anti-α4β7 foram testadas para estabilidade ao longo do curso de 6 a 24 meses a 5°C (Tabelas 6 e 7). Formulações contendo um pH de 6,0-6,2 mostrou aproximadamente menos do que 4% de degradação de espécies principais após 6 meses e em 24 meses. Várias diferentes formulações de anticorpo anti-α4β7 foram testadas para estabilidade por SEC por até 24 meses (Tabelas 4 e 5). As formulações com 60 mg/mL de concentração de proteína e contendo citrato 25 mM tinham uma alteração em agregados de 0,1-0,2% após 2 anos, enquanto as formulações contendo 160 mg/mL de proteína e citrato 25 mM tinha um aumento de agregados de aproximadamente 0,3% por 2 anos. Houve um aumento de 0,6-1,1% de agregados para as formulações contendo 60, 110, ou 160 mg/mL de proteína sem citrato. Para as formulações testadas contendo citrato, mas sem histidina, após 12 meses e 24 meses, houve aproximadamente 0,30,4% de crescimento de agregados.

Exemplo 21: Determinação de vedolizumabe na proporção CD4:CD8

[328] Sujeitos saudáveis de idades 18-45 foram tratados com uma dose única de 450 mg de vedolizumabe reconstituído de uma formulação liofilizada de 10% sacarose e diluída em um sistema de infusão de 0,9% salina. Fluido cerebroespinal (CSF) foi coletado por punção lombar antes (basal) e 5 semanas após a dose única 450-mg de vedolizumabe. Cada sujeito serviu como seu próprio controle.

[329] Um ponto de tempo de 5 semanas foi selecionado baseado em um estudo anterior que mostrou que pacientes com MS tratados com natalizumabe demonstraram efeitos em proporção de CSF CD4+:CD8+ linfócito e redução em número de lesões cerebrais após somente uma dose (Stuve et al. Arch Neurol,2006;63:1383-1387; Stuve et al. Ann Neurol. 2006;59:743-747. Miller et al. N Engl J Med. 2003;348(1):15-23); e ainda porque em 5 semanas, uma dose de 450 mg de vedolizumabe é suficiente para saturar o alvo e fornece concentrações séricas que excedem os níveis mínimos no estado de equilíbrio estimado associado com a fase 3 do regime de doses de 300 mg a cada 4 semanas.

[330] Aproximadamente 15 mL de CSF foram obtidos de cada sujeito para imunofenotipagem. Amostras de CSF foram incluídas para análises se atingem os critérios seguintes: <10 RBCs/μL por amostra (para minimizar contaminação de sangue periférico); resultado negativo para cultura CSF; número adequado de linfócito T em cada amostra de citometria de fluxo; e sem detecção de anticorpos séricos a vedolizumabe.

[331] Mediana na semana 5 (34,80 μg/mL) e concentrações séricas de vedolizumabe dos sujeitos individuais (faixa 24,9-47,9 μg/mL) foram maiores do que a concentração mínima no estado de equilíbrio (~24 μg/mL) para o regime de dose da fase 3. Um grau alto (>90%) de saturação de receptor α4β7 foi observado na semana 5 como medido por MAdCAM-1-Fc, indicado a saturação de vedolizumabe de seu alvo no tempo da avaliação do ponto de avaliação.

[332] Vedolizumabe não foi detectado em qualquer amostra CSF (limite de detecção = 0,125 μg/mL).

Efeito em números e razão de linfócitos T CD4+ e CD8+

[333] Vedolizumabe não reduziu significativamente proporção de CD4+:CD8+ (Tabela 56). Nenhum dos sujeitos teve uma proporção após a dose CD4+:CD8+ <1 (p < 0,0001 (teste de t de 1 lado)). Vedolizumabe não reduziu significativamente o número de linfócitos T CD4+ ou CD8+ T em CSF. Além disso, não houve alterações significativas em % de linfócitos T CD4+ e % CD8+ T (Tabela 57). Ainda, nenhuma alteração significativa em WBC de sangue periférico, linfócitos T de memória CD4+ e CD8+ (Tabela 58) foram observados. Tabela 56: Efeito de tratamento na proporção de CSF CD4+:CD8+ (população avaliável, n=13) CI=intervalo de confiança *p<0,0001 (teste t de uma amostra de um lado para H0:µ<1 vs H1: µ>=1). †Diferença é definida como proporção de semana 5 menos proporção basal Tabela 57: Efeito de tratamento em contagem de linfócito CD4+ e CD8+ em CSF (população avaliável, n=13) Tabela 58: Contagens de Linfócitos T de memória em sangue periférico (RO+) (População avaliável, n=13)

Sumário

[334] Vedolizumabe não afetou contagens de células CSF CD4+ e CD8+ ou proporção de CD4+:CD8+ em voluntários saudáveis após uma dose única de 450 mg. Nenhum dos sujeitos teve uma redução na razão após dose de CD4+:CD8+ CSF a menos do que 1. Vedolizumabe não foi detectado em CSF. Além disso, não houve alteração observada nos WBCs totais ou subgrupos de linfócitos T de memória CD4+ e CD8+ no sangue periférico. A saturação de alvo (α4β7) no sangue ocorreu em todos os sujeitos no momento da avaliação do ponto de avaliação. Os níveis de linfócitos CSF CD4+ e CD8+ e proporção foram semelhantes aos anteriormente reportados na literatura.

[335] Estes resultados são consistentes com falta de efeito de vedolizumabe em ambos sobrevivência imune em CNS fisiológico e inflamação de CNS patológica de macacos.

[336] Enquanto esta invenção foi particularmente mostrada e descrita com referência às modalidades preferenciais da mesma, será entendido pelos especialistas na técnica que várias alterações e detalhes podem ser preparados na mesma sem se afastar do escopo da invenção englobado pelas reivindicações anexadas. Tabela 59: Sequências

Claims (12)

1. Formulação farmacêutica líquida estável, caracterizada pelo fato de que compreende de 150 a 180 mg/mL de um anticorpo anti- α4β7, 5 mM a 50 mM de citrato, 10 mM a 75 mM de histidina, 0,01% a 0,5% (p/v) de polissorbato 80, e 50 mM a 150 mM de arginina, em que o anticorpo anti-α4β7 é o vedolizumabe, e em que a formulação tem um pH entre 6,1 a 6,9.

2. Formulação farmacêutica líquida estável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do polissorbato 80 é de 0,1% a 0,3% (p/v).

3. Formulação farmacêutica líquida estável, de acordo com qualquer a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a concentração do citrato é 20 mM a 30 mM.

4. Formulação farmacêutica líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração de histidina é de 25 mM a 50 mM.

5. Formulação farmacêutica líquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende 160 mg/mL do vedolizumabe, 25 mM de citrato, 50 mM de histidina, 0,2% (p/v) de polissorbato 80, e 125 mM de arginina, e em que a formulação tem um pH de 6,5.

6. Artigo manufaturado caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente, uma formulação farmacêutica líquida estável, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e instruções para seu uso.

7. Artigo manufaturado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida formulação farmacêutica líquida estável compreende 108 mg de anticorpo.

8. Artigo manufaturado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o artigo é uma seringa preenchida.

9. Artigo manufaturado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a seringa preenchida possui uma dose única.

10. Artigo manufaturado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dose é 108 mg.

11. Formulação farmacêutica liquida estável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou artigo manufaturado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de doença intestinal inflamatória.

12. Formulação farmacêutica liquida estável ou artigo manufaturado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato da doença intestinal inflamatória ser doença de Crohn’s ou colite ulcerativa.