BR112013027098B1

BR112013027098B1 - Produtos de vírus adenoassociado recombinante, composição e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112013027098B1
Application number: BR112013027098-5A
Authority: BR
Inventors: Scott Quenton Harper; Jian Liu
Original assignee: Nationwide Children's Hospital, Inc
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2021-12-14
Also published as: ES2702496T3; US20140045925A1; EP2699673B1; CA2839773A1; WO2012145597A3; EP3495472B1; EP3495472A1; EP2699673A4; CA2839773C; US9133482B2; EP2699673A2; BR112013027098A2; WO2012145597A2

Abstract

produtos de vírus recombinante e métodos para inibição de expressão de miotilina a presente invenção se refere a métodos à base de interferência de rna para inibir a expressão do gene da miotilina. vírus adenoassociados recombinantes da invenção distribuem dnas codificando micrornas que derrubam a expressão da miotilina. os métodos têm aplicação no tratamento de distrofias musculares, tal como distrofia muscular de cintura de membro tipo 1a.

Description

Este pedido é uma continuação em parte do Pedido de Patente Provisório US 61/478.012 depositado em 21 de abril de 2011, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a métodos à base de interferência de RNA para a inibição da expressão do gene miotilina. Os vírus recombinantes adeno associados da presente invenção fornecem os DNAs que codificam os microRNAs que derrubam a expressão de miotilina. Os métodos têm aplicação no tratamento de distrofias musculares, tal como Distrofia Muscular de Cinturão de Membro Tipo 1A.

Incorporação por Referência da Listagem de Sequências

Este pedido contém, como uma parte separada da divulgação, uma listagem de Sequências em forma legível por computador (nome do arquivo: 46208PCT_SeqListing.txt; 1.721.237 bytes - arquivo de texto ASCII), que é incorporada por referência na sua totalidade.

Fundamentos

As distrofias musculares (MDs) são um grupo de doenças genéticas. O grupo é caracterizado por fraqueza e degeneração progressiva dos músculos esqueléticos que controlam o movimento. Algumas formas de MD se desenvolvem na infância ou adolescência, enquanto outras podem não aparecer até a meia idade ou mais tarde. Os distúrbios diferem em termos de distribuição e extensão da fraqueza muscular (algumas formas de MD também afetam o músculo cardíaco), a idade do seu aparecimento, a taxa de progressão, e o padrão de herança.

Um grupo de MDs é o grupo de cinturão de membro (LGMD) de MDs. LGMDs são condições raras e se apresentam de forma diferente em pessoas diferentes em relação à idade de início, as áreas de fraqueza muscular, comprometimento cardíaco e respiratório, a taxa de progressão e gravidade. LGMDs podem começar na infância, adolescência, idade adulta, ou mesmo mais tarde. Ambos os sexos são igualmente afetados. LGMDs causam fraqueza no ombro e cinturão pélvica, com os músculos próximos na parte superior das pernas e braços, por vezes, também enfraquecendo com o tempo. A fraqueza nas pernas, muitas vezes aparece antes que a dos braços. Os músculos faciais são geralmente afetados conforme a doença progride, as pessoas podem ter problemas com a caminhada e podem precisar usar uma cadeira de rodas ao longo do tempo. O envolvimento dos músculos do ombro e do braço pode levar à dificuldade em levantar os braços acima da cabeça e levantar objetos. Em alguns tipos de LGMD, os músculos cardíacos e respiratórios podem estar envolvidos.

Existem pelo menos dezenove formas de LGMD, e as formas são classificadas pelos seus defeitos genéticos associados.

Testes especializados para LGMD estão agora disponíveis através de um esquema nacional para o diagnóstico, o National Commissioning Group (NCG).

O LGMD 1A é causada por mutações missense de ganho de função no gene 30 miotilina (MYOT) [Hauser et al, Am. J. Hum. Genet, 71: 1428-1432 (2002); Hauser et al., Hum. Mol. Genet., 9: 2141-2147 (2000); Shalaby et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 68: 701-707 (2009)]. Os pacientes com LGMD 1A desenvolvem perna proximal e fraqueza no braço no início da idade adulta (25 anos é a idade média de início), que progride para a musculatura do membro distal. No nível histológico, os pacientes apresentam degeneração da miofibra e variabilidade do tamanho, divisão da fibra, mionúcleos centralmente localizados, vesículas autofágicas, e substituição de miofibras musculares com gordura e tecido fibroso, que são todas as características comuns de distrofia muscular. Os pacientes com LGMD1A também desenvolvem agregados de proteínas miofibrilares 2 5 intramusculares, vacúolos marginados e graves desorganizações de disco-Z (chamado fluxo do disco-Z), que perturbam completamente a estrutura do sarcômero. Um modelo de camundongo transgênico, o modelo de camundongo T57I, usando um alelo MYOT humano mutante foi desenvolvido [Garvey et al., Hum. Mol. Genet. 15: 2348-2362 (2006)]. Importantentemente, os camundongos T57I recapitulam as alterações histológicas 10 e funcionais progressivas associadas com LGMD1A, incluindo tamanho muscular reduzido, fraqueza muscular, agregados miofibrilares intramusculares, fluxo do disco-Z, e mionúcleos centralmente localizados.

O gene miotilina codifica uma proteína de 57 kDa expressa principalmente no músculo esquelético e cardíaco. A miotilina parece funcionar como um componente 15 estrutural do disco-Z, e pode, por conseguinte, contribuir para a montagem do sarcômero, a estabilização de filamentos de actina, e transmissão de força no músculo estriado. No entanto, a miotilina não é necessária para o desenvolvimento ou função normal do músculo, uma vez que os camundongos null de miotilina são abertamente e histologicamente normais. Especificamente, os músculos do camundongo que não 20 apresentam miotilina são indistinguíveis do tipo selvagem na massa muscular, tamanho da miofibra, resistência contrátil (força específica), e a integridade do sarcolema. Além disso, os camundongos null MYOT desenvolvem-se normalmente, vivem uma vida normal, e não mostram nenhuma evidência histológica de distrofia muscular ou malformações do Disco- Z. Transcritos de miotilina de camundongo e humanos podem ser expressos nos mesmos 25 tecidos, têm as mesmas estruturas genômicas e as sequências proteicas são altamente conservadas (90% de identidade, 94% de similaridade), o que indica um funcional conservado.

A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de regulação de genes em células eucarióticas que foi considerado para o tratamento de várias doenças. RNAi se refere ao 30 controle pós-transcricional da expressão gênica mediada por microRNAs (miRNAs). Os miRNAs são pequenos (21-25 nucleotídeos), RNAs não codificantes que compartilham homologia e pares de base com os RNAs mensageiros cognatos (mRNAs). A interação entre os miRNAs e mRNAs dirige o maquinário de silenciamento de genes celular para impedir a tradução dos mRNAs. A via de RNAi está resumida em Duan (Ed.), Seção 7.3 do Capítulo 7 em Muscle Gene Therapy, Springer Science + Business Media, LLC (2010). A Seção 7.4 menciona a terapia com MYOT RNAi de LGMD1A em camundongos para demonstrar a prova de princípio para a terapia de distúrbios musculares dominantes de RNAi.

Como uma compreensão das vias naturais de RNAi desenvolvidas, os investigadores projetaram miRNAs artificiais para uso na regulação da expressão de genes alvos para o tratamento da doença. Tal como descrito na Seção 7.4 de Duan, supra, os miRNAs artificiais podem ser transcritos a partir de cassetes de expressão de DNA. A sequência de miRNA específica para o gene alvo é transcrita juntamente com as sequências necessárias para dirigir o processamento de miRNA em uma célula. Os vetores virais, tais como vírus adeno associados têm sido usados para distribuir miRNAs ao músculo [Fechner et al., J. Mol.. Med, 86:.987-997 (2008)].

O vírus adeno associado (AAV) é um parvovirus deficiente em replicação, o genoma de DNA de fita simples, que é de cerca de 4,7 kb em comprimento, incluindo 145 repetições terminais invertidas de nucleotídeos (ITRs). Existem vários serotipos de AAV. As sequências de nucleotídeos dos genomas dos serotipos do AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no número de acessão GenBank NC_002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no número de acessão GenBank NC_001401 e Srivastava et al., J. Virol, 45: 555-564 {1983); o genoma completo de AAV- 3 é fornecido no número de acessão GenBank NC 1829, o genoma completo de AAV-4 são fornecidas em número de acessão GenBank NC_001829; o genoma de AAV-5, é fornecido no número de acessão GenBank AF085716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no número de acessão GenBank NC_00 1862; pelo menos porções de genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidos nos números de acessão GenBank AX753246 e AX753249, respectivamente, o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J. Virol, 78: 6381-6388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol. Ther, 13 (1 ):67-76 (2006); e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2):375-383 (2004). As sequências de ação cis que dirigem a replicação de DNA virai (rep), encapsidação/embalagens e a integração do cromossoma da célula hospedeira estão contidas dentro de ITRs de AAV. Três promotores de AAV (denominados p5, pl9 e p40 para as suas localizações do mapa relativas) dirigem a expressão das duas estruturas de leitura abertas internas de AAV que codificam os genes rep e cap. Os dois promotores de rep (p5 e pl9), acoplados com o splicing diferencial do intron de AAV único (nos nucleotideos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas de rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene rep. As proteínas Rep possuem várias propriedades enzimáticas que são responsáveis por replicar o genoma virai. O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e o mesmo codifica as três 5 proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3. O splicing alternativo e sítios de iniciação da tradução não consensuais são responsáveis pela produção dos três proteínas dea capsídeo relacionadas. Um único sítio de poliadenilação de consenso está localizado na posição 95 do mapa do genoma de AAV. O ciclo de vida e as genéticas de AAV são revistos em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

AAV possui características únicas que o tornam atrativo como um vetor para a distribuição de DNA estranho às células, por exemplo, em terapia gênica. A infecção por AAV de células em cultura é não citopatogênica e a infecção natural de humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além disso, o AAV infecta muitas células de mamífero, permitindo a possibilidade de ter como alvo muitos tecidos diferentes in vivo.

Além disso, o AAV transduz lentamente dividindo e não dividindo células, e pode persistir essencialmente para a vida útil dessas células como um epissoma nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossoaml). O genoma pró-viral de AAV é infeccioso como o DNA clonado em plasmídeos que toma a construção de genomas recombinantes viável. Além disso, devido aos sinais que dirigem a replicação de AAV, a 20 encapsidação e integração do genoma estão contidas nas ITRs do genoma AAV, alguns ou todos os internos de aproximadamente 4,3 kb do genoma (codificação da replicação e proteínas de capsídeo estruturais, rep-cap) podem ser substituídos com o DNA estranho. As proteínas de rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outra característica importante do AAV é que o mesmo é um vírus extremamente estável e saudável. Ele resiste facilmente às condições usadas para inativar o adenovirus (56o a 65oC durante várias horas), tomando a conservação a frio de AAV menos crítica. O AAV pode mesmo ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas por AAV não são resistentes à superinfecção.

Há ainda uma necessidade na técnica de um tratamento para LGMD 1 A.

Sumário

A presente invenção fornece métodos e produtos para a prevenção ou inibição da expressão do gene MYOT. Os métodos da invenção utilizam RNAi para prevenção ou inibição da expressão do gene MYOT. Os métodos envolvem a distribuição de RNAs inibidores específicos para o gene MYOT para as células musculares. Os RNAs inibidores de MYOT contempladoas incluem, mas não estão limitados a, RNA antisentido, pequenos RNAs inibidores (siRNAs), RNAs tipo hairpin (shRNAs curtos) ou microRNAs artificiais (miRNAs de MYOT) que inibem a expressão de MYOT. O uso dos métodos e produtos é indicado, por exemplo, na prevenção ou tratamento de LGMD1A. Algumas modalidades 5 da presente invenção exploram as propriedades únicas de AAV para distribuir DNA que codifica RNAs inibidores de MYOT para as células musculares. Outras modalidades da invenção utilizam outros vetores (por exemplo, outros vetores virais, tais como adenovirus, retrovirus, lentivírus, vírus equino associado, alfavírus, poxvirus, vírus do herpes, vírus da poliomielite, vírus Sindbis e vírus de vaccinia) para distribuir polinucleotídeos que 10 codificam RNAs inibidores de MYOT.

Em um aspecto, a invenção fornece miRNAs de MYOT. Em um outro aspecto, a invenção fornece o rAAV que codifica os miRNAs de MYOT em que rAAV não apresenta os genes rep e cap. Em algumas modalidades, o miRNA de MYOT compreende uma fita guia de miRNA antissenso selecionada dentre as previstas na SEQ ID NO: 7 a SEQ ID 15 NO: 11266. Estas sequências compreendem sequências de fita de "guia" antissenso da invenção de vários tamanhos. O fita de guia antissenso é a fita do duplex de miRNA maduro, que se toma o componente de RNA do complexo de silenciamento induzido por RNA responsável pelo silenciamento de gene específico de sequência. Consulte a Seção 7.3 de Duan, supra. Por exemplo, a primeira fita de guia antissenso SEQ ID NO: 7 20 corresponde à (é o complemento inverso de) extremidade 3' da sequência de miotilina estabelecida na Figura 1. A segunda fita de guia antissenso (SEQ ID NO: 8) é deslocada de um nucleotídeo da primeira e assim por diante. Em algumas modalidades, o teor de GC da fita de guia antissenso é 60% ou menos, e/ou a extremidade 5' da fita de guia antissenso é mais rica em AU enquanto a extremidade 3' é mais rico em GC. Os miRNA de MYOT 25 exemplificados são codificados pelos DNAs estabelecidos nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3 e 4.

Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo o rAAV que codifica o miRNA de MYOT.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção ou inibição da expressão do gene MYOT em uma célula, compreendendo contatar a célula com um 30 rAAV que codifica um miRNA de MYOT, em que o miRNA é codificado pelo DNA estabelecido na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 e em que o rAAV não apresenta os genes rep e cap. A expressão de MYOT é inibida em pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99 por cento.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método para distribuição de DNA que codifica o miRNA de MYOT estabelecido na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, a um animal em necessidade do mesmo compreendendo, respectivamente, a administração ao animal de um rAAV que codifica o miRNA de MYOT, em que o rAAV não apresenta os genes rep e 5 cap.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção ou tratamento de uma distrofia musclular (incluindo, mas não limitado a, LGMD1A) compreendendo a administração de um rAAV que codifica um miRNA de MYOT, em que o miRNA é codificado pelo DNA estabelecido na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4 e em que o rAAV não 10 apresenta os genes rep e cap. O "tratamento" pode incluir o alívio de um ou mais sintomas da distrofia muscular (como LGMD1A). Os parâmetros moleculares, bioquímicos, histológicos e funcionais demonstram a eficácia terapêutica destes miRNAs de MYOT. Os parâmetros contemplados pela invenção incluem um ou mais dos seguintes: redução ou eliminação da proteína MYOT mutante nos músculos afetados, knockdown do gene 15 MYOT, redução ou eliminação de (por exemplo, LGMDIA-associado) agregados patogênicos de proteínas nos músculos, aumento dos diâmetros da miofibra, e melhoria na resistência muscular.

Descrição Detalhada

Os genomas de AAV recombinantes da invenção compreendem uma ou mais ITRs 20 de AAV flanqueando um polinucleotídeo que codifica, por exemplo, um ou mais miRNA de MYOT. O polinucleotídeo está operativamente ligado ao DNA de controle transcricional, especificamente DNA promotor que é funcional no alvo. Fornecedores comerciais, como Ambion Inc. (Austin, TX), Darmacon Inc. (Lafayette, CO), InvivoGen (San Diego, CA) e Molecular Research Laboratories, LLC (Herndon, VA) geram 25 moléculas de RNA inibidores customizadas. Além disso, os kits comercialmente disponíveis para a produção de moléculas de siRNA customizadas, tais como kit de construção SILENCER™ siRNA (Ambion Inc., Austin, TX), ou Sistema psiRNA (InvivoGen, San Diego, CA). As modalidades incluem um genoma rAAV compreendendo: o DNA estabelecido na SEQ ID NO: 1 que codifica o miRNA de MYOT (chamado 30 "miMyoT-1291"), o DNA estabelecido na SEQ ID NO: 2 que codifica o miRNA de MYOT (chamado "miMyoT-1321"), o DNA estabelecido na SEQ ID NO: 3 que codifica o miRNA de MYOT (chamado "miMyoT-1366") ou o DNA estabelecido na SEQ ID NO: 4 que codifica o miRNA de MYOT (chamado "miMyoT-1490").

Os genomas rAAV da invenção não apresentam DNA de AAV de rep e cap. O DNA de AAV nos genomas de rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para que um virus recombinante possa ser derivado, incluindo, mas não limitado a, os sorotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 e 5 AAV-11. Como se observa na Seção de “Fundamendos” acima, as sequências de nucleotídeos dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica.

Os plasmídeos de DNA da invenção compreendem genomas de rAAV da invenção. Os plasmídeos de DNA são transferidos para as células permissíveis para a infecção com um vírus auxiliar de AAV (p°r exemplo, adenovirus, adenovirus deletado El ou 10 herpesvirus) para a montagem do genoma de rAAV em partículas virais infecciosas. As técnicas para produzir partículas de rAAV, nas quais um genoma de AAV deve ser empacotado, os genes rep e cap e as funções do vírus helper são fornecidos a uma célula e são padrões na técnica. A produção de rAAV requer que os seguintes componentes estejam presentes dentro de uma única célula (aqui denotada como uma célula de empacotamento): 15 um genoma de de rAAV, genes de rep e cap de AAV separados (ou seja, não em) do genoma de rAAV, e funções do vírus helper. Os genes rep e cap de AAV podem ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual o vírus reCombinante pode ser derivado e pode ser de um sorotipo de AAV diferente do que as ITRs |do genoma de rAAV, incluindo, mas não limitado a, os sorotipos de AAV de AAV-1, AÁV-2, AAV-3, AAV-4, AAV- 5, AAV-6, 20 AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 e AAV-11. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, no WO 01/83692 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Um método para gerar uma célula de empacotamento é a criação de uma linhagem de células que expressa estavelmente todos os componentes necessários para a produção de 25 partículas de AAV. Por exemplo, um plasmídeo (ou plasmídeos múltiplo) compreendendo um genoma de rAAV sem os genes rep e cap de AAV, os genes rep e cap de AAV separados do genoma de rAAV, e um marcador selecionável, tal como um gene de resistência à neomicina, estão integrados no genoma de uma célula. Os genomas de AAV foram introduzidos em plasmídeos bacterianos através de procedimentos, tais como 30 formação de cauda GC (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. EUA, 79:2077-2081), adição de ligantes sintéticos contendo sítios de divagem por endonucleases de restrição (Laughlin et al., 1983, Gene 23:65-73), ou por ligação da extremidade achatada direta (Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). A linhagem de células de empacotamento é, então, infectada com um virus helper tal como adenovirus. As vantagens deste método são que as células podem ser selecionadas e são adequadas para produção em larga escala de rAAV. Outros exemplos de métodos adequados empregam o adenovirus ou baculovirus em vez de introduzirem os plasmídeos em genomas de rAAV e/ou os genes rep e cap em células de empacotamento.

Os princípios gerais de produção de rAAV são revistos, por exemplo, em Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; e Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial, e Immunol., 158:97-129). Várias abordagens são descritas em Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62: 1963 (1988); e Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); Patente U.S. N°. 5.173.414; WO 95/13365 e Patente US correspondente 5.658.776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13: 1244- 1250; Paul et al|. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3: 1124-1132; Patente US 5.786.211; Patente US 5.871.982; e Patente US 6.258.595. Os documentos anteriores são aqui incorporados por referência na sua totalidade neste documento, com particular ênfase para as seções dos documentos relacionados com a produção de rAAV.

A invenção fornece, assim, células de empacotamento que produzem o rAAV infeccioso. Em uma modalidade as células de empacotamento podem ser células cancerosas estavelmente transformadas, tais como célulax HeLa, células 293 e células PerC.6 (uma linhagem de cognato 293). Em uma outra modalidade, as células de empacotamento são células que não são células cancerosas transformadas, tais como as células 293 de baixa passagem (células de rim de feto humano transformadas com El de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetais humanos), células WI-38 (fibroblastos fetais humanos), células Vero (células de rim de macaco) e células FRhL-2 (pulmão de células fetais de Rhesus).

O AAV recombinante (isto é, partículas de rAAV encapsidado infecciosas) da invenção compreende um genoma de rAAV. As modalidades incluem, mas não estão limitadas a, o rAAV incluindo um genoma que codifica miRNA de MYOT estabelecido na SEQ ID NO: 1 (chamado "AAV-U6-miMyoT-1291"), o rAAV incluindo um genoma que codifica o miRNA de MYOT estabelecido na SEQ ID NO: 2 (chamado "AAV-U6- miMyoT-1321"), o rAAV incluindo um genoma que codifica o miRNA de MYOT estabelecido na SEQ ID NO: 3 (chamado “AAV-U6-miMyoT-1366”) e o incluindo um genoma de rAAV que codifica o miRNA de MYOT estabelecido na SEQ ID NO: 4 5 (chamado “AAV-U6-miMyoT-1490”). Os genomas de rAAV não apresentam DNA de AAV de rep e cap, isto é, não há nenhum DNA de AAV de rep ou cap entre as ITRs de genomas.

O rAAV pode ser purificado por métodos padrões na técnica, tais como cromatografia em coluna ou gradientes de cloreto de césio. Os métodos para a purificação 10 de vetores de rAAV a partir de vírus helper são conhecidos na técnica e incluem métodos descritos, por exemplo, em Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp e Clark, Methods Mol. Med„ 69 427-443 (2002); Patente US 6.566.118 ed WO 98/09657.

Em uma outra modalidade, a invenção contempla composições compreendendo o 15 rAAV da presente invenção. As composições da invenção compreendem rAAV em um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições podem também compreender outros ingredientes, tais como diluentes e adjuvantes. Os carreadores, diluentes e adjuvantes são tóxicos para os receptores e são preferencialmente inertes nas dosagens e concentrações empregados, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, ou outros ácidos 20 orgânicos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas, tais como a albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio; e/ou surfactantes não iônicos tais como Tween, Pluronics ou polietileno glicol (PEG).

Titulações de rAAV a serem administradas nos métodos da presente invenção irão variar dependendo, por exemplo, do rAAV particular, do modo de administração, do 30 objetivo do tratamento, do indivíduo, e o tipo de célula(s) alvo(s), e podem ser determinadas por métodos padrões na técnica. As titulações de rAAV podem variar de cerca de IxlO6, cerca de lxlO7, cerca de IxlO8, cerca de IxlO9, cerca de IxlO10, cerca de IxlO11, cerca de IxlO12, cerca de IxlO13, cerca de IxlO14 ou mais partículas resistentes de DNase (DRP) por ml. As dosagens também podem ser expressas em unidades de genomas virais (vg).

Os métodos de transdução de uma célula alvo com rAAV, in vivo ou in vitro, são contemplados pela invenção. Os métodos in vivo compreendem a etapa de administrar uma 1 5 dose eficaz, ou múltiplas doses eficazes, de uma composição compreendendo um rAAV da invenção a um animal (incluindo um humano) em necessidade do mesmo. Se a dose for administrada antes do desenvolvimento de uma doença/distúrbio, a administração é profilática. Se a dose é administrada após o desenvolvimento de uma doença/distúrbio, a administração é terapêutica. Em modalidades da invenção, uma dose eficaz é uma dose que 10 alivia (elimina ou reduz) pelo menos um sintoma associado com o distúrbio/estado de doença a ser tratada, que retarda ou impede a progressão de um distúrbio/estado de doença, que retarda ou impede a progressão de um distúrbio/estado de doença, que diminui a extensão da doença, que resulta em remissão (parcial ou total) de uma doença, e/ou que prolonga a sobrevivência. Um exemplo de uma doença contemplada para a prevenção ou 15 tratamento com os métodos da invenção é LGMD 1 A.

As terapias de combinação também são contempladas pela invenção. A combinação tal como é aqui usada inclui tanto o tratamento simultâneo quanto os tratamentos sequenciais. Combinações dos métodos da invenção com tratamentos médicos padrões (por exemplo, corticosteróide) são especificamente contempladas, como são as 20 combinações com novas terapias.

A administração de uma dose eficaz das composições pode ser por rotas padrões na técnica, incluindo, mas não limitadas a, intramuscular, parentérica, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraniana, intraóssea, intraocular, retal ou vaginal. A(s) rota(s) de administração e do(s) serotipo(s) dos componentes de AAV do rAAV (em particular, as 25 ITRs de AAV e as proteínas do capsídeo) da invenção pode(m) ser escolhida(s) e/ou combinada por aqueles versados na técnica tendo em conta que a infecção e/ou estado da doença a ser tratada e os tecidos/célula(s) alvo(s) que estão a expressar os miRNA de MYOT.

Em particular, a administração atual de rAAV da presente invenção pode ser 30 realizada usando qualquer método físico que vai transportar o vetor recombinante de rAAV para o tecido alvo de um animal. A administração de acordo com a invenção inclui, mas não está limitada a, injeção no músculo, corrente sanguínea e/ou diretamente no fígado. A simples ressuspensão de um rAAV em salina tamponada com fosfato foi demonstrada como sendo suficiente para fornecer um veículo útil para a expressão de tecido do músculo, e não existem restrições conhecidas sobre os carreadores ou outros componentes que possam ser coadministradas com o rAAV (embora as composições que degradam o DNA devam ser evitadas de forma normal com rAAV). As proteínas de capsídeo de um 5 rAAV podem ser modificadas de modo a que o rAAV é alvo para um tecido alvo particular de interesse, tais como o músculo. Ver, por exemplo, WO 02/053703, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. As composições farmacêuticas podem ser preparadas como formulações injetáveis, ou como formulações tópicas a serem distribuídas aos músculos pelo transporte transdérmico. Numerosas formulações, tanto para injeção 10 intramuscular quanto para o transporte transdérmico, foram anteriormente desenvolvidas e podem ser usadas na prática da invenção. O rAAV pode ser usado com qualquer carreador farmaceuticamente aceitável para facilidade de manuseamento e administração.

Para fins de injeção intramuscular, as soluções em um adjuvante tal como o óleo de sésamo ou de amendoim ou em propileno glicol aquoso podem ser empregadas, bem como 15 soluções aquosas estéreis. Tais soluções aquosas podem ser tamponadas, se desejado, e o diluente líquido primeiro se torna isotônico com solução salina ou glicose. As soluções de rAAV como um ácido livre (DNA possui grupos de fosfatos acídicos) ou um sal farmacologicamente aceitável podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante tal como hidroxipropilcelulose. Uma dispersão de rAAV pode também 20 ser preparada em glicerol, polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos.

Sob condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de micro-organismos. Neste contexto, os meios aquosos estéreis empregados são todos prontamente obtidos por técnicas padrões bem conhecidas dos versados na técnica.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injetáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que existe seringabilidade fácil. A mesma deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra as ações de contaminação de 30 micro-organismos tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos, e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de uma dispersão e de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir 5 agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso de agentes que retardem a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação de rAAV na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados 10 acima, como necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do ingrediente ativo esterilizado num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem sob vácuo e a técnica de 15 secagem por congelação que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir da solução previamente esterilizada por filtração.

A transdução com rAAV também pode ser realizada in vitro. Em uma modalidade, as células musculares alvos desejadas são removidas a partir do sujeito, transduzidas com rAAV e reintroduzidas no sujeito. Altemativamente, as células musculares singeneicas ou 20 xenogênicas podem ser usadas, onde as células não irão gerar uma resposta imune adequada no sujeito.

Os métodos adequados para a transdução e a reintrodução de células transduzidas em um sujeito são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as células podem ser transduzidas in vitro através da combinação de rAAV com as células musculares, por 25 exemplo, em meios apropriados e rastreio para as células que abrigam o DNA de interesse usando técnicas convencionais tais como Southern blots e/ou a PCR, ou usando marcadores selecionáveis. As células transduzidas podem então ser formuladas em composições farmacêuticas, e a composição introduzida no sujeito por várias técnicas, tais como através de injeção intramuscular, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal, ou por 30 injeção no músculo liso e cardíaco, usando, por exemplo, um cateter.

A transdução de células com o rAAV da invenção resulta na expressão sustentada de miRNA de MYOT. A presente invenção fornece, assim, métodos de administração/distribuição de rAAV que expressam miRNA de MYOT a um animal, preferencialmente, um humano. Estes métodos incluem a transdução de tecidos (incluindo, mas não limitados a, tecidos tais como o músculo, órgãos como o fígado e o cérebro, e glândulas tais como glândulas salivares) com um ou mais rAAV da presente invenção. A transdução pode ser realizada com os cassetes de genes compreendendo os elementos de 5 controle específicos do tecido. Por exemplo, uma modalidade da invenção fornece métodos de transdução de células musculares e dos tecidos musculares dirigidas por elementos de controle específicos do músculo, incluindo, mas não limitadas a, aquelas derivadas das famílias de genes de actina e miosina, como a partir da família de genes myoD [Ver Weintraub et al., Science, 251:761-766 (1991)], o fator de ligação potenciador específico 10 para miócitos MEF-2 [Cserjesi e Olson, Cell Mol Biol 11: 4854-4862 (1991)], os elementos de controle derivados do gene da actina do esqueleto humano [Muscat et al., Cell Mol Biol, 7:. 4.089-4.099 (1987)], o gene da actina cardíaca, elementos de sequência de creatina quinase muscular [Ver Johnson et al., Cell Mol Biol, 9:3393-3399 (1989)] e o elemento potenciador de creatina quinase (mCK) de murino, elementos de controle 15 derivados do gene de troponina C de contração esquelética rápida, o gene de troponina C de contração lenta e o gene de troponina I de contração lenta: fatores nucleares induzíveis por hipozia [Semenza et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 88: 5680-5684 (1991)], os elementos esteróide induzíveis e promotores incluindo o elemento de resposta ao glucocorticóide (GRE) [Ver Mader e White, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90: 5603-5607 20 (1993)], e outros elementos de controle.

O tecido muscular é um alvo atraente para a distribuição de DNA in vivo, porque o mesmo não é um órgão vital e é de fácil acesso. A invenção contempla a expressão sustentada de miRNAs a partir de miofibras transduzidas.

Por "células musculares" ou "tecido muscular" quer-se dizer uma célula ou grupo 25 de células derivadas do músculo de qualquer tipo (por exemplo, músculo esquelético e músculo liso, por exemplo, a partir do trato digestivo, bexiga urinária, vasos sanguíneos ou tecido cardíaco). Tais células musculares podem ser diferenciadas ou indiferenciadas, tais como mioblastos, miócitos, miotubos, cardiomiócitos e cardiomooblastos.

O termo "transdução" é usado para se referir à administração/distribuição de 30 miRNAs de MYOT para uma célula receptora quer in vivo ou in vitro, através de um rAAV deficiente em replicação da invenção, resultando na expressão de um miRNA de MYOT pela célula receptora.

Assim, a invenção fornece métodos para a administração de uma dose eficaz (ou doses, administradas essencialmente em simultâneo, ou doses administradas em intervalos) de rAAV que codifica o miRNAs de MYOT a um paciente com necessidade da mesma.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra sítios alvos na sequência de miotilina (SEQ ID NO: 11266) para 5 miRNAs exemplificados.

A Figura 2 apresenta sequências de dois miRNAs de MYOT alvos. Em cada painel, as sequências superiores indicam os moldes de DNA a partir do qual cada respectivo miRNA é transcrito. No painel superior, o molde de DNA miMYOT.1321 é a SEQ ID NO: 2. No painel inferior, o molde de DNA miMYOT.1366 é SEQ ID NO: 3. Os transcritos de 10 miRNA dobrado são mostrados como estruturas tipo hairpin. O miRNA dobrado miMYOT.1321 é a SEQ ID NO: 11268. O miRNA dobrado miMYOT.1366 é a SEQ ID NO: 11271. As sequências de miMYO.1321 maduro (SEQ ID NO: 11270 que emparelha com a SEQ ID NO: 11269 na figura) e miDUX4.1366 (SEQ ID NO: 11273 que emparelha com a SEQ ID NO: 11272 na figura) surgem seguindo o processamento nas células alvos 15 pelo maquinário de processamento de miRNA hospedeiro (incluindo Drosha, DGCR8, Dicer e Exportin-5). As sequências sombreadas em cinza indicam sítios usados para a clonagem de cada miRNA no vetor U6T6. Os nucleotídeos correspondentes à fita de guia de antissenso de miRNA maduro que, finalmente, ajuda a catalisar a clivagem do mRNA alvo de MYOT são sublinhados nas porções de miRNA hairpin deste diagrama. As pontas 20 de seta cinzas e pretas indicam sítios de clivagem catalisados de Drosha e Dicer, respectivamente. Os números 13, 35, 53 e 75 são fornecidos para orientação. As sequências entre (e incluindo) as posições 35-53 são derivadas da sequência de mir-30a natural humana, com exceção de A na posição 39, em que G é a sequência de mir-30a normal. Esta foi alterada para um A para facilitar a dobragem da alça de miRNÁ, com base em modelos de dobragem de RNA in silico. A base da haste (5' da posição 13 e 3' da posição 75) é também derivada de estrutura de mir-30a e sequência com algumas modificações, dependendo da sequência primária da fita de guia. Especificamente, o nucleotídeo na posição 13 pode variar para ajudar a facilitar um desemparelhamento necessário entre os nucleotídeos da posição 13 e 75. Esta estrutura inchada a idealizada para facilitar a clivagem de Drosha adequada.

A Figura 3 mostra o efeito de miRNAs de MYOT alvos em camundongos LGMD1A expressando miotilina mutante (MYOT). A Figura 3A é um Western blot mostrando que o knockdown da expressão de mitotilins mutante é de extratos de músculos de camundongos LGMD1A com três meses de idade, onde a Esquerda (L) = lado de tratamento com miMYOT e Direita (R) = lado tratado com controle de miGFP. A Figura 3B mostra os resultados de PCR em tempo real confirmando os dados do teste de Western.

Exemplos

Os aspectos e as modalidades da invenção são ilustrados pelos exemplos seguintes.

O Exemplo 1 descreve miRNAs específicos para o gene MYOT. O Exemplo 2 descreve o efeito dos miRNAs sobre a expressão de MYOT como medida por PCR em tempo real. O Exemplo 3 descreve o rAAV que codifica os miRNAs. O Exemplo 4 descreve o efeito da expressão de U6T6 de miRNAs sobre a expressão de MYOT como medido através de Western blot. O Exemplo 5 descreve a distribuição de miRNA de MYOT para ratos recém- nascidos. O Exemplo 6 descreve a distribuição de miRNA de MYOT de camundongos adultos.

Exemplo 1

MicroRNAs específicos para o gene MYOT

Seis DNAs codificadores miRNAs específicos para o gene MYOT foram gerados por PCR. Os iniciadores de PCR usados tinham as seguintes sequências. Iniciador 775 (miMyoT-592-Direto) (SEQ ID NO: 11274): AAAACTCGAGTGAGCGACCTGATTACAATAGCAGTAAACTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 776 (miMyoT-592-Inverso) (SEQ ID NO: 11275): TTTTACTAGTAGGCAGCCTGATTACAATAGCAGTAAACCCATCTGTGGCTTTACAG Iniciador 777 (miMyoT-1291-Direto) (SEQ ID NO: 11276): AAAACTCGAGTGAGCGACTGGATGTCCTTGCAAAAGAACTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 778 (miMyoT-1291-Inverso) (SEQ ID NO: 11277): TTTTACTAGTAGGCAGCTGGATGTCCTTGCAAAAGAACCCATCTGTGGCT-TTACAG Iniciador 779 (miMyoT-1321-Direto) (SEQ ID NO: 11278): AAAACTCGAGTGAGCGCGCACCAATGTTTATC.TACÃAACTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 780 (miMyoT-1321-Inverso) (SEQ ID NO: 11279): TTTTACTAGTAGGCAAGCACCAATGTTTATCTACAAACCCATCTGTGGCTTTACAG Iniciador 781 (miMyoT-1366-Direto) (SEQ ID NO: 11280): AAAACTCGAGTGAGCGAGGAGATTCAGTGAAACTAGAACTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 782 (miMyoT-1366-Inverso) (SEQ ID NO: 11281): TTTTACTAGTAGGCAGGGAGATTCAGTGAAACTAGAACCCATCTGTGGCTTTACAG Iniciador 783 (miMyoT-1490-Direto) (SEQ ID NO: 11282): AAAACTCGAGTGAGCGCGAAGAGTTACTTTACTGATAACTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 784 (miMyoT-1490-Inverso) (SEQ ID NO: 11283): TTTTACTAGTAGGCAGGAAGAGTTACTTTACTGATAACCCATCTGTGGCTTTACAG- Iniciador 785 (miMyoT-1603-Direto) (SEQ ID NO: 11284): AAAACTCGAGTGAGCGAGCACGTCCAAACCAAACTCTTCTGTAAAGCCACAGATGGG Iniciador 786 (miMyoT-1603-Inverso) (SEQ ID NO: 11285): TTTTACTAGTAGGCAGGCACGTCCAAACCAAACTCTTCCCATCTGTGGCTTTACAG

O DNA que codifica um miRNA designado miMyoT-592 foi gerado usando os iniciadores 775 e 776. O DNA que codifica miRNA designado miMyoT-1291 foi gerado 10 usando os iniciadores 777 e 778. O DNA que codifica miRNA designado miMyoT-1321 foi gerado usando os iniciadores 779 e 780. O DNA que codifica o miRNA designado miMyoT-1366 foi gerado usando os iniciadores 781 e 782. O DNA que codifica o miRNA designado miMyoT-1490 foi gerado usando os iniciadores 783 e 784. O DNA que codifica o miRNA designado miMyoT-1603 foi gerado usando os iniciadores 785 e 786. Os DNAs 15 são definidos abaixo, em que o número nos nomes indicam o nucleotídeo alvo 5' na sequência de miotilina (SEQ ID NO: 11267). Veja a Figura 1, onde as sequências alvo para os miRNAs na sequência miotilina estão sublinhados. miMyoT-592 CTCGAGTGAGCGACCTGATTÃCAATAGCAGTAÃACTGTAAAGCCACAGATGGGTTTACTGCT ATTGTAÃTCAGGCTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 5) miMyoT-1291 CTCGAGTGAGCGACTGGATGTCCTTGCAAAAGAAGTGTAAAGCCACAGATGGGTTATTTTGC AAGGACATCCAGCTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 1) miMyoT-1321 CTCGAGTGAGCGCGCACCAATGTTTATCTACAAACTGTAAAGCCACAGATGGGTTTGTAGAT AAACATTGGTGCTTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 2) miMyoT-1366 CTCGAGTGAGCGAGGAGATTCAGTGAAACTAGAACTGTAAAGCCACAGATGGGTTCTAGTTT 22 CACTGAATCTCCCTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 3) miMyoT-1490 CTCGAGTGAGCGCGAAGAGTTACTTTACTGATAACTGTAAAGCCACAGATGGGTTATCAGTA AAGTAACTCTTCCTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 4) miMyoT-1603 CTCGAGTGAGCGAGCACGTCCAAACCAAACTCTTCTGTAAAGCCACAGATGGGAAGAGTTTG I GTTTACGTGCCTGCCTACTAGA (SEQ ID NO: 6)

A Figura 2 mostra os moldes de DNA miMyoT.1321 e miMyoT.1366 e seus miRNAs dobrados e maduros correspondentes.

Um μg de cada iniciador foi adicionado a uma reação de extensão do iniciador 1 de 5 ciclo: 95°C durante 5 min, 94°C durante 2 min, 52°C durante 1 min.; 72°C durante 15 min; e, em seguida, mantendo a 4°C. Os produtos de PCR foram limpos com o kit de purificação de PCR da Qiagen QIAquick durante a noite, antes de ser digerido durante a noite com as enzimas de restrição Xhol e Spel. O produto da digestão foi então corrido em um gel de TBE a 1,5% e a banda excisada e purificada usando o Kit de Extração Gel 10 Qiagen QIAquick.

Os produtos de PCR foram ligados a um vetor U6T6 (via Xhol e Xbal) durante a noite. Este vetor contém um promotor U6 rato e um sinal de terminação da polimerase III de RNA (6 nucleotídeos da timidina). Os miRNAs são clonados em sítios de restrição de Xhol + Xbal localizados entre a extremidade 3' do promotor U6 e o sinal de terminação 15 (Spel na extremidade 3' do molde de DNA para cada miRNA tem extremidades coesivas complementares com o sítio Xbal). O produto de ligação foi transformado em células de E- coli quimicamente competentes com um choque de calor a 42°C e incubou-se a 37°C com agitação durante uma hora, antes de serem plaqueadas em placas de seleção com canamicina. As colônias foram deixadas crescer durante a noite a 37°. No dia seguinte, elas 20 foram minipreparadas e sequenciadas para precisão.

Exemplo 2

Reação de PCR em Tempo Real para Efeito da Expressão de miRNAs de MYOT

A expressão da sequência alvo de MYOT na presença de miRNAs de MYOT foi ensaiada. A transfecção de lipofectamina 2000 foi feita em células C2C12 em uma placa 25 de ensaio de paredes brancas com 12 poços. 52.000 células foram transfectadas com 100 ng de AAV-CMV-mutMyoT e 1500 ng de um dos vetores de U6T6 descritos no Exemplo I contendo DNA que codifica miRNA. O ensaio foi realizado 48 horas mais tarde.

O meio foi removido das células e 1 μl de Trizol foi adicionado por poço. Em seguida, as células foram ressuspensas e os lisados foram transferidos para tubos EP de 1,5 30 ml. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 5 minutos e 200 μl de clorofórmio foram adicionados. Os tubos foram agitados vigorosamente durante 15 segundos, incubados à temperatura ambiente durante 3 minutos e centrifugados a 12.000 g durante 15 min a 4°C. Em seguida, a fase aquosa foi transferida para um tubo novo e 0,5 ml de álcool isopropílico foram adicionados. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e centrifugadas a 12.000 g durante 10 min a 4°C. O pélete de RNA foi lavado uma vez com 1 ml de etanol a 75% e seco ao ar. 20 μl de água livre de 5 RNase foram adicionados para dissolver o sedimento e a concentração/purificação foram medidas por nano gotas. 1,5 μg de RNA total foram adicionados a uma reação de geração de cDNA: 5°C, durante 10 min., 37°C durante 120 min.; 85°C durante 5 segundos e, em seguida, mantendo a 4°C. Os produtos de DNAc foram diluídos a 1:10 e 4,5 ul foram adicionados a uma reação de PCR em tempo real. Miotilina humana foi usada para 10 verificar a expressão do MYOT e a expressão relativa foi normalizada para a expressão de GAPDH do camundongo.

U6T6-miMyoT-592 (SEQ ID NO: 5) mostrou maior expressão de MYOT do que o U6T6-miGFP de controle. U6T6-miMyoT-1291 (SEQ ID NO: 1) reduziu a expressão de MYOT para 60%, U6T6-miMyoT-1321 (SEQ ID NO: 2) reduziu a expressão de MYOT 15 para 19%, U6T6-miMyoT-1366 (SEQ ID NO: 3) reduziu a expressão de MYOT para 41,7%, U6T6-miMyoT-1490 (SEQ ID NO: 4) reduziu a expressão de MYOT para 55,3%, U6T6-miMyoT-1603 (SEQ ID NO: 6) reduziu a expressão de MYOT para 34,9% quando comparado ao U6T6-miGFP de controle.

Exemplo 3

Produção de rAAV Codificando MYOT MicroRNAs

Os DNAs de U6-miMYOT foram cortados dos construtos de U6T6-miMYOT em sítios de EcoRI e então clonados respectivamente em AAV6-hrGFPs para gerar vetores de rAAV-U6-miMyoT. Estes vetores de rAAV expressam miRNA e hrGFP.

Exemplo 4

Ensaio de Western blot para Efeito da Expressão dos miRNA de MYOT a partir de vetores de U6T6 e rAAV

O efeito da expressão de miRNA de MYOT dos vetores de U6T6 descritos no Exemplo 1 e o rAAV descrito no Exemplo 4 foi analisado por Western blot.

Um dia antes da transfecção, as células 293 foram plaqueadas em uma placa de 24 30 poços a l,5xlO5 células/poço. As células foram então transfectadas com U6T6-miMyoT (592, 1291, 1321, 1366, 1490 ou 1603) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, N.° cat. 11668-019).

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram recolhidas e lavadas com PBS frio uma vez. Setenta μl de tampão de lise (NaCl 137 mM, Tris lOmM pH = 7,4, NP40 a 1%) foram, então, adicionados. As células foram ressuspensas completamente e incubadas em gelo durante 30 min. As amostras foram centrifugadas durante 20 min a 13.000 rpm a 4°C e o sobrenadante foi recolhido. O lisado celular foi diluído 5 vezes para o ensaio de concentração de proteína de Lowry (Reagente de ensaio de proteína da BioRad DC A, B, S„ N.° Cat. 500-0113, 500-0114, 500-115). Vinte μg de cada amostra foram tomados e tampão de amostra 2x (Tris 100 mM pH = 6,8, DTT 100 mM, glicerol a 10%, SDS a 2%, azul de bromofenol a 0,006%) foram adicionados. As amostras foram fervidas por 10 minutos e depois colocadas no gelo.

As amostras foram carregadas em um gel de poliacrilamida a 10% (com base em razão de acrilamida:bis acrilamida de 37,5:1, Bio-Rad, N°. Cat. 161-0158), 15 μg em um gel para cada amostra. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF a 15 V durante 1 h usando transferência semisseca (Trans-Blot SD semi- Dry Transfer Cell, BioRad, N°. Cat. 170-3940). Os blots foram colocados em tampão de bloqueio (5% de leite desnatado seco, Tris 30 mM pH = 7,5, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween-20) e agitados durante 1 h à temperatura ambiente. O tampão de bloqueio foi decantado e uma solução de anticorpo primário anti-miotilina (policlonal de coelho, gerado por Bethyl Laboratories, usando um peptídeo correspondente aos resíduos 473-488 miotilina) e incubou-se com agitação durante a noite a 4°C. As membranas foram então lavadas durante 30 min, mudando o tampão de lavagem (NaCl 150 mM, Tris 30 mM pH - 7,5, 0,05% de Tween- 20) a cada 10 min. O anticorpo de anti-camundongo com cabra conjugada à peroxidase (Jackson ImmunoReserch, N°. Cat. 115-035-146, 1: 100.000) e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 h. As membranas foram então lavadas durante 30 min, mudando o tampão de lavagem a cada 10 min. Os blots foram colocados em solução de trabalho quimioluminescente (Substrato HRP Quimioluminescente Immobilon Weatem, Millipore, N°. Cat. WBKLS0500), incubados com agitação durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, exposto ao filme de raios-X.

As membranas foram lavadas durante 20 minutos, mudando o tampão de lavagem a cada 10 min. Em seguida, tampão de extração (SDS a 2%, Tris 62,5 mM pH = 6,7, b -ME 100 mM) foi adicionado aos blots e incubou-se a 50°C durante 30 min. As membranas foram lavadas de novo durante 30 min, mudando o tampão de lavagem a cada 10 min. Em seguida, as membranas foram bloqueadas novamente e ressondadas com solução de anticorpo primário anti-GAPDH (Chemicon, N°. Cat. MAB374, 1:200.) e anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoReserch, N°. Cat. 115-035-146, 1:100.000) foi usado como anticorpo secundário.

O filme foi digitalizado e a razão da densidade de MYOT para GAPDH foi calculada. Comparado com o U6T6-miGFP de controle, a expressão de MYOT foi superior 5 (1,08) nas amostras de U6T6-miMyoT-592 (SEQ ID NO: 5) e a expressão de MYOT foi reduzida para 78,9%, em U6T6-miMyoT-1291 (SEQ ID NO: 1), *50,2% por U6T6- miMyoT-1321 (SEQ ID NO: 2), 60,2% por U6T6-miMyoT-1366 (SEQ ID NO: 3), 76,2% por U6T6-miMyoT-1490 (SEQ ID NO: 4), 87% por U6T6-miMyoT-1603 (SEQ ID NO: 6).

U6T6-miMyoT-1321 derrubou de forma mais eficaz a expressão de miotilina tanto em PCR em tempo real quanto nas experiências westem-blot. O efeito de knockdown por AAV-miMyoT-1321 também foi confirmado pela experiência de westem-blot.

Exemplo 5

Distribuição de Camundongos Recém-nascidos

O genótipo de PCR de filhotes recém-nascidos foi determinado para identificar camundongos WT ou T57I MYOT femininos (usando iniciadors de MYOT humanos e iniciadores de cromossomo Y). As injeções intramusculares bilaterais de 5xl010 partículas de AAV6.miMYOT-1321 ou AAVó.miGFP de controle por perna em camundongos de 1-2 dias de idade foram suficientes para saturar a musculatura dos membros inferiores.

A correção fenotípica foi determinada inicialmente por análises histológicas.

Especificamente, 3 meses após a distribuição virai, os músculos foram recolhidos e criopreservados. Crioseções em série de dez microns foram cortadas e coradas com anticorpos para detectar os agregados de proteínas positivos para miotilina em miofibras T57I. Os músculos AAV6.miMYOT-1321 tiveram número de agregados por seção 25 reduzidos de forma significativa em comparação com AAVó.miGFP óu controleos não tratados. Além disso, quando os músculos tratados com AAV6.miMYOT-132 não mostraram agregados ocasionais, eles foram significativamente menores do que os observados em animais T57I tratados ou não tratados com controle. O tratamento com AAV6.miMYOT-132 também melhorou os déficits do tamanho do músculo em relação ao 30 tratamento com controle.

O knockdown de MYOT foi confirmado por Western blot e PCR em tempo real, como mostrado na Figura 3. O miMYOT-1321 distribuído por AAV reduziu significativamente a proteína mutante MYOT (Figura 3A) e mRNA (Figura 3B) nos músculos.

Estes resultados suportam a eficácia terapêutica. As experiências contínuas incluem a determinação dos efeitos funcionais do knockdown de MYOT nos músculos inteiros, medindo a força específica de EDL.

Exemplo 6

Distribuição para Camundongos Adultos

O genótipo de PCR de filhotes desmamados é determinado e camundongos com 12 semanas de idade que têm patologia associada a LGMD1A pré-existente significativa são escolhidos para o tratamento. 5x1o11 vetores de AAV6 são distribuídos à musculatura dos 10 membros inferiores por perfusão da perna isolada. A correção fenotípica (incluindo força de preensão dos membros traseiros, parâmetros musculares graves e força específica de EDL) é, então, medida usando vários métodos ao longo dos meses seguintes.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de modalidades específicas, é compreendido que variações e modificações ocorrerão aos versados na 15 técnica. Deste modo, apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações devem ser colocadas na invenção.

Todos os documentos referidos no presente pedido são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Claims

1. Vírus adenoassociado recombinante caracterizado por compreender o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, em que o vírus adenoassociado recombinante carece dos genes rep e cap.

2. Vírus adenoassociado recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão do DNA codificando miRNA está sob o controle de um promotor CMV, um promotor de creatinina cinase muscular (MCK), um intensificador de cadeia pesada de alfa-miosina/promotor de intensificador de MCK (MHCK7) ou um promotor de desmina.

3. Composição caracterizada por compreender o vírus adenoassociado recombinante conforme definido na reivindicação 1.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a expressão do DNA codificando miRNA está sob o controle de um promotor de CMV, um promotor de creatinina cinase muscular (MCK), um intensificador de cadeia pesada de alfa-miosina/promotor de intensificador de MCK (MHCK7) ou um promotor de desmina.

5. Vírus adenoassociado recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ou composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 1, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap.

6. Vírus adenoassociado recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ou composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 2, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap.

7. Vírus adenoassociado recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ou composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 3, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap.

8. Vírus adenoassociado recombinante, de acordo com a reivindicação 1, ou composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 4, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap.

9. Uso de um vírus adenoassociado recombinante que compreende o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 1, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap, caracterizado por ser na preparação de uma composição para tratar distrofia muscular de cintura de membro tipo 1A.

10. Uso de um vírus adenoassociado recombinante que compreende o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 2, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap, caracterizado por ser na preparação de uma composição para tratar distrofia muscular de cintura de membro tipo 1A.

11. Uso de um vírus adenoassociado recombinante que compreende o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 3, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap, caracterizado por ser na preparação de uma composição para tratar distrofia muscular de cintura de membro tipo 1A.

12. Uso de um vírus adenoassociado recombinante que compreende o DNA codificando miRNA de MYOT estabelecido em SEQ ID NO: 4, em que o vírus adenoassociado recombinante não possui os genes rep e cap, caracterizado por ser na preparação de uma composição para tratar distrofia muscular de cintura de membro tipo 1A.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o vírus adenoassociado recombinante inibe a expressão do gene MYOT em uma célula.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que a expressão do DNA codificando miRNA está sob o controle de um promotor de CMV, um promotor de creatina cinase muscular (MCK), um intensificador de cadeia pesada de alfa-miosina/promotor de intensificador de MCK (MHCK7) ou um promotor de desmina.