BR112013000219A2 - método para a produção de um poi recombinante uma linha celular de alta produção e uma cultura celular de alta produção, métodos para aumentar o rendimento e prolongar a fase de produção de um poi recombinante - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE UMA LINHA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO E UMA CULTURA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO, MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO E PROLONGAR A FASE DE PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE. A presente invenção se relaciona a um método de produção de um polipeptídio recombinante (POI) em uma cultura de células, compreendendo a engenharia genética de uma linha celular eucariótica: para ocasionar especificamente o prolongado da fase G2 + M do ciclo celular em uma fase de pré-cultura, e para produzir o POI em uma fase de produção que segue a fase de pré-cultura, uma linha celular e cultural celular de alta produção, bem como um método para aumentar o rendimento de produção de um POI recombinante em uma cultura de células

Description

e.

“ 1/44 Relatório Descritivo do pedido de patente “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE, UMA LINHA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO E UMA CULTURA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO, MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO E PROLONGAR A FASE DE PRODUÇÃO DE UM POI” A invenção refere-se a um método de preparação de uma linha celular de alta produção para produzir um polipeptídeo de interesse (POI) em uma cultura de células Fundamentos O desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante tem permitido a utilização de vários microorganismos como hospedeiros para a expressão de proteínas heterólogas com aplicação industrial e farmacêutica.

Várias células diferentes são usadas para a produção de tais proteínas heterólogas. Produções bem sucedidas de proteínas recombinantes tem sido realizadas com hospedeiros eucarióticos. Os exemplos mais proeminentes são leveduras de brotamento, como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha, fungos filamentosos, como Aspergillus awamori ou Trichoderma reesei, ou célutas de mamíferos, como por exemplo, as células CHO.

Leveduras são hospedeiros atraentes para a produção de proteínas recombinantes e metabólitos pequenos. Píchia pastoris, uma levedura metilotrófica, é frequentemente usada como um sistema de expressão para a produção de proteínas recombinantes, e mais recentemente também para a produção de metabólitos pequenos (Marx et al. Microb cell Fact 7:23 (2008)). Pichia tem uma alta taxa de crescimento e é capaz de crescer em um meio simples de baixo custo. Pichia pode crescer tanto em frascos agitados quanto em um fermentador, o que a torna adequada para ambas as escalas de produção, pequena e grande. Pichia pastoris

: 2/44 recentemente foi reclassificada em um novo gênero, Komagataella e foi separada em três novas espécies: Komagataella pastoris, K. phaffir e K. pseudopastoris (Kurtzman CP. Int J Syst Evol Microbiol 55, 973-976. (2005)). Portanto, Pichia pastoris é um sinônimo para todas as três espécies, K. pastoris, K. phaffir e K. pseudopastoris. De acordo com a literatura prévia, Pichia pastoris é usada em todo este texto, implicitamente significando qualquer uma das espécies Komagataella. Da mesma forma, Hansenula polymorpha e Píchia angusta são sinônimos.

Na maioria dos casos, as células hospedeiras são cultivadas em processos em batelada alimentada para produção industrial. A produtividade total de tal processo é uma função da integral da biomassa sobre o tempo e a produtividade específica (qo) da biomassa. qr está correlacionada com a taxa de crescimento específico (u), geralmente continuamente crescente com o aumento de yu. Portanto, alta qué alcançada em alta 4, considerando que a integral ótima biomassa-tempo (A) é atingida com alta y inicial e, em seguida, py muito baixa. Isto se reflete através da seguinte fórmula para calcular o rendimento do produto (P) com qp constante: P=A.qgp A Figura 1 mostra a relação de qp e p na P. pastoris (Maurer et al. 2006, Micr. Cell Fact. 5:37 doi:10.1186/1475-2859-5-37).

Assim, é atingida uma produtividade ideal de acordo com y, normalmente controlada em batelada alimentada através de um substrato alimentado limitado.

Um caso típico de processo em batelada alimentada é a produção de proteínas recombinantes com microorganismos ou células de mamíferos. Enquanto que a descrição da concentração de produto na massa de células é um tanto simples, —nocaso de um produto intracelular, é mais complexo prever a cinética de um produto

- 3/44 secretado. Um caso típico para sistemas de secreção são leveduras recombinantes. Como a produção de muitas proteínas em leveduras é bastante sensível ao custo, são feitos esforços para prever e controlar a produtividade, tempo de processo e produtos títulos. Abordagens para otimizar os processos em batelada alimentada para a levedura metilotrófica Pichia pastoris têm sido descritas (Zhang et al. Biotechnol. Prog. 2005, 21: 3866-393, Maurer et al. 2006, Micr. Cell Fact.).

Os custos variáveis de um bioprocesso correlacionam-se com a capacidade volumétrica da unidade de fermentação necessária, e o tempo de processo necessário para esta unidade produzir uma quantidade definida de produto.

Assim, a produtividade volumétrica Qp é o alvo mais plausível para otimização. Em um dado ponto de tempo t do processo, Qr é definida como: Qp=P/(Vt) O ciclo celular, ou ciclo de divisão celular é a série de eventos que ocorre em uma célula levando à sua divisão e duplicação (replicação).

A divisão de célula eucariótica procede através de um ciclo celular altamente regulado compreendendo fases consecutivas denominadas G1 (gap 1), S (síntese), G2 (gap 2) e M (mitose). ; A fase GO é chamada de fase de repouso, onde as células em repouso, sob certas circunstâncias ou após receber estímulos específicos, iniciarão a síntese de RNA e proteínas (fase G1) que são necessários para efetivamente realizar a multiplicação de seu DNA e a divisão da célula em duas células filhas. Posteriormente, inicia a síntese de DNA (fase S); uma vez que a célula tenha duplicado seu DNA, inicia um segundo período final de síntese de proteínas (fase G2), que é a fase curta preparando a célula para a divisão (fase M). As fases G2 e M

- 4/44 ambas são caracterizadas pelo arranjo de duplo cromossomo e são muitas vezes consideradas juntas como fase G2 + M.

Durante a breve fase da mitose, a célula eucariótica separa os cromossomos no núcleo da sua célula em dois conjuntos idênticos e em dois núcleos filhos A mitose geralmente é imediatamente seguida por citocinese, separando o citoplasma em duas células filhas, para fornecer os componentes celulares em partes iguais.

Após a divisão celular, cada uma das células filhas começa a interfase de um ciclo novo. As células que pararam de se dividir, temporariamente ou não, são ditasterem entrado em um estado de quiescência ou senescência (GO).

A progressão do ciclo celular é firmemente regulada por uma expressão temporal e espacial definida, localização e destruição de uma quantidade de reguladores do ciclo celular, que exibem comportamento altamenté dinâmico durante o ciclo celular. Por exemplo, em estágios específicos do ciclo celular algumas proteinas translocam do núcleo para o citoplasma, ou vice versa, e algumas são rapidamente degradadas. Para mais detalhes de conhecidos componentes de controle do ciclo celular e interações, ver Alberghina L, Coccetti P, Orlandi |. Systems biology of cell cycle of Saccharomyces cerevisiae: From network mining to system-level properties. Biotechnol Adv 2009 Nov-Dec; 27 (6): 960-78. O processo do ciclo celular é complexo e altamente regulado. Erros no ciclo celular tanto podem matar a célula por apoptose quanto podem levar a divisão celular descontrolada, e em alguns casos ao câncer.

A análise do ciclo celular, principalmente através do estudo da distribuição das células ao longo das fases GO/G1, S e G2/M do ciclo celular tem

. 5/44 provado ser útil na análise de amostras de tumor e o estudo da resposta proliferativa a diferentes estímulos, bem como em outras áreas.

O sincronismo e a interdependência da replicação do DNA (fase S) e a mitose (fase M) são controlados por oscilações nas atividades de quinases « dependentes da ciclina (Cdks). Eucariotas superiores contêm múltiplas Cdks enquanto que nas leveduras, a progressão do ciclo celular requer uma única Cdk conhecida como Cdc2 em leveduras de fissão e Cdc28 em leveduras de brotamento. Ondas de atividade da quinase são determinadas em uma grande extensão pela síntese celular ciclo dependente e degradação de subunidades de ciclina reguladoras da Cdk. À entrada na fase M depende do aparecimento de ciclinas tipo B, cuja atividade associada à quinase promove a formação do fuso mitótico. Em leveduras de brotamento, dois pares relacionados de ciclinas tipo B que aparecem durante a fase S (Clb3,4) e G2 (Clb1,2) estão envolvidos na formação e alongamento do fuso.

Cross et |. (Molecular Biology of the Cel (2005) 16:2129-2138) .

descrevem um comportamento. quantitativo do sistema de controle do ciclo de células eucarióticas dependendo do nível de expressão de CIb2. Foi prevista uma perda de robustez de um sistema de superexpressão Clb2.

Uma série de reguladores fúngicos, incluindo reguladores do ciclo celular, foi descrita para melhorar o rendimento da produção de metabólito fúngico (WO01/29073).

Em um esforço para melhorar a expressão de proteínas de uma linha celular produtora p21 recombinante ou outra proteína inibidora do ciclo celular tem sido co-expressadas para aumentar a produtividade de uma única célula (WOO02/099100A2). p21 é uma inibidora universal de ciclina quinases, conferindo uma

- 6/44 parada estável e quantitativa do ciclo celular. Assim, há que se tomar cuidado para evitar o desencadeamento da morte ou apoptose celular além de seu efeito citostático.

WO0216590A2 divulga a extensão da biossíntese de proteínas de uma cultura celular mudando as células de um estado replicativo para um estado produtivo (alternância RP), que é um estado pseudo-senescente. Isso pode ser realizado por células transformadas expressando condicionalmente um bloqueador do ciclo celular parando a divisão das células. Impedindo a proliferação celular, induzindo a diferenciação para um estado de senescência, seriam obtidos rendimentos : aumentados de bioprodutos.

Vários métodos podem ser usados para sincronizar as culturas de células detendo o ciclo celular em uma determinada fase, ou separando células de diferentes fases. Por exemplo, privação de soro ou adição de fator alfa iria deter a célula na fase G1, destacamento mitótico, tratamento com colchicina e tratamento com nocodazole detem a célula na fase M e tratamento com 5-fluorodeoxiuridina detémascélulasnafasesS.

Uma medida comum para prolongar a fase de produção de uma cultura celular é a limitação de substratos, uma vez que a biomassa tenha crescido até certo ponto. Da mesma forma, são descritos aditivos aos meios de cultura para influenciar o ciclo celular. KR100254810B1 divulga a adição do antibiótico novobiocina a uma cultura celular CHO para aumentar a produção de eritropoietina recombinante. A Novobiocina serve como um inibidor das fases iniciais (pré-M) do ciclo celular.

Uchiyama et al. (Biotechnol Bioeng 54:262-271 (1997)) descrevem culturas síncronas e interrompidas de Saccharomyces cerevisiae. A sincronia foi induzida usando ambos mutantes cdc sensíveis à temperatura e inibidores para parar a progressão do ciclo celular para estudar a dependência do ciclo celular. O ciclo

- 7/44 celular foi interrompido pela alternância de temperatura, de uma temperatura permissiva para uma repressiva, ou então pela adição de um inibidor do ciclo celular.

O bloqueio universal da proliferação e crescimento celular efetivamente pode levar a uma parada celular e apoptose precoce, resultando em um período curto de produção da cultura de células.

Em geral, a produtividade prolongada na ausência de crescimento celular, dificilmente pode ser mantida com a tecnologia do estado da técnica.

É o objeto da presente invenção prolongar uma fase altamente produtiva de uma cultura celular para aumentar o rendimento de bioprodutos.

Resumo da Invenção O objeto é alcançado através do fornecimento das incorporações do presente pedido.

De acordo com a invenção é fornecido um método de preparação de | uma linha celular de alta produção para a produção de um polipeptídeo de interesse (POI) em uma cultura de células, compreendendo a engenharia genética de uma linha celular eucariótica para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular.

À Especificamente, o método é para produzir um polipeptídeo recombinante de interesse (PO!) em uma cultura de células, compreendendo a engenharia genética de uma linha celular eucariótica, - para ocasionar especificamente o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular em uma fase de pré-cultura, e - para produzir o PO! em uma fase de produção seguindo a fase de pré- cultura.

- BI44 A cultura celular (ou seja, linha celular em cultura) na fase de pré-cultura particularmente serve para cultivar as células e estabelecer a fase G2 + M do ciclo celular como um estado estacionário.

Através da alternância das condições da cultura celular para a fase de produção, que é também referida neste documento como "fase de produção", o POI recombinante e eventualmente os respectivos metabólitos mediados pelo tal POI, são efetivamente produzidos, ainda mantendo o vantajoso ' estado GS + M do ciclo celular.

Assim, o método de cultura encenado efetivamente fornece ambos, o enriquecimento da cultura celular para as células capazes de É produzir um alto rendimento de POI na primeira fase, e a produção do POI na segunda fase.

Especificamente a linha celular é uma linha celular tendo um cassete de expressão estavelmente integrado no seu genoma para expressar um modulador do ciclo celular. : Preferencialmente a linha celular é concebida para modular um regulador do ciclo celular, de preferência especificamente pela superexpressão, ativação, mutação, diminuição da modulação, exclusão, degradação ou inibição de um . regulador do ciclo celular. : Reguladores preferidos do ciclo celular como os usados de acordo com à invenção são selecionados do grupo constituído por complexos Cdk/ciclina tais como quinases ciclina dependentes (Cdk), ciclinas específicas G1, G2/ciclinas mitóticas específicas e seus fatores de transcrição ou de degradação, tais como Clb2, CIb1, Clb3-6, Cln1-3, Cdc6, Cde14, Cdc20, Cdc28, Cde48, Cdh1, Kari, Mad2, MBF, Mem1, Pds1, Rrp42, SBF, Sic1, Swe1, Swi5, Whi2.

- 9/44 De acordo com uma incorporação específica a dita linha celular é uma linha celular hospedeira genérica (curinga ou selvagem) ou uma linha celular produtora que é concebida para produzir um modulador do ciclo celular e o dito POI. Especificamente preferido, os POI são selecionados do grupo consistindo proteinas do soro, tais como uma imunoglobulina ou albumina do soro, enzimas, hormônios, moléculas de sinalização, matriz de proteínas, fragmentos ou seus derivados ou um polipeptídeo que medeia a produção de um metabólito de células hospedeiras.

A linha celular eucariótica como a usada de acordo com a invenção preferiveimente é uma célula fúngica, preferencialmente uma célula de levedura, tal : como uma célula do gênero Pichia, em particular, uma célula de uma cepa de P. pastoris, ou uma célula eucariótica superior, de preferência uma célula de um mamífero ou de um vegetal.

A invenção ainda prevê para a linha celular de alta produção obtida através de um método de acordo com a invenção, ter uma produtividade específica q» de pelo menos 0,1 ug/(g-h) para produzir o dito POI, preferivelmente pelo menos 0,1 mg/(g:h), mais preferivelmente pelo menos 1 mg/(g-h), por exemplo, em casos de enzimas industriais ou técnicas, em uma cultura celular sob condições de produção em escala industrial.

A invenção ainda prevê para a cultura celular de alta produção obtida através de um método de acordo com a invenção, onde pelo menos 50% das células estejam na fase G2 + M ao longo de um tempo de processo que seja, pelo menos, 50% do tempo de alimentação.

- 10/44 Especificamente, a cultura celular pode ser mantida estável em um estado estacionário tal como a distribuição G2 + M ao longo de um período de pelo menos 10 horas.

De acordo com aspectos específicos a cultura celular é uma cultura —celularem batelada alimentada ou contínua. Em uma incorporação particularmente preferida a cultura celular da invenção possui uma produtividade volumétrica Qp de pelo menos 0,1 ug(L-h), preferivelmente de pelo menos 10 ug/(L-h), mais preferivelmente de pelo menos 0,1 mg/(L-h), ainda mais preferivelmente de pelo menos 1 mg/(L-h), por exemplo, em casos de enzimas industriais ou técnicas, normalmente sob condições de produção em escala industrial, por exemplo, empregando o cultivo em batelada alimentada em reator com volumes de 100 L a 10 mº ou maior, empregando tempos de processo típicos de vários dias, ou de processos contínuos em fermentador com volumes de aprox. 50-1000 L ou maior, com taxas de diluição de aprox. 0,05 — 0,15 h”. De acordo coma invenção, ainda é previsto um método para aumentar o rendimento de produção de um POI recombinante em uma cultura de células, compreendendo : a) engenharia genética de uma linha celular de produção eucariótica para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular, b) cultivo de dita linha celular de produção, e o) coleta de uma fração da cultura celular contendo POI.

Especificamente, o método é para aumentar o rendimento de produção de um POI recombinante em uma cultura de células, compreendendo a) engenharia genética de uma linha celular de produção eucariótica para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular,

- 11/44 ' b) cultivo de dita de linha celular de produção em uma fase de pré- cultura para obter uma cultura celular em estado estacionário com uma fase G2 + M do ciclo celular prolongada, c) cultivo da dita cultura celular em estado estacionário em uma fase de — produção seguindo dita fase de pré-cultura para produzir o POI, e d) coleta de uma fração da cultura celular contendo POI.

A cultura celutar de produção na fase de produção é às vezes chamada cultura principal; um exemplo é fornecido na seção de exemplos abaixo.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é previsto um método para prolongar a fase de produção para produzir um POI recombinante, ou seja, a " fase de produção de um POI recombinante de uma linha celular de produção eucariótica em uma cultura de células, compreendendo engenharia genética da linha celular para ocasionar especificamente o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular.

Figuras Fig. 1: Relação de qr e yu na P. pastoris.

Linha inferior: relação real de células selvagens.

Linha superior: relação idea! para maior produtividade. : .: Esta figura mostra a relação funcional da produtividade específica de expressão Fab e o crescimento de células em uma cultura celular de P. pastoris.

À . inclinação da curva indica a proporção de qo e y em uma determinada py e é uma medida para o título de produto que pode ser alcançado nesta py determinada.

Assim, o rendimento ideal pode ser alcançado com uma alta taxa de crescimento inicial seguida de um estado estacionário da fase de produção durante um período de tempo prolongado. f

- 12/44 Fig. 2: Relação de qr, p e distribuição do ciclo de células na P. pastoris. qe (linha preta) depende de |) de acordo com uma função Monod.

As frações de células na fase G1 (conjunto de cromossomas únicos, barra da esquerda) É efaseG2+M (pelo menos conjunto de duplo cromossomo, barra da direita) indica uma correlação positiva qP com a fase G2 + M.

Fig. 3: Relação de qr e yu na P. pastoris engenheirada.

Quadrados: controle (cepa selvagem). Triângulos: relação aumentada da cepa e superexpressão de Clb2 Fig. 4: Relação de up e distribuição do ciclo de células na P. pastoris engenheirada.

Barras da esquerda: fração de células na fase G1, barras da direita: : fração de células na fase G2 + M. ; Descrição Detalhada da Invenção + Portanto, a presente invenção baseia-se no efeito vantajoso que um prolongamento específico da fase G2 + M ou um aumento relativo do número de células eucarióticas na fase G2 + M dentro de uma cultura celular fornece a um dispositivo biofábrica altamente produtivo para produzir um POI.

Isto é efetuado através da engenharia genética de uma linha celular para obter uma linha celular recombinada com uma modificação genômica que iria expressar estavelmente uma molécula efetora, ocasionando o dito prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular.

Isto surpreendentemente revelou que uma respectiva cultura celular poderia produzir estavelmente um POI com rendimentos elevados em uma taxa de crescimento baixa, deste modo, aumentando o rendimento volumétrico.

Assim, a linha celular de produção inventiva não só seria útil no processo em batelada alimentada, mas

. 13/44 também em um processo de produção contínua, onde a cultura celular é mantida de modo que a fração de células G2 + M seja mantida em um alto nível durante um tempo prolongado de produção. O termo "modulador do ciclo celular" como o usado de acordo com a invenção refere-se a moléculas efetoras de regulação para cima ou regulação para baixo de inibidores do ciclo celular, quinases ou outras enzimas ou co-fatores do sistema de controle do ciclo celular. O termo deverá incluir reguladores do ciclo celular e deverá referir-se aos agonistas ou antagonistas, ativadores ou inibidores de tais moléculas efetoras, inibidores do ciclo celular ou as respectivas enzimas, que estão ativamente envolvidas no processo do ciclo celular. Moduladores do ciclo celular podem ser efetores fisiológicos de mecanismos de controle do ciclo celular, agentes sintéticos ou químicos, ou substâncias biológicas com uma atividade de modulação comprovada. Assim, moduladores do ciclo celular possuem efeitos diretos ou indiretos sobre a regulação do ciclo celular. Tais compostos podem ser derivados por uma pessoa versada na arte, e eventualmente testados por seus efeitos sobre o ciclo celular eucariótico através de vias padrões.

O termo "regulador do ciclo celular" deve se referir a substâncias : fisiológicas, opcionalmente endógenas envolvidas ativamente no controle do ciclo celular de uma célula eucariótica.

O termo "linha celular" deve se referir a um clone estabelecido de um tipo de célula específica que adquiriu a capacidade de proliferar durante um período prolongado de tempo. O termo "linha celular do hospedeiro" deve se referir a uma linha celular utilizada para expressar um gene recombinante na produção de polipeptídios ou metabólitos de células mediados por esses polipeptídios. Uma linha —celularde produção do hospedeiro comumente entende-se uma linha celular pronta-

” 14/44 para-uso para o cultivo em um biorreator para obter o produto do gene em um processo de produção. O termo "expressão" ou "sistema de expressão" ou "cassete de expressão" se refere a moléculas de ácido nucleico contendo uma codificação de sequências e controle de sequências desejadas em ligação operável, de modo que os hospedeiros transformados ou transfectados com essas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas. De modo a efetuar a transformação, o sistema . de expressão pode ser incluído em um vetor; no entanto, o DNA relevante também pode ser integrado no cromossomo do hospedeiro.

"Vetores de expressão” ou "vetores" usados neste documento são definidos como sequências de DNA que são necessárias para a transcrição de sequências de nucleotídeos recombinantes clonados, ou seja, dos genes recombinantes e da tradução de seu mRNA num organismo hospedeiro adequado. Tais vetores de expressão compreendem geralmente uma origem de replicação autônoma nas células hospedeiras, marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de síntese de aminoácidos ou um gene que confere resistência aos antibióticos tais como zeocina, canamíicina, G418 ou higromícina), vários sítios de clivagem de enzimas de restrição, uma sequência promotora adequada e um terminador de transcrição, cujos componentes estão operaveimente ligados entre si. Os termos plasmídeo e vetor usados neste documento incluem sequências de nucleotídeos autonomamente replicantes bem como sequências de nucleotídeos de integração do genoma.

O termo "hospedeiro eucariótico" deve significar qualquer célula ou organismo eucariótico, que pode ser cultivado para expressar um POI ou um

- 15/44 metabólito da célula hospedeira.

Fica bem entendido que o termo não inclui seres humanos.

O termo "Fase G2 + M do ciclo celular", também chamada de fase G2/M ou alternância G2/M, deve significar a fase curta do ciclo celular que segue a fase de síntese(S), onde as células portam pelo menos um duplo conjunto de cromossomos e estão preparadas para divisão e processadas para mitose (M). A fase G2 + M é seguida por uma fase caracterizada por um conjunto único de cromossomos.

O termo "polipeptídeo" se refere a uma proteína ou peptídeo que contém dois ou mais aminoácidos, geralmente pelo menos 3, preferencialmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 30, mais preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos.

O termo também se refere à polipeptídios de peso molecular mais elevado, tal como proteínas.

A seguir os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente.

O termo "polipeptídeo de interesse" ou POI neste documento refere-se a | um bioproduto produzido em uma célula hospedeira.

Mais especificamente, é produzido um polipeptídeo, que não ocorre naturalmente na célula hospedeira, por exemplo, uma proteína heteróloga.

Outros polipeptídios podem ser nativos da célula hospedeira, proteínas homólogas, por exemplo, mas são produzidos, por exemplo, por transformação com um vetor auto-replicante, contendo a codificação da sequência de ácido nucléico do POI, ou mediante integração através de técnicas de recombinação de uma ou mais cópias da sequência do ácido nucléico que codifica o POI no genoma da célula hospedeira ou por modificação recombinante de uma ou mais sequências | regulatórias que controlam a expressão do gene que codifica o POI, por exemplo, da sequência promotora.

Em alguns casos o POI, conforme usado aqui, também se

- 16/44 refere a qualquer metabólito produzido pela célula hospedeira como mediado por uma proteína recombinantemente expressa.

O termo "célula hospedeira genérica (curinga ou selvagem)" deve significar uma célula hospedeira, que é preparada através da engenharia genética para compreender genes regulatórios, tais como aqueles que codificam os moduladores do ciclo celular, e que está pronta para incorporar um gene de interesse (GI). Assim, a linha celular genérica (curinga ou selvagem) é uma linha celular hospedeira pré-formada, que é caracterizada por sua capacidade de expressão de qualquer POI desejado.

Isto segue uma estratégia "genérica" inovadora para a geração de linhas celulares produtoras, também chamado de linha celular hospedeira de expressão, para a produção de biofármacos, por exemplo, usando troca de cassete mediada por recombinase sitio específica ou recombinação homóloga.

Tal célula hospedeira nova facilta a clonagem de um Gl, por exemplo, em pontos predeterminados de expressão genômica dentro de dias, a fim de obter linhas celulares reprodutíveis com produção altamente eficiente.

Ao determinar a relação de qr, py e outras propriedades das células da levedura Pichia pastoris, verificou-se surpreendentemente que qr refere-se também a distribuição do ciclo celular das células hospedeiras (Figura 2). Descobriu-se que uma cultura é mais produtiva, quanto mais células estiverem na fase G2 + M do ciclo celular A partir destes dados inesperados concluiu-se que podem ser alcançadas melhores propriedades das células, se as células forem engenheiradas de um modo que a distribuição das fases do ciclo celular for alterada com baixa u, de modo que mais células estejam na fase G2 + M do ciclo celular em comparação com as do tipo selvagem.

. 17/44 De acordo com a invenção as células hospedeiras assim alcançadas exibem alta q» em baixa yu, prolongando, assim, a fase de produção de uma cultura celular produzindo um POI.

Através do método inventivo ambos os parâmetros, q» e a concentração do produto, preferencialmente são aumentadas em pelo menos 30%, preferivelmente em pelo menos 40%, mais preferivelmente em pelo menos 50%.

A alta produtividade alcançada de acordo com a invenção é caracterizada especificamente por uma relação qr / y que é de pelo menos 3 ug de produto / g seco de biomassa.

O rendimento volumétrico preferencialmente obtido está na faixa de 0,01 a 10 mg/(L-h), preferivelmente em torno de 1 mg/(L-h).

De acordo com a invenção, mutantes celulares com mecanismos de controle do ciclo celular modificados mantendo as células na fase G2 + M do ciclo celular em um estado estacionário por um período de tempo prolongado tem sido preparadas e comprovadas por alcançar maior produtividade total e maior concentração de produto em comparação com o tipo selvagem.

Através do efetivo prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular relativamente curta, é preferencialmente obtida uma percentagem elevada de células G2 + M na cultura celular hospedeira. O conteúdo preferencial de células na fase G2 + M conforme alcançado em uma produção de linha celular como usado em um processo industrial de acordo com a invenção é pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% até 90%.

O estado estacionário da fase de produção poderia ser alcançado, se a porção desejada das células G2 + M na cultura celular for mantida por um período de

. 18/44 tempo prolongado. De preferência o estado estacionário é mantido durante a maior parte do tempo de alimentação, preferivelmente pelo menos 50% do tempo de alimentação, mais preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%. Normalmente, o estado estacionário seria mantido ao longo deumtempo de processo de pelo menos 10 h, preferivelmente pelo menos 15 h, mais preferivelmente pelo menos 20 h em um processo em batelada alimentada, que reflete a fase de produção da cultura de células. Em um processo contínuo o tempo de processo até mesmo poderia ser mais prolongado.

Normalmente, o status do ciclo celular para populações de células pode ser determinado por citometria de fluxo utilizando marcadores fluorescentes que marcam o conteúdo de DNA do núcleo das células. A citometria de fluxo é também apropriada para examinar a distribuição total do ciclo celular de células de uma população. Através de informações quantitativas sobre o conteúdo de DNA das células, pode ser determinado o número relativo de células nas fases G1, Se G2 + M dociclocelular. Desde que o conteúdo de DNA do núcleo das células varia através do ciclo da célula de uma forma razoavelmente previsível, é possível monitorar a distribuição relativa das células entre as diferentes fases do ciclo celular. A técnica normalmente não determinaria com precisão a posição do ciclo celular de qualquer célula individual devido à ambiguidade na atribuição das células para as fases G2 ou M. Assim,asoma da distribuição celular na fase G2 + M é fornecida. i Preferivelmente, o alvo da engenharia genética é um regulador do ciclo celular, que pode ser especificamente superexpressado, ativado, mutado, modulado para baixo, degradado ou inibido. A superexpressão é, por exemplo, atingida expressando cópias adicionais de um regulador do ciclo celular através do emprego de um cassete de expressão altamente produtor ou através da introdução de genes

.- 19/44 adicionais que codificam o regulador do ciclo celular. A ativação de quinases através da fosforilação é, por exemplo, suportada pelos respectivos fatores e cofatores da fosforilação. Reguladores do ciclo celular também podem ser modificados para prover mutantes de degradação resistentes. Meios exemplares para modular para baixo os — reguladores do ciclo celular são permitir silenciar os respectivos genes usando siRNA, RNA antisenso ou microRNA. Reguladores do ciclo celular também podem ser degradados ou inibidos aumentando a enzima respectiva ou a concentração de inibidor ou a atividade, por exemplo, modulando a atividade das proteases específicas ou quinases.

De acordo com uma incorporação específica uma célula hospedeira nocaute pode ser utilizada, na qual há uma ruptura de um gene que codifica o modulador do ciclo celular, para modular para baixo ou eliminar sua expressão. Uma célula hospedeira nocaute pode ser produzida através de um método para reduzir parcialmente ou completamente, o respectivo gene. Nos casos em que a função do gene ou expressão for modulada ou eliminada, o organismo ou célula resultante também pode ser referido como um nocaute. Uma incorporação do método de produção de células e organismos reduzidos compreende a introdução em uma célula ou organismo no qual um gene deve ser reduzido, o RNA que tem como alvo o gene ou suas sequências reguladoras e mantendo a célula ou o organismo resultante em condições sob as quais ocorre o RNA antisenso, resultando em degradação ou inativação do respectivo MRNA ou suas sequências reguladoras, produzindo assim células ou organismos reduzidos.

Em outra incorporação células ou organismos reduzidos são produzidos através da deleção de genes, ou troca de promotores, ou através da criação de mutantes sensíveis à temperatura.

- 20/44 Para engenheirar uma célula hospedeira para expressar um modulador do ciclo celular, um cassete de expressão pode ser integrado de forma estável no genoma da célula hospedeira. Vetores de expressão adequados compreendendo um ou mais dos moduladores do ciclo celular podem ser engenheirados e seu efeito sobre afaseG2+M de distribuição pode ser determinado através de meios adequados.

O rendimento obtido de um POI co-expressado pode ser comparado ao do tipo selvagem para determinar o efeito do modulador na expressão do POI. Uma : descrição detalhada do procedimento experimental pode ser encontrada nos exemplos abaixo. .

Preferivelmente cassetes de expressão expressando um modulador do ciclo celular poderiam ser integrados de forma estável no genoma da célula hospedeira para preparar a linha celular hospedeira de acordo com a invenção. De acordo com uma incorporação preferencial, é atingida a superexpressão do regulador do ciclo celular Clb2 ou outros reguladores do ciclo celular, tal como ainda G2 / ciclinas mitóticas específicas, quinases ciclina-dependentes (Cdk), e seus fatores regulatórios, tais como Clb2, Clb1, Clb3-6, Cdc14, Cdc20, Cdc28, Mad2, Pds1, Rrp42, Whi2, através da introdução de um gene que codifica tal regulador do ciclo celular, aumentando o número de cópias e a respectiva atividade. Assim, as células realmente : comprovaram uma qP maior em baixa y em comparação com o tipo selvagem.

Através da co-expressão de um modulador adequado do ciclo celular e um PO, é possível prever, em condições comparáveis, pelo menos o mesmo, ou pelo menos aproximadamente 1,3 vezes, ou pelo menos aproximadamente 2 vezes, ou pelo menos aproximadamente 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, até 10 vezes aumentar o rendimento em relação ao tipo selvagem.

: 21/44 Uma linha celular genérica (curinga ou selvagem) pode ser. preparada engenheirando a célula hospedeira para produzir o modulador do ciclo celular respectivo como um primeiro passo. Em seguida, a linha celular genérica (curinga ou selvagem) pode ser trocada para uma produção de linha de células, que é engenheirada para expressar um POI.

Alternativamente, a célula hospedeira pode ser recombinada com genes que codificam o modulador do ciclo celular e ainda com genes de interesse ao mesmo tempo.

Além disso, a célula hospedeira também pode ser engenheirada para primeiro expressar um POI, e então ser recombinada com genes que codificam um modulador do ciclo celular.

O POI pode ser qualquer polipeptídeo eucarionte, procarionte ou | sintético. Pode ser uma proteína secretada naturalmente ou uma proteína intracelular, ou seja, uma proteína que não seja secretada naturalmente. A presente invenção também fornece para a produção recombinante de homólogos funcionais, variantes funcionais equivalentes, derivados e fragmentos biologicamente ativos de proteínas naturais. Homólogos funcionais preferencialmente são idênticos ou correspondentes e têm as características funcionais de uma sequência.

Um PO! aqui referido pode ser, mas não está limitado a, uma proteína adequada tal como uma substância biofarmacêutica como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, fator de crescimento, hormônio, enzima, vacina ou uma proteína que pode ser usada para aplicação industrial como, por exemplo, uma enzima. Um POI | preferencial é selecionado a partir do grupo de proteínas do soro humano, tais como uma imunoglobulina ou albumina sérica, enzimas, hormônios, moléculas de sinalização, matriz de proteínas, fragmentos ou seus derivados, ou um polipeptídeo —“ .R"

" 22/44 que medeia a produção de um metabólito da célula hospedeira.

O POI é preferencialmente uma proteína ou polipeptídeo recombinante heterólogo, que vantajosamente pode ser produzido em uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de levedura, preferiveimente como proteínas secretadas.

Exemplos de proteinas preferencialmente produzidas são imunogliobulinas, fragmentos de imunoglobulinas, aprotinina, inibidor da via do fator tecidual ou outros inibidores da protease, e insulina ou precursores da insulina, análogos da insulina, hormônios do crescimento, interleucinas, ativador do plasminogênio tecidual, fator de transformação do crescimento a ou b, glucagon, peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1),

peptídeo semelhante ao glucagon 2 (GLP2), Fator VII, Fator VIII, Fator XIII, fator de crescimento derivado de plaquetas 1, albumina sérica, enzimas, tais como lipases ou proteases, ou análogos funcionais de qualquer uma destas proteínas.

No presente contexto, o termo "análogo funcional" tem o significado de indicar um polipeptídeo com uma função similar como a da proteína nativa.

O polipeptídeo pode ser estruturalmente semelhante à proteína nativa e pode ser derivado de proteína nativa por adição de um ou mais aminoácidos de qualquer uma ou ambas as terminações C- á e N-terminal ou a cadeia lateral da proteína nativa, substituição de um ou mais aminoácidos em um ou vários locais dos diferentes sítios na sequência de aminoácidos nativa, deleção de um ou mais aminoácidos em qualquer uma ou ambas as terminações da proteína nativa, ou em um ou vários sítios na sequência de aminoácidos, ou inserção de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na sequência nativa de aminoácidos.

Tais modificações são conhecidas para várias das proteínas mencionadas acima.

O POI recombinante normalmente é produzido por técnicas de recombinação por meio da produção de uma linha celular recombinante, :

z 23/44 compreendendo um gene recombinante de interesse que codifica tal POI. É especificamente entendido que tal PO! produzido de acordo com a invenção não é um modulador do ciclo celular ou regulador do ciclo celular, mas opcionalmente produzido como um produto recombinante em adição a qualquer modulador recombinante do : ciclocelular produzido pela mesma cultura de células, conforme o caso.

Um POI também pode ser selecionado de substratos, enzimas, inibidores ou cofatores que são providos para reações bioquímicas na célula .: hospedeira, com o objetivo de obter o produto da dita reação bioquímica ou uma cascata de diversas reações, por exemplo, para obter um metabólito da célula hospedeira. Produtos exemplares podem ser vitaminas, tal como a riboflavina, ácidos orgânicos e álcoois ou antibióticos, que podem ser obtidos com maiores rendimentos, após a expressão de uma proteína recombinante ou um POI de acordo com a invenção.

Em geral, a célula hospedeira, que expressa um produto recombinante, pode ser qualquer célula eucariótica adequada para expressão recombinante de um POIl.

Exemplos de células de levedura preferidas usadas como células . hospedeiras de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, Saccharomyces genus (ou seja, Saccharomyces cerevisiae), Pichia genus (ou seja, P.

pastoris, ou P. methanolica), Komagataella genus (K. pastoris, K. pseudopastoris ou K. phaffi), Hansenula polymorpha ou Kluyveromyces lactis. A literatura recente divide e renomeia Pichia pastoris como Komagataella pastoris, Komagataella phaffii e Komagataella pseudopastoris. Aqui Píchia pastoris é usada como sinônimo de todas, Komagataella pastoris, Komagataella phaffir e Komagataella pseudopastoris. .

— >.

O organismo produtor de levedura usado, preferivelmente de acordo com ' a invenção pode ser qualquer organismo de levedura adequado que, em cultivo, produza grandes quantidades da proteína heteróloga ou do polipeptídeo em questão. Exemplos preferenciais de organismos de leveduras adequadas são as cepas selecionadas das espécies de leveduras Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia Kkluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida sp., Candida utilis, Candida cacaoi, Geotrichum sp., e Geotrichum fermentans.

As células de levedura hospedeiras mais preferidas são derivadas da levedura metilotrófica, tais como Pichia ou Komagataella, ou seja, Pichia pastoris, ou Komoagataella pastoris, ou K. phaffii, ou K. pseudopastoris. Exemplos de hospedeiras incluem leveduras tais como P. pastoris. Exemplos de cepas de P. pastoris incluem CBS 704 (=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382), CBS 2612 (=NRRL Y-7556), CBS 7435 (=NRRL Y-11430), CBS 9173-9189, e DSMZ 70877 (German Collecticn of Microorganisms and Cell Cultures = Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas de Células), mas também cepas invitrogen, tais como X-33, GS115, KM71 e SMD1168. Exemplos de cepas de S. cerevisiae incluem W303, CEN.PK e a serie BY (coleção EUROSCARF). Todas as cepas descritas acima têm sido utilizadas com sucesso para produzir transformantes e expressão de genes heterólogos.

Exemplos de células eucarióticas superiores adequadas, tais como células de mamíferos, insetos ou plantas são CHO, Per.C6, HEK293, Sf-9, Nicotiana tabacum NT-1 ou BY-2.

Em geral, as proteínas de interesse aqui referidas podem ser produzidas através de métodos de expressão recombinantes bem conhecidos para uma pessoa

. 25/44 versada na arte. De acordo com a presente invenção podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante dentro da perícia da arte. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual S (198) À As sequências de nucleotídeos que poderiam ser usadas para a engenharia da célula hospedeira como as usadas de acordo com a invenção, que iriam fornecer uma produção de proteína recombinante melhorada, podem ser obtidas através de uma variedade de fontes. A origem de um promotor é preferivelmente de uma célula de levedura, mais preferencialmente de levedura metilotrófica tal como a do gênero Pichia. A origem homóloga preferencial da sequência de nucleotídeos facilita a sua incorporação à célula hospedeira do mesmo gênero, possibilitando assim a produção estável de um POI, possivelmente com rendimentos aumentados nos processos de fabricação industrial Sequências heterólogas de nucleotídeos funcionalmente equivalente de outros hospedeiros adequados também podem ser usadas.

Vetores de expressão adequados compreendem sequências reguladoras adequadas para expressão de DNA que codifica um polipeptídeo ou proteína heterólogos em uma célula hospedeira eucariótica. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, operadores, e potencializadores, sítios de ligação ribosomal, e sequências que controlam a iniciação e terminação da transcrição e tradução. As sequências reguladoras podem estar ligadas operacionalmente a sequência de DNA a ser expressada. Por exemplo, uma sequência de promotor é dita operavelmente ligada a uma sequência de codificação, se o promotor controla a transcrição da sequência de codificação.

- 26/44 De acordo com a invenção é preferível fornecer um hospedeiro P. pastoris compreendendo sequências reguladoras operavelmente ligadas à sequência de nucleotídeos codificando o modulador do ciclo celular e a sequência de nucleotídeos codificando o POI, opcionalmente ainda empregando sequências reguladoras operativamente vinculadas.

. De acordo com uma incorporação preferida o método de acordo com a invenção emprega uma sequência de nucleotídeos recombinante codificando o POI, que é fornecida em um plasmídeo adequado para integração no genoma da célula hospedeira, numa única cópia ou em várias cópias por célula. A sequência de ' nucleotídeos recombinante que codificam o POI também pode ser fornecida em um plasmídeo que replica de forma autônoma em uma única cópia ou em várias cópias por célula.

O método preferido de acordo com a invenção emprega um plasmídeo, que é um vetor de expressão eucariótico, preferencialmente um vetor de expressão emlevedura. Vetores de expressão podem incluir, mas não estão limitados a, vetores clonados, vetores clonados modificados e plasmídeos especificamente projetados. O vetor de expressão preferencial como usado na invenção pode ser qualquer vetor de expressão adequado para a expressão de um gene recombinante em uma célula hospedeira e é selecionado dependendo do organismo hospedeiro. O vetor de - expressão recombinante pode ser qualquer vetor que seja capaz de replicar ou integrar o genoma dos organismos hospedeiros, também chamado de vetor hospedeiro, como um vetor em levedura. Um vetor de expressão em levedura preferencial é para expressão nas leveduras selecionadas do grupo constituído por leveduras metilotróficas representadas pelos gêneros Hansenula, Pichia, Candida e Torulopsis.

t 27/44 Na presente invenção, é preferível usar como vetor plasmídeos derivados de pPICZ, pGAPZ, pPIC9, pPICZalfa, pGAPZalfa, pPIC9K, pGAPHis ou pPUZZLE.

Para permitir a expressão de uma sequência de nucleotídeos recombinante em uma célula hospedeira, o vetor de expressão pode prever a sequência de nucleotídeos recombinante com um promotor funcional adjacente à extremidade 5' da sequência de codificação, por exemplo, a montante do gene do peptídeo sinal. Assim, a transcrição é regulada e iniciada por essa sequência promotora.

O promotor pode ser qualquer sequência de DNA adequada que apresenta atividade transcricional da célula hospedeira e pode ser derivada de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogos no hospedeiro. O promotor é preferivelmente derivado de um gene que codifica uma proteína homóloga à célula - hospedeira. O promotor pode ser um promotor endógeno ou heterólogo à célula hospedeira.

Sequências promotoras adequadas para uso com células hospedeiras de mamíferos podem incluir, mas não estão limitadas a, promotores obtidos de genomas de vírus, promotores de mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e promotores de proteína de choque térmico. O promotor não está limitado a qualquer espécie particular, desde que estes podem funcionar em células hospedeiras eucariontes e, em particular em levedura.

Outras sequências de promotor adequadas para uso em células hospedeiras de levedura podem incluir, mas não estão limitadas a, promotores obtidos dos genes que codificam enzimas metabólicas, que são conhecidas por estarem presentes em alta concentração na célula, por exemplo, as enzimas glicolíticas como r 28/44 triose fosfato isomerase (TPI), fosfoglicerato quinase (PGK), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), álcool oxidase (AOX), lactase (LAC) e galactosidase (GAL). Exemplos preferenciais de promotores adequados são os promotores de levedura, que contêm uma sequência de DNA que funciona como um promotor para a transcrição de genes em células de levedura.

Exemplos preferenciais são, na S. cerevisiae os promotores Mal, TPI, CUP, ADH ou PGK, ou na P. pastoris o promotor glicose-6-fosfato isomerase (PPGI), o promotor 3-fosfoglicerato quinase (PPGK) ou o promotor gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase PGAP, o promotor álcool oxidase (PAOX), o promotor formaldeído desidrogenase (PFLD), o promotor isocitrato liase (PICL), o promotor do fator de alongamento de tradução (PTEF) e os promotores de P. pastoris enolase 1 (PENO1), triose fosfato isomerase (PTPI), alfa-cetoisocaproato descarboxilase (PTH!), proteínas ribossomal das subunidades (PRPS2, PRPS7, PRPS31, PRPL1), membros da família das proteínas de choque térmico (PSSA1 de PHSP90, PKAR2), 6-Fosfogluconato desidrogenase (PGND1), fosfoglicerato mutase (PGPM1), transcetolase (PTKL1), fosfatidilinositol sintase (PPIS1), ferro-O2- oxidorredutase (PFET3), ferro permease de alta afinidade (PFTR1), fosfatase alcalina repressivel (PPHOS8), N-miristoil transferase (PNMT1), fator de transcrição de resposta ao feromônio (PMCM1), ubiquitina (PUBI4), endonucleases para DNA de cadeia simples (PRAD2) e o promotor do principal transportador ADP/ATP da membrana mitocondrial interna (PPET9). Em um sistema de expressão preferencial o promotor é um promotor indutivel ou constitutivo.

De acordo com uma incorporação preferencial da presente invenção, uma construção recombinante é obtida ligando os genes relevantes em um vetor.

Estes genes podem ser integrados de modo estável no genoma da célula hospedeira

- 29/44 pela transformação da célula hospedeira usando tais vetores. Os polipeptídios codificados pelos genes podem ser produzidos usando a linha célular hospedeira recombinante pelo cultivo de um transformante, obtidos em meio apropriado, isolando .. . o POI expressado da cultura, e purificando através de um método adequado para o produto expressado, em especial para separar o POI das proteínas contaminantes. Í Os procedimentos usados para ligar as sequências de DNA, por " exemplo, que codificam o modulador do ciclo celular e/ou o POI, o promotor e o terminador, respectivamente, e inseri-los nos vetores adequados contendo as informações necessárias para a integração ou a replicação do hospedeiro, são bem conhecidos pelas pessoas versadas na arte, por exemplo, descrito por J. Sambrook et al., "Molecular Cloning 2nd ed.”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Será entendido que um ou mais vetores, que usam os genes que codificam o modulador do ciclo celular e/ou o PO! como um destino de integração, pode ser construidos tanto preparando primeiro as construções do DNA contendo toda asequência de DNA que codifica o modulador e/ou o POI e posteriormente inserindo as construções em um ou mais vetores de expressão adequados, quanto inserindo sequencialmente os fragmentos de DNA que contém a informação genética aos genes individuais seguido pela ligação.

Também vetores com múltiplas clonagens, que são vetores tendo um : sitio de clonagem múltipla, podem ser usados de acordo com a invenção, onde um gene desejado pode ser incorporado em um sitio de clonagem múltipla para fornecer um vetor de expressão. Em vetores de expressão, o promotor é colocado a montante do gene do POLI, e regula a expressão do gene. No caso de vetores com clonagens múltiplas, devido ao gene do POI ser introduzido no sitio de clonagem múltipla, o promotor é colocado a montante do sitio de clonagem múltipla.

. 30/44 São preferidas várias diferentes abordagens para a expressão de POI e secreção na célula eucariótica hospedeira.

Proteínas são expressadas, processadas e + secretadas através da transformação do organismo eucariótico com um vetor de expressão portando o DNA que codifica a proteína desejada e pelo menos um dos = 5 elementos regulatórios de acordo com a invenção, preparando uma cultura do organismo transformado, cultivando a cultura e recuperando a proteína do meio de ' cultura.

O peptídeo sinal empregado pode ser o peptídeo sinal de acordo com a invenção ou um alternativo, por exemplo, um peptídeo sinal heterólogo ou um híbrido entre um nativo e um peptídeo sinal heterólogo.

A função do peptídeo sinal é permitir quea proteína heteróloga seja secretada para entrar no reticulo endoplasmático.

O peptídeo sinal normalmente é removido por clivagem durante este processo.

O peptídeo sinal pode ser heterólogo ou homólogo ao organismo hospedeiro, que . produz a proteína.

A construção do DNA como fornecido para obter a célula hospedeira recombinante de acordo com a invenção pode ser preparada sinteticamente através de métodos padrões estabelecidos, por exemplo, o método da fosforamidita.

A construção do DNA também pode ser de origem genômica ou cDNA, por exemplo obtida através da preparação de uma biblioteca genômica ou cDNA e da triagem (ou screening) das sequências de DNA que codificam todos ou parte dos POI por hibridização usando sondas de oligonucleotidios sintéticos de acordo com as técnicas convencionais.

Finalmente, a construção de DNA pode ser de origem mista sintética e genômica, mista sintética e CONA ou mista genômica e cDNA preparado pelo emparelhamento de fragmentos de origem sintética, genômica ou cDNA, conforme o J caso, os fragmentos correspondendo às várias partes de toda a engenharia de DNA, em conformidade com as técnicas convencionais.

r 31/44 Transformantes de acordo com a presente invenção podem ser obtidos através da introdução de tal vetor DNA, por exemplo, DNA de Plasmídio, em um hospedeiro e selecionando transformantes que expressam o PO! ou o metabólito da ] célula hospedeira com rendimentos elevados.

Células hospedeiras são tratadas para = 5 que possam incorporar DNA estrangeiro através de métodos convencionalmente usados para transformação de células eucarióticas, tais como o método de impulso * À elétrico, o método de protoplastos, o método do acetato de lítio e métodos modificados derivados.

P. pastoris preferivelmente é transformada por eletroporação.

Em outra incorporação preferencial, o vetor de expressão de levedura é capaz de integrar de modo estável o genoma da levedura, por exemplo, por recombinação homóloga.

Subentende-se que os métodos divulgados aqui ainda podem incluir o cultivo de ditas células recombinantes em condições que permitam a expressão do POI, preferencialmente na forma secretada.

Um POI secretado, produzido de modo recombinante ou um metabólito da célula hospedeira pode ser isolado do meio de cultura celular ou outras frações de cultura celular e ainda purificado por técnicas conhecidas por uma pessoa versada na arte.

Um método preferencial de acordo com a invenção se refere ao aumento do rendimento da produção de um POI recombinante em uma cultura de células, compreendendo a) engenharia genética de uma linha celular de produção eucariótica, b) cultivando a dita linha celular de produção, e c) coletando uma fração da cultura celular contendo o POI.

As técnicas de cultivo adequadas podem abranger o cultivo em um —biorreator, começando com uma fase em batelada, seguido por uma fase exponencial

. 32/44 curta em batelada alimentada com elevada taxa de crescimento, ainda seguida por uma fase em batelada alimentada com uma baixa taxa específica de crescimento.

Outra técnica de cultivo adequada pode ser abranger uma fase em batelada, seguida : por uma fase de cultivo contínuo, a uma baixa taxa de diluição.

Técnicas de " 5 fermentação preferenciais são batelada, batelada alimentada ou cultivo contínuo.

Condições de produção em escala industrial se referem a, por exemplo, D cultivo em batelada alimentada em reatores com volume de 100 L a 10 m? ou maiores, empregando o típico processo de vários dias, ou processos contínuos em fermentadores com volume de aprox. 50-1000 L ou maior, com taxas de diluição de aprox. 0,05-0,15h”. A cultura celular de alta produção inventiva também pode ser obtida sem a influência de um modulador recombinante do ciclo celular, por exemplo, através de técnicas específicas de cultivo que iria prolongar a fase G2 + M.

Entre estas estão condições controladas de temperatura, tais como temperaturas abaixo da temperatura ótima de crescimento, ou de alimentação do substrato, tal como controle intermitente de alimentação, ou pulsação de substratos ou químicos, ou outros.

Assim, a cultura celular poderia ser mantida em uma distribuição G2 + M desejada no estado estacionário como apropriado para suportar a alta produtividade da cultura de células.

Uma célula hospedeira transformante de acordo com a invenção obtida pela transformação da célula com um gene que codifica um modulador do ciclo celular e/ou os genes POI pode preferivelmente primeiro ser cultivada em condições para o crescimento eficiente de um grande número de células, sem a obrigação de expressar uma proteína heteróloga.

Quando a linha celular for preparada para a expressão do PO! e a cultura celular tenha alcançado uma densidade celular normalmente de 10 g/L r 33/44 de peso seco celular , as técnicas de cultivo são escolhidas para produzir o produto de . expressão. É preferível cultivar a linha celular hospedeira de acordo com a invenção ! em um biorreator sob condições de crescimento para obter uma densidade de células depelomenos1 g/L de peso seco de célula, mais preferivelmente pelo menos 10 g/L de peso seco de célula, preferivelmente pelo menos 50 g/L de peso seco de célula, : mas menos de 150 ou menos de 200, preferivelmente menos de 100. . Quando o transformante é cultivado com um estímulo indutivo, um modulador do ciclo celular pode ser ativado para atingir o estado estacionário G2 + M, eoPOlé expressado. Um estímulo indutivo é, preferencialmente, calor, ou adição de cádmio, cobre, um agente para aumentar a pressão osmótica, peróxido de hidrogênio, etanol, metanol, metilamina ou similares. Alternativamente, a expressão do gene pode ser estimulada por desrepressão, por exemplo, pela remoção ou diluição de glicose ou tiaminaá ou algo do gênero.

Preferivelmente a levedura é cultivada em meio mineral com uma fonte de carbono adequada, desse modo, ainda simplificando significativamente o processo de isolamento. Um exemplo de um meio mineral preferencial é o que contenha uma fonte de carbono utilizável (por exemplo, glicose, glicerol ou metanol), sais contendo macro elementos (potássio, magnésio, cálcio, amônio, cloreto, sulfato, fosfato) e oligoelementos, ou seja, elementos traço, (cobre, iodeto, manganês, molibdato, cobalto, zinco e sais de ferro e ácido bórico) e, opcionalmente, vitaminas ou aminoácidos, por exemplo, para complementar as auxotrofias.

É vantajoso fornecer a produção de POI em escala piloto ou industrial. À escala de processos industriais iria preferencialmente empregar volumes de pelo

F 34/44 menos 50 L, preferivelmente de pelo menos 1 m?, preferencialmente de pelo menos m?, mais preferivelmente de pelo menos 100 mº?. O POI é preferivelmente expressado empregando condições para ' produzir rendimentos de pelo menos 1 mg/L, preferencialmente de pelo menos 10 O, 5 mg/L, preferivelmente de pelo menos 100 mg/L, mais preferivelmente de pelo menos 1 gal. : A célula hospedeira de acordo com a invenção é preferivelmente testada para sua capacidade de expressão ou rendimento através de pelo menos um dos seguintes testes: ELISA, ensaio da atividade, HPLC ou outros testes adequados. . 10 As células transformadas são cultivadas em condições adequadas para efeito de expressão do PO! desejado, que pode ser purificado de células ou do meio de cultura, dependendo da natureza do sistema de expressão e da proteina expressada, por exemplo, se a proteína está fundida a um peptídeo sinal e se a proteína é solúvel ou ligada à membrana. Como será entendido pelos versados na arte, as condições de cultivo variam de acordo com os fatores que incluem o tipo de célula hospedeira e o vetor de expressão específico empregado.

É preferível que frações específicas da cultura celular sejam coletadas para obter o PO! como um bioproduto. Normalmente o sobrenadante da cultura celular seria coletado, por exemplo, para obter um POI secretado. Dependendo das características do POI, ele pode ser recuperado das frações intracelulares ou de | detritos de células. Por exemplo, as células transformantes cultivadas podem -ser rompidas por meio sonoro ou mecânico, enzimaticamente ou quimicamente para obter um extrato de células contendo o POI desejado, do qual o POI é isolado e purificado. A secreção de produtos recombinantes de expressão das células de levedura é geralmente vantajosa por razões que incluem facilitar o processo de purificação, uma r 35/44 vez que os produtos podem ser recuperados do sobrenadante de cultura, em vez da mistura complexa de proteínas que resulta quando as células de levedura são rompidas para liberar proteínas intracelulares.

Í Normalmente, o composto desejado pode ser isolado e purificado q 5 usandotécnicas do estado da técnica.

Como métodos de isolamento e purificação para obtenção de um : polipeptídeo recombinante ou produto proteico, podem ser usados métodos, tais como os métodos que utilizam a diferença de solubilidade, tais como precipitação por sais (ou salting ouf) e precipitação com solvente, os métodos que utilizam a diferença de peso molecular, tais como a ultrafiltração e eletroforese em gel, os métodos que utilizam a diferença de carga elétrica, tal como a cromatografia de troca iônica, os métodos que utilizam afinidade específica, tal como a cromatografia por afinidade, os métodos que utilizam a diferença de hidrofobicidade, tal como a cromatografia líquida de alta performance de fase reversa, e os métodos que utilizam a diferença de ponto isoelétrico, tal como a focalização isoelétrica.

Etapas específicas de purificação são preferencialmente empregadas para separar qualquer modulador do ciclo celular que é co-expressado e iria contaminar a preparação do POI. , O produto altamente purificado é essencialmente livre de proteínas contaminantes, e de preferência tem uma pureza de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, ou mesmo de pelo menos 98%, até 100%. Os produtos purificados podem ser obtidos através da purificação do sobrenadante da cultura celular ou então a partir de restos celulares.

O PO! isolado e purificado pode ser identificado através de métodos convencionais como Western blot ou ensaio de sua atividade.

A estrutura do composto purificado pode ser definida pela análise de aminoácidos, análise da região r 36/44 amino-terminal, análise da estrutura primária e similares.

É preferível que o composto seja obtido em grandes quantidades e com um elevado grau de pureza, atendendo assim os requisitos necessários para ser usado como um ingrediente ativo em [ composições farmacêuticas. o. 5 A linha celular hospedeira preferencial de acordo com a invenção mantém as propriedades genéticas empregadas de acordo com a invenção e o nível : de expressão permanece elevado, por exemplo, pelo menos em um nível em ug, mesmo depois de cerca de 20 gerações de cultivo, preferivelmente pelo menos. 30 gerações, mais preferivelmente pelo menos 40 gerações, mais preferivelmente pelo menos 50 gerações.

A célula hospedeira recombinante é surpreendentemente estável, o que é uma grande vantagem quando usada na produção de proteína em escala industrial.

A presente invenção é descrita em mais detalhes nos exemplos a seguir, que não tem de forma alguma a intenção de limitar o escopo da invenção conforme reivindicado.

Exemplos Exemplo 1. Distribuição do ciclo celular em taxas de crescimento específico Para analisar as células de P. pastoris em diferentes taxas de crescimento, estas foram cultivadas em culturas quimiotáticas com uma taxa de diluição na faixa entre 0,01 h e 0,21 h.

Foi iniciado um cultivo quimiostático, culturas em batelada chegaram ao fim.

Cada taxa de diluição foi mantida por pelo menos cinco tempos de residência, antes que as amostras fossem colhidas para determinar o peso seco de biomassa, concentração de fragmento Fab e distribuição do ciclo celular.

Fr 37/44 Meio Quimiotático GLI01: 1,0g de ácido cítrico monoidratado, 55 g de glicose monoidratada, 4,4 g de (NH4)2HPO,, 0,7 g de MASO, * 7 HO, 1,7 g de KCI, 0,01 g de CaCi;* 2 HO, 1,6 mL de solução de metais traço (ou oligolelementos) (PTM1) e 1,0 mL de solução de biotina (0,2 g L”) foram dissolvidos em 1000 mL de T. 5 . ddH2O, seguido de filtração estéril.

Foi determinada a concentração de biomassa seca através da lavagem e : secagem da biomassa em alíquotas de 10 mL da cultura.

Foi determinada a concentração do Fragmento Fab por ELISA, conforme descrito por Dragosits et al. 2009 (J.

Proteome Res. 2009 Mar; 8 (3): 1380-92). A produtividade específica foi calculada dividindo a concentração de Fab pela concentração de biomassa seca e multiplicando pela a taxa de diluição.

Para a análise da distribuição de fase do ciclo celular, amostras de células fixadas em etanol de cada ponto de amostra foram lavadas e tratadas com RNaseA.

Em seguida, as células foram sonicadas e incubadas em uma solução de iodeto de propidio para permitir que o reagente entre nas células e marque o DNA genômico.

A citometria de fluxo permite a medição dos vários milhares de células.

Uma contagem de 50.000 eventos foi utilizada como quantidade padrão.

No caso de uma concentração de células muito baixa na amostra restante, este limiar teria que ser baixado.

Os dados foram avaliados com a ajuda do Software FCS Express.

À percentagem de células na fase G2 + M do ciclo celular foi calculada da seguinte forma: (% de célula G2 + M) / [(% de células G1) + (% de células G2 + M)]. Como resultado, a percentagem de células na fase G1 é 100 - (% de células G2 + M). Este cálculo omite todas as células que não foram atribuídas nem à fase G1 ou à fase G2 + M.

A produtividade específica q» e a distribuição de fase do ciclo celular em diferentes taxas de crescimento são mostrados na Figura 3. Exemplo 2. Superexpressão de CLB2 em P. pastoris e determinação da : distribuição do ciclo celular em taxas de crescimento específico O 5 a) Construção de plasmídeos para co-superexpressão Para gerar um plasmídeo adequado para co-superexpressão do gene CLB2 de P. : pastoris em uma cepa já expressando uma proteína heteróloga, o gene CLB2 foi amplificado por PCR da biblioteca de cDNA de P. pastoris.

Modelo não codificado da sequência Kozak em P. pastoris e sítios de restrição para Sbfi e Sfil foram adicionados usando os oligonucleotideos primer respectivos “fonvard” —(5- GATCCACCTGCAGGCCATGTCTAATGTTCAGCCTAACGA-3', ID SEQ No. 1) e “backward"” (S-TEGGCCGAGGCEGGCCCTACAAAATTGGATCCATGATGC-3', ID SEQ No. 2). Produtos Sbfl e Sfil tratados por PCR foram clonados em pPuzzleKanR (Sbfl e Sfil digeridos e tratados com fosfatase alcalina). A nova co-superexpressão do plasmídeo pPuzzleKanR-CLB2 foi transformado em E. coli Top1O (Invitrogen). Foram feitos o sequenciamento e a digestão por endonuclease de restrição para verificar a identidade correta do plasmídeo construído. b) Construção de cepas de P. pastoris co-superexpressando o — fragmento Fab 3H6 do anticorpo humano recombinante e um novo gene do fator . auxiliar O plasmídeo pPuzzleKanR-CLB2, obtido a partir do procedimento de clonagem descrito no exemplo 2 etapa a) foi usado para transformar uma cepa de P. pastoris pré-selecionada pelo alto nível de expressão do fragmento Fab 3H6 do anticorpo humano recombinante sob controle do promotor GAP (Dragosits et al. 2009, J Proteome Res. 2009 Mar; 8 (3): 1380-92). A seleção foi baseada na resistência à

" 39/44 Zeocina para os genes do fragmento Fab e na resistência à Geneticina para os genes do fator auxiliar.

Para avaliar o efeito do gene regulador co-superexpressado do ciclo celular, a cepa ' expressando o fragmento Fab também foi transformada com um plasmídeo L 5 — pPuzzleKanR sem o gene regulador do ciclo celular.

Exemplo 3. Superexpressão / deleção de outros reguladores do celular ! ciclo para alterar o ciclo celular | a) Para a superexpressão de outros reguladores dos ciclos celulares foram construídos vetores de expressão conforme descrito no exemplo 2.a, exceto que os genes do regulador do ciclo celular desejado foram amplificados e clonados em vez de CLB2. S. cerevisiae MAD2 e PDS1 e P. pastoris RRP42 foram, assim, clonados em pPuzzleKanR para construir pPuzzleKanR-MAD2, pPuzzleKanR-PDS1 e pPuzzleKanR-RRP42. Estes plasmídeos foram transformados em P. pastoris, produzindo Fab 3H6, conforme descrito no exemplo 2. b). b) Nocaute de genes reguladores do ciclo celular do genoma de P. pastoris À Dois fragmentos do gene regulador do ciclo celular de aprox. 350 bp de comprimento são amplificados por PCR e clonados em ambos os lados do cassete marcador KkanMX4 conferindo resistência à G418. Após transformação de P. pastoris e seleção por resistência à G418, a deleção de parte do gene regulador do ciclo celular é verificada por PCR. - Exemplo 4. Cultivo de uma cultura celular e análise do efeito da superexpressão do regulador do ciclo celular r 40/44 Pré-culturas da cepa superexpressando CLB2 (conforme descrito no exemplo 2. b) em 2,5 mL de YPD (peptona de soja 20 g/L (HY QUEST), 10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glicose, pH 7,4) em tubos de 50 mL foram inoculados com as células de uma placa. No dia seguinte, todas as principais culturas (10 mL de ' - 5 meio sintético em frasco agitado em tubos de 50 mL) foram inoculadas com ODgoo 0,1. Meio de cultura principal: (22 g de ácido cítrico monoidratado, 22 g de glicose monoidratada, 3,15 g de (NHa)2HPO,, 0,492 g de MgSO, * 7 H2O, 0,8040 g de KCI, 0,0268 g * 2 HO de CaCl2, 1,47 mL de Solução de Metais Traço (PTM1) e 2,0 mL de solução de biotina (0,2 g L) foram dissolvidos em 1000 mL de ddH2O. O pH foi ajustado em 5 com KOH 25%, seguido por filtração estéril. Principais culturas foram iniciadas em ODsoo 0,1 e agitadas a 170 rom, à temperatura ambiente. A densidade óptica foi medida após aproximadamente 24 horas e no final após 48 horas. Foram tomadas amostras do sobrenadante para análise de proteína em ambos os pontos de tempo. A concentração extracelular de : 15 Fab, analisada por ELISA, foi relacionada com a densidade óptica das culturas após 24 e 48 horas de cultivo. Quatro transformantes foram cultivados por cepa e comparados com suas respectivas cepas controle. Produto médio por biomassa: fold change* entre clones CLB2 e vetores controle: 20 . ' Aumento da fold change* Er COR o * NT: "Fold Change" é razão entre o valor obtido para o experimento tratado pelo valor obtido para o experimento controle.

Exemplo 5: Análise do conteúdo de DNA

Y 41/44 Amostras de células fixadas em etanol foram tomadas durante a fase de crescimento exponencial após 24 horas de cultivo em frasco agitado, e tratadas por marcação de DNA e citometria de fluxo conforme descrito no exemplo 1. A distribuição das fases do ciclo celular é mostrada na tabela abaixo. " 5 % células em G1 [| % células em G2+M : aee E e Eme Exemplo 6. Cultivo Quimiotático O cultivo quimiotático foi iniciado para PpCLB2 e a cepa controle após suas culturas em batelada terem chegado ao fim.

Cada taxa de diluição foi mantida —porpelomenos três tempos de residência.

Massa seca de levedura, título de Fab3H6 e produtividade específica estão resumidos na tabela 1 e a produtividade específica vs. taxa de crescimento específico é exibida na Fig. 3. - | Meio Quimiotático GLUO1: 1,0 g de ácido cítrico monoidratado, 55 g de glicose monoidratada, 4,4 g (NHs)2HPO,, 0,7 g de MgSO, * 7 H2O, 1,7 g de KCI, 0,01 gdeCaCl;*2 HO, 1,6 mL de Solução de Metais Traço (PTM1) e 1,0 mL de solução de biotina (0,2 g Lº) foram dissolvidos em 1000 mL de ddH2O, seguido por filtração estéril.

Tabela 1: Cultivo Quimiotático em três taxas de diluição distintas FRCLBz p=D |YDM |Fab3H6 |qP YDM |jFab3H6 |qgP [mg 9- [h-1) Tí9L-1] |fugmL-1] img g-1h-1] |fgL-1] |[ugmb-1] |1h-1] 0,06 26,68 [17,27 0,039 26,58 |23,346 0,053 01 27,25 [13,15 0,048 27,A7 [15,964 0,058 0,15 27,40 [12,78 0,07 27,69 [12,427 0,067

. 42/44 Exemplo 7. Fermentação em batelada alimentada de tipo selvagem e de clones CLB2 superexpressados , Os dados obtidos das amostras quimiotáticas foram usados para calcular : qP em função de p a fim de simular um processo de produção em batelada e. 5 alimentada com um máximo teórico de produtividade volumétrica Qp (Maurer et al. 2006 Microb. Cell Fact). A estratégia de fermentação otimizada é composta por : diferentes fases para efetuar a cinética de crescimento calculado. A fase em batelada foi seguida por uma fase de alimentação exponencial com uma taxa de crescimento de 0,15 h-1 para produção rápida de biomassa (8 horas ou 5 horas, respectivamente) antes de py ser desacelerada até o final do processo (adicional de 8 ou 22 horas, respectivamente). O processo foi desenvolvido para alcançar uma biomassa de 100 g L* e otimizado para Qr.

Conforme para o cultivo quimiotático, iniciou-se alimentação dentro de uma hora após o consumo de substrato total (glicerol) em batelada. Meio em batelada alimentada (glicose) foi bombeado para o reator de acordo com uma função de alimentação calculada que representa a demanda de substrato para aproximar a curva de crescimento modelar para formação ideal do produto.

Foram coletadas amostras de cada um dos dois bioprocessos paralelos a cada duas a três horas com alto foco na simultaneidade relativa aos intervalos de tempo e iguais volumes de amostra que não ultrapassam a 15-20 mL por amostragem, incluindo a purga.

Os dois protocolos em batelada alimentada modelares foram efetuados duas vezes para cepa PpCLB2 e cepa controle, produzindo quatro fermentações paralelas, oito fermentações no total. Foi dada atenção à igualdade de tratamento das —bateladas alimentadas paralelas em relação ao tempo decorrido entre o pico de pO2 e

. 43/44 : o início da alimentação bem como amostragem equidistante e quantidade da amostra.

No curso dos protocolos otimizados das cepas controle, a aeração acabou sendo insuficiente após ter atingido o limite superior do agitador de 1250 rpm.

Para evitar uma queda do valor de pO2, que teve seu valor nominal em 20% e foi controlado pela o 5 atividade do agitador, até 25% de oxigênio puro foi adicionado ao fluxo de ar conforme necessário.

Novamente, as culturas paralelas foram tratadas igualmente em relação à | aeração.

Exemplo 8: Distribuição da fase do ciclo celular em amostras de fermentação em batelada alimentada: ' Para medir o tamanho ou viabilidade da célula, amostras foram diluídas em PBS e puderam ser obtidas diretamente no citômetro de fluxo BD FACS Calibur" e analisadas com o software BD CeliQuest 7“. As amostras para análise de conteúdo de DNA tiveram que ser fixadas em etanol a 70%. Enquanto alguns ul da cultura em batelada alimentada de alta densidade em 500 ul de etanol foram suficientes para tratamento adicional da amostra, até 1 mL da cultura de frasco agitado de baixa densidade foi sedimentado por centrifugação e ressuspendido adicionando um volume igual de etanol! gelado gota a gota.

Em todos os casos, as células tiveram de ser lavadas duas vezes com PBS para remover o etanol, incubadas com RNase A (35 U mr”) por uma hora para digerir dsRNA e lavadas novamente duas vezes em PBS.

A solução com as células, então, : foi transferida para um tubo FACS e sonicada em um pulso por três segundos para romper agregados de células antes de misturadas com igual volume de solução PI (1:100 em PBS). Após curta agitação em Vortex, as células estavam prontas para serem medidas.

As amostras, idealmente, devem conter 1 x 10º células ou partículas pormL.

. 44/44 - As distribuições de fase do ciclo celular da cepa superexpressando CLB2 e a cepa do tipo selvagem, são mostradas na Figura 4.

Claims (1)

1. > E 168

   REIVINDICAÇÕES

   1. “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE EM UMA CULTURA DE CÉLULAS”, caracterizado por compreender a engenharia * : genética de uma linha celular eucariótica - para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do — ciclo celular em uma fase de pré-cultura, e . - para produzir o POI em uma fase de produção após a fase de pré- cultura.

   2. “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita linha celular ser uma linha celular tendo um cassete de expressão integrado de modo estável em seu genoma para expressar um modulador do ciclo celular.

   3. “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela dita linha celular ser engenheirada para modular um regulador do ciclo celular, preferivelmente especificamente superexpressando, ativando, mutando, modulando para baixo, deletando, degradando ou inibindo um regulador do ciclo celular.

   4. “MÉTODO” de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo dito regulador do ciclo celular ser selecionado do grupo consistindo complexos Cdkrfciclina tal como quinases dependentes da ciclina (Cdk), ciclinas específicas G1, G2 / ciclinas mitóticas específicas e seus fatores de transcrição ou de degradação, tais como Clb2, CIb1, Clb3-6, Cin1-3, Cdc6, Cdc14, Cdc20, Cdc28, Cde48, Cdh1, Kar1, Mad2, MBF, Mcm1, Pds1, Rrp42, SBF, Sic1, Swe1, Swi5, Whi2.

   5. “MÉTODO” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pela dita linha celular ser uma linha celular hospedeira tipo genérica (curinga ou selvagem) ou uma linha celular de produção que seja engenheirada para produzir um modulador do ciclo celular e dito POI.

   r - 2/3

   6. “MÉTODO” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 5, caracterizado pelo dito POI ser selecionado do grupo consistindo proteínas do soro, tais como uma imunoglobulina ou albumina sérica, enzimas, hormônios, moléculas de . sinalização, matriz de proteínas, fragmentos ou seus derivados, ou por um — polipeptídeo que medeia a produção de um metabólito da célula hospedeira. = 7. “MÉTODO” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a . 6, caracterizado pela dita célula ser uma célula fúngica, preferencialmente uma célula de levedura, tal como uma célula da Pichia genus, em particular uma célula da cepa de P. pastoris, ou uma célula eucariótica superior, preferivelmente uma célula de mamífero ou de vegetal.

   8. “LINHA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO” que pode ser obtida através de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada por ter uma produtividade específica q» de pelo menos 0,1 ug/(g:h) para produzir dito POI.

   9. “CULTURA CELULAR DE ALTA PRODUÇÃO” de uma linha celular obtida através de um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1a 7, caracterizada por pelo menos 50% das células estarem na fase G2 + M ao longo de um tempo de processo que seja pelo menos 50% do tempo de alimentação.

   10. “CULTURA CELULAR” de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por estar em um estado estacionário por um período de pelo menos 10 horas.

   11. “CULTURA CELULAR” de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada por ser uma cultura celular em batelada alimentada ou contínua.

   r ” 33

   12. “CULTURA CELULAR” de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizada por ter uma produtividade volumétrica Qp de pelo menos 0,1 pg/(L.h) em uma escala industrial. . 13. “MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE” em uma cultura de células, caracterizado por " compreender É a) engenharia genética de uma linha celular de produção eucariótica para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular, b) cultivo de dita linha celular de produção em uma fase de pré-cultura para obter uma cultura celular em estado estacionário com uma fase G2 + M do ciclo celular prolongada, c) cultivo da dita cultura celular em estado estacionário em uma fase de produção seguindo dita fase de pré-cultura para produzir o POI, e f d) coleta de uma fração da cultura celular contendo POI.

   14. “MÉTODO PARA PROLONGAR A FASE DE PRODUÇÃO DE UM POI RECOMBINANTE” de uma linha celular de produção eucariótica em uma cultura de células, caracterizado por compreender a engenharia genética da linha celular : para especificamente ocasionar o prolongamento da fase G2 + M do ciclo celular.

   r - 1/4 Fig. 1 - 12 e 1 PERSA E fem = : = a 08 o e õ

   F RR à 0,6

   W 4 [DA Tipo Selvagem 3 04 E = | / z | o 202 Vo | o r o 0,05 01 0,15 0,2 Taxa de Crescimento Específico (yu)

   - 2/4 Fig. 2: S Ee | é Ai A : A TE EI EINE : tt. 0d gia ta o EEE S Ss MI ANTE ENA OI.

   CERA": TZ 1N11EFENIN "TRAS 1 Si E BE E E EA NNE NIN 0,01 0,02 0,03 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,15 0,17 0,19 0,21 Tx de Crescim.

   Específico [h-1]

   - 3/4 Fig. 3 7 0,08 | e ==

   E É nd 'controlel| z 0,04 ACLB2 a 0,03 = 0,00 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 uh] En ae an,

   - 4/4 Fig. 4 A controle dE A Ea a RA = o E LL e A TEA

   SIA HAO A A e IA Ie [E E ET IE E! E EEN "NNE RIR /EIEIE E!) IM rr nn Tiri 0,021 0,026 0,031 0,041 0,042 0,064 0,086 0,118 ulh-1] B CLB2

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