BR112012031363A2 - Análogos de oligonucleotídeo tendo ligações intersubunidades modificadas e/ou grupos terminais. - Google Patents

Análogos de oligonucleotídeo tendo ligações intersubunidades modificadas e/ou grupos terminais. Download PDF

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Abstract

análogos de oligonucleotídeo tendo ligações intersubunidadwa modificadas e/ou grupos terminais. análogos oligonucleotídeos compreendendo ligações intersubunidades modificadas e/ou grupos terminais 3' e/ou 5' modificados são providos. os compostos revelados são úteis para tratamento das doenças onde inibição da expressão da proteína ou correção de produtos de splice de mrna aberrantes produzem efeitos terapêuticos benéficos.

Description

"ANÁLOGOS DE OLIGONUCLEOTÍDEO TENDO LIGAÇÕES INTERSUBUNIDADES MODIFICADAS E/OU GRUPOS TERMINAIS" Referência cruzada a pedidos relacionados O presente pedido reivindica o benefício sobre 35 U.S.C. §119(e) do Pedido de Pa- 5 tente Provisório dos EUA No. 61/349.783 depositado em 28 de Maio de 2010; Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 61/361.878 depositado em 6 de Julho de 2010 e Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 61/386.428 depositado em 24 de Setembro de 201 O.
Relado relativo à listagem de sequência A Listagem de Sequência associada com este pedido é provida no próximo formato 1O no lugar de uma cópia de papel, e é aqui incorporada por referência na especificação.
O nome do arquivo texto contendo a Listagem de Sequência é 120178_487PC_SEQUENCE_LISTING.txt.
O arquivo texto tem cerca de 19 kb, e foi criado em 27 de Maio de 2011, e está sendo submetido eletronicamente.
Antecedente 15 Campo técnico A presente invenção é geralmente relacionada aos compostos oligonucleotídeos (oligômeros) úteis como compostos anti-senso, e mais particularmente a compostos oligô- meros compreendendo ligações inter-subunidades modificadas e/ou grupos terminais, e o uso de tais compostos oligômeros nos pedidos anti-senso. 20 Descrição da Técnica Relacionada .L Oligômeros antisenso são geralmente designados para ligar ao DNA ou RNA de proteínas causando doenças para prevenir a produção de tais proteínas.
Requerimentos para implementação bem sucedida de terapêuticos antisenso incluem (a) estabilidade in vivo, (b) suficiente permeabilidade de membrana e captação celular, e (e) um bom balanço 25 da afinidade de ligação e especificidade de sequência.
Muitos análogos oligonucleotídeos têm sido desenvolvidos em que as ligações fosfodiéster do DNA nativo são substituídas por outras ligações que são resistentes para degradação de nuclease (ver, por exemplo, Baraw- kar, D.A. et ai., Proc.
Na't'I Acad.
Sei.
USA 95(19):! 1047-52 (1998); Linkletter,B.A. et ai., Nucleic Acids Res. 29(11):2370-6 (2001); Micklefield, J., Curr, Med, Chem, 5(10): 1157-79 30 (2001 )). Oligonucleotídeos antisense tendo outras modificações estruturais têm também sido preparados (Crooke, S.T., Antisense Drug Technology: Principies, Strategies, and Applica- tions, New York, Marcel Dekker (2001); Micklefield, J., Curr, Med, Chem, 5(1 O): 1157-79 (2001 ); Crooke, S.T., Antisense Drug Technology, Boca Raton, CRC Press (2008)). Em adi- ção, oligonucleotídeos têm sido modificados por conjugação peptídica a fim de aumentar a 35 captação celular (Moulton, H.M. et ai., Bioconjug Chem 15(2):290-9 10 (2004); Nelson, M.H. et ai., Bioconjug.
Chem. 6(4):959-66 (2005); Moulton, H.M.et ai., Biochim Biophys Acta (2010)).
O desempenho de tais análogos do ácido nucléico como drogas antisenso ou anti- gênicas tem sido impedido por certas características dos vários análogos.
Por exemplo, aná- logos com ligações negativamente carregadas, incluindo análogos ligados a fosforotioato, sofrem a partir de considerável repulsão eletrostática entre as cargas negativas do oligôme- ro e o DNA ou RNA alvo.
Os fosforotioatos também exibem ligação não específica para ou- tros componentes celulares tais como proteínas.
Esses atributos limitam a efetividade tera- pêutica dos oligômeros antisenso compreendidos de RNA nativo, DNA nativo, e análogos negativamente carregados (Crooke, S.T., Antisense Drug 20Technology: Principies, Strate- gies, and Applications, New York, Marcel Dekker (2001 ); Crooke, S.T., Antisense Drug Technology, Boca Raton, CRC Press (2008)). Os análogos oligonucleotídeos ligados a me- tilfosfonato não iônico podem ser transportados em células por difusão passiva e/ou endoci- tose de fase fluída, mas seus usos são impedidos por complexidade estereoisomérica e po- bre solubilidade (Crooke, S.T., Antisense Drug Technology: Principies, Strategies, and Ap- plications, New York, Marcel Dekker (2001); Micklefield, J., Curr, Med, Chem, 5(10): 1157-79 (2001)). Vários grupos têm relatado a síntese de oligonucleotídeos positivamente carrega- dos (Bailey, C.P. et ai.
Nucleic Acids Res. 26(21):4860-7 (1998); Micklefield, J., Curr, Med, Chem, 8(1 O): 1157-79 (2001 ); Egli, M. et ai., Biochemistry 44(25):9045-57 (2005)). Por exemplo, uma classe de nucleosídeos ligados a guanidina (designado ONG), formada por substituição das ligações fosfato em DNA e RNA por grupos guanidino aquiral, tem sido re- latada (Dempcy, R.O. et ai, Proc.
Nat'I Acad.
Sei.
USA 91 (17):7864-8 (1994); Dempcy, R.O. et ai., Proc.
Nat'I Acad.
Sei.
USA 93(9):4326-30 (1996); Barawkar, D.A. et ai., Proc.
Na't'I Acad.
Sei.
USA 95(19): 11047-52 (1998); Linkletter, B.A. et ai., Nucleic Acids Res. 29(11 ):2370-6 (2001 )). Oligômeros ligados com ligações tiouréia metiladas positivamente carregadas têm também sido relatados (Arya, D.P. et ai., Proc.
Nat'I Acad.
Sei USA 96(8): 4384-9 (1999)). Substituição de algumas dessas ligações com ligações uréias neutras têm sido relatadas para reduzir a tendência de tais oligômeros positivamente carregados para ligação não sequência específica (Linkletter, B.A. et ai., Bioorg.
Med.
Chem. 8(8): 1893-901 (2000)). Oligômeros morfolinos contendo ligações (1-piperazino) fosfonilidenoóxi e (1-(4-(w- guanidino-alcanoil))-piperazino)fosfinilidenoóxi têm sido descrito previamente (ver, por exemplo, W02008036127). Embora progresso significante tenha sido feito, permanece uma necessidade na técnica para análogos oligonucleotídeos com desempenho antisenso ou antigênico melho- rado.
Tal desempenho antisenso ou antigênico melhorado inclui; afinidade mais forte para DNA e RNA sem comprometer seletividade de sequência; farmacocinética melhorada e dis- tribuição tecidual; distribuição celular melhorada e distribuição in vivo confiável e controlável.
Breve resumo
Compostos da presente invenção direcionam-se a esses problemas e prevêem me- lhoramentos sobre moléculas antisenso existentes na técnica. Modificação das ligações in- tersubunidades e/ou conjugação de frações terminais para a terminação 5' e/ou 3' de um análogo oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo morfolino, resulta em um oligô- 5 mero antisenso tendo propriedades superiores. Por exemplo, em certas modalidades, os oligômeros revelados têm distribuição celular, potência e/ou distribuição tecidual aumentada comparado a outros oligonucleotídeos análogos e/ou podem ser efetivamente distribuídos aos órgãos alvos. Essas propriedades superiores dão aumento a índices terapêuticos favo- ráveis, doses clínicas reduzidas, e custo inferior dos produtos. Em uma modalidade, a pre- 1O sente revelação provê um oligômero compreendendo uma estrutura, a estrutura compreen- dendo uma sequência de estruturas de anel morfolino unidas por ligações inter- subunidades, as ligações inter-subunidades unindo uma terminação 3' de uma estrutura do anel morfolino a uma terminação 5' de uma estrutura do anel morfolino adjacente, em que cada estrutura anel morfolino está ligada a uma fração pareadora de base, tal que o oligô- mero pode ligar em uma forma sequência-específica a um ácido nucléico alvo, em que as ligações intersubunidades têm a seguinte estrutura geral (1): w li x-r'l 3' y'l
T 5' (I) ou um sal ou isômero do mesmo, e em que cada das ligações intersubunidades (1) são independentemente ligação (A) ou ligação (B): em que para ligação (A): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -N(CH 3 )2, -NR 1 R2 , -OR 3 ou: (II) Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 2 , R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R2 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou -LNR4 R5 R7 ;
R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6 ; R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila, -C(=NH)NH 2,-Z-L- NHC(=NH)NH2 ou -[C(O)CHR'NH]mH, onde Z é carbonil(C(O)) ou uma ligação direta, R' é uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural um ou ou dois carbonos homó- 5 logos do mesmo, e m é 1 a 6; R 5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila ou um par de elé- tron; R6 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquilaC 1-C 6 ou alcoxial- 1O quilaC1-C5; L é um ligador opcional de até 18 átomos de comprimento compreendendo grupos alquila, alcóxi, alquilamino, ou combinações dos mesmos; e em que para ligação (B): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -NR8 R9 ou -OR 3; e Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 10 , R8 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaCrC 12 ; R9 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaC 1-C 12 , aralqui- laC1-C 12 ou arila; R 1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaC 1-C 12 ou - º 5 LNR 4R R7 ; 9 em que R8 e R podem se unir para formar um mono ou bicíclico heterociclo de 5- 18 membros ou R8 , R9 ou R3 podem se unir com R1 para formar um heterociclo de 5-7 º membros, e em que X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili):
R12
R" ri\ R,(\_1_1+ R12
(III)
em que: R 11 é, em cada ocorrência, independentemente alquilaCrC 12 , aminoalquilaC 1-C 12 , alquilcarbonilaC 1-C 12 , arila, heteroarila ou heterociclila; e R é, em cada ocorrência, independentemente um par de elétron, hidrogênio ou al- quilaCrC12; e R 12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquilaC 1-C 12 , aminoal- 13 14 14 15 quilaC1-C12, -NH 2, -CONH 2, -NR R , -NR 13 R R , alquilaC 1-C 12carbonila, oxo, -CN, trifluor-
metila, amidil, amidinil, amidinilalquila, amidinilalquilcarbonil guanidinila, guanidinilalquila, guanidinilalquilcarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxiC 1- C12, em que R13 , R14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquilaC1-C12; e em que pelo menos uma das ligações intersubunidades é ligação (B). Em outra modalidade a presente revelação provê um oligômero compreendendo grupo terminais modificados, por exemplo, em uma modalidade a revelação provê um oli- gômero compreendendo uma estrutura, a estrutura compreendendo uma sequência de es- truturas de anel morfolino unidas por ligações inter-subunidades do tipo (A), (B) ou combina- ções dos mesmos, em que cada estrutura de anel morfolino sustenta uma fração pareadora 1O de base, tal que o composto oligômero pode se ligar em uma forma sequência-específica a um ácido nucléico alvo, e em que o oligômero compreende uma terminação 3', uma termi- nação 5' e tem a seguinte estrutura (XVII):
Terminal 5'
Terminal 3'
(XVII)
*5' terminus=terminal 5' 3'terminus =terminal 3' ou um sal ou isômero do mesmo, e em que para ligação (A): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -C(CH 3)2, -NR 1R2, -OR 3 ou;
(II)
Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 2, R 1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R2 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou -LNR4 R5 R7 ; 5 R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquila C 1-C 6; R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila, -C(=NH)NH 2, -Z- L-NHC(=NH)NH2 ou -[C(O)CHR'NH]mH, onde Z is carbonila(C(O)) ou uma ligação direta, R' é uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural ou um- ou dois-carbonos homó- logos dos mesmos, e m é 1 a 6; R5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila ou um par de elé- tron; R6 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquila C 1-C 6 ou alcoxial- quila CrC6; L é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo grupos alquila, alcóxi ou alquilamino, ou combinações dos mesmos; e Em que para ligação (8): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -NR 8 R9 ou-OR 3 ; e Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 1º, 8 R é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquila CrC 12 ; 9 R é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C 1-C 12 , aralqui-
ou arila; R 10 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C 1-C 12 ou - LNR 4 R5 R7 · ' em que R8 e R9 podem se unir para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5- 18 membros ou R8 , R9 ou R3 podem ser unir com R1 para formar um heterociclo de 5-7 º membros, e em que quando X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili):
R12
R1Z ri\ R,,(\_1__l+ R12
(III)
em que: R10 é, em cada ocorrência, independentemente alquila CrC 12, aminoalquila C1-C12, alquilacarbonila C1-C 12 , arila, heteroarila ou heterociclil; e R11 é, em cada ocorrência, independentemente um par de elétron, hidrogênio ou al- quila C1-C12; R12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquila CrC 12 , aminoal- quila C1-C 12 , -NH 2, -CONH 2, -NR 13 R 14 , -NR 13 R 14 R15 , alquilacarbonila CrC 12 , -CN, trifluormeti- la, amidila, amidinila, amidinilalquila, amidinilalquilacarbonila, guanidinila, guanidinilalquila, 1O guanidinilalquilacarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxi C 1-C 12 , em que R 13 , R14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquila C1-C 12 ; e R17 é, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio ou alquila C1-
R18 e R19 são, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio, um peptídeo penetrante de célula, um aminoácido natural ou não natural, alquilcarbonilaCrC 30 , -C(=O)OR 21 ou R20 ; R20 é, em cada ocorrência, independentemente guanidinila, heterociclila, alquila C1- C30, cicloalquila CrCs; arilaC 6 -C30, aralquila CrC30, alquilcarbonila C3-C30, cicloalquilacarbo- nila C3-C 8, cicloalquilalquilcarbonilaC 3-C 8, arilcarbonilaCrC 30 , aralquilacarbonilaCrC 30 , alqui- loxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonilaC 3-C 8, arilcarbonilaCrC 30 , aralquiloxicarbonilaC 8- C30, ou -P(=O)(R 22 )2; R21 é alquila C1-C 30 compreendendo um ou mais frações de oxigênio ou hidroxila ou combinações dos mesmos; cada R22 é independentemente arilóxiC 6-C 12 ; B é uma fração pareadora de base; L1 é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo liga- ções selecionadas a partir de alquila, hidroxila, alcóxi, alquilamino, amida, éster, bissulfeto, carbonila, carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina e fosfodiés- ter; x é um número inteiro de O ou maior; e em que pelo menos um de R 18 ou R 19 é R20 e provido que ambos de R17 e R18 não são ausentes.
Em outra modalidade, a presente revelação provê um método de inibição da produ- ção de uma proteína, o método compreendendo exposição de um ácido nucléico codificando a proteína a um oligômero da presente revelação.
Em outra modalidade, a revelação é direcionada a um método de tratar uma doen- ça em um paciente, o método compreendendo administração de uma quantidade terapeuti- camente efetiva de um oligômero.
Métodos de fazer os oligômeros e métodos para seus usos são também providos.
Esses e outros aspectos da invenção serão aparentes sobre referência a seguinte descrição detalhada.
Para este fim, várias referências são reveladas aqui, que descrevem 1O em mais detalhes certa informação antecedente, procedimentos, compostos e/ou composi- ções, e são cada aqui incorporados por referência em sua totalidade.
Breve descrição dos desenhos Figura 1A mostra uma estrutura de oligômero morfolino exemplar compreendendo uma ligação fosforodiamidato.
Figura 1B mostra um oligômero morfolino como na Figura 1A, mas onde as ligações estruturais compreendem uma ligação piperazino fosforodiamidato.
Figura 1C mostra um conjugado de um peptídeo rico em arginina e um oligômero antisenso.
Figura 1D-G mostra o segmento da subunidade de repetição dos oligonucleotídeos morfolino exemplares, designados 1D a 1G.
Figura 2 revela ligações inter-subunidades exemplares ligadas a uma fração morfo- lino-T.
Figura 3 é um esquema reacional mostrando preparação de um ligador para síntese de fase sólida.
Figura 4 demonstra preparação de um suporte sólido para síntese de oligômero.
Figura 5 mostra atividade de escape do éxon dos oligômeros representativos.
Figura 6 é um gráfico de barra mostrando o escape do éxon no modelo de camun- dongo mdx.
Figura 7A-7C provê resultados do tratamento de camundongos eGFP com oligôme- ros exemplares.
Figura 8 mostra redução nos níveis de proteína M2 virais a partir de células tratadas com oligômeros exemplares.
Figura 9 mostra atividade antivirai e perda de peso em camundongos tratados com oligômeros exemplares.
Figura 1O provê dados de peso corporal de camundongos tratados com oligômeros exemplares.
Figura 11 é atividade de correção de splice eGFP em vários tecidos a partir de ca-
mundongos tratados com oligômeros exemplares comparados aos oligômeros PMO e PMO+. Figura 12 mostra um subgrupo de dados de atividade de correção de splice eGFP em vários tecidos a partir de camundongos tratados com oligômeros exemplares compara- 5 dos aos oligômeros PMO e PMO+. Descrição detalhada
1. Definições Na seguinte descrição, certos detalhes específicos são revelados a fim de prover um completo entendimento de várias modalidades. Entretanto, um versado na técnica en- 1O tenderá que a invenção pode ser praticada sem esses detalhes. Em outros exemplos, estru- turas bem conhecidas não têm sido mostradas ou descritas em detalhes para evitar descri- ções desnecessariamente obscuras das modalidades. A menos que o contexto requeira de outra forma, por toda a especificação e reivindicações que seguem, a palavra "compreende" e variações da mesma, tais como, "compreendem" e "compreendendo" são para ser cons- truídas em uma senso aberto, inclusivo, que é, como "incluindo, mas não limitado a". Ainda, títulos providos aqui são para conveniência somente e não interpretam o objetivo ou signifi- cado da invenção reivindicada. Referência por toda esta especificação para "uma modalidade" significa que uma característica particular, estrutura ou característica descrita na conexão com a modalidade é inclusa em pelo menos uma modalidade. Então, aparecimento da frase "em uma modalida- de" em vários lugares por toda esta especificação não é necessariamente todas se referindo a mesma modalidade. Além disso, os traços, estruturas ou características particulares po- dem ser combinados em qualquer maneira adequada em um ou mais modalidades. Tam- bém, como utilizado nesta especificação e nas reivindicações em apêndice, as formas sin- guiares "um" e "o" inclui referentes plurais a menos que o conteúdo claramente dite de outra forma. Deve também ser notado que o termo "ou" é geralmente empregado no seu senso incluindo "e/ou" a menos que o conteúdo claramente dite de outra forma. Os termos abaixo, como aqui utilizados, têm is seguintes significados, a menos que de outra forma indicado: "Amino" refere-se ao radical -NH 2 . "Ciano" ou "nitrila" refere-se ao radical -CN. "Hidróxi" ou "hidroxila" refere-se ao radical -OH. "!mino" refere-se ao substituinte =NH. "Guanidinila" refere-se ao substituinte -NHC(=NH)NH 2 . "Amidinila" refere-se ao substituinte -C(=NH)NH 2 . "Nitro" refere-se ao radical -N0 2 . "Oxo" refere-se ao substituinte =O.
"Tioxo" refere-se ao substituinte =S. "Colato" refere-se à seguinte estrutura: o
H "Deoxicolato" refere-se a seguinte estrutura: o 5 "Alquila" refere-se a um radical de cadeia hidrocarboneto simples ou ramificada que é saturada ou insaturada (isto é, contém uma ou mais ligações duplas e/ou triplas), tendo a partir de um a trinta átomos de carbono, e que é ligado ao resto da molécula por uma liga- ção simples. Alquilas compreendendo qualquer número de átomos de carbono a partir de 1 1O a 30 são inclusos. Uma alquila compreendendo até 30 átomos de carbono é referida como uma alquilaC 1-C 30 , da mesma forma, por exemplo, uma alquila compreendendo até 12 áto- mos de carbono é uma alquilaC1-C 12 . Alquilas (e outras frações aqui definidas) compreen- dendo outros números dos átomos de carbono são representados similarmente. Grupos alquila incluem, mas não são limitados a, alquilaC1-C 30 , alquilaC 1-C20, alquilaC 1-C 15 , alqui- laC 1-C 10 , alquilaC 1-Cs, alquilaC1-C5, alquilaC1-C 4 , alquilaC 1-C 3, alquilaC 1-C 2, alquilaCrC 8 , alquilaC 3-C 8 e alquilaC 4 -C 8 . Grupos alquila representativos incluem, mas não são limitados a, metila, etila, n-propila, 1-metiletila, (isso-propila), n-butila, i-butila, s-butila, n-pentila, 1, 1- dimetiletil(t-butila), 3-Metilexila, 2-metilexila, etenila, prop-1-enila, but-1-enila, pent-1-enila, penta-1,4-dienila, etinila, propinila, but-2-inila, but-3-inila, pentinila, hexinila, e semelhantes. A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo alquila pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Alquileno" ou "cadeia alquileno" refere-se a uma cadeia hidrocarboneto simples ou ramificada divalente ligando o resto da molécula a um grupo radical. Alquilenos podem ser saturados ou insaturados (isto é, contém uma ou mais ligações duplas e/ou triplas). Alquile- nos representativos incluem, mas não são limitados a, alquilenoC 1-C 12 , alquilenoC 1-C 8 , ai-
11 /114 quilenoC1-C5, alquilenoC 1-C 4 , alquilenoC1-C3, alquilenoC 1-C2, alquilenoC 1. Grupos alquileno representativos, mas não limitados a, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, pro- penileno, n-butenileno, propinileno, n-butinileno e semelhantes.
A cadeia alquileno é ligada ao resto da molécula através de uma ligação simples ou dupla e ao grupo radical através de 5 uma ligação simples ou dupla.
Os pontos de ligação da cadeia alquileno para o resto da mo- lécula e para o grupo radical pode ser através de um carbono ou qualquer de dois carbonos dentro da cadeia.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, uma cadeia alquileno pode ser opcionalmente substituída como descrito abaixo. "Alcóxi" refere-se a um radical de fórmula -ORa onde Ra é um radical alquila como 1O definido.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo alcóxi pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Alcoxialquila" refere-se a um radical de fórmula -RbORa onde Ra é um radical alqui- la como definido e onde Rb é um radical alquileno como definido.
A menos que de outra for- ma atestado especificamente na especificação, um grupo alcoxialquila pode ser opcional- mente substituído como descrito abaixo. "Alquilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Ra onde Ra é um radical alquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na es- pecificação, um grupo alquilcarbonila pode ser opcionalmente substituído como descrito acima. "Alquiloxicarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)ORa onde Ra é um ra- dical alquila como definido.
A menos que de outra forma atestado especificamente na espe- cificação, um grupo alquilocarbonila pode ser opcionalmente substituído como descrito abai- xo. "Alquilamino" refere-se a um radical de fórmula -NHRa ou -NRaRa onde cada Ra é, independentemente, um radical alquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo alquilamino pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Amidila" refere-se a um radical de fórmula -N(H)C(=O)Ra onde Ra é um radical al- quila ou arila como aqui definido.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo amidila pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Amidinilalquila" refere-se a um radical de fórmula -Rb-C(=NH)NH 2 na especifica- ção, um grupo amidinilalquila pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Amidinilalquilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Rb-C(=NH)NH 2 onde Rb é um radical alquileno como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo amidinilalquilcarbonila pode ser opcionalmente substituído como descrito abaixo. "Aminoalquila" refere-se a um radical de fórmula -Rb-NRaRa onde Rb é um radical alquileno como definido acima, e cada Ra é independentemente um radical hidrogênio ou uma alquila. "Tioalquila" refere-se a um radical de fórmula -SRa onde Ra é um radical alquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especifica- 5 ção, um grupo tioalquila pode ser opcionalmente substituído. "Arila" refere-se a um radical derivado de um sistema de anel hidrocarboneto com- preendendo hidrogênio, 6 a 30 átomos de carbono e pelo menos um anel aromático.
O radi- cal arila pode ser sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, que pode incluir sistemas de anel fusionados ou ligações.
Radicais arila incluem, mas não são limita- 1O dos a, radicais arila derivados dos sistemas de anel hidrocarboneto de aceantrileno, acenaf- tileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as- indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleiadeno, pireno, e trifenileno.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, o termo "arila" ou o prefixo "ar-" (tal como em "aralquila") é tencionado incluir radicais arila que são opcionalmente substituídos. "Aralquila" refere-se a um radical de fórmula -Rb-Rb onde Rb é uma cadeia alquileno como definido acima e Rc é um ou mais radicais arila como definido acima, por exemplo, benzila, difenilmetila, tritil e semelhantes.
A menos que de outra forma atestado especifica- mente na especificação, um grupo aralquila pode ser opcionalmente substituído. "Arilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Rc onde Rc é um ou mais radicais arila como definido acima, por exemplo, fenila.
A menos que atestado de outra for- ma especificamente na especificação, um grupo arilcarbonila pode ser opcionalmente subs- tituído. "Ariloxicarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)ORc onde Rc é um ou mais radicais arila como definido acima, por exemplo, fenila.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo ariloxicarbonila pode ser opcional- mente substituído. "Aralquilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Rb-Rc onde Rb é uma cadeia alquileno como definido acima e Rc é um ou mais radicais arilas como definido acima, por exemplo, fenila.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especifica- ção, um grupo aralquilcarbonila pode ser opcionalmente substituído. "Aralquiloxicarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)ORb-Rc onde Rb é uma cadeia alquileno como definido acima e Rc é um ou mais radicais arila como definido acima, por exemplo, fenila.
A menos que de outra forma atestado especificamente na espe- cificação, um grupo aralquiloxicarbonila pode ser opcionalmente substituído. "Arilóxi" refere-se a um radical de fórmula -ORc onde Rc é um ou mais radicais arila como definido acima, por exemplo, fenila.
A menos que de outra forma atestado especifica-
mente na especificação, um grupo arilcarbonila pode ser opcionalmente substituído. "Cicloalquila" refere-se a um anel policíclico monocíclico ou policíclico carbocíclico, não aromático, estável, que pode incluir sistemas de anel fusionados ou ligados, que são saturados ou não saturados, e ligados ao resto da molécula por uma ligação simples.
Ciclo- 5 alquilas representativas incluem, mas não são limitados a cicloalquilas tendo de três a quin- ze átomos de carbono e a partir de três a oito átomos de carbono.
Radicais cicloalquila mo- nocíclicos incluem, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, cicloeptila, e ciclooctila.
Radicais policíclicos incluem, por exemplo, adamantil, norbonil, decalinil, e 7,7- dimetil-biciclo[2.2.1]heptanil.
A menos que de outra forma atestado especificamente na es- 1O pecificação, um grupo cicloalquila pode ser opcionalmente substituído. "Cicloalquilalquila" refere-se a um radical de fórmula -RbRd onde Rb é uma cadeia alquileno como definido acima e Rd é um radical cicloalquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo cicloalquilalquila pode ser opcionalmente substituído. "Cicloalquilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Rd onde Rd é um ra- dical cicloalquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamen- te na especificação, um grupo cicloalquilcarbonila pode ser opcionalmente substituído. "Cicloalquiloxicarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)ORd onde Rd é um radical cicloalquila como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especifi- camente na especificação, um grupo cicloalquiloxicarbonila pode ser opcionalmente substi- tuído. "Fusionado" refere-se a qualquer estrutura de anel aqui descrito que é fusionado a uma estrutura de anel existente.
Quando o anel fusionado é um anel heterociclila ou um anel heteroarila, qualquer átomo de carbono na estrutura de anel existente que se torna parte do anel heterociclila fusionado ou o anel heteroarila fusionado pode ser substituído com um átomo de nitrogênio. "Guanidinilalquila" refere-se a um radical de fórmula -Rb-NHC(=NH)NH 2 onde Rb é um radical alquileno como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especifi- camente na especificação, um grupo guanidinilalquila pode ser opcionalmente substituído como descrito acima. "Guanidinilalquilcarbonila" refere-se a um radical de fórmula -C(=O)Rb- NHC(=NH)NH2 onde Rb é um radical alquileno como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo guanidilalquilcarbonila pode ser opcionalmente substituído como descrito acima. "Halo" ou "halogênio" refere-se a bromo, cloro, flúor ou iodo. "Haloalquila" refere-se a um radical alquila, como definido acima, que é substituído por um ou mais radicais halo, como definido acima, por exemplo, trifluormetila, difluormetila,
fluormetila, triclorometila, 2,2,2-trifluoretila, 1,2-difluoretila, 3-bromo-2-fluorpropila, 1,2- dibromoetila, e semelhantes.
A menos que de outra forma atestado especificamente na es- pecificação, um grupo haloalquila pode ser opcionalmente substituído. "Perhalo" ou "perflúor" refere-se a uma fração em que cada átomo de hidrogênio tem sido substituído por um átomo halo ou átomo flúor, respectivamente. "Heterociclila", "heterociclo" ou "anel heterocíclico" referem-se a um radical anel não aromático de 3- a 24-membros compreendendo 2 a 23 átomos de carbono e a partir de 8 heteroátomos a partir do grupo consistindo de nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre. "Gua- nidinilalquila" refere-se a um radical de fórmula -Rb-NHC(=NH)NH 2 onde Rb é um radical 1O alquileno como definido acima.
A menos que de outra forma atestado especificamente na especificação, o radical heterociclila pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tri- cíclico ou tetracíclico, que pode incluir sistemas de anel fusionado ou ligado; e os átomos de nitrogênio, carbono ou enxofre no radical heterociclila podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de ntirogênio pode ser opcionalmente quaternizado; e o radical heterociclila pode ser parcialmente ou completamente saturado.
Exemplos de tais radicais heterociclila incluem, mas não são limitados a, dioxolanila, tienil[1,3]ditianila, decaidroisoquinolil, imidazolinila, imidazolidinila, isotiazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, octaidroindolil, octaidroisoindolil, 2- oxopiperazinila, 2-oxopiperidinila, 2-oxopirrolidinila, oxazolidinila, piperidinila, piperazinila, 4- piperidonila, pirrolidinila, pirazolidinila, quinuclidinila, tiazolidinila, tetraidrofuril, tritianila, te- traidropiranila, tiomorfolinila, tiamorfolinila, 1-oxo-tiomorfolinila, 1, 1-dioxo-tiomorfolinila, 12- crown-4, 15-crown-5, 18-crown-6, 21-crown-7, aza-18-crown-6, diaza-18-crown-6, aza-21- crown-7, e diaza-21-crown-7. A menos que de outra forma atestado especificamente na es- pecificação, um grupo heterociclila pode ser opcionalmente substituído. "Heteroarila" refere-se a um radical do sistema de anel de 5- a 14-membros com- preendendo átomos de hidrogênio, um a trinta átomos de carbono, um a seis heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre, e pelo menos um anel aromático.
Para propósitos desta invenção, o radical heteroarila pode ser um sistema de anel monocíclico, bicíclico, tricíclico ou tetracíclico, que pode incluir sistemas de anéis fusionados ou ligados; e os átomos de nitrogênio, carbono ou enxofre no radical heteroarila podem ser opcionalmente oxidados; o átomo de ntirogênio pode ser opcional- mente quaternizado.
Exemplos incluem, mas não são limitados a, azepinila, acridinila, ben- zimidazolil, benzotiazolil, benzindolil, benzodioxolil, benzofuranila, benzooxazolil, benzoti- azolil, benzotiadiazolil, benzo[b][1,4]dioxepinila, 1,4-benzodioxanila, benzonaftofuranila, ben- zoxazolil, benzodioxolil, benzodioxinila, benzopiranila, benzopiranonila, benzofuranila, ben- zofuranonila, benzotienila (benzotiofenila), benzotriazolil, benzo[4,6]imidazo[1,2-a]piridinila, carbazolil, cinolinila, dibenzofuranila, dibenzotiofenila, furanila, furanonila, isotiazolil, imi- dazolil, indazolil, indolil, indazolil, isoindolil, indolinila, isoindolinila, isoquinolil, indolizinila,
isoxazolil, naftiridinila, oxadiazolil, 2-oxoazepinila, oxazolil, oxiranila, 1-oxidopiridinila, 1- oxidopirimidinila, 1-oxidopirazinila, 1-oxidopiridazinila, 1-fenila-1 H-pirrolil, fenazinila, fenotia- zinila, fenoxazinila, ftalazinila, pteridinila, purinila, pirrolil, pirazolil, piridinila, pirazinila, pirimi- dinila, piridazinila, quinazolinila, quinoxalinila, quinolinila, quinuclidinila, isoquinolinila, tetrai- droquinolinila, tiazolil, tiadiazolil, triazolil, tetrazolil, triazinila, e tiofenila (isto é, tienila). A me- nos que de outra forma atestado especificamente na especificação, um grupo heteroarila pode ser opcionalmente substituído.
Todos os grupos acima podem ser ou substituídos ou não substituídos.
O termo "substituído" como aqui utilizado significa qualquer dos grupos acima (isto é, alquila, alquile- 1O no, alcóxi, alcoxialquila, alquilcarbonila, alquiloxicarbonila, alquilamino, amidil, amidinilalqui- la, amidinilalquilcarbonila, aminoalquila, arila, aralquila, arilcarbonila, ariloxicarbonila, aralqui- lcarbonila, aralquiloxicarbonila, arilóxi, cicloalquila, cicloalquilalquila, cicloalquilcarbonila, ci- cloalquilalquilcarbonila, cicloalquiloxicarbonila, guanidinilalquila, guanidinilalquilcarbonila, haloalquila, heterociclila e/ou heteroarila), podem ser ainda funcionalizados em que pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por uma ligação a um átomo não hidrogênio substituinte.
A menos que especificamente atestado na especificação, um grupo substituinte pode incluir um ou mais substituintes selecionados a partir de: oxo, -C0 2 H, -CONH 2 , nitrila, nitro, hidroxila, tioóxi, alquila, alquileno, alcóxi, alcoxialquila, alquilcarbonila, alquiloxicarboni- la, arila, aralquila, arilcarbonila, ariloxicarbonila, aralquilcarbonila, aralquiloxicarbonila, arilóxi, cicloalquila, cicloalquilalquila, cicloalquilcarbonila, cicloalquilalquilcarbonila, cicloalquiloxicar- bonila, heterociclila, heteroarila, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N- óxidos, imidas e enaminas; um átomo de silicone em grupos tais como grupos trialquilsilil, grupos dialquilarilsilil, grupos alquildiarilsilil, grupos triarilsilil, perfluoralquila ou perfluoralcóxi, por exemplo, trifluormetil ou trifluormetóxi. "Substituído" também significa qualquer dos gru- pos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por uma ligação de maior ordem (por exemplo, uma ligação dupla ou tripla) a um heteroátomo tal como oxigênio em grupos oxo, carbonila, carboxila, e éster; e nitrogênio em grupos tais como iminas, exi- mas, hidrazonas e nitrilas.
Por exemplo, "substituído" inclui qualquer dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos com -NR 9 C(=O)NR 9 Rh, - NR 9 C(=0)0Rh, -NR 9 S0 2 Rh, -OC(=O)NR 9 Rh, -OR9 , -SR 9 , -SOR 9 , -S0 2 R9 , -OS0 2 R9 , -S0 2 0R 9 , =NS0 2 R9 , e -S0 2 NR 9 Rh. "Substituído" também significa qualquer dos grupos acima em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos com -C(=O)R 9 , -C(=O)OR 9 , -CH 2 S0 2 R9 , -
CH 2 S0 2 NR 9 Rh, -SH, -SR 9 ou -SSR 9 . No antecedente, R9 e Rh são os mesmos ou diferentes e independentemente de hidrogênio, alquila, alcóxi, alquilamino, tioalquila, arila, aralquila, ci- cloalquila, cicloalquilalquila, haloalquila, heterociclila, N-heterociclila, heterociclilalquila, hete- roarila, N-heteroarila e/ou heteroarilalquila.
Em adição, cada um dos substituintes antece- dentes pode também ser opcionalmente substituído com um ou mais dos substituintes aci-
ma. Além disso, qualquer dos grupos acima pode ser substituído para incluir um ou mais átomos de oxigênio ou enxofre internos. Por exemplo, um grupo alquila pode ser substituído com um ou mais átomos de oxigênio interno para formar um grupo éter ou poliéter. Similar- mente, um grupo alquila pode ser substituído com um ou mais átomos de enxofre internos para formar um tioéter, bissulfeto etc. Frações amidila podem ser substituídas com até 2 halo átomos, enquanto outros grupos acima podem ser substituídos com um ou mais áto- mos halo. Com a exceção de grupos alquila, todos os outros grupos podem também ser substituídos com amino ou monoalquilamino. Com a exceção de grupos alquila e alquilcar- bonila, todos os outros grupos podem também ser substituídos com guanidinil ou amidinil. 1O Substituintes opcionais para qualquer dos grupos acima também incluem arilfosforila, por exemplo, -RaP(Arh em que Ra é um alquileno e Ar é fração arila, por exemplo, fenila. Os termos "oligômero antisenso" ou "composto antisenso" são usados de forma passível de mudança e referem-se a uma sequência de subunidades, cada tendo uma base continuada de uma subunidade estrutural composta de ribose ou outro açúcar pentase ou grupo morfolino, e onde os grupos estruturais são ligados por ligações intersubunidades que permitem as bases no composto hibridizar a uma sequência alvo em um ácido nucléico (tipi- camente um RNA) por pareamento de base de Watson-Crick, para formar um ácido nucléi- co:oligômero heteroduplex dentro da sequência alvo. O oligômero pode ter a sequência exa- ta de complementariedade à sequência alvo ou complementariedade próxima. Tais oligôme- ros antisenso são designados para bloquear ou inibir tradução de um mRNA contendo a sequência alvo, e podem ser referidos para serem "direcionados" a uma sequência com a qual ele hibridiza. Um "oligômero morfolino" ou "PMO" refere-se a uma molécula polimérica tendo uma estrutura que suporta bases capazes de ligar hidrogênio a polinucleotídeos típicos, em que o polímero tem ausência de uma fração da estrutura do açúcar pentase, e mais especifica- mente uma estrutura ribose ligada por ligações fosfodiéster que é típico de nucleotídeos e nucleosídeos, mas ao invés, contém um anel nitrogênio com acoplamento através do anel nitrogênio. Um oligômero "morfolino" exemplar compreende estruturas de subunidades mor- folinas ligadas junto por ligações (tio)fosforamidato ou (tio)fosforodiamidato, unindo o morfo- lino nitrogênio de uma subunidade ao carbono 5'exocíclico de uma subunidade adjacente, cada subunidade compreendendo uma fração pareadora de base purina ou pirimidina efeti- va par ligar, por ligação de hidrogênio base-específica, a uma base em um polinucleotídeo. Oligômeros morfolino (incluindo oligômeros antisenso) são detalhados, por exemplo, nas Pat. dos EUA Nos. 5.698.685; 5.217.866; 5.142.047; 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444;
5.521.063; 5.506.337 e Pedidos de Patentes dos EUA em espera 12/271.036; 12/271.040; e número de publicação PCT W0/2009/064471, todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. PMOs representativos incluem PMOs em que as ligações in-
tersubunidades são ligações (A 1). "PMO+" refere-se a oligômeros fosforodiamidato morfolino compreendendo qual- quer número de ligações (1-piperazino)fosfonilidenoóxi, (1-(4-w-guanidino-alcanoil))- piperazino)fosfinilidenoóxi (A2 e A3) que tenham sido descritos previamente (ver, por exem- 5 pio, publicação PCT W0/2008/036127 que é aqui incorporada por referência em sua totali- dade. "PMO-X" refere-se a oligômeros fosforodiamidato morfolino revelados aqui compre- endendo pelo menos uma ligação (8) ou pelo menos uma das modificações terminais reve- ladas.
Um grupo "fosforamidato" compreende fósforo tendo três átomos de oxigênio liga- dos e um átomo de nitrogênio ligado, enquanto um grupo "fosforodiamidato" (ver, por exem- plo, Figuras 1D-E) compreende fósforo tendo dois átomos de oxigênio ligados e dois átomos de nitrogênio ligados.
Nas ligações não carregadas ou a intersubunidade modificada dos oligômeros descritos aqui e Pedido de Patente dos EUA co-pendente Nos. 61/349.783 e 11 /801.885, um nitrogênio é sempre pendente a cadeia estrutural.
O segundo nitrogênio, em uma ligação fosforodiamidato, é tipicamente o anel nitrogênio em uma estrutura do anel morfolino.
Ligações "tiofosforamidato" ou "tiofosforodiamidato" são ligações fosforamidato ou fosforodiamitado, respectivamente, em que um átomo de oxigênio, tipicamente o oxigênio pendente à estrutura, é substituído com enxofre. "Ligação intersubunidade" refere-se a ligação conectando duas subunidades morfo- linas, por exemplo, estrutura (1). "Carregado", "não carregado", "catiônico" e "aniônico" como aqui utilizado refere-se a um estado predominante de uma fração química em um pH próximo de neutro, por exem- pio, cerca de 6 a 8. Por exemplo, o termo pode referir ao estado predominante da fração química em pH fisiológico, que é cerca de 7.4. "Alquila inferior" refere-se a um radical alquila de um a seis átomos de carbono, como exemplificado por metila, etila, n-butila, i-butila, t-butila, isoamila, n-pentila, e isopenti- la.
Em certas modalidades, um grupo "alquila inferior" tem um a quatro átomos de carbono.
Em outras modalidades, um grupo "alquila inferior" tem um a dois átomos de carbono; isto é, metila ou etila.
Analogamente, "alquenila inferior" refere-se a um radical alquenila de dois a seis, preferivelmente três ou quatro átomos de carbono, como exemplificado por alila e bu- tenila.
Um substituinte "não interferente" é um que não afeta adversamente a habilidade de um oligômero antisenso como aqui descrito para ligar ao sei alvo tencionado.
Tais substi- tuintes incluem grupos pequenos e/ou relativamente não polares tais como metila, etila, me- tóxi, etóxi ou flúor.
Um oligonucleotídeo ou oligômero antisenso "especificamente hibridiza" a um alvo polinucleotídeo se o oligômero hibridiza ao alvo sobre condições fisiológicas, com uma Tm maior que 37°C, maior que 45ºC, preferivelmente pelo menos 50ºC, e tipicamente 60ºC- 80ºC ou maior.
A "Tm" de um oligômero é a temperatura em que 50% hibridiza a um polinu- 5 cleotídeo complementar.
Tm é determinada sob condições padrões em salina fisiológica, como descrito, por exemplo, em Miyada et ai., Methods Enzymo/. 154:94-107 (1987). Tal hibridização pode ocorrer com complementariedade "próxima" ou "substancial" do oligômero antisenso à sequência alvo, bem como com complementariedade exata.
Polinucleotídeos são descritos como "complementares" a um outro quando hibridi- 1O zação ocorre em uma configuração anti-paralela entre dois polinucleotídeos de fita simples.
Complementariedade (o grau que um polinucleotídeo é complementar com outro) é quantifi- cável em termos da proporção de bases em fitas opostas que são esperadas formar liga- ções de hidrogênio com cada outra, de acordo com regras de pareamento de base geral- mente aceitas.
Uma primeira sequência é uma "sequência antisenso" com respeito a uma segunda sequência se um polinucleotídeo cuja sequência é a primeira sequência especificamente se liga a, ou especificamente hibridiza com, a segunda sequência polinucleotídica sobre condi- ções fisiológicas.
O termo "sequência alvo" é a sequência no oligonucleotídeo análogo que é com- plementar (significando, em adição, substancialmente complementar) para a sequência alvo no genoma RNA.
A sequência inteira, ou somente uma porção, do composto análogo pode ser complementar à sequência alvo.
Por exemplo, em um análogo tendo 20 bases, somente 12-14 podem ser sequências alvos.
Tipicamente, a sequência alvo é formada de bases con- tínuas no análogo, mas podem alternativamente ser formadas de sequências não contíguas que quando colocadas juntas, por exemplo, a partir das terminações opostas do análogo, constituem sequência que transpõem a sequência alvo.
Alvo e sequências alvos são descritas como "complementares" a uma outra quando hibridização ocorre em uma configuração anti-paralela.
Uma sequência alvo pode ter com- plementariedade "próxima" ou "substancial" à sequência alvo e ainda funciona para o propó- sito dos métodos presentemente descritos, que é, ainda ser "complementar". Preferivelmen- te, os compostos análogos oligonucleotídeos empregados nos métodos presentemente des- critos têm no máximo uma má combinação com a sequência alvo de 1O nucleotídeos, e pre- ferivelmente no máximo uma má combinação em 20. Alternativamete, os oligômeros anti- senso empregados têm pelo menos 90% de sequência homóloga, e preferivelmente pelo menos 95% de sequência homóloga, com as sequências alvos exemplares como aqui de- signado.
Para propósitos de complementariedade ligando a um RNA alvo, e como discutido abaixo, uma base guanina pode ser complementar também a uma base RNA uracila cytosi-
neor.
Um "heteroduplex" refere-se a um duplex entre um análogo oligonucleotídeo e a porção complementar de um RNA alvo.
Um "heteroduplex resistente a nuclease" refere-se a um heteroduplex formado pelo ligante de um oligômero antisenso ao seu alvo complemen- 5 tar, tal que o heteroduplex é substancialmente resistente a degradação in vivo por nucleases intracelulares e extracelulares, tal como RNAse H, que são capazes de cortar complexos RNA/RNA ou RNA/DNA de fita dupla.
Um agente é "ativamente tomado por células mamíferas" quando o agente pode en- trar na célula por um mecanismo outro que difusão passiva através da membrana celular.
O 1O agente pode ser transportado, por exemplo, por "transporte ativo", referindo ao transporte de agentes através de uma membrana de célula mamífera por, por exemplo, um mecanismo de transporte dependente de ATP, ou por "transporte facilitado", referindo ao transporte de agentes antisenso através da membrana celular por um mecanismo de transporte que re- quer ligação do agente à proteína de transporte, que então facilita a passagem do agente ligado através da membrana.
Os termos "expressão modulante" e/ou "atividade antisenso" refere-se a habilidade de um oligômero antisenso para ou aumentar ou, mais tipicamente, reduzir a expressão de uma dada proteína, por interferir com a expressão ou tradução de RNA.
No caso de expres- são protéica reduzida, o oligômero antisenso pode diretamente bloquear a expressão de um dado gene, ou contribuir para a quebra acelerada do RNA transcrito a partir deste gene.
Oli- gômeros morfolino como aqui descrito são acreditados atuar através do mecanismo prévio (bloqueio estérico). Alvos antisenso preferidos para oligômeros de bloqueio estérico incluem a região do códon de partida ATG, sítios de splice, regiões proximamente adjacentes aos sítios splice, e região 5'-não traduzida de mRNA, embora outras regiões têm sido com su- cesso direcionadas usando oligômeros morfolino.
Uma "subunidade aminoácida" é preferivelmente um resíduo a-aminoácido (-CO- CHR-NH-); ele pode também ser um 13- ou outro resíduo aminoácido (por exemplo, -CO- CH2CHR-NH-), onde Ré uma cadeia lateral aminoácida.
O termo "aminoácido de ocorrência natural" refere-se a um aminoácido presente em proteínas encontradas na natureza.
O termo "aminoácidos não naturais" refere-se àqueles aminoácidos não presentes nas proteínas encontradas na natureza; exemplos incluem beta- alanina (!3-Ala) e ácido 6-aminoexanóico (Ahx). Uma "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade de oligômero antisenso administrada a um paciente mamífero, ou como uma dose única ou como parte de uma série de doses, que é efetiva para produzir um efeito te- rapêutico desejado, tipicamente por inibir a tradução de uma sequência de ácido nucléico alvo selecionado.
''Tratamento" de um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como um humano) ou uma célula é qualquer tipo de intervenção usada em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula. Tratamento inclui, mas não é limitado a, administração de uma com- posição farmacêutica, e pode ser feito ou profilaticamente ou subseqüente ao início de um 5 evento patológico ou contato com um agente etiológico. li. Oligômeros Antisenso A. Oligômeros com Ligações lntersubunidades Modificadas Como apontado acima, uma modalidade da presente revelação é direcionada aos oligômeros compreendendo ligações intersubunidades novas. Em algumas modalidades, os 1O oligômeros têm afinidade mais alta para DNA e RNA que para os oligômeros não modifica- dos correspondentes e demonstram distribuição celular melhorada, potência, e/ou proprie- dades de distribuição tecidual comparado aos oligômeros tendo outras ligações intersubuni- dades. Em uma modalidade, os oligômeros compreendem pelo menos uma ligação intersu- bunidade de tipo (B) como definido acima. Os oligômeros podem também compreender uma ou mais ligações intersubunidades do tipo (A) como definido acima. As características estru- turais e propriedades dos vários tipos de ligação e oligômeros são descritos em mais deta- lhes na seguinte discussão.
1. Ligação (A) Aplicantes têm encontrado que aumento da atividade antisenso, biodistribuição e/ou outras propriedades desejáveis podem ser otimizadas por preparação de oligômeros tendo várias ligações intersubunidades. Por exemplo, os oligômeros podem opcionalmente com- preender uma ou mais ligações intersubunidade de tipo (A), e em certas modalidades os oligômeros compreendem pelo menos uma ligação do tipo (A). Em certas modalidades cada ligação do tipo (A) tem a mesma estrutura. Ligações do tipo (A) podem incluir ligações reve- !adas na Patente dos EUA de co-propriedade No. 7.943.762 que é aqui incorporada porre- ferência em sua totalidade. Ligação (A) tem a seguinte estrutura (1), em que 3' e 5' indicam o ponto de ligação ao 3'e 5'terminal, respectivamente, do anel morfolino (isto é, estrutura (i) discutido abaixo): w li X_...P,J 11' 3' y'l .,..,..,..,..,. 1 5'
I ou um sal ou isômero do mesmo, em que: W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O;
X é, em cada ocorrência, independentemente -N(CH 3 h, -NR 1R2, -OR 3 ou:
(II)
Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR2, R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; 5 R2 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou -LNR 4 R5 R7 ; R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6; R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila, -C(=NH)NH 2,-Z-L- NHC(=NH)NH2 ou -[C(O)CHR'NH]mH, onde Z é -C(=O)- ou uma ligação direta, R' é uma ca- deia lateral de um aminoácido de ocorrência natural um ou dois carbonos homólogos do 1O mesmo, e m é 1 a 6; R5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila ou um par de elé- tron; R6 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquilaC 1-C 6 ou alcoxial- quilaCrC6; e L é um ligador opcional de até 18 átomos de comprimento compreendendo grupos alquila, alcóxi, alquilamino, ou combinações dos mesmos.
Em alguns exemplos, o oligômero compreende pelo menos uma ligação do tipo (A). Em algumas outras modalidades, o oligômero inclui pelo menos duas ligações consecutivas do tipo (A). Em modalidades adicionais, pelo menos 5% das ligações no oligômero são tipo (A); por exemplo, em algumas modalidades, 5%-95%, 10% a 90%, 10% a 50%, ou 10% a 35% das ligações podem ser ligação do tipo (A). Em algumas modalidades, pelo menos uma ligação do tipo (A) é -N(CH 3 )2. Em outras modalidades, cada ligação do tipo (A) é -N(CH 3 )2. Em outras modalidades, pelo menos uma ligação do tipo (A) é piperizin-1-il, por exemplo, piperazin-1-il não substituída (por exemplo, A2 ou A3). Em outras modalidades, cada ligação do tipo (A) é piperizin-1-il, por exemplo, piperazin-1-il não substituída.
Em algumas modalidades, W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O, e em certas modalidades W é O.
Em certas modalidades, X é, em cada ocorrência, independentemente -X(CH 3 h, - 12 NR R , -OR . Em algumas modalidades X é -N(CH 3 )2. Em outros aspectos X é -NR 1 R2, e 3 em outros exemplos X é -OR 3 . Em algumas modalidades, R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê-
nio ou metila.
Em algumas modalidades, R1 é hidrogênio.
Em outras modalidades X é metila.
Em algumas modalidades, R2 é, em cada ocorrência, hidrogênio.
Em outras moda- lidades R2 é, em cada ocorrência, -NR 4 R5R7 . Em algumas modalidades, R é, em cada ocor- 3 rência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6 . Em outras modalidades, R3 é metila.
Em outras modalidades, R3 é etila.
Em algumas outras modalidades, R3 é n-propila ou iso- propila.
Em algumas outras modalidades, R3 é alquilaC 4 . Em outras modalidades, R3 é alqui- laC5. Em algumas modalidades, R3 é alquila C6 . Em certas modalidades, R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio.
Em outras modalidades, R4 é metila.
Em ainda outras modalidades, R4 é -C(=NH)NH2, e 1O em outras modalidades, R4 é -Z-L-NHC(=NH)NH2. Em ainda outras modalidades, R4 é - [C(=O)CHR'NH]mH.
Z é -C(=O)- em uma modalidade e Z é uma ligação direta em outra mo- dalidade.
R' é uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural.
Em algumas mo- dalidades R' é um homólogo de um ou dois carbonos de cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural.
M é um número inteiro de 1 a 6. M pode ser 1, m pode ser 2, m pode ser 3, m pode ser 4, m pode ser 5, m pode ser 6. Em algumas modalidades, R5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê- nio, metila ou um par de elétron.
Em algumas modalidades, R5 é hidrogênio.
Em outras mo- dalidades, R5 é metila.
Em ainda outras modalidades, R5 é um par de elétron. 6 Em algumas modalidades, R é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê- 6 nio ou metila.
Em algumas modalidades, R é hidrogênio.
Em outras modalidades, R6 é meti- la.
Em outras modalidades, R7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquilaCrC 6 ou alcoxialquilaCrC 6 . Em algumas modalidades R7 é hidrogênio.
Em outras modalidades, R7 é alquilaC 1-C 6 . Em ainda outras modalidades, R7 é alcoxialquilaCrC 6 . Em algumas modalidades, R7 é metila.
Em outras modalidades, R7 é etila.
Em ainda outras mo- dalidades, R7 é n-propila ou isopropila.
Em algumas outras modalidades, R7 é alquila C4 . Em algumas modalidades, R7 é alquilaC 5. Em algumas modalidades, R7 é alquilaC 6 . Em ainda outras modalidades, R7 é alcoxialquila C2 . Em algumas outras modalidades, R7 é alcoxialqui- 7 la C3 . Em ainda outras modalidades, R é alcoxialquila C4 . Em algumas modalidades, R7 é alcoxialquila C 5. Em outras modalidades, R7 é alcoxialquila C6 . O grupo ligador L, como notado acima, contém ligações em sua estrutura selecio- nada a partir de alquila (por exemplo, -CH2-CH2-), alcóxi (por exemplo, -C-0-C-), e alquila- mino (pro exemplo, -CH2-NH-), com a condição que os átomos terminais em L (por exem- pio, aqueles adjacentes a carbonila ou nitrogênio) são átomos de carbono.
Embora ligações ramificadas (por exemplo, -CH2-CH3-) são possíveis, o ligador é geralmente não ramificado.
Em uma modalidade, o ligador é um ligador hidrocarboneto.
Tal um ligador pode ter a estru-
tura (CH2)n- onde n é 1-12, preferivelmente 2-8, e mais preferivelmente 2-6. Oligômeros tendo qualquer número de ligação tipo (A) são providos. Em algumas modalidades, o oligômero não contém ligações do tipo (A). Em certas modalidades, 5, 1O, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 por cento das ligações são ligações (A). Em modalidades 5 selecionadas, 1O a 80, 20 a 80, 20 a 60, 20 a 50, 20 a 40, ou 20 a 35 por cento das ligações são ligações (A).
2. Ligações (8) Em algumas modalidades, os oligômeros compreendem pelo menos uma ligação de tipo (B). Por exemplo, os oligômeros podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais ligações 1O do tipo (B). As ligações do tipo (B) podem ser adjacentes ou podem ser intercaladas por todo o oligômero. Ligação tipo (B) tem a seguinte estrutura (1): w li x-P.. . _; I .f' 3· y'l
T 5' (I) ou um sal ou isômero do mesmo, em que: W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -NR 8 R9 ou -OR 3 ; e Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 10 , R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6 ; R8 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaCrC 12 ; R9 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaCrC 12 , aralqui- laC 1-C 12 ou arila; R 10 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaC 1-C12 ou - LNR 4 R 5 R7 · ' em que R8 e R9 podem se unir para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5- 18 membros ou R8 , R9 ou R3 podem se unir com R1º para formar um heterociclo de 5-7 membros, e em que quando X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili): R12 R". ri\ R' f\__ ,r!- 1__ R12 (III) em que:
R11 é, em cada ocorrência, independentemente alquilaCrC12, aminoalquilaC1-C12, alquilcarbonilaC 1-C 12 , arila, heteroarila ou heterociclila; R é, em cada ocorrência, independentemente um par de elétron, hidrogênio ou al- quilaC1-C12; e R12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquilaCrC 12 , aminoal- quilaC1-C12, -NH 2, -CONH 2, -NR 13 R14 , -NR 13 R14 R15 , alquilaC 1-C 12carbonila, oxo, -CN, trifluor- metila, amidil, amidinil, amidinilalquila, amidinilalquilcarbonil guanidinila, guanidinilalquila, guanidinilalquilcarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxiC 1- C12, em que R13 , R14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquilaC 1-C12. Em alguns exemplos, o oligômero compreende uma ligação do tipo (B). Em algu- mas outras modalidades, o oligômero compreende duas ligações do tipo (B). Em algumas outras modalidades, o oligômero compreende três ligações do tipo (B). Em algumas outras modalidades, o oligômero compreende quatro ligações do tipo (B). Em ainda outras modali- dades, as ligações do tipo (B) são consecutivas (isto é, as ligações do tipo (B) são adjacen- tes a cada outra). Em modalidades adicionais, pelo menos 5% das ligações no oligômero são tipo (B); por exemplo, em algumas modalidades, 5%-95%, 10% a 90%, 10% a 50%, ou 10% a 35% das ligações podem ser ligação tipo (B). Em outras modalidades, R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6 . Em ainda outras modalidades, R3 pode ser metila.
Em outras modalidades, R3 pode ser etila.
Em algumas outras modalidades, R3 pode ser n-propila ou isopropila.
Em ainda outras modalidades, R3 pode ser alquilaC4. Em algumas modalidades, R3 pode ser alquila C . Em algumas modalidades, R3 pode ser alquila C . 5 6 8 Em algumas modalidades, R é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê- nio ou alquilaCrC 12 . Em algumas modalidades, R8 é hidrogênio.
Em ainda outras modalida- des, R8 é etila.
Em algumas outras modalidades, R8 é n-propila ou isopropila.
Em algumas modalidades, R8 é alquila C4. Em ainda outras modalidades, Rª é alquila C5 . Em outras mo- dalidades, R8 é alquila C6 . Em algumas modalidades, Rª é alquila C7 . Em ainda outras mo- dalidades, R8 é alquila C8 . Em outras modalidades, R8 é alquila C9 . Em ainda outras modali- dades, R8 é alquila C10 . Em algumas outras modalidades, R8 é alquila C 11 . Em ainda outras modalidades, Rª é alquila C12 . Em algumas outras modalidades, Rª é alquila CrC 12 e a al- quila CrC 12 inclui uma ou mais ligações duplas (por exemplo, alqueno), ligações triplas (por exemplo, alquino) ou ambas.
Em algumas modalidades, Rª é alquila CrC 12 não substituída.
Em algumas modalidades, R9 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê- nio, alquilaC 1-C 12 , aralquilaC 1-C 12 ou arila.
Em algumas modalidades, R9 é hidrogênio.
Em ainda outras modalidades, R9 é alquilaCrC 12 . Em outras modalidades, R9 é metila.
Em ainda outras modalidades, R9 é etila.
Em algumas outras modalidades, R9 é n-propila ou isopropi- la.
Em algumas modalidades, R9 é alquilaC4. Em algumas modalidades, R9 é alquila C5 . Em ainda outras modalidades, R9 é alquila C5. Em algumas outras modalidades, R9 é alquila C7. Em algumas modalidades, R9 é alquila C8 . Em algumas modalidades, R9 é alquila C9 . Em algumas outras modalidades, R9 é alquila C10. Em algumas outras modalidades, R9 é alquila C 11 . Em outras modalidades, R9 é alquila C 12 . 5 Em algumas outras modalidades, R9 é aralquila C 1-C 12 . Por exemplo, n algumas modalidades R9 é benzila e a benzila pode ser opcionalmente substituído em ou o anel fenila ou o carbono benzílico.
Substituintes a este respeito incluem grupos alquila e alcóxi, por exemplo, metila ou metóxi.
Em algumas modalidades, o grupo benzila é substituído com metila no carbono benzílico.
Por exemplo, em algumas modalidades, R9 tem a seguinte es- 1O trutura (XIV):
(XIV)
Em outras modalidades, R9 é arila.
Por exemplo, em algumas modalidades R9 é fe- nila, e a fenila pode ser opcionalmente substituída.
Substituintes em respeito a substituintes incluem grupos alquila e alcóxi, por exemplo, metila ou metóxi.
Em outras modalidades, R9 é fenila e a fenila compreende uma fração crown éter, por exemplo, um crown éter de 12-18 membros.
Em uma modalidade o crown éter é 18 membros e podem ainda compreender uma fração fenila adicional.
Por exemplo, em uma modalidade R9 tem uma das seguintes estruturas (XV) ou (XVI):
(XV) (XVI) 10 Em algumas modalidades, R é, em cada ocorrência, independentemente hidrogê- nio, alquila C 1-C 12 ou -LNR R R , em que R4 , R5 e R7 são como definido acima com respeito 4 5 7 a ligação (A). Em outras modalidades, R10 é hidrogênio.
Em outras modalidades, R1º é alqui- la C 1-C 12 , e em outras modalidades R10 é -LNR 4 R5 R7 . Em algumas modalidades, R1º é meti- la.
Em ainda outras modalidades, R10 é etila.
Em algumas modalidades, R1º é alquila C3 . Em algumas modalidades, R10 é alquila C4. Em ainda outras modalidades, R1º é alquila C5 . Em algumas outras modalidades, R10 é alquila C6 . Em outras modalidades, R1º é alquila C7 . Em º ainda outras modalidades, R10 é alquila C8 . Em algumas modalidades, R1 é alquila C9 . Em outras modalidades, R10 é alquila C 10 . Em ainda outras modalidades, R é alquila C 11 . Em 10 algumas outras modalidades, R é alquila C12. Em algumas modalidades, R8 e R9 se unem para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5-18 membros.
Em algumas modalidades o heterociclo é um heterociclo mono- 5 cíclico de 5 ou 6 membros.
Por exemplo, em algumas modalidades a ligação (B) tem a se- guinte estrutura (IV):
5'
(IV)
Em outras modalidades, hetericiclo é bicíclico, por exemplo, um heterociclo bicíclico de 12 membros.
O heterociclo pode ser piperizinil.
O heterociclo pode ser morfolino.
O hete- 1O reciclo pode ser piperidinil.
O heterociclo pode ser decaidroisoquinolina.
Heterociclos repre- sentativos incluem os seguintes:
e
(III) (V) (VI) (VII)
(VJil)
Em algumas modalidades, R 11 é, em cada ocorrência, independentemente alqui- laCrC12, aminoalquilaCrC 12 , arila, heteroarila ou heterociclila.
Em algumas modalidades, R11 é alquilaCrC 12 . Em algumas modalidades, R11 é eti- la.
Em outras modalidades, R 11 é alquilaC . Em ainda outras modalidades, R11 é isopropila. 3
Em algumas outras modalidades, R 11 é alquilaC 4 . Em outras modalidades, R11 é alquila C5 . Em algumas modalidades, R11 é alquila C6 . Em outras modalidades, R11 é alquila C7 . Em algumas modalidades, R11 é alquila C8 . Em outras modalidades, R11 é alquila C . Em ainda 9 outras modalidades, R11 é alquila C 10 . Em algumas outras modalidades, R11 é alquila C 11 . Em algumas modalidades, R11 é alquila C 12 .
Em outras modalidades, R 11 é aminoalquilaC 1-C 12. Em algumas modalidades, R 11 é metilamino.
Em algumas modalidades, R 11 é etilamino.
Em outras modalidades, R 11 é ami- 11 noalquilaC3. Em ainda outras modalidades, R é aminoalquilaC4. Em algumas outras moda- lidades, R 11 é aminoalquila C 5 . Em outras modalidades, R 11 é aminoalquila C 6 . Em ainda 5 outras modalidades, R 11 é aminoalquila C . Em algumas modalidades, R 11 é aminoalquila C . 7 8
Em outras modalidades, R 11 é aminoalquila C9 . Em ainda outras modalidades, R 11 é amino- alquila C . Em algumas outras modalidades, R11 é aminoalquilaC . Em outras modalidades, 10 11
R 11 é aminoalquila C12. Em outras modalidades, R 11 é alquilcarbonila C 1-C 12 . Em ainda outras modalidades, 1O R 11 é alquil C 1carbonila.
Em outras modalidades, R 11 é alquilcarbonila C 2. Em algumas mo- dalidades, R 11 é alquilcarbonila C3. Em ainda outras modalidades, R 11 é alquilacarbonila C4. Em algumas modalidades, R 11 é alquilacarbonila C . Em algumas outras modalidades, R 11 é 5 alquilacarbonila C6 . Em outras modalidades, R 11 é alquilacarbonila C 7 . Em ainda outras mo- dalidades, R 11 é alquilacarbonila C 8 . Em algumas modalidades, R 11 é alquilacarbonila C 9 . Em ainda outras modalidades, R 11 é alquilacarbonila C . Em algumas outras modalidades, R 11 é 10 alquilacarbonila C 11 . Em algumas modalidades, R 11 é alquilacarbonila C 12 . Em ainda outras modalidades, R 11 é -C(=O)(CH 2)nC0 2H, onde n é 1 a 6. Por exemplo, em algumas modali- dades, n é 1. Em outras modalidades, n é 2. Em ainda outras modalidades, n é 3. Em algu- mas outras modalidades, n é 4. Em ainda outras modalidades n é 5. Em outras modalida- des, n é 6. Em outras modalidades, R 11 é arila.
Por exemplo, em algumas modalidades, R 11 é fenila.
Em algumas modalidades, a fenila é substituída, por exemplo, com um grupo nitro.
Em outras modalidades, R 11 é heteroarila.
Por exemplo, em algumas modalidades, R 11 é piridinila.
Em outras modalidades, R 11 é pirimidinila.
Em outras modalidades, R 11 é heterociclil.
Por exemplo, em algumas modalidades, R 11 é piperidinila, por exemplo, piperidin-4-ila. 11 Em algumas modalidades, R é etila, isopropila, piperidinila, pirimidinila, colato, deoxicolato, ou -C(=O)(CH 2)nC0 2H, onde n é 1 a 6. Em algumas modalidades, R é um par de elétrons.
Em outras modalidades, R é hi- drogênio, e em outras modalidades R é alquilaC 1-C 12 . Em algumas modalidades, R é metila.
Em algumas modalidades, R é etila.
Em outras modalidades, R é alquilaC 3. Em ainda outras modalidades, R é isopropila.
Em algumas outras modalidades, R é alquilaC 4. Em ainda ou- tras modalidades, R é alquilaC 5 . Em algumas modalidades, R é alquilaC 6 . Em algumas mo- dalidades, R é alquilaC 7 . Em ainda outras modalidades, R é alquilaC 8 . Em outras modalida- des, R é alquilaC 9 . Em algumas modalidades, R é alquilaC 10 . Em ainda outras modalidades, Ré alquilaC 11 . Em algumas modalidades, Ré alquilaC 12 . Em algumas modalidades, R 12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidro-
gemo, alquilaC1-C12, aminoalquilaC1-C12, -NH 2, -CONH 2, -NR R , -NR R R , oxo, -CN, trifluormetila, amidila, amidinila, amidinilalquila, amidinilalquilcarbonil guanidinila, guanidini- lalquila, guanidinilalquilcarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxiC 1-C 12 , em que R13 , R 14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquilaC 1- 5 C12- Em algumas modalidades, R 12 é hidrogênio.
Em algumas modalidades, R12 é alqui- laC1-C12. Em algumas modalidades, R12 é aminoalquilaC 1-C 12 . Em algumas modalidades, R 12 é -NH 2. Em algumas modalidades, R12 é -CONH 2. Em algumas modalidades, R12 é - NR 13 R 14 . Em algumas modalidades, R12 é -NR 13 R 14 R 15 . Em algumas modalidades, R12 é 1O alquilaC 1-C 12carbonila.
Em algumas modalidades, R12 é oxo.
Em algumas modalidades, R12 é amidila.
Em algumas modalidades, R12 é amidinila.
Em algumas modalidades, R12 é ami- dinilalquila.
Em algumas modalidades, R12 é amidinilalquilcarbonila.
Em algumas modalida- des, R 12 é guanidinila, por exemplo, mono metilguanidinil ou dimetilguanidinil.
Em algumas modalidades, R 12 é guanidinilalquila.
Em algumas modalidades, R12 é amidinilalquilcarbonila.
Em algumas modalidades, R12 é colato.
Em algumas modalidades, R 12 é deoxicolato.
Em algumas modalidades, R 12 é arila.
Em algumas modalidades, R 12 é heteroarila.
Em algumas modalidades, R12 é heterociclo.
Em algumas modalidades, R12 é -SR 13 . Em algumas moda- lidades, R12 é alcóxiC 1-C 12 . Em algumas modalidades, R12 é dimetil amina.
Em outras modalidades, R12 é metila.
Em ainda outras modalidades, R12 é etila.
Em algumas modalidades, R12 é alquilaC 3. Em algumas modalidades, R12 é isopropila.
Em al- gumas modalidades, R12 é alquila C4. Em outras modalidades, R 12 é alquilaC 5. Em ainda outras modalidades, R12 é alquilaC 6 . Em algumas outras modalidades, R12 é alquilaC 7 . Em algumas modalidades, R12 é alquilaC 8 . Em ainda outras modalidades, R12 é alquila C9. Em algumas modalidades, R 12 é alquila C 10 . Em ainda outras modalidades, R12 é alquilaC 11 . Em outras modalidades, R12 é alquilaC 12 . Em ainda outras modalidades, a fração alquila é subs- tituída com um ou mais átomos de oxigênio para formar uma fração éter, por exemplo, uma fração metoximetila.
Em algumas modalidades, R12 é metilamino.
Em outras modalidades, R12 é etilami- no.
Em ainda outras modalidades, R12 é aminoalquilaC 3. Em algumas modalidades, R12 é aminoalquilaC 4. Em ainda outras modalidades, R 12 é aminoalquilaC5. Em algumas outras modalidades, R 12 é aminoalquilaC . Em algumas modalidades, R 12 é aminoalquilaC . Em 6 7 algumas modalidades, R 12 é aminoalquilaC 8 . Em ainda outras modalidades, R12 é aminoal- quilaC9. Em algumas outras modalidades, R12 é aminoalquilaC10. Em ainda outras modali- dades, R12 é aminoalquilaC 11 . Em outras modalidades, R12 é aminoalquilaC 12 . Em algumas modalidades, a amino alquila é uma dimetilamino alquila.
Em ainda outras modalidades, R12 é acetila.
Em algumas outras modalidades, R12 é alquilcarbonila C2. Em algumas modalidades, R12 é alquila carbonila C3. Em ainda outras modalidades, R é alquilcarbonila C4 . Em algumas modalidades, R12 é alquila carbonila C5 . Em ainda outras modalidades, R12 é alquila carbonila C6 . Em algumas outras modalidades, R12 é alquila carbonila C7. Em algumas modalidades, R12 é alquilcarbonila C8 . Em ainda ou- tras modalidades, R12 é alquilcarbonila C9 . Em algumas outras modalidades, R12 é alquilcar- 5 bonila C 10 . Em algumas modalidades, R12 é alquilcarbonila C 11 . Em outras modalidades, R12 é alquilcarbonila C 12 . A alquilcarbonila é substituída com uma fração carbóxi, por exemplo, a alquilcarbonila é substituída para formar uma fração de ácido succínico (isto é, uma 3- carboxialquilcarbonila). Em outras modalidades, a alquilcarbonila é substituída com um gru- po -SH terminal.
Em algumas modalidades, R 12 é amidila.
Em algumas modalidades, a amidila com- preende uma fração alquila que é ainda substituída, por exemplo, com -SH, carbamato, ou combinações dos mesmos.
Em outras modalidades, a amidila é substituída com uma fração arila, por exemplo, fenila.
Em certas modalidades, R 12 pode ter a seguinte estrutura (IX):
(IX)
em que R 16 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaCrC 12 , alcóxiC 1-C 12 , -CN, arila ou heteroarila.
Em algumas modalidades, R 12 é metóxi.
Em outras modalidades, R 12 é etóxi.
Em ainda outras modalidades, R 12 é alcóxiC 3 . Em algumas modalidades, R12 é alcóxiC 4 . Em al- gumas modalidades, R12 é alcóxiC 5 . Em algumas outras modalidades, R 12 é alcóxiC 6 . Em outras modalidades, R 12 é alcóxiC7. Em algumas outras modalidades, R12 é alcóxiCs.
Em algumas modalidades, R 12 é alcóxiCg.
Em outras modalidades, R12 é alcóxiC10. Em algumas modalidades, R12 é alcóxiC 11 . Em ainda outras modalidades, R12 é alcóxiC 12 . Em certas modalidades, R12 é pirrolidinil, por exemplo, pirrolidin-1-il.
Em outras mo- dalidades, R 12 é piperidinil, por exemplo, piperidin-1-il ou piperidin-4-il.
Em outra modalidade, R 12 é morfolino, por exemplo, morfolin-4-il.
Em outras modalidades, R12 é fenila, e em ainda modalidades adicionaiss, a fenila é substituída, por exemplo, com um grupo nitro.
Em ainda outras modalidades, R12 é pirimidinil, por exemplo, pirimidin-2-il.
Em outras modalidades, R13 , R 14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemen- te alquil C1-C 12 . Em algumas modalidades, R 13 , R14 ou R15 é metila.
Em ainda outras modali- dades, R 13 , R 14 ou R 15 é etila.
Em outras modalidades, R13 , R14 ou R 15 é alquila C3 . Em ainda outras modalidades, R13 , R 14 ou R 15 é isopropila.
Em outras modalidades, R13 , R14 ou R15 é alquila C4 . Em algumas modalidades, R13 , R 14 ou R 15 é alquila C5 . Em algumas outras moda- lidades, R 13 , R14 ou R15 é alquila C5. Em outras modalidades, R 13 , R14 ou R15 é 15alquila C7.
Em ainda outras modalidades, R , R ou R é alquila C 8 . Em outras modalidades, R , R 13 14 15 ou R 15 é alquila C 9 . Em algumas modalidades, R , R ou R é alquil C 10 . Em algumas mo- 13 13 14 15 dalidades, R , R 14 ou R 15 é alquil C11. Em ainda outras modalidades, R , R ou R é alqui-
la C12- 12 5 Como notado acima, em algumas modalidades, R é amidila substituída com uma fração arila.
A este respeito, cada ocorrência de R 16 pode ser a mesma ou diferente.
Em 16 certas dessas modalidades, R é hidrogênio.
Em outras modalidades, R16 é -CN.
Em outras 16 modalidades, R é heteroarila, por exemplo, tretrazolil.
Em certas outras modalidades, R16 é 16 metóxi.
Em outras modalidades, R é arila, e a arila é opcionalmente substituída.
Substituin- 1O tes opcionais neste respeito incluem: alquilaCrC 12 , alcóxiC 1-C 12 , por exemplo, metóxi; triflu- ormetóxi; halo, por exemplo, cloro; e trifluormetila. 16 Em outras modalidades, R é metila.
Em ainda outras modalidades, R16 é etila.
Em 16 algumas modalidades, R é alquila C3. Em algumas outras modalidades, R16 é isopropila. 16 Em ainda outras modalidades, R é alquila C 4. Em outras modalidades, R 16 é alquila C 5. Em 16 16 ainda outras modalidades, R é alquila C 6. Em algumas outras modalidades, R é alquila 16 C 7. Em algumas modalidades, R é alquila C 8 . Em ainda outras modalidades, R 16 é alquila 16 C . E, algumas outras modalidades, R é alquila C . Em outras modalidades, R 16 é alquila 9 10 16 C 11 . ln some other embodiments, R is C12 alquil. 16 Em algumas modalidades, R é metóxi.
Em algumas modalidades, R16 é etóxi.
Em 16 ainda outras modalidades, R é alcóxi C 3. Em algumas outras modalidades, R16 é alcóxi C 4. 16 Em outras modalidades, R é alcóxi C 5. Em algumas outras modalidades, R 16 é alcóxi C 6. 16 Em ainda outras modalidades, R é alcóxi C7. Em algumas outras modalidades, R16 é alcóxi 16 C 8 . Em ainda outras modalidades, R é alcóxi C 9 . Em algumas outras modalidades, R16 é 16 alcóxi C 10 . Em algumas modalidades, R é alcóxi C 11 . Em algumas outras modalidades, R16 é alcóxi C12- Em algumas outras modalidades, R8 e R9 se unem para formar um crown éter de 12-18 membros.
Por exemplo, em algumas modalidades, o crown éter tem 18 membros, e em outras modalidades o crown éter tem 15 membros.
Em certas modalidades, R 8 e R 9 unem para formar um heterociclo tendo as seguintes estruturas (X) ou (XI):
(X) (XI) 8 9 3 10 Em algumas modalidades, R R ou R se unem com R para formar um heteroci- ,
3 clo de 5-7 membros.
Por exemplo, em algumas modalidades, R se unem com R 1 para for- º mar um heterociclo de 5-7 membros. Em algumas modalidades, o heterociclo tem 5 mem- bros. Em outras modalidades, o heterociclo tem 6 membros. Em outras modalidades, o hete- rociclo tem 7 membros. Em algumas modalidades, o heterociclo é representado pela seguin- te estrutura (XII): w 0,11 Z' I ' Py 3' Nl .rvvv\I\.
R12 1 5' 5 (XII) em Z' representa um heterociclo de 5-7 membros. Em certas modalidades da estru- tura (XI), R12 é hidrogênio em cada ocorrência. Por exemplo, ligação (8) pode ter uma das seguintes estruturas (81 ), (82) ou (83): (Bl) (B2) (B3) Em certas outras modalidades, R12 é alquilcarbonilaCrC 12 ou amidil que é ainda substituído com uma fração arilfosforila, por exemplo, uma fração trifenil fosforil. Exemplos de ligações tendo esta estrutura incluem 856 e 855. Em certa modalidade, ligação (8) não tem qualquer das estruturas A1-A5. Tabela 1 mostra ligações representativas do tipo (A) e (8). Tabela 1. Ligações lntersubunidades Representativas
No. Nome Estrutura o "'N--Py li / / '3' A! PMO º'l .,.,,,,,,,,. 1 5' o PMO~ (forma não 0N--uj HNV / '3• A2 protonada descrita) º'l .NVV\f<.
1 5' o 0N--Uj HNV o/ PMO+ '3· A3 2 (+) 'l """"""' 1 5' o 011 N--Py A4 PMOITl<'rir --Nv d '3· (m+) 'l"""""" 1 5' +NH 2 H2N__l(N o H 0 N--py li A5 PMOGUX Nv / '3· o º'l.,,,..,..,,,... 1 5'
No. Nome Estrutura Bl 82 --i-------1--------- 3' º~x ...; B3 u,.. p'-. /"')--..., 5' 84 PMOShc o li ~ __ P,/ morfolino PMO f -N f ,f' 3' B5 (m) ºV º'l
T 5' / o o __6 o li -D tri P,/ PMO N ,f' 3' B6 (t) ~ ~ 1 5' º""'
No. Nome Estrutura B7 (h) 5' 88 5' 89 5' o li
BIO (a)
H N 2 -D º'! N_P,( . I /'
T 3 5' o 0r li BI 1 PIV10pyr (p) o~N-1~3
T 5'
Nome l 1 No. Estrutura o J:J d o li B 12 PM011 Yr N NAf_ 3' (sal HCI) HCI 'j .,...,,,,.,,,.. 1 5' Bl3 Pl\llÜrba 0--Z: / oli N_P, / ' / 3' º'! JVVVV\.
1 5' : o ~li N_P, 814 PMOsha J I 'f 3· º'! JVVVV\, 1 5' o Bl5 PMOdimetilapn "' /
N J:J º'! Ili N-Py. 3' JVVVV\.
1 5' o ""---- í"N-Py li B 16 PM0"111ip Nv I '3· º'! ,f\N\/\/\, 1 5'
No. Nome Estrutura 5' Bl8 PMQPY•QM" 5' B19 5' 111 B20 PM0 " 5' ~li N.-P,/ B21 / 6-:: 3
T 5'
No. Nome Estrutura ~ ~ o B22 PMObi ' r .-;:;::::. o ~ --0N-Pyº'l Ili . . .
.J\JVVV\. 3· 1 5' B23 PMOpip o --0 N li N-r13' Ol o 1 5' B24 Pl\IIOº<lmb "a º"' ..-:::::. o ~ --0N-pyº'l o li I ... 3· ,,..,,,..,.,,., l 5' ~ --0N-pyº'l F3C'\._ o # o o B25 PMOUb I li . . . 3·
V ..--;::. ~ """"""' 1 5'
No. Nome Estrutura Cl o o li B26
N
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Nome Estrutura
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1 Nome 1 No. Estrutura .
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No. Nome Estrutura ;- oli B50 O º'] N_P,.( Ir 3·
T 5' B5t B52 CA =colato 5' B53 dCA = colato 5' B54 (g) 5'
No. Nome Estrutura o li ~ ~cN-1~3· ~ B55 PMO+tos ~ fi q ~ ~ B56 PMOnpnphos o-crN-0-1'1+ ~ ~ :::::::,,._ 5 o
H 5' 3 · Nas sequências e discussão que seguem, os nomes acima para as ligações são sempre usadas. Por exemplo, uma base compreendendo uma ligação PMOªPn é ilustrada como apns, onde B é uma base. Outras ligações são designadas similarmente. Em adição, 5 designações abreviadas podem ser usadas, por exemplo, as designações abreviadas em parênteses acima podem ser usadas (por exemplo, ªB, refere-se a apnB). Outras abreviações facilmente identificáveis podem também ser usadas. B. Oligômeros com Grupos Térmicos Modificados Como notado acima, a presente revelação também provê um oligômero compreen- 1O dendo grupos terminais modificados. Aplicantes têm encontrado que modificação do termi- nal 3' e/ou 5' do oligômero com várias frações químicas provê propriedades terapêuticas benéficas (por exemplo, distribuição celular aumentada, potência, e/ou distribuição tecidual etc) para os oligômeros. Em várias modalidades, os grupos terminais modificados compre- endem uma fração hidrofóbica, enquanto em outras modalidades os grupos terminais modi- ficados compreendem uma fração hidrofílica. Os grupos terminais modificados podem estar presentes com ou sem as ligações descritas acima. Por exemplo, em algumas modalidades, os oligômeros compreendem um ou mais grupos terminais modificados e ligações do tipo (A), por exemplo, ligações em que X é -N(CH 3 ) 2 . Em outras modalidades, os oligômeros compreendem um ou mais grupos terminais modificados e ligações do tipo (B), por exemplo, ligações em que X é 4-aminopiperidin-1-il (isto é, APN). Em ainda outras modalidades, os oligômeros compreendem um ou mais grupos terminais e uma mistura de ligações (A) e (B). Por exemplo, os oligômeros podem compreender um ou mais grupos terminais modificados (por exemplo, tritil ou trifenil acetil) e ligações em que X é -N(CH 3)2 e ligações em que X é 4- aminopiperidin-1-il.
Outras combinações dos grupos terminais modificados e ligações modi- 5 ficadas também prevêem propriedades terapêuticas favoráveis para os oligômeros.
Em uma modalidade, os oligômeros compreendendo modificações terminais têm a seguinte estrutura (XVII):
Terminal 5'
Terminal 3'
(XVII) * 5'terminus = terminal 5' 3' terminus =terminal 3' ou um sal ou isômero do mesmo, em que X , W e Y são como definido acima para qualquer das ligações (A) e (B) e: 17 R é, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio ou alquilaC 1-
18 19 R e R são, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio, um peptídeo penetrante celular, um aminoácido natural ou não natural, alquilcarbonilaCrC 30 , - C(=O)OR 21 ou R20 ; 20 R é, em cada ocorrência, independentemente guanidinila, heterociclila, alquilaC 1- C30, cicloalquilaC3-Ca; arilaC5-C30, alquilcarbonilC 3-C 30 , cicloalquilcarbonilaC 3-C 8, cicloalqui-
lalquilcarbonilaC 3 -C 8 , arilcarbonilaCrC 30 , aralquilcarbonilaCrC 30 , alquiloxicarbonilaCrC 30 , cicloalquiloxicarbonilaC 3-C 8 , ariloxicarbonilaCrC 30 , aralquiloxicarbonilC 8 -C 30 , ou P(=O)(R 22 )2; B é uma fração pareadora de base; 5 L 1 é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo liga- ções selecionadas a partir de alquila, hidroxila, alcóxi, alquilamino, amida, éster, dissulfeto, carbonila, carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina e fosfodiés- ter; e X é um número inteiro de O ou maior; e em que pelo menos um de R 18 ou R19 é R2º; e 18 19 em que pelo menos um de R ou R é R20 e provido que ambos de R 17 e R 18 não são ausentes.
Os oligômeros com grupos terminais modificados compreendem qualquer número de ligações dos tipos (A) e (B). Por exemplo, os oligômeros podem compreender somente ligação tipo (A). Por exemplo, X em cada ligação pode ser -N(CH 3 )2. Alternativamente, os oligômeros podem somente compreender ligação (B). Em certas modalidades, os oligôme- ros compreendem uma mistura de ligações (A) e (B), por exemplo, de 1 a 4 ligações do tipo (B) e as ligações remanescentes sendo do tipo (A). Ligações neste sentido incluem, mas não são limitados a, ligações em que X é aminopiperidinil para tipo (B) e dimetil amino para tipo (A). 17 Em algumas modalidades, R está ausente.
Em algumas modalidades, R 17 é hi- drogênio.
Em algumas modalidades, R 17 é alquilaC 1-C 6 . Em algumas modalidades, R 17 é 17 metila.
Em ainda outras modalidades, R é etila.
Em algumas modalidades, R 17 é alquila C 3 . 17 Em algumas outras modalidades, R é isopropila.
Em outras modalidades, R 17 é alquilaC 4 . Em ainda outras modalidades, R 17 é alquilaC 5 . Em algumas outras modalidades, R 17 é alqui- laCs.
Em outras modalidades, R 18 é um peptídeo penetrante celular como descrito em mais detalhes abaixo.
Em algumas modalidades, R 18 é um aminoácido natural ou não natu- ral, por exemplo, tirmetilglicina.
Em algumas modalidades, R 18 é R2 º.
Em outras modalidades, R19 está ausente.
Em algumas modalidades, R 19 é hidro- gênio.
Em algumas modalidades, R 19 é um peptídeo penetrante celular como descrito em mais detalhes abaixo.
Em algumas modalidades, R 19 é um aminoácido natural ou não natu- ral, por exemplo, trimetilglicina.
Em algumas modalidades, R 19 é -C(=O)OR 17 , por exemplo, R 19 pode ter a seguinte estrutura:
Em outras modalidades R 18 ou R 19 é alquilcarbonilaCrC 30 , por exemplo, - C(=O)(CH 2)nC0 2H, onde n é 1 a 6, por exemplo, 2. Em outros exemplos, R 18 ou R 19 é aceti- la.
Em algumas modalidades, R20 é, em cada ocorrência, independentemente guani- 5 dinila, heterociclila, alquila C 1-C 3o, cicloalquila C3-Ca; arila C5-C 30 , aralquila CrC 30 , alquilcar- bonila C 3-C 30 , cicloalquilcarbonila Cs-C 8, cicloalquilalquilcarbonil C 3-C 8, arilcarbonila C 6-C 30 , aralquilcarbonila CrC 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila Cs-Ca, ariloxicarbo- 21 nila CrC 30 , aralquiloxicarbonil C 8-C 30 , -C(=O)OR , ou -P(=O)(R 22 )2, em que R 21 é alquila Cr C30 compreendendo um ou mais frações oxigênio ou hidroxila ou combinações das mesmas 22 6 12 e cada R é arilóxi C -C . 19 18 Em certas outras modalidades, R é -C(=O)OR 21 e R é hidrogênio, guanidinila, he- terociclila, alquila CrC30, cicloalquila C 3-C 8; arila C6-C 30 , alquilcarbonila C 3-C 30 , cicloalquil- carbonila C3-Ca, cicloalquilalquilcarbonil C3-Ca, arilcarbonila CrC 30 , aralquilcarbonila CrC 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila C 3-C 8, ariloxicarbonila CrC 30 , aralquiloxicar- bonila Ca-C30, ou -P(=O)(R22 )2, em que cada R22 é arilóxi C6 -C 12 . 20 Em outras modalidades, R é, em cada ocorrência, independentemente guanidini- la, heterociclila, alquila C1-C30, cicloalquila C 3-Ca; arila C 6-C30, alquilcarbonila C 3-C 30 , cicloal- quilcarbonila C 3-C 8, cicloalquilalquilcarbonila Cs-C 8, arilcarbonila CrC 30 , aralquilcarbonila Cr C 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila C 3-C 8, ariloxicarbonila C 8-C 30 , aralqui- loxicarbonila C 8-C 30 , ou -P(=O)(R22 )2. Enquanto em outros exemplos, R20 é, em cada ocor- rência, independentemente guanidinila, heterociclila, alquila C 1-C 30 , cicloalquila C 3-C 8; arila C 1-C 30 , aralquila CrC 30 , cicloalquilcarbonila C3-Ca, cicloalquilalquilcarbonila C 3-C 8, arilcarbo- nila CrC 30 , aralquilacarbonila CrC 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila C 3-C 8, ariloxicarbonila CrC 30 , aralquiloxicarbonila C8-C 30 , ou -P(=O)(R 22 )2. Em algumas modalidades, R20 é guanidinila, por exemplo, mono metilguanidinila ou dimetilguanidinila.
Em outras modalidades, R 20 é heterociclila.
Por exemplo, em algumas modalidades, R2 é piperidin-2-ila.
Em algumas modalidades, a piperidin-4-ila é substituída º com grupo tritil ou Boc.
Em outras modalidades, R 20 é cicloalquilaCs-C 8. Em outras modali- dades, R 20 é arilaC5-C30. Em algumas modalidades, R 20 é arilcarbonilaCrC 30 . Por exemplo, em algumas mo- dalidades, R 20 tem a seguinte estrutura (XVIII):
o
R[~~f y'~ R23
(XVII1)
onde R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo alquila C 1-
C30 , alcóxi C1-C 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , aralquila CrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila ou heterociclalquila, e em que um R23 pode se unir com outro R23 para formar um anel hete- rociclila.
Em algumas modalidades, pelo menos um R23 é hidrogênio, por exemplo, em al- gumas modalidades, cada R23 é hidrogênio.
Em outras modalidades, pelo menos um R23 é alcóxiCrC 30 , por exemplo, em algumas modalidades, cada R23 é metóxi.
Em outras modali- dades, pelo menos um R23 é heteroarila, por exemplo, em algumas modalidades, pelo me- nos um R23 tem uma das seguintes estruturas (XVII la) de (XVlllb):
o or
(XVIJia) (XVIIlb)
Em ainda outras modalidades, um R23 se une com outra R23 para formar um anel 1O heterociclila.
Por exemplo, em uma modalidade R20 é 5-carboxifluoresceína.
Em outras modalidades, R20 é aralquilcarbonilaCrC 30 . Por exemplo, em várias mo- dalidades, R20 tem uma das seguintes estruturas (XIX), (XX) ou (XXI):
(XIX) (XX)
(X,'(l)
em que R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1-
C 30 , alcóxiC 1-C 30 , alquiloxicarbonilaCrC 30 , aralquilaCrC30, arila, heteroarila, heterociclila ou 23 heterociclalquila, em que um R23 pode se unir com outro R para formar um anel heterocicli- la.
X é -OH ou halo e m é um número inteiro de O a 6. Em algumas modalidades específi- cas, m é O.
Em outras modalidades, m é 1, enquanto em outras modalidades, m é 2. Em outras modalidades, pelo menos um R23 é hidrogênio, pro exemplo, em algumas modalida- des cada R23 é hidrogênio.
Em algumas modalidades, X é hidrogênio.
Em outras modalida- des, X é -OH.
Em outras modalidades, X é Cl.
Em outras modalidades, pelo menos um R 23 é alcóxiC 1-C 30 , por exemplo, metóxi.
Em ainda outras modalidades, R20 é aralquilaCrC 30 , pro exemplo, tritila.
Em outras 1O modalidades, R20 é metóxi tritil.
Em algumas modalidades, R20 tem a seguinte estrutura (XXII):
(XXII)
em que R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1- C30, aclóxiC 1-C30, alquiloxicarbonilaC1-C30, aralquilaCrC30, arila, heteroarila, heterociclila ou heterociclalquila, e em que um R23 pode se unir com outro R23 para formar um anel heteroci- clila.
Por exemplo, em algumas modalidades cada R23 é hidrogênio.
Em outras modalidades, pelo menos um R23 é alcóxiC 1-C 30 , por exemplo, metóxi.
Em ainda outras modalidades, R20 é aralquilaCrC 30 e R20 tem a seguinte estrutura (XXII!):
(XXlll) Em algumas modalidades, pelo menos um R23 é halo, por exemplo, cloro.
Em al- gumas outras modalidades, um R23 é cloro na posição para.
Em outras modalidades, R20 é alquilaC 1-C 30 . Por exemplo, em algumas modalida- des, R20 é uma alquilaC 4 -C 20 e opcionalmente compreende uma ou mais ligações duplas.
Por exemplo, em algumas modalidades, R20 é uma alquilaC 4 -C 10 compreendendo uma liga- ção tripla, por exemplo, uma ligação tripla terminal.
Em algumas modalidades, R20 é hexin-6- ila.
Em algumas modalidades, R2 tem uma das seguintes estruturas (XXIV), (XXV), (XXVI) º ou (XXVll):
(XXIV) (XXV) (XXVI) (XXVII)
Em ainda outras modalidades, R20 é uma alquilcarbonilaC 3-C 30 , por exemplo, uma alquilacarbonila C 3-C 30 . Em algumas modalidades, R20 é -C(=O)(CH 2)pSH ou - C(=O)(CH2)pSSHet, em que p é um número inteiro a partir de 1 a 6 e Het é uma heteroarila.
Por exemplo, p pode ser 1 ou p pode ser 2. Em outro exemplo Het é piridinila, por exemplo, 1O piridin-2-ila.
Em outras modalidades, a alquilcarbonilaC 3-C 30 é substituída com um oligômero adicional, por exemplo, em algumas modalidades o oligômero compreende uma alquilcarbo- nilaC3-C30 na posição 3' que liga o oligômero a posição 3' do outro oligômero.
Tais modifica- ções terminais são incluídas dentro do objetivo da presente revelação.
Em outras modalidades, R20 é alquilcarbonila C 3-C 30 que é ainda substituído com uma fração arilfosforila, por exemplo, trifenil fosforila.
Exemplos de tais grupos R2º incluem estrutura 33 na Tabela 2. 20 Em outros exemplos, R é cicloalquilcarbonila C3-C 8 , por exemplo, alquilcarboni- 20 laC5-C7. Nessas modalidades, R tem a seguinte estrutura (XXVlll):
(XXVIII)
em que R 23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1- C30, alcóxiC 1-C 30 , alquiloxicarbonilaC 1-C 30 , aralquilaCrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila ou 23 23 heterociclalquila, e em que um R pode se unir com outro R para formar um anel heteroci- clila.
Em algumas modalidades, R 23 é heterociclilalquila, por exemplo, em algumas modali- 23 dades R tem a seguinte estrutura:
o o Em algumas outras modalidades, R 20 é cicloalquilalquilcarbonila C 3-C 8. Em outras modalidades, R20 é alquiloxicarbonilaCrC 30 . Em outras modalidades, R20 é cicloalquiloxi- 20 carbonilaC3-C8. Em outras modalidades, R é ariloxicarbonilaCrC 30 . Em outras modalida- 1O des, R2 é aralquiloxicarbonilaC 8-C 30 . Em outras modalidades, R 20 é -P(=O)(R22)z, em que º cada R 22 é arilóxiC 6 -C 12 , por exemplo, em algumas modalidades R 20 tem a seguinte estrutura (C24):
Q~P O-P-0 1 ""'! (C24) 20 Em outras modalidades, R compreende um ou mais átomos halo.
Por exemplo, em algumas modalidades R2 compreende um análogo perflúor de qualquer das frações R20 º acima.
Em outras modalidades, R20 é p-trifluormetilfenila, trifluormetiltritila, perfluorpentila ou pentafluorfenila.
Em algumas modalidades o terminal 3' compreende uma modificação e em outras modalidades o terminal 5' compreende uma modificação.
Consequentemente, em algumas 19 20 modalidades, R 18 está ausente e R é R . Em outras modalidades, R 19 está ausente e R 18 é 18 R2º.
Em ainda outras modalidades, R e R 19 são cada R2º.
Em algumas modalidades, o oligômero compreende um peptídeo penetrante celular em adição a uma modificação 3' ou 5'. Consequentemente, em algumas modalidades R19 é 18 20 18 um peptídeo penetrante celular e R é R . Em outras modalidades, R é um peptídeo pe- netrante celular e R 19 é R2º.
Em modalidades adicionais dos antecedentes, o peptídeo pene- trante celular é um peptídeo rico em arginina.
Em algumas modalidades, o ligador L1 que liga o grupo terminal 5' (isto é, R 19 ) ao oligômero pode ser presente ou ausente.
O ligador compreende qualquer número dos gru-
pos funcionais e comprimentos proveram que o ligador retenha sua habilidade em ligar ao grupo terminal 5' para o oligômero e provido que o ligador não interfere com a habilidade do oligômero a uma sequência alvo em uma maneira de sequência específica. Em uma moda- lidade, L compreende ligações fosforodiamidato e piperazina. Por exemplo, em algumas modalidades L tem a seguinte estrutura (XXIX): x/R24 () ~ \ N-P=O / 1 º'l
T (XXIX) 24 em que R 24 está ausente, hidrogênio ou alquilaC 1-C 6. Em algumas modalidades, R está ausente. Em algumas modalidades, R 24 é hidrogênio. Em algumas modalidades, R 24 é alquilaC1-C 6. Em algumas modalidades, R 24 é metila. Em outras modalidades, R 24 é etila. 1O Em ainda outras modalidades, R 24 é alquilaC3. Em algumas outras modalidades, R 24 é iso- 24 propila. Em ainda outras modalidades, R24 é alquilaC 4. Em algumas modalidades, R é al- quilaC5. Em ainda outras modalidades, R 24 é alquilaC 6. Em ainda outras modalidades, R 20 é alquilcarbonilaC 3-C 30 , e R 20 tem a seguinte es- trutura (XXX): (XXX) em que R25 é hidrogênio ou -SR 26 , em que R26 é hidrogênio, alquilaCrC 30 , hetero- ciclila, arila ou heteroarila, e q é um número inteiro a partir de O a 6. Em modalidades adicionais de qualquer dos acima, R 23 é, em cada ocorrência, in- dependentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1-C 30 , alcóxiCrC 30 , arila, heteroarila, heterocicli- ela ou heterociclalquila. Em algumas outras modalidades, somente o terminal 3' do oligômero é conjugado a um dos grupos notados acima. Em algumas outras modalidades, somente o terminal 5' do oligômero é conjugado a um dos grupos notados acima. Em outras modalidades, ambos os terminais 3 e 5' compreendem um dos grupos notados acima. O grupo terminal pode ser selecionado a partir de um dos grupos notados acima ou qualquer dos grupos específicos ilustrados na Tabela 2.
Tabela 2. Grupos Terminais Representativos
No.
Nome Estrutura o
C1 Trimetoxibenzoila
C2 9-flúor-carboxila o
C3 4-carbazolylbenzoyl o
C4 4-indazolilonabenzoila
CH3 CH3
H3C ~ cs Farnesila """""'" 1 CH3 CH 3 CH3
No.
Nome Estrutura
C6 geranil
C7 Fenila
C8 Difenilacetila
C9 Clorodifenilacetila l
C 1O Hidroxidifenilacetila
Cll Trifenilpropionila
No.
Nome Estrutura
C12 Trifenilpropila
C 13 Trifenilacetila
C 14 Tritila (Tr)
Metoxitritila (Me- Cl5 OTr)
"---o o
Cl6 Metilsuccinimidil-
cicloexoila çl° o '/-
No. Nome Estrutura o CI7 Tioacetila HsJ;, o C18 COCH2CH2SSPy Us's~Á
H Cl9 Guanidinila H 2 Nl(I-
NH 1 o C20 Trimetilglicina /N()l;, C21 Lauroil ~Á 10 Trietilenoglicoloila o C?! (EG3) Ho~o~º~o)L/, o C23 Succinicacetila HO~/_ o C24 Difenilfosforila Q op O-P-0 li 1 'VVINV' o\ 1 C25 Piperidin-4-ila
HN
No. Nome Estrutura C26 Tritilpiperidin-4-ila º\; C27 Boc-Piperidin-4-ila C28 Hexin-6-ila o C29 5-carboxifluoresceína
HO C30 benzidrila
No. Nome Estrutura ~ 1 ~ )zÇ C31 p-Clorobenzidrila ~ 1 ~
CI
HNI ~Ny( C32 Piperazinila (pip) C33 Trifenilfos Qo 1 # f ' 2 o ÚNH o C34 Dimerizado ollgo~N H ~/ Oligo =um oligômero adicional
1. Peptídeos Transportadores Em algumas modalidades, o oligômero sujeito é conjugado a uma fração do peptí- deo transportador, por exemplo, uma fração do peptídeo transportador penetrante celular, que é efetivo para aumentar transporte do oligômero em células. Por exemplo, em algumas modalidades a fração do peptídeo transportador é um peptídeo rico em arginina. Em moda- lidades adicionais, a fração transportadora é ligada a ou terminal 5' ou 3' do oligômero, co- mo mostrado, por exemplo, na Figura 1C. Quanto tal peptídeo é conjugado aos terminais, os terminais opostos são então disponíveis para conjugação adicional a um grupo terminal mo- 1O dificado como aqui descrito. Em algumas modalidades dos antecedentes, a fração do peptídeo transportador compreende 6 a 16 subunidades selecionadas a partir das subunidades X', subunidades Y' e subunidades Z', onde (a) cada subunidade X' independentemente representa lisina, arginina ou um aná-
logo de arginina, o referido análogo sendo a-aminoácido catiônico compreendendo uma ca- deia lateral da estrutura R33 N=C(NH 2)R 34 , onde R33 é H ou R; R34 é R35 , NH2, NHR ou NR34 , onde R35 é alquila inferior ou alquenila inferior e pode ainda incluir oxigênio ou nitrogênio; R33 e R34 podem juntos formar um anel; e a cadeia lateral é ligada ao referido aminoácido através de R33 ou R34 · ' (b) cada subunidade Y' independentemente representa um aminoácido neutro - C(O)-(CHR)n-NH-, onde n é 2 a 7 e cada R é independentemente H ou metila; e (c) cada subunidade Z' independentemente representa um a-aminoácido tendo uma cadeia lateral aralquila neutra; 1O em que o peptídeo compreende uma sequência representada por um de (X'Y'X')p. (X'Y')m. e (X'Z'Z')p. onde p é 2 a 5 e m é 2 a 8. Em modalidades selecionadas, para cada X', a fração da cadeia lateral é guanidila, como na subunidade aminoácida arginina (Arg). Em modalidades adicionais, cada Y' é -CO- (CH2)n-CHR-NH-, onde n é 3 a 7 e R é H.
Por exemplo, quando n é 5 e R é H, Y' é uma su- bunidade do ácido 6-aminoexanóico, abreviado aqui como Ahx; quando n é 2 e R é H; Y' é uma subunidade 13-alanina.
Em certas modalidades, peptídeos deste tipo incluem aqueles compreendendo dí- meros de arginina alternando com subunidades Y' únicas, onde Y' é Ahx.
Exemplos incluem peptídeos tendo a fórmula (RY'R)p ou a fórmula (RRY')p, onde Y' é Ahx.
Em uma modalida- de, Y' é uma subunidade do ácido 6-aminoexanóico, Ré arginina e p é 4. Em uma modalidade adicional, cada Z' é fenilalanina, e m é 3 ou 4. Em algumas modalidades, o peptídeo conjugado está ligado a um terminal do oli- gômero através de um ligador Ahx-8, onde Ahx é uma subunidade do ácido 6- aminoexanóico e B é uma subunidade 13-alanina.
Em modalidades selecionadas, para cada X', a fração de cadeia lateral é indepen- dentemente selecionada a partir do grupo consistindo de guanidil (HN=C(NH 2)NH-), amidinil (HN=C(NH 2)C-), 2-aminodiidropirimidil, 2-aminotetraidropirimidil, 2-aminopiridinil, e 2- ami- nopirimidonil, e é preferivelmente selecionado a partir de guanidil e amidinil.
Em uma moda- lidade, a fração de cadeia lateral é guanidil, como na subunidade aminoácida arginina (Arg). Em algumas modalidades, as subunidades Y' são ou contíguas, em que nenhuma subunidade X' intervém nas subunidades Y', ou intercala sozinha entre as subunidades X'. Entretanto, em algumas modalidades a subunidade ligadora pode estar entre as subunida- des Y'. Em uma modalidade, as subunidades Y' estão em um terminal do peptídeo transpor- tador; em outras modalidades, eles são flaqueados por subunidades X'. Em modalidades adicionais, cada Y' é -CO-(CH 2)n-CHR-NH-, onde n é 2 a 7 e R é H.
Por exemplo, quando n é 5 e R é H, Y' é uma subunidade de ácido 6-aminoexanóico, abreviado aqui como Ahx.
Em modalidades selecionadas deste grupo, cada X' compreende uma fração de cadeia lateral guanidil, como na subunidade arginina.
Peptídeos exemplares deste tipo incluem aqueles compreendendo dímeros de arginina alternando com subunidades Y' únicas, onde Y' é pre- ferivelmente Ahx.
Exemplos incluem peptídeos tendo a fórmula (RY'R)4 ou a fórmula (RRY')4, onde Y' é preferivelmente Ahx.
Em algumas modalidades, o análogo do ácido nu- 5 cléico é ligado a uma subunidade Y' terminal, preferivelmente no terminal C, como mostra- do, por exemploo, na Figura 1C.
Em outras modalidades, o ligador é de estrutura AhxB, on- de Ahx é uma subunidade ácido 6-aminoexanóico e B é uma subunidade 13-alanina.
As frações do peptídeo de transporte como descrito acima têm sido mostradas grandemente aumentar a entrada na célula de oligômeros ligados, relativo a captação do 1O oligômero na ausência da fração de transporte ligada, e relativo a captação por uma fração de transporte ligada faltando as subunidades Y' hidrofóbicas.
Tal captação aumentada pode ser evidenciada por pelo menos um aumento de duas vezes, ou em outras modalidades um aumento de quatro vezes, na captação do composto em células mamíferas relativo a capta- ção do agente por uma fração de transporte ligada faltando as subunidades Y' hidrofóbicas.
Em algumas modalidades, captação é aumentada pelo menos vinte vezes ou pelo menos quarenta vezes, relativo ao composto não conjugado.
Um benefício adicional da fração do peptídeo transporte é sua habilidade esperada para estabilizar um duplex entre um oligômero antisenso e sua sequência de ácido nucléico alvo.
Enquanto não desejando estar ligado por teoria, esta habilidade para estabilizar um duplex pode resultar de interação eletrostática entre a fração de transporte positivamente carregada e o ácido nucléico negativamente carregado.
Em algumas modalidades, o núme- ro de subunidades carregadas no transportador é menor que 14, como notado acima, ou em outras modalidades entre 8 e 11, desde que um número muito alto de subunidades carrega- das pode levar a ma redução na especificidade da sequência.
Peptídeos transportadores penetrantes de célula ricos em arginina exemplares compreendendo ligadores (B ou AhxB) são dados abaixo na Tabela 3: Tabela 3: Peptídeos Transportadores Penetrantes de Célula Ricos em Arginina
Nome (Designação) Sequência SEQID NO.ª rTAT RRRQRRKKR 56 Tat RKKRRQRRR 57 R9F2 RRRRRRRRRFF 58 RsF2R.i RRRRRFFRRRR 59 R11 RRRR 60 Rs RRRRR 61 R6 RRRRRR 62 R1 RRRRRRR 63 Rs RRRRRRRR 64 R9 RRRRRRRRR 65 (RAhxR).,; (P007) RAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 66 (RAhxR)s; (CP04057) RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 67 (R.AhxRRBR)2; (CP06062) RAhxRRBRRAhxRRBR 68 (RA.R)4F2 RARRARRARRARFFC 69 (RGR)4f2 RGRRGRRGRRGRFFC 70 ªSequências designadas para SEQ 10 NOs não incluem a porção ligadora (por exemplo, C, G, Ahx, B, AhxB onde Ahx e B referem-se a ácido 6-aminoexanóico e beta- alanina, respectivamente). 5 C. Propriedadades dos Oligômeros Como notado acima, a presente revelação é direcionada ao oligômero compreen- dendo várias modificações que dão propriedades desejáveis (por exemplo, atividade anti- senso aumentada) aos oligômeros. Em certas modalidades, o oligômero compreende uma estrutura compreendendo uma sequência de estruturas de anel morfolino unidas por liga- 1O ções intersubunidades, as ligações intersubunidades unindo uma terminação 3' de uma es- trutura de anel morfolino a uma terminação 5' de uma estrutura de anel morfolino adjacente, em que cada estrutura de anel morfolino está ligada a uma fração pareadora de base, tal que o oligômero pode ser ligar em uma forma sequência-específica a um ácido nucléico al- vo. As estruturas do anel morfolino podem ter a seguinte estrutura (i): 5')\~0)Pi
N ~ 1 3' (i) em que B é, em cada ocorrência, independentemente uma fração pareadora de ba- se. Cada estrutura de anel morfolino sustenta uma fração pareadora de base (Pi), para formar uma sequência de frações pareadoras de base que é tipicamente designada para hibridizar a um alvo antisenso selecionado em uma célula ou em um paciente sendo tratado.
A fração pareadora de base pode ser uma purina ou pirimidina encontrada em DNA ou RNA nativo (A, G, C, T ou U) ou um análogo, tal como hipoxantina (o componente base do nu- cleosídeo inosina) ou 5-metil citosina.
Bases análogas que conferem afinidade de ligação melhorada para o oligômero podem também ser utilizadas.
Análogos exemplares neste sen- tido incluem C5-propinil-pirimidinas modificadas, 9-(aminoetóxi)fenoxazina (G-clamp) e se- melhantes.
Como notado acima, o oligômero pode ser modificado, em acordo com um aspecto da invenção, para incluir uma ou mais ligações (B), por exemplo, até cerca de 1 por cada 2- 5 ligações não carregadas, tipicamente 3-5 por cada 1O ligações não carregadas.
Certas 1O modalidades também incluem uma ou mais ligações do tipo (B). Ótimo melhoramento na atividade antisenso é visto onde até cerca de metade das ligações estruturas são tipo (B). Algum, mas não aumento máximo é tipicamente visto com um número pequeno, por exem- plo, 10-20% de ligações (B). Em uma modalidade, os tipos de ligações (A) e (B) são intercalados ao longo da es- trutura.
Em algumas modalidades, o oligômero não tem um padrão rigorosamente alternante de ligações (A) e (B) ao longo de seu comprimento total.
Os oligômeros podem opcional- mente compreender uma modificação 5' e/ou 3' como descrito acima.
Também considerado são oligômeros tendo blocos de ligações (A) e blocos de liga- ções (A); por exemplo, um bloco central de ligações (A) pode ser flanqueado por blocos de ligações (B), ou vice versa.
Em uma modalidade, o oligômero tem aproximadamente com- primento 5'igual, 3; e regiões centrais, e a porcentagem de ligações (B) ou (A) na região central é maior que cerca de 50%, ou maior que cerca de 70%. Oligômeros para uso em aplicações antisenso geralmente variam em comprimento de cerca de 1O a cerca de 40 su- bunidades, mais preferivelmente cerca de 15 a 25 subunidades.
Por exemplo, um oligômero da invenção tendo 19-20 subunidades, um comprimento útil para um oligômero antisenso, pode idealmente ter dois a sete, por exemplo, quato a seis, ou três a cinco ligações (B), e o remanescente de ligações (A). Um oligômero tendo 14-15 subunidades pode idealmente ter dois a cinco, por exemplo, 3 ou 4, ligações (B) e as ligações remanescentes (A). As subunidades morfolinas podem também estar ligadas por ligações intersubuni- dades baseadas em não fósforo, como descrito ainda abaixo, onde pelo menos uma ligação é ligação (B). Outras ligações análogas oligonucleotídicas que são não carregadas em seu esta- do não modificado, mas que podem também ter um substituinte amina pendente podem também ser usadas.
Por exemplo, um átomo 5'nitrogênio em um anel morfolino pode ser epregado em uma ligação sulfamida (ou uma ligação uréia, onde fósforo é substituído com carbono ou enxofre, respectivamente). Em algumas modalidades, para aplicações antisenso, o oligômero pode ter 100%
de complementaridade à sequência de ácido nucléico alvo, ou ele pode incluir má combina- ções, por exemplo, para acomodar variantes, já que um heteroduplex formado entre o oli- gômero e a sequência de ácido nucléico alvo é suficientemente estável para resistir a ação das nucleases celulares e outros modos de degradação que podem ocorrer in vivo.
Más 5 combinações, se presentes, são menos desestabilizantes para as regiões terminais do du- plex híbrido que no meio.
O número de más combinações permitidas dependerá do compri- mento do oligômero, a procentagem de pares de base G:C no duplex, e a posição das más combinações no duplex, de acordo com os princípios bem entendidos da estabilidade du- plex.
Embora TAM um oligômero antisenso não é necessariamente 100% complementar a 1O sequência do ácido nucléico alvo, ela é efetiva para estabilizar e especificamente ligar a se- quência alvo, tal que uma atividade biológica do ácido nucléico alvo, por exemplo, expres- são da(s) proteína(s) codificada(s) é modulada.
A estabilidade do duplex formado entre um oligômero e a sequência alvo é uma função da ligação Tm e a susceptibilidade do duplex para clivagem enzimática celular.
A Tm de um composto antisenso com respeito a sequência RNA complementar pode ser medida por métodos convencionais, tal como aqueles descritos por Hames et ai, Nucleic Acid Hybri- dization, IRL Press, 1985, pp. 107-108 ou com descrito em Miyada C.G. e Wallace R.B., 1987, Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymo/. Vo. 154, pp. 94-107. Em alguams modalidades, cada oligômero antisenso tem uma Tm de ligação, com respeito a uma sequência RNA complementar, de maior que a temperatura corporal ou em outras modalidades maior que 50° C.
Em outras modalidades Tm's estão na variação de 60- 800 C ou mais.
De acordo com princípios bem conhecidos, a Tm de um composto oligômero, com respeito a um RNA baseado em complementaridade híbrido, pode ser aumentado por aumento da proporção de bases pareadas C:G no duplex, e/ou aumento no comprimento (em pares de base) do heteroduplex.
Ao mesmo tempo, para propósitos de otimização de captação celular, ele pode ser vantajoso para limitar o tamanho do oligômero.
Por esta ra- zão, compostos que mostram alta Tm (50° C ou maior) em um comprimento de 20 bases ou menos são geralmente preferidos sobre aqueles requerendo mais que 20 bases para valo- res de Tm altas.
Para algumas aplicações, oligômeros maiores, por exemplo, maiores que 20 bases podem ter certas vantagens.
Por exemplo, em certas modalidades, oligômeros mais longos pode encontrar particular utilidade para uso em pular éxon ou modulação splice.
As bases de sequência alvo podem ser bases DNA normais ou análogas das mes- mas, por exemplo, uracila e inosina que são capazes de parear base de Watson-Crick às bases de RNA da sequência alvo.
Os oligômeros podem também incorporar bases guanidina no lugar de adenina quando o nucleotídeo alvo é um resíduo uracil.
Isto é útil quando a sequência alvo varia através de diferentes espécies de vírus e a variação em qualquer resíduo nucleotídeo dado é ou citosina ou uracila.
Utilizando guanina no oligômero alvo na posição de variabilidade, a habilidade bem conhecida de guanina para par de base com uracil (denominada pareamen- te de base C/U:G) pode ser explorada.
Por incorporação de guanina nessas localizações, um oligômero único pode efetivamente ter como alvo uma variedade maior de variabilidade 5 de RNA alvo.
Os compostos (por exemplo, oligômeros, ligações intersubunidades, grupos termi- nais) podem existir em diferentes formas isoméricas, por exemplo, isômeros estruturais (por exemplo, tautômeros). Com respeito aos esteroisômeros, os compostos podem ter centros quirais e podem ocorrer como racematos, misturas enantiomericamente enriquecidas, enan- 1O tiômeros individuais, misturas ou diastereômeros ou diastereômeros individuais.
Todas tais formas isoméricas são inclusas dentro da presente invenção, incluindo misturas das mes- mas.
Os compostos podem também possuir quiralidade axial que pode resultar em atropoi- sômeros.
Além disso, algumas das formas cristalinas dos compostos podem existir como polimorfos, que são inclusos na presente invenção.
Em adição, alguns dos compostos po- dem também formar solvatos com água ou outros solventes orgânicos.
Tais solvatos são similarmente inclusos dentro do objetivo desta invenção.
Os oligômeros descritos aqui podem ser usados em métodos de inibição da produ- ção de uma proteína ou replicação de um vírus.
Consequentemente, em uma modalidade um ácido nucléico codificando tal uma proteína é exposto a um oligômero como aqui revela- do.
Em modalidades adicionais dos antecedentes, o oligômero antisenso compreende ou um grupo terminal 5'ou 3' modificado ou combinações do mesmo, como aqui revelado, e as frações pareadoras de base B formam uma sequência efetiva para hibridizar a uma porção do ácido niucléico em uma localização efetiva para inibir a produção da proteína.
Em uma modalidade, a localização é uma região códon de parte ATG de um mRNA, um sítio splice de um pré-mRNA, ou uma sequência alvo virai como descrito abaixo.
Em uma modalidade, o oligômero tem uma Tm com respeito a ligação à sequência alvo de maior que cerca de 50oC, e é captado por células mamíferas ou células bacterianas.
Em outra modalidade, o oligômero pode ser conjugado a uma fração transporte, por exem- . pio, um peptídeo rico em arginina, como aqui descrito para facilitar tal captação.
Em outra modalidade, as modificações terminais descritas aqui podem funcionar como uma fração transporte para facilitar a captação por células mamíferas e/ou bacterianas.
A preparação e propriedades dos oligômeros morfolino são descritas em mais deta- lhes abaixo e na Patente dos EUA No. 5.185.444 e W0/2009/064471, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
D.
Formulação e Administração dos Oligômeros A presente revelação também provê para formulação e distribuição do oligômero revelado.
Consequentemente, em uma modalidade a presente revelação é direcionada a uma composição compreendendo um oligômero como aqui revelado e um veículo farmaceu- ticamente aceitável.
Distribuição efetiva do oligômero antisenso ao ácido nucléico alvo é um importante aspecto de tratamento.
Rotas de distribuição do oligômero antisenso incluem, mas não são 5 limitadas a várias vias sistêmicas, incluindo vias oral e parenteral, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, e intramuscular, bem como distribuição por inalação, transdér- mica e tópica.
A via apropriada pode ser determinada por um dos versados na técnica, co- mo apropriado à condição do paciente sobre tratamento.
Por exemplo, uma via apropriada para distribuição de um oligômero antisenso no tratamento de uma infecção virai da pele é 1O distribuição tópica, enquanto a distribuição de um oligômero antisenso para o tratamento de uma infecção respiratória virai é por inalação.
O oligômero pode também ser distribuído dire- tamente para o sítio de infecção virai, ou para a corrente sanguínea.
O oligômero antisenso pode ser administrado em qualquer veículo conveniente que é fisiologicamente e/ou farmaceuticamente aceitável.
Tal uma composição pode incluir qual- quer de uma variedade de veículos farmaceuticamente aceitáveis empregados por aqueles versados na técnica.
Exemplos incluem, mas não são limitados a, slaina, salina tamponada com fosfotao (PBS), água, etanol aquoso, emulsões, tais como emulsões óleo/água ou emulsões triglicerídeo, comprimidos e cápsulas.
A escolha de veículo fisiologicamente acei- tável adequado variará dependente do modo escolhido de administração.
Os compostos (por exemplo, oligômeros) da presente invenção podem ser geral- mente utilizados como o ácido livre ou base livre.
Alternativamente, os compostos desta in- venção podem ser usados na forma de sais de adição ácida ou básica.
Sais de adição ácida dos compostos livres de amino da presente invenção podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica, e podem ser formados a partir dos ácidos orgânicos e inorgâni- cos.
Ácidos orgânicos adequados incluem ácidos maléico, fumárico, ascórbico, succínico, metanosulfônico, acético, trifluoracético, oxálico, propiônico, tartárico, salicílico, cítrico, glu- tônico, lático, mandélico, cinâmico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutâmico, e benzenosulfônico.
Ácidos inorgânicos adequados incluem ácidos clorídrico, bromídrico, sul- fúrico, fosfórico e nítrico.
Sais de adição básica incluíram aqueles sais que formam com o ânion carboxilato e incluem sais formados com cátions orgânicos e inorgânicos tais como aqueles escolhidos a partir de metais alcalinos e alcalinos terrosos (por exemplo, lítio, sódio, potássio, magnésio, bário e cálcio), bem como o íon magnésio e derivados substituídos do mesmo (por exemplo, dibenzilamônio, benzilamônio, 2-hidroxietilamônio, e semelhantes). Então, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" de estrutura (1) é tencionado compreender qualquer e todas as formas de sal aceitáveis.
Em adição, pró-drogas são também inclusas dentro do contexto desta invenção.
Pró-drogas são covalentemente veículos ligados que liberam um composto da estrutura (1)
in vivo quando pró-droga é administrada a um paciente.
Pró-drogas são geralmente prepa- radas por modificação dos grupos funcionais em uma forma tal que a modificação é clivada, ou por manipulação de rotina ou in vivo, produzindo o composto parente.
Pró-drogas são ligadas a qualquer grupo que, quando administrado a um paciente, cliva para formar os gru- 5 pos hdróxi, amina ou sulfidrila.
Então, exemplos representativos das pró-drogas incluem (mas não são limitados a) derivados acetato, formato e benzoato do álcool e grupos funcio- nais amina dos compostos de estrutura (1). Ainda, no caso de um ácido carboxílico (-COOH), ésteres podem ser empregados, tais como meti! ésteres, etil ésteres e semelhantes.
Em algumas modalidades, lipossomas podem ser empregados para facilitar a cap- tação do oligonucleotídeo antisenso em células (Ver, por exemplo, Williams, S.A., Leukemia 10(12): 1980-1989, 1996; Lappalainen et ai., Antivirai Res. 23:119, 1994; Uhlmann et ai., antisense oligonucleotides: a new therapeutic principie, Chemical Reviews, Volume 90, No. 4, páginas 544-584, 1990; Gregoriadis, G., Capítulo 14, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341, Academic Press, 1979). Hidrogéis podem também ser usados como veículos para administração do oligômero antisenso, por exemplo, como descrito em WO 93/01286. Alternativamente, os oligonucleotídeos podem ser administrados em micros- feras ou micropartículas. (Ver, por exemplo, Wu, G.Y. e Wu, C.H., J.
Biol.
Chem. 262:4429- 4432, 1987). Alternativamente, o uso de microbolhas enchidas de gás complexadas com os oligômeros antisenso pode aumentar a distribuição aos tecidos alvos, como descrito na Pa- tente dos EUA No. 6.245.747. Composições de liberação controlada podem também ser usadas.
Essas podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis não forma de artigos moldados tais como filmes ou microcápsulas.
Em uma modalidade, inibição antisenso é efetiva em tratar infecção de um animal hospedeiro por um vírus, por contato de uma célula infectada com o vírus com um agente antisenso efetivo para inibir a replicação do vírus específico.
O agente antisenso é adminis- trados a um paciente mamífero, por exemplo, humano ou animal doméstico, infectado com um dado vírus, em um veículo farmaceuticamente aceitávei.
É contemplado que o oligonu- cleotídeo antisenso interrompe o crescimento do RNA virai no hospedeiro.
O RNA virai pode ser diminuído em número ou eliminado com pouco ou nenhum efeito deletério no crescimen- to normal ou desenvolvimento do hospedeiro.
Em um aspecto do método, o paciente é um paciente humano, por exemplo, um paciente diagnosticado como tendo uma infecção virai localizada ou sistêmica.
A condição de um paciente pode também ditar administração profilática de um oligômero antisenso da invenção; por exemplo, no caso de um paciente que (1) é imunocomprometido; (2) é uma vítima de queimadura; (3) tem um catéter residente; ou (4) está perto de passar ou tenha recentemente passar por cirurgia.
Em uma modalidade preferida, o oligômero é um oligô- mero morfolino fosforodiamidato, contido em um veículo farmaceuticamente aceitável, e é oralmente distribuído.
Em outra modalidade preferida, o oligômero é um oligômero morfolino fosforodiamidato, contido em um veículo farmaceuticamente aceitável, e é distribuído intra- venosamente (i.v.). Em outra aplicação do método, o paciente é um animal de fazenda, por exemplo, uma galinha, peru, porco, vaca ou cabra etc, e o tratamento é ou profilático ou terapêutico.
A invenção também inclui composição de alimento de um animal de fazenda e aves domésti- cas contendo um grão alimentício suplementado com uma quantidade subterapêutica de um composto antisenso antivirai do tipo descrito acima.
Também contemplado é, em um método de alimentar animal de fazenda e aves domésticas com um grão alimentício suplementado 1O com níveis subterapêuticos de um antivirai, um melhoramento em que o grão alimentício é suplementado com uma quantidade subterapêutica da composição oligonucleotídica antivirai como descrita acima.
Em uma modalidade, o composto antisenso é administrado em uma quantidade e forma efetiva para resultar em um pico de concentração sanguínea de pelo menos 200-400 nM de oligômero antisenso.
Tipicamente, uma ou mais doses de oligômero antisenso são administradas, geralmente em intervalos regulares, por um período de cerca de uma a duas semanas.
Doses preferidas para administração oral são de cerca de 1-1000 mg de oligôme- ro por 70 kg.
Em alguns casos, doses de mais que 1000 mg oligômero/paciente podem ser necessárias.
Para administração i.v., doses preferidas são de cerca de 0,5 mg a 1000 mg do oligômero por 70 kg.
O oligômero antisenso pode ser administrado em intervalos regulares por um curto período de tempo, por exemplo, diariamente por duas semanas ou menos.
En- tretanto, em alguns casos o oligômero é administrado intermitentemente por um período mais longo de tempo.
Administração pode ser seguida por, ou concomitantemente com, ad- ministração de um antibiótico ou outro tratamento terapêutico.
O regime de tratamento pode ser ajustado (dose, freqüência, via etc) como indicado, baseado nos resultados de imunoin- saios, outros testes bioquímicos e exame fisiológico do paciente sobre tratamento.
Um regime de tratamento in vivo efetivo usando os oligonucleotídeos antisenso da invenção pode variar de acordo com a duração, dose, freqüência e via de administração, bem como a condição do paciente sobre tratamento (isto é, administração profilática versus administração em resposta para infecção localizada ou sistêmica). Consequentemente, tal terapia in vivo sempre requererá monitoramento por testes apropriados ao tipo particular da infecção virai sobre tratamento, e ajustes correspondentes na dose e regime de tratamento, a fim de alcançar o resultado terapêutico ótimo.
Tratamento pode ser monitorado, por exem- plo, por indicadores gerais da doença e/ou infecção, tais como contagem sanguínea comple- ta (CSC), métodos de detecção do ácido nucléico, testes imunodiagnósticos, cultura virai, ou detecção do heteroduplex.
A eficácia de um oligômero antisenso antivirai administrado in vivo da invenção em inibição ou eliminação do crescimento de um ou mais tipos de RNA virai pode ser determi- nada a partir de amostras biológicas (tecido, sangue, urina etc) coletada a partir do paciente antes de, durante e subseqüente a administração do oligômero antisenso. Ensaios de tais amostras incluem (1) monitorando a presença ou ausência da formação do heteroduplex com sequências alvo e não alvos, usando procedimentos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, um ensaio de mobilidade de gel eletroforético; (2) monitorando a quantidade da produção da proteína virai, como determinado por técnicas padrões tais como ELISA ou Western blotting, ou (3) medindo o efeito do título virai, por exemplo, pelo método de Spearman-Karber. (Ver, por exemplo, Pari, G.S. et ai., Antimicrob. Agents and Chemo- therapy 39(5): 1157-1161, 1995; Andersen, K.P. et ai., Antimicrob. Agents and Chemothera- py 40(9):2004-2011, 1996, Cottral, G.E. (ed) in: Manual of Standard Methods for Veterinary Microbiology, pp. 60-93, 1978). Em algumas modalidades, o oligômero é ativamente captado por células mamífe- ras. Em modalidades adicionais, o oligômero pode ser conjugado a uma fração transporte (por exemplo, peptídeo transporte) como aqui descrito para facilitar tal captação. E. Preparação dos Oligômeros As subunidades morfolinas, as ligações intersubunidades modificadas e oligômeros compreendendo as mesmas podem ser preparados como descrito nos exemplos e na Pa- tente dos EUA Nos. 5.185.444 e 7.943.762 que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As subunidades morfolinas podem ser preparadas de acordo com o seguinte Es- quema de Reação 1 geral. Esquema de Reação 1. Preparação das Subunidades Morfolinas
B
1. Nal04 , MeoH (aq)
2. (NH4hB401
HO
3. Borane-triethylamine
4. Methanolic acid (p-TsOH OH or HCI) 1 o 1 olºJ 9R8 RN-~- o 8 li ~R RN-P-CI 1 4
CI
N 1
PG 5
Em referência ao Esquema de Reação 1, em que B representa uma fração parea- dora de base e PG representa um grupo protetor, as subunidades morfolinas podem ser preparadas a partir do ribonucleosídeo (1) correspondente como mostrado.
A subunidade morfolina (2) pode ser opcionalmente protegida por reação com um grupo protetor adequado precursor, por exemplo, cloreto de tritila.
O grupo protetor 3' é geralmente removido durante a síntese do oligômero de estado sólido como descrito em mais detalhes abaixo.
A fração pareadora de base pode ser adequadamente protegida por uma síntese de oligômero de fase sólida.
Grupos protetores adequados incluem benzoíla para adenina e citosina, fenila- cetila para guanina, e pivaloiloximetil para hipoxantina (1). O grupo pivaloiloximetil pode ser 1O introduzido na posição N1 da base heterocíclica hipoxantina.
Embora uma subunidade hi- poxantina não produzida, pode ser empregada, produção nas reações de ativação é muito superior quando a base é protegida.
Outros grupos protetores adequados incluem aqueles revelados no Pedido dos EUA co-pendente No. 12/271.040, que é aqui incorporada por refe- rencia em sua totalidade.
Reação de 3 com o composto de fósforo ativado 4, resulta em subunidades morfoli- nas tendo a fração de ligação desejada (5). Compostos de estrutura 4 podem ser prepara- dos usando um número de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
Por exemplo, tais compostos podem ser preparados por reação da amina correspondente e oxi- cloreto de fósforo.
Neste sentido, o material de partida amina pode ser preparado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, aqueles métodos descritos nos Exem- plos e na Patente dos EUA No. 7.943.762. Embora o esquema acima revele preparação das ligações do tipo (B) (por exemplo, X é -NR 8 R9 ), ligações do tipo (A) (por exemplo, X é dimetil amina) pode ser preparada em uma maneira análoga.
Compostos da estrutura 5 podem ser usados na síntese de oligômero automatizada de fase sólida para preparação de oligômeros compreendendo as ligações intersubunida- des.
Tais métodos são bem conhecidos na técnica.
Brevemente, um composto de estrutura 5 pode ser modificado na terminação 5' para conter um ligador a um suporte sólido.
Por exemplo, composto 5 pode ser ligado a um suporte sólido por um ligador compreendendo L1 e/ou R19 . Um método exemplar é demonstrado nas Figuras 3 e 4. Nesta forma, o oligo pode compreender uma modificação terminal 5' após a síntese do oligômero ser finalizada e o oligômero é clivado a partir do suporte sólido.
Uma vez sustentado, o grupo protetor de 5 (por exemplo, tritila) é removido e a amina livre é reagida com uma fração de fósforo ativada de um segundo composto de estrutura 5. Esta sequência é repetida até o oligo de compri- mento desejado ser obtido.
O grupo protetor no final do terminal 5' pode ou ser removido ou deixado se uma modificação 5' é desejada.
O oligo pode ser removido a partir do suporte sólido usando qualquer número de métodos, ou tratamento exemplos com uma base para clivar a ligação ao suporte sólido.
Em uma modalidade, a revelação provê subunidades morfolinas por preparação dos oligômeros, bem como métodos relacionados. As subunidades morfolinas têm a seguin- te estrutura (XXXI) z 1 W=P-X L(º)B
N 1
PG (XXXJ) 5 Em que W, X e Y são como definido para ligação (B) acima, B é uma fração parea- dora de base, Z é uma ligação a um suporte sólido ou um grupo de saída adequado e PG é um grupo protetor, por exemplo, aralquilaCrC 30 . Em algumas modalidades, PG é tritila, por exemplo, metoxitritila. Em outras modalidades, a ligação ao suporte sólido compreende L2 e/ou R 19 como definido acima. L2 é um ligador ótimo compreendendo ligações selecionadas 1O a partir de alquila, hidroxila, alcóxi, alquilamino, amida, éster, dissulfeto, carbonila, carbama- to, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina e fosfodiéster. O comprimento de L2 não é particularmente limitado. Em algumas modalidades, L2 é menos que 60 átomos em comprimento, menos que 50 átomos em comprimento ou menos que 40 átomos de comprimento. Em algumas outras modalidades, Zé halo, por exemplo, cloro. Em ainda outra modalidade, a presente revelação provê um método de preparação qualquer dos oligômeros revelados. O método compreende uso de um composto de estrutu- ra (XXXI) para preparação do oligômero. A preparação das subunidades morfolinas modificadas e oligômeros morfolinos são descritos em mais detalhes nos Exemplos. Os oligômeros morfolinos contendo qualquer número de ligações modificadas podem ser preparados usando métodos descritos aqui, métodos conhecidos na técnica e/ou descritos por referência aqui. Também descrito nos exemplos são modificações globais de oligômeros morfolinos PMO+ preparados como pre- viamente descritos (ver, por exemplo, publicação PCT W0200836127). F. Atividade Antisenso dos Oligômeros A presente revelação também provê um método de inibição da produção de uma proteína, o método compreendendo exposição de um ácido nucléico codificando a proteína a um oligômero como aqui revelado. Consequentemente, em uma modalidade um ácido nucléico codificando tal uma proteína é exposto a um oligômero antisenso compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (8), ou em outras modalidades 10% a 50% tais como liga- ções modificadas, como aqui revelado, onde as frações pareadoras de base P2 formam uma sequência efetiva para hibridizar a uma porção do ácido nucléico em uma locação efe- tiva para inibir a produção da proteína.
O oligômero pode ser alvo, por exemplo, uma região códon de partida ATG de um mRNA, um sítio splice de um pré-mRNA, ou uma sequência virai alvo como descrito abaixo.
Em outra modalidade, o método compreende exposição de um ácido nucléico codificando tal uma proteína para um oligômero antisenso compreenden- 2 do pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos uma fração R º). Em outra modalidade, a revelação provê um método de aumentar a atividade anti- senso de um oligômero tendo uma sequência de subunidades morfolinas, unidas por liga- ções intersubunidades, dando suporte frações pareadoras de base, o método compreende 1O modificação de um oligômero como descrito aqui para conter pelo menos dos grupos termi- nais modificados, pelo menos uma ligação intersubunidade do tipo (B) ou combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades, aumento da atividade antisenso pode ser evidenciada por: (i) uma diminuição na expressão de uma proteína codificada, relativo àquela provi- da por um oligômero não modificado correspondente, quando a ligação do oligômero anti- senso à sua sequência alvo é efetivo para bloquear um códon de partida de tradução para a proteína codificada, ou (ii) um aumento na expressão de uma proteína codificada, relativo àquela provida por um oligômero não modificado correspondente, quando ligação ao oligômero antisenso a sua sequência alvo é efetiva bloquear um sítio splice aberrante em um pré-mRNA que codi- fica a preferida proteína quando corretamente spliced.
Ensaios adequados para medidas desses efeitos são descritos ainda abaixo.
Em uma modalidade, modificação provê esta atividade em um ensaio de tradução livre de célula, um ensaio de tradução da correção spli- ce, ou uma correção splice do ganho de função no sistema de modelo animal como aqui descrito.
Em uma modalidade, atividade é aumentada por um fator de pelo menos dois, pelo menos cinco ou pelo menos dez.
Descrito abaixo são várias aplicações exemplares dos oligômeros da invenção in- cluindo aplicações antivirais, tratamento das doenças neuromuscular, infecções bacterianas, inflamação e doença renal policística.
Esta descrição não tenciona limitar a invenção em qualquer forma, mas serve para exemplificar a variação do humano e animal em condições de doença que pode ser direcionadas usando oligômeros compreendendo as ligações inter- subunidades modificadas aqui descritas.
G.
Atividade in vitro nos ensaios livres de célula Os oligômeros com ligações parcialmente modificadas, tal como PMOªPn (b1 O) e PMosuc (b45), têm maior afinidade para DNA e RNA que os correspondentes compostos neutros, demonstrado pela atividade antisenso aumentada in vitro e in vivo.
Os oligômeros da invenção foram mostrados para prover atividade antisenso superior comparada aos oli- gômeros completamente não modificados quando direcionados a uma variedade dos alvos diferentes. Em uma primeira séries de experimentos, vários PPMO não modificados, modifi- cados e conjugados ao peptídeo com alvo no éxon 23 do gene distrofin de camundongo MDX foram preparados, como descrito nos Materiais e Métodos e Exemplo 27. As sequên- cias são mostradas como no Exemplo 27, com a ligação fosfonilidenoóxi (1-piperazino) pre- viamente descrita (como mostrado na Fig. 18) em cada posição indicada com um "+" para SEQ ID NOs: 2-5; a ligação 4-aminopiperidinil (estrutura (b10); Figura 2) indicado com um"ª" para SEQ ID N0:5 ou; a ligação 4-succinamidopiperazinil (estrutura b45); Figura 2) indicou com um "s". Como descrito no Exemplo 27, oligômeros PMO contendo uma ligação exem- plar (por exemplo, PMOªPn) da invenção foram mais ativos comparados aos compostos PMO+ previamente descrito.
1. Estrutura Secundária Haste-Ansa (Stem-/oop) Alvo dos Vírus ssRNA Uma classe de um composto antivirai exemplar é um oligômero morfolino como aqui descrito, por exemplo, e oligômero compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (8) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R20 ) ou combina- ções dos mesmos, tendo uma sequência de 12-40 subunidades e uma sequência alvo que é complementar a uma região associada com a estrutura secundária haste-ansa dentro da terminação 5' e 40 bases da fita RNA de senso positivo do vírus alvo. (Ver, por exemplo, Pub. PCT No. W0/2006/033933 ou Ped. Dos EUA Pub. Nos. 20060269911 e 2005009291, que são aqui incorporados por referência). O método compreende primeiro a identificação como uma sequência alvo virai, uma região dentro das 40 bases terminais 5' da fita positiva do vírus infectante cuja sequência é capaz de foramr estrutura secundária haste-ansa formadora. Existe então construída, por síntese de fase sólida gradual, um oligômero compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (8) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R2º) ou combinações dos mesmos, e em outras modalidades contendo 20% a 50% de tais ligações modificadas, e tendo uma sequência alvo de pelo menos 12 subunidades que é complemen- tar a região do genoma virai capaz de formar estrutura duplex interna, onde o oligômero é capaz para formar com a sequência alvo virai, uma estrutura heteroduplex composta da fita senso positiva do vírus e o composto oligonucletídeo, e caracterizado por uma Tm de disso- ciação de pelo menos 45° C e interrupção de tal estrutura de haste-ansa. A sequência alvo pode ser identificada por análise das sequências 5'-terminais, por exemplo, 40 bases do 5'-terminais, por um programa de computador capaz de fazer predi- ções estruturais secundárias baseadas em uma pesquisa para o mínimo estágio de energia livre da sequência de RNA de entrada. Em um aspecto relacionado, os oligômeros podem ser usados nos métodos de ini-
bição em uma célula hospedeira mamíferas, replicação de um vírus de RNA infectante tendo um genoma de fita simples, de senso positivo e selecionado a partir das famílias Flaviviri- dae, Picornoviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Astroviridae ou Hepeviridae. O método inclui a administração às células hospedeiras infectadas, uma quan- tidade inibitória de vírus de um oligômero como aqui descrito, tendo uma sequêcia alvo de pelo menos 12 subunidades que é complementar a uma região dentro das 40 bases do ter- minal 5' do genoma virai de fita positiva que é capaz de formar uma estrutura secundária haste-ansa interna. O composto é efetivo, quando administrado às células hospedeiras, para formar uma estrutura heteroduplex (i) composta da fita senso positiva do vírus e o composto 1O oligonucleotídeo, e (ii) caracterizado por uma Tm de dissociação de pelo menos 45° C e in- terrupção de tal estrutura secundária haste-ansa. O composto pode ser administrado a um paciente mamífero infectado com o vírus, ou em risco de infecção com o vírus. Sequências alvo exemplares que tem como alvo as estruturas haste-ansa terminais dos vírus da dengue e encefalite Japonês são listados abaixo como SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. Sequências alvo exemplares adicionais que tem como alvo estruturas haste-ansa terminais dos vírus ssRNA podem também ser encontradas em Ped. dos EUA Num. 11/801.885 e publicação PCT W0/2008/036127 que são aqui incorporadas por referência.
2. Alvo na Primeira Estrutura de Leitura Aberta dos Vlrus ssRNA Uma segunda classe dos compostos antivirais antisenso exemplares para uso na inibição do crescimento dos vírus das famílias piconarvírus, calicivírus, togavírus, coronaví- rus e flavivírus tendo um genoma de senso positivo de fita simples de menos que 12 kb e uma primeira estrutura de leitura aberta que codifica uma poliproteína contendo proteínas funcionais múltiplas. Em modalidades particulares, o vírus é um vírus RNA a partir da família coronavírus ou um vírus do Oeste do Nilo, Febre Amarela ou Dengue a partir da família fla- vivírus. Os compostos inibitórios compreendem oligômeros antisenso descritos aqui, por exemplo, oligômeros compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R2º) ou combinações dos mesmos, tendo uma sequência base alvo que é substancialmente complementar a uma sequência alvo virai que transpõe o sítio de partida AUG da primeira estrutura de leitura aberta do ge- noma virai. Em uma modalidade do método, o oligômero é administrado a um mamífero pa- ciente infectado com o vírus. Ver, por exemplo, Pub. PCT No. W0/2005/007805 e Ped. dos EUA Pub. No. 2003224353, que são aqui incorporados por referência. A sequência alvo preferida é uma região que transpõe o sítio de partida AUG da primeira estrutura de leitura aberta (ORF1) do genoma virai. A primeira ORF geralmente cofidifica uma poliproteína contendo proteínas não estruturais tais como polimerases, heli- cases e proteases. Por "transpõe o sítio de partida AUG" é tencionado que a sequência alvo inclui pelo menos três bases em um lado do sítio de partida AUG e pelo menos duas bases no outro (um total de pelo menos 8 bases). Preferivelmente, inclui pelo menos quatro bases em cada lado do sítio de partida (um total de pelo menos 11 bases). Mais geralmente, sítios alvos preferidos incluem alvos que são conservados entre uma variedade de isolados virais. Outros sítios preferidos incluem o IRES (sítio de entrada do ribossomo interno), sítios de ligação da proteína de transativação, e sítios de iniciação da replicação. Complexo e grandes genomas virais, que podem prover genes redundantes múl- tiplos, podem ser eficientemente alvejados por alvo nos genes celulares hospedeiros codifi- cando para entrada virai e resposta hospedeira a presença virai. 1O Uma variedade de sequências de genoma virai é disponível a partir de fontes bem conhecidas, tal como os bancos de dados NCBI Genbank. O sítio de partida AUG de ORF1 pode também ser identificado na base de dados gênica ou referência baseada nas mesmas, ou ele pode ser encontrado por mapeamento da sequência para um códon AUG na região do sítio de partida ORF1 esperado. A organização genômica geral de cada das quatro famílias de vírus é dada abaixo, seguido por sequências alvos exemplares obtidas por membros selecionados (gênero, es- pécies ou cepas) dentro de cada família.
3. Vírus Influenza Alvo Uma terceira classe dos compostos antivirais antisenso é usada na inibição do crescimento dos vírus da família Orthomyxoviridae e no tratamento de uma infecção virai. Em uma modalidade, a célula hospedeira é colocada em contato com um oligômero como descrito aqui, por exemplo, um oligômero compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R2º) ou combi- nações dos mesmos, ou em outras modalidades compreendendo 20% a 50% de tais liga- ções modificadas, e compreendendo uma sequência base efetiva para hibridizar a uma re- gião alvo selecionada a partir do seguinte: 1) 25 bases do terminal 5' ou 3' dos segmentos de RNA virai de senso negativo; 2) as 25 bases terminais do terminal 5'ou 3'do cRNA senso positivo; 3) 45 bases ao redor dos códons de partida AUG dos mRNAs virais do influenza e; 4) 50 bases ao redor dos sítios do doador ou aceptor splice dos mRNAs influenza sujeitos a splicing alternativo. (Ver, por exemplo, Pub. PCT No. W0/2006/047683; Ped. dos EUA Pub. No. 20070004661; e Ped. OCT Num. 2010/056613 e Ped. dos EUA No. 12/945.081, que são aqui incorporados por referência). Experimentos em suporte da invenção e designados para ter como alvo o segmento M1/M2 do vírus influenza A (cepa H1 N1 PR8) usando PMO com ligações modificadas da invenção foram feitos usando oligômeros baseados em SEQ ID N0:3, listados abaixo na Tabela 4 e descritos no Exemplo 29. Tabela 4. Sequências alvo influenza que incorporam ligações intersubunidades mo-
dificadas ou grupos terminais NG-10- 0038 PMOhex CGG TbTA G1'..A GAC bTCA TCi.T TT NG-10- 0039 PMOhex CGG ThTA GAA GAC "TCA hTCT "TT NG-10- 0096 PMOapn CGG T'TJ\ GAA GAC ªTCA TCªT TT NG-10- 0097 PMOapn CGG 0 0
T TA GAA GAC 0
TCA 0 TC''T TT NG-10- 0099 PMOpyr CGG "TPTA GAA GAC PTCA "TCPT TT NG-10- 0107 PMOtiol 0 CGG T "Tl\. GAA GAC ""TCA TCªHT TT NG-10- 0108 PMOsucc CGG TºTA G1'..A GAC 0 TCA TCºT TT NG-10- 0111 PMOguan CGG TqTA GAA GAC 0 TCA TCgT TT NG-10- 0141 PMOpyr CGG YTA GAA GAC "TCA TCPT TT NG-10- 0142 PMOpyr CGG T"TA G.~ GAC "TCA PTC"T TT NG-10- 0158 PMoglutárico CGG Tg 1 "TA GAA GAC gluTCA TC9"'"T TT NG-10- 0159 PM Qciclo-glut 1 010 CGG TcpgiuTA G.l\A GAC cp" "TC.Z'i. TC=" T TT NG-10- PMOácido cólico CGG TcºTA GAA G1'.C 00
TCA TC T TT 00
NG-10- 0161 PMOdeóxiCA CGG Tdº~TA GA.~ GAC '10•TCA T~ ·T TT 0 NG-10- 0180 PMOapn 0 TT"T CGA CAºT CGG T TA GAA GAC 0
TCA T NG-10- 0174 PMOm CGG T'"T.~ GAA GAC "'TCA TC"T TT NG-10- 0222 PMO MeT CGG T""TA GAA GAC +TCA TC+T TT NG-10- 0223 PMO FarnT CGG TFornTA GAA GAC +TCA TC+T TT NG-10- 0538 PMOapn-tritil CGG T"TA GAA GAC 'TCA TC'T TT NG-10- PMOapn- tritil CGG T"TA GAA GAC "TCA TC"T TT 0539 NG-10-
PMO CGG TTA GAA GAC TCA TCT TT 0015 NG-11- PMOplus CGG +TTA GAA GAC +TCA TC+T TT 0170 NG-11- CGG T+TA GAA GAC +TCA TC+T TT** PMQplus benzidrila 0145 NG-11- CGG TiprpipTA GAA GAC iprpipTCA PM O isopropila 0148 TCiprpipT TT NG-11- CGG pTTA GAA GAC pTCA TCpT TT PMOpyr 0173 NG-11- CGG T*+TA GAA GAC *+TCA TC*+T TT Trimetila Gly 0291 **3'-benzidrila; *+ ligações são trimeti! glicina aciladas nas ligações PMOplus; PMOm representam bases T com um grupo metila na posição 3-nitrogênio. Os compostos são particularmente úteis no tratamento da infecção do vírus influen- za em um mamífero. O oligômero pode ser administrado a um paciente mamífero infectado com o vírus influenza, ou em risco de infecção com o vírus influenza.
4. Vírus Alvos da Família Picornaviridae Uma quarta classe dos compostos antivirais antisenso exempla- res é usada na inibição do crescimento dos vírus da família Picornaviridae e no tratamento 1O de uma infecção virai. Os compostos são particularmente úteis no tratamento da infecção Enterovirus e/ou Rhinovirus em um mamífero. Nesta modalidade, os compostos antivirais antisenso compreendem oligômeros morfolinos, por exemplo, oligômeros morfolinos com- preendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R20 ) ou combinações dos mesmos, e tendo uma sequência de
12-40 subunidades, incluindo pelo menos 12 subunidades tendo uma sequência alvo que é complementar a uam região associada com sequências RNA virais dentro de uma de duas 32 regiões nucleotídicas conservadas da região não tranduzida 5' (Ver, por exemplo, Pub. PCT Nos. W0/2007/030576 e W0/2007/030576 e W0/2007/030691 ou Ped. dos EUA co- pendente eco-propriedade Nums. 11/518.058 e 11/517.757, que são aqui incorporados por referência). Uma sequência alvo exemplar é listada abaixo como SEQ ID N0:6.
5. Vírus Alvo da Família Flavivírus Uma quinta classe dos compostos antivirais antisenso exempalres são usados na inibição de replicação de um flavivírus em células animais. Um oligômero antisenso exem- 1O piar desta classe é um oligômero morfolino compreendendo pelo menos uma ligação do tipo 20 (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R ) ou combi- nações dos mesmos, entre 8-40 bases nucleotídicas em comprimento e tendo uma sequên- cia de pelo menos 8 bases complementares a uma região do genoma RNA de fita positiva do vírus que inclui pelo menos uma porção da sequência de ciclização 5' (5'-CS) ou se- quências 3'-CS do RNA flavivírus de fita positiva. Um alvo altamente preferido é o 3'-CS e uma sequência alvo exemplar para vírus da dengue são listados abaixo como SEQ ID N0:7 (Ver, por exemplo, Pub. PCT No. (W0/2005/030800) ou Ped. dos RUA co-pendente e co- propriedade Num. 10/913.996, que são aqui incorporados por referência).
6. Vírus Alvos da Família Nidovírus Uma sexta classe dos compostos antiviraus antisenso exemplares é usada na inibi- ção da replicação de um nidovírus em células animais infectadas com vírus. Um oligômero antisenso exemplar desta classe é um oligômero morfolino compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo me- nos um R2º) ou combinações dos mesmos, como descrito na presente revelação, e conten- do entre 8-25 bases nucleotídicas, e tem uma sequência capaz de interromper o pareamen- to de base entre as sequências regulatórias transcricionais (TRS) na região líder 5' do ge- noma virai de fita positiva e região subgenômica 3'de fita negativa (Ver, por exemplo, Pub. PCT No. W0/2005/065268 ou Ped. dos EUA Pub. No. 20070037763, que são aqui incorpo- rados por referência).
7. Alvo de Filovírus Em outra modalidade, um ou mais oligômeros como aqui descrito podem ser usa- dos em um método de inibir replicação dentro de uma célula hospedeira de um vírus Ebola ou vírus Marburg, por colocar em contato a célula com um oligômero como aqui descrito, por exemplo, e oligômero compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R2 º) ou combinações dos mesmos, ou em outras modalidades 20% a 50% de tais ligações modificadas, e tendo uma sequência base alvo que é complementar a uma sequência alvo composta de pelo menos 12 bases contíguas dentro de uma região de sítio de partida AUG de um mRNA de fita positiva, como descrito ainda abaixo. O genoma virai filovírus tem aproximadamente 19.000 bases de RNA de fita sim- ples que é não segmento e na orientação antisenso. O genoma codifica 7 proteínas a partir 5 de mRNAs monocistrônicos complementares ao vRNA. Sequências alvos são sequências de RNA (senso) de fita positivas que transpõe ou são logo abaixo (dentro de 25 bases) ou acima (dentro de 100 bases) do códon de partida AUG das proteínas do vírus Ebola selecionado ou as 30 bases do terminal 3' do RNA virai de fita negativa. Alvos protéicos preferidos são as subunidades de polimerase virais VP35 e 1O VP24, embora L, nucleoproteínas NP e VP30, são também contempladas. Entre essas pro- teínas precoces é favorecida, por exemplo, VP35, que é favorecida sobre a L polimerase expressar tardiamente. Em outra modalidade, um ou mais oligômeros como aqui descrito podem ser usa- dos em um método de inibir a replicação dentro de uma célula hospedeira de um vírus Ebola ou vírus Merburg, por contato com a célula dentro de um oligômero como aqui descrito, compreendendo pelo menos uma ligação intersubunidade modificada, ou em outras modali- dades 20% a 50% de tais ligações modificadas, e tendo uma sequência de base alvo que é complementar à sequência alvo composta de pelo menos 12 bases contíguas dentro de uma região do sítio de partida AUG de um mRNA de fita positiva das sequências de mRNA do Filovírus. (Ver, por exemplo, Pub. PCT no. W0/2006/050414 ou Patente dos EUA Nos.
7.524.829 e 7.507.196, e continuação de pedidos com Ped. dos EUA Nos: 12/402.455; 12/402.461; 12/402.464; e 12/853.180 que são aqui incorporados por referência).
8. Alvos de Arenavírus Em outra modalidade, um oligômero como aqui descrito pode ser usado em um mé- todo para inibir infecção virai em células mamíferas por uma espécie na família Arenaviri- dae. Em um aspecto, os oligômeros podem ser usados no tratamento de um paciente mamí- fero infectado como vírus (Ver, por exemplo, Pub. PCT No. W0/2007/103529 ou Patente dos EUA No. 7.582.615, que são aqui incorporados por referência). Tabela 5 é uma lista exemplar de vírus alvos, alvejados por oligômeros da invenção como organizado por sua classificação de Arenavírus do Velho Mundo ou Novo Mundo. Tabela 5. Arenavírus Alvos Família Gênro Vírus Arenaviridae Arena vírus Arenavírus do Velho Mundo Vírus Lassa vrus (LASV) Vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) vírus Mapeia (MOPV) Arenavírus no Novo Mundo Vírus Guanarito (GTOV) Vírus Junin (JUNV)
Vlrus Machupo (MACV) Vírus Pichinide (PICV) Vírus Pirita! (PIRV) Vírus Sabiá (SABV) Vírus Tacaribe (TCRV) Vírus Whitewater Arroyo (WWAV) O genoma dos Arenavírus consiste de segmentos de RNA de fita simples designa- dos S (pequeno) e L (grande). Em vírions, a proporção molar do segmento de RNAs S para L é aproximadamente 2:1. A sequência de RNA de segmento S completa tem sido determi- nada para vários arenavírus e varia de 3,366 a 3,535 nucleotídeos. A sequência de RNA de 5 segmento L completa tem também sido determinada para vários arenavírus e varia de 7,102 a 7,278 nucleotídeos. As sequências terminal 3' dos segmentos de RNA Se L são idênticas em 17 dos 19 últimos nucleotídeos. Essas sequências terminais são conservadas entre to- dos os arenavírus conhecidos. Os 19 ou 20 nucleotídeos do terminal 5' no início de cada RNA genômico são imperfeitamente complementares com cada correspondente na termina- ção 3'. Por causa desta complementaridade, os terminais 3' e 5' são pensados parearem com bases e formarem estruturas tipo cabo de panela. Replicação do vírion infectante ou RNA virai (vRNA) para formar uma fita de RNA virai complementar (vcRNA), antigenômica ocorre na célula infectada. Ambos, o vRNA e vcRNA codificam mRNAs complementares; consequentemente, Arenavírus são classifica- dos como vírus RNA ambisenso, ao invés de vírus de RNA senso negativo ou positivo. A orientação ambisenso dos genes virais é em ambos os segmentos L e S. Os genes d NO e polimerase residem na terminação 3' dos segmentos do vRNA S e L, respectivamente, e são codificados no senso negativo convencional (isto é, eles são expressos através da transcrição do vRNA ou mRNAs complementar ao genoma). Os genes localizados na termi- nação 5' dos segmentos do vRNA S e L, GPC e Z, respectivamente, são codificados no mRNA senso mas não existe evidência que eles são traduzidos diretamente a partir do vRNA genômico. Esses genes são expressos no lugar da transcrição dos mRNAs senso genônico a partir de antigenomas (isto é, o vcRNA), cópias de complementariedade de comprimento inteiro dos vRNAs genônicos que funcionam como intermediários replicativos. Uma sequência exemplar alvo para a família arenavírus dos vírus é listada abaixo como SEQ 10 N0:8.
9. Alvejando o Vírus Sincicial Respiratório Vírus Sincicial Respiratório (RSV) é o único patógeno respiratório mais importante em crianças novas. Condições respiratórias inferiores causadas por RSV, tais como bron- quiolite e pneumonia, sempre requerem hospitalização em crianças com menos que um ano de idade. Crianças com doenças cardiopulmonares e aquelas nascidas prematuramente são especialmente propensas a experimentar distúrbios severos a partir desta infecção. Infecção RSV é também uma importante doença em adultos idosos e de alto risco, e é a segunda maior causa comumente identificada de pneumonia virai em pessoas mais velhas (Falsey, Hennessey et ai, 2005). A Organização Mundial de Saúde estima que RSV é responsável por 64 milhões de infecções clínicas e 160 mil mortes anualmente ao redor do mundo.
Ne- nhuma vacina é correntemente disponível para a prevenção da infecção por RSV.
Embora muitos avanços principais em nosso entendimento da biologia do RSV, epidemiologia, pato- fisiologia e resposta imune do hospedeiro tenha ocorrido ao longo das últimas décadas, con- tinua a existir controvérsia considerável em relação ao ótimo gerenciamento de bebês e crianças com infecção RSV.
Rivabirina é a única droga antivirai licenciada para tratar infec- ção por RSV, mas seu uso é limitado aos infantes de alto risco ou severamente doentes.
A 1O utilidade da Ribavirina tem sido limitada por seu custo, eficácia variável, e tendência a gerar vírus resistente (Marquardt 1995; Prince 2001 ). A corrente necessidade para os agentes anti-RSV efetivos adicionais é bem conhecida.
É conhecido que PMO conjugado a peptídeo (PPMO) pode ser efetivo em inibir RSV em ambos, cultura de tecido e em um sistema de modelo animal in vivo (Lai, Stein et ai, 2008). Dois PPMOs antisenso, designados como alva da sequência que inclui a região terminal 5' e tradução da região sítio de partida do mRNA de RSV, foram testados para ati- vidade anti-RSV em culturas de duas linhagens celulares de vias aéreas humanas.
Uma delas, (RSV-AUG-2; SEQ ID NO 10), reduziu títulos virais por >2,0 log 10 . Tratamento intra- nasal (i.n.) de camundongos BALB/c com RSV-AUG-2 PPMO antes da inoculação de RSV produziu uma redução no título virai de 1,2 log10 no tecido pulmonar no dia 5 pós-infecção (p.i.), e inflamação pulmonar atenuou no dia 7 pós-infecção.
Esses dados mostraram que RSV-AUG-2 proveu potente atividade anti-RSV, merecedora de investigação adicional como um candidato para potencial aplicação terapêutica (Lai, Stein et ai, 2008). A despeito do su- cesso com RSV-AUG-2 PPMO como descrito acima, é desejável evitar incorporação da con- jugação do peptídeo em um terapêutico anti-RSV antisenso devido a preocupação com toxi- dade e custo dos produtos considerados.
Assim, em outra modalidade da presente inven- ção, um ou mais oligômeros como aqui descritos podem ser usados em um método de inibi- ção da replicação dentro de uma célula hospedeira de RSV, por contato da célula com um oligômero como aqui descrito, por exemplo, um oligômero compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R2 º) ou combinações dos mesmos, ou em outras modalidades 10% a 50% de tais ligações modificadas, e tendo uma sequência base alvo que é complementar a uma sequência alvo composta de pelo menos 12 bases contíguas dentro de uma região sítio de partida AUG de anmRNA a partir de RSV, como descrito ainda abaixo.
O gene L do RSV codifica para um componente crítico do complexo RNA polimera- se dependente do RNA virai.
PPMO antisenso designado contra a sequência transpondo o códon do sítio de partida da tradução AUG do mRNA do gene L do RSV na forma de RSV-
AUG-2 PPMO é complementar a sequência a partir da sequência "gene-de partida" (GS) presente na terminação 5' do mRNA L para 13 nt na sequência codificante. Uma sequência alvo do gene L preferida é então complementar a qualquer 12 bases contíguas a partir da terminação 5' do mRNA do gene L, estendendo 40 bases na direção 3' ou 22 bases na se- quência codificante do gene L como mostrado abaixo na Tabela 3 como SEQ ID N0:9. Se- quências alvos do gene L de RSV exemplares são listadas na Tabela 3 como SEQ ID NOs: 10-14. Qualquer das modificações intersubunidades da invenção descritas aqui podem ser incorporadas nos oligômeros para prover atividade antisenso aumentada, distribuição intra- celular melhorada e/ou especificidade tecidual para atividade terapêutica melhorada. Oligô- 1O meros exemplares contendo ligações intersubunidades da invenção são listados abaixo na Tabela 6. Tabela 6. RSV alvo e sequências alvos Nome Sequência (5' a 3') SEQ
IDNO L targct GGGACAAAATGGATCCCATTATTAATGGAAATTCTGCTAA 9 RSV-AUG-2 T.AJl..TGGGATCCATTTTGTCCC 10 RSV-AUG3 AAT~.ATGGGATCCATTTTGTCCC 11 RSV-AUG4 CATTAATAATGGGATCCATTTTGTCCC 12 RSV-AUG5 GAATTTCCATTAATAATGGGATCCATTTTG l3 RSV-AUG6 CAGAATTTCCATT~.ATAATGGGATCCATT 14 RSV- AATAAºF"TGGGAºF"TCCA"P'TT''Í'"TTG ·'F'"TCCC 11 AUG3apn* RSV- AATAA''''""TGGGA"""''TCCA'J"""TT"'·"·'''TTG''"''"TCCC lJ AUG3guan 1O. Doenças Neuromusculares Em outras modalidades, um oligômero terapêutico é provido para uso no tratamento de uma condição de doença associada com uma doença neuromuscular em um paciente mamífero. Modificações do oligômero intersubunidade exemplares mostraram aumentar o transporte no tecido muscular, incluindo aqueles tendo ligações intersubunidades de estrutu- ra b6, b1 O, b51 e b54. Oligômeros antisenso que incorporam tais ligações no oligômero anti- senso M23D (SEQ ID NO: 16) são testados para atividade no modelo de camundongo MDX para Distrofia Muscular de Duchene (DMD) como descrito nos Exemplos. Oligômeros exem- plares que incorporam as ligações usadas em algumas modalidades são listados abaixo na Tabela 7. Em algumas modalidades, o composto terapêutico pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) um oligômero antisenso com alvo contra miostatina humana, tendo uma se-
quência base complementar para pelo menos 12 bases contíguas em uma região alvo do mRNA da miostatina humana identificada por SEQ ID N0:18, para tratar uma condição de dano muscular, como descrito previamente (Ver, por exemplo, Ped. de Patente dos EUA No. 12/493.140, que é aqui incorporado por referência; e publicação PCT W02006/086667). Sequências alvos murinas exemplares são listadas como SEQ ID NOs: 19-20. (b) um oligômero antisenso capaz de produzir salto dos éxons na proteína DMD (distrofina), tal como um PMO tendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NOs: 22 a 35, para restaurar a atividade parcial da proteína distrofina, para tratar DMD, como des- crito previamente (Ver, por exemplo, Pub.
PCT Nos.
W0/2010/048586 e W0/2006/000057 1O ou Publicação de Patente dos EUA No.
US09/061960, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Várias outras doenças neuromusculares podem ser tratadas usando os ligações modificadas e grupo terminais da presente invenção.
Compostos exemplares para tratar atrofia muscular espinhal (SMA) e distrofia miotônica (DM) são discutidas abaixo.
SMA é uma doença recessiva autossômica causada por perda crônica de neurônios alfa-motores na medula espinhal e pode afetar ambos, crianças e adultos.
Expressão redu- zida de neurônio motor de sobrevivência (SMN) é responsável pela doença (Hua, Sahashi et ai. 2010). Mutações que causam SMA são localizadas no gene SMN1, mas um gene pará- logo, SMN2, pode permitir viabilidade por compensar a perda de SMN1 se expresso a partir de uma forma de splice alternativo faltando o éxon 7 (delta? SMN2). Compostos antisenso com alvo no íntron 6, éxon 7 e íntron 7 têm mostrado induzir a inclusão do éxon 7 em vários graus.
Compostos antisenso com alvo no íntron 7 são preferidos (ver, por exemplo, Publica- ção OCT Nos.
W0/2010/148249, W0/2010/120820, W0/2007/002390 e Patente dos EUA No. 7838657). Sequências antisenso exemplares que tem alvo o SMN2 pré-mRNA e indu- zem melhorada inclusão do éxon 7 são listados abaixo como SEQ ID NOs: 36-38. É con- templado que modificações selecionadas dessas sequências de oligômeros usando as liga- ções modificadas e grupos terminais descritos aqui podem ter propriedades melhoradas comparadas àquelas conhecidas na técnica.
Além disso, é contemplado que qualquer oli- gômero com alvo no íntron 7 do gene SMN2 e incorporando as características da presente invenção tem o potencial de induzir a inclusão do éxon 7 e prover um benefício terapêutico para paciente SMA.
Distrofia Miotônica tipo 1 (DM1) e tipo 2 (DM2) são distúrbios dominan- temente herdados, causados pela expressão de um RNA tóxico levando a degeneração neuromuscular.
DM1 e DM2 são associados com longas repetições poliCUG e poliCCUG no 3'-UTR e regiões íntrons 1 do trascrito da proteína quinase de distrofia miotônica (DMPK) e proteína zinc finger 9 (ZNF9), respectivamente (ver, por exemplo, W02008/036406). En- quanto indivíduos normais têm tantas quantas 30 repetições CTG, pacientes DM1 carregam um grande número de repetições variando de 50 a milhares.
A severidade da doença e a idade do início correlacionam com o número de repetições. Pacientes com início na fase adulta mostra sintomas mais suaves e têm menos que 100 repetições, pacientes DM1 com início na fase jovem carreiam tantas quantas 500 repetições e casos congênitos usualmente têm cerca de mil repetições CTG. Os transcritos expandidos contendo repetições CUG for- mam uma estrutura secundária, acumulam no núcleo na forma de foco nuclear e seqües- tram proteínas ligadoras de RNA (RNA-BP). Vários RNA-BP têm sido implicados na doença, incluindo proteínas tipo "musc/eblind' (MBNL) e proteína ligadora de CUG (CUGBP). Proteí- nas MBNL são homólogas às proteínas "musc/eblind' de Drosophila (Mbl) necessárias para fotoreceptor e diferenciação muscular. MBNL e CUGBP Têm sido identificados como anta- 1O gonísticos reguladores de splicing de transcritos afetados em DM1 tal como troponina cardí- aca T (cTNT), receptor de insulina (IR) e canal de cloreto músculo-específico (CIC-1). É conhecido na técnica que oligonucleotídeos antisenso alvejados para as repeti- ções expandidas do gene DMPK podem deslocar o sequestro RNA-BP e sintomas de mio- tonia reversa em um modelo animal de DM 1 (W02008/036406). É contemplado que oligô- meros incorporando características da presente invenção podem prover atividade melhorada e potencial terapêutico para pacientes DM1 e DM2. Sequências exemplares alvejadas para as repetições poliCUG e poliCCUG descritos acima são listadas abaixo como SEQ ID NOs: 39-55 e ainda descritos na Pub. dos EUA No. 13/101.942 que é aqui incorporada em sua totalidade. Modalidades adicionais da presente invenção para tratar distúrbios neuromuscula- res são anticipados e incluem oligômeros designados para tratar outros distúrbios genéticos de instabilidade de repetição do DNA. Essas doenças incluem doença de Huntington, ataxia espino-cerebelar, atrofia espinhal ligada ao X e bulbar muscular e ataxia espinocerebelar tipo 1O (SCA 1O) como descrito em W02008/018795. Experimentos feitos em suporte da invenção usando o camundongo MDX, um mo- delo murino para DMD, são descritos no Exemplo 27. Tabela 7. Sequências M23D (SEQ ID N0:15) que incorporam ligações intersubuni- dades modificadas e/ou grupos terminais 3' e/ou 5' Modificação NG 5' Sequência 3' PMO-X NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG 10- PMO EG3 trifenilacetila
AAA T 0383 NG-
GGC CAA ACC FCG GCF TAC CFG 1O- trifenilfos OH trifenilfos
AAA T 0325 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG 1O- PMO-farnesil OH farnesil
AAA T 0272 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG 1O- PMO OH tritil
AAA T 0102
NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 10- trimetoxibenzoil a EG 3 trimetoxibenzoil
CTG AAA T 033 o NG- GGC C+A+A +ACC TCG GCT TAC 10- PMOplus 5'-pol EG3 H
CTG AAA T 0056 NG- H- GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG 07- PM0-3'-tritil tritil Pip AAA T 0064 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO EG3 trifenilpropionil
CTG AAA T 0382 NG- GGC CAA ACC pTCG GCpT pTAC 1O- PMOpyr EG 3 H CpTG AAA pT 0278 NG- GGC CªNA ªACC TCG GCT TAC 10- PMOapn EG 3 H
CTG AAA T 0210 NG-
GGC CAA ACC PTCG GCPT TAC 10- PMOpyr EG3 CPTG AAA T H 0098 NG- GGC CAA ACC ªTCG GCªT TAC 10- PMOapn EG3 H CªTG AAA ªT 0070 NG- GGC CAA ACC ªTCG GCªT ªTAC 1O- PMOapn EG3 H CªTG AAA ªT 0095 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO EG3 farnesil
CTG AAA T 0317 NG-
GGC CAA ACC FCG GCF TAC 10- PMO triMe Gly EG3 trimeti! Glicina
CFG AAA F 0477 NG- GGC CªAA ªTCG GCªT ªTAC 10- PMOapn OH H CªTG AAA ªT 0133 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO EG3 2-0H, difenilacet
CTG AAA T 0387 NG- 9 GGC CAA ACC TCG GC 9T TAC 10- PMOguan EG3 A9 C9T G AAA T 0104 NG- m+TCG Gcm+T
GGC CAA ACC TAC 1O- PMOplus meti! EG3 Tritil cm+TG AAA m+T 0420 NG- 1 GGC CAA ACC TCG GC1T TAC 10- PMOtri EG3 H cr G 1
AAA T 0065 NG- GGC CAA ACC TCG GCT TAC 9-fluoreno- 1O- PMO-X EG3 CTG AAA T carboxil 0607
NG ACC CPTCG GCCPT 10- PMOcp EG3G GC CAA ccpT G AAA T
TAC
H 0060 NG- PMO-COCH 2 SH EG3 GGC CAA ACC TCG GCT TAC COCH 2 SH
1O- CTG AAA T 016 2 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 10- dfenilacetil EG3 difenilacetil
CTG AAA T 0328 NG- CªAA ªACC 1TCG GC 1T 1
TAC 10- PMOapnPMOtri oH GGC C TG AAA 1T 1 H 0134 NG- GGC CAA ACC TCG GCT TAC 5'-difenilac,3'- 1O- PMO OPA CTG AAA T triti 0386 NG- H- GGC CAA ACC TCG GCT TAC 07- PM0-3'-tritil tritil Pip CTG AAA T 0064 NG-
GGC CAA ACC CPTCG GCCPT 1O- PMOcp EG3 cpTAC ccpT G AAA cpT H 0059 NG- OH GGC CAA ACC 1 TCG GC1T t C1TG 10- PMOtri H AAA 1T 0135 NG- GGC CAA ACC ªTCG GCªT ªTAC 10- PMOapn PMOcls OH H CªTG AAA SHcT 0168 NG- GGC CAA ACC ªTCG GC 1T 1
TAC 10- PMOapnPMOtri OH H CªTG AAA ªT 0113 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG 10- PMO EG3 difenilfosforil
AAA T 0385 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO OH geranil
CTG AAA T 0279 NG- C+AA +ACC +TCG GC+T
GGC TAC 10- PMOplus disp EG3 H C+TG AAA T 0055 NG- GGC CAA ACC ºTCG GCºT TAC 1:1s 1O- PMOsucc EG3 CºT G AAA T 0105 NG- EtpipTCG GCEtpipT TAC
GGC CAA ACC 1O- PMO-X EG3 H cEtpipTG AAA EtpipT 0805 NG- GGC CAA ACC pyroMeTCG GCpyrOMeT 10- PMO-X EG3 T AC CpyrOMeTG AAA pyrQMeT H 0811 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMOplus 3'-pol EG3 H C+TG +A+A+A T 0057 NG- GGC CAA ACC TCG GCT TAC 5- 10- PMO-X EG3 CTG AAA T carboxifluorescein 0625 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 10- dímero EG3 dimerizado
CTG AAA T 0804 NG- EG3 G GC CAA ACC 1TCG GC1T TAC C1T PMOtri H 1O- G AAA tr
NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 10- PMO dissulfeto EG3 COCH 2CH2SSPy
CTG AAA T 0280 NG- GGC CaAaA aACC aTCG GCaT 10- PMOapn EG3 H aTaAC CaTG aAaAaA aT 0212 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- 3'-MeOtritil EG3 MeO-Tr
CTG AAA T 0156 NG- GGC CAA ACC hTCG GChT TAC 10- PMOhex EG3 ChT G AAA hT H 0062 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 11- PMO-X EG3 guanidinil
CTG AAA T 0043 NG- GGC C+A+A +ACC +TCG GC+T 1O- PMOplus EG3 H +T+AC C+TG +A+A+A +T 0206 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO EG3 trifenilacetil
CTG AAA T 0383 NG-
GGC CAA ACC FCG GCF TAC 1O- trifenilfos OH trifenilfos
CFG AAA T 0325 NG-
GGC CAA ACC TCG GCT TAC 1O- PMO-farnesil OH farnesil
CTG AAA T 0272 *Dimerizado indica que o oligômero é dimerizado por uma ligação ligando o terminal 3' dos dois monômeros. Por exemplo, a ligação pode ser -COCH 2CHrS-CH(CONH 2)CHr CO-NHCH 2CH 2CO- ou qualquer outra ligação adequada. 11 . Aplicações Antibacterianas A invenção inclui, em outra modalidade, um oligômero antisenso antibacteriano pa- ra uso no tratamento de uma infeção bacteriana em um hospedeiro mamífero. Em algumas modalidades, o oligômero compreende pelomenos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R20) ou combinações dos mesmos, tendo entre 10-20 bases e uma sequência alvo de pelo menos 1O bases contíguas comple- 1O mentares para uma região alvo do mRNA de bactéria infectante para proteína veículo acil (acpP), subunidade girase A (gyrA), ftaZ, proteína ribossomal S1 O (rpsJ), genes, onde a re- gião alvo contém o códon de partida traducional do mRNA bacteriano, ou uma sequência que está dentro de 20 bases, em uma direção montante (isto é, 5') ou jusante (isto é, 3'), do códon de partida traducional, e onde o oligômero se liga ao mRNA para formar um hetero- duplex, assim inibindo a replicação da bactéria. Também são inclusos conjugados dos oligômeros onde conjugados aos oligômeros estão uma proteína carreadora rica em arginina acoplada ao oligonucleotídeo no terminal carboxila do peptídeo, e preferivelmente representado pela sequência peptídica (RXX)n- ou (RXR)n, onde X é um aminoácido não carregado selecionado a partir do grupo consistindo de alanina, ~-alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, glicina treonina, fenilalanina, tripto- dano, e ácido 6-aminoexanóixo, e n=2 a 4. Nas modalidades exemplares, o peptído carrea- dor tem a sequência (RFF)n, (RFF)nR, ou (RXR)n onde n = 2 a 4. O peptídeo carreador pode ser ligado ao seu e-terminal para uma terminação do oligômero, por exempo, a terminação 5 3' ou 5', através de um ou dois aminoácidos ligadores, tal como o ligador Ahx~Ala, onde Ahx é ácido 6-aminoexanóico e ~Ala é ~-alanina. O peptídeo carreador tem a habilidade, quando conjulgado para o terminal 3' ou 5' do oligonucleotídeo, para aumentar a atividade anti- bacteriana do oligonucleotídeo, como medido por inibição no crescimento bacteriano in vitro por um período de oito horas, por um fator de pelo menos 1O, e preferivelmente 102 ou 103 . 1O Em uma modalidade preferida, o peptídeo veículo tem a sequência (RAhxR)n-, onde n- 4.
12. Modulação dos Receptores de Hormônio Nuclear Em outra modalidade a presente invenção relaciona-se a composições e métodos para modulação da expressão dos receptores de hormônio nuclear (NHR) a partir da super- família do receptor de hormônio nuclear (NHRSF), principalmente por controlar ou alterar o splicing do pré-mRNA que codifica para os receptores. Exemplos de NHRs particulares in- cluem receptor glicocorticóide (GR), receptor de progesterona (PR) e receptor de andrógeno (AR). Em certas modalidades, os oligonucleotídeos antisenso e agentes descritos aqui le- vam a expressão aumentada do ligante-independente ou outras formas selecionadas dos receptores, e expressão diminuída das suas formas inativas. Modalidades da presente invenção incluem oligômeros e análogos do oligonucleo- tídeo, por exemplo, oligômeros compreendendo pelo menos uma ligação do tipo (B) e/ou pelo menos uma modificação terminal (por exemplo, pelo menos um R20 ) ou combinações dos mesmos, que são complementares as sequências exônicas ou intrônicas de um NHR, incluindo os "éxons ligantes de ligante" e/ou íntrons adjacentes de um NHRSF pré-nRNA, entre outros domínios NHR descritos aqui. O termo "éxons ligantes de ligante" refere-se a éxon(s) que estão presentes no mRNA selvagem, mas são removidos a partir do transcrito primário (o "pré-mRNA") para fazer uma forma independente de ligante do mRNA. Em cer- tas modalidades, complementariedade pode ser baseada em sequências na sequência de pré-mRNA que transpõe um sítio splice, que inclui, mas não é limitado a, complementarida- de baseada em sequências que transpõe uma junção éxon-íntron. Em outras modalidades, complementaridade pode ser baseada somente na sequência de íntron. Em outras modali- dades, complementaridade pode ser baseada somente na sequência do éxon. (Ver, por exemplo, Ped. dos EUA Num. 13/046.356, que é aqui incorporado por referência). Moduladores NHR podem ser úteis no tratamento de doenças associadas a NHR, incluindo doenças associadas com os produtos de expressão dos genes cujas transcrições são estimuladas ou reprimidas por NHRs. Por exemplo, moduladores dos NHRs que inibem AP-1 e/ou NH-KB podem ser úteis no tratamento de doenças e distúrbios inflamatórias e imune tais como osteroartrite, artrite reumatóide, esclerose múltipla, asma, doença do intes- tino inflamatória, rejeição do transplante, e enxerto vs. doença do hospedeiro, entre outros descritos aqui e conhecidos na técnica. Compostos que antagonizam transativação podem ser úteis no tratamento de doenças metabólicas associadas com níveis aumentados de gli- cocorticóides, tais como diabetes, osteroporose e glaucoma, entre outros. Também, com- postos que agonizam transativação podem ser úteis no tratamento de doenças metabólicas associadas com uma deficiência no glicocorticóide, tal como doença de Addison e outros. Modalidades da presente invenção incluem métodos de modulação da atividade NHR nuclear ou expressão em uma célula, compreendendo contato da célula com um oli- 1O gômero antisenso composto de subunidade morflino ligado por ligações intersubunidades contendo fósforo, unindo um morfolino nitrogênio de uma subunidade a um carbono 5'exocíclico de uma subunidade adjacente, em que o oligonucleotídeo contém entre 10-40 bases e uma sequência alvo de pelo menos 1O bases contíguas complementares a uma sequência alvo, em que a sequência alvo é um transcrito pré-mRNA do NHR, assim modu- lando a atividade ou expressão do NHR. Em certas modalidades, o oligômero altera a splice do transcrito pré-mRNA e aumenta a expressão de um variante do NHR. Em algumas moda- lidades, o oligômero induz o completo ou parcial escape do éxon de um ou mais éxons do transcrito pré-mRNA. Em certas modalidades, o um ou mais éxons codificam pelo menos uma porção de um domínio ligador de ligante do NHR, e a variante é um ligante indepen- dente da forma do NHR. Em certas modalidades, o um ou mais éxons codificam pelo menos uma porção de um domínio de transativação do NHR, e o variante tem a atividade de ativa- ção transcricional reduzida. Em certas modalidades, o um ou mais éxons codificam pelo menos uma porção de um domínio ligador de DNA do NHR. Em certas modalidades, o um ou mais éxons codificam pelo menos uma porção de um domínio de ativação do N-terminal do NHR. Em certas modalidades o um ou mais éxons codificam pelo menos uma porção do domínio carbóxi-terminal do NHR. Nas modalidades específicas, o variante liga ao NF-KB, AP-1, ou ambos, e reduz transcrição de um ou mais dos genes alvos pró-inflamatórios. Em certas modalidadesm o oligômero agoniza uma atividade transcricional transati- vacional do NHR. Em outras modalidades, o oligômero antagoniza uma atividade transcrici- onal transativacional do NHR. Em certas modalidades, o oligômero agoniza uma atividade de transrepressão do NHR. Em outras modalidades, o oligômero antagoniza uma atividade de transrepressão do NHR. Em modalidades específicas, o oligômero antagoniza uma ativi- dade transcricional transativacional do NHR e agoniza uma atividade transrepressão do NHR. (Ver, por exemplo, Ped. dos EUA Núm. 61/313.652, que é aqui incorporada por refe- rência).
EXEMPLOS A menos que de outra forma notado, todos os químicos foram obtidos a partir de
Sigma-Aldrich-Fluka. Benzoil adenosina, benzoil citidina, e fenilacetil guanosina foram obti- dos a partir de Carbosynth Limited, RU. Síntese de PMO, PMO+, PPMO e PMO contendo modificações de ligação adicio- nais como descrito aqui foi feita usando métodos conhecidos na técnica e descrito nos Pedi- dos dos EUA pendentes Nos. 12/271.036 e 12/271/040 e Publicação PCT número W0/2009/064471, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. PMO com uma modificação 3'tritil são sintetizadas essencialmente como descrito na publicação PCT número W0/2009/064471 com a exceção que o passo de detritilação é omitida. EXEMPLO 1 4-(2,2,2-TRIFLUORACETAMIDO)PIPERIDINA-1-CARBOXILATO DE TERC-
BUTILA TFAHN-CNBoc A uma suspensão de 4-aminopiperidina-1-carboxilato de terc-butla (48,7 g, 0,243 mal) e DIPEA (130 mL, 0,749 mal) em DCM (250 mL) foi adicionado trifluoracetato de etila (35, 6 mL, 0,300 mal) gota a gota enquanto agitação. Após 20 horas, a solução de bicarbo- nato de sódio (200 mL x 3, cone. aq), seca (MgS04 ), e filtrada através de sílica (24 g). A síli- ca foi lavada com DCM e o eluente combinado foi parcialmente concentrado (100 mL), e usado diretamente no próximo passo. APCl/MS caled. Para C12 H19 F3 N20 3 , 296, 1, encontra- do m/z=294,9 (M-1 ). EXAMPLE 2 CLORIDRATO DE 2,2,2-TRIFLÚOR-N-(PIPERIDIN-4-IL)ACETAMIDA TFAHN-CNH
HCI Solução DCM do composto título do Exemplo 1 (100 mL) foi adicionada gota a gota a solução de cloreto de hidrogênio (250 mL, 1.0 mal) em 1,4-dioxano (4 M). Agitação foi con- tinuada por 6 horas, então a suspensão foi filtrada, e o solid lavado com dietil éter (500 mL) para fornecer o composto título (54,2 g, 96% de produção) como um sólido branco. APCl/MS calcd. para C7 H11 F3N20 196,1, found mlz = 196,9 (M+1). EXEMPLO 3 DICLORETO DE (4-(2,2,2-TRIFLUORACETAMIDO)PIPERIDIN-1-IL)FOSFÔNICO
CI TFAHN-0-~=0
CI A uma suspensão arrefecida (banho de gelo/água) do composto título do Exemplo 2 (54,2 g, 0,233 mal) em DCM (250 mL) foi adicionado gota a gota oxicloreto de fósforo (23,9 ml, 0,256 mol) e DIPEA (121,7 ml, 0,699 mol) e agitado. Após 15 minutos, o banho foi re- movido e e com agitação continuada a mistura permitida aquecer para temperatura ambien- te. Após 1 hora, a mistura foi parcialmente concentrada (100 mL), a suspensão filtrada, e the sólido lavado com dietil éter para fornecer o composto título (43,8 g, 60%> produção) como um sólido branco. O eluente foi parcialmente concentrado (100 mL), a suspensão resultante filtrada, e o sólido lavado com dietil éter para fornecer composto título adicional (6,5 g, 9%> produção). ESl/MS calcd. para derivado 1-(4-nitrofenil)piperazina C17H22CIF3Ns04P 483, 1, encontrado mlz =482, 1 (M-1) EXEMPLO 4 (4-(2, 2,2-TRIFLUORACETAMIDO )PIPERIDIN-1-IL)FOSFONOCLORIDATO DE ((2S, 6S)-6- ((R)-5-METIL-2,6-DIOX0-1,2,3,6-TETRAIDROPIRIDIN-3-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2-IL)METILA TFAHN-CN-~=O 0
CI 't,o Rº ?"' NH
LN CPh3 o A uma solução agitada, gelada (banho de gelo/água) do composto título do Exem- plo 3 (29,2 g, 93,3 mmol) em DCM (100 mL) foi adicionada gota a gota por 1O minutos uma solução DCM (100 mL) de Mo(Tr)T # (22,6 g, 46,7 mmol), 2,6-Lutidina (21,7 mL, 187 mmol), e 4-(dimetilamino)piridina (1, 14 g, 9,33 mmol). O banho foi permitido aquecer para tempera- tura ambiente. Após 15 horas, a solução foi lavada com uma solução de ácido cítrico (200 mL x 3, 10 % p/v aq), seca (MgS0 4), concentrada, e o óleo bruto foi carregado diretamente na coluna. Chromatografia [coluna Si0 2 (120 g), eluente hexanos/EtOAc (gradiente 1:1 a O: 1), repetido x 3] frações foram concentradas para prover o composto título (27,2 g, 77% produção) como um sólido branco. ESl/MS calcd. para o derivado1-(4-nitrofenil)piperazina C4sHsoF3N 8 0 8 P 930,3, encontrado mlz =929,5 (M-1 ). EXEMPLO 5 (4-(2,2,2-TRIFLUORACETAMIDO )PIPERIDIN-1-IL)FOSFONOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(6- BENZAMID0-9H-PURIN-9-IL)-4-TRITILMORFOLI N-2-IL)METILA O composto título foi sintetizado em uma forma análoga àquela descrita no Exem- plo 4 para fornecer o composto título (15,4 g, 66%> produção) como um branco sólido.
ESl/MS calcd. para derivado 1-(4-nitrofenil)piperazina Cs3Hs3F3N1107P 1043,4, encontrado mlz = 1042,5 (M-1). EXEMPLO 6 DICLORETO (R)-METIL(1 -FENILETIL)FOSFORAMÍDICO
D-<-~~º / CI 5 A uma solução gelada (banho gelo/água) de oxicloreto de fósforo (2,83 mL, 30,3 mmol) em DCM (30 mL) foi adicionado sequencialmente, gota a gota, e com agitação 2,6- lutidina (7,06 mL, 60,6 mmol) e uma solução DCM de (R)-(+)-N,a-dimetilbenzilamina (3,73 g, 27,6 mmol). Após 5 minutos, o banho foi removido e mistura reacional permitida aquecer 1O para temperatura ambiente.
Após 1 hora, a solução reacional foi lavada com uma solução de ácido cítrico (50 mL x 3, 1O % p/v aq), seca (MgS0 4), filtrada através de Si0 2 e concen- trada para prover o composto título (3,80 g) como uma espuma branca.
ESl/MS calcd. para derivado1-(4-nitrofenil)piperazina C 19 H25 N40 4P 404,2, encontrado mlz =403, 1 (M-1 ). EXEMPLO 7 DICLORETO (S)-METIL(1 -FENILETIL)FOSFORAMÍDICO .::- ' CI N-P=O / CI O composto título foi sintetizado em uma forma análoga àquela descrita no Exem- plo 6 para fornecer o composto título (3,95 g) como uma espuma branca.
ESl/MS 20 calcd. para derivado 1-(4-nitrofenil)piperazina C 19 H2sN404P 404,2, encontrado mlz =403,1 (M-1). EXEMPLO 8 METIL((R)-1-FENILETIL)FOSFORAMIDOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOX0- 3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4- TRITILMORFOLIN-2-IL)METILA
O composto título foi sintetizado em uma forma análoga àquela descrita no Exem- pio 4 para fornecer o clorofosforoamidato título (4,46 g, 28% produção) como um sólido branco.
ESl/MS calcd. para C 38 H40CIN 40 5 P 698,2, encontrado m/z =697,3 (M-1). EXEMPLO 9 METIL((S)-1-FENILETIL)FOSFORAMIDOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOXO-
3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2-IL)METILA ~/CI ~N-P=O 1 i 6 r"Yº ê::(1( CPh3 O composto título foi sintetizado em uma forma análoga àquela descrita no Exem- plo 4 para fornecer o clorofosforoamidato título (4,65 g, 23% produção) como um sólido 5 branco. ESl/MS calcd. para C38 H40CIN40 5 P 698,2, encontrado m/z =697,3 (M-1). EXEMPLO 10 DICLORETO CLORI DRATO (4-(PIRROLIDIN-1-IL)PIPERIDIN-1-IL)FOSFÔNICO
CI CN-CN-~=O
HCI CI A uma solução gelada (banho gelo/água) de oxicloreto de fósforo (5,70 mL, 55,6 mmol) em DCM (30 mL) foi adicionado 2,6-lutidina (19,4 mL, 167 mmol) e uma solução DCM (30 mL) de 4-(1-pirrolidinil)-piperidina (8,58 g, 55,6 mmol) e agitado por 1 hora. A suspensão foi filtrada e o sólido lavado com excesso de dietil éter para fornecer a pirrolidina título (17, 7 g, 91% produção) como um sólido branco. ESl/MS calcd. para derivado 1-(4- nitrofenil)piperazina C19 H30 N5 0 4P 423,2, encontrado mlz =422,2 (M-1 ). EXEMPLO 11 (4-PIRROLIDIN-1-IL)PIPERIDIN-1-IL)FOSFONOCLORIDATO CLORIDRATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOX0-3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2- IL)METILA
CI CN~N-~=O ~ o HCI ºt, N l::(1(H CPh3 A uma solução agitada, gelada (banho de gelo/água) de diclorofosforamidato 8 (17,7 g, 50,6 mmol) em DCM (100 mL) foi adicionado uma solução DCM (100 mL) de Mo(Tr)T # (24,5 g, 50,6 mmol), 2,6-Lutidina (17,7 mL, 152 mmol), e 1-metilimidazol (0,401 mL, 5,06 mmol) gota a gota por 1O minutos. O banho foi permitido aquecer para temperatura ambiente enquanto a suspensão foi agitada. Após 6 horas, a suspensão foi vertida em dietil éter (1 L), agitada por 15 minutos, filtrada e sólido lavado com éter adicional para fornecer um sólido branco (45,4 g). O produto bruto foi purificado por Cromatografia [coluna Si0 2
(120 grama), eluente DCM/MeOH (gradiente 1:O a 6:4)], e as frações combinadas foram vertidas em dietil éter (2,5 L), agitada por 15 min, filtrada, e o sólido resultante lavado com adicional éter para fornecer o composto título (23, 1 g, 60% produção) como um sólido bran- co. ESl/MS calcd. para 1-(4- nitrofenil)piperazina derivado C48 H57 N80 7 P 888,4, encontrado 5 mlz =887,6 (M-1). EXEMPLO 12 ÁCIDO 3-(TERC-BUTILDISULFANIL)-2-(ISOBUTOXICARBONILAMINO )PROPANÓI co )-o~ ......_ 1 HN A8 ,..s~oH 2 o A S-terc-butilmercapto-L-cisteína (10 g, 47,8 mmol) em CH 3 CN (40mL) foi adiciona- 1O do K2C0 3 (16,5 g, 119,5 mmol) em H20 (20mL). Após agitação por 15 minutos, iso-butil clo- roformato (9,4 mL, 72 mmol) foi injetado lentamente. A reação foi permitida correr por 3 ho- ras. O sólido branco foi filtrado através de Celite; o filtrado foi concentrado para remover CH 3 CN. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila (200mL), lavado com 1N HCI (40 mL X 3), solução salina (40 X 1), seco em Na2S04. Produto desejado (2)foi obtido após cromato- grafia (5% MeOH/DCM). EXEMPLO 13 TERC-BUTIL4-(3-(TERC-BUTILDISULFANIL)-2- (ISOBUTOXICARBONILAMINO)PROPANAMIDO)PIPERIDINA-1 -CARBOXILATO )-o~ ....._ J HN H /--.s. . S~N'CNBoc 3 o Ao ácido (composto 2 do Exemplo 12, 6,98 g, 22,6 mmol) em DMF (50 mL foram adicionados HATU (8,58 g, 22,6 mmol). Após 30 min, base Hunig (4,71 mL, 27,1 mmol) e 1- Boc-4-amino piperidina (5,43 g, 27, 1 mmol) foram adicionados à mistura. A reação foi conti- nuada em agitação em TA por outras 3 h. DMF foi removido em alto vácuo, o resíduo bruto foi dissolvido em EtAc (300ml), e lavado com H20 (50 mL X 3). O produto final (3) foi obtido após purificação ISCO (5% MeOH/DCM). EXEMPLO 14 3-(TERC-BUTILDISULFANIL)-1-0X0-1-(PIPERIDIN-4-ILAMINO)PROPAN-2-IL
CARBAMATO DE ISOBUTILA
-.. ._ j HN J-or-<
H /---s..-S~NJ\NH 4 o \ _ _) Ao composto 3 preparado no Exemplo 13 (7,085 g, 18, 12 mmol) foi adicionado 30 mL de 4M HCl/Dioxano. A reação foi completada após2h em TA. O sal HCI (4) foi usado para o próximo passo sem purificação adicional. 5 EXEMPLO 15 3-(TERC-BUTILDISULFANIL)-1-(1-(DICLOROFOSFORIL)PIPERIDIN-4-ILAMIN0)- 1-0XOPROPAN-2-ILCARBAMATO DE ISOBUTILA J-or-<( -....1 HN H CI ~s. . S~N~N-~==o o ~l 5 Ao composto 4 preparado no Exemplo 15 (7,746 g, 18,12 mmol) em DCM (200 mL) 1O a -78° C foi lentamente injetado POCl3 (1,69 mL, 18, 12 mmol) sobre Ar, seguido por adição de Et 3 N (7,58 mL, 54,36 mmol). A reação foi agitada a TA por 5 h, concentrada para remo- ver o excesso de base e solvente. O produto (5) foi dado como um sólido branco após purifi- cação ISCO (50% EtAc/Hexano). EXEMPLO 16 3-(TERCOBUTILDISULFANIL)-1-(CLOR0((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOX0-3,4- DI 1DROPI RI MI OI N-1 (2H)-I L)-4-TRITI LMORFOLI N-2-IL)METÓXl)FOSFORIL)PI PERi OI N-4- 1LAMl N0)-1-0XOPROPAN-2-ILCARBAMATO DE ISOBUTILA o HN)\-o r-< CI >ls. .s~~-CN-f =o l o o o r-717 6 ~O~Nlf NH
N Tr A 1-( (2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il)-5-metilpirimidina-2,4( 1 H, 3H)-diona (moT(Tr)) (5,576 g, 10,98 mmol) em DCM (100 mL) a OoC, foi adicionado lutidina (1,92 mL, 16,47 mmol) e DMAP (669 mg, 5,5 mmol), seguido pela adição de 4 (6, 13 g, 12,08 mmol). A reação foi deixada agitar em TA por 18 h. O produto desejado (6) foi obtido após purificação ISCO (50% EtAc/Hexano). EXEMPLO 17
HEXIL(METIL)FOSFORAMIDOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOX0- 3,4-DI 1DROPI RI MI OI N-1 (2H)-I L)-4-TRITI LMORFOLI N-2-1 L)METI LA
CI - \ 1 \ ;---"N-~=o No ~H \____; ºtorNtH N Tr Uma solução DCM (80 mL) de N-hidroxilmetilamina (4,85 mL, 32 mmol) foi arrefeci- 5 da para -78° C sobre N2. Uma solução de cloreto de fosforila (2,98 mL, 32 mmol) em DCM (1 O mL), seguido por uma solução de Et3N (4,46 mL, 32 mmol) e DCM (1 O mL), foi adicio- nada lentamente. A agitação foi continuada enquanto a reação foi permitida aquecer para TA por uma noite. O produto desejado (1) foi dado como óleo limpo após purificação ISCO (20% EtAc/Hexano). 1O Ao moT(Tr) (5, 1O g, 10,54 mmol) em DC (100 mL) a OoC, foi adicionado lutidina (3,68 mL, 31,6 mmol) e DMAP (642 mg, 5,27 mmol), seguido pela adição de 1 (4,89 g, 21,08 mmol). A reação foi deixada agitando em TA por 18 h. O produto desejado (2) foi obtido após purificação ISCO (50% EtOAc/Hexano). EXEMPLO 18 DODECIL(METIL)FOSFORAMIDOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4- DIOX0-3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2-IL)METILA
CI \ 91 \ 1 o Cj \ N-P=O N-P=O ~ ~ bc~:tHO O composto título foi preparado de acordo com os procedimentos gerais descritos nos Exemplos 6 e 8. EXEMPLO 19 MORDOLI NOFOSFONOCLORI DATO DE ((2S ,6R)-6-METI L-2,4-DIOX0-3,4- DI 1DROPI RIMI OI N-1 (2H)-I L)-4-TRITI LMORFOLIN-2-IL)METI LA
CI í\ 91 /\ 1 O N-P=O O N-P=O ~ \_/ Cr \_/ 1 o o .y (ºy"l("
N Tr O composto título foi preparado de acordo com os procedimentos gerais descritos nos Exemplos 6 e 8.
EXEMPLO 20 (S)-2-(METOXIMETIL)PIRROLIDIN-1-ILFOSFONOCLORIDATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4- DIOX0-3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2-IL)METILA
H
N ·"' "- O:.. N-~=O o
CI
IY º - . 1 o- o ~ r( (ºyN'(H
N Tr 5 O composto título foi preparado de acordo com os procedimentos gerais descritos nos Exemplos 6 e 8. EXEMPLO 21 4-(3,4,5-TRIMETOXI BENZAMI DO)PI PERIDI N-1-1 LFOSFONOCLORI DATO DE ((2S,6R)-6-(5-METIL-2,4-DIOX0-3,4-DllDROPIRIMIDIN-1 (2H)-IL)-4-TRITILMORFOLIN-2-IL)
METILA o Meo~ 0 MeO~N-QNsoc - MeO 1 ó OMe 7 H - i Me O ó N-ONH
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B - OMe O Cl MeOtr-N-ON-~=O
O CI _ ... MeOxr-N-oN-~=o MeO H 1 ! ó ºt_, h 7'
O 1 H 1 MeO ( 9 CI OMe 10 l:)NlNH OMe Tr A 1-Boc-4-piperidina (1 g, 5 mmol) em DCM (20 mL) foi adicionado base Hunig (1,74 mL, 1O mmol), seguido pela adição de cloreto de 3,4,5-trimetoxibenzoi!a (1,38 g, 6 mmol). A reação foi corrida a TA por 3 h, concentrada para remover solvente e excesso de base. O resíduo foi dissolvido em EtAc (100 mL), lavado com 0,05 N HCI (3x 15 mL), NaHC0 3 sat. (2 x 15 mL), seco em Na 2 S0 4 . Produto (1) foi obtido após purificação ISCO (5% MeOH/DCM). Ao 7 foi adicionado 15 mL de 4N HCl/Dioxano, reação foi terminada após 4 h. 8 foi obtido como sólido branco. Um solução DCM (20 mL) do 8 (1,23 g, 4, 18 mmol) foi arrefecida para -78° C sobre N2 . Uma solução de cloreto de fosforila (0,39 mL, 4, 18 mmol) em DCM (2 mL), seguido por uma solução de Et3N (0,583 mL, 4, 18 mmol) em DCM (2 mL), foi adicionada lentamente. A agitação foi continuada enquanto a reação foi permitida aquecer para TA por uma noite. O produto desejado (9) foi obtido após purificação ISCO (50% EtAc/Hexano). A moT(Tr) (1,933 g, 4,0 mmol) em DCM (20 mL) a OoC, foi adicionado lutidina (0,93 ml, 8 mmol) e DMAP (48 mg, 0,4 mmol) seguido pela adição de O (1,647 g, 4 mmol). A rea- ção foi deixada agitar em TA por 18 h. O produto desejado (1 O) foi obtido após purificação ISCO (50% EtAc/Hexano). EXEMPLO 22 5 Síntese de subunidade contendo ciclofosforamida (cpt)
OCM
NMI Tosilação A subunidade moT (25 g) foi suspensa em DCM (175 ml) e NMI (N-metilimidazol, 5,94 g, 1,4 eq.) foram adicionadas para obter uma solução limpa. Cloreto de tosila foi adicio- nado à mistura reacional, e o progresso reacional foi monitorado por TLC até feito (cerca de 2 horas). Um teste adicional aquoso foi feito por lavagem com 0,5 M de tampão de ácido cítrico (pH = 5), seguido por solução salina. A camada orgânica foi separada e seca em Na 2 S0 4 . Solvente foi removido com um rotavapor para obter o produto bruto que foi usado no próximo passo sem purificação adicional. O moT Tosilato preparado acima foi misturado com propanolamina (1 g/ 10 ml). A mistura reacional foi então colocada em um forno a 45oC por uma noite seguido pela dilui- ção com DCM (10 ml). Um teste adicional aquoso foi feito por lavagem com 0,5 M de tam- pão de ácido cítrico (pH = 5), seguido por solução salina. A camada orgânica foi separada e seca em Na2S04. Solvente foi removido com um rotavapor para obter o produto bruto. O produto bruto foi analisado por RMN e HPLC e determinado estar pronto para o próximo passo sem purificação adicional. O produto bruto foi dissolvido em DCM (2,5 ml DCM/g, 1 eq.) e misturado com DIEA (3 eq.). Esta solução foi arrefecida com acetona gelada e POCl3 foi adicionado gota a gota {1,5 eq.). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente por uma noite. Um teste adicional aquoso foi feito por lavagem com 0,5 M de tampão de ácido cítrico (pH = 5), seguido por solução salina. A camada orgânica foi separada seca em Na2S04. Solvente foi removido com um rotavapor para obter o produto bruto como um sólido amarelado. O produ- to bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (produto bruto/sílica = proporção de 1 para 5, gradiente DCM a 50% EA/DCM), e frações foram agrupadas de acordo com análise
TLC. Solvente foi removido para obter o produto desejado como uma mistura de diastereô- meros. O produto purificado foi analisado por HPLC (extinção NPP) e RMN (H-1 e P-31 ). A mistura diastereomérica foi separada de acordo com o seguinte procedimento. A mistura (2,6 g) foi dissolvida em DCM. Esta amostra foi carregada em uma coluna RediSe- pRf (80 g de fase normal feita por Teledyne Isco) e eluída com 10% EA/DCM para 50% de EA/DCM por 20 minutos. Frações foram coletadas e analisadas por TLC. Frações foram agrupadas de acordo com a análise de TLC, e solvente foi removido com um rotavapor em temperatura ambiente. A proporção diastereomérica das frações agrupadas foi determinada por P-31 RMN e análise NPP-TFA. De fato, o procedimento acima foi repetido até a propor- 1O ção diastereomérica alcançar 97%. EXEMPL023
MODIFICAÇÃO GLOBAL DO ÁCIDO CÓLICO DE PMOPLUS o
OH 0~0 DCM
THF C4HsN03 C2~H4005 ... -··- P. Mol.:115.09 OH C2sH43N07 OH P. Mol.:408.57 4.0g P. Mol.:505.64
34.8 mmol 12g
29.4mmol r- o i N=C=N /N~
HCI CaHmCIN3 P. Mol.:191.70 C,H10N2 5.6g P. Mol.:122.17 29.3 rnrnol 1g B.2 rnrnol o --· --
DMSO 500 ui NH3-H20 PM: 7076 OH Fórmula Química: C 2.eH43NOr 09DE14-J(A7 to F7) Peso Molecular: 505 .64352 NG-0~0367 sitio 3 plus 404-152 Peso Molecular ht: 391.56 3"-E h 13 mg 7076+4"391 25 ummef 74G7 20mg 7858
2.8 umol 82'19 5 86'10 A succinimida ativada do derivado do ácido cólico foi preparada de acordo com o seguinte procedimento. Ácido cólico (12 g, 29,4 mmol), N-hidroxisuccinimida (4,0 g, 34,8 mmol), EDCI (5,6 g, 29,3 mmol) e DMAP (1 g, 8,2 mmol) foram carregados para um frasco de fundo redondo. DCM (400 ml) e THF (40 ml) foram adicionados para dissolver. A mistu- ra reacional foi agitada em temperatura ambiente por uma noite. Água (400 mL) foi então adicionada à mistura reacional, a camada orgânica separada e lavada com água (2 x 400 ml), seguido por NaHC03 sat. (300 ml) e solução salina (300 ml). A camada orgânica foi então seca em Na2S04. Solvente foi removido com rotavapor para obter um sólido branco.
O produto bruto foi dissolvido em clorofórmio (100 mL) e precipitado em heptano (1000 mL). O sólido foi coletado por filtração, analisado por HPLC e RMN e usado sem purificação adi- cional. Uma quantidade apropriada de PMOplus (20 mg, 2,8 µmol) foi pesada em um fras- 5 co (4 mL) e dissolvida em DMSO (500 µL). O éster colato ativado (13 mg, 25 µmol) foi adici- onado à mistura reacional de acordo com a proporção de dois equivalentes do éster ativo por sítio de modificação seguido por agitação em temperatura ambiente por uma noite. Pro- gresso de reação foi determinado por MALDI e HPLC (C-18 ou SAX). Após a reação ser completa (como determinado por desaparecimento do PMOplus 1O de partida), 1 mL de amônia concentrada foi adicionada a mistura reacional uma vez a rea- ção esteja completa. O frasco reacional foi então colocado em um forno (45oCO por uma noite (18 horas) seguido por arrefecimento para temperatura ambiente e diluição com 1% de amônia em água (1 O mL). Esta amostra foi carregada em uma coluna SPE (2 cm), e o frasco lavado com 1$ de solução de amônia (2 x 2 mL). A coluna SPE foi lavada com 1% de amô- nia em água (2 x 6 mi), e o produto eluído com 45% de acetonitrila em 1% de amônia em água (6 mL). Frações contendo oligômero foram identificadas por medidas de densidade ótica UV. Produto foi isolado por liofilização. Pureza e identidade foram determinados por MALDI e PLC (C-18 e/ou SAX). Este mesmo procedimento é aplicável a ativação a conjugação do ácido deoxicólico a um PMO+. EXEMPLO 24
GUANIDINILAÇÃO GLOBAL DE PMOPLUS Uma quantidade apropriada de PMOplus (25 mg, 2,8 µmol) foi pesada em um fras- co (6 mL). Cloreto de 1H-pirazol-1-carboxamida (15 mg, 102 µmol) e carbonato de potássio (20 mg, O, 15 mmol) foram adicionados ao frasco. Água foi adicioanda (500 µL), e a mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente por uma noite (cerca de 18 horas). O término da reação foi determinado por MALDI. Uma vez completa, a reação foi diluída com 1% de amônia em água (1 O mL) e car- regada em uma coluna SPE (2 cm). O frasco foi lavado com 1% de solução de amônia (2 x 2 mL), e a coluna SPE foi lavada com 1% de amônia em água (3 x 6 mL). Produto foi eluído com 45% de acetonitrila em 1% de amônia em água (6 mL). Frações contendo oligômero foram identificadas por medidas da densidade ótica UV. Produto foi isolado por liofilização. Pureza e identidade foram determinadas por MALDI e HPLC (C-18 e/ou SAX). EXEMPLO 25 MODIFICAÇÃO GLOBAL DE TIOACETILA DE PMOPLUS (M23D)
B rolº) N º""'~
DMSO J'-olº)ª (_; N SOO ui º)N ""'iv PM: 8710 S MW: 8710'117n Fórmula Química: C8 H9 N0 5 S 1._ 8827 10fob16-J(D1) Massa Exata: 231.0 ~o 8944 NG-09-0719 9061 M23D SATA Massa Exata: 117.0 9178 sitio 3 plus 3"-E h N-succinimidil-S-acetiltioacetato
B !Amonólise 20mg
2.3 umol 7mg 28umol 3eq_ 'olºJ N o~~ (N'ºlº)ª N_) N ºY i ~ BTIO+n'75 H 8785 Massa Exata: 75.0 8860 8935 9010 Uma quantidade apropriada de PMOplus (20 mg, 2,3 µmol) foi pesada em um fras- co ( 4 mL) e dissolvida em DMSO (500 µL). N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) (7 mg, 28 µmol) foi adicionado a mistura reacional, e ela foi permitida agitar em temperatura ambi- ente por uma noite. Progresso reacional foi monitorado por MALDI e HPLC. Uma vez completo, 1% amônia em água foi adicionada à mistura reacional, e ela foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. Esta solução foi carregada em uma coluna SPE (2 cm). O frasco foi lavado com1 % solução de amônia (2 x 2 mL), e a coluna SPE foi lavada com 1% de amônia em água (2 x 6 mL). Produto foi eluído com 45% de acetonitrila 1O em 1% de amônia em água (6 mL). Frações contendo oligômero foram identificadas por medida de densidade ótica UV. Produto foi isolado por liofilização. Pureza e identidade fo- ram determinadas por MALDI e HPLC (C-18 e/ou SAX). EXEMPLO 26
MODIFICAÇÃO GLOBAL DE ÁCIDO SUCCÍNICO DE PMOPLUS -/-o.--......,.ºY 8 lN) º"'~ ---
DMSO SOO ui NHrH,o O ~_) tl'-olº)!l
N Fórmula Quimica: C4 H4 0 3 Pelo Molecular: 100.07276 HO~N ;,.O PM: 8710 o o~ 10FE02-R(A7) 10mg HO NG-09-0719 100umol Fórmula Química: C6 H13 NO Fórmula Química: C..tH 50 3 sitio 3 plus Pelo Molecular: 101.08070 3"-Eh Pelo Molecular: 115.17352 32mg d~0.91 8710"''100
3.7 umol 1C-O umol 8810 12mg 8910 13i1\ 9010 5 9110 Uma quantidade apropriada de PMOplus (32 mg, 3, 7 µmol) foi peada em um frasco (4 mL) e dissolvida em DMSP (500 µL). N-etil morfolino (12 mg, 100 µmol) e anidrido succí-
nico (10 mg, 100 µmal) foram adicionados à mistura reacional, e ela foi permitida agitar em temperatura ambiente por uma noite. Progresso reacional foi monitorado por MALDI e HPLC. Uma vez completa, 1% de amônia em água foi adicionada à mistura reacional, e ela foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. Esta solução foi carregada em uma coluna SPE (2 cm). O frasco foi lavado com solução 1% de amônia (2 x 2 mL), e a coluna SPE foi lavada com 1% de amônia em água (3 x 6 mL). Produto foi eluído com 45% de acetonitrila em 1% de amônia em água (6 mL). Frações contendo oligômero foram identificadas por medida da densidade ótica UV. Produto foi isolado por liofilização. Pureza e identidade fo- ram determinadas por MALDI e HPLC (C-18 e/ou SAX). O procedimento acima é aplicável a modificação do ácido glutártico (anidrido glutá- rico) e ácido tetrametilenoglutárico (anidrido tetrametilenoglutárico) do PMOplus também.
anidrido tetrametilenoglutárico anidrido glutárico EXEMPLO 27
TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS MDX COM OLIGOMEROS PMO
EXEMPLARES DA INVENÇÃO O camundongo MDX é um modelo animal aceito e bem caracterizado para distrofia muscular de Duchene (DMD) contendo uma mutação no éxon 23 do gene distrofina. A se- quência antisenso M23D (SEQ ID N0:15) é conhecida por induzir o escape do éxon 23 e restauração da expressão da distrofina funcional. Camundongos MDX foram doseados uma vez (50 mg/kg) por injeção pela veia da cauda com ou oligômeros M23D PMO+ (NG-09- 0711, NG-10-0055, NG-10-0056) ou dois compostos PMO contendo ou a ligação 4- aminopiperidinil (NG-10-0070 contendo a ligação PMOªPn descrita acima e mostrada na Fi- gura 2) e a ligação 4-succinamidopiperazinil (NG-10-0105 contendo a ligação PMosuc descri- ta acima e mostrada na Figura 2). Um PMO conjugado a peptídeo (PPMO) foi usado como um controle positivo no experimento (AVl-5225; SEQ ID N0:16). Todos os oligômeros testa- dos têm a sequência antisenso, mas variaram pelo tipo de ligação ou um peptídeo (no caso de AVl-5225, ver Tabela 8)). Uma semana pós-injeção, os camundongos MDX foram sacrifi- cados e RNA foi extraído a partir de vários tecidos tissulares. PCR end-point (PCR foi usado para determinar a abundância relativa do mRNA distrofina contendo éxon 23 e mRNA com espace do éxon 23 devido ao escape do éxon induzido por antisenso. Porcentagem de es- cape do éxon 23 é uma medida da atividade antisenso in vivo. Figura 5 mostra os resultados a partir do quadrícepes uma semana após tratamento. NG-10-0070 contendo quatro liga-
ções 4-aminopiperidinil catiônicas mostram um aumento de duas vezes na atividade compa- rada a qualquer dos compostos PMO+ (NG-10-0055, -0056 e -0057). O composto NG-10- 0105 contendo quatro ligações 4-succinamidopiperazinil aniônicas foi igualmente ativo com- parado aos oligômeros PMO+. Como esperado o composto AVl-5225 PPMO (conjugado ao peptídeo) foi mais efetivo devido ao peptídeo de distribuição penetrante em célula. Os tra- tamentos veículo e WT C57 (camundongo selvagem) foram controles negativos e não ex- pressaram mRNA distrifina com escape do éxon 23. Tabela 8. Sequências do Exemplo 27
SEQIO Nome Sequência (5' a 3')
NO M230 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT 15 NG-09- GGC CAA ACC +TCG GC+ T TAC C+ TG AAA +T N/A 0711 NG-10- GGC e+ AA +ACC +TCG GC+T TAC c+TG AAA T N/A 0055 NG-10- GGC C+A+A +ACC TCG GCT TAC CTG AAA T N/A 0056 NG-10- GGC CAA ACC TCG GCT TAC C+TG +A+A+A T N/A 0057 NG-10- GGC CAA ACC apnTCG GCªPíl T TAC CªPíl TG AAA apnT N/A 0070 NG-10- GGC CAA ACC sucTCG GCsuc T TAC csuc TG AAA T N/A 0105 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT- RAhxRRBRRAhxRR- AVl-5225 16 BRAhxB Experimentos adicionais em suporte da invenção foram feitos usando uma variação 1O mais ampla das ligações intersubunidades modificadas dentro do M230 PMO e usado no modelo de camundongo MOX como descrito acima. Um subgrupo de oligômeros com as ligações são listados como acima na Tabela 7. Figura 6 mostra os resultados a partir da tela expandida e mostra que os oligômeros M230 com a atividade mais alta são NH-10-0070, NH-10-0104, NH-10-0095 e NH-10-0133 compreendendo ligações b1 O, b54, b1 O e b1 O, res- pectivamente (na Figura 6, as marcações no eixo x correspondem aos últimos 3 dígitos do composto 10#). Os camundongos MOX receberam uma injeção única intravenosamente em uma dose 50 mg/kg. Outros compostos ativos mostrados na Figura 6 são M230 PMO com- preendendo modificações terminais e são descritos acima na Tabela 6. Todos os compostos foram comparados a um PMO sem qualquer modificações intersubunidades ou terminais (SEQ 10 NO: 15). Experimentos adicionais em suporte da invenção usaram uma expansão ainda maior dos compostos com intersubunidades e ligações terminais. Modificações de ligação intersubunidade são mostradas acima na Tabela 9. Resultados usando estes compostos são mostrados abaixo na Tabela 9. Os resultados são ordenados com os compostos mais ativos em cima da tabela. Tabela 9. Escape do éxon 23 no quadrícepes e tecido do diafragma a partir de ca-
mundongos MDX tratados com compostos PMO-X da invenção NG# Modificação PMO-X Dose Escape de Exon % mg/kg Quads Diaf. NG-10-0383 PMO 30 61 20 NG-10-0325 trifenilfos 30 54 46 NG-10-0272 PMO-farnesil 30 48 14 NG-10-0102 PMO 30 44 23 NG-10-0330 trimetoxibenzoil 30 40 7 NG-10-0056 PMOplus 5'-pol 23 40 13 NG-07-0064 PM0-3'-tritil 30 37 24 NG-10-0382 PMO 30 36 18 NG-10-0278 PMOpir 26 35 29 NG-10-0210 PMOapn 31 34 19 NG-10-0098 PMOpir 30 31 19 NG-10-0070 PMOapn 30 30 10 NG-10-0095 PMOapn 30 30 11 NG-10-0317 PMO 30 30 17 NG-10-0477 PMO triMe Gly 30 28 32 NG-10-0133 PMOapn 30 28 17 NG-10-0387 PMO 30 28 25 NG-10-0104 PMOçiuan 30 27 14 NG-10-0420 PMOplus metil 29 27 25 NG-10-0065 PMOtri 30 26 2 NG-10-0607 PMO-X 30 25 19 NG-10-0060 PMOcp 30 25 6 NG-10-0162 PMO-COCH 2 SH 30 25 8 NG-10-0328 difenilacetil 30 25 20 NG-10-0134 PMOapnPMOtri 30 23 2 NG-10-0386 PMO 30 22 11 NG-07-0064 PM0-3'-tritil 30 22 23 NG-10-0059 PMOcp 30 22 9 NG-10-0135 PMOtri 30 21 19 NG-10-0168 PMOapn PMOcvs 30 21 6 NG-10-0113 PMOapnPMOtri 30 20 20 NG-10-0385 PMO 30 20 32 NG-10-0279 PMO 30 19 22 NG-10-0055 PMOplus disp 30 17 11 NG-10-0105 PMOsucc 30 16 4 NG-10-0805 PMO-X 30 16 21 NG-10-0811 PMO-X 32 16 6 NG-10-0057 PMOplus 3'-pol 30 15 16 NG-10-0625 PMO-X 28 15 11 NG-10-0804 Dímero 35 15 11 NG-10-0066 PMOtri 30 12 1 NG-10-0280 PMO dissulfeto 30 12 14 NG-10-0212 PMOapn 20 11 15 NG-10-0156 3'-MeOtritil 30 10 22 NG-10-0062 PMOhex 30 9 10 NG-11-0043 PMO-X 30 9 16 NG-10-0206 PMOplus 31 8 10 EXEMPLO 28
TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS EGFP TRANSGÊNICOS COM
OLIGÔMEROS PMO EXEMPLARES DA INVENÇÃO Experimentos em suporte da invenção usaram um ensaio baseado em eGFP para atividade antisenso in vivo e foi usado para avaliar oligômeros compreendendo as ligações intersubunidades modificadas da invenção.
O modelo de camundongo eGFP transgênico em que o transgene eGFP-654 é expresso uniformemente através do corpo tem sido des- crito (Sazani, Gemignani et ai 2002). Este modelo usa um ensaio splicing para atividade em que oligômeros modificados da presente invenção bloqueiam splicing aberrante e restauram o splicing correto do pré-mRNA proteína verde fluorescente aumentada (eGFP) modificado.
Nesta abordagem, atividade antisenso de cada oligômero é diretamente proporcional a regu- 1O lação positiva do repórter eGFP.
Como um resultado, os efeitos funcionais do mesmo oligô- mero podem ser monitorados em quase cada tecido.
Isto é em contraste aos oligômeros alvejados para genes cuja expressão é restrita a ou é fenoticamente revelante em somente certos tecidos.
Nos camudnongos eGFP-654, o pré-mRNA foi facilmente detectável em to- dos os tecidos, embora quantidades menores foram encontradas na medula óssea, pele e cérebro.
O nível de eGFP traduzido é proporcional a potência dos oligômeros antisenso e sua concentração no local de infecção.
RT-PCR do RNA total isolado a partir de vários teci- dos mostrou expressão do transcrito eGFP-654 em todos os tecidos avaliados.
Tecidos a partir de camundongos eGFP-654 (n=6) tratados com composto variando de 5 a 150 mg/kg foram coletados 8 dias pós-dosagem e congelados a -80oC.
Tecidos fo- ram descongelados imediatamente antes da imagem em um GE Typhoon Trio, cobertos com PBS, e preparados diretamente na placa de vidro do scanner.
Varreduras de 50 mí- crons para coletar a fluorescência do eGFP foram feitas usando o laser de excitação 488 nm e filtro de emissão 520 nm BP 40 com o plano focal na superfície da placa.
Varreduras dos tecidos foram analisadas usando lmageQuant para determinar a média de fluorescência através de cada tecido.
Fluorescência tecidual a partir de 3-5 camundongos tratados com veículo somente tiveram a média para produzir uma medida de fluorescência basal intrínse- ca para cada tipo de tecido.
Valores de aumento de fluorescência dos tecidos corresponden- tes a partir dos camundongos tratados com compostos foram calculados como a fração da fluorescência do tecido veículo.
Figuras 78-C mostram a atividade específica do tecido no modelo de camundongo eGFP-654 de dois PMO contendo ligações intersubunidades exem- plares da invenção, NG-10-011 O e NG-10-0323-, contendo ligações b54 e b11, respectiva- mente.
Todos dos oligômeros testados são derivados da sequência eGFP654 (SEQ ID NO: 17). Para comparação, resultados usando um PMO tendo a mesma sequência, mas faltando qualquer modificação intersubunidade são mostrados na Figura 7A.
NG-10-011 O (SEQ ID NO: 17) teve alta atividade no quadrícepes e pobre atividade no fígado (Fig. 78) enquanto NG-10-0323 teve atividade hepática melhorada e distribuição muscular (Fig. 7C). Exemplos adicionais em suporte da invenção incluíram experimentos usando oli-
gômeros eGFP (SEQ ID N0:17) modificados usando as ligações e grupos terminais da in- venção. Como mostrado nas Figuras 11 e 12, comparado aos oligômeros PMO e PMOplus, vários oligômeros modificados mostraram correção do splice eGFP em vários tecidos a par- tir de camundongos tratados como descrito acima. 5 As modificações PMO-X específicas dos compostos descritos neste exemplos são mostradas abaixo na Tabela 1O. Tabela 1O. Sequências Usadas no Exemplo 28 Mostrando Tipo de Ligação 1 NG-10-0110 GC9 uªnT AT 9 uªnT ACC T 9 uanTA ACC CAG 1 NG-10-0323 GCpyrT P..T"yrT ACC TpyrTA ACC CAG l PMOplus; NG-10-0301 GC+T AT+T ACC +TTA ACC CAG 1 NG-10-0248 GCaT AaTaT ACC aTaTA ACC CAG 1 NG-10-0600 * GCaT ATaT ACC TaTA ACC CAG 1 NG-10-0602 ** GCpT ATpT ACC TpTA ACC CAG 1 NG-10-0389 GCX ATX ACC TXA ACC CAG 1 NG-10-024 7 GCpT ApTpT ACC TpTA ACC CAG 1 NG-10-0299 GCaT ATaT ACC TaTA ACC CAG 1 NG-10-0355 *** GCaT ATaT ACC TaTA ACC CAG * produto trimeti! glicina acilado a partir de NG-10-0299; ** PT=PMOtyr meti lado pa- 1O ra amina quaternária a partir de NG-10-0323; X - PMOapn; *** 3'tritil EXEMPLO 29
TRATAMENTO DE CÉLULAS INFECTADAS COM VÍRUS INFLUENZA A COM OLIGÔMEROS pmo EXEMPLARES DA INVENÇÃO Uma série de PMO contendo várias ligações intersubunidades modificadas foi pre- parada e usada para tratar células infectadas com vírus influenza A em cultura. O PMO e PMO contendo as ligações intersubunidades modificadas da presente invenção foram todas designadas para ter como alvo o segmento virai M1/M2 no códon de partida AUG e ter uma das duas sequências de base (SEQ ID NOs: 3 e 4). PMO com as ligações intersubunidade modificadas da presente invenção são listados na Tabela 4 e identificados pela designação número NG na Tabela de Listagem de Sequência abaixo. Inibição da replicação do vírus influenza A por alvo antisenso dos múltiplos sítios dentro do segmento M1/M2 é descrita no Ped. dos EUA com co-propriedade eco-pendência No. 12/945.081 que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em adição a inibição da tradução por alvejar o sítio de par- tida M1/M2 AUG comum, sítios de doador de splice e aceptor de splice podem também ser alvejados usando compostos da invenção. Uma linhagem celular de macrófago murino alveolar (ATCC; AMJ2-C11) foi infecta- da a O, 1 MOI com H1 N1 (cepa PR8) e 1 hora pós-infecção PMO foram adicionados. Células foram incubadas a 35 graus C por uma noite. Sobrenadante virai foi então retirado e incuba- do com protease VNAR para liberar o RNA virai. HA RNA foi quantificado por PCR quantita- tivo em tempo real (qRT-PCR). Células foram lavadas, fixadas, e permeabilizadas. Proteínas M1 e M2 foram então avaliadas com anticorpos monoclonais por 30 mina 37 graus C. Célu-
las foram lavadas e lgG anti-camundongo conjugada com Alexa 646 foi adicionada por 15 min em temperatura ambiente. M1 e M2 foram então avaliados por citômetro de fluxo. Para determinar os níveis de proteína M1 e M2, o percentual de células M1 ou M2 positivas foi multiplicado pela média da intensidade de fluorescência de M1 ou M2. Cada amostra foi então dividida pelo controle não tratado para gerar o percentual de M1 ou M2 comparado aos controles misturados não tratados. Figura 8 mostra a redução nos níveis da proteína M2 virai a partir de células trata- das com vários compostos da revelação. O método de citometria de fluxo descrito acima foi usado para determinar a expressão da proteína M2 relativa após o tratamento a 60 micro- molar. Os oligômeros inibiram a produção da proteína M2 para variar graus com NG-10-180 (SEQ ID N0:3) contendo ligação b1 sendo a mais ativa. Resultados usando PMO sem qual- quer modificação intersubunidade são mostrados na Figura 8 como NG-10-0015 (SEQ ID N0:3) para comparação. EXEMPLO 30
TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM VÍRUS INFLUENZA A
IN VIVO COM OLIGOMEROS PMO EXEMPLARES DA INVENÇÃO Experimentos adicionais em suporte da invenção foram feitos usando camundon- gos BALB/c infectados com a cepa PR8 do influenza A. Camundongos foram infectados com 3,5 TCID50 via uma inoculação intranasal após serem tratados 4 horas antes com compostos PMO-X da invenção. Em algumas experimentos uma dose adicional de PMO-X foi administrada em 96 h pós-infecção. Todas as doses consistiram de 100 microgramas do composto teste em 50 microlitros de PBS e foram administradas por insuflação intranasal. O peso dos animais foram monitorados diariamente e foi usado como um ponto final clínico para atividade antivirai da droga. No dia 7 pós-infecção os animais foram sacrificados e pul- mões foram coletados para determinações da carga virai usando o método qRT-PCR des- crito acima no Exemplo 29. Determinações TCID50 foram feitas usando diluições seriadas de meio log dos ho- mogenatos pulmonares e plaqueados em células macrófagos AMJ-C12. Após 24 h a 35 graus C, o meio foi mudado e incubado por um adicional de 72 h a 35 graus C. 50 mL de uma solução de 0,5% de RBC de galinha em PBS foi adicionado e incubado por 1 h a 4 graus C. Padrão de hemaglutinação foi lido e TCID50 foram calculados usando o método Reed e Muench. Valores de TCID50 foram então normalizados para inserção do peso teci- dual. Como mostrado na Figura 9, compostos PMO-X mostram atividade antivirai aumen- tada e perda de peso diminuída comparado a um composto PMOplus após infecção H1 N1. Camundongos BALB/c (n=4) foram infectados com H1N1 e dados uma dose única de 100 microgramas de PMO 4 horas antes da infecção. Camundongos foram pesados diariamente e a porcentagem de perda de peso foi determinada a partir do peso pré-infecção. Pulmões foram coletados no dia 7 pós-infecção e avaliador para carga virai por TCID50. Resultados são apresentados como o número de vezes de aumento na atividade antivirai sobre um PMO sozinho. Este experimento mostra aproximadamente 50 vezes a atividade antivirai aumentada e dois compostos PMO-X (NH-10-0097 e NG-11-0173; SEQ ID N0:3) compara- do a um PMO não modificado (NG-10-0015; SEQ ID N0:3) e aproximadamente atividade 10 vezes maior comparado a um composto PMOplus (NG-11-0170; SEQ ID N0:3). Figura 1O mostra um experimento similar ao descrito para Figura 9 usando o peso corporal como uma medida clínica da atividade antivirai. Relativo ao composto PMOplus 1O (NG-11-0170) vários compostos PMO-X mostraram resultados superiores incluindo compos- tos contendo ligações succinoil (NH-10-0108), isopropil piperazina (NH-11-0148) e pirrolido- na (NG-11-0173) e um composto PMOplus modificado com um grupo benzidrila terminal 3' (NG-11-0145). EXEMPLO 31
PREPARAÇÃO DE UM ANÁLOGO OLIGONUCLEOTÍDEO COMPREENDENDO
UM GRUPO TERMINAL MODIFICADO A uma solução de 25-mer PMO contendo um terminal 3' (27,7 mg, 3,226 µmol) em DMSO (300 µL) foi adicionado brometo de farnesila (1,75 µL, 6,452 µmol) e diisopropiletila- mina (2,24 µL, 12,9 µmol). A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente por 5 horas. A mistura de reação bruta foi diluída com 1O mL de NH40H aquoso 1%, e então car- regada em uma coluna Amberchrome CG300M de 2 ml. A coluna foi então lavada com 3 volumes de coluna de água, e o produto foi eluído com 6 mL de 1: 1 acetonitrila e água (v/v). A solução foi então liofilizada para obter o composto título como um sólido branco. EXEMPLO 32
PREPARAÇÃO DOS OLIGÔMEROS MORFOLINOS Preparação de tritil piperazina fenil carbamato 35 (ver Figura 3): A uma suspensão arrefecida do composto 11 em diclorometano (6 ml/g 11) foi adicionado uma solução de carbonato de potássio (3,2 eq) em água (4 ml/g de carbonato de potássio). Para isto, uma mistura de duas fases foi lentamente adicionada a uma solução de cloroformato de fenila (1,03 eq) em diclorometano (2 g/g de cloroformato de fenila). A mistura reacional foi aqueci- da para 20° C. Sob término da reação (1-2 h), as camadas foram separadas. A camada or- gânica foi lavada com água, e seca em carbonato de potássio anidro. O produto 35 foi isola- do por cristalização a partir de acetonitrila. Produção =80%. Preparação de álcool carbamato 36: hidreto de sódio (1,2 eq) foi suspensa em 1- metil-2-pirrolidinona (32 ml/g de hidreto de sódio). A esta suspensão foram adicionados trietileno glicol (10,0 eq) e composto 35 (1,0 eq). A mistura resultante foi aquecida para 95° C. Sobre término da reação (1-2 h), a mistura foi arrefecida para 20° C. A esta mistura foi adicionada 30% de diclorometano/metil terc-butil éter (v:v) e água.
A camada orgânica con- tendo o produto foi lavada sucessivamente com NaOH aquoso, ácido succínico aquoso, e cloreto de sódio aquoso saturado.
O produto 36 foi isolado por cristalização a partir de diclo- rometano/terc-butil éter/heptano.
Produção =90%. Preparação do terminal ácido 37: A uma solução do composto 36 em tetraidrofura- no (7 ml/g 36) foi adicionado anidreto succínico (2,0 eq) e DMAP (0,5 eq). A mistura foi aquecida para 50° C.
Sobre término da reação (5 h), a mistura foi arrefecida para 20° C e ajustada para pH 8.5 com NaHC0 3 aquoso.
Terc-butil éter de metila foi adicionada, e o pro- duto foi extraído na camada aquosa.
Diclorometano foi adicionado, e a mistura foi ajustada 1O para pH 3 com ácido cítrico aquoso.
A camada orgânica contendo o produto foi lavada com uma mistura do tampão citrato pH = 3 e cloreto de sódio aquoso saturado.
Esta solução de diclorometano de 37 foi usado sem isolamento na preparação do composto 38. Preparação do 38: A solução do composto 37 foi adicionado imida do ácido N- hidróxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq), e então cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (1, 1 eq). A mistura foi aquecida para 55oC.
Sobre o término da reação (4-5 h), a mistura foi arrefecida para 20° C e lavado sucessivamente com 1: 1 0,2 M de ácido cítrico/solução salina e solução salina.
A solução diclorometano passa por troca de solvente para acetona e então para N,N- dimetilformamida, e o produto foi isolado por precipitação a partir de acetona/N,N- dimetilformamida em cloreto de sódio aquoso saturado.
O produto bruto foi re-misturado várias vezes em água para remover N,N-dimetilformamida residual e sais.
Produção = 70% de 38 a partir do composto 36. Introdução do "Terminal" (terminal) ativado na resina âncora dissulfeto foi feito no NMP pelo procedimento usado para incorporação das subunidades durante a síntese da fase sólida.
Preparação do Suporte Sólido para Síntese dos Oligômeros Morfolinos: Este pro- cedimento foi feito em um recipiente de peptídeo silanizado, revestido (feito por ChemGlass, NJ, EUA) com um frita de vidro de porosidade grosseira (40-60 µm), agitador na parte de cima, e válvula de Teflon 3-vias para permitir N2 borbulhar através do frita ou uma extração a vácuo.
Controle de temperatura foi alcançado no recipiente de reação por um banho de água circulante.
O tratamento de resina/passos de lavagem no seguinte procedimento consiste de duas operações básicas: fluidização da resina e extração solvente/solução.
Para fluidização da resina, a válvula foi posicionada para permitir o fluxo de N2 através do frit e o tratamento de resina especificado/lavagem foi adicionado ao reator e permitido permear e completa- mente umedecer a resina.
Mistura foi então iniciada e a mistura de resina misturada pelo tempo específico.
Para extração solvente/solução, mistura e fluxo de N2 foram parados e a bomba de vácuo foi iniciada e então a válvula foi posicionada para permitir a evacuação do tratamento de resina/lavagem para o descarte.
Todo o volume do tratamento de resi- na/lavagem foi 15 ml/g da resina a menos que de outra forma anotado.
A resina aminometilpolistireno (trama 100-200; -1,0 mmol/g substituição N2; 75 g, 1 eq, Polymer Labs, RU, parte #1464-X799) em um recipiente de peptídeo silanizado, revesti- s do foi adicionado 1-metil-2-pirrolidinona (NMP; 20 ml/g resina) e a resina foi permitida in- char com a mistura por 1-2 h.
Seguindo evacuação do solvente inchado, a resina foi lavada com diclorometano (2 x 1-2 min), 5% de diisopropiletilamina em 25% de isopropa- nol/diclorometano (2 x 3-4 min) e diclorometano (2 x 1-2 min). Após evacuação da lavagem final, a resina foi fluidizada com uma solução da âncora dissulfeto 34 em 1-metil-2- 1O pirrolidinina (O, 17 M; 15 ml/g de resina, -2,5 eq) e a mistura resina/reagente foi aquecida a 45oC por 60 h.
Em reação completa, aquecimento foi descontinuado e a solução âncora foi evacuada e a resina lavada com 1-metil-2-pirrolidinona (4 x 3-4 min) e diclorometano (6 x 1- 2 min). A resina foi tratada com uma solução de 10% (v/v) de dicarbonato de dietila em di- clorometano (16 ml/g; 2 x 5-6 min) e então lavada com diclorometano (6 x 1-2 min). A resi- na 39 (ver Figura 4) foi seca sobre uma corrente de N2 por 1-3 h e então sobre vácuo para peso constante (± 2 %) . Produção: 110-150% do peso da resina original.
Determinação do Carregamento da Resina Aminometilpoliestireno-dissulfeto: O car- regamento da resina (número dos sítios reativos potencialmente disponíveis) é determinado por um ensaio espectrométrico para o número de grupos trifenilmetil (tritil) por grama da re- sina.
Um peso conhecido da resina seca (25 ± 3 mg) é transferido a um frasco volumétri- co de 25 ml silanizado e -5 ml de 2% (v/v) ácido trifluoracético em diclorometano é adicio- nado.
Os conteúdos são misturados por rotação gentil e então permitidos descansar por 30 min.
O volume é trazido para 25 ml com ácido trifluoracético 2% (v/v) adicional em dicloro- metano e os conteúdos bem misturados.
Usando uma pipeta de deslocamento positivo, uma alíquota da solução contendo tritila (500 µL) é transferida para um frasco volumétrico de 1O ml e o volume trazido para 1O ml com ácido metanosulfônico.
O conteúdo do cátion tritila na solução final é medido por absorbância UV a 431,7 nm e o carregamento de resina calculado nos grupos tritila por grama de resina (µmol/g) usando os volumes, diluições, coeficiente de extinção (E: 41 µmol-1 cm-1) e peso de resina apropriados.
O ensaio é feito em triplicata e um carregamento médio calculado.
O procedimento de carregamento da resina neste exemplo proverá resina com um carregamento de aproximadamente 500 µmol/g.
Um carregamento de 300-400 em µmol/g foi obtido se o passo de incorporação da âncora dissulfeto for feito por 24 h em temperatura ambiente.
Carregamento do terminal: Usando o mesmo programa e volumes como para a preparação da resina aminometilpoliestireno-dissulfeto, o terminal pode ser introduzido na molécula.
Para o passo de acoplamento, uma solução de 38 (0,2 M) em NMP contendo 4- etilmoriolino (NEM, 0,4 M) foi usada ao invés da solução âncora dissulfeto.
Após 2 h a 45° C, a resina 39 foi lavada duas vezes com 5% de diisopropiletilamina em 25% de isopropa- nol/diclorometano e uma vez com DCM.
À resina foi adicionada uma solução de anidreto benzóico (0,4 M) e NEM (0,4 m). Após 25 min, o envoltório do reator foi arrefecido para tem- peratura ambiente, e a resina lavada duas vezes com 5% de diisopropiletilamina em 25% isopropanol/diclorometano e oito vezes com DCM.
A resina 40 foi filtrada e seca sobre alto vácuo.
O carregamento para resina 40 é definido ser o carregamento da resina aminometil- poliestireno-dissulfeto 39 original usada no carregamento do terminal.
Síntese de Fase Sólida: Oligômeros Moriolinos foram preparados em um Sintetiza- dor de Peptídeo Automático Gilson AMS-422 em colunas de reação de polipropileno Gilson de 2 ml (Parte# 3980270). Um bloco de alumínio com canais para fluxo de água foi coloca- do ao redor das colunas como eles se assentam no sintetizador.
O AMS-422 adicionará al- ternativamente soluções reagente/lavagem, manterá as mesmas por um tempo específico, e evacuará as colunas usando vácuo.
Para oligômeros na variação de até cerca de 25 subunidades em comprimento, re- sina aminometilpoliestireno-dissulfeto com carregamento perto de 500 µmol/g de resina é preferida.
Para oligômeros maiores, resina aminometilpoliestireno-dissulfeto com carrega- mento de 300-400 µmol/g de resina é preferida.
Se uma molécula com terminal 5' é deseja- da, resina que tenha sido carregada com terminal é escolhida com as mesmas instruções de carregamento.
As seguintes soluçõe de reagente foram preparadas: Solução de Detritilação: Ácido Cianoacético 10% (p/v) em 4: 1 diclorometa- no/acetonitrila; Solução de Neutralização: 5% de Diisipropiletilamino em 3:1 diclorometa- no/isopropanol; Solução de Acoplamento: O, 18 M (ou 0,24 M para oligômeros tendo cresci- mento maior que 20 subunidades) de Subunidade Moriolina ativada da base desejada e tipo de ligação e 0,4 M de N etilmoriolina, em 1,3-dimetilimidazolidinona.
Diclorometano (DCM) foi usado como uma lavagem transicional separando as lavagens de solução reagente dife- rentes.
No sintetizador, com o bloco ajustado para 42° C, cada coluna contendo 30 mg de resina aminometilpoliestireno-dissulfeto (ou resina Terminal) foram adicionados 2 ml de 1- metil-2-pirrolidinona e permitido descansar em temperatura ambiente por 30 min.
Após lava- gem com 2 vezes de 2 ml de diclorometano, o seguinte ciclo de síntese foi empregado: Passo Volume Distribuição Tempo de Espera Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos
Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos Detritilação 1,5 ml Tubo Coletor 15 segundos DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Acoplamento 350 µL - 500 µL Seringa 40 minutes DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos Neutralização 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos DCM 1,5 ml Tubo Coletor 30 segundos As sequências dos oligômeros individuais foram programadas no sintetizador de forma que cada coluna recebesse a solução de acoplamento apropriada (A, C, G, T, 1) na sequência apropriada.
Quando o oligômero em uma coluna teve completa incorporação da sua subunidade final, a coluna foi removida a partir do bloco e um ciclo final feito manual- 5 mente com uma solução acopladora compreendida de cloreto de 4-metoxitrifenilmetil (0,32 M em DMI) contendo 0,89 M de 4-etilmorfolina.
Clivagem a partir da resina e remoção das bases egrupos protetores de estrutura: Após metoxitritilação, a resina foi lavada 8 vezes com 2 ml de 1-metil-2-pirrolidinona.
Um ml de uma solução de clivagem consistindo de O, 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT) e 0,73 M de 1O trietilamina em 1-metil-2-pirrolidinona foi adicionada, a coluna tampada, e permitida descan- sar em temperatura ambiente por 30 min.
Após este tempo, a solução foi drenada em um frasco Wheaton de 12 ml.
A resina que se contraiu muito bem foi lavada duas vezes com 300 µL de solução de clivagem.
À solução foi adicionada 4,0 ml de amônia cone.
Aquosa (estocada a -20° C), o frasco tampado fortemente (com tampa de rosca Teflon), e a mistura rotacionada para mistura a solução.
O frasco foi colocado em um forno a 45° C por 16-24 h para afetar a clivagem da base e grupos protetores de estrutura.
Isolamento do Oligomero Inicial: A solução amonolólise no frasco foi removida a partir do forno e permitida arrefecer em temperatura ambiente.
A solução foi diluída com 20 ml de 0,28% de amônia aquosa e passada através de uma coluna de 2,5 x 1O cm contendo resina Macroprep HQ (BioRad). Um gradiente salino (A: 0,28% de amônia com B: 1 M de cloreto de sódio em 0,28% de amônia; 0-100% de B em 60 min) foi usado para eluir o pico contendo metoxitritila.
As frações combinadas foram agrupadas a ainda processadas de- pendendo do produto desejado.
Demotoxitritilação dos Oligômeros Morfolinos: As frações agrupadas a partir da pu- rificação Macroprep foram tratadas com 1 M de H2P04 para diminuir o pH para 2.5. Após mistura inicial, as amostras descansaram em temperatura ambiente por 4 min, em cujo tem-
po elas são neutralizadas para pH 10-11 com 2,8% de amônia/água.
Os produtos foram pu- rificados por extração de fase sólida (SPE). Amberchrome CG-300M (Rohm e Haas; Filadélfia, PA) (3 ml) é empacotada em colunas com frit de 20 ml (Colunas Cromatográficas BioRad Econo-Pac (732-1011 )) e a resina lavada com 3 ml dos seguintes: 0,28% NH40H/80% acetonitrila; 0,5 M NaOH/20% de etanol; água; 50 mM de H3P04/80% de acetonitrila; água'0,5 NaOH/20% de etanol; água; 0,28% NH40H.
A solução a partir da demetoxitritilação foi carregada na coluna e a resina lavada três vezes com 3-6 ml de 0,28% de amônia aquosa.
Um frasco Wheaton (12 ml) foi colo- 1O cada sobre a coluna e o produto eluído por duas lavagens com 2 ml de 45% de acetonitrila em 0,28% de amônia aquosa.
As soluções foram congeladas em gelo seco e os frascos colocados em um liofilizador para produzir um pó branco leve.
As amostras foram dissolvi- das em água, filtradas através de um filtro de 0,22 mícron (Pai! Life Sciences, Acrodisc 25 mm do filtro de seringa, com uma membrana HT Tuffryn HY) usando uma seringa e a Oen- sidade Ótica (00) foi medida em um espectrofotômetro UV para determinar as unidades 00 do presente oligômero, bem como a amostra dispensada para análise.
As soluções foram então colocadas de volta nos frascos Wheaton para liofilização.
Análise de Oligômeros Morfolinos: espectrometria de massa MALOl-TOF foi usada para determinar a composição das frações nas purificações bem como prover evidência pa- ra identidade (peso molecular) dos oligomeros.
Amostras foram corridas seguindo diluição com solução de ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico (ácido sinapínico), 3,4,5- triidoxiacetofenona (THAP) ou ácido alfa-ciano-4-hidoxicinâmico como matrizes.
HPLC de troca catiônica (SCX) foi feita usando uma coluna Oionex ProPac SCX-10, 4x250 mm (Oionex Corporation; Sunnyvale, CA) usando 25 mM pH=5 acetato de sódio, 25% acetonitrila (Tampão A) e 25 mM pH 5 acetato de sódio 25% acetonitrila 1,5 M de cloreto de sódio (tampão B) (Gradiente 10-100% Bem 15 min) ou 25 mM de KH2P04 25% de acetoni- trila no pH-3,5 (tampão A) e 25 mM KH2P04 25% acetonitrila em pH=3,5 com 1,5 M de clo- reto de potássio (tampão B) (Gradiente 035% B em 15 min). O sistema formador foi usado para oligômeros positivamente carregados que não têm um peptídeo ligado, enquanto o último foi usado para conjugar peptídeo.
Purificação dos Oligômeros Morfolinos por Cromatografia de Troca Catiônica: A amostra é dissolvida em acetato de sódio 20 mM, pH=4,5 (tampão A) e aplicado a uma co- luna de resina de troca catiônica Source 30 (GE Healthcare) e eluída com um gradiente de 0,5 M de cloreto de sódio em acetato de sódio de 20 mM e 40% de acetonitrila, pH=4,5 (tampão B). As frações agrupadas contendo produto são neutralizadas com amônia aquosa cone. e aplicadas a uma coluna Amberchrome SPE.
O produto é eluído, congelado e liofili- zado como acima.
Tabela 11. Listagem de Sequência
SEQID Nome Sequência (5' to 3') NO Denque CGGTCCACGTAGACTAACAACT 1 JEV GAAGTTCACACAGATAAACTTCT 2 M1/M2AUG.20.22 CGGTTAGAAGACTCATCTTT 3 M1/M2AUG.25.26 TTTCGACATCGGTTAGAAGACTCAT 4 NP-AUG GAGACGCCATGATGTGGATGTC 5 Picornavírus GAAACACGGACACCCAAAGTAGT 6 Dengue 3'-CS TCCCAGCGTCAATATGCTGTTT 7 Arenavírus GCCTAGGATCCACGGTGCGC 8 RSV-L alvo GGGACAAAATGGATCCCATTATTAATGGAAATTCTGCTAA 9 RSV-AUG-2 TAATGGGATCCATTTTGTCCC 10 RSV-AUG3 AATAATGGGATCCATTTTGTCCC 11 RSV-AUG4 CATTAATAATGGGATCCATTTTGTCCC 12 RSV-AUG5 GAAT TT e CAT TAATAATGGGAT e CAT TT TG 13 RSV-AUG6 CAGAAT TT e CAT TAATAATGGGAT e CAT T 14 M23D GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT 15 GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT- 16/79 AVl-5225 RAhxRRBRRAhxRRBRAhxB eGFP654 GCTATTACCTTAACCCAG 17 huMSTN alvo GAAAAAAGATTATATTGATTTTAAAATCATGCAAAAAC 18
TGCAACTCTGTGTT muMSTN25-104 CATACATTTGCAGTTTTTGCATCAT 19 muMSTN25-183 TCATTTTTAAAAATCAGCACAATCTT 20 muMSTN25-194 CAGTTTTTGCATCATTTTTAAAAATC 21 Exon44-A GATCTGTCAAATCGCCTGCAGGTAA 22 Exon44-B AAACTGTTCAGCTTCTGTTAGCCAC 23 Exon44-C TTGTGTCTTTCTGAGAAACTGTTCA 24 Exon45-A CTGACAACAGTTTGCCGCTGCCCAA 25 Exon45-B CCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAA 26 Exon45-C CATTCAATGTTCTGACAACAGTTTGCCGCT 27 Exon50-A CTTACAGGCTCCAATAGTGGTCAGT 28 Exon50-B CCACTCAGAGCTCAGATCTTCTAACTTCC 29 Exon50-C GGGATCCAGTATACTTACAGGCTCC 30 Exon51 -A ACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGTTTGG 31 Exon51 -B CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG 32 Exon51 -C GAGCAGGTAC CT C CAACAT CAAGGAA 33 Exon53-A CTGAAGGTGTTCTTGTACTTCATCC 34 Exon53-B TGTTCTTGTACTTCATCCCACTGATTCTGA 35 SMN2-A CTTTCATAATGCTGGCAG 36 SMN2-B CATAATGCTGGCAG 37 SMN2-C GCTGGCAG 38 CAG 9mer CAG CAG CAG 39 CAG 12mer CAG CAG CAG CAG 40 CAG 15mer CAG CAG CAG CAG CAG 41 CAG 18mer CAG CAG CAG CAG CAG CAG 42 AGC 9mer AGCAGCAGC 43
AGC 12mer AGC AGC AGC AGC 44 AGC 15mer AGC AGC AGC AGC AGC 45 AGC 18mer AGC AGC AGC AGC AGC AGC 46 GCA 9mer GCAGCAGCA 47 GCA 12mer GCA GCA GCA GCA 48 GCA 15mer GCA GCA GCA GCA GCA 49 GCA 18mer GCA GCA GCA GCA GCA GCA 50 AGC 25mer AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA 51 CAG 25mer CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG C 52 CAGG 9mer CAG GCAGGC 53 CAGG 12mer CAG GCA GGC AGG 54 CAGG 24mer CAGGCAGGCAGGCAGGCAGGCAGG 55
PeQtídeos Penetrantes de Célula Ricos em Arginina rTAT RRRQRRKKR 56 Tat RKKRRQRRR 57 Rgf2 RRRRRRRRRFF 58 RsF2R4 RRRRRFFRRRR 59 R4 RRRR 60 Rs RRRRR 61 Rs RRRRRR 62 R7 RRRRRRR 63 Ra RRRRRRRR 64 Rg RRRRRRRRR 65 (RAhxR) 4; (P007) RAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 66 (RAhxR) 5 ; RAhxRRAhxRRAhxRRAhxRRAhxR 67 (CP04057) (RAhxRRBR)2; RAhxRRBRRAhxRRBR 68 (CP06062) (RAR)4F2 RARRARRARRARFF C 69 (RGR)4F2 RGRRGRRGRRGRFFC 70 As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para prover modali- dades adicionais.
Todas as patentes dos EUA, publicações de pedidos de patentes dos EUA, pedidos de patente dos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patentes referidas nesta especificação e/ou listadas na Folha de Dados dos Pedidos, são aqui incorporadas por referência, em sua totalidade.
Aspectos das modali- dades podem ser modificados, se necessário para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para prover ainda modalidades adicionais.
Essas e outras mudanças podem ser feitas para as modalidades na luz da descrição acima detalhada.
Em geral, nas seguintes reivindicações, os termos usados não devem ser construídos para limitar as rei- 1O vindicações para as modalidades específicas reveladas na especificação e nas reivindica- ções, mas deve ser construído incluir todas as modalidades possíveis junto com o objetivo completo dos equivalentes aos quais tais reivindicações são designadas.
Consequentemen- te, as reivindicações não são limitadas pela revelação.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Oligômero CARACTERIZADO por compreender uma estrutura, a estrutura com- preendendo uma sequência de estruturas de anel moriolino unidos por ligações intersubuni- dades, as ligações intersubunidades unindo uma terminação 3' de uma estrutura do anel moriolino a uma terminação 5' de uma estrutura do anel moriolino adjacente, em que cada estrutura do anel moriolino está ligada a uma fração pareadora de base, tal que o oligômero pode se ligar em uma forma sequência-específica a um ácido nucléico alvo, em quee que as ligações intersubunidades têm a seguinte estrutura geral (1): w li x--P,/ I f' 3' y'! 1 5' (I) ou um sal, estereoisômero ou tautômero do mesmo, e em que cada das ligações in- tersubunidades (1) são independentemente ligação (A) ou ligação (B): em que para ligação (A): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -N(CH 3h, -NR 1 R2, -OR 3 ou: (II) Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR2, R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R2 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou -LNR 4 R5 R7 ; R3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquilaC 1-C 6 ; R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila, -C(=NH)NH 2,-Z-L- NHC(=NH)NH2 ou -[C(O)CHR'NH]mH, onde Z é carbonil(C(O)) ou uma ligação direta, R' é uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural um ou ou dois carbonos homó- logos do mesmo, e m é 1 a 6; R5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila ou um par de elé- tron; R6 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila;
    R7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquila C 1-C 6 ou alcoxial- quila C1-C5; L é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo grupos alquila, alcóxi, alquilamino, ou combinações dos mesmos; e em que para ligação (B): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -NR 8 R9 ou -OR 3; e Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 1º, R8 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquila CrC 12 ; R9 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C1-C 12 , aralquila CrC12 ou arila; R 1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C1-C12 ou - º LNR 4R5R7 ,· em que Rª e R9 podem se unir para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5- 18 membros ou R8 , R 9 ou R3 podem se unir com R10 para formar um heterociclo de 5-7 membros, e em que X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili): R12 R,rl\ R1 /\__1_1+ R12 (III) em que: R11 é, em cada ocorrência, independentemente alquila CrC 12 , aminoalquila C1-C 12 , alquilcarbonila C1-C 12 , arila, heteroarila ou heterociclila; e R é, em cada ocorrência, independentemente um par de elétron, hidrogênio ou al- quila C1-C12; e R12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquila C1-C 12 , amino- alquila CrC 12 , -NH 2, -CONH 2, -NR 13 R14 , -NR 13 R 14 R15 , alquilcarbonila C 1-C 12 , oxo, -CN, trifluo- rmetila, amidila, amidinila, amidinilalquila, amidinilalquilcarbonil guanidinila, guanidinilalquila, guanidinilalquilcarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxiC 1- C12, em que R13 , R 14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquilaC1-C12; e em que pelo menos uma das ligações intersubunidades é ligação (B).
    2. Oligômero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das estruturas do anel morfolino tem a seguinte estrutura (i):
    s·y'(o)P1
    N 1 1 3' (i) em que B é, em cada ocorrência, independentemente uma fração pareadora de ba- se.
    3. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das ligações intersubunidades é liga- ção (A), e/ou onde X é -N(CH 3h em cada ocorrência da ligação (A).
    4. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que (i) pelo menos uma ligação (B) tem a seguinte estrutura (IV): N_,:13 O y'l
    T 5' (IV) onde Z representa um heterociclo mono ou bicíclico de 5-18 membros; preferivelmente onde Z tem uma das seguintes estruturas (Ili), (V), (VI), (VII) ou (VIII): ou (III) (V) (Vl) (VII) (Vlll) mais preferivelmente onde Z tem a estrutura (V) ou (VIII); e/ou (ii) pelo menos uma ligação (B) tem a seguinte estrutura (XII):
    (Xll) em que Z' representa um heterociclo de 5-7 membros; preferivelmente em que pelo menos uma ligação (B) tem a seguinte estrutura (XIII): w R12 ,.._ Pll ' } '-!-..'o- !' ... I ... 3· ~ N R12 '-../ 'j
    T 5' (XlII) ; ou (iii) pelo menos uma ligação (B) tem uma das seguintes estruturas: 5' 5'
    5' . 5'
    QD o o li li 0r H2N~ N..-P, O'! I 'f 3·
    N N..-P, O"! I f 3· JVVVVO,. .J\l\N<J\> 1 1 s . s . 5 ' ' ~N-L N_t u
    OD //'3· ~/ //'3· N O"! O'j HCI """"""' """"""" 1 1 5' ,. 5' ..
    5' . 5' . ' 5' . 5' NC O 0r ' o li Q o li ~~~N-1~ ~ 3 ' ri~ ,,.,,,..,..,.. 3 ' 1 1 5' 5'
    ~ - _lj ~"'N ~ A o li /'r-P-.j o / / ' 3' ~N d/'3• / º'l ~ ~ T 1 ~ . o 5' ; ' li /'r--P,j o--\~} d+.3· o o li º"' ~
    N
    H -D N -P--../ / / ' 3' OlT 5' ; o o li /'r-P,/ ~N d/'3· ~ ~ 1 5'
    CI o o li /'r-P,/ ~d/'3· ...--;::. ~ ~1 5'
    FC.....-- o 3 O D__...Pd. /' N o li .j 3' ~ ~ l 5'
    CI CI O D_.--P,jd N o li f' 3' ~ ~ 1 5' "º o O--0--P-....i N \\ ~ .f' 3' N ~ 1 5' ~ o \\ N.-rf..... 3' / º1 1 5' ;
    r º )o Qº -;:;:::::-- o ~ ~ ~ º'l l 5' ..
    5' 5'
    5' 5' ,. ,.
    o- o o ~li ~li
    I JN~ r-rf( O'! 3' r ~ N~ /e r-rJZ O'l 3' "'N _J .NVINY 1 ~ ~ 1 ! 5· . ' s· . ' o o ~li
    N / N-r'-13'
    O o '! l 5' 5' o o 5' o o li SH li ~N_.-P,/ )-- ~N_.-P,/ / I I f' 3· I t I /' 3' N~ O N~ O 'l o 'l .,., . ,.,., . o .NVINY 1 1 5' . ' 5' 5'
    o li dCÁN~ f'r-r'f O'j
    3.
    ~ dCA = colato 1 CA = colato 5' 5' o li ºyO-l~s· ~ r~ ~ 'b ou
    5. Oligômero, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO por (i) Z ter uma das estruturas (iii), (V), (VI), (VII), (VIII), e em que pelo menos um R12 tem a seguinte estrutura (IX): 5 (IX) em que R 16 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquilaC 1-C 12 , alcóxiC1-C 12 , -CN, arila ou heteroarila; ou em que pelo menos um R12 é -NH 2, -N(CH 3 )2 ou -N+(CH 3 )3; ou em que pelo menos um R 12 é pirrolidinila, piperidinila ou morfolinila; ou em que pelo menos um R 12 é oxo, trifuormetila, guanidinila ou nitrila; ou (ii) em que Z tem uma das estruturas (Ili), (V), (VI), (VII) ou (VIII), e em que R11 é etila, isopropila, piperidinila, pirimidinila, colato, deoxicolato ou -C(=O)(CH 2)nC0 2H, onde n é 1 a 6; e/ou (iii) em que Z representa um éter de coroa (crown éter);
    preferivelmente onde Z tem uma das seguintes estruturas (X) ou (XI): o___/º~ ) N-l- 0 ) ~___/º (X) (XI)
    6. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-4, 8 9 CARACTERIZADO pelo fato de que R é alquila CrC 12 e R é alquila CrC 12 para pelo me- nos uma ocorrência da ligação (B); ou onde R9 é aralquila C1-C 12 ou arila para pelo menos uma ocorrência da ligação (B); onde R9 preferivelmente tem uma das seguintes estruturas (XIV), (XV) ou (XVI): ou (XIV) (XV) (XVI)
    7. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-6, 1O CARACTERIZADO pelo fato de que cada Y e cada W são O.
    8. Oligômero, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-7, CARACTERIZADO pelo fato de que o oligômero tem a seguinte estrutura (XVII):
    Terminal 5'
    Terminal 3'
    (XVII)
    ou um sal, estereoisômero ou tautômero do mesmo, em que: R17 é, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio ou alquila C 1- C5; R 18 e R 19 são, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio, um peptídeo penetrante de célula, um aminoácido natural ou não natural, alquilcarbonila CrC30, -C(=O)OR21 ou R20 ; R2 é, em cada ocorrência, independentemente guanidinila, heterociclila, alquila C1- º C30, cicloalquila C 3-C 8; arila C6-C 30 , aralquila CrC 3o, alquilcarbonila C3-C30, cicloalquilcarboni- 1O laC 3-C 8, cicloalquilalquilcarbonilaC 3-C 8, arilcarbonila CrC 30 , aralquilcarbonila CrC 30 , alqui- loxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila C3-C 8, ariloxicarbonila CrC 30 , aralquiloxicarboni- 22 laCa-C30, ou -P(=O)(R )2; R21 é alquila C1-C 30 compreendendo uma ou mais frações de oxigênio ou hidroxila ou combinações dos mesmos; cada R22 é independentemente arilóxi C6 -C 12 ; B é uma fração pareadora de base; L1 é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo liga- ções selecionadas a partir de alquila, hidroxila, alcóxi, alquilamino, amida, éster, carbonila,
    carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato e fosfodiéster; x é um número inteiro de O ou maior; e desde que ambos R17 e R18 não são ausentes; onde preferivelmente pelo menos um dentre R18 ou R19 é R20 , mais preferivelmente 5 onde R2º é tritila, metoxitritila, benzidrila, p-clorobenzidrila, trifenilacetila, trifenilpro- pila, difenilactila, clorodifenilacetila, hidroxidifenilacetila, trifenilfosforila, difenilfosforila, gera- nil, farnesila, prenila, lauroil, trimetoxibenzoila, trifenilpropionila, trimetilglicina, 1-hidróxi-2,2- difenil acetila, 9-fluoreno-carboxila, 5-carboxifluoresceína, -COCH 2 CH 2 SSPy, -COCH 2 SH, 4- carbazolilbenzoila, 4-indazolilonabenzoila, metilsuccinimidil-cicloexoila, trietilenoglicoloil, 1O succinicacetila, piperidin-4-ila, tritilpiperidin-4-ila, boc-piperidin-4-ila, hexin-6-ila, piperazin-1- ila ou guanidinila, mais preferivelmente onde R2 º é tritila ou trifenilacetila.
    9. Oligômero CARACTERIZADO por compreender uma estrutura, a estrutura com- preendendo uma sequência de estruturas de anel morfolino unidas por ligações intersunida- des do tipo (A), (B) ou combinações das mesmas, em que cada estrutura do anel morfolino suporta uma fração pareadora de base, tal que o composto oligômero pode se ligar em uma forma de sequência-específica a um ácido nucléico alvo, e em que o oligômero compreende uma terminação 3', uma terminação 5' e tem a seguinte estrutura (XVII): Terminal 5' Terminal 3' (XVII) ou um sal, estereoisômero ou tautômero do mesmo, e onde para ligação (A): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; X é, em cada ocorrência, independentemente -N(CH 3 )2, -NR 1R2, -OR 3 ou;
    (II)
    Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 2, R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R2 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou -LNR4 R5 R7 ; R 3 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquila C 1-C 6; R4 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila, -C(=NH)NH 2, -Z- 1O L-NHC(=NH)NH 2 ou -[C(O)CHR'NH]mH, onde Z is carbonila(C(O)) ou uma ligação direta, R' é uma cadeia lateral de um aminoácido de ocorrência natural ou um- ou dois-carbonos homó- logos do mesmo, e m é 1 a 6; R5 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, metila ou um par de elé- tron; R6 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou metila; R 7 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio alquila C1-C6 ou alcoxial- quila C1-C5; L é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo grupos alquila, alcóxi ou alquilamino, ou combinações dos mesmos; e onde para ligação (8): W é, em cada ocorrência, independentemente S ou O; 3 X é, em cada ocorrência, independentemente -NR 8 R9 ou-OR ; e Y é, em cada ocorrência, independentemente O ou -NR 1º, R8 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio ou alquila CrC12; R9 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C1-C12, aralqui- laC1-C12 ou arila; R1 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, alquila C 1-C 12 ou - º 5 LNR 4 R R 7 · ' onde R8 e R 9 podem se unir para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5-18 membros ou R 8 , R9 ou R3 podem ser unir com R 10 para formar um heterociclo de 5-7 mem- bros, e em que quando X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili):
    R12
    R~rl\ R'/\_I__/+ R12
    (Ili)
    onde: R10 é, em cada ocorrência, independentemente alquila CrC 12 , aminoalquila CrC 12 , alquilcarbonila CrC 12 , arila, heteroarila ou heterociclila; e R11 é, em cada ocorrência, independentemente um par de elétron, hidrogênio ou al- quila CrC12; R12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquila C1-C 12 , aminoal- quila CrC 12 , -NH 2, -CONH 2, -NR 13 R14 , -NR 13 R14 R15 , alquilacarbonila CrC 12 , -CN, trifluormeti- la, amidila, amidinila, amidinilalquila, amidinilalquilacarbonila, guanidinila, guanidinilalquila, 1O guanidinilalquilacarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxi C1-C 12 , em que R13 , R14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquila CrC 12 ; e R17 é, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio ou alquila Cr
    R18 e R19 são, em cada ocorrência, independentemente ausente, hidrogênio, um peptídeo penetrante de célula, um aminoácido natural ou não natural, alquilcarbonila CrC30, -C(=O)OR 21 ou R20 ; R2º é, em cada ocorrência, independentemente guanidinila, heterociclila, alquila C1- C30, cicloalquila CTC 8; arila C6 -C 30 , aralquila CrC 30 , alquilcarbonila C3-C30, cicloalquilacarbo- nila C3-C 8, cicloalquilalquilcarbonila C3-C 8, arilcarbonila CrC30, aralquilacarbonila CrC30, alquiloxicarbonila CrC 30 , cicloalquiloxicarbonila C 3-C 8, ariloxicarbonila CrC 3o, aralquiloxicar- bonila Ca-C3 0, ou -P(=O)(R22 )2; R21 é alquila C1-C 30 compreendendo uma ou mais frações de oxigênio ou hidroxila ou combinações dos mesmos; cada R22 é independentemente arilóxi C6 -C 12 ; B é uma fração pareadora de base; L1 é um ligador opcional de até 18 átomos em comprimento compreendendo liga- ções selecionadas a partir de alquila, hidroxila, alcóxi, alquilamino, amida, éster, bissulfeto, carbonila, carbamato, fosforodiamidato, fosforoamidato, fosforotioato, piperazina e fosfodiés- ter; x é um número inteiro de O ou maior; e em que pelo menos um de R18 ou R19 é R20 e desde que ambos R17 e R18 não se- jam ausentes.
    1O.
    Oligômero, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO por (A) R2º é arilcarbonila CrC 30 , preferivelmente onde R2º tem a seguinte estrutura (XVIII):
    o
    R[~~l R23 (~ (XVTII)
    5 onde R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquila C1- C30, alcóxi C1-C30, alquiloxicarbonila C1-C30, aralquila CrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila 23 ou heterociclalquila, e em que um R pode se unir com outro R23 para formar um anel hete- rociclila, mais preferivelmente em que pelo menos um R23 é alcóxi C 1-C 30 , ou 20 (B) R é aralquilcarbonila CrC30, e/ou (C) R2 tem uma das seguintes estruturas (XIX), (XX) ou (XXI): º
    (XIX) (XX)
    (XXI)
    em que R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1- C30, alcóxiC1-C30, alquiloxicarbonilaCrC30, aralquilaCrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila ou heterociclalquila, e em que R23 pode se unir com outro R23 para formar um anel heterociclila, e m é um número inteiro de O a 6, ou 20 (D) R é arila C5-C30; ou (E) R2º tem a seguinte estrutura (XXII):
    (XXII)
    onde R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquila C1- C30, alcóxi C1-C 30 , alquiloxicarbonila C1-C30, aralquila CrC30, arila, heteroarila, heterociclila ou heterociclalquila, e em que um R23 pode se unir com outro R23 para formar um anel hete- rociclila, preferivelmente em que pelo menos um R23 é alcóxi C 1-C 30 ; ou (F) R2º tem a seguinte estrutura (XXII!):
    (XXHI)
    em que R23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquilaC 1 - 1O C 30 , alcóxiCrC 30 , alquiloxicarbonilaC 1-C 30 , aralquilaCrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila ou 23 heterociclalquila, e em que um R23 pode se unir com outro R para formar um anel heteroci- clila, preferivelmente em que pelo menos um R23 é halo; ou (G) R20 é alquila CrC30; e/ou (H) R20 tem uma das seguintes estruturas (XXIV), (XXV), (XXVI) ou (XXVll):
    (XXIV) (XXV) (XXVI) (XXVll)
    (1) R2º é alquilcarbonila C3-C30; e/ou (J) R2º é -C(=O)(CH 2)pSH ou -C(=O)(CH 2)pSSHet, em que p é um número inteiro de 1 a 6 e Het é uma heteroarila; ou (K) R2 é cicloalquilcarbonila C 3-C 8; e/ou º 5 (L) em que R20 tem a seguinte estrutura (XXVlll): o Rn(/~ ~23
    R (XXVlJI) onde R 23 é, em cada ocorrência, independentemente hidrogênio, halo, alquila C 1- C30, alcóxi CrC 30 , alquiloxicarbonila CrC 30 , aralquila CrC 30 , arila, heteroarila, heterociclila 23 ou heterociclalquila, e em que um R pode se unir com outro R 23 para formar um anel hete- 1O rociclila; ou (M) R 20 é -C(=O)(CH 2)nC02H, onde n é 1 a 6; ou (N) R2 é guanidinila; ou º (O) R 19 é -C(=O)OR 21 ; ou (P) a aralquila CrC30 é metoxitritila; ou (Q) R2 é -P(=O)(R22 )2; ou º (R) R 18 é trimetilglicina; ou (S) R2 compreende um ou mais átomos halo; e/ou º (T) R2 é uma fração perflúor; e/ou º (U) R 20 é p-trifluormetilfenila, trifluormetiltritila, perfluorpentila ou pentafluorfenila; ou (V) R2 tem uma das seguintes estruturas: º o o o o
    ""'-o o
    Q~P O-P-0 1 1 ;HO OH· '
    O NH2 o oligo~N H D s~/ o onde oligo representa um oligômero adicional. urhf'l'r"' nllon rf'nr,...,,..;:.-..nt-c. !l fi1rth,.,.r
    11. Composição CARACTERIZADA por compreender o ollgómero, contorme des- crito em qualquer uma das reivindicações 1-10, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 5 12. Oligômero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-10, CARACTERIZADO por ser usado em um método de tratar uma doença em um paciente, o uso compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligômero, conforme descrito em qualquer das reivindicações 1-10, a um paciente em ne- cessidade do mesmo.
    13. Oligômero, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato da doença ser uma infeção virai, uma doença neuromuscular, uma infecção bacteriana, doença inflamatória ou policística dos rins, preferivelmente onde a infecção virai é influenza ou onde a doença neuromuscular é distrofia muscular de Duchene.
    14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA por ser pa- ra uso em um método de tratar uma doença em um paciente, o uso compreendendo a ad- ministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um oligômero, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-1 O, ou uma composição, a um paciente em necessi- dade do mesmo.
    15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato da doença ser uma infecção virai, uma doença neuromuscular, uma infecção bacteriana, doença inflamatória ou policística dos rins, preferivelmente onde a infecção virai é influenza ou onde a doença neuromuscular é distrofia muscular de Duchenne.
    16. Subunidade morfolina CARACTERIZADA por ter a seguinte estrutura (X.XXI):
    z 1 W=P-X ~êºy' N 1
    PG (XXXI) ou um sal, estereoisômero ou tautômero da mesma, em que: W e Y são cada um O; X é -NR 8 R 9 ou -OR 3· e ' R 8 é hidrogênio ou alquila CrC12; R9 é hidrogênio, alquila CrC 12 , aralquila CrC 12 ou arila; em que R8 e R9 podem se unir para formar um heterociclo mono ou bicíclico de 5- 18 membros, e onde quando X é 4-piperazino, X tem a seguinte estrutura (Ili): R12 R,rl\ R,(\+/+ R,2 (III) onde: R11 é alquila CrC 12 , aminoalquila C1-C 12 , alquilcarbonila C1-C 12 , arila, heteroarila ou heterociclila; e R é um par de elétron, hidrogênio ou alquila C 1-C12; e R 12 é, em cada ocorrência, independentemente, hidrogênio, alquilaC 1-C 12 , aminoal- quilaCrC 12 , -NH 2, -CONH 2, -NR 13 R14 , -NR 13 R 14 R15 , alquilcarbonilaC1-C 12 , oxo, -CN, trifluor- metila, amidila, amidinila, amidinilalquila, amidinilalquilcarbonil guanidinila, guanidinilalquila, guanidinilalquilcarbonila, colato, deoxicolato, arila, heteroarila, heterociclo, -SR 13 ou alcóxiCr C 12 , em que R 13 , R14 e R15 são, em cada ocorrência, independentemente alquila C1-C 12 ; Z é halo ou uma ligação a um suporte sólido; e PG é aralquila CrC30.
    17. Uso da subunidade morfolina, conforme definida na reivindicação 16, CARACTERIZADO por ser para preparação de um oligômero, conforme definido em qual- quer das reivindicações 1-10, em uma reação de oligomerização, onde a reação de oligome- rização compreende repetidas etapas de desproteção do nitrogênio do anel de uma fase sólida de uma subunidade morfolina de estrutura (XXXI) e reação com uma subunidade morfolina de estrutura (XXXI).
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