BR112012026837B1 - método in vitro e kit para diagnosticar proliferações melanocíticas - Google Patents

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Abstract

método para diagnosticar proliferações melanocíticas. a invenção proporciona um método para o diagnóstico de uma proliferação melanocítica num indivíduo compreendendo a coloração de uma amostra de melanócitos lesionais com um anticorpo contra a adenilil ciclase solúvel (sac) e interpretar o padrão de coloração do sac, a qual está associada com o diagnóstico de uma proliferação melanocítica. o padrão de coloração sac, que é complexo, é discriminatória e distinto de acordo com a natureza da proliferação melanocítica. o padrão de coloração sac compreende uma ou mais dos pontos semelhantes a coloração de golgi, largo coloração de golgi granular, coloração citoplasmática difusa, coloração nucleolar, a coloração granular incompleta nuclear, e pan-nuclear de coloração. o método da invenção é particularmente útil para a confirmação do diagnóstico ou disaffirming alcançado através de exame histológico convencional de uma amostra. além disso, a invenção fornece um kit para uso na interpretação proliferações melanocíticas.

Description

MÉTODO IN VITRO E KIT PARA DIAGNOSTICAR PROLIFERAÇÕES MELANOCÍTICAS
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/326.174, depositado em 20 de abril de 2010, cujo conteúdo total é incorporado aqui por referência.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO A PROCESSO ELETRÔNICO
É incorporada aqui por referência em sua totalidade uma listagem de sequência de nucleotídios/aminoácidos legível por computador submetida a exame concomitante e identificada como se segue: One 21,813 Byte ASCII (Text) file named 707638_ST25.TXT, criada em 6 de abril de 2011.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Melanócitos, isto é, células produtoras de pigmento na pele, nos olhos e nas superfícies mucosas, dão origem a um espectro de lesões proliferativas que variam de nevos benignos a melanoma evidentemente maligno. Melanoma é uma doença com potencial metastático elevado mesmo nos estágios muito iniciais de desenvolvimento. O melanoma contribui com menos de 5% para casos de câncer de pele, mas causa uma grande maioria de mortes por câncer de pele (Cancer Facts & Figures, American Cancer Society, Atlanta, Georgia (2010)). O malanoma é notável por sua resistência a quimioterapia e radioterapia (Sondak, Cancer J., 7 (Suppl.1): S24-27 (2001)), de modo que um diagnóstico precoce correto de proliferações melanocíticas permanece como um elemento decisivo para redução da morbidade e da mortalidade.
Infelizmente, as lesões melanocíticas exibem
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2/58 heterogeneidade surpreendente em termos de morfologia e comportamento biológico, o que pode tornar seu diagnóstico um desafio mesmo para dermatologistas experientes. Lesões que não são claramente benignas nem claramente malignas têm sido ao longo do tempo agrupadas como “tumores melanocíticos de potencial maligno incerto (“MELTUMP”). Tem-se conseguido progresso no desenvolvimento de critérios histológicos objetivos para o diagnóstico dessas lesões indeterminadas (Magro et al., J. Am. Acad. Dermatol., 62(3: 469-479 (2010)), mas dignósticos inconclusivos podem ainda interferir no tratamento de pacientes, que podem estar sujeitos a procedimentos desnecessários como cirurgias agressivas, tratamentos adjuvantes, quimioterapia, imunoterapia ou radioterapia.
Embora exame histológico de biopsias teciduais permaneça o padrão-ouro no diagnóstico de proliferações melanocíticas (Soyer et. al., Color Atlas of Melanocytic Lesions of the Skin, p. 23 (Springer-Verlag, Berlim, 2007), cada vez mais se tem percebido o valor clínico de técnicas suplementares de diagnóstico. Informação acerca da combinação genética e/ou dos padrões de expressão de
proteínas de uma lesão pode ser usada para confirmar ou
invalidar um diagnóstico obtido por meio de exame
histológico.
Exemplos de técnicas suplementares de diagnóstico
incluem hibridização genômica comparativa (CGH), hibridização in situ por fluorescência (FISH) e imunostatinas. CGH e FISH utilizam sondas de DNA para fornecer informação sobre aberrações genéticas em uma amostra de tecido (Blokx et. al., Histopathol., 56: 121-132
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(2010)). Contudo, , tanto FISH quanto CGH constituem técnicas
trabalhosas e demoradas e requerem equipamento
especializado e amostras de tecido de alta qualidade. Sua
utilidade em um contexto clínico é, portanto, limitada.
Imunocoloração envolve a ligação de um anticorpo marcado a um epítopo proteico específico dentro de uma amostra de tecido, produzindo informação acerca dos níveis de expressão ou localização de proteínas. Colorações para HMB45, uma glicoproteína pré-melanossômica citoplasmática, ou Ki67, uma proteína associada a proliferação celular e transcrição de RNA ribossômico, são ocasionalmente usadas no diagnóstico de proliferações melanocíticas, embora nem a
coloração seja absolutamente específica nem especialmente
sensível (Ohsie e t. al., J. Cutan. . Pathol., 35 (5): 433-444
(2008)).
Os métodos atuais para detecção, diagnóstico,
prognósti co e tratamento de melanoma não reduzem
satisfatoriamente a morbidade e a mortalidade associadas à
doença. Há, portanto, uma necessidade na prática de
técnicas suplementares de diagnóstico para ser usadas em conjunto com a histologia tradicional, particularmente técnicas diagnósticas que sejam rápidas, que tenham boa relação custo-benefício e que sejam fáceis de interpretar.
BREVE RESUMO DA INVENÇÃO
A invenção fornece um método para diagnóstico de uma proliferação melanocíticas em um indivíduo compreendendo coloração de uma amostra de melanócitos lesionais com um anticorpo contra adenilciclase solúvel (sAC) e interpretação do padrão de coloração de sAC, que está associado a um diagnóstico de proliferação melanocítica. A
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4/58 aplicação deste método produz padrões de coloração da sAC característicos, que são complexos, mas parecem distintivos e inconfundíveis de acordo com a natureza da proliferação melanocítica. O padrão de coloração da sAC compreende um ou mais dos procedimentos de coloração de Golgi puntiforme, coloração de Golgi granular extensa, coloração citoplasmática difusa, coloração nucleolar, coloração nuclear granular incompleta e coloração pan-nuclear. A invenção destina-se a emprego na confirmação ou na invalidação de um diagnóstico alcançado mediante exame histológico convencional de uma amostra. Em alguns casos, entretanto, a interpretação do padrão de coloração da sAC isoladamente pode ser suficiente para estabelecer um diagnóstico. Além disso, a invenção fornece um kit para uso na interpretação de proliferação melanocítica.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo benigno. O padrão de coloração de sAC é caracterizado por pequena positividade de Golgi puntiforme ao redor do núcleo (seta). Coloração pan-nuclear não é observada. Coloração nuclear granular fraca, incompleta está algumas vezes presente.
A Figura 2 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo benigno. O padrão de coloração de sAC é caracterizado por pequena positividade de Golgi puntiforme ao redor do núcleo (seta A). Coloração pannuclear não é observada. Coloração nuclear granular fraca, incompleta está presente (seta B).
A Figura 3 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo recidivante. (A-C) Os
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5/58 componentes intraepidérmicos e dérmicos estão associados a algum componente de atipia de baixo grau como visto dentro do espectro do fenômeno nevo recidivante com inflamação e fibrose concomitantes. (D) O padrão de sAC é típico de um nevo benigno que mostra o clássico padrão de coloração puntiforme ao redor do núcleo (seta). Coloração nuclear significativa não é observada.
A Figura 4 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo atípico de locais especiais. (A) Nevos com atipia de baixo grau mostram um padrão semelhante ao do nevo benigno. Pequenos focos de ascensão pagetoide que emanam de zonas de atividade juncional agrupada são observados. As lesões têm densidade relativamente modesta sem zonas de crescimento confluente e os focos pagetoides definem o componente de pequena intensidade das lesões. (B-C) Nesse nevo discretamente atípico de locais especiais, um padrão de coloração de sAC puntiforme (seta) é observado ao redor do núcleo. Coloração nuclear discernível não é vista.
A Figura 5 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo atípico de locais especiais. (A-B) Ascensão pagetoide é uma indicação característica de nevos atípicos de locais especiais. Além disso, pode haver atipia citológica variável. Tais lesões podem por vezes ser confundidas com melanoma maligno. (C) Um padrão de coloração de sAC puntiforme (seta A) e coloração de Golgi extensa ocasional é observado ao redor do núcleo. Coloração nuclear discernível não é vista.
A Figura 6 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo discretamente displásico. (A-B)
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Os achados de microscopia óptica típicos de um nevo displásico composto são discerníveis, incluindo um ombro assimétrico com melanócitos agrupados que se estendem além do componente estabelecido na derme. Atipia citológica e da arquitetura discreta é discernível. (C-D) Há um padrão de coloração de sAC puntiforme ao redor do núcleo típico de lesões melanocíticas benignas (seta A). Há também um componente de coloração nuclear por meio do qual as células exibem um padrão de coloração nucleolar fraco juntamente com coloração nuclear granular incompleta (seta B). Coloração pan-nuclear significativa não é vista.
A Figura 7 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo displásico composto lentiginoso com atipia moderada. (A) A lesão melanocítica composta exibe indicações características de um nevo displásico, incluindo fusão de cristas epidérmicas por melanócitos e displasia lentiginosa moderada discernível. Alterações no estroma de um nevo displásico são notadas. (B-D) O padrão de coloração de sAC é sobretudo no contexto de um padrão de Golgi puntiforme (seta A) com coloração nucleolar focal fraca (seta B). Há também coloração pan-nuclear manifestada por pequena porcentagem das células (seta C).
A Figura 8 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um nevo moderada a intensamente displásico. (A-B) Atipia melanocítica significativa é notada. A lesão foi classificada como moderada a intensamente atípica com base no padrão relativamente confluente de crescimento lentiginoso de células isoladas com displasia lentiginosa de alto grau intercorrente. (C-D) Nesse exemplo, o padrão de coloração de sAC de melanócitos
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7/58 é mais complexo. Coloração de Golgi perinuclear é notada, embora não em toda a célula (seta A). Diversas células exibem coloração nucleolar e nuclear granular incompleta.
Células dispersas que exibem um padrão de coloração pannuclear são observadas, embora as células em sua maioria estejam sem coloração pan-nuclear. Menos de 25% das células mostram um padrão de coloração pan-nuclear (seta B).
A Figura 9 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma lentiginoso acral. (A) A biopsia revela um crescimento lentiginoso e pagetoide de alta densidade de melanócitos intensamente atípicos. (B-C) A coloração de sAC demonstra coloração pan-nuclear extensa de melanócitos dentro da epiderme, pontos mais luminosos dos melanócitos atípicos em uma distribuição lentiginosa e pagetoide. Coloração de Golgi discernível não é aparente.
A Figura 10 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma lentiginoso acral. (A-B) O espécime de biopsia revela um tumor melanocítico composto substancialmente atípico associado a um crescimento confluente e de alta densidade de melanócitos ao longo da junção dermoepidérmica com focos de ascensão pagetoide. A derme subjacente exibe um infiltrado fusiforme maligno. (CD) A coloração de sAC demonstra coloração pan-nuclear extensa de melanócitos dentro da epiderme e da derme; praticamente todas as células exibem esse padrão de coloração pan-nuclear. Coloração de Golgi discernível não é aparente.
A Figura 11 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma lentiginoso maligno. (A) A biopsia revela uma única célula confluente e proliferação
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8/58 agrupada de melanócitos intensamente atípicos ao longo da junção dermoepidérmica. As células exibem displasia lentiginosa clássica, conforme definido por hipercromasia nuclear notável, angulação nuclear e um aumento total no tamanho da célula. (B-D) A coloração de sAC demonstra coloração pan-nuclear extensa de melanócitos dentro da epiderme e da derme (seta A). Um padrão Golgi amplo é visto (seta B). (E) Apenas melanócitos fotoativados benignos que exibem um padrão Golgi são notados na margem lateral. (F) Por outro lado, coloração pan-nuclear evidente de melanócitos malignos está presente em uma margem borrada de resseção.
A Figura 12 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma disseminado superficial. (A) A proliferação melanocítica intraepidérmica possui melanócitos com aspecto epitelioide intensamente atípicos. A lesão é de alta densidade e está associada a obliteração epidérmica. (B-C) O padrão de coloração de sAC é muito anormal exibindo padrão de coloração pan-nuclear com coloração de Golgi mínima.
A Figura 13 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma disseminado superficial. (A) A projeção de baixa potência revela uma proliferação melanocítica composta com uma proliferação melanocítica intraepidérmica assimétrica que se estende além do componente com base na derme. O componente dérmico está associado a um padrão de crescimento obliterado dentro da derme. (B-D) O padrão de coloração de sAC demonstra uma coloração pan-nuclear distintamente extensa dentro da epiderme. Há também coloração pan-nuclear focal entre
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9/58 células neoplásicas na derme (seta A). Alguns núcleos são destituídos de coloração (seta B). Há coloração nucleolar proeminente (seta C). Ausência notável de coloração de Golgi é aparente.
A Figura 14 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma disseminado superficial originando-se dentro de um nevo. (A-B) A projeção de baixa potência exibe uma proliferação melanocítica composta com uma proliferação melanocítica intraepidérmica assimétrica que se estende além do componente estabelecido na derme. O componente dérmico está associado a um padrão de crescimento de obliteração dentro da derme. (C-D) O padrão de coloração de sAC demonstra uma coloração puntiforme perinuclear focal com coloração pan-nuclear observada entre um componente celular de menor importância dentro da derme. É interessante notar que diversas células estão sem nenhuma coloração discernível. (D) O componente do melanoma invasivo (seta B) pode ser distinguido do componente do nevo residual (seta A) pela coloração de sAC.
A Figura 15 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma disseminado superficial que se origina dentro de um nevo. (A-B) O espécime de excisão revela uma proliferação melanocítica composta atípica. O componente intraepidérmico está associado a um padrão de crescimento de alta densidade e confluente ao longo da junção dermoepidérmica com focos de ascensão pagetoide de melanócitos intensamente atípicos. O componente intraepidérmico é o de um melanoma in situ. Há um componente dérmico exibindo atipia variável. (C-D) A coloração de sAC demonstra um padrão de coloração panPetição 870190141330, de 30/12/2019, pág. 21/77
10/58 nuclear extenso (seta A) observado tanto em melanócitos atípicos isoladamente dispostos quanto em melanócitos agrupados localizados na epiderme que correspondem a melanoma in situ. Coloração semelhante é observada entre os melanócitos na derme superficial. Esse componente foi histologicamente mantido para representar melanoma invasivo. É interessante observar que o componente dominante dentro da derme que foi mantido como atípico, embora não diagnóstico de melanoma, demonstrou um padrão de Golgi perinuclear quase onipresente (seta B).
A Figura 16 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma disseminado superficial que se origina em uma localização acral. (A) A biopsia revela um crescimento pagetoide de alta densidade de melanócitos epitelioides intensamente atípicos exibindo um padrão de crescimento pagetoide na epiderme. Células atípicas estendem-se à cama de células granulares. (B-D) O padrão de coloração de sAC demonstra grande número de melanócitos com coloração pan-nuclear (seta A), poucas células com coloração de Golgi puntiforme perinuclear (seta B) e coloração citoplasmática difusa extensa.
A Figura 17 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma nodular. Os três painéis exibem coloração pan-nuclear notável. Somente uma minoria de células exibe alguma coloração de Golgi. A Figura 18 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma nodular. Trata-se de um melanoma nodular clássico, mostrando melanócitos epitelioides malignos com linfócitos mesclados. (B-D) O padrão de coloração de sAC revela coloração citoplasmática difusa juntamente com
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11/58 coloração nuclear focal. O padrão de Golgi não é discernível.
A Figura 19 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de uma variante de baixo risco de tumor de
Spitz atípico convencional. (A) Há uma lesão estabelecida na derme caracterizada por cordões e agrupamentos de algo extenso com a aparência de melanócitos epitelioides com atividade mitótica superficial. Maturação da arquitetura é notada conforme revelado por redução no tamanho e na densidade das células à medida que a base da lesão é aproximada. (B-D) O padrão de coloração de sAC é caracterizado por proeminência nucleolar (seta A) e um padrão amplo de coloração de Golgi (seta B). É notável a ausência de coloração pan-nuclear e de um padrão discreto de coloração de Golgi.
A Figura 20 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de uma variante de alto risco de tumor de Spitz atípico convencional em um idoso. (A-D) Há atipia citológica intensa sem maturação da arquitetura. O padrão de crescimento dominante é nodular com extensão para o tecido adiposo. As células que definem essa lesão mantiveram uma aparência epitelioide extensa intensamente atípica em toda a sua profundidade. (E-G) Ao contrário da variante de baixo risco, o padrão de coloração de sAC é pan-nuclear (seta A), apesar de produzir efeito somente numa minoria das células dérmicas. Embora haja coloração de Golgi ampla com efeito sobre aproximadamente 10% das células, o padrão mais proeminente é o de uma coloração citoplasmática difusa (seta B). Em desacordo com o padrão de coloração encontrado em um melanoma convencional, há
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12/58 ausência relativa de coloração pan-nuclear. A distinção absoluta neste caso de um melanoma nodular é difícil. O padrão é notavelmente diferente do tumor de Spitz atípico de baixo risco. O tumor foi associado a doença do linfonodo regional positivo.
A Figura 21 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um tumor de Spitz atípico superficial com atipia intensa. (A-B) Há uma proliferação melanocítica composta superficial associada a ascensão pagetoide significativa. Embora as células demonstrem um morfologia semelhante a tumor de Spitz fusiforme e epitelioide, há displasia intercorrente. (C-D) O padrão de coloração de sAC é um padrão de Golgi fraco e amplo (não mostrado). Um número significativo de células demonstram coloração pannuclear (seta A), ao passo que outras células exibem coloração nuclear granular (seta B) e nucleolar proeminente (seta C). O caso foi classificado como intensamente atípico.
A Figura 22 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma nodular com características de Spitz originando-se em um paciente de 8 anos de idade. (A-B) O espécime de excisão foi notável para um tumor epitelioide altamente atípico contíguo com a epiderme. Não houve evidência de maturação citomorfológica e/ou da arquitetura. (C-D) O padrão de coloração de sAC é sugestivo de um melanoma nodular com coloração pan-nuclear extensa, ausência de coloração de Golgi aparente e coloração citoplasmática difusa.
A Figura 23 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um tumor limítrofe de baixo risco com
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13/58 características semelhantes às de um nevo com penetração profunda. (A-C) A lesão é definida por uma proliferação melanocítica fusiformes e epitelioides dispostos em agrupamentos e fascículos, que focalmente assumem uma orientação algo perpendicular por toda a extensão do eixo longo da epiderme. As células têm citoplasma razoavelmente abundante e exibem melanização variável. A classificação como um tumor limítrofe é baseada principalmente na celularidade do padrão de crescimento observada mais superficialmente. (D) O padrão de coloração de sAC exibe coloração pan-nuclear mínima. Muitos dos melanócitos exibem coloração nuclear granular e nucleolar incompleta. O padrão de Golgi não é bem visualizado nessa imagem, mas revela um padrão puntiforme predominantemente perinuclear (seta).
A Figura 24 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um tumor limítrofe de alto risco com características semelhantes às de um nevo de penetração profunda. (A-F) Características de alto risco são identificadas incluindo o padrão de crescimento nodular extenso de toda a derme com zonas de crescimento dérmico obliterante. Há atipia citológica embora características evidentes de malignidade não sejam observadas. A lesão mantém uma aparência semelhante à de um nevo de penetração profunda com base na composição citomorfológica epitelioide juntamente com o padrão de crescimento plexiforme associado a acentuação de crescimento lobulado ao redor de estruturas anexas. (G-H) O padrão de coloração de sAC revela diversas células que exibem um padrão pan-nuclear. Há perda notável do padrão de Golgi.
A Figura 25 é uma fotografia que mostra um padrão de
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14/58 coloração de sAC de um tumor limítrofe nevoide. (A-B) Há atipia melanocítica intraepidérmica e dérmica significativa com ascensão pagetoide, associada a alterações do estroma subjacente de um nevo displásico. A atipia citológica é caracterizada por aumento celular substancial com hipercromasia nuclear. As células definidoras, embora atípicas, não são diagnósticas de melanoma. O diagnóstico diferencial dessa lesão é um tumor limítrofe intensamente atípico versus melanoma evidente. (C-D) O padrão de coloração de sAC exibe coloração pan-nuclear intraepidérmica e dérmica significativa, embora não superior a 30% das células (seta A). Várias das células exibem coloração nucleolar evidente e nuclear granular incompleta (seta B). Em termos gerais, a aparência da lesão em associação ao perfil de sAC na microscopia óptica é compatível com uma lesão intensamente atípica, apesar de não ser representativa de melanoma.
A Figura 2 6 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC e nevo capsular benigno. (A) Células de nevo benigno estão presentes dentro da cápsula do linfonodo. (B) Coloração de Golgi de sAC é notada ao redor do núcleo e há coloração nuclear granular incompleta. Coloração pan-nuclear não é identificada.
A Figura 27 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma metastático do pulmão. (A) A biopsia revela um tumor de células fusiformes incompletamente diferenciado. O tumor foi positivo para S100. Havia uma história anterior de um melanoma lentiginoso acral profundamente invasivo. (B-D) A coloração de sAC exibiu coloração pan-nuclear extensa sem coloração
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15/58 do citoplasma.
A Figura 28 é uma fotografia que mostra um padrão de coloração de sAC de um melanoma metastático do pulmão. A coloração de sAC demonstra coloração nuclear focal. Não há coloração discernível do citoplasma, e coloração de Golgi não é aparente.
A Figura 29 é uma representação esquemática dos seis principais padrões de coloração de sAC.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção fornece um método para diagnóstico de uma proliferação melanocítica em um indivíduo compreendendo coloração de uma amostra de melanócitos lesionais com um anticorpo contra adenilciclase solúvel (sAC) e interpretação do padrão de coloração de sAC, que está associado a um diagnóstico de proliferação melanocítica. A aplicação deste método produz padrões de coloração de sAC característicos, que são complexos, mas parecem diferenciadores e distintivos de acordo com a natureza da proliferação melanocítica. O padrão de coloração de sAC compreende um ou mais dos procedimentos de coloração de Golgi puntiforme, coloração de Golgi granular extensa, coloração citoplasmática difusa, coloração nucleolar, coloração nuclear granular incompleta e coloração pannuclear.
A invenção destina-se especialmente ao emprego na confirmação ou invalidação de um diagnóstico obtido mediante exame histológico convencional de uma amostra. Em alguns casos, entretanto, a interpretação do padrão de coloração de sAC isoladamente pode ser suficiente para se alcançar um diagnóstico.
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16/58 sAC é uma enzima sinalizadora solúvel que produz AMP cíclico (AMPc), conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente International No. WO 2001/085753 e Patente U.S. No. 6.544.768. A expressão de sAC foi observada em ceratinócitos, melanócitos, células mononucleares, ductos écrinos e nervos de pele humana (Zippin et. al., J. Invest. Dermatol., 130: 1279-1287 (2010)), além de outras regiões do corpo. O AMPc atua como mediador de respostas celulares a condições nutricionais e sinais extracelulares e cujos efeitos tanto estimuladores como inibidores sobre crescimento e proliferação celular são há muito conhecidos (Dumont et. al., Trends Biochem. Sci., 14: 67-71 (1989);
Rozengurt et al., Science, 234: 161-166 (1986)).
A presença ou a ausência de sAC em uma amostra de tecido pode ser determinada por coloração da amostra com um anticorpo contra sAC. Conforme se usa aqui, amostra ou biopsia refere-se a um espécime biológico removido de um indivíduo para análise diagnóstica. Em uma modalidade preferida, o indivíduo é um ser humano. Tipicamente, a amostra compreende uma biopsia de pele de uma região do corpo contendo melanócitos lesionais. A amostra pode ser derivada de um saca-bocado, raspado, curetagem, aspirado com agulha fina, linfonodo sentinela ou biopsia excisional ou qualquer outro método de biopsia. Em geral, a amostra será fixada com formalina e/ou embebida em parafina para facilitar manipulação. Além disso, conforme se usa aqui, coloração ou imunocoloração refere-se a (i) contato de uma amostra com suspeita de conter componentes antigênicos de sAC com um anticorpo específico contra um antígeno de sAC, extracelular ou intracelular, sob
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17/58 condições em que um complexo antígeno-anticorpo estável pode formar-se entre o anticorpo e os componentes antigênicos na amostra; (ii) detecção de qualquer complexo antígeno-anticorpo formado na etapa (i) usando-se quaisquer meios adequados conhecidos na prática, em que a detecção de um complexo indica a presença de componentes antigênicos de sAC na amostra.
O anticorpo contra sAC, isto é, anticorpo anti-sAC, pode ser qualquer anticorpo, ou fragmento ou derivado dele, que se liga a sAC. O anticorpo contra sAC pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, uma cadeia isolada de um anticorpo ou um fragmento Fab que se liga a sAC. Por exemplo, o anticorpo contra sAC pode ser um anticorpo monoclonal dirigido contra um único epítopo de sAC, uma combinação de anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos diferentes de um único componente antigênico de sAC, anticorpos monoclonais dirigidos para epítopos de diferentes componentes antigênicos de sAC, anticorpos policlonais dirigidos para o mesmo antígeno de sAC ou anticorpos policlonais dirigidos para diferentes antígenos d sAC.
O anticorpo pode ter como alvo qualquer epítopo de qualquer variante de união de sAC. A sAC possui diversas variantes de união, incluindo uma variante de 48 kDa e uma variante de 187 kDa (Buck et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 79-84 (1999); Jaiswal et. al., J. Biol. Chem., 276: 31698-31708 (2001)). Variantes de união adicionais podem também existir. As sequências de aminoácidos de sAC de comprimento normal (sACfl) e sAC truncada (sACt) são demonstradas como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2,
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18/58 respectivamente.
O anticorpo contra sAC pode ser preparado de qualquer maneira apropriada.
Um anticorpo policlonal pode ser preparado por imunização de um animal hospedeiro, como por injeção, com o polipeptídio ou um derivado de sAC (p. ex., fragmento ou proteína de fusão). Animais hospedeiros adequados incluem, mas não se limitam a, coelhos, camundongos, ratos, ovinos, caprinos etc. Um peptídio de sAC pode ser produzido mediante técnica recombinante ou síntese química, e um fragmento ou outro derivado ou análogo seu, incluindo uma proteína de fusão, pode ser usado como um imunógeno para gerar um anticorpo que reconhece o polipeptídio de sAC. Em uma modalidade, o polipeptídio de sAC ou seu fragmento pode ser conjugado com um portador imunogênico, como albumina sérica bovina (BSA) ou hemocianina extraída do molusco denominado lapa californiana (KLH). Adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica do animal hospedeiro, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, mas não se limitando a, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais (como hidróxido de alumínio), substâncias ativas da superfície (como lisolecitina), polióis plurônicos, poliânions, peptídios, emulsões oleosas, hemocianinas extraídas do molusco denominado lapa californiana, dinitrofenol e adjuvantes humanos (como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum).
Um anticorpo monoclonal pode ser preparado mediante qualquer técnica que forneça um anticorpo por uma linhagem celular contínua na cultura. Essas técnicas incluem, mas não se limitam a, técnica do hibridoma originalmente
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19/58 desenvolvida por Kohler e Milstein (Nature, 256: 495-497 (1975)), bem como a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Immunol. Today, 4: 72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 80: 2026-2030 (1983)) e a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., “The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer” em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)).
A produção de anticorpos monoclonais por enxerto de CDR é descrita em U.S. Patent Nos. 5.585.089, 5.693.761,
5.693.762 e 5.225.539. Além disso, anticorpos monoclonais podem ser produzidos em animais livres de germes, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente International No. WO 1989/012690.
Um anticorpo quimérico pode ser preparado, por exemplo, por união de genes de um anticorpo de camundongo específico para um polipeptídio de sAC com genes de um anticorpo humano de atividade biológica apropriada (Morrison et al., J. Bacteriol., 159: 870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); e Takeda et al.,
Nature, 314: 452-454 (1985)). As técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única (conforme descrito em, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5.476.786, 5.132.405 e 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir um anticorpo contra sAC.
Um fragmento de anticorpo, que contém o idiotipo do anticorpo contra sAC, pode ser gerado de qualquer modo apropriado, usando-se por exemplo técnicas conhecidas. Fragmentos de anticorpos apropriados incluem, mas não se limitam a, um fragmento F(ab')2 que pode ser produzido mediante digestão da molécula do anticorpo por pepsina, um
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20/58 fragmento Fab' que pode ser gerado reduzindo-se as pontes de dissulfeto do fragmento F(ab')2 e um fragmento Fab que pode ser gerado por tratamento de um anticorpo com papaína ou um agente redutor.
O anticorpo contra sAC, portanto ligado a sAC presente na amostra, é detectado de modo que se obtenha ou se distinga o padrão de coloração de sAC. A detecção do anticorpo contra sAC pode ser realizada mediante qualquer técnica apropriada, muitas das quais são bem conhecidas na prática, como técnicas mediadas por enzima (fosfatase alcalina, peroxidase da raiz-forte etc.) ou fluoróforo (FITC, TRITC, AMCA etc.). Em uma modalidade, a ligação do anticorpo é determinada por detecção de um marcador no anticorpo contra sAC. Em outra modalidade, o anticorpo primário é determinado por detecção da ligação de um anticorpo secundário ou reagente ao anticorpo primário, em que, em uma modalidade adicional, o anticorpo secundário é marcado e detectado.
Qualquer marcador apropriado pode ser utilizado de modo que se obtenha ou distinga o padrão de coloração de sAC. Marcadores apropriados incluem, mas não se limitam a, aqueles baseados em enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos e moléculas corantes. Outros reagentes e materiais podem ser utilizados para se obter e distinguir o padrão de coloração de sAC, como componentes desparafinadores empregados em amostras embebidas em parafina, pré-tratamento e de reagentes de bloqueio, reagentes de amplificação, tampões de enxágue, reagentes de bloqueio e correagentes de coloração.
Diversos anticorpos anti-sAC foram identificados,
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21/58 incluindo R5, R6.2, R7, R14, R21, R33, R37, R40, R41,
R47.1, R52, R53, R54 e R59 (Kamenetsky, “Mammalian Cells
Possess Multiple, Distinctly Regulated cAMP Signaling Cascades”, Ph.D. Dissertation, Weill Medical College of Cornell University, Publication No. AAT 3251733 (ProQuest Document ID 127639551) (2006)). Os epítopos alvos desses anticorpos são fornecidos em SEQ ID NOS: 3-10. Uma modalidade preferida envolve o uso do anticorpo R21, que é um anticorpo monoclonal de camundongo dirigido contra os aminoácidos 203-216 da proteína sACfl humana (Zippin et al., J. Invest. Dermatol., 130(5): 1279-1287 (2010)).
A coloração de uma amostra de melanócitos lesionais com um anticorpo contra sAC produz um padrão de coloração de sAC. Conforme se usa aqui, “padrão de coloração”, “padrão de expressão” ou simplesmente “padrão” refere-se à localização de sAC dentro de uma célula, conforme visualizado por meio de qualquer uma das técnicas de coloração de anticorpo anteriormente mencionadas. O “padrão de coloração de sAC” compreende coloração de Golgi puntiforme, coloração de Golgi granular extensa, coloração citoplasmática difusa, coloração nucleolar, coloração nuclear granular incompleta e/ou coloração pan-nuclear. A Figura 29 é uma representação esquemática desses seis principais padrões de coloração de sAC. Características adicionais de coloração, tais como coloração “fraca” ou “intensa”, também podem ser consideradas como parte da análise do padrão de coloração de sAC.
O padrão de coloração de sAC pode estar associado a um diagnóstico de um tipo de proliferação melanocítica, incluindo um diagnóstico selecionado do grupo que consiste
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22/58 em nevo benigno, nevo capsular benigno, nevo atípico de locais especiais, nevo displásico, tumor de Spitz atípico convencional, tumor de Spitz atípico superficial, lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe, tumor nevoide limítrofe, melanoma lentiginoso maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma disseminado superficial, melanoma nodular e melanoma metastático. Contudo, deve ser percebido que a terminologia de diagnóstico não é completamente padronizada no campo desta invenção. Exemplos de nomenclatura alternativa são fornecidos para cada diagnóstico, porém não devem ser considerados abrangentes nem limitantes.
Esta invenção é particularmente útil no diagnóstico de proliferações melanocíticas que são clinicamente e/ou histologicamente ambíguas. Em uma modalidade preferida, o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir uma neoplasia benigna de uma neoplasia maligna. Em outra modalidade preferida, o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir um diagnóstico de nevo displásico de um diagnóstico de melanoma disseminado superficial. Em outra modalidade preferida, o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir um diagnóstico de tumor de Spitz atípico superficial de um diagnóstico de melanoma disseminado superficial. Em outra modalidade preferida, o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir um diagnóstico de nevo capsular benigno de um diagnóstico de melanoma metastático. Esta invenção também pode ser útil na avaliação de nódulos proliferativos em nevos congênitos, na avaliação de margens de melanoma lentiginoso maligno, na delineação de melanoma invasivo nevócitos residuais e na
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23/58 avaliação de proliferações melanocíticas de prognóstico indeterminado.
As seções seguintes descrevem os vários tipos de proliferações melanocíticas, incluindo sua nomenclatura alternativa, características histológicas e padrões de coloração de sAC. Variações adicionais na terminologia de diagnóstico, familiares para aqueles com experiência prática, são também incluídas dentro da finalidade desta invenção. As características histológicas são derivadas de The Melanocytic Proliferations: A Comprehensive Textbook of Pigmented Lesions (Crowson et al., “The superficial atypical Spitz tumor and malignant melanoma of superficial spreading type arising in association with the superficial atypical Spitz tumor: A distinct form of dysplastic
Spitzoid nevomelanocytic proliferation”, J. Acad.
Dermatol., 60(5): 814-823 (2009), e Magro et al., The dermal-based borderline melanocytic tumor: A categorical approach”, J. Acad. Dermatol., 62 (3): 469-479 (2010), os quais são incorporados aqui por referência.
As expressões lesão melanocítica”, proliferação melanocítica”, neoplasia melanocítica” e lesão pigmentada” são usadas como sinônimos e se referem a um acúmulo de melanócitos. O termo benigno” refere-se a neoplasias que são não cancerosas e incapacidade de metastatizar. O termo maligno” refere-se a neoplasias que são cancerosas e são dotadas de capacidade de metastatizar. Todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o significado compreendido por uma pessoa com experiência prática a que esta invenção diz respeito.
Nevo benigno
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Nomenclatura alternativa: Um nevo benigno pode também ser referido como um nevo adquirido benigno, um nevo adquirido comum, um nevo congênito, um nevo melanocítico, um nevo não displásico, um nevo juncional, um nevo dérmico, um nevo composto, uma mola ou um hamartoma.
Características histológicas: Um nevo benigno é composto de nevomelanócitos e não possui a atipia própria de proliferações melanocíticas intermediárias ou malignas. Os nevomelanócitos podem ser classificados como tipo A, tipo B ou tipo C e estão localizados na epiderme e na derme, em agrupamentos coesos ou como células dispostas isoladamente. Nevomelanócitos do tipo A são grosseiramente melanizados, sobretudo em seus dendritos, e mais intensamente melanizados ao redor do núcleo. Os nucléolos são minúsculos e manifestam uma coloração azul nas preparações de hematoxilina e eosina. Células do tipo A são encontradas na epiderme e na derme superficial. Os nevomelanócitos do tipo B são células arredondadas ou cuboides não pigmentadas com núcleos hipercromáticos redondos contendo nucléolos imperceptíveis e com uma margem escassa de citoplasma eosinofílico. As células do tipo B têm a morfologia mais estritamente semelhante à de células hematopoiéticas mononucleares, isto é, lifócitos ou mastócitos pequenos, embora costumem ser ligeiramente maiores, com tamanho que varia entre 8 a 10 m. Os nevomelanócitos do tipo C possuem uma morfologia fusiforme com processos citoplasmáticos alongados fibrilares que mais se assemelham a uma célula de Schwann madura.
Nevos benignos prototípicos exibem um padrão característico de evolução. As lesões inicialmente se
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25/58 manifestam como proliferações lentiginosas de células isoladas, dispersas ao longo da camada basal da epiderme, formando máculas não palpáveis de cor marrom ou escura, algumas vezes com um contorno irregular. Dentro da epiderme, tecas juncionais distintas acumulam-se formando nevos juncionais. Um nevo composto, com melanócitos na epiderme e na derme, forma-se à medida que ocorre migração para a derme, sendo o concomitante clínico uma lesão palpável discretamente elevada. Migração completa para a derme resulta em nevo dérmico, que se manifesta clinicamente como uma lesão palpável com pigmentação diminuída, o que confere uma coloração marrom ou pálida à lesão.
Padrões de coloração de sAC: Nevos benignos exibem um padrão monotípico discreto de coloração de Golgi perinuclear puntiforme (Figura 1, seta) na maioria dos melanócitos dentro da epiderme e da derme (Figuras 1-3). Coloração nucleolar pode ser vista e costuma ser fraca. Alguns casos também exibem coloração nuclear granular focal fraca. A maioria dos casos não mostra nenhuma coloração pan-nuclear, mas raras células com esse padrão particular de coloração podem ser observadas.
Nevo capsular benigno
Nomenclatura alternativa: Um nevo capsular benigno pode também ser referido como uma coleção de nevócitos benignos.
Características histológicas: Coleções de nevócitos benignos dentro da cápsula de linfonodo definem o conceito de nevo capsular benigno.
Padrões de coloração de sAC: Os nevos capsulares
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26/58 benignos exibem (i) coloração citoplasmática difusa fraca sem nenhuma coloração nuclear e/ou (ii) coloração de Golgi puntiforme. Os padrões de coloração de sAC de nevos capsulares benignos não são comparáveis àqueles observados no melanoma e/ou em outras proliferações melanocíticas de alto grau (Figura 26).
Nevo atípico de locais especiais
Nomenclatura alternativa: Um nevo atípico de locais especiais pode também ser referido como um nevo atípico.
Características histológicas: Nevos atípicos de locais especiais não são malignos, mas podem revelar características atípicas sugestivas de um nevo displásico ou de um melanoma. Os “locais especiais” mais importantes incluem pele genital, pele acral, pele da orelha e pele flexural. Alguns nevos atípicos de locais acrais têm atipia citológica e disseminação pagetoide de melanócitos através da epiderme que podem tornar difícil sua distinção morfológica de melanoma. Além disso, nevos atípicos de locais acrais podem ser precursores de melanomas do tipo de disseminação superficial e do tipo lentiginoso acral.
Padrões de coloração de sAC: O padrão de coloração de sAC do nevo atípico de locais especiais é semelhante ao do nevo benigno, ou seja, um padrão de coloração de Golgi perinuclear puntiforme proeminente (Figura 4) com coloração nucleolar fraca variável. Em casos que exibem atipia discreta, coloração pan-nuclear em geral é vista em menos de 10% de melanócitos intraepidérmicos e está frequentemente acompanhada de coloração nucleolar fraca. Nenhuma coloração pan-nuclear é observada em melanócitos da derme. Em casos que mostram grau mais elevado de atipia,
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27/58 mais melanócitos intrepidérmicos exibem coloração pannuclear, ao passo que outros melanócitos exibem coloração nuclear granular incompleta intensa. Nenhuma coloração pannuclear é observada em melanócitos da derme. Onde coloração pan-nuclear não é vista, há geralmente preservação do padrão de coloração de Golgi puntiforme em melanócitos da derme. Em um caso particular de um nevo atípico de locais flexurais, não são observadas coloração nuclear e coloração de Golgi perinuclear extensa (Figura 5, seta B).
Nevo displásico
Nomenclatura alternativa: Um nevo displásico pode também ser referido como um nevo com desorganização da arquitetura e atipia citológica ou um nevo atípico.
Características histológicas: Os critérios que devem estar presentes por ocasião de um diagnóstico de nevo displásico são considerados critérios principais, e aqueles critérios adicionais que não estão presentes em todos os casos, mas, quando observados, constituem evidência corroborativa auxiliar de um diagnóstico de nevo displásico, são considerados critérios de menor importância. Um diagnóstico de nevo displásico é feito quando tanto critérios principais quanto pelo menos dois critérios de menor importância são satisfeitos.
Critérios principais incluem (1) proliferação basilar assimétrica de nevomelanócitos ao longo da junção dermoepidérmica estendendo-se lateralmente além dos limites de um componente dérmico preexistente, se e quando presente, em geral por três cristas epidérmicas ou mais e (2) citomorfologia característica, manifestada como displasia melanocítica lentiginosa ou displasia
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28/58 melanocítica de célula epitelioide.
Critérios de menor importância incluem (1) colágeno dérmico papilar com fibrose eosinofílica concêntrica em que uma zona densa de colágeno eosinofílico claramente acelular envolve cristas epidérmicas e/ou fibroplasia lamelar onde camadas delicadas de colágeno são intercaladas com células fusiformes supostamente de origem da crista neural, que agem como fibroblastos facultativos depositando colágeno abaixo das extremidades das redes hiperplásicas em distribuição paralela, (2) infiltrados linfocíticos na derme papilar, sendo de intensidade máxima sob áreas em que melanócitos exibem atipia citológica, (3) vasos proeminentes que podem ser neoformados ou vasos preexistentes que mostram ativação ou hiperplasia de células endoteliais e (4) fusão das redes por crescimento confluente entre agrupamentos de melanócitos adjacentes.
Padrões de coloração de sAC: Nevos displásicos com graus mais elevados de atipia exibem maior coloração pannuclear do que aqueles com graus menores de atipia. Independentemente da extensão de atipia melanocítica intraepidérmica, há ausência significativa de coloração pan-nuclear no componente dérmico em nevos displásicos. Em quase todos os nevos displásicos, um padrão de coloração de Golgi puntiforme perinuclear dominante é observado (Figura 6, seta A; Figura 7, seta A; Figura 8, seta A) na maioria dos melanócitos na epiderme e na derme. Coloração nucleolar e nuclear granular focal pode também ser observada em um número variável de células (Figura 7, seta B). Uma população menor de células exibe coloração de Golgi extensa, especialmente em lesões de grau mais elevado.
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Nevos discretamente displásicos, semelhantemente a nevos benignos, são caracterizados por um padrão de coloração de Golgi puntiforme, em combinação com umas poucas células lesionais dentro da epiderme, tipicamente menos de 10%, que exibem um padrão de coloração pan-nuclear (Figura 6).
Em nevos displásicos de grau mais elevado, muitos dos melanócitos lesionais dentro da epiderme exibem coloração nucleolar proeminente, com coloração nuclear granular focal superposta. Um número significativo de melanócitos intraepidérmicos, geralmente menos de 25%, exibe coloração pan-nuclear (Figura 6, seta B; Figura 7, seta C; Figura 8, seta B).
Tumor de Spitz atípico convencional
Nomenclatura alternativa: Um tumor de Spitz atípico convencional pode também ser referido como um nevo de Spitz atípico convencional, um tumor de Spitz atípico da infância, um tumor de Spitz atípico convencional da infância, um tumor de Spitz ou um nevo de Spitz.
Características histológicas: O tumor de Spitz atípico convencional manifesta-se como uma proliferação nevomelanocítica dérmica e epidérmica de forma nitidamente circunscrita, que assume a arquitetura de um cone invertido com sua base orientada paralelamente à junção dermoepidérmica e seu ápice apontando para a subcútis. Caracteristicamente, grandes tecas de nevomelanócitos estão presentes na junção dermoepidérmica, onde são separadas por espaços semelhantes a fendas a partir da epiderme adjacente. Esses agrupamentos são acompanhados de hiperplasia da derme, que pode ser de caráter
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30/58 pseudoepiteliomatoso, com hiperceratose e hipergranulose sobrejacente. A derme papilar possui aparência edematosa, e há ectasia vascualar. As tecas juncionais parecem “cair em gotas” na derme papilar, à medida que células fusiformes se orientam em toda a extensão das redes alongadas de modo perpendicular ao estrato córneo. Os agrupamentos podem manifestar alguma adesão, um fenômeno que contrasta nitidamente com a epiderme intacta adjacente. Corpos hialinos eosinofílicos com tamanho que varia de 30 a 40 mícrons, referidos como corpos de Kamino”, podem ser vistos em tais agrupamentos e estão presentes em 60% de todos os tipos de nevo de Spitz. Com respeito a sua composição citológica, o tumor de Spitz atípico convencional geralmente compreende uma mistura variável de nevomelanócitos epitelioides e fusiformes, os últimos predominando na maioria dos exemplos.
Padrões de coloração de sAC: Lesões com características de baixo risco exibem coloração nucleolar proeminente (Figura 19, seta A) em combinação com coloração de Golgi granular extensa (Figura 19, seta B), mas não exibem coloração pan-nuclear significativa. Lesões com características de risco elevado exibem adicionalmente coloração citoplasmática difusa (Figura 20, seta B) e coloração pan-nuclear em uma minoria de células tanto na derme quanto na epiderme (Figura 20, seta A).
Tumor de Spitz atípico superficial
Nomenclatura alternativa: Um tumor de Spitz atípico superficial pode também ser referido como um nevo de Spitz do tipo placa.
Características histológicas: Espécimes de biopsia são
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31/58 representados por proliferações melanocíticas compostas relativamente superficiais. Na maioria dos casos, o componente dérmico está amplamente confinado à derme papilar (isto é, equivalente ao nível III de Clark). Há variação na condição da epiderme de natureza hiperplásica a áreas de adelgaçamento epitelial. Disseminação pagetoide é observada e pode definir o crescimento dominante nas margens laterais da lesão. As lesões são definidas por células epitelioides e fusiformes de aparência Spitzoide. Células semelhantes a gânglios pleomorfos são vistas em alguns casos e localizadas predominantemente na derme. A maioria dos casos exibe características de displasia por ocasião da definição entre populações de células intraepidérmicas e dérmicas de graus variados com base na presença de heterogeneidade considerável no tamanho e na forma da célula, aberrações no contorno do núcleo e nucleolação notável particularmente entre células epitelioides. Em alguns casos, de atipia é intensa e acompanhada de aumento de atipia da arquitetura. Em alguns casos, as lesões exibem alterações características da arquitetura que estão associadas a um nevo displásico, incluindo alongamento e fusão de cristas epidérmicas juntamente com fibroplasia semelhante a cortina. Um componente dérmico é observado na maioria dos casos por onde as células assumem um padrão de crescimento de células isoladas e/ou em pequenos grupos sem nenhuma zona de obliteração dérmica. Mitoses da derme não são identificadas além de mitoses juncionais eventuais. Um aspecto característico visto em alguns casos é uma expansão em forma de placa da derme por colágeno esclerótico. A
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32/58 esclerose é algo sugestiva de regressão; entretanto, o estroma é mais hialinizado e contém células multinucleadas Spitzoides características dispostas ao acaso.
Padrões de coloração sAC: Tumores de Spitz atípicos superficiais exibem coloração de Golgi extensa com coloração nucleolar proeminente (Figura 21, seta C) na maioria dos casos e coloração de Golgi puntiforme em uma minoria dos casos. Pequena quantidade de células na derme exibe coloração pan-nuclear. A coloração pan-nuclear de células na epiderme (Figura 21, seta A) é variável, e pode ser extensa, simulando melanoma, em casos com atipia citológica intensa. Em contrapartida, em um caso particular de um paciente de 8 anos de idade acometido de melanoma nodular com características Spitzoides, não há coloração nucleolar, não obstante coloração pan-nuclear significativa; o citoplasma é difusamente positivo (Figura 22).
Lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe
Nomenclatura alternativa: Uma lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe pode também ser referida como uma lesão melanocítica limítrofe que se origina em associação a um nevo de penetração profunda ou uma lesão melanocítica limítrofe com características semelhantes a nevo de penetração profunda.
Características histológicas: Lesões semelhantes a nevo de penetração profunda limítrofe exibem todas as características típicas de um nevo de penetração profunda (DPN) juntamente com características adicionais não encontradas no DPN clássico. Em particular, existem áreas
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33/58 de proliferação celular sobrepostas distribuídas ao longo do eixo da epiderme, em contradição com a orientação regularmente vertical dominante observada no DPN típico, ou um crescimento expansível nodular na base. Um padrão de crescimento nodular expansível nas zonas de proliferação melanocítica orientada verticalmente é também observado. Tais focos também manifestam atipia citológica aumentada com expansão celular e atividade mitótica intensificada, incluindo mitoses marginais. Ao contrário das outras subcategorias de tumores melanocíticos limítrofes, os focos de proliferação anormal podem ser superficialmente confinados apesar de ainda localizados na derme reticular, enquanto a face profunda da neoplasia pode estar dentro do espectro de DPN residual.
Padrões de coloração de sAC: Em lesões semelhantes a nevo de penetração profunda limítrofe, o número de células que demonstram coloração pan-nuclear varia de acordo com a extensão de atipia citológica e da arquitetura. Lesões de baixo risco exibem coloração de Golgi tanto puntiforme quanto extensa, coloração nucleolar e granular incompleta na maioria das células e coloração pan-nuclear em uma minoria das células. Um caso de lesão de baixo risco mostra coloração de Golgi puntiforme preservada (Figura 23, seta) com coloração pan-nuclear mínima. Lesões de alto risco evidenciam coloração pan-nuclear significativa além de perda de coloração de Golgi puntiforme (Figura 24), aquisição de coloração de Golgi extensa e/ou coloração citoplasmática difusa.
Tumor nevoide limítrofe
Nomenclatura alternativa: Um tumor nevoide limítrofe
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34/58 pode também ser referido como um melanoma de desvio mínimo ou um tumor melanocítico de potencial maligno indeterminado (MELTUMP).
Características histológicas: A arquitetura de baixa potência é uma proliferação agrupada com circunscrição lateral da forma. Em variância com a silhueta simétrica de um nevo composto ou dérmico está a condição expansível dos agrupamentos estabelecidos na derme. Em alguns casos, o componente intraepidérmico pode estar ausente, ao passo que em outros casos uma zona limítrofe estreita de derme papilar não envolvida separa agrupamentos dérmicos de áreas de melanócitos intraepidérmicos. Os agrupamentos situados na porção intermediária e na porção mais profunda da derme são maiores que os agrupamentos mais superficiais. Ocasionalmente, são observadas mitoses na porção intermediária da derme. As células são citologicamente atípicas, mas não exibem características diagnósticas de melanoma completamente desenvolvido. Um elemento de monotipismo define a população celular e está em variância com o nevo clássico, que evidencia maturação com descência dérmica, especificamente de um nevomelanócito do tipo A para um nevócito do tipo C fusiforme. As células são notavelmente menores do que as células do melanoma nevoide, mas diferem do nevo melanocítico clássico em razão do tamanho celular maior na base em comparação com as células vistas na face profunda de um nevo melanocítico benigno; há células na base, cujo tamanho excedeu o de células localizadas mais superficialmente. Dispersas por toda a lesão, especialmente na base, estão células que demonstram nucléolos notáveis, sulcos nucleares e proporções entre
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35/58 núcleo e citoplasma aumentadas, embora tais células não definam a população dominante. Células lesionais em todos os casos estendem-se à derme reticular.
Padrões de coloração de sAC: Há duas categorias principais de tumores nevoides limítrofes. Uma categoria principal de tumores nevoides limítrofes é caracterizada por uma proliferação melanocítica dérmica/epidérmica superficial com atipia significativa que simula melanoma superficialmente invasivo do tipo melanoma de disseminação superficial. Esses casos exibem coloração pan-nuclear extensa, com mais casos atípicos mostrando padrões que se assemelham aos daqueles vistos em melanomas. Entretanto, a coloração pan-nuclear na derme é menos extensa do que no melanoma. Do mesmo modo que em melanomas de disseminação superficial, o padrão de coloração de Golgi é ausente ou extenso. Um número variável de células com coloração de Golgi puntiforme preservada pode ser visto. Em tumores nevoides dérmicos limítrofes, que constituem a segunda principal categoria de tumores nevoides limítrofes, as lesões assemelham-se a um nevo dérmico com atipia melanocítica sobreposta que pode ser moderada ou intensa; a distinção de melanoma é revelada pela coloração de Golgi puntiforme dominante na maioria dos casos, embora acompanhada em algum grau de coloração de Golgi extensa. Há coloração pan-nuclear, porém em menos células do que no melanoma (Figura 25).
Melanoma lentiginoso maligno
Características histológicas: a aparência histomorfológica do lentigo maligno, que é o precursor de melanoma lentiginoso maligno, é a de melanócitos de forma
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36/58 poligonal com núcleos hipercromáticos angulados dispersos como unidades individuais, inicialmente confinados à camada basal da epiderme de modo lentiginoso descontínuo. Essas células anormais estendem-se ao longo dos ductos écrinos e do epitélio da bainha radicular de folículos pilosos, permeando as porções intermediária e inferior do istmo e abaixo. Outra característica singular da citomorfologia do lentigo maligno consiste em melanócitos gigantes multinucleados ao longo da camada basal da epiderme. Denominadas “células gigantes estrelares”, elas podem conter mais de 30 núcleos e foram identificadas em até 85% de todos os casos de lentigo maligno. A epiderme no lentigo maligno é caracteristicamente atrófica, manifestando adelgaçamento e perda do padrão retiforme que se sobrepõe ao colágeno elastoide dérmico; telangiectasia e melanófagos completam o quadro que foi designado como um precursor de melanoma. À medida que a lesão progride clínica e histologicamente, é observada continuidade de proliferação melanocítica basilar de células isoladas, seguida por um padrão agrupado de atividade juncional. Especificamente, tecas juncionais adesivas de tamanho variável formam-se ao longo da junção dermoepidérmica; tais agrupamentos assumem uma distribuição paralela por toda a extensão do eixo da epiderme. Essa morfologia de grupo distintiva foi referida como o sinal do ninho de andorinha”. Além disso, focos de infiltração pagetoide proeminente são observados à medida que a lesão progride. Agrupamento, confluência de melanócitos ao longo da camada basal e disseminação pagetoide de melanócitos neoplásicos, que são considerados representaivos das características de melanoma in situ, são
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37/58 os precursores da fase seguinte de evolução da lesão, ou seja, invasão dérmica.
Disseminação pagetoide é incomum nas lesões iniciais. Quando ocorre disseminação pagetoide, a citomorfologia é caracteristicamente a de um tipo de célula epitelioide similar ao observado em lesões neoformadas de displasia melanocítica epitelioide intraepidérmica e melanoma maligno in situ do tipo disseminado superficial. Um padrão agrupado proeminente e áreas de infiltração pagetoide notável usualmente significam um alto risco de que tenha ocorrido progressão para melanoma microinvasivo confinado na fase de crescimento radial. Outros indícios da evolução de melanoma in situ para melanoma microinvasivo é a presença de um infiltrado liquenoide com melanófagos anexos em uma derme papilar que exibe esclerose laminada. Tais achados justificam exame minucioso da derme papilar inflamada quanto à presença de melanócitos neoplásicos distribuídos de modo isolado. Na eventualidade de que melanoma maligno invasivo inequívoco não seja identificado, a presença de alterações regressivas do estroma e de resposta inflamatória do hospedeiro indica que um componente microinvasivo antecedente não pode ser excluído. Neovascularização também pode ser uma característica. As células microinvasivas são em geral distribuídas isoladamente e têm uma citomorfologaia praticamente idêntica à das células dentro da epiderme que são interpretadas como representativas de melanoma in situ. Tipicamente, elas possuem uma morfologia epitelioide, quase sempre manifestando citoplasma regularmente abundante e variavelmente pigmentado.
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Padrões de coloração de sAC: Em melanomas lentiginosos malignos, a maioria dos casos exibe coloração pan-nuclear homogênea e/ou granular proeminente na maioria dos melanócitos neoplásicos (Figura 11, seta A). Coloração de Golgi pode estar ausente, mas, onde coloração de Golgi é discernível, o padrão é tipicamente de coloração extensa (Figura 11, seta B). Não se observa coloração citoplasmática difusa discernível. A coloração pan-nuclear proeminente permite fácil distinção entre lentigo maligno e alterações subjacentes de fotoativação crônica (Figuras 11E e 11F).
Melanoma lentiginoso acral
Características histológicas: Melanoma lentiginoso acral maligno ocorre predominantemente nas palmas das mãos, nas solas dos pés, nas regiões subungueais e nos dígitos e é o tipo mais comum de melanoma maligno. As lesões incipientes de melanoma lentiginoso acral manifestam-se como melanócitos atípicos dispersos isoladamente em uma distribuição lentiginosa com focos de crescimento basilar confluente. Pode haver hiperplasia da epiderme alternandose com zonas de obliteração epidérmica, e uma camada fina orto-hiperceratótica densa sobrejacente pode ser observada. Eliminação de pigmento transepitelial é característica e assume um padrão aletório, ao contrário das colunas de pigmento organizadas associadas a nevos acrais benignos. Quase invariavelmente, uma resposta inflamatória de células mononucleares está presente na derme superficial, um achado que está uniformemente ausente em nevos acrais adquiridos. O infiltrado pode assumir um padrão liquenoide com focos resultantes de formação de fendas subepidérmicas. Com
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39/58 progressão adicional da fase de crescimento radial, infiltração pagetoide da epiderme pode vir a comprometer o padrão dominante de crescimento intraepidérmico. A citomorfologia do componente lentiginoso é a de células grandes com células grandes anguladas hipercromáticas de citoplasma escasso; detalhe do núcleo é obscurecido. Processos dendríticos proeminentes de melanócitos neoplásicos dispostos lentiginosamente podem estender-se para as camadas superiores do estrato espinhoso. Quando em uma distribuição pagetoide, os melanócitos neoplásicos tipicamente têm morfologia epitelioide. Tais lesões podem simular melanoma maligno de disseminação superficial, que pode também ser visto em localizações acrais. Eles se estendem de modo aleatório para a epiderme independentemente do componente juncional agrupado. Tropismo para estruturas anexas pode ser proeminente. Um padrão de células isoladas em geral predomina sobre um padrão de agrupamento, ao passo que o inverso é verdadeiro em nevos benignos. Os agrupamentos variam de tamanho e forma, manifestam adesão e são compostos de células com uma morfologia ou epitelioide ou fusiforme. Embora agrupamentos de tamanho grande e variável e distribuídos possam ser vistos no nevo acral benigno prototípico, as células de melanoma acral exibem atipia nuclear intensa e o padrão de crescimento de células isoladas é dominante e predominante, uma característica que não é de todo comum do nevo melanocítico acral prototípico.
O componente invasivo da fase de crescimento radial do melanoma lentiginoso acral compreende células em uma disposição do tipo células isoladas ou agrupadas com uma
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40/58 citomorfologia similar à das células dentro da epiderme. As células isoladas invasivas em geral exibem citoplasma mais abundante, frequentemente com pigmentação fina. Mitoses são comuns no componente intraepidérmico. Agrupamentos dérmicos dominantes que manifestam mitoses não estão presentes na fase de crescimento radial do melanoma maligno em qualquer local; sua presença significa progressão para melanoma de fase de crescimento vertical. Uma lesão precursora, embora incomum, foi relatada.
Padrões de coloração de sAC: Na maioria dos casos de melanomas lentiginosos acrais, melanócitos neoplásicos demonstram um padrão distintivo de displasia lentiginosa caracterizado por células alongadas com núcleos angulados de coloração escura representando a maioria dos melanócitos intraepidérmicos (Figuras 9-10). Essas células exibem coloração de Golgi amplamente intensa. A maioria das células também exibe coloração pan-nuclear (Figuras 9-10) e nenhuma coloração difusa discernível do citoplasma.
Melanoma de disseminação superficial
Características histológicas: Por definição, melanoma de disseminação superficial maligno deve ter uma fase de crescimento radial. Em seu início, essa fase de crescimento radial é confinada ao compartimento epidérmico.
Um padrão de crescimento intraepidérmico manifesta uma citomorfologia epitelioide e arquitetura pagetoide. Especificamente, as células possuem núcleo arredondado a oval com margens espessas de cromatina nuclear, macronucléolos e quantidades abundantes de citoplasma eosinofílico e anfofílico dentro do qual grânulos de melanina de forma e tamanho variáveis são identificados.
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Essas células crescem de modo aleatório (pagetoide) com distribuição de células isoladas através da epiderme para a camada cornificada. Figuras mitóticas espalhadas podem ser vistas. A epiderme é frequentemente hiperplásica.
Um segundo padrão de crescimento intraepidérmico é o de proliferação lentiginosa contínua de células isoladamente distribuídas ao longo da junção dermoepidérmica. Há obliteração retiforme. Em razão do crescimento melanocítico lentiginoso confluente, ceratinócitos basilares discerníveis não são observados. O caráter citológico das células atípicas que compreende esse padrão lentiginoso é o de núcleos angulados hipercromáticos que podem estar ausentes no detalhe nuclear interno e exceder o tamanho de núcleos de ceratinócitos adjacentes. O citoplasma de cada célula é amplo e contém grânulos de melanina finamente distribuídos.
Um terceiro padrão de crescimento intraepidérmico é o de agrupamentos oblongos confluentes compostos de células hipercromáticas fusiformes com sulcos nucleares distintos, bordas proeminentes de cromatina nuclear, nucléolos proeminentes e malanização variável. A deposição de pigmento é irregular. Pode haver obliteração retiforme. Em muitos casos, um padrão híbrido de crescimento intraepidérmico é observado com uma combinação dos padrões anteriormente mencionados de distribuição e citomorfologia da arquitetura.
Infiltração linfocítica é frequentemente observada na derme papilar subjacente e pode servir de sinal para o início de melanoma microinvasivo incipiente maligno. Fibroplasia delicada é comumente vista. A resposta do
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42/58 estroma perirreticulado organizado do nevo displásico não é observada em tais áreas, entretanto, a menos que seja vista no contexto de um resíduo de um nevo displásico precursor no local.
O estágio seguinte na progressão do malnoma maligno de fase de crescimento radial é o desenvolvimento de tumor microinvasivo confinado à derme papilar. Esse componente compreende tanto células agrupadas quanto isoladamente dispersas com uma citomorfologia semelhante à de células intraepidérmicas. Entretanto, as células do melanoma invasivo isoladamente dispostas costumam exibir citoplasma mais abundante com uma tonalidade eosinofílica. Os agrupamentos não devem exceder o tamanho de qualquer agrupamento ao longo da junção dermoepidérmica nem devem ser identificadas mitoses estabelecidas na derme; qualquer uma destas características sugere melanoma de fase de crescimento vertical incipiente. Em uma minoria dos melanomas malignos de disseminação superficial, a fase de crescimento radial compreende melanócitos fusiformes. Conforme mencionado, melanoma maligno limitado à fase de crescimento radial pode originar-se em um remanescente de um nevo displásico. Usualmente, os focos de nevo displásico estão presentes na periferia. Contudo, por vezes estão presentes como pequenos focos interpostos entre áreas de melanoma.
Qualquer invasão lateral discernível dentro da epiderme além dos limites do componente dérmico define melanoma maligno de disseminação superficial.
Alternativamente, qualquer componente da fase de crescimento radial invasivo superficial com disseminação
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43/58 lateral além dos limites de um componente mais profundamente invasivo define melanoma maligno de disseminação superficial.
Padrões de coloração de sAC: Coloração pan-nuclear intercorrente, que afeta pelo menos 25% da população de células tanto na epiderme quanto na derme, é a característica que diferencia melanomas de disseminação superficial de nevos displásicos (Figuras 12-16) . De fato, um grau significativo de coloração pan-nuclear entre células na derme, ao contrário de coloração intraepidérmica, é um achado importante que significa melanoma invasivo. Em casos que se originam em nevos preexistentes, o padrão de coloração de sAC pode ser usado para fazer distinção entre células de melanoma invasivo e células de nevo residual (Figura 14), as últimas com coloração de Golgi puntiforme perinuclear clássica (Figura 14, seta A) sem coloração pan-nuclear, versus o componente de melanoma invasivo com um padrão de coloração pan-nuclear (Figura 14, seta B). Esse padrão de diferenciação ajuda a determinar a profundidade da invasão. Coloração pan-nuclear define claramente os componentes in situ e superficialmente invasivos do melanoma (Figura 15, seta A), ao passo que, em colorações de rotina, atipia nuclear do componente precursor impede tal distinção. Há uma diferença evidente entre coloração pan-nuclear de células de melanoma versus a coloração de Golgi puntiforme de melanócitos benignos (Figura 15, seta B). A maioria dos casos de melanoma de disseminação superficial exibe coloração de Golgi extensa, mas alguns casos evidenciam preservação de coloração de Golgi puntiforme, e alguns casos não mostram coloração de
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Golgi discernível.
Melanomas de disseminação superficial também podem revelar coloração nuclear granular incompleta e coloração nucleolar (Figura 13, seta C) além de coloração pan-nuclear (Figura 13, seta A). Em algumas circunstâncias, células são destituídas de toda coloração (Figura 13, seta B). Coloração citoplasmática difusa variável também pode estar presente.
O padrão de coloração de sAC no melanoma de disseminação superficial é constante independentemente da localização anatômica. Melanoma acral de disseminação superficial demonstra coloração pan-nuclear (Figura 16, seta A), coloração de Golgi puntiforme (Figura 16, seta B) e coloração citoplasmática difusa e não exibe nenhuma semelhança com melanomas lentiginosos acrais que têm como característica expressão pan-nuclear, porém pouca expressão citoplasmática (Figuras 9-10).
Melanoma nodular
Características histológicas: Melanomas nodulares são caracterizados por um melanoma que exibe somente uma fase de crescimento vertical sem nenhuma evidência de uma fase de crescimento radial.
Padrões de coloração de sAC: Melanomas nodulares exibem coloração pan-nuclear, mas em menos células do que nos outros subtipos de melanoma. Muitas das células também exibem um padrão de coloração nucleolar proeminente. O padrão de coloração de Golgi puntiforme é tipicamente perdido, e a coloração citoplasmática é sobretudo difusa e relativamente intensa. O perfil clássico de coloração de sAC do melanoma nodular compreende coloração pan-nuclear no
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45/58 núcleo em todos os níveis, as células revelando um padrão agrupado com coloração nucleolar e coloração citoplasmática difusa, em geral não acompanhada de coloração de Golgi puntiforme. Os melanócitos lesionais, que não mostram coloração pan-nuclear, exibem coloração nucleolar proeminente e coloração nuclear granular incompleta (Figuras 17-18).
Melanoma metastático
Características histológicas: Melanoma metastático tipicamente se manifesta como melanoma dentro da derme sem continuidade dentro da epiderme. É mais caracteristicamente observado no contexto de um paciente com história passada de melanoma maligno em que a suspeita clínica é de melanoma metastático. Em casos em que essa histologia está presente mas não há história conhecida de melanoma, uma designação alternativa é a de melanoma maligno de tipo não classificado.
Padrões de coloração de sAC: Em melanomas metastáticos com uma citomorfologia fusiforme, a maioria das células exibe coloração pan-nuclear proeminente (Figura 27). Em melanomas metastáticos com uma aparência epitelioide de alto grau, coloração pan-nuclear é notada, mas está presente em uma população menor de células (Figura 28). Há ausência completa de coloração de Golgi em alguns casos. Em casos em que coloração de Golgi é observada, apenas uma minoria da população de células exibe coloração e o padrão é muito extenso, ao contrário do padrão de coloração de Golgi puntiforme pronunciado de um nevo benigno ou displásico. Coloração citoplasmática difusa intensa é muito característica de melanoma metastático e é observada na
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46/58 maioria dos casos. Coloração nucleolar geralmente não é observada.
Quando comparado o padrão de coloração de sAC de depósitos metastáticos com o de nevos capsulares benignos, as diferenças são claras, uma vez que os depósitos metastáticos têm um padrão anormal típico de melanoma, ao passo que nevócitos capsulares ou não se coram ou têm coloração de Golgi puntiforme reprodutível. A base biológica para a perda de coloração de Golgi e nucleolar no melanoma metastático não está esclarecida, mas apesar disso parece ser uma característica de melanoma metastático.
Os indicadores mais importantes de progressão de caráter benigno para maligno parecem ser a perda de coloração de Golgi puntiforme e/ou o ganho de coloração pan-nuclear. Um padrão de coloração de sAC compreendendo coloração de Golgi puntiforme em mais de 25% de melanócitos lesionais e/ou coloração pan-nuclear em 0 a 25% de melanócitos lesionais é indicativo de um diagnóstico de nevo benigno, nevo capsular benigno, nevo atípico de locais especiais ou nevo displásico. Um padrão de coloração de sAC compreendendo coloração de Golgi puntiforme em 0 a 25% de melanócitos lesionais e/ou coloração pan-nuclear em mais de 25% de melanócitos lesionais é indicativo de melanoma lentiginoso maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular ou melanoma metastático.
A invenção também fornece um kit para uso na interpretação de proliferações melanocíticas. Kits adequados para aplicações diagnósticas com base em anticorpo tipicamente incluem um, dois ou todos os três dos
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47/58 seguintes itens: (i) um ou mais anticorpos anti-sAC, (ii) um ou mais outros reagentes e materiais para discernir e/ou amplificar um padrão de coloração em uma amostra e (iii) instruções para uso do kit e/ou condução do método da invenção. Os anticorpos anti-sAC são conforme descrito aqui. Os anticorpos anti-sAC podem ser marcados ou, alternativamente, os anticorpos anti-sAC podem ser não marcados, desejavelmente com os componentes para marcação incluídos no kit em recipientes separados ou com um anticorpo secundário marcado fornecido no kit. Os outros reagentes e materiais podem ser qualquer um dos reagentes e materiais conforme descrito aqui e podem ser reagentes e materiais adequadamente acondicionados exigidos para o protocolo de imunoensaio particular, incluindo matrizes de fase sólida, se aplicáveis, e padrões.
Os exemplos a seguir ilustram ainda mais a invenção, mas não devem ser interpretados de nenhuma maneira que limite seu objetivo.
EXEMPLO 1
Este exemplo demonstra a coloração de uma amostra de tecido com anticorpo R21 contra sAC para proporcionar um padrão de coloração de sAC. Todas as etapas foram realizadas usando-se o autocolorímetro Leica Microsystems BOND-MAXTM (Bannockburn,IL).
Desparafínador: Amostras de melanócitos lesionais fixadas em formalina e embebidas em parafina foram submetidas à temperatura de 60°C por 30 minutos. As lâminas foram então tratadas com Leica Microsystems BOND DEWAX SOLUTION™ (AR9222) por 3 minutos a 72°C, seguindo-se enxágue em BOND DEWAX SOLUTION™ primeiramente a 72°C e
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48/58 então em temperatura ambiente. Finalmente, as lâminas foram enxaguadas por três vezes com álcool etílico de 200 provas (Pharmco-Aaper, Brookfield, CT, 111000200) e três vezes com Leica Microsystems BOND WASH SOLUTION™ (AR9590).
Pré-tratamento e bloqueio: Após o procedimento de desparafinação, as seções foram pré-tratadas por dois enxágues em Leica Microsystems BOND EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION 1TM (AR9961), seguindo-se pré-tratamento por BOND EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION 1TM durante 30 minutos a 100 °C e então pré-tratamento por BOND EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION 1TM durante 12 minutos em temperatura ambiente. Antes de imunocoloração, as seções foram bloqueadas usando-se o Dako DUAL ENDOGENOUS ENZYME BLOCK™ (S2003) por 5 minutos, seguindo-se três lavagens com Leica Microsystems BOND WASH SOLUTION™.
Imunocoloração: Leica Microsystems BOND WASH SOLUTIONTM foi usada como o tampão de enxágue em todas as etapas de enxágue abaixo, a menos que mencionado de outro modo. O anticorpo primário (3 mg/ml, 1:9.000) foi aplicado por 25 minutos em um Leica Microsystems PRIMARY ANTIBODY DILUENTTM tamponado (AR9352). Após essa etapa, as seções foram tratadas por uma etapa pós-primária com fosfatase alcalina (AP) por 20 minutos para sinalizar amplificação como parte do procedimento detalhado no Kit Leica Microsystems BOND POLYMER AP RED DETECTIONSTM (DS9305). O polímero de amplificação foi então adicionado por 30 minutos, seguindo-se dois enxágues em tampão de enxágue e um enxágue em água desionizada. Finalmente, o substrato vermelho misto foi aplicado por 10 minutos, seguindo-se 10 minutos adicionais com substrato vermelho misto fresco,
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49/58 três enxágues em água desionizada apenas e, por fim, montagem com lamínula.
Quando um peptídio bloqueador foi usado, o anticorpo foi pré-diluído em Leica Microsystems PRIMARY ANTIBODY DILUENTTM com peptídio bloqueador (superior a 100 vezes molar) e agitado em temperatura ambiente por toda a noite. Essas soluções pré-diluídas foram usadas para imunocoloração como descrito acima.
Cocoloração: Coloração concomitante com hamatoxilina foi usada para realçar o núcleo. A coloração foi incubada sobre a lâmina por 5 minutos, seguindo-se um enxágue em álcool a 70%, três enxágues em álcool a 100%, dois enxágues em Fisherbrand CITRASOLVTM (22-143975) e montagem com uma lamínula.
EXEMPLO 2
Este exemplo demonstra que a análise de um padrão de coloração de sAC de uma amostra de melanócitos lesionais de um indivíduo pode ser usada para proporcionar um diagnóstico de proliferações melanocíticas no indivíduo.
Amostras de melanócitos lesionais foram obtidas de 140 diferentes indivíduos e submetidas aos procedimentos descritos no Exemplo 1 para se obter ou diferenciar padrões de coloração de sAC. Os 140 padrões de coloração de sAC foram analisados e agrupados em categorias concernentes a diagnósticos diferentes de proliferações melanocíticas. Os resultados dessa análise forneceram os seguintes padrões de coloração de sAC característicos para cada um dos diagnósticos de proliferações melanocíticas.
(1) Nevo benigno e nevo capsular de linfonodos (a) Coloração de Golgi puntiforme em > 50% de
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50/58 melanócitos lesionais (b) Coloração nucleolar fraca e coloração nuclear granular incompleta em 50% de melanócitos lesionais, em média (c) Coloração pan-nuclear em < 10% de melanócitos lesionais (2) Nevo atípico de locais especiais (a) Coloração pan-nuclear na minoria de monócitos lesionais (< 10%), embora aumentada com atipia progressiva na derme apenas (b) Coloração dérmica pan-nuclear em melanócitos lesionais (c) Coloração de Golgi puntiforme em melanócitos lesionais, como em nevos benignos (3) Nevo displásico (a) Coloração de Golgi puntiforme predominante em melanócitos lesionais (> 50%); população menor de melanócitos lesionais exibe a coloração de Golgi extensa tipicamente vista em nevos displásicos de grau mais elevado (b) Coloração pan-nuclear confinada à epiderme e presente em uma minoria de melanócitos lesionais, aumentando com atipia progressiva (discreta > 10%, moderada/grave de 10 a 25%; raramente superior a 25%) (c) Nenhuma coloração pan-nuclear significativa de melanócitos lesionais na derme (4) Tumor de Spitz atípico convencional de baixo risco (a) Coloração nucleolar proeminente de melanócitos lesionais (b) Coloração de Golgi extensa de melanócitos
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51/58 lesionais (5) Tumor de Spitz atípico convencional de alto risco (a) Coloração nucleolar proeminente de melanócitos lesionais (b) Coloração pan-nuclear (minoria de melanócitos lesionais) tanto na epiderme quanto na derme (c) Coloração citoplasmática difusa de melanócitos lesionais (d) Coloração de Golgi extensa de melanócitos lesionais (6) Tumor de Spitz atípico superficial (a) Coloração pan-nuclear variável na epiderme com grande número de melanócitos lesionais corados à medida que a atipia se aproxima da extensão vista em lesões malignas; uma minoria de melanócitos lesionais exibe coloração pan-nuclear na derme (b) Coloração de Golgi extensa de melanócitos lesionais (c) Coloração nucleolar proeminente de melanócitos lesionais (7) Lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe de baixo risco (a) Coloração de Golgi puntiforme e extensa de melanócitos lesionais (b) Coloração nucleolar e nuclear granular incompleta na maioria de melanócitos lesionais (c) Coloração pan-nuclear em uma minoria de melanócitos lesionais (d) Nenhuma acentuação na coloração citoplasmática de melanócitos lesionais
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52/58 (8) Lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe de alto risco (a) Maior grau de coloração pan-nuclear de melanócitos lesionais do que em lesões semelhantes a nevo de penetração profunda limítrofe de baixo risco (b) Coloração citoplasmática difusa de melanócitos lesionais (c) Coloração de Golgi variável de melanócitos lesionais, de ausente a extensa (9) Tumor limítrofe nevoide de variante dérmica (a) Coloração de Golgi puntiforme (dominante) de melanócitos lesionais (b) Padrão menor de coloração de Golgi de melanócitos lesionais (c) Coloração pan-nuclear (minoria de melanócitos lesionais
10) Tumor limítrofe nevoide intensamente atípico exibindo características limítrofes de melanoma de disseminação superficial (a) Coloração pan-nuclear extensa entre melanócitos lesionais dentro da epiderme juntamente com coloração de Golgi extensa; um menor grau de coloração pannuclear observado entre melanócitos lesionais na derme
11) Melanoma lentiginoso maligno (a) Coloração pan-nuclear sem coloração de Golgi de melanócitos lesionais (b) Nenhuma coloração citoplasmática difusa discernível de melanócitos lesionais
12) Melanoma lentiginoso acral (a) Coloração pan-nuclear de melanócitos lesionais
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53/58
(b) Coloração de Golgi extensa de melanócitos
lesionais
(c) Nenhuma coloração citoplasmática difusa
discernível
(13) Melanoma de disseminação superficial (a) Coloração de melanócitos lesionais é sempre nuclear, variando de nucleolar/nucleolar granular incompleta a pan-nuclear (> 25% e usualmente 50 a 75%) (b) Coloração citoplasmática difusa variável de melanócitos lesionais (c) Coloração de Golgi variável de melanócitos lesionais variando de puntiforme (em média < 25%) a extensa (a maioria dos casos exibirá algum componente se não um padrão dominante de coloração extensa) (14) Melanoma nodular (a) Coloração pan-nuclear de melanócitos lesionais, embora menor que em outros subtipos de melanoma (b) Coloração citoplasmática difusa de melanócitos lesionais (c) Coloração nucleolar de melanócitos lesionais (d) Ausência de coloração de Golgi puntiforme perinuclear de melanócitos lesionais
15) Melanoma metastático (a) Coloração citoplasmática difusa intensa ou perda
completa de coloração citoplasmática de melanócitos
lesionais
(b) Nenhuma lesionais coloração nucleolar de melanócitos
(c) Nenhuma lesionais coloração de Golgi de melanócitos
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54/58 (d) Coloração pan-nuclear intensa variável de melanócitos lesionais
EXEMPLO 3
Este exemplo compara os padrões de coloração de Golgi puntiforme e pan-nuclear em nevos displásicos com os padrões de coloração de Golgi puntiforme e pan-nuclear no melanoma.
Perda de coloração de Golgi puntiforme com ganho de coloração pan-nuclear parece ser indicativa de melanoma. Na tabela a seguir (Tabela 1), perda de coloração de Golgi puntiforme (DG) é presumida quando < 25% de melanócitos totais têm esse padrão de coloração (variação para nevos de 50 a 75%; variação para melanomas de 0 a 25%). Ganho de coloração pan-nuclear (PN) é presumido quando > 25% de melanócitos totais têm esse padrão de coloração (variação para nevos de 0 a 25%; variação para melanomas de 50 a 90%). Melanomas foram comparados com um grupo combinado de todos os nevos moderadamente e intensamente displásicos, com “todos os melanomas” representando melanomas de disseminação superficial, lentiginoso acral, nodular e lentiginoso maligno e SSM representando melanomas de disseminação superficial.
Para determinar se padrões particulares de coloração estiveram presentes ou ausentes em determinado tipo de lesão mais frequentemente do que simples chance, um teste de proporção binominal foi realizado (50% de suposição sendo simples chance) com um teste t de Student de dois lados. Para determinar se houve uma diferença qualitativa no padrão de coloração entre diagnósticos, uma análise de ordem de classificação seguida de um Qui-Quadrado foi
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55/58 realizada. Para determinar se houve uma diferença quantitativa no padrão de coloração entre diagnósticos, um NPAIR1WAY com um Qui-Quadrado de Mantel-Haenszel foi realizado, e tendências foram confirmadas com uma análise 5 do Coeficiente de Correlação de Spearman.
Sensibilidade e especificidade foram determinadas para o diagnóstico de melanoma, sendo melanoma comparado com nevos displásicos moderados/intensos. Sensibilidade foi determinada calculando-se o número de diagnósticos de 10 melanoma com < 25% de células exibindo coloração de Golgi puntiforme e/ou >25% de células exibindo coloração pannuclear, dividido pelo número total de melanomas examinado. Especificamente foi determinado por cálculo o número de diagnósticos de nevos displásicos moderados/intensos com < 15 25% de células exibindo coloração de Golgi puntiforme e/ou > 25% de células exibindo coloração pan-nuclear, dividido pelo número total de nevos displásicos moderados/intensos examinados.
Padrões/Diagnósticos Sensibilidade Especificidade
DG e PN/todos os melanomas 98% (p<1.2E-10) (81) 68%
DG ou PN/todos os melanomas 81% (p<1.3E-8) (81) 94%
PN/todos os melanomas 91% (p<3.6E-13) (80) 92%
Golgi puntiforme/todos os melanomas 84% (p<2.2E-5) (81) 65%
DG e PN/SSM 94% (p<2.5E-6) (53) 75%
DG ou PN/SSM 68% (p<2.2E-6) (53) 100%
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56/58
PN/SSM 83% (p<3E-10) (52) 100%
DG/SSM 68% (p<0.006) (53) 71%
A ausência de coloração de Golgi puntiforme combinada com a presença de coloração pan-nuclear foi 98% sensível e 68% específica para o diagnóstico de melanoma (p=2.2E-10), n=81). A presença de coloração pan-nuclear foi 91% sensível e 92% específica (p=3.6E-13, n=80) para o diagnóstico de melanoma.
Uma das tarefas mais difíceis de um patologista é a distinção entre melanoma de disseminação superficial em estágio inicial e nevos moderada e intensamente displásicos. A ausência combinada de coloração de Golgi puntiforme com a presença de coloração pan-nuclear foi 94% sensível e 75% específica para o diagnóstico de melanoma de disseminação superficial (p=2.5E-6, n=53), mais do que de nevos moderada e intensamente displásicos, e, se apenas a presença de cloração pan-nuclear foi considerada, a sensibilidade foi de 83% e a especificidade foi de 100% (p=3E-10, n=52).
Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes e patentes, citadas aqui são por isto incorporadas por referência na mesma extensão como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e foram demonstradas em sua totalidade aqui.
O uso dos termos a e “um” e o e referentes similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado como abrangente tanto do singular quanto do plural, a menos que indicado de outro modo aqui
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57/58 ou claramente dito ao contrário pelo contexto. Os termos compreendendo, tendo, incluindo e contendo devem ser interpretados como termos sem restrições (isto é, significando incluindo, mas não limitado a) a menos que mencionado de outro modo. Repetição de variações de valores aqui tem por objetivo meramente servir como um método taquigráfico de referência individual para cada valor separado que se situa dentro da faixa, a menos que indicado de outro modo aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse repetido individualmente aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado de outro modo aqui ou de outro modo claramente dito ao contrário pelo contexto. O uso de quaisquer exemplos ou todos os exemplos, ou linguagem semelhante (p. ex., tal como) fornecida aqui, tem por objetivo meramente melhor elucidar a invenção e não atribuir uma limitação ao propósito da invenção a menos que reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicativa de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
Modalidades preferidas desta invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido para que os inventores conduzam a invenção. Variações dessas modalidades preferidas podem tornar-se aparentes para aqueles com experiência prática habitual que leiam a descrição precedente. Os inventores esperam que profissionais experientes empreguem tais variações de modo apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra maneira como foi especificamente
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58/58 descrita aqui. Portanto, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto sob apreciação repetidos nas reivindicações anexas conforme permitido por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos 5 elementos acima descritos em todas as suas variações possíveis é abrangida pela invenção a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente dito de outra forma pelo contexto.

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método in vitro para diagnosticar proliferação melanocítica caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) coloração da amostra com um anticorpo contra adenilciclase solúvel (sAC) para estabelecer um padrão de coloração de sAC, e (b) interpretação do padrão de coloração de sAC, em que o padrão de coloração de sAC está associado com um diagnóstico de uma proliferação melanocítica no indivíduo.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC compreende um ou mais padrões de coloração selecionados do
    grupo que consiste em: (a) coloração de Golgi punti forme, (b) coloração de Golgi granular extensa, (c) coloração citoplasmática difusa, (d) coloração nucleolar, (e) coloração nuclear granul ar incompleta, e (f) coloração pan-nuclear. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracter izado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC é indicativo de um diagnóstico selecionado do grupo que
    consiste em nevo benigno, nevo capsular benigno, nevo atípico de locais especiais, nevo displásico, tumor de Spitz atípico convencional, tumor de Spitz atípico superficial, lesão semelhante a nevo de penetração profunda limítrofe, tumor limítrofe nevoide, melanoma lentiginoso maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular e melanoma
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    2/4 metastático.
    4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC compreende: (a) coloração de Golgi puntiforme em mais de 25% de
    melanócitos lesionais e/ou (b) coloração pan-nuclear em 0-25% de melanócitos lesionais, em que o padrão de coloração de sAC é indicativo de um diagnóstico de nevo benigno, nevo capsular benigno, nevo atípico de locais especiais ou nevo displásico.
    5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC compreende:
    (a) coloração de Golgi puntiforme em 0-25% de malanócitos lesionais e/ou (b) coloração pan-nuclear em mais de 25% de melanócitos lesionais, em que o padrão de coloração de sAC é indicativo de um diagnóstico de melanoma lentiginoso maligno, melanoma lentiginoso acral, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular ou melanoma metastático.
    6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir entre uma neoplasia benigna e uma neoplasia maligna. 7. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC
    é usado para distinguir entre um diagnóstico de nevo displásico e um diagnóstico de melanoma de disseminação
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  3. 3/4 superficial.
    8. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir entre um diagnóstico de tumor de Spitz atípico superficial e um diagnóstico de melanoma de disseminação superficial.
    9. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o padrão de coloração de sAC é usado para distinguir entre um diagnóstico de nevo capsular benigno e um diagnóstico de melanoma metastático.
    10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
    11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal se liga a um epítopo compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 10. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o
    método é usado em conjunto com exame histológico convencional da amostra.
    15. Kit para diagnóstico de uma proliferação melanocítica caracterizado pelo fato de que compreende:
    Petição 870190141330, de 30/12/2019, pág. 73/77
  4. 4/4 (a) um anticorpo contra adenilciclase solúvel (sAC) e (b) material de instrução para coloração de uma amostra de melanócitos lesionais de um indivíduo para proporcionar um padrão de coloração e um diagnóstico de uma
  5. 5 proliferação melanocítica no indivíduo mediante interpretação do padrão de coloração de sAC da amostra.
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