BR112012021070B1 - Método para produzir cadaverina - Google Patents

Abstract

método para produzir cadaverina a presente invenção refere-se a um processo para produzir cadaverina, caracterizado pelo cultivo de um microrganismo que tem a capacidade de secretar lisina descarboxilase fora de células do mesmo. de acordo com o processo, a subprodução de lisina pode ser evitada, o rendimento de cadaverina em consumo de glicose é aperfeiçoado em comparação com aqueles em processos convencionais e a carga em uma etapa de purificação para purificação de cadaverina como uma matéria prima de poliamida pode ser reduzida.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR CADAVERINA”

Campo da Técnica [001] A presente invenção refere-se a um método para produzir cadaverina. A presente invenção refere-se especialmente a um método para produzir cadaverina de modo eficaz por permitir produção secretora de lisina descarboxilase por um microrganismo.

Técnica Antecedente [002] Poliamida (PA) é um grupo de importantes polímeros que são usados como matérias primas para uma série de plásticos especiais a serem usados na indústria de automóveis, indústria esportiva e indústria de estilo de vida, e diaminas são importantes componentes monômeros de matéria prima para as poliamidas. Diaminas são condensadas com ácidos dicarboxílicos para formar vários polímeros, e as propriedades dos polímeros variam a depender dos comprimentos de cadeia das diaminas e dos ácidos dicarboxílicos.

[003] Convencionalmente, diaminas são quimicamente produzidas a partir de materiais derivados de petróleo por meio de ácidos dicarboxílicos em um estágio intermediário, ou produzidas por reação de descarboxilação química de aminoácidos (Documento de Não Patente 1). Considerando o aumento brusco nos preços do óleo, os métodos de síntese de diaminas são preferencialmente trocados para métodos com base em processos biotecnológicos tais como reações enzimáticas e cultura de microrganismo, em que recursos renováveis são utilizados.

[004] Em vista disso, interesse recente tem focalizado na cadaverina como uma diamina que pode ser produzida por processos biotecnológicos. Cadaverina é chamada, ainda, de 1,5-pentanediamina, e é um composto que pode ser um monômero de matéria prima para poliamida. Cadaverina é uma amina biogênica que existe de modo onipresente no corpo

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2/41 vivo e seu sistema biossintético está sendo elucidado (consulte o Documento de Não Patente 2). Em uma parte da sua via metabólica biossintética, sabe-se que a lisina descarboxilase (LDC) que catalisa descarboxilização de lisina em cadaverina é envolvida. Como um gene LDC, o gene LDC derivado de E. coli (Escherichia coli) é conhecido (consulte o Documento de Não Patente 3).

[005] Os métodos biotecnológicos convencionais para produção de cadaverina são com base na introdução de um gene LDC em um microrganismo, e podem ser aproximadamente classificados como métodos de produção por reação enzimática por meio do uso de lisina como um substrato e métodos para produção de cadaverina por cultura de microrganismo. Adicionalmente, exemplos conhecidos dos métodos para produção de cadaverina por cultura de microrganismo incluem um método para produzir através do cultivo de E. coli recombinante (consulte o Documento de Patente 1), um método em que a capacidade de uma bactéria corineforme, que é um microrganismo produtor de lisina, para produzir lisina é aperfeiçoado adicionalmente (consulte o Documento de Patente 2), um método em que o sistema de degradação de cadaverina é bloqueado (consulte o Documento de Patente 3) e um método em que o transportador de lisina é bloqueado (consulte o Documento de Patente 4). Entretanto, há muitos problemas a serem solucionados, especialmente nos métodos para produção de cadaverina por cultura de microrganismo, e exemplos de tais problemas incluem subprodução de lisina em casos de cultura de um microrganismo preparado pela introdução de um gene LDC a uma bactéria corineforme, que é um microrganismo produtor de lisina (consulte o Documento de Não Patente 4). Subprodução de lisina impede o aperfeiçoamento do rendimento de cadaverina mesmo com produção bem sucedida de seu precursor. Adicionalmente, visto que a cadaverina precisa ser altamente purificada a fim de ser usada como uma matéria prima para poliamida, subprodução de lisina aumenta a carga na

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3/41 purificação de cadaverina, o que tem sido economicamente problemático.

Documentos de Técnica Anterior [Documentos de Patente]

Documento de Patente 1: JP 2002-223770 A

Documento de Patente 2: JP 2004-222569 A

Documento de Patente 3: Pedido de Patente PCT Traduzido e aberto à inspeção pública N^o JP 2009-531042

Documento de Patente 4: WO2008/092720 [Documentos de Não Patente]

Documento de Não Patente 1: Suyama e Kaneo. Yakugaku Zasshi (1965), Volume 85, páginas 513 a 533.

Documento de Não Patente 2: Celia White Tabor e um colaborador. Microbiological Reviews (1985), Volume 49, páginas 81 a 99.

Documento de Não Patente 3: Shi-Yuan Meng e um colaborador. Journal of Bacteriology (1992), Volume 174, páginas 2.659 a 2.669.

Documento de Não Patente 4: Takashi Mimitsuka e quatro colaboradores. Bioscience, Biotechnology, e Biochemistry (2007), Volume 71, páginas 2.130 a 2.135.

Descrição Resumida da Invenção

Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção [006] A presente invenção visa fornecer um método para produzir cadaverina através do cultivo de um microrganismo, cujo método não permite que lisina como precursor de cadaverina permaneça no líquido de cultura do microrganismo mediante a conclusão da cultura do microrganismo.

Meios para Solucionar os Problemas [007] Os presentes inventores estudaram intensamente um método em que a lisina não permanece no líquido de cultura mediante a conclusão da cultura de um microrganismo, e, como resultado, revelaram que,

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4/41 através do cultivo de um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase, a permanência de lisina no líquido de cultura mediante conclusão da cultura de um microrganismo pode ser evitado, completando, desse modo, a presente invenção. Ou seja, a presente invenção é constituída por (1) a (6) abaixo.

[008] (1) Um método para produzir cadaverina, sendo que o método compreende cultivar um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase.

[009] (2) O método para produzir cadaverina de acordo com (1), em que lisina é adicionada a um meio para cultivar o microrganismo.

[010] (3) O método para produzir cadaverina de acordo com (1) ou (2), em que o microrganismo expressa de maneira intracelular uma proteína que compreende lisina descarboxilase que tem um peptídeo sinal secretor fixado à porção N-terminal da sequência de aminoácidos do mesmo, e cuja lisina descarboxilase é secretada pelo mesmo de modo extracelular.

[011] (4) O método para produzir cadaverina de acordo com (3), em que o microrganismo tem uma construção gênica que compreende, na direção de 5' a 3' da sequência de ácido nucleico, uma sequência promotora que funciona no microrganismo, uma sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo sinal secretor e uma sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase, cuja construção gênica permite expressão intracelular da proteína que compreende lisina descarboxilase que tem um peptídeo sinal secretor fixado à porção N-terminal da sequência de aminoácidos do mesmo.

[012] (5) O método para produzir cadaverina de acordo com (3) ou (4), em que o peptídeo sinal secretor é um peptídeo representado pela sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 13 a 43.

[013] (6) O método para produzir cadaverina de acordo com

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5/41 qualquer um de (1) a (5), em que a lisina descarboxilase é derivada de E. coli.

[014] (7) O método para produzir cadaverina de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o dito microrganismo é uma bactéria corineforme ou E. coli.

Efeito da Invenção [015] De acordo com a presente invenção, no método para produzir cadaverina através do cultivo de um microrganismo, lisina não permanece no líquido de cultura mediante conclusão da cultura do microrganismo, de modo que o rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose é aperfeiçoado em comparação a métodos de produção e, adicionalmente, a carga na etapa de purificação na purificação de cadaverina como uma matéria prima para poliamida pode ser reduzida.

Melhor Modo para Realizar a Invenção [016] O método da presente invenção é um método para produzir cadaverina através do cultivo de um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase. Na presente descrição, secreção extracelular de lisina descarboxilase significa que lisina descarboxilase é transportada para o exterior do microrganismo (exterior da célula) e finalmente colocado em estado completamente livre no meio ou líquido de cultura. Casos em que uma parte de lisina descarboxilase existe no exterior da célula e casos em que lisina descarboxilase é ligada à superfície do microrganismo não são incluídos em “secreção” na presente descrição.

[017] Não se conhece nenhum microrganismo, até agora, que secrete de modo extracelular lisina descarboxilase, mas é possível permitir que um microrganismo desejado secrete de modo extracelular lisina descarboxilase por meio do uso da técnica de engenharia genética. Mais particularmente, secreção extracelular de lisina descarboxilase pode ser alcançada por um método que permite expressão intracelular de uma proteína que compreende

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6/41 lisina descarboxilase que tem um peptídeo sinal secretor fixado à porção Nterminal da sequência de aminoácidos do mesmo.

[018] A lisina descarboxilase usada na presente invenção não é restrita, e é preferencialmente L-lisina descarboxilase. A origem da lisina descarboxilase também não é restrita, e exemplos preferidos da lisina descarboxilase incluem aqueles derivados de Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Selenomonas ruminamtium, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces pilosus, Eikenella corrodens, Eubacterium acidaminophilum, Salmonella typhimurium, Hafnia alvei, Neisseria meningitidis, Thermoplasma acidophilum e Pyrococcus abyssi. A lisina descarboxilase é mais preferencialmente aquele derivada de E. coli, cuja segurança tem sido confirmada. As sequências de aminoácidos dessas lisinas descarboxilases são registradas em uma base de dados (GenBank).

[019] Um peptídeo sinal secretor foi originalmente revelado como uma sequência de peptídeo sinal que funciona para permitir secreção extracelular de uma proteína secretora. Uma proteína secretora é geralmente traduzida como um pré-peptídeo ou pré-propeptídeo e então torna-se uma proteína madura. Sabe-se que, após a tradução da proteína como um prépeptídeo ou pré-propeptídeo, um peptídeo sinal secretor (“pré-porção”) é clivado por uma protease (comumente chamada peptidase de sinal) para converter o peptídeo a um propeptídeo ou peptídeo maduro, cujo propeptídeo passa adicionalmente por clivagem da pró-porção por uma protease para se tornar um peptídeo maduro, seguida de secreção extracelular. Sabe-se que um peptídeo sinal secretor tem uma função para permitir não apenas secreção extracelular de uma proteína secretora, mas também secreção extracelular de uma proteína não secretora em casos em que a proteína não secretora é fundida com o peptídeo sinal secretor. Na presente invenção, através da fusão de lisina descarboxilase com um peptídeo sinal secretor, é possível fazer com que a lisina

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7/41 descarboxilase seja eficazmente secretada de modo extracelular.

[020] O peptídeo sinal secretor usado na presente invenção pode ser derivado de um microrganismo diferente ou do microrganismo a ser usado, e o peptídeo sinal secretor é preferencialmente derivado do microrganismo a ser usado. Adicionalmente, o peptídeo sinal secretor que pode ser usado para o propósito da presente invenção pode compreender uma parte da sequência de aminoácidos N-terminais da proteína madura que ocorre naturalmente a partir da qual o peptídeo foi derivado. Exemplos concretos do peptídeo sinal secretor incluem:

peptídeos de sinal secretor tais como TorA (N-óxido de trimetilamina redutase) e SufI (Supressor de ftsI; supressor de ftsI) derivados de E. coli; PhoD (fosfoesterase) e LipA (lipase) derivados de Bacillus subtilis; e isomaltodextranase (IMD) derivado de Arthrobacter globiformis (consulte a SEQ ID NOs:13 a 17, respectivamente);

o peptídeo sinal secretor descrito no documento JP 3711658 B (consulte a SEQ ID NO:18);

CgR0079, CgR0120, CgR0124, CgR0900, CgR0949, CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2677, CgR2926, CgR0040, CgR0789, CgR0865,

CgR1522, CgR1819, CgR2213, CgR2386 e CgR2535, que são peptídeos de sinal secretor derivados de Corynebacterium glutamicum R descrito em Microbiology (2009), 155, páginas 741 a 750 (consulte a SEQ ID NOs:19 a 36, respectivamente);

o peptídeo sinal secretor descrito no documento JP 9-316095 A (consulte a SEQ ID NO:37);

o peptídeo sinal para arpE, que é o sinal secretor para subtilisina, descrito em Applied and Enviromental Microbiology (1995), 61(4), páginas 1.610 a 1.613 (consulte a SEQ ID NO:38);

o peptídeo sinal secretor descrito em Applied and Enviromental

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Microbiology (2003), 69(1), páginas 358 a 366 (consulte a SEQ ID NO:39); e os peptídeos de sinal secretor descritos em Trends in Microbiology (2005), 13(4), páginas 175 a 180 (consulte a SEQ ID NOs:40 a 43).

[021] Exemplos da lisina descarboxilase e do peptídeo sinal secretor incluem, ainda, proteínas que têm as mesmas sequências de aminoácidos conforme aquelas descritas acima exceto que um ou diversos aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, contanto que suas funções sejam mantidas. O termo “diversos” no presente documento normalmente significa cerca de 1 a 7, preferencialmente cerca de 1 a 5, especialmente de preferência cerca de 1 a 2. Cada uma da lisina descarboxilase e do peptídeo sinal secretor pode ser uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de normalmente não menos que 85%, preferencialmente não menos que 90%, mais preferencialmente não menos que 95% para a sequência de aminoácidos original, contanto que suas funções sejam mantidas.

[022] A(s) substituição(ões), deleção(ões), inserção(ões) e/ou adição(ões) na sequência de aminoácidos descritas acima é/são preferencialmente uma(s) substituição(ões) conservadora(s). Exemplos de substituição conservadora do aminoácido original por outro aminoácido incluem substituição de Ala por Ser ou Thr; substituição de Arg por Gln, His ou Lys; substituição de Asn por Glu, Gln, Lys, His ou Asp; substituição de Asp por Asn, Glu ou Gln; substituição de Cys por Ser ou Ala; substituição de Gln por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg; substituição de Glu por Asn, Gln, Lys ou Asp; substituição de Gly por Pro; substituição de His por Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr; substituição de Ile por Leu, Met, Val ou Phe; substituição de Leu por Ile, Met, Val ou Phe; substituição de Lys por Asn, Glu, Gln, His ou Arg; substituição de Met por Ile, Leu, Val ou Phe; substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu;

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9/41 substituição de Ser por Thr ou Ala; substituição de Thr por Ser ou Ala; substituição de Trp por Phe ou Tyr; substituição de Tyr por His, Phe ou Trp; e substituição de Val por Met, Ile ou Leu.

[023] Exemplos do método para permitir que, por recombinação genética, um microrganismo expresse de maneira intracelular uma proteína que compreende lisina descarboxilase que tem um peptídeo sinal secretor fixado à porção N-terminal da sequência de aminoácidos do mesmo incluem um método em que uma construção gênica que compreende, na direção de 5' a 3' da sequência de ácido nucleico, uma sequência promotora que funciona no microrganismo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e uma sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase é introduzida a um microrganismo.

[024] O promotor usado na presente invenção não é restrito, e qualquer sequência promotora pode ser geralmente usada contanto que funcione no microrganismo empregado . Adicionalmente, o promotor pode ser um derivado de uma espécie diferente. Exemplos preferidos do promotor incluem:

promotores envolvidos em vários sistemas biossintéticos de aminoácido, tais como os promotores do gene de glutamato desidrogenase envolvidos no sistema biossintético de ácido glutâmico; gene de glutamina sintetase envolvido no sistema biossintético glutamínico; gene de asparto quinase envolvido no sistema biossintético de lisina; gene de homosserina desidrogenase envolvido no sistema biossintético de treonina; gene de ácido acetohidróxi sintetase envolvido nos sistemas biossintéticos de isoleucina e valina; gene de ácido málico de 2-isopropila sintetase envolvido no sistema biossintético de leucina; gene de glutamato quinase envolvidos nos sistemas biossintéticos de prolina e arginina; gene de fosforibosl-ATP pirofosforilase envolvido no sistema biossintético de histidina; e gene de desóxi arabino

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10/41 heptulosonato fosfato (DAHP) sintase envolvido nos sistemas biossintéticos de aminoácidos aromáticos tais como triptofano, tirosina e fenilalanina;

promotores envolvidos nos sistemas biossintéticos de ácidos nucleicos tais como ácido inosínico e ácido guanílico, incluindo os promotores para o gene de fosforribosil pirofosfato amidotransferase (PRPP), gene de ácido inosínico desidrogenase e gene de ácido guanílico sintetase; e promotores resistentes tais como o promotor tac.

[025] As sequências desses promotores são registrada na base de dados (GenBank).

[026] A sequência de ácido nucleico que codifica o peptídeo sinal secretor usado na presente invenção não é restrita contanto que a sequência possa ser traduzida no peptídeo sinal secretor descrito acima. A sequência de ácido nucleico pode ser determinada em referência aos códons (códigos genéticos padrões) para a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal secretor (consulte Horton. Biochemistry, 3^a Edição, Tokyo Kagaku Dojin, página 526), e, nesse processo, a sequência de ácido nucleico pode ser reprojetada com códons frequentemente usados no microrganismo usado na presente invenção. Exemplos concretos da sequência de ácido nucleico incluem:

sequências de ácido nucleico que codificam peptídeos de sinal secretor tais como TorA (N-óxido de trimetilamina redutase) e SufI (Supressor de ftsI; supressor de ftsI) derivadas de E. coli; PhoD (fosfoesterase) e LipA (lipase) derivadas de Bacillus subtilis; e isomaltodextranase (IMD) derivada de Arthrobacter globiformis (consulte a SEQ ID NOs:44 a 48, respectivamente);

sequências de ácido nucleico que codificam o peptídeo sinal secretor descrito no documento JP 3711658 B (consulte a SEQ ID NO:49);

sequências de ácido nucleico que codificam CgR0079, CgR0120, CgR0124, CgR0900, CgR0949, CgR1023, CgR1448, CgR2137, CgR2677,

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CgR2926, CgR0040, CgR0789, CgR0865, CgR1522, CgR1819, CgR2213,

CgR2386 e CgR2535, que são os peptídeos de sinal secretor derivados de Corynebacterium glutamicum R descritos em Microbiology (2009), 155, páginas 741 a 750 (consulte a SEQ ID NOs:50 a 67, respectivamente);

sequências de ácido nucleico que codificam o peptídeo sinal secretor descrito no documento JP 9-316095 A (consulte a SEQ ID NO:68);

sequências de ácido nucleico que codificam o peptídeo sinal secretor descrito em Applied and Enviromental Microbiology (1995), 61(4), páginas 1.610 a 1.613 (consulte a SEQ ID NO:69);

sequências de ácido nucleico que codificam o peptídeo sinal secretor descrito em Applied and Enviromental Microbiology (2003), 69(1), páginas 358 a 366 (consulte SEQ ID NO:70); e sequências de ácido nucleico que codificam os peptídeos de sinal secretor descritos em Trends in Microbiology (2005), 13(4), páginas 175 a 180 (consulte a SEQ ID NOs:71 a 74).

[027] Exemplos concretos da sequência de ácido nucleico que codifica a lisina descarboxilase usada na presente invenção incluem sequências de ácido nucleico que codificam as lisina descarboxilases derivadas dos organismos acima descritos, cujas sequências de ácido nucleico podem ser reprojetadas considerando-se a utilização de códon do microrganismo usado. As sequências de ácido nucleico que codificam as lisina descarboxilases derivadas dos organismos descritos acima são registradas na base de dados (GenBank).

[028] Exemplos da sequência promotora, da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e da sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase incluem, ainda, sequências de ácido nucleico que são iguais às suas sequências respectivas exceto que um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados, contanto

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12/41 que suas funções sejam mantidas. O termo “diversos” no presente documento significa normalmente cerca de 1 a 40, preferencialmente cerca de 1 a 30, mais preferencialmente cerca de 1 a 20, especialmente de preferência cerca de 1 a 10, mais preferencialmente cerca de 1 a 5. Adicionalmente, exemplos da sequência promotora, da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e da sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase incluem sequências de ácido nucleico que se hibridizam completa ou parcialmente com aquelas sequências de ácido nucleico ou com as fitas complementares das mesmas sob condições rigorosas, contanto que suas funções sejam mantidas. O termo “polinucleotídeo que se hibridiza sob condições rigorosas” no presente documento significa uma sequência de ácido nucleico que se hibridiza com uma(s) sonda(s) que tem uma ou mais sequências de ácido nucleico sendo que cada uma tem pelo menos 20, preferencialmente 25, mais preferencialmente pelo menos 30 sequências contínuas arbitrariamente selecionadas da sequência de base original, usando uma técnica de hibridização conhecida (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausbel et al., (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4) ou similares são aplicados. As condições rigorosas no presente documento podem ser alcançadas, por exemplo, através da execução de hibridização na presença de formamida a 50% a uma temperatura de 37 °C, a 42 °C para condições mais rigorosas, ou a 65 °C para condições ainda mais rigorosas, seguida de lavagem com solução de SSC 0,1* a 2* (composição de solução de SSC *1: cloreto de sódio de 150 mM, citrato de sódio de 15 mM). Cada uma dentre a sequência promotora, a sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e a sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase pode ser uma sequência de ácido nucleico que tem uma identidade de sequência de normalmente não menos que 85%, preferencialmente não menos que 90%, mais preferencialmente não menos

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13/41 que 95% para a sequência original. Cada uma dentre essas sequência promotora, sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase pode ser obtida de um organismo que não o hospedeiro original ou submetendo-se uma sequência de ácido nucleico obtida do hospedeiro original a mutagênese in vitro ou mutagênese sítio-dirigida, que são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[029] Além da sequência promotora, da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal secretor e da sequência de ácido nucleico que codifica lisina descarboxilase, a construção gênica usada na presente invenção pode ter uma(s) sequência(s) regulatória(s) (operador, terminador e/ou similares) necessária(s) para expressão da lisina descarboxilase na célula do microrganismo em uma(s) posição(ões) apropriada(s) em que a mesma(s) possa funcionar. O vetor que pode ser usado para essa construção não é restrito contanto que o vetor possa funcionar no microrganismo, e o vetor pode ser um que replique de modo autônomo e extracromossômico tal como um plasmídeo, ou pode ser um que é incorporado no cromossomo bacteriano. Adicionalmente, um transpóson artificial ou similares também pode ser usado. Em casos em que um transpóson é usado, o gene de interesse é introduzido ao cromossomo por meio de recombinação homóloga ou por meio da habilidade de transposição do próprio transpóson. Construção e confirmação da construção gênica são realizadas de acordo com técnicas biológicas moleculares bem conhecidas por aqueles versados na técnica, e é possível se referir a, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glovered. 1985); F. M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology (1994) John Wiley & Sons, Inc.; e PCR

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Technology: Principles e Application for DNA Amplication, H. Erlich, ed., Stockton Press.

[030] O método de introdução da construção gênica ao microrganismo não é restrito, e a construção gênica pode ser introduzida pelo método de protoplasto (Gene, (1985), 39, páginas 281 a 286), método de eletroporação (Bio/Technology, (1989), 7, 1067-1070) ou similares.

[031] Na presente invenção, o microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase é preferencialmente um microrganismo para o qual a construção gênica pode ser introduzida por meio de recombinação genética, e exemplos concretos do microrganismo incluem E. coli (Escherichia coli), Bacillus subtilis, fungo, levedura e bactérias corineformes. Entre esses, E. coli e bactéria corineforme, que são conhecidas por produzir de modo eficaz lisina, um precursor de cadaverina, são mais preferidas.

[032] Exemplos concretos de E. coli que pode ser usada incluem a cepa MC1061, cepa HB101, cepa JM105, cepa JM109, cepa DH5a e cepa JE5505.

[033] Bactérias corineformes são bacilos gram-positivos aeróbicos, e incluem, ainda, bactérias que tinham sido anteriormente classificadas no gênero Brevibacterium mas têm sido agora integradas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst., Bacteriol., (1981) 41, página 225). Bactérias corineformes incluem, ainda, as bactérias que pertencem ao gênero Brevibacterium, que é muito próximo ao gênero Corynebacterium. Exemplos de tais bactérias corineformes incluem Corynebacterium acetoacidophylum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium alkanolyticum,

Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium mellassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium herculis, Brevivacterium

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15/41 divaricatum, Brevivacterium flavum, Brevivacterium immariophilum,

Brevivacterium lactofermentum, Brevivacterium roseum, Brevivacterium saccharolyticum, Brevivacterium thiogenitalis, Corynebacterium ammoniagenes, Brevivacterium album, Brevivacterium cerinum e Microbacterium ammoniaphilum.

[034] Exemplos concretos de cepas das respectivas bactérias corineformes incluem Corynebacterium acetoacidophylum ATCC13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511, Corynebacterium callunae ATCC15991, Corynebacterium glutamicum ATCC13020, ATCC13020 e ATCC13060,

Corynebacterium lilium ATCC15990, Corynebacterium mellassecola ATCC17965, Corynebacterium efficiens AJ12340 (adesão No FERM BP-1539), Corynebacterium herculis ATCC13868, Brevivacterium divaricatum ATCC14020, Brevivacterium flavum ATCC13826, ATCC14067 e AJ12418 (adesão N^o FERM BP-2205), Brevivacterium immariophilum ATCC14068, Brevivacterium lactofermentum ATCC13869, Brevivacterium roseum ATCC13825, Brevivacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevivacterium thiogenitalis ATCC19240, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871 e ATCC6872, Brevivacterium album ATCC15111, Brevivacterium cerinum ATCC15112 e Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354.

[035] As bactérias corineformes acima são disponíveis pela, por exemplo, American Type Culture Collection. Ou seja, um número de adesão correspondente é dado a cada cepa e descrito no catálogo da American Type Culture Collection, e cada cepa pode ser obtida por meio da referência a esse número.

[036] Na presente invenção, Corynebacterium glutamicum é preferencialmente usada entre as bactérias corineformes descritas acima. Corynebacterium glutamicum AJ12036 (adesão N^o FERM BP-734)

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16/41 (originalmente depositada com International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science e Technology em 26 de março de 1984), que foi separada como uma cepa mutante resistente a estreptomicina de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, supostamente tem uma mutação em um gene funcional envolvido na secreção de proteínas, e sua habilidade de produção secretora de proteínas estrangeira é bastante alta e cerca de 2 a 3 vezes mais alta que aquela da cepa parental (cepa de tipo selvagem) em termos de acumulação das proteínas sob as condições de cultura ótimas. Portanto, Corynebacterium glutamicum AJ12036 é adequada como a bactéria corineforme a ser feita para secretar lisina descarboxilase (consulte o documento WO 02/081694).

[037] Secreção extracelular de lisina descarboxilase pelo microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase pode ser confirmada através do cultivo do microrganismo e submetendo-se a cultura resultante à centrifugação para separar o microrganismo do sobrenadante de cultura, seguida da medição da atividade de lisina descarboxilase no sobrenadante de cultura obtido para confirmar a presença/ausência de lisina descarboxilase no presente documento. Adicionalmente, a quantidade de lisina descarboxilase no exterior das células pode ser quantificada por uma análise que utiliza reação de antígeno/anticorpo, tal como Western blotting ou ELISA.

[038] Por meio do cultivo de um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase, cadaverina pode ser produzida/acumulada em um meio de cultura.

[039] Exemplos do método de cultura que pode ser usado incluem cultura por batelada, cultura por batelada alimentada e cultura contínua. Em casos de cultura contínua, cultura contínua descrita no documento JP 2008-104453 A ou similares é preferencialmente realizada.

[040] Como um meio de cultura, um meio de nutriente normal

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17/41 que compreende uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, um sal inorgânico e/ou similares pode ser usado. Exemplos da fonte de carbono que pode ser usada incluem sacarídeo tais como hidrolisados de amido, glicose, frutose, sacarose e maltose; álcoois tais como etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido lático e ácido succínico. Exemplos da fonte de nitrogênio de que pode ser usada incluem amônio; sais de amônio orgânicos e inorgânicos tais como cloreto de amônio, sulfato de amônio, carbonato de amônio e acetato de amônio; compostos orgânicos que contêm nitrogênio tais como ureia; e substâncias orgânicas que contém nitrogênio tais como extratos de carne, extratos de levedura, hidrolisados de soja e milhocina. Exemplos do sal inorgânico que pode ser usado incluem fosfato de diidrogênio de potássio, fosfato de hidrogênio de dipotássio, sulfato de amônio, cloreto de sódio, sulfato de magnésio e carbonato de cálcio. Adicionalmente, conforme requerido, micronutrientes tais como biotina, tiamina, vitamina B6 e similares podem ser adicionados. Extratos de carne, extratos de levedura, milhocina, casaminoácidos e similares podem ser usados como alternativas a esses micronutrientes.

[041] Em uma realização preferida da presente invenção, lisina pode ser adicionada de modo preliminar ao meio de cultura. Em casos em que a lisina é adicionada de modo preliminar ao meio de cultura, a lisina adicionada de modo preliminar é usada como um substrato e convertida a cadaverina no meio de cultura por lisina descarboxilase secretada de modo extracelular, de modo que a eficácia de produção de cadaverina seja intensificada. Nos casos em que lisina é adicionada de modo preliminar ao meio de cultura, a concentração de lisina no meio de cultura não é restrita, e a concentração de lisina é preferencialmente uma na qual o crescimento do microrganismo não é afetado de modo adverso e a lisina descarboxilase não é inibida. Mais concretamente, a concentração é preferencialmente de 0,01 a 2 M.

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18/41 [042] A lisina a ser adicionada é preferencialmente L-lisina. A lisina a ser adicionada pode estar na forma livre ou pode ser um sal de lisina, e o sal de lisina é preferencialmente hidrocloreto de lisina ou um dicarboxilato de lisina derivado do ácido dicarboxílico descrito posteriormente. Exemplos concretos preferidos de lisina dicarboxilato incluem adipato de lisina, sebacato de lisina, 1,12-dodecanedicarboxilato de lisina, succinato de lisina, isoftalato de lisina e tereftalato de lisina, e exemplos concretos mais preferidos de dicarboxilato de lisina incluem adipato de lisina.

[043] As condições de cultura não são restritas, e a cultura é realizada sob condições aeróbicas, por exemplo, com vibração ou através de cultura por agitação de aeração profunda. A temperatura de cultura é geralmente de 25 °C a 42 °C, preferencialmente de 28 °C a 38 °C. O período de cultura é normalmente de 1 dia a 6 dias.

[044] Para ajustar o pH de cultura, amônia, ácido clorídrico ou ácido dicarboxílico é preferencialmente usado, e ácido dicarboxílico é mais preferencialmente usado. É preferido usar o neutralizador para controlar o pH de cultura para 5 a 8, mais preferencialmente 6,5 a 7,5. O estado do neutralizador não é restrito, e o neutralizador pode ser usado como uma solução gasosa, líquida, sólida ou aquosa. O neutralizador é especialmente de preferência uma solução aquosa.

[045] O ácido dicarboxílico a ser preferencialmente usado como o neutralizador não é restrito, e o ácido dicarboxílico é preferencialmente um ácido dicarboxílico que substancialmente não tem grupo funcional além dos dois grupos carboxílicos descritos acima. O grupo funcional no presente documento significa um grupo reativo que reage, durante a reação de polimerização de poliamida (sob condições de reação em que, por exemplo, a temperatura de reação é de 250 a 270 °C, a pressão é de 10 a 20 kg/cm², e o tempo de reação é de 1 a 5 hora(s)), com um grupo amina ou grupo carboxila

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19/41 para causar ramificação do polímero ou redução do grau de cristalinidade do polímero (para um grau de cristalinidade de não mais que 80%). Exemplos do grupo funcional incluem o grupo amina e o grupo carboxila, e outros exemplos do grupo funcional incluem grupos ácidos (por exemplo, o grupo ácido sulfônico, grupo fosfato e grupo hidroxila fenólica), grupos básicos (por exemplo, o grupo hidrazino), grupos polares protônicos (por exemplo, o grupo hidroxila), grupos cliváveis (por exemplo, o grupo epóxi e grupo peróxido) e outros grupos altamente reativos (por exemplo, grupo isocianato). Por outro lado, substituintes halogênicos, substituintes aromáticos, grupos éteres, grupos ésteres, grupos amidas e similares não são incluídos no grupo funcional na presente descrição visto que a reatividade dos mesmos é baixa.

[046] O ácido dicarboxílico é mais preferencialmente um ácido dicarboxílico representado pela Fórmula Geral (1), (2) ou (3) abaixo.

HOOC-(CH₂)m-COOH (1) (em que na Fórmula Geral (1), m = 0 a 16).

coou j (CMt)n

(CHí)o

COOH (em que na Fórmula Geral (2), n, o = 0 a 16).

(em que na Fórmula Geral (3), p, q = 0 a 16).

[047] O ácido dicarboxílico é ainda mais preferencialmente ácido adípico, ácido sebácico, ácido 1,12-dodecanodicarboxílico, ácido succínico, ácido isoftálico ou ácido tereftálico.

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20/41 [048] Cadaverina no meio de cultura existe no estado livre ou como um sal de cadaverina. No método para coleta de cadaverina no meio de cultura, o microrganismo é primeiramente removido do meio de cultura. Como o método de separação, um método convencionalmente conhecido tal como remoção de um microrganismo por precipitação, centrifugação, separação de filtragem de membrana ou similares é preferencialmente usado.

[049] Para coletar cadaverina do meio de cultura do qual o microrganismo foi removido e o qual contém cadaverina, dicarboxilato de cadaverina pode ser coletado por cristalização conforme descrito no documento JP 2009-207495 A. Alternativamente, cadaverina na forma livre pode ser purificada e coletada por meio do uso de uma membrana NF conforme descrito no documento JP 2009-29872 A. Alternativamente, cadaverina na forma livre pode ser coletada por extração com um solvente orgânico polar seguida por destilação conforme descrito no documento JP 2009-28045.

Exemplos [050] A presente invenção será agora descrita abaixo em detalhes a título de Exemplos e Exemplos de Referência. Salvo especificação em contrário, todos os meios, meios de ágar e meios de cultura usados nos Exemplos e Exemplos Comparativos foram usados após esterilização por uma operação de esterilização normal (por exemplo, através de autoclavagem a 121 °C por 30 minutos ou esterilização por filtragem através de um filtro de 0,45 pm).

(Método de Análise de Concentrações de Cadaverina e Lisina por HPLC)

Coluna usada: CAPCELL PAK C18 (Shiseido)

Fase Móvel: solução de fosfato aquosa a 0,1% (p/p):acetonitrila = 4,5:5,5

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Detecção: UV 360 nm [051] Pré-tratamento de amostra: Para 0,025 mL (25 pL) da amostra a ser analisada, 0,025 mL (25 pL) de 1,4-diaminobutano (0,03 M), 0,15 mL (150 pL) de carbonato de hidrogênio de sódio (0,075 M) e uma solução de 2,4dinitrofluorobenzeno (0,2 M) em etanol foram adicionados, e a mistura resultante foi misturada, seguida de incubação a 37 °C por 1 hora. Uma alíquota de 0,05 mL (50 pL) da solução de reação acima foi dissolvida em 1 mL de acetonitrila, e a solução resultante foi centrifugada a 10.000 rpm por 5 minutos, seguida da submissão a análise HPLC de 0,01 mL (10 pL) do sobrenadante.

Exemplo de Referência 1 (Preparação de Corynebacterium glutamicum Que Tem A Capacidade De Produzir Lisina) [052] A fim de preparar Corynebacterium glutamicum que tenha a capacidade de sintetizar lisina como um precursor de cadaverina, uma bactéria produtora de lisina foi preparada através da introdução de uma mutação eficaz a asparto quinase. Pelo método descrito em Appl. Microbiol. Biotechnol., (2002), 58, páginas 217 a 223, a cepa Corynebacterium glutamicum AK-1 (a seguir referida como a cepa AK-1) foi preparada. Visto que, nessa cepa bacteriana, inibição de retroalimentação de asparto quinase por lisina e treonina é aliviada, lisina pode ser sintetizada por cultura.

[053] Depois disso, a cepa AK-1 foi submetida a recombinação genética adicional para preparar bactérias corineformes que secretam de modo extracelular lisina descarboxilase (Exemplos 1 e 2) e uma bactéria corineforme que não secreta de modo extracelular lisina descarboxilase (Exemplo Comparativo 1).

Exemplo 1 (Preparação de Corynebacterium glutamicum Que Secreta De Modo Extracelular Lisina Descarboxilase) (Parte 1: Uso de Via Metabólica de Tat) (1) Clonagem de Gene HOM [054] Homosserina desidrogenase foi selecionada como o locus ao qual o gene de lisina descarboxilase deveria ser introduzido. O gene

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22/41 correspondente à região de 300 aminoácidos do N-terminal do gene HOM foi clonado. Em referência à sequência de base do gene HOM (Adesão N^o BA000036) registrada na base de dados (GenBank), iniciadores de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) foram sintetizados. Em um tubo de microcentrífuga de 0,2 mL, 0,0002 mL (0,2 pL) de uma solução de DNA genômico preparado a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de acordo com um método convencional como um padrão de amplificação foi colocado, e cada reagente foi adicionado ao tubo de tal modo que a mistura resultante, em um volume total de 0,05 mL (50 pL), contivesse 20 pmol cada de iniciador, tampão de Tris-HCl pH 8,0 (20 mM), cloreto de potássio (2,5 mM), gelatina (100 pg/mL), cada dNTP (50 pM) e LA Taq DNA polimerase (2 unidades) (manufaturada pela Takara Shuzo Co., Ltd.). Reação em cadeia da polimerase (a seguir referida como PCR) foi realizada por meio do uso de um termociclador manufaturado pela BioRad sob as condições de 30 ciclos de: desnaturação de DNA a 94 °C por 30 segundos, recozimento dos iniciadores a 55 °C por 30 segundos, e reação de extensão dos iniciadores de DNA a 72 °C por 3 minutos. As PCRs nos presentes Exemplos foram realizadas sob as condições acima salvo especificação em contrário. O produto obtido por essa PCR foi submetido a eletroforese em agarose a 1%, e um fragmento de DNA de cerca de 0,9 kb que contém o gene HOM foi excisado do gel, seguido da purificação por meio do uso do kit Geneclean (manufaturado pela BIO 101). Esse fragmento foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, e o fragmento de EcoRI-BamHI de 0,9 kb foi inserido no intervalo de EcoRI/BamHI de pHSG298 (manufaturado pela Takara Shuzo Co., Ltd.) que tinha sido digerido de modo preliminar com EcoRI e BamHI, por meio do uso do kit Ligation Ver. 1 (manufaturado pela Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi designado pHOM1.

(2) Preparação de Cassete de Expressão Secretor de LDC

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23/41 [055] O promotor do gene resistente a canamicina foi selecionado como um promotor expressão constitucional de LDC em Corynebacterium glutamicum; SufI de E. coli, cuja secreção é dependente da via metabólica de Tat, foi selecionado como um sinal de secreção; e cadA de E. coli foi selecionado como o gene LDC.

[056] Primeiro, o promotor do gene resistente a canamicina foi clonado. Em referência à sequência de base de pHSG299 (Adesão N^o M19415) registrada na base de dados (GenBank), iniciadores de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4) foram sintetizados. Por meio do uso do plasmídeo pHSG299 como um padrão de amplificação e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 0,3 kb que contém a região de promotor do gene resistente a canamicina foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. Esse fragmento foi inserido no intervalo no vetor de plasmídeo pT7blue (manufaturado pela Novagen) por meio do uso do kit Ligation Ver. 1, cujo intervalo tinha sido preparado através da digestão do vetor com EcoRV e através da adição da T aos terminais de 3'. Entre os plasmídeos obtidos, o plasmídeo que se tornou um único fragmento de 3,2 kb após digestão com HindIII e SacII foi designado pKMP1.

[057] Depois disso, o gene LDC foi clonado. Em referência à sequência de base do gene LDC (Adesão N^o M76411) registrada na base de dados (GenBank), iniciadores de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6) foram sintetizados. Por meio do uso de uma solução de DNA genômico preparado a partir de E. coli (Escherichia coli ATCC10798) de acordo com um método convencional como um padrão de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOs:5 e 6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para

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24/41 obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 2,1 kb que contém o gene LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. Esse fragmento foi inserido no intervalo no vetor de plasmídeo pT7blue por meio do uso do kit Ligation Ver. 1, cujo intervalo tinha sido preparado através da digestão do vetor com EcoRV e através da adição da T aos terminais de 3'. Entre os plasmídeos obtidos, o plasmídeo que se tornou um único fragmento de 4,0 kb após digestão com HindIII e NcoI foi designado pCADA.

[058] Finalmente, um iniciador de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:7) em que uma sequência de base correspondente à sequência de aminoácidos de SufI de E. coli como um sinal de secreção é fundida ao gene LDC foi sintetizado. Esse iniciador de oligonucleotídeo foi designado de tal modo que sua extremidade 3' tem uma região que se sobrepõe à extremidade 5' do gene LDC. Por meio do uso do pCADA como um padrão de amplificação e os oligonucleotídeos (SEQ ID NOs:7 e 6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 2,2 kb que contém o gene LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean (fragmento 1 do gene LDC). Adicionalmente, um iniciador de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:8) em que uma sequência de base correspondente à sequência de aminoácidos de SufI de E. coli como um sinal de secreção é fundida ao promotor do gene resistente a canamicina foi sintetizado. Esse iniciador de oligonucleotídeo foi designado de tal modo que sua extremidade 5' tem uma região que se sobrepõe à extremidade 3' do promotor do gene resistente a canamicina. Por meio do uso de pKMP1 como um padrão de amplificação e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NOs:3 e 8) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de

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DNA de 0,4 kb que contém o gene LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean (fragmento 1 do promotor do gene resistente a canamicina).

[059] Por meio do uso do assim obtidos fragmento 1 do gene LDC e fragmento 1 do promotor do gene resistente a canamicina como padrões de amplificação, e um iniciador de oligonucleotídeo projetado para conter a recognição da sequência para a enzima de restrição BamHI (SEQ ID NO:9) e um iniciador de oligonucleotídeo projetado para conter a sequência de recognição para a enzima de restrição SphI (SEQ ID NO:10) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 2,6 kb que contém o cassete de expressão secretor de LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. Esse fragmento foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e SphI, e o fragmento BamHI-SphI de 2,6 kb resultante foi inserido no intervalo de BamHI-SphI de pHOM1 que tinha sido digerido de modo preliminar com BamHI e SphI, por meio do uso do kit Ligation Ver. 1 (manufaturado pela Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi designado pTM65.

(4) Incorporação de pTM65 no Cromossomo [060] O plasmídeo pTM65 foi introduzido à cepa AK-1 por eletroporação [FEMS Microbiology Letters, 65, página 299 (1989)], e submetido a seleção no meio de ágar LB (triptono (10 g/L) (manufaturado pela Bacto), extrato de levedura (5 g/L) (manufaturado pela Bacto), cloreto de sódio (10 g/L)) suplementado com canamicina (25 pg/mL). A partir do transformante assim selecionado, uma solução de DNA genômico foi preparada de acordo com um método convencional. Por meio do uso desse DNA genômico como um padrão e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:1) (SEQ ID NO:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi

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26/41 então submetido a eletroforese em agarose a 1,0%. Como resultado, uma tira única de 3,5 kb foi observada. Desse modo, seria possível confirmar que o transformante selecionado tem o gene LDC inserido no locus HOM. Esse transformante foi designado Corynebacterium glutamicum AK-1/pTM65 (a seguir referida como a cepa AK-1/pTM65 para resumir).

Exemplo 2 (Preparação de Corynebacterium glutamicum Que Secreta De Modo Extracelular Lisina Descarboxilase) (Parte 1: por meio de Via Metabólica de Sec) (1) Preparação de Cassete de Expressão Secretor de LDC [061] Subsequentemente, o promotor do gene resistente a canamicina foi selecionado como um promotor para expressão constitucional de LDC em Corynebacterium glutamicum; arpE, que é o sinal para secreção de subtilisina por meio da via metabólica de Sec foi selecionado como um sinal de secreção; e cadA de E. coli foi selecionado como o gene LDC. De modo semelhante ao Exemplo 1, foi sintetizado um iniciador de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:11) em que uma sequência de base correspondente à sequência de aminoácidos de arpE como um sinal de secreção é fundida ao gene LDC. Esse iniciador de oligonucleotídeo foi designado de tal modo que sua extremidade 3' tem uma região que se sobrepõe à extremidade 5' do gene LDC. Por meio do uso de pCADA como um padrão de amplificação e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 2,2 kb que contém o gene LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean (fragmento 2 do gene LDC).

[062] Adicionalmente, foi sintetizado um iniciador de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:12) em que uma sequência de base correspondente à sequência de aminoácidos de arpE como um sinal de

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27/41 secreção é fundida ao promotor do gene resistente a canamicina. Esse iniciador de oligonucleotídeo foi designado de tal modo que sua extremidade 5' tem uma região que se sobrepõe à extremidade 3' do promotor do gente resistente a canamicina. Por meio do uso de pKMP1 como um padrão de amplificação e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:12) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 0,4 kb que contém o gene LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean (promotor do gene resistente a canamicina fragmento 2).

[063] Por meio do uso do assim obtido fragmento 2 do gene LDC e do promotor do gene resistente a canamicina fragmento 2 como padrões de amplificação, e dos iniciadores de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:9) e (SEQ ID NO:10) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em gel de agarose a 1%. Um fragmento de DNA de 2,6 kb que contém o cassete de expressão secretor de LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. Esse fragmento foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e SphI, e o fragmento de BamHI-SphI de 2,6 kb resultante foi inserido no intervalo de BamHI-SphI de pHOM1 que havia sido digerido de modo preliminar com BamHI e SphI, por meio do uso do kit Ligation Ver. 1 (manufaturado pela Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi designado pTM66.

(2) Incorporação de pTM66 no Cromossomo [064] O plasmídeo pTM66 foi introduzido à cepa AK-1 por eletroporação [FEMS Microbiology Letters, 65, página 299 (1989)], e submetido a seleção no meio de ágar LB (triptono (10 g/L) (manufaturado pela Bacto), extrato de levedura (5 g/L) (manufaturado pela Bacto), cloreto de sódio (10 g/L)) suplementado com canamicina (25 pg/mL). A partir do transformante

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28/41 assim selecionado, uma solução de DNA genômico foi preparada de acordo com um método convencional. Por meio do uso desse DNA genômico como um padrão e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto, que foi então submetido a eletroforese em 1.0% agarose. Como resultado, uma faixa única de 3,5 kb foi observada. Desse modo, seria possível confirmar que o transformante selecionado tem o gene LDC inserido no locus HOM. Esse transformante foi designado Corynebacterium glutamicum AK-1/pTM66 (a seguir referido como a cepa AK-1/pTM66 para resumir).

Exemplo Comparativo 1 (Preparação de Corynebacterium glutamicum Que Não Secreta de Modo Extracelular Lisina Descarboxilase) [065] pKMP1 foi digerido com HindIII e NcoI, e o produto resultante foi submetido a eletroforese em agarose a 1,2%. Um fragmento de DNA de 0,3 kb que contém a região de promotor do gene resistente a canamicina foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. O fragmento de HindIII-NcoI assim obtido foi inserido no intervalo de HindIII/NcoI de pCADA que havia sido digerido de modo preliminar com HindIII e NcoI, por meio do uso do kit Ligation Ver. 1. O plasmídeo obtido foi designado pTM100.

[066] Depois disso, pTM100 foi digerido com SacII, e o produto resultante foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,0%. Um fragmento de DNA de 2,4 kb que contém o cassete de expressão de LDC foi excisado do gel, e foi purificado por meio do uso do kit Geneclean. O fragmento de SacII assim obtido foi inserido no intervalo de SacII de pHOM1 que havia sido digerido de modo preliminar com SacII, por meio do uso do kit Ligation Ver. 1. O plasmídeo obtido foi designado pTM101.

[067] O plasmídeo pTM101 foi introduzido à cepa AK-1 por

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29/41 eletroporação [FEMS Microbiology Letters, 65, página 299 (1989)], e submetido a seleção em meio de ágar LB (triptono (10 g/L) (manufaturado pela Bacto), extrato de levedura (5 g/L) (manufaturado pela Bacto), cloreto de sódio (10 g/L)) suplementado com canamicina (25 pg/mL).

[068] A partir do transformante assim selecionado, uma solução de DNA genômico foi preparada de acordo com um método convencional. Por meio do uso desse DNA genômico como um padrão e dos oligonucleotídeos (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) como um conjunto de iniciadores, a PCR foi realizada para obter um produto , que foi então submetido a eletroforese em agarose a 1,0%. Como resultado, um faixa única de 2,1 kb foi observada. Desse modo, seria possível confirmar que o transformante selecionado tem o gene LDC inserido no locus de HOM. Esse transformante foi designado Corynebacterium glutamicum AK1/pTM101 (a seguir referido como a cepa AK-1/pTM101 para resumir).

Exemplo 3 (Confirmação de Secreção Extracelular de Atividade de Lisina Descarboxilase) [069] Cada uma dentre a cepa AK-1/pTM65, cepa AK1 /pTM66 e cepa AK-1/pTM101 foi cultivada em meio BY (consulte J. Bacteriol., 159, páginas 306 a 311 (1984)), e a cultura obtida foi separada no microrganismo e no sobrenadante de cultura por centrifugação. O microrganismo foi homogeneizado de acordo com um método convencional, para preparar um homogenado de microrganismo. As atividades de lisina descarboxilase no sobrenadante de cultura e no homogenado de microrganismo assim obtidos foram medidas (consulte Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, páginas 2.130 a 2.135, (2007)). Tomando a atividade enzimática com a qual a L-lisina é convertida a 1 nmol de cadaverina em 1 minuto com 1 U, os resultados são mostrados na Tabela 1 em termos da atividade específica por peso de proteína.

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Tabela 1

Nome do microrganismo	Atividade da lisina descarboxilase [mU/mg]
Homogenado de microrganismo	Sobrenadante de cultura
Estirpe AK-1/pTM101	19.800	0
Estirpe AK-1/pTM65	44.900	340
Estirpe AK-1/pTM66	57.100	550

[070] Visto que a cepa AK-1/pTM65 e a cepa AK-1/pTM66 tiveram atividade de lisina descarboxilase no sobrenadante de cultura, ou seja, no exterior das células, seria possível confirmar que lisina descarboxilase foi secretada de modo extracelular nesses casos. Adicionalmente, seria possível confirmar que todas as cepas tiveram atividade de lisina descarboxilase no homogenado de microrganismo.

Exemplos 4 e 5, e Exemplos Comparativos 2 e 3 (Cultura de Microrganismo: Casos Em Que O Microrganismo é Uma Bactéria Corineforme) [071] A cepa AK-1/pTM65 (Exemplo 4), a cepa AK-1/pTM66 (Exemplo 5), a cepa AK-1/pTM101 (Exemplo Comparativo 2) e a cepa AK1/pTM101 + 20 mg de lisina descarboxilase purificada (preparada pelo método descrito no documento JP 2004-000114 A) (Exemplo Comparativo 3) foram cultivadas, e comparadas em relação à produtividade de cadaverina.

[072] Em 5 mL de meio BY esterilizado, uma alça de platina de cada cepa foi inoculada, e momento anterior à pré-cultura foi realizado a 30 °C por 24 horas com vibração. Todo o volume do momento anterior à pré-cultura obtida foi inoculado em 50 mL do mesmo meio conforme no momento anterior à pré-cultura, e a pré-cultura foi realizada a 30 °C com uma amplitude de vibração de 30 cm a 120 rpm por 24 horas. Depois disso, todo o volume da précultura obtida foi inoculado em 950 mL de meio MMP (meio de cultura) mostrado na Tabela 2, e a cultura foi realizada sob aeração com ar esterilizado a 0,07 vvm a 30 °C em uma velocidade de rotação de lâmina de agitação de 800 rpm a um pH controlado de 6,7 por 50 horas. Como neutralizadores, uma

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31/41 solução de ácido sulfúrico aquosa (3 M) e amônia aquosa (3 M) foram usadas. No Exemplo Comparativo 3, 20 mg de lisina descarboxilase purificada foi adicionada no começo da cultura.

Tabela 2

Componentes do meio	Concentração final
[g/L]
Glicose	50
(NHÚ2SO4	20
Bacto Peptono	5
KH2PO4	2,5
K2HPO4	2,75
NaCl	0,5
MgSO4^7H2O	0,75
CaC^2H2O	0,05
FeSO2^7H2O	0,01
MnSO4^4~6H2O	0,001
Biotina	0,0005
Tiamina^HCl	0,007
L-homosserina	0,5

[073] Após conclusão da cultura, o microrganismo foi removido pela centrifugação a 4 °C a 8.000 rpm por 10 minutos, seguida pela recuperação do sobrenadante de cultura. Cadaverina e lisina nesse sobrenadante de cultura foram analisadas por HPLC. Para medir a concentração de glicose, o “Teste de Glicose Wako C” (marca registrada) (manufaturado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado. O rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose ((peso de

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32/41 cadaverina produzida/ peso de glicose consumida) χ 100 (%)) foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3

	Exemplo Comparativo 2	Exemplo Comparativo 3	Exemplo 4	Exemplo 5
AK-1/pTM101	AK-1/pTM101 + Lisina descarboxilase	AK-1/pTM65 (por meio de via metabólica de Tat)	AK-1/pTM66 (por meio de via metabólica de Sec)
Cadaverina [g/L]	5,6	6,4	7,5	7,1
Lisina [g/L]	1,2	0,0	0,0	0,0
Rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose [%]	11,2	12,8	15,0	14,2

[074] Como resultado, nos Exemplos Comparativos 2 e 3, um efeito que permite supor que subprodução de lisina pode ser reduzida por adição de lisina descarboxilase ao exterior das células foi observado. Por outro lado, comparando-se entre o Exemplo Comparativo 2 e os Exemplos 4 e 5, revelou-se que a subprodução de lisina pode ser notavelmente reduzida permitindo-se a secreção extracelular de lisina descarboxilase. Surpreendentemente, embora tenha sido esperado que o aumento na concentração de cadaverina acumulada e o aumento no rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose não são diferentes entre o Exemplo Comparativo 3 e os Exemplos 4 e 5, seria possível confirmar que cultivar um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase resulta em maiores aumentos na concentração de cadaverina acumulada e do rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose, em comparação com casos em que lisina descarboxilase é adicionada ao meio de cultura.

Exemplo de Referência 2 (Preparação de E. coli Deficiente em Lisina Descarboxilase) (1) Deleção de Gene de Lisina Descarboxilase (LDC) em E. coli

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33/41 [075] Sabe-se que E. coli tem o gene cadA e o gene IdcC como genes de LDC. De acordo com o método chamado de “Integração acionada por Red”, que foi desenvolvido por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, volume 97, N^o 12, páginas 6.640 a 6.645), os genes cadA e ldcC na cepa W3110 de E. coli foram deletados como segue. No método de “Integração acionada por Red”, oligonucleotídeos sintéticos, cada um dos quais designados de tal modo que sua extremidade 5' tem uma parte do gene de interesse e sua extremidade 3' tem uma parte de um gene de resistência a antibiótico, são usados como iniciadores para obter um produto de PCR, que pode então ser usado para construção de uma etapa de uma cepa deficiente de gene. Adicionalmente, por meio do uso de FLP recombinase derivada de levedura, o gene de resistência a antibióticos que foi incorporado na cepa deficiente em gene pode ser removido.

(1-1) Deleção de Gene de cadA [076] Como um padrão para a PCR, o plasmídeo pKD3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, volume 97, N^o 12, páginas 6.640 a 6.645) foi usado. pKD3 é um plasmídeo produzido através da inserção de FRT (Alvo de Recognição de FLP recombinase), que é a sequência de recognição de FLPrecombinase, e do gene cat, que é um gene de resistência a antibióticos, no pMW118 (manufaturado pela Takara Bio Inc.). Esses são inseridos na ordem de FRT-cat-FRT. FRT é mostrado em SEQ ID NO:75.

[077] A PCR foi realizada por meio do uso, como iniciadores, dos oligonucleotídeos sintéticos mostrados na SEQ ID NOs: 76 e 77, cujos extremidades 3' têm sequências correspondentes a ambas as extremidades do FRT e cujas extremidades 5' cada uma tem 50 bases ladeando o quadro de leitura aberto (ORF) do gene de cadA.

[078] O produto de PCR amplificado foi purificado através de gel de agarose, e introduzido pela eletroporação à cepa W3110 de E. coli que

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34/41 carrega o pKD46, que é um plasmídeo que tem capacidade de replicação sensível a temperatura. O plasmídeo pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, volume 97, N^o 12, páginas 6.640 a 6.645) compreende um fragmento de DNA de fago λ que tem um comprimento total de 2.154 bases (adesão do GenBank/EMBL N^o J02459, posições 31.088 a 33.241) que compreendem os genes que codificam Red recombinase (genes exo, γ e β) para o sistema de recombinação homólogo de λ Red regulado pelo promotor de ParaB induzível por arabinose.

[079] Células competentes para a eletroporação foram preparadas como segue. Ou seja, a cepa W3110 de E. coli foi cultivada em meio LB suplementado com ampicillina a 30 °C durante a noite, e a cultura obtida foi então diluída em 100 dobras com meio SOB suplementado com ampicillina e L-arabinose. As células diluídas obtidas foram permitidas a crescer a 30 °C sob aeração até que OD600 alcance cerca de 0,6, e foram lavadas 3 vezes com glicerol a 10%, de modo que as células pudessem ser usadas em eletroporação.

[080] Às células após a eletroporação, foi adicionado 1 mL de meio SOC, e as células foram então cultivadas a 37 °C por 2,5 horas. Subsequentemente, as células foram submetidas cultura por placa a 37 °C em meio de ágar LB suplementado com cloranfenicol, através do qual um recombinante resistente a cloranfenicol foi selecionado. Depois disso, para remover o plasmídeo pKD46, as células foram subcultivadas duas vezes a 42 °C em meio de ágar LB suplementado com cloranfenicol. As colônias obtidas foram testadas para resistência a ampicillina, e uma cepa sensível a ampicillina, na qual pKD46 é perdido, foi obtida.

[081] Perda do gene cadA no mutante que poderia ser identificado com o gene resistente a cloranfenicol foi confirmada por PCR. A cepa deficiente em cadA obtida foi designado a cepa W3110 cadA::FRT-cat-FRT.

[082] Depois disso, a fim de remover o gene FRT-cat-FRT introduzido no gene cadA, o plasmídeo auxiliar pCP20 foi usado. pCP20 (Proc. Natl.

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Acad. Sci. USA, 2000, volume 97, N^o 12, páginas 6.640 a 6.645) é um plasmídeo que transporta FLP de levedura recombinase e tem capacidade de replicação sensível a temperatura. Através da introdução de pCP20, a recombinase reconhece FRT em dois sítios no cromossomo para causar recombinação, removendo por clivagem, desse modo, o gene entre os sítios FRT, finalmente deixando apenas FRT no cromossomo.

[083] Células competentes da cepa W3110 cadA::FRT-cat-FRT assim obtidas foram preparadas de acordo com um método convencional, e transformadas com o plasmídeo auxiliar pCP20. As células foram então submetidas à cultura de placa a 30 °C no meio de ágar LB suplementado com ampicillina de 50 mg/L, através do qual uma cepa resistente a ampicilina foi selecionada. Depois disso, para remover o pCP20, as células foram cultivadas duas vezes a 42 °C em meio de ágar LB. As colônias obtidas foram testadas para resistência a ampicilina e resistência a cloranfenicol, e uma cepa sensível a cloranfenicol/ampicillina, na qual o gene cat e o pCP20 são perdidos, foi obtida. Essa cepa foi designada W3110 ÁcadA.

(1-2) Deleção de Gene ldcC [084] Deleção do gene ldcC na cepa W3110 ÁcadA de E. coli foi realizada de acordo com o método no (1-1) acima por meio do uso dos iniciadores mostrado na SEQ ID NOs:78 e 79 como iniciadores para destruir ldcC. Desse modo, uma cepa na qual o gene cadA e o gene ldcCs foram deletados foi obtida. A cepa bacteriana construída foi designada W3110 ÁLDC.

Exemplos 6 e 7, Exemplo Comparativo 4 (Preparação de Cepas de E. coli Que Secretam De Maneira Extracelular Lisina Descarboxilase (por meio da Via Metabólica de Sec e por meio da Via Metabólica de Tat) e Preparação de Cepa de E. coli Que não Secreta De Modo Extracelular Lisina Descarboxilase ) [085] A cepa W3110 ÁLDC foi transformada com os plasmídeos pTM101, pTM65 e pTM66 de acordo com um método convencional. As cepas

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36/41 de E. coli recombinantes foram designadas a cepa W3110 ÁLDC/pTM101 (cepa sem secreção extracelular) (Exemplo Comparativo 4), cepa W3110 ÁLDC/pTM65 (cepa com secreção extracelular: por meio da via metabólica de Tat) (Exemplo 6) e cepa W3110 ÁLDC/pTM66 (cepa com secreção extracelular: por meio da via metabólica de Sec) (Exemplo 7), respectivamente.

Exemplo 8 (Confirmação de Secreção Extracelular de Lisina Descarboxilase) [086] A cepa W3110 ÁLDC/pTM101, a cepa W3110 ÁLDC/pTM65 e a cepa W3110 ÁLDC/pTM66 foram cultivadas em meio LB suplementado com canamicina, e cada cultura obtida foi separada no microrganismo e no sobrenadante de cultura por centrifugação. O microrganismo foi homogeneizado de acordo com um método convencional, para preparar um homogenado de microrganismo. As atividades de lisina descarboxilase nos sobrenadante de cultura e homogenado de microrganismo assim obtidos foram medidas. Tomando a atividade enzimática com a qual Llisina é convertida a 1 nmol de cadaverina em 1 minuto como 1 U, os resultados são mostrados na Tabela 4 em termos da atividade específica por peso de proteína.

Tabela 4

Nome do microrganismo	Atividade de LDC [mU/mg]
Homogenado de microrganismo	Sobrenadante de cultura
Cepa W3110 ALDC/pTM101	15.700x103	0
Cepa W3110 ALDC/pTM65	18.700x103	10x103
Cepa W3110 ALDC/pTM66	19.700x103	12x103

[087] Nos casos da cepa W3110 ÁLDC/pTM101 e da cepa

W3110 ÁLDC/pTM65, visto que o sobrenadante de cultura, que é o exterior das células, teve atividade de lisina descarboxilase, seria possível confirmar que a

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37/41 lisina descarboxilase foi secretada de modo extracelular. Adicionalmente, seria possível confirmar que todas as cepas tinham lisina descarboxilase nos seus homogenados de microrganismo.

Exemplos 9 e 10, Exemplo Comparativo 5 (Cultura de Microrganismo: Casos Em Que O Microrganismo É O E. coli) [088] A cepa W3110 ÁLDC/pTM65 (Exemplo 9), a cepa W3110 ÁLDC/pTM66 (Exemplo 10) e a cepa W3110 ÁLDC/pTM101 + 20 m de lisina descarboxilase purificada (preparada pelo método descrito no documento JP 2004-000114 A) (Exemplo Comparativo 5) foram cultivadas, e foram comparadas em relação à produtividade de cadaverina.

[089] Em 5 mL de meio LB suplementado com canamicina, uma alça de platina de cada cepa foi inoculada, e o momento pré da pré-cultura foi realizado a 30 °C por 24 horas com vibração. Todo o volume do momento pré da pré-cultura obtida foi inoculado em 50 mL do mesmo meio conforme no momento pré da pré-cultura, e pré-cultura foi realizada a 30 °C com uma amplitude de vibração de 30 cm a 120 rpm por 24 horas. Depois disso, todo o volume da pré-cultura obtida foi inoculado em 950 mL de meio MS (meio de cultura) mostrado na Tabela 5, e cultura foi realizada sob aeração com ar esterilizado a 0,20 vvm a 37 °C a uma velocidade de rotação de lâmina de agitação de 800 rpm a um pH controlado de 7,0 por 50 horas. Como neutralizadores, uma solução de ácido sulfúrico aquosa (3 M) e amônia aquosa (3 M) foram usadas. No Exemplo Comparativo 6, 20 mg de lisina descarboxilase purificada foi adicionado no começo da cultura.

Tabela 5

Componentes do meio	Concentração final
[g/L]
Glicose	40
(NH4)2SO4	16

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38/41

Componentes do meio	Concentração final
[g/L]
Polipeptona S	10
KH2PO4	1
MgSÜ4-7H2O	1
FeSO2'7H2O	0,01
MnSO4'5H2O	0,01

[090] Após conclusão da cultura, o microrganismo foi removido por centrifugação a 4 °C a 8.000 rpm por 10 minutos, seguido da recuperação do sobrenadante de cultura. Cadaverina e lisina nesse sobrenadante de cultura foram analisadas por HPLC. Para medir a concentração de glicose, “Teste de Glicose Wako C” (marca registrada) (manufaturado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado. O rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose ((peso de cadaverina produzida / peso de glicose consumida) χ 100 (%)) foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6

	Exemplo Comparativo 5	Exemplo 9	Exemplo 10
W3110 ALDC/pTM101 + Lisina descarboxilase	W3110 ÁLDC/pTM65 (por meio de via metabólica de Tat)	W3110 ÁLDC/pTM66 (por meio de via metabólica de Sec)
Cadaverina [g/L]	0,57	1,52	1,72
Lisina [g/L]	0	0	0
Rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose [%]	1,42	3,86	4,3

[091] Com base na comparação entre o Exemplo Comparativo 5 e os Exemplos 9 e 10, seria possível confirmar, de modo surpreendente, que cultivar um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase resulta em maiores aumentos na concentração de cadaverina acumulada e no rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose,

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39/41 em comparação com casos em que a lisina descarboxilase é adicionada ao meio de cultura.

Exemplos 11 e 12, Exemplos Comparativos 6 e 7 (Cultura de Microrganismo: Comparação de Efeito de Adição de Lisina) [092] A cepa W3110 ÁLDC/pTM65 (Exemplo 11), a cepa W3110 ÁLDC/pTM66 (Exemplo 12), a cepa W3110 ÁLDC/pTM101 (Exemplo Comparativo 6) e a cepa W3110 ÁLDC/pTM101 + 20 mg de lisina descarboxilase purificada (preparada pelo método descrito no documento JP 2004-000114 A) (Exemplo Comparativo 7) foram submetidas à comparação da habilidade de conversão da lisina em cadaverina. Cada microrganismo foi cultivado da mesma maneira conforme nos Exemplos 9 e 10 exceto que 62,5 g/L de hidrocloreto de L-lisina foi adicionada ao meio MS (meio de cultura). Após 50 horas da cultura, o microrganismo foi removido por centrifugação a 4 °C a 8.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante de cultura foi recuperado. Cadaverina e lisina nesse sobrenadante de cultura foram analisadas por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7

	Exemplo Comparativo 6	Exemplo Comparativo 7	Exemplo 11	Exemplo 12
W3110 ALDC/pTM101	W3110 ALDC/pTM101 + Lisina descarboxilase	W3110 ALDC/pTM65 (por meio de via metabólica de Tat)	W3110 ÁLDC/pTM66 (por meio de via metabólica de Sec)
Cadaverina [g/L]	5,78	21,2	29,5	29,5
Lisina [g/L]	40,6	8,2	0	0
Taxa de produção de cadaverina [g/Lh]	0,12	0,42	0,59	0,59

[093] Com base na comparação entre os Exemplos

Comparativos 6 e 7 e os Exemplos 11 e 12, seria possível confirmar que a eficácia de produção de cadaverina (taxa de produção) é notavelmente maior

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40/41 que nos organismos que secretam de modo extracelular lisina descarboxilase. Desse modo, foi revelado que a adição de lisina mediante o cultivo de um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase aperfeiçoa a eficácia de produção de cadaverina.

Exemplos 13 e 14, Exemplo Comparativo 8 (Cultura de Microrganismo: Comparação com Microrganismo Que Tem Lisina Descarboxilase Ligada A Sua Superfície) [094] Microrganismos que secretam de modo extracelular lisina descarboxilase (a seguir referidos como microrganismos secretores de LDC) e a cepa JM109/pTM16 descrita no documento JP 2004-298033 A como um microrganismo que tem lisina descarboxilase na sua superfície (a seguir referido como um microrganismo que apresenta superfície de célula de LDC) foram cultivados, e esses foram comparados em relação à produtividade de cadaverina.

[095] Um laço de platina de cada uma dentre a cepa W3110 ÁLDC/pTM65 (Exemplo 13), cepa W3110 ÁLDC/pTM66 (Exemplo 14), e cepa JCM109/pTM16 (Exemplo Comparativo 8) foi inoculado em 5 mL de meio LB suplementado com canamicina (meio LB suplementado com ampicilina no caso da cepa JCM109/pTM16), e o momento pré da pré-cultura foi realizado a 30 °C por 24 horas com vibração. Todo o volume do momento pré da pré-cultura obtida foi inoculado em 50 mL do mesmo meio conforme no momento pré da pré-cultura, e a pré-cultura foi realizada a 30 °C com uma amplitude de vibração de 30 cm a 120 rpm por 24 horas. Depois disso, todo o volume da précultura obtida foi inoculado em 950 mL de meio MS (meio de cultura) suplementado com isopropil-tio-p-D-galactosídeo em uma final concentração de 1 mM, e a cultura foi realizada sob aeração com ar esterilizado a 0,20 vvm a 37 °C a uma velocidade de rotação de lâmina de agitação de 800 rpm em um pH controlado de 7,0 por 50 horas. Como neutralizadores, uma solução de

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41/41 ácido sulfúrico aquosa (3 M) e amônia aquosa (3 M) foram usadas.

[096] Após conclusão da cultura, o microrganismo foi removido por centrifugação a 4°C a 8.000 rpm por 10 minutos, seguido da recuperação do sobrenadante de cultura. Cadaverina e lisina nesse sobrenadante de cultura foram analisadas por HPLC. Para medir a concentração de glicose, “Teste de Glicose Wako C” (marca registrada) (manufaturado pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) foi usado. O rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose ((peso de cadaverina produzida / peso de glicose consumida) χ 100 (%)) foi calculado. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8

	Exemplo Comparativo 8	Exemplo 13	Exemplo 14
JCM109/pTM16 (Apresentação de superfície celular)	W3110 ÁLDC/pTM65 (por meio de via metabólica de Tat)	W3110 ÁLDC/pTM66 (por meio de via metabólica de Sec)
Cadaverina [g/L]	0,24	1,35	1,41
Lisina [g/L]	0,15	0	0
Rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose [%]	0,6	3,38	3,53

[097] Com base na comparação entre o Exemplo Comparativo 8 e os Exemplos 13 e 14, seria possível confirmar, de modo surpreendente, que cultivar um microrganismo secretor de LDC resulta em maiores aumentos na concentração de cadaverina acumulada e no rendimento de cadaverina em relação ao consumo de glicose, em comparação com casos em que um microrganismo que apresenta superfície de célula de LDC é cultivado.

Aplicabilidade Industrial [098] A presente invenção pode ser aplicada de modo adequado para produção de cadaverina.

Claims (4)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA PRODUZIR CADAVERINA, caracterizado pelo dito método compreender cultivar um microrganismo que secreta de modo extracelular lisina descarboxilase, em que o dito microrganismo expressa de maneira intracelular uma proteína que compreende lisina descarboxilase que tem um peptídeo sinal secretor fixado à porção N-terminal da sequência de aminoácidos da mesma, e cuja lisina descarboxilase é, assim, secretada extracelularmente;

   em que o dito peptídeo sinal secretor é um peptídeo representado pela sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 13 a 43.
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela lisina ser adicionada a um meio para cultivar dito microrganismo.
3. 3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela dita lisina descarboxilase ser derivada de E. coli.
4. 4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo dito microrganismo ser uma bactéria corineforme ou E. coli.