BR112012015443B1

BR112012015443B1 - Método de detecção de micro-organismos em uma amostra de teste

Info

Publication number: BR112012015443B1
Application number: BR112012015443-5A
Authority: BR
Inventors: Stephen B. Roscoe; Phillip A. Bolea; Stephanie J. Moeller
Original assignee: 3M Innovative Properties Company
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2019-07-02
Also published as: JP5747043B2; BR112012015443A2; EP2516666A1; EP2516666B1; US8802429B2; US20130316443A1; WO2011087711A1; US20120252049A1; CN102686739A; JP2013514809A; CN102686739B; US8518664B2

Abstract

métodos de detecção de micro-organismo e kits para os mesmos a presente invenção refere-se a um método de detecção de micro-organimos em uma amostra de teste. o método inclui as etapas de : a) incubar a amostra de teste com um meio de crescimento para formar uma amostra incubada , sendo que o meio de crescimento inclui um substrato de enzima e o substrato de enzima inclui um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente ,sendo que os micro -organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o grupo hidrolísavel do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente ,sendo que o produto detectável de formar fluorescente tem espéciaes ácidas e básicas ; b) excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem comprimento de onda ex<syn>iso durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz , sendo que ex<syn>iso é ponto isosbéstico de abordância do produto detectável de forma fluorescente ; e c) detectar luz emitida em um comprimento de onda em<syn>1.

Description

A presente descrição refere-se a métodos de detecção de micro-organismos que utilizam compostos fluorogênicos.

Antecedentes

Os corantes à base de 7-hidroxicumarina (também chamados de umbeliferonas) e seus derivados são amplamente usados como indicadores de atividade enzimática. Um exemplo de uma umbeliferona é 4-metilumbeliferona (chamada de 4-MU), que é usada para a detecção de coliformes, entre outras coisas. A fluorescência mais elevada de 4-MU (e outras umbeliferonas) é observada a partir da forma básica, portanto, tal detecção deve ser realizada em um pH de 8 a 10.

Sumário

Há várias situações nas quais uma resposta de detecção é desejada em valores de pH inferiores. Por exemplo, estudos cinéticos de fosfatase ácida exigem detecção em tempo real de atividade enzimática em meio ácido. A capacidade de observar fluorescência em pHs ácidos também eliminaria etapas necessárias nos protocolos, tornando, deste modo, as análises mais rápidas e mais fáceis. Devido ao desejo de execução de análise de fluorescência de pH baixo, ainda existe uma necessidade de métodos de análise que possam ser executados independentemente do pH.

É descrito no presente documento um método de detecção de micro-organismos em uma amostra de teste, em que o método inclui as etapas de: a) incubar a amostra de teste com um substrato de enzima para formar uma amostra incubada, sendo que o substrato de enzima inclui um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente, em que os micro-organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o grupo hi30 drolisável do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente, sendo que o produto detectável de forma fluorescente tem espécies ácidas e básicas; b) excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda ExAiso durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, em que ExAiso é o ponto isosbéstico de absorbância do produto detectável de forma fluo35 rescente; e c) detectar luz emitida em um comprimento de onda EmA1.

É apresentado, também, um método de detecção de micro-organismos em uma amostra de teste, em que o método inclui as etapas de: a) incubar a amostra de teste com um

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2/25 substrato de enzima, em que o substrato de enzima inclui um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente, em que os micro-organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o grupo hidrolisável do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente, em que o produto detectável de forma fluorescente tem espécies ácidas e básicas; b) excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda ExAiso durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, em que ExAiso é o ponto isosbéstico do produto detectável de forma fluorescente; c) detectar luz emitida em um comprimento de onda EmA1 como um resultado da excitação com luz que tem um comprimento de onda ExAiso; d) excitar o pro10 duto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda ExA2 durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, sendo que ExA2 é a absorção máxima das espécies básicas do produto detectável de forma fluorescente ou a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente; e) detectar luz emitida em um comprimento de onda EmA1 como um resultado da excitação com luz que tem um comprimento de onda ExA2; e f) calcular uma razão com base na luz emitida como um resultado da luz de excitação de ExAiso e na luz emitida como um resultado da luz de excitação de ExAiso, em que a razão é indicativa da quantidade de micro-organismos presentes na amostra de teste.

É apresentado, também, um kit para testar a presença de micro-organismos em uma amostra de teste, em que o kit inclui: substrato de enzima que inclui um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente, em que os micro-organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o grupo hidrolisável do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente em que o produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida e uma básica; e uma fonte de luz capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda ExAiso, em que ExAiso é o ponto isosbéstico do produto detectável de forma fluorescente, e em que a excitação do produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda ExAiso faz com que o produto detectável de forma fluorescente emita luz.

Breve Descrição dos Desenhos

A descrição pode ser compreendida de um modo mais completo levando em consideração a descrição detalhada a seguir das diversas modalidades da descrição junto aos desenhos em anexo.

As figuras não estão necessariamente representadas em escala. Os números semelhantes usados nas figuras se referem a componentes semelhantes. Entretanto, será compreendido que não se pretende que o uso de um número para se referir a um componente em uma determinada figura limite o componente em uma outra figura identificada com o mesmo número.

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As figuras 1A, 1B, e 1C são os espectros de absorção de 4-metilumbeliferona (4MU) para valores diferentes de pH (figura 1A), a emissão (excitação 455 nm) como uma função de pH para dois comprimentos de onda de excitação diferentes (figura 1B), e os espectros de emissão de 400 nm a 500 para valores diferentes de pH (figura 1C);

A figura 2 é um fluxograma que representa métodos exemplificadores revelados no presente documento;

A figura 3 é um fluxograma que representa métodos exemplificadores revelados no presente documento;

A figura 4 é um fluxograma que representa métodos exemplificadores revelados no 10 presente documento;

As figuras 5A, 5B e 5C são espectros de emissão (375 nm) como uma função de pH (figura 5A), espectros de emissão (455 nm) como uma função de pH em três comprimentos de onda diferentes de excitação (figura 5B), e uma plotagem das razões entre emissões de pico para excitação em comprimentos de onda diferentes (figura 5C);

A figura 6 é um espectro de emissão (450 nm) para éster etílico de ácido 7hidroxicumarina-3-carboxílico (EHC) como uma função de pH;

As figuras 7A, 7B e 7C são espectros de absorção de 3-(2-tienil)umbeliferona (TU) para valores de pH diferentes (figura 7A), 380 nm (figura 7B), e emissão (a 500 nm) mediante excitação a 405 nm e emissão (a 490 nm) mediante excitação a 380 nm como uma função de pH (figura 7C);

As figuras 8A e 8B são emissões (a 455 nm) mediante excitação a 335 nm como uma função de pH para 4-MU e 4-MUG na presença e ausência de β-D-galactosidase (figura 8A), e emissão (a 455 nm) mediante excitação a 360 nm como uma função de pH para 4MU e 4-MUG na presença e ausência de β D-galactosidase (figura 8B);

A figura 9 é emissão a 445 nm (370 nm ou 400 nm de excitação) como uma função de pH para MHCgal na presença e ausência de β-D-galactosidase; e

A figura 10 é emissão a 490 nm mediante excitação a 380 nm como uma função de pH para 3-(2-tienil)umbeliferona-e-D-galactopiranosídeo (TUgal) na presença e ausência de β-D-galactosidase, e emissão a 500 nm mediante excitação a 410 nm como uma função de pH para TUgal na presença e ausência de β-D-galactosidase.

Descrição Detalhada

Na descrição a seguir, é feita referência aos desenhos anexos que fazem parte disto, e nos quais são mostradas, a título de ilustração, várias modalidades específicas. Deve ser compreendido que outras modalidades são contempladas e podem ser feitas sem que se afaste do escopo ou espírito da presente descrição. Portanto, não se deve adotar a descrição detalhada a seguir em um caráter limitador.

Todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm significados

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4/25 comumente usados na técnica, exceto onde especificado em contrário. As definições aqui fornecidas são para facilitar o entendimento de certos termos usados frequentemente na presente invenção e não pretendem limitar o escopo da presente descrição.

Salvo onde indicado em contrário, todos os números que expressam atributos de 5 tamanhos, quantidades e propriedades físicas usados no relatório descritivo e nas reivindicações devem ser compreendidos no sentido de serem modificados em todas as instâncias pelo termo “cerca de”. Consequentemente, exceto onde indicado em contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos no relatório descritivo anteriormente mencionado e nas reivindicações em anexo são aproximações que podem variar dependendo das propri10 edades desejadas que os versados na técnica pretendam obter através da utilização dos ensinamentos aqui apresentados.

A representação de faixas numéricas por pontos limitantes abrange todos os números contidos nesta faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1; 1,5; 2; 2,75; 3; 3,80; 4 e 5) e qualquer faixa naquela faixa.

Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” abrangem as modalidades que apresentam referentes plurais, exceto onde o conteúdo determina claramente o contrário. Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, o termo “ou” é genericamente empregado em seu sentido incluindo “e/ou” exceto onde o conteúdo determina claramente o contrário.

São revelados no presente documento métodos e kits para detectar microorganismos em amostras. Em modalidades, um método pode, em geral, incluir as etapas de incubar a amostra de teste com o substrato de enzima, irradiar a amostra incubada com um primeiro comprimento de onda, e detectar luz emitida da amostra. Um substrato de enzima é um composto que pode ser clivado por uma enzima de um micro-organismo, formando um produto detectável de forma fluorescente. O produto detectável de forma fluorescente é, então, irradiado em um comprimento de onda do ponto isosbéstico do produto detectável de forma fluorescente. Mediante excitação do produto detectável de forma fluorescente, o produto detectável de forma fluorescente emitirá luz, que pode, então, ser detectada para confirmar a presença do micro-organismo na amostra de teste.

Em modalidades, os micro-organismos que podem ser detectados com o uso de métodos e kits conforme revelado no presente documento podem incluir bactérias e fungos, por exemplo. Os fungos exemplificadores incluem leveduras (incluindo, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida stellatoidea, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii,

Candida viswanathii, Candida lusitaniae e Rhodotorula mucilaginosa) e mofos (incluindo, por exemplo, Acremonium, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Stachybotrys e Trichoderma), por exemplo. As bactérias exemplificadoras incluem os seguinPetição 870190006032, de 18/01/2019, pág. 12/53

5/25 tes micro-organismos: Aeromonas hydrophilia, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacteroides fragilis, Bacteroides intermedium, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escheríchia coli,

Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Mycobacterium fortuitum, Neisseria gonorrhoeae, Organella morganii, Peptostreptococcus anaerobius, Peptococcus magnus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas pudita, Salmonella typhimurium, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Sta10 phylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus simulans, Streptococcus agalactiae B, Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus faecalis D, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Xanthomonas maltophilia.

Os tipos de amostras que pode ser testadas com o uso de métodos e kits conforme revelado no presente documento (que podem ser denominadas “amostras de teste”) geralmente não são limitados. Os tipos exemplificadores de amostras incluem amostras clínicas, amostras ambientais, amostras alimentícias, cosméticos, amostras de bebida, amostras de água e amostras de solo. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas a partir de artigos mediante enxágue do artigo para formar uma amostra de água a ser testada, por exemplo. As amostras como amostras alimentícias e amostras de solo podem digeridas ou submetidas a outro processamento antes dos métodos e kits apresentados anteriormente serem utilizados para detectar micro-organismos. Tratamentos de filtração, tratamentos de extração e similares também podem ser executados. Em modalidades nas quais uma amostra de teste é incubada com substrato de enzima, mas não meio de crescimento, o pré25 processamento de uma amostra incluiria a incubação da amostra com meio de crescimento e, então, a adição da solução resultante (como a amostra de teste) ao substrato de enzima.

A amostra de teste pode ser incubada com um substrato de enzima. O substrato de enzima pode ser fornecido em ou com meio de crescimento, por exemplo. Os meios de crescimento são em geral, líquidos ou géis que são projetados para suportar o crescimen30 to de micro-organismos. Os meios de crescimento exemplificadores incluem caldos nutrientes e placas de ágar. O meio de crescimento pode ser fornecido como um líquido, um líquido condensado ou desidratado, ou um gel, por exemplo. Um exemplo de um produto que fornece meio de crescimento para uso através de hidratação são as placas Petrifilm™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA).

A incubação da amostra de teste com o substrato de enzima (ou substrato de enzima e meio de crescimento) pode ser realizada simplesmente através da mistura dos dois; através da mistura dos dois e permitir que a mistura assente; através da mistura dos

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6/25 dois e agitar a mistura; através da mistura dos dois e aquecer a mistura; ou através da mistura dos dois, agitar a mistura e aquecer a mistura. a etapa de incubação pode ser executada durante qualquer quantidade de tempo. Em modalidades, é permitido que a amostra de teste e o substrato de enzima sejam incubados em temperaturas elevadas até pelo menos que um processo de divisão celular ocorra.

Em modalidades, a amostra de teste e o substrato de enzima (ou substrato de enzima e o meio de crescimento) podem ser misturados e, então, agitados com o uso de qualquer método de agitação mecânica comumente utilizado. A amostra de teste e o substrato de enzima podem ser misturados e, então, aquecidos com o uso de qualquer método de aquecimento comumente utilizado. Em modalidades, a amostra de teste e o meio de crescimento podem ser misturados e agitados com o uso de métodos comumente utilizados. Por exemplo, os micro-organismos podem ser detectados com o uso de placas Petrifilm™ 3M™. A placa Petrifilm™, que contém meio de crescimento desidratado e substrato de enzima, é reidratado com a amostra de teste, que contém o micro-organismo de interesse. Após a adi15 ção da amostra de teste, a placa Petrifilm™ reidratada pode ser incubada em condições adequadas para permitir detecção de micro-organismos (por exemplo, para uma contagem aeróbica, as placas Petrifilm™ 3M™ podem ser colocados em uma incubadora a 37°C por 24 a 48 horas; ou para levedura/mofo, as placas Petrifilm™ 3M™ podem ser colocadas em uma incubadora a 25 a 28°C por 3 a 5 dias).

Um substrato de enzima, para uso na presente invenção, é um material que é seletivamente hidrolisável por uma enzima a fim de gerar um produto detectável de forma fluorescente quando clivado. Um substrato de enzima, em geral, inclui duas porções, um grupo enzimaticamente hidrolisável (que pode ser, não necessariamente, uma molécula biológica) e um grupo fluorescente. Um substrato de enzima pode ser representado de forma pictórica pela fórmula I abaixo:

Grupo hidrolisável.............Grupo fluorescente (fórmula I)

Na fórmula I, porção A representada por “...........“ pode ser denominada uma ligação enzimaticamente hidrolisável. Uma ligação enzimaticamente hidrolisável refere-se a uma ligação ou aglutinação que pode facilmente ser clivada por uma enzima; particularmen30 te, uma enzima produzida por um micro-organismo de interesse.

O grupo fluorescente pode ser detectável de forma fluorescente uma vez que é clivado do substrato de enzima. Deve-se observar que o substrato de enzima pode ser detectável de forma fluorescente antes que o grupo fluorescente seja clivado do mesmo (ou indicado de outra forma, o grupo fluorescente pode ser detectável de forma fluorescen35 te no substrato de enzima ou clivado do substrato de enzima). Em modalidades, o substrato de enzima pode incluir um corante fluorescente unido a uma porção, que é clivável por uma enzima produzida pelo micro-organismo de interesse.

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O grupo hidrolisável incluído em um substrato de enzima pode incluir uma glicona, um glicosil fosfato, um éster, um aminoácido ou peptídeo, um fosfato, ou um sulfato, por exemplo.

A glicona ou glicosil fosfatos exemplificadores incluem α- e β-D-galactopiranosil, α- e β-D-glicopiranosil, N-acetil-α- e β-D-galactosaminil; N-acetil- α- e β-glicosaminil; β-D5 glicuronil, α-L-arabinopiranosil, α-L-arabinofuranosil, β-D-fucopiranosil, α- e β-Lfucopiranosil, α-D-mannopiranosil, β-D-xilopiranosil, α-D-maltosil, β-D-lactopiranosil, β-Dcelobiosil, α-D-N-acetilneuraminil, e mioinositol-1-il fosfato. Em modalidades, o grupo hidrolisável pode incluir α- e β-D-galactopiranosil, α- e β-D-glicopiranosil ou β-D-glicuronil. Em modalidades, o grupo hidrolisável inclui β-D-galactosil ou β-D-glicosil.

Os ésteres exemplificadores incluem butirato, valerato, hexanoato, caprilato, octanoato, nonaoato e palmitato. Um éster exemplificador pode incluir um éster cadeia longa de umbeliferona, como 4-metilumbeliferilpalmitato, 4-metilumbeliferilaurato, 4metilumbeliferilcaprilato, que estão disponíveis para comercialização (tais grupos hidrolisáveis podem ser usados para detectar esterase ou palmitase). Além disso, os substratos de enzima que são hidrolisáveis por lipase, esterase, acilase e epóxido hidrolase também podem ser utilizados, inclusive aqueles referidos em Sicart et al., Biotechnology Journal, 2007 2(2), 221 a 231.

Os aminoácidos exemplificadores podem incluir aminoácidos ligados a carbóxiterminal ou um sal adição ácido do mesmo. Tais aminoácidos podem incluir N-acetil-L-lisina,

L-alanina, L-arginina, ácido L-aspártico, N-alfa-benzilóxi carbonil-L-arginina, L-citrulina, ácido gama-L-glutâmico, L-glicina, L-histidina, L-hidroxiprolina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, Lmetionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, ácido L-piroglutâmico, L-serina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina. Os peptídeos exemplificadores podem incluir peptídeos ligados a carbóxi terminal que têm 1 a 4 aminoácidos ou um sal de adição do mesmo. Tais peptídeos podem incluir L-arginil-L-arginina, N-benzilóxi carbonil-glicil-L-prolina, L-glutaril-glicil-arginina, glicil-glicina, glicil-L-fenilalanina, glicil-L-prolina, e L-seril-L-tirosina. Em modalidades, o grupo hidrolisável é um peptídeo ligado ao terminal que tem 1 a 4 aminoácidos, sendo que grupos amino livres têm opcionalmente um grupo protetor, ou um sal de adição ácido do mesmo.

Qualquer corante fluorescente que possui uma absorção dependente de pH e um ponto isosbéstico (ou porção fluorogênica do mesmo) pode ser utilizado em substratos de enzima usados na presente invenção. Os corantes fluorescentes exemplificadores incluem derivados de xanteno (como fluoresceína, rodamina e derivados dessas substâncias), derivados de cianina (como cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina e merocianina e derivados dessas substâncias), derivados de naftaleno, derivados de cuma35 rina, derivados de oxadiazol, derivados de pireno, derivados de oxazina, derivados de acridina, derivados de arilmetina e derivados de tetrapirrol.

Em modalidades, os derivados de cumarina podem ser utilizados em substratos de

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8/25 enzima. Os derivados de cumarina exemplificadores incluem derivados de 7-hidroxicumarina (umbeliferona). Os derivados de 7-hidroxicumarina específicos incluem 4-metil-7hidroxicumarina (4-metilumbeliferona ou 4-MU), 3-ciano-7-hidroxicumarina (3cianoumbeliferona ou CyU), e ésteres de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico como etil-75 hidroxicumarina-3-carboxilato (EHC), metil-7-hidroxicumarina-3-carboxilato (MHC), 3-ciano4-metilumbeliferona, 3-(4-imidazolil)umbeliferona, e 6,8-difluoro-4-metilumbeliferona. Os derivados de 7-hidroxicumarina como aqueles que contêm um anel heterocíclico com 5 membros na posição 3 também podem ser utilizados em compostos fluorogênicos da presente invenção. Tais derivados de 7-hidroxicumarina são exemplificados na patente U.S. n°

6.566.508 (Bentsen et al.), estando a descrição da mesma aqui incorporada, por referência a isso. Um exemplo específico de tal derivado é 3-(2-tienil)umbeliferona (TU).

Os substratos de enzima exemplificadores incluem, mas não se limitam a, 4metilumbeliferona-p-D-galactopiranosídeo (MUG), 3-cianoumbeliferona- β-D-galactopiranosídeo, éster etílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico-e-D-galactopiranosídeo, éster metílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico-e-D-galactopiranosídeo, 3-(2-tienil)umbeliferona- β-Dgalactopiranosídeo, 4-metilumbeliferil fosfato, 3-cianoumbeliferil fosfato, etil umbeliferona-3carboxil fosfato, metil umbeliferona-3-carboxil fosfato, 3-(2-tienil)umbeliferil fosfato, 5-bromo-4cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosídeo (X-gal), 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP), ELF 97 Acetato (Invitrogen, Carlsbad, CA), ELF 97 Beta D Glicuronida (Invitrogen, Carlsbad, CA), e

ELF 97 Beta D Galactopiranosídeo (Invitrogen, Carlsbad, CA).

O produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida e uma básica.

Em geral, a espécie ácida de um produto detectável de forma fluorescente é um composto que pode doar um íon de hidrogênio (H+) a outro componente em solução; e uma espécie básica de um produto detectável de forma fluorescente é um composto que pode aceitar um íon de hidrogênio (H⁺) de outro componente em solução. Em modalidades, um produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida que é neutra e uma espécie básica que é aniônica. Em modalidades, um produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida que é catiônica e uma espécie básica que é neutra.

As espécies ácida e básica de um produto detectável de forma fluorescente podem ab30 sorver luz de forma diferente (ou na quantidade de energia absorvida, o comprimento de onda, ou ambos), podem emitir luz de forma diferente (ou em intensidade, o comprimento de onda de emissão, ou ambos) ou podem absorver e emitir luz de forma diferente. A figura 1A mostra o espectro de absorbância de soluções de 4-metilumbeliferona (4-MU) em pHs de 2,5 a 8,0. Como pode ser observado, a absorbância varia enormemente ao longo da faixa de comprimento de onda monitorada (260 nanômetros a 440 nanômetros). A um comprimento de onda de cerca de 332 nanômetros (nm), a absorbância não varia significativamente ao longo de toda a faixa de pH. Esse comprimento de onda, 332 nm para 4-MU, é mencionado neste documento como o

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9/25 ponto isosbéstico de excitação. O ponto isosbéstico de excitação é o comprimento de onda no qual a absorbância das espécies ácida e básica do produto detectável de forma fluorescente é substancialmente igual. O ponto isosbéstico de excitação de um produto detectável de forma fluorescente também é mencionado neste documento como ExAiso.

A excitação de uma solução contendo um produto detectável de forma fluorescente no ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) pode fornecer uma resposta florescente independente de pH. Em modalidades, uma amostra incubada pode ser irradiada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso. Em modalidades, a luz que tem um comprimento de onda ExAiso pode se referir à luz que tem um comprimento de onda de pico de ±

10 nm de ExAiso. Em modalidades, a luz que tem um comprimento de onda ExAiso pode se referir à luz que tem um comprimento de onda de pico de ± 5 nm de ExAiso. Em modalidades, luz que tem um comprimento de onda ExAiso pode se referir à luz que tem um comprimento de onda de pico de ± 2 nm de ExAiso.

A amostra incubada pode ser irradiada com luz que tem um comprimento de onda

ExAiso para uma quantidade de tempo que é suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz. Em modalidades, a amostra incubada pode ser irradiada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso por frações de um segundo a dezenas de segundos. Em modalidades, a amostra incubada pode ser irradiada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso por cerca de um segundo a dezenas de segundos. Em modalida20 des que podem ser utilizadas com o Sistema de Monitoramento Biológico Attest™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA), uma amostra pode ser irradiada por cerca de um segundo, que pode ser tempo suficiente para obter uma amostra estavelmente excitada e integrar a intensidade de emissões. Em modalidades que podem ser utilizadas com o sistema de placa Petrifilm™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA), uma amostra pode ser irradiada por dezenas de segundos, que pode ser tempo suficiente para integrar a intensidade de emissão a fim de obter um sinal detectável acima do ruído de fundo.

Após a amostra incubada ser irradiada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso por um tempo suficiente, o produto detectável de forma fluorescente emitirá luz. A irradiação de um produto detectável de forma fluorescente com um comprimento de onda de luz que o mesmo absorve pode ser chamada de excitação. A excitação em um comprimento de onda além de ExAiso faz com que as espécies ácida e básica absorvam de forma diferente, e, portanto, a luz emitida também será diferente. Esse comportamento rende uma resposta fluorescente sensível a pH da maioria dos produtos detectáveis de forma fluorescente. Um exemplo desse fenômeno pode ser observado na figura 1B. A linha de35 signada 140 mostra a fluorescência (a 455 nm) de 4-metilumbeliferona (4-MU) com excitação a 360 nm em vários pHs de 2,5 a 8,0. Como pode ser observado, a fluorescência muda de forma dramática ao longo dessa faixa de pH. Iniciando em um pH de 6, a fluoresPetição 870190006032, de 18/01/2019, pág. 17/53

10/25 cência começa a aumentar substancialmente. Por essa razão, se aceita, de modo geral, que as medições de fluorescência de 4-MU deveriam ser feitas em um pH básico (geralmente de um pH de 8 a 10) com um comprimento de onda de excitação de cerca de 360 nm de modo que um sinal de fluorescência máxima seja obtido.

A linha designada 130 na figura 1B mostra a fluorescência (a 455 nm) de 4-MU com excitação a 330 nm em vários pHs de 2,5 a 8,0. Como pode ser observado, a fluorescência é quase constante dessa faixa de pH. A combinação dos resultados da figura 1A, que mostra que o ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) de 4-MU é cerca de 332 nm; e os resultados da figura 1B, que mostram que a fluorescência (a 455 nm) é substancialmente constante ao longo da faixa de pH de 2,5 a 8,0 mostram que a excitação de uma amostra no ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) pode fornecer uma resposta de fluorescência independente de pH.

A figura 1C mostra uma varredura de emissão (de 400 nm a 500 nm) de soluções de 4-MU em pHs de 2,5 a 8,0 após excitação a 330 nm. Conforme mostrado na figura 1C, a resposta fluorescente também é independente de pH já que o comprimento de onda de emissão não varia com pH. Esse fenômeno pode ser devido à fotodissociação de espécies neutras (no caso de 4-MU, a espécie ácida) seguido de transferência de próton para o solvente resultando em um ânion fotogerado (no caso de 4-MU, a espécie básica) que, então, emite em seu comprimento de onda característico.

Alguns produtos detectáveis de forma fluorescente exemplificadores e seus pon20 tos isosbésticos de excitação são os seguintes: 4-metilumbeliferona (4-MU) tem um ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) 330 nm; 3-ciano-7-hidroxicumarina (CyU) tem um ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) de cerca de 375 nm; éster etílico de ácido 7hidroxicumarina-3-carboxílico (EHC) tem um ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) de cerca de 370 nm; éster metílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico (MHC) tem um ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) de cerca de 370 nm; e 3-(2-tienil)umbeliferona (TU) tem um ponto isosbéstico de excitação (ExAiso) de cerca de 380 nm.

Com o uso de 4-MU como um exemplo, deslocando a frequência de excitação da comumente utilizada 360 nm para cerca de 330 nm (ExAiso) é possível eliminar a diminuição de 20 a 30 vezes na intensidade de fluorescência ao ir do pH 8 ao pH 5. A diminuição de intensidade pode ser eliminada em métodos apresentados sem a exigência de etapas adicionais (por exemplo, ajuste de pH).

Uma resposta de fluorescência independente de pH pode fornecer vantagens em vários métodos de análise. Por exemplo, a etapa de ajuste do pH da amostra de teste a ser analisada (cuja etapa é necessária em inúmeros métodos anteriormente utilizados) a um pH de 8 a 10 pode ser eliminada. Isso pode tornar a análise mais fácil, mais eficaz e de baixo custo. Por exemplo, vários tipos de bactérias, incluindo, por exemplo, E. Coli, Lactobacillus, e acetobacter, geram ácidos enquanto crescem, uma resposta independente de pH irá assegurar que

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11/25 os resultados não sejam influenciados por tais ácidos. Por exemplo, as amostras que têm níveis variantes de acidez podem ser testadas sem a necessidade de “neutraliza” as mesmas antes do teste. Por exemplo, uma diferença relativamente grande entre os comprimentos de onda de excitação e emissão pode permitir o uso de filtros ópticos baratos (por exemplo, filtros de absorção em oposição a filtros de interferência de faixa estreita mais dispendiosos). Por exemplo, as razões maiores entre sinal e ruído podem ser fornecidas devido a deslocamentos de Stokes superiores e cruzamento de caudas associado.

A excitação da amostra incubada pode ser realizada com o uso de qualquer fonte de luz capaz de fornecer luz que tem o comprimento de onda adequado (por exemplo,

ExAiso). As fontes de luz exemplificadoras podem incluir um diodo laser visível, um diodo emissor de luz visível (LED), um filamento incandescente, ou qualquer outra fonte de luz adequada. A fonte de luz também pode ser combinada com vários filtros e outros componentes ópticos que são comumente utilizados.

Em modalidades, uma fonte de luz pode ser escolhida de modo que uma quantidade relativamente insubstancial de luz esteja presente no comprimento de onda de detecção de emissão. Isso pode ser vantajoso já que pode minimizar a quantidade de luz detectada que é devido à fonte de excitação. Alternativamente, os componentes ópticos podem ser usados para eliminar por filtração uma porção da luz da fonte de luz de excitação. Em modalidades, uma fonte de luz de excitação, componentes ópticos, o comprimento de onda de detecção, um detector, ou alguma combinação dos mesmos são escolhidos de modo que substancialmente nenhuma luz da fonte de luz de excitação seja detectada e/ou atribuída por ser uma emissão de um produto detectável de forma fluorescente.

Uma vez que o produto detectável de forma fluorescente tenha sido excitado com luz que tem um comprimento de onda ExAiso durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, a luz emitida é, então, detectada. Em modalidades, a luz emitida pode ser detectada em pelo menos cerca de um par de minutos de excitação do produto detectável de forma fluorescente. Em modalidades, a luz emitida pode ser detectada em pelo menos cerca de um minute de excitação do produto detectável de forma fluorescente. Em modalidades que utilizam sensores à base de silicone (uma escolha comum para faixas de NIR até 1.000 nm), os tempos de integração podem ser de cerca de um minuto se um único resfriamento termoelétrico (TEC) for usado para resfriar o sensor a cerca de 30° abaixo das temperaturas ambientes.

A detecção da luz emitida pelo produto detectável de forma fluorescente excitado pode ser realizada tal como é de conhecimento geral. Os detectores, como tubos fotomultiplicadores, fotodiodos em avalanche, dispositivos de carga acoplada (CCDs), fotodiodos, ou outros dispositivos ativos, por exemplo, podem ser utilizados. O detector também pode ser combinado com vários filtros e outros componentes ópticos tal como são comumente utilizados.

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O comprimento de onda de luz emitida ser detectada pode depender, pelo menos em parte, do produto detectável de forma fluorescente particular. Conforme observado na figura 1C, um produto detectável de forma fluorescente (como 4-MU, por exemplo) emite luz, em várias quantidades, ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda. Em modalidades, a emissão pode ser detectada em um comprimento de onda que é próximo à emissão máxima. Alternativamente, outros comprimentos de onda (em adição a ou no lugar do comprimento de onda de emissão máxima) podem ser monitorados a fim de detectar a luz emitida. EmA1 pode ter qualquer comprimento de onda desejado, e pode ser escolhido com base, em parte, na intensidade das emissões em vários comprimentos de onda, no detector particular (custo, etc.) que pode ser utilizado, na interferência de outros componentes na amostra (por exemplo, o substrato de enzima), ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades, EmA1 pode ter o comprimento de onda no qual o produto detectável de forma fluorescente tem suas emissões de intensidade máximas. Tal EmA1 pode ser útil para minimizar possível interferência de sinais de fundo, diminuir limites de detecção, ou uma combinação dos mesmos. Seja qual comprimento de onda for selecionado para monitorar a emissão, pode ser chamado na presente invenção como o comprimento de onda de emissão, ou EmA1.

Em modalidades, um substrato de enzima pode ser escolhido, que tem um ExAiso e uma emissão máxima (que pode ser utilizado como EmA1) que são substancialmente afastados em termos de comprimento de onda (nanômetros). Em modalidades, um substrato de enzima pode ser escolhido que tem um ExAiso e uma emissão máxima (como EmA1) que são pelo menos afastados cerca de 20 nm. Em modalidades, um substrato de enzima pode ser escolhido que tem um ExAiso e uma emissão máxima (como EmA1) que são afastados pelo menos cerca de 30 nm. Em modalidades, um substrato de enzima pode ser escolhido que tem um ExAiso e uma emissão máxima (como EmA1) que são pelo menos afastados cerca de 40 nm.

O comprimento de onda particular no qual a emissão é monitorada (EmA1) também pode ser escolhido com base, em parte, na emissão do substrato de enzima. Por exemplo, em modalidades nas quais o substrato de enzima absorve no ponto isosbéstico, mas tem um espectro de emissão que é diferente do produto detectável de forma fluorescente, a excitação em ExAiso junto com a detecção em EmA1, onde EmA1 é escolhido de modo que o substrato de enzima não emita (ou substancialmente não emita), pode ser vantajosa. Tal cenário permite a detecção independente de pH do produto detectável de forma fluorescente, mas não do substrato de enzima. Diferentes produtos detectáveis de forma fluorescente (e/ou diferentes substratos de enzima) pode produzir diferentes comprimentos de onda mais vantajosos para uso como EmA1. Em modalidades, 4-metilumbeliferona β-D35 galactopiranosídeo (4-MUG), éster metílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico-e-Dgalactopiranosídeo (MHCgal), ou éster etílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico-e-Dgalactopiranosídeo (EHCgal) podem ser excitados a ExAiso e o produto detectável de forma

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13/25 fluorescente pode ser detectado (EmA1) em um comprimento de onda comumente utilizado, 455 nm sem detecção substancial do substrato de enzima.

Uma vez que a luz emitida foi detectada (em EmA1), várias etapas adicionais podem ser opcionalmente executadas. Uma etapa opcional é aquela na qual a luz emitida pode ser quantificada a fim de estimar a quantidade de micro-organismos na amostra de teste. Isso pode ser realizado ao comparar a intensidade integrada de luz emitida da amostra de teste à intensidade integrada de luz emitida (sob condições iguais) de uma ou mais de uma amostras padrão que têm quantidades conhecidas de micro-organismos. Uma comparação relativa também pode ser executada, por exemplo, ao comparar a intensidade fluorescente em dois instantes diferentes (por exemplo, antes e após um procedimento de esterilização).

Outra etapa adicional que pode ser opcionalmente executada é formar uma imagem da luz detectada. Em uma modalidade, um CCD (ou outro detector) que tem inúmeros elementos detectores fotossensíveis individualmente direcionáveis pode permitir a coleta de dados fluorescentes do sensor ou conjunto de sensor em uma base pixel por pixel. Esse conjunto pode ser usado em combinação com uma fonte de iluminação e componentes ópticos de coleta apropriados para obter uma imagem de, por exemplo, sítios de crescimento de colônias microbianas em uma superfície bidimensional inoculada (por exemplo, uma placa Petrifilm™ 3M™) que inclui substratos de enzima conforme revelado no presente documento. A imagem eletrônica resultante pode ser transmitida para a montagem de processador, na qual o software para análise de imagens pode ser usado para acentuar o contraste da imagem e para contar o número de pontos fluorescentes automaticamente (ou um usuário pode contar o número de pontos manualmente).

A figura 2 apresenta modalidades exemplificadoras de métodos revelados no presente documento. As modalidades de métodos apresentados podem incluir a etapa 201, que incuba uma amostra de teste com substrato de enzima, a etapa 203, que excita um produto detectável de forma fluorescente na amostra de teste com luz incubada que tem um comprimento de onda ExAiso, e a etapa 205, que detecta a luz emitida em EmA1.

Uma etapa opcional, a etapa 207, pode ser adicionada a tal método antes da etapa 201. A etapa 207 inclui processar uma amostra para formar uma amostra de teste; conforme discutido acima, tal processamento pode incluir filtragem, digestão, extração e similares.

Outra etapa opcional, a etapa 209, pode ser adicionada a tal método após a etapa

205. A etapa 209 inclui quantificar os micro-organismos na amostra de teste; conforme discutido acima, tal quantificação pode incluir o uso de amostras de concentrações conhecidas de micro-organismos, por exemplo, ou pode ser uma comparação relativa (isto é, obter mais ou menos o resultado).

Outra etapa opcional, a etapa 211, pode ser adicionada a tal método após a etapa 205. A etapa 211 inclui a formação de uma imagem da luz emitida; conforme discutido acima,

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14/25 a formação de uma imagem pode incluir o uso de detectores direcionáveis e componentes ópticos de coleta. Em modalidades nas quais a etapa 211 é executada, o método pode incluir, ainda, a etapa 213, que pode ser executada após a etapa 211. A etapa 213 inclui contar colônias de micro-organismo da imagem; conforme discutido acima, tal contagem de colônia pode ser feita automaticamente por um processador em comunicação com os componentes eletrônicos formadores de imagem ou pode ser feita manualmente por um usuário.

Deve-se observar que qualquer combinação das etapas discutidas acima pode ser executada nos métodos revelados no presente documento. Além disso, qualquer combinação de etapas discutidas acima pode ser repetida com o uso de diferentes amostras de teste (ou da mesma amostra de teste).

Os métodos revelados no presente documento podem também incluir etapas de irradiar a amostra incubadas em comprimentos de onda em adição a ExAiso. Tal exemplo inclui irradiar a amostra incubada em um comprimento de onda de ExA2 durante tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz. O comprimento de onda chamado na presente invenção de ExA2 pode ser a absorção máxima das espécies básicas do produto detectável de forma fluorescente, a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente, ou algum outro comprimento de onda. Por exemplo, o produto detectável de forma fluorescente 4-MU, tem uma absorção máxima das espécies básicas em cerca de 360 nm, e uma absorção máxima das espécies ácidas em cerca de 320 nm; o produto detectá20 vel de forma fluorescente CyU tem uma absorção máxima das espécies básicas de cerca de 405 nm, e uma absorção máxima das espécies ácidas em cerca de 355 nm.

A excitação a ExAiso e ExA2 por tempo suficiente para fazer com que o produto marcado fluorescentemente emita luz pode ocasionar as emissões do mesmo comprimento de onda (deve-se observar que emissões em diferentes comprimentos de onda também podem ocorrer).

Em modalidades, as excitações a ExAiso e ExA2 não são feitas no mesmo instante, mas em tempos separados. A detecção da luz emitida independente (ocasionada pela excitação a ExAiso e ExA2) também pode ocorrer em tempo separado. Uma vez que as emissões separadas (ocasionadas pela excitação a ExAiso e ExA2) são detectadas, mas as mesmas podem ser utilizadas de várias formas diferentes. Em modalidades, as duas emissões podem ser utilizadas da mesma forma, como forma de dupla verificação dos resultados.

Em modalidades, as duas emissões podem ser utilizadas para determinar um número adimensional que pode ser utilizado para fornecer uma resposta que não depende na medição da intensidade fluorescente absoluta. Isso pode ser realizado ao determinar uma razão que é a razão entre a emissão causada por ExAiso e a emissão causada por ExA2. A escolha de numerador e denominador é irrelevante; entretanto, se a escolha permanece constante, a razão pode ser usada para comparar resultados de amostra em amostra.

Em modalidades, outro método relativo pode ser utilizado, através do qual a variaPetição 870190006032, de 18/01/2019, pág. 22/53

15/25 ção na intensidade de excitação (ExAiso) pode ser compensada através do monitoramento da intensidade de excitação enquanto integra o sinal de emissão (EmA1). Tal modalidade pode ser utilizada junto com o Sistema de Monitoramento Biológico Attest™ 3M™. Em modalidades de tal método utilizado junto com o Sistema de Monitoramento Biológico Attest™

3M™, os dois grupos de dados podem ser matematicamente processados em um microprocessador no ™ Autoreader™ Rapid Attest3M™ (3M Co., St. Paul, MN).

Em modalidades, a excitação da amostra incubada em dois comprimentos de onda de excitação diferentes (ExAiso e ExA2) pode ser utilizada não apenas para determinar a quantidade de micro-organismos na amostra de teste, mas também para monitorar o pH da amostra incubada ao longo do tempo. Tal é o caso devido ao fato de que ExA2 monitora, por essência, a quantidade das espécies ácida ou básica (presumindo que um comprimento de onda em que pelo menos uma ou ambas as espécies absorvam sejam utilizadas como ExA2) como uma função de tempo. O monitoramento do pH pode ser outro método para monitoramento de crescimento de micro-organismo, atividade metabólica ou uma combinação dos mesmos.

A figura 3 apresenta modalidades exemplificadoras de métodos revelados no presente documento. As modalidades de métodos apresentados podem incluir a etapa 301, que incuba uma amostra de teste com substrato de enzima, a etapa 303, que excita um produto detectável de forma fluorescente na amostra de teste com luz incubada que tem um com20 primento de onda ExAiso, a etapa 305, que detecta a luz emitida (EmA1) como um resultado de ExAiso, a etapa 307, que excita um produto detectável de forma fluorescente na amostra de teste com luz incubada que tem um comprimento de onda de ExA2, e a etapa 309, que detecta a luz emitida (EmA1) como um resultado de ExA2. Em modalidades, a etapa 307 e a etapa 309 podem ser realizadas antes das etapas 303 e 305.

Uma etapa opcional, a etapa 311, pode ser adicionada a tal método após a etapa

309. A etapa 311 inclui determinar uma razão entre a emissão ocasionada por ExAiso e a emissão ocasionada por ExA2. Tal razão pode servir ao propósito de fornecer um número adimensional que não é baseado na intensidade fluorescente. Etapas opcionais como aquelas discutidas acima em relação à figura 2 também podem ser incluídas em métodos como aqueles exemplificados na figura 3. Deve-se observar que qualquer combinação das etapas discutidas acima pode ser executada em métodos revelados no presente documento. Além disso, qualquer combinação de etapas discutidas pode ser repetida com o uso de diferentes amostras de teste (ou da mesma amostra de teste).

Em modalidades, a razão entre a emissão a ExAiso e ExA2 pode indicar coisas que não a quantidade de organismos na amostra. Em modalidades nas quais o substrato de enzima emite fortemente quando excitado a ExAiso (por exemplo, TUgal), a razão entre a emissão a ExAiso e ExA2 pode indicar a quantidade de organismos presentes devido ao

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16/25 fato de que a razão será amplamente invariante com atividade enzimática (ao contrário da excitação próxima ao ânion max). Em modalidades nas quais há uma interferência mínima do substrato de enzima na frequência de excitação (ExAiso e ExA2), então, a razão entre a emissão de ExAiso e ExA2 pode indicar um nível de pH. Para alguns organismos que ge5 ram ácido, uma mudança no pH indica sua presença.

Os métodos revelados no presente documento podem também incluir etapas opcionais de detecção de diferentes comprimentos de onda de emissão. Conforme discutido acima, uma vez que a amostra é irradiada com luz que tem um comprimento de onda de ExAiso, o produto detectável de forma fluorescente emitirá luz. Conforme observado na figura 1C, por exemplo, o produto detectável de forma fluorescente pode emitir luz ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda. Os métodos revelados no presente documento incluem uma etapa de detectar luz emitida de um comprimento de onda EmA1, sendo que tais métodos podem, opcionalmente, incluir uma etapa adicional de detecção de luz emitida em um segundo comprimento de onda diferente. O comprimento de onda adicional de luz emitida que pode ser detectado é mencionado neste documento como EmA2.

EmA2 pode ter qualquer comprimento de onda desejado, e pode ser escolhido com base, em parte, na intensidade das emissões em vários comprimentos de onda, no detector particular (custo, etc.) que pode ser utilizado, na interferência de outros componentes na amostra (por exemplo, o substrato de enzima), no comprimento de onda EmA1 ou uma com20 binação dos mesmos. Em modalidades, EmA2 pode ser o comprimento de onda no qual o produto detectável de forma fluorescente tem suas emissões de intensidade máximas (se tal comprimento de onda não for utilizado como EmA1). Tal EmA2 pode ser útil para minimizar possível interferência de sinais de fundo, diminuir limites de detecção, ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades, EmA2 pode ser o comprimento de onda no qual a emissão do produto detectável de forma fluorescente é independente de pH, ou estabelecido de outro modo, do ponto de emissão isosbéstico (EmAiso). Tal EmA2 pode ser útil para compensar um fotoácido fraco que tem emissão significativa das espécies ácida e básica, que renderia, de outra forma, uma resposta dependente de pH.

Em modalidades, EmA2 é escolhido de modo que a quantidade de luz emitida pe30 lo produto detectável de forma fluorescente seja pelo menos maior que a quantidade de luz emitida pelo substrato de enzima. Em modalidades, EmA2 é escolhido de tal modo que a quantidade de luz emitida pelo produto detectável de forma fluorescente seja substancialmente maior que a quantidade de luz emitida pelo substrato de enzima. Tal EmA2 pode ser útil para minimizar a interferência de fundo do substrato de enzima que não foi clivado por enzimas em micro-organismos.

Em modalidades, as detecções em EmA1 e EmA2 não são feitas no mesmo instante, mas em instantes separados. A excitação do produto detectável de forma fluorescente (por

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ExAiso, por exemplo) também pode ocorrer em instantes separados. As emissões em EmA1 e EmA2 podem ser utilizadas de várias formas diferentes. Em modalidades, as duas emissões podem ser utilizadas da mesma foram, como forma de uma dupla verificação dos resultados.

Em modalidades, as duas emissões podem ser utilizadas para determinar um nú5 mero adimensional que pode ser utilizado para fornecer uma resposta que não depende da medição de intensidade fluorescente absoluta. Isso pode ser realizado ao determinar uma razão que é a razão entre a emissão em EmA1 e a emissão em EmA2. A escolha de numerador e denominador é irrelevante; no entanto, se a escolha permanece constante, a razão pode ser usada para comparar resultados de amostra em amostra.

A figura 4 apresenta modalidades exemplificadoras de métodos revelados no presente documento. As modalidades de métodos apresentados podem incluir a etapa 401, que incuba uma amostra de teste com substrato de enzima, a etapa 403, que excita um produto detectável de forma fluorescente na amostra de teste incubada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso, a etapa 405, que detecta a luz emitida em EmA1 como um resultado de ExAiso, a etapa 407, que excita um produto detectável de forma fluorescente na amostra de teste incubada com luz que tem um comprimento de onda ExAiso, e a etapa 409, que detecta a luz emitida em EmA2 como um resultado de ExAiso.

Uma etapa opcional, a etapa 411, pode ser adicionada a tal método após a etapa 409. A etapa 411 inclui determinar uma razão entre EemA1 e EmA2. Etapas opcionais co20 mo aquelas discutidas acima em relação à figura 2 também podem ser incluídas em métodos como aqueles exemplificados pela figura 4. Deve-se observar que qualquer combinação das etapas discutidas acima pode ser executada em métodos revelados no presente documento. Além disso, qualquer combinação de etapas discutidas pode ser repetida com o uso de diferentes amostras de teste (ou da mesma amostra de teste).

Os kits também são revelados no presente documento. Os kits conforme revelado no presente documento podem incluir substrato de enzima e uma fonte de luz. O substrato de enzima conforme discutido acima pode estar incluído nesses kits revelados. Em geral, o substrato de enzima inclui um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente, em que os micro-organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o gru30 po hidrolisável do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente em que o produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida e uma básica. Em modalidades, o substrato de enzima pode ser definido mais especificamente como acima. Em modalidades, o substrato de enzima pode ser incluído como um componente do meio de crescimento que também pode ser incluído em um kit revelado.

Kits conforme revelado no presente documento também incluem uma fonte de luz. A fonte de luz é pelo menos capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda ExAiso. As fontes de luz exemplificadoras podem incluir um diodo de luz visível, um diodo emissor de luz

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18/25 visível (LED), um filamento incandescente, um diodo emissor de luz orgânico (OLED), ou qualquer outra fonte de luz adequada. Em modalidades, LEDs baratos podem ser utilizados como uma fonte de luz em kits revelados. A fonte de luz pode também ser combinada com ou usada em combinação com vários filtros e componentes ópticos que são comumente utilizados.

A fonte de luz incluída no kit pode também ser capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda de ExA2, em que ExA2 pode ser a absorção máxima das espécies básicas do produto detectável de forma fluorescente, a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente, ou algum outro comprimento de onda. Alternativamente, uma segunda fonte de luz capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda de ExA2 pode ser incluída em kits revelados. Nas últimas modalidades, o kit pode incluir pelo menos duas fontes de luz, uma capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda ExAiso; e uma segunda capaz de fornecer luz que tem um comprimento de onda de ExA2, em que ExA2 pode ser a absorção máxima das espécies básicas do produto detectável de forma fluorescente, a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente, ou algum outro comprimento de onda.

Kits conforme revelado no presente documento podem também incluir recipientes configurados para misturar pelo menos o substrato de enzima e a amostra a ser testada. Em modalidades, o recipiente opcional pode vir pré-carregado com o substrato de enzima; ou, em modalidades, o recipiente opcional pode vir pré-carregado com um meio de cres20 cimento contendo o substrato de enzima. Um exemplo de um recipiente que pode ser précarregado com um meio de crescimento contendo o substrato de enzima são as placas Petrifilm™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA). Outro exemplo de um recipiente que pode ser pré-carregado com um meio de crescimento contendo substrato de enzima é o Sistema de Monitoramento Biológico Attest™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA). Alternativa25 mente, um recipiente pode, opcionalmente, ser fornecido junto com substrato de enzima separadamente embalado, ou misturado com meio de crescimento ou não.

Os kits revelados também podem, opcionalmente, incluir um detector. Podem ser utilizados detectores, como tubos fotomultiplicadores, fotodiodos em avalanche, dispositivos acoplados a carga (CCDs), fotodiodos, ou outros dispositivos ativos, por exemplo. O detector pode também ser combinado com ou usado em combinação com vários filtros e componentes ópticos comumente utilizados. Um detector que pode ser opcionalmente incluído em kits revelados pode ser capaz de detectar um ou mais de um comprimento de onda de luz emitida. Alternativamente, mais de um detector pode opcionalmente ser incluído.

Os kits revelados pode também opcionalmente incluir outros componentes incluindo, por exemplo, componentes de formação de imagens (por exemplo, para formação de imagem da luz emitida detectada), processador(s), ou ajuda para coleta ou preparação de amostra. Em modalidades, um ou mais processadores podem ser utilizados ou configurados para processar

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19/25 imagens de componentes de formação de imagem para limpar as imagens ou automaticamente contar as colônias; para fornecer saída indicando a presença ou ausência de micro-organismos na amostra de teste; para controlar uma fonte(s) de luz, detector(s), componentes ópticos, ou alguma combinação dos mesmos; ou alguma combinação dos mesmos.

Os kits revelados podem ser configurados para trabalhar em conjunto com ou podem ser incluídos junto com sistemas atualmente utilizados como a linha de produtos Petrifilm™ 3M™, o Sistema de Monitoramento Biológico Attest™ 3M™, o SPECTRA MAX M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA), e o Sistema Clean-Trace™ 3M™ (3M Co., St. Paul, MN, EUA).

Em modalidades de kits revelados, o produto detectável de forma fluorescente pode 10 ser um derivado de cumarina. Em modalidades, o produto detectável de forma fluorescente pode ser 4-metilumbeliferona e ExAiso (o comprimento de onda da fonte de luz é capaz de gerar) pode ser cerca de 330 nm. Em modalidades, o produto detectável de forma fluorescente pode ser 3-ciano-7-hidroxicumarina e ExAiso (o comprimento de onda da fonte de luz é capaz de gerar) pode ser cerca de 375 nm. Em modalidades, o produto detectável de for15 ma fluorescente pode ser éster de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico e ExAiso (o comprimento de onda da fonte de luz é capaz de gerar) pode ser cerca de 370 nm. Em modalidades, o produto detectável de forma fluorescente pode ser 3-(2-tienil)umbeliferona e ExAiso (o comprimento de onda da fonte de luz é capaz de gerar) pode ser cerca de 380 nm.

Exemplos

Materiais e Métodos

Exceto onde especificado em contrário, todos os produtos químicos foram obtidos junto à Aldrich, e foram usados sem purificação adicional.

Todas as partes, porcentagens, razões, etc. nos exemplos são expressas em peso, salvo se indicado de outra maneira. Solventes e outros reagentes usados foram obti25 dos a partir de Sigma-Aldrich Chemical Company; Milwaukee, WI, EUA, exceto onde especificado de forma diferente.

Materiais

Éster etílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico (EHC) foi preparado de acordo com Chilvers et. al. J. Appl. Microbiology 2001,91, 1.118 a 1.130.

3-(2-tienil)umbeliferona (TU) foi preparada como na Patente n° U.S. 6.372.895 (Bentsen et al.).

3- (2-tienil)umbeliferona galactosídeo (TUgal) foi preparada como na Patente n° U.S. 6.372.895 (Bentsen et al.).

β-D-galactosidase foi adquirida junto a EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA, EUA).

Exemplo 1

4- metilumbeliferona (4-MU) foi dissolvida em sulfóxido de dimetila (DMSO) em uma concentração de 1 mg/ml. Uma placa de 96 cavidades foi preparada com cada caviPetição 870190006032, de 18/01/2019, pág. 27/53

20/25 dade contendo 100 μΙ de tampão de fosfato a 100 mmolares em valores de pH que se situam na faixa de 8,0 a 2,5. 10 μl da solução de 4-MU foi adicionado a cada uma das cavidades. Um conjunto de cavidades diluídas a 10X também foi preparado para eliminar artefatos devido ao autoarrefecimento brusco do fluoróforo em concentrações elevadas. As cavidades diluídas a 10X foram preparadas mediante diluição da solução a 1 mg/ml em 0,1 mg/ml com DMSO e, então, com a adição de 10 μΙ dessa solução a 100 μΙ de tampão de fosfato a 100 mmolares em cada uma das cavidades.

Os espectros de absorção de 250 a 500 nm foram registrados com o uso de um leitor de placa fluorescente SPECTRAMAX M5 (disponível junto à Molecular Devices, Sunnyvale, CA,

EUA). Os resultados para os espectros de absorção são mostrados na figura 1A. Esses resultados demonstraram que a absorção das espécies de 4-MU neutro (formadas em um baixo pH) é baixa em comprimentos de onda próximos à absorção máxima para o ânion (formado em um pH elevado). A absorção máxima do 4-MU neutro ocorre em cerca de 320 nm e há um ponto isosbéstico (onde a absorbância é invariante com a composição) em cerca de 330 nm.

A emissão em vários comprimentos de onda também foi medida com o leitor de placa fluorescente SPECTRAMAX M5. A figura 1C mostra a emissão resultante para as amostras diluídas a 10X como uma função de comprimento de onda de emissão para um comprimento de onda de excitação de 331 nm e para vários valores de pH. Esses resultados demonstram que a excitação próxima ao ponto isosbéstico (cerca de 330 nm) fornece uma resposta fluorescente que é amplamente invariante com o valor de pH ao longo da faixa estudada (2,5 a 8). A emissão máxima ocorreu em um comprimento de onda de 450 nm.

Para comparação, a emissão também foi medida como uma função de valor de pH para um comprimento de onda de excitação de 360 nm, que está próximo ao comprimento de onda de absorção máximo para o ânion. A figura 1B mostra emissão em cerca de 450 nm como uma função de pH para um comprimento de onda de excitação de 360 nm e 331 nm (aproximadamente no ponto isosbéstico).

Exemplo 2

Placas de 96 cavidades foram preparadas como no Exemplo 1, mas com 3-ciano7-hidroxicumarina (CyU) substituído por 4-MU. Os espectros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

Os espectros de absorção de CyU em vários valores de pH foram obtidos (não mostrado). Os espectros de emissão foram determinados em vários valores de pH para CyU em três diferentes comprimentos de onda de excitação, correspondentes à absorbância máxima das espécies neutras (355 nm), ao ponto isosbéstico (375 nm) (mostrado na figura 5A) ou à máxima absorbância de ânion (405 nm). O comprimento de onda de emissão máxima foi cerca de 455 nm quando o comprimento de onda de excitação era 375 nm. A figura 5B mostra emissão em um comprimento de onda de 455 nm como uma função de valor de pH

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21/25 para comprimentos de onda de excitação de 355 nm, 375 nm (aproximadamente no ponto isosbéstico), e 405 nm. A fluorescência foi aproximadamente independente do valor de pH quando a excitação estava no ponto isosbéstico.

A razão entre a intensidade de emissão de pico registrada em diferentes comprimen5 tos de onda de excitação foi determinada. Conforme mostrado na figura 5C, isso rende um número adimensional que é dependente de forma sensitiva do pH. Isso fornece uma resposta de pH sensível que não depende da medição de intensidade fluorescente absoluta.

Exemplo 3

Éster etílico de ácido 7-hidroxicumarina-3-carboxílico (EHC) foi dissolvido em sul10 fóxido de dimetila (DMSO) em uma concentração de 1 mg/ml. Uma placa de 96 cavidades foi preparada com cada cavidade contendo 100 ql de tampão de fosfato a 100 mmolares em valores de pH que se situam na faixa de 8,0 a 2,5. 10 ql da solução de EHC foi adicionado a cada uma das cavidades. As cavidades diluídas a 10X foram preparadas retirar 10 ql das cavidades preparadas na concentração inicial, e com a adição disto a 90 ql de tampão na concentração adequada. Os espectros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

Os espectros de absorção de EHC em vários valores de pH foram obtidos (não mostrado). verificou-se que o ponto isosbéstico ocorre em cerca de 370 nm. A fluorescência como uma função de pH para as amostras de EHC diluídas a 10X é mostrada na figura 6 com um comprimento de onda de excitação de 370 nm e, para comparação, com um comprimento de onda de excitação de 400 nm (absorbância máxima de ânion). A fluorescência foi aproximadamente constante quando excitada no ponto isosbéstico.

Exemplo 4

As placas de 96 cavidades foram preparadas como no Exemplo 1, mas com 3-(225 tienil)umbeliferona (TU) substituído por 4-MU. TU é descrito nas Patentes n° U.S. 6.372.895 (Bensten et al.) e 6.566.508 (Bensten et al.) que estão por meio desta incorporadas, a título de referência. Os espetros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1, 2, e 3.

Os espectros de absorção das amostras de TU a 10X em vários valores de pH são mostrados na figura 7A. Verificou-se que o ponto isosbéstico ocorria em cerca de

380 nm. Os picos de absorção foram, em geral, de 5 a 10 nm deslocados para região vermelha comparado a CyU e EHC.

Os espectros de emissão foram obtidos para vários valores de pH para TU em três diferentes comprimentos de onda de excitação, 405 nm (ânion máximo, para comparação), 380 nm (ponto isosbéstico - mostrado na figura 7B), e 365 nm (espécies neutras máxima, para comparação). A banda de emissão de ânion foi deslocado na região vermelha 40 nm a cerca de 495 nm comparado a 455 nm para os Exemplos 1 e 2. O deslocamento de Stokes para a espécie aniônica foi determinado em aproximadamente 90 nm.

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Quando as amostras em baixo pH foram excitadas a 405 nm (absorbância máxima de ânion), a emissão a 495 nm diminuiu e o pico máximo foi deslocado para a região azul cerca de 30 nm a 465 nm. O deslocamento para a região azul foi mais aparente quando o comprimento de onda de excitação foi ajustado no ponto isosbéstico (380 nm, figura 7B) ou nas espécies neu5 tras máxima (365 nm). Esses resultados indicam que, em baixos valores de pH, há emissão considerada do estado de excitação do TU neutro, além daquele do ânion fotogerado.

Embora haja variação nos espectros de emissão com valores de pH variantes quando TU foi excitado no ponto isosbéstico para absorção, houve um ponto isosbéstico para emissão (cerca de 490 nm, consulte figura 7B) onde a emissão não depende do pH. A fluorescência co10 mo uma função de pH para as amostras de TU é mostrada na figura 7C para comprimentos de onda de excitação de 380 nm e 405 nm e para comprimentos de onda de emissão de 490 nm e 500 nm. A fluorescência foi aproximadamente independente de pH quando excitada no ponto isosbéstico de absorção (380 nm) e medida no ponto isosbéstico de emissão (490 nm).

Exemplo 5

Sais dissódicos de fosfato de 4-metilumbeliferona (4-MUP) foram dissolvidos em água em uma concentração de 1 mg/ml. Uma placa de 96 cavidades foi preparada com cada cavidade contendo 100 ql de tampão de fosfato a 100 mmolares em valores de pH que se situam na faixa de 8,0 a 2,5. 10 ql da solução de MUP foi adicionado a cada uma das cavidades. Um conjunto de cavidades diluídas a 10X também foi preparado para eli20 minar artefatos devido ao autoarrefecimento brusco do fluoróforo em concentrações elevadas. As cavidades diluídas a 10X foram preparadas mediante diluição da solução a 1 mg/ml em 0,1 mg/ml com água e, então, com a adição de 10 ql dessa solução a 100 ql de tampão de fosfato a 100 mmolares em cada uma das cavidades. Os espetros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

Verificou-se que 4-MUP tinha notável absorção no ponto isosbéstico do corante de 4-MU (cerca de 330 nm), mas absorção mínima no ânion máximo (cerca de 360 nm). O espectro de absorção de MUP mostrou pouca dependência de pH e a absorção no ponto isosbéstico foi apenas cerca de % a U daquela do corante livre.

A emissão máxima ocorreu em cerca de 390 nm para a faixa de valores de pH con30 siderada. A emissão foi muito pequena no comprimento de onda de emissão característico de 4-MU (455 nm). Isso significa que a presença de 4-MUP não reagido não aumentaria significativamente o sinal de fundo quando a presença de 4-MU é medida.

Exemplo 6

4-metilumbeliferona-e-D-galactosídeo (4-MUG) foi dissolvido em sulfóxido de dime35 tila (DMSO) em uma concentração de 0,1 mg/ml. Uma placa de 96 cavidades foi preparada com cada cavidade contendo 100 ql de tampão de fosfato a 100 mmolares em valores de pH que se situam na faixa de 2,5 (coluna 1) até 8,0 (coluna 12). 10 ql da solução de 4-MUG

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23/25 foi adicionado a cada cavidade nas primeiras quatro fileiras. Duas dessas fileiras foram adicionalmente tratadas com 10 μl de uma solução reagente contendo mercaptoetanol (1,4% em v/v), mgCl2 (2% em p/p) e b-D-galactosidase (80 mg/ml). 10 μl de uma solução a 0,1 mg/ml de 4-MU em DMSO foi adicionado a duas fileiras mais para comparação. Os es5 petros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

Os espectros de absorção de 4-MUG com e sem galactosidase foram obtidos. O espectro de 4-MUG na ausência de β-D-galactosidase adicionada mostrou pouca dependência de pH e foi similar àquele de 4-MU em solução ácida, isto é: aquele do 4-MU neutro. Consequentemente, 4-MUG absorve fortemente no ponto isosbéstico de corante de 4-MU (cerca de 330 nm), mas minimamente no ânion máximo (cerca de 360 nm).

Os espectros de emissão (excitação de 335 nm) para 4-MUG na ausência e presença de β-D-galactosidase também foram obtidos para valores de pH de 2,5 a 8. A emissão máxima foi baixa e ocorreu em cerca de 390 nm na ausência de enzima, com muito pouca intensidade no comprimento de onda de emissão característico de 4-MU (455 nm).

Na presença da enzima β-D-galactosidase, um pico de emissão foi observado a 455 nm correspondente à emissão do ânion de 4-MU livre.

A emissão a 455 nm (com uma excitação no comprimento de onda isosbéstico de 355 nm) para 4-MU, bem como 4-MUG na ausência e presença de β-D-galactosidase é mostrada na figura 8A como uma função de pH. A emissão para 4-MUG + β-D-galactosidase cai lentamente abaixo de pH 7, consistente com a atividade relatada da enzima (Sungur e Akbulut, J. Chem. Tech Biotechnol. 1994, 59, 303 a 306). Todavia, foi observada intensidade útil pelo menos tão baixo quanto pH 5. Para comparação, a emissão resultante da excitação no ânion máximo (cerca de 360 nm) é mostrada na figura 8B. Nesse caso, a emissão foi muito baixa em valores de pH ácido e aumentou rapidamente acima de pH 7.

Esse exemplo demonstrou a capacidade de usar MUG para efetivamente detectar b-D-galactosidase ao longo de uma ampla gama de valores de pH sem ajustar as frequências de excitação ou emissão ao excitar no ponto isosbéstico do corante.

Exemplo 7

Metil 7-hidroxicumarina-3-carboxilato galactosídeo (MHCgal) foi preparado através da reação de EHC com α-acetobromo-D-galactose e, então, da hidrolisação do galactosídeo protegido com metóxido de sódio, conforme descrito em Chilvers (J. Appl. Microbiology 2001,91, 1.118 a 1.130). MHCgal foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) em uma concentração de 1,0 mg/ml, e, então, 10 μl colocado em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades preparada com cavidades contendo 100 μl de tampão de fosfato a

100 mmolares em níveis de pH na faixa de 8,0 a 2,5. Metade das fileiras foi adicionalmente tratada com 10 μl de uma solução reagente contendo mercaptoetanol (1,4% em v/v), mgCl2 (2% em p/p) e β-D-galactosidase (80 mg/ml). 10 μl de cada cavidade dessa placa

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24/25 foi, então, adicionado à cavidade correspondente de outra placa contendo 100 μΙ do tampão de fosfato com o pH adequado nas cavidades criando uma placa de diluição a 10X. Os espetros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

Os espectros de absorção de MHCgal com e sem β-D-galactosidase foram obti5 dos. O espectro de MHCgal na ausência de β-D-galactosidase adicionada não mostrou dependência de pH ao longo da faixa de pH testada, e demonstrou uma absorbância máxima em cerca de 340 nm. Com β-D-galactosidase adicionada, a absorção deslocou para 350 nm para o pH 5 a 6 e para 400 nm para valores alcalinos. Isso é consistente com a absorção máxima para as espécies de EHC neutras e aniônicas.

Os espectros de emissão para MHCgal (com um comprimento de onda de excitação de 370 nm) na ausência e presença de β-D-galactosidase foram obtidos para valores de pH de 2,5 a 8. A emissão foi baixa sem enzima, com muito pouca emissão no comprimento de onda de emissão característico de simples cumarinas (~ 450 nm). Na presença da enzima β-D-galactosidase, um forte pico de emissão foi observado a 445 nm corres15 pondente à emissão do ânion de MHC livre.

A emissão a 445 nm (para excitação no ponto isosbéstico a 370 nm, e, para comparação, para excitação no ânion máximo a 400 nm) para MHCgal na ausência e presença de β-Dgalactosidase é mostrada na figura 9 como uma função de pH. Na presença de β-Dgalactosidase, a emissão de MHCgal quando excitado a 370 nm é substancial e constante de um pH de cerca de 5 e superior. Em contraste, a excitação do ânion máximo resultou na emissão que foi muito baixa em baixos valores de pH, mas aumentou gradualmente de pH 6.

Esse exemplo demonstrou a capacidade de usar MHCgal para efetivamente detectar β-D-galactosidase ao longo de uma ampla gama de valores de pH sem ajustar as frequências de excitação ou emissão ao excitar no ponto isosbéstico do corante.

Exemplo Comparativo 8

3-(2-tienil)umbeliferona galactosídeo (TUgal) foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) em uma concentração de 0,1 mg/ml. Uma placa de 96 cavidades foi preparada com cavidades contendo 100 μl de tampão de fosfato a 100 mmolares em valores de pH na faixa de 8,0 a 2,5. 10 μl da solução de TUgal foi adicionado a cada uma das cavidades, e, então, metade das fileiras foi adicionalmente tratada com 10 ml de uma solução reagente contendo mercaptoetanol (1,4% em v/v), mgCk (2% em p/p) e β-galactosidase (80 μg/ml). Os espetros de absorção e emissão foram medidos como no Exemplo 1.

A emissão para TUgal a 490 nm (excitação a 380 nm) e 500 nm (excitação a 410 nm) na presença e ausência de β-D-galactosidase é mostrada na figura 10 como uma função de pH. Quando medido nas frequências isosbésticas para TU (380 ex, 490 em; vide Exemplo 4) TUgal possuiu emissão comparável ao TU, o próprio de fluoróforo. Deste modo, houve pequena diferença entre a emissão na presença ou ausência de enzima. A

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25/25 medição de fluorescência próxima ao ânion máximo (ex 410 nm, em 500 nm) reduziu a emissão do substrato de enzima bem abaixo daquela do ânion e permitiu o uso de TUgal como um substrato de β-D-glactosidase.

Conforme visto nesse exemplo, a irradiação na frequência de excitação isosbésti5 ca pode ser menos eficaz em situações nas quais faz com que o substrato de enzima emita fortemente nas mesmas frequências que o fluoróforo livre.

Deste modo, as modalidades de métodos de detecção de micro-organismos e kits são, portanto, apresentadas. O versado na técnica apreciará que a presente descrição possa ser praticada com as modalidades outras que não aquelas apresentadas. As moda10 lidades descritas são apresentadas para propósitos ilustrativos e sem limitação e a presente descrição se limita somente às reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de detecção de micro-organismos em uma amostra de teste, CARACTERIZADO por compreender as etapas de:

a) incubar a amostra de teste com substrato de enzima para formar uma amostra

5 incubada, onde o substrato de enzima compreende um grupo enzimaticamente hidrolisável e um grupo fluorescente, onde os micro-organismos presentes na amostra de teste incluem uma enzima que hidrolisa o grupo hidrolisável do grupo fluorescente para formar um produto detectável de forma fluorescente, e onde o produto detectável de forma fluorescente tem uma espécie ácida e uma básica;

10 b) excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda ExAiso durante um tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, onde o ExAiso é o ponto isosbéstico de absorbância do produto detectável de forma fluorescente; e

c) detectar luz emitida em um comprimento de onda EmA1.

15 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender ainda quantificar a luz emitida para determinar a quantidade de micro-organismos presentes na amostra de teste.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO por compreender ainda excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento

20 de onda de ExA2 durante um tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, onde ExA2 é a absorção máxima das espécies básicas do produto detectável de forma fluorescente ou a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO por compreender

25 ainda determinar a razão da emissão ocasionada pela excitação a ExAiso e a emissão ocasionada pela excitação a ExA2.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato da etapa de incubar a amostra de teste com o substrato de enzima compreender adicionar a amostra sob uma forma líquida a um meio de crescimen30 to desidratado contendo o substrato de enzima.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO por compreender ainda formar uma imagem da luz detectada.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO por compreender ainda contar colônias a partir da imagem.

35 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,

CARACTERIZADO por compreender ainda detectar e quantificar luz emitida de ambos EmA1 e EmA2, onde EmA1 é o comprimento de onda na fluorescência máxima do produto

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2/2 detectável de forma fluorescente e EmA2 é o comprimento de onda do ponto de emissão isosbéstico, e onde EmA1 e EmA2 são comprimentos de onda diferentes; e determinar uma razão entre a luz emitida em um comprimento de onda EmA1 e a luz emitida em um comprimento de onda EmA2.
5 9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender ainda:

d) excitar o produto detectável de forma fluorescente com luz que tem um comprimento de onda de ExA2 durante um tempo suficiente para que o produto detectável de forma fluorescente emita luz, onde ExA2 é a absorção máxima das espécies básicas do
10 produto detectável de forma fluorescente ou a absorção máxima das espécies ácidas do produto detectável de forma fluorescente;

e) detectar luz emitida em um comprimento de onda EmA1 como um resultado da excitação com luz que tem um comprimento de onda de ExA2; e

f) calcular uma razão com base na luz emitida em um comprimento de onda EmA1 15 como um resultado da luz de excitação de ExAiso e na luz emitida como um resultado da luz de excitação de ExA2, sendo que a razão é indicativa da quantidade de microorganismos presentes na amostra de teste.