BR112012013664B1 - rabdovírus oncolítico - Google Patents

Abstract

RABDOVÍRUS ONCOLÍTICO. As modalidades da invenção compreendem composições e métodos relacionados com o vírus de marabá e o uso destes na terapia anticâncer. Tais rabdovírus possuem propriedades de matar células tumorais in vitro e in vivo.

Description

Este pedido reivindica a prioridade do pedido de Patente Provisório Americano número de série 61/285,461, depositado no dia 10 de dezembro de 2009, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO I. CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se em geral à virologia e medicina. Em certos aspectos, a invenção refere-se aos vírus oncolíticos, particularmente aos rabdovirus oncolíticos.

II. ANTECEDENTES

Foi demonstrado que uma variedade de vírus se replica em e matam uma grande variedade de células tumorais in vitro (vírus Sindbis (Unno et al., 2005); vírus Sendai (Kinoh et al., 2004); vírus Coxackie (Shafren et al., 2004) vírus herpes simplex (Mineta et al., 1995); Parvovirus (Abschuetz et al., 2006); Adenovirus (Heise et al., 2000); Poliovirus (Gromeier et al., 2000); vírus da doença de Newcastle; vírus da estomatite vesicular (Stojdl et al., 2000); vírus do sarampo (Grote et al., 2001); reovírus (Coffey et al., 1998); retrovirus (Logg et al., 2001);

Vaccinia (Timiryasova et al., 1999); e Influenza (Bergmann. et al., 2001 )). Além disso, tais vírus demonstraram eficácia no tratamento de modelos animais de câncer. Continua a existir uma necessidade por terapêuticas adicionais para o tratamento de câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

É aqui descrita uma nova plataforma oncolítica e um sistema recombinante para manipular geneticamente o vírus de Marabá. O duplo mutante Marabá ("DM") foi gerado e demonstra segurança e eficácia pela administração sistêmica em modelos tumorais múltiplos, tanto xenoenxerto imunocompetente quanto humano.

Vários rabdovírus recentemente identificados são muito mais eficientes em matar cânceres ou linhagens de células cancerosas específicas do que VSV. Além disso, VSV e mutantes atenuados de VSV são neurovirulentos e causam patologia no SNC em roedores e primatas. Vários rabdovírus não infectam o SNC (isto é, Muir Springs e Bahia Grande: Kerschner et al., 1986), e demonstram um perfil de segurança mais aceitável. Além disso, as terapias baseadas nos novos rabdovírus podem ser usadas para tratar cânceres do SNC, tanto primários quanto secundários. O rabdovírus da invenção (e/ou outros agentes oncolíticos) pode ser usado em sucessão para contornar a resposta imune do hospedeiro contra (um) vírus terapêutico(s) particular(es). Isto permitiria a terapia prolongada e melhoraria a eficácia.

As modalidades da invenção incluem composições e métodos relacionados com o rabdovirus e o uso destes como terapêuticos anticâncer. Tais rabdovirus possuem propriedades de matar as células tumorais in vitro e in vivo.

Como aqui utilizado, o rabdovirus pode ser o virus de Marabá ou uma variante manipulada do virus Marabá. Os virus aqui descritos podem ser usados em combinação com outros rabdovirus. Outros rabdovirus incluem um ou mais dos seguintes virus ou suas variantes: virus de Carajás, virus Chandipura, virus Cocal, virus Isfahan, virus Piry, virus de Alagoas da estomatite vesicular, virus Bean 157575, virus Boteke, virus Calchaqui, virus Eel Americano, virus Gray Lodge, virus Jurona, virus Klamath, virus Kwatta, virus La Joya, virus de Malpais Spring, virus de morcego de Mount Elgon, virus Perinet, virus Tupaia, Farmington, virus da Bahia Grande, virus Muir Springs, virus de Reed Ranch, virus Hart Park, virus Flanders, virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, ' virus Barur, virus Fukuoka, virus de Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus Le Dantec, virus Keuraliba, virus de Connecticut, virus de New Minto, virus de Sawgrass, virus Chaco, virus de Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, vírus Bimbo, virus Bivens Arm, virus do caranguejo azul, virus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Quango, virus Parry Creek, vírus acará do Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, vírus Sripur, vírus de Braço de Água Doce, vírus Tibrogargan, vírus Xiburema, vírus Yata, Rhode Island, virus do rio Adelaide, virus Berrimah, virus Kimberley ou vírus da febre efêmera bovina. Em certos aspectos, o rabdovírus pode referir-se ao supergrupo de Dimarabdovírus (definida como rabdovírus capazes de infetar tanto células de insetos quanto de mamíferos). Em modalidades específicas, o rabdovírus não é VSV. Em aspectos particulares o rabdovírus é um vírus de Carajás, vírus de Marabá, Farmington, vírus Muir Springs e/ou vírus da Bahia Grande, incluindo variantes dos mesmos. Qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou mais, incluindo todos os números inteiros ou intervalos entre estes, destes vírus pode ser especificamente excluído do escopo da reivindicação.

Uma modalidade da invenção inclui métodos e composições compreendendo um virus de Marabá oncolitico que codifica uma variante da proteina M e/ou G com uma identidade de aminoácidos de pelo menos, ou de no máximo 20, 30, 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99, 100%, incluindo todas as faixas e porcentagens entre estes, para a proteina M ou G do virus de Marabá. Em certos aspectos, o aminoácido 242 da proteina G de Marabá é modificado. Em aspectos adicionais, o aminoácido 123 da proteina M é modificado. Em ainda outros aspectos, tanto aminoácido 242 da proteina G (SEQ ID NO: 5) quanto o aminoácido 123 da proteina M (SEQ ID NO: 4) são modificados. O aminoácido 242 pode ser substituído com uma arginina (Q242R) ou outro aminoácido que atenua o vírus. O aminoácido 123 pode ser substituído com um triptofano (L123W) ou outro aminoácido que atenua o vírus. Em certos aspectos, duas mutações separadas individualmente atenuam o vírus em células saudáveis normais. Na combinação dos mutantes o vírus torna-se mais virulento em células tumorais do que o vírus tipo selvagem. Assim, o índice terapêutico de DM Marabá é aumentado de forma inesperada.

Métodos e composições da invenção podem incluir um segundo vírus terapêutico, tal como um vírus oncolitico ou de replicação defeituosa. Oncolitico tipicamente refere-se a um agente que é capaz de matar, lisar ou interromper o crescimento de uma célula cancerosa. Em termos de um vírus oncolítico o termo refere-se a um vírus que pode replicar até certo grau em uma célula cancerosa, causar a morte, a lise (oncólise) ou a cessação do crescimento de células cancerosas e, tipicamente, possui efeitos tóxicos mínimos sobre células não cancerosas. Um segundo vírus inclui, mas não está limitado, a um adenovirus, um vírus vaccinia, um vírus da doença de Newcastle, um alfavírus, um parvovirus, um herpes vírus, um rabdovirus, um rabdovirus e semelhantes. Em outros aspectos, a composição é uma composição farmaceuticamente aceitável. A composição pode também incluir um agente anticâncer, tal como um quimioterapêutico, radioterapêutico ou imunoterapêutico.

Modalidades adicionais da invenção incluem métodos de matar uma célula hiperproliferativa compreendendo o contato da célula com uma composição de rabdovirus oncolítica isolada aqui descrita.

Ainda outros métodos incluem o tratamento de um paciente com câncer que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma composição de rabdovirus oncolítica aqui descrita.

Em certos aspectos da invenção, uma célula pode estar compreendida em um paciente e pode ser uma célula hiperproliferativa, neoplásica, pré-cancerosa, cancerosa, metastática ou metastatizada. Um rabdovírus {por exemplo, vírus de Marabá) pode ser administrado a um paciente possuindo uma célula suscetível a matar, pelo menos, um rabdovírus ou um regime terapêutico ou composição que inclui um rabdovírus. A administração de composições terapêuticas pode ser feita 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais rabdovírus ou rabdovírus recombinante, isoladamente ou em várias combinações. A composição administrada pode deixar 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 ou mais partículas virais ou unidades formadoras de placas (ufc) . A administração pode ser por via intraperitoneal, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intradérmica, subcutânea ou intranasal. Em certos aspectos, as composições são administradas sistemicamente, particularmente por administração intravascular, que inclui a injeção, perfusão e semelhantes. Os métodos da invenção podem ainda compreender a administração de uma segunda terapia anticâncer, tal como um segundo vírus terapêutico. Em certos aspectos um vírus terapêutico pode ser um vírus oncolítico, mais particularmente um vírus Marabá. Em outros aspectos, um segundo agente anticâncer é um quimioterapêutico, um radioterapêutico, um imunoterapêutico, cirurgia ou similar.

Modalidades da invenção incluem composições e métodos relacionados a um rabdovírus compreendendo uma proteina G heteróloga (vírus pseudotipado) e sua utilização como terapêuticos anticancerosos. Tais rabdovírus possuem propriedades de matar células tumorais in vitro e in vivo. Assim, um vírus Marabá, tal como aqui descrito, pode ser adicionalmente modificado por associação de uma proteína G heteróloga da mesma forma. Tal como aqui utilizado, uma proteína G heteróloga inclui a proteína G de rabdovírus. Rabdovírus incluirão um ou mais dos seguintes vírus ou suas variantes: vírus de Carajás, vírus Chandipura, vírus Cocai, vírus Isfahan, vírus Marabá, vírus Piry, vírus de Alagoas da estomatite vesicular, vírus Bean 157575, vírus Botekè, vírus Calchaqui, vírus Eel Americano, vírus Gray Lodge, vírus Jurona, vírus Klamath, vírus Kwatta, vírus La Joya, vírus de Malpais Spring, vírus de morcego de Mount Elgon, vírus Perinet, vírus Tupaia, Farmington, vírus da Bahia Grande, vírus Muir Springs, vírus de Reed Ranch, vírus Hart Park, vírus Flanders, vírus Kamese, vírus Mosqueiro, vírus Mossuril, vírus Barur, vírus Fukuoka, vírus de Kern Canyon, vírus Nkolbisson, vírus Le Dantec, vírus Keuraliba, vírus de Connecticut, vírus de New Minto, vírus de Sawgrass, vírus Chaco, vírus de Sena Madureira, vírus Timbo, vírus

Almpiwar, virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus Bivens Arm, virus do caranguejo azul, vírus Charleville, virus Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus Humpty Doo, virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo, virus Koolpinyah, virus Kotonkon, virus Landjia, virus Manitoba, virus Marco, virus Nasoule, virus Navarro, virus Ngaingan, virus Oak-Vale, virus Obodhiang, virus Oita, virus Quango, virus Parry Creek, vírus acará do Rio Grande, virus Sandjimba, virus Sigma, vírus Sripur, vírus de Braço de Água Doce, vírus Tibrogargan, vírus Xiburema, vírus Yata, Rhode Island, virus do rio Adelaide, virus Berrimah, virus Kimberley ou vírus da febre efêmera bovina. Em certos aspectos, o rabdovirus pode referir-se ao supergrupo de Dimarabdovírus (definida como rabdovirus capazes de infetar tanto células de insetos quanto de mamíferos). Em aspectos particulares, o rabdovirus não um vírus de Carajás, vírus Marabá, vírus de Muir Springs e/ou vírus da Bahia Grande, incluindo variantes dos mesmos.

Modalidades adicionais da invenção incluem métodos de matar uma célula hiperproliferativa compreendendo a administração ou o contato da célula com uma composição de vírus Marabá oncolítica.

Ainda outros métodos incluem o tratamento de um paciente com câncer que compreende a administração de uma quantidade eficaz de uma tal composição virai.

Em certos aspectos da invenção, uma célula pode estar compreendida em um paciente e pode ser uma célula hiperproliferativa, neoplásica, pré-cancerosa, cancerosa, metastática ou metastatizada. Um virus da invenção pode ser administrado a um paciente que possui uma célula suscetível a matar por, pelo menos, um virus ou um regime terapêutico ou composição que inclui um virus. A administração de composições terapêuticas pode ser feita 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais virus, sozinho ou em várias combinações. A composição administrada pode ter 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, IO10, 10n, 1012, 1013, 1014 ou mais partículas virais ou unidades formadoras de placas (ufc). A administração pode ser por administração intraperitoneal, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intradérmica, subcutânea ou intranasal. Em certos aspectos, as composições são administradas sistemicamente, particularmente por administração intravascular, que inclui injeção, perfusão e semelhantes. Os métodos da invenção podem ainda compreender a administração de uma segunda terapia anticâncer, tal como um segundo vírus terapêutico. Em aspectos particulares um vírus terapêutico pode ser um vírus oncolitico tal como um virus Marabá, como aqui descrito. :Em outros aspectos, um segundo :agente anticâncer é um quimioterapêutico, um radioterapêutico, um imunoterapêutico, cirurgia ou semelhantes.

Outras modalidades da invenção são discutidas em todo o presente pedido. Qualquer modalidade discutida com relação a um aspecto da invenção aplica-se a outros aspectos da invenção da mesma forma, e vice-versa. As modalidades nas secções Descrição Detalhada e Exemplo são entendidas como sendo modalidades não limitativas da invenção que são aplicáveis a todos os aspectos da invenção.

Os termos "inibindo", "reduzindo" ou "prevenindo", ou qualquer variação desses termos, quando utilizado nas reivindicações e/ou no relatório descritivo, inclui qualquer diminuição ou inibição completa mensurável para alcançar um resultado desejado, por exemplo, o tratamento de câncer. Resultados desejados incluem, mas não estão limitados, à paliação, redução, lentidão ou erradicação de um câncer ou condição hiperproliferativa ou sintomas relacionados com um câncer, bem como uma qualidade ou prolongamento da vida melhorado.

O uso da palavra "um" ou "uma", quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou relatório descritivo, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um", e "um ou mais de um."

Ao longo deste pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão do erro para o dispositivo ou o método a ser utilizado para determinar o valor.

O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para se referir apenas às alternativas ou as alternativas são mutuamente excludentes, embora a divulgação suporte uma definição que se refere às únicas alternativas e "e/ou".

Como usado neste relatório descritivo e na(s) reivindicação/reivindicações, as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de compreender, tal como "compreende" e "compreende"), "possuindo" (e qualquer forma de possuir, como "possuir" e "possuir", "incluindo" (e qualquer forma de incluindo, como "inclui" e inclui) ou "contendo" (e qualquer forma de contendo, como "contém" e "contêm" são inclusivas ou abertas e não excluem elementos adicionais, elementos não citados ou etapas de métodos.

Outros objetos, características e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da invenção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para as pessoas versadas na técnica a partir desta descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos a seguir formam parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem compreendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.

Figuras 1A-1B: Novos Rabdovírus Marabá demonstram alta produtividade virai em células cancerosas. Uma curva de crescimento de uma etapa foi utilizada para quantificar a produtividade virai de Marabá, Carajás, Farmington e Bahia Grande nas células da figura IA NCI H226 e figura IB SNB19. Marabá replica consistentemente para títulos elevados em ambas as linhagens celulares, em comparação com os outros vírus.

Figuras 2A-2F: Mutantes Marabá retêm as suas potências de matar em células cancerígenas, ainda que sejam atenuados em células normais. (Figura 2B) Ilustração do genoma de

Marabá em virus Marabá manipulado como um agente oncolitico delineando os vários sítios de mutação para os nossos mutantes simples (L123W, V221Y, Q242R) e mutantes duplos (Q242R L123W). (Figura 2C) Mutações na proteína G e M atenuam a capacidade de Marabá para matar células GM38. Os ensaios de viabilidade foram realizados em células GM38 em 72 horas após a infecção com Marabá, e os mutantes de Marabá indicados. (Figura 2D) Mutação de L123W manipulado em mutante Marabá Q242R reverte os tamanhos de placas para um fenótipo tipo selvagem. O ensaio de placa foi realizado em células SNB19 infectadas com Marabá tipo selvagem, variantes simples e DM. O diâmetro foi medido e área da placa calculada usando a fórmula a seguir A = TTr2. (Figura 2E) Marabá e variantes Marabá são altamente líticos em uma variedade de linhas de células tumorais. Imagens da células PC3, ES2, A549 e SW620 48 horas após a infecção com Marabá e variantes Marabá tipo selvagem. (Figura 2F) Células infectadas com Marabá WT e as variantes Marabá foram analisadas utilizando resazurina para a viabilidade. A viabilidade é drasticamente reduzida em todas as linhas celulares tratadas 48 horas após a infecção com Marabá e suas variantes.

Figuras 3A-3C: Mutantes Marabá variam quanto à sua capacidade para bloquear a produção de interferon. Células

PC-3 foram infectadas com as variantes de Marabá e o sobrenadante foi utilizado para proteger as células Vero de infecção subsequente com o vírus Marabá tipo selvagem, (Figura 3A) O mutante Q242R bloqueia o interferon semelhantemente ao Marabá tipo selvagem. (Figura 3B) O mutante L123W, mutante V221Y, Marabá ΔM51 e o mutante duplo L123W-M/Q242R-G permitem que o interferon seja produzido após a infecção de células PC3. (Figura 3C) rMarabá bloqueia o transporte nuclear/citoplasmático de IFN-β. A indução de mRNA de IFN-β não é detectada na fração citoplasmática após a infecção com rMarabá ou Marabá Q242R, conforme determinado por qRTPCR. As células infectadas com Δ51M, L123W e Marabá DM apresentaram indução do mRNA do INF no citoplasma após a infecção.

Figuras 4A-4D: Administração sistêmica de Marabá DM é eficaz em modelos de tumores singênicos e de xenoenxerto de camundongos. (Figura 4A) Marabá DM é eficaz no tratamento do modelo tumoral bilateral CT-26 (i) DMGFP e DM-FLUC se replica seletivamente no sitio tumoral 24 horas após a injeção IV (5 x 108 ufc). (ii) Sobrevivência durável de camundongos Balb/C com tumores CT26 bilaterais após o tratamento com Marabá DM. (iii) Os volumes tumorais foram calculados em uma base bissemanal. As barras de erro indicam SEM. (iv) O pesos dos camundongos medidos antes e depois do tratamento com Marabá DM e controle. As barras de erro indicam SEM. (Figura 4B) Tratamento sistêmico de tumores CT-26 disseminados, (i) Tumores de pulmão CT-26 foram tratados por via intravenosa com PBS, virus de Carajás ou Marabá DM no dia 10 após a implantação do tumor. No dia 17 os animais foram sacrificados e as imagens do pulmão foram capturadas, (ii) Tratamento de tumor eficaz com 6 doses intravenosas de Marabá MS (5 x 10 ufc/dose) . (Figura 4C) Marabá DM é eficaz em um modelo de xenoenxerto ovariano humano (ES-2) (injeções IP, 1 x 104 ufc/dose). (i) Imagens IVIS demonstrando uma rápida regressão tumoral após o tratamento virai, (ii) Gráfico de fluxo bioluminescente quantificando uma redução significativa na carga tumoral abdominal em resposta ao tratamento de vírus. (iii) O gráfico de Kaplan Meier demonstra sobrevivência aumentada após o tratamento com vírus. (Figura 4D) Marabá DM é superior a VSV Δ51 no tratamento de tumores de xenoenxerto ES-2 (injeções IV, 1 x 105 - 1 x 107 ufc/dose) . (i-ii) Gráfico de Kaplan Meier demonstram aumento da sobrevivência nos animais tratados com Marabá DM, em comparação com VSV Δ51.

Figura 5: Morte celular mediada por rabdovírus no painel de células NCI60. As células do painel de células NCI 60 foram plaqueadas em placas com 96 poços até uma confluência de 90%. Estas células foram infectadas em diluições logarítmicas com vários rabdovírus, conforme indicado. Depois de 48 horas ou 96 horas após a infecção com vírus Marabá manipulado, como um agente oncolitico, as monocamadas foram lavadas, fixadas e coradas com solução de cristal de violeta 1%. As monocamadas coradas foram subsequentemente solubilizadas em SDS 1% em água para criar lisados homogêneos. A absorbância foi lida a 595 nm e para classificar quanto às células viáveis. EC50 de MOI foram classificadas nas faixas como indicado na figura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Aspectos da invenção são baseados na morte por rabdovírus (por exemplo, vírus Marabá) ou rabdovírus pseudotipados de vários tipos ou tipos de células cancerosas. Algumas das vantagens destes rabdovírus oncolíticos e rabdovírus recombinantes incluem os seguintes: (1) Anticorpos para- os rabdovírus da invenção serão de raros a inexistentes na maioria das populações do mundo. (2) Rabdovírus se replicam mais rapidamente do que outros vírus oncolíticos, como os adenovirus, reovírus, vírus do sarampo, parvovirus, retrovirus e HSV. (3) Rabdovírus crescem até títulos elevados e são filtráveis através do filtro de 0,2 micron. (4) Os rabdovírus oncolíticos e seus recombinantes possuem uma ampla faixa de hospedeiros, capaz de infectar muitos tipos diferentes de células cancerosas e não estão limitados aos receptores em uma célula em particular (por exemplo, virus coxsackie, do sarampo e adenovirus). (5) Os rabdovirus da invenção são passiveis de manipulação genética. (6) Os rabdovirus também têm um ciclo de vida citoplasmático e não se integram no material genético de uma célula hospedeira, que confere um perfil de segurança mais favorável.

Como aqui descrito, um novo virus oncolitico foi identificado para servir como uma plataforma para desenvolver terapias de câncer à base de virus eficazes Os Rhabdovirdae foram selecionados para um virus com propriedades que contribuiram para um forte efeito oncolitico. A administração sistêmica é um método previsto de administração, e é um aspecto vantajoso no tratamento de cânceres disseminados no contexto clinico. Em certos aspectos, um virus é administrado por via intravenosa e pode iniciar a infecção nos sítios de tumor diferentes. Postula-se que uma das limitações in vivo à terapia eficaz poderia ser que a distribuição virai ao leito do tumor podem ser limitante. De facto, os limiares de dose abaixo dos quais o vírus não é efetivamente administrado ao tumor em modelos de camundongos foram observados, e estas doses não foram eficazes (Stojdl et al., 2003). Assim, os inventores estavam interessados em encontrar vírus capazes de matar células tumorais em baixas multiplicidades de infecção ("MOI"), que se replicam rapidamente, e para produzir grandes quantidades de progenia para maximizar a probabilidade e a magnitude da infecção no leito tumoral. Até este ponto, um ensaio em placa de poços múltiplos foi projetado para identificar vírus capazes de matar uma grande variedade de células tumorais em baixa MOI. Subsequente aos ensaios MOI, os vírus mais potentes foram analisados quanto à cinética de crescimento e tamanho de ruptura. 0 vírus Marabá foi identificado como um candidato promissor.

As sequências dos genomas completos do Marabá (SEQ ID NO. 1) e Carajás (CRJ) (SEQ ID NO: 7) foram obtidas.

Uma vez que o vírus Marabá foi identificado como um candidato, os inventores realizaram estudos de engenharia genética para melhorar a sua seletividade tumoral. Duas mutações interessantes foram inicialmente identificadas em estudos para monitorar a aptidão do vírus de RNA em ambientes mutáveis. Em um relatório anterior, tanto L123W quanto H242R (Q242R em Marabá) foram individualmente capazes de aumentar a replicação do VSV em células BHK 21. Além disso, foi relatado que a combinação das duas mutações reteram este fenótipo de aptidão. As mutações L123W/Q242R fornecem um vírus com um índice terapêutico de pelo menos 3 logs. (EC50 < IO-3 MOI em algumas células tumorais; EC50 = 3 MOI em fibroblastos GM38). As mutações Q242R e L123W são atenuantes em fibroblastos normais. A mutação L123W parece funcionar da mesma forma como ΔM51 e V221Y, resultando em um déficit na capacidade de bloquear o transporte nuclear/citoplasmático, assim inibindo a cascata de transcrição de IFN no hospedeiro. Para o melhor do conhecimento dos inventores, esta é a primeira demonstração de uma função para esta região da proteína de matriz na mitigação das defesas imunológicas inatas do organismo. Anteriormente, as mutações nesta região foram relatadas para afetar a tradução do mRNA viral (Connor et al., 2006). A mutação Q242R reduz gravemente a citólise do vírus Marabá de células normais, mas de uma maneira independente. Estas propriedades formam a base de uma seletividade tumoral potente que resulta em um aumento significativo no índice terapêutico para esta nova plataforma de vírus oncolitico baseada em Marabá.

Como previsto a partir de resultados in vitro, a variante Marabá DM foi significativamente menos tóxica do que o vírus tipo selvagem quando administrado por via intravenosa em camundongos Balb/C. A dose máxima tolerada ("MTD") foi 100 vezes maior do que o vírus WT. Isto permitiu a dosagem bem abaixo da MTD para alcançar regressões tumorais significativas em ambos os modelos de tumor. No modelo de CT26, por exemplo, 6 doses de virus Marabá DM foram suficientes para proporcionar curas duráveis completas em todos os camundongos. Particularmente importante para o cenário clinico, Marabá DM foi eficaz no tratamento tanto um tumor de xenoenxerto humano quanto de um modelo tumoral singênico imunocompetente por distribuição sistêmica. A replicação virai foi demonstrada no sitio tumoral no modelo de tumor CT26 após a injeção intravenosa, consistente com a oncólise mediada porvirus como um contribuinte para a eficácia. Na verdade, Marabá DM pareceu ser mais eficaz do que os candidatos anteriores VSV ΔM51 no modelo de xenoenxerto ES2. Isto é consistente com os dados in vitro que demonstram que Marabá DM é mais eficaz em matar as células tumorais do que o vírus WT. Vários estudos demonstraram definitivamente que a resposta imune do hospedeiro desempenha um papel positivo e negativo na eficácia do vírus oncolitico (Dhar et al., 2008; Altomonte et al., 2008; Endo et al., 2008; Chiocca, 2008).

Modalidades da invenção incluem composições e métodos relacionados com o vírus Marabá ou rabdovirus pseudotipados e o uso destes como terapêuticos anticãncer.

I. Família Rhabdoviridae (Rabdovirus)

Os rabdovírus arquetípicos são o virus da raiva e da estomatite vesicular (VSV), os mais estudados desta familia de vírus. Embora estes vírus compartilham morfologias similares, eles são muito diferentes em seus ciclos de vida, faixa de hospedeiros e patologia. Rabdovírus é uma família de vírus em forma de bala possuindo genomas de NRA de sentido (-), não segmentados. Há mais do que 250

Rabdovírus conhecidos que infectam mamíferos, peixes, insetos e plantas.

A família de Rabdovírus inclui, mas não limitados se limita, aos: vírus de Carajás, vírus Chandipura (AF128868/gi:4583436, AY871800/gi:62861470, AY871798/gi:62861466, AY871796/gi:62861462, AY871794/gi:62861459, AJ810083/gi:57833891, AY871799/gi:62861468, AY871797/gi:62861464, AY871795/gi:62861460, AY871793/gi:62861457, AY871792/gi:62861455, AY871791/gi: 62861453) , vírus Cocai (AF045556/gi:2865658), vírus Isfahan (AJ810084/gi:57834038), vírus Marabá (SEQ ID NO: 1 a 6) , vírus de Carajás (SEQ ID NO: 7 a 12, AY335185/gi:33578037), vírus Piry (D26175/gi:442480, Z15093/gi:61405), vírus de Alagoas da estomatite vesicular, vírus BeAn 157575, vírus Boteke, vírus Calchaqui, vírus Eel Americano, vírus Gray

Lodge, vírus Jurona, vírus Klamath, vírus Kwatta, vírus La Joya, virus de Malpais Spring, virus do morcego de Mount Elgon (DQ457103/gi|91984805), virus Perinet (AY854652/gi:71842381), virus Tupaia (NC_007020/gi:66508427), Farmington, virus da Bahia Grande (SEQ ID NO: 13 a 18), virus de Muir Springs, virus de Reed Ranch, virus de Hart Park, virus Flanders (AF523199/gi:25140635, AF523197/gi:25140634, AF523196/gi:25140633, AF523195/gi:25140632, AF523194/gi:25140631, AH012179/gi:25140630), virus Kamese, virus Mosqueiro, virus Mossuril, virus Barur, virus Fukuoka (AY854651/gi:71842379), virus de Kern Canyon, virus Nkolbisson, virus de Le Dantec (AY854650/gi:71842377) , virus Keuraliba, virus de Connecticut, virus New Minto, virus de Sawgrass, virus Chaco, virus de Sena Madureira, virus Timbo, virus Almpiwar (AY854645/gi:71842367), virus Aruac, virus Bangoran, virus Bimbo, virus de Bivens Arm, virus do caranguejo azul, virus de Charleville, virus de Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus Garba, virus Gossas, virus de Humpty Doo (AY854643/gi:71842363), virus Joinjakaka, virus Kannamangalam, virus Kolongo (DQ457100/gi|mRNA da nucleoproteina 91984799 (N), cds parciais); virus de Koolpinyah, virus de Kotonkon (DQ457099/gi|91984797, AY854638/gi:71842354); virus de Landjia, virus de Manitoba, vírus Marco, vírus Nasoule, vírus Navarro, vírus Ngaingan (AY854649/gi:71842375) , vírus de Oak-Vale (AY854670/gi:71842417) , vírus de Obodhiang (DQ457098/gi|91984795) , vírus de Oita (AB116386/gi:46020027) , vírus de Quango, vírus de Parry Creek (AY854647/gi:71842371), vírus de acará do Rio Grande, vírus de Sandjimba (DQ457102/gi|91984803), vírus Sigma (AH004209/gi:1680545, H004208/gi:1680544, AH004206/gi:1680542), vírus Sripur, vírus de braço de água doce, vírus de Tibrogargan (AY854646/gi: 71842369), vírus de Xiburema, vírus de Yata, vírus de Rhode Island, vírus do Rio Adelaide (U10363/gi:600151, AF234998/gi:10443747, AF234534/gi:9971785, AY854635/gi:71842348) , vírus Berrimah (AY854636/gi:71842350]), vírus de Kimberley (AY854637/gi:71842352) , ou vírus da febre efêmera bovina (NC_002526/gi: 10086561).

A. Genoma Rabdovirai

Tipicamente, o genoma de rabdovírus é de aproximadamente 11 a 15 Kb com aproximadamente 50 nucleotídeos 3' líder e aproximadamente 60 nucleotídeos da região 5' não traduzida de um RNA virai de sentido (-.) (vRNA) . Tipicamente, o vRNA de rabdovírus tem 5 genes que codificam 5 proteínas. Rabdovírus têm um sinal de poliadenilação conservado no final de cada gene e uma região intergênica curta entre cada um dos 5 genes. Todos os Rabdovirus contêm pelo menos cinco genes que codificam a proteína do nucleocapsídeo (N) , fosfoproteína (P, também designada NS) , proteína da matriz (M) , glicoproteína (G) e proteína grande (L) . Tipicamente, estes genes estão ordenados no vRNA de sentido negativo, da seguinte forma: 3Z-N-P-M-G-(X)-L-5f (SEQ IQ NO: 29). A ordem dos genes é importante uma vez que determina a proporção de proteínas sintetizada. Quaisquer manipulações de um genoma de Rabdovirus incluirá tipicamente pelo menos cinco domínios de transcrição para manter a capacidade de infectar e se replicar em níveis elevados. Rabdovirus têm uma RNA polimerase endógena para a transcrição de RNA mensageiro de sentido mais (mRNA) . O gene X não ocorre em todos os Rabdovirus. O gene X codifica uma proteína não estrutural no vírus da necrose hematopoiética infecciosa (GenBank DQ164103/gi|76262981; DQ164102/gi|76262979; DQ164101/giI76262977; DQ164100/gi|76262975; DQ164099/gi176262973; AB250935/gi|112821165; AB250934/gil12821163; AB250933/gi|112821161; AB250932/gi|12821159; AB250931/gi|112821257; AB250930/gi|12821155; AB250929/gi|12821153; AB250928/giI12821151; AB250927/gi|112821149, que descreve a sequência de nucleotídeo que codifica a proteína G) , uma glicoproteína não estrutural no vírus da febre efêmera bovina e um pseudogene no vírus da raiva. O gene (X) extra foi encontrado em diferentes locais no genoma de Rabdovírus. A síntese da proteína M em células infectadas é citopática para a célula, e eventualmente resultará na morte celular.

A transmissão de rabdovírus varia dependendo do vírus/hospedeiro, mas a maioria são transmitidos por contato direto - por exemplo, transmissão da raiva por mordeduras de animais ou inseto vetor. Existe um longo período de incubação in vivo, mas isto não se reflete na cinética da replicaçâo do -vírus em cultura. As pontas de proteína G se ligam aos receptores na superfície das células hospedeiras e os vírus entram na célula por endocitose e fusão com a membrana da vesícula, mediada pela proteína G.

Sem a intenção de ser limitada a uma teoria em particular, acredita-se que as moléculas receptoras para o rabdovírus sejam fosfolipedos ou carboidratos ao invés de proteínas específicas. A replicaçâo rabdoviral ocorre no citoplasma - tanto proteínas L quanto NS são necessárias para a transcrição - nenhuma função isoladamente. Cinco mRNAs monocístrônicos são produzidos, tampados na extremidade 5' e poliadenilados na extremidade 3 e cada uma contém a sequência líder da extremidade 3' do vRNA na extremidade 5' da mensagem. Estes mRNAs são feitos por transcrição sequencial das ORFs no genoma do vírus e foi demonstrado que a sequência intergênica é responsável para a terminação e reinicio da transcrição pela polimerase entre cada gene, produzindo assim transcritos separados.

A progenia de vRNA é feita a partir de um intermediário de sentido ( + ) . O genoma é replicado pelo complexo da polimerase L + P (como na transcrição), mas os fatores de células hospedeiras adicionais são também necessários. É característico de Rabdovírus que todos estes eventos ocorrem em uma porção do citoplasma que atua como uma "fábrica" de vírus e aparece como um corpo de inclusão citoplasmático característico.

B. Variantes de Proteína Virai

Em certas modalidades, um vírus Marabá ou um rabdovírus compreenderá uma variante de uma ou mais das proteínas N, P, M, G e/ou L. Em certos aspectos da invenção, estas variantes de proteínas virais podem estar compreendidas em um vírus terapêutico, ou uma composição proteicas, que é adicionalmente definida abaixo. As composições proteicas incluem partículas virais e outras composições que tenham um ou mais componentes de proteínas virais. Esta(s) variante(s) de polipeptídeo podem ser manipuladas ou selecionadas para uma modificação em uma ou mais características fisiológicas ou biológicas, tais como faixa de células hospedeiras, especificidade da célula hospedeira, toxicidade para as células ou órgãos não-alvo, replicaçâo, citotoxicidade para uma célula alvo, morte de células cancerosas, estasia de células cancerosas, infectividade, parâmetros de fabricação, tamanho da partícula viral, a estabilidade das partículas virais, depuração in vivo, imunorreatividade e similares. Estas variantes de polipeptideo podem ser manipuladas por meio de uma variedade de metodologias conhecidas na técnica, incluindo várias técnicas de mutagênese. Em certos aspectos, as proteínas N, P, M, G e/ou L podem ser heterólogas para um virus (por exemplo, um VSV pode compreender uma proteina Isfahan G ou sua variante).

C. Rabdovírus recombinantes

Rabdovírus recombinantes podem ser produzidos (1) totalmente usando cDNAs ou (2) uma combinação de cDNAs transfectados para uma célula auxiliadora, ou (3) cDNAs transfectados para uma ’célula, que é posteriormente infectada com um minivirus fornecendo em trans os componentes ou atividades restantes necessários para produzir tanto uma rabdovírus recombinante infeccioso ou não infeccioso. Usando qualquer um destes métodos (pbr exemplo, minivirus, linha celular auxiliadora ou apenas transfecção de cDNA), os componentes mínimos necessários são uma molécula de RNA que contém os sinais de ação para (1) encapsidação do RNA genômico (ou antigenômico) pela proteína N do rabdovírus, e (2) a replicação de um equivalente de RNA genômico ou antigenômico (intermediário replicativo).

Por um elemento de replicação ou replicon, os inventores querem dizer uma fita de RNA contendo minimamente nas extremidades 5' e 3' a sequência líder e a sequência trailer de um rabdovírus. No sentido genômico, o líder está na extremidade 3' e o trailer está na extremidade 5' . Qualquer RNA colocado entre estes dois sinais de replicação será, por sua vez, replicado. As regiões líder e trailer devem ainda conter os elementos de ação cis mínimos para fins de encapsidação pela proteína N e para a ligação da polimerase que são necessários para iniciar a transcrição e replicação.

Para a preparação de rabdovírus manipulados, um minivirus contendo o gene G também deve conter uma região líder, uma região trailer e um gene G com os sinais de iniciação e terminação adequados para a produção de um mRNA de proteína G. Se o minivirus compreender ainda um gene M, os sinais de iniciação e terminação apropriados para a produção do mRNA da proteína M também devem estar presentes.

Para qualquer gene contido dentro do genoma de rabdovirus manipulado, o gene poderia ser flanqueado pela iniciação de transcrição apropriada e sinais de terminação que permitirão a expressão daqueles genes e a produção dos produtos de proteína. Particularmente um gene heterólogo, que é um gene que não é tipicamente codificado por um rabdovirus, como isolado a partir da natureza ou que contém uma região que codifica o rabdovirus em uma posição, forma ou contexto que normalmente não é encontrado, por exemplo, uma proteína G quimérica.

Para produzir rabdovirus manipulados "não infecciosos", o Rabdovirus manipulado deve possuir os elementos de replicon mínimo e as proteínas N, P e L e deve conter o gene M (um exemplo é o construct o ΔG ou G-menos, que está ausente faltando a região de codificação para a proteína G). Isto produz partículas virais que são enxertadas da célula, mas são partículas não infecciosas. Para produzir partículas "infecciosas", as partículas virais devem compreender adicionalmente proteínas que podem mediar a ligação e fusão da partícula virai, como através da utilização de uma proteína de ligação o ligante de receptor. O ligante do receptor nativo de rabdovirus é a proteina G.

Uma "célula adequada" ou "célula hospedeira" significa qualquer célula que poderia permitir a montagem do rabdovírus recombinante. Um método para preparar partículas virais infecciosas, uma linha celular apropriada (por exemplo, células BHK) é primeiro infectado com o virus vaccinia vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) ou equivalente, que codifica uma T7 RNA polimerase ou outra polimerase bacteriófaga adequada como as T3 ou SP6 polimerases (ver Usdin et al., 1993 ou Rodriguez et al., 1990). As células são a seguir transfectadas com cDNA individual contendo os genes que codificam as proteínas de Rabdovírus G, N, P, L e M. Estes cDNAs fornecerão as proteinas para a construção de uma particula de Rabdovírus recombinante. As células podem ser transfectadas por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, lipossomas, eletroporação, etc.).

Também é transfectado na linhagem celular um "cDNA policistrônico" contendo o equivalente de RNA genômico de rabdovírus. Se a particula de rabdovírus recombinante infeciosa se destina a ser litica em uma célula infectada, então os genes que codificam as proteinas N, P, M e L devem estar presentes, bem como qualquer segmento de ácido nucleico heterólogo. Se a particula de rabdovírus recombinante infecciosa não se destina a ser litica, então o gene que codifica a proteína M não está incluído no DNA policistrônico. Por "DNA policistrônico" se entende um Cdna que compreende pelo menos unidades de transcrição contendo os genes que codificam as proteínas N, P e L. O DNA policistrônico de rabdovírus recombinante pode também conter um gene que codifica uma variante de proteína ou fragmento de polipeptídeo da mesma, ou um ácido nucleico terapêutico. Alternativamente, qualquer proteína a ser inicialmente associada com a partícula virai primeiro produzida ou seu fragmento pode ser fornecida em trans.

Outra modalidade contemplada é um cDNA policistrônico compreendendo um gene que codifica uma proteína repórter ou proteína fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde e seus derivados, β-galactosidase, fosfatase alcalina, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, etc.), os genes N-P-L ou N-P-L-M e/ou uma proteína de fusão ou um ácido nucleico terapêutico. Outra DNA policistrônico contemplado pode conter um gene que codifica uma variante de proteína, um gene que codifica um repórter, um ácido nucleico terapêutico e/ou os genes N-P-L ou os genes N-P-L- M.

A primeira etapa na geração de um rabdovírus recombinante é a expressão de um RNA que é um equivalente genômico ou antigenômico a partir de um cDNA. Em seguida aquele RNA é empacotado pela proteína N e, em seguida, replicado pelas proteínas P/L. 0 vírus assim produzido pode ser recuperado. Se a proteína G está ausente do genoma de RNA recombinante, em seguida, ela é tipicamente fornecida em trans. Se tanto as proteínas G quanto as M estão ausentes, então, ambas são fornecidas em trans.

Para a preparação de partículas de "rabdovirus não infecciosos", o procedimento pode ser o mesmo que o descrito acima, exceto que o cDNA policistrônico transfectado para as células poderiam conter apenas os genes N, P e L de rabdovirus. 0 cDNA policistrônico de partículas de rabdovirus não infecciosas pode adicionalmente conter um gene que codifica uma proteína repórter ou um ácido nucleico terapêutico. Para uma descrição adicional sobre os métodos de produção de um rabdovirus recombinante que não tem o gene que codifica a proteína G, ver Takada et al., (1997).

1. Cultura de células para produzir vírus

Células transfectadas são geralmente incubadas durante pelo menos 24 h em temperatura desejada, normalmente a cerca de 37 °C. Para partículas virais não infecciosas, o sobrenadante é coletado e as partículas virais isoladas. Para partículas virais infecciosas, o sobrenadante contendo o vírus é coletado e transferido para células frescas. As células frescas são incubadas durante cerca de 48 horas, e o sobrenadante é coletado.

2. Purificação do rabdovírus recombinante

Os termos "isolamento" ou "isolando" um Rabdovírus significa o processo de cultivo e purificação das partículas virais, de modo que restem fragmentos celulares muito pequenos. Um exemplo seria tomar o sobrenadante contendo o virion e passa-lo através de um filtro de tamanho de poro de 0,1 a 0,2 micron (por exemplo, Millex- GS, Millipore) para remover o vírus e os fragmentos celulares. Alternativamente, os virions podem ser purificados utilizando um gradiente, como um gradiente de sacarose. Partículas de rabdovírus recombinantes podem então, ser peletizadas e ressuspensas em qualquer excipiente ou transportador desejado. Os títulos podem ser determinados através de imunofluorescência indireta utilizando anticorpos específicos para proteínas particulares.

3. Métodos para fazer Rabdovírus Recombinantes utilizando cDNAs e um Minivirus ou uma Linhagem Celular Auxiliadora

Tanto os "minivirus" quanto as "células auxiliadoras" (também conhecidos como "linhagens de células auxiliadoras") fornecem a mesma coisa: fornecem uma fonte de proteínas rabdovírus para a montagem do virion de rabdovírus. Um exemplo de um minivirus de rabdovírus é o minivirus VSV que expressa apenas a proteína G e M, conforme reportado por Stillman et al., (1995). Vírus auxiliadores e minivirus são usados como métodos para fornecer proteínas de rabdovírus que não são produzidas a partir do DNA transfectado que codifica os genes para proteínas de rabdovírus.

Ao utilizar um minivirus, as células são infectadas com o vírus vaccinia como descrito acima, para fornecer a T7 RNA polimerase. 0 RNA policistrônico desejado, e plasmídeos contendo os genes N, P e L, são transfectados nas células. A mistura de transfecção é removida depois de aproximadamente 3 horas, e as células são infectadas com o minivirus em uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de cerca de 1. O minivirus fornece as proteínas G e/ou M que faltara. O RNA policistrônico transfectado para a célula irá depender se um rabdovírus infeccioso ou não infeccioso recombinante é desejado.

Alternativamente, um minivirus poderia ser usado para fornecer os genes N, P e L. O minivirus também poderia ser usado para produzir a proteína M além de N, P e L. O minivirus também pode produzir a proteína G.

Quando se utiliza uma linhagem de célula auxiliadora, os genes que codificam as proteínas de rabdovirus faltantes são produzidos pela linha celular auxiliadora. A linha celular auxiliadora tem proteinas N, P, L e G para a produção de partículas de rabdovirus recombinantes que não codificam a proteína G tipo selvagem. As proteínas são expressas dos genes ou DNAs que não fazem parte do genoma do vírus recombinante. Estes plasmídeos ou outro sistema de vetor são estavelmente incorporados no genoma da linhagem celular. As proteínas são, então, produzidas a partir do genoma da célula e não a partir de um replicon no citoplasma. A linha celular auxiliadora pode então ser transfectada com um DNA policistrônico e cDNAs de plasmídeo contendo os outros genes de rabdovirus não expressos pelo vírus auxiliador. 0 RNA policistrônico utilizado irá depender se um rabdovirus recombinante infeccioso ou não recombinante é desejado. Caso contrário, o fornecimento dos produtos de gene faltantes (por exemplo, G e/ou M) poderia ser realizado como descrito acima.

11. COMPOSIÇÕES VIRAIS

A presente invenção refere-se aos rabdovirus que são vantajosas no estudo e no tratamento de células hiperproliferativas ou neoplásicas (por exemplo, células cancerosas) e condições hiperproliferativas ou neoplásicas (por exemplo, câncer) em um paciente. Isto pode envolver, mas não se limita, ao rabdovírus com uma neurovirulência reduzida, por exemplo, rabdovírus tais como o vírus Marabá. Em certos aspectos, rabdovírus que codificam ou contêm um ou mais componentes de proteína (proteínas N, P, M, G e/ou L) ou um genoma de ácido nucleico distinto daqueles de VSV (isto é, pelo menos ou, no máximo, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80% idêntica ao nível de aminoácido ou nucleotídeo), e/ou que foram construídos com uma ou mais mutações ou variações em relação a um vírus de tipo selvagem ou proteínas virais, de modo que o vírus tem propriedades desejáveis para utilização contra células cancerosas, sendo ao mesmo tempo menos tóxico ou não tóxico para células não cancerosas do que o vírus como originalmente isolado ou VSV. Os ensinamentos descritos abaixo fornecem vários exemplos de protocolos para a implementação de métodos e composições da invenção. Eles fornecem base para a geração de vírus modificados ou variantes através da utilização de tecnologia de biosseleção ou DNA recombinante ou de ácido nucleico.

A. Composições proteicas

As composições proteicas da invenção incluem partículas virais e as composições incluindo as partículas virais, bem como polipeptídeos isolados. Em certas modalidades, s presente invenção envolve gerar ou isolar rabdovírus (por exemplo, vírus Marabá), rabdovírus pseudotipado ou oncolítico (rabdovírus que lisam, matam ou retardam o crescimento de células cancerosas). Em certas modalidades, o rabdovírus será manipulado para incluir variantes de polipeptídeos de proteínas de rabdovírus (N, P, M, G e/ou L) e/ou ácidos nucleicos terapêuticos que codificam polipeptídeos terapêuticos. Outros aspectos da invenção incluem o isolamento de rabdovírus que não têm um ou mais polipeptídeos ou proteínas funcionais. Em outras modalidades, a presente invenção envolve rabdovírus e o uso destes em combinação com ou incluído dentro de composições proteicas como parte de uma formulação farmaceuticamente aceitável.

Como aqui utilizado, uma "proteína" ou "polipeptídeo" refere-se a uma molécula compreendendo polímero de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma versão tipo selvagem de uma proteína ou polipeptídeo é empregada, no entanto, em muitas modalidades da invenção, a totalidade ou parte de uma proteína virai ou polipeptídeo está ausente ou é alterado de modo a tornar o vírus mais útil para o tratamento de um paciente. Os termos acima descritos podem ser aqui utilizados de modo intercambiável. Uma "proteína modificada" ou "polipeptídeo modificado" ou "proteína variante" ou "polipeptídeo variante" refere-se a uma proteína ou polipeptideo cuja estrutura química ou sequência de aminoácidos é alterada em relação ao tipo selvagem ou uma proteína ou polipeptideo de referência. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptideo modificado tem pelo menos uma atividade ou função modificada (reconhecendo que as proteínas ou polipeptídeos podem ter múltiplas atividades ou funções). A atividade ou função modificada pode ser reduzida, diminuída, eliminada, intensificada ou alterada de algum outro modo (como especificidade de infecção) com relação àquela atividade ou função' em uma proteína ou polipeptideo tipo selvagem, ou as características de vírus contendo tal polipeptideo. É contemplado que uma proteína ou polipeptideo modificado pode ser alterado em relação a uma atividade ou função, e ainda reter a atividade tipo selvagem ou inalterada ou a função em outros aspectos. Alternativamente, uma proteína modificada pode ser completamente não funcional ou a sua sequência de ácido nucleico cognata pode ter sido alterada de modo que o polipeptideo já não seja mais expresso, seja truncado ou expresse uma sequência de aminoácidos diferente, como resultado de uma mudança de estrutura ou outra modificação.

Em certas modalidades, o tamanho de uma proteína ou polipeptideo recombinante pode compreender, mas não está limitado, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 ou mais residuos de moléculas de aminoácidos, e qualquer derivável dessa. É contemplado que os polipeptideos podem ser modificados por truncamento, tornando-os mais curtos do que as suas formas inalteradas correspondentes ou por fusão ou embaralhamento de dominio podem tornar a proteina alterada mais longa.

Como aqui utilizado, uma "molécula amino" refere-se a qualquer aminoácido, derivado de aminoácido, ou mimético de aminoácido imitar como seria conhecido para uma pessoa versada na técnica. Em certas modalidades, os residuos da molécula proteica são sequenciais, sem qualquer molécula diferente de aminoácido interrompendo a sequência de resíduos de aminoácidos. Em outras modalidades, a sequência pode compreender uma ou mais porções da molécula que não são aminoácidos. Em modalidades particulares, a sequência de resíduos da molécula proteica pode ser interrompida por um ou mais porções da molécula diferente e aminoácido. Por conseguinte, o termo "composição proteica" abrange sequências da amino molécula compreendendo pelo menos um dos 20 aminoácidos comuns em proteínas naturalmente sintetizadas, ou pelo menos um aminoácido modificado ou incomum.

As composições proteicas podem ser feitas por qualquer técnica conhecida pela pessoa versada na técnica, incluindo a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas de biologia molecular padrão, o isolamento de compostos proteicos das fontes naturais, ou a síntese química de materiais proteináceos. As sequências de nucleotídeos e polipeptídeos para vários genes de rabdovírus ou genomas foram previamente divulgadas, e podem ser encontradas em bases de dados computadorizadas conhecidas pelas pessoas normalmente versadas na técnica. Um tal banco de dados é o GenBank do National Center for Biotechnology Information e GenPept, que podem ser acessados via Internet em ncbi.nlm.nih.gov/. As regiões de codificação para estes genes conhecidos e vírus podem ser amplificadas e/ou expressas utilizando as técnicas aqui reveladas ou como poderia ser conhecido pelas pessoas normalmente versadas na técnica.

B. Aspectos Funcionais

Quando a presente invenção refere-se à função ou atividade de proteínas ou polipeptídeos virais, entende-se que isso se refere à atividade ou função daquela proteína ou polipeptideo virai sob condições fisiológicas, a menos que seja especificado de outra forma. Por exemplo, a proteína G está envolvida na especificidade e eficiência da ligação e infecção de tipos de células particulares. A determinação de que moléculas possuem esta atividade pode ser conseguido utilizando ensaios familiares das pessoas versadas na técnica, como ensaios de infectividade, ensaios de ligação de proteína, ensaios de placa e semelhantes.

C. Variantes de Polipeptídeos Virais

Variantes da sequência de aminoácidos dos polipeptídeos da presente invenção podem ser variantes de substituição, inserção ou eliminação. Uma mutação em um gene que codifica um polipeptideo virai pode afetar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61., 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 , 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais aminoácidos contíguos ou não contiguos (isto é, segmento) de um polipeptideo, em comparação com um polipeptideo tipo selvagem ou inalterado ou outro polipeptideo de referência. Vários polipeptídeos codificados por rabdovírus podem ser identificados por referência aos Números de Acesso do GenBank e às entradas dos bancos de dados relacionados para cada um dos vírus aqui divulgados, todas as entradas do GenBank relacionadas com a família Rhabdoviridae sendo aqui incorporadas por referência.

Variantes de eliminação não têm um ou mais resíduos da proteína natural, inalterada ou de tipo selvagem. Resíduos individuais podem ser excluídos, ou todo ou parte de um domínio (tal como um domínio catalítico ou de ligação) pode ser eliminado. Um códon de parada pode ser introduzido (por substituição ou inserção) em uma sequência de ácido nucleico codificante para gerar uma proteína truncada. Os mutantes de inserção tipicamente envolvem a adição de material em um ponto não terminal no polipeptideo, um tipo específico de inserção é um polipeptideo quimérico que incluem porções homólogas ou semelhantes de uma proteína relacionada no lugar da porção relacionada de uma proteina alvo. Isto pode incluir a inserção de um epitopo imunorreativo ou simplesmente um ou mais residues. Adições terminais, tipicamente chamadas de proteinas de fusão, também podem ser gerados.

Variantes de substituição contêm tipicamente a troca de um aminoácido por outro, em um ou mais sitios na proteina, e podem ser concebidos para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, com ou sem a perda de outras funções ou propriedades. As substituições podem ser conservadoras, isto é, um aminoácido é substituído por um de forma e carga semelhante. As substituições conservatives são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as mudanças de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e

valina para isoleucina ou leucina. Alternativamente, as substituições podem ser não conservadoras de tal modo que uma função ou atividade do polipeptideo é afetada. Alterações não conservativas envolvem tipicamente a substituição de um residuo com um que é quimicamente 5 diferente, tal como um aminoácido polar ou carregado para um aminoácido não polar ou não carregado, e vice-versa. 0 termo "códon funcionalmente equivalente" é aqui utilizado para se referir aos códons que codificam o mesmo aminoácido, tais como os seis códons para arginina ou 10 serina, e também se refere aos códons que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (ver Tabela 1, abaixo). Tabela 1. Tabela de códons

Também será compreendido que as sequências de aminoácido e ácido nucleico podem incluir residuos adicionais, tais como aminoácidos N ou C-terminais adicionais ou sequências 5' ou 3' , e ainda assim ser 5 essencialmente como definidas na presente invenção, incluindo possuir uma certa atividade biológica. A adição de sequências terminais aplica-se particularmente às sequências de ácidos nucleicos que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codificadoras flanqueando as porções 5' ou 3' da região codificadora, ou pode incluir várias sequências internas, isto é, introns, que são conhecidos por ocorrer nos genes.

A seguir está uma discussão baseada na mudança dos aminoácidos de uma proteína N, P, L, M ou G para criar uma molécula equivalente, ou mesmo melhorada. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura proteica sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação ao antígeno de anticorpos ou sítios de ligação em moléculas de substrato. Uma vez que é a capacidade interativa e natureza de uma proteína que define aquela atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína, e na sua sequência de codificação de DNA subjacente, e, no entanto, produzir uma proteína com propriedades semelhantes. É, deste modo, contemplado pelos inventores que várias alterações podem ser feitas nas sequências de ADN de rabdovírus sem perda apreciável da utilidade ou atividade biológica de interesse, como discutido abaixo.

Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de hidropático dos aminoácidos em conferir uma função biológica em uma proteina é geralmente entendido na técnica (Kyte e Doolittle, 1982). Admite-se que o carácter hidropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteina resultante, que por sua vez define a interação da proteina com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antigenos e semelhantes.

Também é compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade. A Patente norte-americana 4.554.101, aqui incorporada por referência, estabelece que a maior hidrofilicidade média local de uma proteina, como determinado pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com uma propriedade biológica da proteina. Como detalhado na Patente norte-americana 4.554.101, os valores de hidrofilicidade a seguir foram atribuidos aos residues de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1)'; serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0) ; treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (0,5); histidina *-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro com um valor de hidrofilicidade semelhante e ainda assim produzir uma proteína biologicamente equivalente e imunologicamente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de + 2 é preferida, aquelas que estão dentro de ± 1 são particularmente preferidas, e aquelas dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferidas.

Como descrito acima, as substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na semelhança relativa dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, suas hidrofobicidades, hidrofilicidades, cargas, tamanhos e similares. Exemplos de substituições que levam em consideração as várias características precedentes são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica ei incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

III. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO

A presente invenção inclui polinucleotídeos isoláveis de células que são capazes de expressar toda ou parte de uma proteína ou polipeptideo viral. Em algumas modalidades da invenção, ela refere-se a todo ou a partes de um genoma viral oue foi especificamente modificado ou alterado para gerar um virus ou polipeptídeo viral, por exemplo, um polipeptídeo ou vírus pseudotipado ou rabdoviral, com certas propriedades e/ou características. Os polinucleotídeos podem codificar um peptideo ou polipeptídeo contendo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos virai ou heteróloga ou ser manipulados de modo que eles não codifiquem tal polipeptídeo virai ou codifiquem um polipeptídeo virai possuindo pelo menos uma função ou atividade aumentada, reduzida, diminuída ou ausente. As proteínas recombinantes podem ser purificadas a partir de células com atividade de expressão para produzir proteínas ativas. 0 genoma dos membros de rabdovírus pode ser encontrado nos Número de Acesso GenBank no banco de dados NCBI ou em bancos de dados semelhantes, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência.

A. Polinucleotídeos que Codificam Proteínas Naturais ou Modificadas

Tal como aqui utilizado, o termo "RNA, DNA ou segmento de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de RNA, DNA ou de ácido nucleico que foi isolada livre do DNA genômico total ou outros contaminantes. Portanto, um segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo refere-se a um segmento de ácido nucleico que contém sequências que codificam polipeptídeos tipo selvagem, polimórficos ou mutantes, e que contém sequências que codificam polipeptídeos tipo selvagem, polimórfico ou mutantes, e ainda que são isoladas de ou purificadas sem ácido(s) nucleico(s) genômico(s). São incluídos no termo "segmento de ácido nucleico" os polinucleotídeos, segmentos de ácido nucleico menores do que um polinucleotídeo e vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, e similares.

Tal como utilizado neste pedido, o termo "rabdovirus" pode referir-se à molécula de ácido nucleico pseudotipada ou rabdoviral que codifica pelo menos um polipeptideo de rabdovirus. Em certas modalidades o polinucleotídeo foi isolado livre de outros ácidos nucleicos. Da mesma forma, um polinucleotídeo de vírus de Marabá, vírus de Carajás, vírus de Muir Springs e/ou vírus da Bahia Grande refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo do vírus de Marabá, vírus de Carajás, vírus de Muir Springs e/ou vírus da Bahia Grande que foi isolado de outros ácidos nucleicos. Um "genoma de rabdovirus" ou um vírus de Marabá, vírus de Carajás, vírus de Muir Springs e/ou vírus da Bahia Grande refere-se a um VSV ou uma molécula de ácido nucleico que pode ser fornecida a uma célula hospedeira para produzir uma partícula virai, na presença ou ausência de um vírus auxiliador ou regiões codificadoras complementares que fornecem outros fatores em trans. 0 genoma pode ou não ter sido recombinantemente modificado em comparação com o virus tipo selvagem ou um inalterado.

O termo "cDNA" destina-se a referir ao DNA preparado usando RNA como um molde. Pode haver momentos em que a sequência genômica completa ou parcial é preferida.

Também é contemplado que um polipeptideo particular, a partir de uma dada espécie, pode ser representado por variantes naturais que possuem sequências de ácido nucleico levemente diferentes, porém que codificam a mesma proteína (ver Tabela 1 acima).

Da mesma forma, um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo tipo selvagem ou modificado, isolado ou purificado, refere-se a um segmento de DNA, incluindo as sequências codificadoras de polipeptideo tipo selvagem ou mutante e, em certos aspectos, sequências reguladoras, isoladas substancialmente longe de outros genes que ocorrem naturalmente ou de sequências que codificam proteínas. Sob este aspecto, o termo "gene" termo é usado por questões de simplicidade para se referir a uma unidade de ácido nucleico que codifica uma proteína, polipeptideo ou peptídeo (incluindo quaisquer sequências necessárias para a transcrição, modificação pós-tradução ou localização adequada). Como será entendido pelas pessoas versadas na técnica, este termo funcional inclui sequências genômicas, sequências de cDNA, e segmentos de ácido nucleico manipulados menores que expressam, ou podem ser adaptados para expressar proteínas, polipeptídeos, domínios, peptideos, proteínas de fusão e mutantes. Um ácido nucleico que codifica todo ou parte de um polipeptídeo natural ou modificado pode conter i am ácido nucleico contíguo de: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1 020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 ou mais nucleotídeos, nucleosídeos ou pares de bases.

Em modalidades particulares, a invenção diz respeito a segmentos de ácido nucleico isolados e vetores recombinantes que incorporam sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo(s) de rabdovírus tipo selvagem ou mutantes que incluem dentro de sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos contigua de acordo com, ou essencialmente correspondendo a um polipeptideo natural. O termo "recombinante" pode ser utilizado em conjunto com um polipeptideb ou o nome de um polipeptideo específico, e isto se refere geralmente a um polipeptideo produzido a partir de uma molécula de ácido nucleico que tenha sido manipulada in vitro ou que seja o produto replicado de uma tal molécula.

Em outras modalidades, a invenção diz respeito aos segmentos de ácido nucleico isolados e vetores recombinantes que incorporam sequências nucleicas que codificam um polipeptideo ou peptídeo que inclui em sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos contígua de acordo com, ou essencialmente correspondente a um ou mais polipeptídeos de rabdovirus. Os segmentos de ácido nucleico utilizados na presente invento, independentemente do comprimento da sequência codificadora em si, podem ser combinados com outras sequências de ácidos nucleicos, tais como promotores, sinais de poliadenilação, locais da enzima de restrição adicionais, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos de codificação e similares, de tal modo que os seus comprimentos totais podem variar consideravelmente. É portanto, contemplado que um fragmento de ácido nucleico de quase todo o comprimento pode ser utilizado, com o comprimento total sendo de preferência limitado pela facilidade de preparação e utilização no protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido.

É contemplado que os constructos de ácido nucleico da presente invenção podem codificar polipeptideo(s) de comprimento total a partir de qualquer fonte ou codificam uma versão truncada ou modificada do(s) polipeptideo(s), por exemplo, um polipeptideo de rabdovírus truncado, de tal forma que o transcrito da região codificadora representa a versão truncada. A transcrição do truncado pode então ser traduzida em uma proteina truncada. Alternativamente, uma sequência de ácido nucleico pode codificar uma sequência de polipeptideo de comprimento completo com sequências codificadoras heterólogas adicionais, por exemplo, para permitir a purificação do peptideo, transporte, secreção, modificação pós-tradução ou para benefícios terapêuticos tais como o alvejamento ou eficácia. Como discutido acima, uma etiqueta ou outro polipeptideo heterólogo pode ser adicionado à sequência codificadora de polipeptideo modificada, em que "heterólogo" refere-se a um polipeptideo ou segmento do mesmo que não é igual que o polipeptideo modificado ou encontrado associado com ou codificado pelo virus de ocorrência natural.

Em um exemplo não limitativo, um ou mais constructos de ácido nucleico podem ser preparados, que incluem um filamento contiguo de nucleotideos idêntico ou complementar a um segmento virai particular, tal como um gene de rabdovírus N, P, M, G ou L. Um constructo de ácido nucleico pode ser de pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 15.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000, 250.000, 500.000, 750.000 até pelo menos 1.000.000 de nucleotideos de comprimento, bem como constructos de maior tamanho, até e incluindo os tamanhos cromossômicos (incluindo todos os comprimentos intermédios e faixas intermédias) . Será prontamente entendido que "comprimentos intermediários" e "faixas intermediárias", tal como aqui utilizado, significa qualquer comprimento ou faixa incluindo ou entre os valores mencionados (isto é, todos os números inteiros, incluindo e entre tais valores).

Os segmentos de ácido nucleico usados na presente invenção abrangem ácidos nucleicos modificados que codificam polipeptídeos modificados. Tais sequências podem surgir como consequência da redundância de códons e equivalência funcional que se sabe que ocorrem naturalmente em sequências de ácidos nucleicos e nas proteínas assim codificadas. Alternativamente, proteínas ou peptídeos funcionalmente equivalentes podem ser criados através da aplicação da tecnologia de DNA recombinante, em que as alterações na estrutura da proteína podem ser manipuladas, com base nas considerações das propriedades dos aminoácidos sendo trocados. Alterações projetadas por seres humanos podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagênese direcionada a sítio, por exemplo, para introduzir melhorias para a antigenicidade ou a sua falta da proteína, para reduzir os efeitos de toxicidade da proteína in vivo para um indivíduo a que foi dada a proteína, ou para aumentar a eficácia de qualquer tratamento envolvendo a proteína ou um vírus compreendendo tal proteína.

Em certas outras modalidades, a invenção diz respeito aos segmentos de ácido nucleico isolados e aos vetores recombinantes que incluem dentro da sequência deles uma sequência de ácido nucleico contígua daquela mostrada nas sequências aqui identificadas (e/ou incorporadas por referência). Tais sequências, no entanto, podem ser modificadas para produzir um produto de proteína cuja atividade é alterada em relação ao tipo selvagem.

Também será compreendido que esta invenção não está limitada ao ácido nucleico particular e às sequências de aminoácidos destas sequências identificadas. Vetores recombinantes e segmentos de ácido nucleico isolados podem, portanto, incluir variadamente regiões codificadoras de rabdovírus em si, regiões codificadoras possuindo alterações ou modificações selecionadas na região de codificação básica, ou elas podem codificar polipeptídeos maiores que, no entanto, incluem regiões codificadoras de rabdovírus, ou pode codificar proteínas ou peptídeos equivalentes biologicamente funcionais que possuem sequências de aminoácidos variantes.

Os segmentos de ácido nucleico da presente invenção podem codificar proteínas e peptídeos de rabdovírus que são o equivalente biológico funcional de, ou variantes ou mutantes de rabdovírus que aumentam o benefício terapêutico do vírus. Tais sequências podem surgir como consequência da redundância de códons e equivalência funcional que se sabe que ocorre naturalmente nas sequências de ácidos nucleicos e nas proteínas assim codificadas. Alternativamente, as proteínas ou peptídeo funcionalmente equivalentes podem ser criados através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante, em que as alterações na estrutura da proteína podem ser manipuladas, com base nas considerações das propriedades dos aminoácidos sendo trocados. Alterações concebidas pelo ser humano podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagênese direcionada a sitio, por exemplo, para introduzir melhorias na ligação das células cancerosas de uma proteína virai.

B. Mutagênese de Polinucleotídeos de Rabdovírus

Em várias modalidades, o polinucleotideo de rabdovírus pode ser alterado ou modificado. Alterações ou mutações podem incluir inserções, eliminações, mutações pontuais, inversões e semelhantes e podem resultar na modulação, 10 ativação e/ou inativação de determinadas proteínas ou mecanismos moleculares, bem como na alteração da função, localização ou expressão de um produto gênico, em particular que tornam um produto gênico não funcional. Onde empregada, a mutagênese de um polinucleotideo que codifica 15 todo ou parte de um rabdovírus pode ser realizada por uma variedade de procedimentos padrão mutagênicos (Sambrook et a., 2001). A mutação é o processo pelo qual mudanças ocorrem na quantidade ou na estrutura de um organismo. A mutação pode envolver a modificação da sequência de 20 nucleotideos de um único gene, blocos de genes ou genomas inteiros. Alterações em genes isolados podem ser a consequência de mutações pontuais que envolvem a remoção, a adição ou a substituição de uma única base de nucleotideos dentro de uma sequência de DNA, ou elas podem ser a )l consequência de alterações envolvendo a inserção ou eliminação de um grande número de nucleotídeos.

1. Mutagênese aleatória a. Mutagênese de Inserção

A mutagênese de inserção baseia-se na inativação de um gene através da inserção de um fragmento de ácido nucleico conhecido. Uma vez que isso envolve a inserção de algum tipo de fragmento de ácido nucleico, as mutações geradas são geralmente de perda de função, ao invés de mutações de ganho de função. No entanto, existem vários exemplos de inserções de geram mutações de ganho de função. A mutagênese de inserção pode ser realizada utilizando técnicas de biologia molecular padrão.

b. Mutagênese Química

A mutagênese química oferece certas vantagens, tais como a capacidade de encontrar uma faixa completa de mutações com graus de gravidade fenotipica, e é fácil e barata de realizar. A maioria dos carcinógenos químicos produzem mutações no DNA. Benzo[a]pireno, N-acetóxi-2- acetilaminofluoreno e aflotoxina BI causam transversões de GC para TA em bactérias e células de mamíferos. Benzo[a]pireno também pode produzir substituições de bases, tais como AT para TA. Compostos N-nitrosos produzem transições de GC para AT. A alquilação da posição 04 da timina induzida pela exposição à n-nitrosoureia resulta em transições de TA para CG.

c. Mutagênese por Radiação

As moléculas biológicas são degradadas por radiação ionizante. A adsorção da energia incidente leva à formação de ions e radicais livres, e à quebra de algumas ligações covalentes. A suscetibilidade a danos de radiação parece bastante variável entre as moléculas, e entre as diferentes formas cristalinas da mesma molécula. Isso depende da dose total acumulada, e também da taxa de dose (como uma vez que radicais livres estão presentes, o dano molecular que eles causam depende da sua taxa de difusão natural e, assim, do tempo real) . Dano é reduzido e controlado por tornar a amostra o mais fria possível. A radiação ionizante causa danos ao DNA, geralmente proporcionais à taxa de dose.

Na presente invenção, o termo "radiação ionizante" significa radiação compreendendo partículas ou fótons que têm energia suficiente ou podem produzir energia suficiente para produzir a ionização (ganho ou perda de elétrons). Uma radiação ionizante exemplar e preferida é uma radiação x. A quantidade de radiação ionizante necessária em uma dada célula ou para uma molécula particular geralmente depende da natureza daquela célula ou molécula e da natureza do alvo de mutação. Meios para determinar uma quantidade eficaz de radiação também são bem conhecidos na técnica.

d. Mutagênese de Varredura In Vitro

Mutagênese aleatória pode também ser introduzida utilizando PCR propenso a erro. A taxa de mutagênese pode ser aumentada através da realização de PCR em tubos múltiplos com diluições de moldes. Uma técnica de mutagênese particularmente útil é a mutagênese de varredura de alanina em que um número de residuos são substituídos individualmente com o aminoácido alanina de modo que os efeitos da perda de interações da cadeia lateral podem ser determinados, minimizando ao mesmo tempo o risco de perturbações em grande escala na conformação da proteina (Cunningham et al., 1989).

Mutagênese de saturação de varredura in vitro fornece um método rápido para a obtenção de uma grande quantidade de informações de estrutura-função, incluindo: (i) a identificação de residuos que modulam a especificidade de ligação do ligante; (ii) uma melhor compreensão da ligação do ligante com base na identificação desses aminoácidos que retêm a atividade e aqueles que abolem a atividade em um determinado local; (iii) uma avaliação da plasticidade global de um sitio ativo ou subdominio de proteina, (iv) a identificação das substituições de aminoácidos que resultam na ligação aumentada.

2. Mutagênese Direcionada a Sitio ç

Mutagênese sítio específica guiada pela estrutura representa uma poderosa ferramenta para a disseção e manipulação de interações proteína-ligante (Wells, 1996; Braisted et al., 1996). A técnica proporciona a preparação e teste de variantes da sequência através da introdução de uma ou mais alterações de sequências nucleotídicas em um DNA selecionado.

C. Vetores

Para gerar mutações em um genoma de rabdovirus, polipeptídeos nativos e modificados podem ser codificados por uma molécula de ácido nucleico compreendida em um vetor. O termo "vetor" é usado para se referir a uma molécula de ácido nucleico transportadora na qual uma sequência de ácido nucleico exógena pode ser inserida para introdução em uma célula onde ela pode ser replicada. Uma sequência de ácido nucleico pode ser "exógena", o que significa que ela é estrangeira para a célula em que o vetor está sendo introduzido ou que a sequência é homóloga a uma sequência na célula, mas em uma posição no ácido nucleico da célula hospedeira no qual a sequência normalmente não é encontrada. Vetores incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus (bacteriófago, vírus de animais e vírus de plantas), e cromossomos artificiais (por exemplo, YACs).

Urna pessoa versada na técnica poderia estar bem equipada para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão, que são descritas em Sambrook et al. (2001) e em Ausubel et al. (1994), ambas aqui incorporadas por referência.

Além da codificação de um polipeptídeo modificado, tal como uma proteina N, proteina P, proteína M, proteína G ou proteína L modificada, um vetor pode codificar sequências de polipeptídeo não modificadas, tais como uma etiqueta ou molécula de etiquetagem. Vetores úteis que codificam tais proteínas de fusão incluem os vetores pIN (Inouye et al., 1985), vetores que codificam um trecho de histidinas e vetores pGEX, para utilização na geração de proteínas de fusão solúveis de glutationa S-transferase (GST) para purificação posterior e separação ou clivagem. Uma molécula de alvejamento é uma que direciona o polipeptídeo modificado para um órgão particular, tecido, célula ou outro local no corpo de um indivíduo. Alternativamente, a molécula de alvejamento altera o tropismo de um organismo, tal como de rabdovírus para certos tipos de células, por exemplo, células cancerosas.

O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma parte de um produto do gene capaz de ser transcrito. Em alguns casos, as moléculas de RNA são traduzidas em uma proteina, polipeptideo ou peptideo. Em outros casos, estas sequências não são traduzidas, por exemplo, na produção de moléculas antissentido ou ribozimas. Os vetores de expressão podem conter uma variedade de "sequências de controle", que se referem às sequências de ácidos nucleicos necessárias para a transcrição e, possivelmente, tradução de uma sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular. Além das sequências de controle que regem a transcrição e tradução, os vetores e vetores de expressão podem conter sequências de ácido nucleico que servem a outras funções da mesma forma, e que são descritos abaixo.

1. Promotores e Intensificadores

Um "promotor" é uma sequência de controle que é uma região de uma sequência de ácido nucleico em que a iniciação e taxa de transcrição são controladas. Ele pode conter elementos genéticos que se ligam às proteinas e moléculas regulatórias como a RNA polimerase e outros fatores de transcrição. As frases "operativamente posicionado", "operativamente acoplado", "operativamente ligado", "sob controle", e "sob controle transcricional" significa que um promotor está em um local funcional correto e/ou orientação em relação a uma sequência de ácido nucleico para controlar a iniciação da transcrição e/ou expressão daquela sequência. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um "intensificador", que se refere a 5 uma sequência regula tória que atua em cis (cis-acting) envolvida na ativação da transcrição de uma sequência de ácido nucleico.

Um promotor pode ser um naturalmente associado com um gene ou sequência, tal como pode ser obtido por isolamento das sequências não codificadoras 5Z localizadas à montante do segmento e/ou éxon codificador. Tal promotor pode ser referido como "endógeno". Da mesma forma, um intensificador pode ser um naturalmente associado com uma sequência de ácido nucleico, localizada à jusante ou à montante daquela sequência. Alternativamente, certas vantagens serão obtidas pelo posicionamento do segmento de ácido nucleico codificante sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente associado com uma sequência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo refere-se também a um intensificador não normalmente associado com uma sequência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadoras de outros genes, e promotores ou intensificadores isolados a partir de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica, e os promotores ou intensificadores que não "ocorrem naturalmente", isto é, contendo elementos diferentes de diferentes regiões reguladoras transcricionais, e/ou mutações que alteram a expressão.

Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências podem ser produzidas utilizando clonagem recombinante e/ou tecnologia de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR™, juntamente com as composições aqui divulgadas (ver a Patente norte-americana 4.683.202, Patente norte-americana 5.928.906, cada uma aqui incorporada por referência). Além disso, é contemplado que as sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências nas organelas não nucleares como as mitocôndrias, cloroplastos e semelhantes, podem ser utilizadas da mesma forma.

Naturalmente, pode ser importante utilizar um promotor e/ou intensificador que direciona eficazmente a expressão do segmento de ácido nucleico no tipo de célula, organela e organismo escolhido para expressão. As pessoas versadas na técnica de biologia molecular geralmente conhecem a utilização de promotores, intensificadores e combinações de tipos celulares para a expressão da proteina, por exemplo, ver Sambrook et al. (2001), aqui incorporado por referência. Os promotores utilizados podem ser constitutivos, específicos de tecidos, seletivos de células (isto é, mais ativos em um tipo de célula em comparação com outro), induzíveis e/ou úteis, nas condições apropriadas para direcionar o alto nível de expressão do segmento de ácido nucleico introduzido, tal como é vantajoso na produção em grande escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. 0 promotor pode ser heterólogo ou endógeno.

Vários elementos/promotores podem ser utilizados, no contexto da presente invenção, para regular a expressão de um gene. Esta lista não pretende ser exaustiva de todos os possíveis elementos envolvidos na ■promoção de expressão, mas, meramente, ser exemplificadora dos mesmos. Também são fornecidos exemplos de elementos induzíveis, que são regiões de uma sequência de ácido nucleico que pode ser ativada em resposta a um estímulo específico. Promotor/Intensificador (Referências) incluem: cadeia pesada da imunoglobulina (Banerji et al., 1983; Gilles et al., 1983; Grosschedl et al., 1985; Atchinson et al., 1986, 1987; Imler et al., 1987; Weinberger et al., 1984; Kiledjian et al., 1988; Porton et al., 1990); cadeia leve da imunoglobulina (Queen et al. , 1983; Picard et al., 1984); receptor de célula T (Luria et al., 1987; Winoto et al., 1989; Redondo et al.; 1990); DQ α e/ou DQ β de HLA (Sullivan et al., 1987); interferon β (Goodbourn et al., 1986; Fujita et al., 1987; Goodbourn et al., 1988); Interleucina-2 (Greene et al., 1989); Receptor da interleucina-2 (Greene et al., 1989; Lin et al., 1990); MHC de classe II 5 (Koch et al., 1989); HLA-DRa de MHC de Classe II (Sherman et al., 1989); β-Actina (Kawamoto et al., 1988; Ng et al.; 1989); Quinase da Creatina Muscular (MCK) (Jaynes et al., 1988; Horlick et al., 1989; Johnson et al., 1989); Pré-albumina (Trnstiretina) (Costa et al., 1988); Elastase I (Omitz et al., 1987); Metalotioneina (MTII) (Karin et al., 1987; Culotta et al., 1989); Colagenase (Pinkert et al., 1987; Angel et al., 1987); Albumina (Pinkert et al., 1987; Tronche et al., 1989, 1990); α-Fetoproteina (Godbout et al., 1988; Campere et al., 1989); y-Globina (Bodine et al., 1987; Perez-Stable et al., 1990); β-Globina (Trudel et al., 1987); c-fos (Cohen et al., 1987); c-HA-ras (Triesman, 1986; Deschamps et al., 1985); Insulina (Edlund et al., 1985); Molécula de Adesão da Célula Neural (NCAM) (Hirsh et al., 1990); αl- Antitripaina (Latimer et al., 1990); Histona H2B (TH2B) (Hwang et al., 1990); Colágeno de Camundongo e/ou Tipo I (Ripe et al., 1989); Proteínas Reguladas pela Glicose (GRP94 e GRP78) (Chang et al., 1989); Hormônio do Crescimento de Rato (Larsen et al., 1986); Amiloide de Soro Humano A (SAA) (Edbrooke et al., 1989); Troponina I (TN I) (Yutzey et al., 1989); Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) (Pech et al., 1989); Distrofia Muscular de Duchenne (Klamut et al., 1990); SV40 (Banerji et al., 1981; Moreau et al., 1981; Sleigh et al., 1985; Firak et al., 1986; Herr et al., 1986; Imbra et al., 1986; Kadesch et al., 1986; Wang et al., 1986; Ondek et al., 1987; Kuhl et al., 1987; Schaffher et al., 1988); Polioma (Swartzendruber et al., 1975; Vasseur et al., 1980; Katinka et al., 1980, 1981; Tyndell et al., 1981; Dandolo et al., 1983; de Villiers et al., 1984; Hen et al., 1986; Satake et al., 1988; Campbell et al., 1988); Retrovirus (Kriegler et al., 1982, 1983; Levinson et al., 1982; Kriegler et al., 1983, 1984a, b, 1988; Bosze et al., 1986; Miksicek et al., 1986; Celander et al., 1987; Thiesen et al., 1988; Celander et al., 1988; Choi et al., 1988; Reisman et al., 1989); Papiloma Vírus (Campo et al., 1983; Lusky et al., 1983; Spandidos e Wilkie, 1983; Spalholz et al., 1985; Lusky et al., 1986; Cripe et al., 1987; Gloss et al., 1987; Hirochika et al., 1987; Stephens et al., 1987); Vírus da Hepatite B (Bulia et al., 1986; Jameel et al., 1986; Shaul et al., 1987; Spandau et al., 1988; Vannice et al., 1988); Vírus da Imunodeficiência Humana (Muesing et al., 1987; Hauber et al., 1988; Jakobovits et al., 1988; Feng et al., 1988; Takebe et al., 1988; Rosen et al., 1988; Berkhout et al., 1989; Laspia et al., 1989; Sharp et al., 1989; Braddock et al., 1989); Citomegalovírus (CMV) (Weber et al., 1984; Boshart et al., 1985; Foecking et al., 1986); e Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (Holbrook et al., 1987; Quinn et al., 1989).

Elementos induzíveis (Elemento/Indutor (Referências)) incluem: MT II/Éster de Forbol (TNFA), Metais pesados (Pal miter et al., 1982; Has linger et al., 1985; Searle et al., 1985; Stuart et al., 1985; Magana et al., 1987, Karin et al., 1987; Angel et al., 1987b; McNeal et al., 1989); MMTV (vírus do tumor mamário de camundongo)/Glicocortcoides (Huang et al., 1981; Lee et al., 1981; Majors et al., 1983; Chandler et al., 1983; Lee et al., 1984; Ponta et al., 1985; Sakai et al., 1988); β-Interferon/poli(ri)x, poly(rc) (Tavernier et al., 1983); Adenovirus 5 E2/E1A (Imperiale et al., 1984); Colagenase/Éster de Forbol (TP A) (Angel et al., 1987a); Estromelisina/Éster de Forbol (TP A) (Angel et al., 1987b); SV40/Éster de Forbol (TP A) (Angel et al., 1987b); Gene MX/Interferon de Murino, Virus da Doença de

Newcastle (Hug et al., 1988); Gene GRP78/A23187 (Resendez et al., 1988); α-2-Macroglobulina/IL-6 (Kunz et al., 1989); Vimentina/Soro (Rittling et al., 1989); Gene MHC de Classe I H-2Kb/Interferon (Blanar et al., 1989); HSP70/E1A, Antigen© T Grande de SV40 (Taylor et al., 1989, 1990a, 1990b); Proliferina/Éster de Forbol-TPA (Mordacq et al., 1989); Fator de Necrose Tumoral/PMA (Hensel et al., 1989); e α Gene do Hormônio Estimulador da Tireoide/Hormônio da Tireoide (Chatterjee et al., 1989).

A identidade dos promotores ou elementos tecido- especificos ou tecido-seletivos (isto é, os promotores que têm uma maior atividade em uma célula em comparação com outra), bem como ensaios para caracterizar a atividade deles, é bem conhecida pelas pessoas versadas na técnica. Exemplos de tais regiões incluem o gene LIMK2 humano (Nomoto et al. 1999), o gene do receptor da somatostatina 2 (Kraus et al., 1998), o gene de ligação ao ácido retinoico epididimal de murino (Lareyre et al., 1'999), CD4 humano (Zhao-Emonet et al., 1998), colágeno alfa 2 (XI) humano (Tsumaki, et al., 1998), gene do receptor de dopamina DIA (Lee, et al., 1997), fator de crescimento tipoinsulina II (Wu et al., 1997), molécula de adesão 1 de células endoteliais plaquetárias humanas (Almendro et al., 1996) e o promotor SM22<x.

Promotores virais adicionais, promotores/intensificadores celulares e promotores/intensificadores induzíveis que poderiam ser usados em combinação com a presente invenção estão listados 5 neste documento. Além disso, qualquer combinação de promotor/intensificador (conforme o Banco de Dados de Promotores Eucarióticos EPDB) poderia também ser usada para direcionar a expressão de genes estruturais que codificam enzimas processadoras de oligossacarideos, proteinas 10 acessórias de dobragem de proteína, proteínas marcadoras selecionáveis ou uma proteína heteróloga de interesse. Alternativamente, um promotor tecido-específico para a terapia do gene de câncer (Tabela 2) ou o alvejamento de tumores (Tabela 3) pode ser utilizado com as moléculas de 15 ácido nucleico da presente invenção. Tabela 2. Promotores Tecido-Específicos Candidatos para a Terapia Genica do Câncer

2. Sinais d© Iniciação e Sítios de Ligação de Ribossomo Internos

Um sinal de iniciação específico também pode ser necessário para a tradução eficiente de sequências de codificação. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Pode ser necessário que sinais de controle de tradução exógenos, incluindo o códon de iniciação ATG, sejam fornecidos. Uma pessoa normalmente versada na técnica poderia ser prontamente capaz de determinar isto e fornecer os sinais necessários. É bem conhecido que o códon de iniciação deve estar "no quadro" com o quadro de leitura da sequência de codificação desejada para assegurar a tradução de toda a inserção. Os sinais de controle de tradução exógenos e os códons de iniciação podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados.

Em certas modalidades da invenção, a utilização de elementos de sitios de entrada de ribossomo internos (IRES) são usados para criar mensagens multigênicas ou policistrônicas. Elementos IRES são capazes de ignorar o modelo de varredura de ribossomo de tradução dependente de Cap 5' metilado e começar a tradução nos sitios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988). Elementos IRES de dois membros da família picornavírus (polio e encefalomiocardite) foram descritos (Pelletier e Sonenberg, 1988), bem como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak e Sarnow, 1991). Elementos IRES podem ser ligados a quadros de leitura abertos heterólogo. Múltiplos quadro de leitura abertos podem ser transcritos em conjunto, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada quadro de leitura aberto é acessível aos ribossomos para tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem (ver as Patentes Americanas 5.925.565 e 5.935.819, aqui incorporadas por referência).

3. Sítios de Clonagem Múltiplos

Vetores podem incluir um sítio de clonagem múltiplo (MCS), que é uma região de ácido nucleico que contém múltiplos sitio de enzima de restrição, qualqu'er um dos quais pode ser usado juntamente conjunção com a tecnologia recombinante padrão para digerir o vetor. (Ver carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, e Cocea, 1997, aqui incorporados por referência.) "Digestão de enzima de restrição" refere-se à divagem catalítica de uma molécula de ácido nucleico com uma enzima que funciona apenas em locais específicos em uma molécula de ácido nucleico. Muitas destas enzimas de restrição são comercialmente disponíveis. A utilização de tais enzimas é amplamente compreendida pelas pessoas versadas na técnica. Frequentemente, um vetor é linearizado ou fragmentado utilizando uma enzima de restrição que corta no MCS para permitir que sequências exógenas sejam ligadas ao vetor. "Ligação" refere-se ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico, que podem ou não ser contíguos um com o outro. Técnicas que envolvem enzimas de restrição e reações de ligação são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica da tecnologia recombinante.

4. Sinais de Terminação

Os vetores ou constructos da presente invenção geralmente compreenderão, pelo menos, um sinal de terminação. Um "sinal de terminação" ou "terminador" é compreendido de sequências de RNA envolvidas na terminação especifica de um transcrito de RNA por uma RNA polimerase. Assim, em certas modalidades, um sinal de terminação que termina a produção de um transcrito de RNA é contemplado. Um terminador pode ser necessário in vivo para alcançar níveis de mensagem desejáveis.

Em vírus de RNA de sentido negativo, incluindo rabdovírus, a terminação é definida por uma porção de RNA.

Terminadores contemplados para utilização na invenção incluem qualquer terminador conhecido da transcrição aqui descrito ou conhecido por uma pessoa versada na técnica, incluindo, mas sem se limitar, por exemplo, às sequências de terminação dos genes, tais como, por exemplo, o terminador do hormônio de crescimento bovino ou sequências de terminação virai, tais como, por exemplo, o terminador SV40. Em certas modalidades, o sinal de terminação pode ser uma falta de sequência trascrevível ou traduzível, tal como devido a um truncamento de sequência.

5. Sinais de Poliadenilação

Na expressão, particularmente expressão eucariótica, uma pessoa irá tipicamente incluir um sinal de poliadenilação para efetuar a poliadenilação adequada do transcrito. Acredita-se que a natureza do sinal de poliadenilação não seja crucial para a prática bem sucedida da invenção, e/ou qualquer tal sequência pode ser utilizada. As modalidades preferidas incluem o sinal de poliadenilação SV40 e/ou o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, conveniente e/ou conhecido por funcionar bem em várias células alvo. A poliadenilação pode aumentar a estabilidade do transcrito ou pode facilitar o transporte citoplasmático.

6. Origens de replicaçâo

A fim de propagar um vetor em uma célula hospedeira, ele pode conter uma ou mais origens de sítios de replicaçâo (frequentemente designados "ori"), que é uma sequência de ácido nucleico específica em que a replicaçâo é iniciada. Alternativamente uma sequência de replicaçâo autônoma (ARS) pode ser utilizada se a célula hospedeira é levedura.

7. Marcadores Selecionáveis e Rastreáveis

Em certas modalidades da invenção, as células que contêm um constructo de ácido nucleico da presente invenção podem ser identificadas in vitro ou in vivo, incluindo um marcador no vetor de expressão. Tais marcadores poderiam conferir uma mudança identificável para a célula, permitindo a fácil identificação de células contendo o vetor de expressão. Geralmente, um marcador selecionável é um que confere uma propriedade que permite a seleção. Um marcador selecionável positivo é um em que a presença do marcador permite a sua seleção, enquanto que um marcador selecionável negativo é aquele em que a sua presença previne a sua seleção. Um exemplo de um marcador selecionável positivo é um marcador de resistência a fármacos.

Geralmente a inclusão de um marcador de seleção de fármacos auxilia na clonagem e identificação dos transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores selecionáveis úteis. Além dos marcadores que conferem um fenótipo que permite a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, outros tipos de marcadores, incluindo marcadores rastreáveis como GFP, cuja base é a análise colorimétrica, são também contemplados. Alternativamente, enzimas rastreáveis tais como a timidina cinase do virus herpes simplex (tk) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT) podem ser utilizadas. Uma pessoa versada na técnica também poderia saber como utilizar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunto com a análise FACS. Não se acredita que o marcador utilizado seja importante, contanto que ele seja capaz de ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico que codifica um produto gênico. Outros exemplos de marcadores selecionáveis e rastreáveis são bem conhecidos por uma pessoa normalmente versada na técnica.

D. Células Hospedeiras

Como usado aqui, os termos "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" podem ser usados de forma intercambiável. Todos esses termos também incluem as suas progenias, que é qualquer e todas as gerações subsequentes. Entende-se que toda a progenia pode não ser idêntica devido às mutações deliberadas ou inadvertidas. No contexto de expressão de uma sequência de ácido nucleico heteróloga, "célula hospedeira" refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica, e inclui quaisquer organismos transformáveis que sejam capazes de replicar um vetor e/ou de expressar um gene heterólogo codificado por um vetor. Uma célula hospedeira pode, e foi utilizada como um receptor para os vetores ou vírus (que não é considerado um vetor se ele não expressa polipeptídeos exógenos). Uma célula hospedeira pode ser "transfectada" ou "transformada", que se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno, tal como uma sequência que codifica uma proteína, é transferida ou introduzida na célula hospedeira. Uma célula transformada inclui a célula do indivíduo primária e a sua progenia.

As células hospedeiras podem ser derivadas de procariotos ou eucariotos, incluindo células de levedura células de inseto e células de mamíferos, dependendo se o resultado desejado é a replicaçâo do vetor ou expressão de parte ou de todas as sequências de ácido nucleico codificadas por vetor. Várias linhagens celulares e culturas estão disponíveis para utilização como uma célula hospedeira, e elas podem ser obtidas através da American Type Culture Collection (ATCC), que é uma organização que serve como um repositório para culturas vivas e materiais genéticos (www.atcc.org). Um hospedeiro apropriado pode ser determinado por uma pessoa versada na técnica com base na estrutura do vetor e no resultado desejado. Um plasmídeo ou cosmídeo, por exemplo, pode ser introduzido em uma célula hospedeira procariótica para a replicaçâo de muitos vetores. As células bacterianas utilizadas como células hospedeiras para replicaçâo e/ou expressão do vetor incluem DH5α, JM109 e KC8, bem como um número de hospedeiros bacterianos comercialmente disponíveis tais como as Células Competentes Sure® e Células Ouro SOLOPACK™ (STRATAGENE®, La Jolla, CA) . Alternativamente, as células bacterianas tais como E. coli LE392 poderiam ser utilizadas como células hospedeiras para os vírus de fagos. Células de levedura apropriadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe e Pichia pastoris,

Exemplos de células hospedeiras eucarióticas para a replicação e/ou expressão de um vetor incluem HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos e PC12. Muitas células hospedeiras de vários tipos de células e organismos estão disponíveis e seriam conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Da mesma forma, um vetor virai pode ser usado em conjunto com qualquer uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica, particularmente uma que é permissiva para a replicação ou a expressão do vetor.

Alguns vetores podem utilizar sequências de controle que lhe permitem ser replicados e/ou expressos em ambas as células procarióticas e eucarióticas. Uma pessoa versada na técnica poderia ainda compreender as condições sob as quais incubar todas as células hospedeiras acima descritas para mantê-las e para permitir a replicação de um vetor. Também são compreendidas e conhecidas as técnicas e condições que permitiriam a produção em grande escala de vetores, bem como a produção dos ácidos nucleicos codificados por vetores e seus polipeptídeos, proteínas ou peptídeos cognatos.

E. Sistemas de Expressão

Vários sistemas de expressão existem que compreendem pelo menos todas ou parte das composições acima discutidas. Sistemas à base de procariotos ou eucriotos podem ser utilizados para uso com a presente invenção para produzir sequências de ácidos nucleicos, ou os seus polipeptídeos cognatos, proteinas e peptideos. Muitos dos tais sistemas são comercialmente e amplamente disponíveis.

O sistema de células de insetos/baculovlrus pode produzir um elevado nivel de expressão de proteina de um segmento de ácido nucleico heterólogo, tal como descrito nas Patentes Americanas 5.871.986 e 4.879.236, ambas aqui incorporadas por referência, e que podem ser compradas, por exemplo, sob o nome MAXBAC® 2,0 junto à Invitrogen® e BACPACK™ BACULOVIRUS EXPESSION SIYSTEM FROM CLONTECH®.

Além dos sistemas de expressão divulgados da invenção, outros exemplos de sistemas de expressão incluem p sistema de Expressão de Mamífero Induzivel COMPLETE CONTROL™ da STRATAGENE®, o qual envolve um receptor induzivel por ecdisona sintético ou o seu sistema de expressão pET, um sistema de expressão de E. coli. Outro exemplo de um sistema de expressão induzivel está disponível junto à Invitrogen®, que transporta o Sistema T-Rex™ (expressão regulada por tetraciclina), um sistema de expressão de mamífero induzivel que usa o promotor CMV de comprimento total. INVITROGEN® também fornece um sistema de expressão de levedura chamado de Sistema de Expressão de Pichia methanolica, que é concebido para a produção em alto nivel de proteinas recombinantes na levedura metilotrófica Pichia methanolica. Uma das pessoas versadas na técnica poderia saber como expressar um vetor, tal como um construct© de expressão, para produzir uma sequência de ácido nucleico ou o seu polipeptideo, proteina ou peptídeo cognato.

F. Detecção de Ácido Nucleico

Além do uso no direcionamento da expressão de proteínas poxvirus, polipeptídeos e/ou peptídeos, as sequências de ácido nucleico aqui divulgadas possuem uma variedade de outros usos. Por exemplo, eles têm utilidade como sondas ou iniciadores para modalidades que envolvem a hibridização de ácido nucleico. Eles podem ser utilizados em métodos de diagnóstico ou de varredura da presente invenção. A detecção de ácidos nucleicos que codificam rabdovírus ou moduladores do polipeptideo de rabdovírus são englobados pela invenção.

1. Hibridização

A utilização de uma sonda ou iniciador entre 13 e 100 nucleotídeos, de preferência entre 17 e 100 nucleotídeos de comprimento, ou em alguns aspectos da invenção, de até 1 a 2 quilobases ou mais de comprimento, permite a formação de uma molécula duplex que é tanto estável quanto seletiva. Moléculas possuindo sequências complementares em filamentos contíguos superiores a 20 bases de comprimento são geralmente preferidos, para aumentar a estabilidade e/ou a seletividade das moléculas híbridas obtidas. Uma pessoa irá geralmente preferir projetar moléculas de ácido nucleico para a hibridização possuído uma ou mais sequências complementares de 20 a 30 nucleotideos, ou até mesmo mais 5 longas, onde desejado. Tais fragmentos podem ser prontamente preparados, por exemplo, pela síntese direta do fragmento por meios químicos ou por introdução de sequências selecionadas em vetores recombinantes para a produção recombinante.

Consequentemente, as sequências de nucleotideos da invenção podem ser utilizadas para as suas capacidades para seletivamente formar moléculas duplex com trechos complementares de DNAs e/ou RNAs ou para fornecer iniciadores para a amplificação de DNA ou RNA de amostras.

Dependendo da aplicação visada, uma pessoa poderia desejar utilizar várias condições de hibridização para atingir graus variados de seletividade da sonda ou iniciadores para a sequência alvo.

Para aplicações que requerem alta seletividade, uma 20 pessoa irá tipicamente desejar utilizar condições de estringência relativamente altas para formar os híbridos. Por exemplo, condições salinas relativamente baixas e/ou de temperatura elevada, tais como aquelas proporcionadas por cerca de 0,02 M a cerca de 0,10 M de NaCl em temperaturas de cerca de 50 °C até cerca de 7 0 °C. Tais condições de alta estringência toleram pouco, se algum, mau emparelhamento entre a sonda ou sondas e o molde ou filamento alvo e poderiam ser particularmente adequadas para o isolamento de genes específicos ou para a detecção de transcritos de RNAm específicos. Ê geralmente percebido que condições podem se tornar mais estringentes pela adição de quantidades crescentes de formamida.

Para certas aplicações, por exemplo, a mutagênese direcionada a sítio, é percebido que as condições de estringência baixa são preferidas. Sob estas condições, a hibridização pode ocorrer embora as sequências dos filamentos de hibridização não sejam perfeitamente complementares, mas são mal emparelhados em uma ou mais posições. As condições podem se tornar menos estringentes pelo aumento da concentração salina e/ou diminuição da temperatura. Por exemplo, uma condição de estringência média poderiam ser fornecida por cerca de NaCl 0,1 a 0,25 M em temperaturas de cerca de 37 °C a cerca de 55 °C, enquanto que uma condição de baixa estringência poderia ser proporcionada por cerca de 0,15 M a cerca de 0,9 M de sal, em temperaturas variando de cerca de 20 °C até cerca de 55 °C. As condições de hibridização podem ser prontamente manipuladas, dependendo dos resultados desejados.

Em outras modalidades, a hibridização pode ser conseguida sob condições, por exemplo, de Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KC1 75 mM, MgC12 3 mM, ditiotreitol 1,0 mM, em temperaturas entre aproximadamente 20 °C até cerca de 37 °C. Outras condições de hibridização utilizadas poderiam incluir aproximadamente Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KC1 50 mM, MgC12 1,5 mM, em temperaturas que variam de aproximadamente 40 °C até cerca de 72 °C.

Em certas modalidades, será vantajoso utilizar ácidos nucleicos de sequências definidas da presente invenção em combinação com um meio apropriado, tal como um marcador, para determinar a hibridização. Uma grande variedade de meios indicadores apropriados são conhecidos na técnica, incluindo fluorescentes, radioativos, enzimáticos ou outros ligantes, tais como avidina/biotina, que são capazes de serem detectados. Em modalidades preferidas, uma pessoa pode desejar utilizar um marcador fluorescente ou uma etiqueta de enzima tal como a urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, em vez de reagentes radioativos ou outros ambientalmente indesejáveis. No caso de etiquetas enzimáticas, substratos indicadores colorimétricos são conhecidos que podem ser utilizados para fornecer um meio de detecção que é visivelmente ou espectrofotometricamente detectável, para identificar a hibridização específica com amostras contendo ácido nucleico complementar.

Em geral, é previsto que as sondas ou iniciadores aqui descritos serão úteis como reagentes na hibridização da solução, como em PCR™, para a detecção da expressão de 5 genes correspondentes, assim como em modalidades utilizando uma fase sólida. Em modalidades que envolvem uma fase sólida, o DNA (ou RNA) de teste é adsorvido ou, de outro modo, fixo a uma matriz ou superfície selecionada. Este ácido nucleico fixo de cadeia simples é a seguir submetido 10 à hibridização com sondas selecionadas sob condições desejadas. As condições selecionadas dependerão das circunstâncias particulares (dependendo, por exemplo, do teor G+C, do tipo de ácido nucleico alvo, da fonte de ácido nucleico, do tamanho da sonda de hibridização, etc.) A 15 otimização das condições de hibridização para a aplicação particular de interesse é bem conhecida para as pessoas versadas na técnica. Após lavagem das moléculas hibridizadas para remover moléculas de sonda não especificamente ligadas, a hibridização é detectada, e/ou 20 quantificada, através da determinação da quantidade de marcador ligado. Métodos de hibridização em fase sólida representativos são divulgados nas Patentes Americanas Nos. 5.843.663, 5.900.481 e 5.919.626. Outros métodos de hibridização que podem ser utilizados na prática da presente invenção são divulgado nas Patentes Americanas 5.849.481, 5.849.486 e 5.851.772. As porções relevantes destas e de outras referências identificadas nesta seção do Relatório Descritivo são aqui incorporadas por referência.

2. Amplificação de Ácidos Nucleicos

Os ácidos nucleicos utilizados como um molde para a amplificação podem ser isolados a partir de células, tecidos ou outras amostras de acordo com metodologias padrão (Sambrook et al., 2001). Em certas modalidades, a análise é realizada em células inteiras ou em homogeneizados de tecido ou amostras de fluidos biológicos sem purificação substancial do ácido nucleico molde. O ácido nucleico pode ser DNA genômico ou fracionado ou RNA de célula inteira. Onde o RNA é usado, pode ser desejado primeiro converter o RNA a um DNA complementar.

O termo "iniciador", tal como é aqui utilizado, destina-se a englobar qualquer ácido nucleico que seja capaz de iniciar a sintese de um ácido nucleico nascente em um processo dependente de molde. Tipicamente, os iniciadores são oligonucleotideos de dez a vinte e/ou trinta pares de base de comprimento, porém sequências mais longas podem ser utilizadas. Os iniciadores podem ser fornecidos na forma de fita dupla e/ou de fita simples, embora a forma de fita simples seja preferida.

Pares de iniciadores projetados para hibridizar seletivamente em ácidos nucleicos correspondendo às sequências de genes aqui identificados entram em contato com o ácido nucleico molde sob condições que permitem a hibridização seletiva. Dependendo da aplicação desejada, condições de hibridização de alta estringência podem ser selecionadas que irão apenas permitir a hibridização para sequências que são completamente complementares aos iniciadores. Em outras modalidades, a hibridização pode ocorrer sob estringência reduzida para permitir a amplificação de ácidos nucleicos que contêm um ou piores emparelhamentos com as sequências iniciadoras. Uma vez hibridizado, o complexo molde-iniciador entra em contato com uma ou mais enzimas que facilitam a síntese de ácido nucleico dependente de molde. Múltiplos ciclos de amplificação, também referidos como "ciclos", são realizados até uma quantidade suficiente de produto de amplificação ser produzida.

Uma variedade de processos dependentes de molde são disponíveis para amplificar as sequências de oligonucleotídeos presentes em uma amostra determinada amostra modelo. Um dos métodos de amplificação mais bem conhecidos é a reação em cadeia da polimerase (referida como PCR™), que é descrito em detalhes nas Patentes

Americanas 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159, e em Innis et al., 1988, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência nas suas totalidades.

Um procedimento de amplificação de PCR™ de transcriptase reversa pode ser realizado para quantificar a quantidade de mRNA amplificado e são bem conhecidos (ver Sambrook et al., 2001; WO 90/07641; e a Patente norte- americana 5.882.864).

Outro método para a amplificação é a reação em cadeia da ligase ("LCR"), divulgado no Pedido Europeu No. 320 308, aqui incorporado por referência na sua totalidade. A Patente norte-americana 4.883.750 descreve um método semelhante à LCR para a ligação de pares de sonda a uma sequência alvo. Um método baseado em PCR™ e ensaio da oligonucleotídeo ligase (OLA), divulgado na Patente norte- americana 5.912.148, podem também ser utilizado. Métodos alternativos para a amplificação de sequências de ácido nucleico alvo que podem ser utilizados na prática da presente invenção são divulgados nas Patentes Americanas 5.843.650, 5.846.709, 5.846.783, 5.849.546, 5.849.497, 5.849.547, 5.858.652, 5.866.366, 5.916.776, 5.922.574, 5.928.905, 5.928.906, 5.932.451, 5.935.825, 5.939.291 e 5.942.391, Pedido GB No. 2 202 328, e no Pedido PCT No. US89/01025, cada um dos quais sendo aqui incorporado por referência nas suas totalidades. Qbeta replicase, descrita no Pedido PCT No. PCT/US87/00880, pode também ser utilizada como um método de amplificação na presente invenção. A amplificação isotérmica como descrita por Walker et al. (1992) também pode ser usada. Bem como a Amplificação por Deslocamento de Fita (SDA), divulgada na Patente norte- americana 5.916.779.

Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico que incluem sistemas de amplificação baseados na transcrição (TAS), incluindo amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (NASBA) e 3SR (Kwoh et al., 1989; Pedido PCT WO 88/10315, aqui incorporados por referência nas suas totalidades) . O Pedido Europeu No. 329 822 divulga um processo de amplificação de ácido nucleico que envolve a sintese ciclicamente de RNA de fita simples ("ssRNA"), ssDNA, e DNA de fita dupla (dsDNA), que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção.

O Pedido PCT WO 89/06700 (aqui incorporado por referência na sua totalidade) descreve um esquema de amplificação de sequência de ácido nucleico com base na hibridização de uma região promotora/sequência de iniciação para um DNA e fita simples alvo ("ssDNA") seguido pela transcrição de muitas cópias de RNA da sequência. Outros métodos de amplificação incluem "RACE" e "PCR unilateral (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989).

3. Detecção de Ácidos Nucleicos

Após qualquer amplificação, pode ser desejável separar e/ou isolar o produto de amplificação do molde e/ou o iniciador em excesso. Em uma modalidade, os produtos de amplificação são separados por eletroforese em gel de agarose, agarose-acrilamida ou poliacrilamida usando métodos padrão (Sambrook et al., 2001).

A separação de ácidos nucleicos pode também ser realizada por técnicas cromatográficas conhecidas na arte. Existem muitos tipos de cromatografia que podem ser utilizados na prática da presente invenção, incluindo cromatografia de adsorção, partição, troca iônica, de hidroxilapatita, de peneira molecular, de fase reversa, em coluna, em papel, em camada fina e a gás, bem como HPLC.

Métodos de visualização tipicos incluem o manchamento de um gel com brometo de etidio e a visualização das bandas sob luz UV. Alternativamente, se os produtos de amplificação são integralmente marcados com nucleotídeos radio ou fluorimetricamente marcados, os produtos de amplificação separados podem ser expostos a filme de raio-X ou visualizados sob os espectros excitatórios apropriados.

Em modalidades particulares, a detecção é por Southern blotting e hibridização com uma sonda marcada. As técnicas envolvidas no Southern blotting são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica (ver Sambrook et al, 2001). Um exemplo do precedente é descrito na Patente norte-americana 5.279.721, aqui incorporada por referência, que divulga um aparelho e um método para a eletroforese automatizada e transferência de ácidos nucleicos. Outros métodos de detecção de ácido nucleico que podem ser utilizados na prática da presente invenção são divulgados na Patentes Americanas 5.840.873, 5.843.640, 5.843.651, 5.846.708, 5.846.717, 5.846.726, 5.846.729, 5.849.487, 5.853.990, 5.853.992, 5.853.993, 5.856.092, 5.861.244, 5.863.732, 5.863.753, 5.866.331, 5.905.024, 5.910.407, 5.912.124, 5.912.145, 5.919.630, 5.925.517, 5.928.862, 5.928.869, 5.929.227, 5.932.413 e 5.935.791, cada uma das quais sendo aqui incorporada por referência.

4. Outros Ensaios

Outros métodos para a varredura genética podem ser utilizados dentro do escopo da presente invenção, por exemplo, para detectar mutações nas amostras de ácidos nucleicos genômicos, cDNA e/ou RNA. Os métodos utilizados para detectar mutações pontuais incluem eletroforese em gel de gradiente desnaturante ("DGGE"), análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ("RFLP"), métodos de clivagem quimica ou enzimática, sequenciamento direto das regiões alvo amplificadas por PCR™ (ver acima), análise de polimorfismo conformacional de fita simples ("SSCP") e outros métodos bera conhecidos na técnica. Um método de varredura para mutações pontuais baseia-se na clivagem da RNase de maus emparelhamentos de pares de bases em heterodúplexes de RNA/DNA ou RNA/RNA. Tal como aqui utilizado, o termo "mau emparelhameno" é definido como uma região de um ou mais nucleotideos desemparelhados ou mal emparelhados em uma molécula de RNA/RNA, RNA/DNA ou DNA/DNA de fita dupla. Esta definição inclui, assim, maus emparelhamentos devido às mutações de inserção/eliminação, assim como mutações pontuais de base simples ou múltipla (por exemplo, ver a Patente norte-americana 4.946.773. Métodos alternativos para a detecção de mutações de eliminação, inserção ou substituição que podem ser utilizados na prática da presente invenção são divulgados nas Patentes Americanas 5.849.483, 5.851.770, 5.866.337, 5.925.525 e 5.928.870, cada uma das quais sendo aqui incorporada por referência na sua totalidade.

G. Métodos de Transferência de Genes

Acredita-se que métodos adequados para a distribuição de ácido nucleico para realizar a expressão de composições da presente invenção incluem virtualmente qualquer método pelo qual um ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo vetores virais e não virais) podem ser introduzidos em uma organela, uma célula, um tecido ou um organismo, tal como aqui descrito ou como seria conhecido por uma pessoa normalmente versada na técnica. Tais métodos incluem, mas não estão limitado, à distribuição direta de ácido nucleico, tal como por injeção (Patentes Americanas 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 e 5.580.859, cada uma aqui incorporada por referência), incluindo a microinjeção (Harland e Weintraub, 1985; Patente norte-americana 5.789.215, aqui incorporada por referência); por eletroporação (Patente norte-americana 5.384.253, aqui incorporada por referência); por precipitação com fosfato de cálcio (Graham e Van Der Eb, 1973; Chen e Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); pelo uso de DEAE dextrana seguido por polietileno glicol (Gopal, 1985); por carregamento sônico direto (Fechheimer et al., 1987);. por transfecção mediada por lipossoma (Nicolau e sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991); por bombardeamento com microprojéteis (Pedidos PCT Nos. WO 94/09699 e 95/06128; Patentes Americanas 5.610.042; 5.322.783 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 e 5.538.880, e cada uma aqui incorporada como referência); por agitação com fibras de carboneto de silício (Kaeppler et al., 1990; Patentes Americanas US 5.302.523 e 5.464.765, cada uma aqui incorporada por referência) ; por transformação mediada por Agrobacterium (Patentes Americanas 5.591.616 e 5.563.055, cada uma aqui incorporada por referência) ; ou por transformação de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh et al., 1993; Patentes Americanas 4.684.611 e 4.952.500, cada uma aqui incorporada por referência); por captação de DNA mediada por dessecação/inibição (Potrykus et al., 1985). Através da aplicação de técnicas tais como estas, organela(s), célula(s), tecido(s) ou organismo(s) podem ser estavelmente ou transitoriamente transformados.

H. Componentes e Porções Lipidicas

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se às composições que compreendem um ou mais lipídeos associados com um ácido nucleico, umà molécula de aminoácido, tal como um peptídeo, ou outro composto de molécula pequena. Em qualquer das modalidades aqui discutidas, a molécula pode ser um polipeptideo de rabdovirus ou um modulador de polipeptideo de rabdovirus, por exemplo, um ácido nucleico que codifica todo ou parte de qualquer polipeptideo de rabdovirus, ou alternativamente, uma molécula de aminoácido que codifica todo ou parte do modulador de polipeptideo de rabdovirus.

Um lipídeo é uma substância que é caracteristicamente insolúvel em água e extraída com um solvente orgânico. Os compostos diferentes daqueles especificamente aqui descritos são compreendidos por uma pessoa versada na técnica como lipídeos, e são englobados pelas composições e métodos da presente invenção. Um componente lipídico e um não lipídico podem ser ligados entre si, quer covalentemente ou não covalentemente.

Um lipídeo pode ser de ocorrência natural ou sintética (isto é, concebido ou produzido pelo homem). No entanto, um lipídeo é geralmente uma substância biológica. Lipídeos biológicos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, gorduras neutras, fosfolipídeos, fosfoglicerideos, esteroides, terpenos, lisolipídeos, glicosfingolipídeos, glicolipídeos, sulfatídeos, lipídeos com ácidos graxos ligados a éter e éster e lipídeos polimerizáveis, e suas combinações.

Uma molécula de ácido nucleico ou uma molécula de aminoácido, tal como um peptídeo, associado com um lipídeo pode ser dispersa em uma solução contendo um lipídeo, dissolvida com um lipídeo, emulsificada com um lipídeo, misturada com um lipídeo, combinada com um lipídeo, ligada covalentemente a um lipídeo, contida como uma suspensão em um lipídeo ou, de outro modo, associada com um lipídeo. Um lipídeo ou lipídeo/composição associada virus da presente invenção não está limitado a qualquer estrutura particular. Por exemplo, eles podem também ser simplesmente intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em qualquer tamanho ou forma. Em outro exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura "colapsada". Em outro exemplo não limitativo, uma lipofectamina de poxvirus (Gibco BRL) ou de complexo virai Superfect (Qiagen) também é contemplada.

Em certas modalidades, uma composição de lipídeos pode compreender cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8% cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11 %, cerca de 12% cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16% cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20% cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24% cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28% cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32% cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36% cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40% cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44% cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48% cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52% cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, 5 cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86 %, cerca de 87%, cerca de 88%, 10 cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99 %, cerca de 100 %, ou qualquer faixa derivável disto, de um lipídeo, tipo de lipideo ou componente não lipídico particular, tal como um 15 fármaco, proteína, açúcar, ácidos nucleicos ou outros materiais aqui divulgados ou como seria conhecido por uma pessoa versada na técnica. Em um exemplo não limitativo, uma composição lipídica pode compreender cerca de 10% a cerca de 20% de lipídeos neutros, e cerca de 33% a cerca de 20 34% de um cerebrosídeo, e cerca de 1% de colesterol. Assim, é contemplado que composições lipídicas da presente invenção podem compreender qualquer um dos lipídeos, tipos de lipídeos ou outros componentes em qualquer combinação ou faixa de porcentagem.

IV. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E REGIMES DE TRATAMENTO

Em uma modalidade da presente invenção, um método de tratamento para uma doença hiperproliferativa ou neoplásica, tais como câncer, através da distribuição de um rabdovirus, tal como virus Marabá, virus Carajás, virus de Muir Springs e/ou virus da Grande Bahia, é contemplado. Exemplos de cânceres contemplados para o tratamento incluem câncer de pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer renal, 10 câncer ósseo, câncer testicular, câncer cervical, câncer gastrintestinal, linfomas, lesões pré-neoplásicas, lesões pré-neoplásicas no pulmão, câncer de cólon, melanoma, câncer da bexiga e quaisquer outros cânceres ou tumores que podem ser tratados, incluindo cânceres metastáticos ou 15 sistemicamente distribuídos.

Uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, em geral, é definida como aquela quantidade suficiente para detectavelmente e repetidamente retardar, melhorar, diminuir, minimizar ou limitar a extensão da doença ou dos seus sintomas. Mais definições rigorosas podem ser aplicadas, incluindo a eliminação, erradicação ou cura da doença.

De preferência, os pacientes terão a função da medula óssea adequada (definida como uma contagem de granulócitos absoluta periférica de > 2.Q00/mm3 e uma contagem de plaquetas de 100.000/mm3) r função hepática adequada (bilirrubina < 1,5 mg/dL) e função renal adequada (creatinina <1,5 mg/dL).

A. Administração

Para matar as células, inibir o crescimento de células, inibir metástase, diminuir o tamanho do tumor ou tecido e, de outro modo reverter, estacionar ou reduzir o fenótipo maligno de células tumorais, utilizando os métodos e composições da presente invenção, uma pessoa geralmente coloca em contato uma célula hiperproliferativa ou neoplásica com uma composição terapêutica, tal como um vírus ou um constructo de expressão que codifica um polipeptideo. As vias de administração irão variar, naturalmente, com a localização e natureza da lesão, e incluir, por exemplo, administração e formulação intradérmica, transdérmica, parenteral, intravascular, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutânea, regional, percutânea, intratraqueal, intraperitoneal, intrarterial, intravesical, intratumoral, inalação, perfusão, lavagem, injeção direta, por alimentação e oral.

Para realizar um benefício terapêutico em relação a uma condição ou doença vascular, poderia colocar em contato uma célula vascular com o composto terapêutico. Qualquer uma das formulações e vias de administração discutidas em relação ao tratamento ou diagnóstico de câncer podem também ser utilizados em relação às doenças e condições vasculares.

A injeção intratumoral, ou injeção na vasculatura tumoral, é contemplada para tumores discretos, sólidos e acessíveis. A administração local, regional ou sistêmica também é contemplada, especialmente para aqueles cânceres que são disseminados ou que são susceptíveis à disseminação sistêmica. As partículas virais podem ser administradas por, pelo menos, ou no máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 injeções.

No caso de intervenção cirúrgica, a presente invenção pode ser utilizada no pré-operatório, para tornar um tumor inoperável passível à resseção. Alternativamente, a presente invenção pode ser utilizada no momento da cirurgia, e/ou posteriormente, para tratar a doença residual ou metastática. Por exemplo, um leito tumoral ressecado pode ser injetado ou perfundido com uma formulação compreendendo um polipeptideo de rabdovírus ou um rabdovírus, que pode ou não abrigar uma mutação, que é vantajosa para o tratamento de câncer ou células cancerosas. A perfusão pode continuar após a resseção, por exemplo, deixando um cateter implantado no sitio da cirurgia. O tratamento pós-cirúrgico periódico também é previsto.

A administração contínua também pode ser aplicada, onde necessário, por exemplo, onde um tumor é cortado e o leito tumoral é tratado para eliminar a doença residual, microscópica. A distribuição através de seringa ou cateterização é preferida. Tal perfusão contínua pode ocorrer durante um período de cerca de 1 a 2 horas, até cerca de 2 a 6 horas, até cerca de 6 a 12 horas, até cerca de 12 a 24 horas, até cerca de 1 a 2 dias, até cerca de 1 a 2 semanas ou mais após o início do tratamento. Geralmente, a dose da composição terapêutica através de perfusão contínua será equivalente àquela dada por uma única injeção ou múltiplas injeções, ajustada ao longo de um período de tempo durante o qual a perfusão ocorre. É ainda contemplado que a perfusão do membro pode ser usada para administrar composições terapêuticas da presente invenção, particularmente no tratamento de melanomas e sarcomas.

Os regimes de tratamento podem variar da mesma forma, e comumente depender do tipo de tumor, localização do tumor, progressão da doença e saúde e idade do paciente. Obviamente, certos tipos de tumor irão necessitar de tratamento mais agressivo, enquanto que, ao mesmo tempo, certos pacientes não podem tolerar protocolos sobrecarregados. 0 clínico será mais bem adequado para fazer tais decisões com base na eficácia e toxicidade conhecidas (se houver) das formulações terapêuticas.

Em certas modalidades, o tumor a ser tratado não pode, 5 pelo menos inicialmente, ser ressecável. Os tratamentos com constructos virais terapêuticos podem aumentar a ressecabilidade do tumor devido ao encolhimento nas margens ou por eliminação de certas porções particularmente invasivas. Após os tratamentos, a resseção pode ser 10 possível. Tratamentos adicionais subsequentes à resseção irão servir para eliminar a doença residual microscópica no sítio do tumor.

Um processo típico de tratamento, para um tumor primário ou um leito tumoral pós-excisão, irá envolver 15 múltiplas doses. O tratamento de tumor primário típico envolve uma aplicação de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais doses durante um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais semanas. Um regime de duas semanas pode ser repetido um, dois, três-, quatro, cinco, seis ou mais vezes. Durante um período de 20 tratamento, a necessidade de completar as dosagens previstas pode ser reavaliada.

Os tratamentos podem incluir várias "doses unitárias". Dose unitária é definida como contendo uma quantidade predeterminada da composição terapêutica. A quantidade a ser administrada, e a via particular e a formulação, estão dentro das habilidades dos clinicos versados na técnica. Uma dose unitária não necessita ser administrada como uma injeção única, mas pode compreender infusão continua ao longo de um periodo de tempo definido. A dose unitária da presente invenção pode ser convenientemente descrita em termos de unidades formadoras de placas (ufc) ou partículas virais para constructos virais. As doses unitárias variam de 103, 104, 105, 106, 107, 108, 10% IO10, 1011, 1012, 1013 ufç ou vp e superior. Alternativamente, dependendo do tipo de virus e do titulo atingível, uma irá administrar de 1 a 100, 10 a 50, 100 a 1000, ou até cerca de 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013, 1 x 1014 ou 1 x 1015 ou mais particulas virais infecciosas (vp) para o paciente ou para as células do paciente.

B. Composições e Formulações Injetáveis

O método preferido para a administração de um construct© de expressão ou virus que codifica todo ou parte de um genoma rabdovírus para o câncer ou células tumorais na presente invenção é por injeção intravascular. No entanto, as composições farmacêuticas aqui divulgadas podem alternativamente ser administradas intratumoralmente, parenteralmente, intravenosamente, intrarterialmente, intradermicamente, intramuscularmente, transdermicamente ou mesmo intraperitonealmente, conforme descrito nas Patentes Americanas 5.543.158 e 5.641.515 e 5.399.363 (cada uma especificamente aqui incorporada por referência na sua totalidade).

A injeção de constructos de ácido nucleico pode ser administrada por seringa ou qualquer outro método utilizado para a injeção de uma solução, enquanto que o constructo de expressão pode passar através do calibrador particular da agulha necessário para injeção (por exemplos, ver Patentes Americanas 5.846.233 e 5.846.225). Soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparados em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis liquidos e suas misturas, e em óleos. Sob condições ordinárias de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microrganismos. As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis (Patente norte-americana 5.466.468, especificamente aqui incorporada por referência na sua totalidade) . Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve fluida até o ponto em que ocorre a fácil seringabilidade. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante dos microrganismos, como bactérias e fungos. O veiculo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido, e similares), suas misturas adequadas e/ou óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pela utilização de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pela utilização nas composições de agentes que retardem a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente liquido primeiro tornado isotônico com solução salina ou glucose suficiente. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intratumoral e intraperitoneal. Assim sendo, meios aquosos estéreis que podem ser utilizados serão conhecidos pelas pessoas versadas na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvidos em 1 mL de solução de NaCl isotônica e ou adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no sitio de infusão proposto (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a Edição, páginas 1035 a 1038 e 1570 a 1580). Alguma variação na dosagem irá necessariamente ocorrer dependendo da condição do individuo sendo tratado. A pessoa responsável pela administração irá, em qualquer caso, determinar a dose apropriada para o sujeito individual. Além disso, para administração a seres humanos, as preparações devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança em geral e pureza exigidos pelos governos dos paises em que as composições estão sendo usadas.

As composições aqui divulgadas podem ser formuladas em uma forma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteina) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ácidos, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Os sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. Na formulação, soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em uma tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de fármacos e semelhantes.

Como aqui utilizado, "veículo" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículo, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotônicos e de absorção, tampões, soluções de veículo, suspensões, coloides e semelhantes. A utilização de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas é contemplada. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

A frase "farmaceuticamente aceitável" ou 5 "farmacologicamente aceitável" refere-se às entidades moleculares e composições que não produzem uma reação não direcionada alérgica ou similar quando administradas a um ser humano. A preparação de uma composição aquosa que contém uma proteina como um ingrediente ativo é bem 10 compreendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, quer como soluções liquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em líquido antes da injeção podem também ser preparadas.

C. Tratamentos de Combinação

Os compostos e métodos da presente invenção podem ser utilizados no contexto de doenças/condições hiperproliferativas ou neoplásicas incluindo o câncer e aterosclerose. A fim de aumentar a eficácia de um 20 tratamento com as composições da presente invenção, tal como rabdovirus, pode ser desejável combinar estas composições com outros agentes eficazes no tratamento daquelas doenças e condições. Por exemplo, o tratamento de um câncer pode ser implementado com compostos terapêuticos da presente invenção e outras terapias anticâncer, tais como agentes anticâncer ou cirurgia.

Várias combinações podem ser utilizadas; por exemplo, um rabdovírus, como virus Marabá, é "A" e a terapia anticânce r secundária é "B" , que pode incluir um segundo rabdovírus ou outro virus oncolitico: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

A administração do virçs terapêutico ou constructos virais da presente invenção a um paciente irá seguir os protocolos gerais para a administração daquela terapia secundária em particular, levando em consideração a toxicidade, se houver, do tratamento do virus. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos conforme necessário. Também é contemplado que várias terapias padrão, bem como intervenção cirúrgica, pode ser aplicada em combinação com o câncer descrito, ou terapia de célula tumoral.

1. Terapia Anticâncer

Um agente "anticâncer" é capaz de afetar negativamente o câncer em um individuo, por exemplo, matando as células cancerosas, induzindo a apoptose em células cancerosas, reduzindo a taxa de crescimento de células cancerosas, reduzindo a incidência ou o número de metástases, reduzindo o tamanho tumoral, inibindo o crescimento tumoral, reduzindo o fornecimento de sangue a um tumor ou células cancerosas, promovendo uma resposta imune contra as células cancerosas de um tumor, prevenindo ou inibindo a progressão de câncer ou aumentando o tempo de vida de um indivíduo com câncer. Agentes anticancerígenos incluem agentes biológicos (bioterapia), agentes de quimioterapia e agentes de radioterapia. Mais geralmente, estas outras composições seriam fornecidas em uma quantidade combinada eficaz para matar ou inibir a proliferação da célula. Este processo pode envolver o contato das células com o vírus ou construto virai e agente(s) ou fator 'es) múltiplo(s) ao mesmo tempo. Isto pode ser conseguido pelo contato da célula com uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos os agentes, ou por contato da célula com duas composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui o vírus e a outra inclui o(s) segundo(s) agente(s).

A resistência da célula tumoral aos agentes de quimioterapia e radioterapia representa um grande problema em oncologia clinica. Um dos objetivos da pesquisa de câncer atual é encontrar maneiras de melhorar a eficácia da quimioterapia e radioterapia combinando esta com a terapia gênica. Por exemplo, o gene da herpes simplex-timidina quinase (HS-TK), quando fornecido a tumores cerebrais por um sistema de vetor retroviral, induziu com sucesso a suscetibilidade ao agente antiviral ganciclovir (Culver et I al., 1992). No contexto da presente invenção, é contemplado que a terapia de poxvirus poderia ser usada de forma semelhante em conjunto com a intervenção quimioterapêutica, radioterapêutica, imunoterapêutica ou outra biológica, além de outros agentes pró-apoptótico ou reguladores do ciclo celular.

Alternativamente, uma terapia virai pode preceder ou seguir o outro tratamento por intervalos que variam de minutos a semanas. Em modalidades em que o outro agente e virus são aplicados separadamente à célula, uma pessoa poderia em geral assegurar que um periodo significativo de tempo não expira entre o tempo de cada distribuição, de tal modo que o agente e o virus ainda seriam capazes de exercer um efeito vantajosamente combinado na célula. Em tais casos, é contemplado que se pode colocar em contato a célula com ambas as modalidades dentro de cerca de 12 a 24h entre si e, mais preferencialmente, dentro de cerca de 6 a 12h entre si. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar o periodo de tempo 1 para o tratamento de forma significativa, no entanto, onde um lapso de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respectivas administrações.

a. Quimioterapia

Terapias do câncer também incluem uma variedade de terapias de combinação com tratamentos de base química e de radiação. Quimioterapias de combinação incluem, por exemplo, cisplatina (CDDP) , carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalano, clorambucil, bussulfano, nitrosureia, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposídeo (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de ligação do receptor de estrogênio, taxol, gemcitabieno, navelbina, inibidores da proteína farnesil transferase, transplatina, 5-fluoruracil, vinblastina, vincristina e metotrexato, temazolomida (uma forma aquosa de DTIC), ou qualquer análogo ou variante derivada do anterior. A combinação de quimioterapia com terapia biológica é conhecida como bioquimioterapia.

b. Radioterapia

Outros fatores que provocam danos ao DNA e que foram usados extensivamente incluem os que são comumente conhecidos como raios y, raios-X, feixe de prótons e/ou a distribuição direcionada de radioisótopos às células tumorais. Outras formas de fatores que danificam o DNA sâo também contempladas, tais como microondas e radiação UV. É mais provável que todos estes fatores efetuem uma ampla gama de danos ao DNA, aos precursores de DNA, na replicação e reparação de DNA e na montagem e manutenção de cromossomos. As faixas de dosagem para os raios-X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens por periodos de tempo prolongados (3 a 4 semanas), até doses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para radioisótopos variam amplamente, e dependem da meia-vida do isótopo, da energia e do tipo de radiação emitida, e da absorção pelas células neoplásicas.

Os termos "contatado" e "exposto", quando aplicados a uma célula, são aqui utilizados para descrever o processo pelo qual um constructo terapêutico e um agente quimioterapêutico ou radioterapêutico são administrados a uma célula alvo ou são colocados em justaposição direta com a célula alvo. Para alcançar a morte ou estasia da célula, ambos os agentes são fornecidos a uma célula em uma quantidade combinada eficaz para matar a célula ou impedir que ela se divida.

c. Imunoterapia

Imunoterapêuticos, em geral, baseiam-se na utilização de células imunoefetoras e moléculas para alvejar e destruir as células cancerosas. 0 imunoefetor pode ser, por exemplo, um anticorpo especifico para alguns marcadores na superfície de uma célula tumoral. 0 anticorpo sozinho pode servir como um efetor de terapia ou ele pode recrutar outras células para de fato exercer efeito na morte celular. 0 anticorpo também pode ser conjugado com um fármaco ou toxina (quimioterapêutico, radionuclideo, cadeia de ricina A, toxina da cólera, toxina pertussis, etc.) e servir meramente como um agente de alvejamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito carregando uma molécula de superfície que interage, diretamente ou indiretamente, com um alvo de célula tumoral. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK. A combinação de modalidades terapêuticas, isto é, atividade citotóxica direta e inibição ou redução de certos rabdovirus ou polipeptídeos de rabdovirus poderia proporcionar benefício terapêutico no tratamento do câncer.

A imunoterapia também poderia ser usada como parte de uma terapia combinada. A abordagem geral para a terapia combinada é discutida abaixo. Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve possuir algum marcador que seja passível de alvejamento, isto é, que não esteja presente na maioria das outras células. Muitos marcadores tumorais existem e qualquer um deles pode ser adequado para o alvejamento no contexto da presente invenção. Marcadores tumorais comuns incluem o antigeno carcinoembrionário, antigeno especifico da próstata, antigeno associado ao tumor urinário, antigeno fetal, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antigeno sialil-Lewis, MucA, MucB, FLAP, receptor de estrogênio, receptor de laminina, erb B e pl55. Lisados de células tumorais também podem ser utilizados em uma composição antigênica.

Um aspecto alternativo da imunoterapia é combinar efeitos anticancerigenos com efeitos imunoestimulatórios. Moléculas imunoestimulantes incluem: citocinas tais como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFNy, quimiocinas como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento tal como ligante FLT3. A combinação de moléculas imunoestimulantes, quer como proteinas ou utilizando distribuição gênica em combinação com um supressor tumoral, mostrou melhorar os efeitos antitumorais (Ju et al., 2000).

Como discutido anteriormente, os exemplos de imunoterapias atualmente sob investigação ou em uso são imunoadjuvantes (por exemplo, compostos de Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e aromáticos) (Patentes Americanas 5.801.005 e 5.739.169; Hui e Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia com citocinas (por exemplo, interferons α, β e y; IL-1, GM- CSF e TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998) terapia gênica (por exemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward e Villaseca, 1998; Patentes Americanas 5.830.880 e 5.846.945) e anticorpos monoclonais (por exemplo, GM2 antigangliosideo, anti-HER-2, anti-pl85) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; Patente norte-americana 5.824.311), Herceptina (trastuzumab) é um anticorpo monoclonal quimérico (camundongo-humano) que bloqueia o receptor HER2-neu (Dillman, 1999). A terapia de combinação do câncer com herceptina e quimioterapia mostrou ser mais eficaz do que as terapias individuais. Assim, é contemplado que uma ou mais terapias anticâncer podem ser utilizadas com as terapias relacionadas com rabdovírus aqui descritas.

(1) Imunoterapia Passiva

Uma variedade de diferentes abordagens para a imunoterapia passiva de câncer existem. Elas podem ser amplamente classificadas da seguinte forma: injeção somente de anticorpos; injeção de anticorpos acoplados às toxinas ou agentes quimioterapêuticos; injeção de anticorpos acoplados aos isótopos radioativos; injeção de anticorpos antiidiotipicos; e, finalmente, purga de células tumorais na medula óssea.

De preferência, anticorpos monoclonais humanos são utilizados na imunoterapia passiva, uma vez que produzem poucos ou nenhum efeito colateral no paciente. No entanto, a aplicação destes é de certa forma limitada por motivos de escassez e até, foram apenas administrados de modo intralesional. Os anticorpos monoclonais humanos para os antígenos de gangliosideos foram administradas intralesionalmente em pacientes que sofrem de melanoma recorrente cutâneo (Irie e Morton, 1986). A regressão foi observada em seis dos dez pacientes, após injeções intralesionais, diariamente ou semanalmente. Em outro estudo, um sucesso moderado foi obtido a partir de injeções intralesionais de dois anticorpos monoclonais humanos (Irie et al., 1989).

Pode ser favorável administrar mais do que um anticorpo monoclonal direcionado contra dois antigenos diferentes ou mesmo anticorpos com especificidade de antigeno múltipla. Os protocolos de tratamento também podem incluir a administração de linfocinas ou outros intensificadores imunes tal como descrito por Bajorin et al. (1988). O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos é descrito em maiores detalhes em outros pontos no relatório descritivo.

(2) Imunoterapia Ativa

Na imunoterapia ativa, um peptideo, polipeptídeo ou proteína antigênica, ou uma composição de célula tumoral autóloga ou alogênica ou "vacina" é administrada, geralmente com um adjuvante bacteriano distinto (Ravindranath e Morton, 1991; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al,, 1993). Na imunoterapia de melanoma, aqueles pacientes que eliciam uma alta resposta de IgM com frequência sobrevivem melhor do que aqueles que não eliciam ou eliciam poucos anticorpos IgM (Morton et al., 1992). anticorpos IgM são frequentemente anticorpos transientes e a exceção à regra parece ser os anticorpos antigangliosídeo ou anticarboidrato.

(3) Imunoterapia Adotiva

Na imunoterapia adoptiva, os linfócitos circulantes no paciente, ou linfócitos infiltrados no tumor, são isolados in vitro, ativados por linfocinas tais como IL 2 ou transduzidos com os genes para a necrose tumoral, e readministrados (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para conseguir isto, uma pessoa poderia administrar a um animal ou paciente humano, uma quantidade imunologicamente eficaz de linfócitos ativados, em combinação com uma composição de peptídeo antigênico incorporado em adjuvante tal como aqui descrito. Os linfócitos ativados serão mais preferivelmente as células do próprio paciente que foram mais facilmente isoladas de uma amostra de sangue ou tumoral e ativadas (ou "expandidas") in vitro. Esta forma de imunoterapia produziu vários casos de regressão de melanoma e carcinoma renal, mas a porcentagem de respondedores foi pouca em comparação com aqueles que não responderam.

d. Genes

Em ainda outra modalidade, o tratamento secundário é uma terapia gênica em que um polinucleotídeo terapêutico é administrado antes, depois ou ao mesmo tempo em que um rabdovirus é administrado. A distribuição de um rabdovirus em conjunto com um vetor que codifica um dos seguintes produtos gênicos irá possuir um efeito anticâncer combinado nos tecidos alvo. Alternativamente, o rabdovirus pode ser manipulado como um vetor virai de modo a incluir o polinucleotídeo terapêutico. Uma variedade de proteínas é englobada na invenção, algumas das quais sendo descritas abaixo. A Tabela 4 lista vários genes que podem ser alvejados para a terapia gênica de alguma forma em combinação com a presente invenção.

(1) Indutores da Proliferação Celular

As proteínas que induzem a proliferação celular ainda se enquadram em várias categorias dependentes da função. A existência de atributos comuns de todas estas proteínas é a capacidade delas para regular a proliferação celular. Por exemplo, uma forma de PDGF, o oncogene sis, é um fator de crescimento segregado. Oncogenes raramente surgem a partir de genes que codificam fatores de crescimento, e no presente, sis é o único fator de crescimento oncogênico de ocorrência natural. Em uma modalidade da presente invenção, é contemplado que mRNA antissentido direcionado para um indutor particular de proliferação celular é utilizado para prevenir a expressão do indutor de proliferação celular.

(2) Inibidores da Proliferação Celular

Os oncogenes supressores tumorais funcionam para inibir a proliferação celular excessiva. A inativação desses genes destrói a sua atividade inibidora, resultando em proliferação desregulada. Supressores de tumor incluem p53, PL6 e C-CAM. Outros genes que podem ser utilizados de acordo com a presente - invenção incluem Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zacl, p73, VHL, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, fusões p27/pl6, fusões p21/p27, genes antitrombóticos (por exemplo, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, EIA, p300, genes envolvidos na angiogênese (por exemplo, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF ou seus receptores) e MCC.

(3) Reguladores da Morte Celular Programada

A apoptose, ou morte celular programada, é um processo essencial para o desenvolvimento embrionário normal, manutenção da homeostase em tecidos adultos e supressão da carcinogênese (Kerr et al., 1972). Foi demonstrado que a familia Bcl-2 de proteínas e proteases tipo ICE são 5 importantes reguladores e efetores de apoptose em outros sistemas. A proteína Bcl2, descoberta em associação com o linfoma folicular, desempenha um papel proeminente no controle da apoptose e aumento da sobrevivência celular em resposta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary e Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto e Croce, 1986) . A proteína Bcl-2 evolutivamente conservada é agora reconhecida como sendo membro de uma família de proteínas relacionadas, que podem ser categorizadas como agonistas de morte ou antagonistas 15 de morte.

Subsequentemente à sua descoberta, foi mostrado que Bcl2 atua para suprimir a morte celular desencadeada por uma variedade de estímulos. Além disso, é agora evidente que há uma família de proteínas regulatórias de morte 20 celular Bcl-2 que compartilham de homologias estruturais e de sequência em comum. Foi demonstrado que estes diferentes membros da família possuem funções semelhantes ao Bcl2 (por exemplo, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, Al, Bfl-1) ou contrabalançam a função Bcl2 e promovem a morte celular II (por exemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).

e. Cirurgia

Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a algum tipo de cirurgia, que inclui cirurgia de prevenção, diagnóstico ou de teste, curativa e paliativa. A cirurgia curativa é um tratamento contra o câncer que pode ser utilizada juntamente com outras terapias, tal como o tratamento da presente invenção, terapias de quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia gênica, imunoterapia e/ou terapias alternativas.

Cirurgia curativa inclui a resseção em que todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, excisado e/ou destruído. A ressecção tumoral refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção tumoral, o tratamento por cirurgia inclui a cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microscopicamente controlada (cirurgia de Mohs). É adicionalmente contemplado que a presente invenção pode ser usada em conjunção com a remoção dos cânceres de superfície, pré-cânceres ou quantidades incidentais de tecido normal.

Na excisão de uma parte de todas as células cancerosas, tecido ou tumor, uma cavidade pode ser formada no corpo. O tratamento pode ser realizado por perfusão, injeção direta ou aplicação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Tal tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas, ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem, da mesma forma, ser de diferentes dosagens.

f. Outros agentes

É contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estes agentes adicionais incluem agentes imunomoduladores, agentes que afetam a suprarregulação de receptores da superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores de adesão celular, agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas aos indutores de apoptose ou outros agentes biológicos. Agentes imunomoduladores incluem fator de necrose tumoral; interferon α, β e y; IL-2 e outras citocinas; F42K e outros análogos de citocina; ou MIP-1, MIP-Iβ, MCP-1, RANTES e outras quimiocinas. É ainda contemplado que a suprarregulação de receptores da superfície celular ou os seus ligantes, bem como o Faz/ligante Fas, DR4 ou DR5/TRAIL (ligante de Apo-2) poderia potencializar potenciam a capacidade de indução apoptótica da presente invenção por estabelecimento de um efeito autócrino ou parácrino em células hiperproliferativas. Aumentos da sinalização intercelular pela elevação do número de junções GAP poderia aumentar os efeitos antiiperproliferativos sobre a população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia antiiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores de adesão celular são contemplados para melhorar a eficácia da presente invenção. Exemplos de inibidores de adesão celular são o inibidores da quinase de adesão focal (FAKs) e lovastatina. É ainda contemplado que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apoptose, tal como o anticorpo c225, poderiam ser usadas em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia do tratamento.

Tem havido muitos avanços na terapia do câncer, após a introdução de fármacos quimioterapêuticos citotóxicos. No entanto, uma das consequências da quimioterapia é o desenvolvimento/aquisição de fenótipos resistentes aos fármacos e o desenvolvimento de múltipla resistência a fármacos. O desenvolvimento de resistência a fármacos continua a ser um obstáculo importante no tratamento de tumores tais e, portanto, existe uma necessidade óbvia de abordagens alternativas tal como a terapia virai.

Outra forma de terapia para uso em conjunto com a quimioterapia, terapia de radiação ou terapia biológica inclui hipertermia, que é um procedimento em que o tecido de um paciente é exposto a temperaturas elevadas (até 106 °F). Dispositivos de aquecimento externos ou internos podem estar envolvidos na aplicação de hipertermia local, regional ou do corpo inteiro. A hipertermia local envolve a aplicação de calor a uma pequena área, tal como um tumor, O calor pode ser gerado externamente com ondas de alta frequência que alvejam um tumor a partir de um dispositivo fora do corpo. Calor interno pode envolver uma sonda estéril, incluindo fios finos aquecidos ou tubos ocos preenchidos com água aquecida, antenas de micro-ondas implantadas ou eletrodos de radiofrequência. □m órgão ou um membro do paciente é aquecido para a terapia regional, que é realizado utilizando dispositivos que produzem grande quantidade de energia, como magnetos. Alternativamente, parte do sangue do paciente pode ser removido e aquecido antes de ser perfundido para uma área que será internamente aquecida. O aquecimento em todo o corpo pode também ser implementado nos casos em que o câncer se espalhou por todo o corpo. Mantas de água aquecida, cera quente, bobinas indutivas e câmaras térmicas podem ser utilizadas para este propósito.

A terapia hormonal pode também ser utilizada juntamente com a presente invenção ou' em combinação com qualquer outra terapia de câncer previamente descrita. A utilização de hormônios pode ser empregada no tratamento de certos cânceres, tais como o câncer da mama, próstata, ovário ou cervical para reduzir o nível ou bloquear os efeitos de certos hormônios, como a testosterona ou estrogênio. Este tratamento é frequentemente usado em combinação com pelo menos uma terapia de câncer como tratamento.

V. EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são dados com o propósito de ilustrar várias modalidades da invenção e não pretendem limitar a presente invenção de qualquer modo. Uma pessoa versada na técnica prontamente perceberá que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetos e alcançar as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aqueles objetos, finalidades e vantagens aqui inerentes. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos descritos neste documento, são presentemente representativos das modalidades preferidas, são exemplificadores e não se destinam como limitações no escopo da invenção. Alterações disso e outros usos que são englobados dentro do espírito da invenção tal como definido pelo escopo das reivindicações ocorrerão para as pessoas versadas na técnica.

A. RESULTADOS

Vírus Marabá demonstra potentes propriedades onaolíticas in vitro.

A família rabdovírus é vasta e geneticamente e geograficamente diversificada. Os inventores selecionaram um painel de rabdovírus com capacidade anteriormente 10 documentada de se replicar em células de mamíferos como um ponto de partida. Sete vírus foram selecionados para a varredura in vitro para identificar aqueles com capacidade citolítica de células tumorais potentes (Tabela 4). Ensaios de morte celular foram realizados no formato de 96 poços em 15 linhagens celulares do painel de célula tumoral NCI 60 e uma variedade de linhagens de tumor de camundongo (Figura 5). Várias espécies foram demonstradas como sendo altamente líticas em linhagens tumorais humanas com pontuações de EC50 de menos de 0,1 MOI por unidades formadoras de placas 20 (ufc) para a maioria das linhagens celulares testadas. Em particular, os vírus Marabá (Travassos da Rosa et al., 1984), Carajás (CRJ) (Travassos da Rosa et al., 1984) e Farmington (FMT) (Travassos da Rosa et al., 2002) pareceram ser muito eficazes em matar linhas tumorais humanas de todas as indicações de câncer representadas no painel de células. Uma exceção notável foi observada para o virus FMT possuindo dificuldade na morte de linhagens celulares derivadas de tumores de cólon. Curiosamente, nem todos os rabdovirus possuem a capacidade para matar eficientemente células cancerosas. Virus, tais como o de Muir Springs (MS) (Kerschner et al., 1986), Bahia Grande (BG) (Kerschner et al., 1986), Ngaingin (NGG) (Doherty et al., 1973) e Tibrogargan (TIB) (Cybinski et al., 1980) demonstraram atividade em uma proporção muito pequena de células tumorais. Atualmente, os mecanismos que regem a restrição desses virus permanecem desconhecidos. Tabela 4. Novas cepas de rabdovirus não caracterizados são altamente líticas no painel celular NCI 60 *porcentagem de linhagens celulares NCI 60 pelo tipo tumoral considerado altamente sensível à infecção viral. Os números entre parênteses denotam o número de linhagens celulares testadas em cada agrupamento de indicação de câncer. O vírus foi classificado como sendo altamente lítico para uma linhagem celular com uma EC50 <0,1 MOI após 96 horas de infecção.

*Porcentagem de linhagens celulares do painel NCI 60 por tipo tumoral considerado altamente sensível à infecção virai. Os número entre parênteses denotam o número de linhagens celulares testadas em cada agrupamento de 5 indicação de câncer. 0 vírus foi classificado como altamente lítico para uma linhagem celular com uma EC50 < 0,1 MOI após 96 horas de infecção.

Para caracterizar adicionalmente estes vírus, curvas I de crescimento de uma única etapa foram realizadas tanto em uma linhagem de células suscetiveis (SNB19), bem como em uma linhagem de células relativamente resistente (NCI H226) para monitorar as taxas de replicação e para quantificar os tamanhos de ruptura viral. Os inventores foram incapazes de detectar o vírus após a infecção de células NCI H226 com o vírus BG, o que é consistente com a observação de que BG é apenas fracamente citolítico nesta linhagem celular. No entanto, BG foi capaz de replicar até um grau semelhante como FMT e CRJ nas células SNB1, novamente correlacionando com a sua capacidade citolítica. Tanto FMT quanto CRJ produziram uma progenia com cinética similar e com tamanhos de ruptura equivalentes quando analisados em células NCI H226. FMT pareceu se replicar para títulos mais elevados do que CRJ em células SNB19, embora ambos claramente produziram progenia suficiente para resultar na rápida morte desta linhagem celular suscetível (Figura 1). MRB produziu vírus com cinética iguais ou mais rápida do que as outras 3 cepas, e para um título muito mais elevado do que os outros vírus, tanto de células SNB19 quanto NCI H226.

O vírus MRB demonstrou boa atividade citolítica contra as linhagens tumorais de rápida produção virai, e grande tamanho de ruptura. Estes são todas as propriedades que contribuem para a boa atividade oncolítica. Marabá foi escolhido como um virus oncolitico para desenvolvimento adicional.

Vírus Marabá. Como um prelúdio para a manipulação genética do virus Marabá, uma abordagem de sequenciamento de "espingarda" (shot gun) foi utilizada para obter a sequência genômica completa para esta cepa. A análise filogenética subsequente foi realizada por alinhamento da sequência de aminoácidos da proteina L de Marabá para os membros dos 6 gêneros conhecidos da família rabdovirus (figura 2A) . O vírus teve a estrutura genômica esperada comum a outros rabdovirus, com 5 cistrons discretos separados por sequências de parada/início de transcrição responsáveis por delinear os genes N, P, M, G e L do vírus (figura 2B).

Mutantes do vírus Marabá manipulado mostraram seletividade da célula de câncer melhorada. A sequência antigenômica de comprimento completo foi clonada em um vetor direcionado pelo promotor T7 e os genes N, P e L nos constructos de expressão direcionados pelo promotor CMV. Esta estratégia foi utilizada com sucesso para desenvolver sistemas genéticos reversos para vários vírus de RNA de fita negativa (Schnell et al., 1994; Whelan et al., 1995v Lawson et al., 1995; Nakaya et al., 2001). O vírus resultante foi resgatado por transfecção do construct© de genoma, os plasmídeos N, P e L em células A549 previamente infectados com o virus vaccinia expressando a T7 polimerase e nomeados rMaraba WT (Marabá tipo selvagem recombinante).

Os inventores introduziram mutações para melhorar as propriedades de morte seletiva de tumores do vírus Marabá tipo selvagem. Os inventores demonstraram anteriormente que uma eliminação da metionina 51 na proteina M de VSV tornou o vírus defeituoso para bloquear a resposta do interferon em células infectadas (Stojdl et al., 2003). Do mesmo modo, os inventores demonstraram que uma dupla mutação na proteína VSV M nos aminoácidos V221F e S226R também tornou o vírus incapaz de bloquear o transporte citoplasmático nuclear de mRNAs hospedeiros e, assim, permitiram que •a célula hospedeira propagasse uma resposta IFN (Stojdl et al., 2003 ). Considerando a cepa Glasgow VSV também tinha uma variação S226R na sua proteína de matriz, foi levantada a hipótese de que o fenótipo de atenuação para o mutante duplo V221F S226R pode surgir a partir da mutação apenas em V221F. Assim, os inventores construíram e resgataram o vírus recombinante Marabá ΔM51, e a cepa mutante Marabá V221Y como possíveis variantes atenuadas (Figura 2B).

Duas outras mutações reportadamente melhoraram a replicaçâo VSV em células BHK-21 (proteína M L123W proteína e proteína L H242R) (Sanjuan et al., 2004) . O alinhamento da sequência Marabá com VSV, a mutação correspondente como sendo L123W e Q242R na sequência Marabá das proteínas M e L, respectivamente. Os vírus Marabá recombinantes foram construídos com mutações individuais de proteína M L123W ou de proteína G Q242R, ou tanto L123W quanto Q242R (doravante referidos como Marabp DM) (figura 2B).

As citotoxicidades das nossas cepas rMarabá tipo selvagem e mutante foram testadas em fibroblastos da pele humana primários (células GM38) para detectar e quantificar qualquer atenuação resultante das mutações manipuladas (figura 2C). O vírus Marabá ΔM51 é atenuado nestas células primárias (EC50 » 10 MOI) em comparação com o vírus rMarabá tipo selvagem (EC50 = 0,01 MOI). O V221Y também foi atenuado, embora a um grau ligeiramente menor do que ΔM51 (EC50 = 3 MOI). Surpreendentemente, ambos os mutantes L123W quanto Q242R também foram altamente atenuados (EC50 = 3 MOI) . Além disso, o mutante duplo combinando ambas as mutações L123W e Q242R foram igualmente atenuados em comparação com os mutantes individuais, resultando em um aumento de 100 vezes na EC50 após 72 horas de infecção de fibroblastos humanos primários (EC50 - 3 MOI). Estes resultados foram surpreendentes uma vez que se esperava que ambas as mutações melhorassem a replicação, e não atenuar o vírus. Estes fenótipos se correlacionaram com a formação de placas da mesma forma. Após a infecção dos fibroblastos GM38, pequenas placas, porém detectáveis, tornaram-se visíveis uma semana após a infecção com rMaraba tipo selvagem. No entanto, nenhuma placa foi visível no mesmo quadro de tempo para os vários mutantes individuais de Marabá ou Marabá DM. Este voltou a demonstrar a natureza severamente atenuada do V221Y, L123W e Marabá DM em fibroblastos primários normais. Ao contrário, grandes placas se formaram em uma linhagem tumoral (SNB19) após apenas 24 horas de infecção com qualquer rMaraba WT, V221Y, L123W ou Marabá DM (Figura 2D). O mutante Q242R, no entanto, formou placas menores em comparação com as outras cepas, sugerindo que esta mutação pode prejudicar ligeiramente a replicação desta cepa em células tumorais, da mesma forma. Curiosamente, no entanto, o mutante duplo, que contém a mutação Q242R, demonstrou claramente nenhum tal comprometimento em células malignas (figura 2d).

Ao contrário da nossa observação em fibroblastos normais, todas as cepas mutantes permaneceram altamente líticas quando analisadas em um painel de linhagens de células malignas (figura 2E). Após 48 horas de exposição ao vírus, a capacidade lítica das várias cepas foi quantificada utilizando o corante vital Alamar Blue (Figura 2E). A cepa L123W pareceu ser tão citolítica como o rMarabá tipo selvagem, em células tumorais e, assim, demonstrou um indice terapêutico melhorado in vitro em comparação com a cepa WT. Marabá Q242R foi muito citolítico em todas as três linhagens tumorais, ainda que parecesse menos citolítico do que a sua cepa de rMarabá WT original; em conformidade com as nossas observações de tamanho de placa. O mutante duplo, no entanto, demonstrou uma inversão interessante deste fenótipo, uma vez que não demonstrou qualquer prejuízo na citotoxicidade devido à mutação Q242R abrigada. Na verdade, Marabá DM consistentemente pareceu ser a cepa mais litica em linhagens de células cancerosas (figura 2E) , ainda que mais citolítica do que a WT original. Parece que a combinação de L123 W e Q242R dá origem a uma cepa Marabá que é apenas seletivamente hipervirulenta em células cancerosas, ainda que permanece atenuada em fibroblastos normais. Isto foi também evidente quando a produção de proteína virai foi avaliada ao longo do tempo em células de carcinoma de ovário humano OVCAR4 (figura 2F) . As cepas de rMaraba WT e L123W mostraram indução de proteína virai rápida, enquanto que o mutante Q242R ficou para trás. Aqui, novamente o mutante duplo Q242R L123W Marabá não apresentou nenhuma alteração na cinética de proteína virai.

Mutantes Marabá sâo variavelmente defeituoso no bloqueio das respostas antivirais de IFN do hospedeiro.

Tendo estabelecido as várias cepas mutantes Marabá como sendo seletivamente atenuadas nos fibroblastos primários normais, os inventores tentaram entender se esta atenuação foi devido a defeitos de bloqueio imune inato. Por exemplo, as mutações ΔM51 e V221 foram anteriormente demonstradas em VSV como tornando o virus incapaz de bloquear o transporte de mRNA nuclear/citoplasmático, inibindo assim a cascata transcricional de IFN do hospedeiro. Quando as células PC3 foram falsamente infectadas, ou infectadas com rMaraba WT, os inventores não puderam detectar a produção de IFN, consistente com a capacidade do virus parenteral para bloquear as respostas imunes inatas (figura 3A). Como esperado, os mutantes ΔM51 e V221Y não apresentaram defeitos na capacidade de bloquear a produção de IFN como medido no bioensaio (figura 3B) . Curiosamente, o mutante L123W também demonstrou um defeito na sua capacidade para bloquear a produção de IFN até uma magnitude semelhante como o mutante V221Y (figura 3B) . O mutante Q242R, no entanto, foi semelhante ao virus WT na sua capacidade para bloquear a produção de citocinas em células PC3, concluindo assim que este mutante não tem defeitos no bloqueio de IFN. Por conseguinte, a atenuação profunda do mutante Q242R parece não estar relacionada com as respostas IFN do hospedeiro. Quando as duas mutações únicas são combinadas na variante Marabá DM, o vírus resultante foi indistinguível do mutante único L123W (figura 3B) . Além disso, observou-se que o transporte de mRNA do interferon beta do compartimento nuclear para o citoplasma foi bloqueado após a infecção com Marabá WT ou o mutante Q242R (Figura 3C) . Estes resultados são consistentes com relatórios anteriores que indicam que certos vírus se baseiam nas suas proteínas de matriz para inibir a cascata transcricional IFN por vários mecanismos, incluindo o bloqueio do transporte de mRNA para o citoplasma (Ferran e Lucas-Lenard, 1997; Terstegen et al., 2001; Stojdl et al., 2003). Estes resultados indicam que o vírus Marabá utiliza a mesma estratégia. Ao contrário, Marabá ΔM51, a cepa L123W e Marabá DM demonstraram um "vazamento" do mRNA de IFN beta detectável no citoplasma após a infecção virai, e este déficit no bloqueio de mRNA foi correlacionado com a capacidade do vírus de bloquear as respostas de IFN como medido no bioensaio (figura 2B).

Marabá DM em menos tóxico in vivo. As doses LD50 e máxima tolerável (MTD) foram determinadas para Marabá WT e várias cepas atenuadas. Uma vez que a via terapêutica desejada de administração para tratar tumores disseminados é a administração intravenosa, os camundongos foram tratados com uma faixa de■doses por via intravenosa com o virus WT, ou duas cepas mutantes. Os inventores observaram que o virus Marabá é bem tolerado após injeção intravenosa em camundongos Balb/C. Como previsto a partir de dados in vitro (Figura 2C), Marabá DM tem um MTD 2 logs maior do que

O Marabá WT parenteral (Tabela 5). Os animais que receberam doses letais de WT, V221Y ou DM exibem sinais de infecção do SNC e possuiam títulos significativos de virus em seus cérebros (dados não mostrados) . Em doses abaixo de MTD, os ratos mostraram geralmente a perda de peso transiente, desidratação e piloereção consistente com uma infecção por virus. Estes sintomas foram solucionados em 3 a 4 dias após a infecção e nenhum virus foi detectado nos cérebros destes camundongos escarifiçados no dia 12 após a infecção. Tabela 5. Toxicidade de Dose Única Intravenosa das 15 cepas de virus rMarabá uma LD50 de dose única avaliada em camundongos Balb/C (fêmeas de 5 a 8 semanas de idade) e calculada usando o método searman Karber. b. Dose Tolerável Máxima (MTD) é igual à dose mais alta não resultante na morbidez durável conforme medido pelo comportamento e peso.

aLD50 da dose única avaliado em camundongo Balb/C (fêmeas de 5 a 8 semanas de idade) e calculado usando o método de Spearman Karber. bDose máxima tolerável (MTD) é igual à dose mais alta não resultante em uma morbidez 5 durável conforme medido por comportamento e peso.

Marabá DM é eficaz nos modelos tumorais singênicos e de xenoenxerto. Os inventores procuraram determinar se o Marabá DM é eficaz em modelos de camundongo in vivo de câncer. Cepas de Marabá’ DM foram projetadas para expressar GFP ou luciferase de vagalume e suas replicações em tumores CT26 subcutâneos após a administração sistêmica ser analisada. Os inventores observaram que o vírus Marabá DM foi distribuído em leitos tumorais e que se replicam em tecido tumoral utilizando tanto visualização 15 bioluminescente em animais inteiros, e microscopia de fluorescência em explantes de tumores (Figura 4A(i)). Em seguida, a eficácia de Marabá DM em um modelo de tumor subcutâneo CT26 bilateral foi examinado (figura 4A (ii) e (iii)). Especificamente animais com tumores bilaterais que 20 atingiram um tamanho de 10 a 600 mm3 foram tratados intravenosamente com Marabá DM três vezes por semana durante 2 semanas. Cinco dias após o primeiro tratamento, os animais de controle tratados com solução salina atingiram o ponto final com tumores atingindo um tamanho de 750 mm3 ou mais. No entanto, os animais que receberam 6 doses sistêmicas de Marabá DM responderam ao tratamento com regressão tumoral completa por volta do dia 35, levando a curas duráveis em 100% dos animais (Figura 4A (ii) e (iii)). Finalmente, o tratamento com Marabá DM intravenoso foi bem tolerado nos animais, sem nenhuma mortalidade e morbidez minima. Piloereção, desidratação branda e perda de peso transitória foram observados (Figura 4A (iv)), mas todos foram resolvidos dentro de 2 semanas do primeiro tratamento.

Os inventores também procuraram determinar a utilidade de Marabá DM para reduzir a carga tumoral em um modelo de doença disseminado. Portanto, as células CT-26 foram injetadas intravenosamente em camundongos Balb/C para induzir tumores pulmonares disseminados. Enquanto animais tratados com salina (PBS) e Carajás exibem uma carga tumoral pesada, os animais Marabá DM apresentam pouca ou nenhuma carga tumoral e exibem um fenótipo de pulmão normal (Figura 4B (i) ) . Além disso, Marabá DM também levou a um prolongamento significativo na sobrevivência quando administrados sistemicamente três vezes por semana, durante duas semanas (Figura 4B (ii)). Estes dados são consistentes com as observações no modelo subcutâneo e demonstram adicionalmente a potência de Marabá DM para tratar eficazmente um modelo tumoral singênico subcutâneo ou disseminado agressivo.

Para complementar esses estudos de eficácia virai em animais imunocompetentes, Marabá DM foi testado usando um modelo de xenoenxerto ovariano ES-2 humano bioluminescente. Mesmo em doses muito baixas (lx 104 ufc), os animais tratados com Marabá DM apresentaram uma redução significativa na carga tumoral (Figura 4C (i-iii)). Ao contrário, os camundongos tratados com controle desenvolveram rapidamente ascite com o aumento da carga tumoral até atingir o ponto final, 0 tratamento sistêmico de camundongos possuindo o tumor ES2 utilizando doses baixas e altas de vírus demonstrou uma resposta tumoral dependente de dose (Figura 4D (i—ii)} . Os inventores testaram Marabá DM contra a cepa virai oncolítica anteriormente desenvolvida (VSV ΔM51), e ambos os níveis de dose de Marabá DM mostraram eficácia superior ao VSV ΔM51.

B. MATERIAIS E MÉTODOS

Linhagens celulares. Carcinoma de pulmão humano A549, carcinoma cervical humano Hela, carcinoma do cólon CT26 de murino (American Type Culture Collection), fibroblastos primários GM38 humanos (National Institute of General Medical Sciences Mutant Cell Repository, Camden, NJ) e as linhagens celulares do painel de células NCI 60 obtidas a partir do Programa de Terapêutica de Desenvolvimento, do National Câncer Institute (Bethesda, MD), foram propagadas em meio Eagle modificado da Dulbecco (Hyclone, Logan, UT) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal (Cansera, 5 Etobicoke, Ontário, Canadá). 0 painel de células NCI 60.

Testagem de citotoxicidade in vitro.

Células do painel de células NCI 60 foram plaqueadas em placas de 96 poços até uma confluência de 90%. Estas células foram infectadas em diluições log com vários 10 rabdovirus, como indicado. Depois de 96 horas após a infecção, as monocamadas foram lavadas, fixadas e manchadas com solução de cristal violeta a 1%. As monocamadas manchadas foram subsequentemente solubilizados em SDS a 1% em água para criar lisados homogêneos. A absorvância foi 15 lida a 595 nm e para efetuar a contagem das células viáveis.

Curvas de crescimento de uma única etapa. As células NCI226 e as células SNB19 foram infectadas com os virus indicados em uma multiplicidade de infecção de 5 ufc/célula 20 durante 1 hora. As células foram então lavadas com PBS e incubadas a 37 °C. Aliquotas (100 |LL) foram tomadas nos pontos de tempo de 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48 e 72 horas e tituladas em células Vero.

Sequenciamento e clonagem de rabdovirus Marabá. O rabdovirus Marabá foi amplificado em células Vero e o RNA foi isolado a partir de virus purificado por técnicas padrão (Trizol + RNAeasy®, Invitrogen). Com exceção das extremidades de terminais 5' e 3', a sequência virai foi obtida usando o kit de clonagem mRNA completo (Invitrogen). O sequenciamento da extremidade 3' e 5' foi completado após a ligação mediada pela T4 RNA ligase dos iniciadores de T7 DNA a qualquer extremidade seguido por RT-PCR e clonagem em pCR2.1-TOPO® (Invitrogen). O cDNA virai foi amplificado em uma reação de RT-PCR única (produzindo um fragmento de > 11 Kbp) e clonado em um vetor LC-KAN modificado (Lucigen Corporation) transportando um promotor de T7 à montante da sequência líder 5' antigenômica e imediatamente à jusante do terminador 3' de uma ribozima HDV modificada e sequência de sinal de terminação da T7 polimerase.

Análise filogenética. As relações filogenéticas entre rabdovirus com base em um alinhamento de músculo das sequências de aminoácidos da proteína L, e usando a cepa Edmonston de sarampo de paramixovírus como o outro grupo. A árvore foi gerada pelo método de união de vizinhos e os valores bootstrap (indicados para cada nó da ramificação) foram estimados utilizando 1000 réplicas de árvores. Os comprimentos do ramo são proporcionais às distâncias genéticas. A barra de escala corresponde às substituições por sítio de aminoácido.

Sistema de Resgate de Marabá Recombinante. Células de carcinoma de pulmão A549 semeadas em células 3,0 x 105 por poço em placas de 6 poços foram infectadas 24 horas depois em uma multiplicidade de infecção (MCI) de 10 com o vírus Vaccinia expressando a T7 RNA polimerase em meio OptiMEM durante 1,5 h. Após a remoção do vírus Vaccinia, cada poço foi transfectado com Marabá LC-KAN (2 pg) juntamente com os constructos pCI-Neo que codificam Marabá N (1 p.g) , P (1,25 p.g) e L (0,25 p.g) com lipofectamina 2000 (5 pL por poço) de acordo com as instruções do fabricante. O reagente de transfecção foi removido 5 h mais tarde e substituído com DMEM contendo FBS 10%. 48 h após a transfecção, o meio foi coletado (reunido a partir de 2 placas), filtrado (0,2 pim) para remover o vírus Vaccinia contaminante e 1 mL foi utilizado para infectar as células de glioblastoma SNB-19 em cada poço de uma placa de 6 poços. Os efeitos citopáticos visíveis 24-48 h mais tarde foram indicativos de um resgate bem sucedido, o qual foi confirmado por purificação de RNA viral e RT-PCR com iniciadores específicos para Marabá. Todos os vírus foram submetidos a 3 ciclos de purificação em placa (em células SNB-19), antes do aumento da escala, purificação em um bloco de sacarose e ressuspenso era PBS contendo glicose a 15%.

Variantes de mutagênese e Marabá. Iniciadores mutagênicos fosforilados únicos (45-55 pb) foram utilizados com a enzima Phusion de alta fidelidade (NEB) para criar o painel de mutantes Marabá LC-Kan descrito nisso. Resumidamente, uma reação de PCR foi realizada com 100 ng de iniciador mutagênico e 100 ng de molde de DNA com a adição HotStart de enzima (98 °C - 2 min, 80 °C de espera - adição e enzima) e configuração típica de PCR (98 °C - 10 s, 55 °C - 30 s, 72 °C durante 7 min durante 30 ciclos) . Dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado na faixa de 0 a 6% em incrementos de 2%. O plasmideo de origem foi digerido com DPn I (NEB) (37 °C durante 1 h) e 4 piL da mistura de PCR digerida com Dpnl de 25 piL foram utilizados para transformar as células competentes TOP-10® (Invitrogen). Os clones positivos foram testados pela introdução de mudanças no sitio de restrição de mudança não codificantes (adição ou remoção) seguido por sequenciamento. Os mutantes atenuados diferentes aqui descritos incluem a eliminação de Met-51 na proteína M (ΔM51), Leu-123 para Trp na proteína M (L123W), Val-221 para Tyr na proteína M (V221Y), Gln-242 para Arg na proteína G (Q242R) e o duplo mutante Leu-123 para Trp na proteína M e Gln-242 para Arg na proteína G (Marabá DM).

Ensaios de viabilidade. As linhagens celulares indicadas foram plaqueadas a uma densidade de 10.000 células/poço em placas de 96 poços. No dia seguinte as células foram infectadas com os vírus indicados em várias multiplicidades de infecções (0,0001 a 10 ufc/célula). Após uma incubação de 48 horas Alamar Blue (sal sódico de resazurina (Sigma-Aldrich)) foi adicionado até uma concentração final de 20 pig/mL. Após uma incubação de 6 horas a absorvância foi lida em um comprimento de onda de 573 nm.

Ensaios de placa. Células Vero foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 105 células por poço de uma placa cora 6 poços. No dia seguinte, 100 p.L de diluições virais em série foram preparadas e adicionadas durante 1 hora às células Vero. Após adsorção virai 2 mL de uma cobertura de agarose foi adicionada (1:1 de agarose 1%:2 x DMEM e FCS 20%). As placas foram contadas no dia seguinte.

Bioensaio de interferon. Células PC-3 foram infectadas com rMarabaWT, ΔM51, V221Y, L123W, Q242R ou Marabá DM a uma multiplicidade de infecção de 3 ufc/célula durante 24 horas. No dia seguinte o sobrenadante foi neutralizado com ácido com HC1 0,25 N de um dia pra o outro a 4 °C, seguido pela adição de NaOH 0,25 para ajustar o pH até 7. Células Vero foram incubadas com o sobrenadante neutralizado durante 24 horas e subsequentemente infectadas com rMarabá WT com uma multiplicidade de infecção variando de 0,0001 a 100 ufc/célula. Qualquer interferon secretado pelas células PC-3 em resposta ao Marabá ou aos mutantes atenuados poderia subsequentemente proteger as células Vero da infecção com Marabá. Após 24 horas, a sobrevivência foi quantificada utilizando um ensaio de cristal violeta. Resumidamente, as células foram incubadas com solução de cristal violeta a 1%, lavadas, secas, ressuspensas em SDS a 1% e lidas a um comprimento de onda de 595 nm.

RT-PCR quantitativo para a detecção do interferon nuclear e citoplasmático. RNA citoplasmático e nuclear foi separado, tal como descrito anteriormente. Resumidamente, células 0VCAR4, tratadas de modo simulado ou infectadas com Marabá, ΔM51, L123W, Q242R ou Marabá DM foram coletadas em PBS, peletizadas e ressuspensas em 200 p.L de tampão de lise (Tris 25 mM [pH 7,4], NaCl 15 mM, MgCÍ2 12,5 mM a 5 % de sacarose, e NP-40 a 1%) . Os lisados foram incubados a 4 °C durante 10 min com vórtex ocasional. Os núcleos foram coletados por centrifugação a 1000 x g durante 3 min. O sobrenadante (fração citoplasmática) foi coletado enquanto que a fração nuclear foi lavada uma vez com 250 p.L de tampão de lise, seguido por extração de RNA total usando o kit Qiagen RNeasy (de acordo com as instruções do fabricante; Qiagen). QRTPCR de mRNA IFN-beta foi realizado utilizando o kit Quantitect SYBR Green RT-PCR da Qiagen com iniciadores descritos anteriormente. IFN-beta foi ensaiado das frações nucleares e citoplasmáticas e normalizado para HPRT mRNA a partir do mesmo compartimento. Os valores normalizados foram normalizados mais uma vez para os valores das frações nucleares e citoplasmáticas, respectivamente, para determinar o valor de vezes de indução em cada compartimento, após a infecção virai. Os valores representados graficamente indicam a razão de indução de mRNA normalizado dos compartimentos citoplasmático para o nuclear. Todos os valores de qPCR foram calculados utilizando o método delta CT.

Determinação da toxicidade in vivo. Grupos de 3 a 5 camundongos Balb/C (6 a 8 semanas de idade) foram injetados por via intravenosa uma vez em incrementos de meio log de virus que variam de 3 x 106 ufc a 3 x 109 ufc. Os animais foram monitorados pelos sinais de perigo, incluindo perda de peso, morbidez, piloereção, paralisia do membro posterior e dificuldade respiratória.

Modelo de tumor subcutâneo bilateral. Células cancerosas de cólon CT2 6 de murinho (3 x 105) foram injetadas nos flancos direito e esquerdo de camundongos Balb/C de 6 a 8 semanas de idade. Os tumores foram deixados crescer até um tamanho de 10 a 600 mm3 seguido por 6 injeções intravenosas totais (três vezes por semana) de 51VSV ou MR-SDM a uma dose de 5 x 108 ufc. Os tumores foram medidos duas vezes por semana após a injeção inicial. Os animais foram monitorados quanto à piloereção, perda de peso, morbidez, paralisia do membro posterior e dificuldade respiratória. Quando a carga tumoral excedeu o tamanho de 750 mm3 os animais foram eutanasiado. A fórmula a seguir foi utilizada para calcular o volume tumoral (L x W2)/2.

Visualização do virus Marabá DM em um modelo de tumor subcutâneo. Marabá DM foi adaptado para a visualização fluorescente ou bioluminescente por manipulação genética em eGFP ou luciferase de vaga-lume (FLUC), respectivamente. DM-GFP e DM-FLUC foram injetados IV (1 x 108) em animais Balb/C com tumores subcutâneos CT-26. Vinte e quatro horas após a infecção animais infectados com DM-GFP foram eutanasiados e os seus tumores foram extraídos e visualizados sob um microscópio fluorescente da Nikon. Animais infectados com DM-FLUC foram injetados com luciferina e submetidos a visualização vivos usando o sistema IVIS Xenogen 200.

Modelo tumoral de pulmão CT-26. Tumores de pulmão foram estabelecidos por uma única injeção intravenosa de 3 x 105 células de câncer de cólon CT-26 em animais Balb/C de 6 a 8 semanas de idade. Geralmente os camundongos desenvolveram desconforto respiratório grave, piloereção e fenótipo arquejado no dia 16-18, em cujo ponto eles são eutanasiados. Os camundongos foram tratados PBS, Carajás OU Marabá DM IV (5 x 108 ufc) tratados no dia 10, 12 e 14, 17, 19 e 21. Alguns animais foram sacrificados no dia 17 e as imagens foram capturadas em um microscópio de dissecação Nikon. Os animais restantes foram monitorados quanto à sobrevivência.

Modelo de xenoenxerto ovariano. Células ES-2 ovarianas humanas foram adaptadas para visualização bioluminescente em cujo tempo 1 x 106 células ES-2 foram injetadas intraperitonealmente em camundongos nus CD-I atimicos com de 6 a 8 semanas de idade. Animais CD-I não tratados desenvolveram ascite por volta do dia 15 a 17. As injeções intraperitoneal e intravenosa (veia da cauda) foram realizadas no dia 8, 9, 12, 14 e 16 com 1 x 104 - 1 x 107 ufc de Marabá DM ou VSV Δ51. A visualização do tumor foi capturada com um sistema Zenogen 200 IVIS (Caliper LS, EUA) .

Estatística. Para as determinações de tamanho da placa, uma ANOVA unicaudal foi realizada utilizando o teste de comparação múltiplo de Bonfeironi para derivar um valor de P (Graphpad Prism). Para os gráficos de Kaplan-Meier, os gráficos de sobrevivência foram comparados usando a análise 5 de classificação logarítmica de Mantel-Cox (Graphpad Prism).

REFERÊNCIAS Patente norte-americana 4.554.101 Patente norte-americana 4.683.195 10 Patente norte-americana 4.683.202 Patente norte-americana 4.684.611 Patente norte-americana 4.800.159 Patente norte-americana 4.879.236 Patente norte-americana 4.883.750 15 Patente norte-americana 4.946.773 Patente norte-americana 4.952.500 Patente norte-americana 5.220.007 Patente norte-americana 5.279.721 Patente norte-americana 5.284.760 20 Patente norte-americana 5.302.523 Patente norte-americana 5.322.783 Patente norte-americana 5.354.670 Patente norte-americana 5.366.878 Patente norte-americana 5.384.253 389 399 464 466 538 538 543 550 563 580 589 591 610 635 641 656 7 02 736 739 780 789 789 7 98 801 Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. 5 Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5, 10 Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5, Patente norte-americana 5. 15 Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. 20 Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. Patente norte-americana 5. .514 .363 .765 .468 .877 .880 .158 .318 .055 .859 .466 . 616 . 042 .377 .515 . 610 .932 .524 .169 .448 .166 .215 .208 .005 I Patente norte-americana 5.824.311 Patente norte-americana 5.830.650 Patente norte-americana 5.830.880 Patente norte-americana 5.840.873 Patente norte-americana 5.843.640 Patente norte-americana 5.843.650 Patente norte-americana 5.843.651 Patente norte-americana 5.843.663 Patente norte-americana 5.846.225 Patente norte-americana 5.846.233 Patente norte-americana 5.846.708 Patente norte-americana 5.846.709 Patente norte-americana 5.846.717 Patente norte-americana 5.846.726 Patente norte-americana 5.846.729 Patente norte-americana 5.846.783 Patente norte-americana 5.846.945 Patente norte-americana 5.849.481 Patente norte-americana 5.849.483 Patente norte-americana 5.849.486 Patente norte-americana 5.849.487 Patente norte-americana 5.849.497 Patente norte-americana 5.849.546 Patente norte-americana 5.849.547 II Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana 5 Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana 10 Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana 15 Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana 20 Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana Patente norte-americana 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 .851.770 .851.772 . 851.772 .853.990 .853.992 .853.993 .856.092 .858.652 .861.244 .863.732 .863.753 .866.331 .866.337 .866.366 .871.986 .882.864 .900.481 .905.024 . 910.407 .912.124 .912.145 .912.148 .916.776 .916.779 Patente norte-americana 5.919.626 Patente norte-americana 5.919.630 Patente norte-ameri,cana 5.922.574 Patente norte-americana 5.925.517 Patente norte-americana 5.925.525 Patente norte-americana 5.925.565 Patente norte-americana 5.928.862 Patente norte-americana 5.928.869 Patente norte-americana 5.928.870 Patente norte-americana 5.928.905 Patente norte-americana 5.928.906 Patente norte-americana 5.929.227 Patente norte-americana 5.932.413 Patente norte-americana 5.932.451 Patente norte-americana 5.935.791 Patente norte-americana 5.935.819 Patente norte-americana 5.935.825 Patente norte-americana 5.939.291 Patente norte-americana 5.942.391 Patente norte-americana 5.945.100 Patente norte-americana 5.981.274 Patente norte-americana 5.994.624 Abschuetz et al., Cell Tissue Res., 325 (3):423-36, 2006. 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Claims (17)

1. Rabdovirus oncolitico caraterizado pelo fato de que compreende: (1) uma proteina M que compreende uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 4, exceto por um triptofano na posição correspondendo a posição 123 da SEQ ID N°: 4, e uma proteina G que compreende uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5; ou (2) uma proteina G que compreende uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica a sequência de aminoácido da SEQ ID N° : 5, exceto por uma arqinina na posição correspondendo a posição 242 da SEQ ID N°: 5 e uma proteina M que compreende uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 4, exceto por um triptofano na posição correspondendo a posição 123 da SEQ ID N°: 4.

2. Rabdovirus, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteina G tem uma sequência de aminoácido que é 100% idêntica a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 5, exceto pela arginina na posição 242 da SEQ ID N° : 5, e em que a proteina M tem uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4 exceto pelo triptofano na posição 123 da SEQ ID N°: 4 .

3. Composição caracterizada pelo fato de compreender um rabdovirus oncolitico isolado como definido nas reivindicações 1 ou 2, e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de compreender ainda um segundo virus oncolitico.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o segundo virus oncolitico é o virus vaccinia, virus herpes, virus do sarampo, virus da doença de Newcastle, adenovirus ou rabdovirus.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o segundo virus oncolitico é um rabdovirus.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o segundo rabdovirus é o virus de Carajás, virus de Chandripura, virus de Cocal, virus de Isfahan, virus de Marabá, virus de Piry, virus da estomatite vesicular do Alagoas, virus BeAn 157575, virus de Boteke, virus de Calchaqui, virus da Eel americano, virus de Gray Lodge, virus de Jurona, virus de Klamath, virus de Kwatta, virus de La Joya, virus de Malpais Spring, virus do morcego de Monte Elgon, virus de Perinet, virus de Tupaia, de Farmington, virus da Bahia Grande, virus de Muir Springs, virus de Reed Ranch, virus de Hart Park, virus de Flanders, virus de Kamese, virus mosqueiro, virus de Mossuril, virus de Barur, virus de Fukuoka, virus de Kern Canyon, virus de Nkolbisson, virus de Le Dantec, virus de Keuraliba, virus de Connecticut, virus de New Minto, virus Sawgrass, virus de Chaco, virus de Sena Madureira, virus de Timbo, virus de Almpiwar, virus de Aruac, virus de Bangoran, virus de Bimbo, virus de Bivens Arm, virus do caranguejo azul, virus de Charleville, virus de Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus de Garba, virus de Gossas, virus de Humpty Doo, virus de Joinjakaka, virus de Kannamangalam, virus de Kolongo, virus de Koolpinyah, virus de Kotonkon, virus de Landjia, virus de Manitoba, virus de Marco, virus de Nasoule, virus de Navarro, virus de Ngaingan, virus de Oak-Vale, virus de Obodhiang, virus de Oita, virus de Quango, virus de Parry Creek, virus de acará do Rio Grande, virus de Sandjimba, virus de Sigma, virus de Sripur, virus de Sweetwater Branch, virus de Tibrogargan, virus de Xiburema, virus de Yata, de Rhode Island, virus do rio de Adelaide, virus de Berrimah, virus de Kimberley ou virus da febre efêmera bovina.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender ainda um segundo agente anticâncer.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o segundo agente anticâncer é um quimioterápico, radioterápico ou imunoterápico.

10. Uso de um rabdovirus oncolitico isolado como definido nas reivindicações 1 ou 2 caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar câncer.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreendendo o rabdovirus oncolitico é para administração intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intradermal, intratumoral, subcutânea ou intranasal.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um segundo agente terapêutico para o câncer.

13. Uso, de acordo com qualquer a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico anticâncer compreende um segundo virus oncolitico.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o segundo virus oncolitico é o virus vaccinia, herpes, do sarampo, da doença de Newcastle, adenovirus, alfavirus, parvovirus ou rabdovirus.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico anticâncer é um segundo rabdovirus oncolitico.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o segundo rabdovirus oncolitico é o virus da estomatite vesicular (VSV), virus de Carajás, virus de Chandripura, virus de Cocal, virus de Isfahan, virus de Piry, virus da estomatite vesicular do Alagoas, virus BeAn 157575, virus de Boteke, virus de Calchaqui, virus da Eel americano, virus de Gray Lodge, virus de Jurona, virus de Klamath, virus de Kwatta, virus de La Joya, virus de Malpais Spring, virus do morcego de Monte Elgon, virus de Perinet, virus de Tupaia, Farmington, virus da Bahia Grande, virus de Muir Springs, virus de Reed Ranch, virus de Hart Park, virus de Flanders, virus de Kamese, virus mosqueiro, virus de Mossuril, virus de Barur, virus de Fukuoka, virus de Kern Canyon, virus de Nkolbisson, virus de Le Dantec, virus de Keuraliba, virus de Connecticut, virus de New Minto, virus Sawgrass, virus de Chaco, virus de Sena Madureira, virus de Timbo, virus de Almpiwar, virus de Aruac, virus de Bangoran, virus de Bimbo, virus de Bivens Arm, virus do caranguejo azul, virus de Charleville, virus de Coastal Plains, virus DakArK 7292, virus Entamoeba, virus de Garba, virus de Gossas, virus de Humpty Doo, virus de Joinjakaka, virus de Kannamangalam, virus de Kolongo, virus de Koolpinyah, virus de Kotonkon, virus de Landjia, virus de Manitoba, virus de Marco, virus de Nasoule, virus de Navarro, virus de Ngaingan, virus de Oak-Vale, virus de Obodhiang, virus de Oita, virus de Quango, virus de Parry Creek, virus de acará do Rio Grande, virus de Sandjimba, virus de Sigma, virus de Sripur, virus de Sweetwater Branch, virus de Tibrogargan, virus de Xiburema, virus de Yata, de Rhode Island, virus do rio de Adelaide, virus de Berrimah, virus de Kimberley ou virus da febre efêmera bovina.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo agente anticâncer é um quimioterápico, radioterápico ou um imunoterápico.

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