BR112012009660B1

BR112012009660B1 - lipossoma tendo fase de água interna contendo sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico, seu processo de preparação, seu uso e preparação farmacêutica lipossômica

Info

Publication number: BR112012009660B1
Application number: BR112012009660-5A
Authority: BR
Inventors: Chunlei Li; Lan Zhang; Caixia Wang; Li Zhang; Dongmin Shen; Yanhui Li; Xian Xiu; Min Liang; Yongfeng Li
Original assignee: Cspc Zhongqi Pharmaceutical Technology (Shijiazhuang) Co., Ltd
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2020-12-22
Also published as: CN102048693B; JP2013508313A; EP2494960A1; KR101772399B1; ES2665033T3; EP2494960B1; CA2776925A1; CN102596178A; EP2494960A4; KR20120089735A; AU2010312078A1; BR112012009660B8; AU2010312078B2; CN102048693A; US8871253B2; BR112012009660A2; CN102596178B; WO2011050710A1; US20120201874A1; CA2776925C

Abstract

LIPOSSOMA TENDO FASE DE ÁGUA INTERNA CONTENDO SAL DE CICLODEXTRINA DE ÉTER SULFOBUTÍLICO. A presente invenção refere-se a um lipossoma compreendendo bicamada e fase de água interna que é descrito. A referida fase de água interna contém ciclodextrina de éter sulfobutílico e composto ativo. A refrerida ciclodextrina de éter sulfobutílico é a-ciclodextrina de éter sulfobutílico, (beta)-ciclodextrina de éter sulfobutílico, ou (gama)-ciclodextrina de éter sulfobutílico.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um lipossoma tendo fase deágua interna contendo sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico, a métodos para fabricar o lipossoma e ao uso do mesmo em preparação de um medicamento para o tratamento de doenças de tumor.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[0002] Como um veículo de fármaco, um lipossoma tem as carac-terísticas tais como realçar eficácia terapêutica, reduzir efeitos adversos, liberação-alvo, e liberação atrasada. Especialmente onde um lipossoma é usado como o veículo de fármaco antitumor, o fármaco pode ser alvejadamente liberado a área de tumor e desse modo ter toxicidade reduzida e eficácia aumentada.

[0003] Há muitos fármacos antitumor em aplicação clínica quepodem ser categorizados em 5 grupos: agentes citotóxicos, hormônios, modificador de resposta biológica, anticorpos monoclonais e outros fármacos antitumor. Entre eles, agentes citotóxicos capturam o maior compartilhamento do mercado, e eles podem ser categorizados em 5 grupos de acordo com mecanismo de ação: (1) fármaco agindo em estrutura química de DNA, tal como agentes de alquilação e compostos de platina; (2) fármacos modificando síntese de ácido nucleico, tal como metotrexato e fluorouracila; (3) fármacos agindo em transcrição de ácido nucleico, tal como doxorrubicina e epidoxorrubicina; (4) fármacos agindo em síntese de tubulina, tal como taxanos e alcalóides de vinca; fármacos agindo em topoisomerase, tal como camptotecina; (5) outros fármacos citotóxicos. Entre eles, os fármacos de grupos (2) e (4) são de caráter específico de ciclo de célula, podem apenas matar células em período específico de ciclo de proliferação de célula de tumor maligno. Vinorelbina e topotecano são dos grupos e são intensivamente investigados na presente invenção.

[0004] É necessário controlar a liberação de fármaco a partir de li-possoma com o objetivo de reduzir toxicidade e realçar eficácia, onde fármaco antitumor com caráter específico de ciclo de célula é preparado em lipossoma. No caso de fármaco muito rápido liberar de lipossoma, os seguintes resultados serão incorridos: (1) parte de fármaco é liberada de lipossoma antes de alcançar área de tumor e é clareada de sangue muito rapidamente para alcançar área de tumor; (2) devido àquelas células de tumor estarem em períodos de crescimento diferentes ao mesmo tempo, o fármaco alcançando área de tumor não pode matar células fora de períodos específicos, que induz exposição muito reduzida do fármaco a células de tumor e têm uma eficácia terapêutica pobre porém induz resposta tóxica de tecidos normais. Desse modo é importante controlar a liberação de fármaco de lipossoma especialmente para os fármacos com caráter específico de ciclo de célula.

[0005] A liberação de fármaco lipossômico é influenciada por fato-res diversificados incluindo tamanho de partícula, composição de membrana de lipídio, fase de água interna e métodos de carregamento de fármaco, entre outros. Métodos de carregamento de fármaco incluem carregamento de fármaco ativo e carregamento de fármaco passivo. Carregamento de fármaco passivo é geralmente adequado para fármacos solúveis a lipídio, enquanto carregamento de fármaco ativo é geralmente adequado para fármacos solúveis em água. Visto que vinorelbina e topotecano são igualmente fármacos alcalescentes fracos solúveis em água, carregamento defármaco ativo é escolhido para preparar seus lipossomas. Três métodos de carregamento de fármaco ativo são geralmente usados na técnica: método de gradiente de pH, método de gradiente de sulfato de amônio e método de gradiente de complexação.

(1) método de gradiente de pH:

[0006] Este método é inventado por investigadores canadenses em1980. Eles descobriram que alcalóides farmacêuticos tal como doxorrubicina poderiam ser ativamente transportados e especificamente agregados em lipossomas na presença de gradiente de pH. A primeira coisa no processo de preparação é escolher tampão de fase de água interno e tampão de fase exterior, que é crítico visto que os tampões diretamente determinam a estabilidade de fármaco em armazenamento e a liberação de fármaco in vivo. Um lipossoma branco é formado por hidratação com tampão de fase de água interno. O lipossoma branco desse modo obtido é também processado para reduzir o tamanho de partícula dentro de uma faixa desejada. A seguir, fase exterior do lipossoma pode ser substituída usando-se os meios técnicos tal como diálise de fluxo cruzada, cromatografia de coluna e modulação de pH, para formar gradiente de pH entre fases de transmembrana externas e internas. O carregamento de fármaco pode ser realizado em uma temperatura apropriada depois que o gradiente de transmembrana é formado.

[0007] Da mesma forma o gradiente de pH de transmembranapode ser formado usando um ionóforo. Durante a preparação do lipossoma branco, sal de íon divalente, tal como sulfato de manganês, é encapsulado no lipossoma, e em seguida a fase exterior de lipossoma é substituída por um tampão contendo um ionóforo, tal como A23187 e EDTA. O ionóforo pode especificamente transportar íon divalente para fora da membrana e transportar H+para dentro do lipossoma. Uso do anterior método pode da mesma forma formar gradiente de pH entre dentro e fora da membrana.

[0008] O mecanismo de carregamento de fármaco por gradiente de pH foi intensivamente investigado. Entre 3 preparações de lipossoma de antraciclina disponíveis no mercado, 2 preparações são preparadas por carregamento de fármaco ativo usando gradiente de pH.

(2) método de gradiente de sulfato de amônio

[0009] Método de gradiente de sulfato de amônio é inventado porinvestigadores israelitas precocemente em 1990. O processo de preparação neste método é similar aquele em método de gradiente de pH tradicional. Primeiro, lipossoma branco é preparado usando-se tampão de sulfato de amônio. Em seguida, sulfato de amônio na fase exterior do lipossoma é removido por diálise de fluxo cruzada entre outros para formar gradiente de sulfato de amônio entre o interior e o exterior da membrana de lipídio. Em seguida carregamento de fármaco é realizado sob condição de aquecimento. É confirmado em pesquisa inicial que o carregamento de fármaco por gradiente de sulfato de amônio pode estar relacionado à diferença de pH entre o interior e o exterior da membrana de fosfolipídeo causada por difusão de transmembrana de amônia livre. Entretanto, é mostrado por dedução teórica rígida que o carregamento de fármaco usando método de gradiente de sulfato de amônio pode ser um processo complicado de difusão direcional dupla, e a formação de gradiente de pH pode ser meramente um dos fatores. [00010] A vantagem de método de gradiente de sulfato de amônio situa-se naquele pH aproximadamente neutro da solução aquosa de sulfato de amônio não pôde induzir hidrolisação de moléculas de fosfolipídeo em excesso, porque uma temperatura relativamente alta é requerida se fosfolipídeo saturado é usado para preparar o lipossoma. O lipídio é hábil para hidrolisar quando método de gradiente de pH tradicional for usado. Além disso, a liberação de fármaco in vivo do lipossoma preparado usando método de gradiente de amônio pode ser diferente.

(3) método de gradiente de complexação

[00011] Neste método, sal de íon de metal transição, tal como sulfato de cobre ou sulfato de níquel é usado em tampão de fase de água interno para preparar lipossoma branco. Logo, íon de metal fora do lipossoma é removido por diálise de fluxo cruzado entre outros para formar gradiente de íon de the metal entre o interior e o exterior da membrana de lipídio. Em seguida carregamento de fármaco é realizado sob condição de aquecimento. O mecanismo de carregamento de fármaco é que o fármaco forma um complexo estável com íon de metal de transição na fase de água interna do lipossoma e é desse modo contido dentro do lipossoma.

[00012] β-Ciclodextrina de éter sulfobutílico (SBE-β-CD) é um derivado ionizado de β-ciclodextrina (β-CD) desenvolvido por Cydex de US em 1990, que são o produto de reação de substituição de β-CD com 1,4-butano sultona. A substituição pode ocorrer em grupo hidroxila de posição 2, 3, 6 em unidade de glicose de SBE-β-CD. SBE-β-CD é um excipiente farmacêutico excelente tendo as vantagens tal como boa solubilidade de água, baixa nefrotoxicidade e baixa hemólise, e é licenciado por FDA como um excipiente para injeção.

[00013] SBE-β-CD foi até agora usado para solubilização por inclusão de fármaco insolúvel, e foi amplamente usado em várias formas de dosagem tal como injeção, formulação oral, formulação tópica entre outros. Chakraborty usou o SBE-β-CD para investigar preparação lipossômica de anfotericina B, com o objetivo de usar solubilização por inclusão de fármaco insolúvel por SBE-β-CD (avaliação Terapêutica e hemolítica de preparação lipossômica in-situ contendo anfotericina-B complexada com β-ciclodextrinas quimicamente modificado diferentes. J Pharm Pharmaceut Sci. 2003 Vol.6, No.2).

[00014] Wang Zhixuan & Deng Yingjie, e outro (Advances em sistemas de liberação de complexo de ciclodextrina de fármaco capturado por lipossoma, Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2006 Vol.23) revisar pesquisas mundiais de complexo de ciclodextrina de fármaco capturado por lipossoma, que é preparado tornando-se fármaco insolúvel em complexo de ciclodextrina solúvel em água e capturando o complexo em fase de água interna de lipossoma. É difícil fármaco insolúvel entrar em fase de água interna de lipossoma, inclusão por complexação por ciclodextrina aumenta solubilidade de água do fármaco insolúvel, e desse modo é fácil de capturar o fármaco no lipossoma. O objetivo principal de preparar fármaco em complexo de ciclodextrina de fármaco capturado por lipossoma é aumentar a solubilidade de fármaco insolúvel e desse modo o carregamento de fármaco.

[00015] Como o fármaco de primeira-linha em terapia antitumor, preparações lipossômicas de vinorelbina e topotecano foram intensivamente investigadas. Agora o carregamento de fármaco de vinorelbina lipossômica e topotecano foi investigado por muitos grupos de pesquisa. Entretanto, alguns problemas sobem tal como o seguinte:

[00016] Companhia de Inex de Canada alcança o carregamento de fármaco usando esfingomielina e colesterol a uma relação molar de 55:45 como membrana de lipídio, usando solução de sulfato de magnésio como fase de água interna para preparar lipossoma branco, em seguida transportando íon de magnésio fora da membrana lipossômica pelo ionóforo A23187 e transportando H+para dentro do lipossoma, e desse modo gerando gradiente de pH. A vinorelbina lipossômica desse modo obtida tem uma taxa de encapsulação de mais do que 90%, e é estável quando armazenada a 2-8 °C durante um ano (Otimização e caracterização de uma formulação de lipossoma de esfingomielina/colesterol de vinorelbina com atividade antitumor promissora. Journal of Pharmaceutics Sciences, 2005 Vol.94 No.5).

[00017] Um grupo de pesquisa canadense rotulado por Bally usa 2 métodos e obtém lipossomas de topotecano tendo taxa de encapsulação alta. No primeiro método, DSPC e colesterol são usados como membrana de lipídio, solução de sulfato de manganês como fase de água interna para preparar lipossoma branco. Em seguida gradiente de pH é formado usando o ionóforo A23187 e o carregamento de fármaco é obtido. O mecanismo deste método é similar aquele usado por companhia de Inex. O segundo método usa DSPC e colesterol como membrana de lipídio, solução de sulfato de cobre como fase de água interna para preparar lipossoma branco. Entretanto, o carregamento de topotecano é realizado sem adicionar A23187, porque um complexo estável é formado entre íon de cobre e topotecano. O princípio usado aqui é justamente o método de gradiente de complexação como descrito acima. A desvantagem deste método é que íon de metal restante na formulação pode causar efeito tóxico em sangue (Uma avaliação de encapsulação mediada por gradiente de íon de transmembrana de topotecano dentro de lipossomas. Journal of Controlled Release. 96 (2004); Complexação de cobre-topotecano media acúulo de fármaco em lipossomas. Journal of Controlled Release. 114 (2006))

[00018] Investigadores de US usam distearoil fosfatidil colina (DSPC), colesterol e distearoil fosfatidil etanolamina conjugado de etanolamina-metoxil-polietileno glicol (DSPE-mPEG) como membrana de lipídio, usam sal de trietilamina (TA) sal de octassulfato de sacarose como fase de água interna para preparar lipossoma branco. Em seguida octassulfato de sacarose TA é removido usando diálise de fluxo cruzado entre outros para formar gradiente de octassulfato de sacarose TA, e o carregamento de fármaco é realizado. O princípio é substantivamenteidêntico aquele usado em método de gradiente de sulfato de amônio. Entretanto, cada octassulfato de sacarose molecular tem 8 grupos ácidos e pode formar um complexo compacto com vinorelbina, e desse modo vinorelbina é bem reprimida. A meia-vida de plasma do lipossoma de vinorelbina desse modo obtido é até 9,2 horas (Melhorou farmacocinéticas e eficácia de uma vinorelbina nanolipossômica altamente estável. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2009 Vol.328 No.1.). A preocupação séria neste método é que octassulfato de sacarose é fisiologicamente ativo e ativa fator de crescimento de fibroblasto in vivo (Base estrutural para ativação de sinalização de fator de crescimento de fibroblasto por octassulfato de sacarose. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, out. de 2002, Vol. 22, no. 20), e induz umas séries de efeitos fisiológicos. Portanto, o uso de octassulfato de sacarose como um excipiente para injeção pode ter um grande risco.

[00019] Companhia de Alza dos US usa fosfatidil colina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol e DSPE-mPEG como membrana de lipídio,usa polímero de poliânion, tal como sulfato de dextrano, sulfato de proteoglicano e sulfato de celulose, em fase de água interna. Em seguida diálise de fluxo cruzado é usada para substituir fase exterior e formar um gradiente de polímero, e o carregamento de fármaco é realizado. O princípio é similar aquele usado em método de gradiente de sulfato de amônio. Este método tem o objetivo de formar um complexo compacto de polímero de poliânion com topotecano, e desse modo o fármaco é bem reprimido. A desvantagem deste método é da mesma forma que os polímeros de poliânion são fisiologicamente ativos e difíceis de ser metabolizados in vivo, desse modo a segurança do mesmoserá também investigada (inibidores de topoisomerase capturados por lipossoma lipossoma. US6465008B1).

[00020] É conhecido a partir do anterior que as investigações de lipossomas de fármacos alcalescentes fracos, tal como vinorelbina e topotecano focalizam método de gradiente de pH, método de gradiente de sulfato de amônio geral e método de gradiente de complexação. Entretanto, eles são apenas testados em laboratório e os materiais usados tem risco de segurança: (1) o sall polianiônico, tal como sal de trietilamina de octassulfato de sacarose e polímero de sulfato, usado nas investigações acima são todos fisiologicamente ativos, e não satisfaz a exigência que um excipiente deveria ser inativo de fisiologia e de farmacologia; (2) íon de cobre, íon de níquel, íon de manganês usado no método de gradiente de complexação acima são todos íon de metal pesado, e seu restante na formulação é prejudicial a humano. Além disso, porque tumor é difícil de ser curado e medicamento é geralmente a longo prazo, o acúmulo in vivo de íon de metal pesado irá além da tolerância paciente.

[00021] Desse modo é ainda requerido desenvolver um novo lipossoma e método correspondente de carregamento de fármaco.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00022] Em um aspecto, a presente invenção fornece um lipossoma compreendendo bicamada e fase de água interna, em que a fase de água interna contém ciclodextrina de éter sulfobutílico ou seu sal e composto ativo.

[00023] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que a ciclodextrina de éter sulfobutílico é α-ciclodextrina de éter sulfobutílico, β-ciclodextrina de éter sulfobutílico ou yciclodextrina de éter sulfobutílico.

[00024] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que cada molécula de ciclodextrina de éter sulfobutílico tem cerca de 6,5 grupos sulfo na média.

[00025] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico é formado por ciclodextrina de éter sulfobutílico com um ou mais de amina, íon de metal e íon de amônio.

[00026] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico é formado por ciclodextrina de éter sulfobutílico com um ou mais de amônio (NH3), trietilamina (TA), trietanolamina (TEA), íon de sódio, íonde potássio e íon de cálcio.

[00027] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que o composto ativo é que um composto alcalescente fraco, preferivelmente um ou mais selecionados de vinorelbina, vincristina, topotecano e irinotecano.

[00028] De acordo com algumas modalidades do lipossoma na presente invenção, em que a bicamada compreende fosfolipídeo, colesterol e lipídio modificado por polímero hidrofílico.

[00029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para preparar o lipossoma da presente invenção descrito acima, compreendendo: (1) hidratar pó de fase de lipídio com solução aquosa de ciclodextrina de éter sulfobutílico ou seu sal para formar um lipossoma branco compreendendo a solução aquosa de ciclodextrina de éter sulfobutílico ou seu sal como fase de água interna, (2) remover o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico na fase exterior do lipossoma branco obtido na etapa (1) para formar um gradiente de ânion, (3) opcionalmente, se o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico for um sal de íon de metal, adicionar um ionóforo do íon de metal à fase exterior do lipossoma branco obtido na etapa (2) para formar um gradiente de pH, e (4) incubar o lipossoma branco obtido na etapa (2) ou (3) com composto ativo em solução aquosa para encapsular o composto ativo no lipossoma.

[00030] De acordo com uma modalidade do processo para preparar o lipossoma na presente invenção, em que o ionóforo do íon de metal é o ionóforo A23187.

[00031] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma preparação farmacêutica lipossômica, compreendendo o lipossoma de acordo com qualquer da presente invenção descrita acima e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00032] De acordo com algumas modalidades da preparação farmacêutica lipossômica na presente invenção, em que o veículo e/ou excipiente compreende regulador osmótico e/ou antioxidante.

[00033] Em outro adicional, a presente invenção fornece uso do lipossoma de acordo com qualquer da presente invenção descrita acima na fabricação de um medicamento para tratamento de um tumor em um paciente, em que o composto ativo no lipossoma é um ou mais de vinorelbina, vincristina, topotecano e irinotecano.

[00034] O desenvolvimento de novos métodos depende da investigação de mecanismo de carregamento de fármaco tradicional. Primeiramente, o método de gradiente de sulfato de amônio é analisado que compreende o seguinte processo: dirigido por concentração e diferença de pH, fármaco de alta concentração em fase exterior do lipossoma supera resistência de membrana de lipídio (bicamada de fosfolipídeo) e entra na fase de água interna do lipossoma. O fármaco que entra na fase de água interna é protonado e precipita-se com SO42-, e é estavelmente reprimido no lipossoma. É necessário dissociar do precipitado e difundir fora do lipossoma para liberação de fármaco. Portanto, a estruturamicroscópica e solubilidade do precipitado determinam a taxa de liberação de fármaco do lipossoma e também determina a segurança e eficácia da formulação.

[00035] A estrutura microscópica e complexidade do precipitado formado pelo fármaco e SO42-estão relacionadas à estrutura espacial e alcalescência fraca do fármaco. Algum fármaco, tal como cloridrato de doxorrubicina, é hábil para formar precipitado com SO42-devido a sua alcalescência forte. Além disso, as moléculas de fármaco podem empilhar uma à outra devido a estrutura quasi-planar da molécula. e um precipitado alongado compacto é formado dentro do lipossoma como microscopicamente mostrado. Portanto, cloridrato de doxorubicina pode ser bem reprimido no lipossoma e a meia-vida t1/2 de sua formulação lipossômica em camundongos KM é mais do que 15 horas. Ao contrário, outros fármacos, tal como vinorelbina e topotecano, são alcalescente fraco e desse modo têm uma capacidade de precipitar pobre com SO42-, e as moléculas de fármaco não podem empilhar uma a outra devido a estrutura não planar da molécula. Portanto, a t1/2 em camundongos KM é menos do que 5 horas ainda se o lipossoma é preparado usando-se a mesma composição de lipídio e método como aqueles do lipossoma de cloridrato de doxorrubicina acima. A meia-vida é tão curta que a maioria do fármaco escoou fora do lipossoma em circulação de sangue e não pode alcançar área de tumor. Ainda uma relação pequena do fármaco lipossômico que alcançou área de tumor será liberada fora rapidamente. É indesejado para fármaco antitumor com caráter específico de ciclo celular exercer seu efeito. É concluído que dos fatores críticos para liberação de fármaco é a complexidade do precipitado formado entre fármaco e ânion.

[00036] A alcalescência fraca do fármaco tal como vinorelbina e topotecano é inalterável, desse é crítica para encontrar ânions que podem associar e formar precipitado compacto com o fármaco, e compostospolianiônicos tendo estrutura complicada podem formar um complexo estável com eles.

[00037] É experimentalmente demonstrado que encapsulação eficiente de fármaco alcalescente fraco, tal como vinorelbina ou topotecano, pode ser obtida na presente invenção. Teste de liberação in vitro e teste farmacocinético confirmam que, em comparação à formulação de fase de água interna de sulfato de amônio de convencional, a taxa de liberação do fármaco lipossômico da presente invenção é notadamente estendida. A presente invenção é da mesma forma adequada para outrosfármacos antitumor, tal como vincristina e irinotecano, com alca-lescência fraca similar de vinorelbina e topotecano.

[00038] Os presentes inventores quebram idéia convencional de usar ação de inclusão de SBE-β-CD, porém emprega seu caráter de multiânion para usar isto como fase de água interna do lipossoma e ativamente carregar o fármaco. O uso de sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico como fase de água interna para carregar fármaco tem um princípio similar como aquele no uso de sulfato de amônio como fase de água interna, pelo qual o ânion em fase de água interna forma precipitado com a molécula de fármaco e desse modo estende liberação de fármaco. Entretanto, cada molécula de éter sulfobutílico tem 6,5 SO32-na média, e pode ligar-se a moléculas de fármaco múltiplas simultaneamente e formar estrutura precipitada mais complexa. Desse modo taxa de encapsulação alta é obtida, e o tempo de retenção de fármaco é significativamente estendida em comparação ao lipossoma com sulfato de amônio como fase de água interna.

[00039] O lipossoma preparado com ciclodextrina de éter sulfobutílico na presente invenção é completamente diferente do lipossoma de inclusão de ciclodextrina convencional. A presente invenção não resolverá o problema de solubilidade de fármaco insolúvel, porém estenderá o tempo de retenção no lipossoma de fármaco alcalescente fraco, e aumentará a taxa de encapsulação de fármaco. Além disso, os exemplos na presente invenção confirmaram que a taxa de encapsulação foi desse modo baixa quando o lipossoma é preparado apenas usando-se a ação de inclusão de ciclodextrina de éter sulfobutílico, que não satisfaz a necessidade de medicamento clínica.

[00040] Para obter preparações lipossômicas com boas propriedades, um sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico deveria ser primeiro preparado, e em seguida o lipossoma deveria ser preparado usando um próprio método. O método usado na presente invenção compreende:(A) Preparação de sais de ciclodextrina de éter sulfobutílico: preparando solução aquosa de ciclodextrina de éter sulfobutílico, e salinificar com trietilamina, trietanolamina, amônia, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de cálcio. (B) Preparação de lipossomas: dissolver excipientes de lipídioem um solvente orgânico, removendo o solvente orgânico por liofilização e em seguida obter um pó de lipídio solto, hidratar o pó de fase de lipídio com solução aquosa de sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico para formar um lipossoma branco. Em seguida reduzir o tamanho de partícula do lipossoma branco por um aparato de micro-jato ou um aparato de extrusão de alta pressão, removendo o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico em fase exterior do lipossoma por diálise ou cromatografia de coluna entre outros para formar um gradiente de transmembrana de ânion. Se o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico usado for um sal de íon de metal, a adição de ionóforo de metal é requerida. O ionóforo de metal pode ser inserido em membrana de fosfolipídeo para trocar íon de metal interno e íon de hidrogênio externo, e desse modo um gradiente de pH é formado. Em seguida a preparação lipossômica é obtida por incubação da solução de fármaco e da suspensão de lipossoma.

[00041] Ciclodextrina de éter sulfobutílico usada na presente invenção será importada atualmente. Entretanto, pode ser produzida em volume com qualidade boa e satisfazer a necessidade de produção em grande escala.

[00042] Em resumo, na presente invenção, uso de sais de ciclodextrina de éter sulfobutílico como fase de água interna de lipossoma é completamente possível em consideração a encapsulação de fármaco, efeito de retenção e custo econômico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00043] A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos, que são apenas exemplares e não deveriam ser interpretados como uma limitação ao escopo da presente invenção.

[00044] Quando aqui usada, a relação de fármaco/lipídeo refere-se a relação de peso de fármaco para fosfolipídeo, e "o teor de DSPE-mPEG" Refere-se a sua porcentagem molar nos componentes de fosfolipídeo totais em bicamada lipossômica.

Exemplo 1 Processo geral de preparação de lipossomas com ciclodextrina de éter sulfobutílico (SBE-CD) como fase de água interna (com a formulação de SBE-CD)

[00045] HSPC, colesterol e DSPE-mPEG2000 em uma relação de massa de 3:1:1 foram misturados e dissolvidos em 95% de álcool t-butílico. O solvente orgânico foi removido por liofilização para obter um pó de lipídio solto. O pó foi hidratado com solução aquosa de β-ciclodextrina de éter sulfobutílico a 50-60°C e incubado durante 1 hora para obter um lipossoma multivesicular heterogêneo. O tamanho de partícula do lipossoma foi reduzido por um aparato de micro-jato. Ânion na fase exterior do lipossoma branco foi removido por um aparato de ultrafiltração para formar um gradiente de transmembrana dinâmico. Uma solução de fármaco aquosa foi adicionada ao lipossoma branco em uma relação de fármaco/lipídeo apropriada, e o carregamento de fármaco foi obtido por incubação a 60°C durante 1 hora.

Exemplo 2 Processo geral de preparação de lipossomas com sal de trietilamina de ciclodextrina de éter sulfobutílico como fase de água interna (com a formulação de SBE-CD/TA)

[00046] HSPC, colesterol e DSPE-mPEG2000 em uma relação de massa de 3:1:1 foram misturados e dissolvidos em 95% de álcool t-butílico. O solvente orgânico foi removido por liofilização para obter um pó de lipídio solto. O pó foi hidratado com solução aquosa de sal de trietilamina de ciclodextrina de éter sulfobutílico a 50-60°C e incubado durante 1 hora para obter um lipossoma multivesicular heterogêneo. O tamanho de partícula do lipossoma foi reduzido por um aparato de extrusão de alta pressão. Ânion na fase exterior do lipossoma branco foi removido por um aparato de ultrafiltração para formar um gradiente de transmembrana dinâmico. Uma solução de fármaco aquosa foi adicionada ao lipossoma branco em uma relação de fármaco/lipídeo apropriada, e o carregamento de fármaco foi obtido por incubação a 60°C durante 1 hora.

Exemplo 3 Processo geral de preparação de lipossomas com sal de sódio de ciclodextrina de éter sulfobutílico como fase de água interna (com a formulação de SBE-CD/Na)

[00047] HSPC, colesterol e DSPE-mPEG2000 em uma relação de massa de 3:1:1 foram misturados e dissolvidos em 95% de álcool t-butílico. O solvente orgânico foi removido por liofilização para obter um pó de lipídio solto. O pó foi hidratado com solução aquosa de sal de sódio de ciclodextrina de éter sulfobutílico a 50-60°C e incubado durante 1 hora para obter um lipossoma multivesicular heterogêneo. O tamanho de partícula do lipossoma foi reduzido por um aparato de extrusão de alta pressão. Ânion na fase exterior do lipossoma branco foi removido por cromatografia de coluna, e em seguida solução de etanol de nicomicina em uma quantidade apropriada foi adicionada (20 ng de nicomicina/1mg HSPC). A mistura resultante foi incubada a 60°C durante dez minutos, para trocar íon de hidrogênio e íon de sódio através da membrana lipossômica, para formar um gradiente de pH. Uma solução de fármaco aquosa foi adicionada ao lipossoma branco em uma relação de fármaco/lipídeo apropriada, e o carregamento de fármaco foi obtido por incubação a 60°C durante 1 hora.

Exemplo 4 Comparação de taxa de encapsulação de lipossomas contendo várias fases de água interna.

[00048] Os lipossomas de vários fármacos com 3 fases de água internas respectivas foram preparados como descrito nos Exemplos 1, 2 e 3, em uma relação de fármaco/lipídeo de 2:9.58 (veja tabela 1). Tabela 1: Efeito de agente de captura intralipossômico em carregamento de fármaco

[00049] Conclusão: como pode ser visto a partir da taxa de encapsulação como descrito, o lipossoma tendo o SBE-CD como fase de água interna tem uma taxa de encapsulação pobre, enquanto taxas de encapsulação altas foram obtidas com SBE-CD/TA e SBE-CD/Na que ilustra que uma boa encapsulação não pode ser obtida a menos que um gradiente de pH seja formado por transporte de íon. O fármaco é primeiramente protonado depois de entrar na fase de água interna do lipossoma, e em seguida associa-se com SBE-CD, enquanto carregamento de fármaco é duramente obtido exclusivamente dependendo do efeito de inclusão de SBE-CD.

Exemplo 5 Liberação in vitro formulações de vincristina lipossômicas contendo fase de água interna diferente (SBE-CD/TA vs sulfato de amônio). 1. Amostras

[00050] Os lipossomas de vincristina foram preparados em uma relação de fármaco/lipídeo de 3:9.58, como descrito no Exemplo 2 para o lipossoma tendo SBE-CD/TA como fase de água interna, e como descrito no Exmaplo 2, com a exceção da substituição de sal de trietilamina de β-ciclodextrina de éter sulfobutílico com sulfato de amônio, para o lipossoma tendo sulfato de amônio como fase de água interna.

2. Condição de liberação

[00051] Amostras de formulações de vincristina lipossômicas foram diluídas em 10 vezes em tampão de liberação (5 mM de NH4Cl/10 mM de histidina/260 mM de glicose, pH 7.0) e transferidas nas bolsas de diálise. A diálise foi realizada contra um volume de 200-vezes de tampão de diálise em frasco de dissolução. Teste de liberação foi realizado a 37°C, 75rpm. Em vários pontos de tempo (1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 24 h), alíquotas foram retiradas para análise. 3. Resultados Tabela 2: Liberação de lipossomas de vincristina com fases de água internas diferentes

[00052] Conclusão: em comparação ao lipossoma tendo sulfato de amônio como fase de água interna, o lipossoma tendo SBE-CD/TA como fase de água interna significativamente estendeu a retenção de fármaco em fase de água interna.

Exemplo 6 Liberação in vitro de formulações de vinorelbina lipossômicas contendo SBE-CD/NH3 e sulfato de amônio como uma fase de água internamisturada. 1, Amostras

[00053] Os lipossomas de vinorelbina foram preparados em uma relação de fármaco/lipídeo de 3:9.58, como descrito no Exemplo 2 com a exceção da substituição de sal de trietilamina de β-ciclodextrina de éter sulfobutílico com a solução misturada de SBE-CD/NH3 e sulfato de amônio como descrito em A-F de tabela 3. Tabela 3: Formulações para Vinorelbina Lipossômica tendo SBE-CD/NH3 e sulfato de amônio como uma fase de água interna misturada

[00054] Amostras de formulações lipossômicas foram diluídas em 10 vezes em tampão de liberação (2 mM de NH4Cl/10 mM de histidina/250 mM de glicose, pH 7,5) e transferidas nas bolsas de diálise. A diálise foi realizada contra um volume de 200-vezes de tampão de diálise em frasco de dissolução. Teste de liberação foi realizado a 37°C, 75rpm. Em vários pontos de tempo (1 h, 2 h, 4 h, 8 h), alíquotas foram retiradas para análise. 3. Resultados Tabela 4: Liberação in vitro de formulações de vinorelbina lipossômicas tendo fase de água interna diferente

[00055] Conclusão: Os lipossomas tendo alta proporção de SBE-CD/NH3 na fase de água interna misturada exibiram liberação de fármaco relativamente lenta, indicando que sal de amônio de SBE-CD poderia estender liberação de fármaco.

Exemplo 7

[00056] Farmacocinéticas para os lipossomas tendo sulfato de amônio, sais de amônio diferentes de SBE-CD como fase de água interna

1. Amostras

[00057] Lipossomas de vinorelbina, vincristina e irinotecano foram preparados em uma relação de fármaco / lipídio de 2:9.58, como descrito no Exemplo 2 com exceção da substituição de SBE-β-CD/TA com (NH4)2SO4 para (NH4)2SO4 como fase de água interna, como descrito no Exemplo 2 para SBE-CD/TA como fase de água interna, e como descrito no Exemplo 2 com exceção da substituição de SBE-β-CD/TA com SBE-β-CD/NH3 para SBE -CD/NH3 como fase de água interna.

2. Animais e dosagem

[00058] Este exemplo foi conduzido em camundongos de DBA/2 machos, e a dosagem foi 10 mg/kg. 3. Resultados Tabela 5: Farmacocinéticas de plasma de formulações de lipossoma tendo fase de água interna diferente

[00059] Conclusão: Como mostrado em resultados farmacocinéticos, em comparação ao lipossoma tendo sulfato de amônio como fase de água interna, os lipossomas tendo SBE-CD/NH3 como de fase de água interna exibem meia vida significativamente estendida.

Exemplo 8 Eficácias de lipossomas de vinorelbina tendo fase de água interna diferente em modelo de tumor LLC 1. Formulações

[00060] Formulação 1: SBE-CD/TA como fase de água interna, preparada como descrito no Exemplo 2.

[00061] Formulação 2: Sulfato de amônio como fase de água interna, preparado como descrito no Exemplo 2 com exceção da substituição de SBE-β-CD/TA com sulfato de amônio.

[00062] Em ambas as formulações, relação de fármaco/lipídeo é 3:9.58, e o teor de DSPE-mPEG2000 é 0,5%.

2. Experiências

[00063] Células de câncer de pulmão LLC foram coletadas, e diluídas com meio de DMEM. Depois da diluição, o número de célula de tumor foi modulado em 2,0x106 cel/ml. 0,2 mL da suspensão de célula de tumor contendo cerca de 4x105 células de tumor foi inoculado em tecido subcutâneo de oxter de membro dianteiro de camundongos C57 fêmeas sob condição asséptica. Quatorze dias depois da inoculação, camundongos foram aleatorizados por volume de tumor em três grupos e administrados com uma única injeção i.v. em uma dose de 10 mg/kg.

[00064] Os camundongos foram normalmente criados depois daadministração. Diâmetros de tumor foram medidos para dinamicamente avaliar eficácias antitumor de formulações diferentes. Volume de tumor (TV) foi calculado com a seguinte fórmula: TV = 1/2 x a x b2 em que a e b representam comprimento e largura, respectivamente.

[00065] Os volumes de tumor foram calculados usando-se os resultados de medida. Os dados da experiência foram analisados usando software de estatísticas SPSS 11.5. 3. Resultados Tabela 6: Eficácias antitumor de lipossomas de vinorelbina tendo fasede água interna diferente em modelo de tumor LLC (n=10, x±sd)

** P< 0,01, *P< 0,05, em comparação com 5% de controle de glicose

[00066] Em comparação com 5% de glicose, o crescimento de tumor foi significativamente suprimido a partir do dia 4 para os lipossomas tendo sulfato de amônio como fase de água interna e a partir do dia 6 para os lipossomas tendo o SBE-CD como fase de água interna.

[00067] Taxa de proliferação de tumor relativa T/C (%) foi calculada com a seguinte fórmula: T/C% = TRTV / CRTV x 100%, em que TRTV e CRTV representam volume de tumor relativo (RTV) de grupo de tratamento e de grupo de controle negativo, respectivamente. RTV = Vt / Vo. Vo significa volume de tumor do dia 0 (dosagem inicial), e Vt significa volume de tumor em cada dia medido. Com respeito à taxa de proliferação de volume de tumor relativa do grupo SBE-CD e grupo sulfato de amônio, o $ de T/C mais baixo foi 51,8% e 31,1% respectivamente. Isto é, eficácia antitumor do grupo SBE-CD em câncer de pulmão de LLC foi superior aquele do grupo sulfato de amônio.

Exemplo 9

[00068] Eficácias antitumor de lipossomas de topotecano tendo fase de água interna diferente em modelo de tumor RM-1 de próstata 1. Formulações

[00069] Formulação 1: SBE-CD/TA como fase de água interna, preparado como descrito no Exemplo 2.

[00070] Formulação 2: Octassulfato de sacarose como fase de água interna, preparado como descrito no Exemplo 2 com exceção da substituição de SBE-β-CD/TA com octassulfato de sacarose.

[00071] Em ambas as formulações, relação de fármaco/lipídeo é 3:9.58, e o teor de DSPE-mPEG2000 é 0,5%.

2. Experiências

[00072] Células de câncer de pulmão RM-1 foram coletadas, e diluídas com meio de1640. Depois da diluição, o número de célula de tumor foi modulado em 2,0x106cels/ml. 0,2 mL da suspensão de célula de tumor contendo cerca de 4x105células de tumor foi inoculado em tecido subcutâneo de oxter de membro dianteiro de camundongos de C57 fêmeas sob condição assépticas. Doze dias depois da inoculação, camundongos foram aleatorizados por volume de tumor em grupos e administrados com uma única injeção i.v. em uma dose de 10 mg/kg.

[00073] Os camundongos foram normalmente criados depois da administração. Diâmetros de tumor foram medidos para dinamicamente avaliar eficácias antitumor de formulações diferentes. Volume de tumor (TV) foi calculado com a seguinte fórmula: TV = 1/2 x a x b2em que a e b representam comprimento e largura, respectivamente.

[00074] Os volumes de tumor foram calculados usando-se os resultados de medida. Os dados da experiência foram analisados usando software de estatísticas SPSS 11.5. 3. Resultados Tabela 7: Os efeitos antineoplásicos de lipossomas de topotecano em modelo de tumor RM-1 (n=10, x1sd )

** P< 0,01, *P< 0,05, em comparação com 5% de grupo de controle de glicose

[00075] Em comparação com 5% de glicose para injeção comocontrole, topotecano livre não suprimiram o crescimento de tumor significativamente(p> 0,05), enquanto o crescimento de tumor foi significativamentesuprimido nos dois grupos dos lipossomas tendo fase deágua interna diferente. Diferenças significantes foram observadas emcomparação com grupos de topotecano livres com dosagens iguaisenquanto nenhuma diferença significante da supressão em tumor RM-1 foi observada entre as duas formulações lipossômicas.

Exemplo 10 Toxicidade de formulações de topotecano lipossômicas diferentes em camundongos KM. 1. Formulações

[00076] Formulação 1: SBE-CD/TA como fase de água interna, preparado como descrito no Exemplo 2.

[00077] Formulação 2: Octassulfato de sacarose como fase de água interna, preparado como descrito no Exemplo 2 com exceção da substituiçãode SBE-β-CD/TA com octassulfato de sacarose.

[00078] Em ambas as formulações, relação de fármaco/lipídeo é 3:9.58, e o teor de DSPE-mPEG2000 é 0,5%.

2. Experiências

[00079] Relativo aos três fármacos lipossômicos e fármaco livre, cada grupo de dosagem tem dois camundongos KM fêmeas, começando com uma dose máxima de 40,6 mg/kg de topotecano e continuando com um fator de dose descendente de 1,25 (isto é, dosagens: 40,6, 32,5, 26,0, 20,8, 16,6, 13,3 e 10,6 mg/kg). Camundongos foram observados em termos de saúde geral e peados diariamente durante um período de 14 dias. Tabela 8. toxicidade de formulações de topotecano lipossômicas tendo fase de água interna diferente

[00080] Como mostrado na Tabela 8, a ordem de toxicidade foi: topotecano livre < lipossoma tendo SBE-CD/TA como fase de água interna < lipossoma tendo octassulfato de sacarose como fase de água interna. O lipossoma de octassulfato de sacarose causou morte de animal em uma dosagem relativa baixa.

[00081] Os presentes inventores também prepararam os lipossomas de vinorelbina, vincristina e irinotecano, e similarmente avaliaram suas toxicidades em camundongos KM. Os mesmos resultados como aqueles de topotecano foram obtidos. A ordem de toxicidade foi: fármaco livre < lipossoma tendo SBE-CD/TA como fase de água interna < lipossoma tendo octassulfato de sacarose como fase de água interna. O lipossoma de octassulfato de sacarose causou morte de animal em uma dosagem relativa baixa.

Claims

1. Lipossoma, caracterizado pelo fato de que compreende bicamada e fase de água interna, em que a fase de água interna compreende um sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico e um composto ativo alcalescente fraco, em que o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico empregando seu caráter multi-ânion forma um precipitado com o composto ativo alcalescente fraco.

2. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ciclodextrina de éter sulfobutílico é α-ciclodextrina de éter sulfobutílico, β-ciclodextrina de éter sulfobutílico ou y-ciclodextrina de éter sulfobutílico.

3. Lipossoma de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a ciclodextrina de éter sulfobutílico tem cerca de 6,5 grupos sulfo em média por molécula.

4. Lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico é formado por ciclodextrina de éter sulfobutílico com um ou mais de amina, íon de metal ou íon de amônio.

5. Lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico é formado por ciclodextrina de éter sulfobutílico com um ou mais de hidróxido de amônio, trietilamina, trietanolamina, íon de sódio, íon de potássio e íon de cálcio.

6. Lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o composto ativo é um ou mais de vinorelbina, vincristina, topotecano e irinotecano.

7. Lipossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a bicamada compreende fosfolipídeo, colesterol e lipídio modificado por polímero hidrofílico.

8. Processo para preparar o lipossoma como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende:(1) hidratar pós de fase de lipídio com solução aquosa de ciclodextrina de éter sulfobutílico ou seu sal, para formar um lipossoma branco compreendendo a solução aquosa de ciclodextrina de éter sulfobutílico ou seu sal como fase de água interna, (2) remover o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico na fase exterior do lipossoma branco obtido na etapa (1), para formar um gradiente de ânion, (3) opcionalmente, se o sal de ciclodextrina de éter sulfobutílico for um sal de íon de metal, adicionar um ionóforo do íon de metal à fase exterior do lipossoma branco obtido na etapa (2) para formar um gradiente de pH, e (4) incubar o lipossoma branco obtido na etapa (2) ou (3) com o composto ativo em solução aquosa, para encapsular o composto ativo no lipossoma.

9. Preparação farmacêutica lipossômica, caracterizada pelo fato de que que compreende o lipossoma como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Preparação farmacêutica lipossômica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o veículo e/ou excipiente compreende regulador osmótico e/ou antioxidante.

11. Uso do lipossoma como definido em qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratamento de um tumor em um paciente, em que o composto ativo no lipossoma é um ou mais de vinorelbina, vincristina, topotecano e irinotecano.