BR112012008484A2 - method, imaging apparatus, at least one computer-readable storage medium and image processor - Google Patents

Abstract

MÉTODO, APARELHO DE FORMAÇÃO DE IMAGENS, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR E PROCESSADOR DE IMAGENS. A presente invenção refere-se a métodos de fornecimento de contraste em seções de tecido para a determinação de patologias. O método compreende as etapas de geração de pelo menos uma primeira imagem e pelo menos uma segunda imagem de uma amostra (108), em que as primeira e segunda imagens geradas compreendem parâmetros de imagem de contraste complementares; e produção de imagens formadoras de contraste para observação.METHOD, IMAGE FORMATING DEVICE, MEDIA READABLE BY COMPUTER AND IMAGE PROCESSOR. The present invention relates to methods of providing contrast in sections of tissue for the determination of pathologies. The method comprises the steps of generating at least a first image and at least a second image of a sample (108), wherein the first and second images generated comprise complementary contrast image parameters; and production of contrast-forming images for observation.

Description

É. í - 1 “MÉTODO, APARELHO DE FORMAÇÃO DE IMAGENS, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR E PROCESSADOR DE IMAGENS”IT IS. í - 1 “METHOD, IMAGE FORMATING EQUIPMENT, MEDIA LEGIBLE BY COMPUTER AND IMAGE PROCESSOR”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de fornecimento de contraste em seções de tecido para a determinação de patologias.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to methods of providing contrast in sections of tissue for the determination of pathologies.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO - Exame clínico microscópico de seções de tecido corados histológicos convencionais pode ser utilizado para avaliar estruturas de tecidos ' e padrões morfológicos com significado diagnóstico. Médicos especializados podem observar essas seções de tecido corados histológicos para diagnóstico e para projetar e avaliar tratamentos. O contraste das estruturas fornecidas por essas imagens utilizando corantes clássicos é famíiliar e permite que o médico dedique os seus esforços à interpretação de características e anomalias de seções de tecido anatômicas e morfológicas e não a tentar traduzir como o procedimento de coramento revela características relevantes para o seu treinamento e experiência médica.BACKGROUND OF THE INVENTION - Microscopic clinical examination of conventional histological stained tissue sections can be used to evaluate tissue structures and morphological patterns with diagnostic significance. Specialist physicians can observe these sections of histological stained tissue for diagnosis and to design and evaluate treatments. The contrast of the structures provided by these images using classic dyes is familiar and allows the doctor to dedicate his efforts to the interpretation of anatomical and morphological tissue sections characteristics and anomalies and not to try to translate how the staining procedure reveals relevant features for the their training and medical experience.

Estão sendo desenvolvidos métodos adicionais de formação de imagens de tecidos que prometem aprimorar as informações de diagnóstico correspondentes que podem ser obtidas pelo médico com base em material de biópsia valioso e amostras de tecido arquivadas. Pode-se utilizar, por exemplo, microscopia de fluorescência para detecção de marcadores moleculares i especializados, mas imagens com base em fluorescência tipicamente não possuem as informações de contexto estrutural e anatômico familiares encontradas em tecidos corados com hematoxilina e eosina (H&E) e observados utilizando microscopia de campo brilhante.Additional tissue imaging methods are being developed that promise to improve the corresponding diagnostic information that can be obtained by the physician based on valuable biopsy material and archived tissue samples. For example, fluorescence microscopy can be used to detect specialized molecular markers, but fluorescence-based images typically lack the familiar structural and anatomical context information found in tissues stained with hematoxylin and eosin (H&E) and observed using bright field microscopy.

Embora imagens com base em fluorescência forneçam informações moleculares úteis para confirmar e caracterizar estados de doença, seções com corantes histológicos convencionais permanecemAlthough fluorescence-based images provide useful molecular information to confirm and characterize disease states, sections with conventional histological stains remain

Ns De Ns) =. . . | fe e é tu e | a tr ii a rimas ns] im [aero se EE quo ear one onde nao um ie fam do en ST te rele de mel | necessárias para a determinação da patologia sobre o tecido. Tipicamente, seções de tecido em série através de uma amostra devem ser preparadas e avaliadas. Comumente, as seções em série incluem uma seção corada com H&E convencional e seção(ões) especialmente corada(s) para marcadores moleculares de diagnóstico. A comparação de seções em série não apenas aumenta o custo e o tempo necessários para avaliação, mas também dificulta ' ou impossibilita a correlação de características encontradas em uma seção com características encontradas na outra. Seções em série podem também ser perdidas ou destruídas no fluxo de processo de corantes.Ns Of Ns) =. . . | fe and it's you and | a tr ii a rimas ns] im [aero if EE quo ear one where not an ie fam do en ST te rer de mel | necessary to determine the pathology on the tissue. Typically, tissue sections in series through a sample should be prepared and evaluated. Commonly, the serial sections include a section stained with conventional H&E and a section (s) specially stained for molecular diagnostic markers. The comparison of sections in series not only increases the cost and time needed for evaluation, but also makes it difficult or impossible to correlate features found in one section with features found in the other. Serial sections can also be lost or destroyed in the dye process flow.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A tecnologia descrita no presente fornece métodos e aparelhos que utilizam contraste multimodal para produzir componentes de contraste complementares segmentados e exibidos de forma relevante para o treinamento e experiência médica para análise de patologias. Esses modos de : 15 contraste complementares podem ser colocados em fluxo de visor para permitir a navegação de estruturas de tecidos, concentração e mudanças de magnitude. As seções de tecido podem conter uma ou mais sondas dirigidas a moléculas específicas ou substâncias de interesse. É fornecido contraste de coloração de estrutura de tecidos que pode ser comparável ao contraste — produzido com corantes histológicos absorventes de coloração convencionais tais como hematoxilina e corantes de eosina (a seguir, “H&E”). As imagens produzidas por meio de um ou mais dos métodos descritos podem também incluir características reveladas utilizando marcadores adicionais e modos de contraste óticos ou químicos. Tipicamente, a correlação de características com marcas diferentes entre diferentes seções de tecido torna-se desnecessária. As imagens são apresentadas em contexto de campo brilhante colorido fornecido digitalmente para fornecer uma aparência de imagem que é comparável com a produzida em lâminas histológicas convencionais que foram coradas paraDESCRIPTION OF THE INVENTION The technology described in the present provides methods and devices that use multimodal contrast to produce complementary contrast components segmented and displayed in a relevant way for training and medical experience for analysis of pathologies. These complementary contrast modes can be placed in a viewfinder flow to allow navigation of tissue structures, concentration and changes in magnitude. Tissue sections can contain one or more probes aimed at specific molecules or substances of interest. Tissue contrast of tissue structure is provided which can be comparable to the contrast - produced with conventional staining absorbent histological dyes such as hematoxylin and eosin dyes (hereinafter “H&E”). Images produced using one or more of the described methods may also include features developed using additional markers and chemical or optical contrast modes. Typically, the correlation of characteristics with different marks between different sections of fabric becomes unnecessary. The images are presented in a brightly colored colored field context provided digitally to provide an image appearance that is comparable to that produced on conventional histological slides that have been stained for

' ' 3 revelar as mesmas características estruturais.'' 3 reveal the same structural characteristics.

Em alguns exemplos descritos de contraste multimodal, o | contraste é derivado das propriedades de índice de refração e marcação fluorescente de tecido preparada especialmente para marcadores de moléculas específicas.In some described examples of multimodal contrast, | contrast is derived from the properties of refractive index and fluorescent tissue marking specially prepared for specific molecule markers.

Estes exemplos demonstram a combinação complementar de formação de imagens de contraste de refração de campo escuro com luz transmitida, com formação de imagens de fluorescência de luz incidente simultânea de contracorantes nucleares e a interrogação de sondas moleculares multiplexadas.These examples demonstrate the complementary combination of dark field refraction contrast imaging with transmitted light, with simultaneous incident fluorescence imaging of nuclear counter dyes and the interrogation of multiplexed molecular probes.

São obtidas imagens correlativas correspondentes simultaneamente (em paralelo) ou sequencialmente (em série). Em alguns exemplos, comprimentos de onda de iluminação e comprimentos de onda de detecção utilizados para criar contraste sobre tecido corado ou não corado podem ser firmemente controlados para promover segmentação sem ambiguidade e evitar interferência com sondas multiplexadas.Corresponding correlative images are obtained simultaneously (in parallel) or sequentially (in series). In some instances, illumination wavelengths and detection wavelengths used to create contrast on stained or unstained tissue can be tightly controlled to promote unambiguous segmentation and avoid interference with multiplexed probes.

Localizações de sonda específicas de moléculas para antígenos de proteína, expressão de MRNA ou redisposições genéticas em DNA podem ser sobrepostas sobre a estrutura de amostra.Molecule-specific probe locations for protein antigens, MRNA expression or genetic rearrangements in DNA can be overlaid on the sample structure.

Este contraste é associado a alterações do índice de refração devido à estrutura de tecido conforme preservado e resolvido utilizando processamento histológico específico.This contrast is associated with changes in the refractive index due to the tissue structure as preserved and resolved using specific histological processing.

Em exemplos típicos, os métodos descritos fornecem contraste de imagens com base em variações do Índice de refração em porções de tecido em combinação com contracorantes fluorescentes para fornecer contexto patológico de coloração para sondas multiplexadas específicas de moléculas.In typical examples, the methods described provide image contrast based on variations in the refractive index in portions of tissue in combination with fluorescent counterstains to provide pathological staining context for specific molecule multiplexed probes.

Exemplos incluem tecidos embutidos em parafina, fixados com formalina e tecido congelado.Examples include fabrics embedded in paraffin, fixed with formalin and frozen tissue.

Contraste de índice de refração pode ser derivado diretamente das propriedades de refração ou : difusão de porções de sonda e tecido ou da amplitude de uma comutação de fases ou velocidade de mudança de um gradiente de comutação de fases.Refractive index contrast can be derived directly from the refractive properties or: diffusion of probe and tissue portions or the amplitude of a phase shift or speed of change of a phase shift gradient.

Alguns métodos descritos compreendem a exposição de umaSome methods described include the exposure of a

' 4 amostra com corantes fluorescentes a um feixe de estímulos selecionado para produzir fluorescência pelo corante fluorescente e a produção de uma imagem de fluorescência correspondente.'4 sample with fluorescent dyes to a stimulus beam selected to produce fluorescence by the fluorescent dye and the production of a corresponding fluorescence image.

A mesma amostra também é exposta a uma iluminação de campo escuro de circunferência com alto NA e é produzida uma imagem de campo escuro correspondente que representa alterações do índice de refração e porções de difusão de luz.The same sample is also exposed to dark field illumination with high NA circumference and a corresponding dark field image is produced that represents changes in the refractive index and light scattering portions.

Em alguns exemplos, a exposição de feixe de estímulo de fluorescência e a exposição de campo de iluminação de refração de campo escuro são aplicadas simultaneamente e as imagens complementares são obtidas em paralelo.In some examples, the fluorescence stimulus beam exposure and the dark field refraction illumination field exposure are applied simultaneously and the complementary images are obtained in parallel.

Em outros exemplos, a imagem de fluorescência e a imagem de contraste de refração de campo escuro são registradas em série.In other examples, the fluorescence image and the darkfield refractive contrast image are recorded in series.

Aparelhos de formação de imagens de acordo com os exemplos compreendem um sistema ótico multimodal configurado para produzir um campo de iluminação de campo escuro transmitido e um sistema ótico de excitação de fluorescência de iluminação incidente.Imaging apparatus according to the examples comprises a multimodal optical system configured to produce a transmitted dark field illumination field and an incident fluorescence excitation optical system.

Esses subsistemas são configurados para produzir diversas imagens complementares que podem ser combinadas para análise correlativa: uma imagem de contraste de refração com base em propriedades do tecido preparado, uma imagem de fluorescência de um contracorante nuclear e uma série de imagens fluorescentes que representam diversos marcadores moleculares que podem ser segmentados por comprimento de onda de emissão.These subsystems are configured to produce several complementary images that can be combined for correlative analysis: a refractive contrast image based on the properties of the prepared tissue, a fluorescence image of a nuclear counter dye and a series of fluorescent images that represent various molecular markers that can be segmented by emission wavelength.

Pelo menos um dispositivo de captura de imagens é acoplado para receber o campo escuro e imagens de RE fluorescência e um processador de imagens é configurado para registrar e processar a imagem de campo escuro e as imagens de fluorescência e produzir uma imagem combinada.At least one image capture device is coupled to receive the darkfield and fluorescence RE images and an image processor is configured to record and process the darkfield image and fluorescence images and produce a combined image.

Meios de armazenagem legíveis por computador compreendem instruções executáveis por computador para receber imagens associadas a Í diversos modos de contraste associados a partes comuns de uma seção de | amostra preparada para exame patológica e sobreposição dos diversos modos | | | i 5 de contraste para produzir uma imagem combinada.Computer-readable storage media comprise computer-executable instructions for receiving images associated with various contrast modes associated with common parts of a | sample prepared for pathological examination and overlapping of different modes | | | i 5 contrast to produce a combined image.

Em alguns exemplos, o processador de imagens é configurado para produzir um campo brilhante pseudocolorido que fornece a imagem combinada com base nas imagens fluorescentes e na imagem de campo escuro de contraste de refração registrada. A imagem de fluorescência e a imagem de refração de campo escuro são individualmente coloridas, | combinadas e invertidas para produzir uma imagem de coloração combinada em um contexto de campo brilhante aparente com contraste relevante para | corantes convencionais. Mapeamentos de coloração específicos para facilitar a | 10 interpretação direta dos médicos são aplicados à imagem de contraste de | refração, contracorantes nucleares fluorescentes e sondas fluorescentes específicas. Estas imagens são combinadas em seguida para produzir uma imagem registrada com coloração combinada no fornecimento de campo brilhante. Em alguns exemplos, o mapeamento de coloração é baseado em medidas quantitativas de percepção humana de coloração preferida para determinação da patologia associada a pelo menos um corante histológico absorvente de coloração tal como um corante de eosina. Em ainda outros exemplos, uma tabela de referência de cores é aplicada a uma imagem de fluorescência, em que o mapeamento de coloração é associado a pelo menos um corante histológico absorvente de coloração contrastante tal como um nm .. . ., corante de hematoxilina. Em alguns exemplos, tabelas de referência de cores são aplicadas à imagem de refração de campo escuro e à imagem de contracorante de fluorescência, de forma a produzir uma imagem que possui contraste invertido associado a matiz de coloração complementar, valor invertido e saturação invertida em comparação com a encontrada em corantes de hematoxilina e eosina ideais. Em outros exemplos, a amostra com imagem formada oticamente é preparada para formação de imagens adicional utilizando espectrometria de massa para fornecer mapeamento molecular.In some examples, the image processor is configured to produce a pseudo-colored bright field that provides the combined image based on the fluorescent images and the recorded refractive contrast dark field image. The fluorescence image and the darkfield refraction image are individually colored, | combined and inverted to produce a combined color image in an apparent bright field context with contrast relevant to | conventional dyes. Specific staining mappings to facilitate the | 10 direct interpretation of doctors are applied to the contrast image of | refraction, fluorescent nuclear counterstains and specific fluorescent probes. These images are then combined to produce a registered image with combined coloring in the bright field supply. In some examples, staining mapping is based on quantitative measures of human perception of preferred staining for determining the pathology associated with at least one staining absorbing histological stain such as an eosin stain. In yet other examples, a color reference table is applied to a fluorescence image, in which the color mapping is associated with at least one absorbent histological dye of contrasting color such as a nm ... ., hematoxylin dye. In some examples, color reference tables are applied to the dark field refraction image and the fluorescence counter dye image, in order to produce an image that has inverted contrast associated with complementary tint, inverted value and inverted saturation in comparison. with that found in ideal hematoxylin and eosin dyes. In other examples, the optically formed sample is prepared for further imaging using mass spectrometry to provide molecular mapping.

ad o 6 Estas e outras características e aspectos da tecnologia descrita são descritos abaixo com referência às figuras anexas.ad o 6 These and other characteristics and aspects of the technology described are described below with reference to the attached figures.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um diagrama esquemático de um sistema de formação deimagens representativo que fornece imagens com base em fluorescência e campo escuro de contraste de refração. ' A Fig. 2 é um diagrama de bloco esquemático de um método de processamento e combinação de imagens com base em corantes fluorescentes e campo escuro registradas.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a schematic diagram of a representative image formation system that provides images based on fluorescence and dark field of refractive contrast. Fig. 2 is a schematic block diagram of a method of processing and combining images based on registered fluorescent dye and dark field.

A Fig. 3 é um diagrama de bloco esquemático de um método representativo de produção de uma amostra de imagem a partir de diversos modos de contraste com contraste correspondente ao utilizado na determinação de patologia com corantes de hematoxilina e eosina (H&E).Fig. 3 is a schematic block diagram of a representative method of producing an image sample from various contrast modes with contrast corresponding to that used in determining pathology with hematoxylin and eosin (H&E) dyes.

A Fig. 4A é uma imagem corada com H&E convencional representativa de uma seção de próstata humana.Fig. 4A is an image stained with conventional H&E representative of a human prostate section.

A Fig. 4B é uma imagem de contraste com múltiplos modos de uma seção de próstata humana com base em uma combinação de uma imagem de refração de campo escuro e uma imagem de contracorantes de fluorescência fornecida em contexto de campo brilhante.Fig. 4B is a multi-mode contrast image of a human prostate section based on a combination of a dark field refraction image and a fluorescence counterstain image provided in a bright field context.

As Figs. 5A-5B são imagens de contraste de múltiplos modos ..... com iluminação dupla (contraste de refração e fluorescência) registradas com CCD monocromático com exposições sequenciais tomadas utilizando filtros de interferência para selecionar os comprimentos de onda de fluorescência DAPI azuis (Fig. 5A) ou os comprimentos de onda de campo escuro transmitidos com — comprimento de onda mais longo (Fig. 5B).Figs. 5A-5B are multi-mode contrast images ..... with double illumination (refraction contrast and fluorescence) recorded with monochrome CCD with sequential exposures taken using interference filters to select the blue DAPI fluorescence wavelengths (Fig. 5A) or dark field wavelengths transmitted with - longer wavelength (Fig. 5B).

A Fig. 5C é uma imagem pseudocolorida obtida por meio da aplicação de tabelas de consulta de coloração invertida para pseudocoloração das imagens das Figs. 5A-5B e adição das imagens de coloração invertida.Fig. 5C is a pseudo-colored image obtained by applying inverted color lookup tables to pseudo-colored the images in Figs. 5A-5B and addition of the inverted coloring images.

Ú 7 A Fig. 5D é um campo brilhante pseudocolorido que fornece a imagem que corresponde à imagem da Fig. 5C após a inversão do espaço de cor mapeado.Ú 7 Fig. 5D is a pseudo-colored bright field that provides the image corresponding to the image in Fig. 5C after the inversion of the mapped color space.

A Fig. 6 é um contexto de campo brilhante que fornece imagem — pormeio de localizações sobrepostas de sondas fluorescentes ponto quântico com comprimentos de onda de emissão de pico de 565 nm e 655 nm de uma : amostra embutida em parafina fixada em formalina contracorada com DAP! também com imagem formada par contraste de refração.Fig. 6 is a bright field context that provides image - through overlapping locations of quantum dot fluorescent probes with peak emission wavelengths of 565 nm and 655 nm of a: embedded paraffin sample fixed in formalin counterstained with DAP ! also with image formed by refractive contrast.

A Fig. 7 contém outros exemplos de imagens de formação de imagens multimodais para exibição de contexto de campo brilhante.Fig. 7 contains other examples of multimodal imaging images for displaying bright field context.

Imagens de contraste refrativo de campo escuro e imagens de fluorescência DAPI de seções de amídala contracoradas com DAPI foram obtidas, sobrepostas e fornecidas como imagens de campo brilhante colorido conforme exibido na Fig. 7 (1a-3a). Imunossondas específicas de proteína (localizadas em fluorescência utilizando pontos quânticos que possuem emissões de pico a 565 nm para antígeno CD20 e 655 nm para antígeno Ki67) foram aplicadas às seções de amídalas contracoradas com DAPI para produzir imagens com base em fluorescência de imunossondas correspondentes.Dark-field refractive contrast images and DAPI fluorescence images of tonsil sections counter-stained with DAPI were obtained, overlaid and supplied as bright colored field images as shown in Fig. 7 (1a-3a). Protein-specific immunoassays (located in fluorescence using quantum dots that have peak emissions at 565 nm for CD20 antigen and 655 nm for Ki67 antigen) were applied to sections of tonsils counterstained with DAPI to produce fluorescence-based images of corresponding immunoassays.

As imagens de sonda foram sobrepostas em pseudocores contrastantes (verde e vermelho) conforme exibido na Fig. 7 (1b-3b). A Fig. 7 (10-3c) exibe as imagens da Fig. 7 (1a-3a) e da Fig. 7 (1b-3b) após a sua combinação. | E Á As Figs. 8A-8B são imagens representativas adicionais nas quais são obtidas imagens histológicas de campo brilhante simuladas e imagens de sonda fluorescente combinadas utilizando métodos alternativos.The probe images were superimposed in contrasting pseudo colors (green and red) as shown in Fig. 7 (1b-3b). Fig. 7 (10-3c) shows the images of Fig. 7 (1a-3a) and Fig. 7 (1b-3b) after their combination. | E Figs. 8A-8B are additional representative images in which simulated bright field histological images and fluorescent probe images are combined using alternative methods.

A Fig. 8A é uma sobreposição aditiva a uma imagem de campo pseudobrilhante com múltiplos modos utilizando sondas de ponto quântico (Ponto quântico — Qdot) com comprimentos de onda de emissão de 565 nm e 655 nm de uma amostra embutida em parafina fixada com formalina contracorada com DAPI.Fig. 8A is an additive overlay to a pseudo-bright field image with multiple modes using quantum dot probes (Quantum Dot - Qdot) with emission wavelengths of 565 nm and 655 nm from a paraffin embedded sample fixed with counterstained formalin with DAPI.

A Fig. 8BFig. 8B

: 8 é uma sobreposição subtrativa na qual as imagens de sondas pseudocoloridas são subtraídas da imagem fornecida com H&E fac-símile.: 8 is a subtractive overlay in which images from pseudo-colored probes are subtracted from the image provided with facsimile H&E.

A Fig. 9 ilustra um exemplo do espaço de coloração CIEL*a*b* utilizado para mapear características de coloração preferenciais para H&E para contraste de refração e fluorescência DAPI para fornecer campo brilhante para determinação de patologias.Fig. 9 illustrates an example of the CIEL * a * b * staining space used to map preferred H&E staining characteristics for refractive contrast and DAPI fluorescence to provide bright field for pathology determination.

As Figs. 10A4-10B são contraste de índice de refração em escala e cinza e imagens de contraste de fluorescência de DAPI, respectivamente. As Figs. 10C-10D são imagens convertidas com eosina e convertidas com hematoxilina pseudocoloridas CIEL*a*b* com base nas imagens das Figs. 10A- 10B, respectivamente. A Fig. 10E é uma imagem combinada obtida por meio de combinação das imagens convertidas das Figs. 10C-10D.Figs. 10A4-10B are gray-scale and gray refractive index contrast and DAPI fluorescence contrast images, respectively. Figs. 10C-10D are images converted with eosin and converted with CIEL * a * b * pseudo-colored hematoxylin based on the images of Figs. 10A-10B, respectively. Fig. 10E is a combined image obtained by combining the converted images of Figs. 10C-10D.

A Fig. 11 é um diagrama esquemático de um sistema ótico que produz simultaneamente imagens de campo escuro de refração lado a lado e imagens com base em fluorescência utilizando uma única câmera CCD.Fig. 11 is a schematic diagram of an optical system that simultaneously produces dark field images of refraction side by side and fluorescence based images using a single CCD camera.

A Fig. 12 contém uma imagem de índice de refração lado a lado (campo escuro) (A) e uma imagem de DAPI (B) da mesma seção de tecido obtida e exibida simultaneamente.Fig. 12 contains a refractive index image side by side (dark field) (A) and a DAPI image (B) from the same section of tissue obtained and displayed simultaneously.

A Fig. 13 contém uma imagem sobreposta que fornece campo brilhante com duas cores (com pseudocoloração e inversão de imagens) com base nas imagens lado a lado da Fig. 12. Observe-se que esta imagem gira | | com relação à imagem da Fig. 12.Fig. 13 contains a superimposed image that provides a bright field with two colors (with pseudocoloration and inversion of images) based on the images side by side in Fig. 12. Note that this image rotates | | with respect to the image in Fig. 12.

As Figs. 14A-14B são imagens de amostras de tecido de rim de camundongos criosseccionados preparadas para deposição de marcas de — formação de imagens espectroscópicas de massa. O contraste é produzido por meio de refração em extremidades de tecidos e autofluorescência de tecidos (azul).Figs. 14A-14B are images of kidney tissue samples from cryosected mice prepared for deposition of mass spectroscopic imaging marks. Contrast is produced through refraction at the ends of tissues and tissue autofluorescence (blue).

As Figs. 154-15B são imagens de amostras de tecido de rim de o 9 camundongos preparadas para formação de imagens espectroscópicas de massa por meio de deposição de uma matriz ionizante. A autofluorescência parece azul e o contraste do índice de refração associado a cristais de matriz ionizante é evidente. | 5 A Fig. 16 é um diagrama esquemático que ilustra um ambiente de computação para o aparelho e os métodos descritos no presente. ] A Fig. 17 é uma imagem em modo múltiplo que fornece contexto celular e nuclear em campo brilhante que fornece um xenoenxerto Calu-3 sondado para determinar a hibridização in situ de MRNA de duas sondas, uma para RNA ribossômico (cor ciano, seta preta tracejada) e a outra para expressão de MRNA HER?2 (cor preta, setas pretas sólidas).Figs. 154-15B are images of kidney tissue samples from the 9 mice prepared to form mass spectroscopic images by depositing an ionizing matrix. Autofluorescence appears blue and the contrast of the refractive index associated with crystals of ionizing matrix is evident. | 5 Fig. 16 is a schematic diagram that illustrates a computing environment for the apparatus and the methods described herein. ] Fig. 17 is a multi-mode image that provides cellular and nuclear context in a bright field that provides a probed Calu-3 xenograft to determine in situ hybridization of two probe MRNA, one for ribosomal RNA (cyan color, black arrow dashed) and the other for MRNA HER? 2 expression (black color, solid black arrows).

A Fig. 18 é uma imagem representativa de um câncer da próstata com imagem formada utilizando contraste em modo duplo e apresentada em contexto de campo brilhante em ampliação de 20x para determinação da | 15 patologia, Nucléolos proeminentes e padrões anômalos de crescimento característicos de câncer da próstata são evidentes.Fig. 18 is a representative image of prostate cancer with an image formed using contrast in double mode and presented in a bright field context at 20x magnification to determine the | 15 pathology, prominent nucleoli and anomalous growth patterns characteristic of prostate cancer are evident.

A Fig. 19 é uma parte da mesma região com imagem formada em ampliação de 40x utilizando o mesmo método de modo duplo simultâneo de combinação de contraste de refração com contracorante nuclear fluorescente e fornecimento em contexto de campo brilhante.Fig. 19 is a part of the same region with an image formed at 40x magnification using the same simultaneous double mode method of combining refractive contrast with fluorescent nuclear counter-dye and delivery in a bright field context.

DESCRIÇÃO DE REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO E Da forma utilizada no presente pedido e nas reivindicações, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, o termo "inclui" significa "compreende", Os sistemas, aparelhos e métodos descritos no presente não deverão ser interpretados como limitadores de nenhuma forma. Ao contrário, o presente relatório descritivo refere-se a todos os aspectos e característicasDESCRIPTION OF ACCOMPLISHMENTS OF THE INVENTION E As used in the present application and in the claims, the singular forms "one", "one" and "o / a" include references to the plural, unless the context clearly indicates otherwise. In addition, the term "includes" means "comprises", The systems, apparatus and methods described herein should not be construed as limiting in any way. On the contrary, the present specification refers to all aspects and characteristics

. inovadoras e não óbvias das diversas realizações descritas, isoladamente e em várias combinações e subcombinações entre si. Os sistemas, métodos e aparelhos descritos não se limitam a nenhum aspecto ou característica específica ou suas combinações, nem os sistemas, métodos e aparelhos descritos necessitam que nenhuma ou mais vantagens específicas estejam presentes ou problemas sejam solucionados.. innovative and not obvious from the various achievements described, in isolation and in various combinations and subcombination between them. The described systems, methods and devices are not limited to any specific aspect or characteristic or their combinations, nor do the described systems, methods and devices require that any or more specific advantages are present or problems are solved.

— Embora as operações de alguns dos métodos descritos sejam descritas em uma ordem sequencial específica para conveniência de apresentação, dever-se-á compreender que esta forma de descrição engloba a redisposição, a menos que seja necessária uma ordem específica por linguagem específica definida abaixo. As operações descritas sequencialmente, por exemplo, podem em alguns casos ser redispostas ou realizadas simultaneamente. Além disso, por motivo de simplicidade, as figuras anexas podem não exibir as diversas formas em que os sistemas, métodos e aparelhos descritos podem ser utilizados em conjunto com outros sistemas, métodos e aparelhos. Adicionalmente, o relatório descritivo às vezes utiliza termos como “produzir” e “fornecer” para descrever os métodos revelados. Estes termos são abstrações de alto nível das operações reais que são realizadas. As operações reais que correspondem a esses termos variarão dependendo da implementação específica e são facilmente discerníveis pelos técnicos no assunto.- Although the operations of some of the described methods are described in a specific sequential order for convenience of presentation, it should be understood that this form of description encompasses redisposition, unless a specific order by specific language defined below is required. The operations described sequentially, for example, can in some cases be rearranged or carried out simultaneously. In addition, for the sake of simplicity, the attached figures may not show the various ways in which the systems, methods and devices described can be used in conjunction with other systems, methods and devices. In addition, the specification sometimes uses terms like "produce" and "supply" to describe the revealed methods. These terms are high-level abstractions from the actual operations that are carried out. Actual operations that correspond to these terms will vary depending on the specific implementation and are easily discernible by those skilled in the art.

É sá As teorias de operação, princípios científicos e outras descrições teóricas apresentadas no presente com referência aos aparelhos ou métodos de acordo com a presente invenção foram fornecidas para fins de melhor compreensão e não se destinam a ser limitadoras do seu escopo. Os aparelhos e métodos de acordo com as reivindicações anexas não se limitam aos aparelhos e métodos que funcionam da forma descrita por essas teorias de operação.É sá The theories of operation, scientific principles and other theoretical descriptions presented herein with reference to the apparatus or methods according to the present invention have been provided for purposes of better understanding and are not intended to limit its scope. The apparatus and methods according to the appended claims are not limited to the apparatus and methods which function in the manner described by these operating theories.

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INTRODUÇÃO Diversos modos de geração de contraste complementar no tecido podem permitir a visualização de contexto de tecido morfológico e anatômico, apresentado em um contexto de campo brilhante familiar para os médicos treinados, em conjunto com localizações de sondas para moléculas específicas ou variações da química de tecidos. O contraste multimodal pode alavancar " uma série de interações de tecidos leves e detecção de sondas, desde que as informações fornecidas sejam complementares. O tecido preparado para exame patológico possui atividade ótica constitutiva e as qualidades óticas produzidas por meio de um protocolo específico podem ser otimizadas para | produzir qualidades de contraste úteis quando combinadas com instrumentação de formação de imagens apropriada. Contraste de imagens para estruturas não fluorescentes pode ser fornecido por meio de componentes com atividade ótica elaborados ou preservados em um esquema de preparação de tecidos específico tal como utilizado em protocolos de corante automatizados sobre tecido embutido em formalina fixado com parafina, bem como tecido congelado. Esta atividade ótica aprimorada pode ser registrada digitalmente e fornecida em contraste de campo brilhante artificial para visualizar e ressaltar estruturas tais como a matriz extracelular, nucléolos e membranas celulares. Essas capacidades de -- -- + -— --—- visualização são utilizadas para diagnosticar padrões de crescimento anômalos e características de morfologia de condições patológicas em tecido. Diversos ] modos de propriedades óticas, químicas ou de atividade em tecido preparado podem ser registrados, em série ou em paralelo, convertidos digitalmente em contraste de imagem de campo brilhante para visualização e são denominados no presente “campo pseudobrilhante”. Estruturas de imagens representativas possuem significado patológico e podem ser utilizadas por médicos na seleção de tecidos e no omni 12 ' AA AA Aa A qa meme em e ms ma TE cem.INTRODUCTION Several ways of generating complementary contrast in the tissue can allow the visualization of the context of morphological and anatomical tissue, presented in a context of bright field familiar to trained physicians, together with probe locations for specific molecules or variations in tissue chemistry. . The multimodal contrast can leverage "a series of interactions of light tissues and probe detection, as long as the information provided is complementary. The tissue prepared for pathological examination has constitutive optical activity and the optical qualities produced through a specific protocol can be optimized to | produce useful contrast qualities when combined with appropriate imaging instrumentation. Image contrast for non-fluorescent structures can be provided through components with optical activity elaborated or preserved in a specific tissue preparation scheme as used in protocols of dye automated over tissue embedded in formalin fixed with paraffin, as well as frozen tissue.This enhanced optical activity can be digitally recorded and provided in artificial bright field contrast to visualize and highlight structures such as the extracellular matrix, nucleoli and cell membranes homes. These - - + - - - - visualization capabilities are used to diagnose anomalous growth patterns and morphology characteristics of pathological conditions in tissue. Several] modes of optical, chemical or activity properties on prepared tissue can be recorded, in series or in parallel, digitally converted into bright field image contrast for viewing and are referred to in the present “pseudo-bright field”. Representative image structures have pathological significance and can be used by doctors in tissue selection and in the omni 12 'AA AA Aa A qa meme in e ms ma TE hundred.

diagnóstico de estados de doença cancerosa e pré-cancerosa, bem como para outros fins de diagnóstico e na avaliação da eficácia de tratamento. Em uma seção de tecido não corado ou com corantes especiais, essas estruturas morfológicas e contexto anatômico podem ser praticamente invisíveis sob — métodos de contraste de modo único tais como detecção por fluorescência ou campo brilhante de luz transmitida convencional. Métodos de formação de imagens com diversas modalidades complementares podem produzir informações estruturais medicamente relevantes e apresentar essa informação em um formato facilmente interpretável sem o uso de uma linhagem de absorção de luz convencional. Valores quantitativos podem ser medidos e registrados com base no uso de um ou mais conjuntos de instruções executáveis por computador fornecidas por um ou mais meios de armazenagem legíveis por computador. Medidas morfológicas podem ser alavancadas para correlacionar essas características morfológicas com as informações moleculares contidas no mesmo tecido; esta abordagem pode ajudar em esforços em andamento para estratificar a condição e prognóstico da doença, bem como monitorar a eficácia do tratamento. Imagens digitais com múltiplas modalidades de seções de tecido podem ser capturadas simultaneamente e oferecidas utilizando cores distintas para componentes com características complementares e fornecidas em fluxo ou armazenadas ou “7 fornecidas de outra forma para exame por um patologista ou outro médico quase em tempo real. Esses métodos faciltam o desenvolvimento de diagnóstico com base em tecidos com alta complexidade e permitem alavancar a experiência e treinamento médico com linhagens histológicas convencionais.diagnosis of cancerous and precancerous disease states, as well as for other diagnostic purposes and in the evaluation of treatment effectiveness. In a section of unstained fabric or with special dyes, these morphological structures and anatomical context can be practically invisible under - unique contrast methods such as fluorescence detection or bright field of conventional transmitted light. Imaging methods with several complementary modalities can produce medically relevant structural information and present this information in an easily interpretable format without the use of a conventional light-absorbing strain. Quantitative values can be measured and recorded based on the use of one or more sets of computer-executable instructions provided by one or more computer-readable storage media. Morphological measures can be leveraged to correlate these morphological characteristics with the molecular information contained in the same tissue; this approach can assist ongoing efforts to stratify the condition and prognosis of the disease, as well as monitor the effectiveness of treatment. Digital images with multiple modalities of tissue sections can be captured simultaneously and offered using different colors for components with complementary characteristics and supplied in flow or stored or “7 otherwise provided for examination by a pathologist or other physician in near real time. These methods facilitate the development of diagnoses based on highly complex tissues and allow leveraging medical experience and training with conventional histological lines.

Dados moleculares, incluindo os de imuno-histoquímica, hibridização de DNA, sondas de hibridização de MRNA, lectinas, espectrometria de massa e outras análises, podem ser integrados para seções de tecido individuais e relatados rapidamente em um formato que seja familiar e pertinente para o patologista e Lebre 13 | Drtrises creme encare. | | praticante.Molecular data, including immunohistochemistry, DNA hybridization, MRNA hybridization probes, lectins, mass spectrometry and other analyzes, can be integrated for individual tissue sections and reported quickly in a format that is familiar and relevant to the pathologist and Hare 13 | Drtrises cream face. | | practitioner.

Í Os exemplos fornecidos no presente alavancam uma estratégia de formação de imagens com múltiplas modalidades utilizando trajetos de iluminação dupla para fornecer imagens com contraste complementar de estrutura de proteina e contracorantes de DNA, bem como marcadores específicos de moléculas para avaliação e diagnóstico médico.The examples provided in the present leverage a multi-modal imaging strategy using dual lighting paths to provide images with complementary protein structure contrast and DNA counters, as well as specific molecule markers for medical assessment and diagnosis.

O exemplo de abordagem inclui uma combinação de refração de campo escuro e contraste de fluorescência; estes modos de contraste complementares são fornecidos de forma digital utilizando tabelas coloridas especializadas derivadas de preferências médicas de qualidades de corantes histológicos clássicas.The example approach includes a combination of darkfield refraction and fluorescence contrast; these complementary contrast modes are provided digitally using specialized color tables derived from medical preferences for classic histological stain qualities.

Com essa combinação, pode-se fornecer contraste com múltiplas cores em amostras de tecido similares às obtidas em amostras coradas utilizando métodos histológicos tais como o corante de hematoxilina e eosina (H&E). Essas imagens podem ser utilizadas para desenvolver regiões de interesse para análise molecular adicional utilizando sondas luminescentes, fluorescentes, de difusão ou absorção para antígenos de proteínas, lipídios e carboidratos, MRNA ou DNA, sondas para propriedades de carga ou para espectrometria de massa de formação de imagens (IMS). O esquema de contraste de iluminação de contraste multimodal exemplificado no presente pode fornecer informações contextuais de seções de tecidos de forma “Tiro + > consistente com combinações de corantes e contracorantes comuns utilizadas em métodos histológicos convencionais.With this combination, it is possible to provide contrast with multiple colors in tissue samples similar to those obtained in stained samples using histological methods such as hematoxylin and eosin dye (H&E). These images can be used to develop regions of interest for additional molecular analysis using luminescent, fluorescent, diffusion or absorption probes for protein, lipid and carbohydrate antigens, MRNA or DNA, probes for charge properties or for mass formation spectrometry of images (IMS). The multimodal contrast lighting contrast scheme exemplified in the present can provide contextual information on tissue sections in a “Tire +>” manner consistent with common dye and counter-color combinations used in conventional histological methods.

Por conveniência, feixes de radiação ótica que são dirigidos a uma amostra para a obtenção de imagens são denominados no presente feixes de estímulo.For convenience, optical radiation beams that are directed to a sample to obtain images are referred to in the present stimulus beams.

Em alguns exemplos, feixes de estímulo são selecionados para produzir fluorescência em uma ou mais partes da amostra e podem ou não estar em comprimentos de onda visíveis.In some examples, stimulus beams are selected to produce fluorescence in one or more parts of the sample and may or may not be at visible wavelengths.

Outros feixes de estímulo incluem feixes de iluminação que estão em comprimentos de onda visíveis para observação direta.Other stimulus beams include beams of light that are at visible wavelengths for direct observation.

Feixes de estímulo podem também ser |Stimulus bundles can also be |

S 14 baseados em outros tipos de radiação, incluindo em outras faixas de comprimentos de onda e feixes de partículas carregados ou feixes acústicos. Em alguns exemplos, esses métodos e aparelhos foram aplicados a aplicações de hibridização in situ por fluorescência (FISH), imuno- —histoquímica (IHC) e hibridização in situ de MRNA (MRNA-ISH) em tecidos embutidos em parafina fixados com formalina. Sondas FISH marcadas com ponto quântico (QDot), sondas IHC marcadas com QDot e sondas de mRNA- ISH marcadas com QDot foram detectadas especificamente sobre tecido utilizando contraste multimodal e fornecimento em campo pseudobrilhante digital para visualização de localizações de sondas no contexto da estrutura anatômica do tecido. Em exemplos típicos, uma imagem de contraste por refração de campo escuro, uma imagem contracorada obtida com um corante nuclear fluorescente e uma ou mais sondas com imagens formadas utlizando detecção QDot fluorescente são combinadas. Estes e outros exemplos são descritos abaixo.S 14 based on other types of radiation, including other wavelength bands and charged particle beams or acoustic beams. In some examples, these methods and devices have been applied to fluorescence in situ hybridization (FISH), immunohistochemistry (IHC) and MRNA in situ hybridization (MRNA-ISH) applications in paraffin embedded tissues fixed with formalin. Quantum dot-labeled FISH probes (QDot), QDot-labeled IHC probes and QDot-labeled mRNA-ISH probes were specifically detected on tissue using multimodal contrast and digital pseudo-bright field delivery for viewing probe locations in the context of the anatomical structure of the fabric. In typical examples, a contrast image by dark field refraction, a counterstained image obtained with a fluorescent nuclear dye and one or more probes with formed images using fluorescent QDot detection are combined. These and other examples are described below.

SISTEMAS DE FORMAÇÃO DE IMAGENS REPRESENTATIVOS Um exemplo representativo de um sistema de formação de imagens apropriado 100 é ilustrado na Fig. 1. Uma fonte de luz de estímulo de fluorescência 102 é posicionada para fornecer um feixe de estímulo 103 ao longo de um eixo 105 para um divisor de feixe dependente de comprimento de onda (dicroico) 104. A fonte de luz 102 é tipicamente um diodo emissor de luz (LED); haleto metálico ou outra lâmpada de arco, mas podem ser utilizadas outras fontes de luz coerentes ou incoerentes, tais como laser. Conforme exibido na Fig. 1, a dicroica 104 reflete o feixe de estímulo 103 para uma lente — objetiva 106 que, por sua vez, dirige o feixe de estímulo 103 para uma amostraREPRESENTATIVE IMAGING SYSTEMS A representative example of an appropriate imaging system 100 is illustrated in Fig. 1. A fluorescence stimulus light source 102 is positioned to provide a stimulus beam 103 along an axis 105 to a wavelength dependent beam splitter (dichroic) 104. Light source 102 is typically a light emitting diode (LED); metal halide or other arc lamp, but other coherent or incoherent light sources, such as laser, can be used. As shown in Fig. 1, dichroic 104 reflects the stimulus beam 103 to a lens - objective 106 which, in turn, directs the stimulus beam 103 to a sample

108. Em exemplos típicos, a amostra 108 é marcada seletivamente com um ou mais fluoroforos que produzem fluorescência em resposta ao feixe de estímulo108. In typical examples, sample 108 is selectively labeled with one or more fluorophores that produce fluorescence in response to the stimulus beam

103. Uma parte da fluorescência é recolhida pela lente objetiva 106 e dirigida103. A portion of the fluorescence is collected by the objective lens 106 and directed

Á 15 ao longo de um eixo 113 através da dicroica 104 para um divisor de feixes opcional 110. O divisor de feixes 110 dirige uma parte da fluorescência para uma câmera 112, de tal forma que uma imagem da amostra possa ser gravada, observada ou analisada em um sistema de computador 130. Uma outra parte da fluorescência é dirigida a uma ocular 114 para observação direta da amostra 108 com base na luz fluorescente.Á 15 along an axis 113 through dichroic 104 to an optional beam splitter 110. The beam splitter 110 directs a portion of the fluorescence to a camera 112, such that an image of the sample can be recorded, observed or analyzed in a computer system 130. Another part of the fluorescence is directed to an eyepiece 114 for direct observation of the sample 108 based on the fluorescent light.

Além disso, um impulsionador 132 ou outro modulador de feixe pode ser fornecido para evitar substancialmente que o feixe de estímulo 103 atinja a amostra 108 ou a fonte de fluorescência pode ser controlada (por meio do sistema computadorizado 130 ou manualmente), de tal forma que nenhum feixe de estímulo seja produzido.In addition, a booster 132 or other beam modulator can be provided to substantially prevent the stimulus beam 103 from reaching sample 108 or the fluorescence source can be controlled (via computer system 130 or manually) in such a way that no stimulus beam is produced.

Comprimentos de onda de luz utilizados para o feixe de estímulo podem ser selecionados conforme conveniente.Light wavelengths used for the stimulus beam can be selected as appropriate.

Tipicamente, o feixe de estímulo inclui principalmente radiação | ótica em comprimentos de onda ou em uma faixa de comprimentos de onda que seja apropriada para gerar luz fluorescente em tinturas fluorescentes ou —fluoroforos associados a quaisquer marcadores seletivos aplicados à amostra. | Faixas de comprimentos de onda típicas para o feixe de estímulos são de cerca de 300 a 550 nm, mas podem ser utilizados comprimentos de onda mais curtos ou mais longos.Typically, the stimulus beam mainly includes radiation | wavelength optics or a range of wavelengths that is appropriate for generating fluorescent light in fluorescent dyes or —fluorophores associated with any selective markers applied to the sample. | Typical wavelength ranges for the stimulus beam are about 300 to 550 nm, but shorter or longer wavelengths can be used.

Além do sistema de formação de imagens por fluorescência, é fornecido um sistema de formação de imagens de contraste por refração utilizando iluminação de campo escuro obliquo em circunferência.In addition to the fluorescence imaging system, a refractive contrast imaging system using oblique dark field illumination in circumference is provided.

No exemplo ———---- --—- —- -da-Fig 1, a iluminação do campo oblíquo em circunferência 117 é selecionada de tal forma que, na ausência de diferenças de índice de refração ou porções de difusão na amostra, o fluxo de luz não atinge a câmera CCD 112 nem a ocular 114, mas surgem apenas transições de índice de refração.In the example ———---- --—- —- of-Fig 1, the illumination of the oblique field in circumference 117 is selected such that, in the absence of differences in refractive index or diffusion portions in the sample , the light flow does not reach the CCD camera 112 or the eyepiece 114, but only refractive index transitions appear.

Utilizando lentes objetivas com ampliação diferente e a mesma abertura numérica (ângulo de aceitação) ou utilizando uma lente de ampliação secundária, podem ser utilizadas as mesmas otimizações de iluminação para formação de imagens à 16 | por refração em diversas ampliações óticas. Existem diversas estratégias para criar contraste com base na refração ou difusão do campo de iluminação. Essas imagens de contraste de índice de refração são denominadas no | presente como imagens de “campo escuro”. Um sistema condensador de —subestágio 116 é posicionado de forma a fornecer uma iluminação de campo oblíquo 117 à amostra 108 substancialmente no mesmo local iluminado pelo feixe de estímulo 103. O sistema condensador de subestágio 116 pode dirigir Ú uma fonte de luz apropriada tal como um LED, lâmpada de halogênio e tungstênio, lâmpada em arco ou outra fonte de luz e uma ou mais lentes, espelhos, filtros, elementos polarizadores, placas de fases, prismas, anéis ou aberturas que podem produzir um feixe apropriado. No exemplo da Fig. 1, a iluminação de campo oblíquo 117 é produzida por um anel cuidadosamente dimensionado, mas, em outros exemplos, podem ser fornecidas diferentes abordagens de iluminação de campo ou varrimento de ponto, varrimento de linha, iluminação de extremidades ou outras estratégias projetadas para produzir contraste de refração. No exemplo da Fig. 1, é fornecida a chamada iluminação de “campo escuro” na qual apenas partes da iluminação de campo que são difundidas ou redirecionadas pela amostra 108 são recolhidas pela abertura numérica da lente objetiva 106 e atingem a câmera 112 ou a ocularUsing objective lenses with different magnification and the same numerical aperture (acceptance angle) or using a secondary magnification lens, the same lighting optimizations can be used for image formation at 16 | by refraction in several optical magnifications. There are several strategies for creating contrast based on the refraction or diffusion of the lighting field. These refractive index contrast images are named in | present as “dark field” images. A sub-stage 116 condenser system is positioned to provide oblique field illumination 117 to the sample 108 in substantially the same location illuminated by stimulus beam 103. The sub-stage condenser system 116 can direct an appropriate light source such as a LED, halogen and tungsten lamp, arc lamp or other light source and one or more lenses, mirrors, filters, polarizing elements, phase plates, prisms, rings or openings that can produce an appropriate beam. In the example in Fig. 1, oblique field lighting 117 is produced by a carefully dimensioned ring, but in other examples, different approaches to field lighting or spot sweeping, line sweeping, edge lighting or other can be provided strategies designed to produce refractive contrast. In the example in Fig. 1, the so-called “dark field” lighting is provided in which only parts of the field lighting that are diffused or redirected by the sample 108 are collected by the numerical aperture of the objective lens 106 and reach the camera 112 or the eyepiece

114.A câmera 112 e a ocular 114 são posicionadas de maneira a formar uma imagem da amostra 108 com base nas partes redirigidas da luz transmitida. -.-.- — Tipicamente, o sistema de iluminação transmitida 117 pode ser impulsionado ou sua fonte de luz desativada conforme o desejado, de tal forma que imagens com base em fluorescência possam ser obtidas ou observadas —independentemente da iluminação transmitida. O exemplo de sistema de microscópio 130 da Fig. 1 permite, portanto, registro de amostras de imagens e a observação de uma amostra com base em fluorescência, contraste de refração de campo escuro ou ambos, seja simultânea ou sequencialmente.114.The camera 112 and the eyepiece 114 are positioned to form an image of the sample 108 based on the redirected parts of the transmitted light. -.-.- - Typically, the transmitted lighting system 117 can be boosted or its light source deactivated as desired, such that fluorescence-based images can be obtained or observed — regardless of the transmitted lighting. The example of microscope system 130 in Fig. 1 therefore allows recording of image samples and observation of a sample based on fluorescence, darkfield refraction contrast, or both, simultaneously or sequentially.

á 117á 117

Utilizando iluminação oblíqua em circunferência transmitida tal como ilustrado na Fig. 1, pode-se produzir contraste com base em interfaces e transições entre partes de amostra que possuem índices de refração diferentes.Using oblique illumination in transmitted circumference as illustrated in Fig. 1, contrast can be produced based on interfaces and transitions between sample parts that have different refractive indices.

Tipicamente, o sistema condensador 116 inclui um anel 118 com tamanho apropriado (e pode ser adicionado a um condensador convencional) no trajeto de luz transmitida de um microscópio composto equipado com uma fonte de luz transmitida.Typically, condenser system 116 includes an appropriately sized ring 118 (and can be added to a conventional condenser) in the transmitted light path of a composite microscope equipped with a transmitted light source.

Desta forma, estruturas que refratam e difundem a luz possuem contraste apreciável de imagens sem o uso de um corante de coloração absorvente de luz.In this way, structures that refract and diffuse light have appreciable contrast of images without the use of a light-absorbing dye.

O comprimento de onda de iluminação transmitido pode ter seu espectro filtrado, por exemplo, com um filtro próximo de IR ou outros filtros ou combinações de filtros, de tal forma que imagens de espectro de sondas fluorescentes possam ser obtidas com contraste transmitido recolhido em comprimento de onda mais longo na mesma obtenção de dados com as duas fontes de iluminação simultaneamente ativas.The transmitted wavelength of light can be filtered, for example, with a filter close to IR or other filters or filter combinations, such that spectrum images from fluorescent probes can be obtained with transmitted contrast collected at wavelengths. longer wave in the same data acquisition with the two light sources simultaneously active.

A iluminação do campo de refração é geralmente selecionada para fornecer uma imagem visual apropriada para registro e encontra-se na faixa de comprimentos de onda de cerca de 400 nm a 900 nm, mas podem ser utilizadas diferentes regiões do espectro dentro dessa faixa, se desejado.The refraction field illumination is generally selected to provide a visual image suitable for recording and is in the wavelength range of about 400 nm to 900 nm, but different regions of the spectrum within that range can be used, if desired .

Nos outros exemplos, utiliza-se iluminação de campo escuro refletido na qual a iluminação oblíqua e a lente objetiva estão situadas no mesmo lado da amostra.In the other examples, reflected dark field lighting is used in which the oblique lighting and the objective lens are located on the same side of the sample.

A imagem de campo escuro da amostra pode ser obtida por si 7 A própria por meio de fluorescência de segmentação com um ou mais filtros, impulsionando, modulando temporalmente ou bloqueando de outra forma o feixe de estímulo.The dark-field image of the sample can be obtained by you 7 Herself through segmentation fluorescence with one or more filters, boosting, temporally modulating or otherwise blocking the stimulus beam.

Em alguns exemplos, a imagem com base em fluorescência — pode ser obtida com um filtro apropriado sintonizado no comprimento de onda de fluorescência e o contraste de refração filtrado até uma faixa de comprimentos de onda diferente; essas faixas de comprimentos de onda diferentes podem ser separadas para sensores diferentes, dirigidos a diferentesIn some examples, the fluorescence-based image - can be obtained with an appropriate filter tuned to the fluorescence wavelength and the refraction contrast filtered to a different wavelength range; these bands of different wavelengths can be separated for different sensors, aimed at different

' 18 partes do mesmo sensor ou gravadas sequencialmente.'18 parts of the same sensor or recorded sequentially.

A contribuição indesejada de iluminação de campo escuro para a(s) imagem(ns) de fluorescência ou vice-versa pode ser reduzida por meio de filtragem do espectro, mas é possível impulsionar o campo de iluminação de campo escuro ouo trajeto de luz fluorescente.The unwanted contribution of dark field illumination to the fluorescence image (s) or vice versa can be reduced by filtering the spectrum, but it is possible to boost the dark field illumination field or the fluorescent light path.

Além disso, as imagens de fluorescência e campo escuro podem ser observadas separada ou simultaneamente.In addition, fluorescence and darkfield images can be viewed separately or simultaneously.

A câmera 112 é tipicamente um dispositivo acoplado de carga (Charge Couple Device - CCD) monocromática ou câmera semicondutora de óxido metálico complementar (CMOS), embora possam ser utilizados outros sensores de imagens tais como CCD de multiplicação de elétrons (Electron Multiplying Charge Couple Device - EMCCD) e sensores CCD intensificados (Intensified Charge Couple Device - ICCD). Filtros de comprimento de onda, elementos de dispersão, placas de fase, prismas, elementos de polarização, cristais óticos sintonizáveis e outros métodos óticos e eletro-óticos podem ser utilizados para modificar a radiação ótica que atinge o CCD e/ou a ocular, de forma a produzir uma ou mais imagens monocromáticas correspondentes nas faixas de comprimentos de onda selecionadas.Camera 112 is typically a monochromatic Charge Couple Device (CCD) or complementary metal oxide semiconductor (CMOS) camera, although other image sensors such as Electron Multiplying Charge Couple Device can be used - EMCCD) and intensified CCD sensors (Intensified Charge Couple Device - ICCD). Wavelength filters, dispersion elements, phase plates, prisms, polarization elements, tunable optical crystals and other optical and electro-optical methods can be used to modify the optical radiation that reaches the CCD and / or the to produce one or more corresponding monochrome images in the selected wavelength ranges.

Em alguns casos, fluorescência que atinge a câmera 112 pode ser resolvida em espectro em uma série de cestos de comprimentos de onda e uma série correspondente de imagens de fluorescência obtidas para análise.In some cases, fluorescence reaching the camera 112 can be resolved in spectrum in a series of wavelength baskets and a corresponding series of fluorescence images obtained for analysis.

Pode-se realizar análise de espectro com uma série de filtros de absorção ou reflexão, um prisma ou uma grade de Lud IADAI difração que são inseridos no trajeto da fluorescência.Spectrum analysis can be performed with a series of absorption or reflection filters, a prism or a Lud IADAI diffraction grid that are inserted in the fluorescence path.

Geralmente, a resolução de espectro pode ser atingida utilizando sistemas óticos interferométricos, de | dispersão ou absorção sob o controle do sistema computadorizado 130 ou | inserida manualmente.Generally, spectrum resolution can be achieved using optical interferometric systems, | dispersion or absorption under the control of the computerized system 130 or | entered manually.

Embora imagens possam ser gravadas na forma de um, | dois ou três conjuntos dimensionais de elementos de quadros com valores | associados a uma intensidade de fluxo de luz recebida (por meio de fluorescência ou outros modos de iluminação contrastante), as imagens podemAlthough images can be recorded as one, | two or three dimensional sets of frame elements with values | associated with an intensity of light flow received (through fluorescence or other contrasting lighting modes), images can

' 19 ser gravadas em outros formatos e estruturas de dados complexos, se desejado. Para conveniência do presente relatório descritivo, uma imagem refere-se a um mapeamento bidimensional de dados em um conjunto estruturado conforme observado pelos médicos através de microscópio ou outros aparelhos de observação e uma imagem gravada designa valores de dados armazenados, processados e/ou exibidos com base em uma imagem recebida por CCD ou outro sensor de imagens.'19 be recorded in other complex data structures and formats, if desired. For the convenience of this specification, an image refers to a two-dimensional mapping of data in a structured set as observed by doctors through a microscope or other observation apparatus and a recorded image designates data values stored, processed and / or displayed with based on an image received by CCD or another image sensor.

Conforme indicado acima, diversas imagens de espectro podem ser obtidas com base em fluorescência e iluminação transmitida, ou ambas. As informações espectroscópicas em cada pixel de uma imagem podem ser reunidas e os dados resultantes analisados com software de processamento de imagens de espectro. Podem ser derivadas diversas imagens que representam intensidades em diferentes comprimentos de onda que são selecionáveis de forma eletrônica e contínua e avaliadas em seguida com um programa de análise projetado para manipulação desses dados. Em alguns exemplos, informações quantitativas de diversos sinais fluorescentes e/ou modalidades de contraste ótico podem ser avaliadas simultaneamente. O sensor de imagens 112 é acoplado ao sistema computadorizado 130 que inclui um teclado 152, uma unidade de processamento 154 e um visor 156. Em alguns exemplos, são fornecidos um ou mais dispositivos de entrada de usuário adicionais tais como joysticks, Saias “mouses ou tablets de digitalização e um ou mais dispositivos de saída adicionais tais como impressoras ou visores. A unidade de processamento 154 inclui tipicamente um microprocessador e um ou mais meios de armazenagem legíveis por computador tais como memória somente de leitura (ROM), memória de acesso aleatório (RAM), disco rígido, disco flexível, disco compacto ou disco de vídeo digital para armazenagem de dados de imagens e instruções executáveis por computador para registro, transmissão, análise eAs indicated above, several spectrum images can be obtained based on fluorescence and transmitted illumination, or both. The spectroscopic information in each pixel of an image can be gathered and the resulting data analyzed with spectrum image processing software. Several images can be derived that represent intensities at different wavelengths that are selectable electronically and continuously and then evaluated with an analysis program designed to manipulate this data. In some instances, quantitative information on various fluorescent signals and / or optical contrast modes can be evaluated simultaneously. The image sensor 112 is coupled to the computer system 130 which includes a keyboard 152, a processing unit 154 and a display 156. In some examples, one or more additional user input devices such as joysticks, mouse skirts or scanning tablets and one or more additional output devices such as printers or displays. Processing unit 154 typically includes a microprocessor and one or more computer-readable storage media such as read-only memory (ROM), random access memory (RAM), hard disk, floppy disk, compact disk or digital video disk for storing image data and instructions executable by computer for recording, transmission, analysis and

É 20 processamento de imagens ou dados de imagens.It is 20 image processing or image data.

Em exemplos típicos, o sistema de computador 100 é acoplado a um ou mais sistemas de computador diferentes por meio de conexão de rede com ou sem fios e, em alguns exemplos, é acoplado à Internet.In typical examples, computer system 100 is coupled to one or more different computer systems via a wired or wireless network connection and, in some examples, it is coupled to the Internet.

Embora operações de processamento de imagens possam ser conduzidas em um único sistema de computador, em alguns exemplos, imagens ou dados de imagens são processados em uma série de sistemas de computador que podem estar situados em um local " comum ou distribuídos em uma rede.Although image processing operations can be conducted on a single computer system, in some instances, images or image data are processed on a series of computer systems that can be located in a common "location or distributed over a network.

Embora computadores laptop possam ser | convenientes, podem ser utilizados outros dispositivos de computação tais como computadores desktop, estações de trabalho, computadores manuais, | computadores netbook ou outros dispositivos de captura e processamento de | imagens.Although laptop computers can be | other computing devices such as desktop computers, workstations, handheld computers, | netbook computers or other capture and processing devices | images.

Em alguns exemplos, dados de imagens podem ser processados, | podem ser fornecidas avaliações de amostras sem um visor e as avaliações | são comunicadas por meio da conexão de rede (tal como por correio | 15 eletrônico), enviadas para uma impressora ou fornecidas na forma de mensagem de texto ou multimídia utilizando uma rede de telefonia celular.In some examples, image data may be processed, | sample evaluations can be provided without a display and the evaluations | they are communicated via the network connection (such as by electronic mail | 15), sent to a printer, or delivered in the form of a text or multimedia message using a cellular telephone network.

O sistema de formação de imagens 100 é um exemplo de sistema de formação de imagens apropriado.The imaging system 100 is an example of an appropriate imaging system.

Em outros exemplos, um objetivo de reflexão ou catadióptrico pode ser utilizado no lugar da lente objetiva 106, pode-se utilizar um filtro de passagem curto no lugar do filtro de passagem longo 104 por meio de redisposição da fonte de estímulo de fluorescência 102, V -— ---- da-câmera 112 e da ocular 114. Em alguns exemplos, apenas uma câmera ou uma ocular é fornecida para registro de imagens ou observação de imagens.In other examples, a reflection or catadioptric objective can be used in place of objective lens 106, a short pass filter can be used in place of long pass filter 104 by means of redisposition of the source of fluorescence stimulus 102, V -— ---- for camera 112 and eyepiece 114. In some instances, only a camera or eyepiece is provided for image recording or image observation.

Espelhos ou prismas adicionais podem ser utilizados para dobrar os eixos óticos conforme venha a ser conveniente.Additional mirrors or prisms can be used to bend the optical axes as appropriate.

Podem ser empregadas diferentes estratégias de contraste multimodal utilizando máscaras de fase, contraste de fases, contraste de Rotterman, contraste de iluminação oblíqua, contraste de Rheinberg, esquemas de contraste de interferência, ótica adaptativa,Different multimodal contrast strategies can be employed using phase masks, phase contrast, Rotterman contrast, oblique lighting contrast, Rheinberg contrast, interference contrast schemes, adaptive optics,

Ô 21 varrimento a laser, formação de imagens vitalícia em domínio de tempo ou de frequência, iluminação estruturada, sondas fotocomutáveis, polarização e anisotropia, formação de imagens de segundo harmônico, excitação de dois fótons e outras estratégias.Ô 21 laser scanning, lifelong image formation in time or frequency domain, structured lighting, photocomutable probes, polarization and anisotropy, formation of second harmonic images, two photon excitation and other strategies.

Hardware de posicionamento de amostras não é exibido por conveniência de ilustração e, em muitos exemplos, pode-se fornecer observação binocular com duas oculares e filtros e divisores de feixe apropriados, de tal forma que diferentes saídas de imagem recebam um fluxo de luz de imagens associado a apenas uma das diversas modalidades de contraste, estados de polarização ou amplitudes de banda de comprimento de onda Podem ser fornecidos filtros adicionais (de reflexão ou absorção), tipicamente para reduzir a magnitude de qualquer luz de estímulo que atinja a câmera 112 ou a ocular 114, ou para controlar a intensidade de luz relativa ou o teor de espectro para observação ou registro.Sample positioning hardware is not displayed for the sake of illustration and, in many instances, binocular observation can be provided with two eyepieces and appropriate beam filters and splitters, in such a way that different image outputs receive an image light stream associated with just one of several contrast modes, polarization states or wavelength band amplitudes Additional filters (reflection or absorption) can be provided, typically to reduce the magnitude of any stimulus light reaching the camera 112 or the eyepiece 114, or to control the relative light intensity or spectrum content for observation or recording.

Um outro sistema de formação de imagens representativo é ilustrado na Fig. 11. Conforme exibido na Fig. 11, um fluxo de luz de imagem combinado 1102 que inclui um fluxo modulado por refração 1102A e um fluxo modulado por fluorescência DAPI (Diagnóstico Avançado Por Imagem) 1102B correspondentes a imagens de campo escuro e DAPI é dirigido ao longo de um eixo 1103 através de uma abertura 1104 até uma lente de colimação 1105. O fluxo de luz combinado colimado é incidente sobre um espelho dicroico 1106 que reflete uma parte do fluxo de luz modulado (o fluxo modulado DAPI 1102A “— -—--— no exemplo da Fig. 11) para espelhos 1108A e para um filtro 1107A que transmite preferencialmente fluorescência de DAPI.Another representative imaging system is illustrated in Fig. 11. As shown in Fig. 11, a combined image light stream 1102 that includes a refraction modulated flow 1102A and a fluorescence modulated flow DAPI (Advanced Imaging Diagnosis) ) 1102B corresponding to dark field images and DAPI is directed along an axis 1103 through an aperture 1104 to a collimation lens 1105. The combined collimated light stream is incident on a dichroic mirror 1106 that reflects a part of the flow of modulated light (the flow modulated DAPI 1102A “- -—--— in the example of Fig. 11) for mirrors 1108A and for a filter 1107A that preferably transmits DAPI fluorescence.

Uma lente 1110 recebe o fluxo modulado de DAPI e forma uma amostra de imagem sobre uma primeira — parte 1112A de um CCD ou outro sensor de imagem 1112. O espelho dicroico 1106 transmite o feixe modulado por refração de comprimento de onda mais longo 1102B para um filtro 1107B selecionado para rejeitar a fluorescência de DAP! e o feixe de estímulo de DAPI associado.A 1110 lens receives the modulated flow of DAPI and forms an image sample over a first - part 1112A of a CCD or other 1112 image sensor. The dichroic mirror 1106 transmits the beam modulated by longer wavelength refraction 1102B to a filter 1107B selected to reject DAP fluorescence! and the associated DAPI stimulus bundle.

Um espelho 1108B dirige oA 1108B mirror directs the

À 22 fluxo modulado 1102B para a lente 1110 que forma uma imagem de campo escuro sobre uma parte 1112B do CCD 1112. O CCD 1112 é acoplado a um computador ou outro dispositivo de processamento que pode armazenar dados de imagens do CCD 1112 em memória e fornecer dados de imagens para um monitor 1118 ou outro visor. Com esse sistema de formação de imagens, imagens de campo escuro e de fluorescência podem ser obtidas simultaneamente e exibidas lado a lado na forma de imagem bruta ou divididas rapidamente em duas imagens, ter a cor mapeada e ser sobrepostas quase em tempo real no monitor 1118. A configuração da Fig. 11 é apenas ilustrativa e os fluxos de amostra de luz de fluorescência e refração modulada podem ser separados e utilizados na formação de imagens em outras disposições, utilizando mais e menos componentes, bem como componentes diferentes. As imagens podem estar lado a lado sobre o CCD 1112 ou ser processadas pelo computador 1114, de tal forma que uma sobreposição de duas cores combinadas em contexto fornecido em campo brilhante possa ser exibida no monitor 1118. Conforme exibido na Fig. 11, diversos fluxos (campo escuro e DAPI) são desviados de um eixo ótico inicial, mas, em outros exemplos, um fluxo pode ser transmitido ao longo do eixo inicial e o CCD 1112 pode ser posicionado de acordo. As imagens de campo escuro e DAPI podem ser produzidas com lentes diferentes que podem ser dispostas para produzir uma ampliação comum ou ampliações diferentes. Podem ser fornecidos filtros, — fontes de luz e outros componentes adicionais, de tal forma que sejam fornecidos marca de detecção molecular e outros fluxos de luz de imagem de contraste de tecidos, que têm sua imagem formada em um ou mais CCDs ou —partesdeum CCD isolado 1112A, 1112B.At 22 modulated flow 1102B to lens 1110 that forms a dark field image over a 1112B part of CCD 1112. CCD 1112 is coupled to a computer or other processing device that can store CCD 1112 image data in memory and provide image data to an 1118 monitor or other viewfinder. With this imaging system, darkfield and fluorescence images can be obtained simultaneously and displayed side by side in the form of a raw image or quickly divided into two images, have the color mapped and be superimposed almost in real time on the monitor 1118 The configuration in Fig. 11 is only illustrative and the sample streams of fluorescence light and modulated refraction can be separated and used for imaging in other arrangements, using more and less components, as well as different components. The images can be placed side by side on the CCD 1112 or be processed by the computer 1114, in such a way that an overlay of two colors combined in context provided in bright field can be displayed on monitor 1118. As shown in Fig. 11, several streams (dark field and DAPI) are deviated from an initial optical axis, but, in other examples, a flow can be transmitted along the initial axis and CCD 1112 can be positioned accordingly. Darkfield and DAPI images can be produced with different lenses that can be arranged to produce a common magnification or different magnifications. Filters, - light sources and other additional components, can be provided in such a way that molecular detection marks and other tissue contrast image light streams are provided, which have their image formed on one or more CCDs or —parts of a CCD isolated 1112A, 1112B.

TABELAS DE CONSULTA DE CORES E INVERSÃO DE IMAGENS O sistema da Fig. 1 permite a observação com múltiplas modalidades e a obtenção de imagens com base na fluorescência ouCOLOR CONSULTATION TABLES AND IMAGE INVERSION The system in Fig. 1 allows observation with multiple modalities and obtaining images based on fluorescence or

% 23 iluminação de campo escuro, ou ambas simultaneamente. As imagens obtidas podem ser manipuladas para apresentar características de amostras em um contexto comum utilizando um método representativo ilustrado na Fig. 2. Em uma etapa 202, é registrada uma imagem de refração de campo escuro, tipicamente na forma de imagem monocromática, e, na etapa 204, são registradas uma ou mais imagens com base em fluorescência. A quantidade : dessas imagens com base em fluorescência pode depender dos números e tipos de marcadores fluorescentes ou tinturas que são aplicados à amostra. Estas imagens podem utilizar diferentes faixas de comprimento de onda correspondentes a comprimentos de onda de emissão dos marcadores fluorescentes. Em alguns exemplos, as diferentes faixas de comprimento de onda podem ser sobrepostas, não sobrepostas ou uma de suas combinações. Na etapa 204, a uma ou mais imagens com base em fluorescência podem ser obtidas em correspondência com a fluorescência de fluoroforos correspondentes. Segmentação de espectro apropriada da luz fluorescente pode ser utilizada para obter diversas imagens com base em fluorescência que podem revelar diferentes características de amostra, tipicamente dependentes da sonda específica associada ao marcador de detecção fluorescente.% 23 dark field lighting, or both simultaneously. The images obtained can be manipulated to present sample characteristics in a common context using a representative method illustrated in Fig. 2. In a step 202, a dark field refraction image is recorded, typically in the form of a monochrome image, and, in the step 204, one or more images based on fluorescence are recorded. The quantity: of these fluorescence-based images may depend on the numbers and types of fluorescent markers or dyes that are applied to the sample. These images can use different wavelength bands corresponding to the emission wavelengths of the fluorescent markers. In some examples, different wavelength ranges can be overlapping, not overlapping, or one of their combinations. In step 204, one or more images based on fluorescence can be obtained in correspondence with the corresponding fluorescence fluorophores. Appropriate spectrum segmentation of fluorescent light can be used to obtain various fluorescence-based images that can reveal different sample characteristics, typically dependent on the specific probe associated with the fluorescent detection marker.

Mediante obtenção das imagens (seja à medida que cada uma é — .. Obtidaou após todas ou algumas haverem sido obtidas), pode-se aplicar uma ou mais tabelas de referência (LookUp Tables - LUTs) de mapas coloridos aos valores de intensidade de imagens monocromáticas em uma etapa 206 para produzir imagens fornecidas pseudocoloridas e essas imagens fornecidas —podem ser sobrepostas em uma etapa 208. Uma ou mais ou todas dentre a matiz, intensidade ou saturação da imagem sobreposta obtida é invertida em uma etapa 210 para produzir uma imagem que possui a aparência de estrutura colorida sobre um campo brilhante. Em uma aplicação típica de LUT bes deh 24 pseudocolorida, pixels de imagens monocromáticas recebem valores de intensidade de coloração de RGB atribuídos com base em valores de intensidade de pixels em escala de cinza e vice-versa. Essas inversões podem também inverter as coordenadas de coloração para produzir mapeamentos de — coloração complementares. A inversão de imagens geralmente mapeia valores de grande intensidade de pixels em valores de intensidade de pixel menores. - Em uma imagem na qual as intensidades de pixel são representadas com valores de intensidade 8 (profundidade de três bits), por exemplo, os valores de intensidade podem ser novamente mapeados conforme exibido na Tabela 1. TABELA 1By obtaining the images (either as each one is - .. Obtained or after all or some have been obtained), one or more reference tables (LookUp Tables - LUTs) of colored maps can be applied to the image intensity values monochrome in one step 206 to produce pseudo-colored images provided and those images provided —can be superimposed in step 208. One or more or all of the hue, intensity or saturation of the overlapping image obtained is inverted in step 210 to produce an image that it has the appearance of a colored structure on a bright field. In a typical application of LUT bes deh 24 pseudo-color, monochrome image pixels receive RGB color intensity values assigned based on gray scale pixel intensity values and vice versa. These inversions can also invert the color coordinates to produce complementary color mappings. Image inversion usually maps high pixel intensity values to smaller pixel intensity values. - In an image in which pixel intensities are represented with intensity values 8 (depth of three bits), for example, the intensity values can be re-mapped as shown in Table 1. TABLE 1

INVERSÃO DE IMAGENS COM VALORES DE TRÊS BITS [originar — | Remapeado | e | Pe 8 2 | e à | Esse esquema de mapeamento pode ser estendido para outras profundidades de bits (tais como oito bits, dez bits, doze bits, dezesseis bits e outras) e pode ser aplicado a diferentes componentes (tais como matiz, saturação, valor) de um dado espaço de coloração. Na etapa 210, valores de imagem que pareceriam escuros são invertidos de forma a parecem claros e valores de imagem que pareceriam claros são invertidos de forma a parecerem escuros. A etapa 210 pode ser rr e NM E | indicada como produtora de uma imagem de campo pseudobrilhante.INVERSION OF IMAGES WITH VALUES OF THREE BITS [original - | Remapped | and | Pe 8 2 | and to | This mapping scheme can be extended to other depths of bits (such as eight bits, ten bits, twelve bits, sixteen bits and others) and can be applied to different components (such as hue, saturation, value) of a given space. coloring. In step 210, image values that would appear dark are inverted in order to appear light and image values that would appear light are inverted in order to appear dark. Step 210 can be rr and NM E | indicated as producing a pseudo-bright field image.

A ordem das inversões de imagens e LUTs pseudocoloridas pode ser variada conforme o necessário. LUTs de coloração específica podem ser | selecionadas de tal forma que, por exemplo, surja uma imagem de campo escuro com contraste de coloração similar a corantes histológicos. Nesta estratégia, os modos de imagem são selecionados cuidadosamente para | revelar as mesmas estruturas para uma imagem produzida com um procedimento de corantes convencionais tal como corantes H&E convencionais. As imagens podem ser sobrepostas em uma etapa 208 com ou sem mapeamento de coloração para componentes de contraste ou inversão para aparência de campo brilhante. Imagens mapeadas com coloração adicional com contraste entre estruturas diferentes podem ser aplicadas à imagem combinada (tipicamente sobreposta com a imagem combinada) em uma etapa 212. A imagem combinada e processada pode ser armazenada e/ou exibida em uma etapa 214. Uma ou mais dessas etapas podem ser omitidas, duplicadas ou realizadas em outra ordem, se mais conveniente.The order of image inversions and pseudo-colored LUTs can be varied as needed. Specifically colored LUTs can be | selected in such a way that, for example, a dark field image with a color contrast similar to histological dyes appears. In this strategy, image modes are selected carefully to | developing the same structures for an image produced with a conventional dyeing procedure such as conventional H&E dyes. Images can be superimposed in one step 208 with or without color mapping for contrast or inversion components for a bright field appearance. Images mapped with additional coloring with contrast between different structures can be applied to the combined image (typically overlaid with the combined image) in step 212. The combined and processed image can be stored and / or displayed in step 214. One or more of these steps can be omitted, duplicated or performed in another order, if more convenient.

Em muitos exemplos práticos, pode ser vantajoso simular a coloração de estruturas de tecidos específicas produzidas com corantes histológicos convencionais em imagens de contraste com múltiplos modos.In many practical examples, it may be advantageous to simulate the staining of specific tissue structures produced with conventional histological dyes in multi-mode contrast images.

Essa simulação fornece uma configuração de diagnóstico e analítica familiar Tot ------ para médicos, permitindo ainda ao mesmo tempo correlação com marcadores específicos adicionais para revelar informações adicionais. Esta simulação também permite a eliminação de corantes de absorção de luz, de tal forma que os corantes não interfiram com a aplicação de outros marcadores nem com a avaliação de características de imagens reveladas por esses marcadores. Pode-se utilizar contraste de refração, por exemplo, para revelar proteínas de membrana e extracelulares, enquanto uma tintura fluorescente específica de núcleo tal como DAPI pode ser utilizada para revelar detalhes da distribuição ee 26 | de cromatina nuclear. Desta forma, pode-se utilizar a combinação de refração e DAPI, com processamento de imagens apropriado, para revelar características de amostra de forma análoga àquela atingida com eosina (eosinofílico ou específico de proteina) e hematoxilina (específico de DNA ou ácido nucleico).This simulation provides a familiar Tot ------ diagnostic and analytical setup for doctors, while also allowing correlation with additional specific markers to reveal additional information. This simulation also allows the elimination of light-absorbing dyes, in such a way that the dyes do not interfere with the application of other markers or with the evaluation of image characteristics revealed by these markers. Refractive contrast can be used, for example, to reveal membrane and extracellular proteins, while a core specific fluorescent dye such as DAPI can be used to reveal details of the ee | of nuclear chromatin. In this way, the combination of refraction and DAPI can be used, with appropriate image processing, to reveal sample characteristics in a manner analogous to that achieved with eosin (eosinophilic or protein specific) and hematoxylin (specific for DNA or nucleic acid).

Como estas imagens são obtidas sobre a mesma amostra, as características de cada uma podem ser registradas no espaço e incluídas em uma imagem exibida para análise conveniente. Podem ser utilizados mapeamentos de coloração otimizados que permitem imagens exibidas conforme preferido pelos médicos para melhor revelar características de interesse no contexto de experiência e treinamento médico. Esses mapeamentos de coloração podem ser descritos convenientemente com referência a um espaço de coloração CIE 1976 L*a*b* e podem também ser utilizados outros espaços de coloração tais como espaço de coloração Hunter 1948 L,a,b, um espaço de coloração CIE 1931 XYZ, CIE 1976 L*u*v*, cor HSV, HSI, HSV, HSB ou valores de coloração RGB ou coloração CMYK, ou escalas de coloração PANTONE ou MUNSELL.As these images are obtained over the same sample, the characteristics of each one can be recorded in space and included in an image displayed for convenient analysis. Optimized staining mappings can be used that allow images displayed as preferred by doctors to better reveal features of interest in the context of medical experience and training. These staining mappings can be conveniently described with reference to a CIE 1976 L * a * b * staining space, and other staining spaces such as Hunter 1948 L, a, b, a CIE staining space can also be used. 1931 XYZ, CIE 1976 L * u * v *, HSV, HSI, HSV, HSB color or RGB or CMYK color values, or PANTONE or MUNSELL color scales.

A Fig. 3 ilustra um método representativo 300 de formação de imagens da amostra que permite o questionamento de características de amostra com base em contraste de índice de refração e fluorescência DAPI. Em uma etapa 302, é registrada uma imagem de mapa de intensidade em escala de cinza de contraste de refração na amostra, tipicamente utilizando . uma câmera CCD monocromática. Em uma etapa 304, é registrada uma imagem de mapa de intensidade de escala de cinza com base em fluorescência DAPI da amostra. Embora sejam utilizados filtros de coloração na obtenção de ambas essas imagens, as imagens são registradas na forma de — valores de intensidade para um conjunto de pixels como imagens em escala de cinza sobre um CCD monocromático. Em uma etapa 306, a imagem de contraste de índice de refração é processada e mapeada para que a coloração possua aparência similar à produzida com absorção de coloração de eosinaFig. 3 illustrates a representative method 300 of imaging the sample that allows questioning of sample characteristics based on contrast of refractive index and DAPI fluorescence. In a step 302, an image of a refractive contrast grayscale intensity map is recorded in the sample, typically using. a monochrome CCD camera. In step 304, a gray scale intensity map image based on the sample's DAPI fluorescence is recorded. Although color filters are used to obtain both of these images, the images are recorded in the form of - intensity values for a set of pixels as grayscale images on a monochrome CCD. In a step 306, the refractive index contrast image is processed and mapped so that the coloration looks similar to that produced with absorption of eosin coloration

' 27 e nm [e e eee eee e e e ee re ee e er DEE sob iluminação transmitida de luz branca.'27 e nm [e e eee eee e e ee re ee e er DEE under transmitted white light illumination.

Corantes de eosina tipicamente produzem contraste de imagem em porções de proteína na matriz extracelular | e em membranas.Eosin dyes typically produce image contrast in portions of protein in the extracellular matrix | and in membranes.

Em alguns exemplos, a etapa 306 pode ser configurada de | tal forma que a imagem processada possua aparência que é baseada em preferências subjetivas do médico para corantes de eosina conforme quantificado e traduzido para espaço de coloração CIE L*a*b*. Esses mapas de . coloração preferidos podem ser baseados em um grupo de médicos ou um médico individual.In some examples, step 306 can be configured from | such that the processed image has an appearance that is based on the physician's subjective preferences for eosin dyes as quantified and translated into CIE L * a * b * staining space. These maps of. Preferred staining can be based on a group of doctors or an individual doctor.

Por conveniência, a imagem resultante da etapa 306 é indicada como imagem convertida.For convenience, the image resulting from step 306 is indicated as a converted image.

Para processamento com base em corantes de eosina, essas imagens podem ser denominadas imagens convertidas com eosina.For processing based on eosin dyes, these images can be called images converted with eosin.

Essas imagens convertidas podem ser imagens exibidas, imagens gravadas ou ambas.These converted images can be displayed images, recorded images, or both.

Em uma etapa 308, a imagem gravada com DAPI é processada para produzir uma imagem associada com aparência que relembra absorção de hematoxilina sob iluminação transmitida com luz branca.In a step 308, the image recorded with DAPI is processed to produce an image associated with an appearance that recalls hematoxylin absorption under transmitted light with white light.

Conforme indicado acima, esta imagem pode ser produzida com base em preferências subjetivas individuais ou de grupos ou coincidentes utilizando medição de coloração de espectro quantitativa e mapeamento no espaço de coloração digital.As indicated above, this image can be produced based on individual or group or coincident subjective preferences using quantitative spectrum color measurement and mapping in the digital color space.

A imagem resultante da etapa 308 pode também ser indicada como imagem convertida ou umaimagem convertida com hematoxilina.The image resulting from step 308 can also be indicated as a converted image or an image converted with hematoxylin.

As imagens convertidas são tipicamente produzidas utilizando um “ou maismapas de coloração ou tabelas de referência especializadas (LUTs). As imagens são geralmente pseudocoloridas e invertidas, de tal forma que a imagem convertida seja uma imagem com cor complementar e saturação, —matiz e/ou valor invertido.The converted images are typically produced using one “or more coloring maps or specialized reference tables (LUTs). The images are generally pseudo-colored and inverted, in such a way that the converted image is an image with complementary color and saturation, - hue and / or inverted value.

Uma imagem combinada é produzida por meio de união das imagens complementares em uma etapa 312, tal como por meio de adição, e é exibida ou analisada de outra forma em uma etapa 314. O método da Fig. 3 é ilustrado com imagens de amostras daA combined image is produced by joining the complementary images in a step 312, such as by means of addition, and is displayed or otherwise analyzed in step 314. The method in Fig. 3 is illustrated with images of samples from the

Í 28 próstata humana exibidas nas Figs. 10A-10E. As Figs. 10A-10B são contraste de refração em escala de cinza e imagens de contraste de fluorescência DAPI, respectivamente. As Figs. 10C-10D são imagens convertidas com hematoxilina e convertidas com eosina com base nas imagens das Figs. 10A-10B, respectivamente. A Fig. 10E é uma imagem combinada obtida por meio de combinação das imagens convertidas das Figs. 10C-10D. A imagem convertida com eosina da Fig. 10C e a imagem convertida com hematoxilina da Fig. 10D são produzidas por meio da aplicação de uma LUT de coloração e inversão de imagem.The human prostate shown in Figs. 10A-10E. Figs. 10A-10B are grayscale refractive contrast and DAPI fluorescence contrast images, respectively. Figs. 10C-10D are images converted with hematoxylin and converted with eosin based on the images in Figs. 10A-10B, respectively. Fig. 10E is a combined image obtained by combining the converted images of Figs. 10C-10D. The image converted with eosin from Fig. 10C and the image converted with hematoxylin from Fig. 10D are produced by applying a LUT for coloring and image inversion.

Espaços de coloração preferenciais para os médicos para tecidos corados com hematoxilina e eosina foram obtidos para coincidir mais de perto com o mapeamento de pseudocores da imagem de refração e contracorante de DAPI para produzir aparência de imagem preferida. Esse mapeamento de coloração é ilustrado na Fig. 9. Com referência à Fig. 9, um espaço de coloração CIE L*a*b* 900 inclui um eixo a* 902, um eixo b* 904 e um eixo L*Preferred staining spaces for clinicians for hematoxylin and eosin stained tissues were obtained to more closely match the pseudo-color mapping of the DAPI refractive and counterstain to produce a preferred image appearance. This color mapping is illustrated in Fig. 9. With reference to Fig. 9, a CIE L * a * b * 900 color space includes an a * 902 axis, a b * 904 axis and an L * axis

906. As coordenadas CIE L*a*b* são representadas como locais sobre uma esfera colorida 910. Tipicamente, são atribuídos arcos coloridos 912, 914 a contraste de índice de refração (análogo a eosina) e contraste de fluorescência DAP! (análogo a hematoxilina), respectivamente. É conveniente selecionar os arcos coloridos 912, 914 para que produzam contraste similar à absorção de luz branca por hematoxilina e eosina em tecido, respectivamente. Pode-se * fornecer mapeamento de coloração atribuindo-se coordenadas a*, b* com base em intensidades medidas (valores L*). O arco de coloração 912 corresponde a um arco longitudinal sobre a esfera de coloração 910 que se encontra em um ângulo de cerca de trinta graus a partir do eixo b. O arco de coloração 914 corresponde a um arco longitudinal sobre a esfera de coloração 910 que se encontra em um ângulo de cerca de sessenta graus a partir do eixo b. Podem também ser utilizados outros arcos. Faixas de coordenadas representativas f 29 que produzem contraste similar a corantes H&E para tipos de tecidos selecionados encontram-se resumidas na Tabela 2 abaixo. TABELA 2 FAIXAS DE COORDENADAS PREFERIDAS CIE L*A*B* PARA TECIDOS SELECIONADOS Lab* citoplasmáticas [Tecido — jramaa [raabr - |ramaa: - Íranab: |906. CIE coordinates L * a * b * are represented as locations on a 910 colored sphere. Typically, colored arcs 912, 914 are assigned to refractive index contrast (analogous to eosin) and DAP fluorescence contrast! (hematoxylin analog), respectively. It is convenient to select the colored arcs 912, 914 so that they produce a contrast similar to the absorption of white light by hematoxylin and eosin in tissue, respectively. You can * provide color mapping by assigning coordinates to *, b * based on measured intensities (L * values). The coloring arch 912 corresponds to a longitudinal arch over the coloring sphere 910 which is at an angle of about thirty degrees from the b-axis. The coloring arch 914 corresponds to a longitudinal arch over the coloring sphere 910 which is at an angle of about sixty degrees from the b-axis. Other bows can also be used. Representative coordinate ranges f 29 that produce contrast similar to H&E dyes for selected tissue types are summarized in Table 2 below. TABLE 2 PREFERRED COORDINATE BANDS CIE L * A * B * FOR SELECTED FABRICS Lab * cytoplasmic [Fabric - jramaa [raabr - | ramaa: - Íranab: |

AMBIENTE DE COMPUTAÇÃO A Fig. 16 e a discussão a seguir fornecem uma breve descrição geral de um ambiente de computação apropriado para o software (tal como programas de computador) configurado para realizar os métodos descritos no presente. Estes métodos podem ser implementados em instruções executáveis por computador organizadas em módulos de programa. Os módulos de programa incluem as rotinas, programas, objetos, componentes e estruturas de dados que realizam as tarefas e implementam os tipos de dados para implementação dos métodos descritos acima. Embora a Fig. 16 exiba uma configuração típica de um computador desktop, a presente invenção pode ser implementada em outras configurações =de sistima de computador, incluindo sistemas a) multiprocessadores, eletrônicos de consumo programáveis ou com base em microprocessador, minicomputadores, computadores mainframe e similares. A presente invenção pode também ser utilizada em ambientes de computação distribuída, nos quais as tarefas são realizadas em paralelo por dispositivos de processamento para aumentar o desempenho. Tarefas relativas às características de medição de possíveis anomalias podem, por exemplo, ser realizadas — simultaneamente em diversos computadores, diversos p 30 processadores em um único computador ou ambos. Em um ambiente de computação distribuída, módulos de programa podem estar localizados em dispositivos de armazenagem de memória locais e remotos. O sistema de computador exibido na Fig. 16 é apropriado para implementação das tecnologias descritas no presente e inclui um computador 1620, com uma unidade de processamento 1621, uma memória de sistema 1622 e um terminal de sistema 1623 que interconecta diversos componentes de sistema, incluindo a memória de sistema 1622, à unidade de processamentoCOMPUTING ENVIRONMENT Fig. 16 and the following discussion provide a brief overview of an appropriate computing environment for software (such as computer programs) configured to perform the methods described herein. These methods can be implemented in executable instructions by computer organized in program modules. The program modules include the routines, programs, objects, components and data structures that perform the tasks and implement the types of data for implementing the methods described above. Although Fig. 16 shows a typical desktop computer configuration, the present invention can be implemented in other computer system configurations, including a) multiprocessor systems, programmable or microprocessor based consumer electronics, minicomputers, mainframe computers and similar. The present invention can also be used in distributed computing environments, in which tasks are performed in parallel by processing devices to increase performance. Tasks relating to the measurement characteristics of possible anomalies can, for example, be carried out - simultaneously on several computers, several processors on a single computer or both. In a distributed computing environment, program modules can be located on local and remote memory storage devices. The computer system shown in Fig. 16 is suitable for implementing the technologies described herein and includes a computer 1620, with a processing unit 1621, a system memory 1622 and a system terminal 1623 that interconnects various system components, including the system memory 1622, to the processing unit

1621. O terminal de sistema pode compreender qualquer um dentre diversos tipos de estruturas de terminais, incluindo um terminal de memória ou controlador de memória, um terminal periférico e um terminal local utilizando arquitetura de terminal. A memória de sistema inclui memória somente de leitura (ROM) 1624 e memória de acesso aleatório (RAM) 1625. Um sistema não volátil 1626 (tal como BIOS) pode ser armazenado em ROM 1624 e contém as rotinas básicas de transferência de informações entre elementos no computador pessoal 1620, tal como ao ser ligado. O computador pessoal 1620 pode incluir adicionalmente um ou mais dispositivos de armazenagem legíveis por computador diferentes 1630 tais como um drive de disco rígido, memória removível (pendrive), drive de disco magnético, por exemplo, para ler ou gravar em um disco removível, e um drive de disco ótico, por exemplo, para ler um disco CD-ROM ou ler e gravar em outros meios óticos. O drive de disco rígido, — drive de disco magnético e drive de disco ótico podem ser conectados ao terminal do sistema 1623 por uma interface de drive de disco rígido, uma interface de drive de disco magnético e uma interface de drive ótico, — respectivamente, ou conectados de alguma outra forma. . Os drives e seus meios legíveis por computador associados fornecem armazenagem não volátil de dados, estruturas de dados, instruções executáveis por computador (incluindo código de programa tal como bibliotecas de links dinâmicos e f 31 arquivos executáveis) e similares para o computador pessoal 1620. Embora a descrição de meios legíveis por computador acima refira-se a um disco rígido, disco magnético removível e CD, ela pode também incluir outros tipos de meios que são legíveis por computadores, tais como cassetes magnéticas, cartões de memória flash, discos de vídeo digital e similares. Diversos módulos de programa podem ser armazenados nos - drives e RAM 1625, incluindo um sistema operacional, um ou mais programas aplicativos, outros módulos de programas e dados de programas. Um usuário pode introduzir comandos e informações no computador pessoal 1620 por meio de um ou mais dispositivos de entrada 1640, tais como um teclado ou dispositivo apontador, tal como um mouse. Outros dispositivos de entrada podem incluir um microfone, joystick, game pad, disco de satélite, scanner ou similares. Estes e outros dispositivos de entrada são frequentemente conectados à unidade de processamento 1621 por meio de uma interface de porta serial que é acoplada ao terminal do sistema, mas podem ser conectados por outras interfaces, tais como uma porta paralela, porta de jogos, Ethernet, IEEE 1394, Gigabit Ethernet, link de câmera ou terminal em série universal (USB). Um ou mais dispositivos de saída 1645, tais como um monitor ou outro tipo de dispositivo de visor, também são conectados ao terminal do sistema 1623 por meio de uma interface, tal como um controlador de visor ou adaptador de vídeo. Além do monitor, computadores pessoais incluem tipicamente outros dispositivos de saída periféricos (não exibidos), tais como alto-falantes e impressoras.1621. The system terminal can comprise any of several types of terminal structures, including a memory terminal or memory controller, a peripheral terminal and a local terminal using terminal architecture. System memory includes read-only memory (ROM) 1624 and random access memory (RAM) 1625. A non-volatile system 1626 (such as BIOS) can be stored in ROM 1624 and contains the basic routines for transferring information between elements on the 1620 personal computer, such as when connected. The personal computer 1620 may additionally include one or more different computer-readable storage devices 1630 such as a hard disk drive, removable memory (pendrive), magnetic disk drive, for example, to read or write to a removable disk, and an optical disc drive, for example, to read a CD-ROM disc or read and write to other optical media. The hard disk drive, - magnetic disk drive and optical disk drive, can be connected to the 1623 system terminal via a hard disk drive interface, a magnetic disk drive interface and an optical drive interface, - respectively, or connected in some other way. . The drives and their associated computer-readable media provide non-volatile data storage, data structures, computer-executable instructions (including program code such as dynamic link libraries and 31 executable files) and the like for the 1620 personal computer. description of computer-readable media above refers to a hard disk, removable magnetic disk and CD, it can also include other types of media that are readable by computers, such as magnetic cassettes, flash memory cards, digital video discs and similar. Several program modules can be stored on - drives and 1625 RAM, including an operating system, one or more application programs, other program modules and program data. A user can enter commands and information on the 1620 personal computer via one or more 1640 input devices, such as a keyboard or pointing device, such as a mouse. Other input devices may include a microphone, joystick, game pad, satellite disc, scanner or the like. These and other input devices are often connected to the 1621 processing unit via a serial port interface that is coupled to the system terminal, but can be connected via other interfaces, such as a parallel port, game port, Ethernet, IEEE 1394, Gigabit Ethernet, camera link or universal serial terminal (USB). One or more 1645 output devices, such as a monitor or other type of display device, are also connected to the 1623 system terminal via an interface, such as a display controller or video adapter. In addition to the monitor, personal computers typically include other peripheral output devices (not shown), such as speakers and printers.

Uma ou mais conexões de comunicação 1650 são tipicamente fornecidas tais como conexões sem fio ou conexões com fio (tais como conexões via Ethernet), de tal forma que o computador pessoal 1620 possa comunicar-se por meio de uma rede de comunicação. Além disso, embora o computador pessoal 1620 inclua uma série de dispositivos de entrada,One or more 1650 communication connections are typically provided such as wireless connections or wired connections (such as connections via Ethernet), in such a way that the 1620 personal computer can communicate over a communication network. In addition, although the 1620 personal computer includes a number of input devices,

& 32 dispositivos de saída, memória e armazenagem, alguns destes componentes encontram-se, em alguns exemplos, em posição remota para acesso por meio de uma rede. Dados de imagens processados obtidos conforme discutido acima podem ser encaminhados, por exemplo, por meio dessa rede para um terminal remoto ou sistema de processamento para exibição, avaliação e processamento adicional por médicos. A armazenagem de dados pode também ser remota. O computador pessoal 1620 pode ser configurado para gravar dados na memória, processar dados de acordo com os métodos descritos no presente e exibir os dados processados em um monitor local. Estas funções podem ser realizadas, entretanto, por diferentes unidades de processamento em diferentes locais conforme venha a ser conveniente. O sistema de computador acima é fornecido meramente como um exemplo. As tecnologias podem ser implementadas em uma ampla variedade | de outras configurações. Além disso, é possível uma ampla variedade de abordagens de coleta e análise de dados relativos a dados de processamento de imagens. Os dados podem ser coletados, por exemplo, e as características, medidas, coloridas e processadas para fornecer imagens de contexto de | campo brilhante para armazenagem e exibição em sistemas de computador | diferentes conforme apropriado. | 20 Além disso, diversos aspectos de software podem ser implementados em hardware e vice-versa.& 32 output, memory and storage devices, some of these components are, in some examples, in a remote position for access via a network. Processed image data obtained as discussed above can be routed, for example, through this network to a remote terminal or processing system for display, evaluation and further processing by doctors. Data storage can also be remote. The 1620 personal computer can be configured to write data to memory, process data according to the methods described herein and display the processed data on a local monitor. These functions can be carried out, however, by different processing units in different locations as may be convenient. The above computer system is provided as an example only. Technologies can be implemented in a wide variety | other settings. In addition, a wide variety of data collection and analysis approaches related to image processing data is possible. Data can be collected, for example, and features, measures, colored and processed to provide context images of | brilliant field for storage and display on computer systems | different as appropriate. | 20 In addition, several aspects of software can be implemented in hardware and vice versa.

ANÁLISE DE TECIDOS E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSAMENTO DE TECIDOS O protocolo histológico destina-se a preservar a estrutura de tecidos e aumentar o contraste entre estruturas de interesse para exame microscópico. A fim de atingir isso, muitas abordagens estão em uso e foram historicamente utilizadas. A fixação de tecidos pode envolver uma série de substâncias, cujos exemplos incluem, mas sem limitações, formalina, fixador de Bouin, etanol, glutaraldeído, criopreservação, micro-ondas, calor, acetona, usoTISSUE ANALYSIS AND TISSUE PROCESSING OPTIMIZATION The histological protocol is intended to preserve the tissue structure and increase the contrast between structures of interest for microscopic examination. In order to achieve this, many approaches are in use and have been used historically. Tissue fixation may involve a number of substances, examples of which include, but are not limited to, formalin, Bouin's fixative, ethanol, glutaraldehyde, cryopreservation, microwave, heat, acetone, use

' 33 de ácidos, soluções alcalinas, detergentes, metais pesados e muitos outros agentes reticulantes ou conservantes.'33 of acids, alkaline solutions, detergents, heavy metals and many other cross-linking agents or preservatives.

Estas substâncias diferentes foram utilizadas para trazer detalhes, preservar estruturas de células e tecidos, assistir na marcação e recuperação de antígenos e outros esforços similares para aumentar o contraste em formação de imagens em modo simples para patologia.These different substances were used to bring details, preserve cell and tissue structures, assist in the marking and recovery of antigens and other similar efforts to increase the contrast in imaging in a simple way for pathology.

O material utilizado para infiltrar e embutir tecido e fornecer suporte a estruturas para microtomia e ultramicrotomia também contribui com as características óticas.The material used to infiltrate and embed tissue and provide support for structures for microtomy and ultramicrotomy also contributes to the optical characteristics.

As estratégias subsequentes de processamento, corantes e montagem contribuem todas com as características óticas e químicas para formação de imagens multimodais.Subsequent processing, dyeing and assembly strategies all contribute to the optical and chemical characteristics for forming multimodal images.

Com isso em mente, estão sendo realizados estudos de otimização de parâmetros de formação de imagens com múltiplas modalidades e seleção de modalidades de formação de imagens apropriadas para condições específicas de fixação, embutimento, marcação e montagem comumente utilizadas para histopatologia.With this in mind, studies are being carried out to optimize imaging parameters with multiple modalities and to select appropriate imaging modalities for specific conditions of fixation, embedding, marking and assembly commonly used for histopathology.

Isso pode ser feito utilizando tecido arquivado preparado por meio de diferentes meios convencionais e ajuste de parâmetros de formação de imagens para aumentar a qualidade das imagens.This can be done using archived tissue prepared using different conventional means and adjusting image formation parameters to increase image quality.

A abordagem inversa de otimização do protocolo de preparação de tecidos para modalidades de formação de imagens também está sendo estudada.The reverse approach to optimizing the tissue preparation protocol for imaging modalities is also being studied.

A qualidade de imagem é uma sinergia entre a preparação de tecidos, agentes de marcação e instrumentação de formação de imagens; a i estratégia de formação de imagens com múltiplos modos leva isso em consideração.Image quality is a synergy between tissue preparation, marking agents and image-forming instrumentation; the multi-mode imaging strategy takes this into account.

Desta forma, considera-se que o tecido e os métodos de preservação e preparação sejam partes do sistema de formação de imagens óticas ou químicas.In this way, it is considered that the tissue and the methods of preservation and preparation are part of the system of formation of optical or chemical images.

Muitas etapas físicas e químicas críticas estão envolvidas no processamento de tecidos para histopatologia.Many critical physical and chemical steps are involved in tissue processing for histopathology.

As fases de princípio de processamento de tecido automático representam muitos parâmetros no condutor de processamento que apresentam impactos sobre a qualidade de mi 34 o o. e e a a a a a a no a imagens. A fim de melhor alavancar modalidades de formação de imagens específicas que produzem informações complementares, as qualidades óticas e químicas de processamento, marcação e montagem de tecidos devem ser cuidadosamente controladas. O uso de equipamento automatizado e | 5 protocolos otimizados para corantes especializados e consistência de | reagentes e substâncias é empregado para permitir avanços significativos na | qualidade de contraste e resolução estrutural/química entre modalidades de formação de imagens complementares. No contexto dos exemplos descritos no presente, os métodos de preparação de tecidos tais como retícula de proteínas pormeio de fixação de formalina, embutimento em parafina, etapas de retirada de parafina, preservação de cromatina nuclear, contracorantes, sondas moleculares específicas, agente de montagem e vidro utilizado para a preparação de tecidos são todos considerados como contribuindo com os diversos modos de formação de imagens. Os diversos modos de formação de imagens utilizados nos exemplos envolvem qualidades de contraste de refração e resolução de massa molecular e/ou sinal fluorescente.The principle phases of automatic fabric processing represent many parameters in the processing conductor that have an impact on the quality of millimeters. and and a a a a a a no images. In order to better leverage modalities of formation of specific images that produce complementary information, the optical and chemical qualities of processing, marking and assembly of fabrics must be carefully controlled. The use of automated equipment and | 5 protocols optimized for specialized dyes and consistency of | reagents and substances is employed to allow significant advances in | contrast quality and structural / chemical resolution between complementary image formation modalities. In the context of the examples described herein, tissue preparation methods such as protein lattice by means of formalin fixation, paraffin embedding, paraffin removal steps, nuclear chromatin preservation, counterstains, specific molecular probes, assembly agent and glass used for fabric preparation are all considered to contribute to the various forms of image formation. The various imaging modes used in the examples involve refractive contrast qualities and resolution of molecular mass and / or fluorescent signal.

SONDAS REPRESENTATIVAS Imagens oferecidas com campo brilhante pseudocoloridas com base em contraste com múltiplas modalidades podem ser combinadas com esquemas de detecção adicionais que utilizam diversos métodos de geração de sinais. Algumas sondas representativas foram descritas, mas a tecnologia | — descritanãose limita a esses exemplos. Algumas sondas que são configuradas para ligar-se especificamente a um ou mais alvos de interesse podem ser acopladas a uma marca que pode ser consultada com base em diversas — propriedades óticas e físico-químicas, tais como absorção de luz, emissão, vida útil de fluorescência, quimioluminescência, características eletrônicas, características químicas, fotocomutabilidade, piscar intermitente, radioatividade, birrefringência ou massa da marca.REPRESENTATIVE PROBES Images offered with pseudo-colored bright field based on contrast with multiple modalities can be combined with additional detection schemes that use different signal generation methods. Some representative probes have been described, but the technology | - description is not limited to these examples. Some probes that are configured to specifically connect to one or more targets of interest can be attached to a brand that can be consulted based on several - optical and physical-chemical properties, such as light absorption, emission, service life fluorescence, chemiluminescence, electronic characteristics, chemical characteristics, photocomutability, intermittent blinking, radioactivity, birefringence or brand mass.

Ô 35 Os conjugados que compreendem porções geradoras de sinais, tais como conjugados de porções de ligação e porções geradoras de sinais específicas, podem ser utilizados para detectar moléculas alvo específicas em amostras biológicas. A porção geradora de sinais é utilizada para fornecer um sinal detectável que indica a presença e/ou a localização do alvo. Exemplos de porções geradoras de sinais incluem, por exemplo, e sem limitações: enzimas, tais como peroxidase de rabanete silvestre, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, oxidase de glicose, B-galactosidase, B-glucuronidase ou B-lactamase.Ô 35 Conjugates comprising signal-generating portions, such as conjugates of binding portions and specific signal-generating portions, can be used to detect specific target molecules in biological samples. The signal generating portion is used to provide a detectable signal that indicates the presence and / or location of the target. Examples of signal-generating moieties include, for example, but are not limited to: enzymes, such as wild radish peroxidase, alkaline phosphatase, acid phosphatase, glucose oxidase, B-galactosidase, B-glucuronidase or B-lactamase.

Quando a porção geradora de sinais incluir uma enzima, pode-se utilizar um composto cromagênico, composto fluorogênico ou composto luminogênico para gerar um sinal detectável. Exemplos específicos de compostos cromogênicos incluem diaminobenzidina (DAB), fosfato de 4- nitrofenila (DbNPP), vermelho rápido, fosfato de bromocloroindolila (BCIP), nitro azul tetrazólio (NBT), BCIP/NBT, vermelho rápido, laranja AP, azul AP, tetrametilbenzidina (TMB), 2,2'-azinodi-[sulfonato de 3-etilbenzotiazolina] (ABTS), o-dianisidina, 4-cloronaftol (4-CN), nitrofenil-B-D-galactopiranosida (ONPG), o-fenilenodiamina (OPD), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B- galactopiranosida (X-Gal), metilumbeliferil-B-D-galactopiranosida (MU-Gal), p- nitrofenil-a-D-galactopiranosida (PNP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-D- —glucuronida (X-Gluc), 3-amino-9-etil carbazol (AEC), fucsina, iodonitrotetrazólio (INT), azul de tetrazólio e violeta de tetrazólio. a peetareeaeedra tendes Um tipo de conjugado detectável é um conjugado covalente de um anticorpo e um fluoroforo. A direção de fótons em direção ao conjugado que possuem um comprimento de onda absorvido pelo fluoroforo estimula a fluorescência que pode ser detectada e utilizada para qualificar, quantificar e/ou localizar o anticorpo. Alguns exemplos descritos no presente são baseados em nanocristais semicondutores (também denominados pontos quânticos ou QDots). Pontos quânticos bioconjugados são caracterizados por rendimentosWhen the signal generating portion includes an enzyme, a chromagenic compound, fluorogenic compound or luminogenic compound can be used to generate a detectable signal. Specific examples of chromogenic compounds include diaminobenzidine (DAB), 4-nitrophenyl phosphate (DbNPP), fast red, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), tetrazolium blue nitro (NBT), BCIP / NBT, fast red, AP orange, AP blue, tetramethylbenzidine (TMB), 2,2'-azinodi- [3-ethylbenzothiazoline sulfonate] (ABTS), o-dianisidine, 4-chloronaftol (4-CN), nitrophenyl-BD-galactopyranoside (ONPG), o-phenylenediamine (OPD ), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-galactopyranoside (X-Gal), methylumbelliferyl-BD-galactopyranoside (MU-Gal), p-nitrophenyl-aD-galactopyranoside (PNP), 5-bromo-4 -chloro-3-indolyl-BD- —glucuronide (X-Gluc), 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC), fuchsin, iodonitrotetrazolium (INT), tetrazolium blue and tetrazolium violet. a peetareeaeedra tendes One type of detectable conjugate is a covalent conjugate of an antibody and a fluorophor. The direction of photons towards the conjugate that have a wavelength absorbed by the fluorophor stimulates the fluorescence that can be detected and used to qualify, quantify and / or locate the antibody. Some examples described here are based on semiconductor nanocrystals (also called quantum dots or QDots). Bioconjugate quantum dots are characterized by yields

Á 36 quantificados comparáveis com as tinturas tradicionais mais brilhantes disponíveis.There are 36 quantifiers comparable to the most brilliant traditional dyes available.

Além disso, esses fluoroforos com base em ponto quântico absorvem de dez a mil vezes mais luz que as tinturas tradicionais.In addition, these quantum dot-based fluorophores absorb ten to a thousand times more light than traditional dyes.

Pontos quânticos são tipicamente fluoroforos estáveis, frequentemente são resistentes à fotoliciviação e possuem uma ampla faixa de excitação, comprimentos de onda e espectro de emissão estreito.Quantum dots are typically stable fluorophores, are often resistant to light curing and have a wide excitation range, wavelengths and narrow emission spectrum.

Pontos quânticos que possuem características de emissão específicas, tais como emissões em comprimentos de onda específicos, podem ser selecionados de tal forma que diversos pontos quânticos diferentes que possuem diversas características de emissão diferentes podem ser utilizados para identificar diversos alvos diferentes.Quantum points that have specific emission characteristics, such as emissions at specific wavelengths, can be selected in such a way that several different quantum points that have different emission characteristics can be used to identify several different targets.

À emissão dos pontos quânticos é estreita e simétrica, o que significa que a sobreposição com outras cores é minimizada, resultando em sangramento mínimo para canais de detecção adjacentes e interferência atenuada, apesar do fato de que podem ser utilizadas muito mais cores simultaneamente.The emission of quantum dots is narrow and symmetrical, which means that overlap with other colors is minimized, resulting in minimal bleeding for adjacent detection channels and attenuated interference, despite the fact that many more colors can be used simultaneously.

Espectros de emissão simétricos e sintonizáveis podem variar de acordo com o tamanho e a composição de material das partículas, o que permite espaçamento próximo e flexível de diferentes pontos quânticos sem sobreposição substancial do espectro.Symmetrical and tunable emission spectra can vary according to the size and material composition of the particles, which allows close and flexible spacing of different quantum points without substantial overlap of the spectrum.

Além disso, os seus espectros de absorção são amplos, o que possibilita excitar todas as variantes de coloração ponto quântico simultaneamente utilizando um único comprimento de onda de excitação, de forma a minimizar a autofluorescência da amostra.In addition, their absorption spectra are wide, which makes it possible to excite all quantum dot color variants simultaneously using a single excitation wavelength, in order to minimize the autofluorescence of the sample.

Ponto = += + - -quântico é uma partícula em .nanoescala que exibe propriedades óticas e eletrônicas dependentes de tamanho devido a um confinamento quantum.Dot = + = + - -quantum is a .nanoscale particle that exhibits size-dependent optical and electronic properties due to quantum confinement.

Pontos “quânticos foram construídos, por exemplo, com materiais semicondutores (tais como selenito de cádmio e sulfeto de enxofre) e com cristalizados (cultivados por meio de epitaxia de feixes moleculares) etc.Quantum dots were constructed, for example, with semiconductor materials (such as cadmium selenite and sulfur sulfide) and crystallized (cultured using molecular beam epitaxy) etc.

Diversos pontos quânticos que possuem várias químicas de superfície e características de fluorescência são disponíveis comercialmenteSeveral quantum dots that have various surface chemicals and fluorescence characteristics are commercially available

É 37 por meio da Invitrogen Corporation, Eugene OR (vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas nº 6.815.064, 6.682.596 e 6.649.138, cada uma das quais é incorporada ao presente como referência). Ponto quântico pode ser acoplado a uma parte de ligação selecionada para um alvo de interesse.It is 37 through Invitrogen Corporation, Eugene OR (see, for example, US Patent Nos. 6,815,064, 6,682,596 and 6,649,138, each of which is incorporated herein by reference). Quantum dot can be coupled to a link part selected for a target of interest.

Após ligação ao alvo, o ponto quântico pode ser detectado com base, por exemplo, nas suas características de fluorescência, características de absorção,After binding to the target, the quantum dot can be detected based, for example, on its fluorescence characteristics, absorption characteristics,

características de excitação ou período de vida de fluorescência. ' Embora possam ser utilizados muitos exemplos de agentes de contraste condutores para formação de imagens de contraste multimodal com sondas multiplexadas, incluindo marcas com base em pontos quânticos tais como as descritas acima, marcas configuradas para espectrometria de massa de formação de imagens também são muito úteis.excitation characteristics or fluorescence life span. 'While many examples of conductive contrast agents can be used for multi-modal contrast imaging with multiplexed probes, including quantum dot based marks such as those described above, marks configured for imaging mass spectrometry are also very useful. .

Essas chamadas “marcas de massa" podem ser configuradas para ligação específica a uma ou mais substâncias ou moléculas de interesse; e detectadas em seguida utilizando espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) ou outros métodos de espectrometria de massa.These so-called "mass marks" can be configured for specific binding to one or more substances or molecules of interest, and then detected using ion-assisted mass spectrometry and matrix-assisted laser desorption (MALDI) or other methods of mass spectrometry .

Uma ou mais marcas de massa podem ser aplicadas a uma amostra tal como uma seção de tecido que deve ser avaliada ou foi avaliada utilizando contraste de índice de refração e/ou fluorescência conforme descrito acima.One or more mass marks can be applied to a sample such as a section of tissue that is to be evaluated or has been evaluated using refractive index and / or fluorescence contrast as described above.

Em um exemplo, ligantes ou anticorpos são selecionados para ligação a uma molécula alvo e são fixados a nanopartículas de ouro ou outras nanopartículas.In one example, ligands or antibodies are selected to bind to a target molecule and are attached to gold nanoparticles or other nanoparticles.

Ligantes ou anticorpos que . estão presentes sobre a nanopartícula ligam-se à proteína alvo.Ligands or antibodies that. are present on the nanoparticle bind to the target protein.

Após ligação ao alvo, as moléculas pequenas sobre uma nanopartícula podem ser analisadas em seguida por meio de espectrometria de massa de tempo de voo —porionização por dessorção a laser (LDI-TOF MS). A Patente Norte-Americana nº 7.202.472 descreve nanopartículas representativas que contêm anticorpos a elas acoplados para ligação específica a um alvo.After binding to the target, small molecules on a nanoparticle can then be analyzed using time-of-flight mass spectrometry — laser desorption porionization (LDI-TOF MS). US Patent No. 7,202,472 describes representative nanoparticles that contain antibodies attached to them for specific binding to a target.

Diversos analisados podem ser detectados desta forma por meio do fornecimento de ligantes ou anticorpos fá 38 específicos — correspondentes — que são ligados a nanopartículas correspondentes, em que tipicamente cada nanopartícula fornece uma assinatura de massa diferente. Em alguns exemplos, podem ser utilizados anticorpos marcados com marca de massa fotodivisível conforme descrito no — Pedido de Patente Norte-Americano publicado nº 2009/0088332. Em outros exemplos, tais como conforme descrito em US 2002/0150927, uma sonda é acoplada a um modificador de massa, o modificador de massa é dividido utiizando uma enzima e o modificador de massa liberado é detectado. Em outros exemplos, tais como conforme descrito em WO 00/68434, que é incorporada ao presente como referência, são fornecidos oligos de ligação específicos que encapsulam lipossomos, cada qual com massas diferenciadoras específicas separáveis por MALDI.Several analyzed can be detected in this way by supplying specific 38 corresponding ligands or antibodies that are attached to corresponding nanoparticles, where typically each nanoparticle provides a different mass signature. In some examples, antibodies marked with a photodivisible mass mark may be used as described in - Published North American Patent Application No. 2009/0088332. In other examples, such as as described in US 2002/0150927, a probe is coupled to a mass modifier, the mass modifier is divided using an enzyme and the released mass modifier is detected. In other examples, such as as described in WO 00/68434, which is incorporated herein by reference, specific binding oligos that encapsulate liposomes are provided, each with specific differentiating masses separable by MALDI.

EXEMPLOS REPRESENTATIVOS Em alguns exemplos adicionais, foram obtidas imagens de seções de tecidos histológicos embutidos em parafina e fixados com formalina preparadas de acordo com protocolos da Ventana Medical Systems (Tucson AZ). Nos exemplos das Figuras 4, 5, 6, 10, 12, 13, 20 e 21, seções de tecidos foram retiradas por meio de prostectomia e processadas para hibridização in situ por fluorescência (FISH) com ponto quântico (QDot) de nanocristal de semicondutores e contracoradas com a linhagem fluorescente 4',6-diamidino-2- fenilindol (DAPI). Detecção QDot e fluorescência DAPI podem ser produzidas .-. --- -com um feixe de estímulo ultravioleta em uma faixa de comprimentos de onda de 370 +/- 20 nm. Esse feixe de estímulos é bem apropriado para excitação multiplex simultânea de contracorantes nucleares de absorção de UV tais como —DAPI bem como sondas QDot multiplexadas. O contraste de índice de refração no exemplo de esquema de contraste brilha contra um campo escuro e não depende de corantes de absorção de luz, de forma a permitir observação e registro simultâneos do contraste de fluorescência.REPRESENTATIVE EXAMPLES In some additional examples, images of sections of histological tissues embedded in paraffin and fixed with formalin prepared according to protocols of Ventana Medical Systems (Tucson AZ) were obtained. In the examples of Figures 4, 5, 6, 10, 12, 13, 20 and 21, tissue sections were removed by means of prostectomy and processed for fluorescence in situ hybridization (FISH) with semiconductor nanocrystal quantum dot (QDot) and counterstained with fluorescent lineage 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). QDot detection and DAPI fluorescence can be produced .-. --- -with an ultraviolet stimulus beam in a wavelength range of 370 +/- 20 nm. This bundle of stimuli is well suited for simultaneous multiplex excitation of UV-absorbing nuclear counters such as —DAPI as well as multiplexed QDot probes. The refractive index contrast in the contrast scheme example glows against a dark field and does not depend on light absorbing dyes, in order to allow simultaneous observation and recording of the fluorescence contrast.

É 39 Concluiu-se que a observação direta dessas amostras utilizando um sistema de microscópio tal como o da Fig. 1 é útil para visualização direta utilizando filtros de longa passagem (410 nm) instalados diretamente em oculares de microscópios.It is 39 It was concluded that direct observation of these samples using a microscope system such as that of Fig. 1 is useful for direct visualization using long-pass filters (410 nm) installed directly in microscope eyepieces.

As imagens observadas resultantes continham — núcleos que pareciam azuis entre a estrutura histológica de ouro e prata.The resulting observed images contained - nuclei that looked blue between the gold and silver histological structure.

Pode ser induzida coloração adicional (tal como amarela ou vermelha) para observação direta utilizando um ou mais filtros de comprimentos de onda no trajeto de luz transmitida.Additional staining (such as yellow or red) can be induced for direct observation using one or more wavelength filters in the transmitted light path.

O contraste fornecido pela iluminação (fluorescência ou campo escuro transmitido) pode ser convenientemente impulsionado para permitir a formação de imagens com um único método de contraste independente do outro.The contrast provided by lighting (fluorescence or transmitted dark field) can be conveniently boosted to allow the formation of images with a single contrast method independent of the other.

As intensidades de fonte de luz (feixe de estímulo, campo de iluminação de campo escuro) podem ser controladas de forma a equilibrar o contraste para visualização de duas cores direta ou registro em um sensor isolado com tempo de integração padronizado.The light source intensities (stimulus beam, dark field illumination field) can be controlled in order to balance the contrast for direct two-color visualization or register in an isolated sensor with standardized integration time.

Um campo escuro combinado representativo (ou seja, refrativo/imagem de contraste por fluorescência é exibido na Fig. 4B em sobreposição de duas cores e campo brilhante fornecido junto com uma imagem de uma seção em série da mesma amostra produzida com um corante H&E convencional (Fig. 44). A imagem da Fig. 4B é baseada em uma inversão de imagem e LUT de cor.A representative combined dark field (ie, refractive / fluorescence contrast image is shown in Fig. 4B in two-color overlay and bright field provided along with an image of a serial section of the same sample produced with a conventional H&E dye ( Fig. 44) The image in Fig. 4B is based on an image inversion and color LUT.

O tipo de dados visíveis na seção de tecido não corado (Fig. 4B) pode ser utilizado no diagnóstico de neoplasia intraepitelial da próstata (PIN) e padrões de crescimento anômalos presentes em câncer da próstata (Fig. 20, Fig. 21) de forma similar à da imagem corada H&E convencional (Fig. 4A), mas também interrogado em busca de localizações de sondas moleculares.The type of data visible in the unstained tissue section (Fig. 4B) can be used in the diagnosis of intraepithelial neoplasia of the prostate (PIN) and abnormal growth patterns present in prostate cancer (Fig. 20, Fig. 21) in a way similar to the conventional H&E stained image (Fig. 4A), but also interrogated for molecular probe locations.

Além disso, as características adicionais, tais como nucléolos proeminentes, não são evidentes com fluorescência de DAPI isoladamente.In addition, additional features, such as prominent nucleoli, are not evident with DAPI fluorescence alone.

Desta forma, estas imagens combinadas e seu processamento podem ser úteis no diagnóstico e tratamento e podem não apenas fornecer as mesmas informações de imagens i 40 com base em linhagem convencional, mas também gerar informações adicionais.In this way, these combined images and their processing can be useful in diagnosis and treatment and can not only provide the same information as i 40 images based on conventional lineage, but also generate additional information.

Nestes exemplos, imagens com contraste duplo (campo escuro de refração e fluorescência, respectivamente) foram registradas com CCD monocromático com exposições sequenciais tomadas utilizando filtros de interferência para selecionar comprimentos de onda de fluorescência DAP! azul ou fluxo de luz de contraste de refração com comprimento de onda mais longo. Ú A Fig. 5A é uma imagem monocromática que utiliza fluorescência DAP! e a Fig. 5B é uma imagem monocromática obtida de contraste de refração com iluminação em campo escuro. Imagens adicionais com base em combinações das imagens das Figs. 5A e 5B são exibidas nas Figs. 5C e 5D. A Fig. 5C é uma imagem pseudocolorida obtida por meio de sobreposição das imagens monocromáticas das Figs. 54 e 5B e aplicação de um mapeamento pseudocolorido com base em tabelas de referência (LUTs) de coloração contrastante. A Fig. 5D é uma imagem que corresponde à imagem da Fig. 5C após a inversão e coloração da imagem da Fig. 5C. A imagem da Fig. 5D pode ser denominada “fornecimento de campo brilhante” da imagem da Fig. 5C. Conforme discutido acima com referência à Fig. 2, podem ser obtidas e combinadas diversas imagens de fluorescência. A capacidade de localizar e fornecer sondas específicas de sequência de DNA utilizando um método de campo pseudobrilhante foi testada utilizando a sonda de - ——.-.-- rompimento ERG 3'5' no contexto de um teste FISH de rompimento de gene ERG em um tecido da próstata contracorado com DAPI preparado de acordo com as etapas descritas na Fig. 18. Considerou-se que a capacidade de aplicação de tabelas de referência de pseudocores aos níveis de intensidade da sonda e sobreposição em um esquema de coloração aditiva antes da inversão gera contraste suficiente para identificar pelo menos duas sondas fluorescentes simultaneamente com o contraste de refração e imagem a 41 contracorada com DAPI fornecida em campo pseudobrilhante.In these examples, images with double contrast (dark field of refraction and fluorescence, respectively) were recorded with monochrome CCD with sequential exposures taken using interference filters to select DAP fluorescence wavelengths! blue or refractive contrast light stream with longer wavelength. Ú Fig. 5A is a monochrome image that uses DAP fluorescence! and Fig. 5B is a monochrome image obtained from refractive contrast with dark field illumination. Additional images based on combinations of the images in Figs. 5A and 5B are shown in Figs. 5C and 5D. Fig. 5C is a pseudo-colored image obtained by overlaying the monochrome images of Figs. 54 and 5B and application of a pseudo-colored mapping based on reference tables (LUTs) of contrasting coloring. Fig. 5D is an image that corresponds to the image in Fig. 5C after inverting and coloring the image in Fig. 5C. The image in Fig. 5D can be called the "bright field supply" of the image in Fig. 5C. As discussed above with reference to Fig. 2, several fluorescence images can be obtained and combined. The ability to locate and provide specific DNA sequence probes using a pseudo-bright field method has been tested using the - ——.-.-- ERG 3'5 'probe in the context of a FISH ERG gene disruption test in a DAPI-contracted prostate tissue prepared according to the steps described in Fig. 18. The ability to apply pseudo-color reference tables to the probe intensity levels and overlap in an additive staining scheme before inversion was considered it generates enough contrast to identify at least two fluorescent probes simultaneously with the refraction and image contrast 41 counterstained with DAPI provided in a pseudo-bright field.

Obtenções sequenciais de localizações de sonda QDot a 565 nm e 655 nm foram obtidas de uma amostra corada com DAP! e processadas para produzir uma imagem exibida na Fig. 6 junto com contraste refrativo e fluorescência do contracorante de DAPI.Sequential retrieval of QDot probe locations at 565 nm and 655 nm was obtained from a sample stained with DAP! and processed to produce an image shown in Fig. 6 along with refractive contrast and fluorescence of the DAPI counterstain.

Conforme exibido no inserto da Fig. 6, essas obtenções permitem o fornecimento de campo brilhante e exibição de localizações FISH com sonda dupla (vide setas dirigidas para as áreas verde e vermelha correspondentes às localizações de sonda a 565 nm e 655 nm, respectivamente). Neste caso, as intensidades de sonda são sobrepostas sobre a imagem de contraste de DAPI/índice de refração de campo pseudobrilhante pseudocolorido.As shown in the insert of Fig. 6, these achievements allow the provision of bright field and display of FISH locations with double probe (see arrows directed to the green and red areas corresponding to the probe locations at 565 nm and 655 nm, respectively). In this case, the probe intensities are superimposed on the DAPI contrast image / pseudo-colored field refractive index.

Desta forma, características de imagens similares às obtidas com corantes H&E convencionais podem ser observadas, em conjunto com redisposições cromossômicas moleculares adicionais reveladas por sondas QDot.In this way, image characteristics similar to those obtained with conventional H&E dyes can be observed, together with additional molecular chromosomal rearrangements revealed by QDot probes.

A aparência geral é familiar para os acostumados a imagens coradas com H&E e — pouca ou nenhuma retração é necessária para permitir que os médicos avaliem confortavelmente amostras com base nessas imagens.The overall look is familiar to those used to H&E-stained images and - little or no retraction is needed to allow doctors to comfortably evaluate samples based on those images.

Em um outro exemplo, imunossondas específicas de proteínas (QD565 para antígeno CD20 e QD655 para antígeno Ki67) foram aplicadas a seções de tecido de amídala contracoradas com DAPI para produzir imagens conforme exibido na Fig. 7. As etapas de processamento generalizadas utilizadas para processamento de tecidos e otimização de contraste são -—--— descritas na Fig. 18. Imagens de refração de campo escuro e imagens de fluorescência DAPI foram obtidas, sobrepostas e fornecidas como imagens de campo pseudobrilhante pseudocolorido conforme exibido na Fig. 7 (1a-3a). Imagens com base em fluorescência de imunosondas foram obtidas para cada detecção de sonda e sobrepostas na forma de imagem de fluorescência em cores contrastantes conforme exibido na Fig. 7 (1b-3b). Conforme exibido na Fig. 7 (1b-3b), as imagens de localização de sondas para as sondas QD565 eIn another example, protein specific probes (QD565 for CD20 antigen and QD655 for Ki67 antigen) were applied to sections of amygdala tissue stained with DAPI to produce images as shown in Fig. 7. The generalized processing steps used for processing Tissues and contrast optimization are -—--— described in Fig. 18. Dark field refraction images and DAPI fluorescence images were obtained, overlaid and supplied as pseudo-colored pseudo-bright field images as shown in Fig. 7 (1a-3a ). Fluorescence-based images from immunosondes were obtained for each probe detection and superimposed as a fluorescence image in contrasting colors as shown in Fig. 7 (1b-3b). As shown in Fig. 7 (1b-3b), the probe location images for probes QD565 and

DI 42 QD655 foram pseudocoloridas em verde e vermelho, respectivamente. As imagens da Fig. 7 (1a-3a) e da Fig. 7 (1b-3b) foram combinadas para produzir as imagens finais, de forma a revelar as localizações de sondas sobre o contexto de estrutura de tecido da Fig. 7 (10-3c).DI 42 QD655 were pseudo-colored in green and red, respectively. The images in Fig. 7 (1a-3a) and Fig. 7 (1b-3b) were combined to produce the final images, in order to reveal the probe locations on the tissue structure context of Fig. 7 (10 -3c).

Os exemplos adicionais ilustram dois métodos de sobreposição da localização de sonda sobre o contexto de campo brilhante. A Fig. 8A é uma sobreposição aditiva de uma imagem de campo pseudobrilhante com imagens de sonda fluorescente utilizando sondas QD565 e QD655 sobre a amostra contracorada com DAP! utilizada na obtenção das imagens da Fig. 7. A Fig. 8B é uma sobreposição subtrativa na qual mapas de coloração de imagens de sondas são subtraídas da imagem pseudo H&E. A sobreposição subtrativa pode aproximar mais imagens obtidas com linhagens absorventes de luz e ser vantajosa na geração de contraste e sobreposição de imagens multiplexadas.The additional examples illustrate two methods of overlapping the probe location over the bright field context. Fig. 8A is an additive overlay of a pseudo-bright field image with fluorescent probe images using probes QD565 and QD655 on the sample countered with DAP! used to obtain the images of Fig. 7. Fig. 8B is a subtractive overlay in which color maps of probe images are subtracted from the pseudo H&E image. The subtractive overlay can approximate more images obtained with light-absorbing strains and be advantageous in generating contrast and overlapping multiplexed images.

Em um outro exemplo, sondas ISH específicas de MRNA (QD605 —paraRNA ribossômico 18s e QD625 para MRNA de HER2) foram aplicadas a seções de tecido de xenoenxerto Calu-3 contracoradas com DAPI para produzir imagens conforme exibido na Fig. 19. As etapas de processamento generalizadas utilizadas para processamento de tecidos e otimização de contraste são descritas na Fig. 18. Imagens de refração de campo escuro e imagens com base em fluorescência de DAPI foram obtidas, sobrepostas e fornecidas como imagens de campo pseudobrilhante pseudocolorido conforme - ---.-— -exibido e imagens com base em fluorescência foram obtidas para cada detecção de sonda e combinadas entre si com o fornecimento de contexto de campo brilhante. Conforme exibido na Fig. 19, as imagens de localização de sondas para as sondas QD605 e QD625 foram pseudocoloridas em ciano (seta preta) e preto (setas verdes), respectivamente. A imagem final da Fig. 19 revela, portanto, as localizações de sonda sobre o contexto de estrutura de tecido.In another example, MRNA-specific ISH probes (QD605 — for 18s ribosomal RNA and QD625 for HER2 MRNA) were applied to sections of Calu-3 xenograft tissue stained with DAPI to produce images as shown in Fig. 19. Generalized processing used for tissue processing and contrast optimization are described in Fig. 18. Dark field refraction images and DAPI fluorescence-based images were obtained, overlaid and provided as pseudo-colored pseudo-bright field images as - ---. -— -displayed and fluorescence-based images were obtained for each probe detection and combined with each other to provide bright field context. As shown in Fig. 19, the probe location images for probes QD605 and QD625 were pseudo-colored in cyan (black arrow) and black (green arrows), respectively. The final image in Fig. 19, therefore, reveals the probe locations on the tissue structure context.

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Para demonstrar a formação de imagens com velocidade de vídeo, foi testado um método de formação de imagens com duas cores utilizando um divisor de feixes de formação de imagens similar ao descrito na Fig. 11 para separar comprimentos de onda de emissão DAPI de contraste de — refração com comprimento de onda mais longo e projetar os dois componentes de comprimento de onda com exatamente o mesmo campo de visão lado a lado sobre um único sensor CCD monocromático.To demonstrate imaging at video speed, a two-color imaging method was tested using an imaging beam splitter similar to that described in Fig. 11 to separate contrast DAPI emission wavelengths from - refraction with longer wavelength and project the two wavelength components with exactly the same field of view side by side on a single monochrome CCD sensor.

O uso de um divisor de 7 feixes secundário permite a obtenção simultânea de imagens de dois canais de cores e envio para um visor de computador, bem como gravação do fluxo de sequências com rápido lapso de tempo limitadas apenas pelo tempo de integração necessário e pelo tempo de leitura da câmera.The use of a secondary 7-beam splitter allows simultaneous acquisition of images of two color channels and sending to a computer display, as well as recording of the stream of sequences with fast time lapse limited only by the necessary integration time and time camera reading.

A Fig. 12 contém uma imagem de índice de refração lado a lado (campo escuro) (A) e uma imagem DAP! (B) da mesma seção de tecido obtida simultaneamente.Fig. 12 contains a refractive index image side by side (dark field) (A) and a DAP! (B) from the same section of tissue obtained simultaneously.

O uso de captura de intensidade monocromática de faixas de comprimentos de onda distintas utilizadas para produzir imagens com modo múltiplo complementares permite a aplicação conveniente de tabelas de referência especializadas das imagens com intensidade de escala de cinza individuais para um contracorante de DAPI, a imagem de campo escuro transmitida e uma ou mais localizações de sonda.The use of monochromatic intensity capture of different wavelength bands used to produce complementary multiple mode images allows for the convenient application of specialized reference tables of the individual grayscale images for a DAPI counterstain, the field image transmitted dark and one or more probe locations.

Um método que mapeia as intensidades de pixel mais baixas em branco no espaço RGB e os pixels mais brilhantes até saturação completa de uma dada matiz foi testado no contexto de obtenção de imagens em fluxo.A method that maps the lowest pixel intensities in white in the RGB space and the brightest pixels to complete saturation of a given hue has been tested in the context of obtaining images in flow.

Este fornecimento alternativo da imagem de campo escuro transmitido pode ser navegado em tempo real em diversas ampliações e imagens instantâneas podem ser registradas à vontade.This alternative delivery of the transmitted dark field image can be navigated in real time at various magnifications and instant images can be recorded at will.

A Fig. 13 contém uma sobreposição com duas cores (com pseudocoloração e inversão de imagens) com base nas imagens lado a lado da Fig. 12 (observe-se que esta imagem girou com relação à imagem da Fig. 12). Essas imagens podem ser produzidas e sobrepostas rapidamente, permitindo uma percepção deFig. 13 contains a two-color overlay (with pseudo-coloring and inversion of images) based on the images side by side in Fig. 12 (note that this image has rotated in relation to the image in Fig. 12). These images can be produced and superimposed quickly, allowing a perception of

A A A Do | 44 observação de campo brilhante de coloração “viva” de estrutura de tecidos e contracorante.A A A Do | 44 observation of a bright field of “vivid” coloring of tissue structure and counterstain.

Esta abordagem pode ser estendida a sobreposição de sondas vivas utilizando diversos sensores ou por meio de divisão da luz em diversas faixas de comprimento de onda para projeção sobre diferentes áreas de um único sensor ou combinações de diversos sensores com vários comprimentos de onda projetadas sobre um ou mais sensores.This approach can be extended to overlapping live probes using different sensors or by dividing light into different wavelength bands for projection over different areas of a single sensor or combinations of different sensors with various wavelengths projected on one or more sensors.

Imagens de fluorescência e refração de campo escuro podem ser alternativamente registradas utilizando filtros de detecção sequenciais, iluminação sequencial, empregando um dispositivo de formação de imagens de espectro conforme descrito em Malik et al 1996, Hoyt et al, 2002, ambos os quais são incorporados ao presente como referência, ou utilizando uma câmera colorida com máscara Bayer de disparo único.Dark field fluorescence and refraction images can alternatively be recorded using sequential detection filters, sequential lighting, using a spectrum imaging device as described in Malik et al 1996, Hoyt et al, 2002, both of which are incorporated into the present as a reference, or using a color camera with a single-shot Bayer mask.

Embora possam ser utilizados métodos de contraste com base ótica utilizando índice de refração, fluorescência ou outros (Fig. 22) nos sistemas de microscópios da Fig. 1 e da Fig. 11, amostras avaliadas desta forma podem também ser preparadas para análise adicional utilizando marcas de massa em espectrometria de massa.Although optical based contrast methods using refractive index, fluorescence or others (Fig. 22) can be used in the microscope systems of Fig. 1 and Fig. 11, samples evaluated in this way can also be prepared for further analysis using marks mass in mass spectrometry.

Em um exemplo representativo, tecidos de rim de camundongo não revestidos e revestidos com matrizes foram preparados utilizando um protocolo de formação de imagens por — espectrometria de massa padrão.In a representative example, uncoated and matrix coated mouse kidney tissues were prepared using a standard mass spectrometry imaging protocol.

O contracorante nuclear não foi utilizado, mas foi possível formar imagens de morfologia de seção bruta e presença de tecido com base em diferenças de índice de refração em extremidades de tecido e por meio da detecção de autofluorescência utilizando um subsistema ótico de detecção de fluorescência.The nuclear counter dye was not used, but it was possible to form images of gross section morphology and tissue presence based on differences in the refractive index at tissue ends and through the detection of autofluorescence using an optical fluorescence detection subsystem.

Seções representativas são ilustradas na Fig. 14. A refração em extremidades de tecidos expostas faz com que as extremidades pareçam brilhantes e a autofluorescência azul é associada ao próprio tecido.Representative sections are illustrated in Fig. 14. Refraction at exposed tissue ends makes the ends look shiny and blue autofluorescence is associated with the tissue itself.

A Fig. 15 contém imagens que ilusttam imagens de autofluorescência e campo escuro combinadas de tecidos de rim de i 45 camundongo após a deposição de uma matriz ionizante para espectrometria de massa. Os cristais de matriz aparecem amarelos e a autofluorescência aparece azul. Estas imagens demonstram que podem ser obtidas imagens de fluorescência e campo escuro, mesmo após a aplicação da matriz ionizante.Fig. 15 contains images that illustrate combined autofluorescence and dark field images of mouse kidney tissues after deposition of an ionizing matrix for mass spectrometry. The matrix crystals appear yellow and the autofluorescence appears blue. These images demonstrate that fluorescence and dark field images can be obtained, even after the application of the ionizing matrix.

DISCUSSÃO ADICIONAL Contraste de índice de refração de campo escuro e fluorescência foram utilizados simultaneamente em alguns exemplos descritos, de forma a produzir imagens com contraste com múltiplas modalidades em amostras de tecido corados com um contracorante nuclear fluorescente. Esta abordagem é útil no uso de sondas específicas de moléculas multiplexadas para IHC, FISH e MRNA-ISH, com detecção de QDot, sobre a mesma seção de tecido, para fins de determinação de condições patológicas, e pode também ser utilizada para formar tecidos de imagens preparados para espectrometria de massa de formação de imagens. Demonstrou-se que este esquema de contraste com múltiplas modalidades fornece informações de contexto estrutural complementares de forma análoga a combinações de contracorante e corante de campo brilhante histológico de rotina, tais como H&E. As estruturas visíveis por meio de contraste de índice de refração incluem porções de proteína e essas imagens permitem a visualização de padrões de crescimento e anomalias estruturais com significado patológico conhecido, incluindo estruturas tais como nucléolos, matriz extracelular e membranas celulares e nucleares. Apenas sob iluminação de fluorescência, essas estruturas não são aparentes. Estruturas específicas visualizadas utilizando contraste de fluorescência e Índice de refração fomecem um contexto de observação de sinais de sondas moleculares sobre a mesma seção de tecido e ajudarão os médicos na seleção de tecidos e diagnóstico de estados de doença de câncer e pré-câncer. O contraste do índice de refração de campo escuro é particularmente útil pelo fato de que a abordagem fornece características brilhantes contra um campo escuro e não utiliza linhagens absorventes da luz.ADDITIONAL DISCUSSION Dark field refractive index and fluorescence contrast were used simultaneously in some described examples, in order to produce images with contrast with multiple modalities in tissue samples stained with a fluorescent nuclear counter dye. This approach is useful in the use of specific probes of multiplexed molecules for IHC, FISH and MRNA-ISH, with detection of QDot, on the same tissue section, for the purpose of determining pathological conditions, and can also be used to form tissues of images prepared for imaging mass spectrometry. This multi-modal contrast scheme has been shown to provide complementary structural context information in a manner analogous to routine histological brilliant field dye and counterstain combinations, such as H&E. The structures visible by means of refractive index contrast include portions of protein and these images allow the visualization of growth patterns and structural anomalies with known pathological significance, including structures such as nucleoli, extracellular matrix and cellular and nuclear membranes. Only under fluorescence lighting, these structures are not apparent. Specific structures visualized using fluorescence contrast and refractive index provide a context for observing molecular probe signals over the same tissue section and will assist clinicians in tissue selection and diagnosis of cancer and pre-cancer disease states. The contrast of the dark field refractive index is particularly useful in that the approach provides bright characteristics against a dark field and does not use light-absorbing strains.

e DA a mi . À 46 Desta forma, o contraste de refração é compatível para combinação direta com sondas emissoras fluorescentes multiplexadas utilizadas para localização de marcadores de câncer sobre seções de tecido transparentes preparadas utilizando protocolos de fixação de tecidos especializada, embutimento e corantes.and DA a mi. In this way, the refractive contrast is compatible for direct combination with multiplexed fluorescent emitting probes used to locate cancer markers on transparent tissue sections prepared using specialized tissue fixation, inlay and dye protocols.

Este método não interfere com a química ou quantificação de sondas quando combinado com a formação de imagens de espectro quantitativa de sondas QDot. - Ao restringir o comprimento de onda de iluminação para contraste por refração até um comprimento de onda que seja alterado em vermelho da emissão de sonda, os métodos de iluminação podem ser utilizados simultaneamente no contexto de obtenção de dados de imagens de espectro de sondas multiplexadas.This method does not interfere with the chemistry or quantification of probes when combined with the formation of quantitative spectrum images from QDot probes. - By restricting the illumination wavelength for refractive contrast to a wavelength that changes in red from the probe emission, the illumination methods can be used simultaneously in the context of obtaining spectrum image data from multiplexed probes.

Contraste de refração combinado com fluorescência também permite contexto de tecido de formação de imagens e estado patológico sobre tecidos transparentes destinados a espectrometria de massa de formação de imagens.Refractive contrast combined with fluorescence also allows for context of imaging tissue and pathological state on transparent tissues intended for imaging mass spectrometry.

Os métodos de contraste combinados (contraste de refração e fluorescência) podem ser visualizados diretamente através da ocular simultaneamente em coloração de contraste.The combined contrast methods (refractive contrast and fluorescence) can be viewed directly through the eyepiece simultaneously in contrast staining.

Além disso, os dados de imagens com duas cores podem ser gravados e/ou exibidos diretamente em forma de fluxo para saída em tempo real e registro conveniente de instantâneos de campos de interesse.In addition, two-color image data can be recorded and / or displayed directly as a stream for real-time output and convenient recording of field snapshots of interest.

O uso de obtenção simultânea de múltiplos comprimentos de onda em uma câmera monocromática fornece um meio conveniente de aplicação de tabelas de referência de cores especializadas ao fluxo de imagens de intensidade de escala de cinza para a imagem de refração de campo escuro e uma imagem de contracorantes nucleares fluorescentes.The use of simultaneously obtaining multiple wavelengths in a monochrome camera provides a convenient means of applying specialized color reference tables to the flow of grayscale intensity images for the darkfield refraction image and a counter-dye image fluorescent nuclear.

À aplicação de tabelas de referência CIEL*a*b* correspondente a valores de — coloração conhecidos preferidos por médicos no contexto de tipos de tecidos específicos refina adicionalmente a apresentação de estrutura de tecido ao médico praticante.The application of CIEL * a * b * reference tables corresponding to known coloring values preferred by doctors in the context of specific tissue types further refines the presentation of tissue structure to the practicing physician.

Tomados em conjunto, o processamento cuidadoso de tecidos, a obtenção de contraste multimodal e o processamento de dados deTaken together, the careful processing of tissues, the obtaining of multimodal contrast and the processing of

Í 47 imagens podem fornecer informações similares às que podem ser derivadas de seções de tecidos coradas com hematoxilina e eosina (H&E) convencionais. Essas imagens podem também ser combinadas com dados de imagens com base em sondas associados a marcadores de antígenos de proteinas e —expressãodemRNA genéticos intranucleares, citoplasmáticos e extracelulares e outras sondas específicas sobre tecido humano de outra forma não corado. Utilizando mapeamentos de coloração e inversões de imagens apropriadas, dados de imagens podem ser apresentados e exibidos a um patologista treinado de forma familiar e dados oticamente ativos ou que podem ser | 10 resolvidos quimicamente do mesmo campo de visão, tais como dados de espectro de massa, podem ser sobrepostos sobre este contexto familiar.47 images can provide information similar to that which can be derived from sections of tissue stained with conventional hematoxylin and eosin (H&E). These images can also be combined with image data based on probes associated with protein antigen markers and intranuclear, cytoplasmic and extracellular genetic RNA expression and other specific probes on otherwise unstained human tissue. Using color mappings and appropriate image inversions, image data can be presented and displayed to a familiarly trained pathologist and data that is optically active or that can be | 10 chemically resolved from the same field of view, such as mass spectrum data, can be superimposed over this familiar context.

| ConCLUSÃO Conforme descrito acima, contraste de múltiplas modalidades pode ser preservado, aprimorado e revelado em células e tecido. Estes elementos de contraste podem ser combinados e fornecidos para produzir imagens similares às produzidas com linhagens absorventes de comprimentos de onda observadas sob iluminação com luz branca transmitida. Imagens de contraste multimodais utilizam diversas características óticas e químicas incorporadas em tecido por meio de processamento especializado. Os componentes contrastantes podem ser efetivamente segmentados e apresentados digitalmente utilizando esquemas coloridos elaborados com base em métodos clássicos de contraste utilizados historicamente para revelar as mesmas estruturas anatômicas e histoquímica, de forma a fornecer relevância ao tratamento e experiência médica. O contexto estrutural resultante pode ser utilizado para determinação da patologia e também para fornecer contexto para marcadores químicos e moleculares multiplexados. Esta abordagem fornece informações correlativas importantes que, de outra forma, podem ser de obtenção difícil ou impossível. Em alguns exemplos, contraste de campo escuro derivado do índice de refração e imagens h 48 contracoradas DAPI fluorescentes são combinadas para produzir imagens similares às obtidas com corantes H&E convencionais. Demonstrou-se que estas imagens de dados multimodais são úteis na interpretação patológica das seções de tecido. Além disso, esses dados de imagens multimodais podem ser colocados em fluxopara monitorar e permitir a navegação ao vivo de amostras histológicas. Em outros exemplos, este contexto estrutural é combinado em seguida com : localizações moleculares de sondas de DNA genético (FISH), locais de expressão | de mRNA (MRNA-ISH) e sondas imuno-histoquímicas (IHC) localizadas sobre as mesmas seções de tecido. Contraste multimodal pode também ser utilizado para —avaliaremapear seções de tecido preparadas para espectrometria de massa. Embora o contraste por refração seja um exemplo conveniente, outros métodos também são apropriados. A Tabela 3 abaixo relaciona | modalidades de contraste que podem ser utilizadas para produzir informações complementares que podem ser combinadas para fornecer contexto estrutural de tecidos útil combinado com informações moleculares para determinação de patologia. A Tabela 4 relaciona fases iniciais de preparação automática de tecidos utilizadas para marcação molecular de sondas imunocitoquímicas, de DNA e mRNA sobre o tecido. Os detalhes dessas fases padronizadas apresenta impacto sobre as qualidades químicas e óticas que permitem formação de imagens com múltiplos modos para | determinação da patologia. | ss * TABELAS| CONCLUSION As described above, multiple modal contrast can be preserved, enhanced and revealed in cells and tissue. These contrast elements can be combined and supplied to produce images similar to those produced with absorbent strains of wavelengths observed under illumination with transmitted white light. Multimodal contrast images use a variety of optical and chemical characteristics embedded in fabric through specialized processing. Contrasting components can be effectively segmented and presented digitally using color schemes elaborated based on classic contrast methods used historically to reveal the same anatomical and histochemical structures, in order to provide relevance to treatment and medical experience. The resulting structural context can be used to determine the pathology and also to provide context for multiplexed chemical and molecular markers. This approach provides important correlative information that may otherwise be difficult or impossible to obtain. In some examples, dark field contrast derived from the refractive index and fluorescent DAPI h 48 counterstained images are combined to produce images similar to those obtained with conventional H&E dyes. These multimodal data images have been shown to be useful in the pathological interpretation of tissue sections. In addition, this multimodal image data can be flowed to monitor and allow live navigation of histological samples. In other examples, this structural context is then combined with: molecular locations of genetic DNA probes (FISH), expression sites | mRNA (MRNA-ISH) and immunohistochemical probes (IHC) located on the same tissue sections. Multimodal contrast can also be used to —evaluate map sections of tissue prepared for mass spectrometry. Although refractive contrast is a convenient example, other methods are also appropriate. Table 3 below lists | contrast modalities that can be used to produce complementary information that can be combined to provide useful tissue structural context combined with molecular information for determining pathology. Table 4 lists initial stages of automatic tissue preparation used for molecular staining of immunocytochemical probes, DNA and mRNA on the tissue. The details of these standardized phases have an impact on the chemical and optical qualities that allow imaging with multiple modes for | pathology determination. | ss * TABLES

MODALIDADES DE FORMAÇÃO DE IMAGENS PERTINENTES À GERAÇÃO DE CONTRASTEMODALITIES OF FORMATION OF IMAGES CONCERNING THE GENERATION OF CONTRAST

COMPLEMENTAR DE TECIDO PARA DETERMINAÇÃO DE PATOLOGIA Microscopia de campo | Uso de propriedades de absorção e difusão de brilhante tecido ou marcadores químicos/moleculares f 49 Microscopia “de campo | Uso de Índice de Refração e propriedades de escuro (refração) difusão de tecido ou marcadores químicos/moleculares Intensidade de fluorescência | Uso de emissão de fluorescência resolvida por de onda contínua | comprimento de onda para formação de (microscopia de | mapas de imagens de moléculas fluorescentes fluorescência) Microscopia de intensidade | Uso de emissão de fluorescência resolvida por de fluorescência não linear | comprimento de onda para formação de com múltiplos fótons mapas de imagens de moléculas fluorescentes com seção cruzada de absorção de dois fótons Microscopia por | Uso de luz de excitação em abertura numérica Fluorescência de Reflexão | que excede o ângulo crítico para criar onda Interna Total (TIRFM) evanescente que excita moléculas fluorescentes apenas em boa proximidade da interface de tampa de cobertura quimioluminescência ou química de tecido | Formação de imagens de | Transferência não emissora (escura) de | “” transferência de energia | estado excitado de uma molécula fluorescente | ressonante (doadora) para outra (receptora) em boa proximidade Formação de imagens de Formação da razão de imagens das rádio por excitação intensidades de emissão de fluorescência em diferentes comprimentos de onda de excitação .COMPLEMENTARY TISSUE FOR DETERMINATION OF PATHOLOGY Field Microscopy | Use of absorption and diffusion properties of shiny tissue or chemical / molecular markers f 49 Field Microscopy | Use of Index of Refraction and properties of dark (refraction) diffusion of tissue or chemical / molecular markers Fluorescence intensity | Use of fluorescence emission resolved by continuous wave | wavelength for formation of (microscopy of | fluorescence molecule image maps) intensity microscopy | Use of fluorescence emission resolved by non-linear fluorescence | wavelength for formation of multi-photon image maps of fluorescent molecules with two-photon absorption cross section Microscopy by | Use of excitation light in numerical aperture Reflection Fluorescence | that exceeds the critical angle to create an evanescent Total Internal Wave (TIRFM) that excites fluorescent molecules only in good proximity to the chemiluminescence or tissue chemistry cover interface | Formation of images of | Non-emitting (dark) transfer of | “” Energy transfer | excited state of a fluorescent molecule | resonant (donor) to another (recipient) in good proximity Formation of images of the formation of the ratio of radio images by excitation intensities of fluorescence emission at different excitation wavelengths.

Á 50Á 50

Formação de imagens de | Formação da razão de diferentes intensidades razão de emissão de emissão de fluorescência em um único comprimento de onda de excitaçãoFormation of images of | Formation of the ratio of different intensities emission ratio of fluorescence emission in a single excitation wavelength

Microscopia de polarização | Contraste de formação de imagens produzido por meio da polarização da atividade ótica de tecido ou sondaPolarization microscopy | Imaging contrast produced by polarizing the optical activity of tissue or probe

Microscopia de polarização | Contraste de formação de imagens produzida de birrefringência por atividades birrefringentes de cristais anisotrópicos na amostra |Polarization microscopy | Image formation contrast produced by birefringence by birefringent activities of anisotropic crystals in the sample |

Formação de imagens ao| Tempos de vida em estado excitado de longo de toda a vida de | formação de imagens resolvidas no tempo de fluorescência moléculas fluorescentesFormation of images to | Lifetime in an excited state over the entire life of | formation of time resolved images of fluorescence fluorescent molecules

Contraste de interferência Taxa de alteração de comutação de fases devido a mudanças no índice de refração em tecido preparadoInterference contrast Rate of change of phase switching due to changes in the refractive index in prepared tissue

Contraste de fases Amplitude de comutação de fases devido a mudanças no índice de refração em tecido preparadoPhase contrast Amplitude of phase switching due to changes in the refractive index in prepared tissue

Geração harmônica Dobro ou triplo de frequências de fonte deHarmonic generation Double or triple source frequency

" " a excitação por meio de organização molecular no tecido ou uso de sondas especializadas"" excitation through molecular organization in the tissue or use of specialized probes

Espectroscopia Raman de | Formação de imagens de mapa de espectro formação de imagens químico em que a difusão inelástica depende de estados moleculares de vibração e rotação de marcadores ou moléculas constitutivas i 51Raman spectroscopy | Formation of spectrum map images formation of chemical images in which inelastic diffusion depends on molecular states of vibration and rotation of markers or constitutive molecules i 51

Espectroscopia FTIR de|Formação de imagens de mapa de espectro formação de imagens químico no qual a absorção de ligações | químicas “orgânicas em marcadores ou | moléculas constitutivas fornece informações ! sobre a composição das amostrasFTIR spectroscopy of | Spectrum map imaging chemical imaging in which bond absorption | “organic chemicals in markers or | constitutive molecules provides information! on the composition of the samples

Espectrometria de massa | Formação de imagens de mapa de espectro de formação de imagens químico em que a composição química é determinada utilizando propriedades de massa e de carga de marcadores Ou moléculas constitutivasMass spectrometry | Formation of chemical imaging spectrum map images in which chemical composition is determined using mass and charge properties of markers or constitutive molecules

Formação de imagens de | Grau de formação de imagens de preservação anisotropia de polarização do estado e polarização ou grau de polarização de luz emitida, transmitida ou refletidaFormation of images of | Degree of formation of anisotropy preservation images of state polarization and polarization or degree of polarization of light emitted, transmitted or reflected

Reconstrução “ótica porjUso de marcadores fotocomutáveis ou fotoativação estocástica | cintlação — estocástica — para — determinar“Optical reconstruction by using photochangeable markers or stochastic photoactivation | scintillation - stochastic - to - determine

(PALM, STORM) estrutura, geralmente empregado em um contexto de fluorescência(PALM, STORM) structure, usually employed in a fluorescence context

VerberE . | Formação de imagens por | Uso de iluminação padronizada para resolver reconstrução da iluminação | detalhes, geralmente empregado em contexto estruturada de fluorescênciaVerberE. | Formation of images by | Use of standardized lighting to resolve lighting reconstruction | details, usually employed in a structured fluorescence context

Microscopia de exclusão| Uso de formação de máscaras óticas para por emissão estimulada permitir a desexcitição de moléculas fluorescentes para aumentar a resolução t 52 — n=- — a. — —— — — — ra —— ——— o an — — Microscopia 4Pi Uso de interferência entre diversos feixes de excitação para aumentar a resolução na geração de sinal de fluorescênciaExclusion microscopy | Use of optical mask formation for stimulated emission to allow the de-excitation of fluorescent molecules to increase the resolution t 52 - n = - - a. - —— - - - ra —— ——— an - - 4Pi Microscopy Use of interference between different excitation beams to increase resolution in fluorescence signal generation

Tomografia por coerência | Uso de luz de frequência em faixa ampla em ótica um método de tomografia interferométrica que identifica interfaces refletivas e de difusão através de um volume em escala microscópicaCoherence tomography | Use of wide-band frequency light in optics an interferometric tomography method that identifies reflective and diffusion interfaces through a microscopic-scale volume

Microscopia ótica de | Uso de uma sonda ótica em nanoescala física varrimento de campo | para limitar a excitação por meio de ondas próximo evanescentes de uma abertura abaixo da resolução varrida em boa proximidade da superfície de amostraOptical microscopy of | Use of an optical probe in a physical nanoscale field scan | to limit excitation by means of near-evanescent waves from an opening below the swept resolution in good proximity to the sample surface

Microscopia de força | Uso de uma sonda física em nanoescala para atômica varrer propriedades topográficas, mecânicas e eletromagnéticas na superfície da amostraForce microscopy | Use of a nanoscale physical probe for atomic sweeping topographic, mechanical and electromagnetic properties on the sample surface

Microscopia eletrônica de | Uso de um feixe de elétrons varrido para varrimento formar imagens da topografia da superfície e marcadores moleculares abaixo do limite de difração da luzElectron microscopy of | Use of a scanned electron beam to scan images of the surface topography and molecular markers below the diffraction limit of light

Microscopia eletrônica de | Uso de feixe eletrônico transmitido para formar transmissão imagens da ultraestrutura de tecidos e marcadores moleculares abaixo do limite de difração da luzElectron microscopy of | Use of transmitted electronic beam to transmit images of tissue ultrastructure and molecular markers below the light diffraction limit

. 53 p Nha p TABELA 4. 53 p Nha p TABLE 4

FASES PRINCIPAIS DE PREPARAÇÃO AUTOMÁTICA DE TECIDOS Imuno-histoquímica Hibridização in situ por | Hibridização in situ | (IHC) fluorescência de DNA | por fluorescência de (FISH) MRNA (mRNA-ISH) : Conservação de tecidos | Conservação de tecidos | Conservação de tecidosMAIN PHASES OF AUTOMATIC TISSUE PREPARATION Immunohistochemistry In situ hybridization by | In situ hybridization | (IHC) DNA fluorescence | fluorescence (FISH) MRNA (mRNA-ISH): Tissue conservation | Conservation of tissues | Conservation of tissues

2. Fase de |2. Fase pré- | 2. Fase pré- recuperação de | hibridização: garantia da | hibridização: garantia antígenos: garantia da | acessibilidade ao DNA da acessibilidade ao acessibilidade ao | alvo DNA alvo antígeno alvo2. | 2 phase. Pre- | 2. Pre-recovery phase of | hybridization: guarantee of | hybridization: guarantee of antigens: guarantee of | accessibility to DNA from accessibility to accessibility to | target DNA target antigen target

3. Fase de ligação de | 3. Fase de hibridização: | 3. Fase de anticorpos: identificação do DNA alvo | hibridização: identificação do | com sondas de DNA identificação do DNA antiggeno — alvo — com alvo com sondas de sondas de anticorpos DNA3. Connection phase of | 3. Hybridization phase: | 3. Antibody phase: target DNA identification | hybridization: identification of | with DNA probes identification of antigenic DNA - target - with target with probes of DNA antibody probes

4. Fase pós-ligação: | 4. Fase pós- | 4. Fase pós- remoção de marcação | hibridização: — remoção | hibridização: remoção de fundo não específica | de marcação de fundo de marcação de fundo : não específica não específica ' 5. Fase de detecção: | 5. Fase de detecção: |5. Fase de detecção: adição de marcadores | adição de marcadores de | adição de marcadores de visualização | visualização — geradores | de visualização geradores de contrato de contraste geradores de contraste sintonia final da | sintonia final da | sintonia final da4. Post-connection phase: | 4. Post- | 4. Post-removal marking phase | hybridization: - removal | hybridization: non-specific background removal | bottom marking bottom marking: nonspecific nonspecific '5. Detection phase: | 5. Detection phase: | 5. Detection phase: addition of markers | adding bookmarks | adding visualization markers | visualization - generators | visualization contrast contract generators contrast generators final tuning of | final tuning of | final tuning of

. 54 Imuno-histoquímica Hibridização in situ por | Hibridização in situ (IHC) fluorescência de DNA | por fluorescência de (FISH) MRNA (mRNA-ISH) ótica ótica qualidade ótica. 54 Immunohistochemistry In situ hybridization by | In situ hybridization (IHC) DNA fluorescence | (FISH) MRNA (mRNA-ISH) fluorescence optical optical optical quality

Utilizando essas modalidades de contraste, métodos de diagnóstico incluem o fornecimento de duas ou mais modalidades de contraste B a características de relevância no diagnóstico médico em tecido, em que as duas ou mais modalidades de contraste fornecem informações correlativas complementares e as duas ou mais modalidades fornecem informações | contextuais referentes à estrutura de nível de tecido, anatomia ou morfologia. | Tipicamente, imagens associadas às duas ou mais modalidades de contexto | são fornecidas de forma consistente com o treinamento médico e familiar para | os profissionais da medicina (tais como pseudo H&E). Essas imagens (antes, durante ou depois do fornecimento) podem ser registradas simultaneamente ou em série e colocadas em fluxo para fornecimento no visor, para permitir a visualização ao vivo do tecido para navegação.Using these contrast modalities, diagnostic methods include providing two or more B contrast modalities to relevant characteristics in medical tissue diagnosis, where the two or more contrast modalities provide complementary correlative information and the two or more modalities provide information | contextual references to tissue level structure, anatomy or morphology. | Typically, images associated with two or more context modalities | are provided in a manner consistent with medical and family training for | medical professionals (such as pseudo H&E). These images (before, during or after delivery) can be recorded simultaneously or in series and streamed to delivery on the display to allow live viewing of the fabric for navigation.

Em alguns exemplos, são utilizados dois ou mais trajetos de iluminação independentes.In some examples, two or more independent lighting paths are used.

Em outros exemplos, imagens de contraste de refração de campo escuro transmitidas são obtidas ou processadas simultaneamente com contraste de fluorescência de luz incidente.In other examples, transmitted dark field refraction contrast images are obtained or processed simultaneously with incident light fluorescence contrast.

Em algumas aplicações, contraste de refração de campo escuro é segmentado por meio da restrição do comprimento de onda de luz utilizado.In some applications, dark field refraction contrast is segmented by restricting the wavelength of light used.

Em outros exemplos, imagens de contraste de fluorescência de luz são utilizadas simultaneamente com contraste de campo escuro transmitido.In other examples, light fluorescence contrast images are used simultaneously with transmitted dark field contrast.

Em alguns exemplos, imagens de contraste complementares são fornecidas para observação direta em dois ou mais componentes coloridos através de oculares ou são dirigidas para um visor.In some examples, complementary contrast images are provided for direct observation on two or more colored components through eyepieces or are directed to a viewfinder.

Em alguns casos, é conveniente obter dois ou mais componentes de contraste complementares em obtenção isolada e registrar simultaneamente componentes complementares de diversos trajetos de iluminação em obtenção de espectro isolado.In some cases, it is convenient to obtain two or more complementary contrast components in isolated acquisition and simultaneously register complementary components from different lighting paths in obtaining isolated spectrum.

Em alguns exemplos, componentes complementares são registrados por meio de segmentação de comprimento de onda simultânea com divisão do trajeto ótico.In some examples, complementary components are registered through simultaneous wavelength segmentation with division of the optical path.

Em outros exemplos, são fornecidos componentes de contraste | complementares para fornecer um contexto de campo brilhante de corantes | histológicos, tipicamente com base em mapas coloridos gerados a partir da preferência do médico de lâminas de corantes absorventes da luz.In other examples, contrast components are provided | to provide a bright field context for dyes | histological, typically based on color maps generated from the physician's preference for light absorbing dye slides.

Em alguns | exemplos, mapas coloridos similares a eosina são utilizados para formação de imagens de refração de porções de proteína eosinofílicas.In some | For example, color maps similar to eosin are used to form refractive images of portions of eosinophilic protein.

Tipicamente, são aplicados mapas de coloração de eosina, seguidos por inversão de imagens.Typically, eosin staining maps are applied, followed by image inversion.

Além disso, pode-se utilizar mapa de coloração similar a hematoxilina para formação de imagens por DAPI de fluorescência de porções de ácido nucleico, seguido por inversão de imagens.In addition, hematoxylin-like staining maps can be used to form fluorescence DAPI images of portions of nucleic acid, followed by image inversion.

Estes e outros componentes de contraste complementares podem ser coloridos e incluídos no fluxo.These and other complementary contrast components can be colored and included in the flow.

Podem ser fornecidos mapas de coloração de eosina invertidos e mapas de coloração de hematoxilina invertidos e imagens combinadas são exibidas em um contexto de campo brilhante.Inverted eosin staining maps and inverted hematoxylin staining maps and combined images are displayed in a bright field context.

Localizações de sonda registradas no espaço e mapas químicos podem ser sobrepostos sobre contexto de campo brilhante estrutural e localizações de sonda podem receber cores para observação de localizações de sondas e mapas químicos sobre contexto de campo brilhante estrutural.Probe locations recorded in space and chemical maps can be overlaid over structural bright field context and probe locations can be colored for observation of probe locations and chemical maps over structural bright field context.

Modalidades de formação de imagens, tabelas de referência de cores, inversões e preparação de amostras podem ser configuradas para fornecer uma aparência de imagem selecionada com base em preferências do patologista.Imaging modalities, color reference tables, inversions and sample preparation can be configured to provide a selected image appearance based on the pathologist's preferences.

Protocolos de preparação de seções de tecidos físicos, óticos e químicos podem ser configurados de acordo com estratégia de formação de imagens de múltiplos modos.Protocols for the preparation of physical, optical and chemical tissue sections can be configured according to a multi-mode imaging strategy.

Diversas ampliações óticas podem ser utilizadas f 56 com os mesmos ambientes de iluminação por refração de campo escuro e pode-se utilizar contraste de imagens multimodal para fornecer contexto estrutural para formação de imagens espectrométricas de massa MALDI-TOF subsequente.Several optical magnifications can be used f 56 with the same lighting environments by dark field refraction and contrast of multimodal images can be used to provide structural context for the formation of subsequent MALDI-TOF mass spectrometric images.

O relatório descritivo acima e os exemplos nele contidos destinam-se a explicações convenientes e não devem ser considerados limitadores do escopo da tecnologia. Reivindicamos tudo o englobado pelas | reivindicações anexas.The above specification and the examples contained therein are for convenient explanations and should not be considered as limiting the scope of the technology. We claim everything covered by | attached claims.

Claims (15)

f 1 REIVINDICAÇÕESf 1 CLAIMS 1. MÉTODO, caracterizado pelo fato de que compreende: - geração de pelo menos uma primeira imagem e pelo menos uma segunda imagem de uma amostra (108), em que as primeira e segunda imagens geradas compreendem parâmetros de imagem de contraste complementares; e - produção de imagens formadoras de contraste para observação.1. METHOD, characterized by the fact that it comprises: - generation of at least a first image and at least a second image of a sample (108), in which the first and second images generated comprise complementary contrast image parameters; and - production of contrast-forming images for observation. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a obtenção de pelo menos uma primeira imagem e de pelo menos uma segunda imagem submetendo-se a amostra (108) à um primeiro feixe de estímulos (103) e a um segundo feixe de | estímulos (117), respectivamente. | 2. METHOD, according to claim 1, characterized by the fact that it additionally comprises obtaining at least a first image and at least a second image by subjecting the sample (108) to a first stimulus beam (103) and a second bundle of | stimuli (117), respectively. | 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado | | 15 —pelofatode que as primeira e segunda imagens são combinadas para produzir | uma imagem combinada. |METHOD, according to claim 2, characterized | | 15 - because the first and second images are combined to produce | a combined image. | 4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que os primeiro (103) e segundo (117) feixes de | estímulo são aplicados à amostra (108) simultaneamente e as imagens complementares de contraste associadas são obtidas simultaneamente. = ' METHOD, according to one of claims 2 or 3, characterized by the fact that the first (103) and second (117) bundles of | stimulus are applied to the sample (108) simultaneously and the associated complementary contrast images are obtained simultaneously. = ' 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a gravação das primeira e segunda imagens de contraste como imagens gravadas correspondentes.5. METHOD, according to claim 2, characterized by the fact that it additionally comprises the recording of the first and second contrast images as corresponding recorded images. 6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra (108) é corada por fluorescentes e o primeiro feixe (103) é selecionado para produzir fluorescência pelo corante fluorescente de tal forma que a primeira imagem é uma imagem de fluorescência da amostra (108) e, adicionalmente, em que o segundo feixe de á 2 estímulo (117) é aplicado à amostra (108) de tal forma que a segunda imagem seja uma imagem de campo escuro de refração.6. METHOD according to one of claims 2 to 5, characterized in that the sample (108) is stained with fluorescents and the first beam (103) is selected to produce fluorescence by the fluorescent dye in such a way that the first image it is a fluorescence image of the sample (108) and, in addition, in which the second beam of 1st stimulus (117) is applied to the sample (108) in such a way that the second image is a dark field image of refraction. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o registro da imagem de fluorescência e a imagem de campo escuro de refração como imagens registradas correspondentes. - 7. METHOD, according to claim 6, characterized by the fact that it additionally comprises the recording of the fluorescence image and the dark field image of refraction as corresponding recorded images. - 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: - aplicar um mapeamento de coloração à imagem de campo escuro gravada para produzir uma imagem de campo escuro pseudocolorida; e - combinar a imagem gravada em campo escuro pseudocolorido e a imagem de fluorescência registrada para produzir uma imagem gravada combinada.8. METHOD, according to claim 7, characterized by the fact that it additionally comprises: - applying a color mapping to the recorded dark field image to produce a pseudo-colored dark field image; and - combining the image recorded in the pseudo-colored field and the recorded fluorescence image to produce a combined recorded image. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofatode que o mapeamento de coloração é baseado em uma tabela de referência de coloração associada a pelo menos um corante de absorção.9. METHOD, according to claim 8, characterized by the fact that the staining mapping is based on a staining reference table associated with at least one absorption dye. 10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a aplicação de uma tabela de referência de coloração à imagem de fluorescência, em que a tabela de referência de coloração é associada a pelo menos um corante de absorção.10. METHOD, according to claim 8, characterized by the fact that it additionally comprises the application of a color reference table to the fluorescence image, in which the color reference table is associated with at least one absorption dye. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a produção de uma imagem registrada de campo pseudobrilhante com base na imagem de registro combinada.11. METHOD, according to claim 8, characterized by the fact that it additionally comprises the production of a pseudo-bright field recorded image based on the combined registration image. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a geração de uma imagem espectroscópica de massa da amostra (108).12. METHOD, according to claim 2, characterized by the fact that it additionally comprises the generation of a mass spectroscopic image of the sample (108). 13. — APARELHO DE FORMAÇÃO DE IMAGENS, caracterizado13. - IMAGE FORMATION EQUIPMENT, characterized A OEA A AA A AE A A A A O A E PRE ti ot jPACJjA PE ióÕõttso ERA RAL OO EE PITT AE A E , 3 pelo fato de que compreende: - um primeiro sistema de formação de imagens configurado para produzir uma primeira imagem de uma amostra (108); e - um segundo sistema de formação de imagens configurado para produzir uma segunda imagem da amostra (108), em que as primeira e i segunda imagens são imagens complementares. : 14. MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR, caracterizado pelo | fato de que compreende instruções executáveis por computador (130, 1620) para: - receber uma primeira imagem e uma segunda imagem complementares associadas à parte comum de uma seção de amostra (108); e - combinar as primeira e segunda imagens para produzir uma imagem combinada.THE OAS A AA A AE A A A A O A E PRE ti ot jPACJjA PE iÓÕõttso ERA RAL OO EE PITT AE A E, 3 because it comprises: - a first image formation system configured to produce a first image of a sample (108); and - a second imaging system configured to produce a second image of the sample (108), wherein the first and second images are complementary images. : 14. LEGIBLE MEDIA BY COMPUTER, characterized by | fact that it comprises instructions executable by computer (130, 1620) to: - receive a first image and a second complementary image associated with the common part of a sample section (108); and - combining the first and second images to produce a combined image. 15. — PROCESSADOR DE IMAGENS, caracterizado pelo fato de que compreende: - entradas de imagens configuradas para receber pelo menos uma primeira imagem e uma segunda imagem complementar; - uma entrada de tabela de referência de cores configurada para receber pelo menos uma tabela de referência de cores; - um combinador de imagens configurado para processar pelo menos uma dentre a primeira imagem e a segunda imagem complementar com base na pelo menos uma tabela de referência de cores e produzir uma imagem pseudocolorida e para combinar a imagem pseudocolorida com uma dentre a primeira imagem e a segunda imagem.15. - IMAGE PROCESSOR, characterized by the fact that it comprises: - image inputs configured to receive at least a first image and a second complementary image; - a color reference table entry configured to receive at least one color reference table; - an image combiner configured to process at least one of the first image and the second complementary image based on at least one color reference table and produce a pseudo-colored image and to combine the pseudo-colored image with one of the first image and the second image. : 1/19 130 / 100 156 Câmera CCD 112 == i 110 le 154 ! == i ” 152 12119 o3 i- 1 104 Fonte de Frsontfesannnnnnn2-D — ! d+ fluorescência NX. destes 105 de = I 113 106 102 132 117 108 118 116 117 Fig. 1 o: 1/19 130/100 156 CCD Camera 112 == i 110 le 154! == i ”152 12119 o3 i- 1 104 Source of Frsontfesannnnnnn2-D -! d + NX fluorescence. of these 105 de = I 113 106 102 132 117 108 118 116 117 Fig. 1 FONTESOURCE DE LUZ o 2/19OF LIGHT 2/19 DBTER IMAGEM DHDBTER IMAGE DH CAMPO ESCURO DE REFRAÇÃO 202DARK REFRACTION FIELD 202 OBTER IMAGENS FLUORESCENTES 204GET FLUORESCENT IMAGES 204 APLICARTO APPLY TABELA DE REFERÊNCIA 206REFERENCE TABLE 206 DE CORBY HEART SOBREPOR 208OVERLAP 208 INVERTER 210INVERTER 210 SOBREPOR 212 " Fig. 2OVERLAY 212 "Fig. 2 EXIBIR 214VIEW 214 : 3/19 | OBTENÇÃO DE CAMPO 302 304 OBTENÇÃO DE DAP!: 3/19 | GETTING FIELD 302 304 GETTING DAP! ESCURO 308 CONVERSÃO DE 306 312DARK 308 CONVERSION OF 306 312 COMBINAR Fig. 3 9 314COMBINE Fig. 3 9 314 FS NA 4/19FS NA 4/19 PESAINIANAE À, A SS UANESNLTA CNASPESAINIANAE À, SS UANESNLTA CNAS RITA PAUTA Pra A a Rc SA AS A o A CO AO: óRITA PAUTA Pra A a Rc SA AS A o A CO AO: ó CN EE ae a a O RL dO am NE SR Ao a AR SS A A NA Di Na No RACN EE a a a O RL dO am NE SR A AR SS A A NA Di Na No RA DN A SE AE - E a NE a a A ma a AE ão a A LEE . | o a NO e NDA A Soo AS A a A Do o a o E RR eDN A SE AE - AND NE a A A ma AE a A LEE. | o a NO and NDA A Soo AS A a A Do o a o E RR and RR A CAD E a o unRR CAD AND UN DR E TN RR E CBN o CNN oo Se & Bo — o EDR E TN RR E CBN o CNN oo Se & Bo - o E RN CE RE O CO NO e DN A aRN CE RE O CO NO and DN A a AP o aAP o a O EN SN NNEEN SN NNE A MNEThe MNE S NS A OAS NS A OA NS A RBNS A RB E E A CN sda a EZ| O A : et AS Ko) Po A ic st a o o ao SN EO CORA PIA 1 NO ES : A NS NOS.E E CN sda EZ | O A: et AS Ko) Po A ic st o o o SN EO CORA PIA 1 NO ES: A NS NOS. A E NONE, A eo O ES SIS A A ia AN a NATAS. | ee A A ES RN E Sa SEE E Na ES AS A CESAR NA SA ANN RA amb TA CER RD E A om EE e aa Ea ae O ES . EAR A DS a E So CN PA RAN [) E ACTO O Ca DANA à OE Mo DA NADA e A E Pa a ES A a e É q A RA O SS RE O ces O PRN SEARA SS RERE E AS NO a BO oa E. e EA O SS SENSE SS NS E RES S . : O E.E NONE, A and O ES SIS A A ia AN a NATAS. | ee A A ES RN AND SA SEE AND ES ES A CESAR AT SA ANN RA amb TA CER RD E A EE and aa Ea a ES. EAR A DS A E SO CN PA RAN [) AND ACTION CA DANA TO OE MO DA NADA and AE Pa a ES A ae E A RA O SS RE O ces PRN SEARA SS RERE AND AS NO a BO oa E. and EA O SS SENSE SS NS E RES S. : E. DSO Se É “E.DSO If it is “E. DE AA E | E = SEE ss ENA AN E o: E "ES RAE BIA SS A E ENE | A e NO e | Ro RS > de e . A & | FER CS AA o Na E 8 é S PES EEE A SRA * o 8 SS . EOAA E | E = SEE ss ENA AN E o: E "ES RAE BIA SS AE ENE | A and NO e | Ro RS> de e. A & | FER CS AA o Na E 8 is S PES EEE SRA * o 8 SS. IT'S THE : + a E rum. 6/19 , AS E Se —— : - a TNIN su NAO eo ce AN MIA CNT. a a NA NS de No DT PA o a É a do "ep 1 TA o E ie DD E det DE a A Ras a o e | A a o o AA SS de De o e Aa A Edo a DM no o a ea A o . MA AN E) a o PR a ko q A Pé o o mo» O MN o Eco e e SN DN o So RS e a ES 3 ao Le SS Mo e e Lato DN a TR Nm A o o =" e / EM . o ao SA TT ——. ff a o mo o O DR So me ne o a 2 OS RO e No "Ras o Sa E SS o SS A E me o SS No Mo AR o FS No o o o No e Do NE o NL o a A mo e Do a SS e a a O ANS CNN SS US E & RA DN o - O AN O ao Sa A VR SN a Ee A E US EE o. AN o A A CS QE NO o. E e o — a A Tomo — a SS e A o: + to E rum. 6/19, AS AND IF ——: - TNIN su NAO and ce AN MIA CNT. aa NA NS de No DT PA oa It is the "ep 1 TA o E ie DD E det DE a A Ras aoe | A aoo AA SS de De oe Aa A Edo a DM no oa and A o. MA AN E) ao PR a ko q A Pé oo mo »O MN o Eco e and SN DN o So RS and ES 3 to Le SS Mo ee Lato DN a TR Nm A oo =" e / EM. o to SA TT ——. ff ao mo O DR So me ne oa 2 OS RO e No "Ras o Sa E SS o SS AE me o SS No Mo AR o FS No ooo No e Do NE o NL o A mo e Do a SS eaa ANS CNN SS US E & RA DN o - O AN O to Sa A VR SN a Ee AE US EE o AN o AA CS QE NO o E and o - a A Tomo - a SS and A o Í ES AO Se o a e + o A O o 40% — . Ee seno EA SANS E AS F DOR es ato PA SS : Fig. 6 a NOIf the a e + o A O o 40% -. Ee sine EA SANS AND F PAIN s act PA SS: Fig. 6 to NO SSSS E E A EE AND A E E A E O a e a Pe EA AR e a BA o SE a SRS a O EA ÃOE A E O a e Pe EA AR and BA o SE a SRS a O EA ÃO EA A RA EA E A a a | o o a A - A A O FT. TERA 1: O [oa ST NA O E RENNES Lo) ENO Te) E NR o ZA E aa REA E fe, DA ANA E OS to SRA A ATE SAO NESSA AMD, x SE CO de ata ao LO Ad (To) EE QUA Er DA [GA S o : & RSS SE SS ANS SS des SA ASSEA A RA EA AND A a a | o o a A - A A O FT. TERA 1: O [oa ST NA OE RENNES Lo) ENO Te) E NR o ZA E REA E fe, DA ANA AND OS TO SRA A ATE ARE IN THIS AMD, x SE CO de minutes to LO Ad (To) EE QUA Er DA [GA S o: & RSS IF SS ANS SS des SA ASS PRC SA NASA ECA SS SS SNS AS E A o BS DR A A A AESA e RA a E A E a ER oe E A E A A EO —— o E BD A o a a E e aà . SS) NE Ro EA a RD Ro a RE ROPRC SA NASA ECA SS SS SNS AS E A o BS DR A A AESA and RA a E A E ER E and E A E A A EO —— o E BD A o a E and a. 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Ex / 906. 910 / S N br Y 1 N7 (amarelo) Á 1 2d Fr ' H 2 Ns / ' tv 904 j 1 : o roboeno e. (verde) | x (vermelho) | À 27 1 j 1 À O 1 Í 1 X PP. ; j eo NO i 914 / Êo É N ! / (azul) . 915 í , É DS ' Pá Dn LA KR L=0 i (preto) 1A * —L = 100: 900; (white) Fig. 9 o! Ex / 906. 910 / S N br Y 1 N7 (yellow) Á 1 2d Fr 'H 2 Ns /' tv 904 j 1: roboeno e. (green) | x (red) | À 27 1 j 1 À O 1 Í 1 X PP. ; j eo NO i 914 / Êo É N! / (blue) . 915 í, É DS 'Pá Dn LA KR L = 0 i (black) 1 —E a e: y e - ae qe - EE a—And a e: y e - ae qe - EE a DNA Re A O ASS o P NAO : MO A e Aa EM RA. -DNA Re A O ASS o P NAO: MO A and Aa IN RA. - SP SRS RE Ss Pa ESP SRS RE Ss Pa E NA E A A A CAE E ES s AB 2 Ra ONA E A A CAE AND ES s AB 2 Ra O MR NAMR NA . 11/19 1112A 1112B Computador NX I / : 1114 > ata png) !. 11/19 1112A 1112B Computer NX I /: 1114> ata png)! A W. CA — 1 110 1118A W. 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I pTPPIPIPM A TATADCCCOo, à | I ; é BIOS ii ! A ; 1624 : 1626 ; j | ' Lescancaned | ! 1620 Lecce! ! = == o o a es is ta Po io o o o o o o o uz [o o [one [a |SA SS A ES ERAS f 16/19 2 Ro TTOT The mmommn memo mor mm memo teen mes mr mem honey mimo me but half eme mms ee ee E Fig. 16 pr ES ES memeemee ———— | Connection (s) | l communication 1650 l | | | | l Input device (s) | | 1640 | Unit (s) of! processing ! | | | | | 1630 storage | ! 1623! | | ! PIOTSANE O Memory! ! RANA 1622! ! 1..2828 ..:! I pTPPIPIPM A TATADCCCOo, à | I; it's BIOS ii! THE ; 1624: 1626; j | 'Lescancaned | ! 1620 Lecce! ! = == o o a es is ta Po io o o o o o o o uz [o o [one [a | A . EA 17/19THE . EA 17/19 DA IEA - ADO OO Do DE a É. “o o O a e "AE. . a o Na E o o A DS SE St am a a a a o DE netoOF IEA - ADO OO Do DE a É. “O o O a e" AE.. O o Na E o o A DS SE St am a a a o DE grandchild EN NA A e AEPDT a To DA O Ro O WS o A o .. Lee lie DD — a A EN A E E o a o e A NU a o A o a RA PA A A e a no Po o a o feet 1 fo NA O o e E o | E CN o RN A o E o O o O Ã. A o o o AEN NA A and AEPDT a To DA O Ro O WS o A o .. Lee lie DD - a A EN A E E o a o e A NU a o o o a RA PA A A e a Po o a o feet 1 fo NA O o and E | E CN o RN A o E o O o O Ã. A o o o A A Cmt Fig. 17 bp : e a a e e A DR o ON So o E PtaA Cmt Fig. 17 bp: a a e e A DR o ON So o E Pta RS NA SA O Po NO RO MOO SO ONA : PTI A cao AMA A mao o WON Ad A E o Roo A NO AA NE fã CON NO A A A O NA SN A OD A a A — nt E ta a a aa | FR see O O NO a RAE O LAN E NO a EA to Da Rr AOS Pe RA a E * e RAN CAN NAN ES PN NA e bo DA ER A a deaças o As a a SN A O RR O NS S NAO as a AA Sa So PA E NR o AARS NA SA PO NO RO ROO MOO SO ONA: PTI A CAO LOO HAND WON Ad A E Roo A NO AA NE fan CON NO A A A O NA SN A OD A A - nt E ta a aa | FR see OO NO A RAE O LAN E NO EA EA Da Da Rr AOS Pe RA a E * e RAN CAN NAN ES PN NA and bo DA ER A d a d a es o aa aa ao ao rs o NS S na as aa AA Sa So PA AND NR AA PN NA EN OE NA O | ENE: NS SR o APN NA EN O AND NA O | ENE: NS SR o A O AA PAO Ea RN NS A OAA PAO Ea RN NS A O CARS RS CEA MESA SN CNN Es A A O ES CNN do e me SN A Ã. o NE ANO E A a ECARS RS CEA MESA SN CNN Es A A ES ES CNN do and me SN A Ã. the NE YEAR E A to E RAR SN RN NA RE MN ESCIARAO O A A NS NANA o DO A o ta a, e Gisaue Ee EA A a NE A “o E e ap e PD a Do Fig. 18RAR SN RN IN RE MN ESCIARAO A A NS NS NANA O DO A TA, and Gisaue Ee EA A a NE A “o E and ap and PD a Do Fig. 18 . Ao - Tome o : e 1919. Ao - Take the: e 1919 ES ANO ANN ACANS — ES No CANNA: WU e. E a E LT . SA NA A A O e CNN : E . LE eo a a Se o RS ASAS SN AA Ao ANA o o DA ee E PT AS a Ab AA o RA EA oo NS. MEN RS SS ces Re RA RD DR E NA: 1 NA en a SS É NL DE AA MNA DAES ANO ANN ACANS - ES No CANNA: WU e. And E LT. SA NA A A O and CNN: E. LE eo a a If RS ASAS SN AA Ao ANA o DA ee E PT AS a Ab AA o RA EA oo NS. MEN RS SS ces Re RA RD DR E NA: 1 NA en SS SS NL DE AA MNA DA ANN A CNN EN PO SN o MN po seo a es O o Na BA o gu dO RA A MO O A DN a o A A o E SE O valo ME E | es —. a No O OS ESSEANN A CNN EN PO SN o MN po seo a es O o Na BA gu guo RA A MO O A DN a o A O E IF THE MEAN VALUE E | es -. a No o os esSE ENA A DOCA AN "e a ao A to 2 ee A PR e MA E A A E a a E NA So o Ds Ras AR ANE PECA NAN ANE a a ON AA de a E A e AS Rr tas a ES SAN NE A o "o MS PAS OC E a e TR Ps a AS SE Ro AN 2 E O NA — E a ANN Lee Ao ON EVAENA A DOCA AN "and A to 2 ee A PR and MA EAAE aa E NA So Ds Ras AR ANE PECA NAN ANE aa ON AA of a E A and AS Routes to ES SAN NE A o" MS MS OC E ae TR Ps a AS Ro AN 2 E NA - E ANN Lee Ao ON EVA MN ESA CA E SO A Ma o a A i eo CA O A po Wo SS NL SA e a e o no DA o ae o O No E a Lao O MN S&S ( 12. es RS ca “o AO e, Pag A S sao E NAO | Mo aU NAN Pao Na o a De ANN Wo AOS Do AÇO O ÁS LONEOS EA 2 MM DR MA " ui AAA Mr a | Fig. 19MN ESA CA E SO A Ma oa A i and CA OA po Wo SS NL SA eaeo no DA o ae o No E a Lao MN S&S (12. es RS ca “o AO e, Pag AS sao E NAO | Mo aU NAN Pao Na ANA Wo Ao DO STEEL o Á LONEOS EA 2 MM DR MA "ui AAA Mr a | Fig. 19 " 1 teme ba Mao : , Mr er o se a ças - Resumo “MÉTODO, APARELHO DE FORMAÇÃO DE IMAGENS, MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR E PROCESSADOR DE IMAGENS” A presente invenção refere-se a métodos de fornecimento de contraste em seções de tecido para a determinação de patologias."1 fears ba Mao:, Mr er o se a ças - Abstract" METHOD, IMAGE FORMATING EQUIPMENT, COMPUTER-READABLE MEDIA AND IMAGE PROCESSOR "The present invention relates to methods of providing contrast in sections of fabric for the determination of pathologies. O método compreende as etapas de geração de pelo menos uma primeira imagem e pelo menos uma segunda imagem de uma amostra (108), em que as primeira e segunda imagens geradas compreendem parâmetros de imagem de contraste complementares; e produção de imagens formadoras de contraste para | 10 observação.The method comprises the steps of generating at least a first image and at least a second image of a sample (108), wherein the first and second images generated comprise complementary contrast image parameters; and production of contrast-forming images for | 10 observation.