BR102022005191A2 - PORTABLE MICROBIOLOGICAL CONTAMINANT MONITORING SYSTEM FOR BEVERAGE AND BIOTECHNOLOGY INDUSTRIES USING AN ELECTROCHEMICAL IMMUNE ASSAY - Google Patents

Abstract

sistema portátil de monitoramento de contaminantes microbiológicos para indústrias de bebidas e biotecnologia usando um imunoensaio eletroquímico. sistema portátil composto por imunoensaio eletroquímico capaz de proporcionar maior acessibilidade à detecção e quantificação de contaminantes encontrados em indústrias de bebidas e biotecnologia. o imunoensaio pode ser aplicado para a detecção e/ou quantificação de bactérias ácido lácticas, para avaliação de possível contaminação durante bioprocessos. propondo versatilidade do método de avaliação da invenção, que pode se estender a praticamente diversos tipos de microrganismos, como: bactérias gram positivas e gram negativas e leveduras. o sistema desenvolvido apresenta uma detecção sensível e específica para várias moléculas alvo por vez, havendo apenas a necessidade de aderir outras proteínas na superfície da partícula magnética. um tempo de análise com tempo total de até 6 horas, o que permitirá uma detecção precoce de microrganismos deteriorantes e um planejamento de ações de combate efetivo. partículas magnéticas utilizadas para o ancoramento de biomoléculas para determinados contaminantes permite a eliminação de interferentes, maior possibilidade de captura do microorganismo e seletividade para o sistema para o potencial contaminante. o sistema possui custo reduzido por análise, e apresenta portabilidade do leitor eletroquímico quando comparado com os dispositivos existentes no mercado, que pode ser um indicativo de acessibilidade para o sistema desenvolvido. a praticabilidade na condução das análises, requerer operadores minimamente treinados para alcançar resultados confiáveis.portable microbiological contaminant monitoring system for beverage and biotechnology industries using an electrochemical immunoassay. portable system composed of an electrochemical immunoassay capable of providing greater accessibility to the detection and quantification of contaminants found in the beverage and biotechnology industries. the immunoassay can be applied for the detection and/or quantification of lactic acid bacteria, to evaluate possible contamination during bioprocesses. proposing versatility of the invention evaluation method, which can be extended to practically different types of microorganisms, such as: gram positive and gram negative bacteria and yeasts. The developed system presents sensitive and specific detection for several target molecules at a time, with only the need to adhere other proteins to the surface of the magnetic particle. a total analysis time of up to 6 hours, which will allow early detection of spoilage microorganisms and planning of effective combat actions. Magnetic particles used to anchor biomolecules to certain contaminants allow the elimination of interferents, greater possibility of microorganism capture and selectivity for the system for contaminant potential. the system has a reduced cost per analysis, and presents portability of the electrochemical reader when compared to existing devices on the market, which may be an indication of accessibility for the developed system. practicality in conducting analyzes requires minimally trained operators to achieve reliable results.

Description

CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION

[0001] A presente invenção é voltada ao campo técnico de monitoramento de contaminantes. Mais especificamente um processo para produzir um imunoensaio eletroquímico, bem como a um método de detecção, quantificação e avaliação de microrganismos em geral através do sensor eletroquímico obtido, capaz de detectar um alvo específico dentro de uma amostra, o que é possível a partir do uso de um bioconjugado (B) - composto formado por partículas com propriedades magnéticas sintetizadas ou comerciais, e proteínas, como anticorpos, peptídeos ou antígenos, para realizar a referida avaliação. A invenção pode ser aplicada na avaliação de microrganismos presentes em amostras complexas nas indústrias que necessitam de um controle microbiológico como indústrias de alimentos, bebidas e biotecnologia, dentre outros campos de aplicação. Por exemplo, o imunoensaio pode ser aplicado para a detecção e/ou quantificação de bactérias ácido lácticas, para avaliação de possível contaminação durante bioprocessos. Porém, se destaca a versatilidade do método de avaliação da invenção, que pode se estender a praticamente diversos tipos de microrganismos, como: bactérias gram positivas e gram negativas e leveduras.[0001] The present invention is aimed at the technical field of contaminant monitoring. More specifically a process for producing an electrochemical immunoassay, as well as a method of detection, quantification and evaluation of microorganisms in general through the electrochemical sensor obtained, capable of detecting a specific target within a sample, which is possible through the use of a bioconjugate (B) - compound formed by particles with synthesized or commercial magnetic properties, and proteins, such as antibodies, peptides or antigens, to carry out the aforementioned evaluation. The invention can be applied to the evaluation of microorganisms present in complex samples in industries that require microbiological control such as food, beverage and biotechnology industries, among other fields of application. For example, the immunoassay can be applied for the detection and/or quantification of lactic acid bacteria, to evaluate possible contamination during bioprocesses. However, the versatility of the invention's evaluation method stands out, which can be extended to practically different types of microorganisms, such as: gram positive and gram negative bacteria and yeasts.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOBASICS OF THE INVENTION

[0002] A produção e qualidade de muitos produtos dentro das indústrias de alimentos e bebidas estão diretamente ligados à presença ou ausência de microrganismos, na qual a sua quantidade poderá influenciar nos métodos de conservação e qualidade do alimento. Nas indústrias de bebidas e alimentos voltadas para a qualidade, o risco de deterioração bacteriana é a sua principal preocupação, uma vez que gera grandes perdas econômicas e impacta negativamente a imagem da marca [Dragone G. et al.; Review: Beer production- Spoilage microorganisms and detection methods; 2008; Pinto U. M. et al.; Deterioração microbiana dos alimentos; 2019]. Deste modo, a utilização de métodos de detecção de microrganismos nesses produtos é uma ferramenta comumente utilizada para garantir sua segurança microbiológica.[0002] The production and quality of many products within the food and beverage industries are directly linked to the presence or absence of microorganisms, whose quantity may influence the preservation methods and quality of the food. In the quality-oriented food and beverage industries, the risk of bacterial spoilage is their main concern, as it generates large economic losses and negatively impacts brand image [Dragone G. et al.; Review: Beer production- Spoilage microorganisms and detection methods; 2008; Pinto U. M. et al.; Microbial spoilage of food; 2019]. Therefore, the use of microorganism detection methods in these products is a commonly used tool to guarantee their microbiological safety.

[0003] Atualmente, o método de plaqueamento é um dos mais utilizados para realizar a avaliação quantitativa do crescimento de microrganismos e, assim, verificar a esterilidade do produto final. Para este procedimento, a quantificação microbiana é feita pela inoculação de um volume conhecido (podendo esse volume ser diluído) em meio de cultura específico, com posterior incubação e contagem das colônias formadas, no qual o resultado é expresso em unidades formadoras de colônia (UFC mL-1) [Priest F.G. et al.; Brewing microbiology; 2003]. Dentre as desvantagens inerentes a esse método, tem-se a necessidade de longos tempos de análise para obter resultados confiáveis e conclusivos, podendo levar até 5 dias. Além da demora do método, a falta de especificidade e de sensibilidade na obtenção dos resultados fazem com que lotes dos produtos sejam recolhidos do mercado e consequentemente perdidos, causando grandes prejuízos econômicos à empresa [Dragone G. et al.; Review: Beer productionSpoilage microorganisms and detection methods; 2008].[0003] Currently, the plating method is one of the most used to carry out the quantitative assessment of the growth of microorganisms and, thus, verify the sterility of the final product. For this procedure, microbial quantification is carried out by inoculating a known volume (which volume can be diluted) in a specific culture medium, with subsequent incubation and counting of the colonies formed, in which the result is expressed in colony forming units (CFU mL-1) [Priest F.G. et al.; Brewing microbiology; 2003]. Among the disadvantages inherent to this method, there is the need for long analysis times to obtain reliable and conclusive results, which can take up to 5 days. In addition to the delay in the method, the lack of specificity and sensitivity in obtaining results means that batches of products are recalled from the market and consequently lost, causing great economic losses to the company [Dragone G. et al.; Review: Beer production Spoilage microorganisms and detection methods; 2008].

[0004] A reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) também tem demonstrado ser um método molecular bastante promissor para a detecção de microrganismos em alimentos e bebidas [Settanni L. et al, The use of multiplex PCR to detect and differentiate food- and beverage- associated microorganisms: A review; 2007]. Alguns autores têm relatado o uso do PCR para detectar e identificar bactérias ácido-lácticas (BAL) que deterioram a cerveja, utilizando os genes de resistência ao lúpulo, horA e horC, como marcadores genéticos [Haakensen M. C. et al.; horA-Specific Real-Time PCR for Detection of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria; 2018; Asano S. et al. PCR Analysis Methods for Detection and Identification of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria; 2019]. De modo geral, algumas desvantagens também estão associadas a este método, tais como, necessidade de infraestrutura e analistas especializados, são dispendiosos e, muitas das vezes não são portáteis, o que pode afetar no monitoramento dos microrganismos em campo.[0004] The polymerase chain reaction (PCR) has also demonstrated to be a very promising molecular method for detecting microorganisms in food and beverages [Settanni L. et al, The use of multiplex PCR to detect and food differentiate- and beverage- associated microorganisms: A review; 2007]. Some authors have reported the use of PCR to detect and identify lactic acid bacteria (LAB) that spoil beer, using the hop resistance genes, horA and horC, as genetic markers [Haakensen M. C. et al.; horA-Specific Real-Time PCR for Detection of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria; 2018; Asano S. et al. PCR Analysis Methods for Detection and Identification of Beer-Spoilage Lactic Acid Bacteria; 2019]. In general, some disadvantages are also associated with this method, such as the need for infrastructure and specialized analysts, they are expensive and, in many cases, they are not portable, which can affect the monitoring of microorganisms in the field.

[0005] A crescente necessidade de métodos rápidos, com uma boa especificidade, facilidade de fabricação em grande escala, baixo custo e aplicabilidade no monitoramento na área clínica, industrial e ambiental, faz com que mais atenção esteja voltada ao desenvolvimento de bioensaios e biossensores [Thakur M. S.; Biosensors in food processing; 2013]. O uso dessas estratégias e dispositivos analíticos vêm ganhando destaque, pois além de atenderem a esses requisitos, são poderosas ferramentas para o controle de microrganismos, principalmente os acoplados às tecnícas eletroquímicas [Ivnitski D. et al.; Application of electrochemical biosensors for detection of food pathogenic bacteria; 2000].[0005] The growing need for fast methods, with good specificity, ease of large-scale manufacturing, low cost and applicability in monitoring in the clinical, industrial and environmental areas, means that more attention is focused on the development of bioassays and biosensors [0005] Thakur M.S.; Biosensors in food processing; 2013]. The use of these analytical strategies and devices has been gaining prominence, as in addition to meeting these requirements, they are powerful tools for controlling microorganisms, especially those coupled to electrochemical techniques [Ivnitski D. et al.; Application of electrochemical biosensors for detection of food pathogenic bacteria; 2000].

[0006] Uma classe de ensaios biológicos bastante estudada devido sua especificidade são os imunoensaios e imunossensores, na qual sua detecção é baseada na reação de interação antígeno-anticorpo [Moina C. et al.; Fundamentals and Applications of Immunosensors Advances in Immunoassay Technology; 2012]. O monitoramento desta reação pode ocorrer a partir da simples detecção direta dessa interação (label-free) ou do uso de um marcador adicional. A utilização desta última estratégia traz como principal vantagem sua alta sensibilidade, parâmetro fundamental na busca por métodos para identificação e rastreamento, com precisão, de fontes específicas de contaminação na indústria [Pei X. et al.; Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review; 2013].[0006] A class of biological assays widely studied due to their specificity are immunoassays and immunosensors, in which their detection is based on the antigen-antibody interaction reaction [Moina C. et al.; Fundamentals and Applications of Immunosensors Advances in Immunoassay Technology; 2012]. Monitoring this reaction can occur through the simple direct detection of this interaction (label-free) or the use of an additional marker. The use of this last strategy has the main advantage of its high sensitivity, a fundamental parameter in the search for methods for accurately identifying and tracking specific sources of contamination in industry [Pei X. et al.; Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review; 2013].

[0007] Comumente, enzimas, moléculas fluorescentes ou radioativas, complexos metálicos, nanopartículas metálicas e outras moléculas eletroativas podem ser utilizadas como marcadores eletroquímicos [Pei X. et al.; Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review; 2013]. Trabalhos têm relatado o acoplamento de moléculas redox simples, como o azul de metileno (AM), a estes ensaios eletroquímicos [Cash K. J. et al.; An electrochemical sensor for the detection of protein-small molecule interactions directly in serum and other complex matrices; 2009; Mao K. et al.; Label-free electrochemical immunosensor based on graphene/methylene blue nanocomposite; 2012].[0007] Commonly, enzymes, fluorescent or radioactive molecules, metal complexes, metal nanoparticles and other electroactive molecules can be used as electrochemical markers [Pei X. et al.; Sandwich-type immunosensors and immunoassays exploiting nanostructure labels: A review; 2013]. Studies have reported the coupling of simple redox molecules, such as methylene blue (AM), to these electrochemical tests [Cash K. J. et al.; An electrochemical sensor for the detection of protein-small molecule interactions directly in serum and other complex matrices; 2009; Mao K. et al.; Label-free electrochemical immunosensor based on graphene/methylene blue nanocomposite; 2012].

[0008] O AM em uma amostra contendo microrganismos é reduzido à forma leuco ou incolor do corante na superfície celular via enzimas redutase presente na membrana celular. Esta forma incolor de azul de metileno não é carregado, é lipofílico e entra nas células por difusão através da membrana plasmática onde é reoxidado e, portanto, sequestrado dentro das células [MAY J. M. et al.; eneration of oxidant stress in cultured endothelial cells by methylene blue: Protective effects of glucose and ascorbic acid; 2003]. Se o oxigênio está disponível, o AM reduzido pode ser oxidado pelo sistema de transporte de elétrons mitocondrial. Este fenômeno resulta no reaparecimento da cor azul.[0008] AM in a sample containing microorganisms is reduced to the leuco or colorless form of the dye on the cell surface via reductase enzymes present in the cell membrane. This colorless form of methylene blue is uncharged, lipophilic and enters cells by diffusion across the plasma membrane where it is reoxidized and therefore sequestered within cells [MAY J. M. et al.; eneration of oxidant stress in cultured endothelial cells by methylene blue: Protective effects of glucose and ascorbic acid; 2003]. If oxygen is available, reduced AM can be oxidized by the mitochondrial electron transport system. This phenomenon results in the reappearance of the blue color.

[0009] Embora não se conheça exatamente o mecanismo de redução do corante, alguns relatórios disponíveis na literatura sugerem que o AM é reduzido por redutases transmembranares [Merkerr M. P. et al.; Pulmonary endothelial thiazine uptake: separation of cell surface reduction from intracellular reoxidation; 1997]. Este mecanismo é aplicado para avaliar o efeito microbiano de carregar em um meio líquido. O menor tempo necessário para o desaparecimento da cor azul é indicativo de uma carga microbiana mais alta. Sendo assim, assume-se que, quanto maior o número de microrganismos, maior a demanda de oxigênio e menor a concentração de oxigênio no meio, resultando no desaparecimento mais rápido da cor azul [Bapat, P. et al. Quantification of metabolically active biomass using methylene blue dye reduction test (MBRT): measurement of CFU in about 200 s; 2006].[0009] Although the exact mechanism of dye reduction is not known, some reports available in the literature suggest that AM is reduced by transmembrane reductases [Merkerr M. P. et al.; Pulmonary endothelial thiazine uptake: separation of cell surface reduction from intracellular reoxidation; 1997]. This mechanism is applied to evaluate the microbial effect of loading in a liquid medium. The shorter time required for the blue color to disappear is indicative of a higher microbial load. Therefore, it is assumed that the greater the number of microorganisms, the greater the oxygen demand and the lower the oxygen concentration in the medium, resulting in the faster disappearance of the blue color [Bapat, P. et al. Quantification of metabolically active biomass using methylene blue dye reduction test (MBRT): measurement of CFU in about 200 s; 2006].

[0010] Nesta conjuntura, a utilização de imunoensaios eletroquímicos para a determinação e monitoramento de microrganismos na indústria de alimentos, bebidas e biotecnologia utilizando AM se mostra bastante viável e vantajosa em comparação às técnicas utilizadas atualmente.[0010] At this juncture, the use of electrochemical immunoassays for the determination and monitoring of microorganisms in the food, beverage and biotechnology industry using AM appears to be quite viable and advantageous in comparison to the techniques currently used.

ESTADO DA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE

[0011] Biossensores são dispositivos analíticos compostos por uma camada de biorreconhecimento (onde ocorre a interação com a molécula alvo), um transdutor elétrico e um elemento de condicionamento e processamento do sinal. Os biorreceptores são responsáveis pela especificidade deste dispositivo, podendo ser usados elementos como ácidos nucléicos, enzimas, peptídeos, proteínas, entre outros. Já os transdutores têm como função converter o sinal químico ou bioquímico, resultante da interação analito/bioreceptor, em um sinal eletrônico, podendo ser classificados como piezoelétricos, calorimétrico, ópticos e eletroquímicos [Holford T. R. J. et al.; Recent trends in antibody based sensors; 2012]. Transdutores eletroquímicos são os mais frequentemente utilizados nestes bioensaios, uma vez que oferecem a possibilidade de miniaturização, diversidade nos formatos dos dispositivos e sua provável integração com análises multiplexadas [Sassolas A. et al.; Immobilization strategies to develop enzymatic biosensors; 2012].[0011] Biosensors are analytical devices composed of a biorecognition layer (where interaction with the target molecule occurs), an electrical transducer and a signal conditioning and processing element. Bioreceptors are responsible for the specificity of this device, and elements such as nucleic acids, enzymes, peptides, proteins, among others, can be used. Transducers have the function of converting the chemical or biochemical signal, resulting from the analyte/bioreceptor interaction, into an electronic signal, which can be classified as piezoelectric, calorimetric, optical and electrochemical [Holford T. R. J. et al.; Recent trends in antibody based sensors; 2012]. Electrochemical transducers are the most frequently used in these bioassays, as they offer the possibility of miniaturization, diversity in device formats and their probable integration with multiplexed analyzes [Sassolas A. et al.; Immobilization strategies to develop enzymatic biosensors; 2012].

[0012] Tecnicamente, bioensaios e biossensores eletroquímicos possuem os mesmos componentes estruturais. No entanto, em um bioensaio, a reação molécula alvo-biorreceptor ocorre em um sistema de fase sólida e a sua detecção eletroquímica correspondente é realizada em outro lugar [Fowler J. M. et al.; Recent developments in electrochemical immunoassays and immunosensors; 2008].[0012] Technically, bioassays and electrochemical biosensors have the same structural components. However, in a bioassay, the target molecule-bioreceptor reaction occurs in a solid phase system and its corresponding electrochemical detection is performed elsewhere [Fowler J. M. et al.; Recent developments in electrochemical immunoassays and immunosensors; 2008].

[0013] Alguns ensaios biológicos se baseiam em interações entre antígeno e anticorpo, sendo estes conhecidos como imunoensaios e imunossensores. Em geral, a abordagem dos imunossensores envolve a imobilização de anticorpos na superfície do sensor (ou superfície sólida), visando capturar seletivamente a molécula alvo na amostra [Moina C. et al.; Fundamentals and Applications of Immunosensors Advances in Immunoassay Technology; 2012]. Em análises com imunossensores eletroquímicos, o uso de moléculas com propriedades de oxirredução é bastante comum, já que antígenos e anticorpos são espécies eletroquimicamente inertes e, assim, o sinal analítico é obtido em função da transferência eletrônica direta do marcador utilizado ou a partir da reação de um mediador (Riccardi C. S. et al; Imunossensor amperométrico; 2002).[0013] Some biological assays are based on interactions between antigen and antibody, these being known as immunoassays and immunosensors. In general, the immunosensor approach involves the immobilization of antibodies on the sensor surface (or solid surface), aiming to selectively capture the target molecule in the sample [Moina C. et al.; Fundamentals and Applications of Immunosensors Advances in Immunoassay Technology; 2012]. In analyzes with electrochemical immunosensors, the use of molecules with redox properties is quite common, since antigens and antibodies are electrochemically inert species and, thus, the analytical signal is obtained as a function of direct electronic transfer of the marker used or from the reaction of a mediator (Riccardi C. S. et al; Amperometric immunosensor; 2002).

[0014] Dentre os principais imunoensaios e imunossensores eletroquímicos desenvolvidos para microrganismos na indústria alimentar e de bebidas, os que apresentam partículas magnéticas em sua aplicação têm ganhado bastante destaque [Wilson D. et al.; Electrical detection of pathogenic bacteria in food samples using information visualization methods with a sensor based on magnetic nanoparticles functionalized with antimicrobial peptides; 2019; Jin Y. et al. Efficient bacterial capture with amino acid modified magnetic nanoparticles, 2014]. Isso se deve às ótimas propriedades dessas partículas, que atuam como materiais para imobilização do elemento de captura e como amplificadores do sinal analítico [Afonso, A. S. et al.; Electrochemical detection of Salmonella using gold nanoparticles; 2013].[0014] Among the main electrochemical immunoassays and immunosensors developed for microorganisms in the food and beverage industry, those that feature magnetic particles in their application have gained considerable prominence [Wilson D. et al.; Electrical detection of pathogenic bacteria in food samples using information visualization methods with a sensor based on magnetic nanoparticles functionalized with antimicrobial peptides; 2019; Jin Y. et al. Efficient bacterial capture with amino acid modified magnetic nanoparticles, 2014]. This is due to the excellent properties of these particles, which act as materials for immobilizing the capture element and as amplifiers of the analytical signal [Afonso, A. S. et al.; Electrochemical detection of Salmonella using gold nanoparticles; 2013].

[0015] Para esta estratégia, o elemento de reconhecimento biológico (anticorpo, antígeno, enzimas, entre outras proteínas) geralmente está ancorado à superfície das partículas, e desta forma, facilita a captura, separação e pré- concentração da molécula alvo [Pastucha, M. et al.; Magnetic nanoparticles for smart electrochemical immunoassays: a review on recent developments; 2019]. A possibilidade de imobilizar qualquer biorreceptor às essas partículas fornece uma detecção sensível e específica para vários analitos por vez, necessitando apenas estabelecer valores de referência de acordo com as otimizações realizadas para analito em questão.[0015] For this strategy, the biological recognition element (antibody, antigen, enzymes, among other proteins) is generally anchored to the surface of the particles, and in this way, facilitates the capture, separation and pre-concentration of the target molecule [Pastucha, M. et al.; Magnetic nanoparticles for smart electrochemical immunoassays: a review on recent developments; 2019]. The possibility of immobilizing any bioreceptor to these particles provides sensitive and specific detection for several analytes at a time, requiring only the establishment of reference values according to the optimizations carried out for the analyte in question.

[0016] Estes imunoensaios eletroquímicos acoplados a uma plataforma simples e portátil, como eletrodos descartáveis, fornecem uma excelente alternativa para detecção em campo. Além do mais, esses dispositivos exigem um mínimo de conhecimento técnico para seu manuseio, sendo um indicativo para sua fácil difusão mercado.[0016] These electrochemical immunoassays coupled to a simple and portable platform, such as disposable electrodes, provide an excellent alternative for field detection. Furthermore, these devices require a minimum of technical knowledge to handle them, which is an indication of their easy dissemination on the market.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃODESCRIPTION OF THE INVENTION

[0017] Os inventores, após inúmeras pesquisas, desenvolveram e investigaram o procedimento eletroquímico de avaliação da reação de interação da substância usada para procedimentos de coloração com a molécula alvo (amostra), no qual é possível utilizar partículas magnéticas com qualquer molécula proteica aderida em sua superfície para captura, separação e pré-concentração do alvo na amostra. De acordo com a invenção, a tecnologia inclui: o processo de preparo e interação com a amostra, o processo de leitura da amostra envolvendo etapas e parâmetros específicos; a forma de leitura eletroquímica incluindo a normalização dos sinais obtidos, faixa de concentração de detecção e correlação linear dos sinais obtidos com a concentração do alvo na amostra.[0017] The inventors, after numerous researches, developed and investigated the electrochemical procedure for evaluating the interaction reaction of the substance used for staining procedures with the target molecule (sample), in which it is possible to use magnetic particles with any protein molecule adhered to its surface for capture, separation and pre-concentration of the target in the sample. According to the invention, the technology includes: the process of preparing and interacting with the sample, the process of reading the sample involving specific steps and parameters; the form of electrochemical reading including normalization of the obtained signals, detection concentration range and linear correlation of the obtained signals with the concentration of the target in the sample.

[0018] Ademais, o sensor descartável da presente invenção permite a simplificação e miniaturização do sistema de detecção, barateamento do custo de produção dos dispositivos e redução do volume da sonda eletroquímica utilizada no sensor. A célula eletroquímica descartável acopla-se a um potenciostato portátil via serial (USB), podendo este operar com a técnica de voltametria de pulso diferencial (DPV, do inglês Differential Pulse Voltammetry) com intervalos de medição de 1 a 1000 μA, faixas de tensão de saída de 1 a 10 V, conversor analógico-digital (ADC) de intensidade de corrente de 16 bits e conversor digital-analógico (DCA) de nível de tensão de 12 bits e possui alimentação via bateria recarregável. A inovação ainda poderá ser aplicada em diversos setores da indústria de alimentos, bebidas e biotecnologia, abrangendo a rotina laboratorial voltada para o controle de qualidade, monitoramento microbiológico em todas as etapas do processo de fabricação da amostra, e ainda pode ser ampliado para testes ambientais.[0018] Furthermore, the disposable sensor of the present invention allows the simplification and miniaturization of the detection system, lowering the production cost of the devices and reducing the volume of the electrochemical probe used in the sensor. The disposable electrochemical cell is coupled to a portable potentiostat via serial (USB), which can operate with the Differential Pulse Voltammetry (DPV) technique with measurement ranges from 1 to 1000 μA, voltage ranges 1 to 10 V output, 16-bit current intensity analog-to-digital converter (ADC) and 12-bit voltage level digital-to-analog converter (DCA) and powered by a rechargeable battery. The innovation can still be applied in various sectors of the food, beverage and biotechnology industry, covering laboratory routine focused on quality control, microbiological monitoring at all stages of the sample manufacturing process, and can even be expanded to environmental tests .

[0021] O processo de obtenção do imunoensaio eletroquímico, segundo a invenção, envolve inicialmente a preparação de um bioconjugado (B) - composto formado por partículas com propriedades magnéticas sintetizadas ou comerciais, preferencialmente partículas magnéticas com grupos carboxílicos, e proteínas, como anticorpos, peptídeos ou antígenos (Figura 1).[0021] The process of obtaining the electrochemical immunoassay, according to the invention, initially involves the preparation of a bioconjugate (B) - a compound formed by particles with synthesized or commercial magnetic properties, preferably magnetic particles with carboxylic groups, and proteins, such as antibodies, peptides or antigens (Figure 1).

[0022] Um volume de 50 a 200 μL da partícula magnética (PM) com a superfície contendo um ligante carboxilado deve ser colocado em um tubo e, esse grupo carboxílico é ativado com a solução mista de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) numa faixa de concentração de 1 a 10 mg mL-1. Após ativar os grupos carboxila da partícula magnética, a proteína, podendo ser um anticorpo, peptídeo ou antígeno (como anti-L.b., por exemplo) (1) deve ser utilizada numa faixa de concentração de anticorpo, peptídeo ou antígeno de ao menos 1 μg mL-1, sendo preferível entre 5 e 150 μg mL-1, sendo mais preferível ainda entre 10 e 100 μg mL-1, diluído em uma solução de ação tamponante ácida, preferencialmente tampão MES (ácido 2- (N- morfolino) etanossulfônico) 0,05 mol L-1, por períodos de 1 a 30 horas. Posteriormente, as partículas devem ser bloqueadas com substâncias compostas por aminas primárias, secundárias ou terciárias, preferencialmente glicina ou caseína ou BSA ou etanolamina ou combinação entre compostos, na concentração de 1,0 mol L-1 durante 15 a 60 minutos (2). Por fim, o composto formado por partículas magnéticas e proteínas, podendo ser anticorpos, peptídeos ou antígenos, são dispersas em uma solução de ação tamponante ácida, sendo preferível o tampão MES 0,05 mol L-1 entre volumes de 200 e 1000 μL. Após a etapa, o bioconjugado (B) está pronto para receber as amostras.[0022] A volume of 50 to 200 μL of the magnetic particle (PM) with the surface containing a carboxylated ligand must be placed in a tube and this carboxylic group is activated with the mixed solution of 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) in a concentration range of 1 to 10 mg mL-1. After activating the carboxyl groups of the magnetic particle, the protein, which may be an antibody, peptide or antigen (such as anti-L.b., for example) (1) must be used in a concentration range of antibody, peptide or antigen of at least 1 μg mL-1, preferably between 5 and 150 μg mL-1, even more preferably between 10 and 100 μg mL-1, diluted in an acid buffering solution, preferably MES buffer (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid ) 0.05 mol L-1, for periods of 1 to 30 hours. Subsequently, the particles must be blocked with substances composed of primary, secondary or tertiary amines, preferably glycine or casein or BSA or ethanolamine or a combination of compounds, at a concentration of 1.0 mol L-1 for 15 to 60 minutes (2). Finally, the compound formed by magnetic particles and proteins, which may be antibodies, peptides or antigens, are dispersed in an acid buffering solution, with MES buffer 0.05 mol L-1 being preferable between volumes of 200 and 1000 μL. After this step, the bioconjugate (B) is ready to receive the samples.

[0023] As amostras (A) devem ser diluídas para volumes de 50 a 500 mL em tampão fisiológico, preferencialmente fosfato salino (PBS, do inglês Phosphate Buffer Saline) 0,01 mol L-1 contendo um surfactante não iônico, como o polissorbato 20 ou 40 ou 60 ou 80, na proporção em volume de ao menos 0,05%. Posteriormente, essa amostra deve ser distribuída em alíquotas entre 5 e 100 mL, seguida de separação por centrifugação com velocidades de rotação por minuto de 1000 a 7000 rpm, durante 10 a 60 minutos. Após o processo de separação, o conteúdo líquido da solução é retirado, cuidadosamente, restando a massa da amostra sedimentada e um volume de sobrenadante de 500 a 10.000 μL. Esse material é misturado e submetido a tratamentos de calor ou de ondas eletromagnéticas, de forma a inviabilizar os microrganismos da amostra.[0023] Samples (A) must be diluted to volumes of 50 to 500 mL in physiological buffer, preferably Phosphate Buffer Saline (PBS) 0.01 mol L-1 containing a nonionic surfactant, such as polysorbate 20 or 40 or 60 or 80, in a volume proportion of at least 0.05%. Subsequently, this sample must be distributed into aliquots between 5 and 100 mL, followed by separation by centrifugation with rotation speeds per minute of 1000 to 7000 rpm, for 10 to 60 minutes. After the separation process, the liquid content of the solution is carefully removed, leaving the mass of the sedimented sample and a supernatant volume of 500 to 10,000 μL. This material is mixed and subjected to heat or electromagnetic wave treatments, in order to make the microorganisms in the sample unviable.

[0024] Dando sequência, um volume de 5 a 50 μL do bioconjugado (B) - formado por partículas magnéticas e proteínas, podendo ser anticorpos, peptídeos ou antígenos, deve ser adicionado à amostra (A) e a incubação acontece por um período de ao menos 30 minutos a uma velocidade de agitação entre 6 e 300 rpm (3).[0024] Following this, a volume of 5 to 50 μL of bioconjugate (B) - formed by magnetic particles and proteins, which may be antibodies, peptides or antigens, must be added to the sample (A) and incubation takes place for a period of at least 30 minutes at a stirring speed between 6 and 300 rpm (3).

[0025] Imediatamente após essa etapa de captura, separação e pré- concentração da molécula alvo, todo conteúdo líquido é ser retirado, restando apenas a molécula alvo que interagiu com as proteínas (3), como anticorpo, peptídeo ou antígeno, sendo preferível o anti-L.b., do bioconjugado (B). Esse material deve ser disperso em volumes de ao menos 50 μL de uma solução com substância usada para procedimentos de coloração, preferencialmente azul de metileno, eosina ou iodeto de propídeo, sendo mais preferível a solução de azul de metileno, preparada em solução de ação tamponante, como PBS, e a incubação deve ocorrer por um período de tempo de ao menos 5 minutos (I). Por fim, o sobrenadante (S) contendo o corante remanescente livre de qualquer partícula suspensa está pronto para ser utilizado nas análises eletroquímicas (Figura 2).[0025] Immediately after this step of capturing, separating and pre-concentrating the target molecule, all liquid content is removed, leaving only the target molecule that interacted with the proteins (3), such as antibody, peptide or antigen, with the preferred anti-L.b., from the bioconjugate (B). This material must be dispersed in volumes of at least 50 μL of a solution containing a substance used for staining procedures, preferably methylene blue, eosin or propidium iodide, with methylene blue solution, prepared in a buffering solution, being more preferable. , such as PBS, and incubation must occur for a period of at least 5 minutes (I). Finally, the supernatant (S) containing the remaining dye free of any suspended particles is ready to be used in electrochemical analyzes (Figure 2).

[0026] Antecedendo as análises eletroquímicas, é necessária a construção dos sensores (4) eletroquímicas descartáveis preparadas com materiais condutivos como preferencialmente a tinta condutiva de carbono - o sensor (4) - que é depositada sobre um substrato inerte não condutor, limpo e aderido estêncil para delinear o formato dos dispositivos, por exemplo, poliéster térmico (Figura 3). Esta figura mostra em (a) a máscara de adesivo sobre o substrato de poliéster térmico, em (b) a visualização dos eletrodos sobre o substrato após deposição do material condutor e material de referência e, em (c) os eletrodos serigrafados com delimitação da área eletroativa por um material inerte não condutor.[0026] Prior to the electrochemical analyses, it is necessary to construct disposable electrochemical sensors (4) prepared with conductive materials such as preferably conductive carbon paint - the sensor (4) - which is deposited on an inert non-conductive substrate, clean and adhered stencil to outline the shape of the devices, for example, thermal polyester (Figure 3). This figure shows in (a) the adhesive mask on the thermal polyester substrate, in (b) the visualization of the electrodes on the substrate after deposition of the conductive material and reference material, and in (c) the screen-printed electrodes with delimitation of the electroactive area by an inert non-conductive material.

[0027] Primeiramente, o estêncil com o modelo do eletrodo é preparado em um material polimérico de vinil adesivo usando um cortador artesanal eletrônico. A máscara de vinil é fixada no substrato de poliéster e, em seguida, a tinta condutiva de carbono é depositada com auxílio de uma espátula e passada com a ajuda de um rodo e curada entre 80 °C e 120 °C por períodos de 15 a 60 minutos. O sensor (4) é composto por três eletrodos: o eletrodo de trabalho (5); o contra-eletrodo (6) de material condutivo como o carbono e eletrodo de material de referência (7), como a prata/cloreto de prata (Figura 3). A tinta de prata/cloreto de prata é depositada manualmente sobre a área correspondente a este eletrodo, sendo a cura da tinta realizada a 60 °C de 30 a 45 minutos. A delimitação da área geométrica dos eletrodos de trabalho é feita com uma máscara de vinil com um formato definido (8).[0027] First, the stencil with the electrode model is prepared on an adhesive vinyl polymeric material using an electronic craft cutter. The vinyl mask is fixed to the polyester substrate and then the conductive carbon ink is deposited using a spatula and passed with the help of a squeegee and cured between 80 °C and 120 °C for periods of 15 to 60 minutes. The sensor (4) is composed of three electrodes: the working electrode (5); the counter electrode (6) made of conductive material such as carbon and the electrode made of reference material (7), such as silver/silver chloride (Figure 3). The silver/silver chloride paint is manually deposited on the area corresponding to this electrode, with the paint curing at 60 °C for 30 to 45 minutes. The delimitation of the geometric area of the working electrodes is done with a vinyl mask with a defined shape (8).

[0028] Tendo depositado o material condutivo de carbono no eletrodo, este passa por processo de normalização dos sinais obtidos, que requer uma etapa de limpeza da superfície do sensor (4) com uma solução de solvente orgânico, sendo mais preferível o dimetilformamida (DMF), podendo estar ou não dissolvido em água na proporção entre 35% e 85% durante 30 e 600 segundos, seguida por uma leitura eletroquímica da solução de corante, tendo mais preferência pela solução de azul de metileno sem interação com a molécula alvo. Continuando o processo de normalização dos sinais obtidos, é realizada uma segunda limpeza da superfície do sensor (4) com uma solução de solvente orgânico, sendo mais preferível dimetilformamida (DMF), podendo estar ou não dissolvido em água na proporção entre 35% e 85% durante 30 a 600 segundos e, finaliza-se com uma última leitura eletroquímica do corante remanescente livre de qualquer partícula suspensa após interação com a molécula alvo.[0028] Having deposited the carbon conductive material on the electrode, it goes through a process of normalizing the signals obtained, which requires a step of cleaning the sensor surface (4) with an organic solvent solution, the most preferable being dimethylformamide (DMF). ), which may or may not be dissolved in water in a proportion between 35% and 85% for 30 to 600 seconds, followed by an electrochemical reading of the dye solution, with more preference for the methylene blue solution without interaction with the target molecule. Continuing the process of normalizing the signals obtained, a second cleaning of the surface of the sensor (4) is carried out with an organic solvent solution, most preferably dimethylformamide (DMF), which may or may not be dissolved in water in a proportion between 35% and 85%. % for 30 to 600 seconds and ends with a last electrochemical reading of the remaining dye free of any suspended particles after interaction with the target molecule.

[0029] Para as leituras eletroquímicas é utilizada técnica de voltametria de pulso diferencial (DPV, do inglês Differential Pulse Voltammetry). A DPV utiliza um intervalo de potencial de 0,0 a -0,6 V vs Ag|AgCl, amplitude de modulação de - 0,5 V, potencial de step de - 0,05 V e velocidade de varredura de 0,05 V s_1.[0029] Differential pulse voltammetry (DPV) technique is used for electrochemical readings. DPV uses a potential range of 0.0 to -0.6 V vs Ag|AgCl, modulation amplitude of - 0.5 V, step potential of - 0.05 V and sweep speed of 0.05 V s_1.

[0030] A detecção por DPV da proteína alvo é indiretamente realizada a partir da concentração final do sobrenadante (S) de azul de metileno remanescente após interação com a mesma. A reação de interação alvo-corante proporciona uma descoloração/absorção do azul de metileno, gerando um sinal eletroquímico proporcional à quantidade de molécula alvo presente.[0030] DPV detection of the target protein is indirectly carried out from the final concentration of the supernatant (S) of methylene blue remaining after interaction with it. The target-dye interaction reaction provides discoloration/absorption of methylene blue, generating an electrochemical signal proportional to the amount of target molecule present.

[0031] Os sinais analíticos são normalizados utilizando a equação matemática representada abaixo, que utiliza como o Iantes o sinal da corrente de pico para a leitura eletroquímica da solução de azul de metileno sem interação com a molécula alvo e, como Idepois é utilizado o sinal da corrente de pico gerado a partir da leitura eletroquímica do sobrenadante (S) contendo o corante remanescente livre de qualquer partícula suspensa após interação com a molécula alvo. Os sinais normalizados são considerados para a interpretação do resultado. [0031] The analytical signals are normalized using the mathematical equation represented below, which uses as the Iantes the peak current signal for the electrochemical reading of the methylene blue solution without interaction with the target molecule and, as the Iafter, the signal is used of the peak current generated from the electrochemical reading of the supernatant (S) containing the dye remaining free of any suspended particles after interaction with the target molecule. The normalized signals are considered for the interpretation of the result.

[0032] Um importante aspecto nesta invenção é o uso de um fator de concentração da molécula alvo, que diminui o volume final da amostra, no entanto a quantidade inicial dessas moléculas permanece constante. Esse efeito favorece algumas etapas do imunoensaio desenvolvido, como a etapa de incubação do alvo com o bioconjugado (B), promovendo eficiência na captura e, consequentemente, aumenta o sinal normalizado (Figura 5).[0032] An important aspect of this invention is the use of a target molecule concentration factor, which reduces the final volume of the sample, however the initial quantity of these molecules remains constant. This effect favors some stages of the developed immunoassay, such as the incubation stage of the target with the bioconjugate (B), promoting capture efficiency and, consequently, increasing the normalized signal (Figure 5).

[0033] Outro aspecto positivo da invenção consiste no uso de um leitor eletroquímico portátil. Particularmente utilizou-se o equipamento de leitura portátil Rodeostat do fabricante IO Rodeoio, o que trouxe um baixo custo ao imunoensaio desenvolvido, haja vista que outros similares também podem ser empregados, encaminhando os parâmetros de leitura da DPV e as curvas obtidas nos ensaios de detecção de diferentes concentrações do Lactobacillus brevis (microrganismo utilizado nessa realização exemplificativa), sendo o equipamento de leitura capaz de medir a concentração desta bactéria na amostra, com o uso do imunonoensaio desenvolvido no estudo.[0033] Another positive aspect of the invention consists of the use of a portable electrochemical reader. In particular, the Rodeostat portable reading equipment from the manufacturer IO Rodeoio was used, which brought a low cost to the developed immunoassay, considering that other similar ones can also be used, forwarding the DPV reading parameters and the curves obtained in the detection assays. of different concentrations of Lactobacillus brevis (microorganism used in this exemplary realization), with the reading equipment capable of measuring the concentration of this bacteria in the sample, using the immunoassay developed in the study.

[0034] Quanto ao imunoensaio desenvolvido, este consiste em um bioconjugado (B) capaz de capturar, separar e pré-concentrar a molécula alvo dentro de uma amostra que contenha outros interferentes.[0034] As for the developed immunoassay, it consists of a bioconjugate (B) capable of capturing, separating and pre-concentrating the target molecule within a sample that contains other interferents.

[0035] O mencionado sensor (4) corresponde a uma célula eletroquímica descartável submetida ao substrato inerte não condutor, depositado um material condutivo, numa forma de realização preferencial, mas não restritiva, tinta condutiva de carbono e seus nanomateriais.[0035] The aforementioned sensor (4) corresponds to a disposable electrochemical cell subjected to the inert non-conductive substrate, deposited with a conductive material, in a preferred but non-restrictive embodiment, conductive carbon paint and its nanomaterials.

[0036] As partículas magnéticas empregadas na obtenção do imunoconjugado podem ser, numa forma de realização preferencial, mas não restritiva, comerciais ou sintetizadas em laboratórios não especializados.[0036] The magnetic particles used to obtain the immunoconjugate can be, in a preferred but not restrictive embodiment, commercial or synthesized in non-specialized laboratories.

[0037] Algumas características estão associadas positivamente ao procedimento desenvolvido, como o processo de detecção do alvo, incluindo a obtenção do bioconjugado (B), as etapas de preparação da amostra, normalização do sinal no processo de detecção eletroquímica, leitura eletroquímica do analito alvo em ao menos 10 minutos e a capacidade deste dispositivo ser portátil.[0037] Some characteristics are positively associated with the developed procedure, such as the target detection process, including obtaining the bioconjugate (B), sample preparation steps, signal normalization in the electrochemical detection process, electrochemical reading of the target analyte in at least 10 minutes and the ability of this device to be portable.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF FIGURES

[0038] A invenção está descrita em forma de realização, sendo que referências são feitas aos desenhos anexos, nos quais estão representadas: Figura 1: desenho esquemático da obtenção do bioconjugado (B) e captura do analito alvo presente na amostra (A). Nesta Figura tem-se: (PM) partícula magnética com grupos carboxilas; (1) EDC/NHS e anticorpo, (2) bloqueio e (3) captura do alvo; Figura 2: Desenho da sequência para captura, separação e pré-concentração da molécula alvo com o bioconjugado (B) em 3, (I) é a interação do alvo capturado com o corante e (S) é o sobrenadante resultante desta interação; Figura 3: Desenho da construção dos sensores (4), em (a) corte para estêncil e o substrato de poliéster térmico, em (b) a tinta de material condutor e material de referência está depositada e em (c) é a máscara de vinil com um formato definido delimitando os eletrodos; Figura 4: Desenho substrato inerte não condutor serigrafado após a retirada do estêncil em primeiro plano e, eletrodo preparado para análises eletroquímicas após a colocação da máscara de vinil delimitadora e preparação do eletrodo de referência em segundo plano; Figura 5: Gráfico na leitura por DPV, os valores considerados para a interpretação dos resultados com fator de concentração da molécula alvo. Figura 6: Gráfico da curva analítica em DPV para o imunoensaio para o microrganismo Lactobacillus brevis; Figura 7: Gráfico com os resultados exemplificados para aplicação do imunoensaio em amostras de para cerveja.[0038] The invention is described in embodiment, with references being made to the attached drawings, in which the following are represented: Figure 1: schematic drawing of obtaining the bioconjugate (B) and capturing the target analyte present in the sample (A). In this Figure we have: (PM) magnetic particle with carboxyl groups; (1) EDC/NHS and antibody, (2) blocking and (3) target capture; Figure 2: Drawing of the sequence for capture, separation and pre-concentration of the target molecule with the bioconjugate (B) in 3, (I) is the interaction of the captured target with the dye and (S) is the supernatant resulting from this interaction; Figure 3: Drawing of the construction of the sensors (4), in (a) cut for stencil and the thermal polyester substrate, in (b) the ink of conductive material and reference material is deposited and in (c) is the mask of vinyl with a defined shape delimiting the electrodes; Figure 4: Screen-printed inert non-conducting substrate design after removing the stencil in the foreground and electrode prepared for electrochemical analyzes after placing the delimiting vinyl mask and preparing the reference electrode in the background; Figure 5: Graph in DPV reading, the values considered for the interpretation of the results with concentration factor of the target molecule. Figure 6: Graph of the analytical curve in DPV for the immunoassay for the microorganism Lactobacillus brevis; Figure 7: Graph with exemplified results for applying the immunoassay to beer samples.

VANTAGENS DA INVENÇÃOADVANTAGES OF THE INVENTION

[0039] Outras vantagens da invenção que devem ser destacadas: - Custo reduzido do imunoensaio desenvolvido, aproximadamente R$ 9,00 por análise, e do leitor eletroquímico portátil quando comparado com os dispositivos existentes no mercado, que pode ser um indicativo de acessibilidade para o sistema desenvolvido; - Praticabilidade na condução das análises, requerendo operadores minimamente treinados para alcançar resultados confiáveis. - Detecção sensível e específica para várias moléculas alvo por vez, havendo apenas a necessidade de aderir outras proteínas na superfície da partícula magnética. - Processo do imunoensaio com tempo total de análise de até 4 horas, o que permitirá uma detecção precoce de microrganismos deteriorantes e um planejamento de ações de combate efetivo.[0039] Other advantages of the invention that should be highlighted: - Reduced cost of the developed immunoassay, approximately R$ 9.00 per analysis, and of the portable electrochemical reader when compared to existing devices on the market, which can be an indication of accessibility for the system developed; - Practicability in conducting analyses, requiring minimally trained operators to achieve reliable results. - Sensitive and specific detection for several target molecules at a time, with only the need to adhere other proteins to the surface of the magnetic particle. - Immunoassay process with a total analysis time of up to 4 hours, which will allow early detection of spoilage microorganisms and planning of effective combat actions.

REALIZAÇÕES DA INVENÇÃOEMBODIMENTS OF THE INVENTION

[0040] A título de melhor exemplificação, uma forma exemplificativa de realização da invenção, com particular destaque para a capacidade de medir em um equipamento portátil, qualquer molécula capaz de interagir com proteínas em qualquer tipo de amostra, bastando apenas a alteração de um componente após a etapa de ativação com EDC/NHS durante a produção do bioconjugado (B), validação da curva analítica e atualização do software do equipamento. Esta capacidade da invenção é demonstrada pela realização abaixo: - Capacidade de medir o microrganismo deteriorante de cerveja Lactobacillus brevis (L.b.): para esta realização foi utilizado um anticorpo anti-L.b. aderido às partículas magnéticas carboxiladas. Este sensor (4) é capaz de detectar e quantificar o microrganismo Lactobacillus brevis em amostras que o contêm, em um intervalo de concentração de 2 a 20.000 UFC mL-1 de L.b. (Figura 6) (por exemplo: cerveja) (Figura 7).[0040] By way of best example, an exemplary form of carrying out the invention, with particular emphasis on the ability to measure in portable equipment, any molecule capable of interacting with proteins in any type of sample, simply by changing one component after the activation step with EDC/NHS during the production of the bioconjugate (B), validation of the analytical curve and updating of the equipment software. This ability of the invention is demonstrated by the embodiment below: - Ability to measure the beer spoilage microorganism Lactobacillus brevis (L.b.): for this embodiment an anti-L.b. antibody was used. adhered to carboxylated magnetic particles. This sensor (4) is capable of detecting and quantifying the microorganism Lactobacillus brevis in samples that contain it, in a concentration range of 2 to 20,000 CFU mL-1 of L.b. (Figure 6) (for example: beer) (Figure 7).

Claims (2)

1. SISTEMA PORTÁTIL DE MONITORAMENTO DE CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS PARA INDÚSTRIAS DE BEBIDAS E BIOTECNOLOGIA USANDO UM IMUNOENSAIO ELETROQUÍMICO caracterizado por: a. um sensor eletroquímico; b. uma sonda para detecção eletroquímica; c. um sistema de aquecimento (banho maria); d. um equipamento portátil programado para análise do contaminante em questão que consiste em um sistema portátil, um protocolo de preparo e interação do bioconjugado com a amostra, um protocolo de interação do corante com o PM- Ab-L.b, um protocolo de limpeza do eletrodo que antecede as leituras eletroquímicas e um protocolo de leitura eletroquímica incluindo a normalização dos sinais obtidos;1. PORTABLE MICROBIOLOGICAL CONTAMINANT MONITORING SYSTEM FOR BEVERAGE AND BIOTECHNOLOGY INDUSTRIES USING AN ELECTROCHEMICAL IMMUNOASSAY characterized by: a. an electrochemical sensor; B. a probe for electrochemical detection; w. a heating system (water bath); d. a portable equipment programmed for analyzing the contaminant in question that consists of a portable system, a protocol for the preparation and interaction of the bioconjugate with the sample, a protocol for the interaction of the dye with PM- Ab-L.b, an electrode cleaning protocol that precedes the electrochemical readings and an electrochemical reading protocol including the normalization of the obtained signals; 2. SISTEMA PORTÁTIL DE MONITORAMENTO DE CONTAMINANTES MICROBIOLÓGICOS PARA INDÚSTRIAS DE BEBIDAS E BIOTECNOLOGIA USANDO UM IMUNOENSAIO ELETROQUÍMICO de acordo com a reinvindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o dito imunoensaio eletroquímico compreende um microtubo contendo um volume de bioconjugado que varia de 5 μL a 50 μL com concentração de partícula magnética que varia de 1 a 20 mg/mL e um microtubo contendo um volume de corante de ao menos 50 μL de uma solução com substância usada para procedimentos de coloração, preferencialmente azul de metileno, eosina ou iodeto de propídeo, sendo mais preferível a solução de azul de metileno na concentração que varia de 0,05 a 0,10 g/L, preparada em solução de ação tamponante, como PBS;2. PORTABLE MICROBIOLOGICAL CONTAMINANT MONITORING SYSTEM FOR BEVERAGE AND BIOTECHNOLOGY INDUSTRIES USING AN ELECTROCHEMICAL IMMUNOASSAY according to the previous claim, characterized by the fact that said electrochemical immunoassay comprises a microtube containing a volume of bioconjugate ranging from 5 μL to 50 μL with a magnetic particle concentration ranging from 1 to 20 mg/mL and a microtube containing a dye volume of at least 50 μL of a solution with a substance used for staining procedures, preferably methylene blue, eosin or propidium iodide, the methylene blue solution being more preferable at a concentration ranging from 0.05 to 0.10 g/L, prepared in a buffering solution, such as PBS;