BR102018077055A2 - aldiminas sintéticas, composições farmacêuticas contra a infecção por htlv-1 e usos - Google Patents

Abstract

A presente tecnologia trata de aldiminas sintéticas e composições farmacêuticas contendo aldiminas sintéticas, isoladas ou em combinação, com atividade imunomoduladora da resposta antiviral para o tratamento de infecções virais provocadas pelo vírus HTLV-1 (Human T-Lymphotropic virus 1).

Description

ALDIMINAS SINTÉTICAS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTRA A INFECÇÃO POR HTLV-1 E USOS

[001] A presente tecnologia trata de aldiminas sintéticas e composições farmacêuticas contendo aldiminas sintéticas, isoladas ou em combinação, com atividade imunomoduladora da resposta antiviral para o tratamento de infecções virais provocadas pelo vírus HTLV-1 (Human T Lymphotropic virus 1).

[002] O HTLV-1 pertence à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e gênero Deltaretrovirus. É um vírus oncogênico que infecta preferencialmente linfócitos T CD4+ e foi o primeiro retrovirus associado a doenças humanas descoberto.

[003] Estima-se que cerca de 5 a 10 milhões de pessoas estejam infectadas por HTLV-1 no mundo. Esse dado é originado de modelos matemáticos que se baseiam em 1,5 bilhão de indivíduos que vivem em áreas endêmicas para o HTLV-1 com sólidos dados epidemiológicos. No entanto, esse número pode ser ainda maior, visto que a epidemiologia em determinados países, como índia e China, por exemplo, não é muito precisa. No Brasil, dados provenientes de candidatos à doação de sangue estimam que existam 2,5 milhões de pessoas infectadas, sendo o país com maior número de infecções no mundo.

[004] A transmissão do HTLV ocorre de mãe para filho através da amamentação, canal do parto, pela relação sexual sem o uso de preservativos e pelo contato com sangue contaminado no compartilhamento de agulhas e seringas, como no uso de drogas ilícitas intravenosas e transfusão sanguínea. Cerca de 5% dos indivíduos infectados por HTLV-1 desenvolverão alguma patologia associada, sendo a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) as mais comuns.

[005] A ATL foi descrita pela primeira vez no final da década de 70 como uma neoplasia linfoproliferativa de células T e acomete populações monoclonais de células T que expressam os marcadores CD3+, CD4+, CD8- e CD25+ na superfície celular. A ATL pode ocorrer em quatro diferentes formas: latente e crônica, de progressão mais lenta; linfomatosa e aguda, que apresentam estados clínicos mais agressivos. Não existe um tratamento padrão para a ATL, sendo o mesmo baseado na classificação da doença e nos fatores prognósticos. Dentre as opções de tratamento estão o coquetel com interferon alfa (IFN-α) e zidovudina (AZT), quimioterapia multiagente e o transplante de células tronco hematopoiéticas.

[006] A HAM/TSP é uma doença neuroinflamatória do sistema nervoso central associada à infiltração perivascular e parenquimal de células T infectadas pelo HTLV-1 e à ativação de células T citotóxicas. A HAM/TSP é caracterizada por meningomielite crônica das massas branca e cinzenta da medula espinal, seguida por degeneração dos axônios, afetando a medula lombar e toráxica. Sintomas no trato urinário, como aumento da frequência urinária, noctúria, disúria, ardor ao urinar, hesitação, sensação de esvaziamento incompleto da bexiga e incontinência, são os primeiros sinais da mielopatia. Os tratamentos existentes para a HAM/TSP são baseados na sintomatologia dos pacientes infectados, não existindo ainda um medicamento ou coquetel efetivo para uso sistemático, não sendo ainda possível prevenir o desenvolvimento do quadro desmielinizante induzido pelo HTLV-1. O uso de drogas anti-espásticas, analgésicos, laxativos e drogas para o controle da bexiga ajudam na reabilitação de pacientes com HAM/TSP. Glicocorticóides reduzem a desabilidade motora, devido às propriedades anti-inflamatórias. Além disso, o uso de corticoides tem reduzido a espasticidade dos pacientes.

[007] Outras infecções inflamatórias causadas pelo HTLV-1, como uveites, dermatites infecciosas, polimiosites, doenças crônicas respiratórias, artropatias associadas ao HTLV-1, síndrome de Sjӧgren e certas leucemias mielóides agudas, são também relatadas, causando um grande impacto tanto na vida dos indivíduos infectados quanto nos sistemas de saúde.

[008] Apesar do HTLV ter sido descoberto há mais de 30 anos e causar patologias graves que causam grande impacto na qualidade de vida dos indivíduos infectados, pouco se avançou no que diz respeito às terapias anti-HTLV. Já em infecções com o vírus da imunodeficiência humana, o HIV, as terapias antirretrovirais evoluíram não somente no sentido de prolongar a vida do indivíduo infectado, como também de reduzir drasticamente a transmissão do vírus, transformando a AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida) de sentença de morte à doença crônica controlável. Apesar do HIV-1 e o HTLV-1 serem retrovirus com tropismo para linfócitos T CD4+, a biologia e a patogênese dos mesmos são bem diferenciadas, o que torna o uso dos coquetéis anti-HIV ineficientes nos tratamentos contra o HTLV.

[009] Os fármacos, de maneira geral, podem ter dois campos de ação: um com base em um alvo, como alguma proteína viral; outro baseado no auxílio à célula hospedeira no combate à infecção, agindo no bloqueio de alguma etapa de multiplicação do vírus ou até mesmo na regulação de componentes da resposta imune celular antiviral, visando o bloqueio da infecção.

[0010] O sistema imune defende o hospedeiro de patógenos através da imunidade inata (detecção de patógenos através do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos - PAMPs - por receptores de reconhecimento de padrões - PRRs), que desencadeia mecanismos inatos antivirais. Grande parte desses mecanismos são mediados pelos interferons, levando à ativação da resposta imune adaptativa, que fornece uma ação mais dirigida e antígeno-específica, além de mais duradoura.

[0011] Dentre os estudos realizados na tentativa de se obter possíveis medicamentos para serem utilizados no tratamento contra o HTLV, as substâncias encontradas na literatura têm como alvo o impedimento de alguma proteína viral, seja estrutural ou enzimática, sendo em sua maioria extratos de plantas, ou a imunomodulação baseada em citocinas e corticoesteroides já em uso corrente para outras patologias.

[0012] O extrato bruto de Citrus bergamia (BSext) e dois componentes desse extrato, a nomilina e a limonina, possuem atividade inibitória contra a expressão gênica de tax/rex (BALESTRIERI, E. et al.; Antiviral activity of seed extract from Citrus bergamia towards human retroviruses. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 19, p. 2084-2089. 2011).

[0013] O miradenolídeo, isolado de Alomia myriadenia, foi capaz de inibir a expressão gênica de gag-pol na concentração de 1μΜ em células MT2 permanentemente infectadas com o HTLV-1 e reduzir a expressão das proteínas estruturais gp46 e p19, além do número de partículas virais na superfície dessas células (MARTINS, C. et al. A reduction of viral mRNA, proteins and induction of altered morphogenesis reveals the anti-HTLV-1 activity of the labdane-diterpene myriadenolide in vitro. BMC Microbiology, v. 24, n. 1, p. 1-12. 2014);

[0014] A azidotimidina (AZT), um análogo da timidina que inibe a atividade da transcriptase reversa do HIV, preveniu a infecção por HTLV-1 (MACCHI, B. et al. Susceptibility of primary HTLV-1 isolates from patients with HTLV-1 -associated myelopathy to reverse transcriptase inhibitors. Viruses, v. 3, p. 469-483. 2011);

[0015] O tenofovir disoproxil fumarato (TDF), um análogo da adenina, e os PCOANs (phosphonated carbocyclic 2’-oxa-3’aza nucleosides) preveniram a transmissão do vírus célula-célula e também inibiram a atividade da transcriptase reversa (MACCHI, B. et al. Susceptibility of primary HTLV-1 isolates from patients with HTLV-1-associated myelopathy to reverse transcriptase inhibitors. Viruses, v. 3, p. 469-483. 2011);

[0016] O tratamento com lamivudina e zidovudina mostrou melhoria de sintomas da HAM/TSP, contribuindo com a qualidade de vida da paciente (HASSAN, S.; AMER, S.; ZERVOS, M. Tropical spastic paraparesis treated with combivir (lamivudine-zidovudine). Journal of Clinical Neuroscience, v. 20, p. 759-760. 2013);

[0017] O uso do anticorpo monoclonal anti-CCR4 mogamulizumab em pacientes com ATL crônica alcançaram o estágio de remissão clínica, com rápida normalização da contagem de linfócitos e redução da carga proviral do HTLV (COOK, L.B. et al. HTLV-1 Proviral Load after Two Months' Treatment with Anti-CCR4 Monoclonal Antibody Mogamulizumab Predicts a Molecular Response to Disease and Durable Clinical Remission in Leukaemic Subtypes of Adult T-Cell Leukaemia/Lymphoma. Blood, v. 128, n. 22, p. 5356. 2016).

[0018] O uso de corticosteroides aumenta a produção de interferons (gama, alfa e β1a), que possuem atividade citostática e antiviral, e são utilizados como terapia imunomodulatória visando alterar a progressão da HAM/TSP, mas têm mostrado ação limitada (GONÇALVES, D.U. et al. Epidemiology, treatment, and prevention of Human T-cell Leukemia Virus Type 1-associated diseases. Clinical Microbiology Reviews, v. 23, n. 3, p. 577-589. 2010; ALBERTI, C. et al. Molecular and clinical effects of betamethasone in Human T-cell Lymphotropic VirusType -1- associated mielopathy/tropical spastic paraparesis patients. Journal of Medical Virology, v. 83, p. 1641-1649. 2011; MOENS, B. et al. Ascorbic acid has superior ex vivo antiproliferative, cell death-inducing and immunomodulatory effects over IFN-α in HTLV-1-associated myelopathy. Neglected Tropical Diseases, v. 6, n. 7, p. 1-15. 2012; HASSAN, S.; AMER, S.; ZERVOS, M. Tropical spastic paraparesis treated with combivir (lamivudine-zidovudine). Journal of Clinical Neuroscience, v. 20, p. 759-760. 2013).

[0019] As amantadinas são derivadas dos adamantanos, muito utilizados na indústria farmacêutica devido a sua propriedade farmacófora (capacidade de interação com um receptor celular). Substâncias que possuem o núcleo adamantano incorporado são mais lipofílicas, possuindo maior permeabilidade através da barreira hematoencefálica, melhorando a entrega da substância no alvo celular.

[0020] Dentre os usos das amantadinas como antivirais, descritos no estado da técnica, destacam-se: (i) contra o vírus Influenza, a amantadina impede a acidificação do endossomo, bloqueando a liberação do RNA viral no citoplasma celular, interrompendo assim seu ciclo de multiplicação (HOFFMANN, C.E.; NEU MAYER, E.M.; HAFF, R.F.; GOLSBY, R.A. Mode of action of the antiviral activity of amantadine in tissue culture. Journal of Bacteriology, v. 90, n. 3, p. 623-628. 1965; KAGAN, B.L. Lysosomotropic agents in AIDS treatment. West Journal of Medicine, v. 146, n. 2, p. 234. 1987; WANKA, L; IQBAL, K.; SCHREINER, P.R. The lipophilic bullet hits the targets: medicinal chemistry of adamantane derivatives. Chemical Reviews, v. 113, n. 5, p. 3516-3604. 2013); (ii) contra o virus influenza, Kontarov e colaboradores (2013) comprovaram que o derivado 1-boroadamantano BG12 apresenta atividade inibitória antiviral por ação direta na polimerase viral. Nesse trabalho os autores buscaram estudar o mecanismo envolvido na interação do composto com a membrana viral empregando uma monocamada de fosfolipídios da fosfatidilcolina. Foi verificado que na concentração 10-6 M há uma diferença de potencial da monocamada, fenômeno que pode conduzir a uma diminuição do grau de interação da membrana viral com a membrana celular, favorecendo o seu uso como antivirais para vírus envelopados (KONTAROV, N.A.; et al. Investigation of the inhibition action of antiviral preparation 1-boraadamantane concerning the flu virus. International Journal of Biomedicine, v. 3, n. 1, p/ 44-46. 2013); (iii) contra o virus da Hepatite C, a amantadina inibe a ação da proteína p7 viral, responsável pelo fluxo de íons de cálcio do retículo endoplasmático ao citoplasma, essencial para a formação de partículas infectivas (GRIFFIN, S.D. et al. The p7 protein of hepatitis C virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, amantadine. FEBS Letters, v. 535, p. 34-38. 2003); (iv) contra o HIV foi inicialmente sugerido o uso da amantadina em estágios iniciais da infecção (KAGAN, B.L. Lysosomotropic adents in AIDS treatment. West Journal of Medicine, v. 146, n. 2, p. 234. 1987). Atualmente, um derivado da amantadina, a memantina, é utilizada no tratamento contra a demência associada ao HIV (ZHAO, Y. et al.; ACTG 301 TEAM. Memantine for AIDS dementia complex: open-label reporto f ACTG 301. HIV Clinical Trials, v.11, n.1, p. 59-67. 2010; WANKA, L; IQBAL, K.; SCHREINER, P.R. The lipophilic bullet hits the targets: medicinal chemistry of adamantane derivatives. Chemical Reviews, v. 113, n. 5, p. 3516-3604. 2013).

[0021] Diversos pesquisadores buscam novas terapias com moléculas extraídas de plantas, substâncias químicas utilizadas nas terapias anti-HIV e moléculas imunomodulatórias. No entanto, até o presente momento, não há um tratamento eficaz para as infecções. A grave cronificação causada pelo HTLV-1 torna necessária a busca de possíveis agentes antivirais.

[0022] A presente tecnologia descreve o uso de derivados da amantadina, que possuem o núcleo químico amantadina conjugado a núcleos (hetero)aromáticos a partir de reações de condensação com diferentes aldeídos. No estado da técnica não foi encontrada tecnologia similar que descreva os derivados de amantadina e composições farmacêuticas conforme descrito na presente tecnologia e que tenham atividade contra infecção por HTLV-1.

[0023] A presente tecnologia trata de composições farmacêuticas compreendendo aldiminas sintéticas derivadas da amantadina, isoladas ou em combinação, com atividade imunomoduladora da resposta antiviral para o tratamento de infecções virais provocadas pelo vírus HTLV-1 (Human T Lymphotropic virus 1). Como destacado acima, a imunomodulação tem sido usada como tratamento paliativo dos pacientes infectados pelo HTLV-1, com a utilização de citocinas e corticoesteroides já em uso corrente para outras patologias. Essas abordagens diferem da presente tecnologia, uma vez que as substâncias químicas aqui descritas modulam de maneira diretiva a resposta imune antiviral em células infectadas pelo HTLV-1. Destaca-se ainda que as aldiminas sintéticas, objeto da presente tecnologia, são obtidas em apenas uma etapa de reação, com rendimentos na faixa de 70-90% após 2 minutos de irradiação por micro-ondas (IMO).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A Figura 1 representa a análise da viabilidade celular frente ao uso dos compostos da presente tecnologia, pela determinação do conteúdo de DNA subdiplóide, por citometria de fluxo, utilizando solução fluorocrômica hipotônica (HFS), que lisa a membrana celular permitindo que o DNA seja intercalado pelo lodeto de Propídeo (PI) e se faça a medida do potencial pró-apoptótico das aldiminas testadas nas células MT2 (permanentemente infectadas pelo HTLV-1). 13A: 3F2; 13B: 3F3; e 13C: 3E10. O controle de diluente (etanol) foi considerado como correspondente a 100% da viabilidade celular. A linha preta pontilhada indica 100% da viabilidade e a linha vermelha 80%. CCélula: Controle de Célula; CDiluente: Controle de Diluente. A concentração 1000μM apresentou leve mortalidade celular em 3F2 e 3F3, enquanto que na 3E10 esse efeito foi observado na concentração 100μΜ. Entretanto, em análise estatística com teste OneWay Anova e pós teste de Tukey (p<0,05) não houve diferença estatística entre os três derivados testados e o controle de viabilidade.

[0025] A Figura 2 representa a análise da viabilidade celular pela determinação do conteúdo de DNA subdiplóide após o uso das aldiminas em células Jukart. 14A: 3F2; 14B: 3F3; e 14C: 3E10. O controle de diluente foi considerado como correspondente a 100% da viabilidade celular. A linha preta pontilhada indica 100% da viabilidade e a linha vermelha 80%. CCélula: Controle de Célula; CDiluente: Controle de Diluente. As letras indicam diferença estatística, sendo que letras iguais significam que não houve diferença significativa e letras diferentes indicam essa diferença. Para 3F2, a análise estatística com teste OneWay Anova e pós teste de Tukey mostrou diferença estatística (p<0,05) entre o controle de diluente e as demais amostras, exceto na concentração 1000μM. Essa também foi estatisticamente significativa (p<0,05) para todas as amostras, exceto para a concentração 0,0001 μΜ, que por sua vez foi estatisticamente igual à concentração 100μΜ. Já para 3F3, o mesmo teste mostrou diferença estatística significativa (p<0,05) entre os grupos: controle de diluente e concentração 1000μΜ contra os demais grupos (controle de célula e tratamento nas concentrações 100μΜ a 0,0001 μΜ). Por fim, para 3E10, o teste mostrou diferença estatística significativa (p<0,05) entre os grupos: controle de diluente e concentração 100μΜ contra os demais grupos (controle de célula e tratamento nas concentrações 10μΜ a 0,0001μΜ).

[0026] A Figura 3 representa a análise da atividade mitocondrial celular por MTT, medindo a viabilidade celular após o uso das aldiminas em células MT2. 15A: 3F2; 15B: 3F3; e 15C: 3E10. O controle de diluente foi considerado como correspondente a 100% da viabilidade celular. A linha preta pontilhada indica 100% da viabilidade e a linha vermelha 80%. CCélula: Controle de Célula; CDiluente: Controle de Diluente; CMorte: Controle de Morte. As letras indicam diferença estatística, sendo que letras iguais significam que não houve diferença significativa e letras diferentes indicam essa diferença. Para 3F2, a análise estatística com teste OneWay Anova e pós teste de Tukey mostrou diferença significativa (p<0,05) entre ο controle de morte contra os demais tratamentos e entre o controle de célula e os tratamentos nas concentrações 10μΜ e 0,1 μΜ contra a concentração 0,0001 μM. Para 3F3, a análise estatística mostrou diferença estatística significativa (p<0,05) entre o controle de morte contra os demais tratamentos e o tratamento na concentração 1000pM contra as demais concentrações. E para 3E10, o mesmo teste mostrou diferença estatística significativa (p<0,05) entre o controle de morte e o tratamento na concentração 1000μM contra os demais tratamentos.

[0027] A Figura 4 representa a análise da atividade mitocondrial celular por MTT medindo a viabilidade celular após o uso das aldiminas em células Jurkat. 16A: 3F2; 16B: 3F3; e 16C: 3E10. O controle de diluente foi considerado como correspondente a 100% da viabilidade celular. A linha preta pontilhada indica 100% da viabilidade e a linha vermelha 80%. CCélula: Controle de Célula; CDiluente: Controle de Diluente; CMorte: Controle de Morte. As letras indicam diferença estatística, sendo que letras iguais significam que não houve diferença significativa e letras diferentes indicam essa diferença. A análise estatística com teste OneWay Anova e pós teste de Tukey mostrou para 3F2 diferença estatística significativa (p<0,05) entre os grupos: controle de diluente versus controle de célula, controle de morte e concentrações 1000pM, 100pM, 10pM e 0,1μM; concentração 1000μM versus os demais; concentração 100μM versus controle de diluente, 1000pM, 0,001μM, 0,0001μM e controle de morte; e controle de morte versus os demais. Já para 3F3, houve diferença estatística significativa (p<0,05) entre o controle de morte e o tratamento na concentração 1000pM contra os demais tratamentos. Para 3E10, o teste mostrou diferença estatística significativa (p<0,05) entre o controle de morte e os tratamentos nas concentrações 1000pM e 100pM contra os demais tratamentos.

[0028] A Figura 5 representa a análise da modulação dos genes da imunidade inata à resposta antiviral em células MT2 tratadas com as três aldiminas e utilizando um sistema comercial de análise da resposta imune antiviral em microarranjo. 17A: 3F2; 17B: 3F3; e 17C: 3E10. 1: tratamento na concentração 1μΜ; e 2: tratamento na concentração 0,1μΜ. Os genes marcados em vermelho foram regulados positivamente, os em azul, negativamente e os em preto não foram regulados, tendo como comparação o controle de diluente na concentração 1μΜ e o ponto de corte de regulação gênica de 2 vezes.

[0029] A Figura 6 representa a análise da modulação dos genes da imunidade inata à resposta antiviral em células Jurkat tratadas com as três aldiminas. 18A: 3F2; 18B: 3F3; e 18C: 3E10. O tratamento com os três derivados foi realizado na concentração 1μΜ. Os genes marcados em vermelho foram regulados positivamente, os em azul, negativamente e os em preto não foram regulados, tendo como comparação o controle de diluente na concentração 1μΜ e o ponto de corte de regulação gênica de 2 vezes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[0030] A presente tecnologia trata de aldiminas sintéticas e composições farmacêuticas contendo aldiminas sintéticas, isoladas ou em combinação, com atividade imunomoduladora da resposta antiviral para o tratamento de infecções virais provocadas pelo vírus HTLV-1 (Human T Lymphotropic virus 1).

[0031] Mais especificamente, as aldiminas sintéticas são caracterizadas por apresentarem a seguinte estrutura química, onde a subunidade R é um aldeído aromático, heteroaromático ou alifático:

[0032] Preferencialmente, as aldiminas sintéticas apresentam as seguintes estruturas químicas:

[0033] As composições farmacêuticas contra a infecção por HTLV-1 compreendem as aldiminas sintéticas definidas acima, isoladamente ou em combinação, e apresentam atividade imunomoduladora da resposta antiviral.

[0034] A concentração das aldiminas sintéticas nas composições farmacêuticas varia de 0,0001 μΜ a 1000 pM, sendo que a concentrações preferenciais de uso para a imunomodulação são entre 0,1μM e 1μM.

[0035] As aldiminas sintéticas e as composições farmacêuticas da presente tecnologia podem ser utilizadas para preparar um medicamento para o tratamento de infecções causadas pelo vírus HTLV-1.

[0036] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida pelos exemplos que se seguem, não limitantes da tecnologia.

EXEMPLO 1. OBTENÇÃO DAS ALDIMINAS

[0037] As aldiminas foram obtidas por meio da condensação entre diferentes aldeídos aromáticos e amantadina, utilizando etanol como solvente. Soluções etanólicas contendo quantidades equimolares dos respectivos aldeídos e amantadina foram irradiadas em reator de microondas DISCOVER CEM®, sob as seguintes condições: temperatura de 80°C; potência máxima de 200 watts; tempo de rampa de 2 minutos; tempo de reação de 2 minutos; agitação máxima; e sob resfriamento. Em seguida, os produtos da reação foram purificados por recristalização, utilizando solventes específicos para cada produto obtido. Uma vez purificadas, as aldiminas foram devidamente caracterizadas por espectroscopias no infravermelho (IV) e de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN de 1H e 13C, respectivamente). Os espectros na região do IV foram obtidos em pastilhas de KBr, em espectrofotômetro Spectrum RX I. Os espectros de RMN de 1H (200 MHz) e de RMN de 13C (50 MHz) foram obtidos em espectrômetro Bruker DPX 200 AVANCE, utilizando dimetilsulfóxido [(CD3)2SO] ou clorofórmio (CDCI3) como solventes deuterados. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e referenciados pelos sinais dos respectivos solventes ou do padrão interno tetrametilsilano (TMS).

[0038] A aldimina aromática 3E10 foi obtida por meio da condensação entre o aldeído heteroaromático e a amantadina. O produto da reação foi purificado por recristalização, utilizando etanol como solvente.

[0039] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3E10 apresenta bandas características de estiramento de ligações Csp2-H em 3146 e 3096 cm-1, e Csp3-H em 2906 e 2850 cm-1. A presença do grupamento -NO2 é evidenciada pelas fortes bandas de absorção em 1522 e 1362 cm-1. Bandas provenientes de estiramento das ligações C=N e C=C também são observadas em 1570 e 1488 cm-1.

[0040] No espectro de RMN de 1H do referido composto observam-se dois multipletos nas regiões compreendidas entre δ 1,56-1,79 e δ 2,05-2,16, com integração correspondendo a um total de 15 hidrogénios, atribuídos aos hidrogênios alifáticos da molécula. Um par de dupletos centrados em δ 7,20 e δ7,74, com constantes de acoplamento escalar igual a 3,7 Hz, integrados para um hidrogênio cada, são atribuídos aos hidrogénios do anel furânico.
O sinal referente ao hidrogênio do grupamento -CH=N- é observado como um simpleto em δ 8,22.

[0041] O espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3E10 apresenta um total de 9 sinais, conforme esperado. Numa região mais blindada do espectro verificam-se 4 sinais (δ 28,8, 35,8, 42,4 e 58,7) referentes aos carbonos alifáticos do anel adamantano. Os sinais dos carbonos hidrogenados do anel furânico são observados em δ 114,0 e δ 115,8. Outros três sinais aparecem numa região mais desblindada do espectro, em δ144,6, δ151,9 e δ153,5, que correspondem aos carbonos do grupamento -CH=N-, juntamente com os dois carbonos não hidrogenados do anel furânico.

[0042] A aldimina aromática 3F2 foi obtida por meio da condensação entre o aldeído aromático e a amantadina. O produto da reação foi purificado por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.

[0043] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3F2 apresenta bandas características de estiramento de ligações Csp2-H em 3058 e 3020 cm-1, e Csp3-H em 2914, 2882 e 2848 cm-1. A banda de absorção proveniente do estiramento da ligação C=N é observada em 1638 cm-1, juntamente com as bandas de estiramento de ligações C=C, que aparecem em 1578, 1490 e 1450 cm-1.

[0044] No espectro de RMN de 1H obtido para o composto 3F2 observam-se dois multipletos numa região mais blindada, entre δ1,57-1,89 e δ2,202,28, com integração correspondendo aos 15 hidrogênios da porção alifática da molécula. Outros dois multipletos são observados numa região mais desblindada, entre δ7,27-7,47 e δ7,65-7,81, integrados para três e dois hidrogênios, respectivamente, atribuídos aos 5 hidrogênios do anel aromático do composto. O sinal referente ao hidrogênio do grupamento -CH=N- é observado como um simpleto integrado para um hidrogênio, em δ8,27.

[0045] O espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3F2 apresenta um total de 9 sinais. Os sinais referentes aos carbonos da porção alifática da molécula são observados em δ 29,7, 36,7, 43,3 e 57,6. Outros quatro sinais aparecem numa região mais desblindada do espectro, em δ128,0, 128,6, 130,2 e 137,4, correspondendo aos carbonos do anel aromático. Por fim, o sinal referente ao carbono do grupamento -CH=N- é observado em δ155,0.

[0046] A aldimina aromática 3F3 foi obtida por meio da condensação entre o aldeído aromático e a amantadina. O produto da reação foi purificado por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.

[0047] O espectro obtido na região do infravermelho para a aldimina 3F3 apresenta uma banda de absorção em 3418 cm-1, característica de estiramento de ligações O-H. Bandas provenientes de estiramento de ligações Csp2-H e Csp3-H são observadas em 3048 e 3004, 2908 e 2850 cm-1. A banda de absorção proveniente do estiramento da ligação C=N é observada em 1630 cm-1.

[0048] No espectro de RMN de 1H do referido composto observam-se dois multipletos nas regiões compreendidas entre δ1,61-1,90 e δ2,10-2,25, com integração correspondendo a um total de 15 hidrogênios, atribuídos aos hidrogênios do anel adamantano. Numa região característica de compostos aromáticos observam-se um tripleto centrado em δ6,82, um dupleto centrado em δ6,92 e um multipleto entre δ7,18 e 7,35, correspondendo aos 4 hidrogênios da porção aromática do composto. O sinal referente ao hidrogênio do grupamento -CH=N- é observado como um simpleto em δ8,31. Por fim, em δ 14,52 observa-se um sinal alargado correspondendo ao hidrogênio do grupamento O-H.

[0049] O espectro de RMN de 13C obtido para o composto 3F3 apresenta 4 sinais em δ29,5, 36,4, 43,0 e 57,2, referentes aos carbonos da porção alifática da molécula. Outros cinco sinais são observados em δ117,5, 118,0, 119,0, 131,4 e 132,1, região característica de compostos aromáticos. O sinal referente ao carbono do grupamento -CH=N- é verificado em δ 159,3, juntamente com o sinal referente ao carbono diretamente ligado ao oxigênio, que aparece em δ 162,5.

EXEMPLO 2. TOXICIDADE DAS ALDIMINAS 3F2, 3F3 E 3E10 EM CÉLULAS PERMANENTEMENTE INFECTADAS PELO HTLV-1, MT2, E CÉLULAS JURKAT

[0050] Inicialmente foi necessário verificar se as substâncias sintetizadas no exemplo 1 apresentam toxicidade às células em sistema in vitro. Foram utilizadas células MT2 (uma linhagem de células T transformadas permanentemente infectadas pelo vírus HTLV-1) e células Jurkat (linhagem de células T também transformadas mas não infectadas pelo HTLV-1), como controle não infectado.

[0051] Foram analisados dois parâmetros de mortalidade celular: o primeiro permite medir a porcentagem de células apoptóticas por citometria de fluxo (determinação do conteúdo de DNA subdiplóide, utilizando solução fluorocrômica hipotônica - HFS, que lisa a membrana celular permitindo que o DNA seja intercalado pelo lodeto de Propídeo). Esta análise (HFS) avalia o conteúdo de DNA subdiplóide presente na célula, uma vez que células em apoptose apresentam conteúdo de DNA menor que 2n e células normais de 2n ou 4n. O segundo método permite medir a atividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase de células viáveis que reduzem o tetrazólio (coloração amarela) para sua forma insolúvel (roxa), formando cristais de formazan (MTT). Ambas as análises foram conduzidas utilizando média e desvio padrão de três experimentos independentes. Tanto para o HFS quanto para o MTT, células MT2 ou Jukart foram incubadas por 24h com as aldiminas (3F2, 3F3 e 3E10) nas concentrações 1000pM, 100μΜ, 10μΜ, 1μΜ, 0,1 μΜ, 0,01μΜ, 0,001μΜ e 0,0001Mm. Além disso, foram realizados um controle celular (sem substâncias que pudessem interferir na viabilidade celular), um controle do diluente utilizado nos compostos avaliados (etanol) na maior concentração dos ensaios (1000 μΜ) e um controle de morte celular (a fim de garantir que as células perderiam totalmente a viabilidade em determinada condição).

[0052] Para o ensaio de HFS, foram utilizadas 1x106 células MT2 ou células Jukart, que tiveram os sedimentos celulares ressuspendidos em 300μΙ de HFS (iodeto de propídio 50μg/ml em 0,1% de citrato de sódio e Triton X-100 0,1%) e incubados por 4h a 4°C para análise por citometria de fluxo. Após a delimitação da população em gráficos pontuais de tamanho versus granulosidade, os núcleos foram analisados em histogramas e o conteúdo de DNA subdiplóide foi determinado pelo programa FlowJo e as análises estatísticas foram realizadas no programa GraphPad Prism 6.0, representadas nas Figuras 1 e 2.

[0053] Os resultados apresentados na Figura 1, para as células MT2, e Figura 2, para Jurkat, demonstram que as células tratadas com as aldiminas não apresentaram viabilidade menor que 80%, após 24 horas de tratamento, em nenhuma das concentrações testadas (1000μΜ a 0,0001μΜ), quando em comparação ao controle de diluente (etanol absoluto) na concentração 1000μΜ. Visto que o álcool etílico pode alterar o perfil da célula e as aldiminas foram nele diluídas, o mesmo foi escolhido como parâmetro na avaliação da toxicidade. Para o tratamento em células MT2 não obtiveram diferença estatística significativa entre os tratamentos (p<0,05). Já para o tratamento com as células Jurkat, os gráficos mostram que, o controle de diluente e as substancias na concentração 1000μΜ tiveram uma redução significativa do conteúdo de DNA subdiplóide (p<0,05) quando em comparação com os demais grupos no tratamento com 3F2 e 3F3. Para a 3E10, essa diferença foi entre o controle de diluente e a concentração 100μΜ (p<0,05). É também possível observar que o controle celular ultrapassou o 100% de células viáveis, estabelecido pelo controle de diluente. Embora estatisticamente significativos os números destacados, na Figura 2 observa-se que esta diferença foi pequena, e, que em relação ao controle não tratado, as drogas não apresentaram citotoxicidade utilizando este modelo de análise de mortalidade precoce.

[0054] Para o MTT, foram utilizadas 5,0x104 células MT2 ou Jukart, que foram incubadas com 20μΙ da solução de MTT (5mg/ml) por mais 4 horas ao abrigo de luz. Em seguida, 120μΙ do sobrenadante foi retirado de cada poço e a mesma quantidade de isopropanol acidificado (ácido clorídrico 4M 1% em isopropanol) foi adicionado. As células foram homogeneizadas exaustivamente para que os cristais de formazan fossem solubilizados e posteriormente submetidas à leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda de 595nm. Os resultados foram analisados no programa estatístico GraphPad Prism 6.0 e são representados nas Figuras 3 e 4.

[0055] A avaliação da viabilidade celular por método colorimétrico realizada através do ensaio de MTT analisa a atividade mitocondrial celular, ou seja, é possível inferir sobre a morte tardia da célula. De acordo com os gráficos representados na Figura 3, a aldimina 3F2 causou menor dano às células MT2 quando comparada com os outros derivados da amantadina após 24 horas de tratamento. Nenhuma das concentrações mostrou viabilidade menor que 80%, apesar de em relação ao controle celular, a concentração 10μΜ e 0,1μΜ terem apresentado diferença estatística significativa na concentração 0,0001μΜ. Tanto 3F3 e 3E10 na maior concentração (1000μΜ) apresentaram toxicidade em MT2, quando em comparação com o controle de diluente, com diferença estatística significativa (p<0,05). Pode-se observar nos gráficos da Figura 3 que as células tiveram atividade mitocondrial alterada na presença do etanol (concentração 1000μΜ) quando comparado com o controle celular, entretanto, essa diferença não foi estatisticamente significativa. Para as células Jurkat, de acordo com a Figura 4, os compostos 3F2 e 3F3 mostraram viabilidade menor que 80% apenas na concentração 1000μΜ quando em comparação com o controle de diluente após 24 horas de tratamento (p<0,05). No entanto, o controle de diluente por si só mostrou redução estatisticamente significativa (p<0,05) da atividade mitocondrial quando comparada com o controle celular no experimento realizado com 3F2. Para 3F3, a diferença estatística entre a concentração 1000μΜ e o controle de morte não foi significativa entre si, mas sim entre os demais grupos comparados (p<0,05). Já para 3E10, tanto a concentração de ΙΟΟΟμΜ quanto a de 100μΜ não tiveram diferença estatística com o controle de morte e ambos se mostraram diferentes estatisticamente (p<0,05) dos demais.

EXEMPLO 3. REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE INATA ANTIVIRAL ANTI-HTLV-1 UTILIZANDO AS ALDIMINAS 3F2, 3F3 E 3E10

[0056] Tendo verificado que as substâncias não são tóxicas para as células alvo, foi verificada a influência das aldiminas na expressão de RNA mensageiro de 84 genes constitutivos da cascata da resposta imune antiviral. Para tal, 1x106 células MT2 ou de células Jukart foram incubadas com os derivados 3F2 (A), 3F3 (B) e 3E10 (C) nas concentrações 1μΜ (1) e 0,1μΜ (2) e posteriormente submetidas à extração de RNA total utilizando o sistema RNeasy mini kit (Quiagen catálogo número 74104). Os RNAs totais foram então submetidos à análise da expressão gênica da atividade antiviral celular utilizando o sistema RT2 Profiler PCR Array Antiviral Response (Qiagen catálogo número PAHS-122Z) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a reação, o baseline e o threshold foram definidos e os dados plotados em planilha fornecida pelo fabricante para a análise dos dados em software comercial, representados na Figura 5 (células MT2; HTLV-1 infectadas) e Figura 6 (células Jurkat; não infectadas).

[0057] A avaliação da atividade antiviral frente ao HTLV-1 em células MT2 foi realizada utilizando-se o sistema de PCR em tempo real (RT2 Profiler PCR Array Antiviral Response - Qiagen catálogo número PAHS-122Z) em um arranjo de 84 genes envolvidos na resposta inata antiviral. Após a validação das amostras, as mesmas foram submetidas ao arranjo de PCR e analisadas através do site http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php. Foi feita a média geométrica das amostras que foram normalizadas com o uso dos genes normalizadores ACTB (Actin, beta), B2M (Beta-2-microblobulin), GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) e RPLP0 (Ribosomal protein, large, P0). O ponto de corte empregado para a regulação positiva ou negativa da modulação da expressão dos genes foi de 2,0 vezes em relação ao controle. Após a análise dos resultados, dos 84 genes avaliados no arranjo da resposta antiviral, 32 (38%) foram regulados no total das seis amostras testadas (três derivados analisados em duas concentrações distintas). A Tabela 1 mostra os resultados dos genes analisados e a regulação dos mesmos em relação ao controle de diluente para células MT2 e Jurkat. As células Jurkat foram utilizadas neste experimento como parâmetro de comparação entre um modelo celular permanentemente infectado pelo vírus HTLV-1 (MT2) e não infectado (Jurkat), uma vez que ambas são linfócitos T transformados (linfoblastos). Foram feitos gráficos do tipo scatter plotter para cada amostra com os 32 genes regulados (Figura 5 [células MT2; HTLV-1 infectadas] e Figura 6 [células Jurkat; não infectadas]).

[0058] Tabela 1. Regulação do RNA mensageiro de genes envolvidos na resposta imune inata antiviral em células MT2 e Jurkat.

[0059] As Figuras 5 (MT2) e 6 (Jurkat) mostram que as aldiminas modularam de forma diferente os genes analisados, atuando de forma dose-dependente. Pode-se observar na Tabela 1 que, dos 32 genes modulados nas vias antivirais estudadas, vinte e dois genes (22 - 69%) pertencem às vias dos receptores do tipo Toll, quatro genes (4 - 12,5%) pertencem às vias dos receptores do tipo NOD, cinco genes (5 -15,6%) às vias dos receptores do tipo RIG-I e um gene (1 - 3%) às vias de sinalização do Interferon tipo I. Considerando-se que as células Jurkat configuram o controle não infectado e MT2 as células infectadas pelo HTLV-1, os compostos (nas concentrações de 1μΜ e/ou 0,1μΜ) 3F2 e 3F3 induziram modulação na Jurkat em 6 genes versus 11 em MT2 e o composto 3E10 induziu modulação na Jurkat em 5 genes versus 29 em MT2.

[0060] Esse conjunto de dados comprova que a imunomodulação e interação com os disparos das vias antivirais deram-se em seu maior número nas células infectadas pelo HTLV-1, comprovando sua especificidade. Considerando-se que a infecção pelo HTLV-1 causa desregulação do sistema imune levando a desfechos clínicos de péssimo prognóstico, induzindo adoecimento neoplásico e/ou desmielinizante à medida que o tempo de infecção se instala e a cronificação viral se agrava, estes compostos aqui estudados possuem o potencial de serem utilizados no tratamento de indivíduos infectados.

Claims (8)

1. ALDIMINA SINTÉTICA, caracterizada por compreender a seguinte estrutura química, onde a subunidade R é um aldeído aromático, heteroaromático ou alifático:

   
2. ALDIMINA SINTÉTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seguinte estrutura química:

   
3. ALDIMINA SINTÉTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seguinte estrutura química:

   
4. ALDIMINA SINTÉTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a seguinte estrutura química:

   
5. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTRA A INFECÇÃO POR HTLV-1, caracterizadas por compreenderem as moléculas definidas nas reivindicações 1 a 4, isoladamente ou em combinação.
6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTRA A INFECÇÃO POR HTLV-1, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas pela concentração de aldiminas variar de 0,0001 μΜ a 1000 pM, preferencialmente variar entre 0,1μM e 1μM.
7. USO das aldiminas definidas nas reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de infecções causadas pelo vírus HTLV-1.
8. USO das composições farmacêuticas definidas nas reivindicações 5 e 6, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de infecções causadas pelo vírus HTLV-1.

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