BR102017010378A2 - magnetic nanoparticles decorated with complementary function molecules, cancer diagnostic, therapy and theragnostic reactive kit and its use, radiolabelled nanoparticles for diagnosis or therapy and its use - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se as nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares tais como reconhecimento e vetorização, preferencialmente, aptâmero anti-muc1 e anticorpo monoclonal trastuzumabe, além de moléculas como ácido dietileno triamina pentaacético (dtpa), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (dota) e ácido etileno diamina tetraacético (edta), com capacidade para ligação de agentes de contraste para diagnóstico tais como os radioisótopos tecnécio-99m e gálio-68; e agentes de tratamento por radioterapia tais como cobalto-60 e iodo-131. adicionalmente, a invenção refere-se a um kit de diagnóstico compreendendo as ditas nanopartículas para diagnóstico ou tratamento de câncer.The present invention relates to magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions such as recognition and vectorization, preferably anti-muc1 aptamer and trastuzumab monoclonal antibody, as well as molecules such as diethylene triamine pentaacetic acid (dtpa), 1,4,7 acid 10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (dota) and ethylene diamine tetraacetic acid (edta) capable of binding diagnostic contrast agents such as technetium-99m and gallium-68 radioisotopes; and radiotherapy agents such as cobalt-60 and iodine-131. Additionally, the invention relates to a diagnostic kit comprising said nanoparticles for diagnosis or treatment of cancer.

Description

(54) Título: NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DECORADAS COM MOLÉCULAS COM FUNÇÕES COMPLEMENTARES, KIT DE REATIVOS PARA DIAGNÓSTICO, TERAPIA E TERAGNÓSTICA DE CÂNCER E SEU USO, NANOPARTÍCULAS RADIOMARCADAS PARA DIAGNÓSTICO OU TERAPIA E SEU USO (51) Int. Cl.: A61K 47/69; A61K 39/44; A61K 39/385; A61K 51/12; A61K 103/10; (...).(54) Title: MAGNETIC NANOPARTICLES DECORATED WITH MOLECULES WITH COMPLEMENTARY FUNCTIONS, DIAGNOSTIC REACTIVES KIT, THERAPY AND CANCER TERAGNOSIS AND ITS USE, RADIOMARCED NANOPARTICLES FOR DIAGNOSIS OR 51 USE. ; A61K 39/44; A61K 39/385; A61K 51/12; A61K 103/10; (...)

(71) Depositante(es): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP.(71) Depositor (s): UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP.

(72) lnventor(es): KOITI ARAKI; RALPH SANTOS OLIVEIRA; SÉRGIO HIROSHI TOMA.(72) Inventor (s): KOITI ARAKI; RALPH SANTOS OLIVEIRA; SÉRGIO HIROSHI TOMA.

(57) Resumo: A presente invenção refere-se as nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares tais como reconhecimento e vetorização, preferencialmente, aptâmero anti-MUCl e anticorpo monoclonal Trastuzumabe, além de moléculas como ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano1,4,7,10-tetraacético (DOTA) e ácido etileno diamina tetraacético (EDTA), com capacidade para ligação de agentes de contraste para diagnóstico tais como os radioisótopos tecnécio-99m e gálio-68; e agentes de tratamento por radioterapia tais como cobalto60 e iodo-131. Adicionalmente, a invenção refere-se a um kit de diagnóstico compreendendo as ditas nanopartículas para diagnóstico ou tratamento de câncer.(57) Abstract: The present invention relates to magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions such as recognition and vectoring, preferably anti-MUCl aptamer and monoclonal antibody Trastuzumab, in addition to molecules such as diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), acid 1,4,7,10-tetraazacyclododecane1,4,7,10-tetraacetic (DOTA) and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), capable of binding contrast agents for diagnosis such as technetium-99m radioisotopes and gallium-68 ; and radiotherapy treatment agents such as cobalt60 and iodine-131. In addition, the invention relates to a diagnostic kit comprising said nanoparticles for diagnosis or treatment of cancer.

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NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS DECORADAS COM MOLÉCULAS COM FUNÇÕES COMPLEMENTARES, KIT DE REATIVOS PARA DIAGNÓSTICO, TERAPIA E TERAGNÓSTICA DE CÂNCER E SEU USO, NANOPARTÍCULASMAGNETIC NANOPARTICLES DECORATED WITH MOLECULES WITH COMPLEMENTARY FUNCTIONS, KIT OF REACTIVES FOR DIAGNOSIS, THERAPY AND TERAGNOSIS OF CANCER AND ITS USE, NANOPARTICLES

RADIOMARCADAS PARA DIAGNÓSTICO OU TERAPIA E SEU USORADIOMARKETS FOR DIAGNOSIS OR THERAPY AND ITS USE

Campo da Invenção:Field of the Invention:

[001] A presente invenção se insere no campo dos materiais de dimensões nanométricas, superparamagnéticos, não tóxicos e aplicáveis em terapia e/ou como agentes de contraste para diagnóstico multitécnica, uma vez que refere-se a nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares tais como reconhecimento e vetorização, preferencialmente, aptâmero anti-MUCl e anticorpo monoclonal Trastuzumabe, além de moléculas como DTPA para ligação de agentes de contraste para diagnóstico tais como os radioisótopos; além de agentes de tratamento por radioterapia.[001] The present invention is inserted in the field of materials of nanometric dimensions, superparamagnetic, non-toxic and applicable in therapy and / or as contrast agents for multitechnical diagnosis, since it refers to magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions such as recognition and vectoring, preferably anti-MUCl aptamer and monoclonal antibody Trastuzumab, in addition to molecules such as DTPA for the binding of diagnostic contrast agents such as radioisotopes; in addition to radiotherapy treatment agents.

Fundamentos da Invenção e Estado da técnica:Basics of the Invention and State of the Art:

[002] Diante de um cenário mundial de aumento da incidência de doenças altamente agressivas como o câncer, cujo diagnóstico precoce se torna cada vez mais importante para mitigar os efeitos e aumentar a sobrevida, bem como a qualidade de vida dos pacientes, muitos equipamentos e técnicas de diagnóstico estão sendo desenvolvidos para melhor atenderem às necessidades da sociedade e estão majoritariamente presentes em hospitais e laboratórios de análises clínicas.[002] Faced with a worldwide scenario of increasing incidence of highly aggressive diseases such as cancer, whose early diagnosis becomes increasingly important to mitigate the effects and increase survival, as well as the quality of life of patients, many equipment and diagnostic techniques are being developed to better meet the needs of society and are mostly present in hospitals and clinical analysis laboratories.

[003] Atualmente, diversos radiofármacos já vêm sendo utilizados tanto para o diagnóstico como para o tratamento de doenças como o câncer. Aproximadamente 40 desses compostos são utilizados para imagem em medicina[003] Currently, several radiopharmaceuticals are already being used for both diagnosis and treatment of diseases such as cancer. Approximately 40 of these compounds are used for medical imaging

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2/41 nuclear no Brasil, gerando um volume de exames correspondente a 80% da rotina clínica de um serviço de medicina nuclear. Isso corresponde a aproximadamente 2 milhões de procedimentos/ano somente nos Estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. No mundo esses números chegam a mais de 100 milhões de procedimentos, movimentando um mercado de mais de 2 bilhões de dólares ao ano.2/41 nuclear in Brazil, generating a volume of tests corresponding to 80% of the clinical routine of a nuclear medicine service. This corresponds to approximately 2 million procedures / year in the states of Rio de Janeiro and São Paulo alone. In the world these numbers reach more than 100 million procedures, moving a market of more than 2 billion dollars a year.

[004] De fato, há uma demanda clínica expressiva por novos materiais que possibilitem o desenvolvimento de métodos mais precisos, com maior sensibilidade e menores custos para o diagnóstico e o tratamento de câncer. Atualmente, os métodos convencionais de diagnóstico por imagem tais como pelas técnicas de ressonância magnética nuclear, tomografia por emissão de pósitrons, tomografia por emissão de fóton único, imagem poi coincidência, gamagrafia, cintilografia, computadorizada por raios-X e imagem por ultrassonografia permitem acessar apenas a imagem morfológica do tumor.[004] In fact, there is an expressive clinical demand for new materials that enable the development of more accurate methods, with greater sensitivity and lower costs for the diagnosis and treatment of cancer. Currently, conventional diagnostic imaging methods such as nuclear magnetic resonance, positron emission tomography, single photon emission tomography, coincidence imaging, gamma, scintigraphy, X-ray computed and ultrasound imaging allow access only the morphological image of the tumor.

[005] Todavia, há um forte direcionamento no sentido de tornar os diagnósticos mais personalizados e capazes de identificar as anomalias em nível celular e molecular, possibilitando diagnósticos cada vez mais precoces, precisos e adaptados para cada paciente. Esta é a tendência da medicina moderna, cujos princípios básicos se fundamentam na utilização de nanoagentes conjugados simultaneamente com moléculas/biomoléculas com diferentes propriedades ou habilidades. Uma das mais importantes nesse sentido é a capacidade de reconhecer e se ligar a moléculas ou estruturas expressas por células ou tecidos tumorais específicos, concentrando-se com elevado grau de câmara de tomografia[005] However, there is a strong direction towards making diagnoses more personalized and capable of identifying anomalies at the cellular and molecular level, enabling increasingly early, accurate and adapted diagnoses for each patient. This is the trend of modern medicine, whose basic principles are based on the use of nanoagents conjugated simultaneously with molecules / biomolecules with different properties or abilities. One of the most important in this regard is the ability to recognize and bind to molecules or structures expressed by specific tumor cells or tissues, concentrating with a high degree of tomography chamber

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3/41 especificidade a estes de modo a permitir a localização, diagnóstico e tratamento/eliminação dos mesmos.3/41 specificity to these in order to allow their localization, diagnosis and treatment / elimination.

[006] De fato, nanopartículas multifuncionalizadas apresentam as características ideais, pois, seu tamanho é cerca de 100 a 1000 vezes menor que o tamanho de células, e podem ter ligados à sua superfície os mais variados tipos de moléculas e biomoléculas. Além disso, seu pequeno tamanho permite que não somente possam ser usados para sondar a superfície das células, mas também o interior das células. Consequentemente, o domínio da tecnologia de nanopartículas abre novos horizontes para o desenvolvimento de sondas altamente sensíveis e voltadas para alvos moleculares específicos abrindo novas perspectivas para o diagnóstico por imagem.[006] In fact, multifunctionalized nanoparticles have the ideal characteristics, because their size is about 100 to 1000 times smaller than the size of cells, and the most varied types of molecules and biomolecules may have attached to their surface. In addition, their small size allows them to not only be used to probe the cell surface, but also the inside of the cells. Consequently, the mastery of nanoparticle technology opens new horizons for the development of highly sensitive probes aimed at specific molecular targets, opening new perspectives for diagnostic imaging.

[007] Na prática clínica, os exames de diagnóstico são realizados para complementar e corroborar os dados históricos e o exame físico/clínico efetuado nos pacientes para a elucidação de seu diagnóstico. Por isso, é fundamental que o resultado do exame seja rápido, precoce e preciso para que seja tomada a melhor conduta ao tratamento do paciente.[007] In clinical practice, diagnostic tests are carried out to complement and corroborate historical data and the physical / clinical examination performed on patients to elucidate their diagnosis. Therefore, it is essential that the test result is fast, early and accurate so that the best approach to patient treatment is taken.

[008] Atualmente, existem centenas de exames de diagnóstico laboratoriais e de imagem disponíveis no mercado, mas, as técnicas de diagnóstico por imagem ganham destaque por fornecer riqueza de detalhes como avaliação anatômica, morfológica e até funcional dos órgãos e estruturas internas de interesse.[008] Currently, there are hundreds of laboratory and imaging diagnostic tests available on the market, but diagnostic imaging techniques are highlighted for providing a wealth of details such as anatomical, morphological and even functional evaluation of the internal organs and structures of interest.

[009] Dentre todas as técnicas de diagnóstico por imagem, a imagem por ressonância magnética (IRM) destaca-se por não ser invasiva, não utilizar fonte de radiações[009] Among all diagnostic imaging techniques, magnetic resonance imaging (MRI) stands out for not being invasive, not using a radiation source

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4/41 ionizantes, oferecer imagens multiplanares da região de interesse investigativo, diferenciar tipos de tecidos e estruturas baseados na intensidade de sinal, ter bom contraste de imagem e alta resolução espacial. Por outro lado, as técnicas baseadas em radiofármacos se caracterizam por apresentarem sensibilidades muito elevadas.4/41 ionizing, offer multiplanar images of the region of investigative interest, differentiate types of tissues and structures based on signal intensity, have good image contrast and high spatial resolution. On the other hand, radiopharmaceutical-based techniques are characterized by having very high sensitivities.

[010] Agentes de contraste de IRM baseados em nanopartículas de magnetita, como Resovist® e Endorem®, já estão sendo comercializados nos EUA e na Europa como agentes de diagnóstico mais eficazes e mais seguros, particularmente tendo-se em vista sua baixa toxicidade e elevada biocompatibilidade. Investigações anteriores mostraram que o aumento de contraste de IRM por nanopartículas superparamagnéticas está fortemente relacionada com sua composição, tamanho, propriedades de superfície e com o grau de agregação no meio biológico.[010] MRI contrast agents based on magnetite nanoparticles, such as Resovist® and Endorem®, are already being marketed in the USA and Europe as more effective and safer diagnostic agents, particularly in view of their low toxicity and high biocompatibility. Previous research has shown that the increase in MRI contrast by superparamagnetic nanoparticles is strongly related to their composition, size, surface properties and the degree of aggregation in the biological environment.

[011] Nanomateriais baseados em óxidos de ferro são interessantes para aplicações biomédicas, porque geralmente apresentam baixa toxicidade, as matérias-primas são abundantes e de baixo custo, e a produção é relativamente simples. Dentre todos os tipos de óxidos de ferro naturalmente encontrados, magnetita (FeaCU) e maguemita (y-FezOi) são os materiais magnéticos mais utilizados como agentes de contraste para IRM e para o desenvolvimento de novos nanomateriais para diagnóstico e terapêutica.[011] Nanomaterials based on iron oxides are interesting for biomedical applications, because they generally have low toxicity, raw materials are abundant and low cost, and production is relatively simple. Among all types of iron oxides naturally found, magnetite (FeaCU) and maguemite (y-FezOi) are the magnetic materials most used as contrast agents for MRI and for the development of new nanomaterials for diagnosis and therapy.

[012] Alguns documentos de patente tratam de nanopartículas e seus usos nas áreas médicas, como apresentados a seguir:[012] Some patent documents deal with nanoparticles and their uses in the medical fields, as shown below:

[013] O documento WO15104664A1 revela[013] WO15104664A1 reveals

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5/41 nanopartículas magnéticas funcionalizadas com catecol compreendendo magnetita e recobertas ou não com biopolímeros. Não obstante, o documento foca em partículas com tamanhos maiores (100 nm) assim como sua aplicação para técnicas diagnosticas como IRM. Ainda, as nanopartículas não compreendem material radioativo e não se referem a avaliação in vivo.5/41 magnetic nanoparticles functionalized with catechol comprising magnetite and covered or not with biopolymers. Nevertheless, the document focuses on particles with larger sizes (100 nm) as well as its application for diagnostic techniques such as MRI. Furthermore, nanoparticles do not comprise radioactive material and do not refer to in vivo evaluation.

[014] Idealmente, as nanopartículas magnéticas para o diagnóstico por ressonância magnética devem exibir comportamento superparamagnético e induzir grande mudança no tempo de relaxação transversal (também denominado relaxação spin-spin, T2) sem apresentar agregação magnética espontânea. Este comportamento é apresentado por nanopartículas bem pequenas, particularmente as nanopartículas ultra-pequenas com diâmetros menores que 10 nm, por serem iguais ou menores em tamanho do que os domínios magnéticos presentes nos materiais magnéticos macroscópicos. Além disso, elas devem ser totalmente dispersáveis em água e em meio biológico, ser biocompatível para evitar resposta tóxica e imunológica e devem apresentar algumas rotas químicas ou físicas para fixar biomoléculas a sua superfície, tais como anticorpos ou outras proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos ou peptídeos, aptâmeros, lipídeos, de acordo com a aplicação desej ada.[014] Ideally, magnetic nanoparticles for the diagnosis by magnetic resonance should exhibit superparamagnetic behavior and induce a large change in the time of transversal relaxation (also called spin-spin relaxation, T2) without presenting spontaneous magnetic aggregation. This behavior is shown by very small nanoparticles, particularly ultra-small nanoparticles with diameters less than 10 nm, as they are equal or smaller in size than the magnetic domains present in macroscopic magnetic materials. In addition, they must be fully dispersible in water and in a biological environment, be biocompatible to avoid a toxic and immunological response and must present some chemical or physical routes to fix biomolecules to their surface, such as antibodies or other proteins, carbohydrates, acids nucleic or peptides, aptamers, lipids, according to the desired application.

[015] O câncer de próstata é a segunda maior causa de óbitos contabilizando cerca de 30.000 mortes e cerca de[015] Prostate cancer is the second leading cause of death accounting for about 30,000 deaths and about

230.000 novos casos reportados nos Estados Unidos em 2004. Os diagnósticos têm melhorado com a disponibilização no mercado do ensaio de PSA (Antígeno Prostático Específico) e230,000 new cases reported in the United States in 2004. The diagnoses have improved with the availability of the PSA (Prostatic Specific Antigen) assay and

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PSA sensitivo. Porém, ainda apresentam limitações pois o diagnóstico clínico definitivo continua sendo realizado por biópsia. Por outro lado, sua sensibilidade ainda não é suficiente para detectar cerca da metade dos tumores considerados agressivos encontrados em pacientes com nível de PSA considerado normal.Sensitive PSA. However, they still have limitations because the definitive clinical diagnosis continues to be made by biopsy. On the other hand, its sensitivity is still not sufficient to detect about half of the tumors considered aggressive found in patients with a PSA level considered normal.

[016] O câncer de mama é considerado uma epidemia mundial, afetando homens e mulheres, numa proporção de 1,7 milhão de novos casos no mundo em 2014. No Brasil mais de mil novos casos foram registrados em 2014. Ainda que, a mamografia seja o exame de escolha, ela apresenta limitações severas, em especial na detecção precoce de tumores malignos do tipo trinegativo, onde nenhum marcador adequado é encontrado até atingir processos substancialmente agressivos.[016] Breast cancer is considered a worldwide epidemic, affecting men and women, in a proportion of 1.7 million new cases in the world in 2014. In Brazil, more than a thousand new cases were registered in 2014. Although, mammography be it the exam of choice, it has severe limitations, especially in the early detection of malignant tumors of the trinegative type, where no suitable marker is found until reaching substantially aggressive processes.

[017] O documento US20020015679 descreve nanopartícuias já radioativas, ou seja, as nanopartícuias que irão incorporar os vetores biológicos, tais como anticorpos monoclonais, peptídeos e outros, partindo de uma nanopartícula radioativa, para em seguida, ser incorporado esse material. Desse modo, uma vez que a nanopartícula já é radioativa ele deve ser vendido como radiofármaco pronto para uso (solução extemporânea). Diferentemente e de forma contrária, na presente invenção parte-se de uma nanopartícula fria (ou seja, não radioativa) a qual se incorpora (liga-se) aos vetores biológicos para em seguida, e como fim de processo, se inserir o elemento radioativo. Essa diferença é crucial e possibilita o estabelecimento de Kits frios para formação de radiofármacos pelo método in house.[017] The document US20020015679 describes nanoparticles that are already radioactive, that is, the nanoparticles that will incorporate biological vectors, such as monoclonal antibodies, peptides and others, starting from a radioactive nanoparticle, and then this material will be incorporated. Thus, since the nanoparticle is already radioactive, it must be sold as a ready-to-use radiopharmaceutical (extemporaneous solution). Differently and in the opposite way, in the present invention, a cold (ie, non-radioactive) nanoparticle is started, which is incorporated (binds) to the biological vectors and then, as a process end, the radioactive element is inserted . This difference is crucial and allows the establishment of cold kits for the formation of radiopharmaceuticals by the in house method.

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7/41 [018] Assim, a tecnologia ora proposta nesta invenção é nova e inventiva frente ao estado da técnica. Apresentamos nanopartículas de magnetita superparamagnéticas ultrapequenas (~7 nm de diâmetro) e funcionalizadas com aptâmeros anti-MUCl, DTPA e anticorpos monoclonais, totalmente dispersáveis em meio aquoso e capazes de ligar Tc-99m e Ga-68 (radioativos). Tais nanopartículas demonstraram ter capacidade de se ligar seletivamente a câncer de próstata e de mama implantados em ratos Wistar, demonstrando alta capacidade de vetorização molecular, apesar de serem parcialmente filtrados pelos rins após injeção retro-orbital. Portanto, os cold kits da presente invenção apresentaram alta eficiência de marcação radioativa (>90%) com Tc-99m e Ga-68, podendo ser utilizados tanto para SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) como para PET (Positron Emission Tomography), PET/CT, SPECT/CT, PET/IRM, SPECT/IRM, cintilografia, dentre outros.7/41 [018] Thus, the technology now proposed in this invention is new and inventive in view of the state of the art. We present ultra-small superparamagnetic magnetite nanoparticles (~ 7 nm in diameter) and functionalized with anti-MUCl, DTPA and monoclonal antibodies, fully dispersible in aqueous medium and capable of binding Tc-99m and Ga-68 (radioactive). Such nanoparticles have been shown to have the ability to selectively bind to prostate and breast cancer implanted in Wistar rats, demonstrating a high molecular vectorization capacity, despite being partially filtered by the kidneys after retro-orbital injection. Therefore, the cold kits of the present invention showed high efficiency of radioactive marking (> 90%) with Tc-99m and Ga-68, and can be used for both SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) and PET (Positron Emission Tomography), PET / CT, SPECT / CT, PET / IRM, SPECT / IRM, scintigraphy, among others.

Breve Descrição da Invenção:Brief Description of the Invention:

[019] A presente invenção refere-se a nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares tais como reconhecimento e vetorização, preferencialmente, aptâmero anti-MUCl e anticorpo monoclonal Trastuzumabe, além de moléculas como ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetraacético (DOTA) e ácido etileno diamina tetraacético (EDTA), com capacidade para ligação de agentes de contraste para diagnóstico tais como os radioisótopos tecnécio-99m (Tc-99m), gálio-68 (Ga68) , sódio-22 (Na-22), flúor-18 (F-18), cobre-64 (CuPetição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 15/75[019] The present invention relates to magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions such as recognition and vectoring, preferably, anti-MUCl aptamer and monoclonal antibody Trastuzumab, in addition to molecules such as diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), acid 1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-l, 4,7,10-tetraacetic (DOTA) and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), capable of binding contrast agents for diagnosis such as technetium-99m radioisotopes (99m Tc) ), gallium-68 (Ga68), sodium-22 (Na-22), fluorine-18 (F-18), copper-64 (CuPetição 870170032828, 05/17/2017, page 15/75

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67/64), rubídio-82 (Rb-82), estrôncio-82 (Sr-82), e talio201 (Tl-201), zircônio-89 (Zr-89), dentre outros, preferencialmente Tc-99m e Ga-68; além de agentes de tratamento por radioterapia tais como cobalto-60 (Co-60), iodo-131 (1-131), iodo-125 (1-125), fosforo-32 (P-32), irídio-192 (Ir-192), renio-186 (Re-188/186) , estrôncio-89 (Sr-89), e samário-153 (Sm-153), dentre outros.67/64), rubidium-82 (Rb-82), strontium-82 (Sr-82), and talio201 (Tl-201), zirconium-89 (Zr-89), among others, preferably Tc-99m and Ga- 68; in addition to radiotherapy treatment agents such as cobalt-60 (Co-60), iodine-131 (1-131), iodine-125 (1-125), phosphorus-32 (P-32), iridium-192 (Ir -192), renio-186 (Re-188/186), strontium-89 (Sr-89), and samarium-153 (Sm-153), among others.

[020] Desta forma, a presente invenção adicionalmente refere-se às nanopartículas radiomarcadas e seu kit, as quais se caracterizam por apresentarem capacidade de vetorização, além de se manterem dispersas no sistema circulatório, em especial por meio de ligação à proteínas plasmáticas, em especial à albumina, por tempo suficiente para interagirem e serem incorporados pelas células e tecidos tumorais, ou seja não tendem a formar aglomerados que sejam facilmente reconhecidos pelo sistema imune ou que venham a obstruir vasos sanguíneos, características indispensáveis de materiais com potencial aplicação como radiofármacos para diagnóstico e tratamento de tumores.[020] Thus, the present invention additionally refers to radiolabelled nanoparticles and their kit, which are characterized by their ability to vectorize, in addition to being dispersed in the circulatory system, in particular through binding to plasma proteins, in albumin, long enough to interact and be incorporated by tumor cells and tissues, that is, they do not tend to form clusters that are easily recognized by the immune system or that will clog blood vessels, indispensable characteristics of materials with potential application as radiopharmaceuticals for diagnosis and treatment of tumors.

Breve Descrição das Figuras:Brief Description of the Figures:

[021] A Figura 1 representa um esquema mostrando as etapas para marcação da nanopartícula multifuncionalizadas com um radionuclídeo, por exemplo, Tc99m, gerando nanopartículas radiomarcadas para diagnostico e/ou terapia.[021] Figure 1 represents a schematic showing the steps for marking the multifunctionalized nanoparticle with a radionuclide, for example, Tc99m, generating radiolabeled nanoparticles for diagnosis and / or therapy.

[022] [022] A Figura 2 Figure 2 representa uma gamagrafia represents a gammagraphy da gives cromatografia chromatography ascendente upward em papel on paper (Whatman n ° (Whatman No. D D demonstrando demonstrating a eficiência the efficiency do processo of the process de marcação das marking nanopartículas nanoparticles de óxido de of oxide ferro funcionalizadas com iron functionalized with o O

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9/41 aptâmero anti-MUCl em relação ao pertecnetato livre (Na(Tc99m)C>4^_) como referência, usando acetona como eluente.9/41 anti-MUCl aptamer in relation to free pertechnetate (Na (99m Tc) C> 4 ^_ ) as a reference, using acetone as the eluent.

[023] A Figura 3 mostra a biodistribuição in vivo em ratos do multiagente de contraste baseado em nanopartículas de óxido de ferro administrado via injeção retro-orbital.[023] Figure 3 shows the in vivo biodistribution in rats of the contrast agent multi-agent based on nanoparticles of iron oxide administered via retro-orbital injection.

[024] A Figura 4 mostra a percentagem de células viáveis em função da concentração do multiagente de contraste baseado em nanopartículas de óxido de ferro, utilizando culturas de linhas de células cancerosas SKOV-3, MCF-7, MDA-MB-231, HepG2, e A54 9. A viabilidade celular foi determinada por ensaio de metabolização de sais de tetrazólio (MTT) e os valores indicados se referem à média ±SD (±DP) de três experimentos independentes.[024] Figure 4 shows the percentage of viable cells as a function of the concentration of the multi-agent contrast agent based on iron oxide nanoparticles, using cultures of cancer cell lines SKOV-3, MCF-7, MDA-MB-231, HepG2 , and A54 9. Cell viability was determined by tetrazolium salt metabolism assay (MTT) and the values indicated refer to the mean ± SD (± SD) of three independent experiments.

[025] A Figura 5 apresenta a imagem de bioluminescência mostrando o desenvolvimento de câncer de mama 21 dias após inoculação subcutânea de 100 pL de suspensão de MDA-MB-231 (1 χ 10⁶ células) no flanco direito de ratos nude Balb/c fêmeas de 8-9 semanas de vida.[025] Figure 5 shows the bioluminescence image showing the development of breast cancer 21 days after subcutaneous inoculation of 100 pL of MDA-MB-231 suspension (1 χ 10 ⁶ cells) on the right flank of nude Balb / c mice females 8-9 weeks old.

[026] A Figura 6 mostra a imagem de coincidência obtida usando câmera Millenium Gamma (janela centrada em 140 KeV) 90 minutos após injeção retro-orbital do multiagente de contraste marcado com Tc-99m. A imagem mostra a vetorização e concentração das nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com o aptâmero anti-MUCl para câncer de mama implantado no dorso de camundongos nude Balb/c fêmea de 8-9 semanas de vida.[026] Figure 6 shows the coincidence image obtained using a Millenium Gamma camera (window centered on 140 KeV) 90 minutes after retro-orbital injection of the Tc-99m contrast agent. The image shows the vectorization and concentration of the iron oxide nanoparticles functionalized with the anti-MUCl aptamer for breast cancer implanted on the back of nude Balb / c mice aged 8-9 weeks old.

[027] A Figura 7 apresenta a imagem de bioluminescência mostrando o desenvolvimento de câncer de próstata 21 dias após inoculação subcutânea de 100 pL de[027] Figure 7 shows the bioluminescence image showing the development of prostate cancer 21 days after subcutaneous inoculation of 100 pL of

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 17/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 17/75

10/41 suspensão de PC-3 (1 χ 10⁶ células) no flanco direito de ratos nude Balb/c machos de 8-9 semanas de vida.10/41 suspension of PC-3 (1 χ 10 ⁶ cells) on the right flank of nude male Balb / c rats aged 8-9 weeks.

[028] A Figura 8 mostra a imagem planar obtida usando câmera Millenium Gamma (janela centrada em 140 KeV), 90 minutos após injeção retro-orbital do multiagente de contraste marcado com Tc-99m em camundongos Balb/c machos induzidos com câncer de próstata, em que (A) mostra o rato de corpo inteiro e (B) mostra o tumor extirpado.[028] Figure 8 shows the planar image obtained using a Millenium Gamma camera (window centered on 140 KeV), 90 minutes after retro-orbital injection of the Tc-99m marked multi-agent contrast agent in male Balb / c mice induced with prostate cancer. , where (A) shows the rat full body and (B) shows the excised tumor.

[029] A Figura 9 mostra o perfil cromatográfico HPLC em diferentes tempos e temperaturas, em que (A) refere-se à marcação à temperatura ambiente por 7 minutos, (B) refere-se à marcação à temperatura de 80 °C por 30 minutos e (C) refere-se à marcação a temperatura de 80°C por 60 minutos, confirmando que o processo de marcação ocorre em 7 minutos à temperatura ambiente e que alterações no tempo e temperatura não alteram a estabilidade da radiomarcação.[029] Figure 9 shows the HPLC chromatographic profile at different times and temperatures, where (A) refers to the marking at room temperature for 7 minutes, (B) refers to the marking at 80 ° C for 30 minutes. minutes and (C) refers to the marking at 80 ° C for 60 minutes, confirming that the marking process occurs in 7 minutes at room temperature and that changes in time and temperature do not change the stability of the radial marking.

[030] A Figura 10 mostra o cromatograma HPLC de nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com aptâmero anti-MUCl, antes da marcação radioativa de modo a confirmar a presença do aptâmero anti-MUCl e de possíveis nucleotídeos. O cromatograma demonstra inequivocamente a presença do aptâmero anti-MUCl ainda que na presença de possíveis nucleotídeos frutos da degradação do aptâmero original.[030] Figure 10 shows the HPLC chromatogram of iron oxide nanoparticles functionalized with anti-MUCl aptamer, before radioactive labeling in order to confirm the presence of the anti-MUCl aptamer and possible nucleotides. The chromatogram unequivocally demonstrates the presence of the anti-MUCl aptamer even though in the presence of possible nucleotides resulting from the degradation of the original aptamer.

[031] A Figura 11 mostra o cromatograma HPLC de Ga-68 livre e de aptâmero anti-MUCl marcado quando injetado sem filtração esterilizante da amostra final ou sem purificação proteica da amostra [032] A Figura 12 mostra o gráfico de[031] Figure 11 shows the HPLC chromatogram of free Ga-68 and labeled anti-MUCl aptamer when injected without sterilizing filtration of the final sample or without protein purification of the sample [032] Figure 12 shows the graph of

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 18/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 18/75

11/41 biodistribuição da magnetita decorada com aptâmero antiMUC1 radiomarcada com Ga-68.11/41 biodistribution of magnetite decorated with anti-MUC1 aptamer radiolabelled with Ga-68.

[033] A Figura 13 mostra o cromatograma HPLC de[033] Figure 13 shows the HPLC chromatogram of

Na-22 do aptâmero anti-MUCl em diferentes tempos de marcação, em que (A) refere-se à marcação com Na-22 em temperatura ambiente por 7 minutos e (B) refere-se à marcação da nanopartícula com Na-22 a 80°C por 30 minutos.Na-22 of the anti-MUCl aptamer at different labeling times, where (A) refers to the labeling with Na-22 at room temperature for 7 minutes and (B) refers to the labeling of the nanoparticle with Na-22 at 80 ° C for 30 minutes.

[034] A Figura 14 mostra a biodistribuição das nanopartículas de magnetita decoradas com anticorpo monoclonal trastuzumabe e radiomarcadas com Tc-99m em ratos[034] Figure 14 shows the biodistribution of magnetite nanoparticles decorated with trastuzumab monoclonal antibody and radiolabeled with Tc-99m in rats

Wistar saudáveis.Healthy Wistar.

[035] A Figura 15 mostra a biodistribuição das nanopartículas de magnetita decoradas com anticorpo monoclonal trastuzumabe radiomarcada com Tc-99m em camundongos Balb/c induzidos com câncer de mama.[035] Figure 15 shows the biodistribution of the magnetite nanoparticles decorated with monoclonal antibody trastuzumab radiolabeled with Tc-99m in Balb / c mice induced with breast cancer.

Descrição Detalhada a Invenção:Detailed Description of the Invention:

[036] A presente invenção refere-se a nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares tais como reconhecimento e vetorização, preferencialmente, aptâmero anti-MUCl e anticorpo monoclonal Trastuzumabe, além de moléculas como DTPA para ligação de agentes de contraste para diagnóstico tais como os radioisótopos tecnécio-99m (Tc-99m), gálio-68 (Ga-68), sódio-22 (Na-22), flúor-18 (F-18), cobre-64 (Cu67/64), rubídio-82 (Rb-82), estrôncio-82 (Sr-82), e talio201 (Tl-201), zircônio-89 (Zr-89), dentre outros, preferencialmente Tc-99m e Ga-68; além de agentes de tratamento por radioterapia tais como cobalto-60 (Co-60), iodo-131 (1-131), iodo-125 (1-125), fosforo-32 (P-32), irídio-192 (Ir-192), renio-186 (Re-188/186) , estrôncio-89[036] The present invention relates to magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions such as recognition and vectoring, preferably anti-MUCl aptamer and monoclonal antibody Trastuzumab, in addition to molecules such as DTPA for binding contrast agents for diagnosis such as technetium radioisotopes-99m (Tc-99m), gallium-68 (Ga-68), sodium-22 (Na-22), fluorine-18 (F-18), copper-64 (Cu67 / 64), rubidium-82 (Rb-82), strontium-82 (Sr-82), and talio201 (Tl-201), zirconium-89 (Zr-89), among others, preferably Tc-99m and Ga-68; in addition to radiotherapy treatment agents such as cobalt-60 (Co-60), iodine-131 (1-131), iodine-125 (1-125), phosphorus-32 (P-32), iridium-192 (Ir -192), renio-186 (Re-188/186), strontium-89

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 19/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 19/75

12/41 (Sr-89), e samário-153 (Sm-153), dentre outros.12/41 (Sr-89), and samarium-153 (Sm-153), among others.

[037] Desta forma, as nanopartículas da presente invenção se caracterizam por apresentarem simultaneamente a capacidade de ligar radioisótopos e capacidade de vetorização, além de se manterem dispersos no sistema circulatório, em especial por meio de ligação à proteínas plasmáticas, em especial à albumina, por tempo suficiente para interagirem e serem incorporados pelas células e tecidos tumorais, ou seja não tendem a formar aglomerados que sejam facilmente reconhecidos pelo sistema imune ou que venham a obstruir vasos sanguíneos, características indispensáveis de materiais com potencial aplicação como radiofármacos para diagnóstico e tratamento de tumores.[037] Thus, the nanoparticles of the present invention are characterized by simultaneously having the ability to bind radioisotopes and the ability to vectorize, in addition to being dispersed in the circulatory system, in particular through binding to plasma proteins, especially albumin, long enough to interact and be incorporated by tumor cells and tissues, that is, they do not tend to form clusters that are easily recognized by the immune system or that will obstruct blood vessels, essential characteristics of materials with potential application as radiopharmaceuticals for diagnosis and treatment of tumors.

[038] As nanopartículas da presente invenção tendem a permanecer mais tempo em circulação porque não são prontamente reconhecidas e atacadas pelo sistema imunológico e também pelo sistema de excreção, em particular o sistema mononuclear fagocítico, de modo a possibilitar uma concentração significativa nos tecidos alvos e uma baixa irradiação em tecidos saudáveis e acumulação indevida em fígado e baço.[038] The nanoparticles of the present invention tend to remain in circulation longer because they are not readily recognized and attacked by the immune system and also by the excretion system, in particular the phagocytic mononuclear system, in order to allow a significant concentration in the target tissues and low irradiation in healthy tissues and undue accumulation in the liver and spleen.

[039] Desse modo, as referidas nanopartículas compreendem:[039] Thus, said nanoparticles comprise:

a) Um núcleo de óxido de ferro, preferencialmente magnetita (FeaCU) , maghemita (y-FezC^) ou mistura de ambas;a) An iron oxide core, preferably magnetite (FeaCU), maghemite (y-FezC ^) or a mixture of both;

eand

b) Uma camada molecular quimicamente ligada à superfície dos núcleos de óxido de ferro através de grupos coordenantes, a qual encontram-se associadas espécies bioativas ou biomoléculas responsáveis pelo processo deb) A molecular layer chemically linked to the surface of the iron oxide nuclei through coordinating groups, which are associated with bioactive species or biomolecules responsible for the process of

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 20/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 20/75

13/41 vetorização, e ligantes polidentados para ligação de radionuclideos.13/41 vectoring, and polyidentated ligands for radionuclide binding.

[040] Em que o referido núcleo possui formato quase esférico e tamanho médio entre 2 e 200 nm, preferencialmente 1 a 50 nm, mais preferencialmente 7 nm, com indice de polidispersividade abaixo de 0,3, preferencialmente 0,15, em que a percentagem em massa de oxido de ferro da referida nanopartícula é entre 50% a 90%.[040] Where said core has an almost spherical shape and an average size between 2 and 200 nm, preferably 1 to 50 nm, more preferably 7 nm, with polydispersity index below 0.3, preferably 0.15, where the The percentage by mass of iron oxide of said nanoparticle is between 50% to 90%.

[041] Ainda, os referidos coordenantes são selecionados dos grupos que consistem em carboxilatos, fosfatos, fosfonatos, catecolatos, fenolatos, poli-fenóis, silanóis, tióis e derivados.[041] In addition, said coordinators are selected from groups consisting of carboxylates, phosphates, phosphonates, catecholates, phenolates, polyphenols, silanols, thiols and derivatives.

[042] Ainda, os referidos coordenantes são associados às espécies bioativas ou biomoléculas, as quais são selecionadas pelo menos uma dentre o grupo constituído por biotina, glicose 1-fosfato, glicose 6-fosfato, ácido fólico, dopamina, ibuprofeno, anticorpo monoclonal Trastuzumabe, além de outros anticorpos monoclonais tais como: Alentuzumabe, Bevacizumabe, Brentuximabe Vedotine, Cetuximabe, Cetuximab, Erbitux®, Gentuzumabe Ozogamicina, Ibritumomabe Tiuxetane, Ipilimumabe, Ofatumumabe, Panituzumabe, Pertuzumabe, Rituximabe, Tositumomabe, Trastuzumabe, Trastuzumab e Herceptin® dentre outras, assim como sequências de DNA e ou RNA, em especial aptâmeros, preferencialmente com aptâmero anti-MUCl e/ou anticorpo monoclonal Trastuzumabe.[042] In addition, these coordinators are associated with bioactive species or biomolecules, which are selected from at least one of the group consisting of biotin, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, folic acid, dopamine, ibuprofen, monoclonal antibody Trastuzumab , in addition to other monoclonal antibodies such as: Alentuzumab, Bevacizumab, Brentuximabe Vedotine, Cetuximab, Cetuximab, Erbitux®, Gentuzumabe Ozogamicina, Ibritumomabe Tiuxetane, Ipilimumabe, Ofatumumabe, Panituzumabe, Pertuzumabe, Tertuzumabe, as well as sequences of DNA and or RNA, in particular aptamers, preferably with anti-MUCl aptamer and / or monoclonal antibody Trastuzumab.

[043] Assim, as referidas espécies bioativas e biomoléculas são responsáveis pelo processo de vetorização targeting.[043] Thus, said bioactive species and biomolecules are responsible for the targeting vectoring process.

[044] Ainda, os referidos ligantes polidentados[044] Furthermore, the referred polyidentated ligands

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 21/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 21/75

14/41 são selecionados do grupo que consistem em ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido etileno diamina tetraacético (EDTA), e similares.14/41 are selected from the group consisting of diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), 1,4,7,10tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), and the like .

[045] Desse modo, os ligantes polidentados são disponíveis para ligação de radionuclídeos.[045] Thus, polyidentated ligands are available for binding radionuclides.

[046] Em que os referidos radionuclídeos são selecionados do grupo que consistem em tecnécio-99m, gálio68, sódio-22, flúor-18, cobre-64, rubídio-82, estrôncio-82, talio-201, dentre outros, além de cobalto-60, iodo-131, iodo-125, fosforo-32, irídio-192, renio-186, estrôncio-89, samário-153, dentre outros, preferencialmente Tc-99m e Ga68.[046] In which said radionuclides are selected from the group consisting of technetium-99m, gallium68, sodium-22, fluorine-18, copper-64, rubidium-82, strontium-82, talio-201, among others, in addition to cobalt-60, iodine-131, iodine-125, phosphorus-32, iridium-192, renium-186, strontium-89, samarium-153, among others, preferably Tc-99m and Ga68.

[047] Adicionalmente, a camada molecular pode ser composta por ligantes adjuvantes tais como polietilenoglicóis (PEGs) e seus derivados, que auxiliam na manutenção da estabilidade coloidal das nanopartículas através de interações fortes com o solvente e/ou repulsão estérica e/ou eletrostática. Desse modo, a adição desses ligantes adjuvantes é responsável pela melhoria da dispersibilidade e tempo de circulação da nanopartícula no sangue que varia de 0,5 a 10 horas.[047] Additionally, the molecular layer can be composed of adjuvant binders such as polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives, which help in maintaining the colloidal stability of the nanoparticles through strong interactions with the solvent and / or steric and / or electrostatic repulsion. Thus, the addition of these adjuvant ligands is responsible for improving the dispersibility and circulation time of the nanoparticle in the blood, which varies from 0.5 to 10 hours.

[048] Para melhor entendimento, as referidas nanopartículas são preparadas pelo método de termodecomposição em solvente de alta temperatura de ebulição partindo-se de um sal de ferro(III), conforme procedimento a seguir.[048] For a better understanding, the referred nanoparticles are prepared by the thermo-decomposition method in high boiling temperature solvent starting from an iron (III) salt, according to the following procedure.

- Processo de obtenção das nanopartículas:- Process of obtaining nanoparticles:

[049] As nanopartículas de óxido de ferro foram preparadas pelo método de termodecomposição em solvente de[049] The iron oxide nanoparticles were prepared by the thermo-decomposition method in solvent of

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15/41 alta temperatura de ebulição, tipicamente hidrocarbonetos como dodeceno, parafinas, óleo mineral, éteres de alta temperatura de ebulição como o difenileter, ou etilenoglicol, dietilenoglicol, trietilenoglicol e outros polióis, partindo-se de um sal ou complexo de ferro(III) como acetilacetonato de ferro.15/41 high boiling temperature, typically hydrocarbons such as dodecene, paraffins, mineral oil, high boiling temperature ethers such as diphenylether, or ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol and other polyols, starting from a salt or iron complex (III ) such as iron acetylacetonate.

[050] Durante a ebulição, notou-se mudança da coloração da solução de alaranjado para preto, sendo o primeiro característico do complexo de ferro e o segundo da suspensão de nanopartículas formadas. Apesar de o aspecto de solução, ao aproximar um ímã, claramente pode-se perceber a atração do líquido resultante indicando a formação de um fluido magnético, ou seja, uma dispersão de nanopartículas magnéticas no solvente de alto ponto de ebulição.[050] During boiling, the color of the solution changed from orange to black, the first being characteristic of the iron complex and the second of the suspension of nanoparticles formed. Despite the solution aspect, when approaching a magnet, one can clearly perceive the attraction of the resulting liquid indicating the formation of a magnetic fluid, that is, a dispersion of magnetic nanoparticles in the high boiling solvent.

[051] Sendo assim, as nanopartículas são obtidas a partir de processo que compreende as etapas de:[051] Therefore, nanoparticles are obtained from a process that comprises the steps of:

[052] (a) preparação das nanopartículas de óxido de ferro pelo método de termodecomposição por 0,5 a 6 horas, tipicamente 3 horas, na faixa de temperatura de 180 a 300°C, tipicamente 230 °C;[052] (a) preparation of iron oxide nanoparticles by the thermo-decomposition method for 0.5 to 6 hours, typically 3 hours, in the temperature range 180 to 300 ° C, typically 230 ° C;

[053] b) purificação das nanopartículas por lavagem, à temperatura ambiente, com solventes puros tais como álcool, acetona, tetrahidrofurano e água, acoplado a separação com ímã;[053] b) purification of the nanoparticles by washing, at room temperature, with pure solvents such as alcohol, acetone, tetrahydrofuran and water, coupled with magnet separation;

[054] c) funcionalização, à temperatura ambiente, da superfície por incubação com os agentes vetorizantes (preferencialmente com lxlO^-10 - lxlO^-6 g de aptâmeros como o anti-MUCl e anticorpos como o Trastuzumabe), agentes quelantes (tipicamente com lxlO^-9 - lxlO^-5 g de DTPA) e/ou[054] c) functionalization, at room temperature, of the surface by incubation with vectoring agents (preferably with lx10 ^-10 - lx10 ^-6 g of aptamers such as anti-MUCl and antibodies such as Trastuzumab), chelating agents (typically with lx10 ^-9 - 1 x 10 ^-5 g DTPA) and / or

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 23/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 23/75

16/41 adjuvantes (tipicamente lxlO^-9 - lxlO^-5 g derivados de PEG (polietilenoglicol) ) ; e [055] d) purificação das nanopartículas multifuncionalizadas com água, à temperatura ambiente, para remoção das moléculas não ligadas.16/41 adjuvants (typically 1x10 ^-9 - 1x10 ^-5 g derived from PEG (polyethylene glycol)); and [055] d) purification of multifunctionalized nanoparticles with water, at room temperature, to remove unbound molecules.

[056] Este processo, embora não reivindicado, é considerado essencial para se atingir as características diferenciadas apresentadas pelas nanopartículas.[056] This process, although not claimed, is considered essential to achieve the different characteristics presented by nanoparticles.

[057] Portanto, através do processo em questão, obtêm-se nanopartículas que apresentam simultaneamente a capacidade de ligar radioisótopos e capacidade de vetorização por tempo suficiente para interagirem e serem incorporados pelas células e tecidos tumorais.[057] Therefore, through the process in question, nanoparticles are obtained that simultaneously have the ability to bind radioisotopes and the ability to vectorize long enough to interact and be incorporated by tumor cells and tissues.

[058] Desse modo, adicionalmente, a presente invenção refere-se a um kit de reativos liofilizados ou não para diagnóstico, terapia e teragnóstica de câncer, compreendendo:[058] Thus, in addition, the present invention relates to a kit of lyophilized or non-reactive reagents for cancer diagnosis, therapy and teragnosis, comprising:

- um frasco (i) , selado em atmosfera de nitrogênio, contendo 10 a 80 mg de um agente redutor, em especial o cloreto estanoso, de modo a converter o pertecnetato de sódio em tecnécio com valência +4 e +5, e 0,1 a 1 mg de um agente quelante, em especial o EDTA, para retirada do excesso de Al⁺³, proveniente da resina de alumina presente nos geradores de Mo-99/Tc-99m; e- a vial (i), sealed in a nitrogen atmosphere, containing 10 to 80 mg of a reducing agent, in particular stannous chloride, in order to convert sodium pertechnetate into technetium with a +4 and +5 valence, and 0, 1 to 1 mg of a chelating agent, especially EDTA, to remove excess Al ^{+ 3} from the alumina resin present in the Mo-99 / Tc-99m generators; and

- um frasco (ii), selado em atmosfera de nitrogênio, com 50 a 1000 pL de uma solução compreendendo nanopartículas magnéticas funcionalizadas com uma ou mais biomoléculas, e ligantes polidentados.- a vial (ii), sealed in a nitrogen atmosphere, with 50 to 1000 pL of a solution comprising magnetic nanoparticles functionalized with one or more biomolecules, and polyidentated ligands.

[059] O referido agente redutor é selecionado do grupo que consiste em borohidreto de sódio (NaBHzj) ,[059] Said reducing agent is selected from the group consisting of sodium borohydride (NaBHzj),

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 24/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 24/75

17/41 ditionito de sódio (NazSzCú), fluoreto estanoso, cloreto estanoso, tartarato estanoso, ácido hidrazinonicotínico, hidrazinonicotinamida, preferencialmente cloreto estanoso.17/41 sodium dithionite (NazSzCú), stannous fluoride, stannous chloride, stannous tartrate, hydrazinonicotinic acid, hydrazinonicotinamide, preferably stannous chloride.

[060] O referido agente quelante é selecionado do grupo que consiste em gluconato, glucoheptonato, ácido etilenodiamino tetra acético, pirofosfato, tartarato de sódio, citrato de sódio, e respectivos sais e anidridos, preferencialmente EDTA (ácido etilenodiamino tetra acético).[060] Said chelating agent is selected from the group consisting of gluconate, glucoheptonate, ethylenediamino tetra acetic acid, pyrophosphate, sodium tartrate, sodium citrate, and their salts and anhydrides, preferably EDTA (ethylenediamine tetra acetic acid).

[061] As referidas nanopartículas são caracterizadas por serem magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares, conforme aqui definidas anteriormente.[061] Said nanoparticles are characterized by being magnetic decorated with molecules with complementary functions, as defined above.

[062] Alternativamente, o frasco (ii) compreende de 0,5 a 10 mg de nanopartículas magnéticas funcionalizadas com uma ou mais biomoléculas e ligantes polidentados, além de 20 a 1000 mg de solubilizantes selecionados do grupo que consistem em açúcares glicose, sacarose e especialmente, manose. Desse modo, as nanopartículas poderão ser facilmente redispersas quando da adição de água, soro fisiológico ou outras soluções aquosas utilizadas como veículos.[062] Alternatively, vial (ii) comprises from 0.5 to 10 mg of magnetic nanoparticles functionalized with one or more biomolecules and polyidentated ligands, in addition to 20 to 1000 mg of solubilizers selected from the group consisting of glucose, sucrose and especially, mannose. In this way, the nanoparticles can be easily redispersed when adding water, saline or other aqueous solutions used as vehicles.

[063] Vale ressaltar que os referidos frascos (i e ii) são estéreis e apirogênicos, em atmosfera de nitrogênio. Preferencialmente, os referidos frascos são multidoses feitos com vidro boro silicato. Ainda, a estabilidade do referido kit de reativos em solução, liofilizados e na forma sólida, é superior a 3 (três) meses, quando armazenados em temperatura de 4 °C.[063] It is worth mentioning that the referred vials (i and ii) are sterile and pyrogenic, in a nitrogen atmosphere. Preferably, said vials are multi-doses made with boron silicate glass. In addition, the stability of said reactive kit in solution, lyophilized and in solid form, is greater than 3 (three) months, when stored at a temperature of 4 ° C.

[064] Portanto, o kit aqui descrito aplica-se à[064] Therefore, the kit described here applies to

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18/41 aquisição de imagens moleculares cintilográficas e tomográficas (por emissão de pósitron (PET) e por emissão de fóton único) assim como as imagens por coincidência de fótons e gamagrafia, ou outro processo de imagem utilizando detecção da radiação (alfa, beta, gama), a depender do radionuclídeo (radioisótopo) utilizado.18/41 acquisition of molecular scintigraphic and tomographic images (by positron emission (PET) and by single photon emission) as well as images by coincidence of photons and gammagraphy, or another image process using radiation detection (alpha, beta, gamma), depending on the radionuclide (radioisotope) used.

[065] [065] Desse Of this modo, mode, para for melhor best compreensão understanding da gives utilização use do presente kit, gift kit, a The seguir é follow is apresentado introduced um one método de method of aplicação application do kit of the kit de in reativos, reactive, conforme ; according ; aqui on here

descrito, para a obtenção de nanopartículas decoradas com radionuclídeos, que quando administrada nos pacientes, possibilita o diagnóstico ou tratamento de tumores.described, to obtain nanoparticles decorated with radionuclides, which when administered to patients, allows the diagnosis or treatment of tumors.

[066] Assim, o referido método compreende as etapas de:[066] Thus, the referred method comprises the steps of:

a) Preparação da solução de radionuclídeo: Transferir um volume de solução de radionuclídeo, por exemplo, pertecnetato de sódio, com atividade na faixa de 10 pCi a 500 mCi (3,70xl0⁵ a 1,85χ10^1θ Bq, definido pelo médico especialista) obtido no gerador de radioisótopos correspondente, ou 500 mCi a 50 Ci (1,85χ10^1θ a l,85xl0¹² Bq, em caso de terapia) para o frasco (i) e incubar com o agente redutor e agente quelante por 10-20 minutos;a) Preparation of the radionuclide solution: Transfer a volume of radionuclide solution, for example, sodium pertechnetate, with activity in the range of 10 pCi to 500 mCi (3.70x10 ¹⁰ to 1.85χ10 ^1θ Bq, defined by the specialist) obtained in the corresponding radioisotope generator, or 500 mCi at 50 Ci (1.85 ^× 10 ^1θ al, 85 x ^{10 12} Bq, in case of therapy) into the vial (i) and incubate with the reducing agent and chelating agent for 10-20 minutes;

b) Radiomarcação das nanopartículas: Transferir a solução de nanopartículas do frasco (ii), após ressuspensão (se necessário) com 100 a 1000 pL de água, para o frasco obtido em (a) e incubar; eb) Radiolabeling the nanoparticles: Transfer the nanoparticle solution from the flask (ii), after resuspension (if necessary) with 100 to 1000 pL of water, to the flask obtained in (a) and incubate; and

c) Filtrar a solução de nanopartículas radiomarcadas obtidas em (b) usando filtro de 0,2 pm.c) Filter the solution of radiolabeled nanoparticles obtained in (b) using a 0.2 pm filter.

[067] Na etapa (a), uma solução de radionuclídeo específico com atividade adequada, definida pelo médico[067] In step (a), a specific radionuclide solution with adequate activity, defined by the doctor

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19/41 especialista, para a realização do diagnóstico ou tratamento de tumores é incubada por 5 a 25 minutos, preferencialmente, 10 minutos, à temperatura ambiente, com um agente redutor e agente quelante do frasco (i) , preferencialmente, cloreto estanoso, nas concentrações de 10 a 400 pg/mL, e um agente quelante, preferencialmente EDTA (ácido etilenodiamino tetra acético), nas concentrações de 0,1 a 10 pg/mL, preferencialmente, 1 pg/mL, em um volume que pode variar de 2 0 a 2 00 pL, preferencialmente, 100 pL.19/41 specialist, for the diagnosis or treatment of tumors is incubated for 5 to 25 minutes, preferably 10 minutes, at room temperature, with a reducing agent and chelating agent from the vial (i), preferably stannous chloride, in the concentrations of 10 to 400 pg / mL, and a chelating agent, preferably EDTA (ethylenediamino tetra acetic acid), in concentrations of 0.1 to 10 pg / mL, preferably 1 pg / mL, in a volume that can vary from 2 0 to 200 pL, preferably 100 pL.

[068] Alternativamente, o agente quelante é suprimido utilizando o método da marcação direta. Isso acontece porque o agente quelante tem como função retirar o tecnécio livre do meio e permitir que somente o produto marcado chegue ao alvo. Se a marcação ocorrer numa estequiometria muito bem feita, não haverá tecnécio livre e o agente quelante pode ser retirado.[068] Alternatively, the chelating agent is suppressed using the direct labeling method. This is because the chelating agent has the function of removing the free technetium from the medium and allowing only the marked product to reach the target. If the marking occurs on a very well done stoichiometry, there will be no free technetium and the chelating agent can be removed.

[069] A seguir, na etapa (b), é realizado o processo de radiomarcação das nanopartículas de oxido de ferro multifuncionalizadas com radionuclídeos selecionados do grupo que consistem de tecnécio-99m, gálio-68, sódio-22, ou outros radionuclídeos, por meio de protocolos convencionais ou análogos, selecionados dos grupos que consistem em, para diagnóstico: flúor-18,cobre-64, rubídio82, estrôncio-82, talio-201, etc; e para radioterapia: cobalto-60, iodo-131, iodo-125, fosforo-32, irídio-192, renio-186, estrôncio-89, samário-153, etc.[069] Next, in step (b), the process of radiolabeling the multifunctionalized iron oxide nanoparticles with radionuclides selected from the group consisting of technetium-99m, gallium-68, sodium-22, or other radionuclides, by using conventional or analogous protocols, selected from the groups consisting of, for diagnosis: fluorine-18, copper-64, rubidium82, strontium-82, talio-201, etc; and for radiotherapy: cobalt-60, iodine-131, iodine-125, phosphorus-32, iridium-192, renio-186, strontium-89, samarium-153, etc.

[070] O processo de radiomarcação é realizado conforme os autores Warnders FJ et al., 2017; Dutta J et al., 2017; Van Mourik T et al., 2017; Revskaya E et al.,[070] The radiolabeling process is performed according to the authors Warnders FJ et al., 2017; Dutta J et al., 2017; Van Mourik T et al., 2017; Revskaya E et al.,

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2017; Cerqueira-Coutinho C et al., 2017; Mastren T et al., 2017; Jin ZH et al., 2017; e Sarcinelli MA et al, 2016.2017; Cerqueira-Coutinho C et al., 2017; Mastren T et al., 2017; Jin ZH et al., 2017; and Sarcinelli MA et al, 2016.

[071] A Figura 1 apresenta um esquema mostrando as etapas para marcação das nanopartículas multifuncionalizadas com um radionuclídeo, por exemplo, Tc99m, gerando nanopartículas radiomarcadas para diagnóstico e/ou terapia.[071] Figure 1 presents a scheme showing the steps for marking multifunctionalized nanoparticles with a radionuclide, for example, Tc99m, generating radiolabeled nanoparticles for diagnosis and / or therapy.

[072] É oportuno ressaltar que cada um desses radionuclídeos exige um protocolo específico definido em função de suas propriedades físico-químicas, tempo de meiavida, forma de apresentação e aplicação (diagnóstico e/ou terapia).[072] It is worth noting that each of these radionuclides requires a specific protocol defined according to their physical-chemical properties, half-life, form of presentation and application (diagnosis and / or therapy).

[073] Ainda na etapa (b), para o processo de radiomarcação, o volume do frasco (ii) é transferido e incubado com a solução de radionuclídeo obtido em (a) , preferencialmente, Tc-99m com atividade de 30 pCi (Ι,ΙΙχΙΟ⁶ Bq) a 300 mCi (Ι,ΙΙχΙΟ¹⁰ Bq) , recentemente eluídos de um gerador de Mo-99/Tc-99m, particularmente, 100 pCi (3,70xl0⁶ Bq) para ensaios in vitro e 10-20 mCi (3,70-7,4x10® Bq) para avaliação in vivo, seguido de uma incubação de 5 a 30 minutos, preferencialmente 10 minutos, à temperatura ambiente.[073] Still in step (b), for the radiolabeling process, the vial volume (ii) is transferred and incubated with the radionuclide solution obtained in (a), preferably, Tc-99m with an activity of 30 pCi (Ι , ΙΙχΙΟ ⁶ Bq) at 300 mCi (Ι, ΙΙχΙΟ ¹⁰ Bq), recently eluted from a Mo-99 / Tc-99m generator, particularly 100 pCi (3.70 x ^{10 6} Bq) for in vitro tests and 10-20 mCi (3.70-7.4x10® Bq) for in vivo evaluation, followed by an incubation of 5 to 30 minutes, preferably 10 minutes, at room temperature.

[074] Importante ressaltar que os recipientes utilizados para a realização do método, tais como tubos de ensaio, frascos e ampolas de vidro borossilicato, devem ser considerados sob pressão negativa (vácuo) ou com atmosfera de Nitrogênio (N2 gás), preferencialmente atmosfera de nitrogênio, durante andamento das etapas.[074] It is important to note that the containers used to carry out the method, such as test tubes, vials and ampoules of borosilicate glass, must be considered under negative pressure (vacuum) or with a nitrogen atmosphere (N2 gas), preferably a nitrogen during the stages.

[075] Ainda, ao final da etapa (b) , a solução resultante deve apresentar-se preferencialmente límpida,[075] Also, at the end of step (b), the resulting solution should preferably be clear,

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21/41 acinzentada, estéril e apirogênica.21/41 greyish, sterile and pyrogenic.

[076] Além disso, a eficiência da marcação é determinada por cromatografia em camada delgada utilizando papel Whatman n°l, e acetona como fase móvel variando de 90 a 100%, conforme determinada pela RDC 38/2008.[076] In addition, labeling efficiency is determined by thin layer chromatography using Whatman paper No. 1, and acetone as the mobile phase ranging from 90 to 100%, as determined by RDC 38/2008.

[077] Alternativamente, na etapa (b) , os radionuclídeos podem ser substituídos por agentes de tratamento radioativos selecionados do grupo que consistem em Radio-223, Iodo-131, Fósforo-32, ítrio-90, Samário-153 e 157, Estrôncio-90 e Holmio-166, dentre outros.[077] Alternatively, in step (b), radionuclides can be replaced by radioactive treatment agents selected from the group consisting of Radio-223, Iodine-131, Phosphorus-32, Yttrium-90, Samarium-153 and 157, Strontium -90 and Holmio-166, among others.

[078] Assim, a seguir, na etapa (c) realiza-se a filtragem com filtro com malha de 0,22 pm para retirada de possíveis aglomerados.[078] Therefore, in step (c), filtering with a 0.22 pm mesh filter is carried out to remove possible agglomerates.

[079] Após a filtração, obtêm-se nanopartículas magnéticas decoradas ligadas a radionuclídeos, com eficiência de marcação superior a 90% e estabilidade até 24h após a marcação.[079] After filtration, decorated magnetic nanoparticles linked to radionuclides are obtained, with marking efficiency greater than 90% and stability up to 24h after marking.

[080] Esse aspecto da invenção está relacionado ao reagente para diagnóstico obtido que apresenta as seguintes características: volume final variando de 0,3 a 1 mL, solução acinzentada com eficiência de marcação superior a[080] This aspect of the invention is related to the diagnostic reagent obtained that has the following characteristics: final volume ranging from 0.3 to 1 mL, gray solution with marking efficiency greater than

95%.95%.

[081] Portanto, adicionalmente, a presente invenção refere-se à nanopartículas radiomarcadas para diagnóstico ou terapia obtida conforme método de preparo do kit descrito anteriormente, em que a mesma compreende:[081] Therefore, additionally, the present invention relates to radiolabeled nanoparticles for diagnosis or therapy obtained according to the kit preparation method described above, in which it comprises:

- Um núcleo de óxido de ferro e uma camada molecular quimicamente ligada à sua superfície através de grupos coordenantes associados às espécies bioativas ou biomoléculas, e ligantes polidentados para ligação de- An iron oxide nucleus and a molecular layer chemically linked to its surface through coordinating groups associated with bioactive species or biomolecules, and polyidentated ligands for binding

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22/41 radionuclídeos, tal como aqui descrito anteriormente; e22/41 radionuclides, as described hereinbefore; and

Pelo menos um radionuclídeo ligado aos ligantes polidentados.At least one radionuclide attached to the polyidentated ligands.

[082] Desta forma, tais nanopartículas de 1 a 50 nm apresentam a capacidade de ligar radionuclídeos e capacidade de vetorização, além de apresentarem dispersabilidade adequada para que se mantenham no sistema circulatório por tempo suficiente para interagirem e serem incorporados pelas células e tecidos tumorais, ou seja não tendem a formar aglomerados que sejam facilmente reconhecidos pelo sistema imune ou que venham a obstruir vasos sanguíneos.[082] In this way, such nanoparticles from 1 to 50 nm have the ability to bind radionuclides and the ability to vectorize, in addition to having adequate dispersibility so that they remain in the circulatory system long enough to interact and be incorporated by tumor cells and tissues, that is, they do not tend to form clusters that are easily recognized by the immune system or that will clog blood vessels.

[083] Nesse sentido, as nanopartículas também não são prontamente reconhecidas e atacadas pelo sistema imunológico e também pelo sistema de excreção, o que é uma vantagem diferencial da presente invenção.[083] In this sense, nanoparticles are also not readily recognized and attacked by the immune system and also by the excretion system, which is a differential advantage of the present invention.

[084] Ainda, as referidas nanopartículas magnéticas decoradas ligadas a radionuclídeos possuem eficiência de marcação superior a 90%, preferencialmente 95% e estabilidade até 24h após a marcação.[084] Still, the said decorated magnetic nanoparticles linked to radionuclides have marking efficiency greater than 90%, preferably 95% and stability up to 24 hours after marking.

[085] Portanto, adicionalmente, a presente invenção refere-se também ao uso dessas nanopartículas aqui descritas para aplicação em diagnóstico e/ou terapia, para câncer de mama, em particular para: Carcinoma Ductal In Situ, Carcinoma Lobular In Situ, Carcinoma Ductal Invasivo, Carcinoma Lobular Invasivo, Câncer de Mama Inflamatório, Câncer de Mama Triplo-negativo, Doença de Paget, Tumor Filoide, Angiosarcoma, Carcinoma Cístico Adenóide, Carcinoma Metaplásico, Carcinoma Medular, Carcinoma Mucinoso, Carcinoma Papilífero, Carcinoma Tubular,[085] Therefore, in addition, the present invention also relates to the use of these nanoparticles described here for application in diagnosis and / or therapy, for breast cancer, in particular for: Ductal Carcinoma In Situ, Lobular Carcinoma In Situ, Ductal Carcinoma Invasive, Invasive Lobular Carcinoma, Inflammatory Breast Cancer, Triple-negative Breast Cancer, Paget's Disease, Phyloid Tumor, Angiosarcoma, Adenoid Cystic Carcinoma, Metaplastic Carcinoma, Medullary Carcinoma, Mucinous Carcinoma, Papillary Carcinoma, Tubular Carcinoma,

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 30/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 30/75

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Carcinoma Micropapilífero, Carcinoma Misto, CarcinomaMicropapillary Carcinoma, Mixed Carcinoma, Carcinoma

Cribiforme e Câncer de Mama Masculino.Cribiform and Male Breast Cancer.

[086] Além disso, pode ser utilizado para Câncer de Próstata, em particular: Adenocarcinoma Acinar, Adenocarcinoma Ductal, Câncer de Célula Transicional ou Urotelial (Transi tional Cell or Urothelial Câncer) , Câncer de Células Esquamosas, Carcinóide, Câncer de Células Pequenas, Sarcomas e Câncer Sarcomatóide. No caso dos Melanomas, o diagnóstico e a terapia podem ser realizadas para: Melanoma Extensivo Superficial, Nodular, Lentigo Maligno, Acral, Sem Sítio Primário, Ocular, Amelanótico, Melanoma Vaginal e Melanona Retal.[086] In addition, it can be used for Prostate Cancer, in particular: Acinar Adenocarcinoma, Ductal Adenocarcinoma, Transitional or Urothelial Cell Cancer (Transitional Cell or Urothelial Cancer), Squamous Cell Cancer, Carcinoid, Small Cell Cancer, Sarcomas and Sarcomatoid Cancer. In the case of Melanomas, diagnosis and therapy can be performed for: Extensive Superficial, Nodular Melanoma, Malignant Lentigo, Acral, Without Primary Site, Ocular, Amelanotic, Vaginal Melanoma and Rectal Melanone.

[087] A possibilidade de utilizar outras espécies vetorizantes (espécies bioativas e biomoléculas), em especial anticorpos monoclonais e aptâmeros, assim como radioisótopos, permite ainda que essas nanopartículas possam ser usadas em câncer coloretal, hepático, esplênico, renal, cerebral, pulmonar e ósseo.[087] The possibility of using other vectorizing species (bioactive species and biomolecules), especially monoclonal antibodies and aptamers, as well as radioisotopes, also allows these nanoparticles to be used in colorectal, liver, splenic, kidney, brain, lung and bony.

[088] A saber, Coloretal: Adenocarcinomas, Tumores Carcinoides, Tumores Estromais Gastrointestinais (Gist), Linfomas, Sarcomas; Hepático: Carcinoma Hepatobiliar, Carcinoma Hepatobiliar Fibrolamelar, Colangiocarcinoma (Carcinoma de Dueto Biliar), Angiosarcoma, Câncer Hepático Secundário; Esplênico: Linfoma, Linfoma Não-Hodgkin' s e Linfomas de Células T; Renal: Carcinoma Renal de Células Claras, Carcinoma Papilar, Carcinoma Renal Cromófobo, Duetos Coletores e Sarcomatóides; Cerebral: Gliomas, Astrocitomas, Oligodendrogliomas, Ependinomas, Meningiomas, Meduloblastomas, Gangliogliomas, Schwannomas(Neurilemomas), Craniofaringiomas, Cordomas, Linfomas Não-Hodgkin's,[088] Namely, Coloretal: Adenocarcinomas, Carcinoid Tumors, Gastrointestinal Stromal Tumors (Gist), Lymphomas, Sarcomas; Hepatic: Hepatobiliary Carcinoma, Fibrolamellar Hepatobiliary Carcinoma, Cholangiocarcinoma (Bile Duct Carcinoma), Angiosarcoma, Secondary Liver Cancer; Splenic: Lymphoma, Non-Hodgkin's Lymphoma and T-Cell Lymphomas; Renal: Renal Clear Cell Carcinoma, Papillary Carcinoma, Chromophobic Renal Carcinoma, Collecting Duets and Sarcomatoids; Cerebral: Gliomas, Astrocytomas, Oligodendrogliomas, Ependinomas, Meningiomas, Medulloblastomas, Gangliogliomas, Schwannomas (Neurilemomas), Craniopharingiomas, Chordomas, Non-Hodgkin's lymphomas,

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 31/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 31/75

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Tumores Pituitários; Pulmonar: Carcinoma, Carcinoma de Células Não Pequenas, Adenocarcinoma, Carcinoma de Células Escamosas, Carcinoma de Grandes Células e Carcinoma de Pequenas Células; Ósseo: Osteossarcoma, Condrossarcoma, Sarcoma Ewing, Histiocitoma Fibroso Maligno, Fibrossarcoma, Tumor Ósseo de Células Gigantes, Cordoma.Pituitary Tumors; Pulmonary: Carcinoma, Non-Small Cell Carcinoma, Adenocarcinoma, Squamous Cell Carcinoma, Large Cell Carcinoma and Small Cell Carcinoma; Bone: Osteosarcoma, Chondrosarcoma, Sarcoma Ewing, Malignant Fibrous Histiocytoma, Fibrosarcoma, Giant Cell Bone Tumor, Chordoma.

[089] Desse modo, as referidas nanopartículas são caracterizadas pelo fato de serem para aquisição de imagens moleculares cintilográficas e tomográficas (por emissão de pósitron (PET) e por emissão de fóton único), assim como as imagens por coincidência de fótons e gamagrafia, ou outro processo de imagem utilizando detecção da radiação (alfa, beta, gama), a depender do radionuclídeo utilizado.[089] Thus, these nanoparticles are characterized by the fact that they are for the acquisition of molecular scintigraphic and tomographic images (by positron emission (PET) and by single photon emission), as well as images by coincidence of photons and gammagraphy, or another imaging process using radiation detection (alpha, beta, gamma), depending on the radionuclide used.

[090] Para tal, as nanopartículas são aplicadas no indivíduo por via intravenosa, intramuscular ou por aplicação tópica. Uma vez aplicadas, as nanopartículas possuem a capacidade de se concentrar em células tumorais, atuando como agentes de contraste para diagnóstico multitécnica de acordo com o radionuclídeo utilizado.[090] For this, the nanoparticles are applied to the individual intravenously, intramuscularly or by topical application. Once applied, the nanoparticles have the ability to concentrate on tumor cells, acting as contrast agents for multitechnical diagnosis according to the radionuclide used.

[091] Para melhor entendimento da aplicação das nanopartículas da presente invenção, a seguir é apresentado um método diagnóstico multitécnica in vivo para aquisição de imagens.[091] For a better understanding of the application of the nanoparticles of the present invention, the following is a multitechnical in vivo diagnostic method for image acquisition.

MÉTODO DIAGNÓSTICO:DIAGNOSTIC METHOD:

[092] Para a aquisição de imagens cintilográficas e tomográficas (por emissão de pósitron e por emissão de fóton único), assim como as imagens por coincidência de fótons e gamagrafia com a nanopartícula radiomarcada preparada com o Kit da presente invenção, deve-se obedecer a um protocolo específico para cada doença que está sendo[092] For the acquisition of scintigraphic and tomographic images (by positron emission and by single photon emission), as well as images by coincidence of photons and gamma with the radiolabeled nanoparticle prepared with the Kit of the present invention, one must obey specific protocol for each disease being

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25/41 diagnosticada, definido pelo médico especialista.25/41 diagnosed, defined by the specialist doctor.

[093] Para a aquisição das imagens, o ângulo do paciente deve ser de 90 graus com o solo, em 5, 10, 15 e 30 minutos e 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas, após a injeção intravenosa de 370 MBq (10 mCi) da nanopartícula/Tc-99m. O tempo de obtenção das imagens planares deve ser de 5 minutos cada, em matriz de 256 x 256 e 13 minutos no caso de cortes tomográficos (SPECT), com matriz de 256 x 256, e 1 a 30 minutos com imagens PET, em matriz de 128 x 128 ou mesmo 256 x 256. Resoluções maiores podem se tornar possíveis em função do desenvolvimento de equipamentos mais avançados.[093] For image acquisition, the patient's angle must be 90 degrees with the ground, in 5, 10, 15 and 30 minutes and 1, 2, 4, 6, 8, 12 and 24 hours after the injection of 370 MBq (10 mCi) of the nanoparticle / Tc-99m. The time for obtaining planar images should be 5 minutes each, in a 256 x 256 matrix and 13 minutes in the case of tomographic slices (SPECT), with a 256 x 256 matrix, and 1 to 30 minutes with PET images, in matrix 128 x 128 or even 256 x 256. Higher resolutions may become possible due to the development of more advanced equipment.

[094] No processamento das imagens, é reconstruída a área de interesse, e feito, pelo computador, o cálculo da contagem radioativa destas áreas. Com base neste cálculo, faz-se uma comparação entre os resultados obtidos nas diferentes aquisições, para verificação de um possível acúmulo do radiofármaco, ao longo do tempo.[094] In the image processing, the area of interest is reconstructed, and the radioactive count of these areas is calculated by the computer. Based on this calculation, a comparison is made between the results obtained in the different acquisitions, to check for a possible accumulation of the radiopharmaceutical, over time.

Exemplos da Invenção:Examples of the Invention:

[095] Para melhor compreensão da presente invenção seguem-se os seguintes exemplos ilustrativos:[095] For a better understanding of the present invention, the following illustrative examples follow:

- Exemplo I: processo de marcação da nanopartícula decorada com aptâmero ANTI-MUC1 com o radionuclídeo tecnécio-99m em presença do agente quelante EDTA.- Example I: process of marking the nanoparticle decorated with an ANTI-MUC1 aptamer with the technetium-99m radionuclide in the presence of the chelating agent EDTA.

[096] Alíquotas da nanopartícula em concentração de 0,1 mg/mL em volume de 200 uL foram incubadas com 50 pg/mL do agente redutor cloreto estanoso e 1 pg/mL de EDTA em um volume de 100 uL obtendo-se uma solução límpida e acinzentada após incubação por dez minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à[096] Aliquots of the nanoparticle at a concentration of 0.1 mg / mL in a volume of 200 µL were incubated with 50 pg / mL of the reducing agent stannous chloride and 1 pg / mL of EDTA in a volume of 100 µL to obtain a solution clear and gray after incubation for ten minutes at room temperature. This solution was incubated for 20 minutes at

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 33/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 33/75

26/41 temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m no volume de 0,3 mL com atividade de 100 pCi a 2 0 mCi (3,70 xl0⁶-7,40xl0⁸ Bq) , obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, acinzentado, estéril e apirogênico à base da nanopartícula marcada com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro Millipore de 0,22 um.26/41 at room temperature, with the technetium-99m radionuclide in the volume of 0.3 mL with activity of 100 pCi at 20 mCi (3.70 x ^{10 6} -7.40 x ^{10 8} Bq), obtaining a clear diagnostic reagent , grayish, sterile and pyrogenic based on the nanoparticle marked with the radionuclide. The reagent obtained was subsequently filtered with a 0.22 µm Millipore filter.

- Exemplo II: processo de marcação da nanopartícula decorada com aptâmero ANTI-MUC1 com o radionuclídeo tecnécio-99m em ausência do agente quelante EDTA.- Example II: process of marking the nanoparticle decorated with an ANTI-MUC1 aptamer with the technetium-99m radionuclide in the absence of the EDTA chelating agent.

[097] Alíquotas da nanopartícula em concentração de 0,1 mg/mL em volume de 200 uL foram incubadas com 50 pg/mL do agente redutor cloreto estanoso em um volume de 100 uL obtendo-se uma solução límpida e acinzentada após incubação por dez minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m no volume de 0,3 mL com atividade de 100 pCi a 20 mCi (3,70xl0⁶-7,40x10® Bq) , obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, acinzentado, estéril e apirogênico a base da nanopartícula marcada com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro Millipore de 0,22 um.[097] Aliquots of the nanoparticle at a concentration of 0.1 mg / mL in a volume of 200 µL were incubated with 50 pg / mL of the stannous chloride reducing agent in a volume of 100 µL to obtain a clear, grayish solution after incubation for ten minutes at room temperature. This solution was incubated for 20 minutes at room temperature, with the technetium-99m radionuclide in the volume of 0.3 mL with activity of 100 pCi at 20 mCi (3.70 x 10 ⁶ -7.40x10® Bq), obtaining a reagent with a clear, grayish, sterile and pyrogenic diagnosis at the base of the nanoparticle marked with the radionuclide. The reagent obtained was subsequently filtered with a 0.22 µm Millipore filter.

- Exemplo III: processo de marcação da nanopartícula com o radionuclídeo tecnécio-99m - estudo da concentração ideal do cloreto estanoso utilizando cromatografia em papel Whatman n°l.- Example III: process of marking the nanoparticle with the technetium-99m radionuclide - study of the ideal concentration of stannous chloride using Whatman paper chromatography No. 1.

[098] A concentração de cloreto estanoso é um fator de relevância no processo de marcação de moléculas com Tc-99m. Foram testadas as eficiências de marcação da nanopartícula com Tc-99m, quando incubada na presença de[098] The concentration of stannous chloride is a relevant factor in the process of labeling molecules with Tc-99m. The efficiency of marking the nanoparticle with Tc-99m was tested when incubated in the presence of

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 34/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 34/75

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10, 20, 25, 50 e 80 pg/mL de cloreto estanoso, por 10 minutos, à temperatura ambiente. Nesta etapa as soluções foram filtradas com filtro Millipore de 0,22 pm. Assim, observou-se que a melhor concentração de SnCl2 ·Η2θ para a marcação da nanopartícula é de 50 pg/mL e que o melhor solvente foi a acetona.10, 20, 25, 50 and 80 pg / mL of stannous chloride, for 10 minutes, at room temperature. In this step, the solutions were filtered with a 0.22 pm Millipore filter. Thus, it was observed that the best concentration of SnCl2 · Η2θ for the nanoparticle marking is 50 pg / mL and that the best solvent was acetone.

- Exemplo IV: processo de marcação da nanopartícula com o radionuclídeo tecnécio-99m - estudo da estabilidade da marcação utilizando cromatografia em papel Whatman n°l.- Example IV: process of marking the nanoparticle with the technetium-99m radionuclide - study of the stability of the marking using chromatography on Whatman paper No. 1.

[099] Com este método, verificou-se através da realização de sucessivos ensaios cromatográficos (Figura 2), a estabilidade de marcação do complexo nanopartícula/ Tc-99m tendo sido esta estável até pelo menos 24 horas. A eficiência de marcação foi superior a 90%, como recomendado. De fato, foi igual ou superior a 97%, dentro do erro experimental (Tabela 1).[099] With this method, it was verified, through successive chromatographic tests (Figure 2), the staining stability of the nanoparticle / Tc-99m complex, which was stable for at least 24 hours. The marking efficiency was over 90%, as recommended. In fact, it was 97% or more, within the experimental error (Table 1).

Tabela 1 - Estabilidade da marcação em um intervalo de tempo de 8 horas e eficiência de marcação com Tc-99mTable 1 - Marking stability over an 8 hour time interval and marking efficiency with Tc-99m

Tempo de reação (h) Time to reaction (h) Marcação (%) Marking (%) 0 0 98,8+0,4% 98.8 + 0.4% 1 1 98,5+0,9% 98.5 + 0.9% 2 2 97,9+0,8% 97.9 + 0.8% 3 3 98,3+1,2% 98.3 + 1.2% 4 4 98,5+0,5% 98.5 + 0.5% 8 8 97,9+1,2% 97.9 + 1.2%

- Exemplo V: processo de marcação da nanopartícula decorada com aptâmero ANTI-MUC1 com o radionuclídeo gálio68 para tomografia por emissão de pósitron.- Example V: process of marking the nanoparticle decorated with an ANTI-MUC1 aptamer with the gallium radionuclide68 for positron emission tomography.

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28/41 [100] Alíquotas da nanopartícula em concentração de 0,1 mg/mL em volume de 2 00 pL foram incubadas com o radionuclídeo gálio-68 no volume de 0,3 mL com atividade de 100 pCi a 20 mCi (3,70xl0⁶ a 7,40xl0⁸ Bq) , e em seguida com 0,25 a 25 M de acetato de sódio (pH = 5) obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, acinzentado, estéril e apirogênico a base da nanopartícula marcado com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro Millipore de 0,22 pm.28/41 [100] Aliquots of the nanoparticle at a concentration of 0.1 mg / mL in a volume of 200 pL were incubated with the radionuclide gallium-68 in a volume of 0.3 mL with activity of 100 pCi at 20 mCi (3, 70x10 ⁶ to 7.40 x ^{10 8} Bq), and then with 0.25 to 25 M sodium acetate (pH = 5), obtaining a clear, grayish, sterile and pyrogenic diagnostic reagent based on the nanoparticle marked with radionuclide. The reagent obtained was subsequently filtered with a 0.22 pm Millipore filter.

- Exemplo VI: biodistribuição e citotoxidade de nanopartículas marcadas com aptâmero e Tc-99m.- Example VI: biodistribution and cytotoxicity of nanoparticles labeled with aptamer and Tc-99m.

[101] Estudos de biodistribuição foram realizados com três ratos, mantidos em jejum alimentar e de água por 24 horas antes da administração sistêmica do agente de contraste (nanorradiofármaco), utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Assessoramento e o Comitê de Ética Animal. As amostras marcadas com Tc-99m (18,5 MBq/mL) foram administradas por injeção retro-orbital, os animais foram sacrificados após 120 minutos, os órgãos removidos, pesados e a radioatividade total medida usando um contador gama[101] Biodistribution studies were carried out with three rats, fasted for food and water for 24 hours before the systemic administration of the contrast agent (nanoradiopharmaceutical), using a protocol approved by the Advisory Committee and the Animal Ethics Committee. Samples labeled with 99m Tc (18.5 MBq / mL) were administered by retro-orbital injection, the animals were sacrificed after 120 minutes, the organs removed, weighed and the total radioactivity measured using a gamma counter

Perkin Elmer modelo Wizard® 2470.Perkin Elmer model Wizard® 2470.

[102] Cinco diferentes linhas de células de tumores sólidos humanos (linha celular de câncer de ovário (SKOV-3), células epiteliais de adenocarcinoma pulmonar (A542), linha celular de carcinoma hepatocelular (HepG2), células de câncer de mama humano sólido sem receptores de estrogênio (MDA-MB-231) e com expressão de receptores de estrogênio (MCF-7) foram utilizados nos estudos de citotoxicidade in vitro. Células A549, MCF-7, MDA-MB-231 e HEPG2 foram mantidos em meio de cultura DMEM, enquanto[102] Five different human solid tumor cell lines (ovarian cancer cell line (SKOV-3), lung adenocarcinoma epithelial cells (A542), hepatocellular carcinoma cell line (HepG2), solid human breast cancer cells without estrogen receptors (MDA-MB-231) and with expression of estrogen receptors (MCF-7) were used in in vitro cytotoxicity studies, cells A549, MCF-7, MDA-MB-231 and HEPG2 were maintained in DMEM culture, while

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29/41 células SKOV-3 foram cultivadas em meio RPMI. Ambos foram suplementados com L-glutamina (4 mM) , penicilina (100 U/mL) , streptomicina (100 pg/mL) , e 10% v/v de soro fetal bovino. A cultura das células foi realizada em condições padrão, ou seja, 37 °C, 100% umidade, e atmosfera com 5% de CO2 e 95% de ar. Os meios de cultura foram analisados periodicamente para verificação de contaminação por micoplasma. Células na fase logarítmica de crescimento foram utilizados nos ensaios. Os experimentos de citotoxicidade foram realizados adicionando-se de 5 a 10 pg/L de nanopartículas/nanoagentes de contraste, e incubando-se por 72 horas nas condições normais de cultura.29/41 SKOV-3 cells were cultured in RPMI medium. Both were supplemented with L-glutamine (4 mM), penicillin (100 U / mL), streptomycin (100 pg / mL), and 10% v / v fetal bovine serum. Cell culture was carried out under standard conditions, that is, 37 ° C, 100% humidity, and an atmosphere with 5% CO2 and 95% air. The culture media were analyzed periodically to check for contamination by mycoplasma. Cells in the logarithmic growth phase were used in the assays. The cytotoxicity experiments were carried out by adding 5 to 10 pg / L of nanoparticles / contrast nanoagents, and incubating for 72 hours under normal culture conditions.

[103] Foram utilizadas como controles, células tratadas com volumes de PBS (ao invés do agente de contraste) correspondentes aos do agente de contraste multitécnica.[103] Cells treated with volumes of PBS (instead of the contrast agent) corresponding to those of the multitechnical contrast agent were used as controls.

[104] Dez mil (10.000) células foram semeadas em 10 pL de meio de cultura de placas de 96 poços com fundo flutuante (PAA, Alemanha), e os ensaios realizados em triplicata aumentando-se a concentração do multiagente de contraste de 5 a 10 pg/L, e incubando-se a 37 °C por 72 h. A viabilidade celular foi determinada usando-se o ensaio[104] Ten thousand (10,000) cells were seeded in 10 pL of 96-well plate culture medium with a floating bottom (PAA, Germany), and assays performed in triplicate by increasing the contrast agent multi-agent concentration from 5 to 10 pg / L, and incubating at 37 ° C for 72 h. Cell viability was determined using the assay

MTT (Sigma Chemical Co., St Louis MO), onde os cristais escuros produzidos foram solubilizados com DMSO e o número de células viáveis determinado pela diferença de absorbância em 580 nm (comprimento de onda para análise) em relação a 720 nm (comprimento de onda de referência), e em comparação com o controle.MTT (Sigma Chemical Co., St Louis MO), where the dark crystals produced were solubilized with DMSO and the number of viable cells determined by the difference in absorbance at 580 nm (wavelength for analysis) in relation to 720 nm (wavelength). reference wave), and compared to the control.

[105] A biodistribuição sistêmica dos multiagentes de contraste foi determinada in vivo, mostrando que a[105] The systemic biodistribution of the contrast multi-agents was determined in vivo, showing that the

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30/41 principal via de excreção é a renal, como mostrado na Figura 3. Este resultado é interessante, pois, no caso de administração inadvertida de doses acima do recomendado, a simples administração de diuréticos pode aumentar a velocidade e eficiência de eliminação do organismo, dessa forma, evitando eventuais efeitos tóxicos severos.The main route of excretion is renal, as shown in Figure 3. This result is interesting because, in the case of inadvertent administration of doses above the recommended, the simple administration of diuretics can increase the speed and efficiency of elimination from the body. thus avoiding any severe toxic effects.

[106] Também, verificou-se baixa retenção nas vesículas biliares, correspondentes à reabsorção durante o processo de excreção. Foi também verificada uma lenta degradação/metabolização pelo fígado, como esperado para moléculas/nanoagentes apresentando elevado tempo de circulação, confirmado pelo grau relativamente elevado de retenção do nanomaterial no sangue e no coração, além da baixa retenção no pulmão. A baixa retenção no baço indica baixo grau de reconhecimento pelo sistema imunológico, particularmente macrófagos retículoendotelial, podendo eficientemente nas células e tecidos tumorais, assim como apresentar baixa imunogenicidade, essencial para repetição do exame. Tais características, ou seja, o maior tempo de circulação e vetorização também são características fundamentais para sistemas de entrega de drogas para tratamento de tumores, demonstrando a adequação dos multiagentes de contraste não somente para diagnóstico, mas também para o desenvolvimento de nanoagentes para teranóstica.[106] Also, there was low retention in the gallbladders, corresponding to resorption during the excretion process. There was also a slow degradation / metabolization by the liver, as expected for molecules / nanoagents with high circulation time, confirmed by the relatively high degree of retention of the nanomaterial in the blood and heart, in addition to the low retention in the lung. The low retention in the spleen indicates a low degree of recognition by the immune system, particularly reticuloendothelial macrophages, being able to efficiently in tumor cells and tissues, as well as presenting low immunogenicity, essential for the repetition of the exam. Such characteristics, that is, the longer circulation and vectoring times are also fundamental characteristics for drug delivery systems for the treatment of tumors, demonstrating the suitability of contrast multi-agents not only for diagnosis, but also for the development of nanoagents for teranosis.

[107] Os resultados dos ensaios de MTT mostrados na figura 4 foram consistentes com nanomateriais não citotóxicos, não sendo observado declínio significativo do número de células viáveis em relação ao controle. De fato, ativados no sistema se concentrar mais[107] The results of the MTT assays shown in Figure 4 were consistent with non-cytotoxic nanomaterials, with no significant decline in the number of viable cells compared to the control. In fact, activated in the system to focus more

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31/41 mesmo nas mais altas concentrações do nanomaterial, foram observados mais de 80% de células viáveis, demonstrando que seu efeito tóxico é muito baixo, tendo possibilidade de aplicação real como multiagente de contraste para diagnóstico molecular.31/41 even at the highest concentrations of nanomaterial, more than 80% of viable cells were observed, demonstrating that their toxic effect is very low, with the possibility of real application as a multi-agent contrast agent for molecular diagnosis.

- Exemplo VII: cold kits para câncer de mama com Tc99m.- Example VII: cold kits for breast cancer with 99m Tc.

[108] Suspensões de 50 pg de nanopartículas de óxido de ferro simultaneamente funcionalizadas com aptâmero[108] 50 pg suspensions of iron oxide nanoparticles simultaneously functionalized with aptamer

anti-MUCl anti-MUCl e dtpa and dtpa foram were incubados incubated com with 30 30 pL de cloreto pL of chloride estanoso tinny (SnClz, (SnClz, Sigma- Sigma- Aldrich) e Aldrich) and 100 100 pCi pCi (3,70xl0⁶ Bq,(3.70 x ^{10 6} Bq, aproximadamente 300 pL) approximately 300 pL) de tecnécio- techno- -99m -99m por per cinco minutos, five minutes,

sob vácuo. A solução de Tc-99m foi removida e o material seco. O grau de marcação foi determinado por cromatografia de camada delgada (TLC) usando papel de filtro Whatman n° 1. Dois (2) microlitros das nanopartículas marcadas com o radioisótopo foram eluídas com acetona (Merck), e a radioatividade da mancha correspondente na tira de papel medida num contador gama. A eficiência do processo de marcação radioativa foi verificada realizando-se o ensaio por TLC com amostras retiradas após 1, 2, 3, 4 e 8 horas após a adição do radioisótopo Tc-99m.under vacuum. The Tc-99m solution was removed and the material dried. The degree of labeling was determined by thin layer chromatography (TLC) using Whatman filter paper No. 1. Two (2) microliters of the radioisotope-labeled nanoparticles were eluted with acetone (Merck), and the corresponding spot radioactivity on the strip of paper measured in a gamma counter. The efficiency of the radioactive staining process was verified by performing the assay by TLC with samples taken after 1, 2, 3, 4 and 8 hours after the addition of the Tc-99m radioisotope.

[109] Ratas nude Balb/c fêmeas de 8-9 semanas de vida foram inoculadas subcutaneamente com 100 pL de suspensão de MDA-MB-231 (1 χ 10⁶ células) no flanco direito, e o crescimento do tumor monitorado duas vezes por semana usando um paquímetro. Imagens de fluorescência in vivo foram obtidas logo após administração intraperitonial de 150 mg/kg de D-luciferina (Promega), usando o equipamento IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen/Caliper[109] Nude female Balb / c rats 8-9 weeks old were inoculated subcutaneously with 100 µl of MDA-MB-231 suspension (1 χ 10 ⁶ cells) on the right flank, and tumor growth monitored twice for week using a caliper. In vivo fluorescence images were obtained shortly after intraperitoneal administration of 150 mg / kg of D-luciferin (Promega), using the IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen / Caliper)

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Life Sciences, CA,) segundo as instruções do fabricante. Os dados foram analisados usando o programa Living Image 4.3 (Xenogen) (Figura 5).Life Sciences, CA,) according to the manufacturer's instructions. The data were analyzed using the Living Image 4.3 (Xenogen) program (Figure 5).

[110] As imagens planares foram obtidas 90 minutos após injeção retro-orbital das nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com aptâmero anti-MUCl e marcadas com Tc-99m usando uma câmera Millenium Gamma (GE Healthcare, Cleveland, USA). As contagens acumuladas em cinco minutos, numa janela de 15% centrada em 140 KeV, foram utilizadas para geração das imagens. As imagens foram processadas usando o programa OsiriX, e as regiões de interesse (ROIs) sobre os tumores selecionadas para análises específicas (Figura 6).[110] Planar images were obtained 90 minutes after retro-orbital injection of the iron oxide nanoparticles functionalized with anti-MUCl aptamer and marked with Tc-99m using a Millennium Gamma camera (GE Healthcare, Cleveland, USA). The counts accumulated in five minutes, in a 15% window centered on 140 KeV, were used to generate the images. The images were processed using the OsiriX program, and the regions of interest (ROIs) on the tumors selected for specific analyzes (Figure 6).

Exemplo VIII: cold kits para câncer de próstata com Tc-99m, [111] Ratos nude Balb/c machos de 8-9 semanas de vida foram inoculados subcutaneamente com 100 pL de suspensão de PC-3 (1 χ 10⁶ células) no flanco direito, e o crescimento do tumor monitorado duas vezes por semana usando um paquímetro. Imagens de fluorescência in vivo foram obtidas logo após administração intraperitonial de 150 mg/kg de D-luciferina (Promega), usando o equipamento IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen/Caliper Life Sciences, CA) segundo as instruções do fabricante. Os dados foram analisados usando o programa Living Image 4.3 (Xenogen) (Figura 7).Example VIII: cold kits for 99m Tc-99m prostate cancer, [111] Male nude Balb / c rats 8-9 weeks old were inoculated subcutaneously with 100 pL of PC-3 suspension (1 χ 10 ⁶ cells) in right flank, and tumor growth monitored twice a week using a caliper. In vivo fluorescence images were obtained shortly after intraperitoneal administration of 150 mg / kg of D-luciferin (Promega), using the IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen / Caliper Life Sciences, CA) according to the manufacturer's instructions. The data were analyzed using the Living Image 4.3 (Xenogen) program (Figure 7).

[112] As imagens planares foram obtidas 90 minutos após injeção retro-orbital das nanopartículas de óxido de ferro decoradas com aptâmero anti-MUCl marcadas com Tc-99m usando uma câmera Millenium Gamma (GE Healthcare,[112] Planar images were obtained 90 minutes after retro-orbital injection of iron oxide nanoparticles decorated with Tc-99m-labeled anti-MUCl aptamer using a Millennium Gamma camera (GE Healthcare,

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Cleveland, USA). As contagens acumuladas em cinco minutos, numa janela de 15% centrada em 140 KeV, foram utilizadas para geração das imagens. As imagens foram processadas usando o programa OsiriX, e as regiões de interesse (ROIs) sobre os tumores selecionadas para análises específicas (Figura 8) . Desse modo, a imagem mostra a vetorização e concentração das nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com o aptâmero anti-MUCl no tumor (próstata) , em que um menor grau de concentração pelo fígado também foi evidenciado.Cleveland, USA). The counts accumulated in five minutes, in a 15% window centered on 140 KeV, were used to generate the images. The images were processed using the OsiriX program, and the regions of interest (ROIs) on the tumors selected for specific analyzes (Figure 8). Thus, the image shows the vectorization and concentration of the iron oxide nanoparticles functionalized with the anti-MUCl aptamer in the tumor (prostate), in which a lower degree of concentration by the liver was also evident.

- Exemplo IX: cold kits para câncer de mama com Ga-68 [113] A eficiência de marcação das nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com o aptâmero anti-MUCl e dtpa com o radioisótopo Ga-68 foi verificada por cromatografia de alta resolução (HPLC) em diferentes tempos e temperaturas, a saber 7 min, 30 min e 60 min e a 25 °C e 80°C respectivamente, usando uma vazão de 1 mL por minuto e solução salina 0,9% como fase móvel (Figura 9). Observa-se que a maior parte do radionuclídeo encontra-se ligado as nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com aptâmero anti-MUCl indicando alto grau de eficiência de marcação (>90%). Observa-se também que tanto o tempo como a temperatura não alteram a estabilidade da marcação, podendo a mesma ser realizada em 7 minutos à temperatura ambiente, assim como a 80 °C por 30 ou 60 minutos.- Example IX: cold kits for breast cancer with Ga-68 [113] The labeling efficiency of the iron oxide nanoparticles functionalized with the anti-MUCl and dtpa aptamer with the radioisotope Ga-68 was verified by high-resolution chromatography ( HPLC) at different times and temperatures, namely 7 min, 30 min and 60 min and at 25 ° C and 80 ° C respectively, using a flow rate of 1 mL per minute and 0.9% saline as the mobile phase (Figure 9 ). It is observed that most of the radionuclide is bound to the functionalized iron oxide nanoparticles with anti-MUCl aptamer indicating a high degree of labeling efficiency (> 90%). It is also observed that both time and temperature do not change the stability of the marking, which can be done in 7 minutes at room temperature, as well as at 80 ° C for 30 or 60 minutes.

[114] As nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com aptâmero anti-MUCl antes da marcação radioativa, monitorada em 220 nm, aparece como um pico fino com tempo de retenção de 3,07 minutos no perfil cromatográfico, como mostrado na Figura 10. Todavia, mostra[114] Iron oxide nanoparticles functionalized with anti-MUCl aptamer before radioactive labeling, monitored at 220 nm, appear as a fine peak with a 3.07 minute retention time in the chromatographic profile, as shown in Figure 10. However shows

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34/41 também a presença de picos referentes a prováveis produtos de decomposição do aptâmero, comuns ao se trabalhar com oligonucleotídeos.34/41 also the presence of peaks referring to probable aptamer decomposition products, common when working with oligonucleotides.

[115] 0 Ga-68 livre aparece como pico único e largo com tempo de retenção de cerca de 4,01 minutos, enquanto o aptâmero anti-MUCl livre tem tempo de retenção de 3,41 minutos (Figura 11) . Estes dados foram utilizados como padrão de comparação nos ensaios de marcação radioativa (aptâmero anti-MUCl/Ga-68) em diferentes condições de temperatura e tempo de reação.[115] The free Ga-68 appears as a single, wide peak with a retention time of about 4.01 minutes, while the free anti-MUCl aptamer has a retention time of 3.41 minutes (Figure 11). These data were used as a standard for comparison in radioactive labeling assays (anti-MUCl / Ga-68 aptamer) under different temperature and reaction time conditions.

[116] As amostras das nanopartículas de magnetita decorada com aptâmero Anti-MUCl e radiomarcadas com Ga-68 foram inoculadas por via retro-orbital em ratos Wistar fêmeas, pesando entre 350-400 g de modo a se traçar um perfil farmacocinético da nanopartícula (Figura 12) . Observa-se que a nanopartícula possui excelente perfil de eliminação renal, com inexpressiva eliminação hepatobiliar. A presença no fígado demonstra efeito pronunciado de metabolização hepática, contudo conservando as características de um radiofármaco diagnóstico, ou seja, a captação hepática não irá causar sobreposição nas imagens (cintilográficas e tomográficas, PET e SPECT) . O perfil apresenta uma captação cerebral desprezível, condizente para a formulação radiofarmacêutica. Além disso, visualizase uma afinidade plasmática, presente na captação sanguínea e cardíaca.[116] Samples of magnetite nanoparticles decorated with Anti-MUCl aptamer and radiolabeled with Ga-68 were inoculated retro-orbitally in female Wistar rats, weighing between 350-400 g in order to trace a pharmacokinetic profile of the nanoparticle ( Figure 12). It is observed that the nanoparticle has an excellent renal elimination profile, with inexpressive hepatobiliary elimination. The presence in the liver demonstrates a pronounced effect of hepatic metabolization, however maintaining the characteristics of a diagnostic radiopharmaceutical, that is, hepatic uptake will not cause overlap in the images (scintigraphic and tomographic, PET and SPECT). The profile shows negligible brain uptake, consistent with the radiopharmaceutical formulation. In addition, plasma affinity, present in blood and cardiac uptake, is visualized.

[117] A radioatividade média do produto radiomarcado com tempo de retenção de 4,8 (4,842 ± 0,033) minutos foi medida com um detector de radiação. Os cromatogramas de HPLC obtidos usando o detector de[117] The average radioactivity of the radiolabeled product with a retention time of 4.8 (4.842 ± 0.033) minutes was measured with a radiation detector. HPLC chromatograms obtained using the

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35/41 radioatividade mostra que, apesar da eficiência de radiomarcação não ser influenciada pela temperatura, foi observado um efeito do tempo de reação. De fato, foi observada uma nova espécie de Ga-68 livre e um novo produto radiomarcado diferente daquele obtido com o aptâmero antiMUC1, indicando a necessidade de se controlar o tempo, que deve ser de até 7-15 minutos.35/41 radioactivity shows that, although the radiolabeling efficiency is not influenced by temperature, an effect of reaction time was observed. In fact, a new species of free Ga-68 was observed and a new radiolabeled product different from that obtained with the antiMUC1 aptamer, indicating the need to control the time, which should be up to 7-15 minutes.

[118] Considerando-se a boa eficiência da marcação radioativa com Ga-68, as reações para os ensaios subsequentes foram realizadas à temperatura ambiente, por 7 minutos, onde o tempo de retenção do aptâmero anti-MUCl é de cerca de 4,8 minutos e do Ga-68 livre de 3,7 minutos na mistura (Tabela 2).[118] Considering the good efficiency of the radioactive labeling with Ga-68, the reactions for the subsequent tests were carried out at room temperature, for 7 minutes, where the retention time of the anti-MUCl aptamer is about 4.8 minutes and free 3.7-minute Ga-68 in the mixture (Table 2).

Tabela 2 - Estabilidade da marcação do Ga-68 junto a nanopartícula de magnetita decorada com aptâmero Anti-MUClTable 2 - Stability of Ga-68 marking next to a magnetite nanoparticle decorated with Anti-MUCl aptamer

Detector Detector Nome do pico Peak name RT RT Área Area Altur a Altur The Área% Area% Altura o O Height O O Exp. Exp. Condutivid Conductiv Desconhecido Unknown 3,292 3,292 398721 398721 25092 25092 34,30 34.30 43,034 43.034 T. T. ade ade 8 8 9 9 8 8 Amb. Amb. Aptamerl Aptamerl 4,067 4,067 633286 633286 26711 26711 54,49 54.49 45,810 45,810 0 0 9 9 1 1 7 7 Desconhecido Unknown 4,767 4.767 130182 130182 65051 65051 11,20 11.20 11,156 11,156 min. min. 3 3 1 1 Radioativi Radioactive Ga-68 livre Ga-68 free 3,675 3,675 11799 11799 660 660 8,001 8,001 13,217 13,217 da de of Produto Product 4,808 4.808 135669 135669 4333 4333 91,99 91.99 86,783 86,783 marcado marked 9 9 Condutivid Conductiv Desconhecido Unknown 3,292 3,292 398721 398721 25092 25092 34,30 34.30 43,034 43.034 ade ade 8 8 9 9 8 8 80 °C 80 ° C Aptamerl Aptamerl 4,067 4,067 633286 633286 26711 26711 54,49 54.49 45,810 45,810

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0 0 9 9 1 1 30 30 Desconhecido Unknown 4,767 4.767 130182 130182 65051 65051 11,20 11.20 11,156 11,156 min. min. 3 3 1 1 Radioativi Radioactive Ga-68 livre Ga-68 free 3,683 3,683 9330 9330 561 561 8,610 8.610 4 4 da de of Produto Product 4,883 4,883 99033 99033 3127 3127 91,39 91.39 4 4 marcado marked 0 0 CCondutivi CCondutivi Desconhecido Unknown 3,292 3,292 408533 408533 24826 24826 33,57 33.57 41,185 41,185 80 °C 80 ° C da de of 3 3 5 5 8 8 Aptamerl Aptamerl 4,075 4,075 640034 640034 27463 27463 52,60 52.60 45,559 45,559 60 60 5 5 7 7 5 5 min. min. Desconhecido Unknown 4,783 4,783 168119 168119 79909 79909 13,81 13.81 13,256 13,256 6 6 8 8 Radioativi Radioactive Ga-68 livre Ga-68 free 3,742 3.742 5827 5827 336 336 6, 978 6, 978 12,437 12,437 da de of Produto Product 4,842 4.842 77679 77679 2363 2363 93,02 93.02 87,563 87,563 marcado marked 2 2

- Exemplo X: cold kits para câncer de mama com Na-22.- Example X: cold kits for breast cancer with Na-22.

[119] Os ensaios de radiomarcação da magnetita decorada com aptâmero/anti-MUCl com Na-22 foi realizada sob várias condições de temperatura e tempo, a saber: 7 minutos à temperatura ambiente e 30 minutos a 80 °C. A Cromatografia de Camada Delgada (CCD) demonstrou que a radiomarcação da magnetita decorada com aptâmero anti-MUCl com Na-22 ocorreu rápida e perfeitamente à temperatura de 80 °C em um tempo de 30 min (96%) . Contudo, devido a natureza lábil do aptâmero, a radiomarcação realizada àquela temperatura por 7 minutos, embora tenha apresentado uma eficiência menor (92%), apresenta condições de uso na rotina, assim como maior viabilidade técnica e executiva (Figura 13).[119] Radiolabeling of magnetite decorated with aptamer / anti-MUCl with Na-22 was carried out under various conditions of temperature and time, namely: 7 minutes at room temperature and 30 minutes at 80 ° C. Thin layer chromatography (CCD) demonstrated that the radiolabeling of the magnetite decorated with anti-MUCl aptamer with Na-22 occurred quickly and perfectly at 80 ° C in a time of 30 min (96%). However, due to the labile nature of the aptamer, the radiolabeling performed at that temperature for 7 minutes, although it had a lower efficiency (92%), presents conditions for routine use, as well as greater technical and executive viability (Figure 13).

- Exemplo XI: processo de marcação da nanopartícula- Example XI: nanoparticle marking process

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 44/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 44/75

37/41 decorada com anticorpo monoclonal (trastuzumabe) com o radionuclídeo tecnécio-99m.37/41 decorated with monoclonal antibody (trastuzumab) with technionium-99m radionuclide.

[120] Alíquotas da nanopartícula de magnetita funcionalizada com anticorpo monoclonal trastuzumabe em concentração de 0,1 mg/mL em volume de 200 pL foram incubadas com 30 pg/mL do agente redutor cloreto estanoso em um volume de 100 pL obtendo-se uma solução límpida e acinzentada após incubação por dez minutos, à temperatura ambiente. Esta solução foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, com o radionuclídeo tecnécio-99m no volume de 0,3 mL com atividade de 100 pCi a 20 mCi (3,70xl0⁶ a 7,40xl0⁸ Bq) , obtendo-se um reagente de diagnóstico límpido, acinzentado, estéril e apirogênico a base da nanopartícula decorada com trastuzumabe marcado com o radionuclídeo. Posteriormente filtrou-se o reagente obtido com um filtro Millipore de 0,22 pm.[120] Aliquots of the magnetite nanoparticle functionalized with monoclonal antibody trastuzumab at a concentration of 0.1 mg / mL in a volume of 200 pL were incubated with 30 pg / mL of the reducing agent stannous chloride in a volume of 100 pL to obtain a solution clear and gray after incubation for ten minutes at room temperature. This solution was incubated for 20 minutes at room temperature, with the technetium-99m radionuclide in the volume of 0.3 mL with activity from 100 pCi to 20 mCi (3.70 x ^{10 6} to 7.40 x ^{10 8} Bq), obtaining a reagent with a clear, grayish, sterile and pyrogenic diagnosis based on the nanoparticle decorated with trastuzumab marked with the radionuclide. The reagent obtained was subsequently filtered with a 0.22 pm Millipore filter.

- Exemplo XII: processo de marcação da nanopartícula com o radionuclídeo tecnécio-99m - estudo da estabilidade da marcação utilizando cromatografia em papel Whatman n°l.- Example XII: process of marking the nanoparticle with the technetium-99m radionuclide - study of the stability of the marking using Whatman paper chromatography n ° 1.

[121] Com este método, verificou-se através da realização de sucessivos ensaios cromatográficos a estabilidade de marcação do complexo nanopartícula funcionalizada com anticorpo monoclonal trastuzumabe/Tc-99m tendo sido esta estável até pelo menos 24 horas. A eficiência de marcação foi superior a 90%, como recomendado. De fato foi igual ou superior a 97%, dentro do erro experimental (Tabela 3).[121] With this method, the stability of the functionalized nanoparticle complex with monoclonal antibody trastuzumab / Tc-99m was verified through successive chromatographic tests, which was stable for at least 24 hours. The marking efficiency was over 90%, as recommended. In fact, it was 97% or more, within the experimental error (Table 3).

Tabela 3 - Estabilidade da marcação em um intervalo de tempo de 8 horas e eficiência de marcação de nanopartículas de óxido de ferro com Tc-99m em função do tempo.Table 3 - Marking stability over an 8 hour time interval and marking efficiency of iron oxide nanoparticles with Tc-99m as a function of time.

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 45/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 45/75

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Tempo de reação (h) Time to reaction (h) marcação (%) marking (%) 0 0 99,7+0,4% 99.7 + 0.4% 1 1 99,5+0,9% 99.5 + 0.9% 2 2 98,3+0,8% 98.3 + 0.8% 3 3 98,1+1,2% 98.1 + 1.2% 4 4 98,5+0,5% 98.5 + 0.5% 8 8 97,2+1,2% 97.2 + 1.2%

Exemplo XIII - cold kit para câncer de mama com a nanopartícula_decorada_com_anticorpo_monoclonal (trastuzumabe).Example XIII - cold kit for breast cancer with nanoparticle_decorated_with_antibody_monoclonal (trastuzumab).

[122] Ratas nude Balb/c fêmeas (3), de 8-9 semanas de vida foram inoculadas subcutaneamente com 100 pL de suspensão de MDA-MB-231(1 χ 10⁶ células) no flanco direito, e o crescimento do tumor monitorado duas vezes por semana usando um paquímetro. Imagens de fluorescência in vivo foram obtidas logo após administração intraperitonial de 150 mg/kg de D-luciferina (Promega), usando o equipamento IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen/Caliper Life Sciences, CA) segundo as instruções do fabricante. Os dados foram analisados usando o programa Living Image 4.3 (Xenogen).[122] Female nude Balb / c rats (3), 8-9 weeks old, were inoculated subcutaneously with 100 pL of MDA-MB-231 suspension (1 χ 10 ⁶ cells) on the right flank, and tumor growth monitored twice a week using a caliper. In vivo fluorescence images were obtained shortly after intraperitoneal administration of 150 mg / kg of D-luciferin (Promega), using the IVIS Spectrum Imaging System (Xenogen / Caliper Life Sciences, CA) according to the manufacturer's instructions. The data were analyzed using the Living Image 4.3 program (Xenogen).

[123] Os ensaios de biodistribuição sistêmica, para avaliar a farmacocinética da nanopartícula magnética, decorada com anticorpo monoclonal trastuzumabe e radiomarcada com Tc-99m, foram determinados in vivo em ratos saudáveis. Dessa forma, três (3) ratas Wistar saudáveis pesando entre 300-400 g foram injetadas com (3,7 MBq/0,1 mL) de dose da nanopartícula de magnetita funcionalizada com anticorpo monoclonal e radiomarcada com[123] Systemic biodistribution assays, to evaluate the pharmacokinetics of the magnetic nanoparticle, decorated with monoclonal antibody trastuzumab and radiolabeled with Tc-99m, were determined in vivo in healthy rats. In this way, three (3) healthy Wistar rats weighing between 300-400 g were injected with (3.7 MBq / 0.1 mL) dose of the magnetite nanoparticle functionalized with monoclonal antibody and radiolabeled with

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 46/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 46/75

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Tc-99m, pela via retro-orbital. Após 1 hora os animais foram sacrificados, seus órgãos removidos e pesados e a radioatividade contada em contador do tipo gama. Os resultados foram expressos em percentagem de dose por órgão, conforme Figura 14. Os resultados demonstraram que quantidade >90% da nanopartícula de magnetita funcionalizada com anticorpo monoclonal e radiomarcada com Tc-99m são eliminadas pelos rins. Ou seja, em caso de sobre dosagem ou mesmo de intoxicação acidental, a administração de diuréticos de alça resolve o caso. Além disso, o clearance renal é importante de modo a se evitar a irradiação de órgãos sadios, o que não ocorrería nesse caso. Observa-se ainda uma discreta captação pelo intestino delgado que se deve a dois fatores principais: 1- presença de receptores HER-2 no intestino delgado; 2- Excreção intestinal da nanopartícula de magnetita decorada com anticorpo monoclonal e radiomarcada com Tc-99m ou de seus catabólitos. Mister se faz ressaltar a desprezível captura pelo cérebro, dotando essa nanopartícula de magnetita decorada com anticorpo monoclonal e radiomarcada com Tc-99m de um elevado grau de segurança. Por fim necessário se faz ressaltar que não houve captação elevada em nenhum outro órgão além dos órgãos excretores, o nanopartícula de magnetita decorada monoclonal e radiomarcada com Tc-99m de pouca ou baixíssimo potencial de acometimento de reações adversas.Tc-99m, via the retro-orbital route. After 1 hour the animals were sacrificed, their organs removed and weighed and the radioactivity counted in a gamma counter. The results were expressed as a percentage of dose per organ, as shown in Figure 14. The results demonstrated that> 90% of the magnetite nanoparticle functionalized with monoclonal antibody and radiolabeled with Tc-99m are eliminated by the kidneys. That is, in case of overdosage or even accidental intoxication, the administration of loop diuretics solves the case. In addition, renal clearance is important in order to avoid irradiation of healthy organs, which would not occur in this case. There is also a slight uptake by the small intestine due to two main factors: 1- presence of HER-2 receptors in the small intestine; 2- Intestinal excretion of the magnetite nanoparticle decorated with monoclonal antibody and radiolabeled with Tc-99m or its catabolites. Mister emphasizes the negligible capture by the brain, endowing this nanoparticle with magnetite decorated with monoclonal antibody and radiolabeled with Tc-99m with a high degree of safety. Finally, it is necessary to emphasize that there was no elevated uptake in any other organ besides the excretory organs, the magnetite nanoparticle decorated with monoclonal and radiolabeled with 99m Tc with little or very low potential for adverse reactions.

[124] De modo a se avaliar a biodistribuição sistêmica em modelos realistas, foi realizado ensaio de biodistribuição em camundongos Balb/c induzidos com tumor de mama, pelo método xenográfico anteriormente descrito.[124] In order to assess systemic biodistribution in realistic models, a biodistribution assay was carried out on Balb / c mice induced with breast tumor, using the xenographic method previously described.

que dota essa com anticorpothat endows this with antibody

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Assim foram injetados em três camundongos Balb/c fêmeas (induzidas com câncer de mama no flanco direto pela injeção de 100 pL de uma suspensão de MDA-MB-231 (1 χ 10⁶ células) no flanco direito) uma solução de (3,7 MBq/0,1 mL) de dose da nanopartícula de magnetita funcionalizada com anticorpo monoclonal trastuzumabe e radiomarcada com Tc-99m, pela via retro-orbital. Após 2 horas os animais foram sacrificados, seus órgãos removidos e pesados e a radioatividade contada em contador do tipo gama. Os resultados foram expressos em percentagem de dose por órgão, conforme Figura 15. Os resultados da biodistribuição da nanopartícula de magnetita decorada com anticorpo monoclonal trastuzumabe e radiomarcada com Tc-99m demonstrou uma grande afinidade pela lesão (>40%). Esse fato corrobora indelevelmente sua aplicabilidade como agente de imagem molecular para câncer de mama. Os resultados demonstraram ainda que a nanopartícula de magnetita decorada com anticorpo monoclonal trastuzumabe e radiomarcada com Tc-99m apresenta uma eliminação discreta pelas vias hepatobiliares e uma acentuada excreção renal.Thus, three female Balb / c mice (induced with breast cancer in the direct flank by injecting 100 pL of a suspension of MDA-MB-231 (1 χ 10 ⁶ cells) in the right flank) were injected with a solution of (3, 7 MBq / 0.1 mL) dose of the magnetite nanoparticle functionalized with monoclonal antibody trastuzumab and radiolabeled with Tc-99m, through the retro-orbital route. After 2 hours the animals were sacrificed, their organs removed and weighed and the radioactivity counted in a gamma counter. The results were expressed as a percentage of dose per organ, as shown in Figure 15. The results of the biodistribution of the magnetite nanoparticle decorated with monoclonal antibody trastuzumab and radiolabeled with Tc-99m demonstrated a great affinity for the lesion (> 40%). This fact indelibly corroborates its applicability as a molecular imaging agent for breast cancer. The results also demonstrated that the magnetite nanoparticle decorated with monoclonal antibody trastuzumab and radiolabeled with Tc-99m presents a discreet elimination through the hepatobiliary pathways and a marked renal excretion.

[125] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.[125] Those skilled in the art will value the knowledge presented here and will be able to reproduce the invention in the modalities presented and in other variants, covered by the scope of the attached claims.

Referências Bibliográficas:Bibliographic references:

[126] Cerqueira-Coutinho C, Missailidis S, Alessandra-Perini J, et al. Comparison of biodistribution profile of monoclonal antibodies nanoparticles and aptamers in rats with breast câncer. Artif Cells Nanomed Biotechnol.[126] Cerqueira-Coutinho C, Missailidis S, Alessandra-Perini J, et al. Comparison of biodistribution profile of monoclonal antibodies nanoparticles and aptamers in rats with breast cancer. Artif Cells Nanomed Biotechnol.

2017 May;45(3):598-601.2017 May; 45 (3): 598-601.

Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 48/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 48/75

41/41 [127] Dutta J, Baijnath S, Somboro AM, et al. Synthesis , in vitro evaluation and ⁶⁸ Garadiolabeling of CDPl towards PET/CT imaging of bacterial infection. Chem Biol Drug Des. 2017 Mar 22.41/41 [127] Dutta J, Baijnath S, Somboro AM, et al. Synthesis, in vitro evaluation and ⁶⁸ Garadiolabeling of CDPl towards PET / CT imaging of bacterial infection. Chem Biol Drug Des. 2017 Mar 22.

[128] Jin ZH, Furukawa T, Ohya T, et al. 67CuRadiolabeling of a multimeric RGD peptide for ανβ3 integrin-targeted radionuclide therapy: stability, therapeutic efficacy , and safety studies in mice. Nucl Med Commun. 2017 Apr;38(4):347-355.[128] Jin ZH, Furukawa T, Ohya T, et al. 67CuRadiolabeling of a multimeric RGD peptide for ανβ3 integrin-targeted radionuclide therapy: stability, therapeutic efficacy, and safety studies in mice. Nucl Med Commun. 2017 Apr; 38 (4): 347-355.

[129] Mastren T, Radchenko V, Bach HT, et al. Bulk production and evaluation of high specific activity 186gRe for câncer therapy using enriched 186WO3 targets in a proton beam. Nucl Med Biol. 2017 Mar 3; 49:24-29.[129] Mastren T, Radchenko V, Bach HT, et al. Bulk production and evaluation of high specific activity 186gRe for cancer therapy using enriched 186WO3 targets in a proton beam. Nucl Med Biol. 2017 Mar 3; 49: 24-29.

[130] Revskaya E, Jiang Z, Morgenstern A, et al. A Radiolabeled Fully Human Antibody to Human Aspartyl (Asparaginyl) β-Hydroxylase Is a Promising Agent for Imaging and Therapy of Metastatic Breast Câncer. Câncer Biother Radiopharm. 2017 Mar;32(2):57-65.[130] Revskaya E, Jiang Z, Morgenstern A, et al. A Radiolabeled Fully Human Antibody to Human Aspartyl (Asparaginyl) β-Hydroxylase Is a Promising Agent for Imaging and Therapy of Metastatic Breast Cancer. Cancer Biother Radiopharm. 2017 Mar; 32 (2): 57-65.

[131] Sarcinelli MA, Albernaz MS, Szwed M, et al. Nanoradiopharmaceuticals for breast câncer imaging: development, characterization, and imaging in inducted animais. Onco Targets Ther. 2016 Sep 23; 9:5847-5854.[131] Sarcinelli MA, Albernaz MS, Szwed M, et al. Nanoradiopharmaceuticals for breast cancer imaging: development, characterization, and imaging in inducted animals. Onco Targets Ther. 2016 Sep 23; 9: 5847-5854.

[132] Van Mourik T, Claesener M, Nicolay K, Gruell H. Development of a novel, fibrin-specific PET tracer. J Labelled Comp Radiopharm. 2017 Mar 20.[132] Van Mourik T, Claesener M, Nicolay K, Gruell H. Development of a novel, fibrin-specific PET tracer. J Labeled Comp Radiopharm. 2017 Mar 20.

[133] Warnders FJ, Terwisscha van Scheltinga AG, Knuehl C, et al. HER3 specific biodistribution and tumor uptake of 89Zr-MSB0010853 visualized by real-time and noninvasive PET imaging. J Nucl Med. 2017 Mar 30. pii: j numed.116.181586.[133] Warnders FJ, Terwisscha van Scheltinga AG, Knuehl C, et al. HER3 specific biodistribution and tumor uptake of 89Zr-MSB0010853 visualized by real-time and noninvasive PET imaging. J Nucl Med. 2017 Mar 30. pii: j numed.116.181586.

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Claims (30)

REIVINDICAÇÕES 1. Nanopartículas magnéticas decoradas com moléculas com funções complementares caracterizadas pelo fato de compreenderem:1. Magnetic nanoparticles decorated with molecules with complementary functions characterized by the fact that they comprise: a) Um núcleo de óxido de ferro, preferencialmente magnetita (Fe3O₄) , maghemita (y-FezOa) ou mistura de ambas;a) An iron oxide core, preferably magnetite (Fe3O ₄ ), maghemite (y-FezOa) or a mixture of both; eand b) Uma camada molecular quimicamente ligada à superfície dos núcleos de óxido de ferro através de grupos coordenantes, a qual encontram-se associadas espécies bioativas ou biomoléculas e ligantes polidentados.b) A molecular layer chemically linked to the surface of the iron oxide nuclei through coordinating groups, which are associated with bioactive species or biomolecules and polyidentated ligands. 2. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de o referido núcleo possuir formato quase esférico e tamanho médio entre 2 e 200 nm, preferencialmente 1 a 50 nm, mais preferencialmente 7 nm, com índice de polidispersividade abaixo de 0,3, preferencialmente 0,15, em que a percentagem em massa de óxido de ferro da referida nanopartícula é entre 50% a 90%.2. Nanoparticles, according to claim 1, characterized by the fact that said nucleus has an almost spherical shape and an average size between 2 and 200 nm, preferably 1 to 50 nm, more preferably 7 nm, with a polydispersity index below 0, 3, preferably 0.15, wherein the mass percentage of iron oxide of said nanoparticle is between 50% to 90%. 3. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de os referidos coordenantes serem selecionados dos grupos que consistem em carboxilatos, fosfatos, fosfonatos, catecolatos, fenolatos, poli-fenóis, silanóis, tióis e derivados.3. Nanoparticles, according to claim 1, characterized by the fact that said coordinates are selected from groups consisting of carboxylates, phosphates, phosphonates, catecholates, phenolates, poly-phenols, silanols, thiols and derivatives. 4. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizadas pelo fato de os referidos coordenantes serem associados às espécies bioativas ou biomoléculas selecionadas pelo menos uma dentre os grupos constituídos por biotina, glicose 1-fosfato, glicose 6-fosfato, ácido fólico, dopamina, ibuprofeno; anticorpos monoclonais Trastuzumabe, Alentuzumabe, Bevacizumabe, Brentuximabe4. Nanoparticles, according to claim 1 or 3, characterized by the fact that said coordinates are associated with bioactive species or biomolecules selected from at least one of the groups consisting of biotin, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, folic acid , dopamine, ibuprofen; monoclonal antibodies Trastuzumab, Alentuzumab, Bevacizumab, Brentuximab Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 50/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 50/75 2/Ί2 / Ί GentuzumabeGentuzumab Ipilimumabe,Ipilimumab, Rituximabe,Rituximab, Vedotine, Cetuximabe, Cetuximab, Erbitux®,Vedotine, Cetuximab, Cetuximab, Erbitux®, Ozogamicina, Ibritumomabe Tiuxetane,Ozogamycin, Ibritumomab Tiuxetane, Ofatumumabe, Panituzumabe, Pertuzumabe,Ofatumumab, Panituzumab, Pertuzumab, Tositumomabe, Trastuzumabe, Trastuzumab e Herceptin® entre outras; sequência de DNA e ou RNA, em especial aptâmeros, preferencialmente com aptâmero anti-MUCl e/ou anticorpo monoclonal Trastuzumabe.Tositumomab, Trastuzumab, Trastuzumab and Herceptin®, among others; sequence of DNA and or RNA, in particular aptamers, preferably with anti-MUCl aptamer and / or monoclonal antibody Trastuzumab. 5. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelo fato de as referidas espécies bioativas ou biomoléculas serem responsáveis pelo processo de vetorização.5. Nanoparticles, according to claim 4, characterized by the fact that said bioactive species or biomolecules are responsible for the vectorization process. 6. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de os referidos ligantes polidentados serem selecionados do grupo que consistem em ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetraacético (DOTA), ácido etileno diamina tetraacético, e similares.6. Nanoparticles according to claim 1, characterized in that said polyidentated ligands are selected from the group consisting of diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-l, 4,7 , 10-tetraacetic (DOTA), ethylene diamine tetraacetic acid, and the like. 7. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de os ligantes polidentados serem disponíveis para ligação de radionuclídeos.7. Nanoparticles, according to claim 6, characterized by the fact that polyidentated ligands are available for binding radionuclides. 8. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de, adicionalmente, a camada molecular ser composta por ligantes adjuvantes selecionados do grupo que consistem em polietilenoglicóis (PEGs) e seus derivados.8. Nanoparticles, according to claim 1, characterized by the fact that, in addition, the molecular layer is composed of adjuvant ligands selected from the group consisting of polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives. 9. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato de os referidos ligantes adjuvantes serem responsáveis pela melhoria da dispersibilidade e tempo de circulação da nanopartícula no sangue que varia de 0,5 a 10 horas.9. Nanoparticles, according to claim 8, characterized by the fact that said adjuvant ligands are responsible for improving the dispersibility and circulation time of the nanoparticle in the blood that varies from 0.5 to 10 hours. Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 51/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 51/75 3/73/7 10. Nanopartículas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadas pelo fato de apresentarem simultaneamente a capacidade de ligar radioisótopos; a capacidade de vetorização; a capacidade de não formar aglomerados; e a capacidade de se manterem dispersos no sistema circulatório, preferencialmente por meio de ligação às proteínas plasmáticas, mais preferencialmente à albumina.Nanoparticles according to any one of claims 1 to 9, characterized by the fact that they simultaneously have the ability to bind radioisotopes; the ability to vectorize; the ability to not form clusters; and the ability to remain dispersed in the circulatory system, preferably through binding to plasma proteins, more preferably to albumin. 11. Kit de reativos para diagnóstico, terapia e teragnóstica de câncer caracterizado pelo fato de compreender:11. Reactive kit for diagnosis, therapy and cancer therapy characterized by the fact that it comprises: - um frasco (i) contendo de 10 a 80 mg de um agente redutor, e de 0,1 a 1 mg de um agente quelante; e- a vial (i) containing 10 to 80 mg of a reducing agent, and 0.1 to 1 mg of a chelating agent; and - um frasco (ii) com 50 a 1000 pL de uma solução compreendendo nanopartículas magnéticas funcionalizadas com uma ou mais biomoléculas, e ligantes polidentados conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.- a flask (ii) with 50 to 1000 pL of a solution comprising magnetic nanoparticles functionalized with one or more biomolecules, and polyidentated binders as defined in any one of claims 1 to 10. 12. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o referido agente redutor ser selecionado do grupo que consiste em borohidreto de sódio (NaBH₄) , ditionito de sódio (Na2S2Ü₄) , fluoreto estanoso, cloreto estanoso, tartarato estanoso, ácido hidrazinonicotínico, hidrazinonicotinamida, preferencialmente cloreto estanoso.12. Kit according to claim 11, characterized in that said reducing agent is selected from the group consisting of sodium borohydride (NaBH ₄ ), sodium dithionite (Na2S2Ü ₄ ), stannous fluoride, stannous chloride, stannous tartrate , hydrazinonicotinic acid, hydrazinonicotinamide, preferably stannous chloride. 13. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o referido agente quelante ser selecionado do grupo que consiste em gluconato, glucoheptonato, ácido etilenodiamino tetra acético, pirofosfato, tartarato de sódio, citrato de sódio, e respectivos sais e anidridos, preferencialmente EDTA (ácido13. Kit according to claim 11, characterized in that said chelating agent is selected from the group consisting of gluconate, glucoheptonate, ethylenediamino tetra acetic acid, pyrophosphate, sodium tartrate, sodium citrate, and respective salts and anhydrides , preferably EDTA (acid Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 52/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 52/75 ΜΊ etilenodiamino tetra acético).ΜΊ ethylene diamine tetra acetic). 14. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de, alternativamente, o frasco (ii) compreender de 20 a 1000 mg de solubilizantes selecionados do grupo que consistem em açucares glicose, sacarose e preferencialmente manose com 0,5 a 10 mg de nanopartículas magnéticas funcionalizadas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.14. Kit, according to claim 11, characterized by the fact that, alternatively, the vial (ii) comprises from 20 to 1000 mg of solubilizers selected from the group consisting of sugars, glucose, sucrose and preferably mannose with 0.5 to 10 mg of functionalized magnetic nanoparticles as defined in any one of claims 1 to 10. 15. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de os referidos frascos (i, ii) serem estéreis e apirogênicos, selados em atmosfera de nitrogênio, em que preferencialmente são frascos multidoses feitos com vidro boro silicato.15. Kit, according to claim 11, characterized by the fact that the said vials (i, ii) are sterile and pyrogenic, sealed in a nitrogen atmosphere, in which they are preferably multi-dose vials made with boron silicate glass. 16. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender reativos em solução, liofilizados ou na forma sólida, em que a estabilidade do kit é superior a 3 meses, quando armazenados em temperatura de 4 °C.16. Kit, according to claim 11, characterized by the fact that it comprises reactives in solution, lyophilized or in solid form, in which the stability of the kit is greater than 3 months, when stored at a temperature of 4 ° C. 17. Uso do kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de ser aplicado à aquisição de imagens moleculares cintilográficas e tomográficas por emissão de pósitron e por emissão de fóton único; às imagens por coincidência de fótons e gamagrafia; ou outro processo de imagem utilizando detecção da radiação alfa, beta, gama, a depender do radionuclídeo utilizado.17. Use of the kit as defined in any of claims 11 to 16, characterized by the fact that it is applied to the acquisition of molecular scintigraphic and tomographic images by positron emission and by single photon emission; to images by coincidence of photons and gammagraphy; or other imaging process using detection of alpha, beta, gamma radiation, depending on the radionuclide used. 18. Nanopartículas radiomarcadas para diagnóstico ou terapia caracterizadas pelo fato de serem preparadas com o kit conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 16, e compreender:18. Radiolabeled nanoparticles for diagnosis or therapy characterized by the fact that they are prepared with the kit as defined in any of claims 11 to 16, and comprise: Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 53/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 53/75 5/75/7 - Um núcleo de óxido de ferro e uma camada molecular quimicamente ligada à superfície do núcleo através de grupos coordenantes associados às espécies bioativas ou biomoléculas, e ligantes polidentados conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; eAn iron oxide core and a molecular layer chemically linked to the surface of the core through coordinating groups associated with bioactive species or biomolecules, and polyidentated ligands as described in any of claims 1 to 10; and Pelo menos um radionuclídeo ligado aos ligantes polidentados.At least one radionuclide attached to the polyidentated ligands. 19. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo fato de possuírem tamanho que varia de 1 a 50 nm.19. Nanoparticles, according to claim 18, characterized by the fact that they have a size ranging from 1 to 50 nm. 20. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo fato de os radionuclídeos serem selecionados dos grupos que consistem tecnécio-99m, gálio68, sódio-22, flúor-18, cobre-64, rubídio-82, estrôncio-82, talio-201,; cobalto-60, iodo-131, iodo-125, fosforo-32, irídio-192, renio-186, estrôncio-89, samário-153, dentre outros.20. Nanoparticles, according to claim 18, characterized by the fact that radionuclides are selected from the groups consisting of technetium-99m, gallium68, sodium-22, fluorine-18, copper-64, rubidium-82, strontium-82, talio -201 ,; cobalt-60, iodine-131, iodine-125, phosphorus-32, iridium-192, renio-186, strontium-89, samarium-153, among others. 21. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadas pelo fato de alternativamente, os radionuclídeos serem substituídos por agentes de tratamento radioativos selecionados do grupo que consistem em Radio223, Iodo-131, Fósforo-32, ítrio-90, Samário-153 e 157, Estrôncio-90 e Holmio-166, dentre outros.21. Nanoparticles according to claim 20, characterized by the fact that, alternatively, the radionuclides are replaced by radioactive treatment agents selected from the group consisting of Radio223, Iodine-131, Phosphorus-32, Yttrium-90, Samarium-153 and 157, Estrôncio-90 and Holmio-166, among others. 22. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo fato de apresentarem capacidade de apresentar dispersabilidade adequada no sistema circulatório por 0,5 a 10 horas para interagirem e serem incorporados pelas células e tecidos tumorais.22. Nanoparticles, according to claim 18, characterized by the fact that they have the ability to present adequate dispersibility in the circulatory system for 0.5 to 10 hours to interact and be incorporated by tumor cells and tissues. 23. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo fato de não serem reconhecidas e23. Nanoparticles, according to claim 18, characterized by the fact that they are not recognized and Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 54/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 54/75 6/7 atacadas pelo sistema imunológico e sistema de excreção.6/7 attacked by the immune system and excretion system. 24. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo fato de possuírem eficiência de marcação superior a 90%, preferencialmente 95%, e estabilidade até 24h após a marcação.24. Nanoparticles, according to claim 18, characterized by the fact that they have marking efficiency greater than 90%, preferably 95%, and stability up to 24h after marking. 25. Nanopartículas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizadas pelo fato de serem administradas por via intravenosa, intramuscular ou aplicação tópica.25. Nanoparticles according to any one of claims 18 to 24, characterized in that they are administered intravenously, intramuscularly or topically. 26. Uso das nanopartículas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de serem para aplicação em diagnóstico para câncer de mama, câncer de próstata, câncer coloretal, hepático, esplênico, renal, cerebral, pulmonar e ósseo, preferencialmente câncer de mama e de próstata.26. Use of nanoparticles as defined in any one of claims 18 to 25, characterized by the fact that they are for use in diagnosis for breast cancer, prostate cancer, colorectal, liver, splenic, renal, brain, lung and bone cancer, preferably breast and prostate cancer. 27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser no preparo de um medicamento para tratar câncer de mama, câncer de próstata, câncer coloretal, hepático, esplênico, renal, cerebral, pulmonar e ósseo, preferencialmente câncer de mama e de próstata.27. Use, according to claim 26, characterized by the fact that it is in the preparation of a medication to treat breast cancer, prostate cancer, colorectal, liver, splenic, renal, brain, lung and bone cancer, preferably breast cancer and prostate. 28. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de o câncer de mama ser selecionado do grupo que consiste em carcinoma ductal in situ, carcinoma lobular in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, câncer de mama inflamatório, câncer de mama triplo-negativo, doença de Paget, tumor angiosarcoma, carcinoma cístico adenóide, metaplásico, carcinoma filoide, carcinoma mucinoso, medular, carcinoma carcinoma papilífero, carcinoma carcinoma micropapilífero, carcinoma misto, tubular, carcinoma28. Use according to claim 26 or 27, characterized in that breast cancer is selected from the group consisting of ductal carcinoma in situ, lobular carcinoma in situ, invasive ductal carcinoma, invasive lobular carcinoma, inflammatory breast cancer , triple-negative breast cancer, Paget's disease, angiosarcoma tumor, adenoid, metaplastic cystic carcinoma, filoid carcinoma, mucinous, medullary carcinoma, papillary carcinoma, micropapillary carcinoma, mixed, tubular carcinoma Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 55/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 55/75 7/7 cribiforme e câncer de mama masculino.7/7 cribiform and male breast cancer. 29. Uso, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de o câncer de próstata ser selecionado do grupo que consiste em adenocarcinoma acinar, adenocarcinoma ductal, câncer de célula transicional ou urotelial, câncer de células esquamosas, carcinóide, câncer de células pequenas, sarcomas e câncer sarcomatóide; melanoma extensivo superficial, nodular, lentigo maligno, acral, sem sítio primário, ocular, amelanótico, melanoma vaginal e melanona retal.29. Use according to claim 26 or 27, characterized in that prostate cancer is selected from the group consisting of acinar adenocarcinoma, ductal adenocarcinoma, transitional or urothelial cell cancer, squamous cell cancer, carcinoid, cancer of small cells, sarcomas and sarcomatoid cancer; extensive superficial, nodular melanoma, malignant lentigo, acral, without primary, ocular, amelanotic site, vaginal melanoma and rectal melanone. 30. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser para aquisição de imagens moleculares cintilográficas e tomográficas por emissão de pósitron (PET) e por emissão de fóton único; para imagens por coincidência de fótons e gamagrafia; ou outro processo de imagem utilizando detecção da radiação alfa, beta, gama, a depender do radionuclídeo utilizado.30. Use, according to claim 26, characterized by the fact that it is for the acquisition of scintigraphic and tomographic molecular images by positron emission (PET) and by single photon emission; for images by coincidence of photons and gammagraphy; or other imaging process using detection of alpha, beta, gamma radiation, depending on the radionuclide used. Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 56/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 56/75 1/151/15 Petição 870170032828, de 17/05/2017, pág. 57/75Petition 870170032828, of 5/17/2017, p. 57/75 2/152/15 * * 'f. 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