BR102016008417B1 - PROCESS OF SELECTIVE CONTROL OF POPULATIONS OF HEMATOPHAGEAL ARTHROPODS USING TYROSINE METABOLISM ENZYME INHIBITORS - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE CONTROLE SELETIVO DE POPULAÇÕES DE ARTRÓPODES HEMATÓFAGOS USANDO INIBIDORES DAS ENZIMAS DO METABOLISMO DA TIROSINA. A presente invenção refere-se a um processo para o controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos, de forma a substituir ou complementar o uso de inseticidas piretróides pelo uso de inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina, mais especificamente pelo uso de inibidores da 4- hidroxifenilpiruvato dioxigenase, especificamente aqueles da classe das piridil fenil cetonas substituídas, seus isômeros e seus sais e ou ainda uma combinação de dois ou mais destes compostos.PROCESS OF SELECTIVE CONTROL OF POPULATIONS OF BLEEDING ARTHROPODS USING INHIBITORS OF TYROSINE METABOLISM ENZYMES. The present invention refers to a process for the selective control of populations of hematophagous arthropods, in order to replace or complement the use of pyrethroid insecticides by the use of inhibitors of tyrosine metabolism enzymes, more specifically by the use of 4- hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, specifically those from the class of substituted pyridyl phenyl ketones, their isomers and their salts and or even a combination of two or more of these compounds.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao uso de inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina para o controle seletivo das populações de artrópodes hematófagos.[001] The present invention refers to the use of inhibitors of tyrosine metabolism enzymes for the selective control of hematophagous arthropod populations.

Fundamentos da InvençãoFundamentals of the Invention

[002] Artrópodes hematófagos são vetores de muitos agentes de doenças infecciosas. Em todo o mundo, a cada ano, mais de 1 bilhão de pessoas são infectadas por doenças transmitidas por vetores artrópodes hematófagos, das quais mais de 1 milhão morrem. Considera-se assim estas doenças um problema de saúde pública.[002] Hematophagous arthropods are vectors of many infectious disease agents. Worldwide, each year, more than 1 billion people are infected by diseases transmitted by hematophagous arthropod vectors, of which more than 1 million die. Thus, these diseases are considered a public health problem.

[003] Esses vetores representam também um dos principais fatores limitantes para a produção animal, causando perdas econômicas de bilhões de dólares por ano. A restrição das populações de vetores artrópodes hematófagos é essencial para controlar doenças transmitidas pelos mesmos.[003] These vectors also represent one of the main limiting factors for animal production, causing economic losses of billions of dollars per year. Restriction of hematophagous arthropod vector populations is essential to control diseases transmitted by them.

[004] Nas últimas décadas, o controle populacional desses vetores tem sido feito a partir do uso de inseticidas químicos pertencentes a três classes principais: organoclorados, organofosforados e piretróides. No entanto, o uso destes compostos tem resultado na seleção de populações resistentes, diminuindo a sua eficiência. Além disso, os compostos utilizados atingem todos os insetos indiscriminadamente, e apresentam toxicidade elevada para vertebrados, incluindo o homem, representando assim uma ameaça ao meio ambiente e a saúde. Portanto, há a necessidade da criação de novas estratégias de controle.[004] In recent decades, population control of these vectors has been carried out using chemical insecticides belonging to three main classes: organochlorines, organophosphates and pyrethroids. However, the use of these compounds has resulted in the selection of resistant populations, decreasing their efficiency. In addition, the compounds used affect all insects indiscriminately, and are highly toxic to vertebrates, including humans, thus representing a threat to the environment and health. Therefore, there is a need to create new control strategies.

[005] Os inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina são usados como herbicidas na agricultura e, na saúde humana, para o tratamento da tirosinemia tipo I, mas até agora seu uso como inseticida não havia sido descrito.[005] Tyrosine metabolism enzyme inhibitors are used as herbicides in agriculture and, in human health, for the treatment of type I tyrosinemia, but until now their use as an insecticide had not been described.

[006] A presente invenção revela a importância particular das enzimas metabólicas da tirosina na fisiologia dos insetos hematófagos e o uso destas enzimas, tal como a Mesotriona e Nitisinona ou outros inibidores da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase, para o controle específico de populações de artrópodes hematófagos.[006] The present invention reveals the particular importance of the metabolic enzymes of tyrosine in the physiology of hematophagous insects and the use of these enzymes, such as Mesotrione and Nitisinone or other inhibitors of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, for the specific control of populations of hematophagous arthropods .

[007] Atualmente a mesotriona é amplamente utilizada como herbicida, comercializada sob o nome Callisto® (registrada pela Syngenta para uso como herbicida). Não há registros de intoxicação em mamíferos por este composto, nem mesmo com doses extremamente altas, de até 5000 mg/kg de peso corporal.[007] Mesotrione is currently widely used as a herbicide, marketed under the name Callisto® (registered by Syngenta for use as a herbicide). There are no records of intoxication in mammals by this compound, not even with extremely high doses, up to 5000 mg/kg of body weight.

[008] A Nitisinona (NTBC), por sua vez, é utilizada na saúde humana para o tratamento da Tirosinemia tipo I, sob o nome comercial de Orfadin® (comercializado por Swedish Orphan Biovitrum).[008] Nitisinone (NTBC), in turn, is used in human health for the treatment of Tyrosinemia type I, under the trade name Orfadin® (marketed by Swedish Orphan Biovitrum).

[009] Os inibidores de HPPD são amplamente utilizados como herbicidas, tal como no documento WO 2005/053407 que revela uma composição pesticida compreendendo inibidores do HPPD como herbicida e um inseticida, que podem ser escolhidos a partir de diversas classes. No entanto, em nenhum momento os inibidores da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase são citados por sua função inseticida, tendo apenas referências de sua função herbicida na literatura científica.[009] HPPD inhibitors are widely used as herbicides, such as in WO 2005/053407 which discloses a pesticidal composition comprising HPPD inhibitors as a herbicide and an insecticide, which can be chosen from several classes. However, at no time are 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors cited for their insecticidal function, with only references to their herbicidal function in the scientific literature.

[0010] Diversos outros documentos patentários, tais como US 2007 225169 A e WO 2011/068567, mencionam o uso de inibidores da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase também como herbicidas.[0010] Several other patent documents, such as US 2007 225169 A and WO 2011/068567, mention the use of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors also as herbicides.

[0011] Conforme visto a partir dos documentos indicados e como é de conhecimento dos técnicos no assunto, os inibidores de HPPD são amplamente utilizados na agricultura como herbicidas e na medicina para o tratamento de Tirosinemia.[0011] As seen from the documents indicated and as known to those skilled in the art, HPPD inhibitors are widely used in agriculture as herbicides and in medicine for the treatment of Tyrosinemia.

[0012] Esta invenção revela o uso de inibidores da 4- hidroxifenilpiruvato dioxigenase e de outros compostos deles derivados, ou cuja ação como inibidores de HPPD já esteja descrita, como uma forma seletiva e mais segura para controlar populações de insetos hematófagos.[0012] This invention reveals the use of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors and other compounds derived from them, or whose action as HPPD inhibitors has already been described, as a selective and safer way to control populations of hematophagous insects.

Breve Descrição da InvençãoBrief Description of the Invention

[0013] A presente invenção refere-se a uma forma sustentável, segura e de baixo custo, para a prevenção das doenças transmitidas pelos artrópodes hematófagos, como mosquitos, barbeiros e flebotomíneos. Além disso, o processo de controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos a partir do uso dos compostos aqui revelados também pode ter a finalidade de tratamento das infestações por outros parasitas hematófagos, tais como pulgas, carrapatos e piolhos.[0013] The present invention relates to a sustainable, safe and low-cost way to prevent diseases transmitted by hematophagous arthropods, such as mosquitoes, kissing bugs and sandflies. In addition, the process of selective control of populations of hematophagous arthropods using the compounds disclosed here may also have the purpose of treating infestations by other hematophagous parasites, such as fleas, ticks and lice.

[0014] A presente invenção trata-se de um processo de controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos usando inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina, como a mesotriona e a nitisinona. Em modalidades não restritivas da invenção, o uso dos referidos inibidores pode ser: na fabricação de uma composição inseticida de uso tópico, diretamente sobre inseto hematófago; de uso oral, pelo hospedeiro endotérmico a ser picado pelo inseto; ou de uso oral direto pelo referido inseto, com em iscas.[0014] The present invention deals with a process of selective control of hematophagous arthropod populations using inhibitors of tyrosine metabolism enzymes, such as mesotrione and nitisinone. In non-restrictive embodiments of the invention, the use of said inhibitors can be: in the manufacture of an insecticide composition for topical use, directly on hematophagous insects; for oral use, by the endothermic host being stung by the insect; or of direct oral use by the said insect, with baits.

Breve Descrição dos DesenhosBrief Description of the Drawings

[0015] A presente invenção será, a seguir, descrita com referência às características representadas nas figuras brevemente descritas a seguir.[0015] The present invention will now be described with reference to the features represented in the figures briefly described below.

[0016] A figura 1 é uma representação esquemática das vias metabólicas da tirosina, apresentando sua a inibição pelo processo da presente invenção.[0016] Figure 1 is a schematic representation of the metabolic pathways of tyrosine, showing their inhibition by the process of the present invention.

[0017] As Figuras de 2A a 2L apresentam uma série de gráficos contendo dados de diversas análises da sobrevivência de artrópodes hematófago e não-hematófagos após realização do processo da presente invenção.[0017] Figures 2A to 2L show a series of graphs containing data from several analyzes of the survival of hematophagous and non-hematophagous arthropods after carrying out the process of the present invention.

Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention

[0018] A figura 1 é uma representação esquemática das vias metabólicas da tirosina. A partir do processo da presente invenção é obtida a inibição das enzimas do catabolismo da tirosina, afetando seletivamente a fisiologia dos artrópodes hematófagos e podendo levar à sua morte e à diminuição da viabilidade de sua prole.[0018] Figure 1 is a schematic representation of the metabolic pathways of tyrosine. The process of the present invention inhibits tyrosine catabolism enzymes, selectively affecting the physiology of blood-sucking arthropods and may lead to their death and reduced viability of their offspring.

[0019] Para uma fácil visualização do efeito do processo nas vias metabólicas, as setas das reações de catabolismo que são interrompidas foram marcadas com um “x” na figura. São inseridas outras legendas na figuras para facilitar a visualização das vias metabólicas da tirosina, onde PAH é a fenilalanina hidroxilasa; TAT é a tirosina aminotransferase; HPPD é a 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase; HgD é a homogentisato 1,2-dioxigenase; MAAI é a maleilacetoacetato isomerase; FAA é a Fumarilacetoacetase; TH é a Tirosina hidroxilase; DDC é a L-DOPA descarboxilase/L-aminoácido aromático descarboxilase; PO é a fenol oxidase; DCT é a dopacromo tautomerase; DCE é a enzima de conversão do dopacromo; TβH é a tiramina β-hidroxilase; L-DOPA é a L-3,4- dihidroxifenilalanina; DHI é a 5,6-dihidroxi; DHICA é o ácido 5,6-dihidroxi-2-carboxílico; L-ODAP é o ácido beta N oxalil L alfa,beta diaminopropiônico.[0019] For an easy visualization of the effect of the process on the metabolic pathways, the arrows of the catabolism reactions that are interrupted were marked with an “x” in the figure. Other legends are inserted in the figures to facilitate the visualization of the metabolic pathways of tyrosine, where PAH is phenylalanine hydroxylase; TAT is tyrosine aminotransferase; HPPD is 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; HgD is 1,2-dioxygenase homogentisate; MAAI is maleylacetoacetate isomerase; FAA is Fumarylacetoacetase; TH is Tyrosine hydroxylase; DDC is L-DOPA decarboxylase/L-aromatic amino acid decarboxylase; PO is phenol oxidase; DCT is dopachrome tautomerase; DCE is the dopachrome converting enzyme; TβH is tyramine β-hydroxylase; L-DOPA is L-3,4-dihydroxyphenylalanine; DHI is 5,6-dihydroxy; DHICA is 5,6-dihydroxy-2-carboxylic acid; L-ODAP is beta N oxalyl L alpha, beta diaminopropionic acid.

[0020] A fim de comprovar o efeito obtido pelo processo da presente invenção na inibição das enzimas do catabolismo da tirosina na fisiologia dos artrópodes hematófagos, foi utilizada a técnica de Ácido Ribonucleico de Interferência (RNAi). A técnica foi realizada, em um dos exemplos da invenção, em Rhodnius prolixus, um vetor da Doença de Chagas. Observou-se que o silenciamento gênico da tirosina aminotrasferase (TAT) e 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) causa a morte deste inseto após a alimentação com sangue contendo inibidores do HPPD.[0020] In order to prove the effect obtained by the process of the present invention in the inhibition of tyrosine catabolism enzymes in the physiology of hematophagous arthropods, the Interference Ribonucleic Acid (RNAi) technique was used. The technique was performed, in one of the examples of the invention, on Rhodnius prolixus, a vector of Chagas disease. It was observed that gene silencing of tyrosine aminotransferase (TAT) and 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) causes the death of this insect after feeding on blood containing HPPD inhibitors.

[0021] Baseado nos resultados obtidos em Rhodnius prolixus, foram avaliados os efeitos dos inibidores da HPPD, mais especificamente de Mesotriona (nome sistemático no IUPAC 2-4-Metilsulfonil-2 nitrobenzoil]ciclohexano-1,3- diona) e de nitisinona (nome sistemático no IUPAC 2-(2-nitro- 4-trifluorometilbenzoil)-1,3-ciclohexanodiona), em artrópodes hematófagos e não hematófagos.[0021] Based on the results obtained in Rhodnius prolixus, the effects of HPPD inhibitors were evaluated, more specifically Mesotrione (systematic name in the IUPAC 2-4-Methylsulfonyl-2-nitrobenzoyl]cyclohexane-1,3-dione) and nitisinone ( systematic IUPAC name 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione), in hematophagous and non-hematophagous arthropods.

[0022] Conforme visto nas figuras de 2A a 2H, que apresentam gráficos da sobrevivência dos insetos com o tempo, os dois inibidores mataram seletivamente artrópodes hematófagos, como os mosquitos, barbeiros e carrapatos, mas não afetaram significativamente a sobrevivência de insetos não hematófagos, tais como Oncopeltus fasciatus e Tribolium castaneum.[0022] As seen in figures 2A to 2H, which show graphs of insect survival over time, the two inhibitors selectively killed hematophagous arthropods, such as mosquitoes, kissing bugs and ticks, but did not significantly affect the survival of non-hematophagous insects, such as Oncopeltus fasciatus and Tribolium castaneum.

[0023] Como a maioria dos inseticidas usados atualmente atuam após absorção através da cutícula do inseto, foi feita a aplicação tópica de mesotriona dissolvida em metanol.[0023] Since most insecticides currently used act after absorption through the insect cuticle, topical application of mesotrione dissolved in methanol was performed.

[0024] Como apresentada nas figuras 2I e 2J, esta aplicação causou a morte de R. prolixus adultos, demonstrando que absorção deste composto ou outros inibidores através da cutícula em concentrações ativas também é viável.[0024] As shown in figures 2I and 2J, this application caused the death of adult R. prolixus, demonstrating that absorption of this compound or other inhibitors through the cuticle in active concentrations is also feasible.

[0025] Em uma outra modalidade, apresentada nas figuras 2K e 2L, os mosquitos foram alimentados com camundongos que receberam uma dose oral de nitisinona (30 mg/kg). Estes insetos morreram após a refeição de sangue, comprovando-se também a possibilidade de uso através da ingestão de inibidores pelo animal o qual deseja-se proteger, tais como seres humanos (a nitisinona já é empregada para tratamento de tirosinemia em seres humanos) ou animais de criação.[0025] In another embodiment, shown in figures 2K and 2L, mosquitoes were fed mice that received an oral dose of nitisinone (30 mg/kg). These insects died after the blood meal, also proving the possibility of use through the ingestion of inhibitors by the animal which one wants to protect, such as humans (nitisinone is already used to treat tyrosinemia in humans) or farmed animals.

[0026] Desde que a HPPD foi identificada como um dos alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos herbicidas, mais do que 6000 inibidores de HPPD com propriedades químicas diferentes foram desenvolvidos. Baseado nos resultados obtidos a partir das análises ora reveladas, os compostos químicos mesotriona e NTBC, separadamente ou em conjunto, assim como outros inibidores das enzimas do catabolismo da tirosina, demonstram ser poderosos inseticidas, especificamente contra insetos hematófagos como uma estratégia segura e de baixo impacto sobre o meio ambiente e a saúde humana e animal, para o controle das populações de insetos hematófagos. Além disso, o uso combinado destes compostos apresenta o potencial de reduzir a probabilidade de desenvolvimento de resistência por parte dos insetos hematófagos.[0026] Since HPPD was identified as one of the most promising targets for the development of new herbicides, more than 6000 HPPD inhibitors with different chemical properties have been developed. Based on the results obtained from the analyzes disclosed herein, the chemical compounds mesotrione and NTBC, separately or together, as well as other inhibitors of tyrosine catabolism enzymes, demonstrate to be powerful insecticides, specifically against hematophagous insects as a safe and low-cost strategy. impact on the environment and human and animal health, for the control of hematophagous insect populations. In addition, the combined use of these compounds has the potential to reduce the likelihood of resistance development by hematophagous insects.

[0027] De uma maneira não restritiva, o processo de controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos da presente invenção pode utilizar uma pluralidade de inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina. Esses inibidores são representados abaixo por fórmulas de Markush, sendo formas equivalentes de acordo com a literatura apresentada neste relatório. Uma possível estrutura de Markush desse inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase é apresentada abaixo:

[0027] In a non-restrictive way, the process of selective control of populations of hematophagous arthropods of the present invention can use a plurality of inhibitors of tyrosine metabolism enzymes. These inhibitors are represented below by Markush formulas, being equivalent forms according to the literature presented in this report. A possible Markush structure of this 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor is shown below:

[0028] Em outra modalidade não restritivas, o composto inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase possui a seguinte estrutura de Markush:

[0028] In another non-restrictive embodiment, the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor compound has the following Markush structure:

[0029] Em outra modalidade não restritivas, o composto inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase possui a seguinte estrutura de Markush:

[0029] In another non-restrictive embodiment, the 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitor compound has the following Markush structure:

[0030] Nas estruturas de Markush apresentadas acima o radical X pode ser o oxigênio ou enxofre. Por sua vez, o radical R é um halogênio ou dióxido de nitrogênio. Os radicais R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são selecionados de um grupo contendo H, OH, alquila de C1-C4, haloalquila de C1-C4, alcoxi de C1-C4, alcoxialquila de C1-C4, ciano, tiociano, N2O e RbSOn, onde n é 0 ou 2 e Rb é uma alquila de C1-C4. Em uma modalidade, o alcoxi de C1-C4 é selecionado de um grupo compreendendo: metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, sec-butóxi, isobutóxi e t-butóxi. Em uma modalidade, a haloalquila de C1-C4 inclui os oito grupos de alquila com um ou mais hidrogênios substituídos por cloro, bromo, iodo ou flúor. Alternativamente, a alquila C1-C4 alcóxi inclui os oito grupos de alquila com um ou mais hidrogênios substituídos por oxigênio. Em uma modalidade, a alquila de C1-C4 é selecionada de um grupo compreendendo: metila, etila, propila, n-propila, isopropila, butila, n- butila, sec-butila, Isobutila e t-butila.[0030] In the Markush structures presented above the radical X can be oxygen or sulfur. In turn, the radical R is a halogen or nitrogen dioxide. The radicals R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 and R8 are selected from a group containing H, OH, C1-C4 alkyl, C1-C4 haloalkyl, C1-C4 alkoxy, C1-C4 alkoxyalkyl , cyano, thiocyano, N2O and RbSOn, where n is 0 or 2 and Rb is a C1-C4 alkyl. In one embodiment, the C1-C4 alkoxy is selected from the group comprising: methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, sec-butoxy, isobutoxy and t-butoxy. In one embodiment, the C1-C4 haloalkyl includes the eight alkyl groups with one or more hydrogens replaced by chlorine, bromine, iodine, or fluorine. Alternatively, C1-C4 alkyl alkoxy includes the eight alkyl groups with one or more hydrogens replaced by oxygen. In one embodiment, the C1-C4 alkyl is selected from the group comprising: methyl, ethyl, propyl, n-propyl, isopropyl, butyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl and t-butyl.

[0031] Em uma outra modalidade da presente invenção, os radicais R3 e R4 são carbonila, e os radicais R1, R2, R5 e R6 são alquila de C1-C4.[0031] In another embodiment of the present invention, the R3 and R4 radicals are carbonyl, and the R1, R2, R5 and R6 radicals are C1-C4 alkyl.

[0032] Para um entendimento mais claro da invenção, são apresentadas abaixo modalidades e exemplos da mesma. Estes exemplos são meramente ilustrativos e não devem ser entendidos de nenhuma maneira como limitantes do escopo ou dos princípios fundamentais da invenção, sendo aqui incluídos principalmente para substanciar os fundamentos teóricos da invenção. De fato, várias modificações, além daquelas descritas nesta invenção, serão evidentes para os técnicos no assunto.[0032] For a clearer understanding of the invention, embodiments and examples thereof are presented below. These examples are merely illustrative and should not be understood in any way as limiting the scope or fundamental principles of the invention, being included here mainly to substantiate the theoretical foundations of the invention. Indeed, several modifications, in addition to those described in this invention, will be evident to those skilled in the art.

Exemplo 1 - Síntese de RNA de cadeia dupla (dsRNA)Example 1 - Synthesis of double-stranded RNA (dsRNA)

[0033] Iniciadores específicos foram concebidos para cada gene alvo e utilizado para amplificar uma região entre 400 e 900 pb por PCR (Tabela 1). Estes iniciadores continham a sequência de ligação da polimerase de T7, necessário para a síntese de dsARN. O gene da proteína de ligação à maltose (MAL) de Escherichia coli (identificador gene 7.129.408) ligado num pBlueScript KS + (Stratagene) foi amplificado utilizando o promotor T7 e foi utilizado para a sínteses de dsRNA utilizando o kit de MEGAscript RNAi (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de dsARN foram determinadas espectrofotometricamente a 260 nm num espectrofotómetro v.3.7 Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific) e visualizada em gel de agarose (1,5% p/v) para conferir o tamanho, pureza e integridade do dsRNA.Tabela 1. Iniciadores específicos para cada gene alvo

[0033] Specific primers were designed for each target gene and used to amplify a region between 400 and 900 bp by PCR (Table 1). These primers contained the T7 polymerase binding sequence necessary for dsRNA synthesis. The Escherichia coli maltose binding protein (MAL) gene (gene identifier 7129408) ligated into pBlueScript KS+ (Stratagene) was amplified using the T7 promoter and was used for dsRNA synthesis using the MEGAscript RNAi kit ( Ambion) according to the manufacturer's instructions. The dsRNA concentrations were determined spectrophotometrically at 260 nm in a v.3.7 Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific) and visualized on an agarose gel (1.5% w/v) to check the size, purity and integrity of the dsRNA.Table 1 Specific primers for each target gene

[0034] Para preparação dos exemplos descritos adiante, insetos retirados de uma colônia de Rhodnius prolixus mantida a 28° C e 80-90% de umidade relativa sob foto período de 12 h de luz por 12 h de escuro foram alimentados com sangue de coelho em intervalos de 3 semanas. Os insetos da espécie Rhodnius prolixus citadas nos exemplos a seguir são adultos fêmeas que foram alimentados uma vez durante a fase adulta.[0034] To prepare the examples described below, insects taken from a colony of Rhodnius prolixus maintained at 28° C and 80-90% relative humidity under a photoperiod of 12 hours of light for 12 hours of darkness were fed on rabbit blood at 3 week intervals. The insects of the Rhodnius prolixus species cited in the examples below are female adults that have been fed once during adulthood.

Exemplo 2 - RNAi para determinar os fenótipos da perda de função dos genes alvosExample 2 - RNAi to determine loss-of-function phenotypes of target genes

[0035] Rhodnius prolixus fêmeas e ninfas de quarto instar foram injetadas com 2,5 μg de dsARN do gene alvo dissolvido em 1 μl de água. Insetos de controle foram injetados com quantidades semelhantes de MALdsRNA (RNA de dupla fita para proteína de ligação de maltose). Os insetos foram alimentados sete dias após a injeção de dsRNA, que foi considerado dia 0 pós a refeição de sangue (doravante denominado pelo acrónimo inglês PBM, para post-bloodmeal). Neste dia, a eficiência do silenciamento dos genes foi avaliada por RT- PCR quantitativo. Observou-se que o silenciamento gênico da tirosina aminotrasferase (TAT) e 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) causa a morte deste inseto após a alimentação com sangue contendo inibidores da HPPD.[0035] Rhodnius prolixus females and fourth instar nymphs were injected with 2.5 μg of dsRNA of the target gene dissolved in 1 μl of water. Control insects were injected with similar amounts of MALdsRNA (double-stranded RNA for maltose-binding protein). The insects were fed seven days after the dsRNA injection, which was considered day 0 post-bloodmeal (hereinafter PBM, for post-bloodmeal). On this day, the efficiency of gene silencing was evaluated by quantitative RT-PCR. It was observed that gene silencing of tyrosine aminotransferase (TAT) and 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) causes the death of this insect after feeding on blood containing HPPD inhibitors.

Exemplo 3 - Administração da Mesotriona em animaisExample 3 - Administration of Mesotrione in animals

[0036] Mesotriona (PESTANAL®-Sigma-Aldrich) foi solubilizada em água e o PH da solução foi ajustado para 7 com o auxílio de NaOH 1M. R. prolixus, carrapatos (R. microplus), Oncopeltus fasciatus e Tenebrio molitor adultos foram injetados no tórax com 1 μl de Mesotriona em concentrações de 2mg/ml, 0,5 mg/ml e 0,1 mg/ml. Os resultados do processo descrito nesse exemplo estão representados nas figuras 2A, 2B, 2D, 2G e 2H.[0036] Mesotrione (PESTANAL®-Sigma-Aldrich) was solubilized in water and the pH of the solution was adjusted to 7 with the aid of 1M NaOH. Adult R. prolixus, ticks (R. microplus), Oncopeltus fasciatus and Tenebrio molitor were injected into the thorax with 1 μl of Mesotrione at concentrations of 2mg/ml, 0.5 mg/ml and 0.1 mg/ml. The results of the process described in this example are represented in figures 2A, 2B, 2D, 2G and 2H.

[0037] A solução foi injetada em R. prolixus no dia 1, antes da refeição de sangue, ou no dia 2 PBM. O mesmo fenótipo foi observado em ambos os casos, independentemente do dia da injeção. Insetos controle foram injetados com 1 μL de água.[0037] The solution was injected into R. prolixus on day 1, before the blood meal, or on day 2 PBM. The same phenotype was observed in both cases, regardless of the day of injection. Control insects were injected with 1 μL of water.

[0038] Alternativamente, 6 μL de mesotriona dissolvidos em metanol (5 mg/mL) foram aplicados topicamente na cutícula abdominal de fêmea adulta de Rhodnius prolixus. Controles receberam 6 μL de metanol.[0038] Alternatively, 6 μL of mesotrione dissolved in methanol (5 mg/mL) were topically applied to the abdominal cuticle of adult female Rhodnius prolixus. Controls received 6 μL of methanol.

[0039] 1 μL de mesotriona dissolvidos em metanol (1 e 3 mg/mL) foram aplicados topicamente na cutícula abdominal de ninfas de Rhodnius prolixus. Os insetos controle receberam 1 μL de metanol. Os resultados do processo descrito nesse exemplo estão representados nas figuras 2I e 2J.[0039] 1 μL of mesotrione dissolved in methanol (1 and 3 mg/mL) were topically applied to the abdominal cuticle of Rhodnius prolixus nymphs. Control insects received 1 μL of methanol. The results of the process described in this example are represented in figures 2I and 2J.

Exemplo 4 - Ninfas de primeiro estágio R. prolixus e Aedes aegyptiExample 4 - First stage nymphs R. prolixus and Aedes aegypti

[0040] Soluções de mesotriona foram preparadas conforme descrito no exemplo 3. A solução da mesotriona foi mistura com sangue de coelho em uma relação de 1/5 para concentrações finais de 0,4 mg/ml, 0,1 mg/ml e 0,02 mg/ml. Ninfas de primeiro estágio de R. prolixus e A. aegypti fêmeas foram alimentadas artificialmente com essas misturas. Insetos controle foram alimentados com sangue diluído em uma relação de 4/5 com água. Além disso, as fêmeas de A. aegypti foram alimentadas com uma solução de açúcar contendo mesotriona 2mg/ml e 20 mg/ml. Insetos controle foram alimentados com uma solução compreendendo somente açúcar. Os resultados do processo descrito nesse exemplo estão representados nas figuras 2F.[0040] Mesotrione solutions were prepared as described in example 3. The mesotrione solution was mixed with rabbit blood in a ratio of 1/5 to final concentrations of 0.4 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0 .02 mg/ml. First stage nymphs of female R. prolixus and A. aegypti were artificially fed with these mixtures. Control insects were fed blood diluted in a 4/5 ratio with water. Furthermore, A. aegypti females were fed a sugar solution containing 2mg/ml and 20 mg/ml mesotrione. Control insects were fed a solution comprising only sugar. The results of the process described in this example are represented in figures 2F.

Exemplo 5 - Administração de NitisinonaExample 5 - Administration of Nitisinone

[0041] Nitisinona (PESTANAL® padrão analítico; Sigma- Aldrich) foi solubilizada em PBS estéril de pH igual a 7,4. Camundongos suíços que tinham recebido previamente uma dose oral de NTBC (30, 20, 10, 1 ou 0,5 mg/kg) foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de 50 μl de Ketamina a 10% e Xilazina a 2% em PBS. A. aegypti foram alimentados com estes camundongos uma hora após a administração NTBC. Os camundongos controle receberam um volume igual de PBS. Alguns dos resultados do processo descrito nesse exemplo estão representados na figura 2K.[0041] Nitisinone (PESTANAL® analytical standard; Sigma-Aldrich) was solubilized in sterile PBS with pH equal to 7.4. Swiss mice that had previously received an oral dose of NTBC (30, 20, 10, 1 or 0.5 mg/kg) were anesthetized with an intraperitoneal injection of 50 µl of 10% Ketamine and 2% Xylazine in PBS. A. aegypti were fed to these mice one hour after NTBC administration. Control mice received an equal volume of PBS. Some of the results of the process described in this example are shown in Figure 2K.

[0042] Conforme visto a partir dos dados revelados acima, inibidores da HPPD, independente da via de administração, tópica, diretamente sobre insetos hematófagos, ou oral, ingerido por presas de insetos hematófagos, possuem atividade inseticida, uma vez que reduziram significativamente as populações de insetos hematófagos após as referidas administrações.[0042] As seen from the data revealed above, HPPD inhibitors, regardless of the route of administration, topical, directly on hematophagous insects, or oral, ingested by hematophagous insect prey, have insecticidal activity, since they significantly reduced populations of blood-sucking insects after the aforementioned administrations.

[0043] Os compostos inibidores da HPPD mencionados nesta invenção também podem ser utilizados na fabricação de uma composição inseticida de uso tópico, diretamente sobre o inseto hematófago, ou de uso oral, pelo hospedeiro endotérmico a ser picado pelo referido inseto.[0043] The HPPD inhibitor compounds mentioned in this invention can also be used in the manufacture of an insecticidal composition for topical use, directly on the hematophagous insect, or for oral use, by the endothermic host to be stung by said insect.

[0044] Muito embora modalidades particulares da presente invenção tenham sido mostradas e descritas, várias combinações, mudanças e modificações podem ser feitas na presente invenção para satisfazer necessidades específicas sem se afastar da invenção nos seus aspectos mais amplos. Além disso, enquanto uma característica particular da invenção pode ter sido divulgada com respeito a apenas uma das várias formas de realização, tal característica pode ser combinada com uma ou mais outras características das outras modalidades, na medida em que pode ser desejado e vantajoso para qualquer aplicação particular.[0044] Although particular embodiments of the present invention have been shown and described, various combinations, changes and modifications can be made to the present invention to meet specific needs without departing from the invention in its broadest aspects. Furthermore, while a particular feature of the invention may have been disclosed with respect to only one of several embodiments, such feature may be combined with one or more other features of the other embodiments, to the extent that may be desired and advantageous to any particular application.

Claims (4)

1. Processo de controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos usando inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina caracterizado por administrar um composto inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase no artrópode hematófago, especificamente mesotriona e nitisinona.1. Process of selective control of hematophagous arthropod populations using tyrosine metabolism enzyme inhibitors characterized by administering a compound that inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in the hematophagous arthropod, specifically mesotrione and nitisinone. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração do composto inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase no artrópode hematófagos é tópica.2. Process according to claim 1, characterized by the fact that the administration of the compound that inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in hematophagous arthropods is topical. 3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que é administrado de 1 a 6μL de mesotriona dissolvidos em metanol, na concentração de 1 a 5 mg/mL.3. Process, according to claims 1 and 2, characterized in that it is administered from 1 to 6μL of mesotrione dissolved in methanol, at a concentration of 1 to 5 mg/mL. 4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração do composto inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase no artrópode hematófagos é via oral, como por exemplo em forma de isca, em armadilhas ou sistemas de alimentação artificiais.4. Process, according to claim 1, characterized by the fact that the administration of the compound that inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase in hematophagous arthropods is oral, such as in the form of bait, in traps or artificial feeding systems.

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