BR102015019298B1 - SET OF ELEMENTS FOR PERFORMING PHENOTYPIC EXAMINATION FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS AND DIAGNOSTIC METHOD - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
conjunto de elementos para realização de exame fenotípico para diagnóstico de tuberculose e método de diagnóstico, mais precisamente trata-se de conjunto de elementos (10) apresentado na forma de 'kit' para a realização de diagnóstico de tuberculose do tipo utilizado na área da saúde, mais especificamente, em laboratórios; dito conjunto de elementos (10) associado ao método de diagnóstico compõe a realização simultânea de quatros exames distintos, quais sejam: (a) isolamento da bactéria; (b) identificação da bactéria; (c) determinação da sensibilidade a isoniazida; (d) determinação da sensibilidade a rifampicina da bactéria; dito kit (10) é constituído de: i) pelo menos vinte peças de laminocultivo (20) formado por um par de lâminas (21) e (22) instalado num tubo cilíndrico (30) formado por duas aberturas distais (31) e (32) onde são acopladas respectivas tampas (40) e (41); cada lâmina (21)/(22) preve um par de poços (p1) e (p2) e (p1') e (p2'); ii) um frasco (50) do tipo conta gotas com solução digestora e descontaminante de hidróxido de sódio a 4% , sendo 4 gramas de hidróxido de sódio em 100 ml de água; iii) um frasco (60) provido de microesferas (70); iv) uma zaragatoa swab (80) constituído de um algodão absorvente hidrofílico com capacidade de absorção de cerca de 1.000 microlitros, o qual é fixado a uma haste plástica cilíndrica de 15 cm de comprimento; v) pelo menos vinte peças de tubos de ensaio (100) confeccionado em poliestireno cristal transparente com 10 cm de comprimento e 70 rnm de diâmetro, sendo que cada tubo (100) possui uma tampa (101) do tipo encaixe por pressão e identificação de volume de 3 ml a 5 ml; ditos tubos (100) são utilizados para acondicionar a solução de naoh 4% durante o processo de descontaminação do escarro; vi) uma caixa para incubação (90) dos laminocultivos (20) dotada de tampa (91), sendo que a porção interna prevê paredes divisórias transversais (91a) e longitudinais (91b) conformando nichos (n) para a acomodação dos laminocultivo (20) durante o transporte para a comercialização e para a estufa a 37°c após a semeadura no processo de incubação.set of elements for carrying out a phenotypic examination for the diagnosis of tuberculosis and diagnostic method, more precisely it is a set of elements (10) presented in the form of a 'kit' for carrying out a diagnosis of tuberculosis of the type used in the health sector , more specifically, in laboratories; Said set of elements (10) associated with the diagnostic method comprises the simultaneous performance of four distinct tests, namely: (a) isolation of the bacteria; (b) identification of the bacteria; (c) determination of sensitivity to isoniazid; (d) determination of the rifampicin sensitivity of the bacteria; Said kit (10) consists of: i) at least twenty pieces of laminoculture (20) formed by a pair of blades (21) and (22) installed in a cylindrical tube (30) formed by two distal openings (31) and ( 32) where respective covers (40) and (41) are attached; each slide (21)/(22) provides a pair of wells (p1) and (p2) and (p1') and (p2'); ii) a dropper-type bottle (50) with a 4% sodium hydroxide digesting and decontaminating solution, with 4 grams of sodium hydroxide in 100 ml of water; iii) a vial (60) provided with microspheres (70); iv) a swab swab (80) made of hydrophilic absorbent cotton with an absorption capacity of around 1,000 microliters, which is attached to a cylindrical plastic rod 15 cm long; v) at least twenty pieces of test tubes (100) made of transparent crystal polystyrene 10 cm long and 70 mm in diameter, with each tube (100) having a press-fit type lid (101) and identification of volume from 3 ml to 5 ml; said tubes (100) are used to condition the 4% naoh solution during the sputum decontamination process; vi) a box for incubating (90) the laminocultures (20) equipped with a lid (91), with the internal portion providing transverse (91a) and longitudinal (91b) dividing walls forming niches (n) for the accommodation of the laminocultures (20 ) during transport to commercialization and to the greenhouse at 37°c after sowing in the incubation process.
Description
[001] Trata a presente invenção de conjunto de elementos para realização de exame fenotípico para diagnóstico de tuberculose e método de diagnóstico do tipo utilizado na área da saúde, mais especificamente, em laboratórios que realizam exames para diagnóstico bacteriológico de doenças infecciosas em, especial, o conjunto de elementos se apresentam na forma de 'kit' que permite a realização de exames fenotípicos para o diagnóstico da tuberculose, quais sejam: (i) isolamento da bactéria; (ii) identificação da bactéria; (iii) determinação da sensibilidade a isoníazida; (iv) determinação da sensibilidade a rifampicina da bactéria. Dito kit compreende o laminocultivo e outros elementos, tais como, frasco provido de solução digestora e descontaminante, frasco provido de microesferas de vidro, tubo de poliestireno, 'zaragatoa' e uma caixa para incubação dos laminocultivos. O inovado método de diagnóstico inovador é capaz de simultaneamente cultivar, identificar e determinar o perfil sensibilidade do o bacilo da tuberculose a antibióticos utilizados no tratamento da doença.[001] The present invention deals with a set of elements for carrying out a phenotypic examination for the diagnosis of tuberculosis and a diagnostic method of the type used in the health sector, more specifically, in laboratories that carry out examinations for the bacteriological diagnosis of infectious diseases in, in particular, the set of elements is presented in the form of a 'kit' that allows phenotypic tests to be carried out for the diagnosis of tuberculosis, namely: (i) isolation of the bacteria; (ii) identification of the bacteria; (iii) determination of sensitivity to isoniazid; (iv) determination of the bacteria’s sensitivity to rifampicin. Said kit comprises the laminoculture and other elements, such as a bottle provided with a digestion and decontaminating solution, a bottle provided with glass microspheres, a polystyrene tube, a 'swab' and a box for incubating the laminocultures. The innovative diagnostic method is capable of simultaneously cultivating, identifying and determining the sensitivity profile of the tuberculosis bacillus to antibiotics used to treat the disease.
[002] Sabe-se que, a tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada pela bactéria 'Mycobacterium tuberculosis' que afeta, principalmente, os pulmões e outros órgãos do corpo, como ossos, rins e meninges, sendo princípalmente transmitida por via aérea a partir da inalação de gotículas contendo os bacilos. De uma forma geral, ditas gotículas são expelidas pela tosse, fala ou espirro do doente com tuberculose.[002] It is known that tuberculosis is an infectious disease caused by the bacteria 'Mycobacterium tuberculosis' that mainly affects the lungs and other organs of the body, such as bones, kidneys and meninges, being mainly transmitted by air from the inhalation of droplets containing the bacilli. In general, these droplets are expelled when a tuberculosis patient coughs, speaks or sneezes.
[003] Dessarte, um dos grandes desafios para o controle da tuberculose consiste na detecção rápida e precoce da doença que, geralmente, é detectada por baciloscopia direta ou cultura, e ainda através da analise de dados clínico-epidemiológicos, sendo que a pesquisa bacteriológica é o método mais seguro para o diagnóstico e pode ser realizado por pesquisa de BAAR pela coleta de três amostras de secreção das vias aéreas inferiores, em dias subsequentes, pela manhã, antes do desjejum. Pacientes pobres em escarro podem fazer a indução do mesmo a partir da nebulização com solução salina hipertônica - NaCI 3%. Pode-se proceder ainda à pesquisa de BAAR nas fezes, quando da presença de quadro diarréico sugestivo. Dito material deve chegar rapidamente ao laboratório ou, se necessário, ser conservado em geladeira até seu processamento.[003] Therefore, one of the great challenges for tuberculosis control consists in the rapid and early detection of the disease, which is generally detected by direct sputum smear microscopy or culture, and also through the analysis of clinical-epidemiological data, with bacteriological research It is the safest method for diagnosis and can be performed by AFB research by collecting three samples of secretion from the lower airways, on subsequent days, in the morning, before breakfast. Patients with poor sputum can induce sputum using nebulization with hypertonic saline solution - 3% NaCI. An AFB test can also be carried out in the feces when there is a suggestive diarrheal condition. This material must reach the laboratory quickly or, if necessary, be kept in the refrigerator until processing.
[004] Para a cultura para microbactéria é indicada nos casos suspeitos que se mantêm com baciloscopia negativa, nas situações de falência terapêutica, nas formas extrapulmonares. Após o isolamento, quando disponível, é feito o teste de sensibilidade aos tuberculostáticos e tipificação do bacilo.[004] Culture for microbacteria is indicated in suspected cases that remain sputum smear negative, in situations of therapeutic failure, in extrapulmonary forms. After isolation, when available, a tuberculostatic sensitivity test and bacillus typing are performed.
[005] Já a prova tuberculínica - PPD -representa um método auxiliar para o diagnóstico de pacientes não-imunizados com BCG, sendo que quando negativa, sugere a investigação de outras doenças que possam ter apresentação semelhante à tuberculose e quando positiva, indica contato atual ou pregresso com a micobactéria, necessitando de outros achados que confirmem a infecção.[005] The tuberculin skin test - PPD - represents an auxiliary method for the diagnosis of patients not immunized with BCG, and when negative, it suggests the investigation of other diseases that may have a similar presentation to tuberculosis and when positive, it indicates current contact or previous infection with mycobacteria, requiring other findings to confirm the infection.
[006] Da mesma forma, existe o estudo do líquido pleural/pericárdico que enviado para o laboratório de bacteriologia e também para o laboratório de anatomia patológica para exame de citologia e o estudo do liquor, bem como, o estudo anatomopatológico pela presença de reação granulomatosa, com ou sem necrose caseosa, e ainda, a presença de bacilos álcool-ácido resistentes - BAAR.[006] Likewise, there is the study of the pleural/pericardial fluid that is sent to the bacteriology laboratory and also to the pathological anatomy laboratory for cytology examination and the study of the cerebrospinal fluid, as well as the anatomopathological study for the presence of a reaction granulomatous, with or without caseous necrosis, and also the presence of acid-fast bacilli - AFB.
[007] Ocorre que se verificou que o acesso dos pacientes sintomáticos respiratórios aos exames bacteriológicos considerados padrão ouro é muíto restrito, sobretudo nos países em desenvolvimento, sendo que ditos exames não são realizados de forma rotineira e universal em razão do seu elevado custo, de sua complexidade técnica e das exigências de biossegurança para realizá-los.[007] It turns out that access for respiratory symptomatic patients to bacteriological tests considered the gold standard is very restricted, especially in developing countries, and these tests are not carried out routinely and universally due to their high cost, their technical complexity and the biosafety requirements to carry them out.
[008] Outro inconveniente reside no fato de não existir um único processo fenotípico capaz de simultaneamente isolar, ou seja, detectar o crescimento micobacteriano, identificar e determinar a sensibilidade do bacilo da tuberculose a isoniazida e rifampicina, sendo que em uma sequência operacional de rotina, detecta-se primeiramente o crescimento micobacteriano - qualquer espécie de micobactéria - no meio de cultura três a quatro semanas e depois realiza-se a identificação e o teste de sensibilidade do bacilo da tuberculose a drogas de 10 a 30 dias.[008] Another drawback lies in the fact that there is no single phenotypic process capable of simultaneously isolating, that is, detecting mycobacterial growth, identifying and determining the sensitivity of the tuberculosis bacillus to isoniazid and rifampicin, in a routine operational sequence. , mycobacterial growth - any species of mycobacteria - is first detected in the culture medium for three to four weeks and then identification and sensitivity testing of the tuberculosis bacillus to drugs is carried out for 10 to 30 days.
[009] Para a realização dos testes os 'kits' existentes no mercado realizam apenas a primeira etapa do processo, ou seja, detectam crescimento micobacteriano, a partir de amostras de escarro por um método denominado 'Ogawa-Kudoh', sendo que mencionados 'kits' são disponibilizados tubos com tampa de rosca contendo meio de cultura fixado longitudinalmente em sua parede, para a semeadura da amostra e detecção do crescimento bacteriano.[009] To carry out the tests, the 'kits' on the market perform only the first stage of the process, that is, they detect mycobacterial growth, from sputum samples using a method called 'Ogawa-Kudoh', and are mentioned ' Kits are tubes with screw caps containing culture medium fixed longitudinally on their wall, for seeding the sample and detecting bacterial growth.
[010] O principal inconveniente reside no fato de atualmente não existir um único teste bacteriológico baseado em análise fenotípica que realize simultaneamente o isolamento, ou seja, a detecção do crescimento bacteriano, a identificação e a determinação da sensibilidade do bacilo da tuberculose a isoniazida e rifampicina a partir da semeadura direta da amostra de escarro ern meios de cultura ou laminocultivo de forma a promover lentidão no diagnóstico.[010] The main drawback lies in the fact that there is currently no single bacteriological test based on phenotypic analysis that simultaneously performs isolation, that is, detection of bacterial growth, identification and determination of the sensitivity of tuberculosis bacillus to isoniazid and rifampicin from direct seeding of the sputum sample in culture media or laminoculture in order to promote slow diagnosis.
[011] Atualmente, existe no mercado um sistema denominado 'BD BACTEC™ MGIT™' que permite cultivar, identificar e determinar a sensibilidade do M. tuberculosis a isoniazida, rifampicina por intermédio de processos fenotípicos.[011] Currently, there is a system on the market called 'BD BACTEC™ MGIT™' that allows the cultivation, identification and determination of the sensitivity of M. tuberculosis to isoniazid and rifampicin through phenotypic processes.
[012] Ocorre que dito sistema não realiza simultaneamente o cultivo, a identificação e a sensibilidade do M. tuberculosis a isoniazida, rifampicina, onde primeiro cultiva-se as bactérias a partir do escarro prazo de 5 a 20 dias, identifica-se o M. tuberculosis - 5 dias e por último determina-se a sua sensibilidade a isoniazida e rifampicina - 7 dias. Outra questão reside no fato dos tubos de cultura 'BD BACTEC1" MGirM' conter um composto fluorescente, embebido em silicone, que é sensível à presença do oxigênio dissolvido no meio. Inicialmente, urna grande quantidade do oxigênio dissolvido extingue as emissões do composto e pouca fluorescência pode ser detectada. Posteriormente, microrganismos respirando ativamente no meio, consomem o oxigênio o que ocasiona a emissão da fluorescência e sua detecção por um equipamento contendo sensores de fluorescência e interface com um computador. Dito sistema automatizado é, portanto, mais laborioso, mais caro e requer manutenção e condições restritas de biossegurança de forma a impossibilitar o uso em locais de pouco recurso.[012] It turns out that this system does not simultaneously carry out the cultivation, identification and sensitivity of M. tuberculosis to isoniazid, rifampicin, where the bacteria are first cultivated from the sputum within 5 to 20 days, the M. tuberculosis - 5 days and finally, its sensitivity to isoniazid and rifampicin is determined - 7 days. Another issue lies in the fact that 'BD BACTEC1" MGirM' culture tubes contain a fluorescent compound, embedded in silicone, which is sensitive to the presence of dissolved oxygen in the medium. Initially, a large amount of dissolved oxygen extinguishes the compound's emissions and little fluorescence can be detected. Subsequently, microorganisms actively breathing in the medium consume oxygen, which causes the emission of fluorescence and its detection by equipment containing fluorescence sensors and an interface with a computer. This automated system is, therefore, more laborious, more expensive and requires maintenance and strict biosafety conditions that make it impossible to use in low-resource locations.
[013] Outro inconveniente dos 'kits' disponíveis no mercado reside no fato de não apresentarem embalagem secundária com dupla função promovendo desperdício de material e, consequentemente, gasto desnecessário.[013] Another drawback of the 'kits' available on the market is the fact that they do not present secondary packaging with dual function, promoting waste of material and, consequently, unnecessary expense.
[014] Outro inconveniente reside no fato de que para realização dos exames de cultura de escarro, identificação e determinação da sensibilidade do bacilo da tuberculose a isoniazida e rifampicina, são utilizados vários tubos com tampas de rosca contendo meios de cultura específicos, o que torna esses exames laboriosos, caros e demorados.[014] Another inconvenience lies in the fact that to carry out sputum culture tests, identification and determination of the sensitivity of the tuberculosis bacillus to isoniazid and rifampicin, several tubes with screw caps containing specific culture media are used, which makes these laborious, expensive and time-consuming tests.
[015] Outra questão reside no fato de, atualmente, existir no mercado um produto denominado laminocultivo, o qual é destinado ao cultivo, contagem e identificação presuntiva de microrganismos causadores de alguns tipos infeções, principalmente as do trato urinário.[015] Another issue lies in the fact that, currently, there is a product on the market called laminoculture, which is intended for the cultivation, counting and presumptive identification of microorganisms that cause some types of infections, mainly those of the urinary tract.
[016] Para tanto, é previsto um tubo que contém uma plataforma ou lâmina retangular plástica, presa à tampa, com meios de cultura específicos, tais como, CLED, Mac Conkey, Agar chocolate etc., sendo que, tecnicamente, os laminocultivos são definidos como estruturas plásticas e cilíndricas que possuem uma tampa de rosca na qual são fixadas duas laminas plásticas retangulares em face oposta.[016] To this end, a tube is provided that contains a plastic rectangular platform or slide, attached to the lid, with specific culture media, such as CLED, Mac Conkey, Chocolate Agar, etc., and, technically, laminocultures are defined as plastic and cylindrical structures that have a screw cap to which two rectangular plastic sheets are fixed on the opposite side.
[017] Cada lâmina contém um ou dois poços onde os meios de cultura são colocados, sendo que os meios de cultivo que compõem os laminocultivos destinam-se a propiciar o crescimento e o estudo das bactérias de interesse médico e podem ser definidos como uma associação equilibrada de agentes químicos, tais como, nutrientes, pH, etc. e físicos - temperatura, viscosidade, etc. que permitem o cultivo e o estudo de microrganismos.[017] Each slide contains one or two wells where culture media are placed, and the culture media that make up laminocultures are intended to promote the growth and study of bacteria of medical interest and can be defined as an association balanced of chemical agents, such as nutrients, pH, etc. and physical - temperature, viscosity, etc. that allow the cultivation and study of microorganisms.
[018] Ocorre que, uma das lâminas dos convencionais laminocultivos possui apenas um poço retangular e a outra lâmina dois poços retangulares onde os meios de cultura são colocados, as quais são dispostas, geralmente, em sentido longitudinal. Dita área dos poços é reduzida e rasa comportando um volume menor de meio de cultura de cerca de 1,0 a 2,0 ml que por este motivo sofre ressecamento, urna vez que, os bacilos da tuberculose levarão um longo período de tempo para crescer no meio de cultura.[018] It turns out that one of the blades of conventional laminocultures has only one rectangular well and the other blade has two rectangular wells where the culture media are placed, which are generally arranged in a longitudinal direction. This area of the wells is reduced and shallow, containing a smaller volume of culture medium of about 1.0 to 2.0 ml, which for this reason suffers from drying out, since tuberculosis bacilli will take a long period of time to grow. in the culture medium.
[019] Outro inconveniente reside no fato dos laminocultivos existentes no mercado não apresentarem identificação para identificar o tipo de meio de cultura que será colocado na lâmina e para leitura dos resultados e dos exames de forma a impossibilitar uma organização adequada no teste.[019] Another inconvenience lies in the fact that the laminocultures on the market do not present identification to identify the type of culture medium that will be placed on the slide and to read the results and exams in a way that makes it impossible to properly organize the test.
[020] Da mesma forma, os convencionais laminocultivos são tubos plásticos cilíndricos transparentes que apresentam apenas uma abertura e uma tampa de rosca na qual são fixadas duas laminas plásticas retangulares em faces opostas para colocação do meio de cultura e cuja tampa compreende uma peça discoide fato que dificulta a manipulação para a abertura do tubo realização da semeadura da amostra.[020] Likewise, conventional laminocultures are transparent cylindrical plastic tubes that have only one opening and a screw cap to which two rectangular plastic sheets are fixed on opposite sides for placing the culture medium and whose lid comprises a discoid piece. which makes it difficult to manipulate the opening of the tube to seed the sample.
[021] Outro grave inconveniente reside no fato dos tubos cilíndricos transparentes dos laminocultivos existentes no mercado serem fabricados cm poliestireno e lâmina/poços confeccionada em plástico de baixa resistência ao calor. Ditos materiais deformam quando mantidos a temperatura na faixa de 80°C a 100"C e por esta razão não podem ser utilizados para acondicionar os principais meios de cultura do bacilo da tuberculose - Ogawa e Lowenstein-Jensen - que requerem paru a sua produção temperatura de 85°C por um período de cerca de 1 hora,[021] Another serious drawback lies in the fact that the transparent cylindrical tubes of laminocultures on the market are made of polystyrene and blades/wells made of low heat resistance plastic. Said materials deform when maintained at a temperature in the range of 80°C to 100"C and for this reason they cannot be used to package the main tuberculosis bacillus culture media - Ogawa and Lowenstein-Jensen - which require temperature for their production. 85°C for a period of approximately 1 hour,
[022] Outro inconveniente reside no fato dos tubos de laminocultivos convencionais apresentarem dimensões reduzidas tornando-se instáveis quando colocado "em pé" sobre a bancada.[022] Another drawback lies in the fact that conventional laminoculture tubes have reduced dimensions and become unstable when placed "upright" on the bench.
[023] Outro inconveniente reside no fato dos laminocultivos existentes no mercado não possuírem canaletas ou área de escape para retenção do excesso de amostra ocasionado pelo processo de semeadura na superfície do meio de cu' , ira,[023] Another drawback lies in the fact that existing laminocultures on the market do not have channels or an escape area to retain the excess sample caused by the seeding process on the surface of the cu' medium.
[024] Em pesquisa realizada em bancos de dados especializados foram encontrados documentos referentes a método de diagnóstico de tuberculose, tal como, o documento de n?. PI 9915055-7 que trata de teste diagnóstico de tuberculose por ou exposição a um mycobacterium que expressa ESAT-6 compreendendo (i) contato de uma população de células T do hospedeiro com um ou mais peplí 1 os ou análogos selecionados dos peptídeos representados por 5EQ ID NO: 1 a 11 e r-us análogos que podem se ligar a um receptor de célula T que reconhece qualquer um dos ditos peptídeos, e (ii) determinação de se as células T da dita população de células T reconhecem o peptídeo(s) e/ou análogo(s).[024] In a search carried out in specialized databases, documents relating to the tuberculosis diagnosis method were found, such as document no. PI 9915055-7 which deals with diagnostic testing of tuberculosis by or exposure to a mycobacterium expressing ESAT-6 comprising (i) contact of a population of host T cells with one or more peptides or selected analogues of the peptides represented by 5EQ ID NO: 1 to 11 and r-us analogues that can bind to a T cell receptor that recognizes any of said peptides, and (ii) determining whether T cells of said T cell population recognize the peptide(s) ) and/or analogue(s).
[025] Outro documento de n5. BR 10 2013 001898 8 refere-se a método para identificação de cepas resistentes de 'mycobacterium' 'tuberculosis' e kit de diagnóstico/prognóstico de tuberculose para identificação de cepas de tuberculose, especialmente aquelas resistentes aos fármacos como, por exemplo, isoniazida e rifampicina com leitura colorimétríca.[025] Another document from n5. BR 10 2013 001898 8 refers to a method for identifying resistant strains of 'mycobacterium' 'tuberculosis' and a tuberculosis diagnostic/prognostic kit for identifying tuberculosis strains, especially those resistant to drugs such as, for example, isoniazid and rifampicin with colorimetric reading.
[026] O documento de nQ. PI 0904305-5 refere-se a método de cultivo e transporte para diagnóstico e monitoramento do controle da tuberculose que permitirá a utilização da metodologia Ogawa - Kudoh pelos laboratórios responsáveis por diagnosticar a tuberculose pulmonar. Embora existam vários exames para esta finalidade, a cultura direta da amostra biológica pelo método de Ogawa-Kudoh (0K) reúne as principais características desejáveis ao serviço público de saúde em razão de se tratar de um, método sensível, simples, de fácil execução e de baixo custo financeiro que será apresentado na versão individual para o processamento de 01 amostra biológica e também na de 30 amostras biológicas. O Kit individual destinado ao processamento de uma amostra biológica será construído de uma caixa resistente, contendo dois recipientes com meio de cultura Ogawa - Kudoh, um swab estéril e descartável, uma lâmina de vidro para microscopia, um palito roliço de madeira, um recipiente com solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4%, uma ficha com instruções de uso do kit e um formulário de notificação obrigatória da doença para o Ministério da Saúde SINAN. O kit coletivo destinado ao processamento de 30 amostras biológicas será constituído de uma caixa resistente, contendo sessenta recipientes com meio de cultura Ogawa - Kudoh, trinta swabs estéreis e descartáveis, trinta lâminas do vidro para microscopia, trinta palitos roliços de madeira, um recipiente com aproximadamente 300 ml de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 4%, trinta recipientes com capacidade aproximada de 5 ml, uma ficha com instruções de uso do kit e trinta formulários de notificação obrigatória da doença para o Ministério da Saúde SINAM.[026] The nQ document. PI 0904305-5 refers to a cultivation and transport method for diagnosis and monitoring of tuberculosis control that will allow the use of the Ogawa - Kudoh methodology by laboratories responsible for diagnosing pulmonary tuberculosis. Although there are several tests for this purpose, the direct culture of the biological sample using the Ogawa-Kudoh (0K) method brings together the main characteristics desirable for the public health service because it is a sensitive, simple, easy to perform and of low financial cost that will be presented in the individual version for processing 01 biological sample and also for 30 biological samples. The individual kit intended for processing a biological sample will be made of a resistant box, containing two containers with Ogawa - Kudoh culture medium, a sterile and disposable swab, a glass slide for microscopy, a round wooden stick, a container with 4% sodium hydroxide (NaOH) solution, a sheet with instructions for using the kit and a mandatory disease notification form for the Ministry of Health SINAN. The collective kit intended for the processing of 30 biological samples will consist of a resistant box, containing sixty containers with Ogawa - Kudoh culture medium, thirty sterile and disposable swabs, thirty microscopy glass slides, thirty round wooden sticks, a container with approximately 300 ml of 4% sodium hydroxide (NaOH) solution, thirty containers with an approximate capacity of 5 ml, a sheet with instructions for using the kit and thirty mandatory disease notification forms for the Ministry of Health SINAM.
[027] O documento de n9. PI 9610268-3 refere-se a compostos e processos para diagnóstico de tuberculose que incluem polipeptídios que contêm pelo menos uma porção antigênica de uma ou mais proteínas secretoras ou não-secretoras de M. tuberculosis, e sequências de ADN codificando tais polipeptidios. Kits diagnósticos contendo tais polipeptidios ou sequências de ADN e um reagente de detecção apropriado podem ser usados para a detecção de infecção com M. tuberculosis em pacientes e amostras biológicas.[027] Document n9. PI 9610268-3 refers to compounds and processes for diagnosing tuberculosis that include polypeptides that contain at least an antigenic portion of one or more secretory or non-secretory proteins of M. tuberculosis, and DNA sequences encoding such polypeptides. Diagnostic kits containing such polypeptides or DNA sequences and an appropriate detection reagent can be used for the detection of M. tuberculosis infection in patients and biological samples.
[028] Os documentos citados nos parágrafos acima, apesar de pertencerem ao mesmo campo de aplicação, ou seja, método de diagnóstico de tuberculose, não apresentam nenhuma das características do objeto ora aperfeiçoado garantindo, assim, que o mesmo atenda aos requisitos legais de patenteabilidade.[028] The documents cited in the paragraphs above, despite belonging to the same field of application, that is, tuberculosis diagnosis method, do not present any of the characteristics of the object now perfected, thus ensuring that it meets the legal requirements for patentability .
[029] Visando apresentar melhorias no diagnóstico de tuberculose, o requerente desenvolveu conjunto de elementos para realização de exame fenotípico para diagnóstico de tuberculose e método de diagnóstico.[029] Aiming to present improvements in the diagnosis of tuberculosis, the applicant developed a set of elements for carrying out a phenotypic examination for diagnosing tuberculosis and a diagnostic method.
[030] Dito conjunto de elementos se apresenta na forma de 'kit' que através do método de diagnóstico, também, inovado permite a realização simultânea de quatros exames diferentes: (i) isolamento da bactéria; (ü) identificação da bactéria; (iii) determinação da sensibilidade a isoniazida; (iv) determinação da sensibilidade a rifampicina da bactéria.[030] This set of elements is presented in the form of a 'kit' which, through the also innovative diagnostic method, allows four different tests to be carried out simultaneously: (i) isolation of the bacteria; (ü) identification of the bacteria; (iii) determination of sensitivity to isoniazid; (iv) determination of the bacteria’s sensitivity to rifampicin.
[031] Dito kit é constituído dos seguintes elementos: laminocultivo; frasco com solução digestora e descontaminante; frasco com microesferas de vidro; tubo de poliestireno; zaragatoa - swab; caixa para incubação dos laminocultivos.[031] Said kit consists of the following elements: laminocultivation; bottle with digestion and decontaminating solution; bottle with glass microspheres; polystyrene tube; swab - swab; box for incubating laminocultures.
[032] Dito laminocultivo apresenta características construtivas inovadas para realização simultânea da detecção do crescimento bacteriano, identificação e determinação da sensibilidade do bacilo da tuberculose a isoniazida e rifampicina a partir da semeadura direta da amostra de escarro. Ditas características construtivas inovadas podem ser descritas como: a) Laminas providas de áreas de poços maiores e mais profundas de forma a permitir a colocação de um volume maior de meio de cultura nos poços, sendo fundamental para que o laminocultivo permaneça em estufa a 37’C por um período de até 60 dias sem que o meio de cultura sofra ressecamento. Esse longo período de tempo de incubação é necessário uma vez que uma vez que os bacilos da tuberculose se multiplicam a cada 18 horas e suas colônias são visualizadas macroscopicamente no meio de cultura entre 21 e 60 dias; b) Previsão de placas com identificação dos poços que contém os meios de cultura, ou seja, controle ou C, PNB, INH e RIF. Dita identificação é fundamental para que os meios de cultura possam ser colocados corretamente nos poços durante o processo de produção e, também, para interpretação dos resultados dos exames após a semeadura da amostra; c) Previsão de duas tampas de roscas no tubo cilíndrico do laminocultivo, sendo uma tampa numa extremidade do tubo provida de meios de fixação de duas laminas plásticas retangulares que pode ser retirada para realização da semeadura da amostra e outra tampa com rosca na extremidade oposta e quando desrosqueada permite acesso as colônias das bactérias após o seu crescimento. Dito recurso é extremamente como biossegurança de forma a reduzir o contato com a amostra; d) Dita tampa receptora das laminas ou plataformas apresenta na face plana externa um membro projetante de forma a compor uma pega ergonômica que permite ao técnico de laboratório segurar a lâmina/poços com mais firmeza para realização da semeadura da amostra; e) Tubo de laminocultivos com dimensões avantajadas, ou seja, 14 cm de altura x 4,5 cm de diâmetro externo e 4,0 de diâmetro interno promovendo maior estabilidade quando disposto sobre a bancada, além das tampas apresentarem uma área maior e serem mais planas; f) Laminocultivo confeccionado com material resistente ao calor, ou seja, polipropileno ou polietileno de alta densidade para que o meio de cultura do bacilo da tuberculose 'Ogawa' possa ser utilizado; g) Laminocultivo com características construtivas idealizadas para comportar um grande volume de meio de cultura e permitir a sua incubação em estufa a 37“C por um período de até 60 dias na estufa sem que o meio de cultura sofra ressecamento. Dito laminocultivo prevê um arranjo de canaletas que impede que o escarro passe de poço com meio de cultura para o outro ou se deposite no fundo do tubo gerando um eventual risco de contaminação, além de prever na extremidade superior de cada poço, uma pequena placa retangular gravada com as iniciais do conteúdo do meio de cultura, tais como, controle ou C, PNB, INH e RIF.[032] Said laminoculture presents innovative constructive characteristics for simultaneously carrying out the detection of bacterial growth, identification and determination of the sensitivity of the tuberculosis bacillus to isoniazid and rifampin from direct seeding of the sputum sample. These innovative constructive features can be described as: a) Blades provided with larger and deeper well areas in order to allow the placement of a larger volume of culture medium in the wells, which is essential for the laminoculture to remain in an oven at 37' C for a period of up to 60 days without the culture medium drying out. This long period of incubation time is necessary since tuberculosis bacilli multiply every 18 hours and their colonies are visualized macroscopically in the culture medium between 21 and 60 days; b) Prediction of plates with identification of the wells containing the culture media, that is, control or C, PNB, INH and RIF. This identification is essential so that the culture media can be correctly placed in the wells during the production process and also for interpreting the test results after seeding the sample; c) Provision of two screw caps on the cylindrical tube of the laminocultivation, with a cap at one end of the tube provided with means of fixing two rectangular plastic sheets that can be removed for seeding the sample and another screw cap at the opposite end and when unscrewed it allows access to the bacteria colonies after their growth. This feature is extremely biosafety in order to reduce contact with the sample; d) Said slide or platform receiving cover has a projecting member on the outer flat face to form an ergonomic handle that allows the laboratory technician to hold the slide/wells more firmly to seed the sample; e) Limmer culture tube with large dimensions, that is, 14 cm in height x 4.5 cm in external diameter and 4.0 in internal diameter, promoting greater stability when placed on the bench, in addition to the lids having a larger area and being more flat; f) Laminoculture made with heat-resistant material, that is, polypropylene or high-density polyethylene so that the 'Ogawa' tuberculosis bacillus culture medium can be used; g) Laminoculture with constructive characteristics designed to accommodate a large volume of culture medium and allow its incubation in an oven at 37“C for a period of up to 60 days in the oven without the culture medium drying out. Said laminoculture involves an arrangement of channels that prevent sputum from passing from one well with culture medium to another or from depositing at the bottom of the tube, creating a possible risk of contamination, in addition to providing at the upper end of each well, a small rectangular plate. engraved with the initials of the culture medium content, such as control or C, PNB, INH and RIF.
[033] Dito kit prevê uma constituído por uma embalagem secundária confeccionada por papelão rígido e envernizado de base plana de onde se desenvolvem paredes periféricas e em cuja porção central são previstas paredes divisórias longitudinais e transversais, as quais tem com dupla função, quais sejam: acomodar e transportar o produto pós produção e venda e acomodar os laminocultivos/tubos na estufa a 37°C após a semeadura servindo como um elemento acessório importante na rotina diagnóstica, pois permite que os laminocultivos sejam mantidos na caixa organizados em ordem cronológica.[033] Said kit provides for one consisting of a secondary packaging made of rigid and varnished cardboard with a flat base from which peripheral walls develop and in whose central portion longitudinal and transversal dividing walls are provided, which have a dual function, namely: accommodate and transport the product after production and sale and accommodate the slide cultures/tubes in the greenhouse at 37°C after sowing, serving as an important accessory element in the diagnostic routine, as it allows the slide cultures to be kept in the box organized in chronological order.
[034] Do mesmo modo, mencionado kit de diagnóstico ora inovado prevê um frasco dotado de microesferas confeccionadas em pérolas de vidro - Borosilicato - com cerca de 1 mm de diâmetro, as quais são utilizadas sob agitação para promover ação mucolítica mecânica do escarro e liberar os bacilos aderidos ao muco e ao pus durante a realização do processo de digestão e de homogeneização do escarro e constitui uma das etapas do processo antes da semeadura da amostra.[034] Likewise, the aforementioned diagnostic kit now innovated includes a bottle equipped with microspheres made of glass beads - Borosilicate - with around 1 mm in diameter, which are used under agitation to promote mechanical mucolytic action of the sputum and release the bacilli adhered to the mucus and pus during the sputum digestion and homogenization process and constitutes one of the stages of the process before seeding the sample.
[035] A principal vantagem do procedimento mecânico ora inovado reside no fato de apresentar um custo reduzido e tão eficiente quanto os procedimentos que utilizam agentes químicos mucolíticos, como N-acetil-L-cisteína - NALC, dithiothreitol - DTT, Dodecil Sulfato de Sódio - SDS - e fosfato trisódico.[035] The main advantage of the mechanical procedure now innovated lies in the fact that it is cost-effective and as efficient as procedures that use mucolytic chemical agents, such as N-acetyl-L-cysteine - NALC, dithiothreitol - DTT, Sodium Dodecyl Sulfate - SDS - and trisodium phosphate.
[036] Completando o kit é previsto o zaragatoa - swab fabricado com um tufo de algodão hidrofílico capaz de absorver cerca de 1.000 microlitros e liberar 100 microlitros da amostra de escarro.[036] Completing the kit is the swab - swab made with a tuft of hydrophilic cotton capable of absorbing around 1,000 microliters and releasing 100 microliters of the sputum sample.
[037] Dita melhoria na absorção promove retenção de um grande volume de amostra no algodão, sendo fundamental para aumentar a probabilidade de captar e transferir os bacilos para superfície do meio de cultura tendo como principal vantagem o aumento da sensibilidade diagnóstica do exame de cultura.[037] This improvement in absorption promotes retention of a large volume of sample in the cotton, being essential to increase the probability of capturing and transferring the bacilli to the surface of the culture medium, with the main advantage of increasing the diagnostic sensitivity of the culture test.
[038] Assim, o inovado kit proporciona a melhoraria e simplificação do diagnóstico bacteriológico da tuberculose para tornando-o mais acessíveis aos laboratórios com pouca infraestrutura compreendendo um meio para realização de testes diagnósticos fenotípicos de cultivo, identificação e sensibilidade do bacilo da tuberculose a antibióticos utilizados no tratamento da doença.[038] Thus, the innovative kit provides the improvement and simplification of the bacteriological diagnosis of tuberculosis to make it more accessible to laboratories with little infrastructure, comprising a means for carrying out phenotypic diagnostic tests for the cultivation, identification and sensitivity of the tuberculosis bacillus to antibiotics used in the treatment of the disease.
[039] A complementar a presente descrição de modo a obter uma melhor compreensão das características do presente invento e de acordo com uma preferencial realização prática do mesmo, acompanha a descrição, em anexo, um conjunto de desenhos, onde, de maneira exemplificada, embora não limitativa, se representou seu funcionamento: A Figura 1 representa uma vista em perspectiva do conjunto de elementos que configuram o kit para diagnóstico de tuberculose ora inovado; A Figura 2 ilustra uma vista em perspectiva explodida dos elementos que compõe o laminocultivo; As Figuras 2A e 2B revelam vistas em perspectiva explodida dos elementos que compõe o tubo de laminocultivo; As Figuras 3 e 3A representam as vistas posterior e frontal da lamina ou plataforma para o laminocultivo; As Figuras 3B e 3C mostram os cortes longitudinal A.A e transversal B.B indicados nas figuras anteriores; e As Figuras 4 e 5 revelam as vistas em perspectiva de variações construtivas do laminocultivo; A Figura 6 representa uma vista em perspectiva de uma variação construtiva da lâmina; e A Figura 7 mostra uma vista em perspectiva de uma terceira variação construtiva do laminocultivo.[039] To complement the present description in order to obtain a better understanding of the characteristics of the present invention and in accordance with a preferred practical implementation of the same, the attached description is accompanied by a set of drawings, where, in an exemplified manner, although non-limiting, its operation was represented: Figure 1 represents a perspective view of the set of elements that make up the tuberculosis diagnosis kit now innovated; Figure 2 illustrates an exploded perspective view of the elements that make up the laminoculture; Figures 2A and 2B reveal exploded perspective views of the elements that make up the laminoculture tube; Figures 3 and 3A represent the rear and front views of the slide or platform for laminocultivation; Figures 3B and 3C show the longitudinal A.A and transversal B.B sections indicated in the previous figures; and Figures 4 and 5 reveal perspective views of constructive variations of laminocultivation; Figure 6 represents a perspective view of a constructive variation of the blade; and Figure 7 shows a perspective view of a third constructive variation of laminocultivation.
[040] Com referência aos desenhos ilustrados, a presente patente de invenção se refere à "CONJUNTO DE ELEMENTOS PARA REALIZAÇÃO DE EXAME FENOTÍPICO PARA DIAGNÓSTICO DE TUBERCULOSE E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO", mais precisamente trata-se de conjunto de elementos (10) apresentado na forma de 'kit' para a realização de diagnóstico de tuberculose do tipo utilizado na área da saúde, mais especificamente, em laboratórios.[040] With reference to the illustrated drawings, the present invention patent refers to the "SET OF ELEMENTS FOR PERFORMING A PHENOTYPIC EXAMINATION FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS AND DIAGNOSIS METHOD", more precisely it is a set of elements (10) presented in form of 'kit' for carrying out tuberculosis diagnosis of the type used in the health sector, more specifically, in laboratories.
[041] Segundo a presente invenção, dito conjunto de elementos (10) associado ao método de diagnóstico inovado configura a realização simultânea de quatros exames distintos, quais sejam: (a) isolamento da bactéria; (b) identificação da bactéria; (c) determinação da sensibilidade a isoniazida; (d) determinação da sensibilidade a rifampicina da bactéria. Dito kit (10) é constituído de: i) pelo menos vinte peças de laminocultivo (20) formado por um par de lâminas (21) e (22) instalado num tubo cilíndrico (30) formado por duas aberturas distais (31) e (32) onde são acopladas respectivas tampas (40) e (41); ii) um frasco (50) do tipo conta gotas com solução digestora e descontaminante de hidróxido de sódio a 4% , sendo 4 gramas de hidróxido de sódio em 100 ml de água; iii) um frasco (60) provido de microesferas (70), preferencialmente confeccionadas em vidro cerca de 1 mm de diâmetro, com superfície lisa e polida e alta dureza para auxiliar no processo de digestão do muco do escarro; iv) uma zaragatoa - swab (80) constituído de um algodão absorvente hidrofílico com capacidade de absorção de cerca de 1.000 microlitros, o qual é fixado a uma haste plástica cilíndrica de 15 cm de comprimento; v) pelo menos vinte peças de tubos de ensaio (100) confeccionado em de poliestireno cristal transparente com 10 cm de comprimento e 70 mm de diâmetro, sendo que cada tubo (100) possui uma tampa (101) do tipo encaixe por pressão e identificação de volume de 3 ml a 5 ml. Ditos tubos (100) são utilizados para acondicionar a solução de NaOH 4% durante o processo de descontaminação do escarro; vi) uma caixa para incubação (90) dos laminocultivos (20), preferencialmente confeccionada em papelão rígido, cartonada, envernizada dotada de tampa (91), sendo que a porção interna prevê paredes divisórias transversais (91a) e longitudinais (91b) conformando nichos (N) para a acomodação dos laminocultivo (20) durante o transporte para a comercialização e para a estufa a 37“Capós a semeadura no processo de incubação.[041] According to the present invention, said set of elements (10) associated with the innovative diagnostic method configures the simultaneous performance of four distinct tests, namely: (a) isolation of the bacteria; (b) identification of the bacteria; (c) determination of sensitivity to isoniazid; (d) determination of the bacteria's sensitivity to rifampicin. Said kit (10) consists of: i) at least twenty pieces of laminoculture (20) formed by a pair of blades (21) and (22) installed in a cylindrical tube (30) formed by two distal openings (31) and ( 32) where respective covers (40) and (41) are attached; ii) a dropper-type bottle (50) with a 4% sodium hydroxide digesting and decontaminating solution, with 4 grams of sodium hydroxide in 100 ml of water; iii) a bottle (60) provided with microspheres (70), preferably made of glass approximately 1 mm in diameter, with a smooth and polished surface and high hardness to assist in the sputum mucus digestion process; iv) a swab (80) made of hydrophilic absorbent cotton with an absorption capacity of around 1,000 microliters, which is attached to a cylindrical plastic rod 15 cm long; v) at least twenty pieces of test tubes (100) made of transparent crystal polystyrene 10 cm long and 70 mm in diameter, with each tube (100) having a press-fit type lid (101) and identification volume from 3 ml to 5 ml. Said tubes (100) are used to store the 4% NaOH solution during the sputum decontamination process; vi) a box for incubation (90) of laminocultures (20), preferably made of rigid cardboard, cardboard, varnished with a lid (91), with the internal portion providing transversal (91a) and longitudinal (91b) dividing walls forming niches (N) to accommodate the laminoculture (20) during transport for commercialization and to the greenhouse at 37“Capó the sowing in the incubation process.
[042] Numa versão construtiva preferencial, o tubo cilíndrico (30) é, preferencialmente confeccionado em poliestireno transparente ou outros materiais adequados, tais como, polipropileno ou polietileno de alta densidade e apresenta dimensões avantajadas como altura (x) de 14 cm a 12,3 cm, diâmetro externo (dl) de 4,5 cm a 4,0 cm e diâmetro interno (cl2) de 4,0 cm a 3,8 cm. As aberturas (31) e (32) do tubo (30) apresentam-se com roscas externas (31a) e (32a) para a montagem de tampas (40) e (41), sendo que a partir da face externa (40a) da tampa (40) se desenvolve um membro protetante laminar (40b) que se desenvolve de forma alargada e prevê afunilamento extremo de forma a compor uma pega (PG) para a manipulação do laminocultivo (20). Na face interna (40c) da mesma tampa (40) é disposto um suporte discoide (40d) provido de recortes (40e) para o acoplamento de abas (21a) e (22a) das lâminas (21) e (22).[042] In a preferred constructive version, the cylindrical tube (30) is preferably made of transparent polystyrene or other suitable materials, such as polypropylene or high-density polyethylene and has advantageous dimensions such as height (x) of 14 cm to 12, 3 cm, external diameter (dl) from 4.5 cm to 4.0 cm and internal diameter (cl2) from 4.0 cm to 3.8 cm. The openings (31) and (32) of the tube (30) have external threads (31a) and (32a) for mounting covers (40) and (41), and from the external face (40a) A laminar protective member (40b) develops from the lid (40) which develops in an enlarged shape and provides extreme tapering in order to form a handle (PG) for handling the laminocultivation (20). On the inner face (40c) of the same lid (40), a discoid support (40d) is provided with cutouts (40e) for coupling the flaps (21a) and (22a) of the blades (21) and (22).
[043] Ditas lâminas (21) e (22) são idênticas e apresentam-se formadas por peça retangular (23) de seção transversal em "U" em cuja porção interna e uma das laterais menores são previstas paredes transversais equidistantes (23a) e (23b) de forma a compor poços (pl) e (p2) ou (pl) e (p2') em cuja superfície interna da base (23c) são previstos múltiplos ressaltos (23d) de formato circular configurando uma base rugosa para aderência do meio de cultura. Ditas lâminas (21) e (22) quando montadas no tubo (30) configuram quatro poços, ou seja, (pl), (p2), (pl') e (p2’).[043] Said blades (21) and (22) are identical and are formed by a rectangular piece (23) with a "U" cross-section in whose internal portion and one of the smaller sides equidistant transversal walls (23a) are provided and (23b) in order to compose wells (pl) and (p2) or (pl) and (p2') on whose internal surface of the base (23c) multiple projections (23d) of circular shape are provided, configuring a rough base for adhesion of the culture medium. Said slides (21) and (22) when mounted on the tube (30) configure four wells, that is, (pl), (p2), (pl') and (p2').
[044] Ditos poços (pl), (p2), (pl) e (p2') apresentam as seguintes dimensões internas largura (11) de 3,0 cm a 2,5 cm, comprimento (cl) de 5,0 a 4,5 cm e altura (tl) de 0,7 cm a 0,6 cm de forma a comportar um volume de cerca de 8,0 ml de meio de cultura. Ditas paredes (23a) e (23b) são dispostas de forma espaçadas entre si configurando uma canaleta (CN) para retenção do excesso de amostra, sendo que dito escoamento é facilitado por um rebaixo semicircular (23al) praticado na porção central da parede (23), enquanto que a outra parede (23b) prevê uma curta projeção (23bl) que se desenvolve a partir da borda de forma a compor uma placa retangular gravada com as iniciais (IN) do conteúdo do meio de cultura, tais controle ou C, PNB, INH e RIF para a identificação dos meios e interpretação correta dos resultados dos exames.[044] Said wells (pl), (p2), (pl) and (p2') have the following internal dimensions width (11) of 3.0 cm to 2.5 cm, length (cl) of 5.0 to 4.5 cm and height (tl) of 0.7 cm to 0.6 cm in order to accommodate a volume of approximately 8.0 ml of culture medium. Said walls (23a) and (23b) are arranged spaced apart, configuring a channel (CN) to retain excess sample, with said flow being facilitated by a semicircular recess (23al) in the central portion of the wall (23 ), while the other wall (23b) provides a short projection (23bl) that develops from the edge to form a rectangular plate engraved with the initials (IN) of the contents of the culture medium, such as control or C, PNB, INH and RIF for identifying the means and correct interpretation of test results.
[045] Já a outra tampa (41) quando retirada permite o acesso fácil e seguro as colônias das bactérias após o seu crescimento.[045] The other lid (41), when removed, allows easy and safe access to the bacteria colonies after their growth.
[046] Dita pega (PG) de cada laminocultivo (20) permite ao técnico de laboratório a manipulação das lâminas (21) e (22) e poços (pl) e (p2) ou (pl') e (p2') com mais firmeza para realização da semeadura da amostra nos meios de cultura designados de controle dos poços (pl) controle ou C, PNB (p2), INH (pl'), RIF (p2') que apresentam as seguintes composições ou fórmula: [046] Said handle (PG) of each slide culture (20) allows the laboratory technician to manipulate the slides (21) and (22) and wells (pl) and (p2) or (pl') and (p2') with more firmly to sow the sample in the culture media designated as control wells (pl), control or C, PNB (p2), INH (pl'), RIF (p2'), which have the following compositions or formula:
[047] Após a adição de todos os elementos, 5,0 ml de cada meio de cultura é colocado nos respectivos poços. As lâminas (21) e (22) contendo os poços (pl), PNB (p2), INH (pl'), RIF (p2') dos laminocultivos (20) são colocados numa bandeja que é então acomodada no coagulador para realização do processo de solidificação do meio de cultura a uma temperatura de 85 °C durante 50 minutos.[047] After adding all the elements, 5.0 ml of each culture medium is placed in the respective wells. The slides (21) and (22) containing the wells (pl), PNB (p2), INH (pl'), RIF (p2') of the laminocultures (20) are placed in a tray that is then accommodated in the coagulator to carry out the process of solidifying the culture medium at a temperature of 85 °C for 50 minutes.
[048] Numa segunda variação construtiva, o tubo (30') pode apresentar uma única abertura (31a') para acoplamento de apenas uma tampa (40') na qual é fixada uma única lâmina (21') com um ou dois poços em sentido transversal. Numa terceira variação construtiva, o meio de fixação entre as aberturas (31") e (32") do tubo (30") para a montagem de tampas (40") e (41") é configurado por travas (31a") e (32a") que engatam em rebaixos praticados nas faces internas das tampas (40") e (41").[048] In a second constructive variation, the tube (30') may have a single opening (31a') for coupling only one lid (40') to which a single blade (21') is fixed with one or two wells in transverse direction. In a third constructive variation, the fixing means between the openings (31") and (32") of the tube (30") for mounting covers (40") and (41") are configured by latches (31a") and (32a") that engage with recesses on the inner faces of the covers (40") and (41").
[049] Numa segunda variação construtiva das lâminas (21') e (22’), as mesmas compreendem receptáculo (23') desprovido de paredes divisórias (23a) e (23b) compondo um poço único (pl').[049] In a second constructive variation of the blades (21') and (22'), they comprise a receptacle (23') devoid of dividing walls (23a) and (23b) composing a single well (pl').
[050] Uma variante terceira do laminocultivo (20"') é construída por tubo (30"’) provido na porção interna de perfis longitudinais (33"') de forma a compor guias para o deslizamento das lâminas (21’") e (22'").[050] A third variant of the laminocultivation (20"') is constructed by a tube (30"') provided on the inner portion with longitudinal profiles (33"') in order to compose guides for the sliding of the blades (21'") and (22'").
[051] Dessarte, para a utilização adequada do laminocultivo (20) devem ser realizados os seguintes procedimentos operacionais: a) Abrir o tubo (30) de laminocultivo (20), retirar as lâminas (21) e (22) com poços (pl), (p2), (pl') e (p2') que encontra-se fixadas a tampa de rosca (40) e reservar o tubo (30) que contém a tampa de rosca (41) na extremidade oposta; b) Preparar os meios de cultura a base de ovos ou de 'agar’ de acordo a formula desejada, sendo que se o meio de cultura for a base de ovos - Ogawa ou Lowenstein-Jensen ou similares - adicionar 5,0 mL dos meios de cultura nos poços que possui a lâmina fixada a tampa de rosca. Colocar ditas lâminas (21)/(22) contendo os poços (pl), (p2), (pl') e (p2') em uma bandeja e acomodá-las no coagulador para realização do processo de solidificação do meio de cultura a uma temperatura de 85 °C durante 50 minutos. Se os meios de cultura forem a base de agar - Middlebrook ou similar -, adicionar 5,0 ml do meio de cultura a uma temperatura de 50-C nas lâminas que contem os poços, manter a temperatura ambiente e aguardar a sua solidificação; c) Retirar do coagulador as lâminas (21)/(22) fixadas a tampa (40) que contém os meios de cultura, inserir no tubo (30) e fechar rosqueando as tampas; d) No momento do uso, girar a tampa (40) contendo os meios de cultura e removê-la cuidadosamente do tubo (30); e) Segurar firmemente a tampa (40) que contém as lâminas (21)/(22) e semear com o auxilio de um swab o escarro descontaminado do paciente na superfície dos meios de cultura dos quatro poços (pl), (p2), (pl') e (p2'). Entende-se por descontaminação a eliminação da flora bacteriana indesejável do escarro, para que seja mantido apenas o bacilo da tuberculose. Para isto imerge-se o swab em solução de Hidróxido de Sódio a 4% durante 2 minutos e a seguir semeia-se com movimentos giratórios a amostra sobre a superfície dos meios de cultura; f) Após a realização do procedimento de semeadura, retornar as lâminas (21)/(22) contendo os meios de cultura para dentro do tubo transparente, rosquear até o fechamento completo do tubo; g) Incubar em estufa a 37 "C até ocorrer o crescimento - colônias - do bacilo da tuberculose na superfície do meio de cultura; h) Havendo crescimento de unidades formadoras de colônias no meios proceder a interpretação dos resultados; A gravação exclusiva nas lâminas (21)/(22) Controle ou C, PNB, INH e RIF identifica o meio de cultura controle e aqueles com antibióticos que será colocado na lâmina; i) Quando houver necessidade de utilizar as colônias do bacilo para subcultivos, congelamento (armazenamento), testes complementares de sensibilidade a antibióticos e ou moleculares, deve-se abrir a tampa (41) da extremidade oposta e com auxilio de uma alça bacteriológica retirar as colônias da superfície do meio controle e realizar o procedimento desejado.[051] Therefore, for the proper use of the laminoculture (20), the following operational procedures must be carried out: a) Open the laminoculture tube (30) (20), remove the slides (21) and (22) with wells (pl ), (p2), (pl') and (p2') which are attached to the screw cap (40) and reserve the tube (30) that contains the screw cap (41) at the opposite end; b) Prepare egg-based or agar-based culture media according to the desired formula, and if the culture medium is egg-based - Ogawa or Lowenstein-Jensen or similar - add 5.0 mL of the media of culture in the wells that have the slide fixed to the screw cap. Place said slides (21)/(22) containing the wells (pl), (p2), (pl') and (p2') in a tray and place them in the coagulator to carry out the process of solidifying the culture medium to a temperature of 85 °C for 50 minutes. If the culture media is agar-based - Middlebrook or similar -, add 5.0 ml of the culture medium at a temperature of 50-C to the slides containing the wells, maintain at room temperature and wait for it to solidify; c) Remove the slides (21)/(22) attached to the lid (40) containing the culture media from the coagulator, insert them into the tube (30) and close by screwing the lids on; d) When using, turn the cap (40) containing the culture media and carefully remove it from the tube (30); e) Firmly hold the lid (40) containing the slides (21)/(22) and use a swab to sow the patient's decontaminated sputum on the surface of the culture media in the four wells (pl), (p2), (pl') and (p2'). Decontamination is understood as the elimination of undesirable bacterial flora from the sputum, so that only the tuberculosis bacillus is maintained. To do this, the swab is immersed in a 4% Sodium Hydroxide solution for 2 minutes and then the sample is sown with rotating movements on the surface of the culture media; f) After carrying out the sowing procedure, return the slides (21)/(22) containing the culture media into the transparent tube, screw until the tube is completely closed; g) Incubate in an oven at 37 "C until growth - colonies - of the tuberculosis bacillus occurs on the surface of the culture medium; h) If there is growth of colony-forming units in the medium, proceed with the interpretation of the results; Exclusive recording on the slides ( 21)/(22) Control or C, PNB, INH and RIF identifies the control culture medium and those with antibiotics that will be placed on the slide; i) When there is a need to use the bacillus colonies for subcultures, freezing (storage), complementary antibiotic and/or molecular susceptibility tests, the lid (41) on the opposite end must be opened and, with the help of a bacteriological loop, the colonies must be removed from the surface of the control medium and the desired procedure carried out.
[052] Assim, antes de iniciar o método deve-se colocar e organizar todos os itens do kit e o frasco contendo a amostra de escarro sobre a bancada próximo a chama de bico de Bunsen ou dentro da cabine de segurança biológica. Para realização do método de diagnóstico método de identificação e de sensibilidade a INH a RIF é necessário realizar os seguintes procedimentos: a) Abrir a tampa do frasco (60) contendo escarro, adicionar cerca de 20 gramas de microesferas (70) de vidro, fechar a tampa do frasco (60) e homogeneizar em agitador de tubos tipo Vortex durante 2 minutos. Esperar por 10 minutos para os aerossóis sedimentarem; b) Retirar o swab - estéril - (80) da embalagem, e com o auxilio de sua haste introduzir o tufo de algodão na amostra de escarro girando cuidadosamente até que o mesmo fique impregnado; c) Colocar 3,0 mL da solução de hidróxido de sódio - NaOH - reservada no frasco (50) a 4% no tubo de poliestireno (100); d) Introduzir o swab (80) contendo a amostra de escarro no tubo (100) e manter imerso na solução de NaOH a 4% por dois minutos. Dito procedimento é denominado de descontaminação, ou seja, eliminação da flora bacteriana - microbiota - indesejável do escarro. Os bacilos da tuberculose permanecem viáveis durante esses procedimento, pois resistem temporariamente ao pH alcalino extremo; e) Espremer o tufo de algodão contra a parede do tubo (100) para retirar o excesso de NaOH; f) Girar a tampa (40) em que se encontra presa à lâmina (21) contendo os meios de cultura cuidando para não tocar nas bordas e remove-la cuidadosamente do tubo transparente (30); g) Segurar firmemente a lâmina (21) e passar o swab (80) mediante movimentos rotatórios e em zigue-zague de maneira a espalhar bem o inoculo primeiro sobre a superfície do poço (pl) - controle - e a seguir sobre a superfície do poço (p2) - PNB; h) Com auxílio de um novo swab (80), repetir os procedimentos b, d e e. Segurar firmemente a lâmina (22) e passar o swab (80) mediante movimentos rotatórios e em zigue-zague de maneira a espalhar bem o inoculo sobre a superfície do poço (pl') - INH; i) Com auxílio de um novo swab (80) - terceiro repetir os procedimentos b, d e e. Segurar firmemente a lâmina (22) e passar o swab (80) mediante movimentos rotatórios e em zigue-zague de maneira a espalhar bem o inoculo sobre a superfície do poço (p2') - RIF. F necessário que se proceda a troca de swabs (80) entre os procedimentos de semeadura para impedir que ocorra transferência do PNB para o meio de cultura controle ou de INH para o meio de cultura com RIF; j) Após a realização do procedimento de semeadura os swabs (80) devem ser descartados em recipiente apropriado do ponto de vista de biossegurança; k) Retornar a lâmina (22) contendo os meios de cultura para dentro do tubo transparente (30), rosquear até o fechamento completo do tubo; l) Acomodar o laminocultivo (20) semeado na caixa cartonada (90) com divisórias (91a) e incubar em estufa a 37°C por um período de até 60 dias; m) Realizar a leitura dos tubos semeados (30) em bancada bem iluminada, próxima à janela ou com foco de luz próximo, tal como, luminária. Se possível, utilizar lupa para melhorar a visualização das colônias pequenas; n) Se ocorrer o crescimento de colônias - micobactérias - na superfície do meio de cultura controle realizar a leitura e interpretação dos resultados entre 21 e 30 dias após a semeadura. Para que o resultado do método de identificação e de sensibilidade a INH a RIF seja válido é necessário que ocorra o crescimento suficiente de unidades formadoras de colônias - UFC - mais de 100 no meio de cultura controle sem droga. A resistência ou a sensibilidade é estimada comparando-se o número de colônias que crescem no meio com o fármaco com o número que cresce no meio controle, e expresso em percentual. Considera-se 1% como o ponto de corte definidor. Desta forma para que possa detectar pelo menos 1% de mutantes resistentes entre os bacilos inoculados - cálculo da porcentagem - será necessária a presença de pelo menos 100 UFC no meio de cultura controle; o) Quantificar o número UFC nos meios de cultura - Controle ou C, PNB, INH e RIF; p) Calcular a porcentagem de UFC desenvolvidas na presença de cada droga - PNB, INH e RIF - corn relação à média de UFC no meio de cultura controle. Se essa proporção é maior do que 1%, o isolado bacteriano é considerado resistente à droga em questão. Se a proporção é menor do que 1% o isolado bacteriano é considerado sensível de acordo com os critérios apresentados na tabela a seguir: q) As micobactérias não pertencentes ao complexo M. tuberculosis também chamadas de microbactérias não causadoras de tuberculose - MNTb - são resistentes ao PNB e geram invariavelmente o mesmo número de colônias em ambos os meios de cultura (controle e com PNB). Portanto, o crescimento de qualquer número de colônias no meio com PNB caracteriza a presença de MNT; r) Caso ocorra o crescimento de poucas UFC no meio de cultura controle e se deseje realizar subcultivos, congelamento - armazenamento testes complementares de sensibilidade a antibióticos e ou moleculares, deve-se abrir - desrosquear - a tampa da extremidade oposta aquela em que estão fixadas as lâminas (2l)/(22) e com auxilio de uma alça bacteriológica retirar as colônias da superfície do meio controle e realizar o procedimento desejado.[052] Therefore, before starting the method, all kit items and the vial containing the sputum sample must be placed and organized on the bench close to the Bunsen burner flame or inside the biological safety cabinet. To carry out the diagnostic method, identification method and sensitivity to INH and RIF, it is necessary to carry out the following procedures: a) Open the lid of the bottle (60) containing sputum, add approximately 20 grams of glass microspheres (70), close the bottle cap (60) and homogenize in a Vortex tube shaker for 2 minutes. Wait 10 minutes for the aerosols to settle; b) Remove the swab - sterile - (80) from the packaging, and with the help of its rod introduce the cotton tuft into the sputum sample, carefully rotating it until it is impregnated; c) Place 3.0 mL of the sodium hydroxide solution - NaOH - reserved in the bottle (50) at 4% in the polystyrene tube (100); d) Insert the swab (80) containing the sputum sample into the tube (100) and keep it immersed in the 4% NaOH solution for two minutes. This procedure is called decontamination, that is, elimination of undesirable bacterial flora - microbiota - from the sputum. Tuberculosis bacilli remain viable during these procedures, as they temporarily resist extreme alkaline pH; e) Squeeze the cotton tuft against the wall of the tube (100) to remove excess NaOH; f) Turn the cap (40) attached to the slide (21) containing the culture media, taking care not to touch the edges, and carefully remove it from the transparent tube (30); g) Hold the blade (21) firmly and pass the swab (80) using rotating and zigzag movements in order to spread the inoculum well first over the surface of the well (pl) - control - and then over the surface of the well (p2) - PNB; h) Using a new swab (80), repeat procedures b, d and e. Hold the blade (22) firmly and pass the swab (80) using rotating and zigzag movements in order to spread the inoculum well over the surface of the well (pl') - INH; i) With the help of a new swab (80) - third, repeat procedures b, d and e. Hold the blade (22) firmly and pass the swab (80) using rotating and zigzag movements in order to spread the inoculum well over the surface of the well (p2') - RIF. It is necessary to exchange swabs (80) between sowing procedures to prevent transfer of PNB to the control culture medium or of INH to the culture medium with RIF; j) After carrying out the sowing procedure, the swabs (80) must be discarded in an appropriate container from a biosafety point of view; k) Return the slide (22) containing the culture media into the transparent tube (30), screw until the tube is completely closed; l) Accommodate the laminocultivation (20) sown in the cardboard box (90) with dividers (91a) and incubate in an oven at 37°C for a period of up to 60 days; m) Read the seeded tubes (30) on a well-lit bench, close to the window or with a nearby spotlight, such as a lamp. If possible, use a magnifying glass to improve visualization of small colonies; n) If colonies - mycobacteria - grow on the surface of the control culture medium, read and interpret the results between 21 and 30 days after sowing. For the result of the identification method and sensitivity to INH to RIF to be valid, there must be sufficient growth of colony forming units - CFU - more than 100 in the control culture medium without drug. Resistance or sensitivity is estimated by comparing the number of colonies that grow in the drug medium with the number that grows in the control medium, and expressed as a percentage. 1% is considered as the defining cutoff point. Therefore, in order to detect at least 1% of resistant mutants among the inoculated bacilli - calculation of the percentage - the presence of at least 100 CFU in the control culture medium will be necessary; o) Quantify the UFC number in the culture media - Control or C, PNB, INH and RIF; p) Calculate the percentage of CFU developed in the presence of each drug - PNB, INH and RIF - in relation to the average CFU in the control culture medium. If this proportion is greater than 1%, the bacterial isolate is considered resistant to the drug in question. If the proportion is less than 1%, the bacterial isolate is considered sensitive according to the criteria presented in the following table: q) Mycobacteria that do not belong to the M. tuberculosis complex, also called microbacteria that do not cause tuberculosis - MNTb - are resistant to PNB and invariably generate the same number of colonies in both culture media (control and with PNB). Therefore, the growth of any number of colonies in the medium with PNB characterizes the presence of NTM; r) If there is growth of a few CFU in the control culture medium and it is desired to carry out subcultures, freezing - storage complementary antibiotic and/or molecular susceptibility tests, the cap on the opposite end to the one on which they are fixed must be opened - unscrewed the slides (2l)/(22) and with the help of a bacteriological loop remove the colonies from the surface of the control medium and carry out the desired procedure.
[053] Dito conjunto de elementos (10) pode apresentar uma variante composta por frasco (50) com solução digestora e descontaminante; frasco (60) com microesferas de vidro (70) ou N-acetil L-Cisteina; tubos de poliestireno (100); swabs (80) e tubos ou frascos (30) de qualquer dimensão e constituição com meios de cultura em substituição ao laminocultivo. Para a obtenção do diagnóstico realiza-se o mesmo método proposto, inoculando a amostra em tubos ou frascos com meios de cultura (30) - Controle, PNB, INH e RIF - ao invés do laminocultivo. Uma terceira variação do kit (10) compreende a utilização de agentes mucolíticos químicos, tais como, N-acetil L-Cisteina para digerir o escarro acondicionado no frasco (60).[053] Said set of elements (10) may have a variant consisting of a bottle (50) with digesting and decontaminating solution; bottle (60) with glass microspheres (70) or N-acetyl L-Cysteine; polystyrene tubes (100); swabs (80) and tubes or bottles (30) of any size and constitution with culture media replacing laminoculture. To obtain the diagnosis, the same proposed method is used, inoculating the sample in tubes or flasks with culture media (30) - Control, PNB, INH and RIF - instead of laminoculture. A third variation of the kit (10) comprises the use of chemical mucolytic agents, such as N-acetyl L-Cysteine to digest the sputum contained in the bottle (60).
[054] Uma quarta variante do kit (10) consiste na composição por frasco com solução digestora e descontaminante (50); frasco (60) com microesferas (70) de vidro ou N- acetil L-Cisteina; tubos de poliestireno (100); swabs (80) e laminocultivo com características construtivas distintas de forma a realizar o método proposto inoculando a amostra em um ou mais laminocultivos com características construtivas diferentes. Uma variação do método de diagnóstico para cultivar, identificar e determinar o perfil sensibilidade do bacilo da tuberculose a isoniazida e rifampicina consiste nas seguintes etapas: 1) Digestão do escarro com N-acetil L-Cisteina e/ou microsesferas de vidro; 2) Diluição da amostra em água ou solução salina; 3) Inoculação com o auxílio de swab (80) ou pipetas em tubos ou frascos com meios de cultura - Controle, PNB, INH e RIF.[054] A fourth variant of the kit (10) consists of the composition per bottle with digestion and decontaminating solution (50); bottle (60) with glass or N-acetyl L-Cysteine microspheres (70); polystyrene tubes (100); swabs (80) and laminoculture with different construction characteristics in order to carry out the proposed method by inoculating the sample in one or more laminocultures with different construction characteristics. A variation of the diagnostic method to cultivate, identify and determine the sensitivity profile of tuberculosis bacilli to isoniazid and rifampicin consists of the following steps: 1) Digestion of sputum with N-acetyl L-Cysteine and/or glass microspheres; 2) Dilution of the sample in water or saline solution; 3) Inoculation with the aid of swab (80) or pipettes in tubes or flasks with culture media - Control, PNB, INH and RIF.
[055] Uma variante operacional para o método de diagnóstico consiste na utilização de p-nitro-α-acetilamino-β-hidroxipropriofenona - NAP - ou outra substância em substituição ao PNB para identificar o complexo M. tuberculosis.[055] An operational variant for the diagnostic method consists of using p-nitro-α-acetylamino-β-hydroxypropriophenone - NAP - or another substance replacing PNB to identify the M. tuberculosis complex.
[056] Uma variante operacional para o método de diagnóstico consiste na utilização de outros agentes químicos alcalinos em substituição ao NaOH para descontaminar o escarro.[056] An operational variant for the diagnostic method consists of using other alkaline chemical agents to replace NaOH to decontaminate the sputum.
[057] Uma variante técnica do meio de cultura na adição de agar evitando o processo de coagulação do meio básico de Ogawa.[057] A technical variant of the culture medium in the addition of agar avoiding the coagulation process of Ogawa's basic medium.
[058] Uma variante técnica pode ser elaborada com os mesmos elementos do kit (10) e método de diagnóstico acrescentando-se a este a técnica da "Nitratase" para diminuir o tempo de detecção do crescimento bacteriano - UFC -. Esta técnica se baseia na capacidade de detectar a redução de nitrato para nitrito realizado por cepas de M. tuberculosis metabolicamente ativa.[058] A technical variant can be created with the same elements as the kit (10) and diagnostic method, adding the "Nitratase" technique to reduce the detection time of bacterial growth - UFC -. This technique is based on the ability to detect the reduction of nitrate to nitrite carried out by strains of metabolically active M. tuberculosis.
[059] É certo que quando o presente invento for colocado em pratica, poderão ser introduzidas modificações no que se refere a certos detalhes de construção e forma, sem que isso implique afastar-se dos princípios fundamentais que estão claramente substanciados no quadro relvindicatório, ficando assim entendido que a terminologia empregada não teve a finalidade de limitação.[059] It is true that when the present invention is put into practice, modifications may be introduced with regard to certain details of construction and shape, without this implying departing from the fundamental principles that are clearly substantiated in the claim framework, leaving therefore, it is understood that the terminology used was not intended to be limiting.
Claims (26)
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