BR102015013031B1 - NANOPARTICLES AND THEIR USE AS A MAGNETIC RESONANCE IMAGING CONTRAST AGENT - Google Patents
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Abstract
NANOPARTÍCULAS E SEU Uso COMO AGENTE DE CONTRASTE EM IMAGEM POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA A presente invenção descreve nanopartículas de óxido de ferro funcionalizadas com moléculas bioativas que apresentam aplicação como agentes de contraste para imagem por ressonância magnética, adequadas para o diagnóstico eficiente e seguro por imagem por ressonância magnética, e como material para tratamento e veiculador de substâncias terapêuticas em locais específicos por acumulação magneticamente induzida em locais de interesse diagnóstico e terapêutico. A presente invenção se insere nos campos da química e da nanotecnologia aplicadas à medicina e, mais particularmente, se refere a agentes de contraste para diagnóstico por imagem por ressonância magnética.NANOPARTICLES AND THEIR USE AS A MAGNETIC RESONANCE IMAGING CONTRAST AGENT The present invention describes iron oxide nanoparticles functionalized with bioactive molecules that have application as contrast agents for magnetic resonance imaging, suitable for efficient and safe diagnosis by resonance imaging magnetic, and as a material for treatment and delivery of therapeutic substances at specific sites by magnetically induced accumulation at sites of diagnostic and therapeutic interest. The present invention falls within the fields of chemistry and nanotechnology applied to medicine and, more particularly, relates to contrast agents for diagnostic magnetic resonance imaging.
Description
[001] A presente invenção refere-se a materiais de dimensões nanométricas, superparamagnéticos, não tóxicos, formados por nanopartículas de magnetita e/ou de maguemita, revestidas com uma camada de moléculas biologicamente ativas, neutras e/ou que confere carga positiva às nanopartículas tornando-as totalmente dispersáveis em um solvente adequado, e seu uso como agentes de contraste em imagem por ressonância magnética. Além disso, as nanopartículas podem conter moléculas terapêuticas que podem ser liberadas em locais específicos promovendo o tratamento após concentração com auxílio de uma fonte de campo magnético. A presente invenção se insere nos campos da química e da nanotecnologia aplicadas à medicina e, mais particularmente, se refere a agentes de contraste para diagnóstico por imagem por ressonância magnética[001] The present invention refers to materials of nanometric dimensions, superparamagnetic, non-toxic, formed by nanoparticles of magnetite and/or maguemite, coated with a layer of biologically active molecules, neutral and/or that confer a positive charge to the nanoparticles. making them fully dispersible in a suitable solvent, and their use as contrast agents in magnetic resonance imaging. In addition, nanoparticles may contain therapeutic molecules that can be released at specific sites promoting treatment after concentration with the aid of a magnetic field source. The present invention falls within the fields of chemistry and nanotechnology applied to medicine and, more particularly, relates to contrast agents for diagnostic magnetic resonance imaging.
[002] Com o advento da tecnologia e diante de um cenário mundial com tantas doenças e moléstias diversificadas, muitos equipamentos e técnicas de diagnóstico estão sendo desenvolvidos para melhor atenderem as necessidades da sociedade e estão majoritariamente presentes em hospitais e laboratórios de análises clínicas.[002] With the advent of technology and in the face of a world scenario with so many diverse diseases and diseases, many diagnostic equipment and techniques are being developed to better meet the needs of society and are mostly present in hospitals and clinical analysis laboratories.
[003] Na prática clinica, os exames de diagnóstico são realizados para complementar e corroborar com os dados históricos e o exame fisico/clínico efetuado nos pacientes para a elucidação de seu diagnóstico. Por isso, é fundamental que o resultado do exame seja rápido, precoce e preciso para que seja tomada a melhor conduta ao tratamento do paciente. Atualmente, existem centenas de exames de diagnóstico laboratoriais e de imagem disponíveis no mercado, mas as técnicas de diagnóstico por imagem ganham destaque por fornecer riqueza de detalhes como avaliação anatômica, morfológica e até funcional dos órgãos e estruturas internas de interesse.[003] In clinical practice, diagnostic tests are performed to complement and corroborate with historical data and physical/clinical examination performed on patients to elucidate their diagnosis. Therefore, it is essential that the result of the exam is fast, early and accurate so that the best conduct for the treatment of the patient is taken. Currently, there are hundreds of laboratory and imaging diagnostic tests available on the market, but diagnostic imaging techniques are highlighted for providing a wealth of details such as anatomical, morphological and even functional evaluation of the organs and internal structures of interest.
[004] Dentre todas as técnicas de diagnóstico por imagem, a imagem por ressonância magnética (IRM) destaca-se por não ser invasiva, não utilizar fonte de radiações íonizantes, oferecer imagens multiplanares da região de interesse investigative, diferencia tipos de tecidos e estruturas baseados na intensidade de sinal, além de apresentar bom contraste de imagem e alta resolução espacial.[004] Among all diagnostic imaging techniques, magnetic resonance imaging (MRI) stands out for being non-invasive, not using a source of ionizing radiation, offering multiplanar images of the region of investigative interest, differentiating types of tissues and structures based on signal strength, in addition to presenting good image contrast and high spatial resolution.
[005] No Brasil, esta técnica faz uso de agentes de contraste baseados em compostos paramagnéticos de gadolínio para facilitar a visualização de órgãos ou outras estruturas internas. Entretanto, existem pacientes que sofrem reações adversas quando tais compostos são administrados intravenosamente, sendo alergia a reação colateral mais corriqueira. Infelizmente, existem relatos de pacientes que vieram a óbito devido a problemas no processo de produção e falha no controle de qualidade dos compostos, onde o gadolínio (metal extremamente tóxico) não foi devidamente quelado, condição necessária para promover a biocompatibilidade e evitar toxicidade aguda ao organismo.[005] In Brazil, this technique makes use of contrast agents based on paramagnetic gadolinium compounds to facilitate the visualization of organs or other internal structures. However, there are patients who suffer adverse reactions when such compounds are administered intravenously, with allergy being the most common side reaction. Unfortunately, there are reports of patients who died due to problems in the production process and failure to control the quality of the compounds, where gadolinium (an extremely toxic metal) was not properly chelated, a necessary condition to promote biocompatibility and avoid acute toxicity to the body.
[006] Outra desvantagem além do quesito segurança, evoca até mesmo a eficiência deste mesmo composto como agente de contraste em IRM se comparado a compostos baseados em nanoparticulas superparamagnétícas.[006] Another disadvantage besides safety, it even evokes the efficiency of this same compound as a contrast agent in MRI compared to compounds based on superparamagnetic nanoparticles.
[007] Agentes de contraste de IRM baseados em nanoparticulas de magnetita, como Resovist® e Endorem®, já estão sendo comercializados nos EUA e Europa como agentes de diagnóstico mais eficazes e mais seguros. No entanto, eles ainda são muito caros devido ao processo de produção, de tal forma que nanoparticulas superparamagnétícas de óxido de ferro (SPIOs) mais baratos estão sendo procurados para efetivar seu uso.[007] Magnetite nanoparticle-based MRI contrast agents such as Resovist® and Endorem® are already being marketed in the US and Europe as more effective and safer diagnostic agents. However, they are still very expensive due to the production process, such that cheaper superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) are being sought to effect their use.
[008] Sabe-se bem que nanoparticulas magnéticas, distribuídas em um campo magnético, criam gradientes extremamente grandes no campo microscópico. Estes gradientes provocam substancial encurtamento dos tempos de relaxação longitudinal (T1) e transversal (T2 e T2*) nas proximidades de núcleos de hidrogênio (prótons), utilizados na maioria das aplicações de IRM. As magnitudes do contraste de IRM conseguidos com SPIOs supera aqueles baseados em compostos de gadolínio (biomarcador específico) clinicamente aprovados, permitindo, assim, a detecção precoce de doenças nos níveis molecular e celular.[008] It is well known that magnetic nanoparticles, distributed in a magnetic field, create extremely large gradients in the microscopic field. These gradients cause substantial shortening of longitudinal (T1) and transverse (T2 and T2*) relaxation times in the vicinity of hydrogen nuclei (protons), used in most MRI applications. The magnitudes of MRI contrast achieved with SPIOs exceeds those based on clinically approved gadolinium (specific biomarker) compounds, thus allowing for early detection of disease at the molecular and cellular levels.
[009] Enquanto os esforços para o desenvolvimento de nanopartículas magnéticas através de novas rotas sintéticas e de funcionalização continuam a crescer, a importância de designs de materiais específicos e da seleção adequada de métodos de imagem têm sido cada vez mais reconhecida. Investigações anteriores mostraram que o aumento de contraste de IRM por nanopartículas magnéticas está fortemente relacionada com sua composição, magnetização, tamanho, grau de cristalinidade do núcleo, propriedades de superfície e com o grau de agregação no meio biológico.[009] As efforts to develop magnetic nanoparticles through novel synthetic and functionalization routes continue to grow, the importance of specific material designs and appropriate selection of imaging methods has been increasingly recognized. Previous investigations have shown that the enhancement of MRI contrast by magnetic nanoparticles is strongly related to their composition, magnetization, size, degree of crystallinity of the nucleus, surface properties and the degree of aggregation in the biological medium.
[010] Portanto, compreender as relações entre esses parâmetros intrínsecos e os processos de relaxação dos prótons sob a influência de nanopartículas magnéticas podem fornecer informações criticas para projetar e aumentar a performance de nanopartículas magnéticas nas diversas aplicações em IRM.[010] Therefore, understanding the relationships between these intrinsic parameters and the processes of proton relaxation under the influence of magnetic nanoparticles can provide critical information to design and increase the performance of magnetic nanoparticles in various applications in MRI.
[011] Os nanomateriais com base em óxidos de ferro são interessantes para aplicações biomédicas, porque geralmente apresentam uma baixa toxicidade, as matérias primas são abundantes e baratas, e processos mais robustos e simples de fabricação estão sendo buscados. Entre todos os tipos de óxidos de ferro naturalmente encontrados, magnetita (Fe3O4) e maguemita (y-Fe2O3) são os materiais magnéticos mais utilizados como agentes de contraste para IRM e para o desenvolvimento de novos nanomateriais para diagnóstico e terapêutica.[011] Nanomaterials based on iron oxides are interesting for biomedical applications, because they generally have low toxicity, raw materials are abundant and cheap, and more robust and simple manufacturing processes are being sought. Among all types of naturally found iron oxides, magnetite (Fe3O4) and maguemite (y-Fe2O3) are the most commonly used magnetic materials as contrast agents for MRI and for the development of new nanomaterials for diagnosis and therapy.
[012] Na busca pelo estado da técnica em literaturas cientifica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:[012] In the search for the state of the art in scientific and patent literature, the following documents were found that deal with the subject:
[013] O documento US20060093555 revela o uso de agentes compostos de óxido de ferro superparamagnético no campo de imagem por ressonância magnética sugerindo o revestimento dos ditos agentes de óxido de ferro com Polietileno glicol (PEG) e/ou Polietiieno iminas (PEI). A presente invenção difere do dito documento pelo fato das partículas utilizadas apresentarem uma composição completamente distinta, possibilitando uma maior sensibilidade devido a maior magnetização desta,[013] The document US20060093555 discloses the use of agents composed of superparamagnetic iron oxide in the magnetic resonance imaging field suggesting the coating of said iron oxide agents with Polyethylene glycol (PEG) and/or Polyethylene imines (PEI). The present invention differs from said document in that the particles used have a completely different composition, allowing greater sensitivity due to its greater magnetization,
[014] O documento BR 102014019921-7, de autoria dos inventores deste pedido descreve a preparação in situ de nanomateriais híbridos automontados e sua utilização como sondas SERS ultrassensíveis, que se caracterizam pelo fato das propriedades superparamagnétícas do material serem exploradas para concentrar o nanomaterial contendo o analito pela ação de um ímã, desta forma aumentando a sensibilidade e reprodutibilidade das medidas No referido documento, as nanoparticulas superparamagnétícas de óxidos de ferro com aminoetilfosfato, foram utilizados em associação com nanoparticulas metálicas, particularmente de ouro, de prata e de cobre, visando à preparação de nanomateriais híbridos automontados ativos para aquela aplicação específica. Também foram descritos um método de análise pela técnica SERS/Raman e kit para realização das análises utilizando os nanomateriais, assim diferindo completamente do presente documento. A presente invenção define nanoparticulas de composição distinta e descreve aplicações diferentes das sugeridas no documento acima.[014] Document BR 102014019921-7, authored by the inventors of this application, describes the in situ preparation of self-assembled hybrid nanomaterials and their use as ultra-sensitive SERS probes, which are characterized by the fact that the material's superparamagnetic properties are exploited to concentrate the nanomaterial containing the analyte by the action of a magnet, thus increasing the sensitivity and reproducibility of the measurements In that document, superparamagnetic nanoparticles of iron oxides with aminoethylphosphate were used in association with metallic nanoparticles, particularly gold, silver and copper, aiming preparation of active self-assembled hybrid nanomaterials for that specific application. A method of analysis using the SERS/Raman technique and a kit for carrying out the analyzes using nanomaterials were also described, thus completely differing from the present document. The present invention defines nanoparticles of different composition and describes applications different from those suggested in the document above.
[015] O estado-da-arte da técnica de preparação de nanoparticulas de magnetita por termodecomposição está bem descrito na literatura e nos exemplos citados neste documento. Contudo as propriedades dos nanomateriais para aplicação como agentes de contraste IRM dependem não somente dos núcleos de magnetita das nanoparticulas, mas também das espécies moleculares ligadas à superfície e o modo como estão ligadas a superfície das mesmas Esta camada é responsável pelo controle das propriedades de dispersão, estabilidade coloidal, interação com espécies biológicas, estabilidade à agregação, imprescindíveis na definição da aplicabilidade das mesmas como agentes de contraste em diagnóstico por imagem de ressonância magnética.[015] The state-of-the-art technique for preparing magnetite nanoparticles by thermodecomposition is well described in the literature and in the examples cited in this document. However, the properties of nanomaterials for application as MRI contrast agents depend not only on the magnetite nuclei of the nanoparticles, but also on the molecular species bound to the surface and the way they are bound to the surface of the same. This layer is responsible for controlling the dispersion properties , colloidal stability, interaction with biological species, stability to aggregation, essential to define their applicability as contrast agents in diagnosis by magnetic resonance imaging.
[016] A tese de Rafael Admar Bini apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista como parte do requisito para obtenção do título de Doutor em Química (2011) discute a síntese e funcionalização de superfície de óxidos de ferro superparamagnéticos e sugere a aplicação de nanopartículas magnéticas como agente de contraste em técnicas de imagem por ressonância magnética. Entretanto, o dito documento sugere a funcionalização de superfície com alcoxissilanos e as partículas utilizadas na presente invenção tem composição completamente distinta, sendo necessárias altas quantidades de material a fim de se obter um contraste adequado.[016] Rafael Admar Bini's thesis presented to the Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista as part of the requirement to obtain the title of Doctor in Chemistry (2011) discusses the synthesis and surface functionalization of superparamagnetic iron oxides and suggests the application of magnetic nanoparticles as a contrast agent in magnetic resonance imaging techniques. However, said document suggests surface functionalization with alkoxysilanes and the particles used in the present invention have a completely different composition, requiring high amounts of material in order to obtain an adequate contrast.
[017] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.[017] Thus, from what can be seen from the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive step compared to the state of the art.
[018] Dessa forma, é constante a busca por novos materiais que sejam mais eficientes e, ao mesmo tempo, mais baratos para utilização como agentes de contraste em IRM (Imagem por Ressonância Magnética).[018] Thus, the search for new materials that are more efficient and, at the same time, cheaper for use as contrast agents in MRI (Magnetic Resonance Imaging) is constant.
[019] A presente invenção visa resolver os problemas constantes no estado da técnica a partir de produtos nanomagnéticos capazes de agir como eficientes agentes de contraste para diagnóstico por imagem por ressonância magnética (IRM).[019] The present invention aims to solve the constant problems in the state of the art from nanomagnetic products capable of acting as efficient contrast agents for diagnosis by magnetic resonance imaging (MRI).
[020] Idealmente, as nanopartículas magnéticas para diagnóstico por ressonância magnética devem exibir comportamento superparamagnético e induzir a maior mudança em T2 possível, sem apresentar agregação magnética espontânea. Este comportamento é apresentado por nanopartículas bem pequenas, particularmente as nanopartículas ultra-pθquenas com diâmetros menores que 10 nm, por serem iguais ou menores em tamanho do que os domínios magnéticos presentes nos materiais magnéticos macroscópicos. Além disso, devem ser totalmente dispersáveis em água e em meio biológico. ser biocompatíveis para evitar resposta tóxica e imunológica, e devem apresentar algumas rotas químicas ou físicas para fixar biomoléculas a sua superfície, tais como anticorpos ou outras proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos ou peptídeos, ou mesmo moléculas bioativas, de acordo com a aplicação desejada[020] Ideally, magnetic nanoparticles for diagnostic magnetic resonance imaging should exhibit superparamagnetic behavior and induce the largest possible change in T2, without showing spontaneous magnetic aggregation. This behavior is shown by very small nanoparticles, particularly ultra-small nanoparticles with diameters smaller than 10 nm, as they are equal or smaller in size than the magnetic domains present in macroscopic magnetic materials. In addition, they must be fully dispersible in water and in a biological medium. be biocompatible to avoid toxic and immunological response, and must have some chemical or physical routes to attach biomolecules to their surface, such as antibodies or other proteins, carbohydrates, nucleic acids or peptides, or even bioactive molecules, depending on the application. desired
[021] Para tal fim, nanopartículas superparamagnéticas de magnetita ultrapequenas, (USPIO), não-tóxicas e dispersáveis em meio aquoso, são adequadas como agente de contraste em IRM com o objetivo de aumentar a eficiência da técnica de diagnóstico, sem causar os efeitos colaterais indesejados como atualmente acontece. Além disso, há a possibilidade de acumulá-las por afinidade (seletividade/especificidade em função das moléculas presentes na superfície das nanopartículas) ou magneticamente em região de interesse diagnóstico ou terapêutico, permitindo a realização do diagnóstico e do tratamento, seja por meios físicos como a hipertermia, seja pela liberação de moléculas bioativas (fármacos, drogas, material radioterápico, etc).[021] To this end, ultra-small magnetite superparamagnetic nanoparticles (USPIO), non-toxic and dispersible in aqueous media, are suitable as a contrast agent in MRI with the aim of increasing the efficiency of the diagnostic technique, without causing the effects unwanted side effects as currently happens. In addition, there is the possibility of accumulating them by affinity (selectivity/specificity depending on the molecules present on the surface of the nanoparticles) or magnetically in a region of diagnostic or therapeutic interest, allowing diagnosis and treatment, either by physical means or hyperthermia, either by the release of bioactive molecules (drugs, drugs, radiotherapy material, etc).
[022] São apresentadas nanopartículas de magnetita superparamagnéticas ultrapequenas, com tamanho médio menor que 10 nm de diâmetro e funcionalizadas com moléculas bioativas neutras ou jónicas, USPIO, com, por exemplo, grupos aminoetilfosfato, dopamina, glicose, biotina, ácido fólico, ibuprofeno, dentre outras, as quais são totalmente dispersáveis em meio aquoso, não apresentam toxicidade in vivo e são altamente eficientes como agentes de contraste em IRM. Outra vantagem deste material é a sua capacidade de se acumular magneticamente em regiões de interesse diagnóstico ou terapêutico após sua administração intravenosa através do posicionamento de um magneto na região externa a esta.[022] Ultra-small superparamagnetic magnetite nanoparticles are presented, with an average size smaller than 10 nm in diameter and functionalized with neutral or ionic bioactive molecules, USPIO, with, for example, aminoethylphosphate groups, dopamine, glucose, biotin, folic acid, ibuprofen, among others, which are fully dispersible in aqueous media, do not present toxicity in vivo and are highly efficient as contrast agents in MRI. Another advantage of this material is its ability to magnetically accumulate in regions of diagnostic or therapeutic interest after its intravenous administration through the positioning of a magnet in the region external to it.
[023] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta nanopartículas compreendendo um núcleo de magnetita e/ou de maguemita tendo apenas um tipo de molécula bioativa ligada em sua superfície , em que o diâmetro das nanopartículas é menor que 10 nm.[023] In a first aspect, the present invention presents nanoparticles comprising a magnetite and/or maguemite core having only one type of bioactive molecule attached to its surface, in which the diameter of the nanoparticles is less than 10 nm.
[024] Em uma concretização, a presente invenção apresenta nanopartículas compreendendo um núcleo de magnetita e/ou de maguemita tendo dois ou mais tipos de moléculas bioativas diretamente ligadas em sua superfície, em que o diâmetro das nanopartículas é menor que 10 nm, e o processo de preparação das mesmas.[024] In one embodiment, the present invention presents nanoparticles comprising a magnetite and/or maguemite core having two or more types of bioactive molecules directly linked on their surface, in which the diameter of the nanoparticles is less than 10 nm, and the their preparation process.
[025] Em uma concretização, a presente invenção apresenta nanopartículas compreendendo um núcleo de magnetita e/ou de maguemita tendo um ou mais tipos de moléculas bioativas ligadas em sua superfície através da formação de ligações amida, em que o diâmetro das nanopartículas é menor que 10 nm, além do processo de preparação das mesmas.[025] In one embodiment, the present invention features nanoparticles comprising a magnetite and/or maguemite core having one or more types of bioactive molecules linked on its surface through the formation of amide bonds, in which the diameter of the nanoparticles is smaller than 10 nm, in addition to their preparation process.
[026] Em uma concretização, a presente invenção apresenta nanopartículas compreendendo: um núcleo de magnetita ou de maguemita coordenadas, diretamente ou por acoplamento, a uma camada constituída por uma ou mais moléculas bioativas, em que o diâmetro médio do núcleo das nanopartículas é menor ou igual a 10 nm e possui magnetização igual ou superior a 50 emu/g de Fe3O4; em que a percentagem em massa de Fe3O4 da referida nanopartícula é entre 50% a 90%.[026] In one embodiment, the present invention features nanoparticles comprising: a magnetite or maguemite core coordinates, directly or by coupling, to a layer consisting of one or more bioactive molecules, in which the average diameter of the core of the nanoparticles is smaller or equal to 10 nm and has a magnetization equal to or greater than 50 emu/g of Fe3O4; wherein the mass percentage of Fe3O4 of said nanoparticle is between 50% to 90%.
[027] Em um segundo aspecto, a presente invenção o uso da nanopartícula como agente de contraste em imagem por ressonância magnética.[027] In a second aspect, the present invention uses the nanoparticle as a contrast agent in magnetic resonance imaging.
[028] Em um terceiro aspecto, apresenta-se um processo de imagem por ressonância magnética que compreende a dispersão de pelo menos uma nanopartícula conforme definida acima[028] In a third aspect, a magnetic resonance imaging process is presented that comprises the dispersion of at least one nanoparticle as defined above
[029] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta formulação de nanopartículas para injeção intravenosa e imagem por ressonância magnética compreendendo a dispersão de pelo menos uma das nanopartículas da presente invenção.[029] In a fourth object, the present invention presents nanoparticle formulation for intravenous injection and magnetic resonance imaging comprising the dispersion of at least one of the nanoparticles of the present invention.
[030] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras e tabelas as quais se faz referências, conforme se segue.[030] To obtain a total and complete visualization of the object of this invention, the figures and tables are presented, to which references are made, as follows.
[031] A Figura 1A mostra representações esquemáticas de exemplos de bio-USPIOs com apenas um tipo de molécula bioativa coordenada à superfície das nanoparticulas de óxido de ferro. No centro está indicado alguns tipos possíveis de moléculas, genericamente indicadas pelo grupo coordenante e o grupo R associado, em que o grupo R pode ser qualquer grupo orgânico alquílico, arílico, mistos ou heterocíclicos, etc. Nas bordas moléculas finais exemplares.[031] Figure 1A shows schematic representations of examples of bio-USPIOs with only one type of bioactive molecule coordinated to the surface of the iron oxide nanoparticles. In the center some possible types of molecules are indicated, generically indicated by the coordinating group and the associated R group, where the R group can be any alkyl, aryl, mixed or heterocyclic organic group, etc. At the edges exemplary final molecules.
[032] A Figura 1B mostra representações esquemáticas de exemplos de bio-USPIOs com dois ou mais tipos de moléculas bioativas coordenadas à superfície das nanoparticulas de óxido de ferro.[032] Figure 1B shows schematic representations of examples of bio-USPIOs with two or more types of bioactive molecules coordinated to the surface of the iron oxide nanoparticles.
[033] A Figura 1C mostra representações esquemáticas de exemplos de bio-USPIOs com um, dois ou mais tipos de molécula bioativas ligadas a superfície das nanoparticulas de óxido de ferro, inclusive por acoplamento a moléculas bioativas previamente coordenadas a superfície das nanoparticulas de óxido de ferro.[033] Figure 1C shows schematic representations of examples of bio-USPIOs with one, two or more types of bioactive molecules attached to the surface of iron oxide nanoparticles, including by coupling to bioactive molecules previously coordinated to the surface of iron oxide nanoparticles. iron.
[034] A Figura 2 mostra a curva de magnetização da amostra obtida em um magnetômetro de amostra vibrante (VSM). Nota-se aqui que se usa uma amostra típica de bio-USPIO com PEA e a curva considera apenas a massa de magnetita contida na amostra.[034] Figure 2 shows the sample magnetization curve obtained in a vibrating sample magnetometer (VSM). Note here that a typical sample of bio-USPIO with PEA is used and the curve considers only the mass of magnetite contained in the sample.
[035] A Figura 3 mostra um difratograma de raio-X típica de amostra de bio-USPIO revestida com PEA.[035] Figure 3 shows a typical X-ray diffractogram of a PEA-coated bio-USPIO sample.
[036] A Figura 4 mostra (A) um espectro Raman do sólido obtido e (B) espectro visível/NIR da amostra dispersa em água de bio-USPIO revestida com PEA.[036] Figure 4 shows (A) a Raman spectrum of the solid obtained and (B) visible/NIR spectrum of the sample dispersed in PEA-coated bio-USPIO water.
[037] A Figura 5 mostra o espectro IV do ligante livre (acima) e da nanopartícula funcionalizada (abaixo) de bio-USPIO revestida com PEA.[037] Figure 5 shows the IR spectrum of the free ligand (above) and the functionalized nanoparticle (below) of PEA-coated bio-USPIO.
[038] A Figura 6 mostra A) Imagem de Microscopía Eletrônica de Transmissão de USPIO funcionalizadas com aminoetilfosfato; B) o histograma de distribuição de tamanho correspondente; e imagem de C) alta resolução TEM mostrando as características franjas de difração (220) correspondentes a distâncias interplanares características de nanocristais de magnetita de bio- USPIO revestida com PEA.[038] Figure 6 shows A) Transmission Electron Microscopy image of USPIO functionalized with aminoethylphosphate; B) the corresponding size distribution histogram; and C) high resolution TEM image showing the diffraction fringe characteristics (220) corresponding to interplanar distances characteristic of PEA coated bio-USPIO magnetite nanocrystals.
[039] A Figura 7 apresenta a distribuição de tamanho das nanopartículas de magnetita utilizada nas reações de pós-funcionalização, pela técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL).[039] Figure 7 shows the size distribution of magnetite nanoparticles used in post-functionalization reactions, by the Dynamic Light Scattering (EDL) technique.
[040] A Figura 8 mostra os espectros de infravermelho FT-IR das nanopartículas de magnetita pós-funcionalizadas com glucose 6-fosfato (G6P), e a distribuição de tamanhos das partículas após funcionalizaçâo, através da técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz.[040] Figure 8 shows the FT-IR infrared spectra of magnetite nanoparticles post-functionalized with glucose 6-phosphate (G6P), and the particle size distribution after functionalization, using the Dynamic Light Scattering technique.
[041] A Figura 9 apresenta os espectros de infravermelho das nanopartículas de magnetita funcionalizadas com glicose 1-fosfato (G1P), e a distribuição do tamanho das partículas em função do seu diâmetro pelo EDL.[041] Figure 9 shows the infrared spectra of magnetite nanoparticles functionalized with glucose 1-phosphate (G1P), and the particle size distribution as a function of its diameter by the EDL.
[042] A Figura 10 contém os espectros de infravermelho das nanopartículas funcionalizadas com glicose 1-fosfato e folato (mono e multifuncionalizadas) e o número de partículas em função do diâmetro pelo Espalhamento Dinâmico de Luz.[042] Figure 10 contains the infrared spectra of the nanoparticles functionalized with glucose 1-phosphate and folate (mono and multifunctionalized) and the number of particles as a function of diameter by Dynamic Light Scattering.
[043] A Figura 11 apresenta os espectros de infravermelho das nanopartículas de magnetita mistas (glicose 1-fosfato e ibuprofeno), e seu tamanho médio em função do Espalhamento de Luz Dinâmico.[043] Figure 11 shows the infrared spectra of mixed magnetite nanoparticles (glucose 1-phosphate and ibuprofen), and their average size as a function of Dynamic Light Scattering.
[044] A Figura 12 mostra os espectros de infravermelho das nanopartículas magnéticas funcionalizadas com folato e biotina (separada e simultaneamente) e histograma do diâmetro médio das nanopartículas mistas pelo Espalhamento de Luz Dinâmico.[044] Figure 12 shows the infrared spectra of the magnetic nanoparticles functionalized with folate and biotin (separately and simultaneously) and histogram of the average diameter of the mixed nanoparticles by Dynamic Light Scattering.
[045] A Figura 13 mostra A) típica série de imagens de ressonância magnética de um rato Wistar macho após a administração intravenosa de 50 mg/kg de bio-USPIO, destacando a variação da densidade dos pixels brancos nos rins, indicados por círculos amarelos. A imagem da esquerda foi tirada amarelos. A imagem da esquerda foi tirada antes da injeção de USPIO (controle), e, em seguida, depois de 2, 4 e 24 horas após a injeção. A cabeça do rato está apontando para cima. B) Média de densidade normalizada de pixels brancos de quatro verificações subsequentes dos rins em função do tempo após administração intravenosa de 50 mg/kg de bio-USPIOs (concentração é inversamente proporcional à densidade de pixels brancos em sinais de ressonância magnética).[045] Figure 13 shows A) typical series of MRI images of a male Wistar rat after intravenous administration of 50 mg/kg of bio-USPIO, highlighting the variation in the density of white pixels in the kidneys, indicated by yellow circles . The image on the left was taken in yellow. The left image was taken before USPIO injection (control), and then after 2, 4, and 24 hours after injection. The mouse's head is pointing up. B) Density normalized mean of white pixels from four subsequent scans of the kidneys as a function of time after intravenous administration of 50 mg/kg of bio-USPIOs (concentration is inversely proportional to the density of white pixels in MRI signals).
[046] A Figura 14 mostra uma típica série de imagens de ressonância magnética de um rato Wistar macho tratado com 50 mg/kg de bio-USPIOs como uma função de tempo a partir de zero até 140 dias após a administração IV, destacando o contraste no fígado e baço. O contraste negativo na coxa esquerda é devido à acumulação de bio-USPIOs induzida por um ímã afixado neste local 2 horas após a injeção IV, melhor descrito adiante. O fígado e o baço são indicadas por um retângulo amarelo; e um circulo azul indica o contraste negativo na coxa.[046] Figure 14 shows a typical series of MRI images of a male Wistar rat treated with 50 mg/kg of bio-USPIOs as a function of time from zero to 140 days after IV administration, highlighting the contrast. in the liver and spleen. The negative contrast in the left thigh is due to the accumulation of bio-USPIOs induced by a magnet affixed to this
[047] A Figura 15 mostra uma típica série de imagens de ressonância magnética de um rato Wistar macho tratado com 10 mg/kg de bio-USPIOs como uma função de tempo a partir de zero até 28 dias após a administração IV, destacando o contraste no fígado e baço. O fígado e o baço estão indicados por um retângulo amarelo; e os círculos amarelo indicam os rins As imagens em A) correspondem ao grupo controle (sem magneto) e em B) ao grupo experimental (com magneto).[047] Figure 15 shows a typical series of MRI images of a male Wistar rat treated with 10 mg/kg of bio-USPIOs as a function of time from zero to 28 days after IV administration, highlighting the contrast. in the liver and spleen. The liver and spleen are indicated by a yellow rectangle; and the yellow circles indicate the kidneys. Images in A) correspond to the control group (without magnet) and in B) to the experimental group (with magnet).
[048] A Figura 16 mostra uma série típica de imagens de ressonância magnética de um rato Wistar tratado com 50 mg/kg de bio-USPIO em função do tempo a partir de zero até 140 dias após a injeção IV, confirmando a acumulação de bio-USPIO na coxa esquerda induzida por um ímã colocado no local durante 2 horas (circulo azul). O contraste negativo mostrado na coxa direita (círculo amarelo) é devido a subsequente administração intramuscular de 15 mg/kg de bio-USPIO.[048] Figure 16 shows a typical series of MRI images of a Wistar rat treated with 50 mg/kg of bio-USPIO as a function of time from zero to 140 days after IV injection, confirming the accumulation of bio -USPIO in the left thigh induced by a magnet placed in place for 2 hours (blue circle). The negative contrast shown in the right thigh (yellow circle) is due to subsequent intramuscular administration of 15 mg/kg of bio-USPIO.
[049] A Figura 17 mostra o número de leucócitos (A), linfócitos (B), e neutrófilos (C) presente em 1 mm3 de sangue antes da administração IV (zero), e em função do tempo até 28 dias após a administração intravenosa de 10 mg/kg de bio-USPIO em ratos Wistar machos (n = 3). Os controles são solução salina (n = 3) e veiculo da solução (n - 3) (10 mM de tampão acetato pH 4,5). Não houve diferença estatística significativa entre os grupos.[049] Figure 17 shows the number of leukocytes (A), lymphocytes (B), and neutrophils (C) present in 1 mm3 of blood before IV administration (zero), and as a function of time up to 28 days after administration. intravenous injection of 10 mg/kg of bio-USPIO in male Wistar rats (n = 3). Controls are saline (n = 3) and solution vehicle (n - 3) (10 mM acetate buffer pH 4.5). There was no statistically significant difference between the groups.
[050] A Figura 18 mostra a dosagem de enzimas hepáticas (ALT e AST em U/L) no sangue, ureia, creatinina do plasma (em mg/dL) e da urina de ratos Wistar machos tratados com 10 mg/kg de bio-USPIO em função do tempo, até 28 dias após a injeção IV. Um magneto foi posto (experimental) ou não (controle) externamente à coxa esquerda de um grupo de ratos (n = 3) durante 2 h. Os controles são solução salina (n = 3) e veículo da solução (n = 3) (10 mM de tampão acetato pH 4,5). * P <0,05 e ** P <0,001 versus tratamento salina respectiva.[050] Figure 18 shows the measurement of liver enzymes (ALT and AST in U/L) in blood, urea, plasma creatinine (in mg/dL) and urine of male Wistar rats treated with 10 mg/kg of bio -USPIO as a function of time, up to 28 days after IV injection. A magnet was placed (experimental) or not (control) externally to the left thigh of a group of rats (n = 3) for 2 h. Controls are saline (n = 3) and vehicle solution (n = 3) (10 mM acetate buffer pH 4.5). * P < 0.05 and ** P < 0.001 versus respective saline treatment.
[051] A Figura 19 apresenta A) Imagens de microscopia intravital de fluorescência que mostra o número de leucócitos (marcados com rodamina 6G) aderidos aos sinusoides hepáticos 3 horas após a injeção intravenosa (1 mL, dose única) de solução salina (controle, imagem acima) e de 10 mg/kg da suspensão de bio-USPIO (experimental, imagem abaixo). B) O número médio de leucócitos aderidos em segmentos de 100 mm de paredes sinusoidais considerando pelo menos cinco sinusoides por rato. As setas brancas indicam leucócitos aderidos. A barra indica um comprimento da extensão de 100 μm.[051] Figure 19 presents A) Intravital fluorescence microscopy images showing the number of leukocytes (labeled with 6G rhodamine) adhering to hepatic sinusoids 3 hours after intravenous injection (1 mL, single dose) of saline (control, above image) and 10 mg/kg of the bio-USPIO suspension (experimental, below image). B) The average number of leukocytes adhered to 100 mm segments of sinusoidal walls considering at least five sinusoids per rat. White arrows indicate adherent leukocytes. The bar indicates an extension length of 100 μm.
[052] A Figura 20 mostra a concentração de ferro ([Fe] μg.L'1) determinada pelo GF-AAS na urina de ratos (n = 3) em função do tempo após a injeção intravenosa de 10 mg/kg de bio-USPIO. O grupo experimental (n = 3) refere-se àquele onde um magneto foi posto externamente à coxa esquerda do animal durante 2 horas, a fim de concentrar as nanoparticulas de magnetita, enquanto o grupo controle refere-se àquele que não o fez.[052] Figure 20 shows the iron concentration ([Fe] μg.L'1) determined by GF-AAS in the urine of rats (n = 3) as a function of time after intravenous injection of 10 mg/kg of bio -USPIO. The experimental group (n = 3) refers to the one where a magnet was placed externally to the animal's left thigh for 2 hours in order to concentrate the magnetite nanoparticles, while the control group refers to the one that did not.
[053] A Figura 21 apresenta o efeito de bio-USPIO sobre a interação leucócito-endotélio na microcirculação do mesentério de ratos Wistar machos por microscopia intravital. O número de (A) rolamentos, (B) aderência e (C) migração leucocitária antes e 30-120 min após a administração IV estão indicados. (D) Diâmetro venular (μm) medido sob as mesmas condições e tempo. Média obtida de 4 a 7 animais em cada grupo. Nenhuma diferença significativa foi observada.[053] Figure 21 shows the effect of bio-USPIO on the leukocyte-endothelium interaction in the mesentery microcirculation of male Wistar rats by intravital microscopy. The number of (A) rolls, (B) adhesion, and (C) leukocyte migration before and 30-120 min after IV administration are indicated. (D) Venular diameter (μm) measured under the same conditions and time. Average obtained from 4 to 7 animals in each group. No significant differences were observed.
[054] A presente invenção faz referência a um produto nanomagnético que apresenta propriedades surpreendentes como agentes de contraste em diagnóstico por imagem por ressonância magnética (IRM).[054] The present invention refers to a nanomagnetic product that has surprising properties as contrast agents in diagnostic magnetic resonance imaging (MRI).
[055] É demonstrado que nanopartículas superparamagnéticas de magnetita ultrapequenas, revestidas com moléculas bioativas (bio-USPIO), não-tóxicas e dispersáveis em meio aquoso, atuam como agente de contraste em IRM, sem causar os efeitos colaterais indesejados como atualmente acontece. Além disso, foi demonstrada a possibilidade de acumulá-las magneticamente em região de interesse diagnóstico ou terapêutico.[055] It is demonstrated that ultra-small magnetite superparamagnetic nanoparticles, coated with bioactive molecules (bio-USPIO), non-toxic and dispersible in aqueous media, act as a contrast agent in MRI, without causing the unwanted side effects as currently happens. In addition, the possibility of magnetically accumulating them in a region of diagnostic or therapeutic interest was demonstrated.
[056] As nanopartículas de magnetita foram preparadas pelo método de termodecomposição em solvente de alta temperatura de ebulição partindo-se de um sal de ferro (III) e ligantes. Durante a ebulição, notou-se mudança da coloração da solução de alaranjado para preto, sendo o primeiro característico do complexo de ferro e o segundo da suspensão de nanopartículas formadas. Apesar do aspecto de solução, ao aproximar um ímã, claramente pode-se perceber a magnetização e atração do liquido resultante, indicando a formação de nanopartículas de magnetita funcionalizadas e dispersas, gerando fluídos magnéticos. Em uma concretização, as nanopartículas estão recobertas por moléculas tais como aminoetilfosfato, dopamina, glicose-fosfato, ácido fólico, ibuprofeno e biotina, sendo prontamente dispersáveis em água desionizada. Tampão acetato 10 mM, pH 4, ou água foram utilizados como meio para a preparação das dispersões de nanopartículas nos experimentos[056] The magnetite nanoparticles were prepared by the thermodecomposition method in a high boiling solvent starting from an iron (III) salt and ligands. During boiling, the color of the solution changed from orange to black, the first being characteristic of the iron complex and the second of the suspension of formed nanoparticles. Despite the solution aspect, when approaching a magnet, one can clearly perceive the magnetization and attraction of the resulting liquid, indicating the formation of functionalized and dispersed magnetite nanoparticles, generating magnetic fluids. In one embodiment, the nanoparticles are coated with molecules such as aminoethylphosphate, dopamine, glucose-phosphate, folic acid, ibuprofen and biotin and are readily dispersible in deionized water.
[057] Em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta nanopartículas compreendendo: um núcleo de magnetita ou de maguemita coordenadas, diretamente ou por acoplamento, a uma camada constituída por uma ou mais moléculas bioativas, em que o diâmetro médio do núcleo das nanopartículas é menor ou igual a 10 nm e possui magnetização igual ou superior a 50 emu/g de Fe3O4; em que a percentagem em massa de Fe3O4 da referida nanopartícula é entre 50% a 90%.[057] In a first aspect, the present invention presents nanoparticles comprising: a core of magnetite or maguemite coordinates, directly or by coupling, to a layer consisting of one or more bioactive molecules, in which the average diameter of the core of the nanoparticles is less than or equal to 10 nm and has a magnetization equal to or greater than 50 emu/g of Fe3O4; wherein the mass percentage of Fe3O4 of said nanoparticle is between 50% to 90%.
[058] Em uma concretização da nanopartícula, uma ou mais moléculas bioativas estão coordenadas diretamente à superfície formando uma camada molecular; ou uma ou mais moléculas bioativas estão ligadas/acopladas a uma camada de moléculas já previamente coordenada a superfície.[058] In an embodiment of the nanoparticle, one or more bioactive molecules are directly coordinated to the surface forming a molecular layer; or one or more bioactive molecules are bound/coupled to a layer of molecules already previously coordinated to the surface.
[059] Em uma concretização da nanopartícula, a camada molecular constituída por uma ou mais moléculas bioativas forma uma monocamada[059] In an embodiment of the nanoparticle, the molecular layer consisting of one or more bioactive molecules forms a monolayer
[060] Em uma concretização da nanopartícula, a monocamada sobre a superfície do núcleo magnético compreende pelo menos um grupo catiônico.[060] In one embodiment of the nanoparticle, the monolayer on the surface of the magnetic core comprises at least one cationic group.
[061] Em uma concretização da nanopartícula, o grupo catiônico é composto de grupo amina. Em uma concretização, o grupo amina é uma alquilamina selecionada do grupo consistindo de etilamina, aminopropil, aminoetilfosfato e dopamina.[061] In an embodiment of the nanoparticle, the cationic group is composed of an amine group. In one embodiment, the amine group is an alkylamine selected from the group consisting of ethylamine, aminopropyl, aminoethylphosphate and dopamine.
[062] Em uma concretização da nanopartícula, as moléculas bioativas são selecionadas de pelo menos uma dentre o grupo constituído por biotina, glicose 1-fosfato, glicose 6-fosfato, ácido fólico, dopamina e ibuprofeno.[062] In an embodiment of the nanoparticle, the bioactive molecules are selected from at least one of the group consisting of biotin, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, folic acid, dopamine and ibuprofen.
[063] Em uma concretização da nanopartícula, as moléculas bioativas estão ligadas à superfície por reação de acoplamento formando ligações amida, éster, éter, coordenativa ou eletrostática, formando uma monocamada sobre a superfície do núcleo das nanopartículas de magnetita e/ou maguemita.[063] In an embodiment of the nanoparticle, the bioactive molecules are linked to the surface by coupling reaction forming amide, ester, ether, coordinative or electrostatic bonds, forming a monolayer on the surface of the magnetite and/or maghemite nanoparticles core.
[064] Em uma concretização, as nanopartículas podem ser isoladas como sólidos e redispersas em água.[064] In one embodiment, the nanoparticles can be isolated as solids and redispersed in water.
[065] Em uma concretização, as nanopartículas são obtidas a partir de processo que compreende as etapas de: a) preparação da nanomagnetita ou maguemita, b) purificação das nanoparticulas, c) produção das bio-USPIO por funcionalização direta da superfície por troca das moléculas estabilizantes por moléculas bioativas; ou d) produção das bio-USPIO por reações de acoplamento de nanoparticulas de magnetita funcionalizadas com grupos amina (NMag@PEA e NMag@DOPA) com moléculas bioativas.[065] In one embodiment, the nanoparticles are obtained from a process that comprises the steps of: a) preparation of nanomagnetite or maguemite, b) purification of nanoparticles, c) production of bio-USPIO by direct functionalization of the surface by exchange of stabilizing molecules by bioactive molecules; or d) production of bio-USPIOs by coupling reactions of magnetite nanoparticles functionalized with amine groups (NMag@PEA and NMag@DOPA) with bioactive molecules.
[066] Em um segundo aspecto, a presente invenção o uso da nanopartícula como agente de contraste em imagem por ressonância magnética.[066] In a second aspect, the present invention uses the nanoparticle as a contrast agent in magnetic resonance imaging.
[067] Em concretização, o uso compreende pelo menos uma etapa de dispersão de pelo menos uma nanopartícula, em que a dita dispersão compreende uma concentração de 0,01 a 2,0 mg da nanopartícula por Kg de peso corpóreo de um indivíduo a ser analisado.[067] In one embodiment, the use comprises at least one step of dispersing at least one nanoparticle, wherein said dispersion comprises a concentration of 0.01 to 2.0 mg of the nanoparticle per kg of body weight of a subject to be analyzed.
[068] Em uma concretização, o uso compreende adicionalmente uma etapa de alocação de uma fonte de campo magnético próxima a uma região alvo para concentrar as nanoparticulas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo moléculas de uso terapêutico adsorvido, dissolvido, aderido e/ou ligado em sua superfície numa região alvo, veiculando as referidas substâncias no local desejado.[068] In one embodiment, the use further comprises a step of allocating a source of magnetic field close to a target region to concentrate the nanoparticles as defined in any one of
[069] Em um terceiro objeto, apresenta-se um processo de imagem por ressonância magnética que compreende a dispersão de pelo menos uma nanopartícula conforme definida acima.[069] In a third object, a magnetic resonance imaging process is presented that comprises the dispersion of at least one nanoparticle as defined above.
[070] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de demonstrar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo, sem limitar o escopo da mesma.[070] The examples shown here are intended only to demonstrate one of the numerous ways to carry out the invention, however, without limiting its scope.
[071] EXEMPLO 1: As nanoparticulas de magnetita foram obtidas pela termodecomposição de complexo de ferro (III) com sais de ácidos carboxílicos, incluindo ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico, em solvente de alto ponto de ebulição, na faixa de 250 a 350 °C, incluindo biodiesel, óleo mineral, parafina, polióis, octadeceno, difeniléter de alto ponto de ebulição. O complexo de ferro foi preparado pela reação de um sal de ferro (III), tipicamente cloreto férrico, com sais de ácidos carboxílicos num solvente ou mistura adequada de solventes. A solução contendo o precursor férrico foi aquecida, na faixa de 150 a 350 °C, entre 30 min a 6 horas. As nanopartículas foram isoladas por precipitação, após esfriamento e separadas por filtração e redispersas no solvente apropriado, gerando nanofluidos com partículas na faixa de 3 a 40 nm. Tipicamente, as partículas de magnetita foram funcionalizadas redispersando- as em um solvente ou mistura de solventes adequada, e reagindo-se com as moléculas bioativas de interesse, seguido da purificação por processos de precipitação e lavagem com o mesmo solvente. As curvas típicas de magnetização, dífratograma de raio-X do pó e espectro Raman e de infravermelho próximo são mostradas nas Figuras 2, 3 e 4, respectivamente[071] EXAMPLE 1: Magnetite nanoparticles were obtained by thermodecomposition of iron (III) complex with carboxylic acid salts, including oleic acid, stearic acid, palmitic acid, in a high boiling solvent, in the range of 250 to 350 °C, including biodiesel, mineral oil, paraffin, polyols, octadecene, high boiling diphenyl ether. The iron complex was prepared by reacting an iron(III) salt, typically ferric chloride, with carboxylic acid salts in a suitable solvent or mixture of solvents. The solution containing the ferric precursor was heated, in the range of 150 to 350 °C, between 30 min to 6 hours. The nanoparticles were isolated by precipitation, after cooling and separated by filtration and redispersed in the appropriate solvent, generating nanofluids with particles in the range of 3 to 40 nm. Typically, magnetite particles were functionalized by redispersing them in a suitable solvent or solvent mixture, and reacting with the bioactive molecules of interest, followed by purification by precipitation and washing processes with the same solvent. Typical magnetization curves, powder X-ray diffractogram, Raman and near-infrared spectrum are shown in Figures 2, 3 and 4, respectively.
[072] EXEMPLO 2: A bio-USPIO tendo aminoetilfosfato como molécula bioativa diretamente ligada à superfície foi preparada por reação de pós- funcionalização, partindo de dispersão de nanopartículas com diâmetro médio do núcleo de magnetita de 5,6 nm, preparada pelo método de decomposição térmica descrito no Exemplo 1. No método de pós-funcionalização, tipicamente, o ferrofluido de nanopartículas de magnetita estabilizado em poliol, foi purificado por precipitação e lavagem com tetrahidrofurano e/ou mistura de tetrahidrofurano:água, seguida de centrifugação a 15000 rpm por cinco a dez minutos, ou por precipitação magnética. O processo de ressuspensão e lavagem com tetrahidrofurano foi repetido pelo menos quatro vezes. Às nanopartículas lavadas, foi adicionada solução aquosa das moléculas bioativas, com concentração 10 a 10000 vezes maior que a de nanopartículas de magnetita ultrapequenas dispersas em água. A solução foi mantida sob agitação num vórtex ou shaker, a 25 °C, por cinco minutos a 24 horas, preferencialmente por dez a sessenta minutos. Em seguida, o excesso de molécula bioativa foi removido por precipitação/lavagem com mistura tetrahidrofurano/água (1:100 a 100:1), ressuspendendo-se as nanopartículas em água e repetindo a operação pelo menos mais três vezes. Finalmente, o bio-USPIO preparado foi separado e seco em dessecador sob vácuo. Outros solventes ou misturas de solventes podem ser utilizados em função das propriedades de solubilidade das biomoléculas empregadas. O espectro de infravermelho e imagem de microscopia eletrônica de transmissão da bio- USPIO são mostrados na Figura 5 e 6, respectivamente.[072] EXAMPLE 2: The bio-USPIO having aminoethylphosphate as a bioactive molecule directly bound to the surface was prepared by post-functionalization reaction, starting from the dispersion of nanoparticles with an average magnetite core diameter of 5.6 nm, prepared by the method of thermal decomposition described in Example 1. In the post-functionalization method, typically, polyol stabilized magnetite nanoparticle ferrofluid was purified by precipitation and washing with tetrahydrofuran and/or tetrahydrofuran:water mixture, followed by centrifugation at 15,000 rpm for five to ten minutes, or by magnetic precipitation. The resuspension and tetrahydrofuran washing process was repeated at least four times. An aqueous solution of the bioactive molecules was added to the washed nanoparticles, with a
[073] EXEMPLO 3: Numa realização da presente invenção foram preparados bio-USPIO com glicose 1-fosfato (G1P) e glicose 6-fosfato (G6P), cujos espectros infravermelho (IV) comparativos da nanopartícula magnética inicial (NMag), da glicose 1-fosfato e da NMag@G1P e NMag@G6P, além dos respectivos histogramas de distribuição de tamanho das dispersões em água das nanopartículas, antes e após a funcionalização com G1P e G6P, são mostradas nas Figura 7 e Figura 8. A pequena alteração ou ausência de alteração no perfil do histograma após funcionalização das NMag com G1P e G6P, indica a ausência de agregação em água A presença das moléculas de glicose na superfície da NMag foi confirmado pelos espectros infravermelho das nanopartículas funcionalizadas (NMag@G6P e NMag@G1P) onde os modos vibracionais do fosfato da G1P e G6P aparecem na região compreendida entre 900 e 1300 cm'1, bem como os picos referentes aos grupos hidroxila da glicose em torno de 3500 cm*1. As nanopartículas cobertas com glicose 1-fosfato ou glicose 6-fosfato apresentam boa dispersão em água mesmo quando armazenadas secas durante meses. De fato, as medidas de Espalhamento Dinâmico de Luz, EDL, (Figura 7) foram realizadas com amostra de NMag@G1P estocada por quatro meses na forma sólida. O pó foi redisperso em água uma hora antes da análise. As medidas de Espalhamento Dinâmico de Luz (Figura 8) foram realizadas com amostra de NMag@G6P estocada por dez meses na forma sólida. Mesmo assim, nota-se apenas um pequeno aumento de tamanho médio das nanopartículas, sem alteração significativa no perfil de distribuição do tamanho das partículas. A pequena variação do raio hidrodinâmico das nanopartículas indica ausência de agregação das nanoparticulas.[073] EXAMPLE 3: In one embodiment of the present invention bio-USPIO was prepared with glucose 1-phosphate (G1P) and glucose 6-phosphate (G6P), whose comparative infrared (IR) spectra of the initial magnetic nanoparticle (NMag), of glucose 1-phosphate and NMag@G1P and NMag@G6P, in addition to the respective size distribution histograms of the water dispersions of the nanoparticles, before and after functionalization with G1P and G6P, are shown in Figure 7 and Figure 8. The small change or absence of change in the histogram profile after NMag functionalization with G1P and G6P, indicates the absence of aggregation in water The presence of glucose molecules on the NMag surface was confirmed by the infrared spectra of the functionalized nanoparticles (NMag@G6P and NMag@G1P ) where the vibrational modes of the phosphate of G1P and G6P appear in the region between 900 and 1300 cm'1, as well as the peaks referring to the hydroxyl groups of glucose around 3500 cm*1. Nanoparticles coated with glucose 1-phosphate or glucose 6-phosphate show good dispersion in water even when stored dry for months. In fact, Dynamic Light Scattering, EDL, measurements (Figure 7) were performed with a sample of NMag@G1P stored for four months in solid form. The powder was redispersed in water one hour before analysis. Dynamic Light Scattering measurements (Figure 8) were performed with a sample of NMag@G6P stored for ten months in solid form. Even so, there is only a small increase in the average size of the nanoparticles, with no significant change in the particle size distribution profile. The small variation of the hydrodynamic radius of the nanoparticles indicates the absence of aggregation of the nanoparticles.
[074] EXEMPLO 4: Numa realização da presente invenção foram preparados bio-USPIO com biotina, aminoetilfosfato (PEA) e dopamina (Dopa), que foram caracterizados como no Exemplo 3 por EDL e IV, além de outras técnicas. Os resultados típicos para NMag@PEA são discutidos abaixo.[074] EXAMPLE 4: In one embodiment of the present invention bio-USPIO was prepared with biotin, aminoethyl phosphate (PEA) and dopamine (Dopa), which were characterized as in Example 3 by EDL and IV, in addition to other techniques. Typical results for NMag@PEA are discussed below.
[075] A Figura 3 mostra os padrões de difração de raio-X obtidos a partir da amostra sólida. Todos os picos podem ser correlacionados e indexados com os picos de difração da estrutura cristalina cúbica de face centrada da magnetita, pertencente ao grupo de simetria Fd3m. O pico em 37,4 graus atribuído à faceta 222 encontra-se sobreposto ao pico em 35,7 graus. De fato, este pico possui a menor intensidade na magnetita, cerca de 8%, e sua sobreposição é favorecida pelo alargamento dos picos de difração do nanomaterial, devido ao pequeno tamanho dos cristalitos.[075] Figure 3 shows the X-ray diffraction patterns obtained from the solid sample. All peaks can be correlated and indexed with the diffraction peaks of the face-centered cubic crystal structure of magnetite, belonging to the Fd3m symmetry group. The peak at 37.4 degrees assigned to facet 222 is superimposed on the peak at 35.7 degrees. In fact, this peak has the lowest intensity in magnetite, about 8%, and its overlap is favored by the broadening of the diffraction peaks of the nanomaterial, due to the small size of the crystallites.
[076] Os tamanhos das nanoparticulas também podem ser estimados através do alargamento dos picos de difração no difratograma através da equação de Debye-Scherrer. O diâmetro médio obtido pelo ajuste dos picos no difratograma da figura 3 foi de 6,60 ± 0,92 nm.[076] The sizes of nanoparticles can also be estimated by broadening the diffraction peaks in the diffractogram using the Debye-Scherrer equation. The mean diameter obtained by adjusting the peaks in the diffractogram of figure 3 was 6.60 ± 0.92 nm.
[077] A Figura 4(A) mostra o espectro Raman obtido a partir da amostra sólida. O espectro mostra a presença de 3 picos principais em 668, 538 e 306 cm'1 atribuídos as bandas Afg, T2g e Egda magnetita.[077] Figure 4(A) shows the Raman spectrum obtained from the solid sample. The spectrum shows the presence of 3 main peaks at 668, 538 and 306 cm -1 assigned to the Afg, T2g and Egda magnetite bands.
[078] A Figura 4(B) mostra o espectro eletrônico Vis/NIR da amostra de nanomagnetita dispersa em água. Pode-se observar um comportamento típico de espalhamento de nanoparticulas em dispersão coloidal no espectro da Figura 4(B) com um maior espalhamento na região de menor comprimento de onda que diminui bruscamente em função do comprimento de onda. Na região de menor energia observa-se a presença de uma banda alargada, que estende-se a partir de 700 nm até valores acima de 1400 nm. Essa banda é atribuída a transição de transferência de carga de intervalência entre os sítios de Fe2+ e Fe3+ adjacentes na magnetita, estando ausente nos demais óxidos como a maguemita e a hematita.[078] Figure 4(B) shows the Vis/NIR electronic spectrum of the nanomagnetite sample dispersed in water. A typical scattering behavior of nanoparticles in colloidal dispersion can be observed in the spectrum of Figure 4(B) with a greater scattering in the region of shorter wavelength that decreases sharply as a function of the wavelength. In the lower energy region, a broad band is observed, which extends from 700 nm to values above 1400 nm. This band is attributed to the interval charge transfer transition between the adjacent Fe2+ and Fe3+ sites in magnetite, being absent in other oxides such as maguemite and hematite.
[079] A Figura 5 mostra os espectros de infravermelho da molécula de aminoetilfosfato e da nanomagnetita funcionalizada com a molécula. O espectro vibracional da amostra do nanomaterial é caracterizado pela presença de bandas intensas na região de 1300 a 900 cm-1 atribuídos aos modos de estiramento das ligações P-0 presentes no aminoetilfosfato. Estas bandas encontram-se bastante deslocadas em relação as da molécula livre indicando sua participação no modo de ligação das moléculas de aminoetilfosfato na superfície do óxido. A banda em 584 cm’1 é característica do estiramento Fe-0 da magnetita e atribuída ao modo vibracional T1u. As bandas alargadas na região de 3500 a 2500 cm'1 são atribuídas ao estiramento das ligações O-H e N-H, presentes na superfície do óxido e na molécula de aminoetilfosfato, respectivamente.[079] Figure 5 shows the infrared spectra of the aminoethylphosphate molecule and the nanomagnetite functionalized with the molecule. The vibrational spectrum of the nanomaterial sample is characterized by the presence of intense bands in the region from 1300 to 900 cm-1, attributed to the stretching modes of the P-0 bonds present in the aminoethylphosphate. These bands are quite displaced in relation to those of the free molecule, indicating their participation in the binding mode of aminoethylphosphate molecules on the oxide surface. The band at 584 cm'1 is characteristic of the Fe-0 stretching of magnetite and attributed to the T1u vibrational mode. The broad bands in the region from 3500 to 2500 cm -1 are attributed to the stretching of the O-H and N-H bonds, present on the oxide surface and in the aminoethylphosphate molecule, respectively.
[080] A amostra da nanomagnetita funcionalizada foi submetida à análise elementar, análise por fluorescência de raio-X por energia dispersiva (EDX) e espectroscopia de emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-OES). Os resultados de microanálise no nanomaterial revelou a presença de 5,18%C, 2,21% H e 1,74%N. Considerando que a presença de Carbono e Nitrogênio são devido à molécula funcionalizante de fórmula C2H8O4NP ligada à superfície das nanopartículas, foi calculado a composição percentual de 79% de Fβ3θ4 e 21% de C2H8O4NP. O resultado de EDX é consistente com uma proporção de Fe (proveniente apenas do núcleo da nanopartícula) e P (proveniente apenas da camada protetora molecular, camada de funcionalização) compatível com a composição percentual de 86% de Fe3O4 e 14% de C2H8O4NP O resultado de ICP-OES revelou a presença de 58,9 g de Fe por 100 g do nanomaterial que corresponde a uma composição percentual de 81% de Fe3O4 e 19% de C2H8O4NP.[080] The functionalized nanomagnetite sample was subjected to elemental analysis, energy dispersive X-ray fluorescence analysis (EDX) and inductively coupled plasma source optical emission spectroscopy (ICP-OES). The results of microanalysis on the nanomaterial revealed the presence of 5.18%C, 2.21% H and 1.74%N. Considering that the presence of Carbon and Nitrogen are due to the functionalizing molecule of formula C2H8O4NP bound to the surface of the nanoparticles, the percentage composition of 79% of Fβ3θ4 and 21% of C2H8O4NP was calculated. The EDX result is consistent with a proportion of Fe (from the nanoparticle core only) and P (from the molecular protective layer, functionalization layer only) compatible with the percentage composition of 86% Fe3O4 and 14% C2H8O4NP. of ICP-OES revealed the presence of 58.9 g of Fe per 100 g of the nanomaterial, which corresponds to a percentage composition of 81% Fe3O4 and 19% C2H8O4NP.
[081] Os tamanhos médios das nanopartículas foram avaliados por microscopia eletrônica de transmissão. Os histogramas de distribuição de tamanhos (Figura 6) revelam a presença de partículas arredondadas com diâmetro médio de 6,1 nm (amina) e distribuição estreita de tamanhos.[081] The average sizes of the nanoparticles were evaluated by transmission electron microscopy. The size distribution histograms (Figure 6) reveal the presence of rounded particles with a mean diameter of 6.1 nm (amine) and a narrow size distribution.
[082] As imagens TEM também revelam o elevado grau de cristalinidade das nanopartículas por meio da presença de franjas de difração, mesmo muito próximo às bordas das nanopartículas que se encontram em foco. Essa característica é responsável peia elevada magnetização de cerca de 60 emu/g observado para amostras de nanopartículas de magnetita funcionalizadas com grupos aminopropil na forma sólida.[082] The TEM images also reveal the high degree of crystallinity of the nanoparticles through the presence of diffraction fringes, even very close to the edges of the nanoparticles that are in focus. This characteristic is responsible for the high magnetization of about 60 emu/g observed for samples of magnetite nanoparticles functionalized with aminopropyl groups in solid form.
[083] EXEMPLO 5: Procedimento análogo ao descrito nos Exemplos 2 e 3 foi utilizado para funcionalização das nanopartículas de magnetita com mais de um tipo de molécula ligada diretamente na superfície das mesmas Nesse processo, tipicamente, o ferrofluido de nanopartículas de magnetita estabilizado em poliol, preparado segundo o Exemplo 1, foi purificado por precipitação e lavagem com tetrahidrofurano, seguida de centrifugação a 15000 rpm por cinco a dez minutos. O processo de ressuspensão e lavagem com tetrahidrofurano foi repetido pelo menos quatro vezes. Às nanopartículas lavadas, foram adicionados misturas de solução aquosa das moléculas bioativas, na faixa de pH de 4 a 10, com concentração 10 a 10000 vezes maior que a de nanopartículas de magnetita ultrapequenas dispersas em água. A mistura foi mantida sob agitação num vórtex ou shaker, a 25 °C, por cinco minutos a 24 horas, preferencialmente por dez a sessenta minutos. Em seguida, o excesso de moléculas bioativas foi removido por precipitação/lavagem com mistura tetrahidrofurano/água (1:100 a 100:1), ressuspendendo as nanopartículas em água e repetindo a operação pelo menos mais três vezes. Finalmente, o bio- USPIO preparado foi separado e seco em dessecador sob vácuo. Outros solventes ou misturas de solventes podem ser utilizados em função das propriedades de solubilidade das biomoléculas empregadas. As Figuras 7, 8 e 9 mostram os resultados de EDL e infravermelho de realizações de nanopartículas funcionalizadas com diferentes moléculas bioativas.[083] EXAMPLE 5: A procedure similar to that described in Examples 2 and 3 was used for the functionalization of magnetite nanoparticles with more than one type of molecule bound directly to their surface. In this process, typically, the ferrofluid of magnetite nanoparticles stabilized in polyol , prepared according to Example 1, was purified by precipitation and washing with tetrahydrofuran, followed by centrifugation at 15,000 rpm for five to ten minutes. The resuspension and tetrahydrofuran washing process was repeated at least four times. To the washed nanoparticles, aqueous solution mixtures of the bioactive molecules were added, in the pH range from 4 to 10, with a
[084] EXEMPLO 6: 10 a 50 mg de nanopartículas purificadas e secas foram redispersas em 100 a 500 μL de água, e reagidas com uma solução aquosa contendo mistura de glicose 1-fosfato e ácido fólico, pH 7 a 10 e excesso estequiométríco de 2000 a 5000 vezes em relação às nanoparticulas de magnetita. A proporção de folato/glicose-1-fosfato foi variada de 1:1 a 1:400. A solução foi mantida sob agitação usando vórtex ou shaker, a 25 °C, por um minuto a seis horas, as bio-USPIO lavadas com THF/água e secas no dessecador sob vácuo. A Figura 10 mostra o espectro de infravermelho e o número de nanoparticulas em função do diâmetro de nanoparticulas contendo glicose 1-fosfato e ácido fólico em sua superfície, onde pode-se observar os modos vibracionais do fosfato da glicose-1-fosfato na região compreendida entre 900 e 1300 cm’1, e os modos vibracionais do ácido fólico, caracterizado principalmente pelo seu pico em 1670, referente aos grupos carboxilatos. Para análise por Espalhamento Dinâmico de Luz (Figura 10), foi preparada uma dispersão, em água, de nanoparticulas que foram secas a vácuo em dessecador logo após reação de pós-funcionalização e guardadas, após a secagem, durante dez meses. Nota-se, pelo Espalhamento Dinâmico de Luz, baixa variação do diâmetro médio das nanoparticulas após a reação, comparado ao EDL antes da reação, o que indica boa dispersão e baixo índice de agregação das mesmas em água.[084] EXAMPLE 6: 10 to 50 mg of purified and dried nanoparticles were redispersed in 100 to 500 μL of water, and reacted with an aqueous solution containing a mixture of glucose 1-phosphate and folic acid,
[085] EXEMPLO 7: Outro exemplo de bio-USPIO funcionalizada com duas moléculas bioativas por reação direta foi realizada com glicose 1-fosfato e ibuprofeno (IBU) A glicose 1-fosfato auxilia na dispersão das nanoparticulas em água, uma vez que o grupo aromático do ibuprofeno eleva a hidrofobicidade e diminui a dispersabilidade desses nanomateriais. Para a reação, 10 a 50 mg de nanoparticulas purificadas e secas foram redispersas em 100 μL a 500 pL de água. As nanoparticulas foram bifuncionalizadas reagindo com solução contendo a mistura das moléculas bioativas na proporção de 100:1 a 1:100 (glicose 1-fosfato:ibruprofenato de sódio), mantendo-se um excesso estequiométríco de 2000 vezes em relação ao número de nanoparticulas de magnetita. A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 25 °C, por dez minutos a seis horas. Em seguida, as nanoparticulas foram purificadas por precipitação/lavagem, secas em dessecador a vácuo e armazenadas. O resultado da análise EDL numa dispersão em água, após dois meses de armazenamento é mostrado na Figura 11. Na Figura 11 também é mostrado o espectro de infravermelho das nanopartículas bifuncionalizadas, onde pode-se notar a presença dos modos vibracionais do grupo fosfato, além dos modos referentes ao anel aromático e do grupo carboxilato.[085] EXAMPLE 7: Another example of bio-USPIO functionalized with two bioactive molecules by direct reaction was carried out with glucose 1-phosphate and ibuprofen (IBU). ibuprofen aromatic increases the hydrophobicity and decreases the dispersibility of these nanomaterials. For the reaction, 10 to 50 mg of purified and dried nanoparticles were redispersed in 100 μL to 500 pL of water. The nanoparticles were bifunctionalized by reacting with a solution containing the mixture of bioactive molecules in a ratio of 100:1 to 1:100 (glucose 1-phosphate:sodium ibruprofenate), maintaining a stoichiometric excess of 2000 times in relation to the number of nanoparticles of magnetite. The reaction mixture was stirred at 25 °C for ten minutes to six hours. Then, the nanoparticles were purified by precipitation/washing, dried in a vacuum desiccator and stored. The result of the EDL analysis in a dispersion in water, after two months of storage, is shown in Figure 11. In Figure 11, the infrared spectrum of the bifunctionalized nanoparticles is also shown, where the presence of the vibrational modes of the phosphate group can be noted, in addition to modes referring to the aromatic ring and the carboxylate group.
[086] EXEMPLO 8: Outra metodologia de funcionalização com uma ou mais moléculas bioativas foi realizada por meio de reações de acoplamento, partindo-se de nanopartículas de magnetita previamente funcionalizadas com PEA ou DOPA. Na Figura 12 são mostrados gráficos do número de partículas em função do diâmetro e os respectivos espectros infravermelho das nanopartículas recobertas com fosforiletanoamina pós-funcionalizadas por reação de acoplamento com biotina e ácido fólico na presença de 1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDO) e n-hidroxisuccinimida (NHS), usados como reagentes de acoplamento. A reação de funcionalização com PEA foi realizada conforme os exemplos acima, e as reações de acoplamento foram realizadas usando excesso estequiométrico de 2000 moléculas de biotina e 50 a 1000 moléculas de ácido fólico por nanopartícula de magnetita. As alterações no espectro infravermelho na faixa de 1000 a 1700 cm'1 foram usados para confirmar a reação entre os grupos carboxilatos das moléculas bioativas e os grupos aminas presentes na superfície das nanopartículas de magnetita (Figura 12). Os resultados de EDL das nanopartículas dispersas em água (três horas após a reação) demonstram a formação do bio-SPIO desejado. A pequena variação no perfil de distribuição de tamanhos das bio-SPIO comparado ao das nanopartículas de magnetita de partida indica ausência de agregação das mesmas.[086] EXAMPLE 8: Another functionalization methodology with one or more bioactive molecules was carried out through coupling reactions, starting from magnetite nanoparticles previously functionalized with PEA or DOPA. Figure 12 shows graphs of the number of particles as a function of diameter and the respective infrared spectra of nanoparticles coated with phosphorylethaneamine post-functionalized by coupling reaction with biotin and folic acid in the presence of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDO) and n-hydroxysuccinimide (NHS), used as coupling reagents. The functionalization reaction with PEA was carried out as in the examples above, and the coupling reactions were carried out using stoichiometric excess of 2000 molecules of biotin and 50 to 1000 molecules of folic acid per magnetite nanoparticle. Changes in the infrared spectrum in the range from 1000 to 1700 cm -1 were used to confirm the reaction between the carboxylate groups of the bioactive molecules and the amine groups present on the surface of the magnetite nanoparticles (Figure 12). The EDL results of the nanoparticles dispersed in water (three hours after the reaction) demonstrate the formation of the desired bio-SPIO. The small variation in the size distribution profile of the bio-SPIO compared to the starting magnetite nanoparticles indicates their absence of aggregation.
[087] Ensaios in vitro e in vivo foram realizados de modo a verificar a toxicidade, vias de eliminação e propriedades das bio-USPIO como agentes de contraste para diagnóstico por IRM. Resultados típicos obtidos com o bio- USPIO NMag@PEA são apresentados abaixo[087] In vitro and in vivo assays were performed in order to verify the toxicity, elimination pathways and properties of bio-USPIO as contrast agents for MRI diagnosis. Typical results obtained with the bio-USPIO NMag@PEA are shown below
[088] EXEMPLO 9: Uma sequência típica de imagens de ressonância magnética de um rato é mostrada nas Figura 13 e Figura 14. Note que nas fatias do controle, os rins (círculos amarelos na Figura 13A) e também do fígado e do baço (retângulo amarelo na Figura 14), aparecem como regiões claras. A região inferior e lateral da cavidade abdominal aparece como uma região mais escura, devido à presença de ar no interior ou entre os órgãos. Assim, intestinos e pulmões aparecem como áreas escuras devido ao ar presente em seu interior No entanto, após a injeção de bio-USPIO, há um aumento das áreas escuras na cavidade abdominal superior, onde estão presentes os rins, o fígado e também o baço (Figura 13A). No entanto, não há outros órgãos que parecem acumular nanopartículas de magnetita. A injeção foi feita através da canulação da veia femoral, sendo a injeção do material feita durante 10 minutos para evitar qualquer dano causado pela rápida injeção (mudança de pressão) ou concentração local elevada da magnetita.[088] EXAMPLE 9: A typical sequence of MRI images of a mouse is shown in Figure 13 and Figure 14. Note that in the control slices, the kidneys (yellow circles in Figure 13A) and also the liver and spleen ( yellow rectangle in Figure 14), appear as light regions. The lower and lateral region of the abdominal cavity appears as a darker region, due to the presence of air inside or between the organs. Thus, intestines and lungs appear as dark areas due to the air present inside. (Figure 13A). However, there are no other organs that appear to accumulate magnetite nanoparticles. The injection was made through the cannulation of the femoral vein, and the material was injected for 10 minutes to avoid any damage caused by the rapid injection (pressure change) or high local concentration of magnetite.
[089] A Figura 13A mostra também um forte contraste negativo no córtex renal (círculos amarelos) 2 horas após a injeção de 50 mg/kg de b/o-USPIO, biodistribuição natural esperada devido à filtração renal. Este contraste começa a perder intensidade após 24 horas da injeção, indicando uma eliminação relativamente rápida das bio-USPIO desse órgão. Este efeito é mostrado quantitativamente na Figura 13B, onde a densidade média normalizada de pixels brancos nos rins é representada em função do tempo, mostrando a diminuição de nanopartículas de magnetita em cerca da metade da sua concentração inicial após 24 horas No entanto, a intensidade do sinal de IRM é um valor relativo. Assim, a densidade média dos pixels brancos nos testículos foi utilizado como controle relativo para normalizar cada imagem, antes de calcular a densidade média de pixels brancos nos rins. Não há evidência de acumulação de bio-USPIO nos testículos. A barra de erro representada no gráfico corresponde ao desvio padrão. Tabela 1 - Parâmetros utilizados para as sequências de imagens em IRM
[090] EXEMPLO 10: O processo de eliminação mostrou-se ainda mais rápido após a injeção de 10 mg/kg de bio-USPIO (Figura 14), indicando que o tempo de eliminação é dependente da dose. Os rins são órgãos principalmente responsáveis pela filtração e remoção de substâncias indesejáveis presentes no sangue A filtração ocorre nos néfrons localizados no córtex renal (região da borda), onde aparece claramente o contraste negativo na imagem de ressonância magnética. Estas nanoparticulas magnéticas no sangue são suficientemente pequenas para atravessar os capilares dos glomérulos para a cápsula de Bowman, a partir de onde são então enviadas à bexiga e mais ou menos rapidamente eliminadas do corpo pela urina Nossos resultados indicam que as bio-USPIO são capazes de circular nos vasos sanguíneos até serem filtradas e excretadas pelos rins num processo relativamente rápido, tal como demonstrado nesse estudo de ressonância magnética.[090] EXAMPLE 10: The elimination process was shown to be even faster after the injection of 10 mg/kg of bio-USPIO (Figure 14), indicating that the elimination time is dose dependent. The kidneys are organs primarily responsible for filtering and removing unwanted substances from the blood. Filtration occurs in the nephrons located in the renal cortex (border region), where the negative contrast clearly appears on the magnetic resonance image. These magnetic nanoparticles in the blood are small enough to pass through the capillaries of the glomeruli into Bowman's capsule, from where they are then sent to the bladder and more or less rapidly eliminated from the body in the urine. circulate in the blood vessels until they are filtered and excreted by the kidneys in a relatively rapid process, as demonstrated in this MRI study.
[091] Por outro lado, cerca de um a quatro meses foram necessários para limpar completamente, respectivamente, 10 (Figura 13A) ou 50 mg/kg (retângulos amarelos na Figura 14) de bio-USPIO no fígado, o órgão responsável pela desintoxicação do organismo através dos hepatócitos, que são conhecidos por acumularem ferro (III) através da ferritina ou hemossiderina. A quantidade de bio-USPIO acumulada no fígado após a injeção de 10 mg/kg começou a mostrar alguma diminuição do contraste negativo após 2 semanas. Já 60 dias foram necessários para observar um efeito semelhante nos ratos Wistar machos que receberam a dose mais elevada. Antes destes períodos, a concentração de b/o-USPIO era demasiadamente elevada de modo que as variações no nível de contraste negativo não puderam ser observadas. Mesmo neste caso desfavorável de acumulação no órgão, todos os ratos utilizados nesses experimentos sobreviveram e não mostraram alteração em seu comportamento, indicando ausência de toxicidade, boa tolerância e eliminação total das nanopartículas de magnetita em função do tempo, mesmo utilizando-se a dose de 50 mg/kg Proporcionalmente, um humano adulto de 70 kg receberia uma dose de 3,5 g de bio-USPIO, uma dose muito mais alta do que a necessária para os diagnósticos por MRI (mesmo no caso desfavorável do Feridex IV. da Bayer (35 mW’s'1, a 0.47 T) a dose típica do agente de contraste é de 0,56 mg de Fe por kg de peso corporal). No entanto, a dose de 10 mg/kg é comumente utilizado em estudos de MRI com ratos, utilizando SPIO como agente de contraste.[091] On the other hand, it took about one to four months to completely clear, respectively, 10 (Figure 13A) or 50 mg/kg (yellow rectangles in Figure 14) of bio-USPIO in the liver, the organ responsible for detoxification. from the body via hepatocytes, which are known to accumulate iron (III) via ferritin or hemosiderin. The amount of bio-USPIO accumulated in the liver after the 10 mg/kg injection began to show some decrease in negative contrast after 2 weeks. Already 60 days were needed to observe a similar effect in male Wistar rats that received the highest dose. Before these periods, the concentration of b/o-USPIO was too high so that variations in the level of negative contrast could not be observed. Even in this unfavorable case of accumulation in the organ, all the rats used in these experiments survived and showed no change in their behavior, indicating absence of toxicity, good tolerance and total elimination of magnetite nanoparticles as a function of time, even using the dose of 50 mg/kg Proportionally, a 70 kg adult human would receive a 3.5 g dose of bio-USPIO, a much higher dose than required for MRI diagnostics (even in the unfavorable case of Bayer's Feridex IV. (35 mW's'1, at 0.47 T) the typical dose of contrast agent is 0.56 mg Fe per kg body weight). However, the 10 mg/kg dose is commonly used in MRI studies with mice, using SPIO as a contrast agent.
[092] O efeito de contraste negativo elevado e durável no fígado por IRM indica um tempo de retenção muito maior das b/o-USPIO em relação aos rins. Esse órgão é conhecido por estocar ferro (III) para a produção posterior de transferrina, uma proteína responsável pelo transporte e distribuição de ferro (III) para todas as células do corpo, especialmente para a medula óssea para a produção de hemoglobina e citocromos, conforme necessário. As propriedades paramagnéticas do material presente no fígado são irrevogavelmente evidenciadas pela presença do contraste negativo. No entanto, não há nenhuma evidência clara de que as nanopartículas de magnetita mantiveram- se como tal, ou foram oxidadas a maguemita (também superparamagnética) ou dissolvida e armazenada como óxidos de ferro (III) também paramagnético. No entanto, a possibilidade de dissolução espontânea de nanopartículas gerando íons de ferro (III) livres que são muito tóxicos pode ser descartada, considerando a ausência de toxicidade nos estudos, a baixa solubilidade desses óxidos de ferro e a presença de proteínas com muitos sítios ativos de elevada afinidade pelo ferro, tais como ferritina e hemosiderina. Provavelmente, bio-USPIOs estão sendo internalizadas pelas células (fagocitadas ou endocitadas) do sistema retículo-endotelial (RES) do fígado (principalmente células endoteliais e de Kupffer) e compartimentalizadas dentro dos lisossomos, onde são lixiviadas com o tempo devido ao baixo pH (3,5-4,0). Os produtos de degradação, como ferritina e hemosiderina, também causam um contraste negativo nas imagens de IRM, mas com potência 10 vezes menos intensa do que em comparação com as SPIOs. Como estas permanecem compartimentalizadas no interior das células, a manutenção do contraste negativo por um longo periodo de tempo pode ser explicada.[092] The high and durable negative contrast effect in the liver by MRI indicates a much longer retention time of b/o-USPIO compared to the kidneys. This organ is known to store iron (III) for the later production of transferrin, a protein responsible for transporting and distributing iron (III) to all cells in the body, especially to the bone marrow for the production of hemoglobin and cytochromes, as shown in Fig. required. The paramagnetic properties of the material present in the liver are irrevocably evidenced by the presence of negative contrast. However, there is no clear evidence that the magnetite nanoparticles remained as such, or were oxidized to maguemite (also superparamagnetic) or dissolved and stored as iron(III) oxides, also paramagnetic. However, the possibility of spontaneous dissolution of nanoparticles generating free iron (III) ions that are very toxic can be ruled out, considering the lack of toxicity in the studies, the low solubility of these iron oxides and the presence of proteins with many active sites. high affinity iron, such as ferritin and hemosiderin. Probably, bio-USPIOs are being internalized by cells (phagocytosed or endocytosed) of the liver reticuloendothelial system (RES) (mainly endothelial and Kupffer cells) and compartmentalized within lysosomes, where they are leached over time due to low pH ( 3.5-4.0). Degradation products such as ferritin and hemosiderin also cause negative contrast on MRI images, but with 10 times less intense potency compared to SPIOs. As these remain compartmentalized within the cells, the maintenance of negative contrast over a long period of time can be explained.
[093] EXEMPLO 11: Para comprovar o potencial de acumulação magnética induzida de bio-USPIO em locais de interesse no animal, foi realizado um experimento de modo semelhante ao descrito anteriormente para aqueles de contraste em IRM, exceto que foi afixado um imã na coxa esquerda de um grupo de três animais imediatamente antes da administração IV de bio- USPIO pela canulaçâo na veia femoral direita, e ali mantido durante 2 horas. Nota-se uma mancha com contraste negativo na coxa esquerda (círculo azul) na imagem de IRM, confirmando que as nanopartículas catiônicas fluiram ao longo do sistema circulatório, eventualmente atingindo o local onde foram magneticamente retidas (Figura 14). A vantagem de usar nanopartículas ultra- pequenas é que estas circulam no sangue por mais tempo do que as partículas com maior diâmetro hidrodinâmico, aumentando a quantidade acumulada magneticamente na região.[093] EXAMPLE 11: To prove the potential for induced magnetic accumulation of bio-USPIO at sites of interest in the animal, an experiment was carried out in a similar manner to that described above for MRI contrast agents, except that a magnet was attached to the thigh left side of a group of three animals immediately before IV administration of bioUSPIO by cannulation in the right femoral vein, and kept there for 2 hours. A stain with negative contrast is noted on the left thigh (blue circle) on the MRI image, confirming that the cationic nanoparticles flowed along the circulatory system, eventually reaching the place where they were magnetically retained (Figure 14). The advantage of using ultra-small nanoparticles is that they circulate in the blood longer than particles with a larger hydrodynamic diameter, increasing the amount magnetically accumulated in the region.
[094] Duas horas após a injeção IV de 50 mg/kg de bio-USPIO com um magneto colocado na coxa esquerda (círculos azuis na Figura 14), foi possível verificar a acumulação local de uma grande quantidade de nanopartículas, cuja eliminação completa demorou mais de 140 dias. Não há acúmulo espontâneo esperado nesta região, como pode ser evidenciado pelo controle mostrado na Figura 14 (fatia à esquerda). Para fins comparativos, 15 mg/kg de bio-USPIO foram injetados intramuscularmente (IM) na coxa direita do animal. Pela imagem de IRM verifica-se a presença de uma mancha de contraste negativo realçada pelo círculo amarelo na figura. Estas nanopartículas desaparecem após cerca de 60 dias, enquanto que as nanopartículas magneticamente acumuladas precisam de mais de 140 dias, sugerindo que a via de administração modifica a interação das bio-USPIO com os tecidos musculares. Um longo tempo de retenção pode ser vantajoso para fins de tratamento de doenças, uma vez que a dose única de bio-USPIO retida na região alvo não causa efeitos tóxicos significativos. Por exemplo, pode permitir o tratamento concomitante por hipertermia ou a liberação controlada de drogas.[094] Two hours after IV injection of 50 mg/kg of bio-USPIO with a magnet placed in the left thigh (blue circles in Figure 14), it was possible to verify the local accumulation of a large amount of nanoparticles, whose complete elimination took time. more than 140 days. There is no spontaneous buildup expected in this region, as can be evidenced by the control shown in Figure 14 (left slice). For comparative purposes, 15 mg/kg of bio-USPIO was injected intramuscularly (IM) into the right thigh of the animal. The MRI image shows the presence of a negative contrast stain highlighted by the yellow circle in the figure. These nanoparticles disappear after about 60 days, while the magnetically accumulated nanoparticles need more than 140 days, suggesting that the route of administration modifies the interaction of bio-USPIO with muscle tissues. A long retention time may be advantageous for disease treatment purposes, as the single dose of bio-USPIO retained in the target region does not cause significant toxic effects. For example, it may allow for concomitant treatment for hyperthermia or the controlled release of drugs.
[095] Além disso, os ratos Wistar machos tratados com a menor dose de 10 mg/kg de bio-USPIO exibiram tempos de eliminação do fígado diferentes: 14 e 7 dias, na ausência e na presença do ímã afixado na coxa esquerda, respectivamente (Figura 13). Os animais foram monitorados até 28 dias, sendo este o tempo necessário para limpar todo organismo das bio-USPIO como confirmado por ressonância magnética. Houve reprodutibilidade dos resultados obtidos com os três ratos de cada grupo. Os resultados descritos acima indicam claramente que a acumulação de bio-USPIO induzida por um ímã na coxa do animal diminui a quantidade de nanoparticulas presentes na circulação sanguínea, reduzindo assim a quantidade retida por outros órgãos, tal como esperado.[095] In addition, male Wistar rats treated with the lowest dose of 10 mg/kg of bio-USPIO exhibited different liver elimination times: 14 and 7 days, in the absence and presence of the magnet affixed to the left thigh, respectively. (Figure 13). The animals were monitored for up to 28 days, this being the time required to clear the entire organism from the bio-USPIO as confirmed by MRI. There was reproducibility of the results obtained with the three rats from each group. The results described above clearly indicate that the accumulation of bio-USPIO induced by a magnet in the animal's thigh decreases the amount of nanoparticles present in the bloodstream, thus reducing the amount retained by other organs, as expected.
[096] Considerando-se o tempo de eliminação relativamente longo, não se pode acreditar que as nanoparticulas de magnetita foram simplesmente retidas no interior das veias e vasos pela presença do campo, porque neste caso seriam redispersas assim que o imã fosse removido devido ao fluxo sanguíneo. Assim, acredita-se que as bio-USPIO cruzaram o endotélio dos vasos e penetraram nos tecidos musculares adjacentes, onde foram mais fortemente retidas. De fato, mostrou-se que 15 mg/kg de bio-USPIO administradas intramuscularmente (IM) na coxa direita se comportou de maneira semelhante àquelas concentradas por um campo magnético externo, como evidenciado pelo contraste negativo em ressonância magnética, que levou cerca de 60 dias para desaparecer (Figura 14). Assim, bio-USPIO provavelmente estão cruzando a parede dos vasos sanguíneos e se depositando no parênquima muscular. Alguns relatos na literatura reforçam essa hipótese. Thomsen et al. utilizaram um modelo in vitro para demonstrar que SPIO podem ultrapassar a barreira hemato-encefálica, a barreira vascular mais fortemente seletiva/restritiva do corpo humano. Além disso, foi mostrado in vitro que as nanopartículas magnéticas podem penetrar nas células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVECs). Tabela 2 - Valores de relaxatividade de exemplo de bio-USPIO preparada conforme os conhecimentos da presente invenção em comparação com as SPIOs comerciais usadas como agentes de contraste em IRM. Nota: a relaxatividade é proporcional ao campo magnético aplicado.
[097] EXEMPLO 12: Apesar dos resultados muito encorajadores descritos acima, a aplicação de bio-USPIO como agente de contraste para IRM seria limitada se sua exposição causasse elevada toxicidade aguda nas condições normalmente utilizadas para os exames de IRM. Assim, amostras de sangue e de urina recolhidas desses mesmos grupos de animais utilizados nos experimentos de IRM, foram analisadas a fim de determinar a contagem de leucócitos e outros parâmetros bioquímicos como dosagem de enzimas hepáticas e renais, e o teor de ferro na urina, em função do tempo de eliminação, como mostrado nas Figuras 19 a 21.[097] EXAMPLE 12: Despite the very encouraging results described above, the application of bio-USPIO as a contrast agent for MRI would be limited if its exposure caused high acute toxicity under the conditions normally used for MRI examinations. Thus, blood and urine samples collected from the same groups of animals used in the MRI experiments were analyzed in order to determine the leukocyte count and other biochemical parameters such as the dosage of liver and kidney enzymes, and the iron content in the urine, as a function of elimination time, as shown in Figures 19 to 21.
[098] O número de leucócitos, neutrófilos e linfócitos (Figura 17) foi determinado nas amostras de sangue coletadas de seis ratos logo após os exames de ressonância magnética, usando um hemocitômetro. O número médio de leucócitos (Figura 17A) manteve-se constante em cerca de 5.000 células por mm3 ao longo de 28 dias, tanto para o controle quanto para o grupo experimental de ratos (n = 3), após a administração de solução salina (veiculo) ou bio-USPIO, respectivamente. Da mesma forma, não houve diferença estatisticamente significativa (P> 0,05) no número de linfócitos e neutrófilos após a injeção de soro fisiológico ou bio-USPIO (Figura 17B e 17C). Portanto, não há qualquer alteração no número de leucócitos, linfócitos e neutrófilos, mesmo após a administração de 10 mg/kg de bio-USPIO. Ali e colaboradores também demonstraram que ferrofluidos biológicos baseados em núcleo magnético de nanopartículas de óxido de ferro embutidas dentro de poli(4- vinilpiridina) (P4VP gerados) e toda revestida com polietileno glicol (PEG) não têm efeito sobre o hemograma completo (hemácias, leucócitos, plaquetas, hemoglobina e hematócrito) nem mostra efeito hemolitico no sangue.[098] The number of leukocytes, neutrophils and lymphocytes (Figure 17) was determined in the blood samples collected from six rats shortly after the MRI scans, using a hemocytometer. The mean number of leukocytes (Figure 17A) remained constant at about 5,000 cells per mm3 over 28 days, for both control and experimental rats (n = 3), after saline administration ( vehicle) or bio-USPIO, respectively. Likewise, there was no statistically significant difference (P>0.05) in the number of lymphocytes and neutrophils after injection of saline or bio-USPIO (Figure 17B and 17C). Therefore, there is no change in the number of leukocytes, lymphocytes and neutrophils, even after administration of 10 mg/kg of bio-USPIO. Ali and collaborators also demonstrated that biological ferrofluids based on magnetic core of iron oxide nanoparticles embedded within poly(4-vinylpyridine) (P4VP generated) and all coated with polyethylene glycol (PEG) have no effect on complete blood count (RBCs, leukocytes, platelets, hemoglobin and hematocrit) nor does it show a hemolytic effect on the blood.
[099] EXEMPLO 13: Os níveis de alanina-aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), ureia, creatinina no sangue e na urina foram dosados ao longo de 28 dias, e estão apresentadas na Figura 18. Essa dosagem foi realizada para avaliar o efeito tóxico que as b/o-USPIOs poderiam causar no fígado e nos rins, tanto na ausência quanto na presença do ímã. Não houve alteração significativa ao administrar i.v o veiculo (10 mM de acetato, pH 4,5) e a suspensão de bio-USPIO tanto para o grupo controle (sem ímã) quanto para o experimental (com ímã) em relação à solução salina, com exceção de ALT nos dias 21 e 28. Entretanto, o nível de ALT é considerado normal até 80 U/L, sendo os valores encontrados na faixa de 25 a 50 U/L dentro da faixa aceitável.[099] EXAMPLE 13: The levels of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea, creatinine in blood and urine were measured over 28 days, and are shown in Figure 18. This measurement was performed for to evaluate the toxic effect that b/o-USPIOs could have on the liver and kidneys, both in the absence and in the presence of the magnet. There was no significant change when i.v. administered the vehicle (10 mM acetate, pH 4.5) and the bio-USPIO suspension for both the control group (without magnet) and the experimental group (with magnet) in relation to saline, with the exception of ALT on the 21st and 28th. However, the ALT level is considered normal up to 80 U/L, with values found in the range of 25 to 50 U/L within the acceptable range.
[0100] EXEMPLO 14: Com o intuito de confirmar estes resultados in vivo, ensaios de microscopia intravital foram realizados na microcirculação hepática para obter uma estimativa mais direta de eventuais efeitos tóxicos de bio- USPIO neste órgão. Nenhuma inflamação (adesão de leucócitos), microhemorragias ou a formação de trombos foi observada nos sinusoides do fígado, tal como descrito em mais detalhe abaixo (Figura 19). Portanto, pode- se concluir que mesmo doses elevadas de bio-USPIO não afetam as funções do fígado,[0100] EXAMPLE 14: In order to confirm these results in vivo, intravital microscopy assays were performed in the hepatic microcirculation to obtain a more direct estimate of possible toxic effects of bio-USPIO in this organ. No inflammation (leukocyte adhesion), microhemorrhages or thrombus formation was observed in the liver sinusoids, as described in more detail below (Figure 19). Therefore, it can be concluded that even high doses of bio-USPIO do not affect liver functions,
[0101] EXEMPLO 15: A urina do grupo de ratos que receberam 10 mg/kg de bio-USPIO, sem (controle, Figura 20 em verde) e com (experimental, Figura 20 em azul) um ímã na coxa esquerda durante 2 horas, foi recolhida logo após as medições de ressonância magnética e analisados por FG-EAA, uma técnica analítica muito sensível, capaz de medir concentrações abaixo de nanomolar. Pode-se notar que a concentração de ferro na urina aumentou significativamente duas horas após administração IV de bio-USPIO e, em seguida, diminuindo progressivamente até 50 μg/L no grupo experimental (Figura 20, em azul), indicando a completa eliminação da magnetita após 28 dias. Comportamento semelhante foi observado para o grupo controle (Figura 20, em verde), mas o nível de ferro imediatamente após a injeção IV (2 horas) mostrou-se significativamente mais elevado do que no grupo experimental (528 μg/L, em comparação com 425 μg/L) e manteve uma estabilização ao redor de 200-300 μg/L, em contraste com os 50 μg/L alcançados pelo grupo experimental. Tabela 3 - Parâmetros instrumentais e o programa de aquecimento do GF- AAS para determinação de Fe em urina.
[0102] Deve-se lembrar neste ponto que a quantidade de nanopartículas de magnetita concentradas no fígado e no baço do grupo controle é mais elevado do que no grupo experimental de ratos. Além disso, a taxa de eliminação de bio-USPIO magneticamente concentrados na coxa esquerda mostrou ser mais lenta do que as que permaneceram nos órgãos internos. Considerando-se que o fígado pode efetivamente eliminar a magnetita, provavelmente, a quantidade extra de bio-USPIO retida pelo controle foi maior do que uma determinada concentração critica, isto é, foi saturada a sua capacidade de processamento. Assim, o referido órgão deve trabalhar em sua capacidade máxima ao longo de 28 dias até, eventualmente, o valor tornar-se mais baixo do que esse limite e o teor de ferro na urina começara diminuir exponencialmente da mesma maneira como no grupo experimental (Figura 20, em azul). O excesso de ferro (III) pode ser eliminado através das fezes também.[0102] It should be remembered at this point that the amount of magnetite nanoparticles concentrated in the liver and spleen of the control group is higher than in the experimental group of rats. Furthermore, the rate of elimination of bio-USPIO magnetically concentrated in the left thigh was shown to be slower than those remaining in Organs internal organs. Considering that the liver can effectively eliminate magnetite, it is likely that the extra amount of bio-USPIO retained by the control was greater than a certain critical concentration, that is, its processing capacity was saturated. Thus, the referred organ must work at its maximum capacity over 28 days until, eventually, the value becomes lower than this limit and the iron content in the urine begins to decrease exponentially in the same way as in the experimental group (Figure 20, in blue). Excess iron (III) can be eliminated through the feces as well.
[0103] EXEMPLO 16: O efeito das bio-USPIO na microcirculação pode ser avaliada in vivo, diretamente por microscopia intravital fluorescente, tal como mostrado na Figura 19A, em que as regiões escuras correspondem às vênulas e sinusoides, enquanto estão coradas de amarelo as regiões do parênquima hepático marcado com rodamina 6G. O mesentério e a microcirculação hepática são tecidos altamente vascularizados, amplamente utilizados para estudar a toxicidade de compostos. Todavia, não foi observada diferença significativa no número de leucócitos aderentes ao longo dos sinusoides hepáticos ao longo de 3 horas após a administração IV de bio-USPIO em comparação com animais-controle, onde foi injetado solução salina (Figura 19B). Da mesma forma, não foi observada diferença significativa no número de leucócitos rolando ao longo do pavimento endotelial vascular das vênulas mesentéricas após a injeção de bio-USPIO, em comparação com os animais- controle (Figura 21 A). O número de leucócitos aderentes e migrados na microcirculação mesentérica aumentou significativamente após 30 e 60 minutos da exposição do tecido, mas um comportamento semelhante foi observado nos controles com solução salina injetada (Figura 21B e 21C), não evidenciando toxicidade significativa induzida por bio-USPIO. Além disso, o diâmetro venular se manteve entre 20 e 24 mm (Figura 21 D) que evidencia novamente a baixa ou nenhuma toxicidade de bio-USPIO para o sistema vascular. Em conclusão, os resultados obtidos por microscopia intravital confirmam a segurança das bio-USPIO em eventos tóxicos importantes, tais como a ativação de leucócitos, formação de trombos ou mudança no diâmetro vascular tanto no leito vascular do fígado quanto no mesentério após a injeção IV. A tendência insignificante de bio-USPIO interagir com as membranas celulares carregadas negativamente na microcirculação pode ser um indicativo da formação de uma coroa de proteção de proteínas séricas, provavelmente a albumina, imunoglobulinas e cadeias de fibrinogênio.[0103] EXAMPLE 16: The effect of bio-USPIO on microcirculation can be evaluated in vivo, directly by intravital fluorescent microscopy, as shown in Figure 19A, where the dark regions correspond to the venules and sinusoids, while the venules and sinusoids are stained yellow. 6G rhodamine-labeled liver parenchyma regions. The mesentery and hepatic microcirculation are highly vascularized tissues, widely used to study the toxicity of compounds. However, no significant difference was observed in the number of adherent leukocytes along the hepatic sinusoids over 3 hours after IV administration of bio-USPIO compared to control animals where saline was injected (Figure 19B). Likewise, no significant difference was observed in the number of leukocytes rolling along the vascular endothelial floor of the mesenteric venules after bio-USPIO injection compared to control animals (Figure 21 A). The number of adherent and migrating leukocytes in the mesenteric microcirculation increased significantly after 30 and 60 minutes of tissue exposure, but a similar behavior was observed in saline-injected controls (Figure 21B and 21C), showing no significant toxicity induced by bio-USPIO. . In addition, the venular diameter remained between 20 and 24 mm (Figure 21 D) which again shows the low or no toxicity of bio-USPIO to the vascular system. In conclusion, the results obtained by intravital microscopy confirm the safety of bio-USPIOs in important toxic events, such as leukocyte activation, thrombus formation or change in vascular diameter both in the vascular bed of the liver and in the mesentery after IV injection. The insignificant tendency of bio-USPIO to interact with negatively charged cell membranes in the microcirculation may be indicative of the formation of a protective crown of serum proteins, probably albumin, immunoglobulins and fibrinogen chains.
[0104] EXEMPLO 17: A suspensão injetável pode ser preparada através da dispersão do material particulado em solução salina (0,9% de NaCI), tampão fosfato, água destilada ou outros tampões com pH entre 4 a 7,4.[0104] EXAMPLE 17: The suspension for injection can be prepared by dispersing the particulate material in saline solution (0.9% NaCl), phosphate buffer, distilled water or other buffers with a pH between 4 to 7.4.
[0105] O material apresenta grande área superficial e alta relaxatividade. As nanoparticulas consistem de nanocristais de magnetita com elevada magnetização de saturação, em temperaturas acima de 100 K e em tempo de medida na escala de segundos, e estão funcionalizadas quimicamente apenas com uma monocamada de moléculas bioativas. Não possui qualquer outro tipo de recobrimento adicional como acontece com a maioria das nanoparticulas magnéticas existentes, onde geralmente estão recobertas com biopolímeros ou grandes cadeias de açúcares ou polióis para aumentar a estabilidade e a biocompatibilidade com o meio biológico.[0105] The material has a large surface area and high relaxivity. The nanoparticles consist of magnetite nanocrystals with high saturation magnetization, at temperatures above 100 K and measurement time in the seconds scale, and are chemically functionalized only with a monolayer of bioactive molecules. It does not have any other type of additional coating as with most existing magnetic nanoparticles, where they are usually coated with biopolymers or large sugar or polyol chains to increase stability and biocompatibility with the biological environment.
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